CN105378062A - 包含分离的肾细胞的类器官及其用途 - Google Patents

Abstract

本文描述了包含选择的生物活性原代肾细胞和生物活性细胞群(例如内皮细胞群，如HUVEC细胞)的混合物的类器官，以及使用所述类器官治疗有需要的受试者的方法。此外，分离的肾细胞可以包括肾小管细胞群和产生促红细胞生成素{EPO}的肾细胞群，所述分离的肾细胞和/或所述内皮细胞群可以是自体的、同系基因的、同种异体的或异种来源的，或其任何组合。此外，提供了使用所述类器官治疗有需要的受试者的方法。

Description

包含分离的肾细胞的类器官及其用途

发明领域

本发明涉及选择的生物活性原代肾细胞和另外的生物活性细胞群的混合物，以及治疗有需要的受试者的方法。本发明进一步涉及包含分离的肾细胞(包括肾小管细胞群和产生促红细胞生成素(EPO)的肾细胞群)的类器官，以及使用所述类器官治疗有需要的受试者的方法。

发明背景

在美国，慢性肾脏疾病(CKD)影响了超过19M人，并且通常是代谢病症包括肥胖症、糖尿病和高血压的后果。数据检查揭示，增加的速度是由于高血压继发性肾衰竭和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的发展(UnitedStatesRenalDataSystem:CostsofCKDandESRD.Bethesda,MD编,NationalInstitutesofHealth,NationalInstituteofDiabetesandDigestiveandKidneyDiseases,2007第223-238页)–这两种疾病也在世界范围内增长。肥胖症、高血压和较差的血糖控制均显示是肾脏损伤的独立风险因素，引起肾小球和肾小管病变并且导致蛋白尿和其他肾滤过功能中的全身性可检测的变化(Aboushwareb,等,WorldJUrol,26:295-300,2008；Amann,K.等,NephrolDialTransplant,13:1958-66,1998)。处于进程中1-3期的CKD患者通过改变生活方式和旨在控制潜在疾病状态的药理学干预被控制，而处于4-5期的患者通过透析和药物方案被控制，所述药物方案通常包括抗高血压剂、红细胞生成刺激剂(ESA)、铁和维生素D补充剂。根据美国肾病数据系统(UnitedStatesRenalDataService,USRDS)，终末期肾病(ESRD)患者每月平均花费>$600在可注射的红细胞生成刺激剂(ESA)、维生素D补充剂和铁补充剂上(UnitedStatesRenalDataSystem:CostsofCKDandESRD.Bethesda,MD编,NationalInstitutesofHealth,NationalInstituteofDiabetesandDigestiveandKidneyDiseases,2007第223-238页)。当与每年平均透析费用($65,405)配合时，用于维持单个患者的健康护理费用上升至>$72,000/年(UnitedStatesRenalDataSystem:CostsofCKDandESRD.Bethesda,MD编,NationalInstitutesofHealth,NationalInstituteofDiabetesandDigestiveandKidneyDiseases,2007第223-238页)–这个数字仅反映标准程序费用，并且不包括其他并发症治疗、紧急程序、或辅助程序，如放置用于透析通路的血管移植物。在2005用于CKD和ESRD的组合医疗费用总计$62B–占那年所有医疗支出的19％(UnitedStatesRenalDataSystem:CostsofCKDandESRD.Bethesda,MD编,NationalInstitutesofHealth,NationalInstituteofDiabetesandDigestiveandKidneyDiseases,2007第223-238页)。对4-5期患者而言肾脏移植是有效的选择，这是为避免透析或者当透析不再足以控制疾病状态时的优先措施，但是在美国可以获益于全肾移植的5期CKD患者的数量(>400,000)远远超过了在任何给定年份中可用的合适供体肾脏的数量(约16,000)(Powe,NR等,AmJKidneyDis,53:S37-45,2009)。因此，需要新的治疗模式来延缓或减少对透析的依赖性并且填补由供体肾脏短缺留下的空白。

进行性肾病由初始疾病损伤(例如，高血压)，接着对该损伤的适应不良的肾脏响应的组合引起。这种响应包括促炎性和促纤维化细胞因子和生长因子的产生。因此，一种减缓CKD进展的策略为改善炎性和纤维化响应，以及通过肾组织的修复和/或再生减轻或逆转肾退化。

慢性肾衰竭普遍存在于人以及一些驯养的动物中。患有肾衰竭的患者不仅经受肾脏功能的丧失(尿毒症)，而且由于骨髓无法通过红细胞生成产生足够数量的红细胞(RBC)而发展为贫血。红细胞样细胞体内平衡依赖于通过驻留在肾脏中的特化间质成纤维细胞产生促红细胞生成素(EPO)以及骨髓中的靶红细胞样细胞祖细胞响应于EPO并且生产更多RBC的能力。肾衰竭的贫血是由于肾脏中EPO的产生减少以及在骨髓中尿毒症因子对EPO作用的负面影响。

迄今为止，治疗慢性肾衰竭的临床方法涉及用于恢复肾滤过和尿产生的透析和肾移植，以及重组EPO或EPO类似物的全身递送以恢复红细胞样细胞的质量。透析向处于中期至晚期肾衰竭的患者提供了存活益处，但是导致了显著的生活质量问题。肾移植对于末期肾衰竭患者而言是高度期望(并且经常是唯一)的选择，但是高质量供体肾脏的供应不能满足肾衰竭人群的需求。使用重组EPO推注给药治疗贫血现在已经与严重的下游健康风险相关联，引起了来自FDA对于药物的黑盒警告，并且迫使进一步研究可替代的治疗以恢复此人群中的红细胞样细胞体内平衡。临床前研究已检查已通过基因治疗方法生成的产生EPO的细胞的体内效力和安全性。这些研究已经表明，通过体内递送产生epo的细胞有可能瞬时刺激红细胞生成和RBC数目。然而，迄今为止，这些方法中没有一个提供了调节的红细胞样细胞体内平衡或长期的体内功能性。因此，HCT和RBC的数目经常增加超过正常值，从而导致了真性红细胞增多症和其他并发症。治疗相关的并且提供优于重组EPO递送的优点的产生EPO的细胞的递送，不但必须增加HCT，而且应该恢复红细胞样细胞体内平衡，同时阳性调节机制和阴性调节机制保持完整。重要的是应注意，尽管EPO缺乏性贫血在患有肾脏疾病的患者中很普遍，其也可以源于其他疾病状态，包括心脏衰竭、多器官系统衰竭和其他慢性疾病。

再生医学技术为慢性肾脏疾病(CKD)提供下一代治疗选择。Presnell等WO/2010/056328和Ilagan等PCT/US2011/036347描述了分离的生物活性肾细胞(包括肾小管细胞群和产生促红细胞生成素(EPO)的肾细胞群)，和分离并且培养所述生物活性肾细胞的方法，以及使用所述细胞群治疗有需要的受试者的方法。

需要一种用于有需要的受试者的改进的并更具针对性的再生医学治疗选择。

发明概述

本文提供了类器官、其制备方法以及用途。

如本文所描述的类器官在不使用支架的情况下为有需要的受试者提供了治疗益处。

一方面，提供了一种形成包含异种肾细胞群和生物活性细胞群的类器官的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在培养系统中培养异种肾细胞群和生物活性细胞群，所述培养系统选自：i)2D培养；ii)3D培养：COL(I)凝胶；iii)3D培养：Matrigel；iv)3D培养：旋转器，接着是COL(I)/Matrigel；以及v)3D培养：COL(IV)凝胶。在一些实施方案中，异种肾细胞群包含生物活性肾细胞群。在某些实施方案中，异种肾细胞群包含含有富集的肾小管细胞群的B2细胞群，并且其中异种肾细胞群废弃了B1细胞群和/或B5细胞群或其组合。在一些实施方案中，异种肾细胞群包含选自B2、B2/B3、B2/B4和B2/B3/B4的细胞群。在实施方案中，异种肾细胞群包含产生促红细胞生成素(EPO)的细胞。

在另一个实施方案中，生物活性细胞群为内皮细胞群。在某些实施方案中，内皮细胞群为细胞系。在一些实施方案中，内皮细胞群来源于人脐带。在一些实施方案中，生物活性细胞群包含内皮祖细胞。在一些实施方案中，生物活性细胞群包含间充质干细胞。在一些实施方案中，内皮细胞群为成人来源的。在一些实施方案中，细胞群选自异种的、同系基因的、同种异体的、自体的及其组合。

在另一个实施方案中，将异种肾细胞群和生物活性细胞群单独培养持续第一时间段，合并并且培养持续第二时间段。在某些实施方案中，将肾细胞群和生物活性细胞群以1:1的比例合并。在某些实施方案中，将肾细胞群和生物活性细胞群合并，例如，悬浮在生长培养基中。在一些实施方案中，第二时间段长度在24小时与72小时之间，优选24小时。

另一方面，提供了一种类器官。在一些实施方案中，类器官根据本文所描述的方法制备。在所有实施方案中，类器官包含异种肾细胞群和生物活性细胞群。在一些实施方案中，生物活性细胞群为内皮细胞群。在一些实施方案中，内皮细胞群为细胞系。在某些实施方案中，内皮细胞群包含HUVEC细胞。

在一些实施方案中，异种肾细胞群包含含有富集的肾小管细胞群的B2细胞群，并且其中异种肾细胞群废弃了B1细胞群。在某些实施方案中，异种肾细胞群进一步废弃了B5细胞群。在选择的实施方案中，异种肾细胞群包含选自B2、B2/B3、B2/B4和B2/B3/B4的细胞群。在一些实施方案中，异种肾细胞群包含产生促红细胞生成素(EPO)的细胞。

另一方面，提供了一种包含至少一种类器官和液态培养基的可注射制剂。在一个实施方案中，液态培养基选自细胞生长培养基、DPBS及其组合。在另一个实施方案中，将类器官悬浮在液体培养基中。

在第二个实施方案中，可注射制剂包含类器官和对温度敏感的细胞稳定生物材料，所述生物材料(i)在约8℃或以下维持大致上固态，并且(ii)在约环境温度或以上维持大致上液态。在一个其他实施方案中，生物活性细胞包括如本文所描述的肾细胞。在另一个实施方案中，生物活性细胞被大致上均匀地分散在细胞稳定生物材料的整个体积上。在其他实施方案中，生物材料在约8℃与约环境温度或以上之间具有固体到液体的过渡态。在一个实施方案中，大致上固态为凝胶态。在另一个实施方案中，细胞稳定生物材料包括水凝胶。在一个其他实施方案中，水凝胶包括明胶。在其他实施方案中，明胶以约0.5％至约1％(w/v)存在于制剂中。在一个实施方案中，明胶以约0.75％(w/v)存在于制剂中。

一方面，提供了一种治疗有需要的受试者的肾脏疾病的方法，所述方法包括施用至少一种包含异种肾细胞群和生物活性细胞群的类器官。在一些实施方案中，生物活性细胞群为内皮细胞群。在某些实施方案中，内皮细胞群为细胞系。在一个实施方案中，内皮细胞群包含HUVEC细胞。

在大多数实施方案中，异种肾细胞群包含含有富集的肾小管细胞群的B2细胞群，并且其中异种肾细胞群废弃了B1细胞群。在选择的实施方案中，异种肾细胞群进一步废弃了B5细胞群。在一些实施方案中，异种肾细胞群包含选自B2、B2/B3、B2/B4和B2/B3/B4的细胞群。在大多数实施方案中，异种肾细胞群包含产生促红细胞生成素(EPO)的细胞。

在一个实施方案中，治疗有需要的受试者的肾脏疾病的方法包括施用如本文所描述的可注射制剂。在所有实施方案中，受试者为选自狗、猫、马、兔、动物园动物、奶牛、猪、绵羊和灵长类的哺乳动物。在具体的实施方案中，哺乳动物是人。在所有实施方案中，受试者患有肾脏疾病。在实施方案中，观察到以下疾病的量度中任何一种的改善：贫血(Hct、Hgb、RBC)、炎症(WBC)、尿浓缩(spGrav)以及氮血症(BUN)。

另一方面，提供了类器官在制备用于治疗肾脏疾病的药剂中的用途。

附图简述

图1示出了在纤连蛋白涂覆的板上原代ZSF1细胞的细胞培养物形态。A.在5x放大倍数下观察的p0未分级分离的预分选；B.在5x放大倍数下观察的p1CD31⁺；C.在第0代结束时，在21％O₂下在纤连蛋白处理的烧瓶的KGM中生长的未分级分离的肾脏细胞的原代培养；D.来自Miltenyi微珠选择的阴性流出物(CD31^-)；以及E.在第一代结束时，在纤连蛋白涂覆的烧瓶的EMG2完全补充的培养基中选择的90％CD31⁺细胞。

图2示出了在5x下观察的人细胞培养物形态。A.在p0结束时，在21％O₂下在TC处理的烧瓶的KGM中生长的未分级分离的肾脏细胞；B.在第0代结束时，暴露于2％O₂O/N，在TC处理的烧瓶的KGM中生长的未分级分离的肾脏细胞；C.在第0代结束时，在纤连蛋白涂覆的烧瓶的EMG2完全补充的培养基中的未分级分离的肾脏细胞；D.在第1代结束时，在纤连蛋白涂覆的烧瓶的完全补充的EMG2培养基中的CD31⁺阳性选择的细胞。

图3示出了FACS分析，其显示在培养期间，在选择的样本中阳性CD31内皮细胞的百分数。在p0时，未分级分离(UNFX)的内皮组合物<3％，并且在p1时当铺于纤连蛋白上并且在EGM-2培养基中培养时富集了约15倍。

图3-1示出了用于谱系示踪研究的BigeneicCre/loxP报道子。A.Six2-CrexR26td番茄红十字示踪上皮细胞：顶叶、近端、和远端上皮细胞，但非间质或集合管上皮细胞；B.未标记的对照物；C.来自p1培养(3天含氧量正常培养，接着1天低氧培养)的Six-2阳性。

图4示出了用于形成SRC类器官的旋转烧瓶(A)和在旋转器上的低结合板(B)。

图5示出了A.大鼠的相位成像(10x)；和B.示出均匀大小的人SRC的相位成像(10x)；C.表达泛钙粘蛋白表型(绿色)、核(蓝色)的类器官的相位成像(20x)。

图6示出了在3D胶原I/IV凝胶中培养的人类器官。A.示出低放大倍数的类器官管形成相位图像(以白色圈出)；B.较高放大倍数下的连同剩下的类器官的相位图像(以白色圈出)；C.GGT-1表型表达(绿色)、核(蓝色)；D.20x放大倍数下的CK18表达(绿色)、核(蓝色)。

图7示出了膜染料标记的类器官。A.x100放大倍数下的只使用DiL(红色)标记的SRC；B.x100放大倍数下的类器官+、使用DiL(红色)标记的SRC、使用DiO(绿色)标记的HuVEC。

图8在图A、B和C中示出了在自生类器官+的ColI/IV凝胶中的3D肾小管发生测定，这些图示出SRC群(红色)和内皮细胞(绿色)两者的存在。当合并时，群呈黄色。在20x放大倍数下的核染色(蓝色)。

图9示出了注射前SPIO罗丹明标记的类器官(红色)。

图10示出了移植后类器官存留的磁共振成像(MRI)，绿色＝细胞。A.注射后24小时；B.注射后48小时。

图11示出了低放大倍数和高放大倍数下的植入类器官的普鲁士蓝染色，示出了细胞存留和生物分布。A.植入后24小时的植入左肾；B.植入后48小时的植入左肾。

图12为一组示出了在已施用本文所描述的类器官的大鼠肾脏中的人细胞的HLA1染色的照片。A.正常人肾脏；B.大鼠肾脏中的人肾细胞；C.未处理的肾切除的大鼠肾脏；D.NKO处理的(低倍显微镜)；E.NKO处理的(高倍显微镜)；F.第二个NKO处理的动物。图A和图B示出了正常人肾脏组织以及急性递送至啮齿动物肾脏的人肾细胞(绿色箭头)的染色(棕色)。在研究未处理的可能由于蛋白质管型的“粘性”性质和受损的肾小管而患病的大鼠肾脏结束时存在背景染色，如在图C和F中通过黄色箭头标识的。这种染色通常颜色较浅但有时为深色，并且大小比细胞小。图D、E、和F示出了较低的放大倍数用于筛选以确定深色染色的细胞，接着较高的放大倍数确认HLA1染色的细胞(绿色箭头)。

专利或申请文件包含至少一幅彩色绘图。在提出请求并支付必要费用后，政府机关将提供具有彩色绘图的本专利或专利出版物的副本。

发明详述

许多细胞类型组成了肾单位，即肾实质内的功能单元。最近已经建立从正常和患病动物和人中分离出治疗性生物活性肾细胞的能力^1-3。在这些研究中使用的方法依赖于使用浮力密度梯度离心分离存在于患病组织活检物中的肾细胞的混合物。

一方面，本发明涉及各种肾单位隔室或小生境中选择的单独细胞群的分离、鉴定和扩增，使得可以组合新型的、多种富集的细胞类型作为选择的混合物。本发明的新型的、选择的混合物提供了对与肾脏疾病的临床和病理生理基础相关联的特定结构和功能缺陷的靶向。组成肾单元并且组合为选择的混合物的多种单独细胞类型的分离和富集能够改进特定肾脏疾病群组的靶向治疗。

细胞类型，如血管内皮细胞、肾小管和集合管上皮细胞、间质细胞、肾小球细胞、间质干细胞等，可以离体分离、鉴定以及扩增。尽管每种细胞类型可能需要用于继代培养的独特方法和培养基制剂，但是它们可以作为类器官簇被添回选择性组合或混合物中，以便针对与特定的急性和/或慢性肾脏疾病患者综合征/群组相关联的潜在的肾组织/细胞缺陷提供增强的递送和改进的治疗⁸。

本发明涵盖了使用确定比例的肾小管上皮细胞与内皮细胞治疗与脉管疾病(例如，高血压、微血管病性贫血)相关联的肾损害的方法。使用选择性培养系统和磁分选来分离、表征以及扩增驻留的肾内皮细胞的能力允许富集先前表征的选择性再生肾上皮细胞(SRC)群^2，4与特定百分数的纯化的肾上皮细胞(SRC+)。本发明的SRC+细胞群包含如先前所述并且还在本文描述的选择的肾细胞(SRC或BRC)，以及另外的生物活性细胞群(包括但不限于内皮细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞、和/或脂肪来源的祖细胞)。在一个实施方案中，另外的生物活性细胞群源自肾源。在另一个实施方案中，另外的生物活性细胞群源自非肾源。

一方面，本发明涉及包含和/或由选择的肾细胞或生物活性肾细胞(SRC或BRC)或SRC+细胞群的异种混合物或级分形成的类器官、分离和培养所述类器官的方法、以及使用本文所描述的类器官进行治疗的方法。预期定向递送呈类器官的SRC或SRC+群至肾脏改进细胞存留，从而改进整体治疗结果。本发明还涉及使用SRC+细胞群进行治疗的方法。

定义

除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。PrinciplesofTissue Engineering,第3版(由RLanza,RLanger,&JVacanti编著),2007为本领域技术人员提供了对本申请中所使用的许多术语的一般指导。本领域技术人员将认识到与本文所描述的方法和材料类似或等价的可用于实施本发明的许多方法和材料。实际上，本发明决不限于所述方法和材料。

如本文所使用的术语“细胞群”是指通过从适合的组织来源，通常从哺乳动物中直接分离而获得的许多细胞。分离的细胞群随后可以被体外培养。本领域普通技术人员将了解与本发明一起使用的用于分离和培养细胞群的各种方法以及适合在本发明中使用的细胞群中的各种细胞数目。细胞群可以是来源于肾脏的未分级分离的异种细胞群。例如，异种细胞群可以从肾活检物或从整个肾脏组织中分离。或者，异种细胞群可以来源于自肾活检物或整个肾脏组织建立的哺乳动物细胞的体外培养物。未分级分离的异种细胞群还可以被称为非富集的细胞群。

术语“天然肾脏”应该意指活受试者的肾脏。受试者可为健康的或不健康的。不健康的受试者可以患有肾脏疾病。

术语“再生作用”应该意指为天然肾脏提供益处的作用。所述作用可以包括但不限于减小对天然肾脏的损伤程度或改进天然肾脏功能的恢复或稳定。肾损伤可以呈纤维化、炎症、肾小球肥大等形式并且与受试者中的肾脏疾病相关。

如本文所使用的术语“再生潜能”或“潜在的再生生物活性”是指包含本文所描述的生物活性细胞制剂和/或混合物的类器官提供再生作用的潜能。

如本文所使用的术语“混合物”是指来源于未分级分离的异种细胞群的两种或更多种分离的、富集的细胞群的组合。根据某些实施方案，本发明的细胞群为肾细胞群。

“富集的”细胞群或制剂是指来源于起始肾脏细胞群(例如，未分级分离的异种细胞群)的细胞群，所述细胞群含有的特定细胞类型的百分数比起始群中所述细胞类型的百分数更大。例如，起始肾脏细胞群可以被富集感兴趣的第一细胞群、第二细胞群、第三细胞群、第四细胞群、第五细胞群等。如本文所使用的术语“细胞群”、“细胞制剂”和“细胞原型”可互换地使用。

一方面，如本文所使用的术语“富集的”细胞群是指来源于起始肾脏细胞群(例如，来自肾脏活检物或培养的哺乳动物肾脏细胞的细胞悬浮液)的细胞群，所述细胞群含有的能够产生EPO的细胞的百分数大于起始群中的能够产生EPO的细胞的百分数。例如，术语“B4”为来源于起始肾脏细胞群的细胞群，与起始群相比所述细胞群含有更大百分数的产生EPO的细胞、肾小球细胞以及血管细胞。本发明的细胞群可以被富集一种或多种细胞类型并且废弃一种或多种其他细胞类型。例如，富集的产生EPO的细胞群可以相对于非富集的细胞群(即富集的细胞群所来源于其中的起始细胞群)中的间质成纤维细胞和肾小管细胞被富集间质成纤维细胞并且废弃肾小管细胞和集合管上皮细胞。在引用EPO富集的或“B4”群的所有实施方案中，富集的细胞群为含有可以氧气调节的方式产生EPO的细胞的异种细胞群，所述氧气调节方式如通过从内源性天然EPO基因氧气可调的EPO表达所显示。

另一方面，与来源于健康个体或受试者的起始肾脏细胞群相比，含有的特定细胞类型(例如，血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞)的百分数比起始群中的所述细胞类型的百分数更大的富集的细胞群还可以缺乏或缺少一种或多种特定细胞类型(例如，血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞)。例如，一方面术语“B4’”或“B4撇号”为来源于起始肾脏细胞群的细胞群，所述细胞群取决于起始样本的疾病状态与健康个体相比缺乏或缺少一种或多种细胞类型，例如，血管细胞、肾小球细胞的或内分泌细胞。在一个实施方案中，B4’细胞群来源于患有慢性肾脏疾病的受试者。在一个实施方案中，B4’细胞群来源于患有病灶性节段性肾小球硬化(FSGS)的受试者。在另一个实施方案中，B4’细胞群来源于患有自身免疫性肾小球性肾炎的受试者。另一方面，B4’为来源于包括所有细胞类型(例如，血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞)的起始细胞群的细胞群，后来使所述细胞群废弃或缺少一种或多种细胞类型(例如，血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞)。在又另一个方面中，B4’为来源于包括所有细胞类型(例如，血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞)的起始细胞群的细胞群，其中富集一种或多种特定细胞类型(例如，血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞)。例如，在一个实施方案中，B4’细胞群可以被富集血管细胞但废弃肾小球细胞和/或内分泌细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群可以被富集肾小球细胞但废弃血管细胞和/或内分泌细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群可以被富集内分泌细胞但废弃血管细胞和/或肾小球细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群可以被富集血管细胞和内分泌细胞但废弃肾小球细胞。在优选的实施方案中，单独地或与另一种富集的细胞群例如B2和/或B3混合的B4’细胞群保留治疗性质。B4’细胞群例如被本文描述于例如实施例7-9的实施例中。

另一方面，富集的细胞群还可以是指如上所讨论的来源于起始肾脏细胞群的细胞群，所述细胞群含有的表达一种或多种血管、肾小球和近端肾小管标记物的细胞与一些产生EPO的细胞的百分数大于起始群中的表达一种或多种血管、肾小球和近端肾小管标记物的细胞与一些产生EPO的细胞的百分数。例如，术语“B3”是指来源于起始肾脏细胞群的细胞群，与起始群相比所述细胞群含有更大百分数的近端肾小管细胞以及血管细胞和肾小球细胞。在一个实施方案中，与起始群相比B3细胞群含有更大百分数的近端肾小管细胞，但与B2细胞群相比含有更小百分数的近端肾小管细胞。在另一个实施方案中，与起始群相比B3细胞群含有更大百分数的血管细胞和肾小球细胞标记物与一些产生EPO的细胞，但与B4细胞群相比含有更小百分数的血管细胞和肾小球细胞标记物与一些产生EPO的细胞。

另一方面，富集的细胞群还可以是指来源于如上所讨论的起始肾脏细胞群的细胞群，所述细胞群含有的表达一种或多种肾小管细胞标记物的细胞的百分数大于起始群中的表达一种或多种肾小管细胞标记物的细胞的百分数。例如，术语“B2”是指来源于起始肾脏细胞群的细胞群，与起始群相比所述细胞群含有更大百分数的肾小管细胞。此外，富集了表达一种或多种肾小管细胞标记物的细胞的细胞群(或“B2”)可以含有来自集合管系统的一些上皮细胞。虽然富集了表达一种或多种肾小管细胞标记物的细胞的细胞群(或“B2”)相对废弃了产生EPO的细胞、肾小球细胞和血管细胞，但与起始群相比富集的群可以含有更小百分数的这些细胞(产生EPO的细胞、肾小球细胞和血管细胞)。通常，废弃异种细胞群中的一种或多种细胞类型以使得相对于废弃前包含于异种细胞群中的细胞类型的比例经过废弃的细胞群含有更小比例的细胞类型。可以被废弃的细胞类型为任何类型的肾脏细胞。例如，在某些实施方案中，可以被废弃的细胞类型包括密度<约1.045g/ml的集合管和肾小管系统的具有大粒度的细胞，称为“B1”。在某些其他实施方案中，可以被废弃的细胞类型包括密度>约1.095g/ml的具有低粒度和生存力的碎片和小细胞，称为“B5”。在一些实施方案中，富集了肾小管细胞的细胞群相对废弃了所有以下细胞：“B1”、“B5”、氧气可调的表达EPO的细胞、肾小球细胞以及血管细胞。

如本文所使用的术语“低氧”培养条件是指其中相对于细胞在大气氧气水平(约21％)下培养的标准培养条件，在培养系统中细胞受到降低的可获得的氧气水平的培养条件。非低氧条件在本文中是指正常或含氧量正常的培养条件。

如本文所使用的术语“氧气可调的”是指细胞基于细胞可获得的氧气的量使基因表达(向上或向下)调节的能力。“低氧可诱导的”是指响应于氧张力减小的基因表达的上调(无论预先诱导或起始氧张力)。

术语“球体”是指被培养以允许与呈单层生长相反的3D生长的细胞的聚集体或集合体。应该指出术语“球体”不暗含聚集体为几何球形。聚集体可以被高度组织成具有完好的形态或它可为无组织的团块；它可以包括单一细胞类型或多于一种细胞类型。细胞可为原代分离物或永久细胞系或这两者的组合。在本定义中包括类器官和器官型培养物。

如本文所使用的术语“类器官”是指细胞的异种3D聚集，其概括了在天然器官中存在的细胞自组织、结构和信号相互作用的方面。术语“类器官”包括由悬浮细胞培养物形成的球体或细胞簇。

如本文所使用的术语“生物材料”是指适合用于引入到活组织中的天然或合成的生物相容材料。天然的生物材料为由活系统制成的材料。合成的生物材料为不是由活系统制成的材料。本文所公开的生物材料可为天然的和合成的生物相容材料的组合。如本文所使用，生物材料包括例如聚合物基质和支架。本领域普通技术人员将了解生物材料可以被配置呈各种形式，例如像液体水凝胶悬浮液、多孔泡沫，并且可以包括一种或多种天然的或合成的生物相容材料。

术语“构建物”是指沉积在由一种或多种合成的或天然存在的生物相容材料构成的支架或基质的表面之上或之中的一个或多个细胞群。一个或多个细胞群可以被涂覆有生物材料、沉积于生物材料上、包埋于生物材料中、附着至生物材料上、接种于或捕获于生物材料中，所述生物材料由一种或多种合成的或天然存在的生物相容聚合物、蛋白质或肽构成。一个或多个细胞群可以在体外或在体内与生物材料或支架或基质组合。通常，用来形成支架/生物材料的一种或多种生物相容材料被选择以指导、促进或容许其上沉积的至少一个细胞群形成多细胞、三维的组织结构。用来产生构建物的一种或多种生物材料还可以被选择以指导、促进或容许构建物或构建物的细胞组分的分散和/或与内源性宿主组织的结合，或被选择以指导、促进或容许构建物或构建物的细胞组分的存活、移植、耐受或功能性性能。

术语“标记物”或“生物标记物”一般是指DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物或基于糖脂的分子标记物，所述标记物或生物标记物在培养的细胞群中的表达或存在可以通过标准方法(或本文所公开的方法)来检测并且与培养的细胞群中的作为具体细胞类型的一种或多种细胞一致。标记物可为由细胞表达的多肽或染色体上可鉴定的物理位置，如基因、限制性内切酶识别位点或编码由天然细胞表达的多肽的核酸(例如，mRNA)。标记物可为称为“基因表达标记物”的基因的一个表达区，或不具有已知编码功能的DNA的一些区段。生物标记物可为细胞来源的(例如，分泌的)产物。

可互换地使用的术语“差异表达的基因”、“差异基因表达”及其同义词是指相对于其在第二细胞或细胞群中的表达在第一细胞或细胞群中的表达被激活至更高或更低水平的基因。所述术语还包括在培养中的第一或第二细胞的传代过程中其表达随着时间推移在不同阶段上被激活至更高或更低水平的基因。还应该理解，差异表达的基因可以在核酸水平或蛋白质水平上被激活或抑制，或可以受到选择性剪接(alternativesplicing)以产生不同的多肽产物。所述差异可以通过例如mRNA水平、表面表达、分泌或多肽的其他分配方面的变化来证明。差异基因表达可以包括两个或更多个基因或其基因产物之间的表达比较，或两个或更多个基因或其基因产物之间的表达比率比较，或甚至相同基因的两个不同加工的产物的比较，所述比较在第一细胞与第二细胞之间不同。差异表达包括例如第一细胞和第二细胞之中的基因或其表达产物上的时间或细胞表达样式的定量以及定性差异。出于本发明的目的，当在第一细胞和第二细胞中的给定基因的表达之间存在差异时认为存在“差异基因表达”。相对于施用之后来自患者的细胞(第二细胞)中的表达，标记物的差异表达可以存在于施用细胞群、混合物或构建物之前来自患者的细胞(第一细胞)中。

术语“抑制”、“下调”、“低表达”和“降低”可互换地使用并且意指相对于一个或多个对照例如像一个或多个阳性和/或阴性对照，基因的表达或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性降低。相对于施用之后来自患者的细胞，低表达可以存在于施用细胞群、混合物或构建物之前来自患者的细胞中。

术语“上调”或“过表达”用来意指相对于一个或多个对照例如像一个或多个阳性和/或阴性对照，基因的表达或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等效RNA分子的水平或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性升高。相对于施用之前来自患者的细胞，过表达可以存在于施用细胞群、混合物或构建物之后来自患者的细胞中。

如本文所使用的，术语“贫血”是指由于受试者的产生EPO的细胞不当产生功能性EPO蛋白、和/或将EPO蛋白不当释放到全身循环中、和/或骨髓中的成红细胞不能响应于EPO蛋白而引起的红细胞数目和/或血红蛋白水平缺少。患有贫血的受试者不能维持红细胞样细胞体内平衡。通常，贫血可以在肾脏功能衰退或失去(例如，慢性肾衰竭)情况下发生，贫血与相对EPO缺乏相关，贫血与充血性心力衰竭相关，贫血与骨髓抑制疗法如化学疗法或抗病毒疗法(例如，AZT)相关，贫血与非骨髓性癌相关，贫血与病毒感染如HIV相关并且慢性疾病如自身免疫性疾病(例如，类风湿性关节炎)、肝脏疾病和多器官系统衰竭的贫血。

术语“EPO缺乏”是指用促红细胞生成素受体激动剂(例如，重组EPO或EPO类似物)可治疗的任何病状或病症，包括贫血。

如本文所使用的术语“器官相关疾病”是指导致器官失去执行其功能的能力的与急性或慢性器官衰竭的任何阶段或程度相关的病症。

如本文所使用的术语“肾脏疾病”是指导致肾脏失去执行血液过滤和从血液中清除多余流体、电解质和废物的功能的能力的与急性或慢性肾衰竭的任何阶段或程度相关的病症。肾脏疾病还包括内分泌功能障碍如贫血(促红细胞生成素缺乏)和矿物质失衡(维生素D缺乏)。肾脏疾病可能起源于肾脏或可以次发于各种病状，包括(但不限于)心脏衰竭、高血压、糖尿病、自身免疫性疾病或肝脏疾病。肾脏疾病可为在对肾脏急性损伤之后发展的慢性肾衰竭的病状。例如，通过局部缺血和/或暴露于毒物而对肾脏的损伤可以引起急性肾衰竭；急性肾脏损伤之后未完全恢复可以导致发展慢性肾衰竭。

术语“治疗”是指针对肾脏疾病、贫血、EPO缺少、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷的治疗性治疗和预防性或防御性措施，其中目标是为了逆转、预防或减缓(减轻)目标病症。有治疗需要的那些人包括已经患有肾脏疾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷的那些人以及倾向于患有肾脏疾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷的那些人或在其体内待预防肾脏疾病、贫血、EPO缺少、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷的那些人。如本文所使用的术语“治疗”包括稳定和/或改进肾脏功能。

术语“受试者”应该意指任何单个人受试者，包括正经历或已经经历肾脏疾病、贫血或EPO缺乏的一种或多种体征、症状或其他指示物的适于治疗的患者。所述受试者包括但不限于最近被诊断或先前被诊断和现在正经历再发生或复发或无论什么原因处于肾脏疾病、贫血或EPO缺乏危险中的受试者。受试者可以先前已经被治疗肾脏疾病、贫血或EPO缺乏，或没有如此治疗。

术语“患者”是指希望治疗的任何单个动物，更优选地哺乳动物(包括例如像狗、猫、马、兔、动物园动物、奶牛、猪、绵羊以及非人灵长类动物那样的非人动物)。最优选地，本文中的患者为人。

术语“样本”或“患者样本”或“生物样本”应该一般意指从受试者或患者、体液、身体组织、细胞系、组织培养物或其他来源中获得的任何生物样本。所述术语包括组织活检物，例如像肾脏活检物。所述术语包括培养的细胞，例如像培养的哺乳动物肾脏细胞。用于从哺乳动物获得组织活检物和培养的细胞的方法在本领域是众所周知的。如果单独使用术语“样本”，它应该意指“样本”是“生物样本”或“患者样本”，即，这些术语可互换使用。

术语“测试样本”是指来自已经通过本发明的方法治疗的受试者的样本。测试样本可以起源于哺乳动物受试者中的各种来源，包括但不限于血液、精液、血清、尿液、骨髓、粘膜、组织等。

术语“对照”或“对照样本”是指其中阴性或阳性结果被预期帮助校正测试样本中的结果的阴性或阳性对照。适合本发明的对照包括但不限于已知表现正常红细胞样细胞体内平衡的指示物特征的样本、已知表现贫血的指示物特征的样本、从已知不是贫血的受试者中获得的样本以及从已知是贫血的受试者中获得的样本。适合用于本发明的方法的额外对照包括但不限于来源于已经用已知调节红细胞生成的药学制剂(例如，重组EPO或EPO类似物)治疗的受试者的样本。此外，对照可为在通过本发明的方法治疗之前从受试者中获得的样本。额外的适合的对照可为从已知具有肾脏疾病的任何类型或阶段的受试者中获得的测试样本和来自已知不具有肾脏疾病的任何类型或阶段的受试者的样本。对照可为正常健康匹配的对照。本领域普通技术人员将了解用于本发明的其他对照。

“再生预后”、“再生性预后”或“预后再生”一般是指预报或预测施用或植入本文所描述的细胞群、混合物或构建物的可能的再生进程或结果。对于再生预后，预报或预测可以由以下的一种或多种来告知：在植入或施用之后功能性器官(例如，肾脏)的改善、在植入或施用之后功能性肾脏的发展、在植入或施用之后改善的肾脏功能或能力的发展以及在植入或施用之后由天然肾脏来表达某些标记物。

“再生器官”是指在植入或施用如本文所描述的细胞群、混合物或构建物之后的天然器官。再生器官特征在于各种指示物，包括但不限于发展天然器官中的功能或能力、改善天然器官中的功能或能力以及表达天然器官中的某些标记物。本领域普通技术人员将了解其他指示物可以适合用于表征再生器官。

“再生肾脏”是指在植入或施用如本文所描述的细胞群、混合物或构建物之后的天然肾脏。再生肾脏特征在于各种指示物，包括但不限于发展天然肾脏中的功能或能力、改善天然肾脏中的功能或能力以及表达天然肾脏中的某些标记物。本领域普通技术人员将了解其他指示物可以适合用于表征再生肾脏。

SRC+细胞群

本发明提供如下细胞群，所述细胞群包含：分离的异种肾脏细胞群，所述肾脏细胞群富集了特定生物活性组分或细胞类型，和/或废弃了特定非活性或不希望的组分或细胞类型；以及用于急性或慢性肾脏疾病治疗的另外的生物活性细胞群，包括但不限于内皮细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞、脂肪来源的祖细胞。富集了特定生物活性组分或细胞类型，和/或废弃了特定非活性或不希望的组分或细胞类型的所述分离的异种肾脏细胞群可包括本文所描述的任何细胞群。在一个实施方案中，另外的生物活性组分，例如内皮细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞、脂肪来源的祖细胞，与富集了特定生物活性组分或细胞类型，和/或废弃了特定非活性或不希望的组分或细胞类型的所述分离的异种肾脏细胞群混合。另一方面，本发明提供用于制备本文所描述的SRC+细胞群的方法。组成所述细胞群的另外的生物活性组分，例如内皮细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞、脂肪来源的祖细胞，可以足以改善细胞或组织缺陷的任何百分数存在。

本发明的细胞群可包含组成所述细胞群的一种或多种另外的生物活性组分，例如但不限于内皮细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞、脂肪来源的祖细胞。在某些实施方案中，细胞群包含两种另外的生物活性组分。在某些实施方案中，细胞群包含三种另外的生物活性组分。在某些实施方案中，细胞群包含四种另外的生物活性组分。在某些实施方案中，细胞群包含五种另外的生物活性组分。在某些实施方案中，细胞群包含六种另外的生物活性组分。在某些实施方案中，细胞群包含七种另外的生物活性组分。在某些实施方案中，细胞群包含八种另外的生物活性组分。在某些实施方案中，细胞群包含九种另外的生物活性组分。在某些实施方案中，细胞群包含十种另外的生物活性组分。

在一个实施方案中，另外的生物活性组分为上皮细胞。在一个实施方案中，上皮细胞为近端肾小管上皮细胞。在另一个实施方案中，上皮细胞为远端肾小管上皮细胞。在另一个实施方案中，上皮细胞为壁层上皮细胞。

在另一个实施方案中，另外的生物活性组分为上皮细胞。在一个实施方案中，上皮细胞为静脉内皮细胞。在一个实施方案中，上皮细胞为动脉内皮细胞。在一个实施方案中，上皮细胞为毛细血管内皮细胞。在一个实施方案中，上皮细胞为淋巴内皮细胞。

在另一个实施方案中，另外的生物活性组分为集合管细胞。在又另一个实施方案中，另外的生物活性组分为平滑肌细胞。在另一个实施方案中，另外的生物活性组分为间充质干细胞。在另一个实施方案中，另外的生物活性组分为内皮、间充质、上皮或造血谱系的祖细胞。在另一个实施方案中，另外的生物活性组分为内胚层、外胚层或胚胎间充质来源的祖细胞。在某些实施方案中，另外的生物活性组分为任何来源或起源的干细胞，包括但不限于胚胎(ES)干细胞和诱导的多能(iPS)干细胞。在一些实施方案中，另外的生物活性组分为任何来源或起源的干细胞的衍生物，包括但不限于胚胎(ES)干细胞和诱导的多能(iPS)干细胞，其中所述衍生物可通过限定组合或混合小分子和/或蛋白质和/或核酸分子由干细胞的定向分化产生。在一些实施方案中，另外的生物活性组分为内皮、间充质、上皮或造血谱系的祖细胞的衍生物，其中所述衍生物可通过限定组合或混合小分子和/或蛋白质和/或核酸分子由干细胞的定向分化产生。在一些实施方案中，另外的生物活性组分为内胚层、外胚层或胚胎间充质来源的祖细胞的衍生物，其中所述衍生物可通过限定组合或混合小分子和/或蛋白质和/或核酸分子由干细胞的定向分化产生。在一个实施方案中，另外的生物活性组分为任何谱系或起源的基因修饰的细胞。

在更另一个实施方案中，另外的生物活性组分为间质性细胞。在一个实施方案中，间质性细胞为支持性成纤维细胞。在另一个实施方案中，间质性细胞为产生促红细胞生成素的特化皮质成纤维细胞。

在一个实施方案中，另外的生物活性组分来源于与受试者自体的来源。在一个其他实施方案中，另外的生物活性组分来源于与受试者同种异体的来源。在某些实施方案中，另外的生物活性组分来源于与受试者自体的来源，所述另外的生物活性组分为与另外一种来源于与受试者同种异体的来源的生物活性组分组合的混合物。

在某些方面，本发明提供用于通过定向递送本文所描述的细胞群和/或类器官和/或生物材料来实现肾脏质量和功能的靶向再生的方法。在其他方面，本发明进一步提供用于通过施用本文所描述的细胞群和/或类器官和/或生物材料来挽救和/或恢复患有急性或慢性肾脏疾病的患者中的肾功能的方法。

治疗性类器官

本发明还提供包含本文描述的生物活性组分(例如B2、B4和B3)和/或由其形成的类器官，所述生物活性组分废弃了非活性或不希望的组分(例如B1和B5)，单独地或混合用于治疗急性和/或慢性肾脏疾病。一方面，本发明提供含有单独地或当与其他生物活性亚级分(例如，B2和/或B3)混合时保留治疗性质(例如，肾脏功能的稳定和/或改善和/或再生)的废弃或缺少一种或多种细胞类型(例如，血管、内分泌或内皮细胞类型)的特定亚级分B4(即，B4’)和/或由其形成的类器官。在优选的实施方案中，生物活性细胞群为B2。在某些实施方案中，B2细胞群与B4或B4’混合。在其他实施方案中，B2细胞群与B3混合。在其他实施方案中，B2细胞群与B3和B4、或B3和/或B4的特定细胞组分混合。在所有实施方案中，本发明的类器官在体外形成并且培养。在所有实施方案中，所述类器官还可包含另外的生物活性细胞群或由另外的生物活性细胞群形成，包括但不限于内皮细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞、脂肪来源的祖细胞。在一个实施方案中，另外的生物活性细胞群(包括但不限于内皮细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞、脂肪来源的祖细胞)与富集了特定生物活性组分或细胞类型，和/或废弃了特定非活性或不希望的组分或细胞类型的分离的异种肾脏细胞群混合。

在一个实施方案中，本发明的类器官包含B2细胞群或由B2细胞群形成，其中B2细胞群包含富集的肾小管细胞群。在另一个实施方案中，异种肾细胞群还包含B4细胞群。在又另一个实施方案中，异种肾细胞群还包含B3细胞群。在还另一个实施方案中，异种肾细胞群还包含B5细胞群。

在某些实施方案中，所述细胞群包含B2细胞群，其中B2细胞群包含富集的肾小管细胞群并且废弃了B1细胞群和/或B5细胞群。

另一方面，本发明提供了形成类器官的方法，所述类器官包含本发明的生物活性组分(例如，B2、B4和B3)，和/或由其形成，所述生物活性组分废弃了非活性或不希望的组分(例如，B1和B5)，为单独的或混合的。一方面，本发明提供了包含单独地或当与其他生物活性亚级分(例如，B2和/或B3)混合时保留治疗性质(例如，肾脏功能的稳定和/或改善和/或再生)的废弃或缺少一种或多种细胞类型(例如，血管、内分泌或内皮细胞类型)的特定亚级分B4(即，B4’)，和/或由其形成的类器官。在优选的实施方案中，生物活性细胞群为B2。在某些实施方案中，B2细胞群与B4或B4’混合。在其他实施方案中，B2细胞群与B3混合。在其他实施方案中，B2细胞群与B3和B4、或B3和/或B4的特定细胞组分混合。

在一个实施方案中，本发明的类器官包含B2细胞群或由B2细胞群形成，其中B2细胞群包含富集的肾小管细胞群。在另一个实施方案中，异种肾细胞群还包含B4细胞群。在又另一个实施方案中，异种肾细胞群还包含B3细胞群。在还另一个实施方案中，异种肾细胞群还包含B5细胞群。

在某些实施方案中，所述细胞群包含B2细胞群，其中B2细胞群包含富集的肾小管细胞群并且废弃了B1细胞群和/或B5细胞群。

另一方面，本发明提供了使用本文所描述的生物活性细胞制剂和/或混合物形成类器官的方法。使用3DCOL(I)凝胶培养由原代肾细胞群产生肾小管的一般方法在本领域是已知的，例如，如在Joraku等,Methods.2009年2月；47(2):129-33中。在所有实施方案中，本发明的类器官在体外形成并且培养。

在一些实施方案中，可以例如并且不限于使用以下培养方法或系统由本文所描述的生物活性细胞制剂和/或混合物诱导形成类器官和肾小管：i)2D培养；ii)3D培养：COL(I)凝胶；iii)3D培养：Matrigel；iv)3D培养：旋转器，然后是COL(I)/Matrigel；以及v)3D培养：COL(IV)凝胶。具体的由NKA形成类器官和肾小管的实施例在以下2和4中提供。

在一个实施方案中，可以在2D培养中诱导由本文所描述的生物活性细胞制剂和/或混合物形成的类器官。在一个实施方案中，将本文所描述的生物活性细胞制剂和/或混合物接种在标准的2D塑料皿上。在一个实施方案中，将细胞以约5000个细胞/cm²的密度接种。细胞可被接种在适当的培养基中，例如像肾细胞完全生长培养基(RCGM)。一般地，细胞群可持续约7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天或更多天生长至汇合，大约每3-4天定期更换培养基。在一个实施方案中，细胞显示在约7天至约15天之间自发性自组织成球状结构，即类器官和肾小管。

在另一个实施方案中，可以在3D培养中诱导由本文所描述的生物活性细胞制剂和/或混合物形成的类器官。在一个实施方案中，使用本发明的细胞群连同天然的或合成来源的生物材料支架一起产生类器官。在一个实施方案中，配制的本文所描述的生物活性细胞制剂和/或混合物可结合到胶原(I)凝胶、胶原(IV)凝胶、Matrigel或如先前所述的这些的任何混合物中(参见Guimaraes-Souza等,2012.Invitroreconstitutionofhumankidneystructuresforrenalcelltherapy.NephrolDialTransplant0:1-9)。可以将液体凝胶调节至中性pH并且将本文所描述的生物活性细胞制剂和/或混合物以约500-2500个细胞/ul混合。在一个实施方案中，以约1000个细胞/ul混合。将细胞/凝胶混合物等分到24孔板的孔中，例如，(约200至约400ul/孔)，并且使其在37℃下固化几个小时。然后添加细胞培养基并且使培养物成熟约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、或约10天，同时定期更换培养基。在一个实施方案中，肾小管结构网络通过本文所描述的生物活性细胞制剂和/或混合物在整个凝胶基质中组织为晶格和环形式。

在另一个实施方案中，类器官可通过在旋转烧瓶或低结合的塑料皿中悬浮培养本文所描述的生物活性细胞制剂和/或混合物来形成。在一个实施方案中，细胞可在旋转烧瓶的培养基中在约80rpm下培养长达4天。例如，球体然后可在Matrigel涂覆的板上再培养约7天、约8天、约9天、或约10天。在一个实施方案中，由本文所描述的生物活性细胞制剂和/或混合物形成的球体显示出产生肾小管的潜力，如肾小管结构从培养的球体重新出芽所示的。

细胞群

本发明的SRC+细胞群和/或类器官可以含有分离的异种肾脏细胞群及其混合物和/或由其形成，所述分离的异种肾脏细胞群及其混合物富集了特定的生物活性组分或细胞类型，和/或废弃了特定的非活性或不希望的组分或细胞类型以用于治疗肾脏疾病，即，提供肾功能的稳定和/或改善和/或再生，这些先前在Presnell等U.S.2011-0117162和Ilagan等PCT/US2011/036347中已描述,其全部内容以引用的方式并入本文。类器官可以含有与健康个体相比缺乏细胞组分但保留治疗性质(即，提供肾脏功能的稳定和/或改善和/或再生)的分离的肾细胞级分。本文所描述的细胞群、细胞级分和/或细胞的混合物可以来源于健康个体、患有肾脏疾病的个体或如本文所描述的受试者。

生物活性细胞群

本发明涵盖待施用至有需要的受试者中的靶器官或组织的SRC+细胞群和包含生物活性细胞群的治疗性类器官。生物活性细胞群一般是指当施用至受试者时可能具有治疗性质的细胞群。例如，当施用至有需要的受试者时，包含生物活性肾细胞群的类器官可以在受试者中提供肾脏功能的稳定和/或改善和/或再生。治疗性质可以包括再生作用。

生物活性细胞群包括但不限于干细胞(例如，多能的、多潜能的、寡能的或单能的)如胚胎干细胞、羊膜干细胞、成人干细胞(例如，造血的、乳房的、肠的、间充质的、胎盘的、肺、骨髓、血液、脐带、内皮的、牙髓、脂肪的、神经的、嗅觉的、神经峭、睾丸的)、诱导的多能干细胞；基因修饰的细胞；以及来源于身体任何来源的细胞群或组织外植体。生物活性细胞群本质上可为分离的、富集的、纯化的、同种的或异种的。本领域普通技术人员将了解适合用于产生本发明的类器官的其他生物活性细胞群。

在一个实施方案中，细胞的来源与所意图的靶器官或组织相同。例如，肾细胞可以源自产生待被施用至肾脏的类器官的肾脏。在另一个实施方案中，细胞的来源不与所意图的靶器官或组织相同。例如，表达促红细胞生成素的细胞可以源自产生待被施用至肾脏的类器官的肾脂肪。

一方面，本发明提供了包含富集了生物活性组分和废弃了非活性或不希望的组分以提供比起始群优越的治疗结果和再生结果的异种肾细胞群的某些亚级分的类器官。例如，本文所描述的生物活性肾细胞(例如，废弃了非活性或不希望的组分(例如B1和B5)的B2、B4和B3，为单独的混合的)可用于产生用于稳定和/或改善和/或再生肾脏功能的类器官。

另一方面，类器官含有单独地或当与其他生物活性亚级分(例如，B2和/或B3)混合时保留治疗性质(例如，肾脏功能的稳定和/或改善和/或再生)的废弃或缺少一种或多种细胞类型(例如，血管、内分泌或内皮细胞类型)的特定亚级分B4(即，B4’)。在优选的实施方案中，生物活性细胞群为B2。在某些实施方案中，B2细胞群与B4或B4’混合。在其他实施方案中，B2细胞群与B3混合。在其他实施方案中，B2细胞群与B3和B4、或B3和/或B4的特定细胞组分混合。

B2细胞群特征在于表达肾小管细胞标记物，所述肾小管细胞标记物选自由以下的一种或多种组成的组：巨蛋白(megalin)、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17(RAS癌基因家族成员)(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含有FXYD结构域的离子转运调节因子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换因子)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)、和钙蛋白酶-8(Capn8)以及集合管标记物水通道蛋白-4(Aqp4)。B2比B3和/或B4的粒状更大和更多，并且因此具有约1.045g/ml与约1.063g/ml之间(啮齿动物)、约1.045g/ml与1.052g/ml之间(人)以及约1.045g/ml与约1.058g/ml之间(犬)的浮力密度。

B3细胞群特征在于表达血管、肾小球和近端肾小管标记物与一些产生EPO的细胞，与B2和B4相比具有中等的大小和粒度，并且因此具有约1.063g/ml与约1.073g/ml之间(啮齿动物)、约1.052g/ml与约1.063g/ml之间(人)以及约1.058g/ml与约1.063g/ml之间(犬)的浮力密度。B3特征在于表达选自由以下的一种或多种组成的组的标记物：水通道蛋白7(Aqp7)、含有FXYD结构域的离子转运调节因子2(Fxyd2)、溶质载体家族17(磷酸钠)成员3(Slc17a3)、溶质载体家族3成员1(Slc3a1)、紧密连接蛋白2(claudin2)(Cldn2)、新天冬氨酸蛋白酶A天冬氨酸肽酶(Napsa)、溶质载体家族2(促进的葡萄糖转运蛋白)成员2(Slc2a2)、丙氨酰(膜)氨基肽酶(Anpep)、跨膜蛋白27(Tmem27)、酰基-CoA合成酶中链家族成员2(Acsm2)、谷胱甘肽过氧化物酶3(Gpx3)、果糖-1,6-二磷酸酶1(Fbp1)以及丙氨酸-乙醛酸转氨酶2(Agxt2)。B3还特征在于血管表达标记物血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)和肾小球表达标记物肾小球足细胞裂隙膜蛋白(podocin)(Podn)。

B4细胞群特征在于表达含有以下的一种或多种的血管标记物集合：PECAM、VEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146；含有以下的一种或多种的肾小球标记物集合：肾小球足细胞裂隙膜蛋白(Podn)和肾小球足细胞特异性蛋白(Neph)；以及与未分级分离(UNFX)的群相比氧气可调的、EPO富集的群，B2和B3。B4还特征在于表达以下标记物的一种或多种：趋化因子(C-X-C基序)受体4(Cxcr4)、内皮素受体B型(Ednrb)、V型胶原α2(Col5a2)、钙粘蛋白5(Cdh5)、纤溶酶原激活物、组织(Plat)、血管生成素2(Angpt2)、激酶插入结构域蛋白受体(Kdr)、酸性富含半管氨酸的分泌蛋白(骨粘连蛋白)(Sparc)、丝甘聚糖(Srgn)、TIMP金属肽酶抑制剂3(Timp3)、维尔姆斯氏瘤1(Wt1)、无翼型MMTV整合位点家族成员4(Wnt4)、G-蛋白信号转导调节子4(Rgs4)、血小板内皮细胞粘着分子(Pecam)以及促红细胞生成素(Epo)。B4还特征在于与B2或B3相比粒状细胞更小、更少，具有约1.073g/ml与约1.091g/ml之间(啮齿动物)、约1.063g/ml与约1.091g/mL之间(人和犬)的浮力密度。

B4’细胞群被定义为具有1.063g/mL与1.091g/mL之间的浮力密度并且表达以下标记物的一种或多种：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、肾小球足细胞裂隙膜蛋白、肾小球足细胞特异性蛋白、EPO、CK7、CK8/18/19。在一个实施方案中，B4’细胞群特征在于表达含有以下的一种或多种的血管标记物集合：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146。在另一个实施方案中，B4’细胞群特征在于表达内分泌标记物EPO。在一个实施方案中，B4’细胞群特征在于表达含有以下的一种或多种的肾小球标记物集合：肾小球足细胞裂隙膜蛋白(Podn)和肾小球足细胞特异性蛋白(Neph)。在某些实施方案中，B4’细胞群特征在于表达含有以下的一种或多种的血管标记物集合：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a并且特征在于表达内分泌标记物EPO。在另一个实施方案中，B4’还特征在于与B2或B3相比粒状细胞更小、更少，具有约1.073g/ml与约1.091g/ml之间(啮齿动物)、约1.063g/ml与约1.091g/mL之间(人和犬)的浮力密度。

一方面，本发明提供了含有分离的、富集的B4’人肾细胞群的类器官，所述B4’人肾细胞群包含密度为1.063g/mL与1.091g/mL之间的产生促红细胞生成素(EPO)的细胞、血管细胞和肾小球细胞中的至少一种。在一个实施方案中，B4’细胞群特征在于表达血管标记物。在某些实施方案中，B4’细胞群特征不在于表达肾小球标记物。在一些实施方案中，B4’细胞群能够进行氧气可调的促红细胞生成素(EPO)表达。

在一个实施方案中，本发明的类器官含有B4’细胞群但不包括B2细胞群，所述B2细胞群包含密度为1.045g/mL与1.052g/mL之间的肾小管细胞。在另一个实施方案中，含有B4’细胞群的类器官不包括B1细胞群，所述B1细胞群包含密度<1.045g/ml的集合管和肾小管系统的大颗粒细胞。在又另一个实施方案中，B4’细胞群类器官不包括B5细胞群，所述B5细胞群包含密度>1.091g/ml的具有低粒度和生存力的碎片和小细胞。

在一个实施方案中，含有B4’细胞群的类器官不包括B2细胞群，所述B2细胞群包含密度为1.045g/mL与1.052g/mL之间的肾小管细胞；B1细胞群，所述B1细胞群包含密度<1.045g/ml的集合管和肾小管系统的大颗粒细胞；以及B5细胞群，所述B5细胞群包含密度为>1.091g/ml的具有低粒度和生存力的碎片和小细胞。在一些实施方案中，B4’细胞群可以来源于患有肾脏疾病的受试者。

一方面，本发明提供了含有包含第一细胞群B2和第二细胞群B4’的人肾细胞混合物的类器官，所述第一细胞群B2包含密度在1.045g/mL与1.052g/mL之间的分离的、富集的肾小管细胞群，所述第二细胞群B4’包含密度在约1.063g/mL与1.091g/mL之间的产生促红细胞生成素(EPO)的细胞和血管细胞但废弃了肾小球细胞，其中混合物不包括B1细胞群或B5细胞群，所述B1细胞群包含密度<1.045g/ml的集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，所述B5细胞群包含密度>1.091g/ml的具有低粒度和生存力的碎片和小细胞。在某些实施方案中，B4’细胞群特征在于表达血管标记物。在一个实施方案中，B4’细胞群特征不在于表达肾小球标记物。在某些实施方案中，B2进一步包含集合管上皮细胞。在一个实施方案中，类器官含有能够进行受体介导的白蛋白摄取的细胞的混合物或由其形成。在另一个实施方案中，细胞的混合物能够进行氧气可调的促红细胞生成素(EPO)表达。在一个实施方案中，混合物含有能够在体外和在体内产生和/或刺激产生透明质酸(HA)的高分子量物质的表达HAS-2的细胞。在所有实施方案中，第一细胞群和第二细胞群可以来源于肾脏组织或培养的肾脏细胞(Basu等LipidsinHealthandDisease,2011,10:171)。

在一个实施方案中，类器官含有能够在体内递送时提供再生刺激的混合物。在其他实施方案中，混合物能够在体内递送时减少肾小球过滤、肾小管再吸收、尿产生和/或内分泌功能的衰退，稳定或改善肾小球过滤、肾小管再吸收、尿产生和/或内分泌功能。在一个实施方案中，B4’细胞群来源于患有肾脏疾病的受试者。

一方面，本发明提供了含有分离的、富集的B4’人肾细胞群的类器官，所述B4’人肾细胞群包含密度在1.063g/mL与1.091g/mL之间的产生促红细胞生成素(EPO)的细胞、血管细胞和肾小球细胞中的至少一种。在一个实施方案中，B4’细胞群特征在于表达血管标记物。在某些实施方案中，B4’细胞群特征不在于表达肾小球标记物。不被表达的肾小球标记物可为肾小球足细胞裂隙膜蛋白(参见实施例10)。在一些实施方案中，B4’细胞群能够进行氧气可调的促红细胞生成素(EPO)表达。

在一个实施方案中，含有B4’细胞群的类器官不包括B2细胞群，所述B2细胞群包含具有密度为1.045g/mL与1.052g/mL之间的肾小管细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群类器官不包括B1细胞群，所述B1细胞群包含密度<1.045g/ml的集合管和肾小管系统的大颗粒细胞。在又另一个实施方案中，B4’细胞群类器官不包括B5细胞群，所述B5细胞群包含密度>1.091g/ml的具有低粒度和生存力的碎片和小细胞。

在一个实施方案中，含有B4’细胞群的类器官不包括B2细胞群，所述B2细胞群包含密度为1.045g/mL与1.052g/mL之间的肾小管细胞；B1细胞群，所述B1细胞群包含密度为<1.045g/ml的集合管和肾小管系统的大颗粒细胞；以及B5细胞群，所述B5细胞群包含密度为>1.091g/ml的具有低粒度和生存力的碎片和小细胞。在一些实施方案中，B4’细胞群可以来源于患有肾脏疾病的受试者。

一方面，本发明提供了含有包含第一细胞群B2和第二细胞群B4’的人肾细胞混合物的类器官，所述第一细胞群B2包含密度在1.045g/mL与1.052g/mL之间的分离的、富集的肾小管细胞群，所述第二细胞群B4’包含密度在约1.063g/mL与1.091g/mL之间的产生促红细胞生成素(EPO)的细胞和血管细胞但废弃了肾小球细胞，其中混合物不包括B1细胞群或B5细胞群，所述B1细胞群包含密度<1.045g/ml的集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，所述B5细胞群包含密度>1.091g/ml的具有低粒度和生存力的碎片和小细胞。在某些实施方案中，B4’细胞群特征在于表达血管标记物。在一个实施方案中，B4’细胞群特征不在于表达肾小球标记物。在某些实施方案中，B2进一步包含集合管上皮细胞。在一个实施方案中，细胞的混合物能够进行受体介导的白蛋白摄取。在另一个实施方案中，细胞的混合物能够进行氧气可调的促红细胞生成素(EPO)表达。在一个实施方案中，混合物含有能够在体外和在体内产生和/或刺激产生透明质酸(HA)的高分子量物质的表达HAS-2的细胞。在所有实施方案中，第一细胞群和第二细胞群可以来源于肾脏组织或培养的肾脏细胞。

另一方面，本发明提供含有异种肾细胞群的类器官，所述异种肾细胞群包含细胞级分或富集的细胞群(例如，B1、B2、B3、B4(或B4’)以及B5)的组合。在一个实施方案中，组合具有约1.045g/ml与约1.091g/ml之间的浮力密度。在一个其他实施方案中，组合具有小于约1.045g/ml与约1.099g/ml或约1.100g/ml之间的浮力密度。在另一个实施方案中，组合具有如通过在密度梯度上分离(例如，通过离心)所确定的浮力密度。在又另一个实施方案中，细胞级分的组合含有废弃了B1和/或B5的B2、B3以及B4(或B4’)。在一些实施方案中，细胞级分的组合含有B2、B3、B4(或B4’)以及B5但废弃了B1。一旦废弃B1和/或B5，组合可以随后在制备包含B2、B3以及B4(或B4’)细胞级分的组合的类器官之前在体外培养。

本发明的发明人已经出乎预料地发现体外培养废弃B1的B2、B3、B4和B5的组合导致B5的废弃。在一个实施方案中，在至少一次、两次、三次、四次或五次传代之后废弃B5。在一个其他实施方案中，在本文所描述的条件下传代的B2、B3、B4以及B5细胞级分组合提供了B5百分数为传代细胞群的小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％或小于约0.5％的传代细胞群。

在另一个实施方案中，B4’为细胞级分的组合的一部分。在一个其他实施方案中，体外培养废弃B5是在低氧条件下。

在一个实施方案中，类器官含有能够在体内递送时提供再生刺激的混合物。在其他实施方案中，混合物能够在体内递送时减少肾小球过滤、肾小管再吸收、尿产生和/或内分泌功能的衰退，稳定或改善肾小球过滤、肾小管再吸收、尿产生和/或内分泌功能。在一个实施方案中，B4’细胞群来源于患有肾脏疾病的受试者。

在一个优选的实施方案中，类器官含有包含与B3和/或B4组合的B2的混合物，和/或由其形成。在另一个优选的实施方案中，混合物包含与B3和/或B4’组合的B2。在其他优选的实施方案中，混合物由以下组成或主要由以下组成：(i)与B3和/或B4组合的B2；或(ii)与B3和/或B4’组合的B2。

含有B4’细胞群的混合物可以含有也从非健康受试者中获得的B2和/或B3细胞群。非健康受试者可为与从其中获得B4’级分相同的受试者。与B4’细胞群相反，从非健康受试者中获得的B2和B3细胞群与来源于健康个体的起始肾脏细胞群相比通常不缺少一种或多种特定细胞类型。

如在Presnell等WO/2010/056328中所描述，已经发现B2和B4细胞群能够通过透明质酸合酶-2(HAS-2)(更确切地在B2细胞群中富集的标记物)的作用在体外和在体内表达透明质酸(HA)的较高分子量物质。在5/6Nx模型中用B2处理显示减少了纤维化，伴随有体内强烈的表达HAS-2表达以及在处理的组织内预期的高分子量HA的产生。显著地，不进行处理的5/6Nx模型导致具有限制的HAS-2检测的纤维化以及很少产生高分子量HA。不希望受理论约束，假设主要由B2产生(并且在一定程度上由B4产生)的HA的这种抗炎性高分子量物质与细胞制剂协同作用于减少肾纤维化和帮助肾再生。因此，本发明包括含有本文所描述的生物活性肾细胞连同包含透明质酸的生物材料一起的类器官。本发明还涵盖通过由植入的细胞直接产生或刺激产生来提供再生刺激的生物材料组分。

一方面，本发明提供了用于在有需要的受试者中治疗肾脏疾病、贫血和/或EPO缺乏的含有和/或产自分离的、异种的、产生EPO的肾脏细胞群的类器官。在一个实施方案中，细胞群来源于肾脏活检物。在另一个实施方案中，细胞群来源于全肾脏组织。在一个其他实施方案中，细胞群来源于产生自肾脏活检物或全肾脏组织的哺乳动物肾脏细胞的体外培养物。在所有实施方案中，这些群为未分离分级的细胞群，在本文中又称为非富集的细胞群。

另一方面，本发明提供了含有和/或产自分离的产生促红细胞生成素(EPO)的肾脏细胞群的类器官，所述分离的产生促红细胞生成素(EPO)的肾脏细胞群被进一步富集以使得富集的亚群中的产生EPO的细胞的比例相对于起始或初始细胞群中产生EPO的细胞的比例更大。在一个实施方案中，相对于包含在未富集的初始群中的间质成纤维细胞和肾小管细胞，富集的产生EPO的细胞级分含有更大比例的间质成纤维细胞和更小比例的肾小管细胞。在某些实施方案中，相对于包含在未富集的初始群中的肾小球细胞、血管细胞和集合管细胞，富集的产生EPO的细胞级分含有更大比例的肾小球细胞和血管细胞以及更小比例的集合管细胞。在所述实施方案中，这些群在本文中称为“B4”细胞群。

另一方面，本发明提供了含有和/或产自与一种或多种额外的肾脏细胞群混合的产生EPO的肾脏细胞群的类器官。在一个实施方案中，产生EPO的细胞群为富集了产生EPO的细胞的第一细胞群，例如B4。在另一个实施方案中，产生EPO的细胞群为没有富集产生EPO的细胞的第一细胞群，例如B2。在另一个实施方案中，第一细胞群与第二肾脏细胞群混合。在一些实施方案中，第二细胞群被富集肾小管细胞，这可以通过肾小管细胞表型的存在来显示。在另一个实施方案中，肾小管细胞表型可以通过一种肾小管细胞标记物的存在来指示。在另一个实施方案中，肾小管细胞表型可以通过一种或多种肾小管细胞标记物的存在来指示。肾小管细胞标记物包括但不限于巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17(RAS癌基因家族成员)(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含有FXYD结构域的离子转运调节因子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换因子)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)以及钙蛋白酶-8(Capn8)。在另一个实施方案中，第一细胞群与数种类型的肾脏细胞中的至少一种混合，所述肾脏细胞包括但不限于间质来源的细胞、肾小管细胞、集合管来源的细胞、肾小球来源的细胞和/或来源于血液或脉管系统的细胞。

本发明的类器官可以包括产生EPO的肾脏细胞群或由其形成，所述产生EPO的肾脏细胞群含有呈与B2和/或B3的混合物形式或呈富集的细胞群形式(例如B2+B3+B4/B4’)的B4或B4’。

一方面，类器官含有和/或产自产生EPO的肾脏细胞群，所述产生EPO的肾脏细胞群特征在于EPO表达和对氧气的生物响应性以使得培养系统的氧张力减小导致EPO表达的诱导。在一个实施方案中，产生EPO的细胞群被富集产生EPO的细胞。在一个实施方案中，当细胞群在一定条件下培养时诱导EPO表达，在所述条件中与在可获得的氧气的正常大气(大约21％)水平下培养的细胞群相比细胞在培养系统中经受可获得的氧气水平的减少。在一个实施方案中，相对于在正常氧气条件下培养的产生EPO的细胞，培养于较低氧气条件中的产生EPO的细胞表达更高水平的EPO。通常，在可获得的氧气的降低水平(又称为低氧培养条件)下培养细胞意指相对于在可获得的氧气的正常大气水平(又称为正常或含氧量正常的培养条件)下培养细胞，减少的氧气水平降低。在一个实施方案中，低氧细胞培养条件包括在约小于1％氧气、约小于2％氧气、约小于3％氧气、约小于4％氧气或约小于5％氧气下培养细胞。在另一个实施方案中，正常或含氧量正常的培养条件包括在约10％氧气、约12％氧气、约13％氧气、约14％氧气、约15％氧气、约16％氧气、约17％氧气、约18％氧气、约19％氧气、约20％氧气或约21％氧气下培养细胞。

在一个其他实施方案中，获得了EPO表达的诱导或增加并且可以通过在约小于5％可获得的氧气下培养细胞和比较在大气(约21％)氧气下培养的细胞的EPO表达水平来观察。在另一个实施方案中，在能够通过一种方法表达EPO的细胞培养物中获得EPO诱导，所述方法包括其中细胞培养物在大气氧气(约21％)下培养一定时间段的第一培养阶段和其中可获得的氧气水平降低并且在约小于5％可获得的氧气下培养所述细胞的第二培养阶段。在另一个实施方案中，响应于低氧条件的EPO表达通过HIF1α来调节。本领域普通技术人员将了解本领域中已知的其他氧气操纵培养条件可以用于本文所描述的细胞。

一方面，类器官含有特征在于生物响应(例如，EPO表达)于灌注条件的富集的产生EPO的哺乳动物细胞群和/或由其形成。在一个实施方案中，灌注条件包括瞬时的、间歇的或连续的流体流动(灌注)。在一个实施方案中，当其中培养细胞的培养基以通过流动将动力转移至细胞这样一种方式间歇或连续循环或搅拌时机械诱导EPO表达。在一个实施方案中，受到瞬时的、间歇的或连续的流体流动的细胞以它们在为形成所述三维结构提供构架和/或间隙的材料之中或之上呈三维结构存在这样一种方式培养。在一个实施方案中，细胞在多孔珠粒上培养并且借助于摇床、轨道式平台或旋转烧瓶经受间歇的或连续的流体流动。在另一个实施方案中，细胞在三维支架上培养并且放入装置中，借此支架是固定的并且定向地流体流动通过或穿过支架。本领域普通技术人员将了解本领域中已知的其他灌注培养条件可以用于本文所描述的细胞。

非活性细胞群

如本文所述，本发明部分地基于以下惊人的发现，即包含异种肾细胞群的某些亚级分和/或由其组成，富集了生物活性组分并且废弃了非活性或不希望的组分的类器官提供了比起始群优越的治疗结果和再生结果。在优选的实施方案中，由本发明提供的类器官含有废弃了B1和/或B5细胞群的细胞群。例如，以下物质可以被废弃B1和/或B5：B2、B3和B4(或B4’)中的两种或更多种的混合物；B2、B3和B4(或B4’)的富集的细胞群。

B1细胞群包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，其中细胞群具有小于约1.045g/m的浮力密度。B5细胞群由具有低粒度和生存力的碎片和小细胞构成并且具有大于约1.091g/ml的浮力密度。

分离和培养细胞群的方法

一方面，本发明的SRC+细胞群和/或类器官含有已从肾脏组织中分离出和/或培养的细胞群和/或由其形成。本文提供了用于分开和分离肾细胞组分的方法，所述肾细胞组分例如为包含在用于治疗用途(包括治疗肾脏疾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷以及肾小球过滤缺陷)的类器官中的富集的细胞群。在一个实施方案中，细胞群从新鲜消化的(即，机械或酶促消化的)肾脏组织中分离出来或从哺乳动物肾脏细胞的异种体外培养物中分离出来。用于分离组成本发明的SRC+细胞群的另外的生物活性细胞群的方法在实施例中进一步描述。

类器官可以含有肾细胞的异种混合物，和/或由肾细胞的异种混合物形成，所述肾细胞的异种混合物在于密度梯度上分离在B4(包括B4’)和B2和/或B3级分中提供细胞的增强的分布和组成之前已经在低氧培养条件下培养。对于从患病和未患病的肾脏中分离出来的肾细胞观察到从B2中将氧气依赖型细胞富集在B4中。不希望受理论约束，这可能由于以下现象的一种或多种：1)在低氧培养周期过程中特定细胞组分的选择性存活、死亡或增殖；2)响应于低氧培养的细胞粒度和/或大小改变，因此影响密度梯度分离过程中的浮力密度和后续定位的改变；以及3)响应于低氧培养周期的细胞基因/蛋白质表达的改变，因此导致任何给定的梯度级分内的细胞的差异特征。因此，在一个实施方案中，类器官含有低氧抗性的富集了肾小管细胞的细胞群，例如B2，和/或由其形成。

用于分开和分离本发明的细胞群的示例性技术包括基于包含在感兴趣的群内的不同细胞类型的不同比重在密度梯度上分离。任何给定的细胞类型的比重可以受到细胞内的粒度程度、细胞内水体积以及其他因素的影响。一方面，本发明提供了用于在多个物种包括但不限于人类、犬和啮齿动物中分离本发明的细胞制剂(例如，B2和B4，包括B4’)的最佳梯度条件。在优选的实施方案中，密度梯度用来获得来源于异种肾细胞群的新型富集的肾小管细胞级分群，即B2细胞群。在一个实施方案中，密度梯度用来获得来源于异种肾细胞群的新型富集的产生EPO的细胞级分群，即B4细胞群。在其他实施方案中，密度梯度用来获得富集的肾脏的肾小管细胞、肾小球细胞以及内皮细胞的亚群。在一个实施方案中，产生EPO的细胞和肾小管细胞分离自红细胞和细胞碎片。在一个实施方案中，产生EPO的细胞、肾小球细胞和血管细胞分离自其他细胞类型和分离自红细胞和细胞碎片，同时肾小管细胞和集合管细胞的亚群伴随地分离自其他细胞类型和分离自红细胞和细胞碎片。在一个其他实施方案中，内分泌细胞、肾小球细胞和/或血管细胞分离自其他细胞类型和分离自红细胞和细胞碎片，同时肾小管细胞和集合管细胞的亚群伴随地分离自其他细胞类型和分离自红细胞和细胞碎片。

一方面，本发明的类器官含有通过部分地使用基于以下描述的某些重要特征包含60％非离子碘化化合物碘克沙醇的水溶液的(Axis-Shield)密度梯度培养基制备的细胞群，和/或由其形成。然而，本领域技术人员将认识到可以根据本发明使用包括用于分离本发明细胞群的必要特征的任何密度梯度或其他手段，例如使用本领域中已知的细胞表面标记物的免疫分离。本领域技术人员还应该认识到可以利用通过密度梯度(大小和粒度)有助于分离细胞亚群的相同细胞特征来通过流式细胞术(前向散射＝通过流式细胞术的大小反射，并且侧向散射＝粒度反射)分离细胞亚群。重要的是，密度梯度培养基应该针对感兴趣的特定细胞具有低毒性。虽然密度梯度培养基应该针对感兴趣的特定细胞具有低毒性，但是本发明涵盖了对感兴趣的细胞的选择过程起作用的梯度培养基的使用。不希望受理论约束，可看出通过包含碘克沙醇的梯度回收的本发明的细胞群为碘克沙醇抗性的，因为在加载和回收步骤之间存在细胞的明显损失，从而表明在梯度条件下暴露于碘克沙醇导致了某些细胞的消除。在碘克沙醇梯度之后在特定带中出现的细胞对碘克沙醇和/或密度梯度暴露的任何不良作用有抗性。因此，还涵盖了对用于本文所描述的类器官的细胞群的分离和/或选择的额外的造影剂的使用，所述额外的造影剂为轻度至中度的肾毒素。此外，密度梯度培养基还应该不结合人血浆中的蛋白质或不利地影响感兴趣的细胞的重要功能。

另一方面，本发明提供了含有使用荧光激活细胞分选(FACS)已经富集了和/或废弃了肾脏细胞类型的细胞群，和/或由其形成的类器官。在一个实施方案中，肾脏细胞类型可以使用BDFACSAria^TM或等效物来富集和/或废弃。

另一方面，类器官含有使用磁性细胞分选已经富集了和/或废弃了肾脏细胞类型的细胞群，和/或由其形成。在一个实施方案中，肾脏细胞类型可以使用Miltenyi系统或等效物来富集和/或废弃。

另一方面，类器官可以包括已经经历三维培养的肾细胞群，和/或由其形成。一方面，培养细胞群的方法为通过连续灌注。在一个实施方案中，当与静态培养的细胞群相比时，通过三维培养和连续灌注培养的细胞群显示更大的细胞性和互连性。在另一个实施方案中，当与所述细胞群的静态培养物相比时，通过三维培养和连续灌注培养的细胞群显示更大的EPO表达以及增强的肾小管相关基因如上皮细胞钙粘蛋白的表达。在又另一个实施方案中，与静态培养的细胞群相比，通过连续灌注培养的细胞群显示更大的葡萄糖和谷氨酰胺消耗水平。

如本文所描述，低氧或缺氧条件可以在制备用于本发明类器官的细胞群的方法中使用。然而，制备细胞群的方法可以在不需要低氧调节的步骤情况下使用。在一个实施方案中，可以使用含氧量正常的条件。

本领域普通技术人员将了解本领域中已知的其他分离和培养的方法可以用于本文所描述的细胞。

生物材料

如在Bertram等美国公布申请20070276507中所描述，可以将聚合物基质或支架成形为任何数目的希望的构型以满足任何数目的总体系统、几何或空间限制。在一个实施方案中，本发明的基质或支架可为三维的并且成形为符合器官或组织结构的尺寸和形状。例如，在使用聚合物支架用于治疗肾脏疾病、贫血、EPO缺少、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷中，可以使用三维(3-D)基质。可以使用各种不同形状的3-D支架。自然地，聚合物基质可以不同大小和形状成形以符合具有不同大小的患者。聚合物基质还可以用其他方式被成形为适应患者的特殊需求。在另一个实施方案中，聚合物基质或支架可为生物相容的多孔聚合物支架。支架可以由各种合成材料或天然存在的材料形成，包括但不限于开孔聚乳酸()、纤维素醚、纤维素、纤维素酯、氟化聚乙烯、酚树脂、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚苯并噁唑、聚碳酸酯、聚氰基芳基醚、聚酯、聚酯碳酸酯、聚醚、聚醚醚酮、聚醚酰亚胺、聚醚酮、聚醚砜、聚乙烯、聚氟烯烃、聚酰亚胺、聚烯烃、聚噁二唑、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、聚硫化物、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚三唑、聚氨酯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、再生纤维素、硅酮、脲甲醛、胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、糖胺聚糖、蚕丝、弹力蛋白、藻酸盐、透明质酸、琼脂糖或其共聚物或物理共混物。支架构型的范围可以从液体水凝胶悬浮液至柔软的多孔支架至刚性形状固定的多孔支架。

支架可以由任何材料形式的生物材料构成，包括但不限于稀释剂、细胞载体、微珠、材料片段、合成组合物(包括但不限于PGA、PLGA、PLLA、OPLA、静电纺纳米纤维)的支架以及合成组合物(包括但不限于PGA、PLGA、PLLA、OPLA、静电纺纳米纤维)的泡沫。

水凝胶可以由各种聚合物材料形成并且用于各种生物医学应用。水凝胶可以被物理描述为亲水聚合物的三维网络。取决于水凝胶的类型，它们含有不同百分数的水，但总体上不溶解于水。尽管它们的含水量高，但由于存在亲水残基水凝胶能够额外地结合大量的液体。水凝胶在不改变其胶状结构的情况下大幅度溶胀。根据所使用的聚合物的性质和产品的额外专门仪器，可以确切地修改水凝胶的基本物理特征。

优选地，水凝胶由生物惰性和与哺乳动物组织生理相容的聚合物、生物来源的材料、合成来源的材料或其组合制成。水凝胶材料优选地不诱导炎性反应。可以用来形成水凝胶的其他材料的实例包括(a)改性的藻酸盐、(b)通过暴露于一价阳离子而成凝胶的多糖(例如吉兰糖胶和角叉菜胶)、(c)为非常粘稠的液体或具有触变性并且通过结构的缓慢演化随时间推移形成凝胶的多糖(例如，透明质酸)，以及(d)聚合物水凝胶前体(例如，聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物和蛋白质)。美国专利号6,224,893B1提供了适合用于制备根据本发明的水凝胶的各种聚合物和所述聚合物的化学性质的详细描述。

支架或生物材料特征可以使得细胞能够附着支架或生物材料并且与支架或生物材料相互作用，和/或可以提供细胞可以被捕获到其中的多孔间隙。在一个实施方案中，本发明的多孔支架或生物材料允许一个或多个细胞群或细胞的混合物添加或沉积在配置为多孔支架(例如，通过细胞附着)的生物材料上和/或支架的孔隙内(例如，通过细胞捕获)。在另一个实施方案中，支架或生物材料允许或促进支架内的细胞与细胞和/或细胞与生物材料的相互作用以形成如本文所描述的构建物。

在一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料由呈水凝胶形式的透明质酸(HA)构成，所述水凝胶形式含有大小在5.1kDA至>2x10⁶kDa范围内的HA分子。在另一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料由呈多孔泡沫形式的透明质酸构成，所述多孔泡沫形式也包含大小在5.1kDA至>2x10⁶kDa范围内的HA分子。在又另一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料由基于聚乳酸(PLA)的泡沫构成，所述泡沫具有开孔结构并且孔隙大小为约50微米至约300微米。在又另一个实施方案中，特定细胞群(优选地B2而且B4)直接提供和/或通过透明质酸合酶-2(HAS-2)刺激合成高分子量透明质酸，尤其在肾内植入之后。

本文所描述的生物材料还可以被设计或调适成响应某些外部条件，例如体外或体内。在一个实施方案中，生物材料对温度敏感(例如，体外或体内)。在另一个实施方案中，生物材料被调适成响应于暴露在酶促降解中(例如，体外或体内)。如本文所描述，生物材料对外部条件的响应可为微调的。所描述的类器官的温度敏感性可以通过调节生物材料在类器官中的百分数来改变。或者，生物材料可以被化学交联以提供对酶促降解的更大抗性。例如，碳二亚胺交联剂可以用来化学交联明胶珠粒从而提供减小的对内源性酶的敏感性。

一方面，由生物材料产生的对外部条件的响应涉及生物材料的结构完整性的丧失。虽然以上提供了对酶促降解的温度敏感性和抗性，但在不同生物材料中存在借此可发生失去材料完整性的其他机制。这些机制可以包括但不限于热力学(例如，相转变如溶解、扩散(例如，使离子交联剂从生物材料扩散到周围组织中))、化学、酶促、pH(例如，对pH敏感的脂质体)、超声以及对光不稳(光穿透)。生物材料借此失去结构完整性的确切机制将改变，但通常在植入时或植入后触发该机制。

本领域普通技术人员将了解本领域中已知的其他类型的合成材料或天然存在的材料可以用来形成本文所描述的支架。

一方面，本发明提供了由以上提到的支架或生物材料制成的本文所描述的构建物。

构建物

一方面，本发明提供了含有可植入构建物的类器官，所述可植入构建物具有用于在有需要的受试者中治疗肾脏疾病、贫血或EPO缺少的本文所描述的一个或多个细胞群。在一个实施方案中，构建物由生物相容材料或生物材料、支架或基质构成，所述支架或基质主要由一种或多种合成的或天然存在的生物相容材料和通过附着和/或捕获沉积在支架表面上或包埋于支架表面中的本文所描述的一个或多个细胞群或细胞的混合物组成。在某些实施方案中，构建物由生物材料和本文所描述的一个或多个细胞群或细胞的混合物构成，所述一个或多个细胞群或细胞的混合物涂覆有生物材料组分、沉积于生物材料组分上、沉积于生物材料组分中、附着至生物材料组分上、捕获于生物材料组分中、包埋于生物材料组分中、接种于生物材料组分或与生物材料组分组合。本文所描述的任何细胞群(包括富集的细胞群或其混合物)可以与基质组合使用以形成构建物。

在另一个实施方案中，构建物的沉积的细胞群或细胞组分为富集了氧气可调的产生EPO的细胞的第一肾脏细胞群。在另一个实施方案中，第一肾脏细胞群含有除了氧气可调的产生EPO的细胞之外的肾小球细胞和血管细胞。在一个实施方案中，第一肾脏细胞群为B4’细胞群。在一个其他实施方案中，构建物的沉积的细胞群或细胞组分包括第一富集的肾细胞群和第二肾细胞群。在一些实施方案中，第二细胞群没有被富集氧气可调的产生EPO的细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群被富集肾小管细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群被富集肾小管细胞并且含有集合管上皮细胞。在其他实施方案中，肾小管细胞特征在于表达一个或多个肾小管细胞标记物，所述肾小管细胞标记物可以包括但不限于巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17(RAS癌基因家族成员)(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含有FXYD结构域的离子转运调节因子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换因子)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)以及钙蛋白酶-8(Capn8)。

在一个实施方案中，沉积在生物材料或支架上或与生物材料或支架组合以形成本发明的构建物的细胞群来源于各种来源，如自体来源。非自体来源也适合于使用，包括但不限于同种异体或同系基因(自基因或同基因)来源。

本领域普通技术人员将了解存在数种用于沉积或以另外的方式使细胞群与生物材料组合以形成构建物的适合的方法。

一方面，本发明的构建物适用于在本文所描述的使用方法中使用。在一个实施方案中，构建物适合用于施用至有治疗任何病因的肾脏疾病、贫血或任何病因的EPO缺少需要的受试者。在其他实施方案中，构建物适合用于施用至有改善或恢复红细胞样细胞体内平衡需要的受试者。在另一个实施方案中，构建物适合用于施用至有改善的肾脏功能需要的受试者。

在又另一个方面中，本发明提供了用于植入到有改善的肾脏功能需要的受试者中的构建物，所述构建物包含：a)包含一种或多种生物相容合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽的生物材料；以及b)包含第一细胞群B2和第二细胞群B4’的来源于患有肾脏疾病的受试者的哺乳动物肾细胞的混合物，所述第一细胞群B2包含密度为1.045g/mL与1.052g/mL之间的分离的、富集的肾小管细胞群，并且所述第二细胞群B4’包含密度为1.063g/mL与1.091g/mL之间的产生促红细胞生成素(EPO)的细胞和血管细胞但废弃了肾小球细胞，涂覆有生物材料、沉积在生物材料之上或之中、捕获于生物材料中、悬浮于生物材料中、包埋于生物材料中和/或以另外的方式与生物材料组合。在某些实施方案中，混合物不包括B1细胞群或B5细胞群，所述B1细胞群包含密度<1.045g/ml的集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，所述B5细胞群包含密度>1.091g/ml的具有低粒度和生存力的碎片和小细胞。

在一个实施方案中，构建物包括特征在于表达血管标记物的B4’细胞群。在一些实施方案中，B4’细胞群特征不在于表达肾小球标记物。在某些实施方案中，混合物能够进行氧气可调的促红细胞生成素(EPO)表达。在所有实施方案中，混合物可以来源于哺乳动物肾脏组织或培养的肾脏细胞。

在一个实施方案中，构建物包括配置为适合用于捕获和/或附着混合物的三维(3-D)多孔生物材料的生物材料。在另一个实施方案中，构建物包括配置为适合用于包埋、附着、悬浮或涂覆哺乳动物细胞的液体或半液体凝胶的生物材料。在又另一个实施方案中，构建物包括被配置由呈水凝胶形式的透明质酸(HA)的主要高分子量物质构成的生物材料。在另一个实施方案中，构建物包括由呈多孔泡沫形式的透明质酸的主要高分子量物质构成的生物材料。在又另一个实施方案中，构建物包括由孔隙为约50微米至约300微米之间的基于聚乳酸的泡沫构成的生物材料。在还另一个实施方案中，构建物包括一个或多个细胞群，所述细胞群可以来源于对有改善的肾脏功能需要的受试者而言自体的肾脏样本。在某些实施方案中，样本为肾脏活检物。在一些实施方案中，受试者患有肾脏疾病。在又其他实施方案中，细胞群来源于非自体的肾脏样本。在一个实施方案中，构建物提供红细胞样细胞体内平衡。

使用方法

一方面，本发明提供了用于在有需要的受试者中使用含有本文所描述的肾脏细胞群和肾脏细胞混合物，和/或由其形成的SRC+细胞群和/或类器官来治疗肾脏疾病、贫血或EPO缺乏的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用包括富集了产生EPO的细胞的第一肾脏细胞群，和/或由其形成的类器官。在另一个实施方案中，第一细胞群被富集了产生EPO的细胞、肾小球细胞以及血管细胞。在另一个实施方案中，类器官还可包括一个或多个额外的肾脏细胞群，和/或可由一个或多个额外的肾脏细胞群形成。在一个实施方案中，额外的细胞群为没有富集产生EPO的细胞的第二细胞群。在另一个实施方案中，额外的细胞群为没有富集产生EPO的细胞、肾小球细胞或血管细胞的第二细胞群。在另一个实施方案中，类器官还包括沉积于生物材料中、沉积于生物材料上、包埋于生物材料中、涂覆有生物材料或捕获于生物材料中以形成如本文所描述的用于治疗本文所描述的疾病或病症的可植入构建物的肾脏细胞群或肾脏细胞的混合物，和/或由所述肾脏细胞群或肾脏细胞的混合物形成。在一个实施方案中，类器官被单独使用或与其他细胞或生物材料(例如，水凝胶、多孔支架或天然的或合成的肽或蛋白质)组合使用以刺激急性或慢性疾病状态中的再生。

另一方面，通过本发明的方法对受试者中的肾脏疾病、贫血或EPO缺乏的有效治疗可以通过红细胞生成和/或肾脏功能的各种指示物来观察。在一个实施方案中，红细胞样细胞体内平衡的指示物包括但不限于血细胞比容(HCT)、血红蛋白(HB)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、红细胞计数(RBC)、网织红细胞数目、网织红细胞％、平均红细胞体积(MCV)以及红细胞分布宽度(RDW)。在一个其他实施方案中，肾脏功能的指示物包括但不限于血清白蛋白、白蛋白与球蛋白比率(A/G比率)、血清磷、血清钠、肾脏大小(通过超声可测量的)、血清钙、磷与钙比率、血清钾、蛋白尿、尿肌酐、血清肌酐、血液尿素氮(BUN)、胆固醇水平、甘油三酯水平以及肾小球过滤率(GFR)。此外，一般健康和康乐的数种指示物包括但不限于体重增加或减轻、存活、血压(平均全身血压、舒张压或收缩压)以及身体耐力性能。

在另一个实施方案中，通过稳定肾脏功能的一种或多种指示物来证明使用SRC+细胞群或生物活性肾细胞类器官的有效治疗。通过与未经过本发明的方法治疗的受试者中的相同指示物比较，观察经过本发明的方法治疗的受试者中的指示物变化从而证明肾脏功能的稳定。或者，可以通过与治疗前相同受试者中的相同指示物比较，观察经过本发明的方法治疗的受试者中的指示物变化从而证明肾脏功能的稳定。第一指示物的变化可为数值增加或减小。在一个实施方案中，由本发明提供的治疗可以包括使受试者中的血液尿素氮(BUN)水平稳定，其中在受试者中观察到的BUN水平与患有类似疾病状态、未经过本发明的方法治疗的受试者相比更低。在一个其他实施方案中，治疗可以包括使受试者中的血清肌酐水平稳定，其中在受试者中观察到的血清肌酐水平与患有类似疾病状态、未经过本发明的方法治疗的受试者相比更低。在另一个实施方案中，治疗可以包括使受试者中的血细胞比容(HCT)水平稳定，其中在受试者中观察到的HCT水平与患有类似疾病状态、未经过本发明的方法治疗的受试者相比更高。在另一个实施方案中，治疗可以包括使受试者中的红细胞(RBC)水平稳定，其中在受试者中观察到的RBC水平与患有类似疾病状态、未经本发明的方法治疗的受试者相比更高。本领域普通技术人员将了解本文所描述的或本领域中已知的一种或多种额外的指示物可以被测量以确定对受试者中的肾脏疾病的有效治疗。

施用方法和途径

本发明的SRC+细胞群和/或生物活性类器官可以单独施用或与其他的生物活性组分组合施用。SRC+细胞群和/或类器官适合用于将合并的组织工程化元件注射或植入至实体器官的内部以再生组织。

一方面，本发明提供了向有需要的受试者提供本文所描述的生物活性细胞类器官的方法。在一个实施方案中，生物活性细胞的来源可为自体的或同种异体的、同系基因的(自基因或同基因的)以及其任何组合。在其中来源不为自体的情况下，方法可以包括施用免疫抑制剂。适合的免疫抑制剂药物包括但不限于硫唑嘌呤、环磷酰胺、咪唑立宾、环孢素、他克莫司水合物、苯丁酸氮芥、氯苯扎利二钠、金诺芬(auranofin)、前列地尔(alprostadil)、胍立莫司盐酸盐、biosynsorb、莫罗单抗(muromonab)、阿法赛特(alefacept)、喷司他丁(pentostatin)、达利珠单抗(daclizumab)、西罗莫司(sirolimus)、麦考酚酸莫酯、来氟米特(leflonomide)、巴利昔单抗(basiliximab)、链道酶α、bindarid、克拉屈滨(cladribine)、吡美莫司(pimecrolimus)、伊洛白介素(ilodecakin)、西利珠单抗(cedelizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、依维莫司(everolimus)、阿尼莫司(anisperimus)、加维莫单抗(gavilimomab)、法拉莫单抗(faralimomab)、氯法拉滨(clofarabine)、雷帕霉素(rapamycin)、西普利珠单抗(siplizumab)、柴苓汤(saireito)、LDP-03、CD4、SR-43551、SK&F-106615、IDEC-114、IDEC-131、FTY-720、TSK-204、LF-080299、A-86281、A-802715、GVH-313、HMR-1279、ZD-7349、IPL-423323、CBP-1011、MT-1345、CNI-1493、CBP-2011、J-695、LJP-920、L-732531、ABX-RB2、AP-1903、IDPS、BMS-205820、BMS-224818、CTLA4-1g、ER-49890、ER-38925、ISAtx-247、RDP-58、PNU-156804、LJP-1082、TMC-95A、TV-4710、PTR-262-MG以及AGI-1096(参见美国专利号7,563,822)。本领域普通技术人员将了解其他适合的免疫抑制剂药物。

本发明的治疗方法涉及递送本文所描述的SRC+细胞群和/或类器官。在一个实施方案中，将细胞直接施用至预期益处的部位为优选的。

鉴于本说明书，将类器官施用于受试者的各种方法对于本领域技术人员来说将是显而易见的。这些方法包括但不限于：实质内注射、囊下放置、经尿道导管插入以及肾内动脉导管插入。

细胞可被插入到通过注射或植入至受试者从而有利于引入的递送装置或媒介物中。在某些实施方案中，递送媒介物可以包括天然材料。在某些实施方案中，递送媒介物可以包括合成材料。在一个实施方案中，递送媒介物提供了模拟或恰好符合器官构造的结构。在其他实施方案中，递送媒介物本质上为流体样的。此类递送装置可以包括用于将细胞和流体注射到受体受试者身体中的管，例如导管。在优选的实施方案中，管额外地具有针(例如，注射器)，通过所述针，本发明的细胞可以在希望的位置上被引入到受试者中。在一些实施方案中，哺乳动物肾脏来源的细胞群被配制用于经过导管施用到血管中(其中术语“导管”意图包括用于将物质递送至血管的任何各种管样系统)。或者，细胞可以被插入到生物材料或支架中或插入于生物材料或支架上，生物材料或支架包括但不限于纺织品，如机织物、针织物、编织物、网状织物；和非织造物、穿孔膜、海绵和泡沫；以及珠粒，如实心或多孔珠粒、微粒、纳米颗粒等(例如，Cultispher-S明胶珠粒-Sigma)。细胞可以被制备用于呈各种不同形式递送。例如，细胞可以被悬浮于溶液或凝胶中。细胞可以与药学上可接受的载体或稀释剂混合，在所述药学上可接受的载体或稀释剂中本发明的细胞保持有生存力。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、缓冲水溶液、溶剂和/或分散介质。此类载体和稀释剂的使用是本领域公知的。溶液优选为无菌的且流动的，并且将通常为等渗的。优选地，溶液在制造和储存条件下是稳定的并且通过使用例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等保存对抗微生物如细菌和真菌的污染作用。本领域技术人员将了解在递送本发明的细胞群及其混合物中使用的递送媒介物可以包括以上提到的特征的组合。

含有分离的肾细胞群(例如，单独的B2细胞群或与B4’和/或B3混合)，和/或由其形成的类器官的施用模式包括但不限于：实质内注射、囊下放置、或肾动脉。待根据本发明使用的额外施用模式包括经过直接剖腹手术、经过直接腹腔镜检查、经腹或经皮的单次或多次注射。待根据本发明使用的又额外的施用模式包括例如逆行性输注和输尿管肾盂输注。施用的手术手段包括一步程序，如但不限于肾部分切除和构建物植入、肾部分切除、肾盂部分切除、用网膜±腹膜血管化、多病灶活检针追踪圆锥或棱锥至圆柱体、和肾柱状置换；以及两步程序，包括例如用于重新移植的类器官内部生物反应器。在一个实施方案中，含有细胞混合物和/或由细胞混合物组成的类器官经过相同途经同时递送。在另一个实施方案中，每个类器官通过本文所描述的一种或多种方法被单独地递送至特定位置或经过特定的方法同时或者以暂时控制的方式递送。

可以从关于类器官活性(例如EPO产生)的现有信息中确定或从在临床前研究中进行的剂量研究推断人体中适当的细胞或类器官植入剂量。从体外培养和体内动物实验中，可以定量类器官的量并且用于计算植入的材料的适当剂量。此外，可以监测患者以确定是否可以进行额外的植入或相应地减少植入的材料。

可向包含本发明的细胞群及其混合物和/或由其组成的类器官中添加一种或多种其他的组分，包括选择的细胞外基质组分，如本领域已知的一种或多种类型的胶原或透明质酸、生长因子、和/或细胞因子(包括但不限于VEGF、PDGF、TGFβ、FGF、IGF、富含血小板的血浆和药物)。

本领域普通技术人员将了解适合用于本文所描述的类器官的各种施用方法。

制品和试剂盒

本发明还包括试剂盒，所述试剂盒包含本发明的聚合物基质和支架及相关材料和/或细胞培养基和使用说明书。使用说明书可包括，例如在本发明的SRC+细胞群或类器官的形成过程中培养细胞的说明书和/或施用SRC+细胞群或类器官的说明书。在一个实施方案中，本发明提供了包含本文所描述的支架和说明书的试剂盒。在又另一个实施方案中，试剂盒包括用于检测标记物表达的试剂、用于使用所述试剂的试剂以及使用说明书。这个试剂盒可以用于在植入或施用本文所描述的类器官之后确定受试者中的天然肾脏的再生预后的目的。所述试剂盒还可用于确定本文所描述的类器官的生物治疗功效。

本发明的另一个实施方案为含有类器官的制品，所述类器官含有可用于治疗有需要的受试者的生物活性细胞和/或由其形成。制品包含容器和在容器上或与容器相关的标签或包装说明书。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料形成。容器容纳有效于治疗病状的组合物并且可以具有无菌进入端口(例如容器可为溶液袋或具有被注射针可穿刺的止挡件的小瓶)。标签或包装说明书指示类器官用于治疗具体病状。标签或包装说明书将还包括用于向患者施用类器官的说明书。还涵盖了本文所描述的包含组合疗法的制品和试剂盒。包装说明书是指习惯上包括于治疗产品的商业包装中的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、用量、施用、禁忌症和/或涉及所述治疗产品使用的警告的信息。在一个实施方案中，包装说明书指示类器官用于治疗疾病或病症，例如像肾脏疾病或病症。它可还包括从商业和使用者立场来看合意的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针以及注射器。还提供对各种目的例如对评价再生结果有用的试剂盒。可以提供含有用于尿来源的囊泡和/或其内含物例如本文所描述的核酸(如miRNA)、囊泡、外来体等的检测剂的试剂盒。检测剂包括但不限于核酸引物和探针以及用于体外检测希望的靶标的抗体。与制品一样，试剂盒包含容器和在容器上或与容器相关的标签或包装说明书。容器容纳包含至少一种检测剂的组合物。可以包括额外的容器，所述额外的容器含有例如稀释剂和缓冲液或对照检测剂。标签或包装说明书可以提供组合物以及用于预期的体外、预后或诊断使用的说明书的描述。

仅出于说明目的提供以下实施例，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1–选择的肾细胞+(SRC+)细胞群的分离：内皮细胞从肾活检物 的分离

以下方法提供了使用先前调适的胶原酶/分散酶消化方案^2，3，5进行酶消化之后分离内皮细胞的实施例。此方法已被应用于患病的ZSF1大鼠肾脏和从透析高血压人ESRD患者中获得的肾脏活检物。

内皮细胞(EC)、血管和淋巴管来源：

通过100μmSteriflip过滤器(Millipore)过滤使用如下文所述的用于肾脏细胞分离的标准操作程序消化的肾。使用含有5％FBS的DMEM中和剩余的细胞悬浮液，然后通过在300xg下离心5分钟来洗涤。将通过100μm过滤器回收的细胞沉淀物重悬浮于完全补充的EGM-2生长培养基(Lonza)中，并且以25K/cm²的细胞密度铺到涂覆有纤连蛋白的培养皿上。每隔3天向培养物中加料。当EC培养物80-90％汇合时，使之胰蛋白酶化并且计数。使用CD31(PECAM)一抗标记胰蛋白酶化的细胞，并且使用Miltenyi抗CD31微珠进行阳性选择。将CD31⁺分选的细胞洗涤、计数、铺板并且以10K/cm²的密度接种在完全补充的EGM-2培养基中。24小时后，内皮细胞的形态应该很明显，并且这些细胞可以通过多次传代进行扩增。血管和/或淋巴管组合物可以使用谱系特异性抗体(例如，VEGF3–血管毛细管；LYVE1-淋巴管)进行分析；可以使用相同的细胞表面表型标记物，使用Miltenyi微珠选择方法来进一步选择/分选特定的内皮亚群。

扩增和纯化后，NKASRC的内皮细胞组分可被富集至比通过浮力密度分级分离(<2％)观测的固有频率更大的百分数(>30％)。在一个实施方案中，对于控制NKA的活性生物成分或组合物而言，纯化的EC在移植前可以在选择的频率下与先前所述的来自浮力密度梯度分级分离的B2和/或B2-B3-B4级分(例如60％B2-B4+40％EC)组合。

使用磁性微珠的内皮细胞分选：

从涂覆纤连蛋白的烧瓶的EGM2培养基中收获的细胞用小鼠抗人CD31一抗以0.4μg/百万个细胞/100μl的浓度在不含补充剂的EGM2培养基中在4℃下染色20分钟。20分钟后，将细胞洗涤并且重悬浮于12ml不含补充剂的EGM2培养基和200μl山羊抗小鼠IgG1中。添加Miltenyi微珠并且在4℃下免受光照孵育另外20分钟。20分钟后，将细胞通过离心(5分钟，300xg下)洗涤两次并且重悬浮于12ml[1千万个细胞/ml]并且使用Miltenyiauto-MACS仪(灵敏模式程序下的双阳性选择)纯化。

在图1所描述的实施例中，内皮细胞选择(CD31+选择)自原代ZSF1细胞。将从此过程回收的360万个细胞计数并且以10K/cm2的浓度在两个T175纤连蛋白涂覆的烧瓶上传代培养。将细胞在21％O2下培养4天并且在85％汇合时收获。在这个选择和培养期后，将细胞计数并且回收950万个细胞。收集用于FACS表型分析的样本为对CD31约90％阳性(图1E，FACS右图)。

人CKD内皮细胞分离、表征和扩增

人肾脏细胞培养：

使用如下文所述的人肾脏原代细胞酶分离和培养的标准操作程序分离人肾脏细胞(供体信息参见下表1)。简而言之，将细胞分离并且以25K/cm²在含有标准KGM的T/C处理的烧瓶中或含有EGM2完全补充培养基的纤连蛋白涂覆的烧瓶中培养。使细胞在21％氧气环境下生长3天，然后更换培养基并且将培养物移至2％氧气环境中以便O/N暴露。4天后将细胞成像以便分析培养物形态(图2A)。然后将其收获并且使用标准方法(参见HK027BatchRecord)计数。收集样本并将样本染色以确定CD31⁺内皮细胞的百分数(图2)。使用小鼠抗人CD31一抗(BDbiosciences)和磁微珠(Miltenyi)分选内皮细胞。然后将CD31⁺细胞以10K/cm²的密度重新铺在纤连蛋白涂覆的烧瓶中并且再培养4天(图2，细胞培养物形态)。然后将细胞计数并且收集样本，以使用小鼠抗人CD31原代和FACS分析确定阳性内皮细胞的百分数(图3)。

表1.人肾脏供体信息：

总而言之，纤连蛋白上患病的ZSF1细胞的初代培养产生了9％CD31⁺培养物(TC处理的<2％)。在p1，在纤连蛋白上继代培养的9％CD31⁺级分产生了约90％CD31⁺细胞，这些细胞从p0到p1扩增了接近3倍。在T/C处理的烧瓶或纤连蛋白涂覆的烧瓶中人CKD细胞的初代培养产生了大致相同的CD31阳性细胞百分数(2.1％比2.7％)。如图所示，在纤连蛋白涂覆的烧瓶上在完全补充的EGM2培养基中继代培养阳性选择的CD31阳性细胞是可能的并且在一代后CD31阳性细胞的百分数增加了13倍(从2.7％至35.5％)。

SRC+细胞群的分离：另外的生物活性细胞类型的分离的实施例：

A.肾上皮细胞：正在进行的活动评估通过浮力密度梯度分离的级分中各种上皮细胞隔室(壁层、近端肾小管、亨利氏袢、远端肾小管细胞)的表示。更具体地说，谱系追踪研究提供了Six2⁺上皮细胞分离的直接和选择性确认；用特异于肾单位上皮隔室的标记物(参见表2-3)共标记Six2证实了细胞特异性检测(参见表4)。表4提供了表征为近端管、远端管、以及集合管细胞类型的混合物的p0ZSF1培养物(组合的级分B2-B3-B4)的有限的上皮标记物组。使用表2-4列出的相同细胞表面检测抗体，预期通过如先前所述的培养选择(培养条件以及磁分选)对这些特化上皮细胞隔室的富集。

表2.用于组织特异性肾单位染色的标记物组

Pos＝阳性，Pos-ind＝选择的细胞群中的阳性细胞，Med–ind＝髓质集合管染色阳性

表3.抗体来源

二抗为Alexa647分子探针山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG以及驴抗山羊IgG、链霉亲和素A647。使用1ug/ml/1x10⁶个细胞染色以下SOP

表4.初步ZSF1p0细胞特异性检测

标记物

隔室

ZSF1p0％阳性

AQP2	集合管	42.36
			DBA	远端肾小管	56.93
LTA	近端的/环/IMCD	39.62
			CK18	泛上皮	68.39

B.肾小球来源的细胞(壁层上皮细胞和足细胞)：骨盆的解剖学排阻改进了肾小球级分的分离。使用下文所述用于肾脏消化的标准操作程序分离细胞并且通过100μmSteri-flip过滤器(Millipore)过滤，并且将大于100μm的细胞颗粒/团块(含有肾小球级分)重新消化另外20分钟。使用含有10％FBS的DMEM培养基中和消化的级分并且通过离心(300xg持续5分钟)洗涤。将重悬浮的细胞沉淀物在VRADD培养基⁶(DMEM/F12、1uM全反式视黄酸(Genzyme,Cambridge,MA)、0.1um地塞米松(Sigma-Aldrich)、10-100nM维生素D(1,25(OH)2D3中培养以促进足细胞培养，或者在壁层上皮友好的无血清培养基，如(50:50DMEM/KSFM)完全补充而不含FBS的培养基中，培养在胶原1型涂覆的T/C板上。将细胞以25K/cm²的密度接种并且继代培养直至出现细胞长出。使用在第一代与Miltenyi微珠结合的一抗，使用PEC特异性标记物(如但不限于紧密连接蛋白-1)或祖细胞特异性标记物(例如，CD146、CD117、SOX2、Oct4A、CD24、CD133)或系膜特异性标记物(如但不限于平滑肌肌动蛋白、波形蛋白、心肌素、钙结合蛋白)或肾小球毛细血管内皮细胞(例如，VEFG3或CD31或LIVE1)来扩增和分选长出细胞。当在最佳细胞产率时收获并且在大于固有频率时与B2组分组合时，更高比例的肾小球来源的细胞可应用于患有肾小球疾病的患者。

C.集合管上皮细胞：肾脏的皮质和髓质区域的解剖学排阻改进了位于或靠近骨盆的细胞的分离。集合管上皮细胞的分离和扩增遵循下文所述的用于分离和扩增以及收获啮齿动物、犬和人的原代肾脏细胞的标准操作程序。用于分级分离细胞级分B1中富集集合管细胞的原代培养的肾脏细胞的亚群的标准操作程序在本文的下文中描述。基于标记物如水通道蛋白2和二花豆凝集素(DBA)，这些细胞含有最高百分数的的集合管上皮细胞。或者，我们已经调适来自BenHumphreys博士的乳头/髓质内层集合管(IMCD)培养方案(补充有EGF的REGM培养基；未公开的数据)。在任意这些情况下，富集集合管上皮细胞的细胞级分可在高于固有频率下与B2组分组合使用，或者使用标准KGM或等效物来扩增并且用于靶向与尿浓缩相关联的疾病病因，并且可以更好地证实可应用于肾盂异常和/或疾病(例如，肾积水、血管输尿管梗阻)的生物活性成分。

实施例2–来自SRC和SRC+群的类器官的产生和表征

自生的类器官/球体形成

在原代肾脏培养、扩增和浮力密度梯度离心后产生类器官以分离SRC(如下文所述用于产生NKA的标准操作程序)。简而言之，将SRC以[1x10⁶个细胞/ml]的浓度重新悬浮于设置为80rpm的磁力搅拌器上的旋转烧瓶(Corning)中的100ml肾细胞生长培养基中持续24-48小时(图4)。细胞类器官/球体由大小范围在50-125μM的细胞簇组成。每类器官的细胞数量可基于旋转烧瓶培养前细胞的类型和大小而变化。类器官/球体已经从大鼠和人SRC中产生，并且表达肾小管上皮表型(图5)。

类器官功能和肾小管发生

SRC形成肾小管的能力可被应用于评定NKA的效力。该测定可应用于在50:50胶原1/胶原IV明胶混合物中3D培养的SRC类器官。当免疫荧光染色培养的类器官时，所得到的肾小管继续表达上皮表型(图6)。

类器官+

当应用其他细胞类型的组合时，SRC形成自生的球体的能力可以证明是有利的。添加血管或干细胞组分可以增强肾小管发生。通过在类器官形成期间在含有SRC群的培养物中添加选择性细胞群，可以形成功能单元，重现在再生结果期间激活的关键细胞信号传导途径。此类细胞-细胞相互作用的实例包括但不限于已知在器官发生期间起关键作用的上皮-间充质信号传导事件(参见Basu和Ludlow2012,Developmentalengineeringthekidney-leveragingmorphogenicprinciplesforrenalregeneration.BirthDefectsResearchPartC96:30-38)。虽然使用标准程序产生了SRC，但是上皮细胞系(HuVEC)被用作类器官(+)组合的实例。使用膜染料(InvitrogenDiL红色标记)标记八千万SRC，并且添加到80rpm下持续48小时的125ml旋转烧瓶内的100mlRCGM培养基中的使用不同颜色膜染料(InvitrogenDiO绿色标记)标记的2000万HuVEC中(图7)。单独的SRC类器官群也开始作为对照。当形成类器官时，在ColI/IV3D凝胶内体外设置肾小管发生测定以确保在发生和不发生潜在的伴随血管化情况下的形成肾小管的能力(图8)。

实施例3-啮齿动物肾脏疾病模型中SRC类器官的表征/生物分布

ZSF1急性研究评估了48小时时段内SPIO标记的类器官的生物分布和细胞存留。将2.5x10⁶个SPIO罗丹明标记的细胞(代表在PBS中的约25000个自生的类器官)以50x10⁶/ml的浓度注射至六只40+周龄的ZSF1大鼠左尾部极点的实质中。(图9)。在移植后以24小时和48小时的间隔收获三只动物。通过MRI和在组织学上使用普鲁士蓝和H&E染色方法评估肾脏的细胞存留和生物分布(图10和11)。

结果

沿着靶向递送类器官很容易被标记和示踪。类器官治疗的耐受性良好，在肾小管或肾小球隔室中没有观察到形态改变。注射后24小时在左肾(肾小管内/间)的肾皮质中频繁地观察到类上皮细胞的多病灶簇(通过普鲁士蓝阳性染色)，并且48小时后程度降低。

实施例4–用以证明SRC+和SRC/SRC+来源的类器官的治疗功效的体内研究：CKD(5/6肾切除)免疫功能受损的啮齿动物研究

在免疫功能受损的啮齿动物(NIHRNU(裸)大鼠；无胸腺的大鼠)中使用5/6-肾切除的慢性肾脏疾病模型来评估人来源的SRC+和SRC/SRC+类器官的治疗功效。疾病状态的建立、治疗干预方式以及治疗响应的临床评估如先前所述(Genheimer等,2012.Molecularcharacterizationoftheregenerativeresponseinducedbyintrarenaltransplantationofselectedrenalcellsinrodentmodelofchronickidneydisease.CellsTissuesOrgans196:374-84)。

细胞分离和选择：如Presnell(2011)中所述从活检物中分离、扩增人肾细胞。继代培养细胞并且在第二代后，将细胞以(20x10⁶个细胞/ml/瓶)的浓度低温贮藏在冷藏缓冲液(80％HTS/10％DMSO/10％FBS)中，使用-1℃/分钟的冷冻速率降至-80℃，然后转移至液氮冷冻箱中以用于长期储存。低温贮藏后，将细胞在37℃下迅速解冻以使用标准台盼蓝排阻方法评定回收率和生存力。然后将细胞以3000个细胞/cm²接种在组织培养容器上并且在肾细胞生长培养基中在含氧量正常条件下(21％O₂/5％CO₂/37℃)培养4天。4天后更换培养基，并且将培养物在低氧环境下(2％O₂/5％CO₂/37℃)孵育过夜，之后收获细胞并且通过密度梯度分离选择SRC。低温贮藏后在EGM2完全补充的培养基中从早期传代扩增人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养物(Lonza2389，目录#CC2517)，直至第3代。收获细胞并且使用标准台盼蓝排阻方法评定生存力。

类器官形成：类器官培养物通过以下方式建立：1)将人SRC和HUVEC以2x10⁶个细胞/ml的浓度重悬浮于它们各自的培养基中，2)将等体积25ml(50x10⁶个细胞/ml)的每种细胞制剂组合到125ml旋转烧瓶(Corning)中。对于组合培养，将25ml每种培养基添加到烧瓶中从而达到为在100ml中1x10⁶个细胞/ml的最终细胞浓度。将烧瓶放置在孵育器中速度为80RPM的磁力搅拌器上并且培养24小时。

测试物品：调节类器官的剂量使得对每只大鼠肾脏施用约(2-5x10⁶个细胞/50μl)。在更大体积的0.5mLDPBS中调节类器官的数量至上述浓度以补偿在装运期间的任何损失。传送一个额外的管作为替换。在4-8℃下，使用CREDO管运送器将这些剂量通过FEDEX送到植入装置的两支0.5ml微量离心管中。

测试物品的递送：通过左侧腹切口评定残余的左肾。在递送前，将类器官通过轻敲或轻弹管的底部(不涡漩)温和地重悬浮。使用18G钝尖针将类器官抽吸到注射器中。然后将针更换为23G切割针以用于递送。通过注射50μL至肾脏的皮质-髓质区域进行靶向递送。未处理的对照动物保持未处理并且不执行程序。

RKM模型程序：雄性NIHRNU大鼠8-12周龄(平均重量约为200g)进行如下的2步肾切除程序：对于每个单独的动物，移除它们的右肾并且称重，允许恢复1周，接着切除左肾的尾部和头部极点的组织，所述左肾也需要称重。恢复2-3周接着是适应期，随后开始研究。适应期后，连续2周收集血液和尿液并进行分析。此后每2周进行后续取样。向所有的啮齿动物喂食市售的饲料，并且随意提供水。

在肾切除后监测到动物具有尿蛋白/尿蛋白肌酐(UPC)增加的一些迹象，并且在肾切除后12周使用人器官处理动物。下表5提供了研究的概述。

表5：研究设计

测量：每两周收集体重(g)。在研究期间每两周进行血清生化评估和血液学评估。每两周进行尿分析，在预定尸检时对研究动物进行总体观察，切除残余的肾脏并固定，并且将动物保持固定在福尔马林中。所有动物和组织根据需要收集、称重、测量并制备以用于组织学处理。执行在肾脏的组织学评估中使用的方法。KMR为肾脏质量减少。

结果：

人NKO的功效在无胸腺大鼠的肾机能不全模型中得到证实。

RKM模型概述

在无胸腺KMR模型中疾病的进展与先前所述的肾切除模型和CKD相关的后遗症(包括肾脏蛋白处理破坏、氮血症、高胆固醇血症、贫血以及发展性尿毒症)相一致。NIHRNU肾切除模型关于疾病状态的结果对在质量减少期间切除的肾脏组织的数量敏感，并且基于临床病理学监测和最终的组织学评估这里使用的动物证明了缓慢发展的早期疾病状态。

NKO表型对解剖前(In-Life)临床病理学的影响

在治疗前检查与肾脏功能相关的临床病理学量度并且以成对的方式与在研究结束前取得的量度比较。根据此比较，如下表所总结，在对未处理的对照动物的4个月研究中，出现了与疾病进展相一致的变化。在成对的BUN、Hct、Hgb、RBC、WBC、sChol、sProt、sAlb、uPro、UPC和spGrav中观察到显著的差异。这些标记物中的变化为早期CKD的特点，并且表明肾功能的下降还没有导致急性氮血症、晚期肾小管过滤/浓缩的丧失和磷酸盐血。在用NKO处理的动物中，BUN、Hct、Hgb、RBC、WBC和spGrav的变化不如基于未处理的对照动物的结果所预期的那样显著(参见下表6)。

表6.治疗前和治疗后治疗组的临床量度

*此处WBC将不反应T细胞介导的应答，因为这些动物没有胸腺。

来自模型的肾脏的组织学概述

病理组织学证明对照动物已进展为轻度的发展性肾病，直到终末期处死。

损伤相关的结果实质上主要为肾小管的萎缩、扩张，以及通常严重度为轻度的蛋白质管型(proteinaceouscast)。肾小管嗜碱细胞增多和纤维化通常极少发生并且间质性炎症通常很少或没有。肾小球严重度变化极小。

囊纤维化/炎症的严重度通常极低并且特征在于很少的炎性细胞内容物；所述反应可能已被无胸腺裸大鼠中不完全的免疫系统削弱。在第1批动物中，矿化和淋巴细胞浸润的发生率和严重度很低。偶尔观察到在实验室大鼠中常见的病灶性矿化。

在未处理的组和NKO处理的组之间没有观察到显著差异。

表7

量度	正常的	未处理的	NKO处理的
				肾小管-间质损伤	0.0+0.1	1.4±0.4	1.8±0.4
肾小球损伤	0.0	0.8±0.3	1.2±0.5

NKO对存活率的影响

所有动物(59％KMR)均存活至研究结束(处理后119天和肾切除后204天)，因此，没有检测到NKO处理的可辨别的存活益处。

在EOS使用染色方法检测的人NKO的移植

由于这种模型允许人产品的异种应用，在大鼠肾脏内通过使用人细胞识别抗体示踪人细胞是可能的。处理后4个月使在RKM大鼠肾脏鉴定的细胞的背景内的人HLA1染色，参见图12。两个独立的评审者证实了被认为与人细胞移植一致的染色的鉴定。虽然在间隙组织内一个簇被鉴定，但是通常在对于每只动物染色的四个切片中的一个内1或2个细胞被鉴定并且结合到肾小管中。

结论：

·在对照动物中，类器官(NKO)的递送减轻了与肾脏疾病进展相关联的显著变化并且包括通过将同源的/自体的NKA递送至疾病模型实现的量度。

·实现的量度与将同源的/自体的NKA递送至疾病模型观察到的量度相一致–贫血(Hct、Hgb、RBC)、炎症(WBC)、尿浓缩(spGrav)以及可能地氮血症BUN)这些量度。

·使用NKO原型治疗后大约4个月检测到非常低数目的人细胞。

·裸大鼠(平均59％KMR)的肾切除导致了早期阶段的状态和慢性进行性肾机能不全，其特征在于发展性贫血、蛋白尿、血脂异常和早期氮血症的可能适应症。

·所有动物均存活至研究结束。

·用于递送人类器官至RKM模型的程序具有良好的耐受性。

实施例5–生物响应性肾细胞的分离和表征

患有特发性进行性慢性肾脏疾病(CKD)和贫血的成年雄性猪(野猪(Susscrofa))的病例，提供了新鲜的患病肾脏组织，所述新鲜的患病肾脏组织与年龄相匹配的正常猪肾脏组织直接比较以用于评定细胞组成和表征。在收获时肾组织的组织学检查证实了肾脏疾病，其特征在于严重的弥漫性慢性间质纤维化和新月体性肾小球性肾炎与多病灶纤维化。临床化学证实了氮血症(血尿氮和血清肌酐升高)和轻度贫血(血细胞比容轻度下降和血红蛋白水平降低)。细胞从患病的肾脏组织和正常的肾脏组织中分离、扩增和表征。如Presnell等WO/2010/056328的图1(以引用的方式整体并入本文)所示，Gomori的三色法染色突出显示了与正常肾脏组织相比患病肾脏组织中的纤维化(由箭头指示的蓝色染色)。表达cubulin:巨蛋白并且能够进行受体介导的白蛋白转运的功能性肾小管细胞从正常肾脏组织和患病肾脏组织中增殖。表达促红细胞生成素(EPO)的细胞也存在于培养物中并且通过多次传代和冷冻/解冻循环得以保留。此外，分子分析证实来自正常组织和患病组织中表达EPO的细胞在HIF1α驱动诱导EPO和其他低氧调节的靶基因(包括vEGF)的情况下体外响应于低氧条件。将细胞通过胶原酶+分散酶的酶消化从猪肾脏组织中分离，并且还在单独的实验中通过进行简单的机械消化和外植体培养来分离。在第二代，使含有表达epo的细胞的外植体来源的细胞培养物经受大气压(21％)和变化的低氧(<5％)培养条件以确定暴露于低氧能否使EPO基因表达的上调达到顶点。如啮齿动物培养物(参见实施例3)所指出，正常的猪显示了氧依赖性的表达和EPO基因的调节。令人惊奇的是，尽管CKD猪处于尿毒症/贫血状态(血细胞比容<34，肌酐>9.0)，表达EPO的细胞仍然易于从组织中分离出来并且增殖，并且EPO基因的表达保持为低氧调节的，如Presnell等WO/2010/056328的图2(以引用的方式整体并入本文)所示。如Presnell等WO/2010/056328的图3(以引用的方式整体并入本文)所示，增殖的培养物中的细胞示出了自组织成肾小管样结构的能力。如Presnell等WO/2010/056328的图4(以引用的方式整体并入本文)所示，通过观察到培养的细胞受体介导的摄取FITC-偶联的白蛋白证实了在培养物中(在第3代)功能性肾小管细胞的存在。绿点(由细白箭头指示)表示胞吞的荧光素偶联的白蛋白，这由肾小管细胞特异性受体巨蛋白和Cubilin介导，这指示功能性肾小管细胞的蛋白质重吸收。蓝色染色(由粗的白箭头指示)为Hoescht染色的细胞核。总而言之，这些数据表明功能性肾小管和内分泌细胞可以从猪肾组织，甚至在已经被CKD严重损害的肾组织中分离出来并且增殖。此外，这些发现支持基于自体细胞的治疗产品用于治疗CKD的发展。

此外，从正常的成年人肾中酶促分离产生EPO的细胞(如以上实施例1中所述)。如Presnell等WO/2010/056328的图5(以引用的方式整体并入本文)所示，相比初始组织所述分离程序导致分离后相对EPO表达更多。如Presnell等WO/2010/056328的图6(以引用的方式整体并入本文)所示，可能在培养物中维持人产生EPO的细胞同时保留EPO基因的表达。将人细胞在普通组织培养处理的塑料上或已经用一些细胞外基质(例如像纤连蛋白或胶原)涂覆的塑料上培养/增殖，并且发现全部都支持随时间EPO的表达。

实施例6–特定生物活性肾细胞的分离和富集

肾脏细胞分离：简而言之，从商业供应商(HilltopLabAnimalsInc.)获得10批2周龄雄性Lewis大鼠肾脏，并且在约4℃的温度下在Viaspan保藏培养基中连夜运送。本文所描述的所有步骤均在生物学安全工作橱(BSC)中进行以保持无菌。将肾脏用汉克平衡盐溶液(HBSS)洗涤3次以冲洗出Viaspan保藏培养基。第三次洗涤后，去除剩余的肾囊以及任何剩余的基质组织。使用微切技术将肾大盏也去除。然后使用无菌解剖刀将肾脏细细切碎成浆体。然后将浆体转移至50ml圆锥离心管中并称重。收集少量样本用于RNA并将其放置于无RNA酶的无菌1.5ml微型离心管中并且在液氮中快速冷冻。一旦冷冻，然后将其转移至-80度的冷冻机中直至进行分析。10个幼年肾脏的组织重量等于约1克。基于批料的重量，调节消化培养基以为每1克组织递送20ml消化培养基。用于此程序的消化缓冲液含有4单位分散酶1(StemCellTech)的HBSS溶液、300单位/ml的胶原酶IV型(Worthington)与5mMCaCl₂(Sigma)。

将适当体积的预热的消化缓冲液添加到管中，然后将所述管密封并且放置在37℃孵育器中的摇座上持续20分钟。此第一消化步骤去除了许多红细胞并且增强了剩余组织的消化。20分钟后，取出管并且将其放置于BSC中。使组织沉降在管的底部然后去除上清液。然后向剩余的组织中补充等于起始体积的新的消化缓冲液。将管再次放置在37℃孵育器中的摇座上持续额外的30分钟。

30分钟后，将消化混合物通过70μm细胞滤器(BDFalcon)吸移到等体积的中和缓冲液(含10％FBS的DMEM)中以终止消化反应。然后通过在300xg下离心5分钟来洗涤细胞悬浮液。离心后，接着将沉淀物重悬浮于20mlKSFM培养基中，并且获得样本用于细胞计数，以及使用台盼蓝排阻法评定生存力。一旦计算出细胞数，收集1百万个细胞用于RNA，在PBS中洗涤并且在液氮中快速冷冻。使用KSFM培养基使剩余的细胞悬浮液达到50ml，并且通过在300xg下离心5分钟再次洗涤。洗涤后，将细胞沉淀物以1500万个细胞/mlKSFM的浓度重悬浮。

向在15ml圆锥离心管(BDFalcon)内的5ml30％(w/v)中添加五毫升肾脏细胞悬浮液并且通过倒转6次混合。这形成了15％(w/v)的最终混合物。倒转后，使用1mLPBS小心地使管分层。将管以800xg不间断地离心15分钟。离心后，取出管并且在混合梯度的顶部形成细胞带。还形成了沉淀物，其含有红细胞、死细胞、和小的活细胞群，所述小的活细胞群包括一些小的小颗粒细胞、一些产生epo的细胞、一些肾小管细胞和一些内皮细胞。使用移液管将带小心地取出并且将带转移至另一个15ml圆锥管中。通过抽吸去除梯度培养基，并且通过将沉淀物重悬浮于1mlKSFM来收集。然后将带细胞和沉淀细胞重组并且重悬浮于使用KSFM稀释至少3次的所收集的带体积中，并且通过在300xg下离心5分钟来洗涤。洗涤后，将细胞重悬浮于20mlKSFM中并且收集样本用于细胞计数。一旦使用台盼蓝排阻法计算出细胞数，收集1百万个细胞用于RNA样本，在PBS中洗涤并且在液氮中快速冷冻。

使用密度梯度分离“清理”预培养物以提高特定生物活性肾细胞的生存 力和培养性能：为了得到清洁的、有生存力的细胞群进行培养，首先如以上所述在“肾脏细胞分离”中产生细胞悬浮液。作为任选的步骤和清理初始制剂的方法，悬浮于无菌等渗缓冲液中的高达100百万个总细胞与等体积的在室温下从60％(w/v)储备碘克沙醇制得的30％(因此得到最终的15％w/vOptiprep溶液)以1:1充分混合并且通过倒转6次充分混合。混合后，将1mlPBS缓冲液小心地层铺在混合的细胞悬浮液顶层上。然后将梯度管小心地装入离心机中，确保适当的平衡。将梯度管在25℃下以800xg不间断地离心15分钟。将清理的细胞群(含有生存力的且功能性的集合管、肾小管、内分泌、肾小球以及血管细胞)在6％和8％(w/v)之间分段，对应于1.025–1.045g/mL之间的密度。其他细胞和碎片沉淀至管的底部。

肾脏细胞培养：然后将组合的细胞带和沉淀物以30,000个细胞/cm2的浓度铺在组织培养物处理的三重烧瓶(NuncT500)或等效物中的150mlDMEM(高葡萄糖)/KSFM50:50混合物中，所述混合物含有5％(v/v)FBS、2.5μgEGF、25mgBPE、1XITS(胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠培养基补充剂)与抗生素/抗霉菌剂。将细胞培养在加湿的5％CO2的孵育器中2-3天，对细胞提供21％大气氧水平。两天后，更换培养基并且将培养物放置在由CO2/氮气多气体加湿孵育器(Sanyo)提供的2％氧气水平的环境中持续24小时。孵育24小时后，用60ml1XPBS洗涤细胞，然后使用40ml0.25％(w/v)胰蛋白酶/EDTA(Gibco)去除细胞。去除后，使用等体积的含有10％FBS的KSFM中和细胞悬浮液。然后通过300xg离心10分钟来洗涤细胞。洗涤后，将细胞重悬浮于20mlKSFM中并且转移至50ml圆锥管中，并收集样本以用于细胞计数。一旦使用台盼蓝排阻法确定了有生存力的细胞计数，收集1百万个细胞用于RNA样本，在PBS中洗涤并且在液氮中快速冷冻。将细胞在PBS中再次洗涤并且通过在300xg下离心5分钟来收集。将洗涤的细胞沉淀物以3750万个细胞/ml的浓度重新悬浮于KSFM中。

使用密度分级梯度分离富集特定生物活性肾细胞：使用由多个浓度w/v的碘克沙醇(Optiprep)制得的密度分级梯度将主要由肾小管细胞组成但是含有其他细胞类型(集合管、肾小球、血管、和内分泌)的小的亚群的培养的肾细胞分离成它们的组分亚群。在收获且施加于梯度之前，将培养物放置于低氧环境下长达24小时。通过在15mL无菌圆锥管中，将四种不同密度的培养基层铺在彼此之上，将具有最高密度的溶液放置在底部并且将最低密度的溶液层铺在顶部而产生分级梯度。将细胞施加到分级梯度的顶部并且离心，这导致了所述群基于大小和粒度被分离成多个带。

简而言之，使用KFSM培养基作为稀释剂制得密度为7％、11％、13％和16％的(60％w/v碘克沙醇)。例如：对于50ml7％(w/v)将5.83ml60％(w/v)储备碘克沙醇添加到44.17mlKSFM培养基中并且通过倒转充分混合。将加载有与无菌毛细管连接的L/S16Tygon管的蠕动泵(MasterFlexL/S)的流速设定为2ml/min，将四种溶液各2mL加载到15mL无菌圆锥管中，开始使用16％的溶液，接着为13％的溶液、11％的溶液、以及7％的溶液。最后，将2mL含有7500万个培养的啮齿动物肾脏细胞的细胞悬浮液加载到分级梯度的顶部(悬浮液已如以上在“肾脏细胞培养”中所述产生)。重要的是，当泵开始递送梯度溶液至管时，小心地使流体以45°角沿管侧缓慢地流动以确保梯度的各层间形成合适的界面。然后将加载有细胞的分级梯度在800xg下不间断离心20分钟。离心后，小心地移出管以便不干扰各界面。产生五个不同的细胞级分(4个带和一个沉淀物)(B1–B4，+沉淀物)(参见图26，左侧圆锥管)。使用无菌一次性球形移液管或5ml移液管收集各级分并且在表型上和功能上表征各级分(参见Presnell等WO/2010/056328的实施例10)。当啮齿动物肾脏细胞悬浮液在分离后立即经受分级梯度分级分离时，富集肾小管细胞(并且含有一些来自集合管的细胞)的级分分段成密度在1.062–1.088g/mL之间。相反，当在离体培养后进行密度梯度分离时，富集肾小管细胞(并且含有一些来自集合管的细胞)的级分分段成密度在1.051–1.062g/mL之间。类似地，当啮齿动物肾脏细胞悬浮液在分离后立即经受分级梯度分级分离时，富集产生epo的细胞、肾小球足细胞和血管细胞的级分(“B4”)以1.025–1.035g/mL的密度分离。相反，当在离体培养后进行密度梯度分离时，富集产生epo的细胞、肾小球足细胞和血管细胞的级分(“B4”)以1.073–1.091g/mL的密度分离。重要的是，通过在收获和分级梯度程序之前将培养物暴露(持续约1小时的时间段至约24小时的时间段)于低氧培养环境中(低氧定义为<21％(大气)氧气水平)，增强了培养后细胞在“B2”和“B4”级分中的分布(关于低氧对带分布影响的其他细节在实施例7中提供)。

将每个带通过3倍体积的KSFM稀释来洗涤，充分混合，并且在300xg下离心5分钟。将沉淀物重悬浮于2mlKSFM中并且使用台盼蓝排阻法和血细胞计数器计数有生存力的细胞。收集1百万个细胞用于RNA样本，在PBS中洗涤并且在液氮中快速冷冻。来自B2和B4的细胞用于移植到尿毒症和贫血雌性大鼠中的研究，所述大鼠是在CharlesRiver实验室通过两步5/6肾切除程序产生的。通过定量实时PCR证实了B4的特征，包括促红细胞生成素和vEGF的氧调节的表达、肾小球标记物(肾小球足细胞特异性蛋白、肾小球足细胞裂隙膜蛋白)的表达、和血管标记物(PECAM)的表达。通过E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、以及水通道蛋白-2的表达证实了‘B2’级分的表型。参见Presnell等WO/2010/056328的图49a和49b。

因此，分级梯度策略的使用不仅允许富集稀有的产生epo的细胞群(B4)，而且还是产生相对富集的功能性肾小管细胞级分(B2)的方法(参见Presnell等WO/2010/056328的图50和51)。分级梯度策略还使得产生EPO的细胞和肾小管细胞从红细胞、细胞碎片、和其他潜在的不希望的细胞类型(如大的细胞聚集体和某些免疫细胞的类型)中分离出来。

分级梯度程序可能需要关于使用的具体密度进行调整以提供细胞组分良好的分离。优选的调整梯度的方法包括1)运行从梯度底部(例如，16-21％Optiprep)处的高密度至梯度顶部(例如，5-10％)处的相对低密度的连续密度梯度。可以根据标准方法(AxisShield)使用任何标准的密度梯度溶液(Ficoll、Percoll、蔗糖、碘克沙醇)制备连续梯度。将感兴趣的细胞加载到连续梯度上并且在800xG下不间断离心20分钟。相似大小和粒度的细胞在梯度中趋向于一起分离，使得可以测量在梯度中的相对位置，并且还可测量溶液在此位置的比重。因此，随后可以得出确定的分级梯度，其集中于基于具体细胞群在特定条件下横穿密度梯度的能力来分离所述具体细胞群。当从不健康组织与健康组织中分离细胞，或者当从不同物种中分离特定的细胞时可能需要使用此类优化。例如，对犬和人肾细胞培养物进行优化以确保在大鼠中鉴定的特定B2和B4亚群可从其他物种分离。用于分离啮齿动物B2和B4亚群的最佳梯度由(w/v)7％、11％、13％和16％Optiprep组成。用于分离犬B2和B4亚群的最佳梯度由(w/v)7％、10％、11％和16％Optiprep组成。用于分离人B2和B4亚群的最佳梯度由(w/v)7％、9％、11％、16％组成。因此，表8提供了用于定位来自培养的啮齿动物、犬以及人肾脏细胞的B2和B4的密度范围。

表8.物种密度范围

实施例7-在梯度之前低氧培养影响带分布、组成和基因表达

为了确定氧气条件对表型B2和B4的分布和组成的影响，使来自不同物种的新肾脏细胞制剂在梯度步骤之前暴露于不同氧气条件中。使用如上文所述的用于大鼠细胞分离和培养开始的标准程序，建立啮齿动物新生肾脏增大(NKA)细胞制剂(RK069)。在21％(大气)氧气条件中培养所有烧瓶2-3天。更换培养基并且然后将一半烧瓶重新位于设定为2％氧气的氧气控制的孵育器中，同时保持剩余的烧瓶处于21％氧气条件下持续额外的24小时。然后使用上文所述的标准酶促收获程序从每组条件收获细胞。根据标准程序制备分级梯度并且分别收获“含氧量正常”(21％氧气)和“低氧”(2％氧气)培养物并且并排施加至相同的分级梯度。(图27)。尽管在这两种条件中产生4个带和1个沉淀物，但在整个梯度上细胞分布在21％和2％氧气培养的批次中为不同的(表3)。确切地说，在低氧条件下B2产率增加，伴随有B3减少。此外，在产自低氧培养的细胞(Presnell等WO/2010/056328的图73)的所得到的梯度中，增强了B4特异性基因(如促红细胞生成素)的表达。

使用如上文所述的用于狗细胞分离和培养的标准程序(类似于啮齿动物分离和培养的程序)建立犬NKA细胞制剂(DK008)。在21％(大气)氧气条件中培养所有烧瓶持续4天，然后将子组烧瓶转移至低氧(2％)持续24小时，同时维持子组烧瓶处于21％下。随后，收获每组烧瓶并且经受相同的分级梯度(图28)。类似于大鼠结果(实施例6)，低氧培养的狗细胞不同于大气氧气培养的狗细胞分布在整个梯度上(表9)。再次，在梯度之前在低氧暴露情况下B2的产率增加，连同伴有分布成B3减少。

表9.

以上数据显示预先梯度暴露于低氧增强了B2组成以及特定特化细胞(产生促红细胞生成素的细胞、血管细胞以及肾小球细胞)分布成B4。因此，低氧培养接着如上文所述的密度-梯度分离为在不同物种中产生‘B2’和‘B4’细胞群的有效方法。

实施例8-肾小管/肾小球细胞从人肾脏的分离

肾小管和肾小球细胞通过通篇所述的酶分离方法从正常人肾脏组织中分离出来并且增殖。通过上文所述的梯度方法，离体富集肾小管细胞级分并在此之后培养。如Presnell等WO/2010/056328的图68(以引用的方式整体并入本文)中所示，在分离和增殖过程中保持了表型特征。在重复传代和低温保藏后，通过标记的白蛋白的摄取评定的肾小管细胞功能也被保留。Presnell等WO/2010/056328的图69(以引用的方式整体并入本文)示出了当肾小管富集的群和肾小管废弃的群在3D动态培养中培养时，肾小管标记物(钙粘蛋白)在肾小管富集的群中的表达显著增加。这证实了当在3D动态环境中培养细胞时，可以维持肾小管细胞富集超过初始富集。对以上在实施例7中描述的相同的培养的肾脏细胞群进行流式细胞术分析以检查前向散射和侧向散射。小的、小颗粒的产生EPO的细胞群是可辨别的(8.15％)，并且通过利用流式细胞计量仪的分选能力阳性选择小的、小颗粒的群来分离(参见Presnell等WO/2010/056328的图70(以引用的方式整体并入本文))。

实施例9-从自身免疫性肾小球性肾炎患者样本中分离出来的未分级分 离的肾细胞混合物的表征

如上所描述从自身免疫性肾小球性肾炎患者样本中分离出未分级分离的肾细胞混合物。为了确定从肾脏组织分离和扩增的特定肾细胞亚群的无偏基因型组成，采用定量实时PCR(qRTPCR)分析(Brunskill等,同上2008)来鉴定细胞亚级分之中的差异细胞类型特异性和途径特异性基因表达样式。如Ilagan等PCT/US2011/036347的表6.1所示，HK20为自身免疫性肾小球性肾炎患者样本。如Ilagan等PCT/US2011/036347的表6.2所示，如通过qRTPCR测定的，由HK20产生的细胞缺乏肾小球细胞。

实施例11-使用荧光激活细胞分选(FACS)的有生存力的肾脏细胞类型的 富集/废弃

使用荧光激活细胞分选(FACS)从分离的原代肾脏组织中可以富集一种或多种分离的肾脏细胞和/或可以废弃一种或多种特定的肾脏细胞类型。

试剂：70％乙醇；洗涤缓冲液(PBS)；50:50肾脏细胞培养基(50％DMEM高葡萄糖)：50％角化细胞-SFM；台盼蓝0.4％；对于肾脏内皮细胞靶向肾脏细胞群如CD31和对于肾脏肾小球细胞靶向肾小球足细胞特异性蛋白的一抗。匹配的同种型特异性荧光二抗；染色缓冲液(0.05％BSA的PBS溶液)。

程序：在用于清洗生物学安全工作橱(BSC)的标准程序之后，可以从T500T/C处理的烧瓶中获得来自原代分离或培养的细胞的肾脏细胞的单一细胞悬浮液并且重悬浮于肾脏细胞培养基中并且放于冰上。然后使用台盼蓝排阻方法确定细胞计数和生存力。对于自异种群的肾脏细胞富集/废弃了例如肾小球细胞或内皮细胞，获得具有至少70％生存力的10与50x10⁶之间的活细胞。然后用起始浓度为1μg/0.1ml染色缓冲液/1x10⁶个细胞(如果需要的话为滴度)的特异于靶细胞类型的一抗使异种肾脏细胞群染色。靶抗体可为偶联的如CD31PE(特异于肾脏内皮细胞)或未偶联的如肾小球足细胞特异性蛋白(特异于肾脏肾小球细胞)。

然后免受光照在冰上或在4℃下使细胞染色持续30分钟。孵育30分钟后，将细胞通过在300xg下离心5分钟来洗涤。然后根据是否需要偶联的同种型特异性二抗，将沉淀物重新悬浮于PBS或染色的缓冲液中。如果用荧光染料偶联的一抗标记细胞，将细胞重悬浮于2mlPBS/10x10⁷个细胞中并且进行到FACSaria或等效的细胞分选仪。如果细胞不用荧光染料偶联的抗体标记，那么细胞用起始浓度为1ug/0.1ml/1x10⁶个细胞的同种型特异性荧光染料偶联的二抗标记。

然后免受光照在冰上或在4℃下使细胞染色持续30分钟。孵育30分钟后，将细胞通过在300xg下离心5分钟来洗涤。离心后，将沉淀物重悬浮于浓度为5x10⁶/ml的PBS溶液中，然后以4ml/12x75mm转移至无菌管中。

根据制造商的说明书制备FACsAria用于活细胞无菌分选(BDFACsAriaUserManual)。将样本管加载到FACsAria中并且在获取开始之后调整PMT电压。使用特定波长使用荧光强度绘制门以选择肾脏特定细胞类型。绘制另一个门以选择阴性群。一旦已经绘制希望的门以包封阳性靶群和阴性群，使用制造商的说明书分选细胞。

在一个15ml圆锥管中收集阳性靶群并且在用1ml肾脏细胞培养基填充的另一个15ml圆锥管中收集阴性群。在收集之后，通过流式细胞术分析来自每个管的样本以确定纯度。

通过在300xg下离心5分钟来洗涤收集的细胞持续并且将沉淀物重悬浮于肾脏细胞培养基中用于进一步分析和实验。

实施例12-使用磁性细胞分选的肾脏细胞类型的富集/废弃

从分离的原代肾脏组织中可以富集一种或多种分离的肾脏细胞和/或可以废弃一种或多种特定肾脏细胞类型。

试剂：70％乙醇、洗涤缓冲液(PBS)、50:50肾脏细胞培养基(50％DMEM高葡萄糖)：50％角化细胞-SFM、台盼蓝0.4％、运行缓冲液(PBS，2mMEDTA，0.5％BSA)、冲洗缓冲液(PBS，2mMEDTA)、清洗溶液(70％v/v乙醇)、MiltenyiFCR阻断试剂、特异于IgG同种型的Miltenyi微珠、靶抗体如CD31(PECAM)或肾小球足细胞特异性蛋白或二抗。

程序：在用于清洗生物学安全工作橱(BSC)的标准程序之后，获得来自原代分离或培养的肾脏细胞的单一细胞悬浮液并且重悬浮于肾脏细胞培养基中。使用台盼蓝排阻方法确定细胞计数和生存力。对于自异种群的肾脏细胞富集/废弃了例如肾小球细胞或内皮细胞，获得具有至少70％生存力的至少10x10⁶个高达至4x10⁹个活细胞。

基于感兴趣的靶细胞确定用于富集/废弃方法的最佳分离。对于使用肾小球足细胞特异性蛋白抗体富集小于10％目标频率例如肾小球细胞，使用MiltenyiautoMACS或等效的仪器程序POSSELDS(灵敏模式下的双阳性选择)。对于废弃大于10％目标频率，使用MiltenyiautoMACS或等效的仪器程序DEPLETES(灵敏模式下的废弃)。

通过将1μg/10x10⁶个细胞/0.1ml的PBS连同0.05％BSA添加于15ml圆锥离心管中，接着在4℃下孵育15分钟来用靶特异性一抗标记活细胞，例如对于肾小球细胞为肾小球足细胞特异性蛋白重组多克隆抗体。

在标记之后，通过添加1-2ml缓冲液/10x10⁷个细胞，接着在300xg下离心5分钟来洗涤细胞以去除未结合的一抗。在洗涤之后，添加1ug/10x10⁶/0.1ml的PBS连同0.05％BSA的同种型特异性二抗如鸡抗兔PE，接着在4℃下孵育15分钟。

在孵育之后，通过添加1-2ml缓冲液/10x10⁷个细胞，接着在300xg下离心5分钟来洗涤细胞以去除未结合的二抗。去除上清液，并且将细胞沉淀物以60μl缓冲液/10x10⁷个总细胞重悬浮，接着添加20μlFCR阻断试剂/10x10⁷个总细胞，然后将其充分混合。

添加20μl的直接MACS微珠(如抗PE微珠)并且混合然后在4℃下孵育15分钟。

在孵育之后，通过添加10-20倍标记体积的缓冲液并且在300xg下离心细胞悬浮液持续5分钟并且将细胞沉淀物以500μl-2ml缓冲液/10x10⁸个细胞重悬浮来洗涤细胞。

根据制造商的说明书，清洗autoMACS系统并且使用autoMACS准备制备用于磁性细胞分离。在出口端口下放置新的无菌收集管。选择autoMACS细胞分离程序。对于选择，选择POSSELDS程序。对于废弃，选择DEPLETES程序。

将标记的细胞插入在摄取端口处，然后开始程序。

在细胞选择或废弃之后，收集样本并且放于冰上直到使用。通过流式细胞术证实废弃的或选择的样本的纯度。

实施例13-具有治疗潜力的细胞可以从正常肾脏组织和患慢性病的肾脏 组织中分离出来并且增殖

本研究的目的为通过高内涵分析(HCA)确定人NKA细胞的功能表征。高内涵成像(HCI)提供了使用两个或更多个荧光探针(多路复用)在许多样本上同时成像多个亚细胞事件。高内涵分析(HCA)提供了同时定量测量在高内涵图像中捕获的多个细胞参数。简单地说，使用标准活检程序独立地从取自患有晚期慢性肾脏疾病(CKD)的五个人肾脏和三个非CKD人肾脏的核心活检中产生未分级分离的(UNFX)培养物(Aboushwareb等,同上2008)并且维持。在离体UNFX的(2)代之后，收获细胞并且经历密度梯度方法(如在实施例2中)以产生亚级分，包括亚级分B2、B3和/或B4。

从如在Ilagan等PCT/US2011/036347的表10.1中总结的非CKD和CKD人供体中获得人肾脏组织。Ilagan等PCT/US2011/036347的图4示出了HK17和HK19样本的组织病理学特征。从所有非CKD(3/3)和CKD(5/5)肾脏中建立离体培养物。人NKA细胞限定兴趣区(ROI)中的白蛋白转运的高内涵分析(HCA)示于Ilagan等PCT/US2011/036347的图5(人NKA细胞中的白蛋白转运的HCA)中。来源于非CKD和CKD肾脏的NKA细胞中的白蛋白转运的定量比较示于Ilagan等PCT/US2011/036347的图6中。

如Ilagan等PCT/US2011/036347的图6所示，在CKD来源的NKA培养物中白蛋白转运不受损。肾小管富集的B2亚级分与肾小管细胞废弃的B4亚级分之间的标记物表达的比较分析示于Ilagan等PCT/US2011/036347的图7(CK8/18/19)中。

肾小管富集的B2亚级分与肾小管细胞废弃的B4亚级分之间的白蛋白转运的比较功能分析示于Ilagan等PCT/US2011/036347的图8中。亚级分B2被富集近端小管细胞并且因此表现出增加的白蛋白转运功能。

白蛋白摄取：用含有1X抗霉菌剂/抗生素和2mM谷氨酰胺的无酚红、无血清、低葡萄糖DMEM(pr-/s-/lgDMEM)替换在24孔胶原IV板(BDBiocoat^TM)中生长至汇合的细胞的培养基持续18-24小时。在临测定之前，用pr-/s-/lgDMEM+10mMHEPES、2mM谷氨酰胺、1.8mMCaCl2以及1mMMgCl2洗涤细胞并且孵育30分钟。使细胞暴露于25μg/mL罗丹明-偶联的牛白蛋白(Invitrogen)持续30分钟，用冰冷的PBS洗涤以停止胞吞并且用含有25μg/mLHoechst核染料的2％低聚甲醛立即固定。对于抑制实验，在白蛋白添加之前10分钟添加1μM受体相关联的蛋白(RAP)(RayBiotech,Inc.,NorcrossGA)。使用BDPathway^TM855高内涵生物成像仪(BectonDickinson)进行显微成像和分析(参见Kelley等AmJPhysiolRenalPhysiol.2010年11月；299(5):F1026-39.2010年9月8日电子出版)。

最后，HCA得到细胞水平数据并且可以显示出由其他测定(即，基因或蛋白质表达)不可检测的群动力学。用于测量白蛋白转运(HCA-AT)功能的可定量离体HCA测定可以被利用表征作为人NKA原型的组分的人肾小管细胞。HCA-AT实现了细胞功能的比较评估，示出了白蛋白转运感受态细胞保留在来源于人CKD肾脏的NKA培养物中。还示出NKA培养物的特定亚级分B2和B4在表型和功能上相异，其中B2表示具有增强的白蛋白转运活性的肾小管细胞富集的级分。来自人CKD的B2细胞亚群为表型上和功能上类似于在体内显示功效的啮齿动物B2的细胞(如上所示)。

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Claims (52)

1.一种形成包含异种肾细胞群和生物活性细胞群的类器官的方法，所述方法包括在培养系统中培养所述异种肾细胞群和生物活性细胞群，所述培养系统选自：i)2D培养；ii)3D培养：COL(I)凝胶；iii)3D培养：Matrigel；iv)3D培养：旋转器，接着是COL(I)/Matrigel；以及v)3D培养：COL(IV)凝胶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述异种肾细胞群包含生物活性肾细胞群。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述异种肾细胞群包含含有富集的肾小管细胞群的B2细胞群，并且其中所述异种肾细胞群废弃了B1细胞群。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述异种肾细胞群进一步废弃了B5细胞群。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述异种肾细胞群包含选自B2、B2/B3、B2/B4和B2/B3/B4的细胞群。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述异种肾细胞群包含产生促红细胞生成素(EPO)的细胞。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物活性细胞群为内皮细胞群。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述内皮细胞群为细胞系。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述内皮细胞群包含HUVEC细胞。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞群选自异种的、同系基因的、同种异体的、自体的及其组合。

11.根据权利要求1所述的方法，其中将所述异种肾细胞群和所述生物活性细胞群单独培养持续第一时间段，合并并且培养持续第二时间段。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第二时间段为至少24小时。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二时间段为24小时至72小时。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述肾细胞群和所述生物活性细胞群的比例为1:1。

15.根据权利要求1所述的方法，其中将所述肾细胞群和所述生物活性细胞群悬浮在生长培养基中。

16.一种类器官，其根据如权利要求1至15中任一项所述的方法制备。

17.一种类器官，其包含异种肾细胞群和生物活性细胞群。

18.根据权利要求17所述的类器官，其中所述生物活性细胞群为内皮细胞群。

19.根据权利要求18所述的类器官，其中所述异种肾细胞群包含含有富集的肾小管细胞群的B2细胞群，并且其中所述异种肾细胞群废弃了B1细胞群。

20.根据权利要求19所述的类器官，其中所述异种肾细胞群进一步废弃了B5细胞群。

21.根据权利要求17所述的类器官，其中所述异种肾细胞群包含选自B2/B3、B2/B4和B2/B3/B4的细胞群。

22.根据权利要求17所述的类器官，其中所述异种肾细胞群包含产生促红细胞生成素(EPO)的细胞。

23.根据权利要求18所述的类器官，其中所述内皮细胞群为细胞系。

24.根据权利要求18所述的类器官，其中所述内皮细胞群包含HUVEC细胞。

25.一种可注射制剂，其包含至少一种类器官和液体培养基。

26.根据权利要求25所述的制剂，其中所述液体培养基选自细胞生长培养基、DPBS及其组合。

27.根据权利要求26所述的制剂，其中所述液体培养基为DPBS。

28.根据权利要求25所述的制剂，其中将所述类器官悬浮在所述液体培养基中。

29.一种可注射制剂，其包含类器官和对温度敏感的细胞稳定生物材料，所述细胞稳定生物材料

(i)在约8℃或以下维持大致上固态，并且

(ii)在约环境温度或以上维持大致上液态。

30.根据权利要求29所述的制剂，其中所述类器官包含生物活性肾细胞。

31.根据权利要求30所述的制剂，其中所述类器官还包含HUVEC。

32.根据权利要求29所述的制剂，其中所述生物活性细胞被大致上均匀地分散在所述细胞稳定生物材料的整个体积上。

33.根据权利要求29所述的制剂，其中所述生物材料在约8℃与约环境温度或以上之间包含固体到液体的过渡态。

34.根据权利要求29所述的制剂，其中所述大致上固态为凝胶态。

35.根据权利要求29所述的制剂，其中所述细胞稳定生物材料包括水凝胶。

36.根据权利要求35所述的制剂，其中所述水凝胶包括明胶。

37.根据权利要求36所述的制剂，其中所述明胶以约0.5％至约1％(w/v)存在于所述制剂中。

38.根据权利要求36所述的制剂，其中所述明胶以约0.75％(w/v)存在于所述制剂中。

39.一种治疗有需要的受试者的肾脏疾病的方法，其包括施用至少一种包含异种肾细胞群和生物活性细胞群的类器官。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述生物活性细胞群是内皮细胞群。

41.根据权利要求39所述的方法，其中所述异种肾细胞群包含含有富集的肾小管细胞群的B2细胞群，并且其中所述异种肾细胞群废弃了B1细胞群。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述异种肾细胞群进一步废弃了B5细胞群。

43.根据权利要求39所述的方法，其中所述异种肾细胞群包含选自B2、B2/B3、B2/B4和B2/B3/B4的细胞群。

44.根据权利要求39所述的方法，其中所述异种肾细胞群包含产生促红细胞生成素(EPO)的细胞。

45.根据权利要求40所述的方法，其中所述内皮细胞群为细胞系。

46.根据权利要求40所述的方法，其中所述内皮细胞群包含HUVEC细胞。

47.一种治疗有需要的受试者的肾脏疾病的方法，其包括施用根据权利要求25-38中任一项所述的可注射制剂。

48.根据权利要求39-46中任一项所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

50.根据权利要求39-46中任一项所述的方法，其中所述受试者患有肾脏疾病。

51.根据权利要求39-46中任一项所述的方法，其中观察到以下疾病的量度中任一种的改善：贫血(Hct、Hgb、RBC)、炎症(WBC)、尿浓缩(spGrav)以及氮血症(BUN)。

52.类器官在制备用于治疗肾脏疾病的药剂中的用途。