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CN115038713A - 流感病毒疫苗及其用途 - Google Patents

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CN115038713A
CN115038713A CN202080070525.6A CN202080070525A CN115038713A CN 115038713 A CN115038713 A CN 115038713A CN 202080070525 A CN202080070525 A CN 202080070525A CN 115038713 A CN115038713 A CN 115038713A
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seq
influenza hemagglutinin
hemagglutinin polypeptide
mutant influenza
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B·勃兰登堡
J·P·M·朗格戴克
T·里切尔
F·J·麦尔德
M·A·C·容格尼伦
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Janssen Vaccines and Prevention BV
Original Assignee
Janssen Vaccines and Prevention BV
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Abstract

本文提供了分离的突变型流感血凝素多肽，用于提供分离的突变型血凝素多肽的方法，包含这些分离的突变型血凝素多肽的组合物，包含这些分离的突变型血凝素多肽的疫苗，以及它们的使用方法，特别是在检测、预防和/或治疗流感中的使用方法。

Description

流感病毒疫苗及其用途
关于联邦资助研究的声明
本发明至少部分是根据由HHS授予的合同号HHSO10020170018C在政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及医学领域。本文提供了分离的流感血凝素多肽，用于提供血凝素多肽的方法，包含这些血凝素多肽的组合物，包含这些血凝素多肽的疫苗，以及它们的使用方法，特别是在检测、预防和/或治疗流感中的使用方法。
对以电子方式提交的序列表的引用
本申请含有一个序列表，该序列表经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，其文件名为“688097.562US Sequence Lisitng”，并且创建日期为2019年9月16日并且大小为468kb。经由EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分，并且通过引用以其整体并入本文。
背景技术
甲型和乙型流感病毒是主要的人病原体，引起呼吸系统疾病(通常称为“流感(influenza)”或“流行性感冒(the flu)”)，其严重程度范围为从亚临床感染至可导致死亡的原发性病毒性肺炎。WHO估计，每年流感的流行会导致约10亿人感染、300-500万例重症病例和300,000-500,000人死亡。大流行性流感的严重程度取决于多种因素，包括大流行性病毒株的毒力和预先存在的免疫水平。发生于1918年的、最严重的流感大流行导致全球>4000万人死亡。每年配制流感疫苗以匹配传播的株系，因为它们由于抗原漂移会产生抗原性。尽管如此，疫苗功效仍不是最佳的，并且在疫苗与传播的病毒株之间的抗原不匹配的情况下疫苗功效非常低。已经开发靶向流感病毒酶神经氨酸酶的抗病毒剂以用于预防和治疗。然而，这些抗病毒药的使用仍然是有限的。对抗流感的新兴方法包括开发通用流感病毒疫苗，这些疫苗提供针对抗原远距离的流感病毒的保护(Krammer等人,Nat.Rev.DiseasePrimers[自然评论疾病引物]4:3(2018))。
在过去的三十年中，两种不同的乙型流感谱系一直在每个季节以不同程度在人群中共同传播，而在特定季节中占主导地位的乙型流感谱系已被证明难以预测，这使得将哪个谱系纳入三价疫苗(TIV)的决定变得复杂(Ambrose等人,H um.Vaccin.Immunother.[人类疫苗与免疫疗法]8:81-8(2012)；US Centers for Disease Control and Prevention,“Seasonal influenza activity surveillance report s 2001-2018”[美国疾病控制和预防中心，“2001-2018年季节性流感活动监测报告”]www.cdc.gov/flu/weekly/pastreports.htm(2018年7月2日访问)；European Centre for Disease Prevention andControl/WHO Regional Office for Europe,“Annual epidemiological reports onseasonal influenza 2001-2018”[欧洲疾病预防和控制中心/WHO欧洲区域办事处，“2001-2018年季节性流感年度流行病学报告”],ecdc.europa.eu/en/seasonal-influenza/surveillance-and-disease-data/aer(2018年7月2日访问))。通过疫苗接种有效覆盖乙型流感的重要性体现在其对季节性流感总体负担的贡献上。根据美国疾病控制中心(USCenters for Disease Co ntrol)的数据和几个欧洲国家的报告，在2001年与2018年之间乙型流感占实验室确诊的流感病例总数的0.8％-82％，其中季节性平均值为25％(Ambrose等人,Hum.Vaccin.Immunother.[人类疫苗与免疫疗法]8:81-8(2012)；US Centers fo rDisease Control and Prevention,“Seasonal influenza activity surveillance reports 2001-2018”[美国疾病控制和预防中心，“2001-2018年季节性流感活动监测报告”]www.cdc.gov/flu/weekly/pastreports.htm(2018年7月2日访问)；Europe an Centre forDisease Prevention and Control/WHO Regional Office for Europe,“Annualepidemiological reports on seasonal influenza 2001-2018”[欧洲疾病预防和控制中心/WHO欧洲区域办事处，“2001-2018年季节性流感年度流行病学报告”],ecdc.europa.eu/en/seasonal-influenza/surveillance-and-disease-data/aer(2018年7月2日访问)；Dijkstra等人,Epidemiol.Infect.[流行病学与感染]137:473-9(2009)；Peltola等人,Clin.Infect.Dis.[临床传染病]36:299-305(2003))。此外，乙型流感是由流感导致的总发病和死亡的主要因素，可归因住院治疗率与流感A/H3N2相似且高于A/H1N1(Thompson等人,JAMA[美国医学会杂志]292:1333-40(2004))，占美国所有可归因于流感的呼吸和循环相关死亡的15％，并且在儿科患者中占34％(Ambrose等人,Hum.Vaccin.Immunother.[人类疫苗与免疫疗法]8:81-8(2012)；Thompson等人,JAMA[美国医学会杂志]289:179-86(2003))。这些原则促使包括世界卫生组织(World Health Organization)和美国免疫实施咨询委员会(US Advisory Committee on Immunization Practices)在内的多个卫生当局推荐含有两种乙型流感抗原(每种乙型谱系中的一种)的四价流感疫苗(QIV)作为季节性疫苗接种的选择之一(Grohskopf等人,MMWR Reco mm.Rep.[MMWR建议与报告]66:1-20(2017)；Grohskopf等人,MMWR Reco mm.Rep.[MMWR建议与报告]67:643-5(2018)；World HealthOrganization,“Recommended composition of influenza virus vaccines for use inthe 2017-2018northern hemisphere influenza season”[世界卫生组织，“2017-2018年北半球流感季节使用的流感病毒疫苗的推荐组成”],www.who.int/influenza/vaccines/viru s/recommendations/2018_19_north/en(2018年7月2日访问))。
当前的免疫实践依赖于对传播的流感病毒的早期鉴定以允许及时生产有效的季节性流感疫苗。除了在预测将在下一季节期间占主导的株系方面的固有困难以外，抗病毒抗性和免疫逃逸也在当前疫苗预防发病和死亡的失败中起作用。除此之外，由源自动物宿主并且重配以增加人与人传播的高毒力病毒株引起大流行病的可能性也对全球健康造成严重且现实的威胁。
乙型流感病毒株几乎仅在人中发现。乙型流感病毒株内的HA中的抗原变异小于在甲型株系内观察到的抗原变异。乙型流感病毒的两个在遗传和抗原方面不同的谱系在人中传播，如由B/山形(Yamagata)/16/88(也称为B/山形)和B/维多利亚(Victoria)/2/87(B/维多利亚)谱系代表(Ferguson等人,2003)。尽管由乙型流感病毒引起的疾病谱通常轻于由甲型流感病毒引起的疾病谱，但在乙型流感感染的情况下仍经常观察到需要住院治疗的严重疾病。
已知中和流感病毒的抗体主要针对血凝素(HA)。血凝素或HA是一种锚定在病毒外壳中并且具有双重功能的三聚体糖蛋白：它负责与细胞表面受体唾液酸结合，并且在吸收后，它介导病毒膜和内体膜的融合，从而导致病毒RNA释放到细胞的胞质溶胶中。HA包含较大的头部结构域和较小的茎部结构域。对病毒膜的附着是由连接至茎部结构域的C末端锚定序列介导的。该蛋白质在指定环中被翻译后裂解以产生两个多肽：HA1和HA2(完整序列称为HA0)。膜远端头部区域主要源自HA1，而膜近端茎部区域主要源自HA2。
季节性流感疫苗必须每年更新的原因是病毒的变异性很大。在血凝素分子中，这种变异特别表现在头部结构域中，在其中抗原漂移和转变已经产生大量不同的变体。由于这也是免疫显性区域，因此大多数中和抗体都针对此结构域，并且通过干扰受体结合起作用。头部结构域的免疫显性和较大变异的组合也解释了感染特定株系不会对其他株系产生免疫的原因：由首次感染引发的抗体只识别有限数量的与首次感染的病毒密切相关的株系。
因此，需要开发一种通用流感病毒疫苗，该通用流感病毒疫苗刺激针对当前和未来流感病毒株(季节性和大流行性二者)产生稳健的、广泛的保护性反应，特别是提供针对乙型流感病毒的保护以有效预防和治疗流感。
发明内容
本文提供了分离的突变型流感血凝素多肽，用于提供这些分离的血凝素多肽的方法，包含这些分离的血凝素多肽的组合物，包含这些分离的血凝素多肽的疫苗，以及使用这些组合物和疫苗的方法。
本文提供了分离的突变型流感血凝素多肽。这些分离的突变型流感血凝素多肽包含在该多肽中的至少两个稳定突变，其中这些稳定突变包含以下位置处的取代突变：(a)氨基酸位置227和/或238；和/或(b)氨基酸位置384和/或476，其中氨基酸位置对应于SEQ IDNO:1的氨基酸位置。在某些实施例中，(a)氨基酸位置227被选自由以下组成的组的氨基酸取代：Q、N、F、I和Y，和/或氨基酸位置238被选自由以下组成的组的氨基酸取代：N、Q、I和F；和/或(b)氨基酸位置384被选自由以下组成的组的氨基酸取代：W、F、N、Q和I，和/或氨基酸位置476被选自由以下组成的组的氨基酸取代：W、F、Y、I、N和Q。在某些实施例中，(a)氨基酸位置227被Q取代并且氨基酸位置238被I取代；和/或(b)氨基酸位置384被I取代并且氨基酸位置476被I取代。在某些实施例中，该分离的突变型流感血凝素多肽进一步包含在该多肽中的一个另外的稳定突变。该另外的稳定突变是氨基酸位置461处的取代，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸位置。在某些实施例中，氨基酸位置461被选自由以下组成的组的氨基酸取代：M、L、W、Y和R。在某些实施例中，氨基酸位置461被R取代。该分离的突变型流感血凝素多肽可以例如包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40。该分离的突变型流感血凝素多肽可以例如包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在某些实施例中，该分离的突变型流感血凝素多肽进一步包含在该多肽的头部结构域中的至少一个另外的聚糖基序。该聚糖基序可以例如包含在至少一个选自由以下组成的组的氨基酸位置中的氨基(N)-连接的糖基化基序的取代：(a)136或137、(b)141和(c)151，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。该聚糖基序可以例如包含在氨基酸位置136和141、136和151、137和141、137和151或141和151处的该N-连接的糖基化基序的取代。在某些实施例中，该聚糖基序包含在氨基酸位置141和151处的该N-连接的糖基化基序的取代。在某些实施例中，该突变型流感血凝素多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45。
在某些实施例中，该分离的突变型流感血凝素多肽进一步包含或仅包含在该多肽中的受体结合位点突变。该受体结合位点突变可以例如包含在选自由以下组成的组的氨基酸位置处的突变：(a)175、(b)219、(c)257和(d)258，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。在某些实施例中，(a)175被选自由以下组成的组的氨基酸取代：F、W和Y；(b)219被选自由以下组成的组的氨基酸取代：F、W、Y、R和E；(c)257被选自由以下组成的组的氨基酸取代：E、D、V、F；或(d)258被选自由以下组成的组的氨基酸取代：E、D、V和F。在某些实施例中，(a)175被W取代，(b)219被E取代，(c)257被E取代，或(d)258被E取代。在某些实施例中，该突变型流感血凝素多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:61。
在某些实施例中，该分离的突变型流感血凝素多肽进一步包含在位置136处的氨基酸取代，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
在某些实施例中，该分离的突变型流感血凝素多肽进一步包含或仅包含融合肽近端区(FPPR)缺失突变。该FPPR缺失突变可以例如包含在氨基酸位置369与382之间的至少三至七个氨基酸残基的缺失，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。该FPPR缺失突变可以例如包含选自由以下组成的组的缺失：Δ372-376、Δ372-378、Δ373-377、Δ373-376、Δ374-379、Δ374-376、Δ376-380和Δ377-381。在某些实施例中，该FPPR缺失突变是选自Δ372-376或Δ376-380的缺失。在某些实施例中，该突变型流感血凝素多肽包含选自SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
在某些实施例中，该分离的突变型流感血凝素多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84。
在某些实施例中，该分离的突变型流感血凝素多肽可以包含折叠子结构域。在某些实施例中，该分离的突变型流感血凝素多肽进一步包含在从氨基酸532至氨基酸位置549的氨基酸位置处开始的羧基(C)末端截短，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。在某些实施例中，该C末端截短在氨基酸位置532、534、536、539、541、543、545、547或549处开始，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
在某些实施例中，该突变型流感血凝素多肽进一步包含在氨基酸位置362处的裂解位点处的氨基酸取代，其中其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。在氨基酸位置362处的该裂解位点取代可以是例如Q。
还提供了一种分离的核酸，该分离的核酸编码本文所述的分离的突变型流感血凝素多肽。
还提供了一种载体，该载体包含本文所述的分离的核酸。
还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含本文所述的载体。
还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的分离的突变型流感血凝素多肽、分离的突变型流感血凝素核酸和/或载体和药学上可接受的载体。
还提供了在有需要的受试者中诱导针对流感病毒的免疫反应的方法。这些方法包括向该有需要的受试者施用本文所述的药物组合物。
还提供了产生分离的突变型流感血凝素多肽的方法。这些方法包括在能够产生该突变型流感血凝素多肽的条件下培养本文所述的宿主细胞，以及从该细胞或培养物中回收该突变型流感血凝素多肽。
还提供了产生本文所述的药物组合物的方法。这些方法包括将该分离的突变型流感多肽与药学上可接受的载体合并。
根据本发明的多肽的各种实施例和用途将根据以下具体实施方式变得清楚。
附图说明
图1A-图1B示出了本发明的多肽的结构和设计要素。图1A示出了本发明的多肽的三维表示(表示乙型流感HA的胞外结构域；pdb ID 4NRJ，Ni等人,Virology[病毒学]450-451:71-83(2014))。图1B示出了具有所指示的取代的位置的本发明的某种多肽UFV180846(SEQ ID NO:2)的示意图；*N-连接的糖基化基序的引入，￥融合肽近端区(FPPR)缺失：省略了残基372-376，φ在此实例中C末端在残基536之后截短(编号是指WT HA；SEQ ID NO:1)。
图2A-图2F示出了EXPI-293表达的具有稳定突变的多肽的分析，相对于含有折叠子三聚化结构域的参考野生型FL HA B/布里斯班(Brisbane)/60/08(UFV170090)(SEQ IDNO:3)归一化。图2A示出了具有以球形指示的氨基酸取代的位置的单体HA胞外结构域的示意性表示。指明了如野生型(WT)HA中存在的残基。图2B示出了单克隆抗体CR9114与在位置461处携带不同氨基酸取代的本发明的多肽的AlphaLISA结合。结合显示为各自的参考HA序列的相对％。图2C示出了单克隆抗体CR9114与在位置227和236处携带不同氨基酸取代的本发明的多肽的AlphaLISA结合。结合显示为各自的参考HA序列的相对％。图2D示出了单克隆抗体CR9114与在位置384和476处携带不同氨基酸取代的本发明的多肽的AlphaLISA结合。结合显示为各自的参考HA序列的相对％。图2E示出了具有稳定取代的组合的多肽的如通过AlphaLISA所确定的表达水平和CR9114结合，以及如通过DSF所确定的温度稳定性。结合显示为各自的参考HA序列的相对％。图2F示出了多肽的SEC曲线；虚线表示包括折叠子三聚化结构域的WT HA(UFV170090)。黑线表示具有(UFV170525(SEQ ID NO:19)和UFV170556(SEQID NO:35))和不具有(UFV171348(SEQ ID NO:39)和UFV171387(SEQ ID NO:40))折叠子三聚化结构域的稳定多肽。如图2B、图2C、图2D和图2E中呈现的“-”符号指示WT残基存在于列标题中指示的位置处。在图2E中，折叠子列中的“+”和“-”符号分别指示存在或不存在C末端折叠子三聚化结构域。
图3A-图3B示出了EXPI-293表达的在头部结构域中引入了氨基(N)-连接的糖基化基序的多肽的分析。图3A示出了具有以球形指示的点取代的位置的野生型单体HA的示意性表示。图3B示出了如通过AlphaLISA所确定的蛋白质表达水平、三聚体含量和抗体结合。对于UFV171991(SEQ ID NO:45)、UFV171992(SEQ ID NO:44)和UFV171993(SEQ ID NO:42)，将值相对于参考多肽UFV171990(SEQ ID NO:41)归一化；并且对于UFV171472(SEQ ID NO:42)，将值相对于参考多肽UFV170090(SEQ ID NO:3)归一化。“+”符号指示在特定位置处存在N-连接的糖基化基序。符号F指示存在折叠子三聚化结构域。
图4A-图4B示出了EXPI-293表达的在受体结合位点附近引入了突变的多肽的分析。图4A示出了具有以球形指示的点取代的位置的单体HA的示意性表示。图4B示出了如通过AlphaLISA所确定的蛋白质表达水平、三聚体含量和抗体结合。将值相对于参考多肽UFV171990(SEQ ID NO:41)归一化。“-”符号指示特定位置没有突变并且存在WT残基。
图5A-图5B示出了EXPI-293表达的在融合肽近端区(FPPR)中具有缺失的多肽的分析。图5A示出了具有以黑色球形指示的FPPR中缺失位置的区域的HA的单体胞外结构域的示意性表示。图5B示出了如通过AlphaLISA所确定的蛋白质表达水平、三聚体含量和抗体结合。将值相对于参考多肽UFV171990(SEQ ID NO:41)归一化。
图6示出了表达具有替代性C末端截短(UFV180454(SEQ ID NO:71)中的位置549处逐步向下至UFV180462(SEQ ID NO:79)中的位置532处)的可溶性三聚体多肽变体的EXPI-293培养上清液的SEC曲线；多肽(黑线)和包括C-标签的全长参考UFV180284(SEQ ID NO:70)(虚线)。
图7A-图7E示出了表达可溶性多肽的EXPI-CHO培养上清液的分析以及纯化的多肽的体外表征。评价了取代的不同组合；在头部结构域中的氨基(N)-连接的聚糖基序，稳定取代，受体结合位点取代257E和FPPR缺失。图7A示出了表达UFV180131(SEQ ID NO:81)(左图)和纯化的UFV180131(SEQ ID NO:81)(右图)的细胞的上清液的SEC曲线。图7B示出了如通过OCTET所确定的多肽的表达水平。如通过ELISA所确定的，茎部(CR9114)、颈部(CR8071)和头部结构域(SD84)特异性抗体对纯化的HA的EC50值。通过差示扫描荧光测定法所得的，纯化的多肽的温度稳定性。“-”符号指示特定位置没有突变并且存在WT残基。图7C示出了如通过OCTET所确定的在EXPI-CHO培养上清液中表达的构建体UFV180846(SEQ ID NO:84)的蛋白质表达水平，如通过ELISA所确定的茎部(CR9114)、颈部(CR8071)和头部结构域(34B5(WO2015/148806)特异性抗体对纯化的HA的EC50值，以及通过差示扫描荧光测定法所得的纯化的多肽的温度稳定性。图7D示出了维多利亚谱系(SEQ ID NO:1)、山形谱系(SEQ ID NO:94)、共有序列(SEQ ID NO:95)、UFV170088(SEQ ID NO:80)、UFV180131(SEQ ID NO:81)、UFV180137(SEQ ID NO:82)、UFV180251(SEQ ID NO:83)和UFV180284(SEQ ID NO:)的比对。图7E示出了维多利亚谱系(SEQ ID NO:1)、山形谱系(SEQ ID NO:94)、共有序列(SEQ IDNO:95)、UFV170088(SEQ ID NO:80)、UFV180846(SEQ ID NO:84)、UFV180847(SEQ ID NO:91)、UFV180848(SEQ ID NO:92)和UFV180849(SEQ ID NO:93)的比对。
定义
以下给出如本发明中所用的术语的定义。
根据本发明的氨基酸可以是二十种天然存在的(或“标准”)氨基酸或其变体中的任何一种(像例如D-脯氨酸(脯氨酸的D-对映异构体))或非天然存在于蛋白质中的任何变体(像例如正亮氨酸)。标准氨基酸可以基于它们的特性分成几组。重要的因素是电荷、亲水性或疏水性、大小和官能团。这些特性对于蛋白质结构和蛋白质-蛋白质相互作用是重要的。一些氨基酸具有特殊的特性，如半胱氨酸，其可以与其他半胱氨酸残基形成共价二硫键(或二硫桥)；脯氨酸，其与多肽骨架形成环；以及甘氨酸，其比其他氨基酸更具柔性。表1示出了标准氨基酸的缩写和特性。
术语“氨基酸序列同一性”是指在一对比对的氨基酸序列之间的同一性或相似性程度，通常以百分比表示。同一性百分比是在比对序列并且引入空位(如果必要)以实现最大序列同源性百分比之后，与在肽中相应的氨基酸残基相同(即，比对中给定位置处的氨基酸残基是相同残基)或相似(即，比对中给定位置处的氨基酸取代是保守取代，如下所讨论)的候选序列中的氨基酸残基的百分比。序列同源性(包括序列同一性和相似性的百分比)是使用本领域熟知的序列比对技术(如通过视觉检查和数学计算)来确定的，或更优选地，比较是通过使用计算机程序比较序列信息来完成的。示例性优选计算机程序是遗传学计算机集团(Genetics Computer Group)(GCG；威斯康星州麦迪逊)威斯康星软件包(Wisconsinpackage)10.0版程序“GAP”(Devereux等人(1984))。
“保守取代”是指将某一类别的氨基酸用同一类别的另一种氨基酸替代。在特定实施例中，保守取代不改变多肽的结构或功能，或二者。用于保守取代目的的氨基酸类别包括疏水性(例如Met、Ala、Val、Leu)、中性亲水性(例如Cys、Ser、Thr)、酸性(例如Asp、Glu)、碱性(例如Asn、Gln、His、Lys、Arg)、构象破坏者(例如Gly、Pro)和芳香族(例如Trp、Tyr、Phe)。
如本文所用，术语“疾病”和“障碍”可互换地用于指代受试者的病症。在一些实施例中，该病症是病毒感染，特别是流感病毒感染。在特定实施例中，术语“疾病”是指由于病毒在细胞或受试者中的存在或由于病毒对细胞或受试者的入侵而引起的病理状态。在某些实施例中，该病症是受试者的疾病，其严重程度通过经由施用免疫原性组合物诱导受试者的免疫反应而降低。
如本文所用，在向受试者施用疗法的背景下的术语“有效量”是指疗法的具有一种或多种预防性和/或治疗性作用的量。在某些实施例中，在向受试者施用疗法的背景下的“有效量”是指疗法的量，该量足以实现流感病毒感染、与其相关的疾病或症状的严重程度的降低或缓解，该降低或缓解诸如但不限于减少流感病毒感染、与其相关的疾病或症状的持续时间；预防流感病毒感染、与其相关的疾病或症状的进展；预防流感病毒感染、与其相关的疾病或症状的发展或发作或复发；预防或减少流感病毒从一名受试者到另一名受试者的传播；减少受试者的住院治疗和/或住院治疗时间；增加患有流感病毒感染或与其相关的疾病的受试者的存活；消除流感病毒感染或与其相关的疾病；抑制或减少流感病毒复制；降低流感病毒滴度；和/或另一种疗法的一种或多种预防性或治疗性作用的增强或改善。在某些实施例中，有效量不会导致对流感病毒疾病的完全保护，但是会导致与未治疗的受试者相比流感病毒的滴度降低或数量减少。降低流感病毒的滴度、数量或总负担的益处包括但不限于感染症状的严重程度降低、感染症状减少和与感染相关的疾病的时间缩短。
如本文所用，术语“宿主”旨在是指其中已经引入载体(如克隆载体或表达载体)的生物体或细胞。该生物体或细胞可以是原核的或真核的。优选地，该宿主包括分离的宿主细胞，例如培养中的宿主细胞。术语“宿主细胞”仅表示细胞被修饰以用于本发明的多肽的(过)表达。应当理解，术语宿主旨在不仅是指特定的受试生物体或细胞，而且也指代这样的生物体或细胞的子代。因为由于突变或环境影响而在后续世代中可能发生某些修饰，事实上这样的子代可能与亲代生物体或细胞不同，但是仍然被包括在如本文所用的术语“宿主”的范围内。
如本文所用的术语“包括(included)”或“包括(including)”被视为后面有措辞“但不限于”。
如本文所用，术语“感染”意指通过流感病毒在细胞或受试者中繁殖和/或存在的入侵。在一个实施例中，感染是“活性”感染，即其中病毒在细胞或受试者中复制的感染。这样的感染的特征在于病毒从最初被病毒感染的细胞、组织和/或器官传播到其他细胞、组织和/或器官。感染还可以是潜伏性感染，即其中病毒不复制的感染。在某些实施例中，感染是指由于病毒在细胞或受试者中的存在或由于病毒对细胞或受试者的入侵而引起的病理状态。
流感病毒分为以下流感病毒类型：甲型、乙型和丙型。术语“亚型”具体地包括每种亚型内的所有个体“株系”，这些“株系”通常是由突变引起的并且显示不同的致病谱，包括天然分离株以及人造突变体或重配体等。此类株系还可以称为病毒亚型的各种“分离株”。因此，如本文所用，术语“株系”和“分离株”可以可互换地使用。当前人流感病毒株或分离株的命名法包括病毒的类型(属)(即甲型、乙型或丙型)、首次分离的地理位置、株系编号和分离年份。
如本文所用，术语“流感病毒疾病”是指由于流感病毒(例如甲型或乙型流感病毒)在细胞或受试者中的存在或流感病毒对细胞或受试者的入侵而引起的病理状态。在特定实施例中，该术语是指由流感病毒引起的呼吸系统疾病。
如本文所用，术语“核酸”旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸可以是单链的或双链的。如本领域技术人员应容易理解的，核酸分子可以进行化学或生物化学修饰或者可以含有非天然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(如不带电荷的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等))、侧链部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和经修饰的键(例如，α异头核酸等)。除非另有说明，否则提及核酸序列涵盖其互补序列。因此，提及具有特定序列的核酸分子应当被理解为涵盖具有其互补序列的其互补链。互补链还可用于例如反义疗法、杂交探针和PCR引物。
如本文所用，在某些实施例中，血凝素中氨基酸的编号是基于野生型流感病毒的血凝素中氨基酸的编号，例如流感毒株B/布里斯班/60/08(SEQ ID NO:1)的氨基酸的编号。如在本发明中所用，用语“氨基酸位置“x”因此意指与特定野生型流感病毒(例如B/布里斯班/60/08(SEQ ID NO:1))的血凝素中的位置x处的氨基酸对应的氨基酸。熟练技术人员应理解，其他流感病毒株和/或亚型中的等效氨基酸可以通过多重序列比对来确定。注意，在贯穿本申请所用的编号系统中，1是指未成熟血凝素蛋白(SEQ ID NO:1)的N末端氨基酸。成熟序列例如在SEQ ID NO:1的位置16处开始。熟练技术人员应理解，在生产期间指导蛋白质转运的前导序列(或信号序列)(例如对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-15)通常不存在于例如在疫苗中使用的最终多肽中。在某些实施例中，根据本发明的多肽因此包含没有前导序列的氨基酸序列，即该氨基酸序列是基于没有信号序列的血凝素的氨基酸序列。
如本领域技术人员已知的，“多肽”是指通过酰胺键连接的氨基酸的聚合物。如本文所用，该术语可以指代通过共价酰胺键连接的单条多肽链。该术语还可以指代通过非共价相互作用(如离子接触、氢键、范德华接触和疏水性接触)缔合的多条多肽链。本领域技术人员应认识到，该术语包括已经例如通过翻译后加工(如信号肽裂解、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接和O-连接的糖基化)、蛋白酶裂解和脂质修饰(例如S-棕榈酰化))修饰的多肽。
术语“载体”表示其中可以插入第二核酸分子以用于引入宿主中并在该宿主中复制，并且在某些情况下表达的核酸分子。换言之，载体能够转运与其连接的核酸分子。如本文所用的术语“载体”考虑克隆载体以及表达载体。载体包括但不限于质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)以及源自噬菌体或植物或动物(包括人)病毒的载体。载体包含被提出的宿主识别的复制起点，并且在表达载体的情况下，包含被宿主识别的启动子和其他调节区域。某些载体能够在其被引入的宿主中自主复制(例如，具有细菌复制起点的载体可以在细菌中复制)。其他载体可以在引入宿主细胞中后被整合到宿主的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。
如本文所用，在病毒的背景下的术语“野生型”是指流行、自然传播并且产生典型疾病爆发的流感病毒。
如本文所用，术语“聚糖基序”或“N-连接的糖基化基序”是指多肽的特定氨基酸基序，使得该特定氨基酸基序可以通过添加聚糖分子而被糖基化。N-连接的糖基化基序包含NxT/S(其中x不是P)的特定氨基酸基序。在其中N-连接的糖基化基序或聚糖基序被取代的多肽中，所列的氨基酸位置与NxT/S氨基酸基序的天冬酰胺相关。举例来说，在下述多肽中，对于位置136、137和151，将N和T引入多肽中，其中分别在位置136、137和151处引入N，并且在位置138、139和153处引入苏氨酸，而对于位置141，天冬酰胺(N)存在于野生型序列中，并且通过在位置143处引入苏氨酸来完成基序。
具体实施方式
流感病毒对全球公共卫生具有重大影响，造成每年数百万例的严重疾病、数千人死亡以及相当大的经济损失。当前的三价和四价流感疫苗会引发对疫苗株和密切相关的分离株的有效中和抗体反应，但是很少扩展到亚型内更多不同的株系或其他亚型。另外，对适当的疫苗株的选择呈现出许多挑战，并且经常产生次优保护作用。此外，目前无法预测下一大流行病毒的亚型，包括其出现的时间和地点。
血凝素(HA)是来自流感病毒的主要包膜糖蛋白，其是中和抗体的主要靶标。血凝素在进入过程期间具有两种主要功能。首先，血凝素通过与唾液酸受体的相互作用介导病毒附着于靶细胞的表面。其次，在病毒胞吞作用后，血凝素随后触发病毒膜与内体膜的融合，以将其基因组释放到靶细胞的细胞质中。HA包含约500个氨基酸的大胞外结构域，该胞外结构域被宿主来源的酶裂解以产生2个仍通过二硫键连接的多肽。大部分N末端片段(HA1，约320-330个氨基酸)形成膜远端球状结构域，该膜远端球状结构域含有受体结合位点和大多数被病毒中和抗体识别的决定子。较小的C末端部分(HA2，约180个氨基酸)形成茎状结构，该茎状结构将球状结构域锚定至细胞膜或病毒膜。HA1多肽之间的序列同源性程度小于HA2多肽之间的序列同源性程度。最保守的区域是裂解位点周围的序列，特别是HA2 N末端的氨基酸，该序列在所有甲型和乙型流感病毒亚型中是保守的。此区域的一部分在HA前体分子(HA0)中作为表面环暴露，但是当HA0裂解为HA1和HA2时变得无法接近(Lorieau等人,Proc.Natl.Acad.Aci.USA[美国国家科学院院刊]107:11341(2010))。
大多数中和抗体与围绕受体结合位点的环结合，并且干扰受体的结合和附着。由于这些环是高度可变的，因此靶向这些区域的大多数抗体具有株系特异性，从而解释了当前疫苗引发这样的有限的株系特异性免疫的原因。然而，近来，产生了针对流感病毒血凝素的具有广泛交叉中和效力的全人单克隆抗体。功能和结构分析已经揭示，这些抗体会干扰膜融合过程，并且针对流感HA蛋白的茎部结构域中高度保守的表位(Throsby等人,2008；Ekiert等人2009；WO 2008/028946；WO 2010/130636；WO 2013/007770)。
分离的突变型血凝素多肽
根据本发明，已经设计了新的分离的突变型血凝素多肽，其呈递用于被广泛保护抗体识别的表位。这些多肽可以用于产生基于表位的通用疫苗，该疫苗诱导针对广泛范围的流感毒株的保护。通过引入聚糖分子，多肽被稳定，然后高度可变且免疫显性的部分(即头部结构域)被屏蔽。头部可以具有多个聚糖来屏蔽表位被免疫系统识别，从而将免疫反应重定向到更保守的颈部和茎部结构域以产生广泛的保护性抗体。
本发明的分离的突变型血凝素多肽能够在不存在在膜远端头部结构域中存在的显性表位的情况下将保守表位呈递给免疫系统。为此，构成头部结构域的血凝素多肽的部分一级序列被聚糖分子屏蔽。通过引入使血凝素多肽其余部分的天然3维结构稳定的特定氨基酸取代来进一步修饰所得的多肽序列。
根据本发明，与相应的野生型流感病毒血凝素多肽(即该突变型血凝素多肽所基于的流感病毒)的氨基酸序列相比，该分离的突变型血凝素多肽包含一个或多个另外的突变，即在头部结构域、茎部结构域中的氨基酸取代和/或聚糖基序取代，和/或受体结合位点取代。
根据本发明的实施例，该分离的突变型血凝素多肽包含氨基酸取代、聚糖基序取代、受体结合位点取代和/或缺失突变。当提及取代和缺失突变时，提供了一个或多个取代和/或一个或多个缺失的一个或多个氨基酸位置。氨基酸位置对应于如本文提供的SEQ IDNO:1的氨基酸序列。举例来说，氨基酸位置227处的氨基酸取代将对应于SEQ ID NO:1的位置227处的赖氨酸(K)的氨基酸取代。另举例来说，氨基酸位置238处的氨基酸取代将对应于SEQ ID NO:1的位置238处的组氨酸的氨基酸取代。特定的氨基酸位置和残基可以根据特定流感毒株的起始血凝素多肽序列而变化；然而，本领域技术人员应能够进行序列比对以鉴定对应于SEQ ID NO:1上的位置的对应的氨基酸位置和残基。
在本发明的实施例中，特定氨基酸位置处的氨基酸取代将基于包括但不限于以下的因素来选择：空间位阻的可能性、电荷吸引、电荷排斥、氨基酸侧链的共同特性、二级和/或三级结构考虑和/或在各自的宿主细胞中的使用频率。本领域技术人员应理解在设计用于本发明的分离的突变型流感血凝素多肽的氨基酸取代时要考虑哪些因素。
在本发明的某些方面，本文提供了分离的突变型流感血凝素多肽，这些多肽包含在该多肽中的至少两个稳定突变，其中这些稳定突变包含以下位置处的取代突变：(a)氨基酸位置227和/或238；和/或(b)氨基酸位置384和/或476，其中氨基酸位置对应于SEQ IDNO:1的氨基酸位置。在某些实施例中，(a)氨基酸位置227被选自由以下组成的组的氨基酸取代：Q、N、F、I和Y，和/或氨基酸位置238被选自由以下组成的组的氨基酸取代：N、Q、I和F；和/或(b)氨基酸位置384被选自由以下组成的组的氨基酸取代：W、F、N、Q和I，和/或氨基酸位置476被选自由以下组成的组的氨基酸取代：W、F、Y、I、N和Q。在某些实施例中，(a)氨基酸位置227被Q取代并且氨基酸位置238被I取代；和/或(b)氨基酸位置384被I取代并且氨基酸位置476被I取代。
在某些实施例中，该分离的突变型流感血凝素多肽进一步包含在该多肽中的一个另外的稳定突变。该另外的稳定突变是氨基酸位置461处的取代，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸位置。在某些实施例中，氨基酸位置461被选自由以下组成的组的氨基酸取代：M、L、W、Y和R。在某些实施例中，氨基酸位置461被R取代。
该分离的突变型流感血凝素多肽可以例如包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40。该分离的突变型流感血凝素多肽可以例如包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:108的氨基酸序列。
在本发明的某些方面，该分离的突变型流感血凝素多肽进一步包含在该多肽的头部结构域中的至少一个另外的聚糖基序。该聚糖基序可以例如包含在至少一个选自由以下组成的组的氨基酸位置中的氨基(N)-连接的糖基化基序的取代：(a)136或137、(b)141和(c)151，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。该聚糖基序可以例如包含在氨基酸位置136和141、136和151、137和141、137和151或141和151处的该N-连接的糖基化基序的取代。在某些实施例中，该聚糖基序包含在氨基酸位置141和151处的该N-连接的糖基化基序的取代。在某些实施例中，该突变型流感血凝素多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45。
在本发明的某些方面，该分离的突变型流感血凝素多肽进一步包含或仅包含在该多肽中的受体结合位点突变。该受体结合位点突变可以例如包含在选自由以下组成的组的氨基酸位置处的突变：(a)175、(b)219、(c)257和(d)258，其中氨基酸位置对应于SEQ IDNO:1的氨基酸位置。在某些实施例中，(a)175被选自由以下组成的组的氨基酸取代：F、W和Y；(b)219被选自由以下组成的组的氨基酸取代：F、W、Y、R和E；(c)257被选自由以下组成的组的氨基酸取代：E、D、V、F；或(d)258被选自由以下组成的组的氨基酸取代：E、D、V和F。在某些实施例中，(a)175被W取代，(b)219被E取代，(c)257被E取代，或(d)258被E取代。在某些实施例中，该突变型流感血凝素多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:61。
在某些实施例中，该分离的突变型流感血凝素多肽进一步包含在位置136处的氨基酸取代，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
在本发明的某些方面，该分离的突变型流感血凝素多肽进一步包含或仅包含融合肽近端区(FPPR)缺失突变。该FPPR缺失突变可以例如包含在氨基酸位置369与382之间的至少三至七个氨基酸残基的缺失，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。该FPPR缺失突变可以例如包含选自由以下组成的组的缺失：Δ372-376、Δ372-378、Δ373-377、Δ373-376、Δ374-379、Δ374-376、Δ376-380和Δ377-381。在某些实施例中，该FPPR缺失突变是选自Δ372-376或Δ376-380的缺失。在某些实施例中，该突变型流感血凝素多肽包含选自SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
在某些实施例中，该分离的突变型血凝素多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQID NO:70、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84。
在某些实施例中，该突变型流感血凝素多肽进一步包含在氨基酸位置362处的裂解位点处的氨基酸取代，其中其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。在氨基酸位置362处的该裂解位点取代可以是例如Q。
在某些实施例中，该分离的突变型流感血凝素多肽源自乙型流感病毒的血凝素。特别地，该分离的突变型流感血凝素多肽可以源自来自B/山形谱系(如由B/山形/16/88代表)或来自B/维多利亚谱系(如由B/维多利亚/2/87代表)的乙型流感病毒的血凝素。在某些实施例中，该多肽源自B/布里斯班/60/08、B/爱荷华(Iowa)/06/2017或B/Lee/40。
在某些实施例中，该分离的突变型流感血凝素多肽可以包含异源三聚化结构域(例如，折叠子)。
在某些实施例中，该分离的突变型流感血凝素多肽进一步包含在从氨基酸532至氨基酸位置549的氨基酸位置处开始的羧基(C)末端截短，其中氨基酸位置对应于SEQ IDNO:1的氨基酸位置。在某些实施例中，该C末端截短在氨基酸位置532、534、536、539、541、543、545、547或549处开始，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
天然形式的流感血凝素(HA)作为三聚体存在于细胞或病毒膜上。在某些实施例中，去除细胞内和跨膜序列，使得在细胞中表达后产生分泌的(可溶性)多肽。已经描述了表达和纯化分泌的HA胞外结构域的方法(参见例如Dopheide等人2009；Ekiert等人2009,2011；Stevens等人2004,2006；Wilson等人1981)。本领域技术人员应理解，这些方法也可以直接应用于本发明的分离的突变型血凝素多肽，以便实现分泌的(可溶性)多肽的表达。因此，这些多肽也被涵盖在本发明中。
任选地，出于纯化目的，his-标签序列(HHHHHH(SEQ ID NO:85)或HHHHHHH(SEQ IDNO:86))可以与(任选地截短的)分离的突变型血凝素多肽连接，任选地通过接头连接。任选地，该接头可以含有蛋白水解裂解位点以在纯化后酶促去除his-标签。
在某些实施例中，通过在分离的突变型血凝素多肽的C末端处引入已知形成三聚体结构的序列(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:87))(任选地通过接头连接)来进一步稳定这些多肽。因此，在某些实施例中，该分离的突变型血凝素多肽的C末端部分已经被氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:87)替代，任选地通过接头连接。该接头可以含有用于随后根据本领域技术人员熟知的方案加工的裂解位点。为了促进可溶性形式的纯化，可以添加标签序列，例如组氨酸标签(HHHHHH(SEQ ID NO:85)或HHHHHHH(SEQ ID NO:86))或FLAG标签(DYKDDDDK)(SEQ ID NO:88)或这些的组合，任选地经由短接头连接。该接头可以任选地含有(部分)蛋白水解裂解位点，例如IEGR(SEQ ID NO:89)(因子X)或LVPRGS(SEQ ID NO:90)(凝血酶)，用于随后根据本领域技术人员熟知的方案加工。经加工的蛋白质也被涵盖在本发明中。
这些突变型流感血凝素多肽可以根据认为适合技术人员的任何技术(包括下述技术)来制备。
因此，本发明的免疫原性多肽可以通过本领域已知的标准方法合成为DNA序列，并且使用合适的限制酶和本领域已知的方法克隆并随后在体外或体内表达。因此，本发明还涉及编码上述多肽的核酸分子。本发明进一步涉及包含编码本发明的多肽的核酸的载体。在某些实施例中，根据本发明的核酸分子是载体(例如质粒)的一部分。此类载体可以通过本领域技术人员熟知的方法容易地操作，并且可以例如被设计为能够在原核和/或真核细胞中复制。另外，许多载体可以直接或以从其分离的所需片段的形式用于真核细胞的转化，并且将整个或部分整合到此类细胞的基因组中，从而产生在其基因组中包含所需核酸的稳定的宿主细胞。所使用的载体可以是适于克隆DNA并且可以用于转录目的核酸的任何载体。当使用宿主细胞时，优选该载体是整合载体。可替代地，该载体可以是游离复制载体。
本领域技术人员能够选择合适的表达载体，并且以功能性方式插入本发明的核酸序列。为了获得编码多肽的核酸序列的表达，本领域技术人员熟知，能够驱动表达的序列可以与编码该多肽的核酸序列功能性连接，从而产生编码呈可表达形式的蛋白质或多肽的重组核酸分子。通常，启动子序列位于应当被表达的序列的上游。许多表达载体在本领域是可获得的，例如英杰公司(Invitrogen)的pcDNA和pEF载体系列、来自BD科学公司(BDSciences)的pMSCV和pTK-Hyg、来自斯曲杰公司(Stratagene)的pCMV-Script等，它们可以用于获得合适的启动子和/或转录终止子序列、聚A序列等。在参考控制所编码多肽的转录和翻译的序列适当插入编码目的多肽的序列的情况下，所得的表达盒可用于产生目的多肽，称为表达。驱动表达的序列可以包括启动子、增强子等，及其组合。这些应当能够在宿主细胞中起作用，从而驱动与它们功能性连接的核酸序列的表达。本领域技术人员知道不同启动子可以用于获得基因在宿主细胞中的表达。启动子可以是组成型或调节型的，并且可以从不同来源(包括病毒、原核或真核来源)获得，或是人工设计的。目的核酸的表达可以来自天然启动子或其衍生物或者来自完全异源的启动子(Kaufman,2000)。在真核细胞中用于表达的一些熟知且常用的启动子包括源自病毒(如腺病毒)的启动子，例如E1A启动子；源自巨细胞病毒(CMV)的启动子，如CMV立即早期(IE)启动子(在本文中称为CMV启动子)(例如可从pcDNA获得，英杰公司)；源自猿猴病毒40(SV40)的启动子(Das等人,1985)等等。合适的启动子也可以源自真核细胞，如金属硫蛋白(MT)启动子、延伸因子1α(EF-1α)启动子(Gill等人,2001)、泛素C或UB6启动子(Gill等人,2001)、肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子等。对启动子功能和启动子强度的测试是本领域技术人员的常规工作，并且通常可以涵盖在启动子序列后克隆测试基因(如lacZ、萤光素酶、GFP等)，并且测试该测试基因的表达。当然，可以通过其中序列的缺失、添加、突变来改变启动子，并且测试其功能性，以发现新的、减毒的或改良的启动子序列。根据本发明，优选在选择的真核细胞中给出高转录水平的强启动子。
可以使用本领域技术人员熟知的方法将构建体转染到真核细胞(例如植物、真菌、酵母或动物细胞)或合适的原核表达系统(如大肠杆菌)中。在一些情况下，可以将合适的“标签”序列(像例如但不限于his-、myc-、strep-或flag-标签)或完全蛋白质(像例如但不限于麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽S转移酶)添加到本发明的序列上，以允许从细胞或上清液中纯化和/或鉴定多肽。任选地，可以包括含有特定蛋白水解位点的序列，以便之后通过蛋白水解消化去除标签。
可以通过本领域已知的光谱方法(例如圆二色光谱法、傅立叶变换红外光谱法和NMR光谱法或X射线晶体学)分析纯化的多肽，以研究所需结构(像螺旋和β折叠)的存在。ELISA、Octet和FACS等可以用于研究本发明的多肽与先前描述的广泛中和抗体(CR9114、CR8071、CR8033)(Dreyfus等人,Science[科学]337(6100):1343-8(2012))的结合。因此，可以选择具有正确构象的根据本发明的多肽。
药物组合物/免疫原性组合物和使用方法
本发明进一步涉及包含治疗有效量的至少一种本发明的多肽和/或核酸的免疫原性组合物。这些免疫原性组合物优选地进一步包含药学上可接受的载体。在本上下文中，术语“药学上可接受的”意指该载体在所采用的剂量和浓度下不会在它们施用的受试者中引起不必要或有害的影响。此类药学上可接受的载体和赋形剂是本领域熟知的(参见Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿制药科学],第18版,A.R.Gennaro编辑,Mack Publishing Company[麦克出版公司][1990]；Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides and Proteins[肽和蛋白质的药物配制品开发],S.Frokjaer和L.Hovgaard编辑,Taylor&Francis[泰勒弗朗西斯公司][2000]；和Handbook ofPharmaceutical Excipients[药用赋形剂手册],第3版,A.Kibbe编辑,PharmaceuticalPress[医药出版社][2000])。术语“载体”是指与组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液可以例如用作液体载体，特别是对于注射液而言。确切的配制品应当适合施用方式。这些多肽和/或核酸分子优选地作为无菌溶液配制和施用。通过无菌过滤或通过本领域已知的其他方法制备无菌溶液。然后可以将这些溶液冻干或填充到药物剂量容器中。溶液的pH通常在pH 3.0至9.5(例如pH 5.0至7.5)的范围内。
本发明还涉及用于诱导针对流感HA蛋白的免疫反应的如上所述的流感突变型血凝素多肽、核酸分子和/或载体。本发明还涉及用于在受试者中诱导免疫反应的方法，该方法包括向受试者施用如上所述的多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物。根据本发明的受试者优选地是能够感染传染性疾病致病因子(特别是流感病毒)或以其他方式可以从诱导免疫反应受益的哺乳动物，此类受试者例如是啮齿类动物(例如小鼠、白鼬)，或是家畜或农场动物，或是非人类灵长类动物，或是人。优选地，该受试者是人类受试者。因此，本发明提供了用于利用本文所述的多肽、核酸和/或免疫原性组合物在受试者中诱导对流感病毒血凝素(HA)的免疫反应的方法。
由于熟知小蛋白质和/或核酸分子并不总是有效地诱导有效的免疫反应，因此可能有必要通过添加佐剂来增加多肽和/或核酸分子的免疫原性。在某些实施例中，本文所述的免疫原性组合物包含佐剂或与佐剂组合施用。用于与本文所述的组合物组合施用的佐剂可以在所述组合物施用之前、同时或之后施用。合适的佐剂的实例包括铝盐，如氢氧化铝和/或磷酸铝；油-乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，如MF59(参见例如WO90/14837)；皂苷配制品，像例如QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如US 5,057,540；WO 90/03184；WO 96/11711；WO 2004/004762；WO 2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例是单磷酰脂质A(MPL)、3-O-脱酰基化MPL(3dMPL)、含CpG基序的寡核苷酸、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体，如大肠杆菌热不稳定性肠毒素LT、霍乱毒素CT、百日咳毒素PT或破伤风类毒素TT、基质M(伊斯克诺瓦公司(Isconova))。另外，可以使用已知的免疫增强技术，如将本发明的多肽与本领域已知的增强免疫反应的蛋白质(例如破伤风类毒素、CRM197、rCTB、细菌鞭毛蛋白等)融合，或将这些多肽包括在病毒体中，或其组合。可以使用的其他非限制性实例例如由Coffman等人(2010)披露。
在一个实施例中，将本发明的流感突变型血凝素多肽掺入病毒样颗粒(VLP)载体中。VLP通常包含通常源自病毒的一种或多种结构蛋白的一种或多种病毒多肽。优选地，这些VLP不能复制。在某些实施例中，这些VLP可以缺乏病毒的完整基因组或包含病毒基因组的一部分。在一些实施例中，这些VLP不能感染细胞。在一些实施例中，这些VLP在其表面上表达本领域技术人员已知的一种或多种病毒(例如，病毒表面糖蛋白)或非病毒(例如，抗体或蛋白质)靶向部分。
在一个特定实施例中，将本发明的多肽掺入病毒体中。可以使用本领域技术人员已知的技术产生含有根据本发明的多肽的病毒体。例如，可以通过破坏纯化的病毒、提取基因组并且用病毒蛋白(例如，本文所述的突变型流感血凝素多肽)和脂质重新组装颗粒以形成含有病毒蛋白的脂质颗粒来产生病毒体。
本发明还涉及用于在受试者中诱导针对流感HA的免疫反应、特别是用作疫苗的上述多肽、核酸和/或免疫原性组合物。因此，本文所述的流感突变型血凝素多肽、编码此类多肽的核酸或包含此类核酸或多肽的载体可以用于引发针对流感病毒(例如，针对流感病毒血凝素的颈部或茎部结构域)的保护性抗体。本发明特别涉及用作预防和/或治疗由流感病毒引起的疾病或病症的疫苗的如上所述的多肽、核酸和/或免疫原性组合物。
本发明的多肽可以在体外或在合适的细胞表达系统(包括细菌和真核细胞)中合成后使用，或者可替代地，可以通过表达编码该免疫原性多肽的核酸在有需要的受试者体内表达。此类核酸疫苗可以采取任何形式，包括裸DNA、质粒或病毒载体(包括腺病毒载体)。
根据本发明的多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物的施用可以使用标准的施用途径来进行。非限制性实例包括肠胃外施用(如静脉内、皮内、透皮、肌内、皮下等)，或粘膜施用(例如鼻内、经口等)。熟练技术人员应能够确定施用根据本发明的多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物以便诱导免疫反应的各种可能性。在某些实施例中，将该多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物(或疫苗)施用一次以上，即以所谓的同源初免-加强方案进行施用。在将该多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物施用一次以上的某些实施例中，第二剂的施用可以例如在该多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物的第一剂施用后一周或更长时间、在第一剂施用后两周或更长时间、在第一剂施用后三周或更长时间、在第一剂施用后一个月或更长时间、在第一剂施用后六周或更长时间、在第一剂施用后两个月或更长时间、在第一剂施用后3个月或更长时间、在第一剂施用后4个月或更长时间等直到在第一剂施用后数年的时间间隔后进行。也可以将该疫苗施用两次以上，例如三次、四次等，使得在首次初免施用后再进行一次以上的加强施用。在其他实施例中，将根据本发明的多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物仅施用一次。
这些多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物还可以在异源初免-加强方案中作为初免来施用或作为加强来施用。
本发明进一步提供了用于利用本文所述的多肽、核酸和/或组合物预防和/或治疗受试者的流感病毒疾病的方法。在一个特定实施例中，用于预防和/或治疗受试者的流感病毒疾病的方法包括向有需要的受试者施用有效量的如上所述的多肽、核酸和/或免疫原性组合物。治疗有效量是指如本文所定义的多肽、核酸和/或组合物有效预防、缓解和/或治疗由于感染流感病毒而引起的疾病或病症的量。预防涵盖抑制或减少流感病毒的传播或者抑制或减少与流感病毒感染相关的一种或多种症状的发作、发展或进展。如本文所用的缓解可以指代减少流感感染的可见或可察觉的疾病症状、病毒血症或任何其他可测量的表现形式。
需要治疗的那些受试者包括已经患有由于感染流感病毒而引起的病症的那些，以及其中要预防感染流感病毒的那些。因此，可以将本发明的多肽、核酸和/或组合物施用于原初受试者，即未患有由流感病毒感染引起的疾病或尚未感染流感病毒感染和当前未感染流感病毒感染的受试者，或者施用于已经感染和/或已经感染了流感病毒的受试者。
在一个实施例中，预防和/或治疗可以针对易受流感病毒感染的患者群组。此类患者群组包括但不限于例如老年人(例如≥50岁、≥60岁、优选≥65岁)、年幼者(例如≤5岁、≤1岁)、住院治疗的患者以及已经用抗病毒化合物进行治疗但是已经显示出不充分抗病毒反应的患者。
在另一个实施例中，可以将这些多肽、核酸和/或免疫原性组合物与一种或多种其他活性剂(如现有的或未来的流感疫苗、单克隆抗体和/或抗病毒剂、和/或抗菌剂、和/或免疫调节剂)组合施用于受试者。该一种或多种其他活性剂可以有益于治疗和/或预防流感病毒疾病或者可以缓解与流感病毒疾病相关的症状或病症。在一些实施例中，该一种或多种其他活性剂是疼痛缓解剂、抗热药剂或者缓和或协助呼吸的治疗剂。
可以调整本发明的多肽和/或核酸分子的剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。合适的剂量范围可以例如是0.1-100mg/kg体重、优选1-50mg/kg体重、优选0.5-15mg/kg体重。要采用的多肽和/或核酸分子的精确剂量将例如取决于施用途径和由它引起的感染或疾病的严重程度，并且应当根据从业者的判断和每名受试者的情况来决定。例如，有效剂量根据靶标部位、患者的生理状态(包括年龄、体重、健康状况)以及治疗是预防性还是治疗性而变化。通常，该患者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。将治疗剂量进行最佳调整以优化安全性和功效。
本发明的多肽还可以用于验证被鉴定为潜在治疗候选物的单克隆抗体的结合。另外，本发明的多肽可以用作诊断工具，例如通过确定这样的个体的血清中是否存在能够结合本发明的多肽的抗体来测试个体的免疫状态。因此,本发明还涉及用于检测患者中流感感染的存在的体外诊断方法，所述方法包括以下步骤：a)使获得自所述患者的生物样品与根据本发明的多肽接触；以及b)检测抗体-抗原复合物的存在。
本发明的多肽还可以用于鉴定新的结合分子或改善现有的结合分子，如单克隆抗体和抗病毒剂。
在以下实例和附图中进一步说明了本发明。这些实例并不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
本发明还提供了以下非限制性实施例：
实施例1是一种分离的突变型流感血凝素多肽，该多肽包含在该多肽中的至少两个稳定突变，其中这些稳定突变包含以下位置处的取代突变：
a.氨基酸位置227和/或238；和/或
b.氨基酸位置384和/或476，
其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
实施例2是如实施例1所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中
a.氨基酸位置227被选自由以下组成的组的氨基酸取代：Q、N、F、I和Y，和/或氨基酸位置238被选自由以下组成的组的氨基酸取代：N、Q、I和F；和/或
b.氨基酸位置384被选自由以下组成的组的氨基酸取代：W、F、N、Q和I，和/或氨基酸位置476被选自由以下组成的组的氨基酸取代：W、F、Y、I、N和Q。
实施例3是如实施例2所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中
a.氨基酸位置227被Q取代并且氨基酸位置238被I取代；和/或
b.氨基酸位置384被I取代并且氨基酸位置476被I取代。
实施例4是如实施例1至3中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，该多肽进一步包含在该多肽中的一个稳定突变，其中该稳定突变是氨基酸位置461处的取代，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸位置。
实施例5是如实施例4所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中氨基酸位置461被选自由以下组成的组的氨基酸取代：M、L、W、Y和R。
实施例6是如实施例5所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中氨基酸位置461被R取代。
实施例7是如实施例3所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:39或SEQID NO:40。
实施例8是如实施例6所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
实施例9是如实施例1至8中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，该多肽进一步包含在该多肽的头部结构域中的至少一个另外的聚糖基序。
实施例10是如实施例9所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该聚糖基序包含在至少一个选自由以下组成的组的氨基酸位置中的氨基(N)-连接的糖基化基序的取代：
a.136或137、
b.141和
c.151，
其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
实施例11是如实施例10所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该聚糖基序包含在氨基酸位置136和141、136和151、137和141、137和151或141和151处的该N-连接的糖基化基序的取代。
实施例12是如实施例11所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该聚糖基序包含在氨基酸位置141和151处的该N-连接的糖基化基序的取代。
实施例13是如实施例10所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45。
实施例14是如实施例1至13中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，该多肽进一步包含在该多肽中的受体结合位点突变。
实施例15是如实施例14所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该受体结合位点突变包含在选自由以下组成的组的氨基酸位置处的取代：
a.175、
b.219、
c.257和
d.258，
其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
实施例16是如实施例15所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中
a.175被选自由以下组成的组的氨基酸取代：F、W和Y；
b.219被选自由以下组成的组的氨基酸取代：F、W、Y、R和E；
c.257被选自由以下组成的组的氨基酸取代：E、D、V、F；或
d.258被选自由以下组成的组的氨基酸取代：E、D、V和F。
实施例17是如实施例16所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中
a.175被W取代，
b.219被E取代，
c.257被E取代，或
d.258被E取代。
实施例18是如实施例17所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:61。
实施例19是如实施例14-18中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该多肽进一步包含在位置136处的氨基酸取代，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
实施例20是如实施例1-19中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，该多肽进一步包含融合肽近端区(FPPR)缺失突变。
实施例21是如实施例20所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该FPPR缺失突变包含在氨基酸位置369与382之间的至少三至七个氨基酸残基的缺失，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
实施例22是如实施例21所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该FPPR缺失突变包含选自由以下组成的组的缺失：Δ372-376、Δ372-378、Δ373-377、Δ373-376、Δ374-379、Δ374-376、Δ376-380和Δ377-381。
实施例23是如实施例22所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该FPPR缺失突变包含选自Δ372-376或Δ376-380的缺失。
实施例24是如实施例23所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽包含选自SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
实施例25是如实施例1-24中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型血凝素多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84。
实施例26是一种分离的突变型流感血凝素多肽，该多肽包含融合肽近端区(FPPR)缺失突变，其中该FPPR缺失突变包含在氨基酸位置369与382之间的至少三至七个氨基酸残基的缺失，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
实施例27是如实施例26所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该FPPR缺失突变包含选自由以下组成的组的缺失：Δ372-376、Δ372-378、Δ373-377、Δ373-376、Δ374-379、Δ374-376、Δ376-380和Δ377-381。
实施例28是如实施例26或27所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该FPPR缺失突变包含选自Δ372-376或Δ376-380的缺失。
实施例29是如实施例28所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽包含选自SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
实施例30是一种分离的突变型流感血凝素多肽，该多肽包含在该多肽中的受体结合位点突变，其中该受体结合位点突变包含在选自由以下组成的组的氨基酸位置处的取代突变：
a.175、
b.219、
c.257和
d.258，
其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
实施例31是如实施例30所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中
a.175被选自由以下组成的组的氨基酸取代：F、W和Y；
b.219被选自由以下组成的组的氨基酸取代：F、W、Y、R和E；
c.257被选自由以下组成的组的氨基酸取代：E、D、V、F；或
d.258被选自由以下组成的组的氨基酸取代：E、D、V和F。
实施例32是如实施例31所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中
a.175被W取代，
b.219被E取代，
c.257被E取代，或
d.258被E取代。
实施例33是如实施例32所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:61。
实施例34是如实施例30-33中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该多肽进一步包含在氨基酸位置136处的氨基酸取代，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
实施例35是如实施例1至17、19至23、26至28、30至32或34中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽包含异源三聚化结构域。
实施例36是如实施例1至34中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽进一步包含在从氨基酸532至氨基酸位置549的氨基酸位置处开始的羧基(C)末端截短，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
实施例37是如实施例36所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该C末端截短在氨基酸位置532、534、536、539、541、543、545、547或549处开始。
实施例38是如实施例1-37中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽进一步包含在氨基酸位置362处的裂解位点处的氨基酸取代，其中其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
实施例39是如实施例38所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中氨基酸位置362被Q取代。
实施例40是一种分离的核酸，该分离的核酸编码如实施例1-39中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽。
实施例41是一种载体，该载体包含如实施例40所述的分离的核酸。
实施例42是一种宿主细胞，该宿主细胞包含如实施例41所述的载体。
实施例43是一种药物组合物，该药物组合物包含如实施例1-39中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽、和药学上可接受的载体。
实施例44是一种药物组合物，该药物组合物包含如实施例40所述的分离的核酸。
实施例45是一种药物组合物，该药物组合物包含如实施例41所述的载体。
实施例46是一种在有需要的受试者中诱导针对流感病毒的免疫反应的方法，该方法包括向该有需要的受试者施用如实施例43至45中任一项所述的药物组合物。
实施例47是一种产生分离的突变型流感血凝素多肽的方法，该方法包括在能够产生该突变型流感血凝素多肽的条件下培养如实施例42所述的宿主细胞，以及从该细胞或培养物中回收该突变型流感血凝素多肽。
实施例48是一种产生如实施例43所述的药物组合物的方法，该方法包括将该分离的突变型流感多肽与药学上可接受的载体合并。
实例
表1.标准氨基酸、缩写和特性
Figure BDA0003584249810000301
Figure BDA0003584249810000311
实例1：基于茎部的多肽-结构和设计要素。
表示流感病毒血凝素(HA0)的胞外结构域的多肽序列中改变的结构和位置示于图1A中。当表达为可溶性胞外结构域时，多肽被羧基(C)末端截短；例如在SEQ ID NO:1的位置536处，因为注意到对于UFV180846(SEQ ID NO:2)，该多肽只有535个氨基酸)，省略了天然C末端跨膜和胞质结构域(氨基酸550-585)。注意，对于氨基酸位置的编号，使用野生型HA B/布里斯班/60/08(SEQ ID NO:1)编号并且包括信号肽(残基1-15)。
为了稳定HA、增加表达并且确保与亲代野生型全长HA类似的正确折叠和三聚化，在多肽的位置227、238、384、461和476处引入取代(图1A-图1B)。
为了改善广泛结合抗体(例如mAb CR9114(如WO2013/007770中所述))对HA茎部表位的可及性，在某些多肽中，包含融合近端区(FPPR，氨基酸362-382)的柔性环的长度减少了约5个氨基酸。
为了阻止受体或抗体与某些多肽中的HA头部结构域的溶剂暴露表面结合，保守的受体结合位点(RBS)被取代(Q257E)和/或一个或多个氨基酸残基被取代以引入氨基(N)-连接的糖基化基序(NxS/T，然而x不是P，即在位置136、141和151处)，或者可替代地被取代为带电荷的残基(即在位置136和257处)。
通过将位置362(图1B)处的天然一元裂解位点氨基酸精氨酸(R)取代为例如谷氨酰胺(Q)，多肽可以对胰蛋白酶样蛋白酶裂解具有抗性。与天然融合前HA相比，包括R329Q取代的本发明的多肽对胰蛋白酶样蛋白酶具有抗性并且不能再被裂解。如果没有裂解成HA1和HA2，流感病毒血凝素蛋白不能经历构象变化到融合后状态，并且随后不能介导病毒融合。
实例2：稳定突变的表征。
设计
可溶性多肽表示乙型流感的流感病毒血凝素(HA)。在位置461处(图2B)、在位置227和238处(图2C)并且在位置384和476处(图2D)测试旨在稳定和改善多肽折叠的多个残基取代。在Expi293F细胞培养上清液中评估多肽的表达和折叠。
哺乳动物细胞中的蛋白质表达
合成编码多肽的DNA片段(金斯瑞公司(Genscript)；新泽西州皮斯卡塔韦)，并且将其克隆到pcDNA2004表达载体(具有增强型CMV启动子的经修饰pcDNA3质粒)中。
多肽含有羧基(C)末端折叠子三聚化结构域(除了UFV171348(SEQ ID NO:39)和UFV171387(SEQ ID NO:40)之外)和用于筛选目的和纯化的FLAG-接头-His标签。它们是以微量规模(200μL)在真核悬浮细胞系Expi293F中产生的。简言之，使用ExpiFectamine 293转染试剂盒(Gibco，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)；马萨诸塞州沃尔瑟姆)将细胞用工业级DNA在96半深孔板(System Duetz)中以2.5x10E+06vc/mL的细胞密度进行瞬时转染，并且在Expi293表达培养基(Gibco，赛默飞世尔科技公司)中在37℃、250rpm、8％CO2和75％湿度下进行孵育。在第3天收获含有分泌的多肽的细胞培养上清液，并且将其通过离心(在400xg下10分钟)，然后过滤(96孔滤板，0.22μm PVDF膜，康宁公司(Corning)；纽约康宁)进行澄清。
培养上清液分析
通过放大发光邻近均相测定(AlphaLISA，图2B-图2D)根据制造商的说明书(珀金埃尔默公司(PerkinElmer)；马萨诸塞州沃尔瑟姆)来评估多肽的表达和折叠。这种溶液中和结合中的平衡测定法是基于供体和受体珠粒二者经由特异性抗体与多肽的成功结合。当紧密靠近时，在680nm处激光辐照供体珠粒会产生单线态氧流，触发附近受体珠粒中的化学事件，从而导致615nm处的化学发光发射。通过向细胞培养上清液中同时添加镍供体珠粒(与His标签结合/复合)和与针对FLAG标签的抗体结合的珠粒，经由表达-AlphaLISA装置测量表达水平。此表达-AlphaLISA装置识别C末端FLAG-接头-His标签，而不论多肽的折叠如何。通过向细胞培养上清液中同时添加镍供体珠粒、浓度为2nM的人IgG抗体CR9114(如WO2013/007770中所述)和抗人IgG受体珠粒，在结合-AlphaLISA中评估多肽的正确折叠。只有当多肽正确折叠并且允许流感病毒HA特异性IgG结合时，才能获得信号。
对于所有AlphaLISA装置，均以10μg/mL的浓度添加检测珠粒。根据制造商的说明书，在不同稀释度下测试培养上清液以避免钩状效应。在室温下在暗处孵育后2小时，使用EnSightTM多模式读板器(珀金埃尔默公司)进行读数。将数据相对于参考构建体UFV170090(SEQ ID NO:3)(包括折叠子三聚化结构域和FLAG-接头-His标签的野生型HA B/布里斯班/60/08(SEQ ID NO:1))(其设置为100％)归一化。
通过差示扫描荧光测定法(DSF)经由监测添加到培养上清液中的Sypro Orange染料(赛默飞世尔科技公司)的荧光发射来确定多肽的热稳定性。随着温度从25℃逐渐升高至95℃(60℃/小时)，多肽去折叠并且荧光染料与暴露的疏水性残基结合，这导致了发射的特征改变。使用ViiA7实时PCR机(应用生物系统公司(Applied BioSystems)；加利福尼亚州费城)测量解链曲线，并且通过Spotfire套件(泰必高软件公司(Tibco Software Inc.)；加利福尼亚州帕洛阿尔托)计算Tm50值。Tm50值表示50％的蛋白质去折叠时的温度，因此是多肽温度稳定性的量度。
使用Vanquish系统(赛默飞世尔科技公司)和BEH 200A柱(沃特斯公司(Waters)，注射体积40μL，流量0.35mL/min)通过超高效液相色谱法(UHPLC)中的分析型尺寸排阻色谱法(SEC)来评估Expi293F细胞培养收获物中已表达的多肽的含量。通过Helios光散射检测器(怀雅特科技公司(Wyatt Technology)；加利福尼亚州戈利塔)来监测洗脱。通过Astra 6软件包(怀雅特科技公司)分析SEC图谱。
结果与结论
除了色氨酸(UFV171702，SEQ ID NO:6)导致mAb CR9114结合降低约40％之外，大多数在位置461处的替代性氨基酸都是良好耐受的(图2B)。在位置461处包括精氨酸残基的多肽UFV171741(SEQ ID NO:8)展示了mAb CR9114结合的约2.8倍的增加。对于所测试的氨基酸，在位置227处的残基的取代导致CR9114结合增加约1.5倍，然而在位置238处的取代不影响抗体结合(图2C)。在这些位置处的谷氨酰胺和异亮氨酸的组合分别导致CR9114结合显著增加(约2.5倍)。向位置384引入取代导致CR9114结合降低3至4倍，然而在位置476处的取代是良好耐受的或导致结合水平适度增加(UFV170550(SEQ ID NO:29)和UFV170551(SEQID NO::30))。两个残基均被取代的多肽展示了CR9114结合的显著降低，除非当两个残基均被取代为异亮氨酸。此组合(UFV170556(SEQ ID NO:35))展示了CR9114结合的约2.3倍的增加(图2C)。如通过DSF所确定的多肽的温度稳定性表明，在引入Q227和I238取代(UFV170525(SEQ ID NO:19)相比于UFV170090(SEQ ID NO:3))后，Tm50增加了3.9℃，然而表达水平没有受到显著影响(图2D)。
没有观察到取代I384和I476对温度稳定性的显著影响(降低0.5℃)，然而，包括这些突变的多肽(UFV170556(SEQ ID NO:35))展示了增加的表达水平(约1.4倍)和CR9114的结合增加(约2倍)。去除折叠子三聚化结构域还导致表达水平增加(UFV171348(SEQ ID NO:39))相比于UFV170556(SEQ ID NO:35))，然而，观察到CR9114结合降低。在位置227、238、384和476处的所有四(4)个有利取代的组合产生表达良好(相对于参考增加2倍)和良好结合CR9114(相对于参考增加约1.7倍)的多肽。引人注目的是，该多肽非常稳定(Tm50为64.7℃，比亲代构建体高5.2℃)，并且在不存在折叠子三聚化结构域的情况下表达为可溶性三聚体多肽(图2F)。
综上所述，结果表明，通过取代HA核心中的四(4)个残基，产生了在不存在异源三聚化结构域的情况下形成可溶性三聚体的多肽，这代表野生型乙型流感HA的正确折叠和稳定的融合前构象。
实例3：添加到头部结构域中的N-连接的糖基化基序的表征。
设计
在不同位置处，将N-连接的糖基化基序NxT/S(其中x不是P)引入多肽的头部结构域中。对于位置136、137和151，引入N和T，然而对于位置141，天冬酰胺存在于野生型序列中，并且通过在位置143处引入苏氨酸来完成基序(图3A)。
培养上清液分析
如实例2中所述合成编码本发明多肽的DNA片段。在真核悬浮细胞系Expi293F中以微量规模(200μL)产生包括用于筛选目的和纯化的FLAG-接头-His标签的多肽。表达具有折叠子三聚化结构域的UFV171472(SEQ ID NO:43)，表达不具有折叠子三聚化结构域的其他多肽。
如实例2中所述，通过AlphaLISA评估本发明多肽的表达和折叠。分别在1.5nM和2nM的浓度下进行CR8071(Dreyfus等人,Science[科学]337(6100):1343-8(2012))和SD84(Laursen等人,Science[科学]362(6414):598-602(2018))的结合。使用三聚体-AlphaLISA装置来确定培养上清液中存在的三聚体多肽的含量。三聚体-AlphaLISA测定依赖于与单体HA特异性结合的人IgG，如46B8C(WO2015/148806A1)。如果将不同标记的46B8C(生物素或DIG标记)的1:1混合物添加到HA中，则仅当允许至少两种抗体结合的多聚体存在时才检测到AlphaLISA信号。先前已表明，此三聚体-AlphaLISA装置优选地检测三聚体并且对二聚体、多聚体或单体不敏感。在生物素化的和DIG标记的46B8C IgG(各自以1nM)存在下，通过向培养上清液中同时添加链霉亲和素供体珠粒和抗DIG IgG受体珠粒进行三聚体-AlphaLISA。将多肽UFV171991(SEQ ID NO:45)、UFV171992(SEQ ID NO:44)和UFV171993(SEQ ID NO:42)的数据相对于参考构建体UFV171990(SEQ ID NO:41)(表示稳定B/布里斯班/60/08HA)归一化。对于多肽UFV171472(SEQ ID NO:43)，将数据相对于参考构建体UFV170090(SEQ ID NO:3)(包括折叠子三聚化结构域的野生型HA B/布里斯班/60/08)归一化。将参考构建体设置为100％。
结果与结论
在位置136、137、141或151处向本发明多肽的头部结构域中引入另外的N-连接的糖基化基序是可能的(图3B)，并且仅观察到表达水平的最小降低(至多UFV171472(SEQ IDNO:43)的约30％)。茎部(CR9114)和颈部(CR8071)特异性抗体的结合得到维持，然而观察到头部结构域特异性结合剂SD84的预期降低。对于在位置137(UFV171472，SEQ ID NO:43)或位置151(UFV171991，SEQ ID NO:45)处引入了N-连接的聚糖的多肽，观察到SD84结合的最大降低。相对于不具有另外的N-连接的糖基化位点的多肽，SD84的头部结合分别降低了40％和52％。
实例4：受体结合位点修饰的表征。
设计
为了降低保守受体与其天然配体唾液酸结合的亲和力以及为了改变受体结合位点内和周围的头部结合抗体的保守表位，将点取代引入本文披露的多肽中。在位置175处，引入替代性疏水性残基，然而对于位置219、257和258，评价疏水性残基和带电荷的残基二者(图4A)。
培养上清液分析
如实例2中所述合成编码多肽的DNA片段。在真核悬浮细胞系Expi293F中以微量规模(200μL)产生包括用于筛选目的的FLAG-接头-His标签的多肽。如实例2和3中所述，通过AlphaLISA评估多肽的表达和折叠。将数据相对于参考构建体UFV171990(SEQ ID NO:41)(表示包括FLAG-接头-His标签的稳定B/布里斯班/60/08HA)(其设置为100％)归一化。
结果与结论
与参考相比，在受体结合位点附近或内具有改变的残基的所有多肽都展示了降低的表达水平(图4B)。在位置219和258处的取代是最差耐受的；UFV172072(SEQ ID NO:54)和UFV172064(SEQ ID NO:46)是最低(11％)和最高(56％)表达的多肽。关于蛋白质表达，在位置175和257处的取代被更好地接受。多肽UFV172073(SEQ ID NO:55)、UFV172075(SEQ IDNO:57)和UFV172078(SEQ ID NO:60)受到的影响最小，并且达到相对于参考的75％、70％和74％的水平。类似地，这三种多肽展示了最高的三聚体含量；分别为90％、89％和78％。此外，茎部结合单克隆抗体CR9114的结合得到保留(71％-94％)，而头部结构域特异性SD84的结合显著改变；UFV172073(SEQ ID NO:55)几乎不结合(17％)，而UFV172075(SEQ ID NO:57)展示了结合的显著增加(579％)。对于在位置175处具有取代的UFV172078(SEQ ID NO:60)，SD84的结合仅受到最小的影响(74％)。
总体而言，受体结合位点内和周围的取代不是良好耐受的。包括257E、257V或175W取代的多肽展示了表达水平、三聚体含量和mAb CR9114的结合的小但可接受的降低。这些多肽的唯一观察到的差异是SD84的结合。
实例5：在本发明的多肽中融合肽近端区(FPPR)缺失的表征。
设计
在位置362处的HA0裂解位点之后的结构上未定义的环的残基被称为融合肽近端区(FPPR，残基369-383，图1A和图5A)。评价包含不同长度(从3至7个残基)和位置的FPPR缺失的多肽，目的是增加HA稳定性和保守茎部表位的可及性。
培养上清液分析
如实例2中所述合成编码多肽的DNA片段。在真核悬浮细胞系Expi293F中以微量规模(200μL)产生包括用于筛选目的的FLAG-接头-His标签的多肽。如实例2和3中所述，通过AlphaLISA评估多肽的表达和折叠。将数据相对于参考构建体UFV171990(SEQ ID NO:41)(表示包括FLAG-接头-His标签的稳定B/布里斯班/60/08HA)(其设置为100％)归一化。
结果与结论
FPPR的部分缺失没有显著改变蛋白质表达水平(83％-110％，图5B)。与参考相比，对于两种多肽UFV172680(SEQ ID NO:63)和UFV172683(SEQ ID NO:65)，观察到三聚体形成降低约2倍，然而所有其他多肽显示出类似的三聚体含量。对于茎部特异性mAb CR9114的结合，观察到更大的差异。UFV172690(SEQ ID NO:69)与参考相比具有24％的CR9114结合，显示出最低的结合，这表明超过位置380的缺失不是良好耐受的。与参考相比，UFV172680(SEQID NO:63)、UFV172683(SEQ ID NO:65)和UFV172691(SEQ ID NO:68)也展示了CR9114结合的降低，分别为55％、66％和74％。颈部特异性mAb CR8071的结合受到的影响最小，并且与参考相比，相对结合在67％至104％的范围内。头部结构域特异性SD84的结合展示了更大的结合分布；具有7个氨基酸的缺失的UFV172683(SEQ ID NO:65)显示出最低的结合(43％)，而UFV172686(SEQ ID NO:66)展示了最高的结合(167％)。
总体而言，FPPR的部分缺失是良好耐受的；表达水平、三聚体形成和正确折叠得以维持或显示出最小的降低，即使去除此高度保守环的多达7个氨基酸。当缺失到达位置381时，CR9114的折叠明显受损，这可能太接近保守的HA茎部表位。多肽UFV172680(SEQ ID NO:63)和UFV172683(SEQ ID NO:65)显示出对所评估的所有抗体的结合降低。
实例6：C末端处的替代性截短
设计
血凝素是位于病毒颗粒和感染细胞的表面的一种膜蛋白，该蛋白质的C末端部分嵌入病毒膜中。对于多肽的可溶形式，通过在跨膜结构域(TM)的起点处截短而使跨膜结构域缺失。另外，在稳定HA B/布里斯班/60/08参考多肽UFV180284(SEQ ID NO:70)中评价替代性截短位置。表达不具有折叠子三聚化结构域并且包括C-标签的参考多肽，然而具有替代性C末端截短的变体被表达为无标签的可溶性三聚体多肽(表2)。
表2.多肽的替代性C末端截短，源自来自B/布里斯班/60/08的HA的胞外结构域。“-”指示在位置533与552之间截短的残基。“TM”代表跨膜结构域。
推定的N-聚糖位点在氨基酸位置533和546处突出显示。
Figure BDA0003584249810000391
培养上清液分析
如实例2和4中所述，合成编码表2中所列多肽的DNA片段，并且将其在EXPI-293细胞培养物中表达。如实例2中所述，通过分析型SEC使用HPLC分析收获的培养上清液中表达的三聚体多肽的存在。
结果与结论
通过SEC对培养上清液的分析表明，所测试的所有构建体都有一个主峰(约6.5分钟保留时间)，对应于多肽的三聚体形式(图6)。观察到替代性C末端截短对三聚体多肽的表达水平的最小影响；对于UFV180461(SEQ ID NO:78)和UFV180462(SEQ ID NO:79)，仅观察到三聚体峰高的轻微降低，与参考UFV180284(SEQ ID NO:70)相比约20％峰高。此外，观察到尺寸排阻柱中的保留时间逐渐增加，这与逐步截短C末端后多肽三聚体大小的减小相关。保留时间的变化可能通过去除位置533和/或546处的两个假定的N-连接的糖基化天冬酰胺而得到增强。
总之，本发明多肽的残基533与549之间的C末端截短是良好耐受的，并且仅观察到对三聚体乙型流感HA的表达水平的轻微影响。
实例7：本发明的三聚体多肽的表达、纯化和体外表征。
设计
为了表征另外的N-连接的糖基化基序、受体结合位点(RBS)取代和融合肽近端区中的缺失的组合，在不存在折叠子三聚化结构域的情况下将它们引入稳定HA B/布里斯班/60/08中。在没有引入N-连接的糖基化基序的多肽中，在位置136处引入谷氨酸(E)；UFV180137(SEQ ID NO:82)、UFV180251(SEQ ID NO:83)和UFV180284(SEQ ID NO:84)。RBS取代(257E)被包括在所有多肽中。出于比较目的，使用包括C末端折叠子三聚化结构域的WTHA B/布里斯班/60/08(UFV170088：SEQ ID NO:80)。在ExpiCHO细胞中产生所有多肽，它们包括C-标签，一种融合到多肽的C末端的四个残基的酸性肽(E-P-E-A)。
蛋白质表达和纯化
合成编码多肽的DNA片段(金斯瑞公司)，并且将其克隆到pcDNA2004表达载体(具有增强型CMV启动子的经修饰pcDNA3质粒)中。通过使用ExpiFectamineTM转染试剂(Gibco，赛默飞世尔科技公司)根据制造商的方案瞬时转染各自的工业级DNA(≤0.01EU/μg内毒素水平且≥90％超螺旋含量)，在于ExpiCHOTM表达培养基中培养的ExpiCHO悬浮细胞中产生多肽。根据制造商的方案，在转染后1天向细胞培养物中添加ExpiFectamine CHO增强子和ExpiCHO进料(Gibco，赛默飞世尔科技公司)。在第10天收获含有分泌的多肽的培养上清液，并且将其通过离心，然后经0.2μm瓶盖式过滤器(康宁公司)过滤进行澄清。以中等规模(约70mL)和更大规模(约350mL)表达多肽。
通过两步方案纯化多肽。首先，将收获和澄清的培养上清液(大规模转染)上样到HiScale 16/20柱(通用医疗公司(GE Healthcare)；伊利诺伊州芝加哥)上，该柱填充有亲和树脂(Capture Select；赛默飞世尔科技公司)，该亲和树脂由固定在基于琼脂糖的珠粒(赛默飞世尔科技公司)上的C-标签特异性单结构域抗体组成。此树脂对具有C-标签的结合蛋白具有高度特异性。在纯化前通过OCTET(抗C-标签)确定收获的培养上清液中施加的多肽的量。使用含有2M MgCl2的TRIS缓冲液进行C-标记蛋白的洗脱。基于UV信号(A280)，将洗脱的级分合并并且通过Millex-GV 0.22μm滤膜(密理博西格玛公司(MilliporeSigma)；马萨诸塞州伯灵顿)过滤。随后，将收集的洗脱峰施加到在电泳缓冲液(20mM Tris、150mMNaCl，pH 7.8)中平衡的Superdex 200pg 26/60柱(通用医疗公司)上进行精细纯化，即去除最小量的多聚体和单体蛋白。基于UV信号(A280)，将三聚体级分合并。
培养上清液和纯化的蛋白质分析
使用OCTET平台根据制造商的说明书(佛特比奥公司(FortéBio)；加利福尼亚州弗里蒙特)通过生物层干涉测量法评估细胞培养上清液中表达的多肽的水平。首先，使用加载有CaptureSelectTM生物素抗C-标签缀合物(赛默飞世尔科技公司)的链霉亲和素生物传感器(佛特比奥公司)，通过评估稀释系列的明确定义的参考批次的纯化的同源多肽(包括C末端C-标签的稳定HA B/布里斯班/60/08；UFV172551SEQ ID NO:96)的结合转变，建立标准曲线。随后，测量预先稀释(在动力学缓冲液中，佛特比奥公司)的含有多肽的细胞培养上清液的结合转变，并且使用已建立的标准曲线来计算多肽的浓度。
通过使用高效液相色谱法(HPLC)Infinity 1260系列装置(安捷伦公司(Agilent)；加利福尼亚州圣克拉拉)的尺寸排阻色谱法多角度光散射(SEC-MALS)分析来评估培养上清液中的多肽和纯化的多肽的三聚体含量。使各40μg的纯化的多肽在TSK凝胶G3000SWxl柱(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；密苏里州圣路易斯)上运行(1mL/min)，并且通过miniDAWN Treos多角度光散射检测器和Optilab T-rEx差示折光计(怀雅特科技公司)测量洗脱材料的摩尔质量。通过Astra 6软件包(怀雅特科技公司)分析数据，并且从折射率信号得出分子量计算值。
通过ELISA(抗体结合的EC50值)评估纯化的多肽的抗原性。为此，将多肽以10nM的浓度包被并且与稀释系列的单克隆抗体(mAb)CR9114(如WO2013/007770中所述)、CR8071(如Dreyfus等人,337(6100):1343-8(2012)中所述)、SD84(如(Laursen等人,Science[科学]362(6414):598-602(2018))中所述)和34B5(如WO2015/148806中所述)一起孵育。CR9114、CR8071和34B5施加的起始浓度为70nM，然而SD84使用的起始浓度为100nM。通过与二抗抗人Fc HRP(小鼠抗人IgG，杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)；宾夕法尼亚州西格罗夫)一起孵育来确定抗体结合，并且通过添加POD底物来使其可视化。使用EnSightTM多模式读板器(珀金埃尔默公司；马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行读数。使用Spotfire套件(泰必高软件公司；加利福尼亚州帕洛阿尔托)计算EC50值。
如实例2中所述，通过差示扫描荧光测定法(DSF)经由监测添加到6μg多肽溶液中的Sypro Orange染料(赛默飞世尔科技公司)的荧光发射来确定培养上清液中的多肽的热稳定性。
结果与结论
通过SEC-MALS对粗细胞培养上清液的分析(图7A，左图)表明，存在显著的可溶性三聚体多肽(约7分钟保留时间)。类似的分析也表明，两步纯化方案产生纯的三聚体多肽(图7A，右图)。此外，如通过OCTET所确定的，三聚体多肽以高水平表达；与参考相比，观察到高达2倍的增加(图7B)。纯化的多肽被正确折叠，如通过ELISA分析所证明的，该分析表明CR9114与多肽的茎部强结合(EC50值在较低的纳摩尔范围内(<2.6nM))。类似地，观察到颈部特异性mAb CR8071的结合的EC50值。相比之下，没有观察到头部结构域特异性结合剂SD84的结合。引入的N-连接的糖基化基序可能被糖基化并且由于聚糖部分的空间位阻，阻止SD84结合。通过DSF确定50％的多肽去折叠时的温度。所有多肽都是温度稳定的，并且UFV180131(SEQ ID NO:81)、UFV180137(SEQ ID NO:82)、UFV180251(SEQ ID NO:83)和UFV180284(SEQID NO:84)所展示的Tm50值分别为68.3℃、69.2℃、69.4℃和69.3℃。参考(包括折叠子三聚化结构域的野生型HA)的Tm50值低约8.6℃，这表明取代和缺失的组合对多肽的温度稳定性具有显著影响。使用替代性C末端截短位置并且敲除HA0裂解位点导致蛋白质表达水平降低；然而，每种多肽都以与参考相当的高水平良好表达(图7C)。多肽折叠不受影响，并且对于茎部特异性mAb CR9114和颈部特异性mAb CR8071结合，观察到较低纳摩尔范围内的EC50值(<4.6nM)。与对于SD84观察到的情况类似，没有观察到头部结构域特异性mAb172498(WO2015/148806)的结合。引入的N-连接的糖基化基序可能被糖基化并且由于聚糖部分的空间位阻，阻止mAb172498的结合。与具有非突变裂解位点和其他截短位置的多肽相比，所有多肽都展示了类似的Tm50值。
总之，稳定取代和融合肽近端区缺失的组合是有益的，并且允许添加非天然头部结构域聚糖和受体结合位点取代。多肽表达良好，作为正确折叠的三聚体多肽从细胞培养上清液中纯化出，是温度稳定的，并且在溶液中维持正确的HA折叠和三聚体融合前构象。
实例8：与不同亚型的野生型乙型流感HA相比，可溶性稳定乙型流感HA的表达
设计
除实例2-7中所述的HA多肽之外，还表达了进一步稳定的乙型流感HA，并且将其与它们各自的野生型可溶性HA胞外结构域进行比较。因此，将位置227处的谷氨酰胺(Q)、位置238处的异亮氨酸(I)、位置384处的异亮氨酸(I)、位置461处的精氨酸(R)和位置476处的异亮氨酸(I)引入四种另外的乙型流感毒株的HA氨基酸序列中：B/Lee/1940、B/山形/16/1988(山形谱系)、B/佛罗里达(Florida)/04/2006(山形谱系)和B/爱荷华/06/2017(维多利亚谱系)。除了B/爱荷华/06/2017来源的多肽之外，所有多肽都包括融合肽近端区(FPPR)缺失突变372-376。转染后三天，将多肽在Expi293F细胞培养上清液中的表达水平与其各自的不具有突变的WT多肽进行比较。
培养上清液分析
如实例2中所述合成编码本发明多肽的DNA片段。在真核悬浮细胞系Expi293F中以微量规模(200μL)产生包括His-标签的野生型多肽和包括用于筛选目的和纯化的接头-分选酶识别序列-His标签的稳定多肽。
使用OCTET平台(佛特比奥公司)通过生物层干涉测量法评估细胞培养上清液中表达的多肽的水平。简言之，使用抗HIS(HIS2)生物传感器(佛特比奥公司)通过测量稀释系列的明确定义的参考批次的纯化的可比较多肽的结合转变来建立标准曲线。随后，测量预先稀释(在动力学缓冲液中，佛特比奥公司)的含有本发明多肽的细胞培养上清液的结合转变，并且使用已建立的标准曲线来计算多肽的浓度。
通过使用Vanquish系统(赛默飞世尔科技公司)的超高效液相色谱法(UHPLC)装置中的尺寸排阻色谱法多角度光散射(MALS)来评估培养上清液中表达的多肽的存在及其四级结构(其指示多肽是单体、三聚体还是多聚体)。对于B/Lee/40、B/山形/16/1988和B/佛罗里达/04/2006来源的多肽，使用BEH 200A柱(沃特斯公司，注射体积40μL，流量0.35mL/min)，对于B/爱荷华/06/2017来源的多肽，使用Unix-C 300A柱(赛分科技公司(SepaxTechnologies)，注射体积15μL，流量0.1mL/min)。通过Helios光散射检测器(怀雅特科技公司)来监测洗脱。通过Astra 6软件包(怀雅特科技公司)分析SEC图谱。
结果与结论
如在实例2中观察到的，在不同毒株的野生型HA中，在具有或不具有FPPR(残基372-376)的缺失的情况下，在位置227处取代为谷氨酰胺，以及在位置238、384和476处取代为异亮氨酸，在位置461处取代为精氨酸导致表达增加，如通过生物层干涉测量法所确定的(图8A)。通过SEC-MALS对粗细胞培养上清液的分析(图8B)表明，在引入稳定突变后，对于所有可溶性稳定HA，明显的三聚体(T)峰出现在约6.5分钟的保留时间处，该峰高于对于其各自的野生型HA胞外结构域观察到的三聚体峰(图8B)。此外，没有稳定HA展示了单体(M)峰，如对于野生型B/爱荷华/06/2017HA在6.5与7分钟之间的保留时间处出现的那样。
总之，数据证实，突变227Q、238I、384I、461R和476I的引入导致稳定的可溶性三聚体HA多肽的表达和形成增加。
参考文献
Ambrose et al.,Hum.Vaccin.Immunother.8:81-8(2012)
Dijkstra et al.,Epidemiol.Infect.137:473-9(2009)
Dopheide TA,Ward CW,J Gen Virol.367-370(1981)
Dreyfus et al.,Science 337(6100):1343-8(2012)
Ekiert et al.,Science 324:246(2009).
Ekiert et al.,Science 333:844(2011).
Ferguson et al.(2003),Nature 422:428-443(2003).
Grohskopf et al.,MMWR Recomm.Rep.66:1-20(2017)
Grohskopf et al.,MMWR Recomm.Rep.67:643-5(2018)
Krammer et al.,Nat.Rev.Disease Primers 4:3(2018)
Laursen et al.,Science 362(6414):598-602(2018)
Lorieau et al.2010,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,107:11341(2010).
Ni et al.,Virology 450-451:71-83(2014)
Peltola et al.,Clin.Infect.Dis.36:299-305(2003)
Steven et al.,Science 303:1866(2004)
Steven et al.,Science 312:404(2006)
Thompson et al.,JAMA 292:1333-40(2004)
Thompson et al.,JAMA 289:179-86(2003)
Throsby et al.(2008),Plos One 12(3):1-15(2008)
Wilson et al(1981)Nature 289:366(1981)
US Centers for Disease Control and Prevention,“Seasonal influenzaactivity surveillance reports 2001-2018”www.cdc.gov/flu/weekly/pastreports.htm(accessed on July 2,2018)
European Centre for Disease Prevention and Control/WHO RegionalOffice for Europe,“Annual epidemiological reports on seasonal influenza 2001-2018,”ecdc.europa.eu/en/seasonal-influenza/surveillance-and-disease-data/aer(accessed on July 2,2018)
World Health Organization,“Recommended composition of influenza virusvaccines for use in the 2017-2018 northern hemisphere influenza season,”www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2018_19_north/en(accessed on July 2,2018)
WO2008/028946
WO2010/130636
WO2013/007770
WO2015/148806
序列
SEQ ID NO 1：全长B/布里斯班/60/08
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SEQ ID NO 7：UFV171703
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SEQ ID NO 8：UFV171741
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SEQ ID NO 9：UFV170519
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SEQ ID NO 10：UFV170520
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SEQ ID NO 11：UFV170521
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SEQ ID NO 12：UFV170522
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SEQ ID NO 13：UFV170523
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SEQ ID NO 14：UFV170515
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SEQ ID NO 15：UFV170516
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SEQ ID NO 16：UFV170517
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SEQ ID NO 17：UFV170518
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SEQ ID NO 18：UFV170524
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SEQ ID NO 19：UFV170525
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SEQ ID NO 20：UFV170541
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SEQ ID NO 21：UFV170542
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SEQ ID NO 22：UFV170543
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SEQ ID NO 23：UFV170544
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SEQ ID NO 24：UFV170545
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SEQ ID NO 25：UFV170546
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SEQ ID NO 26：UFV170547
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SEQ ID NO 27：UFV170548
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SEQ ID NO 28：UFV170549
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SEQ ID NO 29：UFV170550
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SEQ ID NO 30：UFV170551
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SEQ ID NO 31：UFV170552
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SEQ ID NO 32：UFV170553
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SEQ ID NO 44：UFV171992
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SEQ ID NO 45：UFV171991
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SEQ ID NO 46：UFV172064
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SEQ ID NO 47：UFV172065
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SEQ ID NO 48：UFV172066
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SEQ ID NO 49：UFV172067
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SEQ ID NO 50：UFV172068
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SEQ ID NO 51：UFV172069
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SEQ ID NO 52：UFV172070
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SEQ ID NO 53：UFV172071
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SEQ ID NO 54：UFV172072
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SEQ ID NO 55：UFV172073
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SEQ ID NO 57：UFV172075
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SEQ ID NO 58：UFV172076
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SEQ ID NO 69：UFV172690
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SEQ ID NO 70：UFV180284
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SEQ ID NO 71：UFV180454
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SEQ ID NO 72：UFV180455
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SEQ ID NO 73：UFV180456
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SEQ ID NO 74：UFV180457
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SEQ ID NO 75：UFV180458
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SEQ ID NO 76：UFV180459
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SEQ ID NO 77：UFV180460
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SEQ ID NO 78：UFV180461
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSEHNVINATNAPGGPYNITTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDKNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQQFTSSANGVTTIYVSQIGGFPNQTEDGGLPESGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKEQGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWIGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELRVLLSNEGIINSEDEILLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNI
SEQ ID NO 79：UFV180462
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSEHNVINATNAPGGPYNITTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDKNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQQFTSSANGVTTIYVSQIGGFPNQTEDGGLPESGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKEQGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWIGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELRVLLSNEGIINSEDEILLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSL
SEQ ID NO 80：UFV170088
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSTHNVINAENAPGGPYKIGTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDKNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITASGSLVPRGSGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGSEPEA
SEQ ID NO 81：UFV180131
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSNHTVINATNAPGGPYNITTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDKNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQQFTSSANGVTTIYVSQIGGFPNQTEDGGLPESGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFEGMIAGWIGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELRVLLSNEGIINSEDEILLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTIEPEA
SEQ ID NO 82：UFV180137
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSEHNVINATNAPGGPYNITTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDKNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQQFTSSANGVTTIYVSQIGGFPNQTEDGGLPESGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFEGMIAGWIGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELRVLLSNEGIINSEDEILLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTIEPEA
SEQ ID NO 83：UFV180251
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSEHNVINATNAPGGPYNITTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDKNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQQFTSSANGVTTIYVSQIGGFPNQTEDGGLPESGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGAGWIGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELRVLLSNEGIINSEDEILLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTIEPEA
SEQ ID NO 84：UFV180846
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSNHTVINATNAPGGPYNITTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDKNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQQFTSSANGVTTIYVSQIGGFPNQTEDGGLPESGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKEQGFFGAIAGFEGMIAGWIGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELRVLLSNEGIINSEDEILLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITAEPEA
SEQ ID NO 85：HIS-标签
HHHHHH
SEQ ID NO 86：HIS-标签
HHHHHHH
SEQ ID NO 87：三聚化结构域
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO 88：FLAG标签
DYKDDDDK
SEQ ID NO 89：因子X蛋白水解裂解位点
IEGR
SEQ ID NO 90：凝血酶蛋白水解裂解位点
LVPRGS
SEQ ID NO 91：UFV180847
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SEQ ID NO 92：UFV180848
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSEHNVINATNAPGGPYNITTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDKNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQQFTSSANGVTTIYVSQIGGFPNQTEDGGLPESGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKEQGFFGAIAGFLEGGAGWIGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELRVLLSNEGIINSEDEILLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITAEPEA
SEQ ID NO:93UFV180849
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSEHNVINATNAPGGPYNITTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDKNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQQFTSSANGVTTIYVSQIGGFPNQTEDGGLPESGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKEQGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWIGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELRVLLSNEGIINSEDEILLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITAEPEA
SEQ ID NO 94：山形谱系（B/佛罗里达/04/06）
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSYFANLKGTRTRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPSAKASILHEVKPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTQNVIDAEKAPGGPYRLGTSGSCPNATSKSGFFATMAWAVPKDNNKNATNPLTVEVPYICTEGEDQITVWGFHSDDKTQMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGSFPDQTEDGGLPQSGRIVVDYMMQKPGKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTILLYYSTAASSLAVTLMLAIFIVYMVSRDNVSCSICL
SEQ ID NO 95：共有序列
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSYFANLKGTETRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPSAKASILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSTQNVIDAEKAPGGPYRLGTSGSCPNATSKNGFFATMAWAVPKDNNKNATNPLTVEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNKTQMKKLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPDQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKPGKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVDIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTI
SEQ ID NO 96：UFV172551
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSTHNVINATNAPGGPYNITTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDKNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQQFTSSANGVTTIYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWIGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELRVLLSNEGIINSEDEILLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTIGGSEPEA
SEQ ID NO 97：UFV180846-分泌的
DRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSNHTVINATNAPGGPYNITTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDKNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQQFTSSANGVTTIYVSQIGGFPNQTEDGGLPESGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKEQGFFGAIAGFEGMIAGWIGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELRVLLSNEGIINSEDEILLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITA
SEQ ID NO 98：UFV180847-分泌的
DRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSEHNVINATNAPGGPYNITTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDKNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQQFTSSANGVTTIYVSQIGGFPNQTEDGGLPESGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKEQGFFGAIAGFEGMIAGWIGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELRVLLSNEGIINSEDEILLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITA
SEQ ID NO 99：UFV180848-分泌的
DRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSEHNVINATNAPGGPYNITTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDKNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQQFTSSANGVTTIYVSQIGGFPNQTEDGGLPESGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKEQGFFGAIAGFLEGGAGWIGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELRVLLSNEGIINSEDEILLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITA
SEQ ID NO 100：UFV180949-分泌的
DRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSEHNVINATNAPGGPYNITTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDKNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQQFTSSANGVTTIYVSQIGGFPNQTEDGGLPESGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKEQGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWIGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELRVLLSNEGIINSEDEILLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITA
SEQ ID NO 101：UFV180567
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTRSHFANLKGTQTRGKLCPNCFNCTDLDVALGRPKCMGNIPSAKVSILHEVKPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTSNVINAETAPGGPYKVGTSGSCPNVANRNGFFNTMAWVIPKDNNKTAINPVTVEVPYICSEGEDQITVWGFHSDDKTQMERLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDEGLKQSGRIVVDYMVQKPGKTGTIVYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMNGLHDEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGDFSLPTFDSLNITAHHHHHH
SEQ ID NO 102：UFV180566
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTRSHFANLKGTQTRGKLCPNCFNCTDLDVALGRPKCMGNIPSAKVSILHEVKPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTSNVINAETAPGGPYKVGTSGSCPNVANRNGFFNTMAWVIPKDNNKTAINPVTVEVPYICSEGEDQITVWGFHSDDKTQMERLYGDSNPQQFTSSANGVTTIYVSQIGGFPNQTEDEGLKQSGRIVVDYMVQKPGKTGTIVYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFEGMIAGWIGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMNGLHDEILELDEKVDDLRADTISSQIELRVLLSNEGIINSEDEILLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGDFSLPTFDSLNITASGSLVPSGSLPETGGGSHHHHHH
SEQ ID NO 103：UFV180565
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTKTRGKLCPNCLNCTDLDVALGRPMCMGTIPSAKASILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTHNVINAERAPGGPYRLGTSGSCPNVTSRNGFFATMAWAVPRDNKTATNPLTVEVPYICTKGEDQITVWGFHSDDKTQMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGDFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKPGKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVDIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGEFSLPTFDSLNITAHHHHHH
SEQ ID NO 104：UFV180400
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SEQ ID NO 105：UFV180571
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSYFANLKGTRTRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPSAKASILHEVKPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTQNVIDAEKAPGGPYRLGTSGSCPNATSKSGFFATMAWAVPKDNNKNATNPLTVEVPYICTEGEDQITVWGFHSDDKTQMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGSFPDQTEDGGLPQSGRIVVDYMMQKPGKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGEFSLPTFDSLNITAHHHHHH
SEQ ID NO 106：UFV180570
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSYFANLKGTRTRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPSAKASILHEVKPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTQNVIDAEKAPGGPYRLGTSGSCPNATSKSGFFATMAWAVPKDNNKNATNPLTVEVPYICTEGEDQITVWGFHSDDKTQMKNLYGDSNPQQFTSSANGVTTIYVSQIGSFPDQTEDGGLPQSGRIVVDYMMQKPGKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFEGMIAGWIGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELRVLLSNEGIINSEDEILLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGEFSLPTFDSLNITASGSLVPSGSLPETGGGSHHHHHH
SEQ ID NO 107：UFV190909
MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHVRLSTHNVINAEGAPGGPYKIGTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPDKNKTATNPLTIEVPYVCTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDKIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITAHHHHHH
SEQ ID NO 108：UFV190521
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Claims (48)

1.一种分离的突变型流感血凝素多肽，该多肽包含在该多肽中的至少两个稳定突变，其中这些稳定突变包含以下位置处的取代突变：
a.氨基酸位置227和/或238；和/或
b.氨基酸位置384和/或476，
其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
2.如权利要求1所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中
a.氨基酸位置227被选自由以下组成的组的氨基酸取代：Q、N、F、I和Y，和/或氨基酸位置238被选自由以下组成的组的氨基酸取代：N、Q、I和F；和/或
b.氨基酸位置384被选自由以下组成的组的氨基酸取代：W、F、N、Q和I，和/或氨基酸位置476被选自由以下组成的组的氨基酸取代：W、F、Y、I、N和Q。
3.如权利要求2所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中
a.氨基酸位置227被Q取代并且氨基酸位置238被I取代；和/或
b.氨基酸位置384被I取代并且氨基酸位置476被I取代。
4.如权利要求1至3中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，该多肽进一步包含在该多肽中的一个稳定突变，其中该稳定突变是氨基酸位置461处的取代，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸位置。
5.如权利要求4所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中氨基酸位置461被选自由以下组成的组的氨基酸取代：M、L、W、Y和R。
6.如权利要求5所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中氨基酸位置461被R取代。
7.如权利要求3所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40。
8.如权利要求6所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:108的氨基酸序列。
9.如权利要求1至8中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，该多肽进一步包含在该多肽的头部结构域中的至少一个另外的聚糖基序。
10.如权利要求9所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该聚糖基序包含在至少一个选自由以下组成的组的氨基酸位置中的氨基(N)-连接的糖基化基序的取代：
a.136或137、
b.141和
c.151，
其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
11.如权利要求10所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该聚糖基序包含在氨基酸位置136和141、136和151、137和141、137和151或141和151处的该N-连接的糖基化基序的取代。
12.如权利要求11所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该聚糖基序包含在氨基酸位置141和151处的该N-连接的糖基化基序的取代。
13.如权利要求10所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45。
14.如权利要求1至13中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，该多肽进一步包含在该多肽中的受体结合位点突变。
15.如权利要求14所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该受体结合位点突变包含在选自由以下组成的组的氨基酸位置处的取代：
a.175、
b.219、
c.257和
d.258，
其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
16.如权利要求15所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中
a.175被选自由以下组成的组的氨基酸取代：F、W和Y；
b.219被选自由以下组成的组的氨基酸取代：F、W、Y、R和E；
c.257被选自由以下组成的组的氨基酸取代：E、D、V、F；或
d.258被选自由以下组成的组的氨基酸取代：E、D、V和F。
17.如权利要求16所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中
a.175被W取代，
b.219被E取代，
c.257被E取代，或
d.258被E取代。
18.如权利要求17所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:61。
19.如权利要求14-18中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该多肽进一步包含在位置136处的氨基酸取代，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
20.如权利要求1-19中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，该多肽进一步包含融合肽近端区(FPPR)缺失突变。
21.如权利要求20所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该FPPR缺失突变包含在氨基酸位置369与382之间的至少三至七个氨基酸残基的缺失，其中氨基酸位置对应于SEQID NO:1的氨基酸位置。
22.如权利要求21所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该FPPR缺失突变包含选自由以下组成的组的缺失：Δ372-376、Δ372-378、Δ373-377、Δ373-376、Δ374-379、Δ374-376、Δ376-380和Δ377-381。
23.如权利要求22所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该FPPR缺失突变包含选自Δ372-376或Δ376-380的缺失。
24.如权利要求23所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽包含选自SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
25.如权利要求1-24中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型血凝素多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:106。
26.一种分离的突变型流感血凝素多肽，该多肽包含融合肽近端区(FPPR)缺失突变，其中该FPPR缺失突变包含在氨基酸位置369与382之间的至少三至七个氨基酸残基的缺失，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
27.如权利要求26所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该FPPR缺失突变包含选自由以下组成的组的缺失：Δ372-376、Δ372-378、Δ373-377、Δ373-376、Δ374-379、Δ374-376、Δ376-380和Δ377-381。
28.如权利要求26或27所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该FPPR缺失突变包含选自Δ372-376或Δ376-380的缺失。
29.如权利要求28所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽包含选自SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:68的氨基酸序列。
30.一种分离的突变型流感血凝素多肽，该多肽包含在该多肽中的受体结合位点突变，其中该受体结合位点突变包含在选自由以下组成的组的氨基酸位置处的取代突变：
a.175、
b.219、
c.257和
d.258，
其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
31.如权利要求30所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中
a.175被选自由以下组成的组的氨基酸取代：F、W和Y；
b.219被选自由以下组成的组的氨基酸取代：F、W、Y、R和E；
c.257被选自由以下组成的组的氨基酸取代：E、D、V、F；或
d.258被选自由以下组成的组的氨基酸取代：E、D、V和F。
32.如权利要求31所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中
a.175被W取代，
b.219被E取代，
c.257被E取代，或
d.258被E取代。
33.如权利要求32所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:61。
34.如权利要求30-33中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该多肽进一步包含在氨基酸位置136处的氨基酸取代，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
35.如权利要求1至17、19至23、26至28、30至32或34中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽包含异源三聚化结构域。
36.如权利要求1至34中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽进一步包含在从氨基酸位置532至氨基酸位置549的氨基酸位置处开始的羧基(C)末端截短，其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
37.如权利要求36所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该C末端截短在氨基酸位置532、534、536、539、541、543、545、547或549处开始。
38.如权利要求1-37中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中该突变型流感血凝素多肽进一步包含在氨基酸位置362处的裂解位点处的氨基酸取代，其中其中氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置。
39.如权利要求38所述的分离的突变型流感血凝素多肽，其中氨基酸位置362被Q取代。
40.一种分离的核酸，该分离的核酸编码如权利要求1-39中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽。
41.一种载体，该载体包含如权利要求40所述的分离的核酸。
42.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如权利要求41所述的载体。
43.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1-39中任一项所述的分离的突变型流感血凝素多肽、和药学上可接受的载体。
44.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求40所述的分离的核酸。
45.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求41所述的载体。
46.一种在有需要的受试者中诱导针对流感病毒的免疫反应的方法，该方法包括向该有需要的受试者施用如权利要求43至45中任一项所述的药物组合物。
47.一种产生分离的突变型流感血凝素多肽的方法，该方法包括在能够产生该突变型流感血凝素多肽的条件下培养如权利要求42所述的宿主细胞，以及从该细胞或培养物中回收该突变型流感血凝素多肽。
48.一种产生如权利要求43所述的药物组合物的方法，该方法包括将该分离的突变型流感多肽与药学上可接受的载体合并。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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WO2025051975A1 (en) * 2023-09-06 2025-03-13 Sanofi Modified influenza b hemagglutinin polypeptides and nucleic acids and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN107074912A (zh) * 2014-07-10 2017-08-18 扬森疫苗与预防公司 流行性感冒病毒疫苗及其用途
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201400743VA (en) * 2011-09-20 2014-04-28 Sinai School Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104066446A (zh) * 2011-11-28 2014-09-24 克鲁塞尔荷兰公司 流感病毒疫苗及其用途
CN107074912A (zh) * 2014-07-10 2017-08-18 扬森疫苗与预防公司 流行性感冒病毒疫苗及其用途
WO2019145310A1 (en) * 2018-01-23 2019-08-01 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Influenza virus vaccines and uses thereof

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