CN114732832A

CN114732832A - 一种防宫腔粘连的可植入物

Info

Publication number: CN114732832A
Application number: CN202210363491.0A
Authority: CN
Inventors: 刘丹; 张慧星; 简鹏; 李刚; 胡明月; 金鹤; 元娟娟; 李锋
Original assignee: Affiliated Hospital of Ningxia Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital of Ningxia Medical University
Priority date: 2022-04-08
Filing date: 2022-04-08
Publication date: 2022-07-12

Abstract

本发明涉及一种细胞及生物材料，尤其涉及一种防宫腔粘连的可植入物。本公开提供了一种防宫腔粘连的可植入物，包括水凝胶和类器官，其为可注射型植入物，在公开中，室温下为液态的可植入物注射入宫腔后，液态水凝胶在体温下在逐渐凝固的过程中可顺应所在的腔隙塑形，在宫腔内，则塑形为宫腔形状，完整隔离宫腔内各创面之间的接触。这种温敏型水凝胶的塑形过程完全具备适应人体不同宫腔形态的个性化需求。另外通过注射型避免了放置宫腔时宫颈管对细胞的剥脱以及放置位置的不确定性。

Description

一种防宫腔粘连的可植入物

技术领域

本发明涉及一种细胞及生物材料，尤其涉及一种防宫腔粘连的可植入物。

背景技术

宫腔粘连(IUA)是流产、刮宫、感染等常见因素等对宫腔基底层子宫内膜造成了不可逆的深度损伤，造成其内的干细胞丢失，导致功能层内膜再生困难，被纤维化的瘢痕取代，无法再生的功能层内膜造成月经异常，也无法提供营养良好、适宜受精卵种植存活的环境，导致不孕及反复流产，是难治性不孕的重要原因之一。目前，宫腔粘连的传统治疗包括宫腔镜下粘连分离术（TCRA）、术后宫内放置物理屏障隔离创面防止粘连复发、雌激素促进子宫内膜再生三个部分。然而中、重度宫腔粘连术后再粘连率高达62.5％，生育力的恢复未突破50%。治疗中无法突破的关键瓶颈是损伤及瘢痕部位干细胞丢失或低质量，内膜修复障碍导致内膜薄化功能差。如何改善这种修复、最大程度恢复生育，是亟待解决的关键问题。

在现有技术无法突破疾病生殖改善的状况下，干细胞治疗是近年非常有前景的研究热点，包括脊髓来源、经血来源、脐带来源、脂肪来源等，临床应用后取得了优于传统治疗的修复效果，成为纤维化疾病细胞治疗临床转化最有前景的应用方向。但是，干细胞应用的限制和不足包括：向有功能的目标细胞的分化（即定向分化）由于其体外分化的不稳定性和可能在分化过程中脱离调控导致肿瘤发生等，的致瘤性以及可能涉及的伦理问题导致临床应用的受限。因此，如何在应用具有最大潜能再生能力的干细胞，同时对其进行定向诱导分化并鉴定排除其致瘤结果，同时结合生物物理支撑材料，形成复合装置的细胞补片，既能有效隔离创面，又可同时并促进子宫内膜增殖修复，是亟待解决的问题。

已有报道利用生物载体负载细胞作为治疗药剂，如专利文献CN105378062A公开了利用包含细胞和对温度敏感的细胞稳定生物材料制备的生物材料作为治疗肾脏疾病，但该文献仅仅是在细胞层面，即利用细胞稳定生物材料如水凝胶等来负载细胞，并未在水凝胶直接负载类器官层面进行研究。相对于细胞，直接采用类器官治疗效果更好。但由于类器官与细胞的性质存在巨大差异，采用生物材料来负载类器官存在较大的技术障碍，目前还没有相关报道。

发明内容

为了解决相关技术中的问题，本公开提供了一种防宫腔粘连的可植入物。

第一方面，本公开提供了一种防宫腔粘连的可植入物，包括水凝胶和类器官。

结合第一方面，所述水凝胶室温下为液态。

结合第一方面，所述水凝胶在体温下形成凝固的水凝胶，其中所述凝固的水凝胶具有孔隙。

结合第一方面，所述类器官负载在所述凝固的水凝胶的孔隙内。

结合第一方面，所述孔隙的孔径约为100微米。

结合第一方面，所述水凝胶为生物可降解的温敏型水凝胶。

结合第一方面，所述水凝胶具有与人体生理状况相同的pH值。

结合第一方面，所述类器官为子宫内膜腺上皮来源，经过定向分化形成的微型子宫内膜器官。

结合第一方面，所述植入物是可注射的。

第二方面，本公开还提供了一种前述植入物的制备方法，所述方法包括如下步骤：

（1）、将子宫内膜类器官从基质胶中解离，添加子宫内膜类器官培养基制备类器官混悬液；

（2）将液态的、符合类器官释放的微孔直径的水凝胶置于低温环境下，配制类器官细胞悬液，将所述类器官细胞悬液与所述水凝胶充分混匀，形成所述可植入物。

结合第二方面，前述述低温环境为4℃冰上，优选地，所述类器官细胞悬液的浓度为15%；更优选地，将1mL的类器官细胞悬液与3mL水凝胶混匀。

第三方面，本公开还提供了一种根据前述的植入物在制备用于治疗子宫内膜的功能性修复的药剂中的用途。

结合第三方面，治疗子宫内膜的功能性修复过程如下：

步骤一，将从患者自体子宫内膜中经过分离纯化特殊培养后获得的子宫内膜类器官；

步骤二，将子宫内膜类器官从基质胶中解离，添加1mL子宫内膜类器官培养基制备类器官混悬液；

步骤三：将液态的、符合类器官释放的微孔直径的水凝胶置于4℃冰上，配制浓度为15%，将1mL的类器官细胞悬液与3mL水凝胶充分混匀，形成可植入物；

步骤四：宫腔粘连患者经完善术前各项准备后，行宫腔镜下宫腔粘连分解术，以完全分离粘连恢复宫腔正常形态、同一视野内可同时看到双侧输卵管开口为停止手术标准；

步骤五：将宫腔内残留血液及膨宫介质吸收干净后，将4ml步骤三中制备好的可植入物注射至宫腔内，患者取头低臀高位，保留液体细胞补片20分钟，可植入物在人体温度下凝固成果冻质感的固体，包含其内的类器官形成复合装置，既可有效隔离分离粘连后的创面防止贴靠后形成再粘连，同时果冻样组织质感较软，对子宫肌层血管不会产生压迫，可以保障内膜修复中良好的血液供应。之后，水凝胶孔隙缓慢释放类器官，募集到粘连分离后的创面，促进子宫内膜的功能性修复，达到改善生殖的作用；

步骤六：观察患者术后一般情况，有无过敏发热等不良反应，并遵照宫腔粘连分离术后细胞治疗的标准流程进行管理和复诊。

定义：

除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

本公开中所使用的术语“室温”为25℃左右。

本公开中所述使用的术语“体温”为37℃左右。

在公开中，室温下为液态的可植入物注射入宫腔后，液态水凝胶在体温下在逐渐凝固的过程中可顺应所在的腔隙塑形，在宫腔内，则塑形为宫腔形状，完整隔离宫腔内各创面之间的接触。这种温敏型水凝胶的塑形过程完全具备适应人体不同宫腔形态的个性化需求。另外通过注射型避免了放置宫腔时宫颈管对细胞的剥脱以及放置位置的不确定性。

在本公开中，凝固后的水凝胶呈果冻样，硬度不会对子宫肌壁血管和内膜产生压迫。凝固后的水凝胶带有孔隙，直径为100微米左右，为类器官逸出的适宜孔径。该可植入物具有可控的的生物降解性，与新生子宫内膜的生长速度相匹配，目前在20-30天左右，降解物对人体无毒副作用。另外，在水凝胶逐渐降解的过程中（20天左右），类器官可以缓慢均匀的被释放并募集到损伤部位进行持续性的修复；达到改善生殖的目的。水凝胶可以是温敏型胞外基质为构成的类型。

在本公开中，类器官为患者自体子宫内膜来源制备，不存在免疫排斥。

在本公开中，类器官自水凝胶孔隙缓慢释放，募集到粘连分离后的创面进行修复。

附图说明

结合附图，通过以下非限制性实施方式的详细描述，本公开的其它特征、目的和优点将变得更加明显。在附图中：

附图1为可植入物移植后HE染色；

附图2为GFP绿色荧光子宫内膜类器官培养；

附图3为GFP细胞补片原位移植；

附图4为左图小鼠左侧子宫为宫腔粘连未放置可植入物，右侧为造模后放置可植入物，可见妊娠。

具体实施方式

下文中，将参考附图详细描述本公开的示例性实施例，以使本领域技术人员可容易地实现它们。此外，为了清楚起见，在附图中省略了与描述示例性实施例无关的部分。

在本公开中，应理解，诸如“包括”或“具有”等的术语旨在指示本说明书中所公开的特征、数字、步骤、行为、部件、部分或其组合的存在，并且不欲排除一个或多个其他特征、数字、步骤、行为、部件、部分或其组合存在或被添加的可能性。

另外还需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本公开。

实施例1：

子宫内膜类器官的制备：

步骤1：将获得的小鼠子宫内膜组织置于含2%（v/v）双抗的生理盐水中反复振荡洗涤几次；

步骤2，将洗涤后的组织加入HBSS缓冲液，15min内将其处理成1~2mm3的组织碎块；

步骤3，在组织碎块中加入消化液 I，于 37℃恒温消化1~3 h，之后加入HBSS 缓冲液终止消化，离心后保留沉淀；

步骤4，在步骤3获得的沉淀中加入消化液 II，于37℃恒温消化 8~12min 后加入HBSS 缓冲液终止消化，离心后保留沉淀；

步骤5，在步骤4获得的沉淀中加入HBSS 缓冲液重悬沉淀，用 100μm 滤网过滤并离心，得到子宫内膜上皮细胞沉淀；

步骤6，在子宫内膜上皮细胞沉淀中加入红细胞裂解液裂解，之后加入HBSS 缓冲液终止裂解，离心后获得细胞沉淀；

步骤7，在细胞沉淀中加入预冷的Advanced DMEM/F12 培养基混匀，再加入基质胶混匀，形成胶滴后接种于培养皿中静置，凝固后于37℃恒温倒置一段时间，之后加入扩增培养基于37℃、5%CO2条件下扩增培养5~7天，每间隔 2-3 天更换一次扩增培养基；

步骤8，扩增培养后在体系中加入分化培养基继续培养13~18d，分化培养基隔天更换一次，即得子宫内膜类器官。

可植入物的制备与移植：

步骤1，将获得的子宫内膜类器官，将子宫内膜类器官从基质胶中解离，添加200ul子宫内膜类器官培养基制备细胞混悬液；

步骤2，将水凝胶置于4℃冰上，配制浓度为15%，将200ul的细胞悬液与150ul水凝胶充分混匀备用，形成可植入物；

步骤3，建立宫腔粘连小鼠模型，暴露两侧宫角，用20ul的移液器可植入物注射至小鼠子宫损伤部位，两侧各40ul体积；

步骤4：将损伤部位两侧结扎，待30min后解除结扎带，可植入物已形成果冻样适合宫腔形态的复合装置紧密支撑并隔离于损伤部位。

步骤5：观察小鼠子宫内膜修复与生殖改善结局。

从附图1可以看出，随着时间的推移，移植的类器官在体内各组视野内子宫内膜腺体数量逐渐增多，当移植后4周，移植组的腺体明显高于对照组。

从附图2可以看出，经GFP小鼠获取的子宫内膜在条件培养基的培养下可形成GFP子宫内膜类器官，呈绿色荧光成像模式，直径可达100um以上，具有增殖与分化功能。

从附图3可以看出，体内生物发光成像显示，水凝胶支架可以将类器官在受伤部位保留更长的时间。

从附图4可以看出，经类器官移植治疗后的 IUA 模型侧小鼠子宫成功受孕，而没有进行类器官移植治疗的IUA 模型侧小鼠子宫未能受孕。

以上描述仅为本公开的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本公开中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本公开中公开的（但不限于）具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

Claims

1.一种防宫腔粘连的可植入物，包括水凝胶和类器官。

2.根据权利要求1所述的可植入物，所述水凝胶室温下为液态。

3.根据权利要求1或2所述的可植入物，所述水凝胶在体温下形成凝固的水凝胶，其中所述凝固的水凝胶具有孔隙；

优选地，所述类器官负载在所述凝固的水凝胶的孔隙内；

更优选地，所述孔隙的孔径约为100微米。

4.根据前述权利要求任一项所述的可植入物，所述水凝胶为生物可降解的温敏型水凝胶。

5.根据前述任一项所述的可植入物，所述水凝胶具有与人体生理状况相同的pH值。

6.根据前述权利要求任一项所述的可植入物，所述类器官为子宫内膜腺上皮来源，经过定向分化形成的微型子宫内膜器官。

7.根据前述任一项所述的植入物，所述植入物是可注射的。

8.根据权利要求1-7中任一项所述植入物的制备方法，所述方法包括如下步骤：

（1）将子宫内膜类器官从基质胶中解离，添加子宫内膜类器官培养基制备类器官混悬液；

9.根据权利要求8所述的制备方法，所述低温环境为4℃冰上，优选地，所述类器官细胞悬液的浓度为15%；更优选地，将1mL的类器官细胞悬液与3mL水凝胶混匀。

10.根据权利要求1-7中任一项所述的植入物在制备用于治疗子宫内膜的功能性修复的药剂中的用途。