CN106714812A - 用于治疗肾病的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供使用半乳凝素‑3抑制剂，例如改性果胶(例如GCS‑100)，治疗肾病，例如慢性肾病或NASH，的方法。同时描述了用于评估和/或监测半乳凝素‑3抑制剂的效果，例如，以便于在治疗期间调整抑制剂的给药方案的方法。

Description

用于治疗肾病的组合物和方法

相关申请

本申请要求2014年3月10日提交的美国临时申请No.61/950,806的利益，通过引用的方式将其内容合并入本文。

发明背景

在发达国家，被诊断为高血压、高血脂和糖尿病的个体的持续增加促使肾病的发生的总体上升，例如慢性肾病(CKD)、NASH、和终末期肾病(ESRD)。(Tumlin等,(2013)“Cardiorenal Syndrome Type 4:insights on clinical presentation andpathophysiology from the Eleventh Consensus Conference of the acute dialysisquality initiative,”Contrib Nephrol.2013；182:158-73)。慢性肾病(CKD)和终末期肾病(ESRD)的流行性的上升是全球性的医疗和流行病学问题(Redon等,(2006)“ERIC-HTA2003 study investigators:kidney function and cardiovascular disease in thehypertensive population:the ERIC-HTA study,”J.Hypertens 24:663-669)。在美国，据估计高达13％的人口(3千万人)有CKD。越来越多的证据表明肾功能下降是心血管疾病的独立危险因素。患有CKD的患者在心肌梗塞之后有较高的死亡危险，甚至只是经历过短暂肾功能异常的患者，也具有增加的CVD长期危险(Id.；Mathew等,(2002)“Coronaryintervention incidence and prognostic importance of acute renal failure afterpercutaneous coronary intervention,”Circulation 105:2259-2264.)。

虽然在患者中导致CKD的机理还不完全清楚，但越来越意识到在肾反应中发挥作用以补偿受损的肾小球滤过率(GFR)和肾损伤的多个信号传导途径的作用。大量科学研究集中于这些途径的独特的病理生理学机理，希望设计新的策略，用以治疗肾病(Ronco等,“Cardio-renal syndromes:report from the consensus conference of AcuteDialysis Quality Initiative,”Eur Heart J 31:703-771.)。

这些生理反应可能导致多个补偿途径的激活，包括肾素-血管紧张素-醛固酮轴(RAAS)和交感神经系统的上调，以及钙-甲状旁腺轴的激活。(Tumlin等,(2013)“Cardiorenal Syndrome Type 4:insights on clinical presentation andpathophysiology from the Eleventh Consensus Conference of the acute dialysisquality initiative,”Contrib Nephrol.2013；182:158-73)。

近来的几项研究表明半乳凝素-3的循环水平的升高与终末期肾病(ESRD)患者的预后不良相关(de Boer等,2011)。此外，使用多个肾病(单侧输尿管梗阻[UUO]、缺血再灌注[I/R]和肾移植)动物模型进行的若干临床前研究证明巨噬细胞中半乳凝素-3的表达和分泌在导致肾衰竭的组织纤维化的形成中的直接因果作用。特别是，与表达半乳凝素-3的对照小鼠相比，通过基因工程方法使其缺乏半乳凝素-3的动物在肾损伤或移植之后没有表现出疤痕形成(纤维化)，而是表现出促炎性细胞因子表达的减少和肾功能的提高(Henderson等,2008,Dang等,2012,Fernandes Bertocchi等,2008)。

这些发现共同强调了间接或直接靶向半乳凝素-3在治疗肾病中的可能性。由于下调半乳凝素-3的能力可以减轻肾损伤并提高肾功能，本领域中有极大的需求去鉴别靶向半乳凝素-3或半乳凝素-3介导的信号传导途径的化合物，以适当地确定有效并经济的治疗用药过程。

发明简述

本文描述的发明提供一种安全并有效的肾病疗法，其使用半乳凝素-3抑制剂，特别是改性果胶，例如GCS-100。本发明进一步提供用半乳凝素-3抑制剂或改性果胶与一种或更多种附加治疗剂共同治疗肾病的组合疗法，所述一种或更多种附加治疗剂可用于治疗癌症、心血管疾病、感染、炎症、纤维化和肾损伤。与治疗肾病的方法相关的组合物和制品，包括药盒，也被预期是本发明的一部分。

在特定的实施方案中，以相对于其它半乳凝素，特别是半乳凝素-9而言，优选性地影响半乳凝素-3的水平和/或活性的剂量施用半乳凝素-3抑制剂，例如，因为与该药剂抑制半乳凝素-9的水平和/或活性相比，它抑制半乳凝素-3的水平和/或活性的程度更高。例如，该药剂针对半乳凝素-9的IC₅₀可以比它针对半乳凝素-3的IC₅₀高至少2、3、5、10、20、50、100倍或者甚至超过100倍。不希望受到理论的束缚，抑制半乳凝素-9的水平和/或活性可能引发不希望的副作用，因此，抑制半乳凝素-3的水平和/或活性达到治疗有效的程度，但基本上不抑制半乳凝素-9的水平和/或活性，是合乎需要的。相应地，在一些实施方案中，本文描述的方法包括在用半乳凝素-3抑制剂治疗的患者中测量半乳凝素-9的水平，以确定对半乳凝素-9的水平和/或活性的影响是否达到临床显著的程度。如果测量显示半乳凝素-9的水平和/或活性受到显著影响，可以相对于测量前施用的剂量减少半乳凝素-3抑制剂的一个或更多个后续剂量。

本发明的一方面提供在患者中治疗肾病的方法，包括：给患者施用至少一种半乳凝素-3抑制剂。

在一些实施方案中，肾病选自NASH(非酒精性脂肪性肝炎)、肾衰竭、CKD(慢性肾病)、肝肾综合症、酸中毒、ARF(急性肾衰竭)、无生育力(Agenesis)、Alport综合症(Alportsyndrome)、淀粉样变性、止痛药性肾病变、抗-GBM病(Goodpasture病(Goodpasturedisease))、抗-磷脂综合症、动脉粥样硬化栓塞(Atheroemboli)(胆固醇栓塞)、巴特综合症(Bartter syndrome)、良性家族性血尿、伯杰氏病(Berger's disease)、动静脉内瘘(Brescia-Cimino fistula)、钙化防御、慢性肾盂肾炎(反流性肾病)、CRF(慢性肾衰竭)、慢性肾功能不全、保守治疗、新月体肾炎(RPGN(急进性肾小球肾炎))、膀胱炎、肾囊肿、致密物沉积病或MCGN(小叶性肾炎(mesangiocapillary glomerulonephritis))、尿崩症、糖尿病性肾病、排尿困难、浮肿、ESRD或ESRF(终末期肾病(End Stage Renal Disease)或终末期肾衰竭(End Stage Renal Failure))、Fabry病(Fabry disease)、范可尼综合症(Fanconisyndrome)、纤维颤动性肾炎(Fibrillary nephritis)、FSGS(局灶节段性肾小球硬化)、Gitelman综合症(Gitelman syndrome)、肾小球肾炎、血尿、HUS(溶血性尿毒综合症)、肾积水、过敏性紫癜、肝肾综合症、肾上腺样瘤、发育不全、IgA肾病(伯杰氏病)、间质性肾炎、腰痛血尿综合症、恶性高血压、髓质海绵肾、膜性肾病、膜增生性肾小球肾炎、MCGN(小叶性肾炎)、MPA(显微镜下多血管炎)、肾病变(Nephropathy)、肾病综合症、胡桃夹综合症、少尿、骨营养不良、Page肾(Page kidney)、多动脉炎、(PKD)多囊肾病、感染后肾小球肾炎、梅干腹综合症(Prune belly syndrome)、肾盂肾炎、反流性肾病、肾小管性酸中毒、腹膜后纤维化、肉样瘤(Sarcoidosis)、过敏性紫癜、硬皮病肾危象、干燥综合症(Sjogren's syndrome)、系统性硬化、系统性血管炎、薄GBM病(Thin GBM disease)、血栓性血小板减少性紫癜、TTP(血栓性血小板减少性紫癜)、结节性硬化症、尿道炎、血管炎和韦格纳氏肉芽肿(Wegener’sgranulomatosis)。

在一些实施方案中，患者患有CKD。

在一些实施方案中，患者患有NASH。

在一些实施方案中，患者具有约15-44mL/min/1.73m²的基线eGFR(肾小球滤过率)。

在一些实施方案中，半乳凝素-3抑制剂是改性果胶。

在一些实施方案中，改性果胶的主链包括同聚半乳糖醛酸和/或鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I。

在一些实施方案中，改性果胶是去酯化的并且部分解聚的，以具有中断的(disrupted)鼠李糖半乳糖醛酸聚糖主链。

在一些实施方案中，改性果胶具有在50-200kDa之间，优选在80-150kDa之间的平均分子量。

在一些实施方案中，改性果胶基本不含有分子量在25kDa以下的改性果胶。

在一些实施方案中，改性果胶是GCS-100。

在一些实施方案中，改性果胶通过使改性的或未改性的果胶穿过切向流过滤器来制作。

在一些实施方案中，方法包括以约0.1-2mg/m²的剂量施用改性果胶。

在一些实施方案中，剂量是约1.5mg/m²。

在一些实施方案中，剂量是约1-10mg。

在一些实施方案中，剂量是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg，优选1、3或9mg。

在一些实施方案中，半乳凝素-3抑制剂每周施用一次或每两周施用一次。

在一些实施方案中，半乳凝素-3抑制剂在诱导阶段每周施用一次，然后在维持阶段每两周施用一次。

在一些实施方案中，诱导阶段是1-3个月，优选2个月。

在一些实施方案中，维持阶段是至少1个月，优选至少3个月，或者甚至六个月或更长。

在一些实施方案中，所述至少一种半乳凝素-3抑制剂以降低患者血清中尿酸水平的量被施用。

在一些实施方案中，所述至少一种半乳凝素-3抑制剂以降低患者血清中BUN水平的量被施用。

在一些实施方案中，所述至少一种半乳凝素-3抑制剂以引起患者中GFR变化的量被施用。

在一些实施方案中，所述至少一种半乳凝素-3抑制剂以降低患者血清中半乳凝素-3水平的量被施用。

在一些实施方案中，所述至少一种半乳凝素-3抑制剂以降低患者中半乳凝素-3的表达水平的量被施用。

在一些实施方案中，所述至少一种半乳凝素-3抑制剂以降低患者中半乳凝素-3的活性的量被施用。

在一些实施方案中，半乳凝素-3的浓度、表达水平或活性与对照相比降低0.5、1、2、3、4或5倍。

在一些实施方案中，该方法还包括：1)在施用半乳凝素-3抑制剂之前测量半乳凝素-3的浓度、水平或活性，和2)在施用半乳凝素-3抑制剂之后测量半乳凝素-3的浓度、水平或活性。

在一些实施方案中，施用半乳凝素-3抑制剂之后半乳凝素-3的浓度、水平或活性降低表明半乳凝素-3抑制剂的剂量对于治疗患者的肾病来说是半乳凝素-3抑制剂的有效剂量。

在一些实施方案中，施用半乳凝素-3抑制剂之后半乳凝素-3的浓度、水平或活性升高表明半乳凝素-3抑制剂的剂量对于治疗患者的肾病来说是半乳凝素-3抑制剂的无效剂量。

在一些实施方案中，该方法还包括给患者施用第二剂量的半乳凝素-3抑制剂，所述第二剂量比之前施用的量低。

在一些实施方案中，该方法还包括施用附加的治疗剂。

在一些实施方案中，附加的治疗剂对于治疗心血管疾病、肾衰竭、癌症、炎症、纤维化或感染是有用的。

在一些实施方案中，附加的治疗剂选自抗氧化剂，抗炎药物，化疗的、抗感染的、抗菌的或抗纤维化的药物。

在一些实施方案中，该方法包括与治疗剂同时施用半乳凝素-3抑制剂。

在一些实施方案中，该方法包括在施用治疗剂之后施用半乳凝素-3抑制剂。

在一些实施方案中，该方法包括在施用半乳凝素-3抑制剂之后施用治疗剂。

在一些实施方案中，该方法包括在至少8周的时间段中施用多个剂量的半乳凝素-3抑制剂。

在一些实施方案中，该方法包括每周一次施用半乳凝素-3治疗剂。

在一些实施方案中，半乳凝素-3抑制剂通过注射或静脉输注被施用。

在一些实施方案中，半乳凝素-3抑制剂通过静脉输注被施用。

可以预期，在没有明确禁止的情况下，本文描述的所有实施方案，包括那些在本发明的不同方面中描述的，可以与另一个实施方案相组合。

附图描述

图1描绘已知的哺乳动物半乳凝素家族。

图2示意性地描绘了不与半乳凝素-3结合的和与半乳凝素-3结合的GCS-100的结构。

图3显示了在癌症患者中给予单次1.5mg/m²剂量后GCS-100相对于基线半乳凝素-3的浓度。

图4显示了在癌症患者中给予单次30mg/m²剂量后GCS-100相对于基线半乳凝素-3的浓度。

图5显示了eGFR随时间的变化。

发明详述

本文提供使用半乳凝素-3抑制剂，特别是改性果胶，例如GCS-100，治疗肾病，例如慢性肾病或NASH，的方法。本发明进一步提供用半乳凝素-3抑制剂或改性果胶与一种或更多种对于治疗癌症、心血管疾病、感染、炎症、纤维化和肾损伤有用的附加治疗剂共同治疗肾病的组合疗法。同时描述了用于评估和/或监测半乳凝素-3抑制剂的效果，例如以便于在治疗期间调整抑制剂的给药方案的方法。与治疗肾病的方法相关的组合物和制品，包括药盒，也被预期是本发明的一部分。

本文中将对本发明的各个方面进行更详细的描述。

I.定义

除非本文另有定义，本申请中使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文描述的与化学、分子生物学、细胞和癌症生物学、免疫学、微生物学、药理学、和蛋白质和核酸化学相关的术语和技术，是本领域中众所周知的并且是常用的那些。

在整个说明书中，用词“包括”或者其变形形式例如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”可被理解为意味着包括描述的整体(或组分)或整体(或组分)的组，但不排除任何其它整体(或组分)或整体(或组分)的组。单数形式“一(a)”、“一(an)”和“一(the)”包括复数形式，除非上下文明确指出是其它含义。术语“包括(including)”用于表示“包括但不限于(including but not limited to)”。“包括”和“包括但不限于”可以互换使用。

“约(about)”和“大约(approximately)”通常指根据测量的性质或精度而定的测量数量的可接受程度的误差。通常，例示的误差程度在给定数值或数值范围的20％以内，优选在10％以内，并且更优选在5％以内。可替换地，并且尤其是在生物系统中，术语“约(about)”和“大约(approximately)”可表示与给定数值在一个数量级以内的数值，优选在5倍以内，并且更优选在2倍以内。除非另外声明，本文中给出数值的量是近似值，它表示在没有明确说明的情况下，可以推定使用术语“约(about)”和“大约(approximately)”。

“基线”是在首次施用研究药物之前进行的最后一次评估。

“相对于基线的变化”是基线后值和基线值之间的算术差：相对于基线的变化＝(基线后值-基线值)，相对于基线的变化百分比＝[(基线后值-基线值)/基线值]×100。

“体表面积”或BSA由以下公式定义：

本文使用的“临床反应”是指药剂治疗有效性的指示。例如，可以在给慢性肾病(CKD)患者施用改性果胶，例如GCS-100，8周之后，由相对于对照而言的估算的肾小球滤过率(eGFR)相对于基线的变化来确定临床反应，基线eGFR是约15-44mL/min/1.73m²。临床反应可以是相对于对照而言，在CKD患者中施用8周的改性果胶的安全性和耐受性。在特定的实施方案中，临床反应是改性果胶相对于对照在以下方面的效果的测量结果：1)循环半乳凝素-3水平；2)血清标志物；和/或3)炎症、纤维化和肾损伤的标志物。

短语“第一种药剂与第二种药剂组合”中的术语“组合”包括第一种药剂和第二种药剂的共同施用，例如它们可以在同一种药学可接受的载体中溶解或混杂，或者先施用第一种药剂，然后施用第二种药剂，或者先施用第二种药剂，然后施用第一种药剂。因此，本发明包括组合治疗用药的方法和组合药物组合物的方法。

短语“联合治疗用药”中的术语“联合”包括在存在第二种药剂的情况下施用药剂。联合治疗用药方法包括这样的方法，其中第一种、第二种、第三种或附加的药剂被共同施用。联合治疗用药方法还包括这样的方法，其中在存在第二种或附加药剂的情况下施用第一种或附加药剂，其中所述第二种或附加药剂，例如，可以是之前已被施用的。联合治疗用药方法可以由不同的操作者逐步进行。例如，一个操作者可以给受试者施用第一种药剂，第二个操作者可以给所述受试者施用第二种药剂，施用步骤可以同时进行，或者几乎同时进行，或者相隔较长地进行，只要第一种药剂(和附加药剂)是在存在第二种药剂(和附加药剂)的情况下被施用。操作者和受试者可以是同一个实体(例如人)。

本文使用的术语“联合疗法”和“组合疗法”是指两种或更多种治疗物质，例如半乳凝素-3抑制剂或改性果胶，和另一种用于治疗炎症、纤维化、肾损伤或癌症的药物，的施用。可以在施用半乳凝素-3抑制剂或改性果胶时联合施用、在其之前施用或在其之后施用其它药物。

本文使用的术语“剂量”指给受试者施用的治疗剂，例如半乳凝素-3抑制剂或改性果胶(例如GCS-100)的量。

本文使用的术语“给药”指施用治疗剂，例如半乳凝素-3抑制剂或改性果胶(例如GCS-100)，以达到治疗目的(例如肾病的治疗)。给药的水平可以基于半乳凝素-3的基线水平。确定合适剂量的一种方法是测量基线半乳凝素，以确定靶剂量，然后在施用之后另外进行测量，以确定该剂量对于半乳凝素-3的效果。

“给药方案”描述施用治疗剂，例如半乳凝素-3抑制剂或改性果胶(例如GCS-100)，的时间安排，例如在较长时间段中或者治疗的整个过程中的治疗时间安排，例如，在第0周施用第一剂量的半乳凝素-3抑制剂或改性果胶(例如GCS-100)，然后以每周一次或每两周一次的给药方案施用第二剂量的半乳凝素-3抑制剂或改性果胶(例如GCS-100)。

“肾小球滤过率”或GFR，是用于检查肾功能情况的测试。具体来说，它估算每分钟有多少血液通过肾小球。肾小球是肾中的微型过滤器，它过滤出血液中的废物。可以每2周、4周、6周、8周、10周、12周、16周、20周、24周、26周、28周、32周、34周、36周、42周、44周、48周、50周、52周、56周、57周等对GFR进行测量。优选地，在第0周、50周和57周测量GFR。

术语“固定剂量”或“全身剂量”指给所治疗的受试者的每一次施用时递送的治疗剂的固定量。在特定的实施方案中，半乳凝素-3抑制剂或改性果胶(例如GCS-100)以0.1mg/m²-30mg/m²范围的固定剂量被施用给受试者。在特定的实施方案中，改性果胶或半乳凝素-3抑制剂以0.1mg/m²、0.5mg/m²、1mg/m²、3mg/m²、6mg/m²、9mg/m²、12mg/m²、15mg/m²、18mg/m²、21mg/m²、24mg/m²、27mg/m²、30mg/m²、35mg/m²、40mg/m²、50mg/m²、60mg/m²、70mg/m²、80mg/m²、90mg/m²、100mg/m²、110mg/m²、120mg/m²、130mg/m²、140mg/m²、150mg/m²、160mg/m²、170mg/m²、180mg/m²、190mg/m²、200mg/m²等的固定剂量被施用给受试者。任何上述记载的值之间的值的范围也被意图包括在本发明的范围内，例如，0.2mg/m²、0.6mg/m²、1.9mg/m²、4mg/m²、8mg/m²、10mg/m²、13mg/m²、17mg/m²、20mg/m²、23mg/m²、25mg/m²、26mg/m²、28mg/m²、32mg/m²、45mg/m²、55mg/m²、65mg/m²、75mg/m²、85mg/m²、95mg/m²、105mg/m²、115mg/m²、125mg/m²、135mg/m²、145mg/m²、155mg/m²、165mg/m²、175mg/m²、185mg/m²、195mg/m²、205mg/m²，基于上述剂量的范围也包括在本发明的范围内，例如0.1-5mg/m²、5-10mg/m²、10-15mg/m²、15-20mg/m²、20-25mg/m²、25-30mg/m²、30-80mg/m²、80-120mg/m²、120-150mg/m²、150-175mg/m²、175-200mg/m²。全身剂量应当不超过每周1g/m²或者每天200mg/m²乘以5。

术语“诱导剂量”或“负荷剂量”在本文中可以互换使用，指改性果胶或半乳凝素-3抑制剂(例如GCS-100)的第一剂量，它是治疗肾病最初使用的。可以例如在诱导阶段期间施用负荷剂量。与后续的维持或治疗剂量相比，负荷剂量可以更大。诱导剂量可以是单次剂量或者，可替换地，一组剂量。例如，1.5mg/m²的剂量可以以单次的1.5mg/m²剂量的方式施用，或者以两次剂量、每次0.75mg/m²的方式施用，或者以四次剂量，每次0.375mg/m²的方式施用。在特定的实施方案中，诱导剂量之后是施用较小剂量的改性果胶或半乳凝素-3抑制剂(例如GCS-100)，例如治疗或维持剂量。在治疗的诱导或负荷阶段期间施用诱导剂量。诱导阶段之后可以是维持阶段。

那些“需要治疗的”包括已患有肾病的哺乳动物，例如人，还包括那些需要预防疾病或病症的，例如被鉴别为具有发展为所述疾病或病症的风险的那些。

本文所使用的术语“肾病”指肾的任何肾病变、疾病、失调、疾患、感染、炎症、退化、纤维化、损伤或疤痕。肾病可以包括，但不限于，下述的NASH(非酒精性脂肪性肝炎)、肾衰竭、CKD(慢性肾病)、肝肾综合症、酸中毒、ARF(急性肾衰竭)、无生育力、Alport综合症、淀粉样变性、止痛药性肾病变、抗-GBM病(Goodpasture病)、抗-磷脂综合症、动脉粥样硬化栓塞(胆固醇栓塞)、巴特综合症(Bartter syndrome)、良性家族性血尿、伯杰氏病(Berger'sdisease)、动静脉内瘘、钙化防御、慢性肾盂肾炎(反流性肾病)、CRF(慢性肾衰竭)、慢性肾功能不全、保守治疗、新月体肾炎(RPGN(急进性肾小球肾炎))、膀胱炎、肾囊肿、致密物沉积病或MCGN(小叶性肾炎)、尿崩症、糖尿病性肾病、排尿困难、浮肿、ESRD或ESRF(终末期肾病(End Stage Renal Disease)或终末期肾衰竭(End Stage Renal Failure))、Fabry病、范可尼综合症(Fanconi syndrome)、纤维颤动性肾炎、FSGS(局灶节段性肾小球硬化)、Gitelman综合症、肾小球肾炎、血尿、HUS(溶血性尿毒综合症)、肾积水、过敏性紫癜、肝肾综合症、肾上腺样瘤、发育不全、IgA肾病(伯杰氏病(Berger's disease))、间质性肾炎、腰痛血尿综合症、恶性高血压、髓质海绵肾、膜性肾病、膜增生性肾小球肾炎、MCGN(小叶性肾炎)、MPA(显微镜下多血管炎)、肾病变、肾病综合症、胡桃夹综合症、少尿、骨营养不良、Page肾、多动脉炎、多囊肾病(PKD)、感染后肾小球肾炎、梅干腹综合症(Prune bellysyndrome)、肾盂肾炎、反流性肾病、肾小管性酸中毒、腹膜后纤维化、肉样瘤、过敏性紫癜、硬皮病肾危象、干燥综合症(Sjogren's syndrome)、系统性硬化、系统性血管炎、薄GBM病、TTP(血栓性血小板减少性紫癜)、结节性硬化症、尿道炎、血管炎和韦格纳氏肉芽肿。

术语“凝集素”指在身体中发现的一种蛋白质，它与位于细胞中的、细胞表面上的和细胞之间的糖类特异性相互作用。这种相互作用引起细胞行为改变，包括细胞移动、增殖和其它细胞功能。凝集素和它们的靶糖之间的相互作用通过凝集素中的糖识别域(CRD)发生。半乳凝素是凝集素的一个亚家族。

术语“半乳凝素”是凝集素的一个亚家族，它具有与β-半乳糖苷糖分子特异性结合的CRD。半乳凝素具有广泛的功能，包括细胞存活和粘附的调控、细胞间相互作用的促进、血管的生长、和免疫系统和炎性反应的调节(Leffler等,2004)。目前已知15种哺乳动物半乳凝素，它们可以被分为三个亚类：具有一个CRD的那些(半乳凝素1、2、5、7、10、13、14和15)，具有两个CRD的那些(半乳凝素4、6、8、9和12)，和具有一个CRD以及包括氨基酸尾部的第二域的那些(半乳凝素3)，如图1所示。在低浓度时，半乳凝素以单体形式存在。但是，在较高浓度时，它们以二聚体和寡聚体形式存在(图1)，并且，由此与细胞内以及细胞间和它的环境中存在的含β-半乳糖苷的受体一起形成晶格状的网络(图1)。正因为如此，在低浓度时，半乳凝素可能具有不同的生物学功能，这种生物学功能在半乳凝素上调和过表达时会发生变化(Rabinovich等,2007)。

术语“维持治疗”或“维持给药方案”指对于被诊断为肾病的受试者或患者的治疗时间安排，以使他们将其健康维持在给定状态，例如减少肾损伤或获得临床反应。例如，本发明的维持治疗可以使患者将他们的健康维持在完全没有或基本没有症状的状态。可替换地，本发明的维持治疗可以使患者将他的健康维持在这样的状态：与接受治疗之前的患者的状况相比，与该疾病相关的症状显著地减少。

本文使用的术语“维持阶段”或“治疗阶段”指治疗的时间段，所述治疗包括给受试者施用改性果胶或半乳凝素-3抑制剂(例如GCS-100)，以维持所希望的治疗效果，例如与肾病相关的症状的改善。维持阶段之前可以是诱导阶段，所述诱导阶段的剂量典型地大于维持剂量，例如，其目的是快速将患者的治疗剂，例如改性果胶，的血浆水平由基线水平(例如0)提高至治疗有效窗口，然后通过在维持阶段的施用进行维持。

术语“维持剂量”或“治疗剂量”是受试者为维持或继续所希望的治疗效果而采用的改性果胶或半乳凝素-3抑制剂(例如GCS-100)的量。维持剂量可以是单次剂量或者，可替换地，一组剂量。可以在治疗的治疗阶段或维持阶段期间施用维持剂量。典型地，维持剂量小于诱导剂量，并且在连续给药时，维持剂量可以彼此相等。

短语“多可变剂量”包括被施用给受试者用于治疗用药的改性果胶或半乳凝素-3抑制剂(例如GCS-100)的不同剂量。“多可变剂量方案”或“多可变剂量疗法”描述了这样的治疗时间安排：它基于在整个治疗过程中，在不同的时间点施用不同量的改性果胶或半乳凝素-3抑制剂(例如GCS-100)。

术语“药学有效量”或“治疗有效量”指在患者中有效治疗肾病的组合物或治疗剂，例如半乳凝素-3抑制剂，的量，所述治疗例如提高肾功能，和/或使患有肾病的患者的总体健康产生有益的和/或所期望的改变。“药学有效量”或“治疗有效量”还指改善患者临床症状的量。

本文所使用的术语“药学可接受的赋形剂”表示药学可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、载体、湿润剂、崩解剂、溶剂或封装材料，它们是本领域技术人员认为适用于制备适合给受试者施用的药物制剂的。从与制剂的其它成分相容的意义上来说，每一种赋形剂必须是“可接受的”，并且是如上所定义的“药学可接受的”。可用作药学可接受的赋形剂的材料的实施例包括但不限于：糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸酯；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；二氧化硅；蜡；油，例如玉米油和芝麻油；二醇，例如丙二醇和甘油；多元醇，例如山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；和其它药物制剂中常规使用的无毒相容物质。

术语“预防”是本领域普遍接受的，当与病况例如肾病关联使用时，是本领域众所周知的，包括施用组合物，与未接受所述组合物的受试者相比，所述组合物在受试者中减少病况的频率或者延缓病况的症状的发生。预防肾毒性包括，例如，从肾除去毒性物质，以防止那些物质对于肾及其功能的有害作用。

术语“预防性”或“治疗性”治疗是本领域普遍接受的，指给宿主施用药物。如果在不希望的病况(例如疾病或宿主动物的其它不希望的状态)出现临床表现之前施用，那么该治疗是预防性的，即它保护宿主不发展为不希望的病况，但是，如果是在不希望的病况有表现之后施用，该治疗是治疗性的(即它的目的是消除、减轻或保持现有的不希望的病况或其所带来的不良反应)。预防性的和治疗性的治疗可以与已知的减轻肾功能障碍的方法结合使用，所述已知的减轻肾功能障碍的方法例如，但不限于，血管成形术、血液透析、血液过滤、碎石术、透析和姑息治疗。

本文使用的术语“受试者”和“患者”可以互换使用。在特定的实施方案中，受试者指可以用改性果胶或半乳凝素-3抑制剂(例如GCS-100)进行治疗性治疗的个体。

“基本上不含”具有低于特定数值的特定分子量的改性果胶，表示组合物具有少于1％的，优选少于0.5％的或者甚至少于0.1％的分子量低于该数值的改性果胶。

化合物，例如本发明的改性果胶的“治疗有效量”，当用于主题治疗方法时，指制剂中化合物的量，当它作为所希望的给药方案的一部分被施用给受试者时，达到了治疗目的(例如肾病的治疗)。治疗有效量可以通过如下方式确定：测量基线半乳凝素-3水平以确定靶剂量，然后在施用之后另外进行测量，以确定该剂量对于半乳凝素-3的效果。在这样的实施方案中，如果患者的半乳凝素-3的水平或活性被降低、抑制或减少，那么该剂量是治疗有效量。

本发明全文中使用的术语“治疗”意为包括治疗性治疗，以及预防性或抑制性措施。

III.半乳凝素-3抑制剂

在本发明的特定实施方案中，半乳凝素-3抑制剂是与半乳凝素-3结合并抑制它的试剂，例如通过降低它的抗-凋亡活性抑制它。这样的试剂可以例如通过阻止半乳凝素-3的细胞内信号转导途径和/或转运来发挥作用。仅仅是为了举例说明，该试剂可以是抑制半乳凝素-3的多聚化和/或半乳凝素-3与抗-凋亡Bcl-2蛋白，例如Bcl-2或bcl-xL的相互作用的试剂。它还可以是抑制半乳凝素-3的磷酸化的试剂，例如抑制半乳凝素-3在Ser-6上的磷酸化。在总机理水平上，抑制剂可以是抑制半乳凝素-3在细胞核和细胞质之间转运的试剂或抑制半乳凝素-3向核周膜转运的试剂和抑制线粒体释放细胞色素C的试剂。抑制剂还可以是诱导成纤维细胞增殖的试剂，例如通过结合并抑制半乳凝素-3来诱导成纤维细胞增殖。

本发明设想的一类半乳凝素-3抑制剂是聚合物，特别是含有糖类的聚合物，它们与半乳凝素-3结合并抑制它的抗-凋亡活性。本发明中有用的材料通常可以包括天然的或合成的聚合物和寡聚物。优选地，这样的聚合物的毒性非常低。

用于实施本发明的优选的一类聚合物是衍生自糖类的聚合物，其含有活性半乳凝素结合糖位点，但是它与简单的糖相比具有较高的分子量，这使得它们能够持续阻断、激活、抑制半乳凝素蛋白，或者与半乳凝素蛋白发生其它相互作用。优选的一类治疗材料包括天然来源或合成来源的寡聚物或聚合物，它们富含半乳糖或阿拉伯糖，例如果胶。这样的材料优选可以具有达500000道尔顿范围的分子量，以及更优选达100000道尔顿范围的分子量。一种具体的材料包括可以被鼠李糖分隔的基本上脱甲氧基聚半乳糖醛酸主链，所述鼠李糖具有依附于其上的半乳糖封端侧链。另一种具体的材料包括同聚半乳糖醛酸主链，其具有或不具有依附于其上的侧链。

果胶是一种复合糖，具有高度分支的结构，包括聚半乳糖醛酸主链，所述聚半乳糖醛酸主链具有依附于其上的许多分支侧链。分支产生特征为“平滑”和“多毛”的区域。已发现果胶可以通过各种化学、酶学或物理处理被改性，以便将分子断裂成更小的部分，这些更小的部分具有更加线性化的、基本上去甲氧基化的聚半乳糖醛酸主链，该主链带有鼠李糖残基的悬垂侧链，所述鼠李糖残基具有减少的分支。所得到的部分解聚的果胶在本领域中被称为改性果胶。

在特定的实施方案中，本发明提供改性果胶，其包括具有中性糖侧链的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖和/或同聚半乳糖醛酸主链，并具有依附于主链的较低程度的中性糖分支。在特定的实施方案中，改性果胶是去酯化的，并且是部分解聚的，以具有被中断的(disrupted)鼠李糖半乳糖醛酸聚糖主链。

在特定的实施方案中，改性果胶包括半乳糖醛酸和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I的共聚物，其中仍然连接有至少一些含有半乳糖和阿拉伯糖的侧链。在优选的实施方案中，改性果胶具有50-200kD，优选70-200kD，更优选70-150kD的平均分子量，用凝胶渗透色谱法(GPC)并使用多角度激光散射(MALLS)检测进行测量。

在特定的实施方案中，改性果胶包括同聚半乳糖醛酸主链，其中具有少量的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖，其中主链具有中性糖侧链，并具有依附于主链的较低程度的分支。在特定的实施方案中，同聚半乳糖醛酸主链的半乳糖醛酸亚基已被部分去酯化。

在特定的实施方案中，本发明可以用下述式I和II的任一个或二者来描述，应当理解，可以根据美国专利No.8128966描述的原理制备和使用这些通式的变体。

同聚半乳糖醛酸

-[α-GalpA-(1→4)-α-GalpA]_n- (I)

鼠李糖半乳糖醛酸聚糖

在上述的化学式中，m≥0，n、o和p≥1，X是α-Rhap；并且Y_m代表糖的直链或支链(链Y_m中的每一个Y可以独立地代表链中的不同的糖)。糖Y可以是，但不限于下述任何一种：α-Galp、β-Galp、β-Apif、β-Rhap、α-Rhap、α-Fucp、β-GlcpA、α-GalpA、β-GalpA、β-DhapA、Kdop、β-Acef、α-Araf、β-Araf和α-Xylp。

这种类型的一个示例性的聚合物是改性果胶，优选水溶性的pH-改性柑橘果胶。这种类型的适合的聚合物在例如美国专利5834442、5895784、6274566、6500807、7491708和8128966，美国专利公开号2002/0107222和PCT公开号WO 96/01640和WO 03/000118中公开。

可以理解，天然果胶不具有完全规律的重复结构，并且有可能通过果胶的部分水解引入额外的随机变化，因此在上述式II表示的p重复单元的一个重复和下一个重复之间，Ym的类型和“n”和“o”的值可以不同。

本文使用的缩写的糖单体的名称定义如下：GalA：半乳糖醛酸；Rha：鼠李糖；Gal：半乳糖；Api：红-芹菜糖；Fuc：海藻糖；GlcA：葡萄糖醛酸；DhaA：3-脱氧-D-来苏-庚酮糖酸；Kdo：3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；Ace：槭汁酸(3–C–羧基–5–脱氧–L–来苏糖)；Ara：阿拉伯糖。斜体的p表示吡喃糖形式，斜体的f表示呋喃糖环。

美国专利No.5895784、8128966、8658224、8409635、8420133和8187642，通过引用将它们公开的内容合并入本文，描述了改性果胶材料，它们的制备技术以及该材料作为各种癌症的治疗剂的用途，并且这些材料也可以用在本文所述的组合物和方法中。如‘784专利中所述的，通过基于pH的改性方法制备改性果胶，其中果胶被放入溶液中并暴露于一系列的程序化的pH变化，这导致分子的断裂，从而产生治疗上有效的改性果胶。优选的起始材料是柑橘果胶，虽然应当理解改性果胶也可以由获自其它来源的果胶，例如苹果果胶，来制备。另外，可以通过对果胶进行酶处理，或者通过物理过程例如加热，来实现改性。改性果胶和它们的制备和使用技术进一步在美国专利5834442和7491708中公开，通过引用将其公开的内容合并入本文。这种类型的改性果胶通常具有小于100kDa范围内的分子量。一组这样的材料具有小于3kDa的平均分子量。另一组具有1-15kDa范围内的平均分子量，特定的一组材料具有约10kDa的分子量。在特定的实施方案中，改性果胶具有果胶酸聚合物的结构，其中仍然存在某些果胶侧链。在优选的实施方案中，改性果胶是同聚半乳糖醛酸和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I的共聚物，其中仍然连接有含有一些半乳糖和阿拉伯糖的侧链。改性果胶可以具有1-500千道尔顿(kD)的平均分子量，优选10-250kD，更优选50-200kD或80-150kD，最优选80-100kD，通过凝胶渗透色谱法(GPC)和多角度激光散射(MALLS)检测进行测定。在特定的实施方案中，改性果胶是改性苹果果胶，其具有20-70kD范围内的平均分子量。在特定的实施方案中，改性果胶可以具有1-15kD范围内的平均分子量，而在其它实施方案中，改性果胶具有15-60kD范围内的平均分子量。参见Gunning等,The FASEB Journal,(2009)卷23,416页，通过引用将其中有关与半乳凝素-3结合的半乳聚糖的讨论整体合并入本文。这样的半乳聚糖也可以用于本文描述的组合物和方法中。

在特定的实施方案中，改性果胶基本不含分子量在25kDa以下的改性果胶。改性果胶可以通过使改性的或未改性果胶穿过切向流过滤器来制备。

酯化的程度是改性果胶的另一个特征。在特定的实施方案中，酯化的程度可以在0-80％之间，在10-60％之间，在0-50％之间，或在20-60％之间，例如20-45％或30-40％酯化。

糖含量是改性果胶的另一个特征。在特定的实施方案中，改性果胶完全由单一类型的糖亚基构成。在其它实施方案中，改性果胶包括至少两种，优选至少三种，最优选至少四种类型的糖亚基。例如，改性果胶可以完全由半乳糖醛酸亚基构成。可替换地，改性果胶可以包括半乳糖醛酸和鼠李糖亚基的组合。在另一个实施例中，改性果胶可以包括半乳糖醛酸、鼠李糖和半乳糖亚基的组合。在另一个实施例中，改性果胶可以包括半乳糖醛酸、鼠李糖和阿拉伯糖亚基的组合。在另一个实施例中，改性果胶可以包括半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖亚基的组合。在一些实施方案中，改性果胶的半乳糖醛酸含量大于50％，优选大于60％，最优选大于80％。在一些实施方案中，鼠李糖含量小于25％，优选小于15％，最优选小于10％；半乳糖含量小于50％，优选小于40％，最优选小于30％；阿拉伯糖含量小于15％，优选小于10％，最优选小于5％。在特定的实施方案中，改性果胶除了含有上述提及的糖单元之外，还可以含有其它糖醛酸、木糖、核糖、来苏糖、葡萄糖、阿洛糖、阿卓糖、艾杜糖、塔罗糖、gluose、甘露糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖或塔格糖(talalose)。

适用于主题方法中的改性果胶还可以具有各种键连接的任何一种或它们的组合。键连接是指果胶中的单个糖与另一个糖连接的位点。在一些实施方案中，改性果胶仅包括单一类型的键连接。在特定的优选的实施方案中，改性果胶包括至少两种类型的键连接，最优选包括至少3种类型的键连接。例如，改性果胶可以仅包括α-1,4键连接的半乳糖醛酸亚基。可替换地，改性果胶可以包括α-1,4-键连接的半乳糖醛酸亚基和α-1,2-鼠李糖亚基。在另一个实施例中，改性果胶可以由α-1,4-键连接的半乳糖醛酸亚基和通过第4位与阿拉伯糖亚基连接的α-1,2-鼠李糖亚基构成。在另一个实施例中，改性果胶可以包括α-1,4-键连接的半乳糖醛酸亚基和通过第4位与阿拉伯糖亚基连接并具有另外的3-连接的阿拉伯糖亚基的α-1,2-鼠李糖亚基。在另一个实施例中，改性果胶可以包括α-1,4-键连接的半乳糖醛酸亚基和通过第4位与阿拉伯糖亚基连接并具有另外的5-连接的阿拉伯糖亚基的α-1,2-鼠李糖亚基。在另一个实施例中，改性果胶可以包括α-1,4-键连接的半乳糖醛酸亚基和通过第4位与阿拉伯糖亚基连接并具有另外的3-连接和5-连接的阿拉伯糖亚基的α-1,2-鼠李糖亚基。在另一个实施例中，改性果胶可以包括α-1,4-键连接的半乳糖醛酸亚基和通过第4位与阿拉伯糖亚基连接并具有另外的3-连接和5-连接的阿拉伯糖亚基的α-1,2-鼠李糖亚基，所述3-连接和5-连接的阿拉伯糖亚基具有3,5-连接的阿拉伯糖分支点。在另一个实施例中，改性果胶可以包括α-1,4-键连接的半乳糖醛酸亚基和通过第4位与半乳糖亚基连接的α-1,2-鼠李糖亚基。在另一个实施例中，改性果胶可以包括α-1,4-键连接的半乳糖醛酸亚基和通过第4位与半乳糖亚基连接并具有额外的3-连接的半乳糖亚基的α-1,2-鼠李糖亚基。在另一个实施例中，改性果胶可以包括α-1,4-键连接的半乳糖醛酸亚基和通过第4位与半乳糖亚基连接并具有额外的4-连接的半乳糖亚基的α-1,2-鼠李糖亚基。在另一个实施例中，改性果胶可以包括α-1,4-键连接的半乳糖醛酸亚基和通过第4位与半乳糖亚基连接并具有额外的3-连接的半乳糖亚基的α-1,2-鼠李糖亚基，所述3-连接的半乳糖亚基具有3,6-连接的分支点。在另一个实施例中，改性果胶可以包括α-1,4-键连接的半乳糖醛酸亚基和通过第4位与半乳糖亚基连接并具有额外的4-连接的半乳糖亚基的α-1,2-鼠李糖亚基，所述4-连接的半乳糖亚基具有4,6-连接的分支点。在特定的实施方案中，改性果胶的侧链除包括上述的糖单元之外，还可以包括糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、鼠李糖、木糖、核糖、来苏糖、葡萄糖、阿洛糖、阿卓糖、艾杜糖、塔罗糖、gluose、甘露糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖或塔格糖。

适用于本文所述的组合物和方法的改性果胶可以具有上述特征的一个或更多个。

其它能结合并抑制半乳凝素-3的包括半乳糖残基的糖类材料也可用于本文公开的组合物和方法中。例如，甘露聚糖、葡聚糖、聚半乳糖醛酸盐、聚葡糖胺和其它水溶性多糖(参见，例如，美国专利公开号2005/0043272，Platt等，通过引用将其中公开的组合物合并入本文)可用作半乳凝素-3抑制剂。所包含的靶特异性糖，例如半乳糖、鼠李糖、甘露糖或阿拉伯糖可以是不同的，以靶向肿瘤细胞上的特异性凝集素类型受体，例如，以便于调节半乳凝素-3相对于半乳凝素-9的相对抑制。本领域技术人员将会认识到，聚合物上可以具有异种糖残基群体，正像一些天然存在的聚合物，例如改性果胶和一些半乳糖体那样。具体的多糖包括半乳甘露聚糖(例如来自于瓜儿豆(Cyamopsis tetragonolobus))、阿拉伯半乳聚糖(例如来自于北美落叶松(Larix occidentalis))、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(例如来自于马铃薯)、角叉菜胶(例如来自于麒麟菜海藻(Eucheuma seaweed))和槐豆胶(例如来自于长角豆(Ceratonia siliqua))。

烷基修饰的多糖可以来自于天然来源和/或从天然存在的糖聚合物合成制备。烷基化多糖的微生物来源对于本领域技术人员来说是众所周知的，参见，例如，美国专利No.5997881，通过引用将其全文的教导合并入本文。一些微生物来源已被用在石油泄漏补救行动中(参见Gutnick和Bach"Engineering bacterial biopolymers for thebiosorption of heavy metals；Applied Microbiology and Biotechnology,54(4)451-460,(2000)；还参见美国专利No.4395354,Gutnick等，1983，通过引用将其全文教导合并入本文)。这些在石油泄漏补救行动中涉及到的微生物被称为“Emulsans”，其中它们的多糖中的一些是O-酰化的。类似的烷基化糖也被从酵母发酵中分离出来，并被称为槐糖脂。

适合的多糖的另一个实施例是基本由2-氨基-2,6-双脱氧己醛糖、葡糖胺和一种或更多种非胺化糖组成的多糖链，其中胺化糖的氨基基本上全部是乙酰化形式。多糖链通过酯键与烷基部分相连，所述烷基部分由50-95％包括十二酸和3-羟基-十二酸的约10到约18个碳原子的饱和的和/或不饱和的链组成。在一个特定的方面，十二酸以大于3-羟基-十二酸的量存在。

可选地，烷基化多糖可以包括阴离子基团，例如磷酸基、硫酸基、硝酸基、羧基和/或硫酸基基团，同时保持疏水部分。

例如，合成多糖可以被约8至约40个碳原子的直链或支链烷基酯化。这些烷基基团可以是脂肪族的或不饱和的，并可选可以含有一个或更多个芳香基团。在特定的实施方案中，烷基化多糖的表面可以用糖配体，例如半乳糖、鼠李糖、甘露糖或阿拉伯糖，进一步衍化，以进一步增加凝集素的识别位点。本发明的多糖可以用烷基、芳基或其它化学部分衍化。

在特定的实施方案中，多糖可以是半乳甘露聚糖，如美国专利公开号2003/0064957、2005/0053664、2011/0077217和2013/0302471中所描述的，通过引用将其中公开的所有组合物合并入本文。例如，半乳甘露聚糖的分子量可以具有20-600kD范围的平均分子量，例如半乳甘露聚糖具有90-415kD或40-200kD范围的分子量，例如83kD或215kD的平均分子量。合适的半乳甘露聚糖可以分离自美国皂荚(Gleditsia triacanthos)、长角豆(Ceratonia siliqua)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、葫芦巴(Trigonellafoenum-graecum)、黄花苜蓿(Medicago falcate)、或瓜儿豆(Cyamopsis tetragonoloba)或者可以从由它们分离的半乳甘露聚糖制备。

在特定的这样的实施方案中，半乳甘露聚糖可以是β-1→4-D-半乳甘露聚糖，并包括一定的半乳糖对甘露糖的比例，其中甘露糖在1.0-3.0的范围内，半乳糖在0.5-1.5的范围内。可替换地，半乳甘露聚糖可以具有2.6甘露糖对1.5半乳糖的比例。

在特定的实施方案中，半乳甘露聚糖具有2.2甘露糖对0.9半乳糖的比例。可替换地，半乳甘露聚糖可以具有1.13甘露糖对1半乳糖的比例。可替换地，半乳甘露聚糖可以具有2.2甘露糖对1半乳糖的比例。

在特定的实施方案中，多糖可以是β-1,4-D-半乳甘露聚糖，并且包括的甘露糖对半乳糖的比例为约1.7。在特定的实施方案中，半乳甘露聚糖多糖的分子量在约4至约200kD的范围内。在特定的具体实施方案中，半乳甘露聚糖具有约40-60kD的平均分子量。在另一个方面，半乳甘露聚糖的结构是多-β-1,4甘露聚糖主链，具有通过α-1-6-糖苷键依附于其上的侧取代基。在特定的实施方案中，半乳甘露聚糖多糖可以是β-1,4-D-半乳甘露聚糖。在特定的具体实施方案中，多糖是(((1,4)-连接的β-D-吡喃甘露糖)17-((1,6)-连接的-β-D-吡喃半乳糖)10)12)。

合适的多糖可以具有靶特异性糖的侧分支，例如半乳糖、鼠李糖、甘露糖或阿拉伯糖，以赋予其靶向细胞表面上特异性凝集素类型受体的识别能力，例如，以便于调节半乳凝素-3相对于半乳凝素-9的相对抑制。分支可以是低聚糖的单个单元或两个或更多个单元。

另一种合适的多糖在美国专利公开号2005/0282773中公开，通过引用将其中公开的组合物合并入本文。这样的多糖可以具有糖醛酸糖主链或糖醛酯糖主链，并在主链上连接有中性单糖，每二十个主链单元上连接一个至每二十五个主链单元上连接一个。得到的多糖可以具有至少一个侧链，所述侧链包括与主链连接的主要是中性的糖和糖衍生物，所述侧链为约每七到二十五个中性单糖中有一个侧链。一些优选的多糖可以具有至少一个基本上没有进一步的二级糖分支的糖侧链，其末端糖包括半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖或其衍生物。其它优选的多糖可以具有至少一个用阿魏酸基团修饰的糖封端的糖的侧链。

合适的多糖可以具有约40,000-400,000道尔顿之间的平均分子量，并具有糖的多个分支，例如，包含葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖等的分支，而且这些分支可以与主链通过中性单糖例如鼠李糖相连接。这些分子可以进一步包括糖醛酸糖主链，所述糖醛酸糖主链可以有少至约10％的到多至约90％的糖醛酸残基被酯化。多个分支本身可以具有糖的多个分支，多个分支可选地包括中性糖和中性糖衍生物。

可以通过化学改性程序来制备这样的多糖，所述化学改性程序涉及利用依赖于pH的解聚作用将其改性为较小的，去分支化的多糖分子，其中使用顺序控制的pH、温度和时间，例如，pH10.0在37℃持续30分钟，然后约3.5的pH在25℃持续12小时(参见实施例1)。一种可选的替代改性程序是在存在还原剂，例如硼氢化钾，的条件下，在碱性溶液中水解多糖，形成大小相应于重复亚单元的片段(参见，例如，美国专利No.5554386)。化学改性的多糖的分子量范围在5-60kD范围内，更特别地，在约15-40kD范围内，更特别地，例如，为约20kD。

其它合适的多糖在美国专利公开号2008/0107622中公开，通过引用将其中公开的组合物合并入本文。这样的多糖的一种类型包括半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯(GR)，它是交替的1,2-连接的鼠李糖和1,4-连接的Gala残基的分支杂聚物，携带有与RGI主链的鼠李糖残基相连的主要是1,4-β-D-半乳糖和/或1,5-α-L-阿拉伯糖残基的中性侧链。GR侧链可以具有阿拉伯糖残基(阿拉伯半乳聚糖I)修饰或其它糖修饰，所述其它糖包括果糖、木糖和甘露糖。这些在商业用途中也被称为果胶材料(pectic material)。

这些多糖的制备可以包括对天然存在的聚合物进行改性，以将分子量降低到所希望的范围，调整烷基化基团(去甲氧基化或去乙酰化)，并将侧链低聚糖调整到最佳效果。例如，天然多糖可以具有在约40,000-1,000,000之间范围的分子量，并具有糖的多个分支，例如包括1-20个葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖等的单糖的分支，并且这些分支可通过中性单糖，例如鼠李糖，与主链相连接。这些分子可以进一步包括有少至约2％到多至约30％被酯化的糖醛酸糖主链。多个分支本身可以具有糖的多个分支，所述多个分支可选地包括中性糖和中性糖衍生物，从而产生主要是疏水的实体。

在特定的实施方案中，鼠李糖半乳糖醛酸具有2,0-200kD的分子量范围。在特定的实施例中，鼠李糖半乳糖醛酸可以具有约34kD或约135kD的平均大小分子量，并且是通过化学、酶学、和/或物理处理获得的。起始材料可以通过从柑橘果皮、苹果渣、大豆皮、或甜菜、或其它适合的材料的果胶物质分离和/或纯化获得，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。

在特定的实施方案中，对天然存在的聚合物进行改性，以将分子量降低到所希望的范围，减少烷基化基团(去甲氧基化或去乙酰化)，来制备可溶的在化学上被改变的半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸。在进行化学改性之前，天然多糖可以具有约40,000-1,000,000之间的分子量范围，并且具有糖的多个分支，例如包括1-20个葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖等的单糖的分支，并且这些分支可通过中性单糖，例如鼠李糖，与主链相连接。这些分子可以进一步包括单个的或成链的糖醛酸糖主链，所述糖醛酸糖主链可以有少至约2％到多至约30％被酯化。多个分支本身可以具有糖的多个分支，所述多个分支可选地包括中性糖和中性糖衍生物，从而产生主要是疏水的实体。

也可以使用较小的糖。合适的化合物包括N-乙酰氨基乳糖及其衍生物(参见，例如，Sorme等,Chembiochem.2002年3月,1；3(2-3):183-9，通过引用将其全文合并入本文，它公开了一系列3’-氨基-N-乙酰氨基乳糖衍生物)，以及它们的寡聚物和聚合物衍生物，例如聚-N-乙酰氨基乳糖。

其它类别的与半乳凝素-3结合的半乳凝素-3抑制剂包括对半乳凝素-3特异性的抗体，与半乳凝素-3结合并干扰其活性的肽和多肽，和结合并以抑制半乳凝素-3的小的(优选小于2500amu)有机分子。

为进一步进行举例说明，在本发明的特定的实施方案中，主题方法可以用与半乳凝素-3具有免疫反应性并对其抗-凋亡活性有抑制性的抗体或其片段来实施。

示例性的蛋白质治疗剂在PCT公开号WO 02/100343中被描述。该参考文献公开了特定的N-末端截短的半乳凝素-3蛋白，它抑制完整半乳凝素-3与糖配体的结合，并由此抑制可能为半乳凝素-3的抗-凋亡活性所需要的它的多聚化和交联活性。

示例性的小分子半乳凝素-3抑制剂包括硫代二半乳糖苷(例如在Leffler等,1986,J.Biol.Chem.261:10119中描述的)和PCT公开号WO 02/057284中描述的试剂，通过引用将其中公开的抑制剂合并入本文。

在与半乳凝素-3结合的半乳凝素-3抑制剂的特定的优选实施方案中，选择抑制剂以使结合半乳凝素-3的解离常数(Kd)为10^-6M或更小，更优选小于10^-7M、10^-8M或甚至10^-9M。

本发明中有用的特定的半乳凝素-3抑制剂通过与半乳凝素-3结合并破坏半乳凝素-3与一种或更多种抗-凋亡Bcl-2蛋白之间的相互作用来发挥作用。半乳凝素-3抑制剂可以直接与Bcl-2结合位点结合，由此竞争性抑制Bcl-2的结合。但是，与Bcl-2蛋白结合的半乳凝素-3抑制剂也被预期，并且包括与Bcl-2蛋白结合并竞争性地或变构性地抑制与半乳凝素-3的相互作用的半乳凝素-3抑制剂。

如上所提及的，特定的主题半乳凝素-3抑制剂通过抑制半乳凝素-3的磷酸化发挥其作用。半乳凝素-3抑制剂的结合可以阻断负责半乳凝素-3磷酸化的激酶的接近，或者可替换地，可以引起半乳凝素构象的改变，隐藏或暴露磷酸化位点。但是，本发明还预期激酶抑制剂的使用，所述激酶抑制剂直接作用在负责半乳凝素-3磷酸化的激酶上。

在其它实施方案中，半乳凝素-3活性的抑制还可以通过抑制半乳凝素-3蛋白的表达来实现。这样的抑制是使用反义或RNAi构建体实现的，所述反义或RNAi构建体具有相应于从半乳凝素-3基因转录而来的mRNA序列的一部分的序列。

在特定的实施方案中，半乳凝素-3抑制剂可以是核酸。在特定的实施方案中，本发明涉及与半乳凝素-3mRNA杂交并降低半乳凝素-3表达的反义核酸的使用。这样的反义核酸可以被递送，例如作为表达质粒被递送，当其在细胞中被转录的时候，产生与编码半乳凝素-3的细胞mRNA的至少一个独特部分互补的RNA。可替换地，该构建体是在体外产生的寡核苷酸，当它被引入到细胞中时，通过与编码半乳凝素-3的mRNA和/或基因组序列杂交导致表达的抑制。这样的寡核苷酸可选地是被修饰的寡核苷酸，能抵抗内源核酸酶，例如外切酶和/或内切酶，并且因此在体内是稳定的。示例性的用作反义寡核苷酸的核酸分子是DNA的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基膦酸酯类似物(还参见美国专利No.5176996；5264564和5256775)。此外，可用于核酸疗法的寡聚体的一般构建方法已由，例如van der Krol等,(1988)Biotechniques 6:958-976和Stein等,1988,Cancer Res.48:2659-2668进行了综述。

在其它的实施方案中，本发明涉及使用RNA干扰(RNAi)达到使半乳凝素-3基因的表达基因沉默的效果。RNAi构建体包含可以特异性阻断靶基因表达的双链RNA。“RNA干扰”或“RNAi”最初是用于植物和虫类中观察到的一种现象的术语，其中双链RNA(dsRNA)以特异性的和转录后的方式阻断基因表达。RNAi提供了一种有用的在体外或在体内抑制基因表达的方法。如本文所使用的，术语“RNAi构建体”是通用术语，包括小干扰RNA(siRNA)、发夹RNA和其它能在体内被切割以便形成siRNA的RNA种类。本文的RNAi构建体还包括能够在细胞中产生形成dsRNA或发夹RNA的转录物，和/或能在体内产生siRNA的转录物的表达载体(也被称为RNAi表达载体)。

RNAi构建体可以包括与靶核酸序列相同或基本上相同的dsRNA的长的延伸，或者仅与靶核酸序列的一个区域相同或基本上相同的dsRNA的短的延伸。

可选地，RNAi构建体含有在细胞的生理条件下与待抑制基因(即“靶”基因)的mRNA转录物的至少一部分的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。双链RNA只需要与天然RNA足够相似，以使得它有能力介导RNAi。因此，本发明具有能够容许序列变异的优点，所述序列变异是由于基因突变、品系多态性或进化趋异而可以被预期的。所容忍的靶序列和RNAi构建体序列之间的核苷酸错配的数目是在5个碱基对中不超过1个错配，或者在10个碱基对中不超过1个错配，或者在20个碱基对中不超过1个错配，或者在50个碱基对中不超过1个错配。siRNA双链中心的错配是最关键的，可能从根本上破坏对靶RNA的切割。相反，与靶RNA互补的siRNA链的3'末端的核苷酸对靶点识别的特异性并没有明显的贡献。可以通过本领域已知的序列比较和比对算法(参见Gribskov和Devereux,Sequence Analysis Primer,Stockton Press,1991，和其中引用的参考文献)，并通过例如BESTFIT软件程序(例如威斯康星大学的基因计算组(Genetic Computing Group))中使用的Smith-Waterman算法，利用默认参数计算核苷酸序列之间的差异百分比，从而对序列同一性进行优化。优选在抑制性RNA和靶基因的部分之间具有大于90％的序列同一性，或者甚至100％的序列同一性。可替换地，RNA的双链区域可以在功能上被定义为能与靶基因转录物的一部分杂交的核苷酸序列(例如，400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃杂交12-16小时；然后洗涤)。

双链结构可以由单个自身互补的RNA链形成或者由两个互补RNA链形成。RNA双链形成可以在细胞内部开始或在细胞外部开始。可以以允许向每个细胞递送至少一个复制品的量引入RNA。较高剂量(例如每个细胞至少5、10、100、500或1000复制品)的双链材料可以产生更有效的抑制，而较低剂量在特定的应用中也可能是有用的。抑制是序列特异性的，相应于RNA的双链区域的核苷酸序列被靶向，以便于进行基因抑制。

主题RNAi构建体可以是“小干扰RNA”或“siRNA”。这些核酸的长度是19-30个核苷酸左右，甚至更优选长度是21-23个核苷酸。siRNA被认为可以募集核酸酶复合物，并通过与特定序列配对来引导该复合物靶向mRNA。因此，靶mRNA被蛋白复合物中的核酸酶降解。在一些实施方案中，21-23个核苷酸的siRNA分子包括3'羟基基团。在特定的实施方案中，siRNA构建体可以通过对较长的双链RNA的加工来产生，例如在存在酶dicer的条件下加工。例如，可以使用果蝇体外系统。在该系统中，dsRNA与来自果蝇胚胎的可溶性提取物组合在一起，由此产生复合体。在dsRNA被加工成约21至约23个核苷酸的RNA分子的条件下保持该复合体。可以使用多种本领域技术人员已知的技术纯化siRNA分子。例如，可以使用凝胶电泳纯化siRNA。可替换地，可以使用非变性方法，例如非变性柱层析，纯化siRNA。此外，层析(例如尺寸排阻层析)、甘油梯度离心、用抗体进行的亲和纯化可用于纯化siRNA。

可以通过化学合成方法或通过重组核酸技术产生RNAi构建体。被处理细胞的内源RNA聚合酶可以介导体内转录，或者可以使用克隆的RNA聚合酶进行体外转录。RNAi构建体可以包括对磷酸酯-糖主链或核苷酸的修饰，例如用于降低对细胞核酸酶的敏感性、提高生物利用度、改善制剂特性和/或改变其它的药物动力学性质。例如，可以对天然RNA的磷酸二酯键进行修饰以使其包括氮或硫杂原子中的至少一个。可以对RNA结构中的修饰进行调整以允许特异性的基因抑制，同时避免对dsRNA的广泛反应。同样，可以对碱基进行修饰以阻断腺苷脱氨酶的活性。RNAi构建体可以通过酶促方式产生或者通过部分/全有机合成来产生，可以通过体外酶合成或有机合成引入任何修饰的核糖核苷酸。化学修饰RNA分子的方法可能适用于修饰RNAi构建体(参见，例如，Heidenreich等,1997,Nucleic Acids Res.,25:776-780；Wilson等,1994,J.Mol.Recog.7:89-98；Chen等,1995,Nucleic Acids Res.23:2661-2668；Hirschbein等,1997,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7:55-61)。仅仅作为举例说明，可以用硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、嵌合甲基膦酸酯-磷酸二酯、肽核酸、包含5-丙炔基-嘧啶的寡聚物或糖修饰物(例如2'-取代的核糖核苷，a-构型)修饰RNAi构建体的主链。

在一些情况下，siRNA分子的至少一条链具有长度为约1至约6个核苷酸的3′突出端，虽然其长度也可以是2至4个核苷酸。更优选地，该3′突出端长度为1-3个核苷酸。在特定的实施方案中，一条链具有3′突出端，另一条链是平末端或者也具有突出端。每条链突出端的长度可以相同或不同。为了进一步增强siRNA的稳定性，可使3′突出端稳定化来对抗降解。在一些实施方案中，通过包括嘌呤核苷酸，例如腺苷或鸟苷核苷酸，来稳定RNA。可替换地，通过修饰类似物对嘧啶核苷酸的取代，例如2′-脱氧胸苷对尿苷核苷酸3′突出端的取代是被容忍的，并且所述取代不影响RNAi的功效。缺少2′羟基显著增强组织培养物介质中突出端的核酸酶抗性，可能在体内有益。

RNAi构建体还可以是长双链RNA形式。在特定的实施方案中，RNAi构建体是至少25、50、100、200、300或400个碱基。在特定的实施方案中，RNAi构建体的长度为400-800个碱基。双链RNA在细胞内被消化，例如，以便在细胞内产生siRNA序列。但是，在体内使用长双链RNA并不总是可行的，推测是因为不依赖于序列的dsRNA反应可能会引起有害效果。在这样的实施方案中，优选使用可降低干扰素或PKR作用的局部递送系统和/或试剂。

可替换地，RNAi构建体是发夹结构(被称为发夹RNA)的形式。发夹RNA可以外源性合成或者可以在体内由RNA聚合酶III启动子转录而形成。制备和使用这样的发夹RNA在哺乳动物细胞中进行基因沉默的实施例在例如Paddison等,Genes Dev.,2002,16:948-58；McCaffrey等,Nature,2002,418:38-9；McManus等,RNA,2002,8:842-50；Yu等,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,2002,99:6047-52中描述。优选地，在细胞中或动物中构建这样的发夹RNA，以确保所希望基因的连续和稳定的抑制。本领域中已知可以通过在细胞中加工发夹RNA来产生siRNA。

在其它实施方案中，本发明涉及核酶分子的使用，所述核酶分子被设计用于催化切割半乳凝素-3mRNA转录物，以阻止mRNA的翻译(参见，例如，PCT国际公开号WO90/11364，于1990年10月4日公开；Sarver等,1990,Science 247:1222-1225和美国专利号No.5093246)。虽然可以使用在位点特异性识别序列上切割mRNA的核酶来破坏特定的mRNA，但优选使用锤头状核酶。锤头状核酶在由侧翼区域指示的位置切割mRNA，所述侧翼区域与靶mRNA形成互补碱基对。唯一的要求是靶mRNA具有以下两个碱基的序列：5'-UG-3'。锤头状核酶的构建和产生是本领域众所周知的，在Haseloff和Gerlach,1988,Nature,334:585-591中有更全面的描述。本发明的核酶还包括RNA核糖核酸内切酶(“Cech-型核酶”)，例如在嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中天然出现的那种(被称为IVS或L-19IVS RNA)和已有广泛描述的那种(参见，例如，Zaug等,1984,Science,224:574-578；Zaug和Cech,1986,Science,231:470-475；Zaug等,1986,Nature,324:429-433；University Patents Inc公开的国际专利申请No.WO88/04300；Been和Cech,1986,Cell,47:207-216)。

在进一步的实施方案中，本发明涉及使用DNA酶抑制半乳凝素-3基因的表达。DNA酶整合了反义和核酶技术的某些机制特征。设计DNA酶以使得它们识别特定的靶核酸序列，这点更像是反义寡核苷酸，但是它们能催化并特异性地切割靶核酸，这点更像是核酶。简单地说，为了设计理想的特异性识别并切割靶核酸的DNA酶，本领域技术人员必须首先鉴定独特的靶序列。优选地，独特的或基本的序列是大约18-22个核苷酸的富含G/C的序列。高G/C含量有助于确保DNA酶和靶序列之间的较强的相互作用。在合成DNA酶时，能使所述酶靶向信使的特异性反义识别序列是分开的，从而使它包括DNA酶的两个臂，并且DNA酶的环被置于这两个特异性臂之间。制备和施用DNA酶的方法可以参见，例如，美国专利No.6110462。

其它抑制剂可以包括与半乳凝素-3结合的单克隆、多克隆、人源化和/或嵌合抗体。本文使用的术语“抗体”意图是指免疫球蛋白分子，它包括四条多肽链，两条重(H)链和两条轻(L)链，它们通过二硫键相互连接。每一条重链包括重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个域，CH1、CH2和CH3。每一条轻链包括轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个域，CL。VH和VL区可以被进一步再划分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间穿插着更为保守的区域，称为框架区(FR)。每一个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。代表性的抗体在美国专利No.6090382；6258562和6509015中被进一步详细描述。

本文使用的术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或者简单的“抗原部分”)指抗体的一个或更多个片段，其保留了与抗原(例如半乳凝素-3)特异性结合的能力。已表明抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来行使。结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fabc、Fv、单链、和单链抗体。术语抗体的“抗原结合片段”中所包含的结合片段的实施例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHI域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，包括两个Fab片段的双价片段，所述两个Fab片段在铰链区通过二硫桥连接起来；(iii)由VH和CHI域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单个臂的VL和VH域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等(1989)Nature 341:544-546)，它由VH域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。

进一步，虽然Fv片段的两个域VL和VH由单独的基因编码，但可以通过使用重组方法用合成的接头将它们连接起来，所述接头可使它们被制备成单个蛋白链，其中VL和VH区域配对，以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等(1988)Science 242:423-426和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体也意图被包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。其它形式的单链抗体，例如双功能抗体，也被包括在内。双功能抗体是二价的、双特异性的抗体，其中VH和VL域在单个多肽链上表达，但是使用的接头非常短以至于同一条链上的两个域之间不能配对，由此迫使这些域与另一条链上的互补域配对并产生两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak等(1994)Structure 2:1121-1123)。本发明的抗体部分在美国专利No.6090382、6258562、6509015中进一步详细描述，通过引用将它们每一个的全文合并入本文。

而且，抗体或其抗原结合部分可以是更大的免疫粘附分子的一部分，所述免疫粘附分子通过抗体或抗体部分与一个或更多个其它蛋白或肽的共价或非共价结合形成。这样的免疫粘附分子的实施例包括使用链霉亲合素核心区制备四聚scFv分子(Kipriyanov,S.M.等(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)，并使用半胱氨酸残基，标志物肽和C末端多组氨酸标记制备二价的并且生物素化的scFv分子(Kipriyanov,S.M.等(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)。可以用常规技术从完整抗体制备抗体部分，例如Fab和(ab')2片段，所述常规技术例如分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗体。而且，可以使用如本文所述的标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。

“嵌合抗体”指这样的抗体，其中每一个重链和轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的或属于特定种类的抗体中的相应序列同源，同时该链的其余部分与来自另一个物种的相应序列同源。在特定的实施方案中，本发明的特征在于嵌合抗体或抗原结合片段，其中轻链和重链两者的可变区类似于源自于一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定部分与源自于另一个物种的抗体的序列同源。在特定的实施方案中，通过将来自小鼠抗体的CDR移植到人抗体的框架区上来制备嵌合抗体。

“人源化抗体”指包括至少一条链的抗体，所述至少一条链包括基本上来自人抗体链(称为受者免疫球蛋白或抗体)的可变区框架残基和至少一个基本上来自非人抗体(例如小鼠)的互补决定区(CDR)。除了移植CDR之外，人源化抗体典型地经受进一步的改变以提高亲和性和/或免疫原性。

术语“多价抗体”指包括超过一个抗原识别位点的抗体。例如，“二价”抗体具有两个抗原识别位点，而“四价”抗体具有四个抗原识别位点。术语“单特异性”、“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等指多价抗体中存在的不同抗原识别位点特异性的数量(相对于抗原识别位点的数量)。例如，“单特异性”抗体的抗原识别位点都结合同一个表位。“双特异性”或“双重特异性”抗体具有至少一个与第一表位结合的抗原识别位点和至少一个与第二表位结合的抗原识别位点，所述第二表位与第一表位不同。“多价单特异性”抗体具有多个抗原识别位点，它们都结合同一个表位。“多价双特异性”抗体具有多个抗原识别位点，其中一些与第一表位结合，一些与第二表位结合，所述第二表位与第一表位不同。

本文使用的术语“人抗体”意图是指包括具有来自于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机突变或位点特异性突变或者通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中。但是，本文使用的术语“人抗体”不意图包括这样的抗体：其中来自于另一个哺乳动物物种种系，例如小鼠，的CDR序列已被移植到人框架序列。

本文使用的术语“重组人抗体”意图包括所有通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体，例如使用重组表达载体转染到宿主细胞中表达的抗体(在下文中进一步描述)，从重组的、组合的人抗体文库中分离的抗体(在下文中进一步描述)，从用人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的单克隆抗体(参见，例如，Taylor等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287)或通过任何其它涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列中的方式制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而在特定的实施方案中，这样的重组人抗体经过体外突变(或者，当使用用人Ig序列转基因的动物时，经过体内体细胞突变)，因此，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列，当来自于人种系VH和VL序列或与人种系VH和VL序列相关时，可以是不自然存在于人体内抗体种系组成成分中的序列。

IV.血清标志物和生物标志物

血清标志物可以与半乳凝素-3一起进行测量，以测量半乳凝素-3抑制剂，例如改性果胶(GCS-100)，的治疗效果。可以抽取全血样品，用于确定循环半乳凝素-3、肌酐、BUN、血浆有丝分裂原和/或其它血清标志物的水平。可以根据本文描述的和本领域已知的方法进行半乳凝素-3浓度和血清标志物的测定。

在特定的实施方案中，例如与在未治疗患者或用安慰剂治疗的患者中测量的GFR相比，本发明的方法在被给予低剂量半乳凝素-3抑制剂的患者中使GFR水平提高0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、4、6、8或甚至10倍。

在特定的实施方案中，例如与在未治疗患者或用安慰剂治疗的患者中测量的BUN水平相比，本发明的方法在被给予低剂量半乳凝素-3抑制剂(例如1.5mg/m²的改性果胶，例如GCS-100)的患者中使BUN水平降低0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、4、6、8或甚至10倍。

在特定的实施方案中，例如与在未治疗患者或用安慰剂治疗的患者中测量的尿酸相比，本发明的方法在被给予低剂量半乳凝素-3抑制剂(例如1.5mg/m²的改性果胶，例如GCS-100)的患者中使尿酸水平降低0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、4、6、8或甚至10倍。

在特定的实施方案中，例如与在未治疗患者或用安慰剂治疗的患者中测量的半乳凝素-3相比，本发明的方法在被给予低剂量半乳凝素-3抑制剂(例如1.5mg/m²的改性果胶，例如GCS-100)的患者中使半乳凝素-3水平降低0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、4、6、8或甚至10倍。

在特定的实施方案中，本发明方法降低血清中的脲浓度。特别是，与在未治疗患者或用安慰剂治疗的患者中测量的脲相比，施用半乳凝素-3抑制剂后测量的血清中的脲浓度可以降低至少20％。

在特定的实施方案中，本发明方法降低绝对和或相对血清肌酐水平。特别是，与在未治疗患者或用安慰剂治疗的患者中测量的肌酐相比，施用半乳凝素-3抑制剂后测量的血清中的肌酐相对浓度可以降低至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。在其它实施方案中，肌酐的绝对浓度可以降低约0.1-1.0mg/dl，例如约0.1-0.5mg/dl或降低0.1mg/dl以上、0.2mg/dl以上或0.3mg/dl以上。

在特定的实施方案中，本发明方法改变近端肾小管损伤标志物，例如β-2微球蛋白、N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶和α₁-酸性糖蛋白，的尿排泄。特别是，与在未治疗患者或用安慰剂治疗的患者中测量的肾小管损伤标志物相比，相对于治疗之后尿中测量的肾小管损伤标志物，施用半乳凝素-3抑制剂后测量的尿中的一个或更多个的肾小管损伤标志物的浓度可以减少至少20％。其它标志物可以包括N-gal、胱抑素C和/或其它与肾活性和/或损伤相关的尿标志物。

炎症、纤维化和肾损伤的生物标志物

确定半乳凝素-3的存在或水平还可以和对一种或更多种其它生物标志物的检测组合进行，所述生物标志物的表达增加或减少与肾病相关。所选择的生物标志物可以是通常对于多种类型的肾病、炎症、纤维化和肾损伤有用的治疗、诊断或预后标志物。这些标志物可以包括，但不限于，中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)、胶原蛋白、白介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、胞内粘附分子-1(ICAM-1)、血红蛋白Alc(HbAlc)和E-选择素。

本领域技术人员能够选择一种或更多种有用的治疗、诊断或预后标志物，用于与半乳凝素-3组合测量。类似地，可以一起使用三种或更多种、四种或更多种或五种或更多种或多种生物标志物确定患者的诊断或预后。

在特定的实施方案中，与在施用安慰剂的患者中测量的相同生物标志物的水平相比，本发明方法在被给予低剂量半乳凝素-3抑制剂(例如1.5mg/m²的改性果胶，例如GCS-100)的患者中使生物标志物的水平降低或增加0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8.1.9、2、4、6、8或甚至10倍。

V.半乳凝素-3和生物标志物蛋白检测技术

蛋白质，例如半乳凝素-3蛋白和生物标志物的检测方法是本领域技术人员熟知的，包括ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫测定)、免疫印迹(Western blotting)和免疫组化。免疫测定例如ELISA或RIA通常是更优选的，它们可以非常快速。这些方法使用抗体或抗体等同物检测半乳凝素-3蛋白。也可以使用抗体阵列或蛋白质芯片，参见，例如美国专利申请No:20030013208A1；20020155493A1，20030017515和美国专利No:6329209；6365418，通过引用将其全文合并入本文。

ELISA和RIA程序可以这样进行，半乳凝素-3标准品被标记(用放射性同位素，例如¹²⁵I或³⁵S，或者可检测的酶，例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记)，并与未标记的样品一起与相应的抗体接触，使用二抗结合一抗，并测定放射性或固定化酶(竞争性测定)。可替换地，使样品中的半乳凝素-3与相应的固定化抗体反应，使放射性同位素或酶标记的抗-半乳凝素-3抗体与该系统反应，并测定放射性或酶(ELISA-夹心测定)。也可以使用其它合适的常规方法。

上述技术实质上可以以“一步法”或“两步法”测定的方式来进行。“一步法”测定涉及使抗原与固定化抗体接触，并且无需洗涤，使混合物与标记的抗体接触。“两步法”测定涉及在混合物接触标记的抗体之前洗涤。也可以使用其它合适的常规方法。

在特定的实施方案中，用于测量半乳凝素-3水平的方法包括：使生物样本与选择性结合半乳凝素-3的抗体或其变体(例如片段)接触，并检测所述抗体或其变体是否与所述样品结合，并由此测量半乳凝素-3的水平。一种方法可以进一步包括使样本与第二抗体，例如标记的抗体，接触。该方法可以进一步包括一个或更多个洗涤步骤，例如用于除去一种或更多种试剂。

可以通过任何合适的方式实现半乳凝素-3和/或抗体的酶标记或放射性标记。这样的方式通常可以包括酶与所讨论抗原或抗体的共价连接，例如通过戊二醛连接，特别是，这样不会不利地影响酶的活性，这表示酶必然仍然能够与它的底物相互作用，虽然不需要全部的酶具有活性，只要足够剩余足以允许进行测定。事实上，一些结合酶的技术是非特异性的(例如使用甲醛)，并且可以仅产生一定比例的活性酶。

将测定系统的一种组分固定在支持物上是符合期望的，由此使得系统的其它组分可以接触这种组分并易于被除去，无需辛苦和费时的劳动。第二相被固定在与第一相有一定距离的地方是可能的，但是通常单相就是足够的。

将酶本身固定在支持物上是可能的，但是如果需要固相酶，那么通常最好通过与抗体结合并将抗体固定在支持物上获得固相酶，其模型和系统是本领域众所周知的。简单的聚乙烯可以提供合适的支持物。

标记可用的酶没有特别限制，但可以选自例如氧化酶组的成员。它们与它们的底物反应催化产生过氧化氢，葡萄糖氧化酶常被使用，因为它具有良好的稳定性，易于获得并且价格便宜，而且它的底物(葡萄糖)也易于获得。可以通过测量酶标抗体与底物在本领域众所周知的控制条件下反应后形成的过氧化氢的浓度来测定氧化酶的活性。

根据本文公开的内容，根据操作者的优选，可以使用其它技术检测半乳凝素-3。一种这样的技术是免疫印迹(Towbin等,Proc.Nat.Acad.Sci.76:4350(1979))，其中经过合适处理的样品在SDS-PAGE胶上跑胶，然后被转移到固相支持物，例如硝酸纤维素膜上。然后使抗-半乳凝素-3抗体(未标记的)接触支持物，并用第二免疫试剂，例如标记的蛋白A或抗-免疫球蛋白(合适的标记包括¹²⁵I、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)，进行测定。也可以使用色谱法检测。

免疫化学可以用于检测人的半乳凝素-3的表达，例如在活组织检查样品中。将合适的抗体与，例如，薄层细胞，接触，洗涤，然后与第二标记抗体接触。可以通过荧光标志物，酶(例如过氧化物酶)，亲和素或放射性标记进行标记。该测定通过显微镜可以直观地计数。结果可以是定量的，例如，如实施例中所描述的。

免疫组化分析可以可选地与信号的定量联合进行，如下所述。可以用例如亲和素-生物素化的过氧化物酶复合物系统制备免疫组化染色玻片，直接对组织中半乳凝素-3和生物标志物的表达进行评估。

对着色点，即半乳凝素-3或生物标志物的存在的评估，还可以通过定量免疫组化研究来进行，例如用计算机图像分析仪进行(例如自动化细胞成像系统，ACIS,ChromaVision Medical System Inc.,San Juan Capistrano,CA)，它可以用于评价免疫染色组织样品中半乳凝素-3或生物标志物表达的水平。使用ACIS，可以选择“细胞质染色”作为检测半乳凝素-3或生物标志物所用的程序。可以使用ACIS系统分析免疫染色肿瘤样品的不同区域。超过或小于1的平均ACIS值，例如，约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5.、2、2.5、3、5、10、30、100或更高，表示半乳凝素-3或生物标志物表达的升高或降低。

还可以使用其它机械或自动成像系统测量半乳凝素-3的免疫染色结果。本文所使用的“定量”免疫组化指对进行免疫组化的样品进行扫描和评分的自动化方法，以对特定的生物标志物，例如抗原或其它蛋白的存在进行鉴别和定量。给样品的得分是样品的免疫组化染色密度的数值表示，其代表了样品中存在的靶生物标志物的量。如本文所使用的，光密度(OD)是代表染色密度的数值得分。如本文所使用的，半定量免疫组化指通过人眼对免疫组化结果进行评分，其中受过训练的操作者以数值方式排列结果(例如，结果是1、2或3)。

适用于免疫组化的各种自动化样品处理、扫描和分析系统是本领域中可获得的。这样的系统可以包括自动化染色(参见，例如，Benchmark^TM系统，Ventana MedicalSystems,Inc.)和显微镜扫描、计算机成像分析、连续切片比较(以控制样品方向和尺寸上的变化)、数字报告生成和样品(例如其上放置有组织切片的玻片)的归档和追踪。细胞成像系统是可商购获得的，它将传统的光学显微镜和数字图像处理系统组合在一起，以在细胞和组织，包括免疫染色样品上进行定量分析。参见，例如，CAS-200系统(Becton,Dickinson&Co.)。

可用于对半乳凝素-3或生物标志物蛋白水平进行检测和定量的另一种方法是免疫印迹，例如如实施例中所描述的。可以冷冻肿瘤组织并在裂解缓冲液中进行匀浆。可以用增强化学发光系统(例如，来自于PerkinElmer Life Sciences,Boston,MA)用半乳凝素-3抗体进行免疫检测。然后剥去膜，并用对照抗体，例如Sigma(St.Louis,MO)的抗肌动蛋白(A-2066)多克隆抗体再次杂交。用光密度测定软件(例如，NIH Image 1.61)对信号密度进行定量。在对半乳凝素-3、生物标志物和对照信号(例如肌动蛋白)定量之后，通过每条道中的肌动蛋白的量对半乳凝素-3或生物标志物的相对表达水平进行标准化，即用半乳凝素-3或生物标志物信号的值除以对照信号的值。当相对水平大于1，例如约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5.、2、2.5、3、5、10、30或者甚至100时，半乳凝素-3或生物标志物蛋白表达被认为是升高的。相反，当相对水平小于1，例如约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、2.5、3、5、10、30或者甚至100时，半乳凝素-3或生物标志物蛋白表达被认为是降低的。

抗-半乳凝素-3或生物标志物抗体还可以用于成像目的，例如，用于检测受试者细胞和组织中半乳凝素-3或生物标志物的存在。合适的标记包括放射性同位素，碘(¹²⁵I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹²In)和锝(⁹⁹mTc)，荧光标记，例如荧光素和罗丹明，和生物素。通过使用不同的酶，例如过氧化物酶、碱性磷酸酶，或不同的发色团，例如DAB、AEC或固红，可以直观观察免疫酶相互作用。

为体内成像的目的，抗体本身是无法从身体外部检测到的，因此必须被标记，或者以另外的方式被修饰，以允许检测。用于这个目的的标志物可以是任何基本上不干扰抗体结合，但允许外部检测的标志物。合适的标志物可以包括可以被X-射线、NMR或MRI检测到的那些。对于X-射线技术来说，合适的标志物包括任何发射可检测辐射但明显对患者无害的放射性同位素，例如钡或铯。用于NMR和MRI的合适的标志物，通常包括具有可检测特征螺旋的那些，例如氘，例如它可以通过对相关杂交瘤的营养盐的合适的标记被掺入到抗体中。

受试者的大小和所使用的成像系统可以决定产生诊断性图像所需的成像体的数量。在使用放射性同位素体的情况下，对于人受试者，注入的放射性的数量范围通常可以是锝-99m的约5-20毫居里。随后标记的抗体或抗体片段可能优先在含有半乳凝素-3的细胞位置聚集。然后可以用已知的技术检测标记的抗体或其变体，例如抗体片段。

可以用于检测半乳凝素-3的抗体包括任何与待检测的半乳凝素-3，例如人半乳凝素-3，足够强地且特异性结合的抗体，无论其是天然的还是合成的，是全长的还是其片段，是单克隆的还是多克隆的。抗体的Kd可以是不超过约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^{- 11}M、10^-12M。短语“特异性结合”指例如抗体与表位或抗原或抗原决定簇以这样的方式结合：其结合可以被相同或相似表位、抗原或抗原决定簇的第二种制备物代替或被其竞争。相对于其它蛋白，例如相关蛋白，例如半乳凝素1-15，抗体可以优先与半乳凝素-3结合。

可以使用的抗体及其衍生物包括多克隆或单克隆抗体、嵌合的、人的、人源化的、灵长类动物源化的(CDR移植)、镶嵌修饰的(veneered)或单链的抗体、噬菌体产生的抗体(例如来自于噬菌体展示文库)、以及抗体的功能性片段，即半乳凝素-3结合片段。例如，可以使用能与半乳凝素-3或其部分结合的抗体片段，包括但不限于Fv、Fab、Fab’和F(ab’)₂。这样的片段可以通过酶切或通过重组技术产生。例如，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶切割分别可以产生Fab或F(ab')2片段。也可以使用其它具有所需底物特异性的蛋白酶产生Fab或F(ab')₂片段。也可以使用抗体基因产生多种截短形式的抗体，其中在天然终止位点的上游引入一个或更多个终止密码子。例如，编码F(ab')₂重链部分的嵌合基因可以被设计为包括编码重链的CH、域和铰链区的DNA序列。

在一些实施方案中，使用与半乳凝素-3特异性结合的试剂或者除抗体以外的试剂，例如肽。可以通过本领域已知的任何方法鉴别与半乳凝素-3特异性结合的肽。例如，可以用肽噬菌体展示文库筛选半乳凝素-3的特异性肽结合物。

通常，可以使用能检测半乳凝素-3或生物标志物多肽的试剂，以使得半乳凝素-3或其它生物标志物的存在被检测和/或被定量。如本文所限定的，“试剂”指能够鉴别或检测生物样品中的半乳凝素-3的物质(例如鉴别或检测半乳凝素-3或生物标志物mRNA、DNA和蛋白)。在一些实施方案中，试剂是标记的或可标记的抗体，其与半乳凝素-3或生物标志物多肽特异性结合。如本文所使用的，短语“标记的或可标记的”指连接有或包括有标记(例如标志物或指示剂)或者有能力连接或包括标记(例如标志物或指示剂)。标记物或指示剂包括但不限于，例如，在底物中产生可检测的变化的放射性分子、比色分子和酶分子。

此外，可以使用质谱例如MALDI/TOF(飞行时间)、SELDI/TOF、液相色谱-质谱(LC-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)、高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)、毛细管电泳-质谱、核磁共振光谱测定、或串联质谱(例如MS/MS、MS/MS/MS、ESI-MS/MS等)检测半乳凝素-3或生物标志物蛋白。参见，例如，美国专利申请No:20030199001、20030134304、20030077616，通过引用将它们合并入本文。

质谱方法是本领域众所周知的，已被用于定量和/或鉴别生物分子，例如蛋白质(参见，例如，Li等(2000)Tibtech 18:151-160；Rowley等(2000)Methods 20:383-397和Kuster和Mann(1998)Curr.Opin.Structural Biol.8:393-400)。而且，质谱技术的发展已经允许对分离的蛋白质进行至少部分从头测序。Chait等,Science 262:89-92(1993)；Keough等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96:7131-6(1999)；在Bergman,EXS 88:133-44(2000)中进行了综述。

在特定的实施方案中，使用气相离子分光光度计。在其它实施方案中，使用激光解吸/离子化质谱分析样品。现代激光解吸/离子化质谱("LDI-MS")有两个主要的变形形式：基质辅助激光解吸/离子化("MALDI")质谱和表面增强激光解吸/离子化("SELDI")。在MALDI中，被分析物与含有基质的溶液混合，液滴被放置在基体的表面上。基质溶液然后与生物分子共结晶。基体被插入到质谱仪中。激光能量对准基体表面，在此使生物分子解吸并离子化，而不会使它们明显地片段化。但是，MALDI作为分析工具具有局限性。它不提供样品分馏手段，基质材料可能会干扰检测，特别是对于低分子量的被分析物。参见，例如，美国专利No.5118937(Hillenkamp等)和美国专利No.5045694(Beavis&Chait)。

在SELDI中，基体表面被修饰，以使得它参与解吸过程。在一种变形形式中，表面用选择性结合感兴趣蛋白的吸附剂和/或捕获试剂衍生化。在另一种变形形式中，表面用能量吸收分子衍生化，所述能量吸收分子在受到激光轰击时不解吸。在另一种变形形式中，表面用与感兴趣蛋白结合并含有光解键的分子衍生化，所述光解键在使用激光照射时断裂。在这些方法的每一种中，衍生化试剂通常位于基体表面上的特定位置，样品被施加在该位置。参见，例如，美国专利No.5719060(Hutchens&Yip)和WO 98/59361(Hutchens&Yip)。这两种方法可以组合使用，例如，使用SELDI亲和表面捕获被分析物，并向被捕获的被分析物加入含有基质的液体，以提供能量吸收材料。

有关质谱的其它信息，参见，例如，Principles of Instrumental Analysis,第三版,Skoog,Saunders College Publishing,Philadelphia,1985和Kirk-OthmerEncyclopedia of Chemical Technology,第四版第15卷(John Wiley&Sons,New York1995),1071-1094页。

对标志物或其它物质的存在的检测典型地可以涉及检测信号强度。这转而可以反映与基体结合的多肽的数量和特性。例如，在特定的实施方案中，可以比较第一样品和第二样品的光谱的峰值的信号强度(例如，目测、通过计算机分析等)，以确定特定生物分子的相对量。可以使用软件程序例如Biomarker Wizard program(Ciphergen Biosystems,Inc.,Fremont,Calif.)来帮助分析质谱。质谱仪和它们的技术对于本领域技术人员来说是众所周知的。

本领域的任何技术人员会理解，质谱仪的任何组成部分(例如解吸源、质量分析器、检测器等)和不同的样品制备可以与本文所述的或本领域已知的其它适合的组成部分或制备进行组合。例如，在一些实施方案中，可以通过重原子(例如¹³C)的存在区分对照样品、参考样品和或一种或更多种测试样品，可选地通过使用与样品阵列中待检测基体连接的同位素差异化标记进行，由此允许在同一次质谱测定中组合多个样品并区分它们。

在特定的优选的实施方案中，使用激光解吸飞行时间(TOF)质谱仪。在激光解吸质谱测定中，向进样系统引入具有连接的标志物的基体。标志物被来自离子化源的激光解吸和离子化成气相。通过离子光学组件收集产生的离子，然后在飞行时间质量分析器中，通过短的高电压场加速离子并使它们流进入高真空室。在高真空室的远端，被加速的离子在不同时间撞击敏感探测器的表面。由于飞行时间是离子质量的函数，离子形成和离子探测器撞击之间经过的时间可被用于鉴别特定质荷比的分子的存在与否。

在一些实施方案中，通过用可编程数字计算机执行算法，以在某种程度上确定第一或第二样品中存在的一种或更多种生物分子的相对量。算法鉴别第一质谱和第二质谱中的至少一个峰值。算法然后对质谱的第一质谱的峰值的信号强度和第二质谱的峰值的信号强度进行对比。相对信号强度指示第一和第二样品中存在的生物分子的量。可以将含有已知量的生物分子的标准品作为第二样品进行分析，以更好地对第一样品中存在的生物分子的量进行定量。在特定的实施方案中，还可以确定第一样品和第二样品中的生物分子的种类。

VI.半乳凝素-3和生物标志物RNA检测技术

可以使用任何定性或定量检测半乳凝素-3/生物标志物RNA，例如mRNA，的方法。

可以通过Northern blotting实现对RNA转录物的检测，例如，其中在变性琼脂糖凝胶上制备RNA，并转至合适的支持物，例如活化的纤维素、硝酸纤维素或玻璃或尼龙膜上。然后使放射性标记的cDNA或RNA与制备物杂交，洗涤并通过放射自显影进行分析。

可以进一步使用扩增方法实现对RNA转录物的检测。例如，以下方案在本发明的范围内：将mRNA逆转录成cDNA，然后进行聚合酶链式反应(RT-PCR)；或者，使用单个酶进行这两个步骤，如美国专利No.5322770中所述的，或者将mRNA逆转录成cDNA，然后进行对称缺口连接酶链式反应(RT-AGLCR)，如R.L.Marshall等,PCR Methods and Applications 4:80-84(1994)所述。

在特定的实施方案中，使用定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)评估半乳凝素-3的mRNA水平(参见实施例)。可以对癌组织和相邻良性组织中的半乳凝素-3/生物标志物和对照mRNA，例如甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA，水平进行定量。为此，可以将冷冻组织切成5微米的切片并提取总RNA，例如，通过Qiagen RNeasy Mini Kit(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)。将来自每个组织的特定量的RNA，例如500ng的总RNA用例如QiagenOmniscript RT Kit进行逆转录。可以进行两步qRT-PCR，例如使用ABI TaqMan PCRreagent kit(ABI Inc,Foster City,CA)，和半乳凝素-3引物和GAPDH引物，和两种基因的探针，在ABI Prism 7700系统上进行。可用的合适的引物参见实施例。然后可以用半乳凝素-3/生物标志物复制品数量除以GAPDH复制品数量，并乘以1000，得到特定受试者的值。换句话说，用同一个RNA提取物中测量的GAPDH mRNA的量对半乳凝素-3/生物标志物mRNA的量进行标准化，获得半乳凝素-3/生物标志物/GAPDH比值。该比值等于或大于1，例如约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、2.5、3、5、10、30或100可以被视为高的半乳凝素-3/生物标志物表达。

可以用于本文中的其它已知的扩增方法包括但不限于PNAS USA 87:1874-1878(1990)和Nature 350(No.6313):91-92(1991)中描述的所谓的“NASBA”或“3SR”技术；公开的欧洲专利申请(EPA)No.4544610描述的Q-beta扩增；G.T.Walker等,Clin.Chem.42:9-13(1996)和欧洲专利申请684315中描述的链置换扩增；和PCT公开号WO9322461描述的靶介导的扩增。

可用于扩增半乳凝素-3核酸部分扩增的引物见实施例。

还可以使用原位杂交可视方法，其中放射性标记的反义RNA探针与组织活检样品的薄切片杂交，洗涤，用RNase切割并暴露于放射自显影的感光乳剂。样品可以用苏木精染色，以显示样品的组织组成，用合适的滤光片进行暗视野成像来显示显色的乳剂。还可以使用非放射性标记例如地高辛。

另一种评估半乳凝素-3/生物标志物表达的方法是通过荧光原位杂交(FISH)检测基因扩增。FISH是可以直接鉴别细胞中DNA或RNA的特定区域的技术，因此使得可以直观观察确定组织样品中半乳凝素-3/生物标志物的表达。FISH方法的优点是有更客观的评分系统，并且存在内置的内部对照，所述内部对照由相同样品中所有非赘生性细胞中存在的半乳凝素-3/生物标志物基因信号组成。荧光原位杂交是一种直接的原位技术，它相对快速和灵敏。FISH测试还可以是自动化的。当半乳凝素-3/生物标志物的表达水平通过单独的免疫组化难以确定的时候，免疫组化可以和FISH方法组合使用。

可替换地，可以在DNA阵列、芯片或微阵列上检测mRNA表达。相应于半乳凝素-3/生物标志物的寡核苷酸可以被固定在芯片上，然后与从患者获得的测试样品的标记核酸杂交。含有半乳凝素-3/生物标志物转录物的样品可以获得阳性杂交信号。制备DNA阵列的方法及其应用是本领域众所周知的(参见，例如，美国专利No:66186796；6379897；6664377；6451536；548257；美国20030157485和Schena等1995Science 20:467-470；Gerhold等1999Trends in Biochem.Sci.24,168-173和Lennon等2000 Drug discovery Today 5:59-65，通过引用将其全文合并入本文)。还可以进行基因表达系列分析(SAGE)(参见例如美国专利申请20030215858)。

为了监测mRNA水平，例如，可以从待检测的生物样品提取mRNA，逆转录，并产生荧光标记的cDNA探针。然后用标记的cDNA探针探针检测能与半乳凝素-3/生物标志物cDNA杂交的微阵列，扫描载片并测量荧光强度。该强度与杂交强度和表达水平相关。

用于检测半乳凝素-3/生物标志物RNA的探针的类型包括cDNA、核糖核酸探针、合成的寡核苷酸和基因组探针。所使用的探针的类型通常可以由具体情况决定，例如对于原位杂交使用核糖核酸探针，对于Northern blotting使用cDNA。最优选地，探针针对半乳凝素-3/生物标志物的独特核苷酸区域。探针可以短至区分识别半乳凝素-3/生物标志物mRNA转录物所需的长度；并且可以短至例如15个碱基；但是，优选探针为至少17个碱基，更优选至少18个碱基，更优选至少20个碱基。优选地，引物和探针在严谨条件下与具有相应于半乳凝素-3基因的核苷酸序列的DNA片段杂交。如本文所使用的，术语“严谨条件”表示仅仅在序列之间具有至少95％和优选至少97％的同一性时，才可以发生杂交。

探针标记的形式可以是任何适合的方式，例如使用放射性同位素，例如³²P和³⁵S。无论探针是化学合成的还是生物合成的，通过使用适当标记的碱基，都可以实现用放射性同位素进行标记。

VII.用半乳凝素-3抑制剂治疗肾病的方法

本发明提供用半乳凝素-3抑制剂或改性果胶，例如GCS-100，在患者中治疗肾病的方法。

A.剂量和给药方案

在一些实施方案中，给患者施用(例如注射或静脉输注)的组合物中的治疗有效物质(半乳凝素-3抑制剂或改性果胶，例如GCS-100)的总量是适合于该患者的量。本领域技术人员将会理解，不同的个体可能需要半乳凝素-3抑制剂或改性果胶的不同的总量。在一些实施方案中，半乳凝素-3抑制剂或改性果胶的量是药学有效的量。技术人员将能够基于例如患者年龄、体重和身体状况的因素确定治疗患者所需的组合物中的半乳凝素-3抑制剂或改性果胶的量。半乳凝素-3抑制剂或改性果胶的浓度部分取决于它在静脉施用溶液中的溶解度以及可以被施用的流体的体积。

在特定的实施方案中，半乳凝素-3抑制剂或改性果胶(例如GCS-100)以0.1mg/m²-30mg/m²范围的固定剂量被施用给受试者。例如，改性果胶或半乳凝素-3抑制剂可以以0.1mg/m²、0.5mg/m²、1mg/m²、3mg/m²、6mg/m²、9mg/m²、12mg/m²、15mg/m²、18mg/m²、21mg/m²、24mg/m²、27mg/m²、30mg/m²、35mg/m²、40mg/m²、50mg/m²、60mg/m²、70mg/m²、80mg/m²、90mg/m²、100mg/m²、110mg/m²、120mg/m²、130mg/m²、140mg/m²、150mg/m²、160mg/m²、170mg/m²、180mg/m²、190mg/m²、200mg/m²等的固定剂量被施用给受试者。上述提及的值之间的值的范围也意图被包括在本发明的范围中，例如，0.2mg/m²、0.6mg/m²、1.5mg/m²、2mg/m²、4mg/m²、8mg/m²、10mg/m²、13mg/m²、17mg/m²、20mg/m²、23mg/m²、25mg/m²、26mg/m²、28mg/m²、32mg/m²、45mg/m²、55mg/m²、65mg/m²、75mg/m²、85mg/m²、95mg/m²、105mg/m²、115mg/m²、125mg/m²、135mg/m²、145mg/m²、155mg/m²、165mg/m²、175mg/m²、185mg/m²、195mg/m²、205mg/m²，基于前述剂量的范围也被包括在本发明的范围中，例如，0.1-5mg/m²、5-10mg/m²、10-15mg/m²、15-20mg/m²、20-25mg/m²、25-30mg/m²、30-80mg/m²、80-120mg/m²、120-150mg/m²、150-175mg/m²、175-200mg/m²。全身剂量不应超过每周1g/m²或每天200mg/m²乘以5。

在特定的实施方案中，半乳凝素-3抑制剂或改性果胶(例如GCS-100)以例如每周1-10mg范围的固定剂量被施用给受试者。例如，在每种情况下，固定剂量可以分别是每周1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg或10mg。在特定的这样的实施方案中，在最初的时期(例如诱导阶段，例如1-3个月，优选2个月)每周施用一次改性果胶，优选GCS-100，然后之后每两周使用一次(例如维持或治疗阶段，例如1-6个月，或者甚至无限期)。在特定的这样的实施方案中，在两个阶段全程固定剂量是相同的，只是在两个阶段之间施用的频率有所不同。

所施用的组合物中半乳凝素-3抑制剂或改性果胶的浓度可以是至少16ug/ml。在一些实施方案中，半乳凝素-3抑制剂或改性果胶的浓度可以是约1.0ug/ml、约2.0ug/ml、约3.0ug/ml、约4.0ug/ml、约5.0ug/ml、约6.0ug/ml、约7.0ug/ml、约8.0ug/ml、约9.0ug/ml、约10.0ug/ml、约11.0ug/ml、约12.0ug/ml、约13.0ug/ml、约14.0ug/ml、约15.0ug/ml等。如本文所讨论的，可以以足以获得一种或更多种生理参数或一种或更多种生物标志物水平的提高或调整的速度施用包括半乳凝素-3抑制剂或改性果胶的组合物，所述生理参数例如肾小球滤过率、肾血管阻力、肾血流、滤过分数、平均动脉压等。患者可以与监测器相连，所述监测器在治疗的一些过程或全过程中提供连续的、定期性的、或不定期的测量。可以人工调节(例如由医生或护士)或自动调节(例如通过能够根据监测器接收到的生理参数的反应调节组合物的递送的医疗设备)施用速度，以将患者的生理和/或生物标志物参数保持在所希望的范围内或保持在所希望的阈值之上或之下。例如，半乳凝素-3抑制剂或改性果胶的的施用速度可以是从约0.032ng/kg/min至约100ug/kg/min，其形式是在可注射组合物中。在一些实施方案中，半乳凝素-3抑制剂或改性果胶的的施用速度可以是从约0.4至约45ug/min，从约0.12至约19ug/min，从约3.8至约33.8ug/min，从约0.16至约2.6ug/min等。在特定的实施方案中，半乳凝素-3抑制剂或改性果胶的的施用速度可以是约0.032ng/kg/min、约0.1ng/kg/min、约0.32ng/kg/min、约1ng/kg/min、约1.6ng/kg/min、约2ng/kg/min、约3ng/kg/min、约4ng/kg/min、约5ng/kg/min、约6ng/kg/min、约7ng/kg/min、约8ng/kg/min、约9ng/kg/min、约10ng/kg/min、约15ng/kg/min、约20ng/kg/min、约25ng/kg/min、约30ng/kg/min、约40ng/kg/min、约50ng/kg/min、约60ng/kg/min、约70ng/kg/min、约80ng/kg/min、约90ng/kg/min、约100ng/kg/min、约200ng/kg/min、约300ng/kg/min、约400ng/kg/min、约500ng/kg/min、约600ng/kg/min、约700ng/kg/min、约800ng/kg/min、约900ng/kg/min、约1ug/kg/min、约1.1ug/kg/min、约1.2ug/kg/min、约1.3ug/kg/min、约1.4ug/kg/min、约1.5ug/kg/min、约1.5ug/kg/min、约1.6ug/kg/min、约1.7ug/kg/min、约1.8ug/kg/min、约1.9ug/kg/min、约2ug/kg/min、约2.1ug/kg/min、约2.2ug/kg/min、约2.3ug/kg/min、约2.4ug/kg/min、约2.5ug/kg/min、约2.6ug/kg/min、约2.7ug/kg/min、约2.8ug/kg/min、约2.9ug/kg/min、约3.0ug/kg/min、约3.1ug/kg/min、约3.2ug/kg/min、约3.3ug/kg/min、约3.4ug/kg/min、约3.5ug/kg/min、约3.6ug/kg/min、约3.7ug/kg/min、约3.8ug/kg/min、约3.9ug/kg/min、约4.0ug/kg/min、约4.1ug/kg/min、约4.2ug/kg/min、约4.3ug/kg/min、约4.4ug/kg/min、约4.5ug/kg/min、约4.6ug/kg/min、约4.7ug/kg/min、约4.8ug/kg/min、约4.9ug/kg/min、约5.0ug/kg/min、约6ug/kg/min、约7ug/kg/min、约8ug/kg/min、约9ug/kg/min、约10ug/kg/min、约11ug/kg/min、约12ug/kg/min、约13ug/kg/min、约14ug/kg/min、约15ug/kg/min、约16ug/kg/min、约17ug/kg/min、约18ug/kg/min、约19ug/kg/min、约20ug/kg/min、约25ug/kg/min、约30ug/kg/min、约31ug/kg/min、约32ug/kg/min、约33ug/kg/min、约33.8ug/kg/min、约34ug/kg/min、约35ug/kg/min、约40ug/kg/min、约45ug/kg/min、约50ug/kg/min、约55ug/kg/min、约60ug/kg/min、约65ug/kg/min、约70ug/kg/min、约75ug/kg/min、约80ug/kg/min、约85ug/kg/min、约90ug/kg/min、约95ug/kg/min、约100ug/kg/min等。

组合物可以被施用一段时间段，所述一段时间段选自至少8小时，至少24小时，和从8小时至24小时。组合物可以被连续施用至少2-6天，例如2-11天，持续2-6天，在至少2-6天，例如2-11天的时间段内每天8小时。在持续时间较长的输注之后，中断期(从几个小时到几天)可能是有益的。在特定的实施方案中，治疗的持续时间可以持续达连续给药8周或者直到发生剂量限制性毒性。

B.药物制剂

本发明的组合物可以通过任何适合的途径被施用。在一些实施方案中，本发明的组合物适合于肠胃外施用。这些组合物可以被，例如腹腔内、静脉内、肾内或鞘内施用。在一些实施方案中，本发明的组合物被静脉注射。本领域技术人员应当认识到，施用治疗有效的本发明的物质制剂或组合物的方法将会取决于多种因素，例如待治疗的患者的年龄、体重、身体状况，和待治疗的疾病或病况。因此，技术人员应当能够逐个选择对患者来说最佳的施用方法。

组合物可以是溶液，其按重量计含有至少0.5％、1％、5％或10％的半乳凝素-3抑制剂或改性果胶，例如，按重量计达约10％或15％。在特定的实施方案中，以水中的胶体溶液的方式提供改性果胶。胶体颗粒的尺寸可以是直径小于1μm，优选小于约0.65μm，最优选小于约0.2μm。

制剂可以包括合适的赋形剂，包括本领域众所周知的药学可接受的缓冲剂、稳定剂、局部麻醉剂等。对于肠胃外施用，示例性的制剂可以是无菌溶液或悬浮液；对于口服给药，可以是糖浆剂、片剂或适口的溶液；对于局部应用，可以是洗剂、霜剂、喷雾剂或软膏；对于阴道内或直肠内施用，可以是阴道栓、栓剂、霜剂或泡沫剂。优选地，给药途径是肠胃外，更优选静脉内。

在替换的实施方案中，本发明的药物组合物可以是适合于口服给药的方式，例如糖浆剂或适口溶液；适用于局部应用的方式，例如霜剂或软膏；或者适用于通过吸入方式施用的形式，例如微晶粉末或适合于雾化的溶液。配制替换给药途径的药物成分的方法和手段是本领域众所周知的，可以预期，相关领域的技术人员可以使这些已知方法适用于本发明的半乳凝素-3抑制剂。

可以通过压缩或模塑制备片剂，可选地使用一种或更多种助剂。可以使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如乙醇酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备压缩片剂。可以通过在适合的机器中对用惰性液体稀释剂湿润的粉末状化合物的混合物进行模塑来制备模塑片剂。

可以可选地利用包衣或包壳，例如药物配制领域中公知的肠溶包衣和其它包衣刻划或制备片剂和本发明的药物组合物的其它固体剂型。它们也可以被配制成缓慢或控制释放的，其中使用，例如，不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所希望的释放模式、其它聚合物基质、脂质体和/或微球。它们可以例如通过细菌截留过滤器过滤进行灭菌，或者通过加入可溶于无菌水的无菌固体组合物形式的灭菌剂进行灭菌，或者通过在使用前立即加入一些其它无菌可注射介质进行灭菌。这些组合物还可以可选地含有乳浊剂，可以是仅在或优先在胃肠道的特定部分释放活性成分的组合物，可选地以延迟的方式释放。可使用的植入组合物的实施例包括聚合物类物质和蜡。半乳凝素-3抑制剂还可以是微囊形式，如果适当的话，其含有一种或更多种上述赋形剂。

用于本发明的半乳凝素-3抑制剂的口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂和酏剂。除了半乳凝素-3抑制剂之外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂，例如，水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂。

除了惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包括辅料，例如湿润剂、乳化剂和悬混剂、甜味剂、风味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。

除了活性化合物之外，悬混剂还可以含有助悬剂，例如，乙氧基异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂和黄蓍胶以及它们的混合物。

可以指明药物施用是用于治疗轻度、中度或重度、急性或慢性症状，或用于预防性治疗。可以理解所施用的精确剂量可以取决于患者的年龄和状况，所使用的特定颗粒药物和施用的频率可以最终由监护医生确定。典型地，可以每周施用一次，虽然可以以规则或不规则的频率发生，例如每天一次或每月一次或者它们的组合(例如每月有五天每天一次)。

适用于肠胃外给药的本发明的药物组合物包含本发明的半乳凝素-3抑制剂和与之组合的一种或更多种药学可接受的无菌等渗水性或非水性溶液，或者在使用前可重建成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质或助悬剂或增稠剂。

这些组合物还可以含有辅助剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂来确保预防微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸等。组合物中也可能需要包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。

药学可接受的抗氧化剂的实施例包括但不限于抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、掊酸丙酯、α-生育酚、和螯合剂如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸，磷酸等。

可注射的贮库形式可以通过在可生物降解的聚合物，如聚丙交酯-聚乙交酯，中形成主题化合物的微囊基质来制备。根据药物与聚合物的比例，和所使用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速度。其它可生物降解的聚合物的实施例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中制备贮库可注射制剂。

用于本发明化合物的局部或透皮施用的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂和吸入剂。半乳凝素-3抑制剂可以在无菌条件下与药学可接受的载体混合，并包含任何可能需要的防腐剂、缓冲剂或喷射剂。

通过在本发明的组合物中包括pH-调节剂，pH调节剂可能有益于调节组合物的pH。改变制剂或组合物的pH可能对于，例如治疗有效物质的稳定性或溶解性具有有益效果，或者可能对于制备适用于肠胃外施用的制剂或组合物来说是有用的。pH-调节剂是本领域众所周知的。相应地，本文所述的pH-调节剂并不意图构成详尽的列表，而仅仅是作为可用于本发明组合物的示例性pH调节剂被提供。pH-调节剂可以包括，例如，酸和碱。在一些实施方案中，pH-调节剂包括，但不限于，乙酸、盐酸、磷酸、氢氧化钠、碳酸钠和它们的组合。本发明的组合物的pH可以是任何为制剂或组合物提供所需性质的pH。所需的性质可以包括，例如，治疗有效物质稳定性，与其它pH的组合物相比治疗有效物质保留时间增加，以及提高的过滤效率。在一些实施方案中，本发明的组合物的pH可以是从约3.0到约9.0，例如，从约5.0到约7.0。在特定的实施方案中，本发明的组合物的pH可以是5.5±0.1、5.6±0.1、5.7±0.1、5.8±0.1、5.9±0.1、6.0±0.1、6.1±0.1、6.2±0.1、6.3±0.1、6.4±0.1或6.5±0.1。

在特定的实施方案中，半乳凝素-3抑制剂是改性果胶，它被制备成基本不含乙醇并且适用于肠胃外施用。基本不含乙醇意味着本发明的组合物含有按重量计少于5％的乙醇。在优选的实施方案中，组合物含有按重量计少于2％的，以及更优选少于0.5％的乙醇。在特定的实施方案中，组合物进一步包括一种或更多种药学可接受的赋形剂。这样的组合物包括本发明的半乳凝素-3抑制剂的水性溶液。在这样的水性溶液的特定的实施方案中，发生果胶改性的浓度为至少7mg/mL，至少10或15或更多mg/ml。任何这样的组合物也是基本上不含除乙醇外的其它有机溶剂。

可以使用缓冲剂在溶液中重悬化合物。在特定的实施方案中，缓冲剂可以具有例如约5.5、约6.0或约6.5的pKa。本领域技术人员将认识到，可以基于其pKa和其它性质选择本发明的组合物中包括的合适的缓冲剂。缓冲剂是本领域众所周知的。相应地，本文描述的缓冲剂并非意图构建详尽列表，而仅仅是作为可用于本发明组合物的示例性缓冲剂被提供。在特定的实施方案中，缓冲剂可以包括下述一种或更多种：Tris、Tris HCl、磷酸钾、磷酸钠、柠檬酸钠、抗坏血酸钠、磷酸钠和磷酸钾的组合、Tris/Tris HCl、碳酸氢钠、磷酸精氨酸、盐酸精氨酸、盐酸组氨酸、卡克酸盐、琥珀酸盐、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、马来酸盐、bis-tris、磷酸盐、碳酸盐和任何药学可接受的盐和/或它们的组合。

可以加入增溶剂以提高药物或化合物的溶解性。在一些实施方案中，在半乳凝素-3抑制剂或改性果胶中包括增溶剂可能是有益的。增溶剂对于增加制剂或组合物的任何组分，包括治疗有效物质半乳凝素-3抑制剂或赋形剂的溶解性是有用的。本文所述的增溶剂并非意图构建详尽列表，而仅仅是作为可用于本发明组合物的示例性增溶剂而被提供。在特定的实施方案中，增溶剂包括，但不限于，乙醇、叔丁醇、聚乙二醇、甘油、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和其任何药学可接受的盐和/或它们的组合。

稳定剂可以有助于增加本发明组合物中治疗有效物质的稳定性。这可以通过，例如减少治疗有效物质的降解或防止治疗有效物质的聚集而实现。不希望受到理论的束缚，增加稳定性的机制可以包括将治疗有效物质与溶剂隔开，或抑制蒽环霉素化合物的自由基氧化。稳定剂是本领域众所周知的。相应地，本文所述的稳定剂并非意图构建详尽列表，而仅仅是作为可用于本发明组合物的示例性稳定剂被提供。稳定剂可以包括但不限于，乳化剂和表面活性剂。

可以加入表面活性剂以降低液体组合物的表面张力。这可以提供有益的性质，例如更易于过滤。表面活性剂还可以作为乳化剂和/或增溶剂。表面活性剂是本领域众所周知的。相应地，本文所述的表面活性剂并非意图构建详尽列表，而仅仅是作为可用于本发明组合物的示例性表面活性剂被提供。可以包括的表面活性剂包括但不限于脱水山梨醇酯，例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)，脂多糖，聚乙二醇(例如PEG 400和PEG3000)，泊洛沙姆(即pluronics)，环氧乙烯和聚氧化乙烯(例如Triton X-100)，皂苷，磷脂质(例如卵磷脂)和它们的组合。

渗透压调节剂可用于帮助制备适用于施用的制剂或组合物。当给患者施用组合物，例如进行肠胃外施用时，液体组合物的渗透压是重要的考量因素。渗透压调节剂是本领域众所周知的。相应地，本文所述的渗透压调节剂并非意图构建详尽列表，而仅仅是作为可用于本发明组合物的示例性渗透压调节剂被提供。渗透压调节剂可以是离子的或非离子的，可以包括但不限于无机盐、氨基酸、碳水化合物、糖、糖醇和碳水化合物。示例性的无机盐包括氯化钠、氯化钾、硫酸钠和硫酸钾。示例性的氨基酸是甘氨酸。示例性的糖可以包括糖醇，如甘油、丙二醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖和甘露醇。

B.制品和药盒

本发明还提供包装的药物组合物，其中半乳凝素-3抑制剂或改性果胶，例如GCS-100，被包装在药盒或者制品中。本发明的药盒或制品可以含有对于治疗有用的材料，包括改善、和/或缓解、预防和/或诊断或监测肾病的材料。药盒或制品可以包括容器和在容器上的或与容器相连接的标签或说明书或打印材料，它提供半乳凝素-3抑制剂或改性果胶在治疗肾病中的应用的相关信息。

在特定的实施方案中，本发明提供包括半乳凝素-3抑制剂和说明书的制品，其中所述说明书指明半乳凝素-3抑制剂可用于在eGFR在约15-44mL/min/1.73m²范围内的患者中治疗肾病。

术语“说明书”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明，它含有与适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或有关使用这样的治疗产品的警告相关的信息。

在特定的实施方案中，本发明的制品包括(a)第一容器，其中有包括半乳凝素-3抑制剂或改性果胶的组合物；和(b)说明书，其指明半乳凝素-3抑制剂或改性果胶可以如何被施用给患者，如本文所讨论的。在优选的实施方案中，标签或说明书指明半乳凝素-3抑制剂或改性果胶(例如GCS-100)被用于治疗肾病。在特定的实施方案中，本发明的特征在于药盒，其包括足够数量的容器，以提供负荷剂量和维持剂量的半乳凝素-3抑制剂或改性果胶。例如，药盒可以含有容器，所述容器含有约1.5和30mg/m²，或者范围在0.1-5mg/m²、5-10mg/m²、10-15mg/m²、15-20mg/m²、20-25mg/m²、25-30mg/m²、30-80mg/m²、80-120mg/m²、120-150mg/m²、150-175mg/m²、175-200mg/m²之间的量的改性果胶，用于静脉注射。含有半乳凝素-3抑制剂或改性果胶(例如GCS-100)的每个容器都能，例如，提供足够的改性果胶以便于每周进行一次静脉施用并连续施用直至8周，或者以另外一种适合的频率施用例如每天一次或每月一次。

用于半乳凝素-3抑制剂或改性果胶(例如GCS-100)的合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器，包括预装型或预填充型注射器，笔，包括自动注射笔等。容器可以用多种材料，例如玻璃或塑料，形成。容器中装有组合物本身或者它与另一种可有效用于治疗、预防和/或诊断病况的组合物的组合，并且可以具有无菌接入口(access port)。

在特定的实施方案中，药物组合物和相关的制品对于治疗特定患者群体是有用的，所述患者群体可能对于改性果胶有良好反应。例如，改性果胶，例如GCS-100，可用于治疗患者的肾病，所述患者对用于治疗他们的肾病的口服抗生素或药物没有反应或者不耐受。

在特定的实施方案中，药物组合物和/或相关的制品可以提供适用于治疗肾病的治疗剂施用的剂量。在特定的实施方案中，制品包括在治疗开始时施用的约1.5mg/m²的负荷剂量。在特定的实施方案中，制品包括约0.5mg/m²的维持剂量，例如用于之后的数周，例如从第4周开始。例如，本发明的药盒可以包括负荷剂量和一种或更多种维持剂量。

在其它实施方案中，制品提供适用于皮下注射的半乳凝素-3抑制剂或改性果胶(例如GCS-100)。

在本发明的特定实施方案中，药盒包括半乳凝素-3抑制剂或改性果胶，包括附加治疗剂的第二药物组合物，和可选的两种药剂用于治疗肾病的施用说明书。说明书可以描述如何施用，例如皮下或静脉内，以及何时施用，例如在第0周、第2周以及之后每周一次或每两周一次，给受试者施用以进行治疗的改性果胶和/或附加治疗剂的剂量。

在特定的实施方案中，药盒含有药物组合物，所述药物组合物包括半乳凝素-3抑制剂或改性果胶和药学可接受的载体和一种或更多种附加药物组合物，所述附加药物组合物每种包括用于治疗肾病(例如CKD或NASH)或其症状的药物和药学可接受的载体。可替换地，药盒包括单个药物组合物，所述药物组合物包括半乳凝素-3抑制剂(例如改性果胶)、一种或更多种对于于治疗肾病(例如CKD或NASH)有用的药物和药学可接受的载体。

在另一个方面，本发明提供药物包装，其包括小瓶或安瓿瓶，所述小瓶或安瓿瓶含有根据本发明的半乳凝素-3抑制剂，其形式是可重建粉末或适用于注射或输注的溶液，所述药品包装可选地还包括给遭受肾毒性之苦的患者施用组合物的说明书。说明书包括但不限于文字的和/或图示的有关以下内容的说明：活性成分、将组合物稀释到适合于施用的浓度的说明、适应症、合适的给药方案、禁忌症、药物相互作用和临床试验过程中注意到的任何不良副作用。

在替换的实施方案中，药物包装可以包括塑料袋，所述塑料袋含有100mL到2L的本发明的药物组合物，其形式是适用于静脉施用的溶液，所述药物包装可选地还包括上述的说明书。

C.附加治疗剂

半乳凝素-3抑制剂或改性果胶，包括GCS-100，可以单独地或与附加治疗剂组合用于本发明的方法中，所述附加药剂由技术人员根据其预期目的来选择。例如，附加药剂可以是本领域认为对于治疗由半乳凝素-3抑制剂或改性果胶治疗的疾病或病况有用的治疗剂。

应当进一步理解，本发明中包括的组合是对于其预期目的有用的那些组合。下述的治疗剂是为了举例说明的目的，并非意图是限定。组合，其是本发明的一部分，可以是半乳凝素-3抑制剂或改性果胶和至少一种选自下述列表的附加治疗剂的组合。如果组合所形成的组合物可以行使其预期的功能，组合还可以包括一种以上的附加药剂，例如两种或三种附加治疗剂。本文描述的改性果胶或半乳凝素-3抑制剂可以与用于治疗癌症、心血管疾病、炎症、纤维化和肾损伤的附加治疗剂组合使用，所述附加治疗剂的作用可以独立于、依赖于改性果胶的功能或者与改性果胶的功能相配合。本发明中使用的改性果胶还可以与一种或更多种治疗剂组合，例如甲氨蝶呤、美沙拉嗪、奥沙拉嗪、氯喹、羟基氯喹、青霉胺、金硫代苹果酸盐(肌肉内或口服)、秋水仙素、β-2肾上腺素能受体激动剂(沙丁胺醇、普米克令舒、沙美特罗)、黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)、色甘酸盐、奈多罗米、酮替芬、异丙托溴铵、氧托溴铵、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟米特、NSAIDs(例如布洛芬)、糖皮质激素(例如泼尼松龙、甲基泼尼松龙、和甲基泼尼松龙醋酸盐)、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成试剂、补体抑制剂、肾上腺素能药物、干扰促炎性细胞因子如TNFα或ILl的信号传导的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-l-转换酶抑制剂、TNFa转换酶(TACE)抑制剂、T-细胞信号传导抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺胺吡啶、咪唑硫嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受体和衍生物p75 TNFRiγG(Enbrel^TM和p55 TNFRiγG(Lenercept))、siL-lRI、siL-lRII、siL-6R)、抗炎性细胞因子(例如，IL-4、IL-l0、IL-12、IL-13和TGFβ)、塞来昔布、叶酸、硫酸羟化氯喹、罗非考昔、依那西普、英夫利昔单抗、萘普生、伐地考昔、美洛昔康、硫代苹果酸金钠、阿司匹林、曲安奈德、萘磺酸丙氧芬、叶酸、萘丁美酮、双氯芬酸、吡罗昔康、依托度酸、双氯芬酸钠、噁丙嗪、氧可酮、酒石酸氢可酮、双氯芬酸钠、米索前列醇、芬太尼、阿那白滞素、曲马多、水杨酰水杨酸、舒林酸、氰钴胺、叶酸、吡哆醇、对乙酰氨基酚、阿仑膦酸钠、波尼松龙、硫酸吗啡、利多卡因、吲哚美辛、硫酸氨基葡萄糖、软骨素、阿米替林、磺胺嘧啶、奥洛他定、奥美拉唑、环磷酰胺、利妥昔单抗、IL-l TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18 BP、抗-IL-18、抗-IL15、BIRB-796、SCI0-469、VX-702、AMG-548、VX-740、罗氟司特、IC-485、PSORIASIS C-801和Mesopram。

可以与改性果胶或其它半乳凝素-3抑制剂组合使用的肾病治疗剂的非限制性实施例包括下述药剂：抗菌剂和止汗剂(例如纯乙醇中的6.25％的六水合氯化铝)、抗炎性或抗雄激素疗法例如四环素、病灶内用曲安奈德或非那雄胺。半乳凝素-3抑制剂或改性果胶还可以与例如下述试剂组合使用，例如甲氨蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟米特、NSAIDs(例如布洛芬)、糖皮质激素例如泼尼松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成剂、补体抑制剂、肾上腺素能药物、干扰促炎性细胞因子如TNFα或ILl的信号传导的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-lβ-转换酶抑制剂、TNFa转换酶抑制剂、T-细胞信号传导抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺胺吡啶、咪唑硫嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受体、siL-lRI、siL-lRII、siL-6R)和抗炎性细胞因子(例如，IL-4、IL-l0、IL-12、IL-13和TGFβ)。

可以与改性果胶组合使用的肾病治疗剂的其它实施例包括下述药剂：D2E7(PCT公开号No.WO 97/29131；)、Ca2TNFR-Ig构建体、(p75 TNFRiγG(Enbrel^TM)和p55 TNFRiγG(Lenercept)抑制剂和PDE4抑制剂。半乳凝素-3抑制剂或改性果胶可以与糖皮质激素，例如布地奈德和地塞米松，组合使用。半乳凝素-3抑制剂或改性果胶还可以与药剂，例如柳氮磺胺吡啶、5-氨基水杨酸和奥沙拉秦，与干扰促炎性细胞因子如ILl的合成或作用的药剂例如IL-lβ-转换酶抑制剂和IL-lrα，组合使用。半乳凝素-3抑制剂或改性果胶还可以与T细胞信号传导抑制剂，例如酪氨酸激酶抑制剂6-巯基嘌呤，一起使用。半乳凝素-3抑制剂或改性果胶可以与IL-12组合使用。半乳凝素-3抑制剂或改性果胶可以与美沙拉嗪、波尼松、咪唑硫嘌呤、巯基嘌呤、英夫利昔单抗、甲基泼尼松龙、苯已哌定/atrop sulfate、盐酸洛哌丁胺、甲氨蝶呤、奥美拉唑、叶酸、环丙沙星、酒石酸氢可酮、盐酸四环素、氟轻松醋酸酯、甲硝唑、硫柳汞、消胆胺、盐酸环丙沙星、硫酸莨菪碱、盐酸哌替啶、盐酸咪达唑仑、氧可酮、盐酸异丙嗪、磷酸钠、磺胺甲恶唑I甲氧苄氨嘧啶、塞来昔布、聚卡波非、萘磺酸丙氧芬、氢化可的松、多种维生素、巴柳氮二钠、磷酸可待因、盐酸考来维仑、氰钴胺、叶酸、左氧氟沙星、甲基波尼松龙、那他珠单抗和干扰素-gamma组合使用。半乳凝素-3抑制剂或改性果胶还可以与例如下述物质的药剂组合使用，例如阿伦单抗、屈大麻酚、达利珠单抗、米托蒽醌、盐酸扎利罗登、fampridine、醋酸格拉替雷、那他珠单抗、sinnabidol、a-免疫因子NNS03、ABR-215062、AnergiX.MS、趋化因子受体拮抗剂、BBR-2778、calagualine、CPI-1189、LEM(脂质体包封的米托蒽醌)、THC.CBD(大麻素激动剂)MBP-8298、mesopram(PDE4抑制剂)、MNA-715、抗-IL-6受体抗体、neurovax、吡非尼酮同素异形体1258(RDP-1258)、sTNF-Rl、他仑帕奈、特立氟胺、TGF-beta2、替利莫肽、VLA-4拮抗剂(例如，TR-14035、VLA4Ultrahaler、AntegranELAN/Biogen)、干扰素gamma拮抗剂、IL-4激动剂和人源化IL-6抗体托珠单抗。

在特定的实施方案中，半乳凝素-3抑制剂或改性果胶可以与本领域已知的抗病毒剂或抗细菌剂组合使用，以治疗感染。本文使用的术语“抗生素”指抑制微生物的生长或杀死微生物的化学物质。该术语包括本领域已知的由微生物产生的抗生素，以及合成的抗生素(例如类似物)。抗生素包括，但不限于，克拉霉素环丙沙星和甲硝唑

在特定的实施方案中，半乳凝素-3抑制剂或改性果胶可以与可引起肾毒性的化疗剂组合使用。可替换地，半乳凝素-3抑制剂可以与除化疗剂以外的可引起肾毒性的疗法，或者对例如药物滥用或暴露于重金属的情况有响应的疗法组合使用，后者也具有肾毒性。

具有肾毒性的癌症治疗剂包括烷化剂，例如AZQ(亚丝醌)、顺铂、顺铂类似物、异环磷酰胺、亚硝基脲；抗肿瘤抗生素例如丝裂霉素C和普卡霉素；抗代谢物例如5-氮胞苷和甲氨蝶呤；生物药剂例如干扰素和白介素-2，和其它药物例如硝酸镓、环孢霉素和他克莫司。化疗剂可以选自铂复合物、顺铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、沙铂、BBR3464或ZD0473。在特定的实施方案中，半乳凝素-3抑制剂与选自顺铂、甲氨蝶呤、丝裂霉素、环孢霉素、异环磷酰胺和唑来膦酸的化疗剂或免疫抑制剂一起被施用。

在特定的实施方案中，半乳凝素-3抑制剂与除化疗剂以外的肾毒性药物组合使用，其选自抗生素、免疫抑制剂、降高血脂药、ACE抑制剂、NSAIDs和阿司匹林。抗生素可以选自氨基糖苷类、磺胺类、两性霉素B、膦甲酸、喹诺酮(例如，环丙沙星、左氧氟沙星)、利福平、四环素、阿昔洛韦、戊烷脒或万古霉素。在特定的实施方案中，方法包括将半乳凝素-3抑制剂或改性果胶与两种或更多种肾毒性疗法例如化疗疗法和抗生素疗法联合施用。治疗肾病的方法可以进一步包括施用附加治疗剂例如抗炎性药物或抗氧化剂。在特定的实施方案中，抗氧化剂可以选自别嘌呤醇、依步硒、厄多司坦、依达拉奉、N-乙酰半胱氨酸、水飞蓟素、柚皮素、维生素C和维生素E。在特定的实施方案中，抗炎性剂选自水杨酸盐。

包括半乳凝素-3抑制剂或改性果胶的组合物可以与附加药剂组合施用，以帮助改善肾功能。在一些实施方案中，附加药剂是白蛋白，因为白蛋白静脉给药导致的血浆体积增加已显示能在具有肝肾综合症的患者中改善肾功能。所施用的附加药剂的量根据包括半乳凝素-3抑制剂或改性果胶和附加药剂在内的治疗的累积治疗效果而不同。例如，所施用的白蛋白的量可以是在第一天静脉内给予每千克体重1g白蛋白，然后每天给予20-40g。而附加药剂可以是米多君、奥曲肽、生长激素抑制素、加压素类似物鸟氨酸加压素、特利加压素、己酮可可碱、乙酰半胱氨酸、去甲肾上腺素、米索前列醇等的任何一种或更多种。在一些实施方案中，其它利钠肽也可以与半乳凝素-3抑制剂或改性果胶治疗剂组合使用，以补救与上述讨论的疾病相关的钠排泄损伤。例如，利钠肽可以包括任何类型的心钠素(ANP)、脑钠肽(BNP)、C-型利钠肽(CNP)和/或树眼镜蛇利钠肽等。几种利尿化合物可以与半乳凝素-3抑制剂或改性果胶组合使用，以诱导尿排出。例如，黄嘌呤如咖啡因、茶碱、可可碱；噻嗪类如苄氟噻嗪、氢氯噻嗪；留钾利尿剂如阿米洛利、螺内酯、氨苯喋呤、坎利酸钾；渗透压性利尿剂如葡萄糖(特别是在未受控制的糖尿病中)、甘露醇；髓袢利尿剂如布美他尼、依他尼酸、呋塞米、拖拉塞米；碳酸酐酶抑制剂如乙酰唑胺和多佐胺；Na-H交换拮抗剂如多巴胺；排水利尿剂如秋麒麟草、杜松；精氨酸加压素受体2拮抗剂如两性霉素B、柠檬酸锂；酸化盐如CaCl₂、NH₄Cl等中的任何一种或更多种可以与半乳凝素-3抑制剂或改性果胶组合使用以治疗患者。上述的附加药剂的列表仅仅是举例说明，还可以包括任何对于治疗与本文讨论的任何肾病相关的肾衰竭有用的附加药剂。

1.联合施用

半乳凝素-3抑制剂和附加治疗剂的联合施用可以涉及同时施用。在特定的实施方案中，联合施用涉及两种药剂彼此在约10分钟内、约20分钟内或约30分钟内被施用。在示例性的实施方案中，半乳凝素-3抑制剂以与附加治疗剂重叠的方式被施用，例如，附加治疗剂被静脉内施用，半乳凝素-3抑制剂在静脉给药的过程期间被口服施用。

可以在施用附加治疗剂之后施用半乳凝素-3抑制剂。可以在施用附加治疗剂之后立即或者在例如1小时、2小时、4小时、6小时或12小时之内施用半乳凝素-3抑制剂。在其它实施方案中，可以在半乳凝素-3抑制剂之后施用附加治疗剂。可以在半乳凝素-3抑制剂之后立即或者在例如1小时、2小时、4小时、6小时或12小时之内施用附加治疗剂。

可以通过任何适当的方式施用半乳凝素-3抑制剂以使其接触肾并积累足够的量以预防或治疗肾病。半乳凝素-3抑制剂或含有半乳凝素-3抑制剂的组合疗法可以口服施用、通过静脉注射肠胃外施用、透皮施用、通过肺部吸入施用、通过阴道内或直肠内插入施用、通过皮下植入施用、肌肉注射或者通过向受影响组织直接注射施用，例如注射到肿瘤部位中。在一些例子中，可以在进行外科手术的时候局部使用这些材料。

这些材料被配制为适合所希望的给药途径。可以以有助于施用的方式配制半乳凝素-3抑制剂和任何附加治疗剂的每一个。例如，组合疗法可以被配制为静脉内施用，而半乳凝素-3抑制剂可以被配制为雾化吸入。下述关于制剂的讨论可以应用于组合疗法的单个制剂或半乳凝素-3抑制剂或二者的组合。

半乳凝素-3抑制剂无需与其它组合疗法以同样的方式被施用。例如，半乳凝素-3抑制剂可以被口服施用，而附加治疗剂被静脉内施用。此外，半乳凝素-3抑制剂可以在施用组合疗法之前、过程中或之后被施用，例如在施用组合疗法之前被施用。在优选的实施方案中，半乳凝素-3抑制剂以在肾中积聚有效浓度的半乳凝素-3抑制剂的方式被施用。任何一种或更多种上述提及的治疗剂，单独或以组合的方式，都可以与半乳凝素-3抑制剂或改性果胶组合被施用给遭受肾病的受试者，例如使用多可变剂量治疗方案。

治疗肾病的方法可以进一步包括在附加治疗剂和半乳凝素-3抑制剂的联合施用之前、其过程中和/或之后用盐水给患者补水。

在一些实施方案中，任何一种上述提及的治疗剂，单独地或以组合方式，可以在除了用于治疗癌症、心血管疾病、炎症等的治疗剂之外被施用给遭受肾病的受试者。应当理解，附加治疗剂可与上述的疗法组合使用，但也可以用于本文所述的其它需要有有益效果的适应症。用于本文所述的方法和药物组合物的药剂的组合可以对靶向治疗的病况或疾病具有治疗加和效果或协同效果。本文所述的方法或药物组合物中使用的药剂的组合还可以减少有害作用，所述有害作用与至少一种药剂单独施用或不与特定药物组合物中的附加药剂一起施用相关。例如，一种药剂的毒性的副作用可以被组合物中的另一种药剂减轻，由此允许更高的剂量，提高患者的配合度，和/或提高治疗效果。组合物的加和或协同效果、益处和优点适用于各类治疗剂，无论是结构类或是功能类，或者适用于单个化合物本身。

VIII.半乳凝素抑制剂和改性果胶的效力

本发明还提供用于评估受试者中半乳凝素-3抑制剂或改性果胶的效果的方法。这样的方法可以用于确定半乳凝素-3抑制剂或改性果胶的效力，或者用于根据所测量的效果调整患者剂量。使用本文所述的方法，半乳凝素-3抑制剂或改性果胶的效果可以被确定或验证，并且，可选地，可用于治疗肾病的方法。

在特定的实施方案中，本发明提供用于确定半乳凝素-3抑制剂或改性果胶，包括GCS-100，在受试者中治疗肾病的效力的方法，其使用基线eGFR的变化来确定效力。在特定的实施方案中，通过检测半乳凝素-3的水平和/或活性的变化，来评估半乳凝素-3抑制剂或改性果胶，包括GCS-100，在受试者中治疗肾病的效力，半乳凝素-3的水平降低显示具有所需的结果。其它适合的标志物包括胱抑素C、肌酐、BUN、血浆有丝分裂原、钾、尿酸、脲和其它肾功能和/或损伤标志物。

在特定的实施方案中，本发明提供在受试者中治疗肾病的方法，包括给患者施用半乳凝素-3抑制剂或改性果胶，例如GCS-100，以使得肾病被治疗，例如其中半乳凝素-3抑制剂或改性果胶在患者或患者群体中获得了具有统计学显著性的临床反应。

在特定的实施方案中，本发明的方法用于确定半乳凝素-3抑制剂或改性果胶的剂量对于用半乳凝素-3抑制剂或改性果胶治疗的患者来说是否是半乳凝素-3抑制剂改性果胶的有效剂量。

在特定的实施方案中，本发明的方法包括给患者施用半乳凝素-3抑制剂或改性果胶，并通过确定患者的变化、改善、测量结果等、eGFR、半乳凝素-3、生物标志物、血清水平(相对于患者的预治疗状况，相对于预先测定的所希望状况或标准，或者相对于未治疗患者或用安慰剂治疗的患者的状况)来确定改性果胶的效力。

用于确定效力的方法可以包括评估给药方案对于患肾病受试者的效果，以确定半乳凝素-3抑制剂或改性果胶是否是有效的疗法或者确定是否需要改变剂量，所述给药方案包含半乳凝素-3抑制剂或改性果胶。

本文所述的实施例和发现是改性果胶的代表，GCS-100，它对于治疗肾病来说是有效的。因此，本文的实施例部分所述的研究和结果可以用作使用半乳凝素-3抑制剂或改性果胶治疗肾病的指南。

本发明的其它实施方案在下述实施例中描述。本发明通过下述实施例进行进一步举例说明，下述实施例不应当被理解为任何方式的限定。

范例

半乳凝素-3抑制剂：GCS-100是复合多糖，它能够结合并可能阻断半乳凝素-3的作用。GCS-100是果胶的衍生物，果胶是在不同植物的结构，包括柑橘的果肉和果皮，中发现的天然存在的多糖。果胶由几种类型的糖构成，它们排列在复杂的聚合物构型中，并具有多个侧分支。特别是，果胶具有多个侧分支，所述侧分支含有被半乳凝素-3的糖结合域识别的糖β-半乳糖。因此，GCS-100能够结合并螯合胞外(循环)半乳凝素-3的多个分子(图2)。此外，由于它具有较高的平均分子量，GCS-100在体内保留的时间持续较长(半衰期为大约30小时)，这增加了它与循环半乳凝素-3相互作用和螯合它的时间。

实施例1：GCS-100药理学研究概述

已在被称为是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的纤维化的、促炎性的脂肪肝小鼠模型中研究了GCS-100。在该模型中，通过在出生后单次皮下注射链脲霉素，然后在4周龄后自由供应高脂肪饮食，在小鼠中建立NASH。NASH发生在约7周龄，并在第9周有纤维化的证据，在第11-12周形成肝结节。在目前的研究中，小鼠在9周龄被随机分为三组，通过静脉给予无活性的安慰剂(对照)、1mg/kg GCS-100或25mg/kg GCS-100进行治疗。所有动物在第9-12周期间每周三次接收它们各自的给药。在第12周结束时，收集血液和组织样品，并分析肝酶、非酒精性脂肪肝(NAFLD)活性得分，和纤维化。

总的来说，在NASH小鼠中，用GCS-100进行的治疗具有良好的耐受性，并导致血浆ALT下降。没有观察到对血液葡萄糖水平的影响。组织学分析显示NAFLD得分有显著提高，并且具有减少的小泡和大泡脂肪沉积、肝细胞膨胀和炎性细胞浸润。观察到羟脯氨酸的减少，通过天狼星红染色测量还观察到纤维化的显著减少。这项研究证明GCS-100可有效减少纤维化。

实施例2：GCS-100在慢性肾病患者的治疗中的应用

为了获得所希望的治疗效果，获得在较长时间段中足以以有效水平结合并中和血浆半乳凝素-3的循环GCS-100浓度是有帮助的。ESRD患者中循环半乳凝素-3的平均浓度是约64ng/mL，这等同于2.21x10^-6μmol半乳凝素-3/mL血浆(de Boer等,2011)。

基于人药代动力学数据，单次的1.5mg/m²剂量的GCS-100预期会导致起始血浆浓度超过预期的半乳凝素-3浓度。以摩尔为基础，在这个剂量下，在GCS-100的C_max，GCS-100比循环半乳凝素-3浓缩约6倍。血浆中GCS-100的近似平均半衰期是30小时，因此，在下次治疗之前，GCS-100的水平将会落到这个基线以下(图3)。

类似地，单次的30mg/m²剂量的GCS-100预期会导致起始血浆浓度超过预期的半乳凝素-3浓度。以摩尔为基础，在这个剂量下，在GCS-100的C_max，GCS-100比循环半乳凝素-3是大约浓缩约160倍，在下次治疗之前GCS-100的血浆水平将不会落到这个基线以下。

根据前述的基本原理，本研究使用的剂量组和给药时间安排预期会产生有效的半乳凝素-3抑制，同时能够被良好地耐受。

研究药物施用和给药时间安排

被分在治疗组的患者在第1、8、15、22、29、36、43和50天接受安慰剂或GCS-100。根据体表面积确定所施用的GCS-100的量(按mg计)，根据体重和身高，使用下式III或IV计算。

或

给药方案

患者每周给药一次，持续8周。在第1天计算用于每个患者的研究药物剂量。

治疗

患者被随机分为接受安慰剂(0.9％氯化钠注射液，USP)、1.5mg/m²GCS-100或30mg/m²GCS-100。安慰剂和GCS-100通过静脉输注施用，每周一次，持续8周。

表3-4显示了注射30mg/m²(表3)和1.5mg/m²(表4)的患者的GFR从基线值到第50天和第57天平均值的平均变化。表5-8显示了被施用1.5mg/m²的GCS-100和30mg/m²的GCS-100的患者的基线GFR、BUN、尿酸和半乳凝素-3的变化。

表3.被施用30mg/m²的GCS-100和安慰剂的患者中GFR变化的小结

高剂量相对于安慰剂的GFR变化

t-检验:两样品假设不等方差

表4.被施用1.5mg/m²的GCS-100和安慰剂的患者中GFR变化的小结

低剂量相对于安慰剂的GFR变化

t-检验:两样品假设不等方差

表5：被施用安慰剂、1.5mg/m²的GCS-100和30mg/m²的GCS-100的患者中基线eGFR(mL/min/1.73m²)的变化。

安慰剂	低剂量	高剂量
			-0.58	1.26	0.06

表6：被施用安慰剂、1.5mg/m²的GCS-100和30mg/m²的GCS-100的患者中基线BUN(mg/dL)的变化。所显示的数据是在基线水平升高(异常)的受试者的数据。

BUN	变化
		安慰剂	-0.74
低剂量	-3.93
		高剂量	0.34

表7：被施用安慰剂、1.5mg/m²的GCS-100和30mg/m²的GCS-100的患者中基线尿酸(mg/dL)的变化。所显示的数据是在基线水平升高(异常)的受试者的数据。

BUN	变化
		安慰剂	-0.55
低剂量	-1.64
		高剂量	0.13

表8：被施用安慰剂、1.5mg/m²的GCS-100和30mg/m²的GCS-100的患者中基线半乳凝素-3(ng/mL)的变化。

BUN	变化
		安慰剂	1.03
低剂量	-0.88
		高剂量	1.29

表9：被施用安慰剂和1.5mg/m²的GCS-100的患者中基线钾的变化。

	安慰剂	1.5mg/m2
			n	40	41
基线	4.42	4.49
			第50/57天平均值	4.45	4.37
变化	0.03	-0.12
			StDev	0.33	0.4
P-值(ANOVA)		0.07

实施例3：慢性肾病(CKD)患者中GCS-100的2期研究

在121个进展性CKD患者中进行多中心的、随机的、盲的、安慰剂作对照的2期研究。2期研究符合其主要效力终点，即在肾功能上统计学显著的提高。特别是，在给药8周后，与安慰剂相比，剂量为1.5mg/m²的GCS-100，导致估算肾小球滤过率(eGFR)有统计学显著(p＝0.045)的提高。与安慰剂相比，这种提高在给药结束后保持了5周(p＝0.07)。在30mg/m²剂量组中没有观察到eGFR有统计学显著的提高。

表10.在2期研究中被施用安慰剂、1.5mg/m²的GCS-100和30mg/m²的GCS-100的患者中基线eGFR(mL/min/1.73m²)的变化。

在糖尿病病因患者的前瞻性定义子集中，GCS-100对于eGFR的效果更明显(p＝0.029)。根据糖尿病性CDK患者的肾中半乳凝素-3升高的观察结果预先确定了对该子集的分析，在这些患者中半乳凝素-3的水平与蛋白尿(肾脏健康的标志物)相关。

表11.在2期研究中被施用安慰剂、1.5mg/m²的GCS-100和30mg/m²的GCS-100的糖尿病患者中基线eGFR(mL/min/173m²)的变化。

GCS-100具有良好的耐受性。在1.5mg/m²组中，没有严重的不良事件，没有3/4级的不良事件并且没有早期研究中止。在任何剂量组中没有观察到对于血压的影响。

进行了扩展研究，其中来自2期研究的患者被重新随机分配接受1.5或30mg/m²的GCS-100(第16周可获得完整数据)。在参加的总共93名患者中，在扩展研究中用GCS-100进行治疗之前，有33名患者之前在2期研究中接受过安慰剂。这一组代表了首次接受GCS-100的一组患者，分析效力。与盲2期结果一致，1.5mg/m²组在eGFR上具有显著的提高。当将这些患者的反应与下述反应相比时，观察到这种结果：(1)接受30mg/m²的平行随机组中的反应(p＝0.04)；和(2)参与扩展研究的安慰剂治疗患者在盲2期研究中对安慰剂的先前反应(p＝0.02)。

表12.在扩展研究中被施用安慰剂、1.5mg/m²的GCS-100和30mg/m²的GCS-100的2期患者的基线eGFR(mL/min/1.73m²)的变化。*参与扩展研究的安慰剂治疗患者在盲2期研究中对安慰剂的先前反应(相对于第12周的基线)

参考文献

本文提及的所有出版物和专利，包括下面所列的那些参考文献，通过引用将其全文合并入本文，如同通过引用将每一个单个出版物或专利特别地和单独地合并入本文。在发生矛盾的情况下，可以以本申请，包括本文的任何定义为准。

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等同方案

本领域技术人员将会通过不超过常规的实验认识到，或者能够确定本文所述本发明的特定实施方案的许多等同方案。虽然已经讨论了主题发明的特定实施方案，但上述说明书是举例性质的并非是限制性的。在本说明书描述的基础上，本发明的许多变形方案对于本领域技术人员来说可能都变得是显而易见的。本发明的完整范围应当参考权利要求，以及等同方案和说明书以及这样的变形方案它们的完整范围来确定。这样的等同方案意图被包括在下述权利要求中。

Claims (41)

1.一种用于在患者中治疗肾病的方法，所述方法包括：给所述患者施用至少一种半乳凝素-3抑制剂。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述肾病选自NASH(非酒精性脂肪性肝炎)、肾衰竭、CKD(慢性肾病)、肝肾综合症、酸中毒、ARF(急性肾衰竭)、无生育力、Alport综合症、淀粉样变性、止痛药性肾病变、抗-GBM病(Goodpasture病)、抗-磷脂综合症、动脉粥样硬化栓塞(胆固醇栓塞)、巴特综合症、良性家族性血尿、伯杰氏病、动静脉内瘘、钙化防御、慢性肾盂肾炎(反流性肾病)、CRF(慢性肾衰竭)、慢性肾功能不全、保守治疗、新月体肾炎(RPGN(急进性肾小球肾炎))、膀胱炎、肾囊肿、致密物沉积病或MCGN(小叶性肾炎)、尿崩症、糖尿病性肾病、排尿困难、浮肿、ESRD或ESRF(终末期肾病或终末期肾衰竭)、Fabry病、范可尼综合症、纤维颤动性肾炎、FSGS(局灶节段性肾小球硬化)、Gitelman综合症、肾小球肾炎、血尿、HUS(溶血性尿毒综合症)、肾积水、过敏性紫癜、肝肾综合症、肾上腺样瘤、发育不全、IgA肾病(伯杰氏病)、间质性肾炎、腰痛血尿综合症、恶性高血压、髓质海绵肾、膜性肾病、膜增生性肾小球肾炎、MCGN(小叶性肾炎)、MPA(显微镜下多血管炎)、肾病变、肾病综合症、胡桃夹综合症、少尿、骨营养不良、Page肾、多动脉炎、多囊肾病(PKD)、感染后肾小球肾炎、梅干腹综合症、肾盂肾炎、反流性肾病、肾小管性酸中毒、腹膜后纤维化、肉样瘤病、过敏性紫癜、硬皮病肾危象、干燥综合症、系统性硬化、系统性血管炎、薄GBM病、血栓性血小板减少性紫癜、TTP(血栓性血小板减少性紫癜)、结节性硬化症、尿道炎、血管炎和韦格纳氏肉芽肿。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述患者患有CKD。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述患者患有NASH。

5.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述患者具有约15-44mL/min/1.73m²的基线eGFR(肾小球滤过率)。

6.如权利要求1所述的方法，其中半乳凝素-3抑制剂是改性果胶。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述改性果胶的主链包括同聚半乳糖醛酸和/或鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述改性果胶是去酯化的并且部分解聚的，以具有中断的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖主链。

9.如权利要求6-8任一项所述的方法，其中所述改性果胶具有在50-200kDa之间，优选在80-150kDa之间的平均分子量。

10.如权利要求6-9任一项所述的方法，其中所述改性果胶基本不含有分子量在25kDa以下的改性果胶。

11.如权利要求6所述的方法，其中所述改性果胶是GCS-100。

12.如权利要求6-11任一项所述的方法，其中所述改性果胶通过使改性的或未改性的果胶穿过切向流过滤器来制作。

13.如权利要求6-12任一项所述的方法，包括以约0.1-2mg/m²的剂量施用所述改性果胶。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述剂量是约1.5mg/m²。

15.如权利要求6-12任一项所述的方法，包括以约1-10mg的剂量施用所述改性果胶。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述剂量是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg，优选1、3或9mg。

17.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述半乳凝素-3抑制剂每周施用一次或每两周施用一次。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述半乳凝素-3抑制剂在诱导阶段每周施用一次，然后在维持阶段每两周施用一次。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述诱导阶段是1-3个月，优选2个月。

20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述维持阶段是至少1个月，优选至少3个月，或者甚至六个月或更长。

21.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述至少一种半乳凝素-3抑制剂以降低所述患者血清中尿酸水平的量被施用。

22.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述至少一种半乳凝素-3抑制剂以降低所述患者血清中BUN水平的量被施用。

23.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述至少一种半乳凝素-3抑制剂以引起所述患者中GFR变化的量被施用。

24.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述至少一种半乳凝素-3抑制剂以降低所述患者血清中半乳凝素-3水平的量被施用。

25.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述至少一种半乳凝素-3抑制剂以降低所述患者中半乳凝素-3的表达水平的量被施用。

26.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述至少一种半乳凝素-3抑制剂以降低所述患者中半乳凝素-3的活性的量被施用。

27.如前述权利要求任一项所述的方法，其中半乳凝素-3的浓度、表达水平或活性与对照相比降低0.5、1、2、3、4或5倍。

28.如前述权利要求任一项所述的方法，还包括：1)在施用所述半乳凝素-3抑制剂之前测量所述患者的半乳凝素-3的浓度、水平或活性，和2)在施用所述半乳凝素-3抑制剂之后测量半乳凝素-3的浓度、水平或活性。

29.如权利要求28所述的方法，其中施用所述半乳凝素-3抑制剂之后半乳凝素-3的浓度、水平或活性降低表明半乳凝素-3抑制剂的剂量对于治疗患者的肾病来说是半乳凝素-3抑制剂的有效剂量。

30.如权利要求29所述的方法，其中施用所述半乳凝素-3抑制剂之后半乳凝素-3的浓度、水平或活性升高表明半乳凝素-3抑制剂的剂量对于治疗患者的肾病来说是半乳凝素-3抑制剂的无效剂量。

31.如权利要求30所述的方法，还包括给所述患者施用第二剂量的所述半乳凝素-3抑制剂，所述第二剂量比之前施用的量低。

32.如前述权利要求任一项所述的方法，还包括施用附加的治疗剂。

33.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述附加的治疗剂对于治疗心血管疾病、肾衰竭、癌症、炎症、纤维化或感染是有用的。

34.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述附加的治疗剂选自抗氧化剂，抗炎药物，化疗的、抗感染的、抗菌的或抗纤维化的药物。

35.如前述权利要求任一项所述的方法，包括与所述治疗剂同时施用所述半乳凝素-3抑制剂。

36.如权利要求1-34任一项所述的方法，包括在施用所述治疗剂之后施用所述半乳凝素-3抑制剂。

37.如权利要求1-34任一项所述的方法，包括在施用所述半乳凝素-3抑制剂之后施用所述治疗剂。

38.如前述权利要求任一项所述的方法，包括在至少8周的时间段中施用多个剂量的所述半乳凝素-3抑制剂。

39.如前述权利要求任一项所述的方法，包括每周一次施用所述半乳凝素-3治疗剂。

40.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述半乳凝素-3抑制剂通过注射或静脉输注被施用。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述半乳凝素-3抑制剂通过静脉输注被施用。