CN108450482B

CN108450482B - 提高抗逆境能力的植物生长调节剂及其用途

Info

Publication number: CN108450482B
Application number: CN201810252850.9A
Authority: CN
Inventors: 陈奕兴; 蔡宛桦; 黄璻尹; 黄祥恩; 许育仁
Original assignee: Genmont Biotech Inc
Current assignee: Genmont Biotech Inc
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2018-03-26
Publication date: 2020-06-12
Anticipated expiration: 2038-03-26
Also published as: US11889835B2; US20190320659A1; CN108450482A

Abstract

本发明提供一种提高抗逆境能力的植物生长调节剂及其用途。前述植物生长调节剂由乳杆菌发酵培养液所组成，具有优异的热稳定性、安全且不具有副作用，可显著提高植物抗生物性逆境以及抗非生物性逆境的能力，进而用于植物生长调节剂或制备提高植物抗逆境能力的组合物的用途。

Description

提高抗逆境能力的植物生长调节剂及其用途

【技术领域】

本发明是关于一种植物生长调节剂及其应用，特别是关于一种提升抗逆境能力之天然植物生长调节剂及其用途。

【背景技术】

植物生长过程中，经常会遭受生物性逆境及非生物性逆境的影响，严重者导致作物产量减少，造成农业经济损失。大体而言，生物性逆境多来自于病原感染，被感染的植物会逐渐黄化、腐烂、萎凋甚至死亡。非生物性逆境则例如高温、寒害、干旱、高盐及辐射照射等，会改变植物生长过程，生成过量活性氧(reactive oxygen species,ROS)导致氧化压力、严重者甚至死亡。

目前大多施用化学性农药或肥料，以帮助植物克服上述逆境。然而，化学性农药或肥料的残留会造成环境污染，因此开发非化学性农药或肥料，以帮助作物对抗逆境，实为重要议题。

益生菌发展已久，且益生菌安全又无副作用，过去研究指出特定菌种的乳酸菌具有抑制病原菌之功效。例如植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)可抑制黑腐病的黑腐病菌(Xanthomonas campestris)、萎凋病的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)及疫病的德雷疫霉(Phytophthora drechsleri Tucker)等植物性病原菌生长；干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)及植物乳杆菌的发酵液，可抑制造成炭疽病的胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)与造成灰霉病的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。不过，未经实证研究，无法预期在不同植株上是否具有提升抗生物性逆境以及抗非生物性逆境之能力，仍有必要寻找更佳的植物生长调节剂。

有鉴于此，实有必要提供一种植物生长调节剂，以利于后天提升植物抗逆境能力，进而帮助植物对抗逆境、甚至提升其适应气候变迁的能力。

【发明内容】

因此，本发明的一个目的是提供一种提高抗逆境能力的植物生长调节剂，其由乳杆菌发酵培养液所组成。

本发明的另一目的是提供一种乳杆菌发酵培养液用于制备提高抗逆境能力的植物生长调节组合物的用途，其是向植物的全株、植物部位及/或植物的栽培介质给予上述的乳杆菌发酵培养液，以提高植物抗生物性逆境或非生物性逆境的能力。

根据本发明的上述目的，提出一种提高抗逆境能力的植物生长调节剂，其由乳杆菌发酵培养液所组成。

在上述实施例中，乳杆菌发酵培养液为来自于副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)GMNL-32(亦称为GM-080)，保藏于中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学典型培养物保藏中心(CCTCC)，且保藏编号为CCTCC M 204012。

在本发明的一实施例中，上述乳杆菌发酵培养液可例如为含有副干酪乳杆菌GMNL-32的活菌或死菌。

根据本发明的另一目的，提出一种乳杆菌发酵培养液用于制备提高抗逆境能力的植物生长调节组合物的用途，包含向植物的全株、植物部位及/或植物的栽培介质给予上述的乳杆菌发酵培养液，以提高植物抗生物性逆境或非生物性逆境的能力。

在本发明的一实施例中，上述植物可例如为双子叶植物或单子叶植物。在一例子中，上述双子叶植物为茄科植物或瓜科植物。

在本发明的一实施例中，上述生物性逆境可包含病原菌的感染。在一例子中，上述病原菌包含炭疽菌属及假单胞菌属。

在本发明一实施例中，上述非生物性逆境可例如至少45℃之高温、紫外线及至少14天之干旱。

应用本发明的提高抗逆境能力的植物生长调节剂，其由副干酪乳杆菌的发酵培养液所组成，具有优异的热稳定性、安全且不具有副作用，可显著提高植物抗生物性逆境以及抗非生物性逆境的能力，进而用于植物生长调节剂或制备提高植物抗逆境能力的组合物的用途。

【附图说明】

为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的详细说明如下：

〔图1A〕及〔图1B〕显示根据本发明一实施例的西红柿植株经给予植物生长调节剂后接种胶孢炭疽菌的叶片外观(图1A)及每个叶片之病斑数直方图(图1B)；

〔图2A〕至〔图2D〕显示根据本发明一实施例的西红柿植株经给予植物生长调节剂后接种西红柿丁香假单胞菌的叶片外观(图2A、图2C)及每个叶片之病斑数直方图(图2B、图2D)；

〔图3A〕及〔图3B〕显示根据本发明一实施例的西红柿植株经给予植物生长调节剂后以热处理的植株外观(图3A)及热损伤直方图(图3B)；

〔图4A〕及〔图4B〕显示根据本发明一实施例的西红柿植株经给予植物生长调节剂后照射紫外线的植株外观(图4A)及热损伤直方图(图4B)；

〔图5A〕及〔图5B〕显示根据本发明一实施例的西红柿植株经给予植物生长调节剂后干旱处理的植株外观(图5A)及干旱损伤直方图(图5B)；

〔图6A〕及〔图6B〕显示根据本发明一实施例的西红柿植株经接种苏云金芽孢杆菌(图6A)或液化淀粉芽孢杆菌(图6B)的菌液后给予植物生长调节剂的根部菌数直方图；

〔图7〕显示根据本发明一实施例的西红柿植株给予植物生长调节剂的叶部过氧化氢含量直方图；

〔图8〕显示根据本发明一实施例的西红柿植株给予植物生长调节剂的叶部过氧化氢酶活性含量直方图；

〔图9A〕至〔图9F〕显示根据本发明一实施例的西红柿植株经给予植物生长调节剂后基因LeOPR3、LeCOI1及LeJAZ1的mRNA相对含量直方图；

〔图10A〕及〔图10B〕显示根据本发明一实施例的西红柿植株经给予植物生长调节剂后基因LePR1的mRNA相对含量直方图。

【具体实施方式】

本发明所提到的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。数值范围(如10％～11％的A)若无特定说明皆包含上、下限值(即10％≦A≦11％)；数值范围若未界定下限值(如低于0.2％的B，或0.2％以下的B)，则皆指其下限值可能为0(即0％≦B≦0.2％)。上述用语是用以说明及理解本发明，而非用以限制本发明。

本发明提供一种提高抗逆境能力的植物生长调节剂及其应用，其由乳杆菌发酵培养液所组成，可显著提升植物抗生物性逆境以及抗非生物性逆境之能力。

在一实施例中，上述乳杆菌发酵培养液为来自副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)GMNL-32(亦称为GM-080)。具体而言，上述副干酪乳杆菌GMNL-32指于2004年2月19日保藏于中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学典型培养物保藏中心(CCTCC)、保藏编号为CCTCC M 204012的菌株。

在上述实施例中，上述乳杆菌发酵培养液可例如含有副干酪乳杆菌GMNL-32的活菌或死菌。

在应用时，上述乳杆菌发酵培养液可用于制备提高抗逆境能力的植物生长调节组合物的用途。在本发明的一实施例中，上述乳杆菌发酵培养液可通过非侵入的方式(例如喷洒法、抽气接种法、浸泡法等)或侵入的方式(例如经由切口或伤口等)，向植物的全株、植物部位及/或植物的栽培介质而给予，藉此提升植物抗生物性逆境或非生物性逆境的能力。

本发明此处所述的提高植物抗逆境能力可包括但不限于提高植物抗生物性逆境或非生物性逆境的能力。

在上述实施例中，植物之种类并无特别限制。不过在一些例子中，前述植物可例如双子叶植物或单子叶植物，其中双子叶植物可例如茄科植物或瓜科植物，茄科植物之具体例子可为西红柿，而瓜科植物之具体例子可为木瓜，而单子叶植物之具体例子可为水稻。

在上述实施例中，栽培介质之种类并无特别限制。不过在一些例子中，前述栽培介质之具体例子可包含但不限于水、土壤、培养土、发泡炼石、树皮、人造土、科技土、蛭石、珍珠石、蛇木屑、沸石、水草或上述之任意组合。

本发明此处所述的生物性逆境可包含病原菌的感染，惟前述病原菌的种类视植物种类而异，本发明并无特别限制。在一例示中，前述的病原菌可包含但不限于炭疽菌属及假单胞菌属，其中炭疽菌属之具体例子可包含但不限于胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)，假单胞菌属之具体例子可包含但不限于西红柿丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.Tomato)与无致病力变种之西红柿丁香假单胞菌。

本发明此处所述的非生物性逆境可包含各种不适合植物生长的环境，其具体例子可包含但不限于至少45℃之高温、紫外线及至少14天之干旱，惟本发明不限于此处所列举。

本发明前处所述的提高抗逆境能力亦可包括但不限于通过提高根际菌缠聚植物根部的能力、提高植物内部过氧化氢含量及过氧化酶活性、提高植物抗病基因表达(例如促进植物体内茉莉酮酸(JA)及水杨酸(SA)相关基因的表现量)等机制，以于后天提高植物抗逆境能力。

在本发明的一实施例中，上述植物生长调节剂的剂型可例如为液态、粉末、膏状、块状、锭剂、胶囊、或结合其他适合的载体，惟本发明不限于此处所列举。另外，上述植物生长调节剂为以乳杆菌发酵培养液作为有效成分，并可视实际需求，选择性添加其他各种习知非活性成分。

在本发明的一实施例中，上述植物生长调节剂的菌体浓度并无特别限制，可视植物种类及施用部位而调整。举例而言，在施用于叶片的例子中，可于叶片表面喷洒的方式给予乳杆菌发酵培养液(原液稀释10倍)至少10次，或于叶片表面以抽气接种的方式给予乳杆菌发酵培养液(菌液浓度10⁷CFU/mL)。在施用于土壤的例子中，其单次有效剂量可例如于2kg土壤中给予150mL的乳杆菌发酵培养液(原液稀释10倍)，然本发明不限于此处所列举。

以下利用数个实施例以说明本发明之应用，然其并非用以限定本发明，本发明技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作各种之更动与润饰。

实施例一、由副干酪乳杆菌GMNL-32制备植物生长调节剂

首先，本实施例评估副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei；GMNL-32)之菌学特征。

1.副干酪乳杆菌GMNL-32之菌学特征

副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-32的来源为健康人体胃肠道，其外观特征及生理特征已揭露于中国专利公告号CN 100396771C，在此一并列为参考文献。

其次，副干酪乳杆菌GMNL-32经API 50 CHI V5.1鉴定试剂盒分析后(图未绘示)，确认为副干酪乳杆菌。

另外，利用习知方法提取副干酪乳杆菌GMNL-32的总RNA后，通过如序列编号(SEQID NO):1及2的引物对(上游引物为PAF primer，下游引物为536R primer)扩增16S rDNA基因的部分序列，其中所得的核酸片段如序列编号(SEQ ID NO):3所示。关于提取总RNA的方法属本发明所属技术领域具有通常知识者所熟知，在此不另赘述。

此核酸片段与美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information；NCBI)基因库(GenBank)比对后，亦确认为副干酪乳杆菌。

2.制备植物生长调节剂

将副干酪乳杆菌GMNL-32置于5L发酵槽培养隔夜后，收集发酵培养液(菌数约10⁶CFU/mL至约10⁹CFU/mL)，即为副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养原液。

上述副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养原液再经高温(90℃至121℃)进行热灭杀15分钟至30分钟，即为副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液。

上述发酵培养原液经水稀释10倍后，分别为副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液(以下简称GMNL-32)或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液(以下简称GMNL-32_HK)，以进一步评估二者作为植物生长调节剂的效果。

实施例二、评估植物生长调节剂提高植物抗逆境能力的效果

1.评估植物生长调节剂提高西红柿植株抗生物逆境的效果

1.1接种植物病原菌

此实施例利用西红柿植株(Solanum lycopersicum，品系：农友301，农友种苗公司，台湾)，4至5周大)，其叶片在田间先经实施例一的副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液处理11次后，再分别接种下述植物病原菌。

将胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides；造成西红柿炭疽病)培养于1/5马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基(Potato Dextrose Agar；PDA)培养基中，以5mL含0.05％Tween 20的0.1％水琼脂(wateragar；WA)培养基震荡5分钟后，利用血球计数器计算分生孢子数量。接着，将分生孢子调整浓度至10⁶孢子/mL﹝含1/5马铃薯-葡萄糖-肉汤(PotatoDextrose Broth；PDB)及10mM MgSO₄)﹞，喷洒接种于经副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液处理后的西红柿叶片上。于接种5天后，拍摄植株外观并计算每个叶片的病斑数，其中叶片黑化坏疽代表一个病斑，其结果如图1A及图1B所示。

另外，将西红柿丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000；PstDC3000；造成西红柿细菌性斑点病)与无致病力变种的西红柿丁香假单胞菌Pst DC3000avrRpt2，分别培养于含50ppm立泛霉素(rifampicin)的国王培养基B(King's medium B；KBM)与含50ppm立泛霉素及康那霉素(kanamycin)的KBM中，以逆渗透(RO)水调整菌液浓度至10⁷CFU/mL，以抽气接种法接种于经副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液处理后的西红柿叶片上。于接种4天后，拍摄植株外观并计算每个叶片的病斑数，其结果如图2A至图2D所示。

上述所得的数据均以平均值(mean)±标准偏差(SD)表示，利用市售统计软件(例如SPSS 12.0)进行统计分析，以单因子变异数分析(one-way analysis of variance)比较各组差异，再以邓肯式多变域分析法(Duncam’s multiple range method)进行显著性差异的比较。图1B、图2B及图2D的英文字母a、b、c分别代表统计的结果，不同字母表示组间具有显著性差异(p<0.05)，相同字母表示组间不具有统计上差异(p>0.05)。

1.2评估植物生长调节剂提高西红柿植株抗炭疽菌的效果

请参阅图1A及图1B，其显示根据本发明一实施例的西红柿植株经给予植物生长调节剂后接种胶孢炭疽菌的叶片外观(图1A)及每个叶片的病斑数直方图(图1B)。在图1B中，假处理(Mock)代表未给予植物生长调节剂但接种胶孢炭疽菌的植株叶片外观。

由图1A及图1B的假处理组的结果显示，西红柿叶片以胶孢炭疽菌喷洒5天后，确实会使叶片发生黄化现象(如图1A所示)，并产生黑色腐烂的坏疽斑(图1A及图1B)。

然而，由图1A及图1B的GMNL-32或GMCL-32_HK处理组的结果显示，西红柿叶片经给予植物生长调节剂后再以胶孢炭疽菌喷洒5天后，叶片没有黄化现象(如图1A所示)，且显著减少病斑数(图1A及图1B)，显示副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液可增加西红柿抵抗胶孢炭疽菌感染的效果。

其次，副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液经热灭杀处理后(即GMCL-32_HK)，仍具有保护效果(如图1B所示)，且与副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液不具有统计上的显著差异性﹝相同字母表示组间不具有统计上差异(p>0.05)﹞，代表副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液的保护效果不受热影响。

1.3评估植物生长调节剂提高西红柿植株抗假单胞菌的效果

请参阅图2A至图2D，其显示根据本发明一实施例的西红柿植株经给予植物生长调节剂后接种西红柿丁香假单胞菌的叶片外观(图2A、图2C)及每个叶片之病斑数直方图(图2B、图2D)。在图2A至图2D中，假处理(Mock)代表未给予植物生长调节剂但接种西红柿丁香假单胞菌(图2A至图2B)或无致病力变种的西红柿丁香假单胞菌(图2C至图2D)的植株叶片外观。

由图2A至图2D的假处理组的结果显示，西红柿叶片以西红柿丁香假单胞菌(PstDC3000)或无致病力变种之西红柿丁香假单胞菌(Pst DC3000 avrRpt2)接种4天后，确实会使叶片发生黄化现象(如图2A所示)，并产生黑色腐烂的坏疽斑(图2A至图2D)。

由图2A至图2D的GMNL-32处理组的结果显示，西红柿叶片经给予植物生长调节剂后再以西红柿丁香假单胞菌(Pst DC3000)或无致病力变种之西红柿丁香假单胞菌(PstDC3000 avrRpt2)接种4天后，叶片病斑数显著减少(图2B及图2D)，显示副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液可增加西红柿抵抗西红柿丁香假单胞菌感染的效果。

其次，副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液经热灭杀处理后(即GMCL-32_HK)，仍具有保护效果(如图2B及图2D所示)，且与副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液不具有统计上的显著差异性﹝相同字母表示组间不具有统计上差异(p>0.05)﹞，代表副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液的保护效果不受热影响。

2.评估植物生长调节剂提高西红柿抗非生物逆境的效果

此实施例利用西红柿植株(Solanum lycopersicum，品系：农友301，农友种苗公司，台湾)，4至5周大)，分别以RO水﹝假处理(Mock)﹞、实施例一的副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液处理(即浇灌植株)9天后，进行以下各种逆境处理。

2.1评估植物生长调节剂提高西红柿植株耐热能力的效果

将上述西红柿植株以45℃处理6小时达高温损伤后，拍摄植株外观，并于接下来的24小时内进行损伤程度分级观测，其结果如图3A及图3B。前述损伤程度以式(I)进行损伤程度分级量化：

高温损伤(％)＝[(卷曲叶片数/总叶片数)*100％]。 (I)

图3B的英文字母a、b、c分别代表统计结果，不同字母表示组间具有显著性差异(p<0.05)。

请参阅图3A及图3B，其显示根据本发明一实施例的西红柿植株经给予植物生长调节剂后以热处理的植株外观(图3A)及热损伤直方图(图3B)。在图3B中，纵轴代表热损伤率(％)，横轴则代表各处理组，其中假处理(Mock)代表以水进行处理，GMNL-32代表以副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液进行处理，GMNL-32_HK代表以副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液进行处理。

由图3A假处理组的结果显示，假处理组的西红柿植株以水处理后再以高温45℃处理6小时并静置24小时，叶片会卷曲死亡。

然而，由图3A及图3B的GMNL-32或GMCL-32_HK处理组的结果显示，西红柿植株经副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液浇灌后，叶片卷曲情况较不严重(如图3A所示)。而且由图3B分级量化热损伤率的结果显示，相较于假处理组的热损伤程度，经副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液处理后，可显著降低西红柿植株的热损伤程度，显示副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液可增加西红柿植株的耐热能力。

其次，副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液经热灭杀处理后(即GMCL-32_HK)，仍具有保护效果(如图3B所示)，代表副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液的保护效果不受热影响。

2.2评估植物生长调节剂降低紫外线损伤西红柿植株的效果

以UV-C(波长253.7nm)照射上述西红柿植株30分钟达紫外线损伤后，于接下来的24小时内拍摄植株外观，并以式(II)进行损伤程度分级，其结果如图4A及图4B：

损伤率(％)＝

(N0*n+N1*n+N2*n+N3*n)/(Nt*nt)*100。 (II)

在式(II)中，N代表级数，n代表样本数，Nt代表总级数，nt代表总样品数。图4B之英文字母a、b、c分别代表统计之结果，不同字母表示组间具有显著性差异(p<0.05)，相同字母表示组间不具有统计上差异(p>0.05)。

请参阅图4A及图4B，其显示根据本发明一实施例的西红柿植株经给予植物生长调节剂后照射紫外线的植株外观(图4A)及热损伤直方图(图4B)。在图4B中，纵轴代表紫外线损伤率(％)，横轴则代表各处理组，其中假处理(Mock)代表以水进行处理，GMNL-32代表以副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液进行处理，GMNL-32_HK代表以副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液进行处理。

由图4A假处理组的结果显示，假处理组的西红柿植株以水处理后再以UV-C(波长253.7nm)照射30分钟并静置24小时，叶片会卷曲死亡。

然而，由图4A及图4B的GMNL-32或GMCL-32_HK处理组的结果显示，西红柿植株经副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液浇灌后，叶片卷曲情况明显降低(如图4A所示)。而且由图4B分级量化热损伤率的结果显示，相较于假处理组的紫外线损伤程度，经副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液处理后，可显著降低西红柿植株的紫外线损伤程度，显示副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液可增加西红柿植株的抗紫外线能力。

其次，副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液经热灭杀处理后(即GMCL-32_HK)，仍具有保护效果(如图4B所示)，且与副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液不具有统计上的显著差异性﹝相同字母表示组间不具有统计上差异(p>0.05)﹞，代表副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液的保护效果不受热影响。

2.3评估植物生长调节剂降低干旱损伤西红柿植株的效果

干旱损伤方法为将上述西红柿植株经副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液处理后，即停止浇水，于14天拍摄植株外观并以式(II)进行损伤程度分级，其结果如图5A及图5B。

图5B的英文字母a、b、c分别代表统计的结果，不同字母表示组间具有显著性差异(p<0.05)，相同字母表示组间不具有统计上差异(p>0.05)。

请参阅图5A及图5B，其显示根据本发明一实施例的西红柿植株经给予植物生长调节剂后干旱处理的植株外观(图5A)及干旱损伤直方图(图5B)。在图5B中，纵轴代表干旱损伤率(％)，横轴则代表各处理组，其中假处理(Mock)代表以水进行处理，GMNL-32代表以副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液进行处理，GMNL-32_HK代表以副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液进行处理。

由图5A假处理组的结果显示，假处理组的西红柿植株以水处理后再断水14天后，叶片会卷曲干枯死亡。

然而，由图5A及图5B的GMNL-32或GMCL-32_HK处理组的结果显示，西红柿植株经副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液浇灌后，叶片干枯情况明显降低(如图5A所示)。而且由图5B分级量化干旱损伤率的结果显示，相较于假处理组的干旱损伤程度，经副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液处理后，可显著增加西红柿植株对干旱的耐受能力。

其次，副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液经热灭杀处理后(即GMCL-32_HK)，仍具有保护效果(如图5B所示)，且与副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液不具有统计上的显著差异性﹝相同字母表示组间不具有统计上差异(p>0.05)﹞，代表副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液的保护效果不受热影响。

3.评估植物生长调节剂提高根际菌缠聚西红柿根部能力的效果

目前已知促进植物生长根际菌(plant growth-promoting rhizobacteria；PGPR)包含苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)及液化淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。此实施例评估通过植物生长调节剂，调节根际菌缠聚根部的能力，进而提高植物抗逆境能力。

首先，将苏云金芽孢杆菌及液化淀粉芽孢杆菌接种于营养肉汁(Nutrient broth；NB)液态培养基，于28℃下培养14小时及16小时。接着，将所得的菌液浓度调整至OD_600nm 0.8后，分别倒入2kg土壤中(土壤菌数＝10⁸CFU/g)，同时加入150mL的副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液，于1、5、9、13、17及30天采集西红柿根部组织，秤重后以20mL含0.025％SILWET L-77之0.1％WA震荡5分钟，进行序列稀释并以玻璃珠涂于LB(Luria-Bertaini)培养基中，置于28℃培养1天后计算菌落数，以评估根际菌于植物根部缠聚能力，其结果分别如图6A及图6B所示。图6A及图6B之英文字母a、b、c分别代表统计的结果，不同字母表示组间具有显著性差异(p<0.05)，相同字母表示组间不具有统计上差异(p>0.05)。

请参阅图6A及图6B，其显示根据本发明一实施例的西红柿植株经接种苏云金芽孢杆菌(图6A)或液化淀粉芽孢杆菌(图6B)之菌液后给予植物生长调节剂的根部菌数直方图。在图6A及图6B中，假处理(Mock)组代表接种苏云金芽孢杆菌或液化淀粉芽孢杆菌之菌液仅给予等体积的水(但未给予植物生长调节剂)的根部菌数。

由图6A的假处理组的结果显示，西红柿根部接种苏云金芽孢杆菌之菌液后，经过9天后可观察到菌数下降约100倍。然而，接种菌液时若同时加入副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液，则可减缓苏云金芽孢杆菌之菌数下降，并维持苏云金芽孢杆菌之菌数达30天。

由图6B的假处理组之结果显示，西红柿根部接种液化淀粉芽孢杆菌之菌液后，经过5天后亦可观察到菌数下降约100倍。然而，接种菌液时若同时加入副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液，则可减缓液化淀粉芽孢杆菌菌数下降，并维持液化淀粉芽孢杆菌之菌数达21天，显示副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液皆具有维持植物根际菌缠聚于西红柿植株根部的效果。

其次，副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液经热灭杀处理后(即GMCL-32_HK)，仍具有保护效果(如图6A及图6B所示)，代表副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液的保护效果不受热影响。

4.评估植物生长调节剂提高西红柿的过氧化氢含量的效果

西红柿植株移植生长5天后，于根部灌浇25mL的副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液。在处理0、12、24、36与48小时后，取植物顶部第二片叶片的0.05g，以液态氮磨碎，加入600μL磷酸缓冲溶液(50mM,pH 6.8)震荡10秒。接着，以9,000xg离心25分钟，取400μL之上层溶液加入200μL硫酸钛溶液后，震荡10秒，再以6,000xg离心15分钟。之后，取200μL上层溶液，测定于410nm之吸光值，并利用式(III)计算过氧化氢含量，其结果如图7所示：

过氧化氢含量＝

{[(OD_410nm-0.0011)/0.0004]*1.5}/重量(mg)。 (III)

图7之英文字母a、b分别代表统计的结果，不同字母表示组间具有显著性差异(p<0.05)，相同字母表示组间不具有统计上差异(p>0.05)。

请参阅图7，其显示根据本发明一实施例的西红柿植株给予植物生长调节剂的叶部过氧化氢含量直方图。在图7中，假处理(Mock)组代表仅给予等体积的水(但未给予植物生长调节剂)的叶部过氧化氢含量。

由图7的假处理组的结果显示，西红柿植株经水处理后，叶部的过氧化氢含量并无显著变化。然而，西红柿植株经副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液处理12小时后，能有效提高叶片的过氧化氢含量。另外，而经副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液处理12及24小时均有效提高叶片的过氧化氢含量，显示副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液皆具有提高西红柿的过氧化氢含量的效果。

5.评估植物生长调节剂提高西红柿的过氧化酶活性的效果

西红柿植株移植生长5天后，于根部灌浇25mL的副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液。在处理12、24、36与48小时后，取植物顶部第二片叶片的0.05g，以液态氮磨碎，加入1,000μL磷酸缓冲溶液(50mM,pH 5.8)震荡10秒。接着，以12,000xg离心20分钟，取10μL上层溶液加入100μL磷酸盐缓冲溶液、100μL磷甲氧基苯酚与90mL 39mM过氧化氢，测定于470nm之吸光值，并利用式(IV)计算过氧化酶(peroxidase)活性，其结果如图8所示：

过氧化酶活性(ΔAbs 470nm/min/gFW)＝

(△OD_470nm)/26.6*反应体积(mL)*稀释倍率/反应时间/重量(g)。 (IV)

图8之英文字母a、b分别代表统计的结果，不同字母表示组间具有显著性差异(p<0.05)，相同字母表示组间不具有统计上差异(p>0.05)。

请参阅图8，其显示根据本发明一实施例的西红柿植株给予植物生长调节剂的叶部过氧化氢酶活性含量直方图。在图8中，假处理(Mock)组代表仅给予等体积的水(但未给予植物生长调节剂)的叶部过氧化酶活性。

由图8的假处理组的结果显示，西红柿植株经水处理后，叶部的过氧化酶活性并无显著变化。然而，相较于假处理(Mock)组，西红柿植株经副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液处理24小时后，其叶片的过氧化酶活性有效提高5倍，并可维持至48小时。另外，而经副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液处理12小时后，亦可有效提高叶片的过氧化酶活性，并维持至36小时，显示副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液皆具有提高西红柿的过氧化氢含量的效果。

6.评估植物生长调节剂提高西红柿的抗病基因表达的效果

目前已知与茉莉酮酸(jasmonic acid；JA)相关的信号传递路径中的调控基因(例如LeOPR3、LeCOI1及LeJAZ1)，与水杨酸(salicylic acid；SA)相关的信号传递路径中的调控基因(例如LePR1)，与植株抗病相关，通过检测上述基因的mRNA表达量，以评估植物生长调节剂提高西红柿抗病的效果。

西红柿植株培养20天后，于根部灌浇25mL的副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液。在处理1天及3天后，取植物顶部第二片叶片，利用市售提取总RNA试剂盒(如Tissue total RNA mini kit)提取植物组织的总RNA。接着，利用市售反转录试剂盒(如MMLV Reverse Transcription kit)将1μL RNA反转录成cDNA后，加入1μL 10mM之引物对、2μL 10X PCR缓冲液、1μL 2.5mM dNTP、0.1μL 5units/μL Pro TaqDNA聚合酶(polymerase)、10μL 2X super SYBR Green PCR Master Mix，并以无菌水将反应物的总体积补至20μL，进行实时定量(Quantitative real time)PCR反应，其结果如图9A至图10B所示。

前述引物对包含LeOPR3、LeCOI1、LeJAZ1及LePR1的上游引物及下游引物，其序列如序列编号(SEQ ID NO):4至13所示。LeOPR3、LeCOI1、LeJAZ1及LePR1之PCR反应循环数，与ef1α之PCR反应循环数二者的比值，作为相对值的数据。上述所得的数据利用与实施例相同的统计方法进行，此处不另赘述。图9A至图10B的英文字母a、b分别代表统计的结果，不同字母表示组间具有显著性差异(p<0.05)，相同字母表示组间不具有统计上差异(p>0.05)。

6.1评估植物生长调节剂提高西红柿的茉莉酮酸相关信号传递路径的效果

请参阅图9A至图9F，其显示根据本发明一实施例的西红柿植株经给予植物生长调节剂后基因LeOPR3、LeCOI1及LeJAZ1的mRNA相对含量直方图。

由图9A至图9F的结果显示，以假处理组的LeOPR3、LeCOI1与LeJAZ1的mRNA表达量为1.0，经副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液(如图9A至图9C所示)或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液(如图9D至图9F所示)处理1天后的西红柿植株，其叶片中JA调控基因LeOPR3、LeCOI1与LeJAZ1的表达，皆显著高于假处理组(Mock)。而在处理3天后，经副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液(如图9A至图9C所示)或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液(如图9D至图9F所示)处理后的西红柿植株内LeCOI1表达量，仍与假处理组(Mock)具显著性差异，显示以副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液处理植株，确实能活化植物体内茉莉酮酸(JA)相关的抗病路径。

6.2评估植物生长调节剂提高西红柿的水杨酸相关信号传递路径的效果

请参阅图10A及图10B，其显示根据本发明一实施例的西红柿植株经给予植物生长调节剂后基因LePR1的mRNA相对含量直方图。

由图10A及图10B的结果显示，以假处理组的LePR1的mRNA表达量为1.0，经副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液(如图10A所示)或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液(如图10B所示)处理1天后的西红柿植株，其叶片中SA调控基因LePR1的表达显著高于假处理组(Mock)。而在处理3天后，经副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液(如图10B所示)处理后的西红柿植株内LePR1表达量，仍与假处理组(Mock)具显著性差异，显示以副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液处理植株，确实能活化植株体内水杨酸(SA)相关的抗病路径。

由上述结果显示，本发明以西红柿作为植物模型，证实经副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液处理后，的确提高植物抗生物性逆境(包含抑制胶孢炭疽菌、西红柿丁香假单胞菌Pst DC3000与无致病力变种的西红柿丁香假单胞菌Pst DC3000 avrRpt2对西红柿植株的感染)以及抗非生物性逆境(包含高温、紫外线及干旱)的能力。而植株抗病能力的提高，有可能是通过维持根际菌缠聚于植株根部的能力、有效增加植株体内的过氧化氢含量及过氧化酶活性、大量表达与抗病相关的基因(包含与茉莉酮酸相关之信号传递路径中的调控基因LeOPR3、LeCOI1及LeJAZ1，以及与水杨酸相关的信号传递路径中的调控基因LePR1)，由此增加对生物性(即病原菌)与非生物性(即环境)的抗性，使植物更有能力适应逆境或气候变迁。

补充说明的是，本发明使用的副干酪乳杆菌GMNL-32源自于人体胃肠道，而副干酪乳杆菌GMNL-32发酵培养液或副干酪乳杆菌GMNL-32热灭杀发酵培养液经上述实验证实具有优异的热稳定性(保护效果不受热影响)、安全且不具有副作用，确实有潜力应用于植物生长调节剂或含此的植物液肥。

综言之，本发明虽以特定菌株、特定的剂型、特定的对象、特定的给予方式、或特定的评估方式作为例示，说明本发明的提高抗逆境能力的植物生长调节剂及其用途，惟本发明所属技术领域中任何具有通常知识者可知，本发明并不限于此，在不脱离本发明之精神和范围内，本发明亦可使用其他菌株、其他的剂型、其他的对象、其他的给予方式或其他的评估方式进行。

举例而言，本发明的植物生长调节剂可给予其他双子叶植物(例如瓜科植物的木瓜)或单子叶植物(例如水稻)的全株、一部位或其栽培介质，以提高植物抗生物性逆境以及抗非生物性逆境的能力。另外，本发明的植物生长调节剂之剂型可为液态、粉末、膏状、块状、锭剂、胶囊、或结合其他适合的载体，惟本发明不限于此处所举。

由上述实施例可知，本发明的提高抗逆境能力的植物生长调节剂及其用途，其优点在于此植物生长调节剂由副干酪乳杆菌的发酵培养液所组成，具有优异的热稳定性、安全且不具有副作用，可显著提高植物抗生物性逆境以及抗非生物性逆境的能力，进而用于植物生长调节剂或制备提高植物抗逆境能力的组合物的用途。

虽然本发明已以数个实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，在本发明所属技术领域中任何具有通常知识者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作各种之更动与润饰，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。

【生物材料保藏】

副干酪乳杆菌GMNL-32(亦称为GM-080)保藏于中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2004年2月19日，保藏编号为CCTCC M204012。

【序列表】

<110> 景岳生物科技股份有限公司

<120> 提高抗逆境能力的植物生长调节剂及其用途

<130> 无

<160> 13

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物(PAF)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物(536R)

<400> 2

gtattaccgc ggctgctg 18

<210> 3

<211> 521

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)16S rDNA部分序列

<400> 3

tctgcggtgc ctatacatgc aagtcgtacg cactggccca actgattgat ggtgcttgca 60

cctgattgac gatggatcac cagtgagtgg cggacgggtg agtaacacgt aggtaacctg 120

ccccggagcg ggggataaca tttggaaaca gatgctaata ccgcataaca acaaaagcca 180

catggctttt gtttgaaaga tggctttggc tatcactctg ggatggacct gcggtgcatt 240

agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcgatgatgc atagccgagt tgagagactg 300

atcggccaca atggaactga gacacggtcc atactcctac gggaggcagc agtagggaat 360

cttccacaat gggcgcaagc ctgatggagc aacaccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc 420

tcgtaaagct ctgttgttgg agaagaacgt gcgtgagagt aactgttcac gcagtgacgg 480

tatccaacca gaaagtcacg gctaactacg tgccagatgg g 521

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物(LeOPR3)

<400> 4

TTGGCTTAGC AGTTGTTGAA AG 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物(LeOPR3)

<400> 5

tacgtatcgt ggctgtgtta ca 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物(LeCOI1)

<400> 6

atgggcgagc catcgctaag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物(LeCOI1)

<400> 7

agccctggct accttgcagc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物(LeJAZ1)

<400> 8

CGTCCGTTGA AACAAATCCT 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物(LeJAZ1)

<400> 9

GGGGTTCTGT TTGTTGGCTA 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物(LePR1)

<400> 10

CCGTGCAATT GTGGGTGTC 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物(LePR1)

<400> 11

gagttgcgcc agactactt 19

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物(ef1α)

<400> 12

agcccccttc gtcttccact tc 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物(ef1α)

<400> 13

accagtctca acacgtccca c 21

Claims

1.一种乳杆菌发酵培养液在制备提高抗逆境能力的植物生长调节组合物中的用途，其特征在于包含向一植物的全株、一植物部位及/或该植物的一栽培介质给予一乳杆菌发酵培养液，以提高该植物抗生物性逆境或非生物性逆境的能力，其中该乳杆菌发酵培养液源自于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-32，且该副干酪乳杆菌GMNL-32于2004年2月19日保藏于中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCM 204012，且该乳杆菌发酵培养液为含有该副干酪乳杆菌GMNL-32的活菌或死菌。

2.根据权利要求1所述的乳杆菌发酵培养液在制备提高抗逆境能力的植物生长调节组合物中的用途，其特征在于其中该植物为双子叶植物或单子叶植物。

3.根据权利要求2所述的乳杆菌发酵培养液在制备提高抗逆境能力的植物生长调节组合物中的用途，其特征在于其中该双子叶植物为茄科植物或瓜科植物。

4.根据权利要求3所述的乳杆菌发酵培养液在制备提高抗逆境能力的植物生长调节组合物中的用途，其特征在于其中该茄科植物为西红柿。

5.根据权利要求3所述的乳杆菌发酵培养液在制备提高抗逆境能力的植物生长调节组合物中的用途，其特征在于其中该瓜科植物为木瓜。

6.根据权利要求3所述的乳杆菌发酵培养液在制备提高抗逆境能力的植物生长调节组合物中的用途，其特征在于其中该单子叶植物为水稻。

7.根据权利要求1所述的乳杆菌发酵培养液在制备提高抗逆境能力的植物生长调节组合物中的用途，其特征在于其中该植物部位包含一叶片、一茎部及/或一根部。

8.根据权利要求1所述的乳杆菌发酵培养液在制备提高抗逆境能力的植物生长调节组合物中的用途，其特征在于其中该栽培介质选自水、土壤、培养土、发泡炼石、树皮、人造土、科技土、蛭石、珍珠石、蛇木屑、沸石、水草及上述之任意组合。

9.根据权利要求1所述的乳杆菌发酵培养液在制备提高抗逆境能力的植物生长调节组合物中的用途，其特征在于其中该生物性逆境包含一病原菌的感染。

10.根据权利要求9所述的乳杆菌发酵培养液在制备提高抗逆境能力的植物生长调节组合物中的用途，其特征在于其中该病原菌包含炭疽菌属及假单胞菌属。

11.根据权利要求10所述的乳杆菌发酵培养液在制备提高抗逆境能力的植物生长调节组合物中的用途，其特征在于其中该炭疽菌属包含胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)。

12.根据权利要求10所述的乳杆菌发酵培养液在制备提高抗逆境能力的植物生长调节组合物中的用途，其特征在于其中该假单胞菌属包含西红柿丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae pv.Tomato)与无致病力变种的西红柿丁香假单胞菌。

13.根据权利要求1所述的乳杆菌发酵培养液在制备提高抗逆境能力的植物生长调节组合物中的用途，其特征在于其中该非生物性逆境包含至少45℃高温、紫外线及至少14天干旱。