DE69931791T2

DE69931791T2 - Pharmazeutische zusammensetzung die ein inhibierendes effekt auf die überproduktion und akkumulation der extrazellulären matrix hat

Info

Publication number: DE69931791T2
Application number: DE69931791T
Authority: DE
Inventors: Tokyo Res. Ctr. Satoshi Teijin Limited Hino-shi SASAKI; Tokyo Res. Ctr. Yoshihiko Teijin Limited Hino-shi SUMI; Reginald Colin National Inst. Med. R London HUGHES
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1998-08-06
Filing date: 1999-08-05
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2019-08-06
Also published as: WO2000007624A3; JP2002522398A; HK1038308A1; EP1104307B1; AU5065399A; EP1104307A2; WO2000007624A2; DE69931791D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine präventive oder therapeutische pharmazeutische Zusammensetzung mit einem inhibierenden Effekt auf die Überproduktion und die Ansammlung von extrazellulärer Matrix, wobei die Zusammensetzung eine Verbindung als einen aktiven Bestandteil umfasst, die die biologische Aktivität von Galektin-3 inhibiert.
TECHNISCHER HINTERGRUND
Galektin-3 ist ein Protein, dass ein Molekulargewicht von etwa 30 Kd hat und zu der Familie der β-Galactosid-bindenden Proteine gehört und es ist ein Lectin, das auf der Zelloberfläche, im Zytoplasma und im Kern des Gewebes weit verbreitet auftritt (siehe z. B. Barondes, S. H. et al., J. Biol. Chem. (1994) 296: 20807-20810, Hughes, R. C. Glycobiology (1994) 4: 5-12, Wang, L. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1995) 217: 292-303, und dergleichen). Es ist bekannt, dass Galektin-3 an einem geeigneten Zuckerkettenabschnitt von auf der Zelloberfläche oder in der extrazellulären Matrix (ECM) vorhandenen Glycoproteinen bindet und dadurch inflammatorische Zellen wie Neutrophile, Basophile oder Makrophagen aktiviert, um die Produktion von Zytokinen von diesen Zellen zu fördern (siehe z. B. Sato, S. et al., J. Biol. Chem. (1994a) 269: 4424-4430, Liu, F. T. Immunol. Today (1993) 14:486-490), oder um den apoptotischen Tod von T-Zellen durch ihre Überexpression zu unterdrücken (siehe Yang, R-Y, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1996) 93: 6737-6742), und es wird angenommen, dass es ein wichtiges Protein verantwortlich für inflammatorische und immunologische Reaktionen ist.
Es wurde ebenfalls vorgeschlagen, dass zelloberflächenexponiertes Galektin-3 an der Bildung von Zellaggregaten beteiligt ist (siehe Probstmeier, R. et al., J. Neurochemistry (1995) 64(6): 2465-2472).
Darüber hinaus ist Galektin-3 ebenfalls bekannt dafür, eine wichtige Rolle in der Bildung und der Reparatur von Gewebe zu spielen, da es während der Schadensreparaturzeit im durch Röntgenbestrahlung induzierten Lungenverletzungs-Rattenmodell hoch exprimiert wird (siehe Kasper, M. et al., J. Pathol. (1996) 179: 309-316) und es spielt möglicherweise eine wichtige Rolle in der Bildung von Nierengewebe in Menschen während des Embryonalstadiums (siehe Winyard, P. J. D. et al., J. Am. Soc. Nephrol. (1997) 8: 1647-1657).
Es wird angenommen, dass die Überproduktion und die Ansammlung von extrazellulärer Matrix (ECM), wie etwa Kollagen, ein wichtiger Faktor für die Pathogenese von Gewebsfibrosen, wie etwa der Leber, der Nieren, der Lunge, des Herzens, der Bauchspeicheldrüse, der Arterien, des Gastrointestinaltraktes, der Schilddrüse, der Speicheldrüsen und der Haut ist (siehe Okada, H. et al., Kidney Int. (1996) 49: Supple. 54: S-37-S-38, Coker, R, K. et al., Eur. Respir. J. (1998) 11(6): 1218-1221 und dergleichen). ECM ist ebenfalls bei der Erhaltung der Homöostase der zellulären Funktionen zusammen mit der Unterstützung der parenchymalen Zellen bei physiologischen Bedingungen, beteiligt. Wenn Geweben geringfügige Verletzungen zugefügt werden, wird die Reparatur der verletzten Gewebe durch die Behandlung der verletzten Gewebe durch phagozytische Zellen im Rahmen von Entzündungs- und Reparaturreaktionen, durch die nachfolgende Regeneration der Parenchymalzellen und den Wiederaufbau des stützenden Substrats, ECM, vervollständigt. Jedoch wenn die Verletzungen schwerwiegend sind oder für längere Zeit andauern, verursacht die Überproduktion und die Ansammlung von ECM schwerwiegende Schäden in den Funktionen des jeweiligen Gewebes. In der Leber z. B. infiltrieren Lymphozyten und Makrophagen zur Peripherie der verletzten Leberzellen, und diese zellulären Infiltrate und Kupferzellen oder vaskulären Endothelialzellen und dergleichen produzieren Zytokine, wie etwa PDGF, TGF-β, etc., welche dann Itozellen, eine Art von ECM-produzierenden Zellen, aktivieren. Die aktivierten Itozellen teilen sich und produzieren ECM in einem Überschuss in den Disse-Raum und verursachen dadurch hepatische Fibrose oder hepatische Zirrhose, welchen nachgesagt wird, ein Endstadium der hepatischen Erkrankungen zu sein. In den Nierenglomeruli werden z. B. Zytokine wie etwa PDGF und TGF-β von den Zellen, die in die Peripherie der verletzten Nierenzellen oder Endothelialzellen in den Glomeruli etc. infiltriert haben, produziert, um die Mesangium-Zellen, welche eine Art von ECM-produzierenden Zellen sind, zu aktivieren. Die aktivierten Mesangium-Zellen teilen sich während sie selbst ebenfalls Zytokine, wie etwa PDGF und TGF-β zusammen mit einem Überschuss an ECM produzieren, und dabei Faktoren schaffen, die verschiedene glomerulare Erkrankungen verursachen, z. B. chronische glomerulare Nephritis, beinhaltend IgA Nephropathie, diabetische Nephropathie, glomerulare Sklerose und dergleichen. Ebenfalls im interstitiellen Gewebe der Niere, aufgrund der Aktivierung von Myofibroblasten, einer Art von ECM-produzierenden Zellen, und der Epithelialzellen der Nierentubuli, produzieren diese Zellen ECM im Überschuss im interstitiellen Bereich der Nierentubuli und bilden Fibrosen des Tubulointerstitiums und reduzieren dadurch wesentlich die Nierenfunktion. Daher beschränken die ECM's, die in jedem Gewebe überproduziert und angesammelt wurden, physisch die zelluläre Funktion jeder Zelle und substituieren die funktionalen Einheiten jedes Gewebes, und verursachen schwerwiegende funktionelle Störungen jedes Organs.
Für die oben genannten Erkrankungen werden Nebennierencorticosteroide, immunosupressive Agenzien, Anti-Blutplättchen Agenzien, Anti-Gerinnungsmittel, antifibrinolytische Agenzien, ACE Hemmer, und dergleichen zur Zeit verwendet, aber keine Arzneimittel zeigen zufriedenstellende Wirksamkeit auf die Überproduktion und die Ansammlung von ECM, und daher besteht ein dringender Bedarf für Agenzien, die einen neuen Wirkmechanismus aufweisen.
Obwohl Galektin-3 hochexprimiert wurde am verletzten Ort des Gewebes in durch Röntgenbestrahlung induzierten Lungenverletzungs-Rattenmodellen, einem Modell für pulmonale Fibrose, wurde nicht geklärt, ob es die Überproduktion und die Ansammlung von ECM, wie etwa Kollagen, und das Überleben der Mesangiumzellen, die eine Art von ECM-produzierenden Zellen sind, regulieren kann. Dementsprechend ist es nicht bekannt, ob die Inhibierung der Wirkung von Galektin-3 die Überproduktion und die Ansammlung von ECM inhibieren kann und dadurch eine therapeutische und/oder präventive Nützlichkeit für glomerulare Nephritis, diabetische Nephropathie oder Gewebsfibrose aufweist.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Verwendung einer Verbindung bereitzustellen, die Galektin-3 bindet, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von glomerularer Nephritis, diabetischer Nephropathie oder Gewebefibrose wie in den Ansprüchen definiert.
Unter Berücksichtigung des Standes der Technik der konventionellen Technologie haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung intensive Studien durchgeführt und herausgefunden, dass Galektin-3 ein Molekül ist, das die Überproduktion und die Ansammlung von ECM, wie etwa Kollagen, regulieren kann, und ein Molekül ist, das das Überleben von den Mesangiumzellen, welche eine Art von ECM-produzierenden Zellen sind, regulieren kann, und haben ebenfalls herausgefunden, dass Substanzen, die die biologische Aktivität von Galektin-3 inhibieren, die Überproduktion und die Ansammlung von ECM, wie etwa Kollagen, regulieren können.
Dies deutet darauf hin, dass Verbindungen, die die biologische Aktivität von Galektin-3 inhibieren, ein therapeutisches oder präventives Agenz für glomerulare Nephritis, diabetische Nephropathie oder Gewebsfibrose sein können, deren Ursache die Überproduktion und die Ansammlung von extrazellulärer Matrix ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Veränderung in der Expression von Galektin-3 in dem anti-Thy-1.1 antikörperinduzierten Ratten-Nephritis-Modell.

A: Die Niere jener Ratten, die keinen anti-Thy-1.1-Antikörper erhalten haben, B: Tag 8 nach der Verabreichung des Anti-Thy-1.1-Antikörpers, C und D: Tag 14 nach der Verabreichung des Anti-Thy-1.1-Antikörpers.

Der Stern in der Fig. zeigt eine repräsentative Macula-Densa-Region, m eine repräsentative Mesangiumregion, c eine repräsentative Halbmondkörper bildende Region, das geschlossene Pfeilende eineb repräsentativen distalen Nierentubulus, der geschlossene Pfeil einen repräsentativen proximalen interstitielles Nierentubulus und der offene Pfeil einen repräsentativen infiltrierten Makrophagen oder Fibroblasten.
2 zeigt eine Veränderung in der Expression von Galektin-3 im UUO-Rattenmodell.

A: kontralaterale Niere, B: blockierte Niere

Der Stern in der Fig. zeigt eine repräsentative Macula-Densa-Region, das geschlossene Pfeilende einen repräsentativen distalen Nierentubulus und der offene Pfeil einen repräsentativen infiltrierten Makrophagen oder Fibroblasten.
3 zeigt wie die Aktivität von Galektin-3 den zellulären Tod der Mesangiumzellen inhibiert.
4 zeigt wie die Aktivität von Galektin-3 die Produktion von Kollagen Typ IV durch die Ratten-Mesangiumzellen fördert.
5 zeigt die Unterdrückung der Aktivität von Galektin-3 die Produktion von Kollagen Typ-IV Produktion durch die Ratten-Mesangiumzellen zu fördern durch Galektin-3-bindendes inhibierendes Glycoprotein.
6 zeigt die Unterdrückung der Aktivität von Galektin-3 die Produktion von Kollagen Typ-IV Produktion durch die Ratten-Mesangiumzellen zu fördern durch Galektin-3-bindenden inhibierenden Zucker.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Verbindungen die binden, um die biologische Aktivität von Galektin-3 zu inhibieren für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung beinhalten z. B. die folgenden:

(1) Anti-Galektin-3-Antikörper: Maus-Anti-Galektin-3 monoklonaler Antikörper (z. B. ein Antikörper beschrieben in Lui, F. T., Et al., J. Biol. Chem. (1996) 35: 6073-6079);
(2) Inhibitoren der Galektin-3-Bindung: Zucker an welche Galektin-3 binden kann, wie etwa Galβ1-4GIc, Galβ1-4GlcNAc, Fucα1-2Galβ1-4Glc, Galα1-3Galβ1- 4GlcNAc, Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4(Fucα1-3)Glc, Fucα1-2(GlcNAcα1-3)Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, NeuNAcα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, NeuNAcα2-6Galβ1- 4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-3(NeuNAcα2-6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-3GlcNAcβ1-3)Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-2)Manα1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAc, Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-4(Galβ1-4GlcNAcβ1-2)Manα1-3)Manβ1-4GlcNAc, GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAc, Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-4(Galβ1-4GlcNAcβ1-2)Manα1-3)Manβ1-4GlcNAc, Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-2)Manα1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-4(Galβ1-4GlcNAcβ1-2)Manα1-3)Manβ1-4GlcNAc, und Blutgruppe-B-artige Zuckerketten, oder Glykolipide umfassend die obengenannten Zucker, oder Glykoproteine mit Zuckerketten auf der Zelloberfläche an die Galektin-3 binden kann, oder Fragmente davon, wie etwa Fetuin, Asialofetuin, Transferrin, Asialotransferrin, α1-Säure-Glycoprotein, Asialo-α1-Säure-Glycoprotein, Laminin, Fibronektin, CD11b, Lamp-1, Lamp-2, Mac-3, CD98, neutrophiles115-kD-Protein, neutrophiles 180-kD-Protein (NCA-160/CD66), hochaffiner IgE-Rezeptor, Fc ε R1, und dergleichen (siehe z. B. Feizi, T. et al., Biochemistry (1994) 33: 6342-6349, Sato, S., et al., J. Biol. Chem. (1992) 267: 6983-6990).

Verbindungen die Galektin-3 binden für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung können gestaltet werden, um pharmazeutische Zusammensetzungen mit einem inhibierenden Effekt auf die Überproduktion und die Ansammlung von ECM herzustellen, durch das Vermengen der Verbindungen als aktive Bestandteile mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann therapeutische oder präventive Agenzien sein, umfassend die Verbindung und pharmazeutisch akzeptable Träger.
Erkrankungen, die durch die Überproduktion und die Ansammlung von ECM verursacht werden, beinhalten glomerulare Nephritis, diabetische Nephropathie oder Gewebsfibrose und beinhalten ebenfalls glomerulare Nephritis, diabetische Nephropathie oder Gewebsfibrose, die von der anormalen Vermehrung der Mesangiumzellen abgeleitet sind.
Wie hier verwendet, können pharmazeutisch akzeptable Träger jene, die identisch mit den unten genannten Arzneimittelträgern sind, beinhalten. Die vermengten Mengen einer Verbindung, die die biologische Aktivität von Galektin-3 inhibiert und eines Trägers, folgen ausnahmslos der Dosis des weiter unten genannten aktiven Bestandteils und kann weitgehend ausgewählt werden. Die Menge einer Verbindung, die die biologische Aktivität von Galektin-3 inhibiert beträgt für gewöhnlich 1 bis 70 Gewichts-% und bevorzugt 5 bis 50 Gewichts-% in der gesamten Zusammensetzung.
Die so erhaltene Zusammensetzung kann bereitgestellt sein als ein orales Präparat, wie etwa eine weiche Kapsel, eine harte Kapsel, eine Tablette, Granulat, Pulver, eine Suspension, eine Flüssigkeit, ein Sirup etc., eine Injektion, ein Zäpfchen, oder ein externes Präparat unter Verwendung eines geeigneten Arzneimittelträgers in einem bekannten Verfahren.
Solche Arzneimittelträger beinhalten z. B. Pflanzenöle (z. B. Maiskeimöl, Baumwollsamenöl, Kokosnussöl, Mandelöl, Erdnussöl, Olivenöl und dergleichen), ölige Ester, wie etwa Glyceridöle mit mittelkettigen Fettsäuren, Mineralöl, Glycerinester, wie etwa Tricaprylin und Triacetin, Alkohole wie etwa Ethanol, physiologische Saline, Propylenglykol, Polyethylenglykol, Vaseline, tierische Fette, Zellulosederivate (kristalline Zellulose, Hydroxypropyl-Zellulose, Hydroxypropylmethyl-Zellulose, Methyl-Zellulose), Polyvinylpyrrolidon, Cyclodextrin, Dextrin, Laktose, Mannitol, Sorbitol, Stärke und dergleichen.
Die Dosis des aktiven Bestandteils, obwohl abhängig vom Grad der Erkrankung und dem Alter des Patienten etc., ist in etwa 0,01 mg bis 1000 mg pro Tag pro Kopf, bevorzugt 1 mg bis 200 mg pro Tag pro Kopf. Es ist gewünscht, dass die Rezepturen diese Bedingungen erfüllen.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erklärt, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese Beispiele in irgendeiner Weise beschränkt.
Beispiel 1. Veränderung in der Expression von Galektin-3 im Ratten-Nephritis-Modell induziert durch anti-Thy1.1-Antikörper
Hasen-Anti-Thy-1.1-Antiserum wurde durch die subkutane Immunisierung von Hasen auf dem Rücken mit aus Rattenthymuszellen aufgereinigtem Thy-1.1-Antigen erhalten. Das Ratten-Nephritis-Modell induziert durch Anti-Thy-1.1-Antikörper wurde hergestellt durch das intravenöse Verabreichen von 0,25 ml des obengenannten Hasen-Anti-Thy-1.1-Antiserums 2fach verdünnt in phosphatgepufferter Saline in die Schwänze von Sprague-Dawley-Ratten zusammen mit 0,25 ml von normalem Hasenkompliment (Sigma) gemäß dem Verfahren von Okuda et al. (Okuda S., et al., J. Clin. Invest. (1990) 86: 453-462). Die Ratten wurden am Tag 3, 7 und 14, nach der Verabreichung des Antikörpers geopfert und die Nieren wurden aus jeder Ratte nach Perfusion mit phosphatgepufferter Saline extrahiert. Die extrahierten Nieren wurden in 4 % (Gewicht/Volumen) phosphatgepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingelegt, und Gewebeschnitte wurden für das Immunfärben präpariert. Das Immunfärben der Gewebeschnitte wurde durchgeführt durch die Verwendung von affinitätsgereinigten Hasen-Anti-Galektin-3-Antikörper als den primären Antikörper, peroxidasegelabeltem Ziegen-Anti-Hasen-Antikörper (Sigma) als den zweiten Antikörper und DAB (Sigma: DAB Tablette) als das chromogene Substrat.
Das Ergebnis der Immunfärbung der Gewebeschnitte ist in 1 gezeigt. Es wurde bestätigt, dass in jenen Ratten, die keinen Anti-Thy-1.1-Antikörper erhalten haben, eine geringe Menge von Galektin-3 im distalen Nierentubulus und der Makula-Densa-Region des Glomerulus vorhanden war, während in jenen Ratten, die Anti-Thy-1.1-Antikörper erhalten haben, eine große Menge von Galektin-3 im distalen und im proximalen Nierentubulus und dem Glomerulus am Tag 8 und 14 nach der Antikörperverabreichung beobachtet wurde. Es wurde ebenfalls bestätigt, dass am Tag 14 infiltrierte Makrophagen und Fibroblasten mit Galektin-3 in der präfibrotischen Region des Tubulo-Interstitiums koexistent waren. Dieses Ergebnis bestätigt, dass die Expression von Galektin-3 zur Zeit der Pathogenese in Ratten-Nephritis-Modellen induziert durch Anti-Thy-1.1-Antikörper gesteigert ist, und da Galektin-3 koexistent war mit infiltrierten Makrophagen oder Fibroblasten, die eine Art von ECM-produzierenden Zellen sind und von denen angenommen wird, dass sie die Überproduktion von ECM in der präfibrotischen Region induzieren, ist stark anzunehmen, dass Galektin-3 in der Bildung von Fibrosen involviert ist.
Beispiel 2. Veränderung in der Galektin-3 Expression im unilateralen-ureteralenobstruktions(UUO)-behandelten Ratten-Interstitialen-Fibrose-Modell
Weibliche Sprague-Dawley-Ratten (um die 8 Wochen alt zu Beginn des Experiments) wurden verwendet. Unter Anästhesie mit Pentobarbital wurde eine komplette ureterale Obstruktion der linken Niere durch Abbinden des Harnleiters mit 4-0 Seidenfaden an zwei Punkten und Schneiden zwischen den Abbindungen, hergestellt. Die linken Nieren jeder Ratte mit UUO wurden als blockierte Nieren geerntet und die rechten Nieren als kontralaterale Nieren nach Perfusion mit phosphatgepufferter Saline unter Diethyl-Ether Anästhesie nach 10 Tagen nach der Operation. Die geernteten Nieren wurden mit 4 % (Gewicht/Volumen) phosphatgepuffertem Paraformaldehyd über Nacht fixiert und in 70 %iges Ethanol transferriert. Die fixierten Nieren wurden in Paraffin eingebettet und für das Immunfärben geschnitten. Das Immunofärben der Gewebeschnitte wurde durchgeführt unter Verwendung eines affinitätsgereinigten Hasen-Anti-Galektin-3-Antikörpers als den primären Antikörper, eines peroxidasegelabelten Ziegen-Anti-Hasen-Antikörper (Sigma) als den sekundären Antikörper und DAB (Sigma: DAB Tablette) als das chromogene Substrat.
Das Ergebnis der Immunfärbung der Gewebeschnitte ist in 2 gezeigt. Das UUO-Modell, in welchem die Überproduktion und die Ansammlung von ECM, wie etwa Kollagen, in der interstitiellen Region des Nierentubulus beobachtet wird, ist ein gut bekanntes Modell, das interstitielle Fibrose induziert (siehe Wright, E. J., et al., Lab. Invest. (1996) 74: 528-537, Yamate, J., et al., Toxicol. Pathol. (1998) 26: 793-801 und dergleichen). In den kontralateralen Nieren ist eine geringe Menge von Galektin-3 im distalen Nierentubulus und der Macula-Densa-Region des Glomerulus vorhanden, während in den blockierten Nieren infiltrierte Makrophagen und Fibroblasten koexistent mit Galektin-3 in der fibrotischen Region des Tubulo-Interstitiums waren. Dieses Ergebnis deutet stark darauf hin, dass Galektin-3 in der Bildung von Fibrose involviert ist, da Galektin-3 koexistent mit infiltrierten Makrophagen oder Fibroblasten war, welche eine Art von ECM-produzierenden Zellen sind und von denen angenommen wird, dass sie die Überproduktion von ECM in der fibrotischen Region induzieren.
Beispiel 3. Suppressive Aktivität von Galektin-3 auf den Zelltod von Ratten-Mesangiumzellen
Ratten-Mesangiumzellen wurden aus Sprague-Dawley-Ratten nach dem Verfahren nach Striker et al. getrennt (Striker, G. E., et al., Lab. Invest. (1985) 53; 123-128). Die getrennten Ratten-Mesangiumzellen wurden bei 37°C unter Vorhandensein von 5 % CO₂ in den Wells einer 96-Well Platte kultiviert, unter Verwendung eines Essentialmediums (DMEM/F12 (1:1) Kulturmedium beinhaltend 60 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, hergestellt von Gibco BRL) angereichert mit 10 % fötalem bovinen Serum. Nach Kultivierung bis zur Semikonfluenz wurden die kultivierten Ratten-Mesangiumzellen mit dem Essentialmedium gewaschen, für 2 Tage in dem Essentialmedium angereichert mit 0,1 % bovinem Serumalbumin (Sigma) kultiviert und wurden dann weiter kultiviert für ein bis vier Tage im Essentialmedium angereichert mit 0,1 % bovinem Serumalbumin (Sigma) beinhaltend 0 oder 50 μg/ml Galektin-3 und 0 oder 0,4 ng/ml TGF-β. Am Tag 1, 2, 3 und 4 nach Zugabe von Galektin-3 und TGF-β wurde die Menge der kultivierten Ratten-Mesangiumzellen, die in ihren jeweiligen Wells überlebt haben, gemessen, wobei als ein Index die Konvertierung von MTS-Tetrazolium (Cell Titer 96 Aqueous one Lösung hergestellt von Promega) zu Formazan durch die lebenden Zellen verwendet wurde.
Das Ergebnis ist in 3 gezeigt. Sowohl bei Vorhandensein als auch in Abwesenheit von TGF-β wurde Galektin-3 bestätigt, den zellulären Tod der Ratten-Mesangiumzellen, einer Art von ECM-produzierenden Zellen, zu supprimieren.
Beispiel 4. Fördernder Effekt von Galektin-3 auf die Kollagen-Typ-IV-Produktion durch Mesangiumzellen
Ratten-Mesangiumzellen wurden in ähnlicher Weise wie der von Beispiel 3 aufgetrennt. Die aufgetrennten Mesangium-Zellen wurden bei 37°C unter Vorhandensein von 5 % CO₂ in den Wells einer 96-Well Platte kultiviert, unter Verwendung eines Essentialmediums (DMEM/F12 (1:1) Kulturmedium beinhaltend 60 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, hergestellt von Gibco BRL) angereichert mit 10 % fötalem bovinen Serum. Nach Kultivierung bis zur Konfluenz wurden die kultivierten Ratten-Mesangiumzellen mit dem Essentialmedium gewaschen, für 1 bis 2 Tage in dem Essentialmedium angereichert mit 0,1 % bovinem Serumalbumin (Sigma) kultiviert und wurden dann für weitere 3 Tage im Essentialmedium angereichert mit 0,1 % bovinem Serumalbumin (Sigma) beinhaltend 0, 10 oder 30 μg/ml Galektin-3 und 0, 0,1, 0,4 oder 1,6 ng/ml TGF-β kultiviert. Am Tag 3 nach Zugabe von Galektin-3 und TGF-β wurde die Menge des in der Kulturflüssigkeit angesammelten Typ-IV-Kollagen unter Verwendung eines Sandwich-ELISA-Verfahrens gemessen, das einen Ziegen-Anti-Typ-IV-Kollagen-Antikörper als den immobilisierten Antikörper, und einen Biotin-gelabelten Ziegen-Anti-Typ-IV-Kollagen-Antikörper (Chemicon) als den primären Antikörper verwendet. Die Menge von Typ-IV-Kollagen in der Kulturflüssigkeit jedes Wells wurde normalisiert durch Dividieren der Menge durch die Menge der lebenden Zellen in jedem Well bestimmt in einer ähnlichen Weise wie jener beschrieben in Beispiel 3.
Das Ergebnis ist in 4 gezeigt. Es wurde bestätigt, dass Galektin-3 die Produktion und/oder die Ansammlung von Typ-IV-Kollagen, welches eine Art von ECM ist, von den Ratten-Mesangiumzellen, welche eine Art von ECM-produzierenden Zellen sind, fördert, in einer ähnlichen Weise zu und in einer additiven Weise mit TGF-β.
Beispiel 5. Inhibierung der Förderung von Galektin-3 auf die Kollagen-Typ-IV-Produktion durch Ratten-Mesangiumzellen unter Verwendung eines Glykoproteins, das die Galektin-3 Bindung inhibiert
Ratten-Mesangiumzellen wurden in einer ähnlichen Weise wie der von Beispiel 2 aufgetrennt. Die aufgetrennten Ratten-Mesangiumzellen wurden bei 37°C unter Vorhandensein von 5 % CO₂ in den Wells einer 96-Well Platte kultiviert, unter Verwendung eines Essentialmediums (DMEM/F12 (1:1) Kulturmedium beinhaltend 60 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, hergestellt von Gibco BRL) angereichert mit 10 % fötalem bovinen Serum. Nach Kultivierung bis zur Konfluenz wurden die kultivierten Ratten-Mesangiumzellen mit dem Essentialmedium gewaschen, für 1 bis 2 Tage in dem Essentialmedium angereichert mit 0,1 % bovinem Serumalbumin (Sigma) kultiviert und wurden dann für weitere 4 Tage im Essentialmedium angereichert mit 0,1 % bovinem Serumalbumin (Sigma) beinhaltend 10 μg/ml von Galektin-3 und 0, 0,1, 0,2, 0,5 oder 1,5 mg/ml Fetuin Glykoprotein, welches ein Substrat ist, das bekannt ist Galektin-3 Bindungen zu inhibieren, kultiviert (siehe z. B. Sato, S. et al., J. Biol. Chem. (1992) 267: 6983-6990). Am Tag 4 nach Zugabe von Galektin-3 und Fetuin wurde die Menge des in der Kulturflüssigkeit von jedem Well angesammelten Typ-IV-Kollagens unter Verwendung eines Sandwich-ELISA-Verfahrens gemessen, das einen Ziegen-Anti-Typ-IV-Kollagen-Antikörper (Chemicon) als den immobilisierten Antikörper und einen Biotin-gelabelten Ziegen-Anti-Typ-IV-Kollagen-Antikörper (Chemicon) als den primären Antikörper verwendet. Die Menge von Typ-IV-Kollagen in der Kulturflüssigkeit jedes Wells wurde normalisiert durch Dividieren der Menge durch die Menge der lebenden Zellen in jedem Well bestimmt in einer ähnlichen Weise wie jener beschrieben in Beispiel 3.
Das Ergebnis ist in 5 gezeigt. Es wurde bestätigt, dass ein Glykoprotein mit hohem Molekulargewicht, das die Galektin-3 Bindung inhibiert, die Förderung der Produktion und/oder die Ansammlung von Typ-IV-Kollagen, welches eine Art von ECM ist, von den Ratten-Mesangiumzellen, welche eine Art von ECM-produzierenden Zellen sind, durch die Zugabe von Galektin-3, unterdrückt.
Beispiel 6. Inhibierung des Effekts von Galektin-3 auf die Förderung von Kollagen-Typ-IV-Produktion durch Ratten-Mesangiumzellen durch Galektin-3-bindenden inhibierenden Zucker
Ratten-Mesangiumzellen wurden in einer ähnlichen Weise wie der von Beispiel 3 beschrieben aufgetrennt. Die aufgetrennten Ratten-Mesangiumzellen wurden bei 37°C in Vorhandensein von 5 % CO₂ in den Wells einer 96-Well Platte kultiviert, unter Verwendung eines Essentialmediums (DMEM/F12 (1:1) Kulturmedium beinhaltend 60 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, hergestellt von Gibco BRL) angereichert mit 10 % fötalem bovinen Serum. Nach Kultivierung bis zur Konfluenz wurden die kultivierten Ratten-Mesangiumzellen mit dem Essentialmedium gewaschen, für 1 bis 2 Tage in dem Essentialmedium angereichert mit 0,1 % bovinem Serumalbumin (Sigma) kultiviert und wurden dann für weitere 2 Tage im Essentialmedium angereichert mit 0,1 % bovinem Serumalbumin (Sigma) beinhaltend 0,4 μg/ml von Galektin-3 und 0, 0,25, 0,5, 1 oder 2 mM Lacto-n-Fucopentaose I, welche eine bekannte Galektin-3-bindungshemmende Substanz ist, kultiviert (LNFP-1, siehe z. B. Sato, S. et al., J. Biol. Chem. (1992) 267: 6983-6990). Am Tag 2 nach Zugabe von Galektin-3 und LNFP-I wurde die Menge des in der Kulturflüssigkeit von jedem Well angesammelten Typ-IV-Kollagens unter Verwendung eines Sandwich-ELISA-Verfahrens gemessen, das einen Ziegen-Anti-Typ-IV-Kollagen-Antikörper (Chemicon) als einen immobilisierten Antikörper und einen Biotin-gelabelten Ziegen-Anti-Typ-IV-Kollagen-Antikörper (Chemicon) als einen primären Antikörper verwendet. Die Menge von Typ-IV-Kollagen in dem Kulturmedium jedes Wells wurde normalisiert durch Dividieren der Menge durch die Menge der lebenden Zellen in jedem Well bestimmt in einer ähnlichen Weise wie jener beschrieben in Beispiel 4.
Das Ergebnis ist in 6 gezeigt. Es wurde bestätigt, dass ein Zucker mit geringem Molekularglewicht, der die Galektin-3 Bindung inhibiert, die Förderung der Produktion und/oder die Ansammlung von Typ-IV-Kollagen, welches eine Art von ECM ist, von den Ratte-Mesangiumzellen, welche eine Art von ECM-produzierenden Zellen sind, bei der Zugabe von Galektin-3, unterdrückt.
Wie oben beschrieben, wurde gezeigt, dass Galektin-3 eine gesteigerte Expression während der Pathogenese in dem Anti-Thy-1.1-Antikörper induzierten Ratten-Nephritis-Modell, einem Tiermodell von mesangialer proliferativer Glomerulonephritis, (Beispiel 1) aufweist, und es wurde daher nahegelegt, dass Galektin-3 in der Pathogenese von mesangialer proliferativer Glomerulonephritis involviert ist. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass in dem Anti-Thy-1.1-Antikörper induzierten Ratten-Nephritis-Modell und in den blockierten Nieren des UUO-Rattenmodels Galektin-3 mit infiltrierten Makrophagen und Fibroblasten in der präfibrotischen oder fibrotischen Region des Tubulo-Interstitiums koexistent ist (Beispiel 1 und 2). Dieses Ergebnis deutet stark darauf hin, dass Galektin-3 in der Bildung von Fibrose involviert ist, weil Galektin-3 koexistent war mit infiltrierten Makrophagen und/oder Fibroblasten, einer Art von ECM-produzierenden Zellen, von denen angenommen wird, dass sie die Überproduktion von ECM in der präfibrotischen oder fibrotischen Region induzieren. Es wurde weiters gezeigt, dass Galektin-3 den zellulären Tod der Mesangiumzellen, einer Art von ECM produzierenden Zellen (Beispiel 3), inhibiert, und dass es die Produktion und/oder die Ansammlung von ECM von den ECM-produzierenden Zellen (Beispiel 4), fördert. Es wurde ferner gezeigt, dass eine Substanz, die die biologische Aktivität von Galektin-3 inhibiert, die Förderung der Produktion und/oder der Ansammlung von ECM von ECM-produzierenden Zellen durch Galektin-3 (Beispiel 5 und 6) unterdrückt.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Die Verwendung der vorliegenden Verwendung kann als ein therapeutisches oder präventives Agenz für glomerulare Nephritis, diabetische Nephropathie oder Gewebefibrose klinisch anwendbar sein.

Claims

Verwendung einer Verbindung, die Galektin-3 bindet, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von glomerularer Nephritis, diabetischer Nephropathie oder Gewebefibrose, wobei die Verbindung, die Galektin-3 bindet, ein Inhibitor der Galektin-3-Bindung ist und ausgewählt ist aus: i) einem Zucker, an den Galektin-3 binden kann; ii) einer Blutgruppe-B-artigen Zuckerkette; iii) einem Glykolipid, umfassend einen Zucker, an den Galektin-3 binden kann; iv) einem Glykoprotein, umfassend einen Zucker, an den Galektin-3 binden kann; v) einem Fragment des Glykoproteins von Bestandteil iv); und vi) einem Anti-Galektin-3-Antikörper.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Zucker von Bestandteil i), iii) oder iv) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAc, Fucα1-2Galβ1-4Glc, Galα1-3Galβ1-4GlcNAc, Galβ1-3GlcNAcβ-1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ-3(Fucα1-4)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4(Fucα1-3)Glc, Fucα1-2(GlcNAcα1-3)Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, NeuNAcα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, NeuNAcα2-6-Galβ1-4GlcNacβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ-3(NeuNAcα2-6)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-3-GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-3GlcNAcβ1-3)Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-2)Manα1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAc, Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-4(Galβ1-4GlcNAcβ1-2)Manα1-3)Manβ1-4GlcNAc, GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galα-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3)Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAc, Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-4(Galβ1-4GlcNAcβ1-2)Manα1-3)Manβ1-4GlcNAc, und Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-2)Manα1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-4(Galβ1-4GlcNAcβ1-2)Manα1-3)Manβ1-4GlcNAc.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Glykoprotein von Bestandteil iv) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Fetuin, Asialofetuin, Transferrin, Asialotransferrin, α1-Säure-Glykoprotein, Asialo-α1-Säure-Glykoprotein, Laminin, Fibronektin, CD11b, Lamp-1, Lamp-2, Mac-3, CD98, neutrophilem 115-kD-Protein, neutrophilem 180-kD-Protein (NCA-160/CD66), hochaffinem IgE-Rezeptor oder Fc ε R1.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die glomerulare Nephritis, diabetische Nephropathie oder Gewebefibrose durch die abnorme Proliferation von Mesangiumzellen verursacht ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Behandlung therapeutisch ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Behandlung präventiv ist.