DE3446635C2 - Synthese von Aminoderivaten von Oligonukleotiden - Google Patents

Description

Ein Oligonukleotid ist ein kurzes Polymer, bestehend aus einer geraden Sequenz von vier Nukleotiden in einer definierten Ordnung. Die Nukleotiduntereinheiten sind verbunden durch Phosphodiesterbindungen, die die 3′-Hydroxylgruppe des einen Nukleotids mit der 5′-Hydroxylgruppe des nächsten Nukleotids verbinden. Ein Beispiel eines Oligonukleotids ist 5′ ApCpGpTpApTpGpGpCp 3′. Die Buchstaben A, C, G und T beziehen sich auf die Art der Purin- oder Pyrimidinbase, die an der 1-Position der Desoxyribose gebunden ist. A, Adenin; C, Cytosin; G, Guanin; T Thymidin. P steht für die Phosphodiester­ bindung. Die Struktur eines Teils eines Oligonukleotids ist in Fig. 1 gezeigt.

Die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung herge­ stellten einsträngigen Oligonukleotide sind weiter dadurch gekennzeichnet, daß sie homogen sind im Hinblick auf die Sequenz der Nukleosiduntereinheiten und ein einheitliches Molekulargewicht haben.

Synthetische Oligonukleotide sind leistungsfähige Hilfsmittel in der modernen Molekularbiologie und bei der rekombinierenden DNA-Arbeit. Es gibt verschiedene Anwendungen für diese Molekü­ le, eingeschlossen a) als Sonden für die Isolierung spezifi­ scher Gene, basierend auf der Proteinsequenz des Genprodukts, b) um die in vitro Mutagenese eines gewünschten Gens zu lenken, c) als Primer für die DNA-Synthese einer einsträngigen Schablo­ ne, d) als Schritte in der Totalsynthese von Genen und viele mehr, die in Wm. R. Bahl et al., Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 21, 101 (1978) zusammengefaßt sind.

Sehr beträchtliche Anstrengungen wurden deshalb der Entwicklung wirkungsvoller chemischer Methoden für die Synthese dieser Oligonukleotide gewidmet. Eine kurze Übersicht dieser Methoden, wie sie entwickelt wurden bis zur Gegenwart, ist zu finden bei Crocket, G.C., Aldrichimica Acta 16(3), 47-55 (1983). Die beste Metho­ denlehre, die derzeit erhältlich ist, verwendet Phos­ phoramididderivate der Nukleoside in Kombination mit einem Festphasensyntheseverfahren, Matteucci et al, J. Am. Chem. Soc., 103, 3185 (1981); und Beaucage et al, M. H. Tet. Lett., 22(20), 1858-1862 (1981). Oligo­ nukleotide mit einer Länge von bis zu 30 Basen können routinemäßig hergestellt werden in dieser Hinsicht und Moleküle mit bis zu 50 Basen wurden schon hergestellt. Apparate, die diese Technologie anwenden, sind nun im Handel erhältlich.

Es gibt andere Berichte in der Literatur der Derivati­ sierung der DNA. Ein modifiziertes Nukleosidtriphosphat wurde entwickelt, worin eine Biotingruppe konjugiert ist an eine aliphatische Aminogruppe an der 5-Position von Uracil, Langer et al, Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., 78, 6633-6637 (1981). Dieses Nukleosidderivat wurde tatsächlich in eine doppelsträngige DNA eingebracht. Wenn es einmal in der DNA ist, kann es durch Antibiotin- Antikörper gebunden werden, die dann verwendet werden können für die Detektion durch Fluoreszenz oder enzyma­ tische Methoden. Die DNA, die das Biotin-konjugierte Nukleosid inkorporiert hatte durch die Methode von Langer et al wurde fragmentiert in kleinere Einzel- und Doppelstrangstücke, die heterogen sind im Hinblick auf die Sequenz der Nukleosiduntereinheiten und verschieden im Molekulargewicht. Draper und Gold, Biochemistry, 19, 1774-1781 (1980) berichteten über die Einführung von aliphatischen Aminogruppen durch eine bisulfitkataly­ sierte Transaminierungsreaktion und die nachfolgende Reaktion mit einem Fluoreszenzmarker. Bei Draper und Gold ist die Aminogruppe direkt an eine Pyrimidinbase gebunden. Die Aminogruppe, die so angebracht ist, inhibiert Wasserstoffbrücken und aus diesem Grunde sind diese Materialien nicht geeignet für Hybridisierung und ähnliches. Chu et al, Nucleic Acid Res. 11(18), 6513- 6529 (1983) haben eine Methode berichtet für die Bin­ dung eines Amins an das terminale 5′-Phosphat der Oligonukleotide oder Nukleinsäuren.

Es gibt viele Gründe, eine Methode wünschenswert er­ scheinen zu lassen, für die kovalente Bindung anderer chemischer Gattungen an synthetische Oligonukleotide. Fluoreszenzfarben, die an Oligonukleotide gebunden sind, erlauben es, Radioisotope aus der Forschung und diagnostischen und klinischen Verfahren zu eliminieren, in denen sie verwendet werden und verbessern die Le­ bensdauer und die Verfügbarkeit. Wie in der Parallel­ anmeldung für eine DNA-Sequenzierungsvorrichtung erlaubt die Synthese von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden die Automatisierung des DNA-Sequenzierungsverfahrens Die Entwicklung geeigneter Techniken und Instrumente für die Detektion und die Verwendung von fluoreszenzmar­ kierten Oligonukleotiden erlaubt die Automation anderer, jetzt schwieriger Labor- und klinischer Techniken. Die Bindung von DNA-Spaltungschemikalien wie die, die bei Schultz et al, J. Am. Chem. Soc., 104, 6861 (1982; und Hertzberg et al, J. Am. Chem. Soc., 104, 313 (1982) offenbart sind, erlauben die Bildung von synthetischen Restriktionsenzymen, deren Spezifität durch die Oligo­ nukleotidsequenz gelenkt wird.

Die vorliegende Erfindung offenbart eine allgemeine Methode für die Einführung einer freien aliphatischen Aminogruppe(n) in synthetische Oligonukleotide. Diese Aminogruppe reagiert schnell und spezifisch mit einer Vielzahl von aminoreaktiven Funktionen und erlaubt dadurch die kovalente Bindung einer weiten Vielzahl von chemischen Gattungen.

Die vorliegende Erfindung umfaßt das Molekül 5′-Trifluoracet­ amido-5′-desoxy-3′-N,N-diisopropylphosphoramidthymidin sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung, umfassend die Umsetzung von 5′-Desoxy-5′-trifluoracetatthymidin mit Chlor- N,N-diisopropylaminomethoxyphosphin.

Weiter umfaßt die Erfindung die Verwendung dieser Verbindung zur Herstellung von Oligonukleotiden, welche ein 5′-terminales 5′-Amino-5′-deoxythymidin enthalten. Bevorzugt wird hierzu 5′- Trifluoracetamido-5′-desoxy-3′-N,N-diisopropylphosphoramid­ thymidin mit einem an einen Festphasenträger gebundenen Oligo­ nukleotid im letzten Kopplungsschritt der Oligonukleotidsyn­ these umgesetzt, gefolgt von der Trennung des Oligonukleotids von dem Festphasenträger und Entfernung der Schutzgruppen des Oligonukleotids.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Erfin­ dung die Verwendung von 5′-Trifluoracetamido-5′-desoxy-3′-N,N- diisopropylphosphoramidthymidin zur Herstellung von Oligonu­ kleotiden, wobei das Oligonukleotid über die Aminogruppe am 5′- Kohlenstoff des 5′-terminalen 5′-Amino-5′-deoxythmidins mit einem detektierbaren Marker, ausgewählt aus der Gruppe beste­ hend aus Fluorophoren, Chromophoren, Proteinen, Enzymen und Jod¹²⁵ kovalent verknüpft wird.

Die vorliegende Erfindung umfaßt das synthetisierte Molekül 5′-Trifluoracetamido 5′-Desoxy 3′-N,N-Diisopropylphosphoramido­ thymidin (Fig. 2) und seine Addition an das 5′-Ende als letz­ ter Addition der Festphasenoligonukleotidsynthese. Während der Spaltung und der Schutzgruppenabspaltung des Oligonukleotids wird die Trifluoracetylgruppe hydrolysiert, wobei eine freie aliphatische Aminogruppe am 5′-Ende des Oligonukleotids zurückbleibt. Dieses aminoderivatisierte Oligonukleotid kann dann umgesetzt werden mit einer Vielzahl von aminoreaktiven Molekülen, um die ent­ sprechenden Oligonukleotidderivate zu ergeben. Dies ist ein Spezialfall der allgemeineren Lösung, ein modifi­ ziertes Nukleotid zu verwenden, das eine geschützte aliphatische Aminogruppe an dem Basenanteil eher als an dem 5′-Kohlenstoff hat. Ein derartiges Molekül erlaubt es, verschiedene freie Aminogruppen in dem Oligonukleo­ tid anzubringen und an jeder gewünschten Position in der Oligonukleotidsequenz.

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, neue Reagenzien und Techniken zu schaffen, die anwendbar sind für die DNA- Sequenzierung.

Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, Verbesserungen bei der DNA-Hybridisierung für die Detektion von gene­ tischen Krankheiten und für andere Zwecke zu schaffen.

Diese und andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden durch die folgende Beschreibung offenbart werden.

Die Strategie, die verwendet wird, um aliphatische Aminogruppen in ein Oligonukleotid einzuführen ist, ein 3′Phosphoramiditderivat eines Nukleosidanalogen zu synthetisieren, das eine geschützte aliphatische Amino­ gruppe enthält. Dieser Phosphoramidit kann dann umge­ setzt werden mit dem Oligonukleotid, das synthetisiert wird auf einem festen Träger in einer Art, die analog ist zu der Reaktion des underivatisierten Nukleosid­ phosphoramitids. Die Spaltung von der festen Phase und die Abspaltung der Schutzgruppe der Basenanteile und der aliphatischen Aminogruppe ergibt das aminoderivati­ sierte Oligonukleotid.

Beispiel 1

Synthese von VI. In Fig. 3 wird die Synthese der Ver­ bindung VI aus der im Handel erhältlichen Verbindung I (Thymidin) gezeigt. Die Synthese der Verbindungen II bis IV ist offenbart in Horowit et al, J. Org. Chem., 27, 3045-3048 (1962); und Gibbs and Orgel, J. Carbohydrates-Nucleosides and Nucleotides, 3(5 und 6), 315-334 (1976). Die Synthese der Verbindungen V und VI ist die folgende.

Beispiel 2

5′-Trifluoracetamido-5′-Desoxythymidin (V): 1,25 g (5 mmol) 5′-Amino 5′Desoxythymidin wurden aufgelöst in 25 ml trockenem Dimethylformamid. Dazu wurden 1,3 ml (10 mmol) S-Ethyltrifluorthioacetat (Aldrich) gegeben. Die Reaktion wurde leicht bei Raumtemperatur gerührt. TLC der Reaktionsmischung auf Silica Gel F-254 Platten in MeOH:Aceton 1 : 1 zeigte einen einzigen Punkt des Produkts, detektiert durch Kurzwellen-UV. Das Produkt hatte eine hohe Mobilität in diesem Lösungsmittelsystem im Gegensatz zu der Ausgangsverbindung VI, die tat­ sächlich immobil ist.

Die Reaktionsmischung wurde rotationsabgedampft zur Trockene unter reduziertem Druck, in einen Erlenmeyer Kolben in 30 ml Isopropanol überführt und rekristalli­ siert aus kochendem Isopropanol:MeOH. Ausbeute = 1,315 g (3,9 mmol, 80% Ausbeute), Schmelzpunkt 261° bis 262° (dec), Analyse berechnet: C, 42,7%, H, 4,18%; N 12,5%; gefunden: C 42,7%, H 4,16%; N 12,4%. Die Struktur von V wurde weiter bestätigt durch ′H NMR.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines geschützten aminoderivatisierten Nukleotidphosphoramidits.

5′Trifluoracetamido 5′-Desoxy 3′-N′N-diisopropyl-phos­ phoramidothymidin (VI): Alle Glaswaren, Spritzen und Kapillarröhrchen′ die bei dieser Reaktion verwendet wurden, wurden über Nacht in einem Trockenofen getrock­ net. Dimethylformamid (DMF) wurde über einem 4 Å Mole­ kularsieb (Linde) aufbewahrt. Diisopropylethylamin (DIPEA) wurde aus Natriumhydroxid destilliert, dann aus Kalziumhydrid und über einem 4 Å Molekularsieb aufbe­ wahrt.

Zu einem trockenen 50 ml Dreihals-Rundkolben mit Rühr­ fisch wurden 63 mg (0,19 mmol) V zugegeben. Die Drei­ hälse wurden mit Gummiserumstopfen verstopft und Nadeln wurden in die Stopfen eingeführt. Der Kolben wurde für mehrere Stunden in einem Dessikkator über trockenem CaCl₂ ausgepumpt. Der Kolben wurde unter einem leichten Strom von trockenem Stickstoffgas gehalten und 2 ml trockenes DMF wurden durch eine Spritze zugegeben. 60 µl DIPEA (0,34 mmol) wurden zugegeben in einem trockenen 100 µl Kapillarröhrchen. 40 µl Chlor-N,N- diisopropylamino-methoxyphosphin (American Bionuclear, Emeryville, CA) wurden zugegeben (in einem trockenen 100 µl Kapillarröhrchen). Die Reaktion wurde leicht gerührt, bis alle Ausgangsmaterialien gelöst waren und dann absetzen gelassen bei Raumtemperatur (immer unter N₂). Ein TLC nach einer Stunde auf Silikagel F-254 Platten in HCCl₃ : EtOH : Et₃N 88 : 10 : 2 zeigte einen einzi­ gen Punkt des Produkts von weitaus größerer Mobilität als das Ausgangsmaterial V. Versuche, dieses Produkt zu reinigen in einer Art ähnlich der, beschrieben für das Nukleosidphosphoramidit (4) waren nicht erfolgreich wegen des Abbaues des Produkts. Deshalb wurde die rohe Reaktionsmischung direkt verwendet für das Ankuppeln an das synthetische Oligonukleotid an dem Festphasenträger. Die Struktur von VI wird entnommen aus der Reaktivität dieses Produkts in der Addition des Oligonukleotids und aus dem erwarteten Produkt der Reaktion, basierend auf den Literaturergebnissen.

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines Oligonukleo­ tids, das am 5′-Ende über eine Phosphodiesterbindung an die 3′-Hydroxylgruppe des 5′-Amino 5′-Desoxythymidins gebunden ist.

Addition von VI an das 5′-Ende eines Oligonukleotids: Ein basengeschütztes synthetisches Oligonukleotid der Sequenz 5′OH-AGC ACT TTT AGA GT 3′ gebunden an die Festphase an dem 3′-Ende wurde hergestellt durch Ver­ fahren, die im Detail beschrieben sind in dem Protokoll mit dem Titel "A Procedure for the Manual Synthesis of Deoxyoligonucleotides using dimethoxytrityl nucleoside phosphoramidites on a Solid Support", herausgegeben von Applied Biosystems, Inc., Foster City, California. Die Unterschiede für die Reaktion des Oligonukleotids mit VI waren a) statt der Schritte 4.22 und 4.23 wird 1 ml der frisch hergestellten Reaktionsmischung, die VI ent­ hält, mit 1 ml 0,5 M Tetrazol in Acetonitril kombiniert und zugegeben zu dem Reaktionsgefäß; b) nach dem Schritt 4.33 gibt es zwei 30 Sekunden Waschschritte mit Acetonitril; und c) die Verschlußsektion 5 wird ausge­ lassen (um für den Versuch unreagierte Hydroxylgruppen in einer folgenden Addition zu lassen).

Die Wirksamkeit der Kupplungsreaktion wird leicht über­ wacht durch nachfolgendes Kuppeln mit einem "normalen" Phosphoramidit und Spaltung der Dimethoxytritylgruppe, um einen Farbnachweis zu ergeben. Wenn die 5′-Hydroxyl­ gruppen des Oligonukleotids bei dem ersten Kuppeln mit VI reagierten, sind sie nicht mehr erhältlich für die Reaktion beim nachfolgenden Kuppeln und daher wird wenig Farbe frei bei der DCA-Behandlung, die der zweiten Kupplung folgt. Bei diesem Beispiel wurden OD₄₅₀=1.12 (nach Verdünnung) für die DMT-Gruppe frei aus dem Oligonukleotid vor der Reaktion mit VI. OD₄₅₀=0.026 (nach Verdünnung) für das DMT wurden aus einem G-Rest frei, der nachfolgend zu der Reaktion mit VI zugegeben wurde. Daher wurden 98% der 5′OH-Gruppen durch die Reaktion mit VI blockiert. Bei dem Oligonukleotid wurden die Schutzgruppen abgespalten und es wurde von der Festphase gespalten durch Behandlung mit Thiophenol und konzentriertem NH₄OH in üblicher Art und Weise und das NH₄OH wurde unter vermindertem Druck entfernt. Das Oligonukleotid wurde aufgelöst in 1 ml destilliertem H₂O. Das OD₂₆₀ war 128 von dieser Lösung, was anzeigte, daß die Konzentration an DNA 4,5 mg/ml war. 50 µl dieser Lösung wurden verdünnt auf 1 ml mit H₂O und 15 Minuten gemischt mit 100 mg AG50W-X4 (Natriumform) Ionenaustauscherharz, um das DNA von dem Ammoniumsalz in das Natriumsalz umzuwandeln (die Ammoniumionen stören den nachfolgenden Ninhydrintest). Das Harz wurde durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand wurde in einem Savant-Rotationskonzentrator getrocknet. Der quantitative Ninhydrinnachweis (Sarin, V. K., et al, Anal. Biochem. 117, 147-157 (1981)) ergab ungefähr 1 Mol Aminogruppe pro Mol Oligonukleotid (die molare Konzentration an Oligonukleotid wurde bestimmt aus einem berechneten Extinktionskoeffizienten E₂₆₀ = 1.55 × 10⁵, bezogen auf die Nukleotidzusammensetzung). Ein Ninhydrinnachweis derselben molaren Menge eines Kon­ trolloligonukleotids, mit dem kein VI konjugiert worden war, ergab keine aminopositive Reaktion.

Beispiel 5

Konjugation mit dem Farbstoff: Zu 100 µl der obigen Lösung des Aminooligonukleotids wurden 200 µl H₂O, 50 µl 1M Carbonat/Bicarbonatpuffer mit pH 9,0 und 25 µl frisch hergestelltes 10 mg/ml Fluoresceinisothiocyanat (FITC) (Molekularsonden, Inc., Junction City, Oregon) in Dimethylsulfoxid zugegeben. Die Mischung wurde mehrere Stunden bei Raumtemperatur belassen und gerei­ nigt durch Chromatographie auf einer Säule (1 cm × 9 cm) Sephadex G-25 in Wasser. Das gelbe Produkt wurde eluiert in das ausgeschiedene Volumen und wurde sauber getrennt von unreagiertem Farbstoff. Eine Kontrollreaktion mit Oligonukleotid, mit dem kein VI umgesetzt worden war, ergab wenig oder keine Farbe in dem ausgeschiedenen Volumen der Säule, was anzeigte, daß der Farbstoff tat­ sächlich mit der zugegebenen Aminogruppe reagiert hatte. Das Farbstoff-Oligonukleotid-Konjugat hatte OD₂₆₀ = 2,3, OD₄₉₅ = 0,54. Bezogen auf E₄₉₅ 7 × 10⁴ für FITC ergibt dies eine 7,7 µM Lösung des Farbstoffs. Bezogen auf E₂₆₀ = 1,55 × 10⁵ ist das DNA 12,8 µM. Daher waren ungefähr 60% der DNA-Moleküle mit Farbstoff markiert. Dies ist eine grobe Schätzung, die nicht Änderungen in der Absorption von gebundenem Fluoreszein relativ zu ungebundenem berücksichtigt, noch kontaminierende kürzere und nichtreaktive Oligonukleotide. Ein Aliquot dieser gefärbten DNA wurde einer Elektrophorese auf einem 20% Polyacrylamidgel unterzogen und war leicht sichtbar als einzelne gefärbte (und fluoreszierende) Bande einer Mobilität, die für ein Oligo­ nukleotid dieser Länge angemessen war.

Das farbstoffkonjugierte Oligonukleotid wurde leicht gereinigt durch Hochdruck-flüssig-Chromatographie (HPLC) auf einer Reverse-phase-C₁₈ Säule (Waters) unter Verwendung eines Acetonitril : 0,1 N Triethylammoniumacetat pH 7 Gradienten für die Elution.

Es gibt viele mögliche Anwendungen der aminoderivatisierten Oligonukleotide, die oben offenbart worden sind. Die aliphati­ sche Aminogruppe reagiert leicht und spezifisch mit einer großen Anzahl von funktionellen Gruppen. Dies bedeutet, daß tatsächlich jedes gewünschte Molekül an ein Oligonukleotid, das hergestellt ist, wie oben beschrieben, gebunden werden kann. Dies schließt Enzyme, andere Proteine, Fluoreszenzmarker, Biolumineszenzmarker, Chromophore usw. ein. Oligonukleotide wurden weithin benutzt in einer Vielzahl von Gebieten, oft in Verbindung mit Radiomarkern. Es wird nun möglich sein, nicht radioaktive Testmoleküle gegen radioaktive Marker auszutau­ schen. Dies macht Verfahren unter Verwendung von Oligonukleoti­ den billiger und leichter verwendbar und kompatibel mit der klinischen Ausstattung. Obwohl Radiomarker weniger bevorzugt sind, können die neuen aminoderivatisierten Oligonukleotide auch radiomarkiert werden, z. B mit J¹²⁵. Die folgenden drei speziellen Beispiele für Verwendungen der aminoderivatisierten Oligonukleotide sind nur beispielhaft:

• 1. Automatisierte DNA-Sequenzierung.
• 2. Detektion genetischer Krankheit durch DNA-Hybridi­ sierung.
• 3. Allgemeine Verwendung der Fluoreszenz für die Detektion der Hybridisierung.

Detektion genetischer Abnormalitäten: Oligonukleotide können verwendet werden, um den Genotyp von Individuen zu bestimmen. Dies wird bei DNA-Proben durchgeführt, die vom Fötus durch Amniozentese erhalten werden. Diese Information ist unschätzbar für die genetische Beratung von Paaren mit einem Risiko für eine Vielzahl von gene­ tischen Krankheiten. Der Genotypus von Erwachsenen kann auch bestimmt werden und erlaubt eine effektive Diagnose und Behandlung in einem frühen Stadium. Ein treffendes Beispiel dieser Technologie ist für die Detektion von Sichelzellenanämie, Connor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 278 (1983). 19 Basenpaare lange syntheti­ sche Oligonukleotide wurden synthetisiert, eines komple­ mentär zu dem normalen Human-β-Globingen (β^A) und eines komplementär zu dem Sichelzellen-β-Globingen (β^S) Diese Moleküle werden radioaktiv markiert und verwendet als Tests bei der DNA-Hybridisierung. Unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen können diese Proben verwendet werden, um das β^A-Gen von dem β^S-Allel zu unterscheiden. Dies erlaubt die Diagnose der Sichelzellenkrankheit. Allgemeiner, wie in Connor et al ausgeführt, "schafft dieses allelspezifische Hybridisierungsverhalten der Oligonukleotide eine allgemeine Methode für die Diagnose jeglicher genetischer Krankheit, die eine Punktmutation in der DNA-Sequenz eines single-copy-Gens enthält". Die vorliegende Erfindung ist direkt anwendbar für diese Technik. Die Oligonukleotidproben werden hergestellt mit einer Aminogruppe und markiert mit einem Fluoreszenz­ marker. Das Fluoreszenzprobenmolekül ist unbegrenzt stabil im Gegensatz zu der kurzen Lebensdauer radioak­ tiver Proben und erfordert keine besonderen Vorsichts­ maßnahmen für die Verwendung oder Behandlung. Dies be­ deutet eine Methode, die äußerst bevorzugt ist für die Verwendung im klinischen Einsatz, der das Hauptgebiet ist, in dem die Technologie verwendet werden wird.

Oligonukleotidproben werden weithin verwendet in der Forschungsarbeit ebenso wie bei der klinischen Arbeit. Sie werden allgemein verwendet, um ein Stück DNA zu ermitteln und eine gewünschte Sequenz in einer "Biblio­ thek", einer Sammlung von DNA-Fragmenten, die in ein Plasmid oder einen Farbenvektor geklont werden, der Sequenzen enthält, die das gesamte Genom (oder expressed RNA) oder eines Organismus enthalten. Sie werden auch verwendet, um DNA einer gegebenen Sequenz in einem "Fleck" einer Restriktionsauswahl eines be­ stimmten Stückes DNA zu hybridisieren. In all diesen Beispielen, ebenso wie in anderen, wird das Oligonukleo­ tid markiert mit ³²P, gewöhnlich am 5′-Ende, und die Moleküle werden durch Autoradiographie detektiert. Die vorliegende Erfindung beschreibt die Markierung von Oligonukleotiden mit Fluoreszenzfarbstoffen. Deshalb kann die Fluoreszenz verwendet werden für die Detektion der Moleküle in jeder der Techniken, in denen Radioakti­ vität in üblicher Weise verwendet wurde. Dies bietet verschiedene Vorteile gegenüber der Radioaktivität wie Stabilität der Testproben, Kosten und Leichtigkeit der Verwendung und Beseitigung.

Claims (5)

1. 5′-Trifluoracetamido-5′-desoxy-3′-N,N-diisopropyl­ phosphoramidthymidin.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, umfassend die Umsetzung von 5′-Desoxy-5′- trifluoracetatthymidin mit Chlor-N,N- diisopropylaminomethoxyphosphin.

3. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung von Oligonukleotiden, welche ein 5′-terminales 5′-Amino-5′- deoxythymidin enthalten.

4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß 5′-Trifluoracetamido-5′-desoxy-3′-N,N- diisopropylphosphoramidthymidin mit einem an einen Festphasenträger gebundenen Oligonukleotid im letzten Kopplungsschritt der Oligonukleotidsynthese umgesetzt wird, gefolgt von der Trennung des Oligonukleotids von dem Festphasenträger und Entfernung der Schutzgruppen des Oligonukleotids.

5. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid über die Aminogruppe am 5′-Kohlenstoff des 5′-terminalen 5′-Amino-5′-deoxythymidins mit einem detektierbaren Marker, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluorophoren, Chromophoren, Proteinen, Enzymen und Jod¹²⁵ kovalent verknüpft wird.