DE4239531A1

DE4239531A1 - Reagenz zur Kupplung verschiedener Substanzen an Nukleinsäuren sowie Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE4239531A1
Application number: DE19924239531
Authority: DE
Inventors: Gabor Dr Igloi
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-11-25
Filing date: 1992-11-25
Publication date: 1994-05-26
Also published as: WO1994012518A2; WO1994012518A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Ribooligonukleotid, das heißt ein Reagenz zur Kupplung mindestens eines Moleküls an Nukleinsäuren, insbesondere Ribonukleinsäuren (RNA), ein Verfahren zu dessen Herstellung, dessen Verwendung sowie ein auf diesem modifizierten Ribooligonukleotid basierendes Reagenzkit. Bei diesem Kupplungsreagenz handelt es sich um ein spezifisch modifiziertes Ribooligonukleotid, das im Prinzip aus beliebig vielen, mindestens aber aus einem Ribonukleotid besteht. Mit Hilfe dieses Kupplungsreagenz ist es möglich, mittels enzymatischer Methoden verschiedenste Markierungen, insbesondere Fluoreszenzmarkierungen aber auch Digoxigenin- oder Biotinderivate, oder auch andere Moleküle, wie z. B. Proteine an Nukleinsäuren, insbesondere Ribonukleinsäuren (RNA), zu kuppeln.

Die Kupplung unterschiedlichster Moleküle an Nukleinsäuren ist ein weitverbreitetes Verfahren in der Molekularbiologie. Besonders zur Markierung von Nukleinsäuren sind derartige Verfahren von großer Bedeutung. Sie werden eingesetzt für Protein- Nukleinsäure-Wechselwirkungsstudien, Nukleinsäure-Strukturuntersuchungen, zur DNA- und RNA-Sequenzierung oder, für die medizinische Diagnostik von enormer Bedeutung, bei Hybridisierungsverfahren, insbesondere in-situ- Hybridisierungsverfahren. Die Markierung erfolgte bisher hauptsächlich auf radioaktiver Basis mit Hilfe von isotop-substituierten Nukleotiden und entsprechenden Enzymen. Da radioaktiv markierte Stoffe aber recht teuer sind, der Umgang mit ihnen nicht ungefährlich ist und auch die Entsorgung des radioaktiven Abfalls aus ökologischen Erwägungen heraus problematisch ist, gibt es seit einiger Zeit Bemühungen, alternative (d. h. nicht radioaktive) Markierungsmöglichkeiten einzusetzen.

Die wohl am häufigsten eingesetzte Markierungstechnik für RNA bedient sich eines 3′,5′-Bisphosphats, normalerweise [5′-³²P]pCp(Cytidin-3′,5′-Bisphosphat), aber pCp kann auch mit anderen Isotopen als ³²P markiert werden. Unter Katalyse einer RNA-Ligase wird dieses pCp an das 3′-Ende einer RNA gekuppelt. Das Produkt dieser Reaktion ist ein RNA-Molekül, das um ein Nukleotid verlängert ist und eine radioaktive Markierung am 3′-Terminus trägt. Diese Methode erlaubt ausschließlich die radioaktive Markierung von RNA.

In der Zeitschrift "Nucleic Acids Research" 12 (4) 1791-1810 (1984) ist eine enzymatische Methode zur Fluoreszenzmarkierung von tRNA und Oligodeoxynukleotiden beschrieben. Als Kupplungsreagenz wird ein modifiziertes pdCp verwendet, bei dem ein Sauerstoffatom der 3′-Phosphatgruppe gegen ein Schwefelatom ausgetauscht ist, so daß ein Molekül der Form pdCp(S) entsteht. An dieses Schwefelatom wird ein fluoreszentes Molekül, ein Biman, gebunden. Mittels T4 RNA-Ligase wird dieses Molekül dann an das 3′-Ende einer tRNA, sowie an verschiedene synthetische Oligodeoxynukleotide, die als Modelle für Deoxynukleinsäuren verwendet werden, gebunden. Nachteilig dabei ist, daß man bei der Auswahl des Fluoreszenzmarkers sehr beschränkt ist, da sich nur wenige der gebräuchlichen Marker an den Schwefel binden lassen.

Im "Journal of Histochemistry and Cytochemistry" 29, 227-237 und 238-246 (1981), ist eine Methode beschrieben, mit der sich durch Periodatoxidation der benachbarten 2′,3′-Hydroxylgruppen eines endständigen Ribosids geeignete Markierungen an die entstehenden Aldehydgruppen binden lassen. Nachteilig an dieser Methode sind die auftretenden Nebenreaktionen. So geht ein Großteil des Produktes durch die zwangsläufig eintretende β-Eliminierung verloren. Lediglich bei Verwendung von Hydraziden gelangt man zu befriedigenden Ergebnissen, da in diesem Fall keine β- Eliminierung eintritt. Ein weiterer Nachteil ist, daß die als Donor verwendeten Substanzen einer recht aufwendigen chemischen Vorbehandlung unterzogen werden müssen. Darüberhinaus haben derartige chemische Markierungsmethoden gegenüber enzymatischen Verfahren ganz allgemein den großen Nachteil, weniger spezifisch zu sein. Durch die hohe Spezifität von Enzymen werden Nebenreaktionen von vornherein weitestgehend ausgeschlossen.

Einen Fortschritt bringt bereits die von R.W. Richardson und R.I. Gumport in der Zeitschrift "Nucleic Acids Research" 11 (18), 6167-6184 (1983) beschriebene weitere Markierungsmethode für RNA. Es wird vorgeschlagen, β-substituierte ADP-Derivate der Form Ado-5′PP-X dazu zu verwenden, unter Katalyse des Enzyms T4 RNA- Ligase den Molekülteil P-X unter Bildung einer 3′-Phosphodiester-Bindung an das 3′-Ende einer RNA zu binden. X kann dabei z. B. ein Fluoreszenzmarker wie Fluoreszein oder Rhodamin sein. Ein Nachteil dieser Methode ist darin zu sehen, daß die Synthese der ADP-Derivate relativ kompliziert und aufwendig ist. Darüberhinaus ist auch bei dieser Methode die Anzahl der Markersubstanzen, die verwendet werden können, sehr eingeschränkt.

Ein weiterer Fortschritt ist in der Methode von Zuckermann et al. (vgl. Zeitschrift "Nucleic Acids Research" 15 (13), 5305-5321 (1987)) zu sehen. Die Autoren beschreiben ein Verfahren zur Synthese von DNA-Oligomeren mit einer freien 3′- Thiolgruppe, die mit geeigneten Proben markiert werden können. Die SH-Gruppe, die zur Bindung des Markers vorgesehen ist, fungiert während der Synthese als Bindemolekül an das Säulenmaterial. Dies bedingt aber beispielsweise, daß nur ein Marker an das Oligonukleotid gebunden werden kann. Ein weiterer Nachteil ist, daß eine freie SH-Gruppe relativ empfindlich ist, so daß eine längere Aufbewahrung des unmarkierten Oligonukleotids kritisch ist.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein spezielles Ribooligonukleotid, d. h. ein Reagenz zur Kupplung mindestens eines Moleküls, allgemeiner betrachtet verschiedener Substanzen, insbesondere eines Fluoreszenzmarkers, eines Biotinderivates, eines Digoxigeninderivates oder eines Proteins an Nukleinsäuren, insbesondere Ribonukleinsäuren (RNA), zur Verfügung zu stellen, das die genannten Nachteile vermeidet, dessen Verwendung also auf enzymatischen Umsetzungen beruht und dadurch eine hohe Spezifität besitzt, die einfach durchführbar ist und die es erlaubt, viele verschiedene Substanzen an Nukleinsäuren zu kuppeln. Weiterhin ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, spezifische Verwendungsmöglichkeiten für das modifizierte Ribooligonukleotid, sowie ein Reagenzkit auf der Basis dieses Ribooligonukleotids zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß ein Kupplungsreagenz mit einer Struktur gemäß Formel (I) nach Anspruch 1 oder (II) nach Anspruch 2 oder (III) nach Anspruch 3 zur Verfügung gestellt wird. An dieses Kupplungsreagenz wird das Molekül R₃ (oder die Moleküle), das an die Nukleinsäure gekuppelt werden soll, gebunden und mittels eines einfachen Verfahrens mit der zu markierenden Nukleinsäure gekuppelt. Das Molekül (R₃) das mittels des Kupplungsreagenz an eine Nukleinsäure gekuppelt wird, ist bevorzugt ein Fluoreszenzmarker, z. B. ein Fluoreszeinderivat, kann aber beispielsweise auch ein Digoxigenin- oder Biotinderivat oder ein Protein sein. Unabhängig von der Natur dieses Moleküls R₃ wird es im folgenden der Einfachheit halber als Marker bezeichnet. Grundsätzlich ist auch die Einführung eines radioaktiven Isotops möglich, wobei im Gegensatz zu dem herkömmlicherweise für radioaktive Markierungen benutzten pCp mit dem erfindungsgemäßen Kupplungsreagenz auch "exotische" Isotope , wie z. B. ¹²⁵J eingeführt werden können.

Die durch das erfindungsgemäße Kupplungsreagenz nunmehr gute Verfügbarkeit von Fluoreszein-markierter RNA ermöglicht es auch, RNA-Sequenzanalysen in Analogie zu DNA-Sequenzanalysen mit Hilfe von DNA-Sequenzanalysegeräten automatisch durchzuführen. Die automatische DNA-Sequenzanalyse ist ausführlich beschrieben bei Ansorge et al., Zeitschrift "Nucleic Acids Res". 16, 2203 (1988).

Die Option, neben Markersubstanzen auch Proteine mit Hilfe von modifizierten Ribooligonukleotiden gezielt an Nukleinsäuren kuppeln zu können, eröffnet ganz neue Möglichkeiten in der Manipulation von Nukleinsäuren. Durch Kupplung von entsprechenden Nukleasen an Ribooligonukleotide, die als Sonde eingesetzt werden, ist es möglich, Nukleinsäuren an genau definierter Stelle zu spalten. Daß hierfür großer Bedarf besteht, wird von U. Englisch und D.H. Gauss explizit betont: "An der Möglichkeit zur künstlichen ortsspezifischen Spaltung von immer wieder anderen RNA- oder DNA-Einzelsträngen besteht Bedarf." [Chemisch modifizierte Oligonukleotide als Sonden und Agentien; Zeitschrift "Angewandte Chemie" 103 (6), 629-739 (1991)]. Besonders vorteilhaft ist die Kupplung eines DNA-spaltenden Enzyms an ein Ribooligonukleotid, da auf diese Weise ausgeschlossen ist, daß das Enzym das als Sonde fungierende Oligonukleotid, an das es gekoppelt ist, zerstört.

Weitere Spezifikationen im Hinblick auf die erfindungsgemäße RNA sind Gegenstand der Unteransprüche.

Mit anderen als im Hauptanspruch gebrauchten Worten besteht das erfindungsgemäße Kupplungsreagenz aus einem Ribooligonukleotid beliebiger Länge, bei dem an eine oder mehrere 3′-Phosphatgruppen direkt oder über eine Spacergruppe eine reaktive Gruppe, insbesondere eine Aminogruppe gebunden ist. Auch eine Sulfhydrylgruppe ist als reaktive Gruppe einsetzbar, sie ist allerdings empfindlicher und reagiert nicht mit so vielen Substituenten wie eine Aminogruppe. Mit der minimalen Anzahl an Nukleotiden, mit der es erfindungsgemäß funktionsfähig ist, besitzt das Kupplungsreagenz z. B. die Form gemäß Anspruch 2:

wobei jeweils

R₁ eine Phosphatgruppe
R₂ eine Nukleobase, insbesondere Cytidin
R₃ das zu kuppelnde Molekül und
R₄ ein Wasserstoffatom bedeuten,
und wobei m = 1, n₁ = 1 und n₂ = 1.

Bei Verwendung der Basen Adenin, Guanin oder Uracil erhält man ebenfalls ein erfindungsgemäß funktionierendes Kupplungsreagenz, die Umsatzraten der Kupplungsreaktion liegen allerdings bis zu 50% niedriger als bei Verwendung von Cytidin. Das Ribooligonukleotid kann an seiner 3′Phosphatgruppe mit weiteren Nukleotiden verlängert werden, die ebenfalls substituiert sein können.

In einer weiteren Ausführungsform enthält die als Spacer verwendete Alkylkette keine Phosphatgruppe und damit auch keinen Rest R₄. An das C-Atom der Alkylkette, an das nach den Ansprüchen 1 und 2 eine Phosphatgruppe gebunden ist, ist dann statt dessen ein Wasserstoffatom gebunden. Eine Verlängerung des Kupplungsreagenz auf die oben beschriebene Art ist dann nicht möglich und das Kupplungsreagenz verfügt nur über ein einziges Markermolekül R₃.

Einer der Vorteile der Verwendung eines modifizierten Ribooligonukleotids als Kupplungsreagenz liegt darin, daß seine Kupplung an das 3′-Ende einer Nukleinsäure enzymatisch erfolgen kann, unter Verwendung einer RNA-Ligase, insbesondere der T4-RNA-Ligase. Die Mindestanforderungen dieses Enzyms an sein Substrat sind ein 3′,5′-Ribonukleosid-Bisphosphat. Ribooligonukleotide, die an ihrem 5′-Ende eine solche Gruppe enthalten, werden von der RNA-Ligase an die 3′ OH-Gruppe einer beliebigen Ribonukleinsäure gebunden. Auch an eine DNA kann das Reagenz gekuppelt werden, es muß hierzu nur vor der Kupplung ein Ribonukleotid an das 3′-Ende der DNA angehängt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die den Marker bindende reaktive Gruppe über einen Phosphat enthaltenden Spacer an die 3′-Phosphatgruppe des Kupplungsreagenz gebunden. Der Spacer ist eine Alkylkette mit einer Länge zwischen 1 und 30 C-Atomen, an den eine Phosphatgruppe gebunden sein kann. An dieser Phosphatgruppe des Spacers kann das Kupplungsreagenz weiter verlängert werden: Entweder, indem ein weiteres Nukleosid, an das wiederum ein Marker gebunden sein kann, angehängt wird (siehe Formel I), oder indem direkt weitere Markermoleküle mit Spacer eingeführt werden (siehe Formel II).

Da die Länge des Ribooligonukleotids ganz nach Bedarf gewählt werden kann und prinzipiell die Möglichkeit besteht, Marker beliebig an mehrere oder alle Phosphatgruppen mit Ausnahme der 5′terminalen Phosphatgruppe zu binden, steht mit dem erfindungsgemäßen Kupplungsreagenz ein Reagenz zur Verfügung, mit dem Nukleinsäuren in einem Arbeitsschritt mit mehreren Markern gekuppelt werden können, wodurch beispielsweise ein stärkeres Signal erhalten wird. Insbesondere im Zusammenhang mit in situ Hybridisierungsverfahren ist dies ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Kupplungsreagenz, da es bei konventionellen Markierungsmethoden sehr aufwendig ist, zu einer Signalverstärkung zu gelangen.

Die Synthese des Kupplungsreagenz erfolgt analog zur automatischen DNA- Synthese. Es ist erfindungswesentlich, daß das Kupplungsreagenz automatisch mit Hilfe von herkömmlichen DNA-Synthesegeräten synthetisiert werden kann, wobei der Synthesezyclus in geeigneter Weise auf die Belange der RNA-Synthese modifiziert ist.

Das heißt, es werden Ribonukleotide anstatt Desoxyribonukleotiden als Bausteine verwendet und statt Thymidin wird Uracil eingesetzt. Weiterhin wird die 2′-OH- Gruppe durch eine Schutzgruppe, beispielsweise eine Silylgruppe während der Reaktion geschützt. Schließlich beträgt die Reaktionszeit bei der RNA-Synthese ca. 10 min gegenüber ca. 3 min bei der DNA-Synthese.

Das Ribooligonukleotid wird nach der Phosphoramidit-Methode, die im Einzelnen beschrieben ist bei T. Atkinson und M. Smith (in: Oligonucleotide Synthesis; A Practical Approach; M. J. Gait (Hrsg.) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1984) an der Festphase von 3′ nach 5′ aufgebaut.

Die Einführung einer reaktiven Aminogruppe erfolgt bevorzugt mit Hilfe eines speziellen Aminierungsreagenz der Form (1-Dimethoxytrityloxy-3- fluorenylmethoxycarbonylamino-propan-2-yl)-(2-cyanoethyl)-(N,N-diiso-propyl)- phosphoramidit (z. B. bei der Firma Glen Research [Sterling, Vancouver, Kanada] als 5′-Branched Modifier C3 erhältlich). Bei Verwendung dieses Aminierungsreagenz resultiert ein Kupplungsreagenz mit einem 3′-terminalen Nukleosid. Dieses kann weiter modifiziert werden, beispielsweise, indem die 2′- und 3′-OH-Gruppen zu Aldehydgruppen oxidiert werden. Diese Aldehydgruppen können mit Aminogruppen unter Ausbildung einer Schiff′schen Base reagieren. Läßt man die Aldehydgruppen mit entsprechenden Aminogruppen von Enzymen reagieren, erreicht man eine Bindung des Enzyms an das Oligonukleotid.

Erfolgt keine Modifikation des endständigen Nukleosids, besteht die Gefahr, daß die 3′-OH-Gruppe dieses Nukleosids mit der 5′-Phosphatgruppe gleichartiger Moleküle reagiert. Um eine solche Selbstligierung des erfindungsgemäßen Ribooligonukleotids zu vermeiden, wodurch ein kleiner Prozentsatz des Kupplungsreagenz inaktiviert werden kann, kann das Nukleosid am 3′-Ende mittels ß-Eliminierung abgespalten und dadurch die Selbstligierung unterbunden werden.

Alternativ kann die reaktive Aminogruppe auch mit einem Aminierungsreagenz der Form (1-Dimethoxytrityloxy-3-fluorenylmethoxycarbonylamino-propan-2-succi-noyl) aminoalkan (z. B. bei der Firma Glen Research als 3′-Amino-Modifier-CPG erhältlich) eingeführt werden, wobei direkt eine 3′-Phosphatgruppe gemäß Formel (I) oder (II) resultiert. In diesem Fall spart man sich die β-Eliminierung, wenn man kein endständiges Nukleosid wünscht.

Mit der eingeführten Aminogruppe werden dann verschiedene Substanzen (R₃), die leicht mit einer Aminogruppe reagieren, wie Fluoreszenzmarker, z. B. ein Fluoreszeinderivat, oder Digoxigenin- oder Biotinderivate oder auch Proteine, insbesondere Nukleasen, verknüpft. Aktivierte Substituenten können vorliegen als Isothiocyanate, Isocyanate, als N-Hydroxysuccinimidester, p-Nitrophenylester, Sulfonsäurechloride, Triazinchloride oder als Säureazide.

Bevorzugt werden folgende Substanzen als Marker verwendet:
Fluoreszein-Succinimidester, NBD-F (4-fluoro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3diazol), Tetramethylrhodamin5(6)isothiocyanat, Texas Rot (Sulphorhodamin-101- Säurechlorid), Biotin-Succinimidester, Digoxygenin-Succinimidester.

Neben derartigen Markersubstanzen können auch Proteine, insbesondere Nukleasen an das Kupplungsreagenz gebunden werden. Dieses "Crosslinking" eines Enzyms an ein Oligonukleotid kann neben der oben bereits beschriebenen Methode prinzipiell auf folgenden Wegen erfolgen: Zum einen kann durch Einbau eines Cysteinrestes eine freie Sulfhydrylgruppe in das Enzym eingebaut werden (siehe R. Zuckermann et al., Zeitschrift "J. Am. Chem. Soc." 110, 1614 (1988)), die dann mit der Sulfhydrylgruppe eines sogenannten Heteroquervernetzungsreagenz (z. B. N- succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionat) unter Ausbildung einer Disulfidbrücke reagiert. Der Succinimidylrest des Heteroquervernetzungsreagenz reagiert mit der Aminogruppe des Kupplungsreagenz, wodurch das Enzym über das Vernetzungsreagenz an das Kupplungsreagenz gebunden wird. Eine weitere Möglichkeit, eine freie SH-Gruppe in das entsprechende Enzym einzuführen, ist die, eine Aminogruppe chemisch in eine SH-Gruppe umzuwandeln (siehe Carlsson et al., Zeitschrift "Biochem. J". 173, 723-737 (1978)). Die eigentliche Quervernetzung erfolgt wie oben beschrieben. Eine dritte Möglichkeit der Bindung eines Enzyms an das Kupplungsreagenz besteht in der Verwendung eines Homoquervernetzungsreagenz, das im Gegensatz zum oben genannten Heteroquervernetzungsreagenz zwei Succinimidylreste besitzt. Es reagiert sowohl mit der Aminogruppe des Kupplungsreagenz als auch mit einer Aminogruppe des Enzyms.

Die Einführung einer Phosphatgruppe am 5′-Terminus des Ribooligonukleotids, die für die Reaktion des Ribooligonukleotids mit der zu markierenden Nukleinsäure nötig ist, erfolgt bevorzugt mittels eines Phosphorylierungsreagenz der Form: 2-[2- (4,4′-Dimethoxy-trityloxy)ethylsulfonyl]ethyl-(2-cyanoethyl)-(N,N-di-isopropyl) phosphoramidit (z. B. bei der Firma Glen Research als Chemical Phosphorylation Reagent erhältlich). Eine solche 5′-Phosphorylierung ist auch mit anderen Methoden möglich, z. B. mittels ATP und dem Enzym Polynukleotidkinase. Diese Methode ist aber insbesondere im größeren Maßstab äußerst umständlich und langwierig.

Unter Verwendung der entsprechenden aktivierten Nukleoside sowie der oben beschriebenen Aminierungs- und Phosphorylierungsreagenzien kann das erfindungsgemäße Kupplungsreagenz mit Hilfe konventioneller DNA-Synthesegeräte automatisch synthetisiert werden. Im folgenden wird als Ausführungsbeispiel die Synthese eines Kupplungsreagenz der Form 5′pCpCp-Fluoreszein näher erläutert.

a) Synthese des Zwischenproduktes 5′pCpCp(Amino)A

Mit Hilfe des DNA-Synthesegerätes 394 der Firma Applied Biosystems [Foster City, Kalifornien, USA] wurde mittels der Phosphoramidit-Methode zunächst ein modifiziertes RNA-Triplett hergestellt aus folgenden Bausteinen (Richtung: 5′-3′):

5′ 1.) Phosphorylierungsreagenz (Chemical Phosphorylation Reagent)
   2.) RiboC-Phosphoramidit
   3.) RiboC-Phosphoramidit
   4.) Aminierungsreagenz (5′-Branched Modifier C3)
3′ 5.) RiboA-CPG (control pore glass).

Die Reagenzien wurden bei der Fa. Glen Research bezogen, sind aber auch bei anderen Firmen erhältlich.

Für die Synthese von ca. 1 µmol pCC(Amino)A werden 30 mg RiboA-CPG in eine Säule gefüllt und diese danach abgedichtet. Der Synthesezyklus der RNA wird gestartet. Die Einstellung am DNA-Synthesegerät ist: Tr off, auto. Das bedeutet, daß die Schutzgruppen abgespalten sowie das Produkt vom Träger abgespalten wird. Hierzu wird nach Beendigung der Reaktion die Säule gespült mit Ethanol:NH₃/1 : 3. Inkubation der erhaltenen Lösung für 12 h bei 55°C vervollständigt die Abspaltung der Schutzgruppen.

Das so erhaltene Produkt wird lyophilisiert und anschließend wieder aufgenommen in 0,2 ml 1 M Tetraethylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran. Anschließend wird für 6 h bei Raumtemperatur inkubiert, wodurch die Schutzgruppen an der Ribose abgespalten werden.

Dieser Lösung wird nun 0,3 ml 1 M Ammoniumacetat-Lösung, pH 5,3, zugesetzt und mit 5 ml Wasser verdünnt. Diese Lösung wird zur Aufreinigung des Ribooligonukleotids mittels Ionenaustauschchromatographie auf eine mit 50 mM Triethylammoniumacetat (TEAA) äquilibrierte Sephadex A25 Ionenaustauschsäule (Pharmacia [Uppsala, Schweden]) mit einem Volumen von 1 ml gegeben. Diese Säule wird anschließend zunächst mit 0,2 M TEAA, danach mit 0,5 M TEAA gewaschen und das Produkt anschließend mit 2 M TEAA eluiert. Das so erhaltene Produkt wird lyophylisiert, in 70% Ethanol aufgenommen und wiederum lyophylisiert. Schließlich wird das modifizierte Ribooligonukleotid in 100 µl Wasser gelöst und seine Konzentration ermittelt durch spektralphotometrische Bestimmung der Absorption bei 260 nm (1 OD = 30 µg/ml). Die Substanz läßt sich bei -20°C oder lyophilisiert für längere Zeit ohne Verlust aufbewahren.

b) Markierung des Ribooligonukleotids mit Fluoreszein

Das Inkubationsmedium enthält:

- 0,1 µmol des modifizierten Ribooligonukleotids in 1 ml Wasser
- 0,1 ml 1 M Natriurnhydrogencarbonat, pH 8,8
- 3 mg Fluoreszein-Succinimidester (FLUOS, Fa. Boehringer [Mannheim, BRD]) in 150 µl Dimethylformamid.

Diese Mischung wird für 18 h bei Raumtemperatur im dunkeln inkubiert. Nach 18 h werden 0,2 ml 1 M Arnmoniumacetat-Lösung, pH 5,3, zugegeben und diese Lösung dann lyophylisiert. Freies Fluoreszein wird vom getrockneten Produkt durch viermaliges Extrahieren mit je 1 ml Ethanol entfernt. Anschließend wird das Produkt in 100 µl 2 M TEAA, pH 7, aufgenommen und wiederum lyophylisiert. Die Reinigung erfolgt anschließend chromatographisch, wie unter a) beschrieben.

c) Entfernen des 3′-terminalen Adenosinrestes durch Periodatoxidation

Um das 3′-Ende vor Selbstligation zu schützen, wird der 3′-terminale Adenosinrest durch Periodatoxidation entfernt.

Das Inkubationsmedium enthält:

- 50 µl markiertes Ribooligonukleotid (aus b)
- 1 µl 3 M Natriumacetat, pH 4,8
- 50 µl 50 mM Natriumperiodat.

Die Inkubation erfolgt bei 0°C für 1 h. Durch Zugabe von 50 µl Ethylenglycol und weitere Inkubation für 30 min bei 0°C wird überschüssiges Periodat zerstört. Durch anschließende Zugabe von 150 µl 0,5 M Lysin (oder beliebige primäre Amine), pH 9,3 und Inkubation für 4 h bei Raumtemperatur wird die Ribose zusammen mit der daranhängenden Adeninbase mittels β-Eliminierung entfernt. Die Reaktionslösung wird nun mit Wasser auf 1,5 ml verdünnt und, wie unter a) beschrieben, auf eine Sephadex A 25 Säule aufgegeben, gewaschen, eluiert, das Eluat lyophylisiert, in Wasser gelöst und seine Konzentration bestimmt.

Das Kupplungsreagenz hat jetzt die Form gemäß Formel II (Anspruch 2), wobei R₁ 3′,5′-CytidyIbisphosphat, R₂ Cytidin, R₃ eine Fluoresceinylgruppe und R₄ ein Wasserstoffatom sind und wobei n₁ = 1, n₂ = 1 und m = 1 sind.

In dieser Form wird das Kupplungsreagenz zur Kupplung an Nukleinsäuren verwendet.

Kupplung des Kupplungsreagenz an Nukleinsäuren

Ein Enzym, und zwar eine RNA-Ligase, bevorzugt die T4 RNA-Ligase, katalysiert die Bindung zwischen dem 5′-Phosphatende des Kupplungsreagenz und dem 3′-OH- Ende der zu modifizierenden Nukleinsäure. Die Reaktion wird durchgeführt in einem speziellen RNA Ligase-Puffer, der bei einem leicht alkalischen pH-Wert Magnesiumchlorid, ein organisches Lösungsmittel, ATP, Kupplungsreagenz, die zu modifizierende Nukleinsäure sowie die RNA Ligase enthält. Diese Mischung wird bei Temperaturen zwischen 0 und 10°C für 4 bis 24 h inkubiert und die modifizierte Nukleinsäure anschließend mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt.

Als Beispiel ist im folgenden die Markierung einer RNA mit Fluoreszein mittels des Kupplungsreagenzes ausgeführt, dessen Synthese im obigen Beispiel beschrieben wurde.

Das Inkubationsmedium enthält im Gesamtvolumen von 30 µl:

- 15 µl doppelt konzentrierter RNA-Ligase-Puffer (100 mM Hepes/KOH, pH 7,8; 40 mM Magnesiumchlorid; 7 mM Dithiothreitol; 20 µg/ml Rinderserumalbumin; 20% Dimethylsulfoxid)
- 3 µl 1 mM ATP
- 1 µl 180 µM Kupplungsreagenz (an das Fluoreszein gebunden ist)
- 5 µg RNA (oder auch weniger)
- 20 U T4-RNA-Ligase.

Diese Mischung wird bei 4°C für 8 h inkubiert. Die markierte RNA wird danach durch Phenolextraktion und anschließender Fällung mit Ethanol gewonnen.

Verwendung des Kupplungsreagenz

Eine Hauptanwendung des erfindungsgemäßen Kupplungsreagenz ist die Kupplung von Markierungssubstanzen (R₃), insbesondere Fluoreszenzmarkern, an Nukleinsäuren. Die Unkompliziertheit des Verfahrens, Markersubstanzen an das Kupplungsreagenz sowie das Kupplungsreagenz an eine Nukleinsäure zu binden, ermöglicht in der Praxis, dem Anwender beispielsweise in Form eines Kits das noch unmodifizierte Kupplungsreagenz und separat diverse Markersubstanzen zur Verfügung zu stellen. Der Anwender kann sich dann je nach Bedarf das Kupplungsreagenz leicht selbst in der richtigen Menge und der benötigten Modifikation herstellen. Da es sich bei der Kupplung des modifizierten Kupplungsreagenz an die zu markierende Nukleinsäure um ein enzymatisches Verfahren handelt, ist dem Anwender eine einfache Möglichkeit gegeben, sehr schonend und mit hoher Spezifität beliebige Nukleinsäuren mit Markern seiner Wahl zu kuppeln.

Claims

1. Ribooligonukleotid zur Kupplung mindestens eines Moleküls, beispielsweise eines Fluoreszenzmarkers oder eines Biotinderivates oder eines Digoxigeninderivates oder eines Proteins, an Nukleinsäuren, insbesondere Ribonukleinsäuren (RNA), gekennzeichnet durch folgende Strukturformel (I): wobei jeweils
R₁ eine Hydroxylgruppe oder Phosphatgruppe oder mindestens ein 3′,5′-Nukleotidbisphosphat,
R₂ eine Nukleobase,
R₃ das zu kuppelnde Molekül und
R₄ ein Wasserstoffatom oder ein Nukleosid bedeuten,
und wobei
m eine Zahl zwischen 1 und 100, insbesondere zwischen 2 und 5, und
n₁ entweder 0 oder eine Zahl zwischen I und 30, insbesondere 1, und
n₂ entweder 0 oder eine Zahl zwischen 1 und 30, insbesondere 1, sind.

2. Ribooligonukleotid zur Kupplung mindestens eines Moleküls, beispielsweise eines Fluoreszenzmarkers oder eines Biotinderivates oder eines Digoxigeninderivates oder eines Proteins, an Nukleinsäuren, insbesondere Ribonukleinsäuren (RNA), gekennzeichnet durch folgende Strukturformel (II): wobei jeweils
R₁ eine Hydroxylgruppe oder Phosphatgruppe oder mindestens ein 3′,5′-Nukleotidbisphosphat,
R₂ eine Nukleobase,
R₃ das zu kuppelnde Molekül und
R₄ ein Wasserstoffatom oder ein Nukleosid bedeuten,
und wobei
m eine Zahl zwischen 1 und 100, insbesondere zwischen 2 und 5, und
n₁ entweder 0 oder eine Zahl zwischen 1 und 30, insbesondere 1, und
n₂ entweder 0 oder eine Zahl zwischen 1 und 30, insbesondere 1, sind.

3. Ribooligonukleotid gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die als Spacer dienende Alkylkette keine Phosphatgruppe mit daran gebundenem R₄ und statt dessen ein Wasserstoffatom enthält (Formel III).

4. Ribooligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleobase (R₂) ein Adenin, Guanin, Uracil oder Cytidin ist.

5. Ribooligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das zu kuppelnde Molekül R₃ ein Fluoreszenzmarker, insbesondere ein Fluoreszeinderivat, ein Biotinderivat, ein Digoxigeninderivat, oder ein Protein, insbesondere eine Nuklease, ist.

6. Verfahren zur Synthese eines Ribooligonukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese eines mit einer oder mehreren Aminogruppen modifizierten Ribooligonukleotids mit einem DNA-Synthesegerät bei modifiziertem Synthesezyclus durchgeführt wird, wobei die Bestandteile:

- Phosphoramidite
- Aminierungsreagenzien
- Phosphorylierungsreagenz

verwandt werden und der gewünschte Marker (R₃) anschließend mittels an sich bekannter Methoden an dieses modifizierte Ribooligonukleotid gebunden wird.

7. Verwendung von Ribooligonukleotiden gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5

a) für Hybridisierungsverfahren, insbesondere in situ Hybridisierungsverfahren oder
b) für RNA-Strukturuntersuchungen oder
c) für Protein-RNA-Wechselwirkungsstudien oder
d) zum gezielten Bearbeiten von Nukleinsäuren.

8. Reagenzkit zur Kupplung von Molekülen an Nukleinsäuren, insbesondere Ribonukleinsäuren, bestehend aus:

a) Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei R₁, R₂ und gegebenenfalls R₄ die obige Bedeutung haben und R₃ anstatt des zu kuppelnden Moleküls ein Wasserstoffatom ist
b) Markersubstanz oder Nuklease
c) RNA Ligase, insbesondere T4 RNA Ligase.