CN105294857B

CN105294857B - 基于fix的抗原表位及其应用

Info

Publication number: CN105294857B
Application number: CN201410273142.5A
Authority: CN
Inventors: 李荣秀; 杜进
Original assignee: Shanghai Jiao Tong University
Current assignee: Yuetenong Biotechnology Hebei Co ltd
Priority date: 2014-06-18
Filing date: 2014-06-18
Publication date: 2019-02-19
Anticipated expiration: 2034-06-18
Also published as: CN105294857A

Abstract

本发明公开了基于FIX的抗原表位及其应用。具体地，本发明提供了一种抗原表位肽，所述抗原表位肽源自动物FIX且包含一个或多个抗原表位，并且所述抗原表位肽氨基酸序列长度为FIX全长的2‑100％，且所述抗原表位肽的长度为5‑500个氨基酸；并且所述抗原表位肽与载体蛋白形成的重组蛋白可诱发同一种类的所述动物产生针对FIX的免疫反应。该抗原表位肽与载体蛋白融合后能激发起较强的体液免疫反应，产生特异性针对FIX的抗体。本发明还公开了一种特异性识别并结合人FIX的抗体及FIX抗体的制备方法，该抗体可用于人FIX的分离纯化、检测以及治疗与所述抗原表位相关的疾病。

Description

基于FIX的抗原表位及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及一种基于FIX的抗原表位及其应用。

背景技术

FIX是凝血系统中参与凝血级联反应的一个重要的维生素K依赖的糖蛋白，它在人体内的缺乏或不足将导致血友病B。终身输注FIX制剂是血友病B最主要的治疗途径，也就是说血友病B患者终身都离不开FIX的治疗，因此，获得高安全性的hFIX对于血友病B病人来说是非常重要的。

FIX的主要来源途径是从健康人血浆中纯化FIX(pdhFIX)和通过基因工程技术制备重组FIX(rhFIX)。传统的pdhFIX纯化方法包括磷酸钙吸附法、氢氧化铝吸附法、离子交换法和肝素亲和纯化法等。由于血液中hFIX的浓度非常低(健康人血浆中hFIX浓度约为5μg/mL)，且这类凝血蛋白的物理化学性质又十分相似，因此，这些传统方法制备的hFIX纯度总是很低，常含有FII、FVII、FX和蛋白C等，由于血友病人需要终生用药，因此，反复注射这种低纯度的hFIX制剂会有增加血栓形成和发生血栓栓塞的危险。少数的一些方法虽然能够制得纯度较高的hFIX，但是由于其成本高或者回收率低，无法应用于hFIX的工业化生产中。在rhFIX研制方面，已有通过牛乳系统成功表达出了有活性的rhFIX的报道，但是在其规模化分离纯化方面，至今仍未能找到有效的方法。所尝试的一些方法，包括离子交换层析、肝素亲和层析或者几种方法串联使用等，均未能取得良好的结果，往往不是使得rhFIX失活就是因步骤繁多导致回收率极低或者纯度过低。因此，研究出一种高效且适宜于的FIX(包括pdhFIX和rhFIX)规模化纯化的方法便至关重要且迫在眉睫。

免疫亲和层析因其高特异性和高纯化效率被认为是纯化抗原的潜在理想方法，而它成功的关键首先在于是否能够制得足量特异性好且亲和力适中的抗hFIX抗体。1984年，Liebman等通过制备Ca²⁺依赖型的单克隆抗体来纯化hFIX，结果，经一步纯化便获得了特异凝血活性高达150IU/mg的纯hFIX，回收率高，而且该单克隆抗体与hFIX的结亲和力较为温和，这样便保证了hFIX的活性。但是，该单克隆抗体造价昂贵、制备周期很长，限制了其在hFIX规模化生产中的应用。多克隆抗体可被用于抗原的纯化，而且制备简单，但是由于普通的多克隆抗体是由多个B表位产生的抗体混合物，性质不均一，且亲和力非常强，当它用于纯化时，洗脱条件难易掌握，且往往由于过于严苛的洗脱条件致使目标蛋白失活。另一方面，多抗的特异性往往比较低，当它用来纯化牛乳中的rhFIX的时候，很可能会与牛内源性FIX(bFIX)发生非特异性结合，从而导致纯化的产物安全性降低，因此，它不适宜用来纯化hFIX(包括pdhFIX和rhFIX)。因此，要解决这两种抗体用于纯化hFIX存在的问题，就需要找到一种新的抗hFIX抗体制备方法，使其能够产生足量特异性好且亲和力温和的抗体，从而使它能够用于hFIX的规模化免疫亲和纯化，得到高纯度且保持凝血活性的hFIX。

作为用于纯化抗原的抗体，它识别的并不是整个抗原分子，而是抗原分子中的B表位。研究表明，抗体的特异性与抗原的特异性相关，而抗原的特异性实际上指的是表位的特异性。因此获得特异性好、亲和力适中的抗原表位是制备纯化抗体的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于FIX的抗原表位肽及其应用，该抗原表位肽与载体蛋白融合后能激发起较强的体液免疫反应，产生特异性针对FIX的抗体。

本发明的另一目的是提供一种特异性识别并结合人FIX的抗体及FIX抗体的制备方法，该抗体可用于人FIX的分离纯化、检测以及治疗与所述抗原表位相关的疾病。

本发明的第一方面，提供了一种抗原表位肽，所述抗原表位肽源自动物FIX且包含一个或多个抗原表位，

并且所述抗原表位肽氨基酸序列长度为FIX全长的2-100％(优选地，所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的5-70％；更优选地，所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的5-50％；最优选地，所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的5-30％，如5％、10％、15％、20％、25％)，且所述抗原表位肽的长度为5-500个氨基酸；

并且所述抗原表位肽与载体蛋白形成的重组蛋白可诱发同一种类的所述动物产生针对FIX的免疫反应。

优选地，所述抗原表位肽氨基酸序列长度为3-57。更优选地，所述抗原表位肽氨基酸序列长度为5-17。如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17个氨基酸。

在另一优选例中，所述动物为哺乳动物。如，人、鼠、兔、牛或羊。

在另一优选例中，所述抗原表位肽包括人FIX全长序列、鼠FIX全长序列、兔FIX全长序列、牛FIX全长序列、羊FIX全长序列或其同源序列。

在另一优选例中，所述人FIX全长序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述鼠FIX全长序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述牛FIX全长序列如SEQ ID NO.:3所示。

在另一优选例中，所述抗原表位肽选自下组：

(1)NAAINKY；

(2)将(1)中氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的衍生的多肽。

在另一优选例中，所述载体蛋白具有至少一个T细胞表位，并且在所述载体蛋白的至少一个分子表面氨基酸残基区通过拼接、替换、和/或插入而引入所述的抗原表位肽。

在另一优选例中，所述载体蛋白与所述抗原肽段不是来自同一个蛋白，并且所述载体蛋白可以增强所述表位肽的免疫原性。

在另一优选例中，所述载体蛋白包括白喉毒素DT、白喉毒素的跨膜结构域DTT、霍乱毒素B亚单位(CTB)、沙门氏菌鞭毛蛋白(FliC)、百日咳毒素(PTX)、破伤风毒素、或上述蛋白的免疫原性片段(如破伤风毒素的C片段)、轮状病毒VP7、利什曼原虫的热休克蛋白、空肠弯曲菌鞭毛蛋白、沙眼衣原体主要外膜蛋白、血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)，鸡卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)，纤维蛋白原。

在另一优选例中，所述“分子表面氨基酸残基区”包括loop区、beta-tum区、N末端或C末端。

本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白是如本发明第一方面所述的抗原表位肽与载体蛋白融合所形成的。

在另一优选例中，所述的载体蛋白为白喉毒素的跨膜结构域DTT，并且所述的loop区包括292-298，305-310位氨基酸。在另一优选例中，通过将所述抗原表位肽替换所述DDT的第292-295位氨基酸制成所述融合蛋白。

在另一优选例中，所述的载体蛋白为霍乱毒素B亚单位，并且所述的loop区包括：

霍乱毒素B亚单位(CTB)可植入表位可植入表位29-38位氨基酸

在另一优选例中，所述抗原表位肽连接于所述载体蛋白的C末端和/或N末端形成所述融合蛋白。

在另一优选例中，所述抗原表位和所述载体蛋白之间具有连接肽。优选地，所述连接肽长度为3-30个氨基酸。更优选地，所述连接肽长度为4-20个氨基酸。最优选地，所述连接肽长度为7-17个氨基酸。

在另一优选例中，所述抗原表位和所述载体蛋白之间不具有连接肽。

在另一优选例中，所述抗原表位肽替换DTT中的第292-295位氨基酸形成所述融合蛋白。

在另一优选例中，所述融合蛋白选自：

(a)具有SEQ ID NO.:12所示氨基酸序列的多肽；

(b)将(a)中的每个多肽分别经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有诱发免疫反应功能的由(a)衍生的多肽。

本发明的第三方面，提供了一种抗体，所述抗体特异性的结合本发明第一方面所述的抗原表位肽或本发明第二方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述抗原表位肽为NAAINKY。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:12所示。

本发明的第四方面，提供了一种分离的抗原抗体复合物，其中，形成所述复合物的抗原中包含本发明第一方面所述的抗原表位肽或本发明第二方面所述的融合蛋白，所述抗原表位肽形成抗原表位，所述抗体特异性地结合于所述抗原表位。

在另一优选例中，所述抗原表位的氨基酸序列为NAAINKY。

本发明的第五方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的抗原表位肽、本发明第二方面所述的融合蛋白或本发明第三方面所述的抗体。

本发明的第六方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第五方面所述的所述的多核苷酸。

本发明的第七方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第六方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有本发明第五方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、CHO细胞、DC细胞等。

本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物含有本发明第一方面所述的抗原表位肽、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的所述的抗体、本发明第四方面所述的所述的多核苷酸、本发明第六方面所述的表达载体或者本发明第七方面所述的所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述的组合物为疫苗。

本发明的第九方面，提供了一种疫苗组合物，所述的组合物含有本发明第一方面所述的抗原表位肽、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的所述的抗体、本发明第四方面所述的所述的多核苷酸、本发明第六方面所述的表达载体或者本发明第七方面所述的所述的宿主细胞，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。

在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、quil A、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、FIX、IL-12、和CpG)。

本发明的第十一方面，提供了本发明第一方面所述的抗原表位肽、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的所述的抗体、本发明第四方面所述的所述的多核苷酸、本发明第六方面所述的表达载体或者本发明第七方面所述的宿主细胞的用途，

(a)用于制备针对所述抗原表位的抗体；和/或(b)用于制备治疗与所述抗原表位相关的疾病的药物。

在另一优选例中，所述的疾病包括：心血管疾病、血栓、中风以及梗塞等。

本发明的第十二方面，提供了本发明第三方面所述的抗体或本发明第四方面所述的抗原抗体复合物的用途，用于

(1)FIX的分离纯化；或

(2)非诊断目的FIX的检测。

本发明的第十三方面，提供了一种制备FIX抗体的方法，包括步骤：

(1)使用本发明第二方面所述的融合蛋白作为抗原免疫动物，并在动物体内产生抗FIX的抗体；

(2)分离纯化所述FIX抗体。

在另一优选例中，所述动物为哺乳动物。

在另一优选例中，所述动物包括人、鼠、兔、牛或羊。

本发明的第十四方面，提供了一种分离纯化人FIX的方法，包括步骤：

(1)使用本发明第十三方面所述的方法制备人FIX抗体；

(2)使用步骤(1)中获得的抗体，采用亲和层析的方法纯化人FIX。

本发明的第十五方面，提供了一种治疗方法，给需要的对象施用本发明第一方面所述的抗原表位肽、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的所述的抗体、本发明第四方面所述的所述的多核苷酸、本发明第六方面所述的表达载体或者本发明第七方面所述的宿主细胞、本发明第八方面所述的所述的药物组合物或本发明第九方面所述的疫苗组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了实施例3中Western-blot检测纯化所得抗体的结合特异性。

图2显示了实施例3中抗体等温量热滴定测量结果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一类新的FIX表位，将该表位与载体蛋白融合，制得的融合蛋白作为抗原免疫动物，能够获得特异性好，亲和力适中的抗FIX抗体，且该抗体既能识别pdhFIX，又识别rhFIX，为高纯度的抗hFIX抗体的规模化制备，奠定了坚实的基础。

FIX

人FIX的氨基酸序列如下所示：

MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT(SEQ ID NO.:1)

小鼠FIX的氨基酸序列如下所示：

MKHLNTVMAESPALITIFLLGYLLSTECAVFLDRENATKILTRPKRYNSGKLEEFVRGNLERECIEERCSFEEAREVFENTEKTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGICKDDISSYECWCQVGFEGRNCELDATCNIKNGRCKQFCKNSPDNKVICSCTEGYQLAEDQKSCEPTVPFPCGRASISYSSKKITRAETVFSNMDYENSTEAVFIQDDITDGAILNNVTESSESLNDFTRVVGGENAKPGQIPWQVILNGEIEAFCGGAIINEKWIVTAAHCLKPGDKIEVVAGEYNIDKKEDTEQRRNVIRTIPHHQYNATINKYSHDIALLELDKPLILNSYVTPICVANREYTNIFLKFGSGYVSGWGKVFNKGRQASILQYLRVPLVDRATCLRSTTFTIYNNMFCAGYREGGKDSCEGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT(SEQ ID NO.:2)

牛FIX的氨基酸序列如下所示：

YNSGKLEEFVRGNLERECKEEKCSFEEAREVFENTEKTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGMCKDDINSYECWCQAGFEGTNCELDATCSIKNGRCKQFCKRDTDNKVVCSCTDGYRLAEDQKSCEPAVPFPCGRVSVSHISKKLTRAETIFSNTNYENSSEAEIIWDNVTQSNQSFDEFSRVVGGEDAERGQFPWQVLLHGEIAAFCGGSIVNEKWVVTAAHCIKPGVKITVVAGEHNTEKPEPTEQKRNVIRAIPYHSYNASINKYSHDIALLELDEPLELNSYVTPICIADRDYTNIFSKFGYGYVSGWGKVFNRGRSASILQYLKVPLVDRATCLRSTKFSIYSHMFCAGYHEGGKDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT(SEQ ID NO.:3)

载体蛋白

如本文所用，术语“载体蛋白”指在本发明的重组蛋白中作为蛋白结构骨架的蛋白。通常，所述的载体蛋白是免疫原性较强的蛋白，例如病原体蛋白，代表性的例子包括(但并不限于)：病毒蛋白、细菌蛋白、衣原体蛋白、支原体蛋白等。

如本文所用，术语“抗原表位(肽)”指拟诱导动物产生免疫反应的其它蛋白的一段肽，该表位相对于载体蛋白而言的不是指载体蛋白本身能够引起免疫反应的肽段。通常，抗原表位指免疫反应拟靶向的肽段，较佳地来源于哺乳动物(如人)蛋白的一段肽，而不是来自所述载体蛋白。

如本文所用，术语.pdb专指蛋白质三级结构数据文件，来自Protein Data Bank(www.pdb.org)；

如本文所用，术语DTT指白喉毒素的跨膜结构域；

如本文所用，术语T细胞表位又称为T细胞抗原表位，是抗原分子经过抗原呈递细胞中酶解加工产生的一段肽，能够由主要组织相容性复合体(MHC)分子结合，呈递在细胞表面被T细胞受体(TCR)结合，激活T细胞，包括T辅助细胞表位等。

如本文所用，术语“低免疫原性蛋白”是指单独免疫动物不能引起足够的免疫反应的蛋白。

如本文所用，术语“分子表面氨基酸残基区”或“表面氨基酸残基区”是指位于蛋白分子表面的氨基酸残基组成的区域，优选地，所述“分子表面氨基酸残基区”包括loop区、beta-tum区、N末端或C末端。

代表性的载体蛋白

1.白喉毒素及其跨膜结构域

白喉毒素(diphtheria toxin，DT)是感染了beta噬菌体的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)产生的外毒素，存在于临床使用的百白破疫苗成份中。安全性得到多年临床使用的验证，罕见严重不良反应，目前尚无由白喉成份引起过敏反应的报道。

白喉毒素分子由535个氨基酸残基构成，空间上相对独立的催化结构域(1-193AAs)、跨膜结构域(205-378AAs)和受体结合域(386-535AAs)组成；跨膜结构域和受体结合域本身无毒性，其功能是通过细胞表面受体结合，将催化结构域转导进入细胞内。

白喉毒素氨基酸序列(P00588，DTX_CORBE)如下所示：

GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KGFYSTDNKY

DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF HQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVA FHRSSSEKIH SNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLSLF FEIKS(SEQ IDNo.:4)

白喉毒素分子中的存在5个T-辅助细胞表位可被高达80％以上的人MHCclassⅡ识别。本发明人对白喉毒素的蛋白结构进行模拟，保留结构稳定需要的α螺旋和β折叠元件和T细胞表位，能够被替换植入抗原表位的表面氨基酸残基区位置292-298，305-310位氨基酸。

白喉毒素跨膜结构域(DTT)本身无毒，主要由α螺旋元件构成核心骨架，螺旋元件之间由灵活性的环区连接。

DTT氨基酸序列(1F0L.pdb：202–378)如下所示：

202INLDWDVIRD KTKTKIESLK EHGPIKNKMS ESPNKTVSEE KAKQYLEEFH QTALEHPELS

262ELKTVTGTNP VFAGANYAAW AVNVAQVIDS ETADNLEKTT AALSILPGIG SVMGIADGAV

322HHNTEEIVAQ SIALSSLMVA QAIPLVGELV DIGFAAYNFV ESIINLFQVV HNSYNRP(SEQID No.:5)

本发明人对DTT的蛋白结构进行模拟，保留结构稳定需要的α螺旋和β折叠元件和T细胞表位，能够被替换植入抗原表位的位置292-298，305-310位氨基酸。

在本发明的优选例中，可选择药物拟干预的靶蛋白的肽段移植到DTT上，并替换DTT的表面氨基酸残基区，包括α螺旋元件之间环区氨基酸残基。

本发明的研究表明，白喉毒素跨膜结构与来自靶蛋白的肽段整合后，不会或基本上不会影响各自的折叠。在重组蛋白中，DTT作为蛋白骨架，靶蛋白肽段移植到DTT上后，可以诱导动物产生针对所述靶蛋白的免疫反应。因此DTT是一种非常合适的蛋白骨架。

2.霍乱毒素B亚单位(CTB)

霍乱毒素(cholera toxin)是霍乱弧菌分泌的外毒素(84kDa)，由A、B亚基组成，为AB5型。霍乱毒素B亚单位(CTB)是霍乱毒素无毒的部分，具有良好的免疫原性，经人体试验证明是疫苗的有效成分。CTB能与大多数哺乳动物细胞表面存在的神经节苷脂GM1特异性结合，刺激机体产生粘膜IgA，加强抗原性诱导粘膜免疫反应。CTB已用于新型口服霍乱疫苗、佐剂及蛋白质载体。

CTB无毒，由2段α螺旋元件和6段beta-片构成核心骨架，结构元件之间由灵活性的环区连接。五个B亚以长α螺旋元件相对平行向内组装，形成五角星形状。每个亚基都可独立结合细胞膜上的神经结苷脂(GM1)受体。

CTB氨基酸序列(3CHB.pdb：1–103)如下所示：

1TPQNITDLCA EYHNTQIYTL NDKIFSYTES LAGKREMAII TFKNGAIFQV EVPGSQHIDS

60QKKAIERMKD TLRIAYLTEA KVEKLCVWNN KTPHAIAAIS MAN(SEQ ID No.:6)

CTB含2个T细胞表位，CTB-Th表位81-100(81-KVEKLCVWNNKTPHAIAAIS-100)为优势表位，CTB-Th表位31-50(31-LAGKR EMAIITFKNGAIFQV-50)为弱势表位，分布在亚单位结构核心的4段Beta-片上。

本发明人对CTB的蛋白结构进行模拟，保留结构稳定需要的α螺旋和β折叠元件，T细胞表位，能够被替换植入抗原表位的位置为29-38位氨基酸

3.沙门氏菌鞭毛蛋白(FliC)

沙门氏菌鞭毛蛋白FliC(Phase1-C flagellin)是鞭毛的丝状体成份，与多种动物细胞受体TLR5结合，激发动物的先天性免疫系统应答，促使未成熟DC细胞表面表达CD80和CD86，分泌多种细胞因子和趋化因子，在先天性免疫反应和特异性特异性免疫反应中发挥较强的免疫佐剂作用，其作为免疫佐剂成份已在多个病原体疫苗制剂中获得应用。

FliC由494个氨基酸组成,晶体结构显示，此蛋白回折使其N端与C端靠拢形成状如大写的希腊字母gamma“Γ”。

FliC(1ucu.pdb：1–494)的氨基酸序列如下所示：

AQVINTNSLS LLTQNNLNKS QSALGTAIER LSSGLRINSA KDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDG ISIAQTTEGA LNEINNNLQR VRELAVQSAN STNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQ FNGVKVLAQD NTLTIQVGAN DGETIDIDLK QINSQTLGLDTLNVQQKYKVSDTAATVTGY ADTTIALDNS TFKASATGLG GTDQKIDGDL KFDDTTGKYYAKVTVTGGTGKDGYYEVSVD KTNGEVTLAG GATSPLTGGL PATATEDVKN VQVANADLTEAKAALTAAGVTGTASVVKMS YTDNNGKTID GGLAVKVGDD YYSATQNKDG SISINTTKYTADDGTSKTALNKLGGADGKT EVVSIGGKTY AASKAEGHNF KAQPDLAEAA ATTTENPLQKIDAALAQVDTLRSDLGAVQN RFNSAITNLG NTVNNLTSAR SRIEDSDYAT EVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVL SLLR(SEQ ID No.:7)

本发明人对FliC的蛋白结构进行模拟，在保留结构稳定需要的α螺旋和β折叠元件的情况下，能够被替换植入抗原表位的位置为348-KYTADDGTSKTA-359氨基酸残基。

组合物和施用方法

本发明还提供了一种组合物，它含有：(i)本发明的重组蛋白或本发明的可编码重组蛋白的多核苷酸，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。

本发明的组合物可以是单价的(仅含有一种重组蛋白或多核苷酸)，也可以是多价的(含有多种重组蛋白或多核苷酸)。

本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

(i)药物组合物

本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明重组蛋白或多核苷酸。

本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的重组蛋白。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的重组蛋白)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。

组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

(ii)疫苗组合物

本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病)或治疗性的(即在患病后治疗疾病)。

这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明重组蛋白)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。

增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO90/14837)，(b)SAF，和(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、FIX、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。

包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。

更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。

此外，本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。

(iii)给药途径和剂量

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。

当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组蛋白直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

应以“有效量”给予重组蛋白疫苗，即重组蛋白的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。

代表性的疾病包括(但并不限于)：自身免疫性疾病、肿瘤等。

在各疫苗剂份中所选用的重组蛋白的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000mg，较佳地为1μg-100mg，更佳地10μg-50mg蛋白质。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。

优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。

此外，本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予，或者与其他治疗剂一起给予。

本发明的主要优点在于：

(1)包含本发明的基于FIX的抗原表位的融合蛋白，用作疫苗可有效激发机体针对FIX的免疫反应。

(2)携带本发明的抗原表位的重组蛋白的制备成本低，给药方便。

(3)相对于与载体蛋白化学偶联的制剂，本发明的抗原结构确切、质量可控，更安全。

(4)使用包含本发明抗原表位肽的融合蛋白免疫动物，制备的针对FIX的抗体，其特异性强，亲和力适中，该抗体非常适用于FIX的分离纯化。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1 设计B细胞抗原表位并制备融合蛋白

在本实施例中，设计了4个hFIX的B表位，这些表位的基本信息见表1和表2。

表1设计的hFIX的B表位的基本信息

表2设计的hFIX的B表位序列的同源性

表3表位移植结果

1.表位融合蛋白制备

1.1引物设计

各FIX表位基因序列如下：

FIX-1:ATTGAGGAGACAGAACAT(SEQ ID NO.:13)

FIX-2:AATGC AGCTATTAAT AAGTAC(SEQ ID NO.:14)

FIX-3:CTCCACAAAGGGAGATCA(SEQ ID NO.:15)

FIX-4:GTTGAA ACTGGTGTTA AAATT(SEQ ID NO.:16)

DTT基因序列:

ataaatcttgattgggatgtcataagggataaaactaagacaaagatagagtctttgaaagagcatggccctatcaaaaataaaatgagcgaaagtcccaataaaacagtatctgaggaaaaagctaaacaatacctagaagaatttcatcaaacggcattagagcatcctgaattgtcagaacttaaaaccgttactgggaccaatcctgtattcgctggggctaactatgcggcgtgggcagtaaacgttgcgcaagttatcgatagcgaaacagctgataatttggaaaagacaactgctgctctttcgatacttcctggtatcggtagcgtaatgggcattgcagacggtgccgttcaccacaatacagaagagatagtggcacaatcaatagctttatcatctttaatggttgctcaagctattccattggtaggagagctagttgatattggtttcgctgcatataattttgtagagagtattatcaatttatttcaagtagttcataattcgtataatcgtccc(SEQ ID NO.:17)

利用重组PCR技术用设计的FIX抗原表位的碱基序列替换DTT上的碱基序列，形成融合蛋白的碱基编码序列。

重组PCR中使用的重组引物如表5所示。

表5引物设计

1.2载体构建

1)第一轮PCR

以DTT质粒为模板，用引物DTT正向-A/DTT反向-D和各上半段反向-B/各下半段正向-C进行第一轮PCR，分别扩增各DTT-FIX表位重组基因的上半段和下半段。

反应体系为5μL 10×KOD-Plus Buffer，5μL dNTPs(2mmol/L)，2μL MgSO4(25mmol/L)，1.5μL引物B或C，1.5μL引物A或D，1μL KOD-Plus(聚合酶)，0.5μL DTT质粒(模板)，用无菌双蒸水补至50μL。

扩增程序：

94℃预变性2min，94℃变性15s，55℃退火30s，68℃延伸2min，34个循环，68℃延伸10min。12℃,Forever，保存。

电泳检测，所有突变片段大小与预期相一致。

2)第二轮PCR

将第一轮PCR割胶回收产物上下半段分别稀释15-20倍后，然后按如下反应体系将上下半段混合，用DTT两端的引物A和D扩增出DTT-表位重组基因全序列。

反应体系为5μL 10×KOD-Plus Buffer，5μL dNTPs(2mmol/L)，2μL MgSO₄(25mmol/L)，两端引物各1.5μL，1μL KOD-Plus(聚合酶)，0.5μL DTT质粒(模板)，用无菌双蒸水补至50μL。

用重组PCR方式扩增DTT-表位重组基因，经电泳检测，第一轮PCR后，分别获得了200bp和300bp左右的基因片段，表明各重组基因的上下片段均扩增成功；而第二轮混合拼接后，所有片段大小均为500bp左右，与所预期目的片段大小一致。

3)混合连接产物与载体双酶切

第二轮PCR产物经电泳检测，割胶回收后，用BamHI和Xho I双酶切。将pGEX-6P-1载体用相同的酶双酶切，酶切体系如下：

通过检测，载体与目的DNA均被成功双酶切，可以进行连接。

4)连接与转化

将割胶回收的双酶切产物用连接酶连接起来。连接体系为：1μL pEGX-6P-1载体，1μL 10×Ligation Buffer，0.5μL T4DNA连接酶，1μL目的DNA(10ng/μL)以及6.5μL ddH₂O。

按比例1:100DH5α将连接产物转入感受态细胞中，冰浴30min，42℃水浴热激90S，转入含1mL LB培养基的离心管，37℃，150rpm摇床复苏1h，取出500μL涂平板(含有氨苄青霉素)，37℃恒温箱中培养20h左右，挑取阳性单菌落，37℃恒温培养，OD＝0.4左右，提取重组质粒。

挑取单菌落培养，进行菌液PCR阳性菌落鉴定，经鉴定所有菌液均为阳性克隆，可进行测序进一步验证。

5)测序

经菌液PCR鉴定正确的阳性克隆，取200μL对应的菌液测序，测序工作由南京金斯瑞生物公司完成。

6)提取阳性重组质粒，转化BL21(DE3)细胞。

抽提测序正确的阳性克隆菌液的重组质粒，重新转入BL21(DE3)细胞中，质粒提取操作和转化操作同上。

1.3蛋白表达与纯化

取15ml离心管，加入3mL的LB含氨苄青霉素的培养基，挑取转化到BL21细胞的阳性克隆加入其中，37℃恒温培养，OD＝0.5左右时，将其转接到1L含LB(含千分之一氨苄青霉素)的三角瓶中摇床培养，OD＝0.6左右时，加入千分之一的50mM IPTG，诱导5h左右，将诱导菌液离心，12000g，5min，用10倍体积PBS重悬，超声破碎后，再次离心(16000g，20min)，将上清液进行亲和纯化。

蛋白纯化：取5mLGST柱子，10倍体积10mM PBS(pH7.5)平衡，流速3ml/min；平衡完后，以1.5mL/min的流速上样；上样完后，用10mM PBS(pH7.5)以1.5-2.0mL/min的流速洗杂，直至OD₂₈₀将至接近0时停止；用50mM GSH洗脱液(pH8.0)洗脱目的蛋白，收集目的蛋白，电泳检测其纯度。

电泳检测结果表明所纯化出的蛋白分子量均为45kDa左右，与DTT-表位重组蛋白蛋白的大小一致，因此，我们成功制得了所需的表位融合蛋白，经Image-lab软件灰度分析，纯度均达到90％以上，可以用来做动物免疫实验。

本实施例中所设计的FIX-2-DTT重组蛋白(融合蛋白)的氨基酸序列如下所示：

INLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSNAAINKYNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRP(SEQ ID NO.:12)

实施例2融合蛋白的活性检测

1表位鉴定

1.1.小鼠免疫

1)饲养42只4-5周龄的雌性Bal b/c小鼠。

2)根据所测的蛋白浓度和所需的免疫剂量准备好各蛋白的用量，并用相同体积的氢氧化铝佐剂(稀释8倍)与其充分混合均匀。

3)当小鼠长至6周的时候，将42只6周龄的雌性Bal b/c小鼠平均分成6组，其中2组为阴性对照组，注射DTT-GST和氢氧化铝佐剂；其余4组为实验组，分别用相应表位融合蛋白对每组的Bal b/c小鼠进行免疫，组别如下：

表9小鼠免疫

4)抗原准备好后，按上述表格进行注射，初次免疫采用皮下多点注射免疫的方法每只小鼠注射50μg抗原(实际操作过程中，小于100μL的我们注射了2个点，大于100μL的注射了3-4个点)，并于免疫前取血做阴性对照。

5)第一次免疫两周后用相同的佐剂与抗原混合并均匀，进行第二次小鼠免疫，免疫剂量为50μg抗原/只小鼠，注射方法同上。

6)第二次免疫两周后采用同样的剂量和方法进行第三次次免疫。

7)于第二次加强免疫一周后采用眼球取血法采集小鼠血清，4000rpm，4℃，离心获得血清后，分装保存于-80℃冰箱，用ELISA的方法检测血清中的特异性抗体效价，并进一步做Western-Blot验证分析。

1.2ELISSA检测抗体产生情况：

以FIX标准品作为包被抗原，各小组倍比稀释后的血清作为一抗，分别检测针对FIX抗体的产生情况。实验设计如下表：

表10ELISA检测

实验操作：

1)包被

用CBS包被液将各抗原稀释至0.1-1μg/mL，向每个酶标板的反应孔中加入100μL，4℃孵育过夜，然后通过洗板机洗涤5次，每次用洗涤缓冲液(PBS-T)洗涤3分钟，洗涤完后，将酶标板倒扣，轻轻拍干其中的液体。

2)封闭

每孔加300μL的封闭液，37℃封闭2h，用洗涤液洗板5次，洗涤方法与上相同，洗涤完后轻轻扣干。

3)将被测血清分别用抗体稀释液作1:100，1:200，1:500，1:1000的稀释。然后按上述表格每孔各加入对应血清100μL，做3个并行复孔，37℃孵育2h，洗板5次后将酶标板倒扣，轻轻拍干其中的液体。

4)将羊抗鼠IgG-HRP用抗体稀释液稀释5000倍，每孔加入该稀释后的酶标二抗100μL，37℃孵育1h，用洗涤液洗涤5次，后将酶标板倒扣，轻轻拍干其中的液体。

5)向每个反应孔中各加入100μL新鲜配制的底物溶液，37℃孵育10-30min。视颜色适时终止。

6)向每个反应孔中加入50μL的终止液，用酶标仪检测其450nm处的吸光值。

以空白对照的吸光值调零，若待测孔的OD₄₅₀值大于或等于阴性对照孔的2.1倍，则定义为阳性值，并将该值下对应的最大血清稀释倍数，定义为血清中特异性抗体的效价。

结果表明，在稀释倍数为100时，阴性对照组DTT-GST和Al(OH)₃的OD₄₅₀值均为0.25左右，而实验组OD₄₅₀最高值为0.92，为FIX-2-DTT免疫的小鼠血清。其余组OD₄₅₀均较低，不超过0.4。当血清稀释倍数增加时，各稀释倍数下的OD₄₅₀值仍以FIX-2-DTT组为最高，并在稀释倍数为1000时，其OD₄₅₀值仍大于其余组分的最大OD₄₅₀值，说明FIX-2-DTT免疫的小鼠血清中产生了抗人FIX抗体，而其余组分均未产生针对FIX的抗体或产生量极低。

为进一步检测FIX-2-DTT组的抗体效价，进一步增加FIX-2-DTT组血清的倍数，直到OD₄₅₀值接近0，或与阴性对照组在该稀释倍数下的OD₄₅₀值接近。测量方法与上述ELISA完全相同。在稀释倍数为5000倍时，FIX-2组的N/P值大于2.1，而稀释倍数，大于5000倍时，该比值小于2.1，因此，测定FIX-2-DDT组血清的抗体效价为5000。

1.3.Western-blot检测抗体结合特异性

试剂配制：

转移缓冲液：25mM Tris base，0.2M甘氨酸，20％甲醇(pH8.3)

10mM PBS：140mMNaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄·10H₂O用KH₂PO₄调pH到7.4。

洗涤缓冲液(PBS-T)：10mM PBS，加0.1％Tween-20，混匀。

封闭缓冲液：向PBS-T中加5％(w/v)的脱脂奶粉。

抗体稀释液体：同封闭液。

实验设计如下表：

表11Western-blot检测

实验步骤：

1)电泳分离样品

识别胶好坏，用1×loading buffer补齐，预染色Marker指示转膜效率和标志泳道。

2)转膜(槽式湿转)

电泳即将结束的时候，先准备好6张滤纸，并将其剪取与电转仪大小一致，等电泳结束后，将其放于转移缓冲液中浸泡10min左右，同时，也将胶剥下，切去不含目标蛋白的部分，放入该转移缓冲液中平衡10min左右。立即，剪取与胶大小一致的PVDF膜，先放入甲醇中浸泡2min左右，然后转入转移缓冲液中平衡8min左右。平衡完成后，按负极面(黑色面)-海绵-3层滤纸-凝胶-PVDF膜-3层滤纸-海绵-正极面(红色面)的顺序装配转移三明治，每层加完后，切记用玻璃棒小心赶去气泡，以防止短路。装好三明治后，将其至于转移槽中(黑色面对黑色面)，加入转移缓冲液，并将整个装置置于冰浴中，插上电极，300mA恒流，转膜1h。或20V电压下转膜过夜(10h以上)。转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。按预先的点样顺序将膜进行切割。

3)用25mL PBS-T洗膜3次，每次5min，室温，摇动。

4)将膜放于一平皿中，加入25mL的封闭缓冲液中，室温摇动孵育1h,或或者4℃静置过夜。

5)用PBS-T洗涤3次，每次5min。

6)将每个切割的膜分别置于一10mL离心管中，加入对应的适量各稀释后的血清，室温孵育1h，缓慢摇动。

7)用PBS-T洗涤3次，每次5min。

8)将所有膜一起至于一平皿中，加入适量稀释后的二抗(羊抗鼠IgG-HRP，稀释5000倍)，缓慢摇动反应，室温孵育1h。

9)用PBS-T洗涤3次，每次5min。

10)将膜用去离子水再稍加洗涤，并用干净的滤纸将其表面的水吸干，然后将混合好的发光显色液小心均匀的滴于膜上，显色5min左右，选择合适的曝光时间，进行曝光成像。

结果表明，阳性对照组出现了一条明显的带，分子量60KD左右，与FIX标准品分子量相符。各组血清中，只有FIX-2-DTT组在相同位置出现了一条带，而其余组均无目标条带出现。该结果与ELISA结果一致，说明FIX-2-DTT免疫小鼠后确实产了生针对FIX的抗体。

以上结果表明，FIX-2是FIX的B表位，将其移植到DTT_292-295形成重组蛋白后，具有良好的免疫原性，免疫小鼠能够产生针对完整FIX的抗体。

实施例3抗体制备

1.1兔子免疫

1)准备6只3-4个月大，体重2kg左右的雄性日本大耳白兔子，用于免疫FIX-2-DTT重组蛋白。

2)抗原乳化：根据所需免疫剂量准备好蛋白抗原，加入等量的弗氏佐剂，用乳化仪充分激震混匀。初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏非完全佐剂。

3)初次免疫每只兔子注射1mg乳化好后的抗原。采用多点注射法，分别在兔左颈部注射6点，左前腋下注射6点，左前肩背注射5点。免疫前用实验兔固定器固定兔子，耳缘静脉取血20-100μL保存作阴性对照。

4)加强免疫每只兔子注射0.5mg乳化好后的抗原，同样采取多点注射法，分别在兔右颈部注射6点，右前腋下注射6点，右前肩背注射5点。

5)两周后相同的佐剂与抗原混匀，进行二次加强免疫，方法同步骤4。

6)于第二次加强免疫一周后，于兔子的耳缘静脉取血20-100μL，4000rpm，4℃离心，获得血清，用ELISA的方法检测血清中的特异性抗体效价，以决定是否继续加强免疫。

7)如果效价不高，则继续进行加强免疫，免疫方法与上述加强免疫相同，最多总共免疫5次停止。

8)放血：免疫结束后，采用颈动脉取血的方式采集兔子血液，首先使兔子仰卧于操作架上并将其头部固定住，然后用小的布料绳套将其四肢拴住固定起来。将头部略放低一点以便暴露颈部，减去颈部的毛，然后用酒精棉进行皮肤消毒。消毒完成后，用手术刀纵向切开前颈部皮肤长约10cm左右，分离皮下结缔组织，当气管两侧的胸锁乳突肌完全暴露出后，用止血钳将皮肤分开夹住，剥离皮下组织，露出肌层，用刀柄加以分离，即见搏动的颈动脉。小心将颈动脉和迷走神经剥离长约5cm，选择血管中段，用止血钳夹住血管壁周围的筋膜。远心端用丝线结扎，近心端用动脉钳夹住，用酒精棉花球消毒血管周围，用无菌剪刀剪一V形缺口。取长2.5cm、直径为1.6mm塑料管一段，将一端剪成针头样斜面，并将此端插入颈动脉中，另一端放入200mL无菌三角瓶内。以上程序全部完成后，松开止血钳开始放血，用干净的接收容器收集血液。将收集的血液室温放置2小时左右，4000rpm，4℃离心5min，收集上清即获得兔子血清。

ELISA检测3免后兔子抗血清效价，结果表明，经三次免疫后，所有兔子的血清中特异性抗体效价均达到1:16000及以上，说明每只兔子用FIX-2-DTT免疫都产生了针对FIX的目标抗体，因此，这也进一步验证了前面所鉴定的FIX-2确实是FIX的一个B表位。

1.2抗体纯化

1.2.1.抗原亲和介质制备

1)多肽合成：

合成一段包含有目的表位的多肽(多肽序列：CHNYNAAINKYNHD(SEQ ID NO.:27)，其中C为额外加的半胱氨酸，作为与层析介质的偶联位点；划线部分为表位序列)，该项工作由上海晟利生物有限公司完成。最终合成的多肽纯度达90％。

2)多肽偶联：

将10mg合成的多肽与2mg经溴化氰活化的Sepharose4FF相偶联，制成多肽亲和介质。偶联条件为37℃，16h。偶联反应缓冲体系为0.2M NaHCO₃(pH8.5)。

1.2.2.抗体纯化

1)用10mM PBS pH7.0的缓冲液将兔子血清稀释5倍待用(所有兔子的血清很合均匀)；

2)取出上述制备好的多肽亲和介质(2mL)装入空柱子中，用5倍体积的10mM PBS(pH7.0)冲洗柱子，直至流出的液体A₂₈₀值接近零为止；

3)取出经10mM PBS稀释好后的各只兔子的血清，分别流经多肽亲和柱进行纯化，上样流速控制在以0.5mL/min左右，上样完成后用10mM PBS(pH7.0)洗去未结合的非特异性蛋白，直至流出液A₂₈₀接近零，流穿全部接收；

4)用pH3.0的Gly-HCl缓冲液洗脱结合的抗体，收集洗脱出来的液体(预先在接收的容器中加入适量NaOH)，立即调pH至中性；

5)用10mM PBS(pH7.0)冲洗介质至流出液pH为7.0后，将流穿溶液再次上样并洗脱，反复多次；收集洗脱液；

6)通过SDS-PAGE检测抗体纯度；

7)通过BCA定量法测定抗体的浓度；

8)通过Western-Blot检测抗体结合特异性。

经多肽免疫亲和层析，最终纯化得到18mg特异性的目标抗体。

1.3Western-Blot检测

分别以普通牛奶脱脂乳，转基因牛奶脱脂乳(该脱脂乳中含有rhFIX，获自上海儿童医院遗传研究所，可参考文献，黄赞等：山羊-酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子IX.遗传学报2002,29(3):206-211；Yan J-B等:Transgenic mice canexpress mutant human coagulation factor IX withhigher level of clottingactivity.Biochemical genetics2006,44(7-8):347-358)。

hFIX标准品(购自Enzyme Research Laboratories)，凝血酶原复合物(PCC，购自华兰生物)和牛FIX(购自Enzyme Research Laboratories)作为检测抗原，以纯化所得的抗体作为一抗(将上述纯化的抗体进行混合，并均匀)，以羊抗兔IgG-HRP作为二抗，检测抗体的结合特异性，具体操作如下：

1)电泳分离样品：识别胶好坏，hFIX标准品上样量为100ng，其余样品上样量为15μL，用预染色Marker指示转膜效率和标志泳道。

2)转膜(槽式湿转)：将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。依据胶的大小剪取PVDF膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和1min。装配转移三明治：负极面(黑色面)-海绵-3层滤纸-凝胶-PVDF膜-3层滤纸-海绵-正极面(红色面)，每层放好后，赶去气泡。将转移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面对黑色面)，加转移缓冲液，插上电极，300mA恒流，1h。或20V转移过夜(10h以上)。转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。按预先的点样顺序将膜进行切割。

3)用25mL PBS-T洗膜3次，每次5min，室温，摇动。

4)将膜放于于25mL封闭缓冲液中1h,室温，摇动(或者4度过夜)。

5)用PBS-T洗涤3次，每次5min。

6)将每个切割的膜分别置于一10mL离心管中，加入一抗(稀释1000倍)，室温孵育1h，缓慢摇动。

7)用PBS-T洗涤3次，每次5min。

8)将所有膜一起至于一平皿中，加入适量稀释后的二抗(羊抗兔IgG-HRP，稀释5000倍)，缓慢摇动反应，室温孵育1h。

9)用PBS-T洗涤3次，每次5min。

10)将膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干水分，将发光也A和B按1：1比例混合，滴于膜上，5min左右选择合适的曝光时间，进行曝光成像。

检测结果如图1，图中：1-5检测抗原依次为普通牛奶脱脂乳，转基因牛奶脱脂乳，FIX标准品，PCC和牛FIX。FIX标准品的上样量为100ng，其余抗原上样量为15μL。

从图可以看出，1号和5号泳道均无任何条带出现，2-4号均有条带且均只有一条带出现。2和4条带分子量大小约为55KD，与PCC中的FIX和转基因牛乳中的rFIX分子量相近；3号条带的分子量约61KD，与FIX标准品分子量接近。该结果说明，通过FIX-2-DTT免疫所制得的抗体可以识别FIX标准品、PCC和转基因牛乳中的hFIX，而不识别bFIX及普通牛乳中的蛋白。也就是说，该抗体具有良好的特异性，与非FIX物质无交叉反应。这里，hFIX的标准品分子量比pdhFIX和rhFIX的分子量要大，这是因为FIX是糖蛋白，其分子量变化范围依赖于其含糖量的高低，而hFIX标准品含糖量相比pdhFIX和rhFIX较高所致。

1.4ITC200测定抗体亲和力

1)样品准备：先将抗体用1×PBS稀释至0.1mg/mL，用相同的PBS透析PCC、转基因牛奶脱脂乳和普通牛奶脱脂乳，并将其进行浓缩，使其中的FIX摩尔浓度至少是反应池中抗体摩尔浓度的10倍。然后以浓缩后的样品作为滴定物来滴定抗体。

2)换水和甲醇：换水和甲醇，并将缓冲液或去离子水先离心上。

3)开机及清洗：打开ITC200和电脑，点击运行软件ITC200With origin软件，先将温度设成25℃平衡上。按照提示仔细清洗ITC200注射器和测量池，点击cell and syringewash开始清洗，至少清洗3次，清洗时，确保针头中有进水，否则重新洗涤。

4)水滴水预实验：洗涤完成后，先用水滴水做预实验，样品池中加入280μL水。加样时，注射器吸入约380μL的反应物，注射器先直接插入底部，然后边推压使反应物滴于反应池中，边慢慢上提注射器，期间切勿直接将针头拔出，以免进入气泡。当滴完后，将超过池面部分的反应物重新吸回，检查池中是否有气泡，如果有，重新吸干净后加样。在PCR管中加入80μL的水，放到load处。首先，然后将针头移到rest位置处，按syringe fill进行排气，然后将针头移到load处，连续点击OK，开始上样，确保针头中气泡要拍完，否则继续按syringefill直至气泡排尽。

6)运行仪器：设置程序和路径，反应温度设置为25℃，进行16滴的等温滴定反应，按start开始，仪器平衡一段时间后自动进入滴定程序。

7)分析数据：反应完成后，得到能量变化的曲线，再通过Origin ITCversion7.0One Site模型拟合曲线，获得结合常数(K_D)、化学计量(N)、焓变(△H)和熵变(△S)等热力学参数。

8)样品测定：通过预实验分析，确保仪器状态正常后，进行待测样品的检测，程序与上相同。进样针头吸取40μL的滴定物，反应池中加入280μL的抗体溶液，进行16滴的等温滴定反应。完成后对数据进行分析处理。

在反应池中注入上述所纯化的抗FIX抗体，针头中分别注入PCC、转基因牛奶脱脂乳(含rFIX)和非转基因牛奶脱脂乳进行等温量热滴定反应，并使用Origin ITCversion7.0One Site模型进行曲线模拟，其结果如图2和表12所示，图2为，用表达rFIX的转基因牛奶脱脂乳滴定抗体，从图可以看出，用Origin ITC version7.0One Site模型进行模拟获得了较好的拟合曲线。并且用PCC滴定抗体用Origin ITC version7.0One Site模型进行模拟也获得了较好的拟合曲线；而用普通牛奶脱脂乳滴定抗体用该模型进行拟合时，出现错误提示，即无法拟合。说明本实施例所制得的抗体与PCC中天然形式的pdhFIX及转基因牛奶中的rhFIX均能够发生结合反应，而不与非转基因牛奶中的其他蛋白发生结合反应。结合前面的Westerm-blot数据，说明抗体的特异性较好，且能识别非变性形式的pdFIX和rFIX。

表12抗FIX抗体与不同抗原结合反应的结合常数、焓变及熵变

从表中的数据可以看出，本发明所制得的抗FIX抗体与PCC及转基因牛奶脱脂乳反应的结合常数K_D分别为1.14±0.34×10⁶(M^-1)和4.69±0.76×10⁶(M^-1)，说明在10mM PBS条件下，该抗体与pdFIX和rFIX的亲和力均比较温和。因此，这就为使用抗体作为亲和配体来纯化FIX(包括pdFIX和rFIX)奠定了良好的基础，这是因为，它与pdFIX和rFIX的亲和力均比较温和，当它们用于FIX的免疫亲和纯化时，即不会像高亲和力抗体那样，需要严苛的洗脱条件，从而导致目的蛋白失活；也不会像低亲和力抗体那样，结合力非常弱，导致纯化效率低下。因此，它们既能够保持目的蛋白的活性又能保持较好的纯化效率，是用于FIX的免疫亲和纯化较为的理想配体。

从所有反应的焓变和熵变数据知道，该抗体与PCC中的pdFIX及转基因牛乳中rFIX的结合反应的△H<0和△S<0，说明，它们的主要作用力均是氢键和范德华力形成的复合体系。

通过以上方法，制得了一种特异性好，亲和力适中的抗FIX抗体，该方法简便快捷，制备成本低，为规模化制备抗FIX抗体，从而用于FIX的免疫亲和层析中奠定了良好的基础。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽源自动物FIX且包含一个或多个抗原表位，

所述抗原表位肽与载体蛋白形成的重组蛋白可诱发同一种类的所述动物产生针对FIX的免疫反应；

其中，所述抗原表位肽为NAAINKY。

2.一种融合蛋白，所述融合蛋白是如权利要求1所述的抗原表位肽与载体蛋白融合所形成的，其中，所述融合蛋白为具有SEQ ID NO.:12所示氨基酸序列的多肽。

3.一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的抗原表位肽或权利要求2所述的融合蛋白。

4.一种表达载体，所述表达载体含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体，或者在基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

6.一种药物组合物，所述的组合物含有权利要求1所述的抗原表位肽、权利要求2所述的融合蛋白、权利要求3所述的多核苷酸、权利要求4所述的表达载体或者权利要求5所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

7.一种疫苗组合物，所述的组合物含有权利要求1所述的抗原表位肽、权利要求2所述的融合蛋白、权利要求3所述的多核苷酸、权利要求4所述的表达载体或者权利要求5所述的宿主细胞，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。

8.权利要求1所述的抗原表位肽、权利要求2所述的融合蛋白、权利要求3所述的多核苷酸、权利要求4所述的表达载体或者权利要求5所述的宿主细胞的用途，

9.一种制备FIX抗体的方法，其特在于包括步骤：

(1) 使用权利要求2所述的融合蛋白作为抗原免疫动物，并在动物体内产生抗FIX的抗体；

(2)分离纯化所述FIX抗体。

10.一种分离纯化人FIX的方法，其特在于，包括步骤：

(1)使用权利要求9所述的方法制备人FIX抗体；