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JP7146926B2 - Ｃｄ４ヘルパーｔ細胞エピトープの融合ペプチドおよびそのワクチン - Google Patents

Ｃｄ４ヘルパーｔ細胞エピトープの融合ペプチドおよびそのワクチン Download PDF

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Description

本発明は、分子生物学および免疫学の分野に属する。特に、本発明は、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞エピトープの融合ペプチド、特に、エピトープ融合ペプチドを含むワクチン、およびその使用に関する。
Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）は、免疫系、特に適応免疫系において重要な役割を果たすＴ細胞である。Ｔｈ細胞は、Ｔ細胞サイトカインを放出することによって他の免疫細胞の活性を促進する。これらの細胞は、免疫応答を阻害または調節するのに役立つ。これらは、Ｂ細胞抗体クラスの変換、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化および成長、ならびにマクロファージなどの食細胞の殺菌活性の極大化に必須である。
タンパク質ＣＤ４を発現する成熟Ｔｈ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞として公知である。そのようなＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞として、一般には免疫系内で所定のプロセスに供される。例えば、抗原提示細胞がＭＨＣクラスＩＩ上に抗原を提示（ｅｘｐｒｅｓｓ）すると、ＣＤ４＋細胞は、細胞間相互作用（例えば、ＣＤ４０（タンパク質）とＣＤ４０Ｌ）とサイトカインを組み合わせることによってこれらの細胞を補助する。
ヘルパーＴ細胞の重要性は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に主に感染するウイルスであるＨＩＶに関して見ることができる。ＨＩＶ感染の後期には、機能的なＣＤ４＋Ｔ細胞の喪失により、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）として公知の感染症状の段階に至る。ＨＩＶウイルスが早期に血液中または他の体液中に見いだされた場合には、連続的な治療により、ＡＩＤＳの発症を遅延させることができる。ＡＩＤＳが発症した場合にも、治療によりＡＩＤＳの過程をより良好に管理することができる。リンパ球減少症などの他の稀な疾患の結果、ＣＤ４＋Ｔ細胞の喪失または機能障害がもたらされる。これらの疾患では同様の症状が生じ、その多くは致死的なものである。
抗原エピトープ（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｅｐｉｔｏｐｅ）、略して「エピトープ」（ｅｐｉｔｏｐｅ）は、「抗原性決定因子」（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）としても公知であり、抗原特異性を決定する抗原の表面上の化学基を指す。抗原エピトープは、免疫系、特に、抗体、Ｂ細胞またはＴ細胞が認識することができる。抗原エピトープを認識することができる抗体の部位は、「パラトープ」または「抗体決定因子」と称される。抗原エピトープは、通常は外来タンパク質の一部分などを指すが、自己免疫系が認識することができるエピトープも抗原エピトープに分類される。
タンパク質抗原のエピトープは、それらの構造およびパラトープとの相互作用に応じてコンフォメーショナルエピトープと直鎖状エピトープとに分けられる。コンフォメーショナルエピトープは抗原のアミノ酸配列の別個の部分からなるので、パラトープの抗原エピトープとの相互作用は、抗原の三次元的特性および表面の形状または三次構造に基づく。大多数の抗原エピトープはコンフォメーショナルエピトープに属する。対照的に、直鎖状エピトープは抗原の連続したアミノ酸配列からなり、抗原との相互作用はその一次構造に基づく。
Ｔ細胞エピトープ（Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）は、主に８～１７アミノ酸の短いペプチドからなり、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ、ＡＰＣ）上に存在し、抗原エピトープとして主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）と結合して複合体を形成し、対応するＴ細胞エピトープ受容体に結合し、それにより、Ｔ細胞が活性化され、対応する細胞性免疫応答が生じる（Ｓｈｉｍｏｎｉｋｅｖｉｔｚ他、１９８４；Ｂａｂｂｉｔｔ他、１９８５；Ｂｕｕｓ他、１９８６；ＴｏｗｎｓｅｎｄおよびＢｏｄｍｅｒ、１９８９）。エピトープに結合するＭＨＣ分子には２つの主要なクラスがある。それらの中で、主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩは通常８～１１アミノ酸の長さのポリペプチドからなるＴ細胞抗原エピトープを提示し、一方、主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩＩは１３～１７アミノ酸からなる比較的長いＴ細胞抗原エピトープを提示する。
Ｔ細胞エピトープの中で、ヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈ ｅｐｉｔｏｐｅ、即ちＴｈエピトープ）は、ＭＨＣ分子に結合し、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞受容体が認識することができる複合体を形成するＴ細胞エピトープのクラスを指す。Ｔｈエピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子によってコードされ、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ、ＡＰＣ）の表面上に存在する分子に主に結合する。次いで、クラスＩＩ分子およびペプチドエピトープの複合体がＴヘルパーリンパ球の表面上の特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。このように、ＭＨＣ分子との関連で抗原エピトープを提示するＴ細胞が活性化され、Ｂリンパ球分化に必須のシグナルがもたらされ得る。伝統的に、ペプチド免疫原のＴヘルパーエピトープの供給源はペプチドと共有結合によりカップリングした担体タンパク質であるが、カップリングプロセスには、カップリングプロセス中の抗原性決定因子の改変およびペプチドに対する抗体をなおざりにして、担体に対する抗体を誘導するなどの他の問題が伴い得る（Ｓｃｈｕｔｚｅ，Ｍ．Ｐ．、Ｌｅｃｌｅｒｃ，Ｃ．Ｊｏｌｉｖｅｔ，Ｍ．Ａｕｄｉｂｅｒｔ，Ｆ．Ｃｈｅｄｉ，Ｌ．Ｃａｒｒｉｅｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｔｏｐｉｃ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａ ｍａｊｏｒ ｉｓｓｕｅ ｆｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８５、１３５、２３１９－２３２２；ＤｉＪｏｈｎ，Ｄ．、Ｔｏｒｒｅｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｍｕｒｉｌｌｏ、Ｊ．Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ａ．他、Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｒｉｍｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃａｒｒｉｅｒ ｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ．１９８９、２、１４１５－１４１６）。さらに、無関連のタンパク質を調製に使用することには品質管理上の問題が伴い得る。ペプチドワクチンの設計において重要である適切な担体タンパク質の選択は、毒性および大規模生産の実現性などの因子によって限定される。この方法には、カップリングすることができるペプチドの負荷サイズおよび安全に投与することができる担体の用量を含めた他の限定が存在する（Ａｕｄｉｂｅｒｔ，Ｆ．ａ．Ｃ．、Ｌ．１９８４．Ｍｏｄｅｒｎ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｃｎｉｃｉｔｙ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．）。担体分子は、強力な免疫応答を誘導することができるものであるが、これらには抗ペプチド抗体応答の阻害などの有害作用も伴う（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ａ．およびＴｏｋｕｈｉｓａ，Ｔ．１９８０．Ｃａｒｒｉｅｒ－ｐｒｉｍｉｎｇ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｈａｐｔｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ２８５：６６４；Ｓｃｈｕｔｚｅ，Ｍ．Ｐ．、Ｌｅｃｌｅｒｃ，Ｃ．、Ｊｏｌｉｖｅｔ，Ｍ．、Ａｕｄｉｂｅｒｔ，Ｆ．、およびＣｈｅｄｉｄ，Ｌ．１９８５．Ｃａｒｒｉｅｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｔｏｐｉｃ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａ ｍａｊｏｒ ｉｓｓｕｅ ｆｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３５：２３１９；Ｅｔｌｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｍ．、Ｆｅｌｉｘ，Ａ．Ｍ．、Ｇｉｌｌｅｓｓｅｎ，Ｄ．、Ｈｅｉｍｅｒ，Ｅ．Ｐ．、Ｊｕｓｔ，Ｍ．、Ｐｉｎｋ，Ｊ．Ｒ．、Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ，Ｆ．、Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ，Ｄ．、Ｔａｋａｃｓ，Ｂ．、Ｔｒｚｅｃｉａｋ，Ａ．、および他、１９８８．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｏｆ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍａｌａｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｅ，Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０：６２６）。
一般に、免疫原は、細胞傷害性Ｔ細胞上に存在する表面Ｉｇまたは受容体によって認識されるエピトープに加えて、ヘルパーＴ細胞エピトープを含有しなければならない。これらの型のエピトープは全く異なるものであり得ることが理解されよう。Ｂ細胞エピトープに関しては、Ｂ細胞受容体はネイティブな免疫原に直接結合するので、コンフォメーションが重要である。対照的に、Ｔ細胞によって認識されるエピトープは、エピトープのコンフォメーション完全性とは無関係であり、ＣＴＬに対する約９アミノ酸の短い配列と、ヘルパーＴ細胞に対するわずかに長い（長さの制限が少ない）配列と、からなる。これらのエピトープには、それぞれクラスＩまたはクラスＩＩ分子の結合性くぼみに適応させることのみが要求され、その結果、複合体はＴ細胞受容体に結合することができる。クラスＩＩ分子の結合性部位は両端が開いており、８アミノ酸残基という短さの報告されているエピトープ（Ｆａｈｒｅｒ，Ａ．Ｍ．、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．、Ｗｈｉｔｅ，Ｄ．Ｏ．、Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．およびＢｒｏｗｎ，Ｌ．Ｅ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｃｌａｓｓ ＩＩ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｒｅｖｅａｌｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＨＥｄ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５．１５５：２８４９－２８５７）に結合するペプチドの長さに大きな変動が許容される（Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｈ．、Ｔ．Ｓ．Ｊａｒｄｅｔｚｋｙ、Ｊ．Ｃ．Ｇｏｒｇａ、Ｌ．Ｊ．Ｓｔｅｒｎ、Ｒ．Ｇ．Ｕｒｂａｎ、Ｊ．Ｌ．ＳｔｒｏｍｉｎｇｅｒおよびＤ．Ｃ．Ｗｉｌｅｙ．１９９３．Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｔｉｇｅｎ ＨＬＡ－ＤＲ１．Ｎａｔｕｒｅ ３６４：３３）。
Ｔｈエピトープは、ヘルパーＴ細胞を刺激し、活性化することができ、したがって、ＣＤ８Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化を促進し、最終的に免疫応答を増大させることができる。本質的に、Ｔｈエピトープは、それ自体に対する免疫応答を活性化することができることに加えて、それらに関連する他の抗原またはエピトープに対する免疫応答の補助にも有効である。したがって、異種の強力なＴｈエピトープを標的免疫原と融合し、それにより、標的免疫原の免疫原性を増大させることができる。ＰＡＤＲＥ（汎ＨＬＡ ＤＲ結合性エピトープ（ｐａｎ ＨＬＡ ＤＲ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｅｐｉｔｏｐｅ））と称される人工的な強力なＴｈエピトープが、関連性のある免疫原に対する免疫応答のレベルを上昇させるための多数のワクチンの融合物構築において使用されている（ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏ他、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９７、１５：４４１．；Ｆｒａｎｋｅ，Ｅ．Ｄ．他、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９９、１７：１２０１；Ｊｅｆｆ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ他、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００、１６４（３）１６２５－１６３３；Ｊｅｆｆ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ他、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００４、２２：２３６２．；Ｌａ Ｒｏｓａ、Ｃｏｒｉｎｎａ他、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ、２０１２、２０５：１２９４－３０４）。さらに、破傷風毒素（Ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ）に由来する強力なＴｈエピトープとして、Ｐ２も、免疫原性を増強するための標的免疫原とのカップリングに一般に使用される（Ｐａｎｉｎａ－Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ Ｐ他、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８９、１９：２２３７－４２；Ｌａ Ｒｏｓａ、Ｃｏｒｉｎｎａ他、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ、２０１２、２０５：１２９４－３０４）。
しかし、一般に、免疫原性を増大させるためのＴｈエピトープは、通常、異種である。言い換えれば、ワクチン対象においてＴｈエピトープ自体に対する高レベルの免疫応答は生じない。したがって、ワクチン対象に上記の強力なＴｈエピトープをワクチン接種すると、ワクチン対象の免疫系がそのようなＴｈエピトープに最初に曝露され、レシピエント免疫系におけるそのようなＴｈエピトープおよび標的免疫原の両方に対する活性化がほぼ同時に起こり、そのようなＴｈエピトープに対するＴ細胞の発生時間および数は、標的免疫原に対するものと同様である。このように、標的免疫原の補助に対する効果はそれゆえ限定される。特に、免疫原性が弱い腫瘍抗原については、そのようなＴｈエピトープの助力の効果を発揮させることがより難しい。実際に、強力なＴｈエピトープの直接使用では、腫瘍抗原を活性化することはできるが、腫瘍ワクチンの要求に見合わない低いレベルの細胞性免疫応答が引き出される（Ｇｈａｆｆａｒｉ－Ｎａｚａｒｉ Ｈ他、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、２０１５、１０（１１）：ｅ０１４２５６３）。
したがって、標的免疫原、特に、腫瘍抗原などのいくらか弱い免疫原の免疫原性を増強するために、新しいＴｈエピトープ戦略が必要とされている。
本発明の目的の一つは、標的免疫原の免疫原性を増強するＣＤ４ヘルパーＴ細胞エピトープの融合ペプチドを提供することである。
さらに、本発明では、標的免疫原の免疫原性を増強するためのエピトープ融合ペプチドを得るために、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）およびインフルエンザ（Ｉｎｆｌｕｖｉｒｕｓ、Ｆｌｕ）ウイルス（インフルウイルス）に由来する強力なＴｈエピトープを利用する。
本発明の目的に関して、次の用語を以下に定義する。
「エピトープ融合ペプチド」は、いくつかのエピトープを接合することによって形成されるペプチドを指す。
「標的免疫原」は、抗原、好ましくはタンパク質などの免疫学的活性を有する物質を含めた、ある特定の免疫応答を実現するために使用される免疫原を指す。
本発明の目的のもう一つは、エピトープ融合ペプチドと標的免疫原の融合タンパク質を提供することである。
上記の目的を実現するために、本発明は、ＣＭＶエピトープおよび／またはインフルエンザウイルスエピトープを含むＣＤ４ヘルパーＴ細胞エピトープの融合ペプチドを提供する。
本発明の一実施形態では、エピトープ融合ペプチドは、配列番号１～１０に示されているものから選択されるＣＭＶエピトープのうちの１つもしくは複数、および／または配列番号１１～２３に示されているものから選択されるインフルエンザウイルスエピトープのうちの１つもしくは複数を含む。
本発明の一実施形態では、エピトープ融合ペプチドは、配列番号１～１０に示されているものから選択されるＣＭＶエピトープのうちの１つもしくは複数、および／または配列番号１１～２３に示されているものから選択されるインフルエンザウイルスエピトープのうちの１つもしくは複数からなる。エピトープ融合ペプチドは、例えば配列番号３４または４４に示されているエピトープ融合ペプチドなど、５種もしくは１０種のＣＭＶエピトープ、および／または８種もしくは１３種のインフルエンザウイルスエピトープからなることが好ましい。エピトープ融合ペプチドは、例えば配列番号４８に示されているエピトープ融合ペプチドなど、１３種のインフルエンザウイルスエピトープからなることが最も好ましい。
エピトープ融合ペプチドは、液性または細胞性免疫応答を誘導するものであることが好ましい。
本発明は、エピトープ融合ペプチドと標的免疫原の融合タンパク質も提供する。
本発明は、エピトープ融合ペプチドおよび／または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。
本発明の一実施形態では、標的免疫原は、任意の１つまたは複数の免疫原である。標的免疫原は、ペプチド、抗原、ハプテン、炭水化物、タンパク質、核酸、アレルゲン、ウイルスもしくはウイルスの一部、細菌、寄生生物または他の丸ごとの微生物（ｗｈｏｌｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）であることが好ましい。
本発明の一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原または感染関連抗原である。
本発明の一実施形態では、腫瘍抗原は、肺がん抗原、精巣がん抗原、黒色腫抗原、肝がん抗原、乳がん抗原または前立腺がん抗原から選択される１つまたは複数の腫瘍抗原である。
本発明の一実施形態では、腫瘍抗原は、ＬＡＧＥ抗原、ＭＡＧＥ抗原またはＮＹ－ＥＳＯ－１抗原から選択される１つまたは複数の腫瘍抗原である。ＬＡＧＥ抗原はＬＡＧＥ－１であり、ＭＡＧＥ抗原はＭＡＧＥ－Ａ３であることが好ましい。腫瘍抗原は、ＬＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－Ａ３およびＮＹ－ＥＳＯ－１を含むことがさらに好ましい。ＬＡＧＥ－１のアミノ酸配列は配列番号２４に示されているものであり、ＭＡＧＥ－Ａ３のアミノ酸配列は配列番号２５に示されているものであり、また、ＮＹ－ＥＳＯ－１のアミノ酸配列は配列番号２６に示されているものであることが好ましい。
本発明の一実施形態では、感染関連抗原は、ＨＩＶ抗原、Ｆｌｕウイルス抗原またはＨＢＶ抗原から選択される１つまたは複数の感染関連抗原である。
融合タンパク質は、配列番号５５～５８のうちの１つで示されるものであることが好ましい。
本発明の別の目的は、治療有効量の本発明によるエピトープ融合ペプチド、融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド、ならびに薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物を提供することである。
免疫原性組成物はワクチンであることが好ましい。
本発明の別の目的は、本発明によるエピトープ融合ペプチド、融合タンパク質、ポリヌクレオチドおよび／または免疫原性組成物、およびそれらの使用の指示を含むキットを提供することである。
本発明は、標的免疫原の免疫原性を増大させるための医薬またはワクチンの製造における、本発明によるエピトープ融合ペプチド、融合タンパク質、ポリヌクレオチドおよび／または免疫原性組成物の使用も提供する。
本発明は、本発明によるエピトープ融合ペプチドを使用して標的免疫原の免疫原性を増大させるための方法であって、ワクチン対象または集団においてより強力な免疫応答を有するＣＤ４ヘルパーＴ細胞エピトープを標的免疫原と融合させて融合タンパク質を形成することを含む方法も提供する。当該方法は、具体的には、以下のステップ：
（１）１つまたは複数のＣＤ４ヘルパーＴ細胞エピトープを選択するステップであって、該エピトープをＭＨＣ分子と組み合わせることによって形成される複合体をＣＤ４ヘルパーＴ細胞受容体が認識することができ、また、ワクチン接種前にワクチン対象において該エピトープの少なくとも１つに対するＴ細胞免疫応答が生じている、該エピトープを選択するステップと、
（２）エピトープを融合してエピトープ融合ペプチドを調製し、エピトープ融合ペプチドを標的免疫原と融合して融合タンパク質を調製し、融合タンパク質を発現させ、それでワクチンを調製するステップであって、発現ベクターが、ＤＮＡワクチンベクター、タンパク質ワクチンベクターまたはウイルスワクチンベクターの形態であり得る、ワクチンを調製するステップと、
（３）ワクチン対象に上記のワクチンおよびワクチン接種のために選択することができる不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、または水酸化アルミニウムアジュバントなどの適切なアジュバントをワクチン接種するステップと
を含む。
さらに、当該方法のステップ（１）は、ワクチン対象のＭＨＣ表現型を検査するステップをさらに含む。ワクチン対象のＭＨＣ表現型を検査するステップは、ワクチン対象のＭＨＣクラスＩＩ遺伝子サブタイプを検査することを含むことが好ましい。
本発明は、本発明のエピトープ融合ペプチド、融合タンパク質、免疫原性組成物および／またはポリヌクレオチドを治療有効量で投与することを含む、それを必要とする対象における状態を治療または予防するための方法も提供する。状態は、悪性腫瘍、ならびに細菌およびウイルス慢性感染から選択される１つまたは複数の状態であることが好ましい。悪性腫瘍は、乳がんまたは結腸がんであることが好ましい。当該方法において、免疫を免疫誘導するためにＤＮＡワクチンベクターを使用し、免疫を免疫増強するためにタンパク質ワクチンベクターを使用することが好ましい。免疫誘導のためにｐＶＫＤ１．０－ＣＩ－ＬＭＮＢ ＤＮＡワクチンを使用し、免疫増強のためにＬＭＮＢ－Ｉ１３タンパク質を使用することがより好ましい。本発明によって提供されるエピトープ融合ペプチドは、標的免疫原、特に、弱い免疫原に対する細胞性免疫応答のレベルを実質的に改善することができるものであり、抗原、特に腫瘍抗原または感染関連抗原に対する免疫系の免疫寛容を克服するための有効な手段であり、また、ワクチンの有効性を効率的に増強するために適切である。
以下に、添付図面を参照して本発明の実施形態を詳細に記載する。
ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原のコード配列を運ぶＤＮＡワクチンベクターｐＶＫＤ１．０－ｈＬＭＮのプラスミドマップである。 ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原のコード配列を運ぶＤＮＡワクチンベクターｐＶＫＤ１．０－ｈＬＭＮを同定するための２重酵素消化のマップである。 ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原ならびにコレラ毒素サブユニットＢのコード配列を運ぶＤＮＡワクチンベクターｐＶＫＤ１．０－ｈＬＭＮ－ＣＴＢのプラスミドマップである。 ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原ならびにコレラ毒素サブユニットＢのコード配列を運ぶＤＮＡワクチンベクターｐＶＫＤ１．０－ｈＬＭＮ－ＣＴＢを同定するための２重酵素消化のマップである。 ＣＭＶおよびＦｌｕウイルス由来ＣＤ４エピトープのコード配列を運ぶＤＮＡワクチンベクターｐＶＫＤ１．０－ＣＩのプラスミドマップである。 ＣＭＶおよびＦｌｕウイルス由来ＣＤ４エピトープのコード配列を運ぶＤＮＡワクチンベクターｐＶＫＤ１．０－ＣＩを同定するための２重酵素消化のマップである。 ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、コレラ毒素サブユニットＢ、ならびにＣＭＶおよびＦｌｕウイルス由来ＣＤ４エピトープのコード配列を運ぶＤＮＡワクチンベクターｐＶＫＤ１．０－ＣＩ－ＬＭＮＢプラスミドマップである。 ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、コレラ毒素サブユニットＢ、ならびにＣＭＶおよびＦｌｕウイルス由来ＣＤ４エピトープのコード配列を運ぶＤＮＡワクチンベクターｐＶＫＤ１．０－ＣＩ－ＬＭＮＢを同定するための２重酵素消化のマップである。 ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原のコード配列を運ぶ原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＬＭＮのプラスミドマップである。 ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原のコード配列を運ぶ原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＬＭＮを同定するための２重酵素消化のマップである。 ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原ならびにコレラ毒素サブユニットＢのコード配列を運ぶ原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＬＭＮ－ＣＴＢのプラスミドマップである。 ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原ならびにコレラ毒素サブユニットＢのコード配列を運ぶ原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＬＭＮ－ＣＴＢを同定するための２重酵素消化のマップである。 ＣＭＶ由来エピトープのコード配列を運ぶ原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ Ｔｈのプラスミドマップである。 ＣＭＶ由来エピトープのコード配列を運ぶ原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ Ｔｈを同定するための２重酵素消化のマップである。 ＣＭＶ由来エピトープ、ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、ならびにコレラ毒素サブユニットＢのコード配列を運ぶ原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ１０－ＬＭＮＢのプラスミドマップである。 ＣＭＶ由来エピトープ、ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、ならびにコレラ毒素サブユニットＢのコード配列を運ぶ原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ１０－ＬＭＮＢを同定するための２重酵素消化のマップである。 それぞれＦｌｕウイルス由来エピトープのコード配列を運ぶ原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ Ｔｈのプラスミドマップならびに当該原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ Ｔｈを同定するための２重酵素消化のマップである。 Ｆｌｕウイルス由来エピトープのコード配列を運ぶ原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ Ｔｈを同定するための２重酵素消化のマップである。 Ｆｌｕウイルス由来エピトープ、ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、ならびにコレラ毒素サブユニットＢのコード配列を運ぶ原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－インフル８－ＬＭＮＢのプラスミドマップである。 Ｆｌｕウイルス由来エピトープ、ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、ならびにコレラ毒素サブユニットＢのコード配列を運ぶ原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－インフル８－ＬＭＮＢを同定するための２重酵素消化のマップである。 Ｆｌｕウイルス由来エピトープ、ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、ならびにコレラ毒素サブユニットＢのコード配列を運ぶ原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－インフル１３－ＬＭＮＢのプラスミドマップである。 Ｆｌｕウイルス由来エピトープ、ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、ならびにコレラ毒素サブユニットＢのコード配列を運ぶ原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－インフル１３－ＬＭＮＢを同定するための２重酵素消化のマップである。 動物免疫実験における細胞性免疫応答の検出結果を示す図である。 ＣＭＶ由来エピトープ、ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、ならびにコレラ毒素サブユニットＢのコード配列を運ぶ原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ５－ＬＭＮＢのプラスミドマップである。 ＣＭＶ由来エピトープ、ＬＡＧＥ－１抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、ならびにコレラ毒素サブユニットＢのコード配列を運ぶ原核生物ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ５－ＬＭＮＢを同定するための２重酵素消化のマップである。 実施例１２の動物免疫実験における細胞性免疫応答の検出結果を示すグラフである。 実施例１３におけるマウスの腫瘍成長を示すグラフである。 実施例１３におけるマウスの無腫瘍生存期間を示すグラフである。 実施例１３におけるマウスの全生存期間を示すグラフである。 ４Ｔ１－ｈＮＹ－ＥＳＯ－１マウス腫瘍モデルについての各処置群におけるマウスの腫瘍成長を示すグラフである。 ＣＴ２６－ｈＬＡＧＥ－１マウス腫瘍モデルについての各処置群におけるマウスの腫瘍成長を示すグラフである。
特定の実施形態を参照して本発明を以下にさらに詳細に記載する。実施例は単に本発明を例示する目的で示され、本発明の範囲を限定するものではない。
ＤＮＡワクチンｐＶＫＤ１．０－ｈＬＭＮの構築
ＬＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－Ａ３およびＮＹ－ＥＳＯ－１のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２４～２６に示す。オンラインコドン最適化ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅ／）を利用し、それぞれ配列番号２７～２９に示されている哺乳動物コドン使用優先のヌクレオチド配列を上記の抗原アミノ酸配列に基づく最適化によって得た。ヌクレオチド配列を、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．で合成し、次いで、ＤＮＡワクチンベクターｐＶＫＤ１．０（Ｖａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋにより供給を受けた）上の多重クローニング部位Ｓａｌ ＩとＢａｍＨ Ｉの間に当技術分野で周知の方法によってクローニングして、融合タンパク質を抗原として発現させることができるＤＮＡワクチンベクターｐＶＫＤ１．０－ｈＬＭＮ（プラスミドマップが図１に示されている）を構築し、これを、同定のために配列決定した後、保管した。ベクターｐＶＫＤ１．０－ｈＬＭＮを制限エンドヌクレアーゼＳａｌ ＩおよびＢａｍＨ Ｉ（酵素消化系が表１に示されている）によって同定した。検証のための酵素消化マップが図２に示されている。
Figure 0007146926000001
ＤＮＡワクチンｐＶＫＤ１．０－ｈＬＭＮ－ＣＴＢの構築
コレラ毒素サブユニットＢ（Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ、ＣＴＢ）のアミノ酸配列（配列番号３０）の哺乳動物コドン最適化配列（配列番号３１）およびその真核生物発現ベクターｐＶＫＤ１．０－ＣＴＢについて、Ｖａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋから供給を受けた。ｐＶＫＤ１．０－ＣＴＢを鋳型として使用することによってプライマーを設計した（表２参照）。ＣＴＢ遺伝子断片をＰＣＲによって増幅し、次いで、対応する断片をゲルから回収した。ＣＴＢ断片を直線化されたベクターｐＶＫＤ１．０－ｈＬＭＮ上の対応する位置に相同組換え法によって挿入して、ＤＮＡワクチンベクターｐＶＫＤ１．０－ｈＬＭＮ－ＣＴＢ（プラスミドマップが図３に示されている）を構築し、これを、同定のために配列決定した後、保管した。ベクターｐＶＫＤ１．０－ｈＬＭＮ－ＣＴＢを制限エンドヌクレアーゼＳａｌ ＩおよびＢａｍＨ Ｉによって同定した（酵素消化系が表３に示されている）。検証のための酵素消化マップが図４に示されている。
Figure 0007146926000002
Figure 0007146926000003
ＤＮＡワクチンｐＶＫＤ１．０－ＣＩ－ＬＭＮＢの構築
サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）およびインフルエンザ（Ｉｎｆｌｕｖｉｒｕｓ、Ｆｌｕ）ウイルスに由来する強力なＴｈエピトープ（表４参照）を免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）から得た。ＣＭＶの強力なＴｈエピトープには、ｐｐ６５－１１、ｐｐ６５－７１、ｐｐ６５－９２、ｐｐ６５－１２３、ｐｐ６５－１２８、ｐｐ６５－５７、ｐｐ６５－６２、ｐｐ６５－３０、ｐｐ６５－１１２およびｐｐ６５－１０４が含まれ、Ｆｌｕウイルスの強力なＴｈエピトープには、ＨＡ２０３、ＮＰ４３８、ＮＳ１－８４、Ｍ１－１８１、ＨＡ３７５、ＮＰ２４、ＮＰ９５、ＮＰ２２１、ＨＡ４３４、ＨＡ４４０、ＮＰ３２４、Ｍ１－１２７およびＭ１－２１０が含まれている。表４の選択されたエピトープは、ヒトおよびマウスの双方におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の大多数のサブタイプを包含する。次いで、選択されたエピトープｐｐ６５－１１、ｐｐ６５－７１、ｐｐ６５－９２、ｐｐ６５－１２３、ｐｐ６５－１２８、ＨＡ２０３、ＮＰ４３８、ＮＳ１－８４、Ｍ１－１８１、ＨＡ３７５、ＮＰ２４、ＮＰ９５、ＮＰ２２１を縦列に連結して、配列番号３４に示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶウイルスエピトープおよびＦｌｕウイルスエピトープの融合ペプチドを形成した。エピトープ融合ペプチドを哺乳動物コドン最適化に供して配列番号３５に示されている核酸配列を得、それを合成のためにＳｕｚｈｏｕ Ｓｙｎｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄに送付し、次いで、ＤＮＡワクチンベクターｐＶＫＤ１．０（Ｖａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ）に当技術分野で周知の分子生物学的方法によって挿入して、ベクターｐＶＫＤ１．０－ＣＩ（プラスミドマップが図５に示されている）を形成し、同定のために配列決定した後、保管した。ベクターｐＶＫＤ１．０－ＣＩを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ ＩおよびＢｇｌ ＩＩによって同定した（酵素消化系が表５に示されている）。検証のための酵素消化マップが図６に示されている。
Figure 0007146926000004
Figure 0007146926000005
最後に、実施例２のベクターｐＶＫＤ１．０－ｈＬＭＮ－ＣＴＢを鋳型として使用することによってプライマーを設計した（表６参照）。標的遺伝子断片ｈＬＭＮ－ＣＴＢをＰＣＲによって増幅し、次いで、ｐＶＫＤ１．０－ＣＩベクター上の制限部位Ｎｏｔ ＩとＢａｍ ＨＩの間に当技術分野で周知の分子生物学的方法によって挿入してＤＮＡワクチンベクターｐＶＫＤ１．０－ＣＩ－ＬＭＮＢを構築し（プラスミドマップが図７に示されている）、これを、同定のために配列決定した後、保管した。ベクターｐＶＫＤ１．０－ＣＩ－ＬＭＮＢを制限エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩおよびＥｃｏＲ Ｖによって同定した（酵素消化系が表７に示されている）。検証のための酵素消化マップが図８に示されている。
Figure 0007146926000006
Figure 0007146926000007
ＬＭＮ原核生物発現ベクターの構築
ＬＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－Ａ３およびＮＹ－ＥＳＯ－１のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２４～２６に示す。オンラインコドン最適化ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅ／）を利用し、それぞれ配列番号３８～４０に示されているＥ．ｃｏｌｉコドン使用優先のヌクレオチド配列を抗原アミノ酸配列に基づく最適化によって得た。ヌクレオチド配列をＳｕｚｈｏｕ Ｓｙｎｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．で合成し、次いで、原核生物発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃａｔ番号６９９０９）上の多重クローニング部位Ｎｃｏ ＩとＸｈｏ Ｉの間に当技術分野で周知の分子生物学的方法によって挿入して原核生物発現構築物ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＬＭＮを構築し（プラスミドマップが図９に示されている）、これを、同定のために配列決定した後、保管した。ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＬＭＮを制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ ＩおよびＸｈｏ Ｉによって同定した（酵素消化系が表８に示されている）。検証のための酵素消化マップが図１０に示されている。
Figure 0007146926000008
ＬＭＮ－ＣＴＢ原核生物発現ベクターの構築
コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）のアミノ酸配列（配列番号３０）およびその原核生物コドン最適化核酸配列（配列番号４１）についてＶａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋから供給を受けた。プライマーを設計し（表９参照）、ＣＴＢコード配列を含有する核酸断片を、ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＴＢ（Ｖａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ）を鋳型として使用してＰＣＲ法によって増幅し、具体的な方法についてはＥｘ Ｔａｑ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ株式会社、Ｃａｔ番号ＲＲ００１Ｂ）の指示を参照した。次いで、核酸断片をｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＬＭＮベクターに相同組換えによって挿入してｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＬＭＮ－ＣＴＢベクターを構築し（プラスミドマップが図１１に示されている）、これを、同定のために配列決定した後、保管した。ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＬＭＮ－ＣＴＢを制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ ＩおよびＸｈｏ Ｉによって同定した（酵素消化系が表１０に示されている）。検証のための酵素消化マップが図１２に示されている。
Figure 0007146926000009
Figure 0007146926000010
ＬＭＮ－ＣＴＢおよびＣＭＶ Ｔｈエピトープの融合タンパク質を含有する原核生物発現ベクターの構築
１０種のＣＭＶ由来Ｔｈエピトープ、ｐｐ６５－１１、ｐｐ６５－７１、ｐｐ６５－９２、ｐｐ６５－１２３、ｐｐ６５－１２８、ｐｐ６５－５７、ｐｐ６５－６２、ｐｐ６５－３０、ｐｐ６５－１１２およびｐｐ６５－１０４を表４から選択し、縦列に連結して配列番号４４に示されているアミノ酸配列を形成した。配列番号４４内の配列セグメント「ＥＦＥＬＲＲＱ」は、融合および構築のために一般的な技法に属する酵素制限部位の導入に起因して形成される。オンラインコドン最適化ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅ／）を利用し、Ｅ．ｃｏｌｉコドン使用優先のヌクレオチド配列（配列番号４５）をＴｈエピトープのアミノ酸配列に基づいた最適化によって得た。ヌクレオチド配列をＳｈａｎｇｈａｉ Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．で合成し、次いで、原核生物発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃａｔ番号６９９０９）上の多重クローニング部位Ｎｃｏ ＩとＸｈｏ Ｉの間に当技術分野で周知の分子生物学的方法によって挿入して、融合タンパク質を抗原として発現させることができる原核生物発現構築物ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ Ｔｈを構築し（プラスミドマップが図１３に示されている）、これを、同定のために配列決定した後、保管した。ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ Ｔｈを制限エンドヌクレアーゼＭｌｕ ＩおよびＸｈｏ Ｉによって同定した（酵素消化系が表１１に示されている）。検証のための酵素消化マップが図１４に示されている。
図１３に示されている通り、ＣＭＶ Ｔｈ１は、ｐｐ６５－１１、ｐｐ６５－７１、ｐｐ６５－９２、ｐｐ６５－１２３およびｐｐ６５－１２８からなる５種のＣＭＶ Ｔｈエピトープを縦列に含有し、ＣＭＶ Ｔｈ２は、ｐｐ６５－５７、ｐｐ６５－６２、ｐｐ６５－３０、ｐｐ６５－１１２およびｐｐ６５－１０４からなる５種のＣＭＶ Ｔｈエピトープを含有する。ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓａｃ ＩおよびＳａｌ Ｉなどの３つの制限酵素部位をＣＭＶ Ｔｈ１とＣＭＶ Ｔｈ２の間に導入した。
Figure 0007146926000011
プライマーを設計し（表１２参照）、ＬＭＮ－ＣＴＢコード配列を含有する核酸断片を実施例５のｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＬＭＮ－ＣＴＢを鋳型として使用してＰＣＲ法によって増幅し、具体的な方法についてはＥｘ Ｔａｑ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ株式会社、Ｃａｔ番号ＲＲ００１Ｂ）の指示を参照した。次いで、核酸断片を実施例６のｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ Ｔｈベクター上のＮｏｔ ＩとＸｈｏ Ｉの間に当技術分野で周知の分子生物学的方法によって挿入してｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ１０－ＬＭＮＢベクターを構築し（プラスミドマップが図１５に示されている）、これを、同定のために配列決定した後、保管した。ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ１０－ＬＭＮＢを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ ＩおよびＸｈｏ Ｉによって同定した（酵素消化系が表１３に示されている）。検証のための酵素消化マップが図１６に示されている。図１５に示されている通り、ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ１０－ＬＭＮＢは、ＣＭＶ Ｔｈ１断片およびＣＭＶ Ｔｈ２断片、すなわち、表４のＣＭＶ Ｔｈエピトープ１０種全てを含有する。これらのエピトープは、ｐｐ６５－１１、ｐｐ６５－７１、ｐｐ６５－９２、ｐｐ６５－１２３、ｐｐ６５－１２８、ｐｐ６５－５７、ｐｐ６５－６２、ｐｐ６５－３０、ｐｐ６５－１１２およびｐｐ６５－１０４である。
Figure 0007146926000012
Figure 0007146926000013
ＬＭＮ－ＣＴＢおよびインフルＴｈエピトープの融合タンパク質を含有する原核生物発現ベクターの構築
Ｆｌｕウイルスに由来するＴｈエピトープ１３種、ＨＡ２０３、ＮＰ４３８、ＮＳ１－８４、Ｍ１－１８１、ＨＡ３７５、ＮＰ２４、ＮＰ９５、ＮＰ２２１、ＨＡ４３４、ＨＡ４４０、ＮＰ３２４、Ｍ１－１２７およびＭ１－２１０を表４から選択し、縦列に連結して配列番号４８に示されているアミノ酸配列を形成した。オンラインコドン最適化ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅ／）を利用し、Ｅ．ｃｏｌｉコドン使用優先のヌクレオチド配列（配列番号４９）を、ＦｌｕウイルスＴｈエピトープを含有するアミノ酸配列に基づく最適化によって得た。ヌクレオチド配列をＳｈａｎｇｈａｉ Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．で合成し、次いで、原核生物発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃａｔ番号６９９０９）上の多重クローニング部位Ｎｃｏ ＩとＸｈｏ Ｉの間に当技術分野で周知の分子生物学的方法によって挿入して、融合タンパク質を抗原として発現させることができる原核生物発現構築物ｐＥＴ－３０ａ（＋）－インフルＴｈを構築し（プラスミドマップが図１７に示されている）、これを、同定のために配列決定した後、保管した。ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－インフルＴｈを制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ ＩおよびＸｈｏ Ｉによって同定した（酵素消化系が表１４に示されている）。検証のための酵素消化マップが図１８に示されている。
図１７に示されている通り、インフルＴｈ１は、ＨＡ２０３、ＮＰ４３８、ＮＳ１－８４、Ｍ１－１８１、ＨＡ３７５、ＮＰ２４、ＮＰ９５およびＮＰ２２１からなる８種のＦｌｕウイルスＴｈエピトープを縦列に含有し、インフルＴｈ２は、ＨＡ４３４、ＨＡ４４０、ＮＰ３２４、Ｍ１－１２７およびＭ１－２１０からなる５種のＦｌｕウイルスＴｈエピトープを含有する。ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓａｃ ＩおよびＳａｌ Ｉといった３つの制限部位をインフルＴｈ１とインフルＴｈ２の間に導入した。
Figure 0007146926000014
プライマーを設計し（表１５参照）、ＬＭＮ－ＣＴＢコード配列を含有する核酸断片を実施例５のｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＬＭＮ－ＣＴＢを鋳型として使用してＰＣＲ法によって増幅し、具体的な方法についてはＥｘ Ｔａｑ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ株式会社、Ｃａｔ番号ＲＲ００１Ｂ）の指示を参照した。次いで、核酸断片を実施例７のｐＥＴ－３０ａ（＋）－インフルＴｈベクター上のＮｏｔ ＩとＳａｌ Ｉの間に当技術分野で周知の分子生物学的方法によって挿入してｐＥＴ－３０ａ（＋）－インフル８－ＬＭＮＢベクターを構築し（８種のＦｌｕウイルスＴｈエピトープを含有する；プラスミドマップが図１９に示されている）、これを、同定のために配列決定した後、保管した。ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－インフル８－ＬＭＮＢを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ ＩおよびＸｈｏ Ｉによって同定した（酵素消化系が表１６に示されている）。検証のための酵素消化マップが図２０に示されている。図１９に示されている通り、ｐＥＴ－３０ａ（＋）－インフル８－ＬＭＮＢベクターは、インフルＴｈ１セグメント、すなわち、表４のＨＡ２０３、ＮＰ４３８、ＮＳ１－８４、Ｍ１－１８１、ＨＡ３７５、ＮＰ２４、ＮＰ９５、およびＮＰ２２１を含めた８種のＦｌｕウイルスＴｈエピトープを含有する。
Figure 0007146926000015
Figure 0007146926000016
プライマーを設計し（表１７参照）、ＬＭＮ－ＣＴＢコード配列を含有する核酸断片を実施例５のｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＬＭＮ－ＣＴＢを鋳型として使用してＰＣＲ法によって増幅し、具体的な方法についてはＥｘ Ｔａｑ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ株式会社、Ｃａｔ番号ＲＲ００１Ｂ）の指示を参照した。次いで、この核酸断片を実施例６のｐＥＴ－３０ａ（＋）－インフルＴｈベクター上のＮｏｔ ＩとＸｈｏ Ｉの間に当技術分野で周知の分子生物学的方法によって挿入してｐＥＴ－３０ａ（＋）－インフル１３－ＬＭＮＢベクターを構築し（１３種のＦｌｕウイルスＴｈエピトープ含有する；プラスミドマップが図２１に示されている）、これを、同定のために配列決定した後、保管した。ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ１０－ＬＭＮＢを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ ＩおよびＸｈｏ Ｉによって同定した（酵素消化系が表１８に示されている）。検証のための酵素消化マップが図２２に示されている。
図２１に示されている通り、ｐＥＴ－３０ａ（＋）－インフル１３－ＬＭＮＢベクターは、インフルＴｈ１セグメントおよびインフルＴｈ２セグメントの両方、すなわち、表４のＨＡ２０３、ＮＰ４３８、ＮＳ１－８４、Ｍ１－１８１、ＨＡ３７５、ＮＰ２４、ＮＰ９５、およびＮＰ２２１を含めた８種のＦｌｕウイルスＴｈエピトープ、ならびに表４のＨＡ４３４、ＨＡ４４０、ＮＰ３２４、Ｍ１－１２７およびＭ１－２１０を含めた５種のＦｌｕウイルスＴｈエピトープを含有する。当該ベクターは、表４の全部で１３種のＦｌｕウイルスＴｈエピトープの全てを含む。
Figure 0007146926000017
Figure 0007146926000018
融合タンパク質の発現および精製
実施例４において構築された原核生物発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＬＭＮ、実施例５において構築された原核生物発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＬＭＮ－ＣＴＢ、実施例６において構築された原核生物発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ５－ＬＭＮＢおよびｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ１０－ＬＭＮＢ、実施例７において構築された原核生物発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－インフル８－ＬＭＮＢおよびｐＥＴ－３０ａ（＋）－インフル１３－ＬＭＮＢをそれぞれｐＥＴ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍａｎｕａｌ（ＴＢ０５５ 第８版 ０２／９９、Ｎｏｖａｇｅｎ）に従ってＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に導入してそれを形質転換して（Ｔｉａｎｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｃａｔ番号ＣＢ１０５；形質転換方法についてはコンピテント細胞の指示を参照した）、それぞれ組換えタンパク質ＬＭＮ（アミノ酸配列が配列番号５９に示されている）、ＬＭＮＢ（アミノ酸配列が配列番号５４に示されている）、ＬＭＮＢ－Ｃ１０（アミノ酸配列が配列番号５８に示されている）、ＬＭＮＢ－１８（アミノ酸配列が配列番号５５に示されている）、およびＬＭＮＢ－１３（アミノ酸配列が配列番号５６に示されている）を調製し、これらを、サブパッケージング後に－８０℃で保管した。
調製された組換えタンパク質の濃度はＢＣＡ法（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ番号Ｐ０００９）によって検出して１ｍｇ／ｍＬに調製され、検出方法については検出キットの指示を参照した。調製された組換えタンパク質中の内毒素の含有量は、ゲル法（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ ｃｒａｂ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｍａｎｕｆａｃｔｏｒｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、Ｘｉａｍｅｎ、Ｃａｔ番号Ｇ０１１０００）によって測定して１ＥＵ／ｍｇ未満であり、これは動物実験の要件を満たす。検出方法についてはカブトガニ薬剤の指示を参照した。
動物免疫実験
実施例２、３および８において調製されたワクチンに関する情報が表１９に示されている。ＤＮＡワクチンベクターｐＶＫＤ１．０についてＶａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋから供給を受け、ＤＮＡワクチンｐＶＫＤ１．０－ＮＰ（発現はウイルス株Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）に由来する）のＦｌｕ抗原ＮＰ（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００９１１８４７６．１）についてＶａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．．Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋから供給を受け、タンパク質ワクチンＶＰ１（エンテロウイルス７１のＶＰ１タンパク質、中国特許出願第２０１３１００８８３６４．５号を参照されたい）についてＶａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．．Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋからの供給を受けた。
６～８週齢雌ＢＡＬ Ｂ／ｃマウス１６匹をＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから購入し、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｚｈｏｕ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳＰＦ動物舎で飼育した。実験動物の群分けおよびワクチン接種スキームが表２０に示されている。全てのＤＮＡワクチンを動物当たり１００μｇで幼獣の前脛骨筋に注射した。全てのタンパク質ワクチンを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）または不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いて完全に乳化し、動物当たり１０μｇで背中に皮下注射した。最後の免疫の２週間後、マウスを屠殺し、それらの血清および脾細胞をそれぞれ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよび酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のために採取した。マウスＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴキットをＢＤ、ＵＳＡ（Ｃａｔ番号５５１０８３）から購入し、当該方法に関してＢＤからのＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴキットの指示を参照した。刺激用ペプチドは、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により合成されたＮＹ－ＥＳＯ－１ ４１＃ペプチド（ＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰ）であり、最終濃度は１０μｇ／ｍＬであった。正の刺激ホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ－１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ－１３－ａｃｅｔａｔｅ、ＰＭＡ）およびイオノマイシンをＳｉｇｍａ、ＵＳＡから購入した。
ＥＬＩＳＡ法は、当業者には周知であり、簡単に述べると下記の通りである。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＪｉａｎｇｈａｉ Ｇｌａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｆａｃｔｏｒｙから購入した。組換えＬＭＮおよびＮＹ－ＥＳＯ－１の双方について、Ｖａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋから供給を受けた。プレートを、ＮａＨＣＯ３緩衝剤（ｐＨ９．６）に加えたタンパク質を用い、４℃で一晩、コーティング濃度１０μｇ／ｍＬでコーティングし、その後、０．１％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）を加えたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用い、３７℃で３０分にわたってブロッキングし、次いで、０．５％のＴｗｅｅｎ２０を加えたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＴ）で５回洗浄した。マウス血清と一緒に室温で１時間、最初の希釈度１：１００でインキュベートし、ＰＢＳＴを用いて５回洗浄し、ヤギ抗マウスＨＲＰ二次抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と一緒に１：５０００、３７℃で３０分間さらにインキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、基質を、３，３，５，５－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて３７℃で１５分にわたって発色させ、２Ｍの希釈硫酸を用いて停止し、次いで、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）を使用して吸光度（Ａ）値を４５０ｎｍにおいて読み取った。陰性対照値Ａの２．１倍の値を陽性であると判断し、陽性値に関して最高希釈度の逆数を血清抗体力価と定義した。最高希釈度が最初の希釈度１：１００未満の場合には力価を５０と定義した。
Figure 0007146926000019
Figure 0007146926000020
細胞性免疫応答アッセイの結果が図２３に示されている。それらの中で、ｐＶＫＤ１．０－ＣＩ－ＬＭＮＢ ＤＮＡワクチンを用いて免疫誘導し、ＬＭＮＢ－Ｉ１３タンパク質を用いて免疫増強した群（すなわち、実施例８における群Ｄ）が最良の免疫効果を有し、これは、並行対照群（群Ｂ）およびＬＭＮＢ－Ｉ８を用いて免疫増強した群（群Ｃ）の免疫効果よりも有意に高かった。さらに、ＬＭＮＢ－Ｉ１３タンパク質を用いて免疫増強した群における細胞性免疫応答のレベルは、並行対照群（群Ｂ）における細胞性免疫応答のレベルのほぼ３倍であった。結果から、１３種のＦｌｕウイルスＴｈエピトープの負荷（群Ｄ）により、弱い免疫原に対する細胞性免疫応答レベルを有意に増大させることができることが示された。
ＬＭＮ－ＣＴＢおよびＣＭＶ Ｔｈエピトープの融合タンパク質を含有する原核生物発現ベクターの構築
プライマーを設計し（表２１参照）、ＬＭＮ－ＣＴＢコード配列を含有する核酸断片を実施例５のｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＬＭＮ－ＣＴＢを鋳型として使用してＰＣＲ法によって増幅し、具体的な方法についてはＥｘ Ｔａｑ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ株式会社、Ｃａｔ番号ＲＲ００１Ｂ）の指示を参照した。次いで、核酸断片を実施例６のｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ Ｔｈベクター上のＮｏｔ ＩとＳａｌ Ｉの間に当技術分野で周知の分子生物学的方法によって挿入して、ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ５－ＬＭＮＢベクターを構築し（プラスミドマップが図２４に示されている）、これを、同定のために配列決定した後、保管した。ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ５－ＬＭＮＢを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ ＩおよびＸｈｏ Ｉによって同定した（酵素消化系が表２２に示されている）。検証のための酵素消化マップが図２５に示されている。図２４に示されている通り、ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ５－ＬＭＮＢは、ＣＭＶ Ｔｈ１断片、すなわち、表４の最初の５種のＣＭＶ Ｔｈエピトープを含有する。これらのエピトープは、ｐｐ６５－１１、ｐｐ６５－７１、ｐｐ６５－９２、ｐｐ６５－１２３およびｐｐ６５－１２８である。
Figure 0007146926000021
Figure 0007146926000022
融合タンパク質の発現および精製
実施例８に記載の通り、実施例１０において構築した原核生物発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣＭＶ５－ＬＭＮＢを、ｐＥＴ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍａｎｕａｌ（ＴＢ０５５ 第８版 ０２／９９、Ｎｏｖａｇｅｎ）に従ってＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に導入してそれを形質転換して（Ｔｉａｎｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｃａｔ番号ＣＢ１０５；形質転換方法についてはコンピテント細胞の指示を参照した）、組換えタンパク質ＬＭＮＢ－Ｃ５（アミノ酸配列が配列番号５７に示されている）を調製し、それをサブパッケージング後に－８０℃で保管した。
調製された組換えタンパク質の濃度は、ＢＣＡ法（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ番号Ｐ０００９）によって検出して１ｍｇ／ｍＬに調製された。検出方法については検出キットの指示を参照した。調製された組換えタンパク質中の内毒素の含有量は、ゲル法（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ Ｃｒａｂ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｍａｎｕｆａｃｔｏｒｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｘｉａｍｅｎ、Ｃａｔ番号Ｇ０１１０００）によって測定して１ＥＵ／ｍｇ未満であり、これは動物実験の要件を満たすものであった。検出方法についてはカブトガニ薬剤の指示を参照した。
動物免疫実験
ワクチン情報が表１９に示されている。ＤＮＡワクチンｐＶＫＤ１．０－ＣＩ（実施例３）についてＶａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋから供給を受けた。
６～８週齢雌ＢＡＬ Ｂ／ｃマウス２０匹をＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから購入し、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｚｈｏｕ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳＰＦ動物舎で飼育した。実験動物の群分けおよびワクチン接種スキームが表２３に示されている。全てのＤＮＡワクチンを動物当たり１００μｇで幼獣の前脛骨筋に注射した。全てのタンパク質ワクチンを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）または不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いて完全に乳化し、および動物当たり１０μｇで背中に皮下注射した。最後の免疫の２週間後、マウスを屠殺し、血清および脾細胞をそれぞれ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよび酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のために採取した。マウスＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴキットをＢＤ、ＵＳＡ（Ｃａｔ番号５５１０８３）から購入し、当該方法に関してＢＤからのＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴキットの指示を参照した。刺激用ペプチドは、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により合成されたＮＹ－ＥＳＯ－１ ４１＃ペプチド（ＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰ）であり、最終的な刺激濃度は１０μｇ／ｍＬであった。正の刺激ホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシンをＳｉｇｍａ、ＵＳＡから購入した。
ＥＬＩＳＡ法は、当技術分野で周知であり、簡単に述べると下記の通りである。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＪｉａｎｇｈａｉ Ｇｌａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｆａｃｔｏｒｙから購入した。組換えＬＭＮおよびＮＹ－ＥＳＯ－１の双方について、Ｖａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋから供給を受けた。プレートを、ＮａＨＣＯ３緩衝剤（ｐＨ９．６）に加えたタンパク質を用い、４℃で一晩、コーティング濃度１０μｇ／ｍＬでコーティングし、その後、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用い、３７℃で３０分にわたってブロッキングし、次いで、０．５％のＴｗｅｅｎ２０を加えたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＴ）で５回洗浄した。マウス血清と一緒に最初の希釈度１：１００で、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄した。ヤギ抗マウスＨＲＰ二次抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と一緒に１：５０００、３７℃で３０分間さらにインキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、基質を３，３，５，５－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて３７℃で１５分にわたって発色させ、２Ｍの希釈硫酸を用いて停止し、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）を使用して吸光度（Ａ）値を４５０ｎｍにおいて読み取った。陰性対照値Ａの２．１倍の値を陽性であると判断し、陽性値に関して最高希釈度の逆数を血清抗体力価と定義した。最高希釈度が最初の希釈度１：１００未満の場合には力価を５０と定義した。
Figure 0007146926000023
細胞性免疫応答アッセイの結果が図２６に示されている。それらの中で、ｐＶＫＤ１．０－ＣＩ－ＬＭＮＢ ＤＮＡワクチンを用いて免疫誘導し、ＬＭＮＢ－Ｃ５タンパク質を用いて免疫増強した群（すなわち、実施例１１における群Ｃ）およびＬＭＮＢ－Ｃ１０タンパク質を用いて免疫増強した群（すなわち、実施例１１における群Ｄ）が最良の免疫効果を有し、これは、並行対照（群Ｂ）における免疫効果よりも有意に高かった。結果から、５種のＣＭＶウイルスＴｈエピトープの負荷（群Ｃ）および１０種のＣＭＶウイルスＴｈエピトープの負荷（群Ｄ）により、弱い免疫原に対する細胞性免疫応答を有意に改善することができることが示された。
腫瘍予防のための動物実験
実施例２、３および８において調製されたワクチンに関する情報が表１９に示されている。ＤＮＡワクチンベクターｐＶＫＤ１．０についてＶａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋから供給を受け、ＤＮＡワクチンｐＶＫＤ１．０－ＮＰ（発現がウイルス株Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）に由来する）のＦｌｕ抗原ＮＰ（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００９１１８４７６．１）についてＶａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋから供給を受け、タンパク質ワクチンＶＰ１（エンテロウイルス７１のＶＰ１タンパク質、中国特許出願第２０１３１００８８３６４．５号を参照されたい）についてＶａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋから供給を受けた。
６～８週齢雌ＢＡＬ Ｂ／ｃマウス６０匹をＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから購入し、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｚｈｏｕ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳＰＦ動物舎で飼育した。実験動物の群分けおよびワクチン接種スキームが表２４に示されている。全てのＤＮＡワクチンを動物当たり１００μｇで幼獣の前脛骨筋に注射した。全てのタンパク質ワクチンを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）または不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いて完全に乳化し、動物当たり１０μｇで背中に皮下注射した。最後の免疫の２週間後、マウスに、４Ｔ１－ｈＮＹ－ＥＳＯ－１（Ｖａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋにより供給を受けた）を安定にトランスフェクトした細胞株をマウス当たり細胞１×１０５個の接種用量で皮下接種し、接種後に腫瘍成長を連続して観察し、測定した。腫瘍体積を以下の方程式に従って算出した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ×幅２／２。腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えたらマウスを屠殺した。
Figure 0007146926000024
各群の免疫したマウスの腫瘍成長が図２７に示されている。それらの中で、対照群（群Ａ）の全てのマウスで腫瘍攻撃後（すなわち、腫瘍接種後）１４日目に腫瘍が発生し、腫瘍は急速に成長した。各免疫群のマウスの腫瘍成長は対照群の腫瘍成長よりも遅延し、ここで、ＬＭＮＢ－Ｉ１３を用いて免疫増強した群のマウス（群Ｄ）およびＬＭＮＢ－Ｉ１３とＬＭＮＢ－Ｃ１０の混合物を用いて免疫増強した群のマウス（群Ｅ）の腫瘍成長が最も遅く、したがって、これらの２つの群のワクチンの効果が最良であった。
さらに、マウスについて無腫瘍生存期間の分析を実施した。結果が図２８に示されている。対照群Ａのマウスの無腫瘍生存期間（ＴＦＳ）の中央値は１４日間であった。ワクチンで免疫した各群のマウスの無腫瘍生存期間は、対照群の無腫瘍生存期間よりも有意に高く、これにより、全てのワクチンにより免疫したマウスの無腫瘍生存期間を増大させることができたことが示される。それらの中で、Ｉ１３エピトープ融合ペプチドを用いた群Ｄ、ならびにＩ１３およびＣ１０エピトープ融合ペプチドを用いた群Ｅおよび群Ｆで効果が最良であり、マウスの無腫瘍生存期間は最大で２倍であった。Ｉ１３エピトープ融合ペプチドを用いたワクチン群（群Ｄ）では、無腫瘍生存期間が従来のワクチン群（群Ｂ）と比較して約４０％有意に増大し、これにより、１３種のＦｌｕウイルスのＴｈエピトープまたは１０種のＣＭＶのＴｈエピトープの負荷により、腫瘍ワクチンの腫瘍に対する保護効果を有意に改善することができたことが示される。
最後に、マウス全生存期間の分析も実施した。結果が図２９に示されている。それらの中で、対照群Ａのマウスの全生存期間（ＯＳ）の中央値は３５日間であった。ワクチンで免疫した各群のマウスの全生存期間は対照群の全生存期間よりも有意に高く、これにより、全てのワクチンによりマウスの免疫後の生存を増大させることができたことが示される。それらの中で、Ｉ１３エピトープ融合ペプチドを用いた群ＤならびにＩ１３およびＣ１０エピトープ融合ペプチドを用いた群ＥおよびＦで効果が最良であり、全生存率が８３％上昇した。従来のワクチン群（群Ｂ）と比較して、Ｉ１３エピトープ融合ペプチドを用いたワクチン群（群Ｄおよび群Ｆ）では無腫瘍生存期間が最大で２８％有意に増大し、これにより、１３種のＦｌｕウイルスＴｈエピトープまたは１０種のＣＭＶ Ｔｈエピトープの負荷により腫瘍ワクチンの保護効果を著しく改善することができたことが示される。
腫瘍処置実験
使用したワクチンは実施例９に示されている。６～８週齢雌ＢＡＬ Ｂ／ｃマウス３０匹をＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから購入し、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｚｈｏｕ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳＰＦ動物舎で飼育した。実験動物の群分けおよびワクチン接種スキームが表２５に示されている。全てのＤＮＡワクチンを動物当たり１００μｇで幼獣の前脛骨筋に注射した。全てのタンパク質ワクチンを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）または不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いて完全に乳化し、動物当たり１０μｇで背中に皮下注射した。最後の免疫の２週間後、マウスに、腫瘍細胞４Ｔ１－ｈＮＹ－ＥＳＯ－１（Ｖａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋにより供給を受けた）を安定にトランスフェクトした細胞株をマウス当たり細胞１×１０５個の用量で皮下接種し、対応するマウスにタンパク質ワクチンをそれぞれ腫瘍細胞接種後１日目、８日目および１５日目に皮下接種した。接種後に腫瘍成長を連続して観察し、測定した。腫瘍体積を以下の方程式に従って算出した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ×幅２／２。腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えたらマウスを屠殺した。
Figure 0007146926000025
各群の免疫したマウスの腫瘍成長が図３０に示されている。それらの中で、対照群（群Ａ）の全てのマウスで腫瘍攻撃後（すなわち、腫瘍接種後）１４日目に腫瘍が発生し、腫瘍は急速に成長した。ＬＭＮＢ－Ｉ１３タンパク質ワクチン処置群（群Ｃ）のマウスの腫瘍成長は無処置の対照群（群Ａ）と比較して最も遅かった。さらに、腫瘍攻撃後２２日目のＬＭＮＢ－Ｉ１３タンパク質ワクチン処置群のマウスの腫瘍サイズは対照群（群Ａ）の腫瘍サイズよりも有意に小さく、３０日目まで２つの群間で腫瘍サイズになお有意差があった。３５日目までに、群Ｃにおけるマウスの腫瘍成長が加速し始め、これは、おそらくＬＭＮＢ－Ｉ１３タンパク質ワクチンのワクチン接種を終了したことに関連する。結果から、ＬＭＮＢ－Ｉ１３タンパク質ワクチンによりマウスにおける腫瘍成長を阻害することができることが示された。
腫瘍処置実験
使用したワクチンは実施例９に示されている。３０匹の６～８週齢雌ＢＡＬ Ｂ／ｃマウスをＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから購入し、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｚｈｏｕ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳＰＦ動物舎で飼育した。実験動物の群分けおよびワクチン接種スキームが表２６に示されている。全てのＤＮＡワクチンを動物当たり１００μｇで幼獣の前脛骨筋に注射した。全てのタンパク質ワクチンを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）または不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いて完全に乳化し、動物当たり１０μｇで背中に皮下注射した。最後の免疫の２週間後、マウスに、腫瘍細胞ＣＴ２６－ｈＬＡＧＥ－１（Ｖａｃｄｉａｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋにより供給を受けた）を安定にトランスフェクトした細胞株をマウス当たり細胞１×１０５個の接種用量で皮下接種し、対応するマウスにタンパク質ワクチンをそれぞれ腫瘍細胞接種後１日目、８日目および１５日目に皮下接種した。接種後に腫瘍成長を連続して観察し、測定した。腫瘍体積を以下の方程式に従って算出した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ×幅２／２。腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えたらマウスを屠殺した。
Figure 0007146926000026
各群の免疫したマウスの腫瘍成長が図３１に示されている。無処置の対照群（群Ａ）の一部のマウスへの腫瘍接種が失敗したので、腫瘍攻撃後（すなわち、腫瘍接種後）、そのようなマウスは分析には含めず、並行対照ワクチン群（群Ｂ）およびＬＭＮＢ－Ｉ１３処置群（群Ｃ）を比較した。群Ｂと比較して、群Ｃのマウスの腫瘍成長はより遅く、また、腫瘍攻撃後２２日目のＬＭＮＢ－Ｉ１３タンパク質ワクチン処置群のマウスの腫瘍サイズは並行対照ワクチン群（群Ｂ）の腫瘍サイズよりも有意に小さかった。３０日目まで２つの群間で腫瘍サイズになお有意差があった。同様に、群Ｃにおけるマウスの腫瘍成長の増大もＣＴ２６マウスモデルにおいて後期に観察され、これは、おそらくＬＭＮＢ－Ｉ１３タンパク質ワクチンのワクチン接種を終了したことに関連する。これらの結果から、ＬＭＮＢ－Ｉ１３タンパク質ワクチンによりマウスにおける腫瘍成長を阻害することができることが示された。

Claims (15)

  1. ＣＤ４ヘルパーＴ細胞エピトープの融合ペプチドであって、
    前記エピトープの融合ペプチドが、配列番号３４、４４もしくは４８に示されているエピトープの融合ペプチド、または、配列番号１～５もしくは配列番号１１～１８のエピトープを縦列に連結することによって形成されたエピトープの融合ペプチドである、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞エピトープの融合ペプチド。
  2. 請求項１に記載のエピトープの融合ペプチドと標的免疫原とを含む融合タンパク質。
  3. 前記標的免疫原が、ペプチド、抗原、ハプテン、炭水化物、タンパク質、核酸、アレルゲン、ウイルスもしくはウイルスの一部、細菌、寄生生物および他の丸ごとの微生物からなる群から選択される、請求項２に記載の融合タンパク質。
  4. 前記抗原が、腫瘍抗原または感染関連抗原である請求項３に記載の融合タンパク質。
  5. 前記腫瘍抗原が、肺がん抗原、精巣がん抗原、黒色腫抗原、肝がん抗原、乳がん抗原および前立腺がん抗原からなる群から選択される１つまたは複数の腫瘍抗原である、請求項４に記載の融合タンパク質。
  6. 前記腫瘍抗原が、ＬＡＧＥ抗原、ＭＡＧＥ抗原およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原からなる群から選択される１つまたは複数の腫瘍抗原である、請求項５に記載の融合タンパク質。
  7. 前記ＬＡＧＥ抗原が、ＬＡＧＥ－１であり、
    前記ＭＡＧＥ抗原が、ＭＡＧＥ－Ａ３である、請求項６に記載の融合タンパク質。
  8. 前記ＬＡＧＥ－１のアミノ酸配列が、配列番号２４に示されているものであり、
    前記ＭＡＧＥ－Ａ３のアミノ酸配列が、配列番号２５に示されているものであり、
    前記ＮＹ－ＥＳＯ－１のアミノ酸配列が、配列番号２６に示されているものである、請求項７に記載の融合タンパク質。
  9. 前記感染関連抗原が、ＨＩＶ抗原、インフルエンザウイルス抗原およびＨＢＶ抗原からなる群から選択される１つまたは複数の感染関連抗原である、請求項４に記載の融合タンパク質。
  10. 前記融合タンパク質が、配列番号５５～５８のうちの１つで示される、請求項２から９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  11. 請求項１に記載のエピトープの融合ペプチドまたは請求項２から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  12. 予防有効量または治療有効量の請求項１に記載のエピトープの融合ペプチド、請求項２から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、および／または請求項１１に記載のポリヌクレオチド、ならびに薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物。
  13. 標的免疫原の免疫原性を増大させるための医薬の調製における、請求項１に記載のエピトープの融合ペプチド、請求項２から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１１に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項１２に記載の免疫原性組成物の使用。
  14. 請求項１に記載のエピトープの融合ペプチドを使用する標的免疫原の免疫原性を増大させるための医薬またはワクチンであって、
    ワクチン対象または集団においてより強力な免疫応答を有するＣＤ４ヘルパーＴ細胞エピトープを標的免疫原と融合することによって形成された融合タンパク質を含む、医薬またはワクチン。
  15. それを必要とする対象における状態を治療または予防するための医薬またはワクチンであって、請求項１に記載のエピトープの融合ペプチド、請求項２から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１１に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項１２に記載の免疫原性組成物を含む医薬またはワクチン。
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