DE69535593T2

DE69535593T2 - Verwendung von hgf zur herstellung eines arzneimittels zur behandlung von lungenfibrose

Info

Publication number: DE69535593T2
Application number: DE69535593T
Authority: DE
Inventors: Toshikazu Nakamura; Akira Shiota; Nobuaki Ishibashi Heights 201 FUJISE; Mitsuo Namiki
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1995-04-25
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2015-04-26
Also published as: EP0784980A4; EP1776959A2; JP3818322B2; EP0784980B1; US6303126B1; DE69535593D1; ATE372781T1; WO1995029694A1; JPH07300426A; EP2163254A1; EP1776959A3; US5840311A; EP0784980A1; ES2289742T3

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF) zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Lungenfibrose.
Stand der Technik
Fibrose ist eine Krankheit, die durch die übermäßige Anhäufung einer Bindegewebskomponente charakterisiert ist, und eine solche, die eine auffällige Komponente bei der Fibrose ist, ist Kollagen. Die Anhäufung von Kollagen erfolgt in einer Vielfalt von Viszera, sie ruft z.B. eine Lungenfibrose in der Lunge und eine Leberfibrose in der Leber hervor. Auch in der Haut z.B. ruft die Anhäufung von Kollagen Erkrankungen hervor, wie die Hautkeloidbildung.
In vielen Fällen ist die Nettoanhäufung von Kollagen bei der Fibrose das Ergebnis eines Missverhältnisses zwischen Faktoren, die eine Zersetzung und Produktion von Kollagen hervorrufen.
Obwohl verschiedene medizinische Behandlungen durchgeführt wurden, um die Fibroseerkrankung und Fibrosekrankheit zu behandeln, dienten sie hauptsächlich zur symptomatischen Therapie der Erkrankung im Allgemeinen und betrafen nicht solche, die auf die Lösung der Pathogenese abzielen, nämlich das Missverhältnis zwischen Metabolismusfaktoren, die die Zersetzung und Produktion von Kollagen und der anderen Bindegewebskomponente steuern. Daher stellten diese Therapien kein speziell wirksames Verfahren hinsichtlich einer Gewebereparatur dar. Obwohl z.B. lokales Corticosteroid zur Behandlung des anfänglichen Entzündungsstadiums der Hautkeloidbildung verwendet wurde und sich in gewissem Maße ein Erfolg einstellte, hat eine solche Steroid-Behandlung eine geringe oder keine Auswirkung auf das spätere Fibrose-Stadium, wie im Fall der tatsächlichen Keloidbildung als Ergebnis einer übermäßigen Kollagenbildung.
Wie oben beschrieben wurde, existiert gemäß Stand der Technik kein sicheres und wirksames Verfahren, das spezifische Fibrose-Erkrankungen beim Menschen behandelt, die Bildung von Fasergewebe hemmt und den vorher gebildeten Herd einer Fibrose reduziert oder vollständig entfernt.
US-A-5004805 , EP-A-0462549 , ODENTHAL, M. (1) ET AL: 'Cellular distribution of HGF-synthesis in rat liver upon acute intoxication and fibrosis' PATHOLOGY RESEARCH AND PRACTICE, (1994) Band. 190, Nr. 3, Seite 238–239. MEETING INFO.: 78TH MEETING OF THE GERMAN SOCIETY OF PATHOLOGY ZURICH, SWITZERLAND 5.–9. APRIL 1994, XP002123899, GARABEDIAN, H.D. (1) ET AL: 'Recombinant hepatocyte growth factor accelerates endothelial cell regrowth in vivo following arterial injury'. CIRCULATION. (1995) Band. 92 Nr. 8 SUPPL., Seite 1750. MEETING INFO.: 68TH SCIENTIFIC SESSION OF THE AMERICAN HEART ASSOCIATION ANAHEIM, CALIFORNIA, USA 13.–16. NOVEMBER 1995, XP002022818, EP-A-0492614 , JP-A-6172207 und JP-A-5213733 offenbaren pharmazeutische Zusammensetzungen, die HGF umfassen.
US-A-5,004,805 und Odenthal, M. et al offenbaren die Verwendung von HGF zur Behandlung von Leberzirrhose/fibrose. EP-A-0462549 lehrt die Verwendung von HGF bei Zuständen chronischer Nephritis. EP-A-0492614 offenbart die Verwendung von HGF für die nachoperative Wiederherstellung der Haut, um eine Narbenbildung zu vermeiden.
Die durch die vorliegende Erfindung zu lösende Aufgabe besteht darin, ein die Kollagen-Zersetzung beschleunigendes Mittel bereitzustellen, das die Zersetzung einer Kollagenmatrix von übermäßig angehäuftem Bindegewebe im Gewebe einleiten kann, und insbesondere ein therapeutisches Mittel bereitzustellen, das zur Behandlung von Lungenfibrose (nachstehend als "Fibroseerkrankung" bezeichnet) brauchbar ist.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben intensive Untersuchungen durchgeführt, um die oben beschriebene Aufgabe zu lösen. Als Ergebnis fanden die Erfinder, dass HGF zur Förderung der Zersetzung von Kollagen wirksam ist und zur Behandlung einer Lungenfibrose-Erkrankung wirksam ist, und zwar basierend auf seiner Wirkung; und dadurch wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF) zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Lungenfibrose.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das den Medizin-Verabreichungszeitplan im Beispiel 1 zeigt.
2 ist ein Diagramm, das den Medizin-Verabreichungszeitplan im Test A des Beispiels 2 zeigt.
3 ist ein Diagramm, das den Medizin-Verabreichungszeitplan im Test B des Beispiels 2 zeigt.
4 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der GOT-, GPT- und γ-GTP-Messungen im Test A des Beispiels 2 zeigt.
5 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der GOT-, GPT- und Hepaplastein-Tests und die Messung des Leber-Hyp (Hydroxyprolin)-Gehalts im Test B des Beispiels 2 zeigt.
6 ist eine graphische Darstellung, die den Überlebenseffekt von HGF bei einer Leberfibrose von Ratten im Test A von Beispiel 3 (nicht gemäß der Erfindung) zeigt. In 6 gibt die punktierte Linie eine Gruppe (Kontrollgruppe, n = 10) an, die physiologische Kochsalzlösung erhält, gibt die gestrichelte Linie eine Gruppe (n = 5) an, die HGF in einer Dosis von 50 μg/kg Körpergewicht erhält und gibt die durchgezogene Linie eine Gruppe (n = 5) an, die HGF in einer Dosis von 200 μg/kg Körpergewicht erhält.
7 ist eine Photographie, die den Leberfibrose-lindernden Effekt von HGF bei Ratten mit Leberfibrose im Test B des Beispiels 3 (nicht gemäß der Erfindung) zeigt.
8 ist eine graphische Darstellung, die den Anteil (%) von Fasergewebe jeder einzelnen Leber im Beispiel 4 zeigt (nicht gemäß der Erfindung).
Beste Arten zur Durchführung der Erfndung
Als in der vorliegenden Erfindung zu verwendender HGF können durch verschiedene Verfahren hergestellte Verbindungen verwendet werden, wenn sie in dem Maße gereinigt werden, dass sie als Medizin verwendet werden können.
Viele Verfahren zur Herstellung von HGF sind bekannt, und HGF kann z.B. durch Extraktion und Reinigung aus Organen, wie Leber, Milz, Lunge, Knochenmark, Gehirn, Niere, Plazenta und dergleichen, Blutzellen, wie Plättchen, Leukozyten und dergleichen, Plasma und Serum von Säugern, wie Ratte, Rind, Pferd, Schaf und dergleichen erhalten werden (FEBS Letters, 224, 312, 1987; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5844, 1989).
Es ist auch möglich, HGF durch Kultivieren von Primärkulturzellen oder Zelllinien, die HGF erzeugen, und anschließende Abtrennung und Reinigung aus dem Kulturprodukt (z.B. Kulturüberstand, kultivierte Zelle usw.) zu erhalten. Weiterhin kann HGF nach einem gentechnischen Verfahren erhalten werden, das das Klonen des Gens, das HGF codiert, das Einsetzen desselben in einen geeigneten Vektor, die Transfektion des Vektors unter Erhalten einer Transformanten und die Isolierung des gewünschten rekombinanten HGF aus dem Kulturüberstand der Transformanten umfasst (z.B. Nature, 342, 440, 1989; Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967, 1989). Die Wirtszelle ist nicht speziell eingeschränkt, und verschiedene Wirtszellen, die üblicherweise bei gentechnischen Verfahren verwendet werden, können verwendet werden, z.B. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hefe, Fadenpilze und Pflanzen- oder Tierzellen.
Insbesondere besteht das Verfahren der Extraktion und Reinigung von HGF aus frischen Geweben z.B. darin, einer Ratte Tetrachlorkohlenstoff intraperitoneal zu verabreichen, die Leber aus der Ratte mit Hepatitis zu entfernen, sie zu homogenisieren und HGF durch gebräuchliche Proteinreinigungstechniken, wie Gelsäulenchromatographie unter Verwendung von S-Sepharose und Heparin-Sepharose, HPLC und dergleichen, zu reinigen.
Weiterhin wird unter Verwendung des gentechnischen Verfahrens das Gen, das die Aminosäuresequenz von humanem HGF codiert, in einen Vektor wie Rinder-Papillomavirus-DNA und dergleichen insertiert, um einen Expressionsvektor zu erhalten; unter Verwendung dieses Expressionsvektors werden Tierzellen, wie Eierstockzellen Chinesische Hamster (CHO-Zellen), Maus-C127-Zellen, Affen-COS-Zellen und dergleichen transformiert, und HGF kann aus dem Kulturüberstand der Transformanten erhalten werden.
Was das so erhaltene HGF betrifft, gibt es Möglichkeiten, dass ein Teil der Aminosäuresequenz von HGF deletiert oder durch eine andere Aminosäure (andere Aminosäuren) substituiert ist, dass eine andere Aminosäuresequenz teilweise insertiert ist, dass eine, zwei oder mehr Aminosäuren an den C- und/oder N-Terminus gebunden sind oder dass Zucker in ähnlicher Weise deletiert oder substituiert sind.
Das Mittel, das die Kollagen-Zersetzung beschleunigt, umfasst den oben beschriebenen HGF als Wirkstoff, und der HGF hat eine beschleunigende Auswirkung auf die Kollagen-Zersetzung (Zunahme der Kollagenase-Aktivität), wie in später erwähnten Testbeispielen gezeigt wird. Daher ist das die Kollagen-Zersetzung beschleunigende Mittel zur Behandlung von Lungenfibrose sowie zur Prävention derselben wirksam.
Weiterhin umfasst das therapeutische Mittel für eine Fibroseerkrankung gleichermaßen den oben erwähnten HGF als Wirkstoff und ist zur Behandlung der Fibroseerkrankung brauchbar, die durch übermäßige Produktion einer von Fibroblasten herstammenden Bindegewebsmatrix, die Kollagen, Fibronectin und Glycosaminoglycan (GAG) enthält, gekennzeichnet ist.
Das die Kollagen-Zersetzung beschleunigende Mittel und das therapeutische Mittel für die Fibroseerkrankung sind für die Behandlung von Lungenfibrose und die Beschleunigung der Kollagen-Zersetzung in Säugern (z.B. Rind, Pferd, Schwein, Schaf, Hund, Katze und dergleichen) zusätzlich zum Menschen anwendbar.
Das die Kollagen-Zersetzung beschleunigende Mittel und das therapeutische Mittel für Lungenfibrose kann in verschiedenen Herstellungsformen (z.B. Flüssigkeit, Tablette, Kapsel) hergestellt werden, und im Allgemeinen wird es in Form einer Injektion, Inhalation, eines Suppositoriums oder oralen Präparats, das HGF als alleinigen Wirkstoff enthält, oder zusammen mit einem herkömmlicherweise verwendeten Träger hergestellt. Die Injektion kann durch das herkömmliche Verfahren hergestellt werden, und z.B. wird HGF in einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. sterilisiertes Wasser, Puffer-Lösung, physiologische Kochsalzlösung) gelöst, filtriert und sterilisiert und aseptisch in einen Behälter gegeben. Der Gehalt an HGF in der Injektion kann üblicherweise 0,0002 bis 0,2 w/v-%, vorzugsweise 0,001 bis 0,1 w/v-% betragen. Als orales Präparat wird es in verschiedenen Präparateformen produziert, einschließlich Tablette, Granulat, feines Granulat, Pulver, Weich- oder Hartkapsel, Flüssigkeit, Emulsion, Suspension oder Sirup, und diese Präparate können durch das konventionelle Verfahren hergestellt werden. Als Suppositorium kann es durch das konventionelle pharmazeutische Verfahren unter Verwendung einer Suppositorium-Basis (z.B. Kakaoöl, Laurinöl, Glycero-Gelatine, Makrogol, Witepsol usw.) hergestellt werden. Als Inhalation kann es zudem durch das konventionelle pharmazeutische Verfahren hergestellt werden. Der Gehalt an HGF im Präparat kann zweckmäßigerweise in Abhängigkeit von der Präparatform und zu behandelnden Krankheit eingestellt werden.
Vorzugsweise wird bei der Herstellung des Präparats ein Stabilisator zugegeben, und Beispiele für den Stabilisator schließen Albumin, Globulin, Gelatine, Glycin, Mannit, Glucose, Dextran, Sorbit, Ethylenglycol und dergleichen ein. Zudem kann das Präparat andere Additive enthalten, die für die pharmazeutische Zubereitung notwendig sind, wie einen Arzneimittelträger, ein Lösehilfsmittel, ein Antioxidationsmittel, ein schmerzlinderndes Mittel, ein Isotoniemittel und dergleichen. Das flüssige Präparat wird vorzugsweise unter Gefrierbedingungen oder nach dem Entfernen von Wasser durch ein Verfahren wie Lyophilisierung gelagert. Das lyophilisierte Präparat wird durch erneutes Lösen in destilliertem Wasser für die Injektion und dergleichen vor der Anwendung verwendet.
Das die Kollagen-Zersetzung beschleunigende Mittel und das therapeutische Mittel für Lungenfibrose werden durch verschiedene Wege in Abhängigkeit von der Zubereitungsform verabreicht. Z.B. wird die Injektion intravenös, intraarteriell, subkutan, intramuskulär und dergleichen verabreicht. Die Dosis wird in Abhängigkeit von Symptomen, Alter und Körpergewicht des Patienten richtig eingestellt, und im Allgemeinen werden 0,05 mg bis 500 mg, vorzugsweise 1 mg bis 100 mg HGF einmal oder mehrere Male täglich verabreicht.
Gewerbliche Anwendbarkeit
HGF – der Wirkstoff – beschleunigt die Zersetzung von Kollagen (Erhöhung der Kollagenase-Aktivität) und kann effizient Lungenfibrose behandeln. Daher sind gemäß der vorliegenden Erfindung die Prävention und Behandlung einer Krankheit aufgrund einer reduzierten Kollagenase-Aktivität und der oben erwähnten Fibroseerkrankung, die durch eine übermäßige Produktion einer von Fibroblasten herstammenden Bindegewebsmatrix gekennzeichnet sind, möglich.
Beispiele
Die folgenden Beispiele sind nicht gemäß der Erfindung, sie sind aber zum Verständnis der Erfindung nützlich. Präparatbeispiel 1 Produktionsbeispiel einer HGF-Zubereitung

(1) HGF 20 μg

humanes Serumalbumin 100 mg
Die oben beschriebenen Substanzen wurden in 0,01 M PBS (pH 7,0) gelöst, und die sich ergebende Lösung wurde mit dem gleichen Lösungsmittel auf 20 ml aufgefüllt. Die sich ergebende Mischung wurde sterilisiert, dann wurden 2-ml-Aliquote der Mischung separat in Ampullen gegossen und lyophilisiert und versiegelt.

(2) HGF 40 μg

Tween 80 1 mg

humanes Serumalbumin 100 mg
Die oben beschriebenen Substanzen wurden in einer physiologischen Kochsalzlösung zur Injektion gelöst, um eine Mischung mit einem Gesamtvolumen von 20 ml herzustellen. Die sich ergebende Mischung wurde sterilisiert, dann wurden 2-ml-Aliquote der Mischung separat in Ampullen gegossen, lyophilisiert und versiegelt.
Beispiel 1
Verhindernde und verbessernde Auswirkungen von HGF auf die mit Dimethylnitrosamin induzierte Leberfibrose von Ratten
1. Testverfahren
(1) verwendete Tiere: männliche Wistar-Ratte, 5 Wochen alt
(2) Zeitplan des Tests
Dimethylnitrosamin (DMN) wurde Ratten in einer Dosis von 10 μl/kg jeden Dienstag, Mittwoch und Donnerstag 4 Wochen lang intraperitoneal verabreicht.
HGF wurde Ratten in einer Dosis von 500 μg/kg zweimal täglich (1000 μg/kg/Tag) 28 Tage lang seit der ersten DMN-Verabreichung intravenös verabreicht. Der Verabreichungszeitplan ist in 1 aufgeführt. Am 29. Tag wurden die Testratten der folgenden Messung unterzogen.
(3) Messung
Die Ratten wurden seziert, um das Gewicht der Leber zu messen. Weiterhin wurden der Hydroxyprolin-Gehalt (Hyp; ein Index für Fibrose) und die Kollagenase (Kollagenzersetzungsenzym)-Aktivität im Lebergewebe durch das Verfahren von Kivirikko et al. (Anal. Biochem, 19, 249, 1967) bzw. das Verfahren von Murawaki et al. (J. Biochem. 108, 241, 1990) gemessen. Zudem wurden die DNA- und Proteingehalte im Lebergewebe durch das von Burton modifizierte Dishe-Verfahren (Biochem. J. 62, 315, 1956) bzw. ein Protein-Assaykit (hergestellt von Bio-Rad Ltd.) gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 aufgeführt.

Gleichzeitig wurde auch Blut aus der unteren Hohlvene gesammelt, und der klinische biochemische Test des gesammelten Serums wurde durch eine automatische Analyseapparatur vom Typ Hitachi 7150 analysiert. Dann wurde unter Verwendung des aus der unteren Hohlvene gesammelten Bluts, dem EDTA zugefügt wurde, die Anzahl der Plättchen, die Anzahl der Leucocyten, die Anzahl der Erythrocyten, der Hämatokrit-Wert und die Hämoglobin-Konzentration durch eine automatische Mehrzweck-Blutzellen-Zählapparatur (E-4000, hergestellt von Sysmex) gemessen. Unter Verwendung des Plasmas, das durch Mischen einer wässrigen 3,8 prozentigen Natriumcitrat-Lösung und des aus der unteren Hohlvene gesammelten Bluts in einem Verhältnis von 1:9 erhalten wurde, wurde auch die Koagulationsfähigkeit des Plasmas (Prothrombinzeit, Fibrinogen-Gehalt, Koagulationszeit durch den Hepaplastein-Test und den Thrombo-Test) durch eine automatische Messapparatur der Koagulationsfähigkeit (KC-40) gemessen. Das Ergebnis ist in der Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 1

	Gruppe, der Lösungsmittel verabreicht wurde	Gruppe, der HGF verabreicht wurde	normale Tiere
Lebergewicht (g)	9,33 ± 0,72	13,02 ± 0,53**	13,59 ± 0,51**
Gesamt-DNA-Gehalt (mg/Leber)	33,6 ± 2,5	39,3 ± 1,8*	44,8 ± 1,7**
Gesamt-Protein-Gehalt (g/Leber)	1,36 ± 0,12	1,84 ± 0,09**	2,33 ± 0,09**
Kollagenase-Aktivität (μg/min/g Leber)	0,22 ± 0,01	0,36 ± 0,07**	0,27 ± 0,02
Hydroxyprolin-Gehalt (μg/g Leber)	423,1 ± 35,9	300,1 ± 18,0**	129,3 ± 6,4**

Mittelwert = Standardfehler (n = 10)
*: P < 0,05; **: P < 0,01 gegenüber der Gruppe, der Lösungsmittel verabreicht wurde

Biochemie-Testwert des Serums	Gruppe, der Lösungsmittel verabreicht wurde	Gruppe, der HGF verabreicht wurde	normale Tiere
GOT (IE/I)	136 ± 9	78 ± 4**	64 ± 3**
GPT (IE/I)	50 ± 4	28 ± 1**	15 ± 1**
γ-GTP (E/I)	4,8 ± 0,4	3,4 ± 0,2**	1,9 ± 0,1**
Gesamt-Bilirubin (mg/dl)	0,45 ± 0,08	0,25 ± 0,01**	0,19 ± 0,01**
direktes Bilirubin (mg/dl)	0,20 ± 0,02	0,18 ± 0,00	0,13 ± 0,01**
Gesamtprotein (g/dl)	4,9 ± 0,1	6,4 ± 0,1**	5,7 ± 0,0**
Albumin (g/dl)	2,4 ± 0,1	3,1 ± 0,1**	2,6 ± 0,0**
Blutzucker (mg/dl)	131 ± 4	152 ± 6**	180 ± 8**
Gesamt-Cholesterin (mg/dl)	53 ± 2	98 ± 5**	72 ± 3**
HDL-Cholesterin (mg/dl)	28,0 ± 1,9	61,6 ± 3,9**	41,3 ± 1,7**
Triglyceride (mg/dl)	70 ± 9	152 ± 16**	157 ± 16**
Phospholipid (mg/dl)	116 ± 4	208 ± 8**	160 ± 5**
β-Lipoprotein (mg/dl)	107 ± 11	222 ± 20**	202 ± 18**
Blut, Koagulationstestwert	Gruppe, der Lösungsmittel verabreicht wurde	Gruppe, der HGF verabreicht wurde	normale Tiere
Anzahl der Plättchen (10⁴/μl)	31 ± 5	78 ± 4**	105 ± 5**
Anzahl der Leukocyten (10²/μl)	144 ± 6	101 ± 8**	87 ± 8**
Anzahl der Erythrocyten 10⁴/μl	667 ± 16	702 ± 9**	755 ± 6**
Hämatokrit-Wert (%)	39,9 ± 0,9	41,6 ± 0,3*	44,3 ± 0,3**
Hämoglobin-Konzentration (g/l)	12,7 ± 0,3	13,6 ± 0,1**	14,6 ± 0,1**
Prothrombinzeit (s)	15,6 ± 0,5	13,8 ± 0,2*	13,8 ± 0,2*
Fibrinogen (g/dl)	1,45 ± 0,10	2,05 ± 0,11**	2,31 ± 0,05**
Hepaplasteinzeit (s)	37,3 ± 2,7	28,6 ± 0,6**	28,5 ± 0,5**
Thrombo-Testzeit (s)	30,0 ± 1,9	22,5 ± 0,3**	22,8 ± 0,3**

Mittelwert ± Standardfehler (n = 10)
*: P < 0,05; **: P < 0,01 gegenüber der Gruppe, der Lösungsmittel verabreicht wurde

2. Ergebnis
Wie aus den Tabellen 1 und 2 ersichtlich ist, wurden aufgrund der wiederholten Verabreichung von DMN eine deutliche Progression der Leberfibrose und ein Schrumpfen der Leber in der Gruppe, der Lösungsmittel verabreicht wurde (Kontrolle), beobachtet und es wurde eine klare Herabsetzung der Leberfunktion durch die klinische Biochemie, die Blut- und Koagulationstestwerte bestätigt. Andererseits offenbarten die Leberfunktionstestwerte der Gruppe, der HGF verabreicht wurde, Werte, die nahe bei denen von normalen Tieren lagen, mit einer signifikanten Differenz im Vergleich zu solchen Werten der Lösungsmittel verabreichten Gruppe, und zeigten klar den verbessernden Effekt auf. Wegen der HGF-Verabreichung waren zudem die Kollagenase-Aktivität, der Protein- und DNA-Gehalt im Lebergewebe signifikant erhöht, der Hydroxyprolin-Gehalt, der ein Hinweis auf die Fibrose ist, war signifikant reduziert und das Lebergewicht erholte sich auf einen in etwa normalen Wert.
Beispiel 2
Auswirkung von HGF auf die mit Tetrachlorkohlenstoff induzierte Leberfibrose von Ratten
Tetrachlorkohlenstoff wurde männlichen Wistar-Ratten (6 Wochen alt) in einer Dosis von 0,7 ml/kg jeden Montag und Donnerstag 12 Wochen lang oral verabreicht, um Leberfibrose-Modelle herzustellen. Diese Ratten mit durch Tetrachlorkohlenstoff induzierter Leberfibrose wurden den folgenden zwei Tests unterzogen.
(1) Test A
Wiederholter Verabreichungstest
HGF wurde den oben beschriebenen Ratten mit durch Tetrachlorkohlenstoff induzierter Leberfibrose (eine Gruppe schließt 13–14 Individuen ein) in Dosen von 50 und 500 μg/kg zweimal täglich (100 und 1000 μg/kg/Tag) 7 Tage lang intravenös verabreicht. Der Verabreichungszeitplan ist in 2 gezeigt. Die Änderungen der GOT-, GPT- und γ-GTP-Werte im Serum am Tag 3, 5 und 7 nach der Initiierung der HGF-Verabreichung wurden mit solchen im Serum der Lösungsmittel-Verabreichungsgruppe (Kontrolle) verglichen. Die Ergebnisse sind in 4 aufgeführt.
Wie in 4 ersichtlich ist, wurde ein beschleunigender Effekt von HGF auf die Wiederherstellung am Tag 5 bei einer Dosis von 1000 μg/kg/Tag und am Tag 7 bei einer Dosis von 100 μg/kg/Tag beobachtet.
(2) Test B
Tropfinfusionstest
HGF wurde in die oben beschriebenen Ratten mit durch Tetrachlorkohlenstoff induzierter Leberfibrose (n = 12 – 13 pro Gruppe) in Dosen von 100 und 1000 μg/kg/Tag durch einen Dauerkatheter in der Halsvene infundieren gelassen, und 72 Stunden nach der Initiierung der HGF-Infusion wurden sie seziert. Der HGF-Infusionszeitplan ist in 3 aufgeführt.
GOT, GPT, Serum-Gesamtprotein und Albumin im Serum wurden durch eine automatische Analyseapparatur vom Typ Hitachi 7150 gemessen, und bezüglich der Koagulationsfähigkeit des Plasmas, das durch Mischen einer wässrigen 3,8 prozentigen Natriumcitrat-Lösung und des aus der unteren Hohlvene gesammelten Bluts in einem Verhältnis von 1:9 erhalten wurde, wurde die Koagulationszeit im Hepaplasteintest durch eine automatische Messapparatur der Koagulationsfähigkeit (KC-40) gemessen.
Weiterhin wurde der Hydroxyprolin-Gehalt im Lebergewebe (Hyp), der ein Index der Fibrose ist, durch das oben von Kivirikko et al. beschriebene Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 und 5 aufgeführt.

Wie aus Tabelle 3 und 5 ersichtlich ist, wurden bei einer Verabreichung von HGF in einer Dosis von mehr als 100 μg/kg/Tag eine Verbesserung des Leberfunktionstestwerts, eine Erholung der Hypoproteinämie und eine Reduktion des Hydroxyprolin-Gehalts im Lebergewebe beobachtet, was auf eine Verbesserung der Fibrose hinweist, und zwar jeweils in Abhängigkeit von den Dosen. Tabelle 3

	Konzentration an gesamten Protein (g/dl)	Albumin-Konzentration (g/dl)
Lösungsmittel-Verabreichungsgruppe	5,0 ± 0,1	1,8 ± 0,1
HGF-Verabreichungsgruppe (100 μg/kg/Tag)	5,5 ± 0,2*	2,1 ± 0,1*
HGF-Verabreichungsgruppe (1000 μg/kg/Tag)	5,7 ± 0,2**	2,1 ± 0,1*
gesunde und normale Tiere	6,0 ± 0,1**	2,4 ± 0,03**

Mittelwert ± Standardfehler (n = 12 bis 13)
*: P < 0,05; **: P < 0,01 gegenüber der Gruppe, der Lösungsmittel verabreicht wurde

Beispiel 3
Auswirkung von HGF auf die durch DMN induzierte Leberfibrose und auf die damit verbundene Leberfunktionsinsuffizienz
(1) Test A
Die Gruppe von Ratten mit durch DMN induzierter Leberfibrose, der HGF verabreicht wurde, und die Gruppe von Ratten mit durch DMN induzierter Leberfibrose, der kein HGF verabreicht wurde, wurden auf ihre Überlebensverhältnisse getestet.
Der Verabreichungszeitplan der Medizinen ist im oberen Teil von 6 aufgeführt. DMN, das in einer physiologischen Kochsalzlösung in einer Konzentration von 1 gelöst wurde, wurde männlichen SD-Ratten dreimal pro Woche 6 Wochen lang, wie durch den Pfeil angezeigt wird, in einer Dosis von 10 μl DMN pro 1 kg Körpergewicht intraperitoneal verabreicht. Human-HGF oder physiologische Kochsalzlösung wurde Ratten jeden Tag während der durch das schraffierte Band angezeigten Zeitspanne vom 21. Tag an nach der Initiierung der DMN-Verabreichung intravenös verabreicht, um den zeitlichen Verlauf der Überlebensraten von getesteten Ratten zu überprüfen. Die Ergebnisse sind in
6 aufgeführt. In 6 gibt die punktierte Linie die Gruppe an, der physiologische Kochsalzlösung verabreicht wurde (Kontrollgruppe, n = 10), gibt die gestrichelte Linie die Gruppe (n = 5) an, der 50 μg/kg Körpergewicht HGF verabreicht wurde, und gibt die durchgezogene Linie die Gruppe (n = 5) an, der 200 μg/kg Körpergewicht HGF verabreicht wurde.
Wie in 6 gezeigt ist, wurden durch die Verabreichung von HGF die Überlebensraten der Ratten verbessert und insbesondere wurde kein Todesfall bei der Gruppe beobachtet, der 200 μg/kg Körpergewicht HGF verabreicht wurde.
(2) Test B
Die Zersetzung von Kollagen vom Typ I (histologische Beobachtung) der Leber der Ratte, der DMN verabreicht wurde, wurde unter Verabreichung oder Nicht-Verabreichung von HGF untersucht.
D.h. zum Nachweis von Kollagenfasern wurden die Ratten getötet, und die Lebern wurden am 42. Tag in den in 6 gezeigten Tests entnommen. Für die Immunofluoreszenz-Anfärbung von Kollagen wurde die Leber schnell in OTC-Verbindung eingefroren, und die präparierten Scheiben wurden mit Kaninchenanti-Rattenkollagen-Typ I-Antikörper (erhalten von LSL Ltd.) und einem Fluoreszenz-markierten Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper umgesetzt, dann wurden die Proben photographiert. Die Ergebnisse sind in 7 aufgeführt.
Wie in 7 gezeigt wird, gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen der Verabreichung und Nicht-Verabreichung von HGF bei Abscheidungen von Kollagen vom Typ I in der Leber. In der Kontrollrattengruppe, der physiologische Kochsalzlösung verabreicht wurde, war die Abscheidung von Kollagen vom Typ I in der Leber offensichtlich; dicke oder dünne Bündel einer Kollagen-Typ-I-Faser wurden in einem breiten Bereich um die Blutgefäße und Hepatocyten herum abgeschieden.
Diese Erscheinungen verschwanden bei der Verabreichung von HGF in einer dosisabhängigen Weise, wobei die Verbesserung der Läppchenstruktur in der Gruppe, der HGF verabreicht wurde, deutlich war. Auf diese Weise wurde der unterdrückende Effekt von HGF auf die Leberfibrose durch die histologische Beobachtung des Leberschnitts aufgezeigt.
(3) Test C
Die Änderungen der Prothrombinzeit, der Gehalte an Hepatozyt-verarmtem-Enzym und Leber-Hydroxyprolin durch HGF-Verabreichung wurden untersucht.
D.h. Ratten wurden gemäß dem in 6 gezeigten Versuchsschema behandelt. Die Prothrombinzeit (PT), die Werte im Serum (Plasma) von Albumin (Alb), Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase (GOT), Glutaminsäure-Pyruvinsäure-Transaminase (GPT) und alkalischer Phosphatase (ALP) und der Gehalt an Leber-Hydroxyprolin (HYP) wurden jeweils gemessen in einer Gruppe normaler Ratten (n = 5, angegeben als normale Ratte in der Tabelle 4), einer Gruppe, in der eine DMN-Behandlung 5 Wochen lang durchgeführt wurde und nur physiologische Kochsalzlösung verabreicht wurde (n = 5, angegeben als 5W in der Tabelle 4), einer Gruppe, in der eine DMN-Behandlung 6 Wochen lang durchgeführt wurde und nur physiologische Kochsalzlösung verabreicht wurde (n = 5, angegeben als 6W in der Tabelle 4) oder Gruppen, in denen HGF in Dosen von 50 μg/kg Körpergewicht (n = 3, angegeben als 50 in der Tabelle 4) und 200 μg/kg Körpergewicht (n = 5, angegeben als 200 in der Tabelle 4) anstelle der physiologischen Kochsalzlösung verabreicht wurde. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 aufgeführt. Hierin wurden die als 5W angegebenen Werte erhalten, indem man die Ratten am 35. Tag tötete, und die anderen Werte wurden erhalten, indem man die Ratten am 42. Tag nach der Initiierung der DMN-Behandlung tötete.
Wie in der Tabelle 4 gezeigt wird, wurde aufgrund der HGF-Verabreichung festgestellt, dass die Leberfibrose und die Insuffizienz der Leberfunktion verbessert waren.
Beispiel 4
Auswirkung der HGF-Verabreichung auf die Verbesserung der mit DMN induzierten Leberfibrose von Ratten
(1) Verfahren
DMN wurde männlichen SD-Ratten (5 Wochen alt) in einer Dosis von 10 μl/kg an drei aufeinander folgenden Tagen einer Woche (Montag, Dienstag, Mittwoch) 4 Wochen lang intraperitoneal verabreicht, um Ratten Leberfibrose zuzufügen. Diesen Ratten wurde 1 mg/kg HGF oder 1 ml/kg eines Lösungsmittels (Phosphatgepufferte Salzlösung, die 2,5 mg/ml HSA und 0,01 % Tween 80 umfasst) an fünf aufeinander folgenden Tagen einer Woche (Montag, Dienstag, Mittwoch, Donnerstag, Freitag) seit der Initiierung der DMN-Verabreichung bis zum 4. Tag der 4. Woche verabreicht. Am 5. Tag der 4. Woche wurden die Ratten getötet, die Lebern wurden entnommen und in neutralem Formalin fixiert, und nach der Herstellung von Schnitten wurden sie einer Trichrome-Anfärbung nach Masson unterzogen, die Lebergewebe anfärbt, nicht aber anderes Gewebe anfärbt. Dabei wurden zum Vergleich auch die Lebern von normalen Ratten angefärbt. Bezüglich der Lebergewebeproben von entsprechenden Individuen wurde jeweils die Fasergewebefläche in der gesamten Fläche des Gewebeschnitts durch eine Bildanalyseapparatur (T. Watanabe et al., Analytical Cellular Pathology 4 (3), 248, 1992) berechnet und die Gehalte an Fasergewebe in normalem Gewebe wurden verglichen. Die für die Analyse verwendeten Proben umfassten 8 Versuchsobjekte der normalen Ratten, 8 Versuchsobjekte der Gruppe, der DMN + Lösungsmittel verabreicht wurde, und 6 Beispiele der Gruppe, der DMN + HGF verabreicht wurde (HGF + DMN), außer bei Ratten-Versuchsobjekten, bei denen die Neutralisationsaktivität für HGF in ihrem Serum erzeugt wurde.
(2) Ergebnis
Die Ergebnisse sind in 8 aufgezeigt. Jeder Punkt in der Figur zeigt den Anteil (%) an Fasergewebe in jeder einzelnen Leber von normalen Ratten (n = 8), bei Ratten, denen DMN verabreicht wurde (n = 8), oder Ratten, denen DMN + HGF verabreicht wurde (n = 6), an. Der horizontale Strich gibt den Mittelwert an.
Wie aus 8 ersichtlich ist, nahm – verglichen mit normalen Ratten – der Anteil an Fasergewebe im Lebergewebe bei der DMN verabreichten Gruppe auf 7,3 von 1,3 % (Mittelwert bei normalen Ratten) zu. Andererseits nahm im Fall der Gruppe, der DMN + HGF verabreicht wurde, der Anteil auf 2,8 % ab, verglichen mit demjenigen der DMN-Verabreichungsgruppe. Dieses Phänomen zeigt die Verbesserung der mittels DMN induzierten Leberfibrose durch die Verabreichung von HGF an.

Claims

Verwendung von Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF) zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Lungenfibrose.