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CN108570423A - 改善干癣症状的副干酪乳杆菌菌株gmnl-653及其组合物 - Google Patents

改善干癣症状的副干酪乳杆菌菌株gmnl-653及其组合物 Download PDF

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CN108570423A
CN108570423A CN201710271792.XA CN201710271792A CN108570423A CN 108570423 A CN108570423 A CN 108570423A CN 201710271792 A CN201710271792 A CN 201710271792A CN 108570423 A CN108570423 A CN 108570423A
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周佳璇
蔡佩珍
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Abstract

本发明公开一种改善干癣症状的副干酪乳杆菌菌株GMNL‑653及其组合物。所述副干酪乳杆菌菌株GMNL‑653具有抗发炎、抑制细胞激素IL‑6及IL‑17分泌的能力，因此改善过度发炎造成的干癣症状。

Description

改善干癣症状的副干酪乳杆菌菌株GMNL-653及其组合物
技术领域
本发明是有关于一种改善干癣症状的副干酪乳杆菌菌株GMNL-653及其组合物，特别是关于一种具有抗发炎能力且可以抑制细胞激素IL-6及IL-17分泌的副干酪乳杆菌菌株GMNL-653及其组合物。
背景技术
干癣又称为银屑病，是一种慢性免疫疾病，会反复发作。由于皮肤的免疫系统失调而导致皮肤细胞的生长增加，成为厚厚的皮屑患者在头皮、脸、躯体及四肢很容易反复长出隆起的红色脱屑斑块，且发病后多数就终身无法治愈。有部分干癣病人会合并干癣关节炎，造成关节发炎肿胀，它不仅是皮肤疾病，也是一种全身性疾病；40％患者合并关节炎，另外合并高血脂、代谢症候群、肥胖、心血管疾病、糖尿病、忧郁症等的机率也高于一般人。
目前最常用来治疗干癣的方式为使用外用药物、口服药物、生物制剂及光照疗法等。常见的外用药物包含(1)外用类固醇：可抗发炎、抑制细胞增生，但长期使用于皮肤薄处后，会造成皮肤萎缩的副作用；(2)外用维生素D：可抑制角质细胞增生、抗发炎，但会出现局部刺激感；(3)外用A酸：抑制角质过多、促进角质细胞分化，但效果不佳；(4)焦油：辅助抗发炎及抑制角质细胞增生；(5)保湿剂：避免皮肤过于干燥而刺激发炎。口服药物包含(1)MTX(methotrexate)，主要的副作用为血球下降、肝毒性；与(2)环孢霉素(cyclosporine)，主要的副作用为血球下降、肾毒性；(3)口服A酸，主要的副作用为肝功能异常、血脂升高、皮肤干燥、致畸胎；(4)全身性类固醇：只用在孕妇。生物制剂则是注射具有免疫调节功能的抗体，虽然安全但价格昂贵，且必需注意肺结核。光照疗法的照光时问的长短要请医师评估后再决定，且必须亲自到医疗院所治疗。
上述几种干癣的治疗方式普遍具有副作用高、便利性不佳及价格昂贵等问题；因此寻找非类固醇治疗，并兼具便利性及价格平实等优势，将成为未来发展治疗干癣的新趋势。
故，有必要提供一种改善干癣症状的副干酪乳杆菌菌株GMNL-653及其组合物，以解决现有技术中所存在的问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种改善干癣症状的副干酪乳杆菌菌株及其组合物，所述副干酪乳杆菌菌株GMNL-653(Lactobacillus Paracasei GMNL-653)具有抗发炎的能力，且可抑制血清中细胞激素IL-17的产生以降低其含量，进而改善干癣症状。
为达上述的目的，本发明的一实施例提供一种改善干癣症状的副干酪乳杆菌(Lactobacillus Paracasei)菌株，所述副干酪乳杆菌菌株是副干酪乳杆菌菌株GMNL-653，并以保藏编号M 2016226保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
在本发明的一实施例中，所述副干酪乳杆菌菌株GMNL-653是活菌菌株或死菌菌株。
在本发明的一实施例中，所述副干酪乳杆菌菌株GMNL-653具有抑制产生细胞激素IL-17(Interleukin-17)的能力。
在本发明的一实施例中，所述副干酪乳杆菌菌株GMNL-653具有抑制产生细胞激素IL-6(Interleukin-6)的能力。
为达上述的目的，本发明的另一实施例提供一种改善干癣症状的组合物，其包含如上所述的改善干癣症状的副干酪乳杆菌菌株。
在本发明的一实施例中，所述改善干癣症状的组合物是一医药组合物、一营养补充品、一保健食品、一医疗食品或其组合。
附图说明
图1：显示实验1的抗发炎测试中不同副干酪乳杆菌菌株(GMNL-653、32、133)的活菌菌株对LPS诱发RAW264.7的一氧化氮(NO)浓度的长条图。
图2：显示实验1的抗发炎测试中不同副干酪乳杆菌菌株(GMNL-653、32、133)的死菌菌株对LPS诱发RAW264.7的一氧化氮(NO)浓度的长条图。
图3：显示实验2的不同剂量的副干酪乳杆菌菌株GMNL-653对发炎产生的细胞激素IL-6含量的影响。
图4A至4C：实验3中各组小鼠在不同天数时的背部皮肤照片。
图5：显示实验3中喂食副干酪乳杆菌菌株GMNL-653对血清中的细胞激素IL-17含量的影响。
图6：干癣造症后小鼠皮肤外观的红肿情形以文献方法进行评估所获得的分数的比较图。
图7：干癣造症后小鼠皮肤角质层角化不全的症状以文献方法进行评估所获得的分数的比较图。
具体实施方式
为了让本发明的上述及其他目的、特征、优点能更明显易懂，下文将特举本发明较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。此外，本发明所提到的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括数个引用，除非上下文另有明确规定。数值范围(如10％至11％的A)若无特定说明皆包含上、下限值(即10％≦A≦11％)；数值范围若未界定下限值(如低于0.2％的B，或0.2％以下的B)，则皆指其下限值可能为0(即0％≦B≦0.2％)。上述用语是用以说明及理解本发明，而非用以限制本发明。
本发明的一实施例提供一种改善干癣症状的副干酪乳杆菌菌株，所述副干酪乳杆菌菌株是副干酪乳杆菌菌株GMNL-653(Lactobacillus Paracasei GMNL-653)，并以保藏编号M 2016226保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。所述副干酪乳杆菌菌株GMNL-653可为活菌菌株或死菌菌株，其具有抗发炎能力，且能抑制细胞激素IL-6及IL-17(Interleukin-17)的产生。
本发明的一实施例提供一种改善干癣症状的组合物，其包含如上所述的副干酪乳杆菌菌株GMNL-653。优选的，所述改善干癣症状的组合物也可以一医药组合物、一营养补充品、一保健食品、一医疗食品或其组合的方式呈现，亦即所述改善干癣症状的组合物可以根据有效性或方便性来考量设计成不同的形态。此外，所述改善干癣症状的组合物优选是以食用方式进入消化系统。
上述实施例中的所述副干酪乳杆菌菌株GMNL-653主要是从人体肠道筛选分离获得的多个分离株的其中一株。利用表1的引子(SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)进行PCR以复制多个分离株各自的16S rDNA片段，接着将其加以定序，定序完成后得到其中一株的16SrDNA基因序列如下(SEQ ID NO:3)；随后，由NCBI网站比对后的结果可知，所述分离株的16SrDNA序列与副干酪乳杆菌(Lactobacillus Paracasei)的16S rDNA序列相似，相似度均为99％以上，故可知此菌株GMNL-653确实属于副干酪乳杆菌。
表1、引子序列对照
引子 序列编号 序列
PAF SEQ ID NO:1 AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
536R SEQ ID NO:2 GTA TTA CCG CGG CTG CTG
所述副干酪乳杆菌GMNL-653的完整16S rDNA序列(SEQ ID NO:3)如下：
CGGAGGCCCCTATGATGGGCGTCGTACGAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCACCGAGATTCTCATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCTGTAACCGCATGGTTCTTGGCTGATAGATGGCGTAAGCTATCGCTGTTGGATGGACCCGCGGCGTATTATCTAGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCGAGGCCATGATACGTATCCGAGCTGAGAGGTTGATGGGCGAGTTTGTGACTGAGACACGTCCCAAACTACTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGGGGGGTAATACA
对所述副干酪乳杆菌菌株GMNL-653进行酦酵试验，可获得如表2的结果。
表3、酦酵试验结果
为了验证本发明所提供的所述副干酪乳杆菌菌株GMNL-653具有抗发炎的特性，且能达到改善干癣症状的目的，进行了以下动物模式的实验。由于动物模式中，小鼠的表症贴近临床人類疾病病症，包含慢性皮肤发炎与角化性疾病症状，因此可用来评估及模拟所述副干酪乳杆菌GMNL-653使用于人类可获得的效果。
实验1：抗发炎测试
菌株：三种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei GMNL-653为实验组，GMNL-32及GMNL-133为比较组)
菌液培养：每组自冻管接种副干酪乳杆菌到1ml的MRS肉汤，并于37℃有氧下静置培养20小时。次日，取15μl隔夜培养菌液至1.5ml的MRS肉汤(1％二次活化)，37℃有氧下静置培养20小时。
细胞培养：将巨噬细胞株(RAW 264.7)的细胞数调整为8×105cells/ml，在24孔盘中加入0.5ml细胞液(最终细胞数为4×105cells/well)，并于37℃静置隔夜后，先以磷酸盐生理食盐水(以下简称PBS)清洗1次后，将细胞培养基更换成0.4ml/well不含血清的培养基(DMEM)进行饥饿(starvation)2小时。
菌液与细胞共培养：取出前一晚培养的菌液进行离心(每分钟13,000转、1分钟)，并进行两次PBS洗菌，再次移除上清液后，取20μl的PBS悬浮菌块混合980μl的PBS(稀释50倍)，测量OD 600，回推调整菌液浓度为1x1010cfu/ml；将调整好的菌液取0.1ml再混合0.9ml的DMEM(无血清)，使最终菌数成为1x109cfu/ml。重复上述步骤制备好此菌数共两管，一管为活菌，另一管则进行热杀(121℃，15分钟)备用。待细胞进行饥饿2小时后，再加入100μl已制好的活菌及死菌菌液(最终菌数为1x108cfu/ml)，并和细胞共同培养2小时。
菌液与细胞共培养2小时后，继续在每个孔洞中加入0.5ml含200ng/ml的LPS的DMEM；控制组(mock)则加入0.5ml的DMEM，再共同培养20小时后，收集细胞上清液，并测定一氧化氮(NO)含量。
将NO试剂(80μl Griess reagent A+80μl Griess reagent B)混合80μl细胞上清液，于室温下作用5分钟后，利用ELISA reader测定OD 550nm的吸光值。
实验1的结果如图1及2所示，除了可发现LPS能有效的促进RAW264.7细胞的发炎物质一氧化氮的产生，在图1中，三种副干酪乳杆菌菌株(GMNL-653、32及133)的活菌菌株都可以降低NO的产生浓度，但以GMNL-653的效果最好；在图2中，则可以发现仅有副干酪乳杆菌菌株GMNL-653的死菌菌株能够有效降低NO浓度，其余两个副干酪乳杆菌菌株效果不明显，甚至GMNL-133还会使NO浓度略为上升。因此可知，副干酪乳杆菌菌株GMNL-653的活菌或死菌型态都可以有效抑制LPS刺激RAW264.7细胞所产生的发炎现象。副干酪乳杆菌菌株GMNL-653具有抗发炎的能力。
实验2：不同剂量的副干酪乳杆菌菌株GMNL-653对发炎产生的细胞激素IL-6的抑制效果
菌液培养：自冻管接种副干酪乳杆菌菌株GMNL-653到1ml的MRS肉汤，并于37℃有氧下静置培养20小时。次日，取15μl隔夜培养菌液至1.5ml的MRS肉汤(1％二次活化)，37℃有氧下静置培养20小时。
细胞培养：将巨噬细胞株(RAW 264.7)的细胞数调整为8×105cells/ml，在24孔盘中加入0.5ml细胞液(最终细胞数为4×105cells/well)，并于37℃静置隔夜后，先以PBS清洗1次后，将细胞培养基更换成0.4ml/well不含血清的培养基(DMEM)进行饥饿(starvation)2小时。
菌液与细胞共培养：取出前一晚培养的菌液进行离心(每分钟13,000转、1分钟)，并进行两次PBS洗菌，再次移除上清液后，取20μl的PBS悬浮菌块混合980μl的PBS(稀释50倍)，测量OD 600，回推调整菌液浓度为1x1010cfu/ml；将调整好的菌液取0.2ml再混合0.8ml的DMEM(无血清)，使最终菌数成为2x109cfu/ml。并预先将此最终浓度依序调整菌量成为2x109、1x109、5x108、1x108、5x107cfu/ml备用。待细胞进行饥饿2小时后，再加入100μl已制好的不同稀释倍数的菌液，处理细胞2小时。
菌液与细胞共培养2小时后，继续在每个孔洞中加入0.5ml含200ng/ml的LPS的DMEM；控制组(mock)则加入0.5ml的DMEM，再共同培养20小时后，收集及分装细胞上清液，保存于-20℃待测。进行测试前，先将细胞上清液以测试稀释剂(Assay diluents)稀释5倍(0.1ml细胞上清液+0.4ml测试稀释剂)，再进行细胞激素IL-6分析，并以ELISA reader测定OD 450nm的吸光值，每组重复两次。
实验2的结果请参照图3，可发现不同剂量的副干酪乳杆菌菌株GMNL-653均能有效降低LPS刺激RAW264.7产生的IL-6的分泌量，剂量越高抑制IL-6分泌的效果越好。
实验3：干癣小鼠的动物模式测试
实验材料：10周龄大BALB/c母鼠，共分成四组，包括控制组(管喂无菌水，未进行干癣造症，2只)、单纯造症组(管喂无菌水，进行干癣造症，5只)以及副干酪乳杆菌组(进行干癣造症，包括管喂活菌及死菌两种型态，活菌剂量为1.6×107cfu/mouse，5只；死菌剂量为8.1×107cells/mouse，5只)。
实验方法：
(1)活菌制备：自冻管接种副干酪乳杆菌菌株GMNL-653到1ml MRS肉汤，并于37℃有氧下静置培养20小时。次日，取15μl隔夜培养菌液至1.5ml MRS肉汤(1％二次活化)，37℃有氧下静置培养20小时，以OD 600nm推估菌数并将活菌剂量调整为8×107cfu/ml备用。
(2)死菌制备：自冻管接种副干酪乳杆菌菌株GMNL-653到1ml MRS肉汤，并于37℃有氧下静置培养20小时。次日，取15μl隔夜培养菌液至1.5ml MRS肉汤(1％二次活化)，37℃有氧下静置培养20小时，以OD 600nm推估菌数，并将菌数调整为4×108cfu/ml，并进行121℃高温高压灭菌15分钟。
(3)流程：BALB/c母鼠预先管喂副干酪乳杆菌6天；至第6天时先将小鼠背部除毛，在第7天开始涂抹0.05g药膏(Imiquimod Cream,，5％Aldara，以下简称Imq)造症，控制组则是擦凡士林(vaseline)，连续涂抹7天，此过程仍持续管喂副干酪乳杆菌，拍照记录皮肤产生皮屑的状况，并以心脏采血方式收集小鼠血清，并以ELISA kit(BioLgend,Mouse IL-17A,Cat.No.432505)进行细胞激素IL-17的分析。所得的数据均以双尾变异数分析(two-way analysis of variance)，并进行T-test统计分析各组均与造症组(Imq)相比，**代表p＜0.01。
请参照图4A至4C，其分别显示第0、4及5天的小鼠背部皮肤的照片。经过4或5天的Imq药膏处理后，单纯造症组(Imq)与无照症的控制组(Vaseline)的小鼠背部皮肤状况明显不同，主要出现隆起的红色脱屑斑块及掉落的皮屑，也会出现伤口，即类似人类的干癣病症；而相较于单纯Imq组别，喂食GMNL-653活菌组及GMNL-653死菌组，虽然皮肤仍有少量的皮屑形成，但隆起的红色脱屑斑块部位及数量减少许多，表示不论活菌或死菌形式的GMNL-653对于Imq造成的干癣皮肤症状，具有明显改善的效果。
继续参照图5，可发现在有Imq造症并同时管喂死菌或活菌形式的GMNL-653均能大幅降低小鼠体内细胞激素IL-17的量，有效抑制细胞激素IL-17产生。因此，可推论副干酪乳杆菌菌株GMNL-653可通过减少IL-17分泌而达到改善干癣所造成的全身性发炎现象。
图6为干癣造症后小鼠皮肤外观的红肿情形以文献方法(Bangladesh JPharmacol.2016；11:849-851)进行评估所获得的分数的比较图。从图6可看出，涂抹凡士林的组别在第1、4、5天并无差异；在干癣造症成功后，虽然涂抹Imq的三个组别都出现皮肤红肿的发炎情形；但相较于单纯Imq造症组，Imq+GMNL-653活菌组及Imq+GMNL-653死菌组都有减缓红肿发炎程度，添加GMNL-653活菌组或GMNL-653活菌组与Imq组别相比均具有显著性差异(**:p<0.01，*:p<0.05)。
图7为干癣造症后小鼠皮肤角质层角化不全的症状以文献方法(Bangladesh JPharmacol.2016；11:849-851)进行评估所获得的分数的比较图。由于皮肤角质层角化不全，因此在皮肤上不停产生及掉落新皮屑。从图7可看出，涂抹凡士林的组别在第1、4、5天并无差异。在干癣造症成功后，虽然涂抹Imq的三个组别都出现皮屑情形，但相较于单纯Imq造症组，Imq+GMNL-653活菌组及Imq+GMNL-653死菌组都有减少皮屑产生的情形及速度，GMNL-653活菌组或GMNL-653死菌组与Imq组别相比均具有显著性差异(**:p<0.01，*:p<0.05)。
综合上述结果，可以确定本发明所提供的副干酪乳杆菌GMNL-653，在动物模式的实验中，不论是活菌或热杀死菌型态均具有改善干癣症状的效果，且其机制为通过调节细胞激素IL-17的产生来降低过度发炎的现象。本发明所提供的改善干癣症状的所述副干酪乳杆菌GMNL-653及其组合物可应用于干癣的治疗上，是相当安全、无副作用、价格便宜且使用上相当方便的。
本发明已由上述相关实施例加以描述，然而上述实施例仅为实施本发明的范例。必需指出的是，已公开的实施例并未限制本发明的范围。相反地，包含于权利要求书的精神及范围的修改及均等设置均包括于本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 景岳生物科技股份有限公司
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<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAF引子
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 536R引子
<400> 2
gtattaccgc ggctgctg 18
<210> 3
<211> 523
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMNL-653 16S rDNA序列引子
<400> 3
cggaggcccc tatgatgggc gtcgtacgag ttctcgttga tgatcggtgc ttgcaccgag 60
attctcatgg aacgagtggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ccttaagtgg 120
gggataacat ttggaaacag atgctaatac cgcatagatc ctgtaaccgc atggttcttg 180
gctgatagat ggcgtaagct atcgctgttg gatggacccg cggcgtatta tctagttggt 240
gaggtagtgg ctcaccgagg ccatgatacg tatccgagct gagaggttga tgggcgagtt 300
tgtgactgag acacgtccca aactactacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg 360
gacgcaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag gctttcgggt cgtaaaactc 420
tgttgttgga gaagaatggt cggcagagta actgttgtcg gcgtgacggt atccaaccag 480
aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc ggggggtaat aca 523

Claims (9)

1.一种改善干癣症状的副干酪乳杆菌菌株，其特征在于，所述副干酪乳杆菌菌株是副干酪乳杆菌菌株GMNL-653，并且所述副干酪乳杆菌菌株GMNL-653以保藏编号M 2016226保藏于中国典型培养物保藏中心。
2.如权利要求1所述的改善干癣症状的副干酪乳杆菌菌株，其特征在于：所述副干酪乳杆菌菌株GMNL-653是活菌菌株或死菌菌株。
3.如权利要求1所述的改善干癣症状的副干酪乳杆菌菌株，其特征在于：所述副干酪乳杆菌菌株GMNL-653具有抑制产生细胞激素IL-17的能力。
4.如权利要求1所述的改善干癣症状的副干酪乳杆菌菌株，其特征在于：所述副干酪乳杆菌菌株GMNL-653具有抑制产生细胞激素IL-6的能力。
5.一种改善干癣症状的组合物，其特征在于，所述组合物包含如权利要求1所述的改善干癣症状的副干酪乳杆菌菌株。
6.如权利要求5所述的改善干癣症状的组合物，其特征在于：所述改善干癣症状的组合物是一医药组合物、一营养补充品、一保健食品、一医疗食品或其组合。
7.如权利要求5所述的改善干癣症状的组合物，其特征在于：所述副干酪乳杆菌菌株GMNL-653是活菌菌株或死菌菌株。
8.如权利要求5所述的改善干癣症状的组合物，其特征在于：所述副干酪乳杆菌菌株GMNL-653具有抑制产生细胞激素IL-17的能力。
9.如权利要求5所述的改善干癣症状的组合物，其特征在于：所述副干酪乳杆菌菌株GMNL-653具有抑制产生细胞激素IL-6的能力。
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