CN107540624B

CN107540624B - 热休克蛋白抑制剂及其制备方法和应用

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Publication number: CN107540624B
Application number: CN201610509310.5A
Authority: CN
Inventors: 张健存; 林财; 李德耀; 邹晴安; 张袁超; 顾自强
Original assignee: Guangzhou Henovcom Bioscience Co ltd
Current assignee: Guangzhou Henovcom Bioscience Co ltd
Priority date: 2016-06-29
Filing date: 2016-06-29
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2036-06-29
Also published as: CN107540624A; WO2018001084A1

Abstract

本发明公开了一种热休克蛋白抑制剂及其制备方法和应用，属于药物化学技术领域。该热休克蛋白抑制剂具有式I结构特征。该类化合物能够抑制热休克蛋白90的活性，进而可以用于制备抗肿瘤的药物中。

Description

热休克蛋白抑制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，特别是涉及一种热休克蛋白抑制剂及其制备方法和应用。

背景技术

热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是生物体中普遍存在的高度保守的蛋白质。根据分子量大小，热休克蛋白分为：HSP100(100-110kD)，HSP90(83-90kD)，HSP70(66-78kD)，HSP60及小分子HSP(15-30kD)。其中，热休克蛋白90(HSP90)是ATP依赖性的分子伴侣，参与客户蛋白(client protein)激活并促进其成熟，维持细胞多种蛋白的构象和功能，与细胞的增殖、凋亡、癌变和肿瘤发展密切相关。在普通细胞中，表达的HSP90占细胞内总蛋白的1-2％，而这其中的3％是在细胞核内发现的，其具有影响细胞核调节的功能。在应激状态下，如在癌细胞中，表达的HSP90的水平增加到占整个蛋白质组学的4-6％。HSP90与200多种不同的客户蛋白相互作用，这些客户蛋白涉及信号的传导、蛋白质的运输、受体成熟及适应性免疫。而大量的关键致癌蛋白就属于客户蛋白，例如：Her2、AKT、CDK4、VEGF、MET、ALK、突变p53等。HSP90主要有四个亚型：HSP90α和HSP90β(位于细胞质内)，Grp94亚型(位于内质网中)，TRAP1亚型(位于线粒体基质中)。HSP90的主要分子伴侣包括Aha1、Hip、Hop、HSP70、CDC37/P50等。在癌细胞中，HSP90处于活化态，其与客户蛋白及共分子伴侣HSP70、p23等形成复合物，保护客户蛋白不被蛋白酶体降解。癌症的发生、发展受到HSP90受体蛋白的多途径、多环节影响，从而使其成为抗癌药物作用的新靶点。HSP90抑制剂根据其结合位点不同可分为N-末端抑制剂、中间端抑制剂及C-末端抑制剂。

HSP90客户蛋白结构和功能的稳定需要HSP的参与，而客户蛋白则起着促进细胞生长、增殖和存活等重要功能，同时其在恶性肿瘤中处于过度表达或持续表达状态，与肿瘤的发生发展有着密切联系。如：非小细胞肺癌细胞(NSCLC)中的突变EGFR、慢性骨髓性白血病细胞中的融合蛋白BCR-ABL、乳腺癌细胞中的Her2等肿瘤特异性蛋白的构象与功能的维持和调控需要HSP90的参与。

非小细胞肺癌的发生率占肺癌的3/4—4/5，而EGFR在约3/5的非小肺癌细胞中有高表达。目前许多患者对FDA批准上市的治疗非小细胞肺癌药物—吉非替尼和埃罗替尼普遍产生耐药。研究表明，HSP90抑制剂17-DMAG对20种EGFR非小细胞肺癌细胞株具有抗增殖效应，能明显下调EGFR突变细胞株中p-EGFR、p-Akt、CyclinD1、Cdk4等的水平。而17-AAG能下调WT-EGFR的水平，只是需要更高的浓度和作用时间。引起非小细胞肺癌对吉非替尼和埃罗替尼耐药是主要原因是K-Ras突变。虽然现在还没有针对其治疗的特异性抑制剂，但Jamie等发现Ganetespib能降解K-Ras的底物C-Raf，失活一些下游信号分子。这些都表明HSP90抑制剂对非小肺癌细胞具有明显抑制作用，从而拮抗非小肺癌细胞对吉非替尼和埃罗替尼的耐药。

20％-30％的乳腺癌中过度表达原癌基因Her2，临床对部分过表达Her2/neu的乳腺癌患者多应用赫赛汀单克隆抗体，但多数患者会产生耐药。由于Her2对HSP90最依赖且对HSP90抑制剂最敏感，因此Scaltriti等以PI3K突变激活或PTEN表达下降引起的原发或继发耐药模型，研究HSP90抑制剂IPI504对处理的BT47R(Her2+)、BT477H1047R(Her2+)乳腺癌细胞株的作用。结果表明IPI504对能下调以上两种细胞中Her2的表达并抑制AKT、MAPK信号通路，抑制细胞增殖呈剂量依赖性。对Trastuzmab产生耐药的主要原因是HER2胞外区域缺失产生p95-Her2从而失去与其结合的区域进而产生耐药。Chandarlapaty的研究发现HSP90抑制剂SNX-2112能降解细胞内p95-Her2，同时抑制AKT和ERK的活性；细胞毒试验表明SNK-2112可以完全抑制T47D细胞增殖，大大高于Trastuzmab；在体内应用SNX-2112的口服前药SNX-5422作用表达p95-Her2的MEFS肿瘤模型，其可以完全抑制肿瘤的生长。由于三阴性乳腺癌缺乏抗Her2的治疗靶点，目前还没有得到针对性的抑制剂。但实验研究表明PU-H71可抑制AKT和Bcl-xl蛋白活性和下调其水平，从而诱发三阴性乳腺癌细胞凋亡。其对三阴性乳腺癌细胞株HCC-1806、MAD-MB-231和MAD-MB-468的细胞死亡率分别为80％、65％和80％。以上可知，HSP90抑制剂作为临床乳腺癌耐药治疗具有十分重要的意义。

并且，慢性粒细胞性白血病的发生与ABL基因的突变密切相关，而伊马替尼广泛应用于慢性粒细胞性白血病的治疗。对伊马替尼产生耐药的白血病患者主要因BCL-ABL激酶区发生基因扩增或点突变导致。而此激酶是一种HSP90客户蛋白，因此HSP90抑制剂应该能对其作用。实验研究表明天然HSP90抑制剂雷公藤红素能使因T315I突变引起的伊马替尼耐药的KMB5-T315I细胞发生凋亡，免疫组化分析显示其抑制了BCL-ABL的表达。而合成小分子HSP90抑制剂17-AAG能降解突变型和野生型BCL-ABL，从而抑制细胞增殖。因此对伊马替尼耐药的慢性粒细胞性白血病可以采用HSP90抑制剂进行拮抗。

与传统激酶抑制剂相比，HSP90抑制剂抑制HSP90活性的同时降解多种相似激酶，能够对一些耐药型肿瘤产生较好的抑制效果。实验表明HSP90抑制剂单一或者联合用药都具有抗肿瘤的作用。因此，HSP90是癌症治疗的一种具有研究和开发意义的靶标。

发明内容

基于此，本发明提供一种新的热休克蛋白抑制剂，该类化合物能够抑制热休克蛋白90的活性，进而可以用于制备抗肿瘤的药物中。

一种具有式I结构特征的热休克蛋白抑制剂或其药学上可接受的盐：

其中：

R₁、R₇、R₈分别独立选自：H，C₁-C₆烷基，C₂-C₆不饱和烷基，卤素，羟基，C₁-C₆烷氧基，NHCOOR，SO₂NHR，NHSO₂R，CN，NHCOR，CONHR；

R选自：H，C₁-C₆烷基，C₃-C₆不饱和烷基，C₃-C₈环烷基；

R₂、R₃分别独立选自：H，D，C₁-C₆烷基，C₃-C₆不饱和烷基，C₃-C₈环烷基，苯基，取代的苯基，杂芳基，酰基；

R₄选自：氨基，C₁-C₆饱和烷基胺，C₂-C₆饱和杂环胺，C₁-C₆烷基酰胺基，芳基酰胺基，取代的芳基酰胺基，杂芳基酰胺基，取代的杂芳基酰胺基；

R₅、R₆为同一个氧原子或分别独立选自：H，D，C₁-C₆烷基，C₃-C₈环烷基，羰基，氰基，C₁-C₆烷氧基，COOR’，NHCOR’，CONHR’；

R’选自：H，C₁-C₆烷基，C₃-C₆不饱和烷基；

X、Y、Z、W分别独立选自：C，NH，CH，N，O，S。

本发明人在研究中发现，AUY922(为一个报道的HSP90抑制剂)结构中吗啉链接的苄基位点可能容易被代谢从而可能产生毒副作用。在上述研究基础上，本发明人在自身长期经验积累的基础上，通过实验摸索和研究后发现，在该苄基位点引入其它基团，不仅提高了活性还可能会抑制该位点的代谢从而消除潜在的毒副作用。

在其中一个实施例中，所述包含X、Y、Z、W的五元芳杂环选自如下结构：

在其中一个实施例中，所述热休克蛋白抑制剂选自如下通式II的化合物：

其中：

R₇、R₈选自：H，C₁-C₆烷基，C₂-C₆不饱和烷基，卤素，羟基，C₁-C₆烷氧基，CN；

R₁选自：C₁-C₆烷基，C₂-C₆不饱和烷基，C₁-C₆烷氧基。

在其中一个实施例中，所述R₂、R₃分别独立选自：H，C₃-C₈环烷基，C₁-C₆烷基，C₃-C₆不饱和烷基。

在其中一个实施例中，R₄选自：氨基，C₁-C₆饱和烷基胺，C₂-C₆饱和杂环胺，C₁-C₆烷基酰胺基，芳基酰胺基，取代的芳基酰胺基，杂芳基酰胺基，取代的杂芳基酰胺基；

R₅选自：H，或与R₆为同一个氧原子；

R₆选自：CN，COOR’，CONHR’，或与R₅为同一个氧原子；

其中，R’选自：H，C₁-C₆烷基，C₃-C₆不饱和烷基，C₃-C₈环烷基。

在其中一个实施例中，R₄选自如下基团：

在其中一个实施例中，所述热休克蛋白抑制剂选自如下通式III的化合物：

其中：

R₁选自：C₁-C₆烷基；

R₇、R₈选自：羟基；

R₂选自：H；

R₃选自：C₁-C₆烷基；

R₄选自如下基团：

R₅选自：H，或与R₆为同一个氧原子；

R₆选自：CN，COOR’，CONHR’，或与R5为同一个氧原子

本发明还公开了上述的热休克蛋白抑制剂或其药学上可接受的盐的制备方法，采用以下线路合成：

其中：R₁₀为羟基保护基。

R₁₀选自：苄基，三甲硅基，三乙硅基，叔丁基二甲基硅基，叔丁基二苯基硅基，二特丁基甲基硅基，甲基，乙酰基，对甲氧基苄基，甲氧基甲基。

本发明还公开了一种上述的热休克蛋白抑制剂或其药学上可接受的盐在制备预防和治疗具有热休克蛋白90表达增加的病理学特征的疾病的药物中的应用。

在其中一个实施例中，所述具有热休克蛋白90表达增加的病理学特征的疾病为：癌症，代谢疾病，骨髓增生异常综合征，系统性肥大细胞增生病，希佩尔-林道综合征，多中心型Castleman病，和银屑病中的至少一种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的热休克蛋白抑制剂或其药学上可接受的盐，是一种新型的热休克蛋白抑制剂，与常规同类抑制剂相比，保留了原分子中与HSP90受体活性口袋中氨基酸残基相互作用的原子和官能团，进一步对骨架可能存在作用力的位置进行修饰，从而优化了对照化合物的抑制效力，使其具备以下优点：

1、引进有效的修饰，增加目标化合物与受体蛋白的氨基酸残基的结合力，同时对HSP90α 和HSP90β两种酶受体，以及五类肿瘤细胞系具有抑制作用。

2、进一步提高阳性对照化合物NVP/AUY-922在酶水平和细胞水平的抑制能力，为推进该类抑制剂的成药进程提供可能。

3、与单一抑制剂相比，同时使用两个分别作用于单一靶点的药物相比，作用于两个靶点的药物患者使用起来比较方便，还可以避免药物与药物的相互作用。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步的说明，但并不对本发明造成任何限制。

本发明的化合物及其盐也可以通过已知用于制备化学相关化合物的方法制备，在实施例中涉及的原料均可通过现有技术的类似方法获得。

本发明通式I中的由苯环外指向苯环内的直线表示位置不固定的取代。

本发明通式I中带虚线的五元环为包含X，Y，Z，W的五元芳杂环。

“烷基”是指饱和烃基，包括直链或支链的烷基，如C₁-C₆烷基是指具有1至6个碳原子的饱和直链或支链的烷基，其中饱和直链烷基的示例包括但不限于乙基，正丙基等，饱和支链烷基的示例包括但不限于异丙基，叔丁基等；“不饱和烷基”是指具有烯基或炔基的烃基，包括直链或支链的不饱和烷基，其中不饱和直链烷基的示例包括但不限于乙烯基、丙烯基等，不饱和支链烷基的示例包括但不限于2-甲基丙烯基等；“环烷基”是指具有环状结构的烷基，如C₃-C₈环状烷基指具有3至8个碳原子的饱和或不饱和的具有环状结构的烷基，其中饱和环状烷基的示例包括但不限于环丙基，环戊基、乙基取代环己基等，不饱和环状烷基的示例包括但不限于环戊烯等，本发明中优选C₃-C₆环状烷。

“取代的”是指用指定取代基的基团置换特定结构中的氢基。当任何特定结构中的一个以上位置可经一个以上选自指定群组的取代基取代时，所述取代基可在每一位置相同或不同。如本文中所使用，术语“取代”预期包括有机化合物的所有可允许取代基。在一广泛方面，所述可允许取代基包括有机化合物的非环状和环状、分支和未分支、碳环和杂环、芳香族和非芳香族取代基。诸如氮等杂原子可具有氢取代基和/或本文所述的有机化合物的任何可允许取代基，所述取代基满足杂原子的价数。

“杂芳基”是指含有5-6元单环6的4n+2芳香环系统，并且芳环体系具有环碳原子和1-4个环杂原子，其中每个环杂原子独立地选自氮，氧和硫。包含一个或多个氮原子的杂芳基，连接点可以是碳或氮原子，如果过化学价允许。杂芳基的多环系统可以包括一个或多个杂原子。“杂芳基”还包括如上定义所述的杂芳基环系统，稠合有一个或多个碳环或杂环基团，其中连接点是杂芳基环上，并且在这种情况下，环成员的数量只包括杂芳基环体系上成员的数目。“杂芳基”还包括如上定义所述的杂芳基环系统，稠合有一个或多个芳基基团，其中连接点可以是芳基或杂芳基环上，并且在这种情况下，环成员的数量只包括在稠合多环(芳基/杂芳基)环体系中的环成员数目。多环杂芳基，其中一个不含有杂原子的环(例如，吲哚基，喹啉基，咔唑基，以及类似物)，其连接点可以是在任意一环上，也就是说，可以是在包含杂原子的环上(例如，2-吲哚基)或在不含有杂原子的环上(例如，5-吲哚基)。含2个杂原子的示例性5元杂芳基包括但不限于，咪唑，吡唑，恶唑，异恶唑基，噻唑基，和异噻唑。含有1个杂原子的示例性6元杂芳基包括但不限于，吡啶基。含2个杂原子的示例性6元杂芳基包括但不限于，哒嗪基，嘧啶基，和吡嗪基。

“杂环基”是指如本文所定义的环状烷基，其中主链还包括1个或多个杂原子(如氧，硫，氮，硼，硅，磷)。

“胺基”是指氨的氢原子被烷基代替后的有机化合物，如杂环胺、芳烷基胺基等。

“酰胺基”是指氨(或胺)的氢被酰基取代的衍生物，如环烷基酰胺基、烷基酰胺基、芳基酰胺基、苯并芳基酰胺基、杂芳基酰胺基、苯并杂芳基酰胺基、杂环基酰胺基、磺酰胺基、烷基脲等。

实施例1

以下实施例参照下述反应路线制备

化合物1：4-(4-(氰基(吗啉代)甲基)苯基)-5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-甲基异恶唑-3-甲酰胺)的制备。

按照以上线路合成，包括如下步骤：

(1)1-(2,4-双(苄氧基)苯基)乙酮(化合物I-2)的制备。

在装有回流冷凝管的500mL两口瓶中加入2,4-二羟基苯乙酮I-1(9.12g，60.00mmol)，碳酸钾(21.00g，151.00mmol)，乙腈200mL于油浴锅中在80℃下加热回流1h，然后用注射器注入溴化苄(14.70mL，144.00mmol)继续回流过夜。TLC(薄层色谱)检测反应至起始原料反应完全后，冷却至室温，布氏漏斗抽滤，二氯甲烷洗涤残余物，收集滤液，旋蒸除去溶剂得到棕黄色油状物。向油状物中加入乙醚，搅拌产生白色絮状沉淀，砂芯漏斗抽滤然后乙醚洗涤，重复以上操作两次得到白色固体15.80g，即为化合物I-2，收率为79％。质谱监测ESI-MS m/z:333.0(M+H)⁺。

(2)(((4-丙-1-烯-2-基)-1,3-(双氧基))双(亚甲基))二苯(化合物I-3)的制备。

在装有滴液漏斗的250mL两口瓶中加入叔丁醇钾(4.72g，42.15mmol)，三苯基磷碘甲烷(17.88g，42.15mmol)，在0℃及氮气保护作用下注入无水THF(四氢呋喃)搅拌1h。然后将1-(2,4-双(苄氧基)苯基)乙酮I-2(10.76g，32,42mmol)完全溶解于无水THF中注入滴液漏斗中再经滴液漏斗缓慢滴加入反应体系中，待滴加完全后搅拌1h，再将反应于室温下搅拌过夜。TLC监测起始原料反应完全后，旋蒸除去反应溶剂，乙酸乙酯溶解所得残余物，用水萃取三次，饱和氯化钠水溶液萃取一次，收集乙酸乙酯层，再用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去有机溶剂，最后经硅胶柱纯化得到白色固体8.45g，即为化合物I-3，收率79％。

该化合物I-3的表征数据为：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d,δ_ppm):7.38-7.28(m,10H),7.13(d,J＝8.4Hz,1H),6.59(s,1H),6.52(d,J＝8.4Hz,1H),5.08(s,2H),5.03(s,2H),5.00(s,2H),2.12(s,3H)。

(3)4-异丙基苯-1,3-二醇(化合物I-4)的制备。

在2L的高压釜中加入I-3(350.00g，1.06mol)，35g的10％钯碳，1mL甲酸，1L乙醇，通入氢气并加热至78℃回流两天。反应完全后冷却至室温，将反应液用装有硅藻土的布氏漏斗抽滤，乙醇洗涤，收集滤液，旋蒸除去有机溶剂，最后用硅胶柱纯化得到白色固体130g，即为化合物I-4，收率80％。

该化合物I-4的表征数据为：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d,δ_ppm):7.01(d,J＝8.4Hz,1H),6.39(d,J＝8.4Hz,1H),6.32(s,1H),5.50(brs,1H),5.33(brs,1H),3.12(m,1H),1.21(d,J＝6.4Hz,6H).

(4)1-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-乙酮(化合物I-5)的制备。

在安装有回流冷凝管的250mL两口瓶中加入4-异丙基苯-1,3-二醇I-4(5.36g，35.25mmol)，然后在N₂的保护作用下注入100mL 47％三氟化硼乙醚溶液搅拌半小时后，注入4.03mL乙酸于油浴锅中加热回流过夜，TLC监测起始原料反应完全后冷却至室温，加入70mL10％醋酸钠水溶液搅拌2h，加水稀释至250mL，再加入乙酸乙酯萃取三次，收集有机层，无水硫酸钠干燥后旋蒸除去有机溶剂得到棕红色固体，加入二氯甲烷打浆产生淡黄色不溶物，砂芯漏斗抽滤并用二氯甲烷洗涤得到淡黄色固体6.80g，即为化合物I-5，收率99.4％.

该化合物I-5的表征数据为：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d,δ_ppm):12.56(s,1H),7.50(s,1H),6.31(s,1H),,5.89(s,1H),3.14(m,1H),2,57(s,3H),1.25(d,J＝6.0Hz,6H).

(5)1-(2,4-双(苄氧基)-5-异丙基)-乙酮(化合物I-6)的制备。

在装有回流冷凝管的250mL两口瓶中加入1-(2,4-双羟基-5-异丙基)苯乙酮I-5(6.80g，35.05mmol)，碳酸钾(12.09g，87.63mmol)，100mL乙腈，于油浴锅中80℃回流1h，然后用注射器注入溴化苄(10mL，84.15mmol)回流过夜。TLC监测反应起始原料反应完全后，反应体系冷却至室温，布氏漏斗抽滤，残余物用二氯甲烷洗涤，收集滤液，旋蒸除去有机溶剂得到棕红色油状物。将石油醚加入油状物中搅拌打浆，产生白色沉淀，砂芯漏斗抽滤，石油醚洗涤，得到白色固体6.72g，即为化合物I-6，收率51.26％.

该化合物I-6的表征数据为：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d,δ_ppm):7.76(s,1H),7.32-7.42(m,10H),6.51(s,1H),5.10(s,2H),5.09(s,2H),3.29(m,1H),2,56(s,3H),1.22(d,J＝6.8Hz,6H).

(6)(Z)-乙基-4-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-2-羟基-4-氧代丁-2-烯酸甲酯(化合物I-7)的制备。

在安装有回流冷凝管的250mL两口瓶中加入金属钠(0.90g，39.00mmol)，100mL乙醇于0℃冰浴中搅拌直至金属钠反应完全后，在室温下加入1-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)乙酮I-6(6.72g，17.98mmol)搅拌30min，注入草酸二乙酯(3.94mL，29.11mmol)于油浴锅中80℃回流4h。TLC监测至底物反应完全后冷却至室温，加入2M的盐酸水溶液调节PH值至小于7产生淡黄色沉淀物，真空干燥除去有机溶剂，然后加入二氯甲烷溶解，水萃取三次，饱和氯化钠溶液萃取一次，无水硫酸钠干燥后旋蒸除去二氯甲烷，得到棕黄色固体8.18g，即为化合物I-7收率96％。

该化合物I-7的表征数据为：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d,δ_ppm):7.87(s,1H),7.45-7.35(m,11H),6.53(s,1H),5.13(s,2H),5.11(s,2H),4.28(q,J＝14.0Hz,2H),3.30(m,1H),1.28(t,J＝6.8Hz,3H),1.23(d,J＝6.8Hz,6H).

(7)5-(2,4-双(苯甲氧基-5-异丙基苯基)异恶唑-3-羧酸乙酯(化合物I-8)的制备。

在安装有回流冷凝管的250mL两口瓶中加入(Z)-乙基-4-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-2-羟基-4-氧代丁-2-烯酸甲酯I-7(8.18g，17.26mmol)，盐酸羟胺(1.56g，22.48mmol)及100mL乙醇于油浴锅中80℃回流5h。TLC监测反应完全后冷却至室温，真空干燥得到白色固体。乙酸乙酯溶解固体，水萃取三次，饱和氯化钠水溶液萃取一次，无水硫酸钠干燥有机层，旋蒸除去有机溶剂得到白色固体6.74g，即为化合物I-8，收率83％。

该化合物I-8的表征数据为：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d,δ_ppm):7.83(s,1H),7.41-7.33(m,10H),7.00(s,1H),6.58(s,1H),5.16(s,2H),5.07(s,2H),4.42(q,J＝7.2Hz,2H),3.34(m,1H),1.41(t,J＝7.2Hz,3H),1.23(d,J＝6.8Hz,6H).

(8)5-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)异恶唑-3-甲酰胺(化合物I-9)的制备。

在安装有回流冷凝管的250mL两口瓶中加入5-(2,4-双(苯甲氧基-5-异丙基苯基)异恶唑-3-羧酸乙酯I-8(6.74g，14.31mmol)，100mL乙醇加热搅拌，使固体完全溶解后注入70％乙胺水溶液(13.80mL，215.73mmol)于油浴锅中80℃回流过夜。TLC监测反应完全后冷却至室温，真空干燥得到白色固体。乙酸乙酯溶解固体，1M的盐酸水萃取一次，饱和碳酸钠水溶液萃取一次，水萃取一次，饱和氯化钠水溶液萃取一次，无水硫酸钠干燥有机层，然后旋蒸除去有机溶剂得到白色固体6.46g，收率96％。

该化合物I-9的表征数据为：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d,δ_ppm):7.79(s,1H),7.33-7.39(m,10H),7.07(s,1H),6.81(brs,1H),6.55(s,1H),5.17(s,2H),5.14(s,2H),3.48(m,2H),3.33(m,1H),1.27(t,J＝6.8Hz,3H),1.24(d,J＝6.8Hz,6H).

(9)5-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-甲基异恶唑-3-甲酰胺(化合物I-10)的制备

在安装有回流冷凝管的250mL两口瓶中加入5-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-N-乙基异恶唑-3-甲酰胺I-9(6.46g，13.47mmol)，100mL乙腈加热搅拌，使固体完全溶解后加入碘代丁二酰亚胺(3.71g，16.49mmol)及硝酸铈铵(0.74mg，1.35mmol)于油浴锅中85℃回流过夜。TLC监测反应完全后冷却至室温，真空干燥得到棕红色固体。乙酸乙酯溶解固体，水萃取三次，饱和氯化钠水溶液萃取一次，无水硫酸钠干燥有机层，然后旋蒸除去有机溶剂，最后经硅胶柱纯化得到棕白色固体5.62g，收率70％。

该化合物I-10的表征数据为：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d,δ_ppm):7.40-7.29(m,11H),6.81(brs,1H),6.59(s,1H),5.08(s,2H),5.05(s,2H),3.48(m,2H),3.34(m,1H),1.27(t,J＝6.8Hz,3H),1.23(d,J＝6.8Hz,6H).

(10)5-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-N-甲基-4-(4-甲酰基苯基)异恶唑-3-甲酰胺(化合物I-11)的制备。

在安装有回流冷凝管的100mL两口瓶中加入5-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-N-乙基-4-碘代异恶唑-3-甲酰胺1-10(1.35g，2.27mmol)，4-甲酰基苯硼酸(0.68g，4.54mmol)，二三苯基磷二氯化钯(0.08g，0.12mmol)，碳酸钾(0.626mg，4.54mmol)，以及20mL四氢呋喃和2mL蒸馏水，在氮气保护作用下于80℃油浴锅中回流过夜。TLC监测反应完全后冷却至室温，旋蒸除去反应溶剂，加入乙酸乙酯溶解，水萃取三次，饱和氯化钠水溶液萃取一次，无水硫酸钠干燥，真空干燥后经硅胶柱纯化得到红棕色固体1.02g，收率79％。

该化合物I-11的表征数据为：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d,δ_ppm):9.96(s,1H),7.70(d,J＝6.4Hz,2H),7.41(d,J＝6.4Hz,2H),7.39-7.33(m,5H),7.27(s,2H)7.19(s,1H),7.00(s,2H),6.82(t,J＝2.2Hz,1H),6.43(s,1H),4.98(s,2H),4.69(s,2H),3.45(m,2H),3.26(m,1H),1.24(t,J＝5.6Hz,3H),1.11(d,J＝6.0Hz,6H).

(11)5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-N-甲基-4-(4-甲酰基苯基)异恶唑-3-甲酰胺(化合物I-12)的制备

取一100mL两口瓶，加入化合物I-11(1g)，氩气保护，加入无水DCM(20mL)溶解，置于-5℃下，搅拌15min，滴加三溴化硼的二氯甲烷溶液(1M，5.2mL，3当量)，搅拌20min，置于室温下，搅拌2h。TLC跟踪显示原料反应完毕。0℃下，加入DCM(10mL)稀释，加入饱和NaHCO₃溶液淬灭，萃取，收集有机相。往水相中加入EA，将生成的絮状固体溶解，收集有机相，混合，无水硫酸钠干燥，浓缩过柱子(DCM:acetone＝1:1)。可得650mg棕色固体，产率为94.8％。ESI-MS m/z:395.1(M+H)⁺。

(12)4-(4-(氰基(吗啉代)甲基)苯基)-5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-甲基异恶唑-3-甲酰胺(化合物1)的制备。

取一25mL单口瓶，加入化合物I-12(50mg)，甲醇(2mL)溶解，加入吗啉(17μL，1.5当量)，盐酸胍(6mg，0.5当量)，在40℃下搅拌15min，加入化合物TMSCN(47μL，3当量)，该温度下搅拌2h，TLC跟踪显示原料反应完毕。加入EA稀释(10mL)，加入饱和NaHCO₃溶液淬灭，饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩过柱子(DCM:acetone＝1:1)。将所得黄色粘稠状产物打浆，加入石油醚，低温下静置，析出白色固体，吸去黄色液体，所得固体油泵抽干，可得25mg白色固体，产率为41.0％。

该化合物1的表征数据为：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d,δ_ppm):7.58(d,J＝8.0Hz,2H),7.44(d,J＝8.0Hz,2H),6.80(s,1H),6.32(s,1H),4.80(s,1H),3.72(d,J＝3.6Hz,4H),3.57-3.40(m,2H),2.99-2.92(m,1H),2.61(d,J＝3.6Hz,4H),1.25(t,J＝7.2Hz,3H),0.88(d,J＝6.8Hz,6H).¹³C NMR(125MHz,Chloroform-d,δ_ppm):167.7,159.3,157.1,156.6,154.0,132.8,131.4,130.7,128.5,128.1,127.6,115.3,105.8,104.5,67.0,62.6,51.2,50.4,34.9,30.0,29.7,26.3,22.6,14.9.ESI-MS m/z:491.3(M+H)⁺,489.3(M-H)^-.

实施例2

化合物2：4-(4-(氰基(2S，6R)-2,6-二甲基吗啉)甲基)-5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-N-乙基异恶唑-3-甲酰胺的制备。

取一25mL单口瓶，加入化合物I-12(30mg)，甲醇(1mL)溶解，加入(2S,6R)-2,6-二甲基吗啉(15μL，1.5当量)，盐酸胍(4mg，0.5当量)，在40℃下搅拌15min，加入化合物TMSCN(29μL，3当量)，TLC跟踪显示原料未能完全反应完毕，故直接纯化。加入EA稀释(10mL)，加入饱和NaHCO₃溶液淬灭，饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩过柱子(DCM:acetone＝1:1)。将所得黄色粘稠状产物经过HPLC纯化，所得固体油泵抽干，可得9mg白色固体，产率为23.1％。

该化合物2的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.47(d,J＝8.0Hz,2H),7.37(d,J＝8.0Hz,2H),6.80(s,1H),6.35(s,1H),5.11(s,1H),3.78(t,J＝7.6Hz,1H),3.59(t,J＝6.4Hz,1H),3.39,3.31(dd,J＝7.2,7.6Hz,2H),3.11-3.04(m,1H),2.91(d,J＝10.8Hz,1H),2.45(d,J＝10.4Hz,1H),2.21(t,J＝10.4Hz,1H),1.86(t,J＝10.4Hz,1H),1.21(t,J＝7.2Hz,6H),1.08(d,J＝6.0Hz,3H),0.99(d,J＝7.2Hz,6H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):170.0,163.4,160.1,159.4,156.9,134.4,133.3,132.0,130.0,129.8,129.1,117.2,117.0,107.3,104.8,73.8,73.7,63.3,60.1,60.1,55.0,54.9,36.3,28.1,24.0,23.9,20.1,20.0,15.5.ESI-MS m/z:519.3(M+H)⁺,517.3(M-H)^-.

实施例3

化合物3：4-(4-(氰基(4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯基)-5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-N-甲基异恶唑-3-甲酰胺的制备，参照实施例1的方法。

该化合物3的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.477(d,J＝8.0Hz,2H),7.35(d,J＝8.4Hz,2H),6.81(s,1H),6.36(s,1H),5.06(s,1H),3.39,3.36(dd,J＝7.2,7.6Hz,2H),3.10-3.04(m,1H),2.99(d,J＝11.2Hz,1H),2.62(d,J＝11.2Hz,1H),2.47(t,J＝8.8Hz,1H),2.10(t,J＝10.8Hz,1H),1.74(d,J＝8Hz,1H),1.61(d,J＝13.2Hz,1H),1.22(t,J＝12Hz,3H),0.98,0.95(dd,J＝7.2,6.4Hz,9H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):169.9,163.4,160.1,159.4,156.8,135.3,133.0,132.1,131.2,130.0,129.9,129.7,129.1,117.6,117.0,107.3,104.8,63.9,54.9,36.3,36.3,35.9,32.6,28.1,23.9,23.8,23.8,22.9,15.5.ESI-MS m/z:503.2(M+H)⁺,501.3(M-H)^-.

实施例4

化合物4：4-(4-(氰基-(4-羟基哌啶-1-基)甲基)苯基)-5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-N-甲基异恶唑-3-甲酰胺的制备，参照实施例1的方法。

该化合物4的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.47(d,J＝8.0Hz,2H),7.36(d,J＝8.4Hz,2H),6.81(s,1H),6.36(s,1H),5.10(s,1H),3.66-3.62(m,1H),3.39,3.55(dd,J＝7.6,7.2Hz,2H),3.10-3.04(m,1H),2.92(t,J＝5.6Hz,1H),2.69(t,J＝5.6Hz,1H),2.49-2.43(m,1H),2.27(t,J＝9.2Hz,1H),1.90(t,J＝12.8Hz,2H),1.67-1.58(m,1H),1.53-1.29(m,1H),1.21(t,J＝7.2Hz,3H),0.90(d,J＝6.8Hz,6H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):169.9,163.4,160.1,159.4,156.9,135.3,133.0,132.0,130.0,129.7,129.1,117.5,117.0,107.3,104.8,63.5,48.1,36.3,36.1,35.8,28.1,23.9,23.8,15.5.ESI-MS m/z:505.3(M+H)⁺,503.3(M-H)^-.

实施例5

化合物5：4-(4-(氰基(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)甲基)苯基)-5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-甲基异恶唑-3-甲酰胺的制备，参照实施例1的方法。

该化合物5的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.41(d,J＝8.0Hz,2H),7.37(d,J＝8.4Hz,2H),6.85(s,1H),6.36(s,1H),4.90(s,1H),4.78(t,J＝7.6Hz,4H),3.55(d,J＝7.6Hz,2H),3.50(d,J＝7.6Hz,2H),3.41,3.37(dd,J＝7.2,7.2Hz,2H),3.14-3.07(m,1H),1.23(t,J＝7.2Hz,3H),0.99(d,J＝7.2Hz,6H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):169.9,163.4,160.1,159.4,156.8,134.5,133.5,132.1,131.2,130.0,129.4,129.1,118.1,117.0,107.3,104.7,82.8,62.4,62.1,41.0,36.3,28.1,23.9,23.8,15.5.ESI-MSm/z:503.3(M+H)⁺,501.3(M-H)^-.

实施例6

化合物6：4-(4-(氰基(4AR,7AS)-四氢-2H-[1,4]二恶烷并[2,3-c]吡咯-6-(3H)-基)甲基)苯基)-5-(2,4-羟基-5-异丙基苯基)-N-甲基异恶唑-3-甲酰胺的制备，参照实施例1的方法。

该化合物6的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.50(d,J＝8.4Hz,2H),7.38(d,J＝6.4Hz,2H),6.86(s,1H),6.38(s,1H),5.25(s,1H),4.18-4.09(m,2H),3.85-3.79(m,2H),3.61-3.57(m,2H),3.42,3.39(dd,J＝7.2,7.2Hz,2H),3.14-3.07(m,1H),3.00-2.99(m,2H),2.86-2.83(m,1H),1.24(t,J＝7.6Hz,3H),1.03(d,J＝6.8Hz,6H).¹³CNMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):169.9,163.5,160.1,159.5,156.8,135.4,133.2,132.0,130.0,129.5,129.1,127.1,118.5,117.1,107.3,104.8,75.2,75.1,64.7,64.3,61.0,53.7,53.4,36.3,31.6,28.1,24.6,23.9,15.5,15.3.ESI-MS m/z:533.1(M+H)⁺,531.2(M-H)^-.

实施例7

化合物7：4-(4-(氰基(3-甲基吡咯烷-1-基)甲基)苯基)-5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-N-甲基异恶唑-3-甲酰胺的制备，参照实施例1的方法。

该化合物7的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.48(d,J＝8.0Hz,2H),7.37(d,J＝8.4Hz,2H),6.85(d,J＝2.4Hz,1H),6.37(d,J＝0.8Hz,,1H),5.23(s,1H),4.02-3.96(m,1H),3.41,3.37(dd,J＝7.2,7.2Hz,2H),3.29(d,J＝8.4Hz,3H),3.15-3.06(m,1H),2.90-2.80(m,2H),2.67-2.57(m,4H),2.16-2.09(m,1H),1.85-1.79(m,1H),1.22(t,J＝7.6Hz,3H),1.01(d,J＝1.2Hz,6H).ESI-MS m/z:505.1(M+H)⁺,503.2(M-H)^-.

实施例8

化合物8：4-(4-(2-硫杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基(氰基)甲基)苯基)-5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-甲基异恶唑-3-甲酰胺的制备，参照实施例1的方法。

该化合物8的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.55(d,J＝8.4Hz,1H),7.50(d,J＝8.0Hz,1H),7.40(t,J＝6.4Hz,2H),6.86(d,J＝2.8Hz,1H),6.38(s,1H),5.24(s,0.5H),5.08(s,0.5H),3.99(s,0.5H),3.79(s,0.5H),3.56-3.51(m,1H),3.42,3.39(dd,J＝7.2,7.6Hz,2H),3.25(d,J＝5.2Hz,1H),3.12-3.06(m,2H),3.02(t,J＝10Hz,1H),2.90,2.86(dd,J＝9.2, 10Hz,1H),2.42,2.38(dd,J＝11.2,9.6Hz,1H),1.83(t,J＝13.6Hz,1H),1.22(t,J＝4Hz,3H),1.03(d,J＝6.8Hz,6H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):170.0,163.4,160.1,159.4,156.8,136.6,136.1,133.2,132.1,130.0,129.7,129.5,129.1,120.4,117.3,107.3,104.8,64.6,64.3,63.9,62.3,60.1,59.7,47.0,46.9,41.7,41.3,39.6,39.0,36.3,31.6,28.1,23.9,15.5.ESI-MS m/z:519.0(M+H)⁺,517.3(M-H)^-.

实施例9

化合物9：4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)(氰基)甲基)苯基)-5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-N-甲基异恶唑-3-甲酰胺的制备，参照实施例1的方法。

该化合物9的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.49(d,J＝7.2Hz,2H),7.38(d,J＝7.2Hz,2H),6.83(s,1H),6.35(s,1H),5.19(s,1H),3.58(s,4H),3.38(d,J＝7.6Hz,2H),3.10-3.07(m,1H),2.60-2.53(m,4H),2.10(s,3H),1.21(t,J＝7.2Hz,3H),1.00(dd,J＝6.4Hz,6H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):172.1,171.8,169.8,162.9,162.1,158.8,156.3,132.0,129.8,129.4,128.9,116.8,112.0,107.0,104.6,95.6,63.1,51.4,50.8,47.9,43.1,36.1,36.3,31.3,27.7,23.8,22.0,15.5.ESI-MS m/z:532.3(M+H)⁺,530.3(M-H)^-.

实施例10

化合物10：4-(4-(氰基(2-甲氧基乙基)氨基)甲基)苯基)-5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-甲基异恶唑-3-甲酰胺的制备，参照实施例1的方法。

该化合物10的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.47(d,J＝8.0Hz,2H),7.36(d,J＝8.0Hz,2H),6.89(s,1H),6.34(s,1H),5.00(s,1H),3.53(t,J＝4.8Hz,1H),3.38,3.35(dd,J＝2.0,3.6Hz,2H),3.34(s,3H),3.10-3.07(m,1H),2.87(t,J＝5.2Hz,2H),1.21(t,J＝7.2Hz,3H),1.02(d,J＝6.8Hz,6H).ESI-MS m/z:479.1(M+H)⁺,477.2(M-H)^-.

实施例11

化合物11：4-(4-(2-氨基-1-吗啉代-2-氧乙基)苯基)-5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-甲基异恶唑-3-甲酰胺的制备。

取一25mL单口瓶，加入化合物1(30mg)，加入DMSO(1mL)溶解，加入30％的双氧水(20mg，3当量)和碳酸钾(23mg，3当量)，室温搅拌2h，TLC跟踪显示原料反应完毕。加入EA稀释(10mL)并用水(10mL)萃取，有机相用饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩过柱子(EA:PE＝2:1)。将所得黄色粘稠状产物打浆，加入石油醚，低温下静置，析出白色固体，吸去黄色液体，所得固体油泵抽干，可得3.4mg白色固体，产率为11.0％。

该化合物11的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.45(d,J＝8.4Hz,2H),7.31(d,J＝8.4Hz,2H),6.81(s,1H),6.35(s,1H),3.74(s,1H),3.73(t,J＝4.4Hz,4H),3.40,3.37(dd,J＝7.2,7.2Hz,2H),3.09-3.06(m,1H),2.46-2.37(m,4H),1.21(t,J＝7.2Hz,3H),0.99(d,J＝6.8Hz,6H).ESI-MS m/z:509.1(M+H)⁺,507.2(M-H)-.

实施例12

以下实施例参照下述反应路线制备。

按照以上线路，包括如下步骤：

(1)甲基-2-(4-(5-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)异恶唑-4-基)苯基)-2-羟基(化合物Ⅱ-1)的制备。

取一50mL单口瓶，加入化合物I-11(1g)，加入催化量的粉末状碘，加入无水DCM(10mL)溶解，滴加TMSCN(0.26mL，1.2当量)，室温搅拌1h，TLC跟踪显示原料反应完毕。加入DCM稀释(10mL)，加入水(5mL)淬灭，有机相用饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩直接投入下一步。

将所得化合物加入氯化氢的甲醇溶液(20％，15mL)，置于40℃下搅拌过夜。TLC跟踪显示原料反应完毕。加入EA(30mL)稀释，将生成的固体过滤，收集滤液浓缩，再加入EA(20mL)溶液，加入饱和NaHCO₃溶液中和，饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩过柱子(PE:EA＝4:1)。得白色固体1.05g，两步产率为95.4％。ESI-MS m/z:635.1(M+H)⁺。

(2)甲基-2-(4-(5-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-3-(乙基氨基甲酰基)异恶唑-4-基)苯基)-2-(甲苯磺酰氧基)乙酸甲酯(化合物Ⅱ-2)的制备。

取一50mL单口瓶，加入化合物Ⅱ-1(0.5g)，加入无水DCM(10mL)溶解，加入干燥的三乙胺(0.33mL，3当量)，置于0℃，搅拌15min，加入TsCl(0.46g，3当量)，搅拌15min，升温至40℃，搅拌过夜。TLC跟踪显示原料反应完毕。加入饱和NaHCO₃溶液中和，饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩过柱子(PE:EA＝6:1)。得白色固体0.34g，产率为55.2％。ESI-MS m/z:789.2(M+H)⁺。

(3)甲基-2-(4-(5-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-3-(乙基氨基甲酰基)异恶唑-4-基)苯基)-2-吗啉代乙酸酯(化合物Ⅱ-3)的制备。

取一50mL单口瓶，加入化合物Ⅱ-2(0.33g)，加入甲苯(5mL)溶解，加入干燥的三乙胺(0.12mL，2当量)，加入吗啉(55μL，1.5当量)，置于油浴锅回流2h，TLC跟踪显示原料反应完毕。加入EA(15mL)稀释，加入饱和食盐水萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩用于下一步。得粘稠状产物232mg，产率为80％。ESI-MS m/z:7032(M+H)⁺。

(4)甲基-2-(4-(5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-3-(乙基氨基甲酰基)异恶唑-4-基)苯基)-2-吗啉代乙酸酯(化合物12)的制备。

取一50mL两口瓶，加入化合物Ⅱ-3(0.2g)，氩气保护，加入无水DCM(10mL)溶解，置于-5℃下，搅拌15min，滴加三溴化硼的二氯甲烷溶液(1M，0.9mL，3当量)，搅拌10min，置于室温下，搅拌1h。TLC跟踪显示原料反应完毕。0℃下，加入DCM(10mL)稀释，加入饱和NaHCO₃溶液淬灭，萃取，收集有机相。往水相中加入EA，将生成的絮状固体溶解，收集有机相，混合，无水硫酸钠干燥，浓缩过柱子(DCM:acetone＝1:1)。将所得黄色粘稠状产物打浆，加入石油醚，低温下静置，析出白色固体，吸去黄色液体，所得固体油泵抽干，可得35.7mg白色固体，产率为24.0％。

该化合物12的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.40(d,J＝8.4Hz,2H),7.30(d,J＝8.4Hz,2H),6.76(s,1H),6.36(s,1H),4.02(s,1H),3.68(d,J＝4.4Hz,4H),3.66(s,3H),3.39,3.35(dd,J＝7.2,7.6Hz,2H),3.09-3.02(m,1H),2.45(d,J＝4.4Hz,4H),1.20(t,J＝7.6Hz,3H),0.95(d,J＝6.8Hz,6H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):174.1,169.8,163.4,160.0,159.4,156.9,136.7,132.8,132.0,130.8,130.1,129.0,117.1,107.3,104.8,76.0,68.5,53.6,53.4,36.3,28.0,26.1,23.9,15.5.ESI-MS m/z:524.3(M+H)⁺,523.3(M-H)^-.

实施例13

化合物13：乙基-2-(4-(5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-3-(乙基氨基甲酰基)异恶唑-4-基)苯基)-2-吗啉代乙酸酯的制备，参照实施例12的方法。

该化合物13的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.41(d,J＝8.0Hz,2H),7.31(d,J＝8.0Hz,2H),6.77(s,1H),6.36(s,1H),4.20-4.05(m,2H),4.00(s,1H),3.69(t,J＝4.8Hz,3H),3.39,3.35(dd,J＝7.2,7.2Hz,2H),3.14-3.02(m,1H),2.46(d,J＝4.4Hz,4H),1.21,1.18(dd,J＝7.2,6.8Hz,6H),0.95(d,J＝7.2Hz,6H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):173.6,169.8,163.5,160.0,159.5,156.9,131.9,130.8,130.0,129.0,117.1,107.3,104.8,76.1,68.5,53.1,53.4,36.3,28.0,23.9,15.5,15.2.ESI-MS m/z:538.3(M+H)⁺,536.3(M-H)^-.

该化合物13的结构式为：

实施例14

化合物14：5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-N-甲基-4-(4-(2-(二甲基氨基)-1-吗啉代-2-氧乙基)苯基)异恶唑-3-甲酰胺的制备。

(1)5-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-N-甲基-4-(4-(2-(二甲基氨基)-1-羟基-2-氧代乙基)苯基)异恶唑-3-甲酰胺(化合物Ⅱ-5)的制备。

取一50mL单口瓶，加入化合物Ⅱ-4(0.5g)、乙胺水溶液(68％，0.2mL，4当量)，乙醇(5mL)，置于油浴锅中，回流反应过夜，TLC跟踪显示原料反应完毕。旋去大部分溶剂，加入EA(20mL)和饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩直接用于下一步。所得粘稠状产物(0.48g)，产率为96.2％。ESI-MS m/z:648.3(M+H)⁺。

(2)化合物14：5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-N-甲基-4-(4-(2-(二甲基氨基)-1-吗啉代-2-氧乙基)苯基)异恶唑-3-甲酰胺的制备，参照实施例12的方法。

该化合物14的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.40(d,J＝8.4Hz,2H),7.29(d,J＝8.0Hz,2H),6.79(s,1H),6.35(s,1H),3.70(t,J＝4.4Hz,5H),3.38,3.42(dd,J＝7.2,7.6Hz,2H),3.24-3.14(m,2H),3.09-3.02(m,1H),2.40-2.34(m,4H),1.19(t,J＝7.2Hz,3H),1.10(t,J＝7.2Hz,3H),0.96(d,J＝6.8Hz,6H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):174.1,169.7,163.5,160.0,159.5,156.8,137.9,132.3,131.7,130.6,130.0,129.0,117.2,107.4,104.8,78.1,68.6,54.1,36.3,36.0,28.1,23.1,23.9,15.6,15.5.ESI-MS m/z:537.3(M+H)⁺,535.3(M-H)^-.

实施例15

化合物15：甲基-2-(4-(5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-3-(乙基氨基甲酰基)异唑-4-基)苯基)-2-(4AR,7AS)-四氢-2H-[1,4]二恶烷并[2,3-c]吡咯-6-(3H)-基)乙酸乙酯的制备，参照实施例12的方法。

该化合物15的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.41(d,J＝8.4Hz,2H),7.30(d,J＝8.1Hz,2H),6.77(s,1H),6.36(s,1H),4.25(s,1H),4.09-4.04(m,2H),3.80-3.75(m,2H),3.65(s,3H),3.57-3.49(m,2H),3.39,3.33(dd,J＝7.2,7.2Hz,2H),3.09-2.99(m,2H),2.84-2.71(m,2H),2.76-2.68(m,1H),1.20(t,J＝7.2Hz,3H),0.96(d,J＝2.8Hz),0.95(d,J＝2.8Hz).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):174.2,169.8,163.5,160.0,159.5,156.9,138.1,132.7,131.9,130.4,130.1,129.1,117.1,107.3,104.8,75.5,75.3,75.0,64.7,64.2,55.5,54.1,53.5,36.3,31.6,31.2,28.0,23.9,15.5.ESI-MS m/z:566.2(M+H)⁺,564.1(M-H)^-.

该化合物15的结构式为：

实施例16

化合物16：乙基-2-(4-(5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-3-(乙基氨基甲酰基)异唑-4-基)苯基)-2-(4AR,7AS)-四氢-2H-[1,4]二恶烷并[2,3-c]吡咯-6-(3H)-基)乙酸乙酯的制备，参照实施例12的方法。

该化合物16的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.44(d,J＝8.4Hz,2H),7.33(d,J＝8.4Hz,2H),6.81(s,1H),6.39(s,1H),4.23(s,1H),4.21-4.13(m,1H),4.10-4.08(m,3H),3.65(s,3H),3.82,3.80(dd,J＝4,3.2Hz,2H),3.59-3.52(m,2H),3.41,3.38(dd,J＝5.6,6Hz,2H),3.11-3.04(m,2H),2.87-2.84(m,2H),2.75-2.72(m,1H),1.20(t,J＝7.2Hz,3H),1.23,1.21(dd,J＝5.6,5.6Hz,6H),1.00,0.98(dd,J＝2.8,2.8Hz,6H).ESI-MSm/z:580.2(M+H)⁺,578.1(M-H)^-.

该化合物16的结构式为：

实施例17

以下实施例参照下述反应路线制备

按照以上线路，包括如下步骤：

(1)甲基4-(5-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)异恶唑-4-基)苯甲酸甲酯(化合物Ⅲ-1)的制备。

取一50mL单口瓶，加入化合物Ⅰ-10(600mg，1mmol)，(4-(甲氧基羰基)苯基硼酸(235mg，1.3mmol，1.3当量)，Pd(PPh₃)₂Cl₂(70mg，0.1mmol，10mol％)，碳酸氢钠(252mg，3mmol，3当量)，氩气交换，加入DMF：H₂O＝10mL：2mL溶液，置于80℃，搅拌5h。TLC跟踪监测。旋去大部分溶剂，过柱(PE：EA＝4:1)，得棕黄色产物620mg。ESI-MS m/z:605.2(M+H)⁺.

(2)4-(5-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-3-(甲基氨基甲酰基)异恶唑-4-基)苯甲酸(化合物Ⅲ-2)的制备。

取一25mL单口瓶，加入化合物Ⅲ-1(600mg)，加入丙酮(2mL)溶解，加入35％氢氧化钠溶液(1mL)，加入甲醇(4mL)使分层消失，室温搅拌2h。TLC跟踪监测。加入1N HCl溶液，调至酸性，旋去大部分有机溶液，加入EA和饱和食盐水萃取，收集有机相，干燥，旋干。直接用于下一步。ESI-MS m/z:591.1(M+H)⁺.

(3)5-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-N-甲基-4-(4-(4AR，7AS)-六氢-2H-[1,4]二恶烷并[2,3-C]吡咯-6-羰基)苯基)异恶唑-3-甲酰胺(化合物Ⅲ-3)的制备。

取一25mL单口瓶，加入粗化合物Ⅲ-2(400mg，0.68mmol)，HOBt(110mg，0.816mmol，1.2当量)，EDCI(195mg，1.02mmol，1.5当量)，DCM(5mL)溶解，加入TEA(0.4mL，2.72mmol，4当量)，搅拌15min，加入化合物7(87mg，0.68mmol，1当量)，搅拌过夜。TLC跟踪监测。加入DCM和饱和食盐水萃取，干燥，旋干，过柱(PE：EA＝2:1)。得无色粘壁状产物160mg。ESI-MS m/z:702.1(M+H)⁺.

(4)5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-N-甲基-4-(4-(4AR,7AS)-六氢-2H-[1,4]二恶烷并[2,3-C]吡咯-6-羰基)苯基)异恶唑-3-甲酰胺(化合物17)的制备。

取一25mL两口瓶，加入粗化合物Ⅲ-3(160mg,0.23mmol)，氩气保护，加入无水DCM(10mL)溶解，置于-5℃下，搅拌15min，滴加三溴化硼的二氯甲烷溶液(1M，0.69mL，3当量)，搅拌10min，置于室温下，搅拌1h。TLC跟踪显示原料反应完毕。-5℃下，加入DCM(10mL)稀释，加入饱和NaHCO₃溶液淬灭，萃取，收集有机相。往水相中加入EA，将生成的絮状固体溶解，收集有机相，混合，无水硫酸钠干燥，浓缩过柱子(DCM:acetone＝ 2:1)。将所得黄色粘稠状产物打浆，加入石油醚，低温下静置，析出白色固体，吸去黄色液体，所得固体油泵抽干，可得80mg白色固体。

该化合物17的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.51(d,J＝6.4Hz,2H),7.42(d,J＝6.4Hz,2H),6.94(s,1H),6.36(s,1H),4.32(s,1H),4.20(s,1H),3.88-3.59(m,8H),3.42,3.39(dd,J＝5.6,5.6Hz,2H),3.34-3.12(m,1H),1.24(t,J＝6.0Hz,3H),1.08(d,J＝5.6Hz,6H). ¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):173.3,169.9,163.3,160.2,159.4,156.7,136.8,134.9,131.6,130.0,129.1,128.9,117.0,107.3,104.7,75.0,74.2,64.4,64.2,62.4,51.4,36.4,28.2,23.9,23.9,15.5.ESI-MS m/z:522.1(M+H)⁺,520.1(M-H)^-.

实施例18

化合物18：5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-N-甲基-4-(4-(吗啉-4-羰基)苯基)异恶唑-3-甲酰胺的制备，参照实施例17的方法。

该化合物18的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.40-7.35(m,4H),6.91(s,1H),6.32(s,1H),3.72-3.70(m,8H),3.39,3.36(dd,J＝7.2,7.2Hz,2H),3.14-3.07(m,1H),1.21(t,J＝7.2Hz,3H),1.05(d,J＝6.8Hz,6H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):173.2,170.0,163.3,160.2,159.4,156.7,136.2,134.6,131.7,130.0,129.1,128.8,117.1,107.3,104.7,68.6,74.2,36.3,28.2,23.9,15.5.ESI-MS m/z:480.1(M+H)⁺,478.3(M-H)^-.

该化合物18的结构为：

实施例19

以下实施例参照下述反应路线制备

按照以上线路，包括如下步骤：

(1)(S)-乙基-2-羟基-2-苯基乙酸酯(化合物Ⅳ-1)的制备。

取一100mL单口瓶，加入3g(s)-(+)-扁桃酸，用乙醇(30mL)溶解，滴加浓硫酸(0.3mL)，置于80℃下回流，搅拌3h，TLC跟踪显示原料反应完毕。加入饱和NaHCO₃溶液直至无气泡生成，旋去大部分乙醇溶液，加入EA(30mL)萃取，饱和食盐水洗，收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋干，得无色油状液体(3.5g，98.5％)。

该化合物Ⅳ-1的表征数据为：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d,δ_ppm):7.42–7.27(m,5H),5.15(d,J＝4.0Hz,1H),4.27–4.10(m,2H),3.68(d,J＝4.0Hz,1H),1.20(t,J＝8.0Hz,3H)

(2)(S)-乙基-2-羟基-2-(4-碘苯基)乙酸乙酯(化合物Ⅳ-2)的制备。

取一100mL单口瓶，加入化合物Ⅳ-1(3.2g,17.8mmol)，无水DCM(60mL)溶解，将瓶子外壁用锡纸包裹避光，加入碘(4.5g，17.7mmol)和三氟甲磺酸银(4.56g，17.7mmol)，室温搅拌4h，TLC跟踪显示原料反应完毕。加入硫代硫酸钠溶液淬灭，过滤沉淀，DCM冲洗沉淀，萃取，饱和食盐水洗，收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱(PE：EA＝8:1),得棕色油状液体。

该化合物Ⅳ-2的表征数据为：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d,δ_ppm):7.67(d,J＝8.0Hz,2H),7.16(d,J＝8.4Hz,2H),5.10(d,J＝4.8Hz),4.29-4.12(m,2H),3.59(d,J＝5.2Hz),1.24(t,J＝7.8Hz,3H).

(3)(S)-乙基-2-羟基-2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)苯基)乙酸乙酯(化合物Ⅳ-3)的制备。

取一50ml的两口瓶，加入化合物Ⅳ-2(0.55g，1.8mmol)，联硼酸频那醇酯(0.55g，2.16mmol)，[1,1'-双(二异丙基膦)二茂铁]二氯钯(54mg，0.09mmol)，乙酸钾(529mg，5.4mmol)，氩气交换，加入DMF溶解，置于90℃下，搅拌1h，TLC跟踪显示原料反应完毕。旋去大部分DMF，加入EA，过滤沉淀，EA冲洗，旋干，过柱(PE：EA＝8:1)。得无水油状液体(390mg，70.9％)。

该化合物Ⅳ-3的表征数据为：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d,δ_ppm):7.81(d,J＝7.6Hz,2H),7.44(d,J＝7.2Hz,2H),5.16(s,1H),4.23-4.09(m,2H),3.56(s,1H),1.33(s,12H),1.22(t,J ＝7.2Hz,3H).

(4)(S)-乙基2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)-2-(甲苯磺酰氧基)乙酸甲酯(化合物Ⅳ-4)的制备。

取一100mL单口瓶，加入化合物3(1g，3.27mmol)，无水DCM(10mL)溶解，加入干燥三乙胺(1.4mL，9.8mmol，3当量)，缓慢加入TsCl(1.86g，9.8mmol，3当量)，置于50℃下，搅拌过夜。TLC跟踪显示原料反应完毕。加入水和DCM，萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱(PE：EA＝10:1)。得无水油状液体(1g，66.7％)。

(5)(S)-乙基2-吗啉基-2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊烷-2-基)苯基)乙酸乙酯(化合物Ⅳ-5)的制备。

取一50mL单口瓶，加入化合物Ⅳ-4(0.5g，1.09mmol)，甲苯(8mL)溶解，加入干燥三乙胺(0.3mL，2.17mmol，2当量)，吗啉(0.14mL，1.64mmol，1.5当量)，置于油浴锅中回流。搅拌2h，TLC跟踪显示原料反应完毕。旋去大部分甲苯，加入EA和饱和食盐水，萃取，无水硫酸钠干燥，旋干(260mg，64％)，直接用于下一步。

(6)(S)-(4-(2-乙氧基-1-吗啉代-2-氧乙基)苯基)硼酸(化合物Ⅳ-6)的制备。

取一50mL单口瓶，加入化合物Ⅳ-5(250mg，0.67mmol)，加入HCl溶液10mL(调至pH＝3)，加入正己烷(10mL)，搅拌，加入苯硼酸(81mg，0.67mmol，1当量)，剧烈搅拌，直至苯硼酸全部溶解，再搅拌0.5h，TLC跟踪显示原料反应完毕。萃取，保留水相，加入正己烷再洗一次，加入EA洗去反应不完的苯硼酸，保留水相，加入饱和碳酸氢钠溶液，将水相调至偏碱性，再加入EA*2萃取，无水硫酸钠干燥，旋干，直接用于下一步。得无色粘稠状产物160mg，82％。

(7)(S)-乙基2-(4-(5-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-3-(乙基氨基甲酰基)异恶唑-4-基)苯基)-2-吗啉代乙酸酯(化合物Ⅳ-7)的制备。

取一25mL单口瓶，加入化合物Ⅰ-10(102mg，0.17mmol)，化合物Ⅳ-6(60mg，0.2mmol，1.2当量)，Pd(PPh₃)₂Cl₂(12mg，0.02mmol，10mol％)，碳酸氢钠(43mg，0.51mmol，3当量)，氩气交换，加入DMF：H₂O＝10mL：2mL溶液，置于80℃，搅拌3h。TLC跟踪监测。旋去大部分溶剂，过柱(PE：EA＝4:1)，得棕黄色产物75mg。ESI-MS m/z:718.1(M+H)⁺。

(8)(S)-乙基2-(4-(5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-3-(乙基氨基甲酰基)异恶唑-4-基)苯基)-2-吗啉代乙酸酯(化合物19)的制备。

取一25mL两口瓶，加入粗化合物Ⅳ-7(68mg)，氩气保护，加入无水DCM(10mL)溶解，置于0℃下，搅拌15min，滴加三溴化硼的二氯甲烷溶液(1M，0.28mL，3当量)，搅拌10min，置于室温下，搅拌1h。TLC跟踪显示原料反应完毕。0℃下，加入DCM(10mL)稀释，加入饱和NaHCO₃溶液淬灭，萃取，收集有机相。往水相中加入EA，将生成的絮状固体溶解，收集有机相，混合，无水硫酸钠干燥，浓缩过柱子(DCM:acetone＝1:1)。将所得黄色粘稠状产物打浆，加入石油醚，低温下静置，析出白色固体，吸去黄色液体，所得固体油泵抽干，可得25mg白色固体(S构型)。

该化合物19的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.44(d,J＝6Hz,2H),7.33(d,J＝5.6Hz,2H),6.79(s,1H),6.39(s,1H),4.22(d,J＝8Hz,1H),4.19(d,J＝5.6Hz,1H),4.12(d,J＝5.6Hz,1H),4.02(s,4H),3.40(d,J＝5.6Hz,2H),3.10(t,J＝5.2Hz,1H),2.47(s,4H),1.22(d,J＝5.6Hz,6H),0.98(d,J＝5.2Hz,6H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):173.6,169.8, 163.4,160.0,159.4,156.9,132.7,132.1,131.9,130.8,130.0,129.0,117.3,117.1,107.3,104.7,76.1,68.5,63.1,53.6,53.6,36.3,28.0,23.9,23.9,15.5,15.2.ESI-MS m/z:538.1(M+H)⁺,536.1(M-H)^-.

实施例20

化合物20：(S)-乙基-2-(4-(5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-3-(乙基氨基甲酰基)异恶唑-4-基)苯基)-2-(4AR,7AS)-四氢-2H-[1,4]二恶烷并[2,3-c]吡咯-6-(3H)-基)乙酸乙酯的制备，参照实施例19的方法。

该化合物20的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.44(d,J＝6.4Hz,2H),7.33(d,J＝6.4Hz,2H),6.81(s,1H),6.81(s,1H),4.26(s,1H),4.21-4.16(m,1H),4.12-4.09(m,3H),3.82-3.79(m,2H),3.59-3.54(m,2H),3.41,3.38(dd,J＝5.6,6.0Hz,2H),3.11-3.05(m,2H),2.87-2.84(m,1H),2.81-2.72(m,1H),1.23,1.20(dd,J＝5.6,5.6Hz,6H),0.99(t,J＝2.4Hz,6H). ¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):173.7,169.7,163.5,160.0,159.5,156.9,138.1,134.0,132.6,131.9,130.4,130.0,129.0,117.1,107.3,104.7,75.4,75.3,75.2,64.7,64.1,63.1,55.5,54.1,36.3,28.1,23.9,15.5,15.2.ESI-MS m/z:580.2(M+H)⁺,578.1(M-H)^-.

该化合物20的结构式为：

实施例21

化合物21：(S)-异丙基-2-(4-(5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-3-(乙基氨基甲酰基)异恶唑-4-基)苯基)-2-(4AR,7AS)-四氢-2H-[1,4]二恶烷并[2,3-c]吡咯-6-(3H)-基)乙酸乙酯的制备，参照实施例19的方法。

该化合物21的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.44(d,J＝8.4Hz,2H),7.33(d,J＝8.4Hz,2H),6.81(s,1H),6.39(s,1H),5.02-4.97(m,1H),4.21(s,1H),4.09(s,2H),3.82-3.80(m,2H),3.59-3.53(m,2H),3.41,3.38(dd,J＝5.6,5.6Hz,2H),3.11-3.04(m,2H),2.86-2.78(m,2H),2.75-2.72(m,1H),1.27(d,J＝4.8Hz,3H),1.22(t,J＝5.6Hz,3H),1.14(d,J＝4.8Hz,3H),1.00(t,J＝3.2Hz,6H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):173.3,169.7,163.5,160.0,159.6,156.9,138.2,132.5,131.8,130.4,130.0,129.0,117.1,107.3,104.7,75.5,75.3,70.9,64.7,64.1,55.5,54.1,36.4,28.1,24.0,22.8,22.6,15.5.ESI-MS m/z:594.2(M+H)⁺,592.1(M-H)^-.

该化合物21的结构式为：

实施例22

化合物22：(S)-乙基2-(4-(5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-3-(乙基氨基甲酰基)异恶唑-4-基)苯基)-2-((2S,6R)-2,6-二甲基吗啉)乙酸酯的制备，参照实施例19的方法。

该化合物22的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.39(d,J＝8.4Hz,2H),7.31(d,J＝8.0Hz,2H),6.77(s,1H),6.37(s,1H),4.19-4.03(m,2H),3.97(s,1H),3.77-3.63(m,2H),3.39,3.35(dd,J＝7.2,7.2Hz,2H),3.09-3.02(m,1H),2.86(d,J＝6.8Hz,1H),2.57(d,J＝11.2Hz,1H),1.94(t,J＝6.8Hz,1H),1.66(t,J＝10.8Hz,1H),1.20-1.16(s,6H),1.22(d,J＝6.4Hz,3H),1.03(d,J＝6.4Hz,3H),0.96(d,J＝6.4Hz,6H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):173.6,169.7,163.4,159.9,159.4,156.9,136.6,132.5,131.8,130.7,130.0,128.9,117.0,107.2,104.7,75.7,73.6,73.4,63.0,59.5,58.6,36.3,28.8,28.0,23.9,23.8,20.0,15.4,15.2.ESI-MS m/z:566.2(M+H)⁺,564.1(M-H)^-.

该化合物22的结构式为：

实施例23

化合物23：(R)-乙基-2-(4-(5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-3-(乙基氨基甲酰基)异恶唑-4-基)苯基)-2-吗啉代乙酸酯的制备，参照实施例19的方法。

该化合物23的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.40(d,J＝6.4Hz,2H),7.30(d,J＝6.4Hz,2H),6.77(s,1H),6.36(s,1H),4.26(s,1H),4.29-4.10(m,1H),4.09-4.04(m,1H),3.99(s,1H),3.67(s,4H),3.39,3.35(dd,J＝5.6,5.6Hz,2H),3.08-3.03(m,1H),2.45(d,J＝3.6Hz,4H),1.20,1.17(dd,J＝5.6,6.0Hz,6H),0.95(d,J＝5.6Hz,6H).¹³CNMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):173.6,169.8,163.4,160.0,159.4,156.9,126.7,132.7,132.0,131.9,130.8,130.2,129.0,117.1,117.1,107.3,104.7,104.6,76.1,68.6,68.5,63.1,53.6,36.3,28.0,23.9,23.9,15.5,15.2.ESI-MS m/z:538.1(M+H)⁺,536.1(M-H)^-.

该化合物23的结构式为：

实施例24

化合物24：(R)-乙基-2-(4-(5-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-3-(乙基氨基甲酰基)异恶唑-4-基)苯基)-2-(4AR,AS)-四氢-2H-[1,4]二恶烷并[2,3-c]吡咯-6-(3H)-基)乙酸乙酯的制备，参照实施例19的方法。

该化合物24的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OD,δ_ppm):7.41(d,J＝6.4Hz,2H),7.30(d,J＝6.4Hz,2H),6.78(s,1H),6.37(s,1H),4.24(s,1H),4.18-4.15(m,1H),4.09-4.06(m,1H),3.79-3.76(m,2H),3.56-3.49(m,2H),3.38,3.35(dd,J＝5.6,5.6Hz,2H),3.08-3.01(m,2H),2.85-2.76(m,2H),2.73-2.69(m,1H),1.20,1.17(dd,J＝5.2,5.6Hz,6H),0.97(dd,J＝2.8,2.8Hz,6H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):173.6,169.8,163.5,160.0,159.5,156.9,138.0,132.6,131.9,130.4,130.1,130.1,129.7,129.0,117.1,107.3,104.8,75.4,75.3,75.2,64.7,64.1,63.1,55.5,54.1,36.3,28.1,24.0,23.8,15.5,15.2.ESI-MS m/z:580.2(M+H)⁺,578.1(M-H)^-.

该化合物24的结构式为：

实施例25

以下实施例参照下述反应路线制备

按照以上线路，包括如下步骤：

(1)(4-溴苄基)氧基)(叔丁基)二甲基硅烷(化合物Ⅶ-1)的制备。

取一100mL单口瓶，加入4-溴苄醇(5g，26.9mmol)，咪唑(2.2g，1.2当量，32.3mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(催化量)，DCM(40mL)溶解，缓慢加入叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)(4.87g，1.2当量，32.3mmol)，搅拌过夜。TLC监测反应完毕，加入水，溶解生成的固体，萃取，加入饱和食盐水洗，收集有机相，无水硫酸钠干燥后旋蒸除去有机溶剂，得7.7g无色油状物，产率为95％。ESI-MS m/z:301.0(M+H)⁺。

(2)1-(4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)苯基)乙酮(化合物Ⅶ-2)的制备。

取一50mL两口瓶，加入化合物2(4g，13.3mmol)和四三苯基膦钯(0.77g，5mmol％，0.67mmol)，氩气交换，加入DMF溶解，加入三丁基(1-乙氧基乙烯)锡(5.4mL，1.2当量，16mmol)，置于100℃，搅拌2h，TLC监测反应完毕。用油泵减压，真空旋蒸，除去大部分DMF，加入EA和1N盐酸溶液，搅拌，TLC监测反应完毕，萃取，加入饱和食盐水洗，收集有机相，无水硫酸钠干燥后旋蒸除去有机溶剂，拌样过柱(PE：DCM＝8:1)，得2.5g无色液体，产率为70％。

(3)3-(4-((叔丁基二甲基硅氧基)甲基)苯基)-3-氧代丙酸乙酯(化合物Ⅶ-3)的制备。

取一50mL单口瓶，加入化合物3(1g，3.8mmol)，甲苯溶解，加入碳酸二乙酯(0.91mL，2当量，7.6mmol)，缓慢加入NaH(0.3g，2当量，7.6mmol)，置于100℃，回流搅拌过夜。TLC监测反应完毕。置于0℃中，加入水淬灭，旋蒸除去大部分有机溶剂，加入EA萃取两次，加入饱和食盐水，收集有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩过柱(PE：DCM＝4:1)。得650mg无色油状物，产率为50％。

该化合物Ⅶ-3的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃Cl,δ_ppm):7.93(d,J＝8.1Hz,2H),7.44(d,J＝8.1Hz,2H),4.80(s,2H),4.24(dd,J＝7.2,7.2Hz,2H),3.98(s,2H),0.95(s,9H),0.11(s,6H).

(4)乙基-1-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-5-(4-(((叔丁基二甲基硅氧基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-羧酸乙酯(化合物Ⅶ-4)的制备。

取一50mL单口瓶，加入化合物Ⅶ-3(600mg，1.8mmol)和(((4-叠氮基-6-异丙基-1,3-亚苯基二(氧基))双(亚甲基))二苯(1g，1.5当量，2.7mmol，混合物)，DMSO溶解，加入DBU(0.4mL，1.5当量，2.7mmol)，室温搅拌过夜。TLC监测反应完毕。加入水和EA，收集有机相，加入水再萃取两次，收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋干过柱PE：EA＝8:1，得800mg油状物，产率为64％。

(5)1-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-5-(4-(((叔丁基二甲基硅氧基)甲基)苯基)-N-乙基-1H-1,2,3-三唑-4-甲酰胺(化合物Ⅶ-5)的制备。

取一50mL单口瓶，加入化合物Ⅶ-4(800mg，1.16mmol)，加入乙醇溶解，加入乙胺水溶液(10mL)，置于80℃，回流搅拌1d，TLC监测反应完毕。旋蒸除去大部分有机溶剂，加入EA，萃取两次，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，旋干，得600mg油状产物，产率为75％。

(6)1-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-N-甲基-5-(4-(羟基甲基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-甲酰胺(化合物Ⅶ-6)的制备。

取一50mL单口瓶，加入化合物Ⅶ-5(600mg，0.87mmol)，加入四丁基氟化胺(TBAF)的THF溶液(10mL)溶解，室温搅拌2h。TLC监测反应完毕。旋蒸除去大部分有机溶剂，加入EA，萃取两次，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，旋干，得500mg油状产物，产率为 99.8％。

(7)1-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-N-甲基-5-(4-甲酰基苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-甲酰胺(化合物Ⅶ-7)的制备。

取一50mL单口瓶，加入化合物Ⅶ-6(500mg，0.87mmol)，DCM溶解，加入2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)和四丁基溴化铵(TBAB)(催化量)，加入次氯酸钠(NaOCl)溶液(5mL)和NaHCO₃溶液(2mL)，室温搅拌1h。溶液从红棕色变成浅黄色。TLC监测反应完毕。加入DCM，萃取三次，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱(PE：EA＝5:1)得250mg粘稠状产物，产率50％。

该化合物Ⅶ-7的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃Cl,δ_ppm):9.99(s,1H),7.75(d,J＝8Hz,2H),7.46(d,J＝8.4Hz,2H),7.39-7.21(m,8H),6.94(t,J＝5.6Hz,2H),6.39(s,1H),4.96(s,2H),4.72(s,2H),3.82(t,J＝6.4Hz,1H),3.51-3.44(m,2H),3.31-3.26(m,1H),1.26(d,J＝2.8Hz,3H),1.18(d,J＝6.8Hz,6H).ESI-MS m/z:575.0(M+H)⁺。

(8)乙基-2-(4-(1-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-4-(乙基氨基甲酰基)-1H-1,2,3-三唑-5-基)苯基)-2-羟基乙酸(化合物Ⅶ-8)的制备。

取一50mL单口瓶，加入化合物Ⅶ-7(250mg，0.44mmol)，DCM溶解，加入I₂(催化量)，加入三甲基氰硅烷(TMSCN)(0.11mL，2当量，0.87mmol)，室温搅拌30min，TLC监测反应完毕。加入水淬灭，萃取，饱和食盐水洗，干燥，无水硫酸钠旋干。加入氯化氢乙醇溶液(10mL)，室温搅拌过夜。TLC监测反应完毕。加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭，旋蒸除去大部分有机溶剂，加入EA，萃取两次，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，旋干过柱PE：EA＝4:1，得140mg，产率为49.1％。ESI-MS m/z:649.0(M+H)⁺。

(9)乙基-2-(4-(1-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-4-(乙基氨基甲酰基)-1H-1,2,3-三唑-5-基)苯基)-2-(甲苯磺酰)乙酸酯(化合物Ⅶ-9)的制备。

取一25mL单口瓶，加入化合物Ⅶ-8(140mg，0.22mmol)，DCM溶解，加入TEA(92μL，3当量，0.66mmol)和TsCl(126mg，3当量，0.66mmol)，置于40℃中，搅拌4h。TLC监测反应完毕。加入饱和食盐水萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱PE:EA＝4:1，得50mg，产率28％。

(10)乙基-2-(4-(1-(2,4-双(苯甲氧基)-5-异丙基苯基)-4-(乙基氨基甲酰基)-1H-1,2,3-三唑-5-基)苯基)-2-吗啉代乙酸酯(化合物Ⅶ-10)的制备。

取一25mL单口瓶，加入化合物11(50mg，0.06mmol)，甲苯溶解，加入吗啉(20μL，4当量，0.24mmol)和TEA(33μL，4当量，0.24mmol)，置于100℃，回流搅拌2h。TLC监测反应完毕。旋蒸除去大部分有机溶剂，加入饱和食盐水萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋干，得30mg，产率为70％。

ESI-MS m/z:718.0(M+H)⁺。

(11)乙基-2-(4-(1-(2,4-二羟基-5-异丙基苯基)-4-(乙基氨基甲酰基)-1H-1,2,3-三唑-5-基)苯基)-2-吗啉代乙酸酯(化合物25)的制备。

取一25mL单口瓶，加入化合物Ⅶ-10(30mg，0.04mmol)，氩气交换，加入无水DCM溶解，置于-5℃下，搅拌15min，滴加三溴化硼二氯甲烷溶液(0.12mL，3当量，0.12mmol)，搅拌15min，置于室温搅拌2h。加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭，萃取，饱和食盐水洗，收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱(DCM：acetone＝2:1)，得10mg固体，产率48％。

该化合物25的表征数据为：¹H NMR(400MHz,CD₃OH,δ_ppm):7.43(d,J＝8.4Hz,2H),7.39(d,J＝8.4Hz,2H),6.85(s,1H),6.37(s,1H),4.19-4.08(m,2H),4.06(s,1H),3.72-3.65(m,4H),3.45,3.42(dd,J＝6,6.4Hz,2H),3.16-3.09(m,1H),2.48-2.41(m,4H),1.27(t,J＝7.2Hz,3H),1.18(t,J＝7.2Hz,3H),1.09(d,J＝6.8Hz,6H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD,δ_ppm):194.4,176.9,164.2,163.7,159.3,157.4,153.5,142.4,140.2,137.5,132.15,130.3,129.1,127.7,117.0,104.6,83.4,75.7,69.2,68.3,63.3,53.5,48.0,35.9,28.2,23.8,15.9,15.2.ESI-MS m/z:538.2(M+H)⁺,536.2(M-H)^-.

实验例

(1)目标化合物的酶活性筛选方法。

原理：FITC标记的格尔德霉素与HSP90结合后，会使产生荧光偏振，如果化合物能与格尔德霉素竞争性抑制HSP90酶，则检测不到荧光偏振。

试剂与仪器：荧光标记的格尔德霉素(Sigma公司)，Hsp90α或Hsp90β酶溶液(Stressgen Bioreagents Corp公司，cat.no.SPP-776)，DTT(Promega公司)，牛血清白蛋白(BSA)(Hyclone公司)，DMSO(Sigma公司)。Envision2104荧光测定仪(美国Perkin Elmer公司)，加样器(Eppendorf公司)，微孔板(corning公司)。

每个化合物均设置多个不同剂量组，高剂量组配置成母液，剩余剂量组依次三倍比稀释至最低剂量组，全部样品溶入DMSO中并于-20℃下保存备用。实验buffer包含有20mmol/l HEPES(K)，50mmol/l KCl，5mmol/l MgCl₂，20mmol/l Na₂MoO₄和0.01％NP40，PH为7.3。每次实验前加入5μl含40mM DTT和2mg/ml BSA的反应缓冲液，再加入2.5μl荧光标记的格尔德霉素(反应浓度5nM)。然后利用化合物转移仪器Liquid Handler Echo520将10nl1000×梯度浓度稀释好的化合物加入到反应液中，最后加入2.5μl Hsp90βor Hsp90α酶溶液(反应浓度35ng/μl)。室温轻微振荡反应2小时，最后用微孔板读板仪测定读数，激发光为485nm，发射光为530nm，数据用Graphpad Prism5软件处理。

(2)目标化合物抗癌细胞活性筛选方法。

CCK试剂盒工作原理：Cell Counting Kit简称CCK试剂盒，是一种基于WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲瓒产物(formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶联检测仪在540/720nm波长处测定吸光值，间接反映活细胞数量。

试剂与仪器：各种癌细胞系(美国ATCC公司)，青霉素、链霉素、DMSO(Sigma公司)，CCK8(CK04，日本同仁化工)，RPMI1640(GIBCO公司)，BSA(Hyclone公司)，胰蛋白酶(吉诺公司)，384孔细胞培养板(Corning)。

各癌细胞混悬于相应培养液中配制成适宜浓度，50μl/孔体积种植于384孔板，培养于37℃，5％CO₂恒温培养箱内24h。将化合物用DMSO溶解成10mM母液，并用DMSO 1:3梯度稀释成10个浓度梯度的1000×化合物系列浓度储存液，利用化合物转移仪器LiquidHandler Echo520将1000×系列浓度化合物储存液转移至细胞384孔板的相应孔中，每孔50nL，空白对照孔中加入等体积溶媒DMSO。轻柔混匀，37℃继续培养。72h后重新更换相应培养基，并向每孔加入3μl的CCK8细胞增殖——毒性检测试剂。继续将培养板在37℃培养箱孵育2h，然后使用酶联检测仪在540/720nm波长处测定吸光值。

本实验采用上述方法分别测定了所合成的目标化合物对HSP90蛋白的两种亚型HSP90α和HSP90β的抑制活性；对HSP90高表达的人肺癌细胞系A549、人乳腺癌细胞系MCF-7、慢性骨髓性白血病细胞系K562、前列腺癌细胞系DU145及试验用增殖表皮癌细胞系Hela的抑制活性。结果如表1所示。

表1目标化合物对HSP90蛋白及肿瘤细胞系的抑制活性IC₅₀(单位为nM)

根据表1，从酶活水平来看，上述化合物同时对两种HSP90亚型均具有抑制作用，且大部分化合物与HSP90α的结合能力较强于HSP90β。相比阳性对照化合物NVP/AUY-922(CAS：747412-49-3)，大多数化合物表现出更强的抑制活性，进一步证明目标骨架更适合靶点的活性口袋。从细胞水平来看，上述化合物对五类癌细胞系都有较强的抑制活性，大多数化合物能达到几或几十个纳摩尔的水平，尤其是对表皮癌细胞系Hela有较好的抑制效果。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。