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JPH01500748A - アミノ−誘導化亜リン酸エステル及びリン酸エステル結合剤、ホスホルアミダイト前駆体及び有用な複合体 - Google Patents

アミノ−誘導化亜リン酸エステル及びリン酸エステル結合剤、ホスホルアミダイト前駆体及び有用な複合体

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JPH01500748A
JPH01500748A JP61505094A JP50509486A JPH01500748A JP H01500748 A JPH01500748 A JP H01500748A JP 61505094 A JP61505094 A JP 61505094A JP 50509486 A JP50509486 A JP 50509486A JP H01500748 A JPH01500748 A JP H01500748A
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ウー，サム　リー
エム スミス，ロイド
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アプライド　バイオシステムズ　インコ−ポレイテツド
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アミノ−誘導化亜リン酸エステル及び リン酸エステル結合剤、ホスホルアミダイト前駆体及び有用な複合体 産量 本発明は一般的に有機リン化合物、より詳しくはアミノ−誘導化重合体、特にオ リゴヌクレオチド類を合成するための有機リン化合物に関する。
遺伝子及び遺伝子コントロール領域は現在では分子レベルにおいて日常的に特徴 付けられ研究することができる。これはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を操作及び 変成することに伴う技術における幾つかの最近の進歩により可能である。特に重 要であるのはＤＮＡ配列決定における進歩、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｎ ＋ｏｌｏｇｙ、　Ｇｒｏｓｓｍａｎ及びＭｏ１ｄａｖｅ　１ｌＶｏ１．６５　（ Ａｃａｄｅ＋＋＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８０）中のマクサム（ Ｍａｘａｍ）及びギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）　の”Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　 Ｅｎｄ−Ｌａｂｅｌｅｄ　ＤＮＡ　ｗｉｔｈＢａｓｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｌｅａｖａｇｅｓ”　ｓ及びスミス（Ｓａ＋１ｔｈ）Ｄ　Ｎ　 Ａ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　Ｐｒｉｍｅｄ　５ｙｎ−ｔｈ ｅｓｉｓ”、それぞれｐ、４９９〜５６０及び５６０〜５８０；多数の宿主制限 変成酵素の単離、Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＥｎｚｙ＋＋＋ｏｌｏｇｙ、Ｗｕ　ｖｇ Ｖｏｌ、　６　Ｂ　（Ａｃａｄｅｎ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ−ニューヨーク、１９７ ９）中のロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）　”Ｄｉｃｔｉｏ−ｎａｒｙ　ｏｆ　Ｒｅ ５ｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ″；及び規定されたＤＮＡ配 列のクローニング及び増幅のためのベクターの造成、例えばＭｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、　ＷｕｌｉＶｏｌ。
６８　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９７９）中のポリバ ー（Ｂｏｌｉｖａｒ）及びバンクマンＣＢａｃｋｍａｎ）　、”Ｐｌａ−ｓｇｉ ｄｓ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ａｓ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅ ｃｔ、ｏｒｓ”などである。
これらの新しい技術の多（はＤＮＡ断片或いはオリゴヌクレオチドが重合体支持 体に標識化或いは結合されることを要求する。商業的或いは化学的に重要な天然 遺伝子の配置を助けるために用いることのできるＤＮＡ配列決定技術及び遺伝子 プローブは標識化オリゴヌクレオチドの使用を要求する。最近まで全てのＤＮＡ 配列決定技術は電気泳動により分離されたオリゴヌクレオチド断片を区別するた めに放射活性標識に頼っていた。放射活性標識は感度が高（立体妨害、その他の 化学的副作用なしに導入することが出来る。しかしながら、それらの使用は実験 室の健康の危険を生じ、それらが特別の取扱い及び処分を受けることを必要とす る。更に、それらの使用はヌクレオチド特異性放射性標識が異ったヌクレオチド 塩基の実際的な同定には利用可能でなく、オートラジオグラフィ及びシンチレー シッン計数などの放射検知技術は余りにも時間がかかるのでオリゴヌクレオチド 類の迅速な自動配列決定には適していない、その結果、蛍光及び比色標識化など の蛍光性或いは発色性分子を共有結合的にオリゴヌクレオチドに結合させる能力 に依存する他の非−放射性標識化技術が探索されてきた。
チュ等（Ｃｈｕ　ｅｔ　ａｌ、）はＤｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｕｎ ｐｒｏ−ｔｅｃｔｅｄ　Ｐｏ１ｙ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ’、Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｂ＋Ｖｏ１．１１、ｐ、６５１３−６５２９　（ １９８３）においてアミンをオリゴヌクレオチドの末端５′−ホスフェートに結 合する方法を開示している。この方法の一つの目的はアミン結合により有機標識 分子をオリゴヌクレオチドに結合する手段を提供することである。この方法はオ リゴヌクレオチドをカルボジイミドで処理することを含む。
コレット（Ｃｈｏｌｌｅｔ）及びカワシマ（Ｋａｗａｓｈｉｍａ）は＝Ｂｉｏｔ ｉｎ−Ｌａｂｅｌｅｄ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎ ｕｃｌｅｓｔｉ−ｄｅｓ　：　Ｃｈｅｏ＋１ｃａｌ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎ ｄ　Ｕｓｅｓ　ａｓ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａ−ｔｉｏｎ　Ｐｒｏｂｅｓ”、Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ、　１３　。
１５２９−１５４１頁（１９８５）においてチュ等のビオチンをオリゴヌクレオ チドの５′−ホスフェートに結合する方法の使用を開示する。報告された５０〜 ７０％の収率は自動シンセサイザーに使用するに必要とされるよりも低いもので あり、カルボジイミドは反応の途中においてオリゴヌクレオチド塩基の望ましく ない変成を引起こし得るものである。
スミス等（Ｓ＋＊ｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、）は“５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｌ ｉｇｏ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ａｎ　Ａ１１ｐｈａ ｔｉｃ　Ａｍ１ｎｏ　Ｇｒｏｕｐａｔ　ｔｈｅ５　’　丁ｅｒｍｉｎｉｓ　＝　 ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ＤＮＡ　Ｐｒｉｍｅｒｓ 　ｆｏｒ　Ｕｓｅ　ｉｎ　ＤＮＡ５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ”。
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ、１３．　２３９９　 ２４１２頁（１９８５）において蛍光或いは比色標識をオリゴヌクレオチド断片 に結合するための保護されたアミノ−誘導化ヌクレオチドホスホルアミダイトを 開示する。この結合剤は塩基−特異性標識をオリゴヌクレオチドの５′−末端に 結合するのに極めて有用であるが、保護−アミンホスホルアミダイトは容易に精 製されない。
コノリー（Ｃｏｎｎｏｌ　ｌｙ）及びライダー（Ｒ４ｄｅｒ）は“Ｃｈｅ−ｍｉ ｃａｌ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｓｔｉｄｅｓ　Ｃｏ ｎｔａｉｎｉｎｇ　ａＦｒｅｅ　５ｕｌｐｈｙｄｒｙｌ　Ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　 ５ｕｂｓｅｑｕｅｎｔ　Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔｏｆ　Ｔｈ１ｏｌ　５ｐｅｃｉｆ ｉｃ　Ｐｒｏｂｅｓ″、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ−ｃｈ、Ｖ ｏｌ、　１３．４４８５−４５０２頁（１９８５）においてトリチル−保護イオ ウを２．３、或いは６個の炭素鎖を介してオリゴヌクレオチドの５′ホスフエー トに結合して有するオリゴヌクレオチドの合成を開示する。
標識化剤をオリゴヌクレオチド類に結合することから離れて、調製的及び分析的 用途の両目的のために各種分子を触媒、酵素、微生物、アフィニティ試薬、免疫 吸着剤などの重合体支持体上に固定化することに大きな関心が寄せられている０ 例えばショット（Ｓｃｈｏｔｔ）。
Ａｆｆｉｎｉｔｙ　ＣｈｒｏＩｌａｔｏｇｒａｐｈｙ　（Ｍｅｒｃｅｌ　Ｄｅｋ ｋｅｒ、Ｉｎｃ、　二ニーヨーク１９８４）及びモスバック（Ｍｏｓｂａｃｋ） Ｕ４Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋Ｖｏ１．４４　”　Ｉｍｍ ｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚ−ｙｍｅｓ’＋　（Ａｃａｄｅｌｌｉｃ　Ｐｒｅｓｓ 、ニューヨーク、１９７６）。
特にこの分野で興味深いのは分子及び細胞を共有結合により固定化するための手 段である。
光里亘塁１ 本発明の化合物は２−Ｒ換−３−保１１−１．３．２−オキサザホスファシクロ アルカン類及びそれらのホスホルアミダイド前駆体よりなる新規結合剤を包含す るものである。本発明の化合物は更に上記結合剤とオリゴヌクレオチド類との複 合体、上記結合剤と重合体支持体との複合体及び上記結合剤によりオリゴヌクレ オチド類に結合された染料よりなる複合体を包含するものである。本発明は蛍光 及び発色染料などの有機部分をＤＮＡ断片及びオリゴヌクレオチド類、特に−末 鎖ＤＮＡ及びＲＮＡに結合するために、及びＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド類 、タンパク質などを重合体支持体に結合するために有用な化合物に関する。これ らの化合物及びそれらの複合体は自動及び手動ＤＮＡ及びＲＮＡ合成及び配列分 析、遺伝子プローブの構成、アフィニティ技術などにおいて有用である。特に、 本発明の結合剤の環状態様はより容易に精製された結合剤を提供することにより 現在利用可能な結合方法に伴う欠点を有利に克服するものである。
主肌二反皿 本発明の結合化合物は下記一般式により表わされる２−置換−３−保護−１，３ ，２−オキサザホスファシクロアルカン類を包含する： （ＣＲｚＲｉ）、ｌ 好ましくは２に等しい。
Ｒ，はアミノ保護基、好ましくは酸−不安定な或いは塩基−不安定ないづれかで あり、例えばグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）により「有機合成における保護基（Ｐｒ ｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ） Ｊ　（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ。
ニューヨーク、１９８１）第７章に説明されているようなものであり、同書は本 発明において準用する。好ましい塩基−不安定な保護基は複素環の窒素或いはそ の前駆体のそれと共に塩基−不安定なアミド及びカルバメート保護基、好ましく はトリハロアセチル類、アセトアセチル、及びフルオレニルメチルカルバメート 類特に９−フルオレニルメチルカルバメート及び９−（２−スルホ）−フルオレ ニルメチルカルバメート、最も好ましくはトリフルオロアセチルである。好まし い酸−不安定な保護基としてはトリチル類、及びそれらの低級（１〜３の炭素数 を含有する）アルコキシ誘導体、特に４−モノメトキシトリチル及び４．４’− ジメトキシトリチルなどが挙げられる。
Ｒ２及びＲ，３は（１）それらが一般式■の化合物の環化を立体的に妨害する可 能性が最小とされるように、（２）一般式■の複素環の環電子密度が減少される ように（何故ならばこれが反応性或いは一般式■の化合物における 水酸基に対するＮ−Ｐ結合を高められると考えられているので）、及び（３１− ｇ式■の化合物の分子量がそれが蒸留により精製することのできる可能性を増大 するために最小とされるように選ばれる。Ｒ２及びＲ５は別々に各々水素、低級 アルキル、低級置換アルキル、特にハロー、シアノ−１或いはニトロ−置換低１ ）アルキル、低級アシル、シアノ、ハロ及びニトロを表わし、より好ましくはＲ １及びＲ１は別々に各々水素、低級アルキル及び低級ハロアルキルを表わし、最 も好ましくはＲ２及びＲ３は水素を表わす。
Ｒ４は１０個までの炭素原子を含有するアルキル、アルケニル、アリール、アラ ルキル、或いはシクロアルキルを表わす、より好ましくは、Ｒ４は低級アルキル ：を子−引抜きベーター置換エチル、特にベータートリハロメチル−、ベーター シアノ−、ベータースルホ−、ベーターニトロ−置換エチルなど；電子−引抜き 置換フェニル、特にハロー、スルホ−、シアノ−１或いはニトロ−１置換フェニ ル；或いは電子−引抜き置換フェニルエチルを表わす、最も好ましくは、Ｒ４は メチル、ベーターシアノエチル、或いは４−ニトロフェニルエチルを表わす。
本発明において用いられる「低級アルキル」という用語は１〜６個の炭素原子を 含有する直鎖及び分岐鎖アルキル基例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロ ピル、ｔｅｒ　ｔ−ブチル、イソブチル、５ｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅ ｒ　ｔ−ペンチルなどを示す、「低級置換アルキル」とはハロ、シアノ、ニトロ 、スルホ、或いは七ノー、ジー、或いはトリハロメチルなどの電子−引抜き置換 基を有する低級アルキルを示す、「低級ハロアルキル」とは１個以上のハロゲン 原子置換基通常フルオロ、クロロ、ブロモ、或いはヨードを有する低級アルキル を示す。「低級アシル」とは非−二重結合炭素が低級アルキルよりなりハロー、 シアノ−１或いはニトロ−置換基を有してもよい１〜７個の炭素原子を含有する アシルを示す。「電子−引抜き」とは置換基のそれが離れている分子の原子価電 子を吸引する傾向、即ちそれが電気陰性であることを示す。
上記結合側の特別の場合として次式で規定される二環式化合物が包含される： （ＣＨ，）。
式中、ｍは１〜３の範囲にあり、ｎｓＲ＋及びＲ４は上記と同義である。より好 ましくは、ｍは１〜２の範囲にあり、最も好ましくはｍは１である。オキサザホ スファ−複素環に結合した低級シクロアルキルは環応力を複素環中に導入して窒 素−リン結合をより反応性にするものと考えられる。
本発明の結合化合物は父上記２−置換−３＝保護−１，３，２−オキサザホスフ ァシクロアルカン類のホスホルアミダイト前駆体も包含し、これらの前駆体は次 式により定義される： Ｒｒ　、Ｒｔ　、Ｒｚ及びＲ１は上記と同義であり；ｊは２〜１０の範囲、より 好ましくは２〜４の範囲、最も好ましくは２〜３の範囲であり（この後者の範囲 は最も好ましい環化のための立体配置を有する前駆体を生ずるものと思われる） 、及び Ｒ′及びＲ″は別々に各々１０個までの炭素原子を含有するアルキル、アラルキ ル、シクロアルキル及びシクロアルキルアルキルを表わす〕。
好ましくは、Ｒ′及びＲ＃は別々に低級アルキルを表わし、最も好ましくは上記 ホスホルアミダイトが直接に結合剤として使用される場合には、Ｒ′及びＲ″は 別々にホスホルアミダイトの化学的安定性、及び従ってそれらの貯蔵寿命を高め る立体的妨害性低級アルキルである。その様な立体妨害性低級アルキルとしては イソプロピル、ｔ−ブチル、イソブチル、５ｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅ ｒｔ−ペンチル、イソペンチル、５ｅｃ−ペンチルなどが挙げられる。最も好ま しくは、上記ホスホルアミダイトが上記オキサザホスファ−複素環の前駆体とし て用いられる場合には、Ｒ′及びＲ″は別々にイソプロピルである。
Ｒ′及びＲ″は一緒に主鎖に５個までの炭素原子及び合計１０個までの炭素原子 を含有し、該鎖の両末端原子価結合がＲ′及びＲ＃が結合する窒素原子に結合し たアルキレン鎖を形成するか、或いはＲ′及びＲ＃はそれらが結合する窒素原子 と共に窒素、酸素及びイオウから選ばれた一種以上の付加的ペテロ原子を含有し てもよい飽和窒素複素環を形成する。より好ましくは、Ｒ′及びＲ＃は共に且つ それらが結合する窒素原子と共にピロリジノ、モルホリノ、或いはピペリジノを 表わす、最も好ましくは、Ｒ′及びＲ″は共にそれらが結合する窒素原子と一緒 にモルホリノを表わす。
上記２−置換−３−保護−１，３，２−オキサザホは次式により表わされる置換 −低級シクロアルカン類を包含する： 式一旦 （式中、Ｒ，、Ｒ，、Ｒ’及びＲ″は上記と同義であり、及びｔは０〜８の範囲 にあり、ＳはＯ〜８の範囲にあり、但し、ｓ＋ｔは１〜８の範囲にあり、より好 ましくはｔは０〜２の範囲にあり、Ｓは１〜３の範囲にあり、より好ましくはｔ は０であり、Ｓは１〜２の範囲にあり、最も好ましくはｔはＯでありζＳは１で ある）、′ 本発明の複合体は次式で表わされる亜リン酸トリエステル及びリン酸トリエステ ル及びジエステル化合物を包含する： １は０或いは１であり（ｉ＝０は亜リン酸エステルを示し、及びｉ＝１はリン酸 エステルを示す）、ｋはｉが０に等しい場合には１に等しく、或いはｉが１に等 しい場合にはｋは０或いは１に等しい（ｋ＝０はジエステルを示し、及びに＝１ はトリエステルを示す）、 ｊ−Ｒｒ　−Ｒ１、Ｒ３及びＲ１は上記と同義であり、及びＷはオリゴヌクレオ チド、重合体支持体、或いは重合体支持体に結合したオリゴヌクレオチドを示す 〕。
オリゴヌクレオチド類としては、−末鎖或いは二本鎖ＲＮＡの断片及び−末鎖一 及び二本ｌＤＮＡの断片を含む。好ましくは結合剤はオリゴヌクレオチドの末端 ５′炭素、オリゴヌクレオチドの末端３′炭素或いはＲＮＡの末端２′炭素に接 合している０尾り好ましくは、結合剤はオリゴヌクレオチドの、末端５′炭素原 子に接合しており、最も好ましくは結合剤は一本鎖ＤＮＡの断片の末端５′炭素 に接合している。
重合体支持体は各種の形態及び組成を有してよい。
重合体支持体は天然材料、合成的に変成された天然材料及び合成材料から誘導す ることができる。特に興味深いのはポリサンカライド類、特に架橋ポリサッカラ イド類、例えば５ｅｐｈａｒｏｓｅとして利用可能なアガロース、５ｅｐｈａｄ ｅｘ及び５ｅｐｈａｃｙｌとして利用可能なテキストラン、セルロース、デンプ ンなどである（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ。
５ｅｐｈａｄｅｘ及び５ｅｐｈａｃｙｌはＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌｓの商標を付された製品である）。その他の材料としてはポリアク リルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルメタクリ レートとメチルメタクリレートの共重合体、シリコーン、テフロンガラス、細胞 などが挙げられる０粒子などの形状の固体支持体に加えて、重合体支持体は又内 部液体を含有し、空間を規定するのに役立つ親油性或いは両親媒性膜よりなる液 体粒子の形態であってよい、その様な粒子としては、小胞、細胞、リポソームな どが挙げられる。
好ましくはＡ′はヒドロキシル官能性を有する不溶性重合体支持体を表わす０本 発明の結合剤は以下に一般的に説明される結合剤をオリゴヌクレオチド類に結合 させる次の方法によりヒドロキシル官能性を有する重合体支持体に結合される。
一般式Ｖの左手側の（Ｈ及びＲ９を囲む）はこの実施態様が化合物の保護及び脱 保護形態の両者を含むことを示す。
オリゴヌクレオチド類はアフィニティクロマトグラフィの標準的技術により或い は例えばカルサーズ等（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、）により米国特許４ ，４５８．０６６号及び４，４１５．７３２号明細書などにより開示される結合 手段により重合体支持体に結合される。
本発明の亜リン酸トリエステル及びリン酸トリエステル及びジエステル複合体は 更に次式で表わされる化合物を含む： 莢一旦 （式中、ｌ　ｓ　ｋｚ　Ｓ　ｓ　ｔ％　Ｒ＋　、Ｒａ及びＷは上記と同義である ）。
一般的に本発明のリン酸トリエステル化合物は上記亜リン酸複合体から酸化によ り、例えば水、２，６−ルチジン及びテトラヒドロフラン中においてＩ２を用い て酸化により得られる。酸化は極めて迅速である（１〜２分）。
本発明のリン酸ジエステル複合体は上記リン酸トリエステルから標準的技術によ り、例えばＲ４がメチルである場合にはリン酸ジエステルはチオフェノール／ト リエチルアミンで約３０分間処理することによりリン酸トリエステルから得られ る。一般式■及び■のホスホルアミダイト前駆体を合成する一般的方法は次の工 程を含んでなる０次式により表わされるハロー置換−Ｎ、　Ｎ−ジー置換−〇− 置換ホスフィン：（式中、Ｘはハロゲン、通常クロロであり、及びＲ′、Ｒ＃及 びＲ４は上記と同義である） を次式で定義されるアミノ−保護アルコールアミンを：（式中、Ｒ，ＳＲ１及び Ｒ２は上記と同義である）反応中に放出されたハロゲン酸を吸収する非−求核塩 基、例えばＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキルアミンを含 有する非−プロトン性溶媒例えばジクロロメタンなど中で反応させる。好ましく は反応はアルゴンなどの不活性雰囲気下に行われる。
酸はホスホルアミダイト生成物のアミンをプロトン化させて反応性にするので反 応混合物中の酸性条件は避けるべきである。非−求核塩基は塩基と活性化ホスホ ルアミダイトの間の副反応の可能性を減少させる。
アミノ−保護アルコールアミンのアルキル部分即ち−（ＣＲｔＲｚ）Ｒ−が例え ば一般式■におけるようにシクロアルキルである場合には、常にアルコールアミ ンのアミド或いはカルバメート部分はヒドロキシとｃｉｓ立体配置にあるのが好 ましく、さもなくばオキサザホスファ−複素環の形成は二つの基の空間的分離に より困難に或いは不可能にさえなる。
上記材料を反応後、以下第一反応混合物と称される反応混合物を軽度に塩基性の 溶液で洗浄して非−求核塩基の塩を除去する。最後に、第一反応混合物を例えば Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ　、Ｎ　ａ　ｔｓ　Ｏａなどを用いて乾燥し、ホスホルアミダ イト前駆体を得る。
−Ｊ’Ｇ弐■及び■の複素環はそれぞれ一触弐■或いは■で表わされる適当な前 駆体を加熱して第二反応混合物を形成し、次いで複素環を混合物から除去するこ とにより得られる。必要な加熱量、即ち温度及び継続時間は本発明の異った実施 態様に応じて異るが、好ましくは加熱は前駆体を約２５〜２５０℃の、より好ま しくは約２５〜１５０℃、最も好ましくは約２５〜１００℃の範囲内の温度に上 昇させることを含む。分離方法の選択は置換基Ｒ，、Ｒよ、Ｒ３及びＲ４，の性 質に応じて異る。、例えば大雑把な近似として置換基の総分子量が十分に低い場 合には、加熱及び分離工程は蒸留により達成することが出来る。その他の分離方 法としては、結晶化及びクロマトグラフィが挙げられる。好ましくは、本発明の オリゴヌクレオチドと結合剤の複合体は結合剤をカルバメート（Ｃａｒｕｔｈｅ ｒｓ）及び彼の共同研究者により開発された固相合成方法により合成されたオリ ゴヌクレオチド類に結合させることにより形成される〔例、カルーサース等（Ｃ ａｒｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、）、ｐ。
１〜１７　、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ、　４　、Ｓｅ ｔｌｏｗ　ａｎｄＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ　［（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、ニュ ーヨーク、１９８２）、及びカルーサース等（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｔ 、）米国特許４，４５８．０６６号明細書〕。
結合剤の結合は合成方法の最終工程として行われる、即ち結合剤はそれがあたか もカルーサース等におけるヌクレオチドのサブユニットであるが如く、オリゴヌ クレオチドに結合される。
以下の実施例は本発明を例示するのに役立つものである。試薬の濃度、温度、及 びその他の可変バラメー夕の値は本発明の応用を例示するのみであり、それらの 限定と考えられてはならない。
実施例１．　２−メトキシ−３−ト！゛フルオロアセチ上二上工１工に主土並ヱ 主スヱＬ之久 ロペン　ンのホスホルアミダイトｆ駆 −ｑ金五 クロロ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィンＣ５，Ｏｍｌ　ｓ　 Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、ミルウォーキーウィスコンシン州 から市販）を０℃においてジクロロメタン（約４０ｓｊり中のＮ−（２−ヒドロ キシエチル）　−２，２，２−）リフルオロアセタミド（３，９ｇ）及びジイソ プロピルエチルアミン（５，０ｓｊｔ）の攪拌された溶液にアルゴン下に滴加し た。　Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２，２，２−トリフルオロアセタミドを ラザラス（Ｌａｚａｒｕｓ）及びペンコピツク（Ｂｅ−ｎｋｏｖｉｃ）によりＪ 、＾＋ｓ、Ｃｈｅｓ＋、Ｓｏｃ、Ｖｏ１．１０１．４３００−４３１２頁（１９ ７９）により開示される次の方法に従って合成した。即ち、５０ｓ＋Ａのクロロ ホルム中のエチルトリフルオロアセテ−）　（５６，８ｇ５０．４ａ＋ｏＩりを ５０ｓｊ！のクロロホルム中の２４．４　ｇ　（０，４０１０１）のエタノール アミンの攪拌された溶液に滴加した。この溶液を室温で５時間攪拌し、ロータリ ーエバポレーションにより溶媒を除去し、及び１１５℃で蒸留して（４，３Ｔｏ ｒｒ）　、５８．５ｇの油を得、これは引掻くことにより結晶化した。室温にお いて０．５時間攪拌後、反応混合物を０．２　Ｍ炭酸カリウム溶液で一回、及び 塩水で一回洗浄し、乾燥しくＭ　ｇ　Ｓ　Ｏａ　）　、減圧濃縮しＴＮ−（２− （Ｎ’、Ｎ’−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィニルオキシ）エチル）− ２，２，２−）リフルオロアセタミドを無色液体として得た（７．７７ｇ）　。
’　Ｈ−ＮＭ　Ｒ（Ｃ’ＤｔＣＮ　ｚ）　：δ３．６（６Ｈ，ｍ）、３．４（３ Ｈ，ｄ　、　Ｊ−１２）、 １．２（１２Ｈ％ｄ、Ｊ−６．５） ”Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤｔＣｌｚ　、’Ｈ−ｄｅｃｏｕｐｌｅｄ）　：δ１４９（り 実施例■、２−メトキシ−３−ト１フルオロアセチ、火口」工」し−Ｌニオま」 」うＬと２工之！−ロヘキサンのホスホルアミ　゛イト１ 坐金底 スフィン（３，７ｍ１）を０℃でジクロロメタン（約２０ｍＪ）中のＮ−（３− ヒドロキシプロピル）　−２，２゜２−トリフルオロアセタミド（２，９ｇ、　 ３−アミノ−１−プロパツール及びエチルトリフルオロアセテートからラザラス 及びペンコピツク、Ｊ、Ａ＋ｍｅｒ、Ｃｈｅａ＋、Ｓｏｃ。
Ｖｏｌ、　１０１．４３００−４３１２頁（１９７９）に開示された方法と同様 にして合成）及びジイソプロピルエチルアミン（３，７ｓ＋　１　）の攪拌され た溶液にアルゴン下に滴加した。室温で３時間攪拌後反応混合物をヘキサン（１ ００ｓｊり中に注ぎ攪拌した。混合物を沈澱させ、上澄液を分離し、減圧濃縮し てＮ−（３（Ｎ’。
Ｎ′−ジイソプロピルアミノメトキシホスホニルオキシ）プロピル）−２，２， ２−）リフルオロアセタミドを無色液体として得た（５．２　ｇ）　。
”Ｐ−ＮＭＲ（ＣＨ＊Ｃ１ｔ　％　’Ｈｄｅｃｏｕｐｌｅｄ）　：δ１４９（ｓ ） Ｎ−（２−（Ｎ’、Ｎ’−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィニルオキシ） エチル）−２，２，２−トリフルオロアセタミド（７，７ｇ）を蒸留して（０， ８Ｔｏｒｒにおいて５８〜５９℃）、定量的に２−メトキシ−３−トリフルオロ アセチル−１，３，２−オキサザホスファシクロペンクンを無色液体として得た 。
ＩＲ（膜）：１７０５．１４２０．１２３０．１２００．１１６０．１０２０． ９６５ｃｍ−’ ’ＨＮＭＲ（ＣＤｉＣｌｔ）：δ４．４５　（２Ｈ，ｍ）、３．６５（２Ｈ，ｍ ）、 ３．６０　（３ＨＳｄ　、　Ｊ　＝１２）”Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤｚＣｌｘ、’　Ｈ ｄｅｃｏｕｐｌｅｄ）　：δ１３２（Ｓ）、 ＭＳ：ｍ／ｅ　２１７　（Ｍ”）、１９７．１４８．１３６．１２３．１２０， １０９．９２．７９．７０　（１００）、６９．６２ 土二上−り一肚コリプオ漣ノ１ユ之え 旦二乙り乙烈１ｇ些し」這ｌ」■１二 ２−オキサザホスファシクロペンタンのオリゴヌクレオチドの５′ヒドロキシル への結合はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ−ｓｔｅｍｓ　３８０　Ａ　ＤＮＡシン セサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ−ｏｓｙｓｔｅ＋ｗｓ、フォスターシティ、 カリフォルニア州）或いは同様の機器上で行った。カルーザス等（Ｃａｒｕｔｈ ｅｒｓｅｔ　ａｌ、）　、米国特許４，４５８．０６６号；カルーザス等、米国 特許４，４１５，７３２号；及びカルーザス等「デオキシオリゴヌクレオチド類 の新しい合成方法ＣＮｅ５　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎ ｇ　ＤｅｏｘｙｏｌｉｊＨｏｎｕｃ−Ｉｅｓｔｉｄｅｓ）　Ｊ　、Ｇｅｎｅｔｉ ｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ、　４．１〜１７頁（Ｐｌｅｎｕｗ　Ｐｒ ｅｓｓ、ニューヨーク、１９８２）はＡｐｐ−１ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 　３８０　Ａ　ＤＮＡシンセサイザーにより用いられる化学の詳細な説明を与え ている。従って、これらの文献はそれらの説明に対して準用する。
２−メトキシ−３−トリフルオロアセチル−１，３゜２−オキサザホスファシク ロペンクンは０．５Ｍテトラゾール／アセトニトリル溶液と組合わせて０．２Ｍ アセトニトリル溶液として用い、合成サイクルにおける活性試薬を形成した。通 常のシンセサイザーサイクルは活性試薬の添加時においての４次の様に変成した 。活性試薬は各添加後１時間の待時間で°２度添加した。カップリング収率は約 ９５％であった。チオフェノール／トリエチルアミン及び次いで水酸化アンモニ ウムによる通常の脱保護は５′−アミノエチルホスフェートオリゴヌクレオチド を与えた。活性試薬が０．２Ｍ２−メトキシ−３−トリフルオロアセチル−１， ３，２−オキサザホスファシクロペンクン及び０．１Ｍ４−ジメチルアミノピリ ジンを含有するアセトニトリル溶液よりなる場合にも同様な収率が得られた。こ の場合には、変成活性剤試薬は一度添加され、約１５分間反応させた。
実施例Ｖ、　２−メトキシ−３−トリフルオロアセチル−１，３，２−オキサザ ホスファシクロペン　ンのオリゴヌクレオチドの３′末】ヒづ１１命 結合はオリゴヌクレオチドが一般的にカルーザス等（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ 　ａｌ、）米国特許４，４５８．０６６号明細書に記載された方法に従って３′ 方向に合成された以外は実施例■と実質的に同様にして達成された。
〔大雑把に云って、相違はオリゴヌクレオチドが５′−保護ヌクレオチドの３’ Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトの代りに３′−保護ヌクレオ チドの５’Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトから合成されるこ とである。或いは又、オリゴヌクレオチドはコラナ（Ｋｈｏｒａｎａ）及びイタ クラ（Ｉｔａ−ｋｕｒａ）のホスホトリエステル法を用いて３′方向に合成され る（即ち、Ｋｈｏｒａｎａ　％　５ｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ、　２０３．６１４〜 ６２５頁（１９７９）　；　Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、Ｖｏｌ、　２５０．４５９２〜４６００頁、これらの両文 献は準用する）或いはその他者による修正、例えばレフシンガー（Ｌｅｔｓｉｎ ｇｅｒ）及びマハデラン（Ｍａｈａｄｅｒａｎ）Ｊ、Ａ＋＋＋、Ｃｈｅｍ、Ｓｏ ｃ、Ｖｏｌ、　１　Ｂ　？、ｐ、３５２６〜（１９６５））。いづれの場合にも 結合剤はヌクレオチドの代りに最終添加として結合される。
実施例■、　フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）のアミノエチル ホスフェート主ニブｙｔｔｙｖ＋’ｔｖ’Σ悲板金 チルホルムアミド溶液（１０ｍｇ／ｍ１濃度の２５μ！。
例えばＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ、ジャンクションシティ〜オ レゴン州から市販）を水（２００μり及びＩＭＮ　ａ　ＨＣＯｘ　／　Ｎ　ａ　 ｚ　ＣＯｓ緩衝液、ｐ　Ｈ９，０（２５μｌ）中の５′−アミノエチルホスフェ ートＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴ（０，２００ｕ　ｔａｏ　ｌ　、　Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３ＢＯＡＤＮＡシンセサイザー上で作られた 未精製物質、藏でＴ＝チミジン、Ｃ＝シチジン、Ｇ＝ニブアノシン及びＡ＝アデ ノシン）の溶液に添加した。得られた溶液を室温において暗所で少なくとも６時 間貯蔵した。未結合染料を除去するために反応混合物を平衡化された１　０ｍｊ ！　Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｎ＋１−ｃａｌ ｓの商標）Ｇ−２５（媒体）カラムに水で通過させた。排除された容積内の着色 物質のバンドを集めた。
粗製５′−フルオレフセインアミノエチルホスフエートオリゴヌクレオチドをＨ ＰＬＣ（例、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥＩＩＩｌｅｒＳｅｒｉｅｓ　４、或いは同様の機 器）によりＶｙｄａｃ　Ｃ１８カラム（Ｎｏ、２１８ＴＰ　５４）など上で１０ 〜２０％アセトニトリル１０．１Ｍ）リエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ７ ，０の線形勾配中で精製した。
国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ８６１０１９７０ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ！、Ｃ１ａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｕｂ’ｅｃｔ　ＭａセｔｅｒＩＮ ’！’、　Ｃ１，（４）！　Ｃ０７Ｈ１９／１０；　Ｃ０７Ｅ！　１９／２０Ｕ 、Ｓ、Ｃｒ、：　５４６／２１；　５４８／４１２；　５５８／８１；　５５Ｂ ／１７０；　５５８／１９０１１１＋＠ｌｌｕむ””””””””　ＰＣＴ／Ｉ ＪＳｌ１６１０１９７０ＰＣＩ’１０５８６１０１９フ０ ＰＣ”Ｃ’１０５８６１０１９７０ Ｔｅｌｅｐｈｏｎｅ　Ａｐｐｒｏｖａｌ＝Ｒｅａｓｏｎｓ　ｆｏｒ　ｈｏｌｄｉ ｎｇ　１ａｃｋ　ｏｆ　ｕｎｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｖｅｎｔｉｏｎｓ

Claims (82)

    【特許請求の範囲】
  1. １．下記一般式で表わされる化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中： ｎは２〜４の範囲にあり； Ｒ１はアミノ保護基であり； Ｒ２及びＲ３は別々に各々水素、低級アルキル、低級置換アルキル、低級シクロ アルキル、低級アシル、シアノ、ハロ、或いはニトロを表わし；及びＲ４は１０ 個までの炭素原子を含有するアルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、或 いはシクロアルキルである。
  2. ２．ｎが２〜３の範囲にある請求の範囲第１項記載の化合物。
  3. ３．Ｒ１がそれが結合した窒素原子と共に塩基−不安定なアミド或いはカルバメ ート保護基を表わし、及びＲ４が低級アルキル、電子−引抜きベーター置換エチ ル、電子−引抜き置換フェニルエチル、或いは電子−引抜き置換フェニルを表わ す請求の範囲第２項記載の化合物。
  4. ４．Ｒ４が低級アルキル；ベータートリハロメチル−、ベーターニトロ、ベータ ースルホ、或いはベーターシアノ−置換エチル；ハロ−ニトロ−、スルホー、或 いはシアノ−置換フェニル；或いはハロ−、ニトロー、スルホー、或いはシアノ −置換フェニルエチルを表わす請求の範囲第３項記載の化合物。
  5. ５．Ｒ４がメチル、ベーターシアノエチル、或いは４−ニトロフェニルエチルで ある請求の範囲第４項記載の化合物。
  6. ６．Ｒ４がメチル、或いはベーターシアノエチルである請求の範囲第５項記載の 化合物。
  7. ７．Ｒ１がトリハロアセチル、アセトアセチル、或いはフルオレニルメチルカル バメートである請求の範囲第３項記載の化合物。
  8. ８．Ｒ４が低級アルキル；ベータートリハロメチル−、ベーターニトロ−、ベー ターシアノ−、或いはべータースルホー置換エチル；ハロ−、ニトロ−、シアノ ー、或いはスルホー置換フェニル；或いはハロ−、ニトロ−、シアノ−、或いは スルホー置換フェニルエチルである請求の範囲第７項記載の化合物。
  9. ９．Ｒ４がメチル、ベーターシアノエチル、或いは４−ニトロフェニルエチルで ある請求の範囲第８項記載の化合物。
  10. １０．Ｒ４がメチル、或いはベーターシアノエチルである請求の範囲第９項記載 の化合物。
  11. １１．Ｒ１がトリフルオロアセチル、アセトアセチル、９−（２−スルホ）−フ ルオレニルメチルカルバメート、或いは９−フルオレニルメチルカルバメートで ある請求の範囲第７項記載の化合物。
  12. １２．Ｒ４がメチル、ベーターシアノエチル、或いは４−ニトロフェニルエチル であり、Ｒ２及びＲ３が水素である請求の範囲第１１項記載の化合物。
  13. １３．Ｒ１がトリフルオロアセチル或いはアセトアセチルであり、Ｒ４がメチル 或いはベーターシアノエチルである請求の範囲第１２頁記載の化合物。
  14. １４．Ｒ１が酸−不安定なアミノ保護基である請求の範囲第２項記載の化合物。
  15. １５．Ｒ４が低級アルキル；ベータートリハロメチル−、ベーターニトロ−、ベ ータースルホー、或いはべーターシアノ−置換エチル；ハロ−、ニトロ−、シア ノー、或いはスルホー置換フェニル；或いはハロ−、ニトロ−、シアノ−、或い はスルホー置換フェニルエチルである請求の範囲第１４項記載の化合物。
  16. １６．Ｒ１がトリチル或いは低級アルコキシー置換トリチルである請求の範囲第 １５項記載の化合物。
  17. １７．Ｒ１が４−モノメトキシトリチル或いは４，４′−ジメトキシトリチルで ある請求の範囲第１６項記載の化合物。
  18. １８．Ｒ４がメチル或いはベーターシアノエチルである請求の範囲第１７項記載 の化合物。
  19. １９．２−メトキシ−３−トリフルオロアセチル−１，３，２−オキサザホスフ ァシクロペンタン。
  20. ２０．２−メトキシ−３−トリフルオロアセチル−１，３，２−オキサザホスフ ァシクロペンタン。
  21. ２１．下記一般式で表わされる化合物：▲数式、化学式、表等があります▼ 式中： ｍは１〜３の範囲にあり； ｎは２〜３の範囲にあり； Ｒ１はアミノ保護基であり；及び Ｒ４は１０個までの炭素原子を含有するアルキル、アルケニル、アリール、アラ ルキル、或いはシクロアルキルである。
  22. ２２．ｍが１〜２の範囲にあり； ｎが２であり； Ｒ１がそれが結合した窒素原子と共に塩基−不安定なアミド或いはカルバメート 保護基を表わし；及び Ｒ４が低級アルキル；ベータートリハロメチル−、ベーターシアノ−、ベーター ニトロ−、或いはべータースルホー置換エチル；ハロ−、ニトロ−、シアノー、 或いはスルホー置換フェニル；或いはハロ−、ニトロ−、シアノ−、或いはスル ホー置換フェニルエチルを表わす 請求の範囲第２１項記載の化合物。
  23. ２３．Ｒ１がトリハロアセチル、アセトアセチル或いはフルオレニルメチルカル バメートであり、Ｒ４がメチル、ベーターシアノエチル、或いは４−ニトロフェ ニルエチルである請求の範囲第２２項記載の化合物。
  24. ２４．Ｒ１がトリフルオロアセチル、或いはアセトアセチルであり、Ｒ４がメチ ル或いはベーターシアノエチルである請求の範囲第２３項記載の化合物。
  25. ２５．ｍが１〜２の範囲であり； ｎが２であり； Ｒ１が酸−不安定なアミノ保護基であり、及びＲ４が低級アルキル；ベータート リハロメチル−、ベーターシアノ−、ベーターニトロ−、或いはべータースルホ ー置換エチル；ハロ−、ニトロ−、シアノー、或いはスルホー置換フェニル、或 いはハロ−、ニトロ−、シアノ−、或いはスルホー置換フェニルエチルである 請求の範囲第２１項記載の化合物。
  26. ２６．Ｒ１がトリチル或いは低級アルコキシー置換トリチルであり、Ｒ４がメチ ル、ベーターシアノエチル、或いは４−ニトロフェニルエチルである請求の範囲 第２５項記載の化合物。
  27. ２７．Ｒ１が４，４′−ジメトキシトリチル或いは４−モノメトキシトリチルで あり、Ｒ４がメチル或いはベーターシアノエチルである請求の範囲第２６項記載 の化合物。
  28. ２８．下記一般式で表わされる化合物：▲数式、化学式、表等があります▼ 式中： ｊは２〜１０の範囲にあり； Ｒ１はアミノ保護基であり； Ｒ２及びＲ３は別々に各々水素、低級アルキル、低級置換アルキル、低級シクロ アルキル、低級アシル、シアノ、ハロ、或いはニトロを表わし；Ｒ４は１０個ま での炭素原子を含有するアルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、或いは シクロアルキルであり； Ｒ′及びＲ′′は別々に各々１０個までの炭素原子を含有するアルキル、アリー ル、アラルキル、シクロアルキル、或いはシクロアルキルアルキルを表わし；及 び Ｒ′及びＲ′′は主鎖中に５個までの炭素原子、合計１０個までの炭素原子を含 有するアルキレン鎖を形成し、該鎖の両末端原子価結合はＲ′及びＲ′′が結合 する窒素原子に結合しており、或いはＲ′及びＲ′′は共にそれらが結合する窒 素原子と共に飽和窒素複素環を形成する。
  29. ２９．ｊが２〜４の範囲にある請求の範囲第２８項記載の化合物。
  30. ３０．ｊが２〜３の範囲にある請求の範囲第２９項記載の化合物。
  31. ３１．Ｒ１がそれが結合する窒素原子と共に塩基−不安定なアミド或いはカルバ メート保護基を表わし、及びＲ４が低級アルキル、電子−引抜きベーター置換エ チル、電子−引抜き置換フェニル、或いは電子−引抜き置換フェニルエチルを表 わす請求の範囲第３０項記載の化合物。
  32. ３２．Ｒ４が低級アルキル；ベータートリハロメチル−、ベーターシアノ−、ベ ーターニトロ−、或いはべータースルホー置換エチル；ハロ−、シアノ−、ニト ロー、或いはスルホー置換フェニル；或いはハロ−、シアノ−、ニトロ−、或い はスルホー置換フェニルエチルである請求の範囲第３１項記載の化合物。
  33. ３３．Ｒ４がメチル、４−ニトロフェニルエチル、或いはベーターシアノエチル である請求の範囲第３２項記載の化合物。
  34. ３４．Ｒ１がトリハロアセチル、アセトアセチル、或いはフルオレニルメチルカ ルバメートである請求の範囲第３１項記載の化合物。
  35. ３５．Ｒ４が低級アルキル；ベータートリハロメチル−、ベーターシアノ−、ベ ーターニトロ−、或いはべータースルホー置換エチル；ハロ−、シアノ−、ニト ロー、或いはスルホー置換フェニル；或いはハロ−、シアノ−、ニトロ−、或い はスルホー置換フェニルエチルである請求の範囲第３４項記載の化合物。
  36. ３６．Ｒ４がメチル、４−ニトロフェニルエチル或いはベーターシアノエチルで ある請求の範囲第３５項記載の化合物。
  37. ３７．Ｒ１がトリフルオロアセチル、アセトアセチル、９−（２−スルホ）−フ ルオレニルメチルカルバメート、或いは９−フルオレニルメチルカルバメートで ある請求の範囲第３６項記載の化合物。
  38. ３８．Ｒ′及びＲ′′が別々に立体妨害性低級アルキルであり、Ｒ′及びＲ′′ がそれらが結合する窒素原子と共にモルホリノ、ピロリジノ、或いはピペリジノ を形成する請求の範囲第３７項記載の化合物。
  39. ３９．Ｒ′及びＲ′′が別々にイソプロピルであり、Ｒ′及びＲ′′が共にモル ホリノを表わす請求の範囲第３８項記載の化合物。
  40. ４０．Ｒ２及びＲ３が水素である請求の範囲第３９項記載の化合物。
  41. ４１．Ｒ１が酸−不安定なアミノ保護基である請求の範囲第３０項記載の化合物 。
  42. ４２．Ｒ１がトリチル或いは低級アルコキシー置換トリチルであり； Ｒ４が低級アルキル；ベーターシアノ−、ベータートリハロメチル−、ベーター ニトロ−、或いはべータースルホー置換エチル；ハロ−、シアノ−、ニトロー、 或いはスルホー置換フェニル；或いはハロー、シアノ−、ニトロ−、或いはスル ホー置換フェニルエチルであり； Ｒ′及びＲ′′が別々に立体妨害性低級アルキル基を表わし；及び Ｒ′及びＲ′′がそれらが結合する窒素原子と共にモルホリノ、ピロリジノ、或 いはピペリジノである請求の範囲第４１項記載の化合物。
  43. ４３．Ｒ１が４−モノメトキシトリチル或いは４，４′−ジメトキシトリチルで ある請求の範囲第４２項記載の化合物。
  44. ４４．下記一般式で表わされるシクロアルカン：▲数式、化学式、表等がありま す▼ （該シクロアルカンは保護アミノ置換基及びホスホルアミダイト置換基を表わし 、式中 ｓは０〜８の範囲であり、ｔは０〜８の範囲であり、及びｓ＋ｔは１〜８の範囲 にあり；Ｒ１はアミノ保護基であり； Ｒ４は１０個までの炭素原子を表わすアルキル、アルケニル、アラルキル、或い はシクロアルキルであり； Ｒ′及びＲ′′は別々に立体妨害性低級アルキルであり；及び Ｒ′及びＲ′′がそれらが結合する窒素原子と共にモルホリノ、ピロリジノ、或 いはピペリジノである）。
  45. ４５．ｓが１〜３の範囲にあり、ｔが０〜２の範囲にあり、及び該式により規定 されるシクロアルカンヘの保護アミン及びホスホルアミダイト置換基がシス立体 配置にある請求の範囲第４４項記載の化合物。
  46. ４６．Ｒ１がそれが結合する窒素原子と共に塩基−不安定なアミド或いはカルバ メート保護基を表わし、及びＲ４が低級アルキル、電子−引抜きベーター置換エ チル、電子−引抜き置換フェニル、或いは電子−引抜き置換フェニルエチルを表 わす請求の範囲第４５項記載の化合物。
  47. ４７．Ｒ１がトリハロアセチル、アセトアセチル或いはフルオレニルメチルカル バメートである請求の範囲第４６項記載の化合物。
  48. ４８．ｔが０であり； ｓが１〜２の範囲であり； Ｒ１がトリフルオロアセチル或いはアセトアセチルであり； Ｒ４がメチル、４−ニトロフェニルエチル、或いはベーターシアノエチルであり ； Ｒ′及びＲ′′が別々にイソプロピルであり；及びＲ′及びＲ′′がそれらが結 合した窒素原子と共にモルホリノである 請求の範囲第４７項記載の化合物。
  49. ４９．Ｒ１が酸−不安定なアミノ保護基である請求の範囲第４５項記載の化合物 。
  50. ５０．Ｒ４が低級アルキル、電子−引抜きベーター置換エチル、電子−引抜き置 換フェニル、或いは電子−引抜き置換フェニルエチルであり； Ｒ′及びＲ′′が別々に立体妨害性低級アルキルを表わし；及び Ｒ′及びＲ′′がそれらが結合する窒素原子と共にモルホリノ、ピロリジノ、或 いはピペリジノである請求の範囲第４９項記載の化合物。
  51. ５１．ｔが０であり、ｓが１〜２の範囲であり、及びＲ１がトリチル或いは低級 アルコキシー置換トリチルである請求の範囲第５０項記載の化合物。
  52. ５２．Ｒ１が４−モノメトキシトリチル或いは４，４′−ジメトキシトリチルで ある請求の範囲第５１項記載の化合物。
  53. ５３．下記一般式で表わされる化合物：▲数式、化学式、表等があります▼ 式中： ｉは０或いは１であり； ｊは２〜１０の範囲であり； ｋはｉが０である時には１であり、ｋはｉが１である時には０或いは１であり； Ｒ１はアミノ保護基であり； Ｒ２及びＲ３は別々に各々水素、低級アルキル、低級シクロアルキル、低級アシ ル、シアノ、ハロ或いはニトロを表わし； Ｒ４は１０個までの炭素原子を含有するアルキル、アルケニル、アリール、アラ ルキル、或いはシクロアルキルであり；及び Ｗはオリゴヌクレオチド、重合体支持体、或いは重合体支持体に結合したオリゴ ヌクレオチドを表わす。
  54. ５４．Ｒ２及びＲ３が水素であり、及びＲ４が低級アルキル、電子−引抜きベー ター置換エチル、電子−引抜き置換フェニル、或いは電子−引抜き置換フェニル エチルである請求の範囲第５３項記載の化合物。
  55. ５５．ｊが２〜４の範囲にある請求の範囲第５４項記載の化合物。
  56. ５６．Ｗがオリゴヌクレオチドである請求の範囲第５５項記載の化合物。
  57. ５７．Ｒ１がそれが結合する窒素原子と共に塩基−不安定なカルバメート或いは アミド保護基である請求の範囲第５６項記載の化合物。
  58. ５８．Ｒ１がトリハロアセチル、アセトアセチル、或いはフルオレニルメチルカ ルバメートである請求の範囲第５７項記載の化合物。
  59. ５９．Ｒ１が酸−不安定なアミノ保護基である請求の範囲第５６項記載の化合物 。
  60. ６０．Ｒ１がトリチル或いは低級アルコキシー置換トリチルである請求の範囲第 ５９項記載の化合物。
  61. ６１．Ｗが重合体支持体である請求の範囲第５５項記載の化合物。
  62. ６２．該重合体支持体が架橋ポリサッカライドである請求の範囲第６１項記載の 化合物。
  63. ６３．該架橋ポリサッカライドがデキストラン、セルロース及びアガロースより なる群から選ばれる請求の範囲第６２項記載の化合物。
  64. ６４．下記一般式で表わされる化合物：▲数式、化学式、表等があります▼ 式中： Ｒ１はアミノ保護基であり； ｓは０〜８の範囲にあり、ｔは０〜８の範囲にあり、ｓ＋ｔは１〜８の範囲にあ り； Ｒ４は低級アルキル、電子−引抜きベーター置換エチル、電子−引抜き置換フェ ニル、或いは電子−引抜き置換フェニルエチルであり、ｉは０或いは１であり； ｋはｉが０である時は１であり、或いはｋはｉか１である時には０であり；及び Ｗはオリゴヌクレオチド、重合体支持体、或いは重合体支持体に結合したオリゴ ヌクレオチドである。
  65. ６５．ｔが０〜２の範囲にあり、ｓが１〜３の範囲にある請求の範囲第６４項記 載の化合物。
  66. ６６．Ｗがオリゴヌクレオチドである請求の範囲第６５項記載の化合物。
  67. ６７．Ｒ１がそれが結合する窒素原子と共に塩基−不安定なアミド或いはカルバ メート保護基である請求の範囲第６６項記載の化合物。
  68. ６８．Ｒ１がトリハロアセチル、アセトアセチル、或いはフルオレニルメチルカ ルバメートである請求の範囲第６７項記載の化合物。
  69. ６９．ｔが０であり、ｓが１〜２の範囲にある請求の範囲第６８項記載の化合物 。
  70. ７０．ｔが０〜２の範囲にあり、ｓが１〜３の範囲にあり、及びＲ１が酸−不安 定なアミノ保護基である請求の範囲第６６項記載の化合物。
  71. ７１．Ｒ１がトリチル或いは低級アルコキシー置換トリチルである請求の範囲第 ７０項記載の化合物。
  72. ７２．Ｗが重合体支持体である請求の範囲第６５項記載の化合物。
  73. ７３．該重合体支持体が架橋ポリサッカライドである請求の範囲第７２項記載の 化合物。
  74. ７４．２−低級アルコキシ−３−保護−１，３，２−オキサザホスファシクロア ルカン類の合成方法であって、該方法が、 ホスホルアミダイト前駆体を加熱して２−低級アルコキシ−３−保護−１，３， ２−オキサザホスファシクロアルカンを含有する反応混合物を形成する工程；及 び 反応混合物から２−低級アルコキシ−３−保護−１，３，２−オキサザホスファ シクロアルカンを分離する工程 を含んでなることを特徴とする方法。
  75. ７５．更に、 ハロ−置換−Ｎ，Ｎ−ジ−置換−低級アルコキシホスフィンをアミノ−保護アル コールアミンと非プロトン溶媒中において反応させて該ホスホルアミダイト前駆 体を含有する第一の反応混合物を形成する工程；及び 該ホスホルアミダイト前駆体を第一の反応混合物から分離する工程 を含む請求の範囲第７４項記載の方法。
  76. ７６．該加熱工程が約２５〜２５０℃の範囲の温度に加熱することを含む請求の 範囲第７５項記載の方法。
  77. ７７．該加熱工程が約２５〜１５０℃の範囲の温度まで加熱することを含む請求 の範囲第７６項記載の方法。
  78. ７８．該加熱工程が約５０〜１００℃の範囲の温度まで加熱することを含む請求 の範囲第７７項記載の方法。
  79. ７９．該２−低級アルコキシ−３−保養−１，３，２−オキサザホスファシクロ アルカンを分離する該工程が蒸留を含む請求の範囲第７５項記載の方法。
  80. ８０．該２−低級アルコキシ−３−保護−１，３，２−オキサザホスファシクロ アルカンが２−メトキシ−３−トリフルオロアセチル−１，３，２−オキサザホ スファシクロペンタン或いは２−メトキシ−３−トリフルオロアセチル−１，３ ，２−オキサザホスファシクロヘキサンである請求の範囲第７９項記載の方法。
  81. ８１．オリゴヌクレオチドを標識化する方法であって、２−低級アルコキシ−３ −保護−１，３，２−オキサザホスファシクロアルカン結合剤をオリゴヌクレオ チドの未保護ヒドロキシルと反応させてリンカー−オリゴヌクレオチド複合体を 形成する工程であって、２−低級アルコキシ−３−保護−１，３，２−オキサザ ホスファシクロアルカン結合剤が保護アミンを有する工程； 保護アミンを脱保護する工程；及び 標識を脱保護アミンと反応させる工程 を含んでなることを特徴とする方法。
  82. ８２．更に該オリゴヌクレオチドを固相合成操作により合成する工程を含み、及 び２−低級アルコキシ−３−保護−１，３，２−オキサザホスファシクロアルカ ンを反応させる該工程が該固相合成操作における最終付加工程として達成される 請求の範囲第８１項記載の方法。
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