本發明之核苷酸序列及胺基酸序列的列表
SEQ ID No.：1-全長S蛋白質之胺基酸序列
SEQ ID No.：2-S蛋白質之S1區域之胺基酸序列
SEQ ID NO.：3-具有IgE前導序列之全長S基因之胺基酸序列
1至18加下底線的胺基酸殘基代表IgE前導序列之胺基酸序列，而19至1289胺基酸殘基代表全長S蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO.：4-具有IgE前導序列之全長S基因之核苷酸序列
1至54加下底線的核苷酸殘基代表IgE前導序列之DNA序列(核苷酸序列)，而55至3873核苷酸殘基代表S基因之DNA序列(核苷酸序列)。
SEQ ID NO.：5-具有t-PA前導序列之全長S基因之胺基酸序列
1至22加下底線的胺基酸殘基代表t-PA前導序列之胺基酸序列，而23至1289胺基酸殘基代表全長S蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO.：6-具有t-PA前導序列之全長S基因之核苷酸序列
1至66加下底線的核苷酸殘基代表t-PA前導序列之DNA序列(核苷酸序列)，而67至3885核苷酸殘基代表S基因之DNA序列(核苷酸序列)。
SEQ ID NO.：7-具有IgE前導序列之S基因之S1區域之胺基酸序列
1至18加下底線的胺基酸殘基代表IgE前導序列之胺基酸序列，而19至702胺基酸殘基代表S蛋白質之全長S1區域之胺基酸序列。
SEQ ID NO.：8-具有IgE前導序列之S基因之S1區域之核苷酸序列
1至54加下底線的核苷酸殘基代表IgE前導序列之DNA序列(核苷酸序列)，而55至2112核苷酸殘基代表S基因之S1區域之DNA序列(核苷酸序列)。
SEQ ID NO.：9-具有t-PA前導序列之S基因之S1區域之胺基酸序列
1至22加下底線的胺基酸殘基代表t-PA前導序列之胺基酸序列，而23至706胺基酸殘基代表S蛋白質之全長S1區域之胺基酸序列。
SEQ ID NO.：10-具有t-PA前導序列之S基因之S1區域之核苷酸序列
1至66加下底線的核苷酸殘基代表t-PA前導序列之DNA序列(核苷酸序列)，而67至2124核苷酸殘基代表S基因之S1區域之DNA序列(核苷酸序列)。
SEQ ID NO.：11-具有IgE前導序列之全長S基因(Hexapro)之胺基酸序列
1至18加下底線的胺基酸殘基代表IgE前導序列之胺基酸序列，而19至1289胺基酸殘基代表全長S蛋白質之胺基酸序列。在19至1289區中進一步加下底線的脯胺酸殘基代表6個脯胺酸取代(K986P、V987P、F817P、A892P、A899P、及A942P)，其在本文中被稱為Hexapro取代(
Hexapro substitution)。
SEQ ID NO.：12-具有IgE前導序列之全長S基因(Hexapro)之核苷酸序列
1至54加下底線的核苷酸殘基代表IgE前導序列之DNA序列(核苷酸序列)，而55至3873核苷酸殘基代表S基因(Hexapro)之DNA序列(核苷酸序列)。
SEQ ID NO.：13-具有IgE前導序列之全長S基因(2P)之胺基酸序列
1至18加下底線的胺基酸殘基代表IgE前導序列之胺基酸序列，而19至1289胺基酸殘基代表全長S蛋白質之胺基酸序列。在19至1289區中進一步加下底線的脯胺酸殘基代表2個脯胺酸取代(K986P、V987P)，其在本文中被稱為2P取代(2P substitution)。
定義
如本文中所使用之術語「SARS-CoV-2」、「2019-nCoV」、及「HCoV-19」係指於2019年12月爆發並在中國武漢首次報導的冠狀病毒。
如本文中所使用之術語「游離基因體(episome)」係指共同表現S基因或S基因之S1區及前導序列的質體DNA構築體，其可獨立地進入宿主細胞進行轉錄及轉譯，該宿主細胞較佳地為人類肌肉細胞、皮膚細胞、或抗原呈現細胞。游離基因體能進入宿主細胞核並在不整合至宿主細胞基因組中之情況下使用宿主細胞機器(host cell machinery)表現目標蛋白質，在此處較佳地為S蛋白質或S蛋白質之S1區。
如本文中所述之術語「訊息肽(signal peptide)」係一種肽(有時稱為訊息序列、靶向訊息、定位訊息、定位序列、輸送肽、前導序列或前導肽)，係存在於新合成蛋白質之N端的短肽(通常16至30個胺基酸長)，使該些蛋白質注定朝向分泌路徑。
如本文中所使用之術語「多肽(polypeptide)」、「蛋白質(protein)」、及「胺基酸序列(amino acid sequence)」通常係指胺基酸殘基之聚合物且不限於產物之最小長度。因此，肽、寡肽、二聚體、多聚體、及類似者均被包括在該定義中。全長蛋白質及其片段皆由該定義所涵蓋。
如本文中所使用之術語「核苷酸(nucleotide)」通常係指核酸殘基之序列且不限於產物之最小長度。全長核苷酸及其片段或變體皆由該定義所涵蓋。
如本文中所使用之術語「片段(fragment)」或「變體(variant)」係指全長多肽、蛋白質、或核苷酸之功能性部分，其序列與對應的全長多肽、蛋白質、或核苷酸不完全相同，但保留與全長多肽、蛋白質、或核苷酸相同的功能。該功能性片段或功能性變體可具有比相應的天然分子更多、更少、或相同數目的殘基且/或可包含一或多個胺基酸或核苷酸取代。
「免疫原性組成物(immunogenic composition)」、「免疫原性調配物(immunogenic formulation)」、及「調配物(formulation)」可互換使用且係指包含抗原分子的組成物或調配物，其中將該組成物投予至個體導致在個體中對感興趣之抗原分子發展體液性及/或細胞性免疫反應。免疫原性組成物可直接引入至接受者個體中，諸如藉由注射、吸入、口服、鼻內、或任何其他非經腸胃、黏膜、或穿皮(例如，直腸內或陰道內)投予途徑。
如本文中所述之術語「假型病毒(pseudovirus)」係合成或重組病毒，其具有核心及封套蛋白質衍生自不同的病毒。實施例為表現SARS S蛋白質之麻疹病毒。術語「假型病毒粒子(pseudovirion)」具有與「假型病毒(pseudovirus)」術語相同的意義，但其常與中和抗體檢定一起使用。如本文中所使用之術語「多肽(polypeptide)」、「蛋白質(protein)」、及「胺基酸序列(amino acid sequence)」通常係指胺基酸殘基之聚合物且不限於產物之最小長度。因此，肽、寡肽、二聚體、多聚體、及類似者均被包括在該定義中。全長蛋白質及其片段皆由該定義所涵蓋。
術語「醫藥調配物(pharmaceutical formulation)」係指製劑，其以此種形式允許活性成分之生物活性明確有效。術語「醫藥調配物(pharmaceutical formulation)」、「醫藥組成物(pharmaceutical composition)」、及「組成物(composition)」在此可互換使用。
術語「賦形劑(excipient)」係指可添加至調配物中以穩定呈調配形式之活性藥物物質，以調整並維持醫藥製劑之滲透壓及pH。常用賦形劑之實施例包括但不限於麻醉化合物、糖類、多元醇、胺基酸、界面活性劑、及聚合物。
「醫藥上可接受之(pharmaceutically acceptable)」賦形劑係那些可適度地投予至個體哺乳動物以提供所使用活性成分之有效劑量的賦形劑。
如本文中所使用之術語「治療(treatment)」或「治療劑(therapeutics)」係指對哺乳動物，特別是人類之疾病的任何治療。其包括：(a)預防疾病在可能易感染疾病或處於得病風險但尚未診斷為患病的個體中出現；(b)抑制疾病，亦即阻止其發展；及(c)減輕疾病，亦即引起疾病之消退。
術語「患者(patient)」及「個體(subject)」可互換使用且係以彼等的習知意義使用，係指患有或傾向有藉由投予本發明之組成物來預防或治療的病症的活生物體，且包括人類及非人類動物兩者。個體之實施例包括但不限於人類、黑猩猩、及其他猿類及猴子物種；農畜諸如牛、羊、豬、山羊、及馬；家養哺乳動物諸如狗、及貓；實驗室動物包括囓齒類諸如小鼠、大鼠、及豚鼠；鳥類，包括家禽、野生鳥類、及獵禽(game bird)(諸如雞、火雞)及其他鶉雞類鳥類、鴨、鵝、及類似者。該術語不表示特定年齡。因此，成人、青少年、及新生個體都關注。
術語「ZVTC_COV」及「VTC_COV」意義相似且可互換使用。
如本文中所使用之術語「胺基酸取代(amino acid substitution)」或「取代(substitution)」係將在親體多肽中特定位置(position/location)處的胺基酸用另一胺基酸置換。例如，取代K986P係指其中在位置986處之的離胺酸用脯胺酸置換的變體多肽，在此情況下為SARS-CoV-2之S蛋白質的變體。
本發明中所使用的縮寫
γ：伽瑪
2019-nCoV：新型冠狀病毒
A：腺嘌呤
ACE2：血管緊縮素轉化酶2
APC：抗原呈現細胞
BGH：牛生長荷爾蒙
BSA：牛血清白蛋白
C：胞嘧啶
CMV：巨細胞病毒
CL：陽離子脂質
CoV：冠狀病毒
CPE：細胞病變效應
DNA：去氧核醣核酸
DMEM：達爾伯克氏(Dulbecco)改良伊格爾培養基
DOTMA：1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙烷
DOTAP：N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基甲基硫酸銨
ELISA：酶聯免疫吸附檢定法
ELISpot：酶聯免疫吸附斑點
FACS：螢光活化細胞分選
FBS：胎牛血清
FITC：螢光異硫氰酸鹽
G：鳥嘌呤
h：小時
Hr：小時
HRP：山葵過氧化酶
ID：皮內
IFN：干擾素
IM：肌內
IgG：免疫球蛋白G
IgE：免疫球蛋白E
MERS：中東呼吸道症候群冠狀病毒
MHC：主要組織相容性複合體
ml：毫升
MNT：微中和測試
MV：麻疹載體
%：百分比
℃：攝氏度
nM：奈米莫耳
NFIS：無針頭注射系統
OD：光密度
p：質體
pDNA：質體DNA
PBS：磷酸鹽緩衝液
RBD：受體結合結構域
RNA：核糖核酸
RPMI：洛斯維派克紀念研究所(Roswell park
memorial institute)
S蛋白質：棘突蛋白質
SARS：嚴重急性呼吸道症候群
SC：皮下
T：胸嘧啶
t-PA：組織血漿蛋白原活化因子
TCID
50
：50%組織培養感染性劑量
TMB：3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺
TNF：腫瘤壞死因子
VSV：水泡性口炎病毒
本發明之具體實施例
在一個具體實施例中，本發明提供DNA構築體，可將其發展成預防SARS-CoV-2之疫苗。在較佳具體實施例中，根據本發明之DNA構築體包含SARS-CoV-2之S基因或SARS-CoV-2之S蛋白質之S1區域之基因。
在該等具體實施例中之一者中，該DNA構築體包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質的基因或SARS-CoV-2之S蛋白質的截斷基因。本發明之S蛋白質的截斷基因包括結合至人類血管緊縮素轉化酶(ACE)-2受體的S1區或受體結合結構域RBD。
在較佳具體實施例中，本發明提供包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之基因的DNA構築體具有如SEQ ID NO.：4或SEQ ID NO.：6所示之核苷酸序列。
在較佳具體實施例中，本發明提供包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之基因的DNA構築體之胺基酸序列，其中該胺基酸序列係SEQ ID NO.：3或SEQ ID NO.：5。
在該等較佳具體實施例中之一者中，本發明提供包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之基因的DNA構築體具有來自SEQ ID NO.：4之55至3873的核苷酸殘基的核苷酸序列或其片段或其變體。
在該等較佳具體實施例中之一者中，本發明提供包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之基因的DNA構築體具有來自SEQ ID NO.：6之67至3885的核苷酸殘基的核苷酸序列或其片段或其變體。
在該等較佳具體實施例中之一者中，本發明提供包含編碼具有取代之SARS-CoV-2之融合前穩定S蛋白質之基因的DNA構築體，其中SARS-CoV-2之S蛋白質具有K986P、V987P、F817P、A892P、A899P、及A942P取代。在此類較佳具體實施例中之一者中，本發明提供包含編碼具有取代之SARS-CoV-2之融合前穩定S蛋白質之基因的DNA構築體，其中SARS-CoV-2之S蛋白質具有選自K986P、及V987P取代的取代。在此類較佳具體實施例中之一者中，本發明提供包含編碼具有取代之SARS-CoV-2之融合前穩定S蛋白質之基因的DNA構築體，其中SARS-CoV-2之S蛋白質具有取代K986P、V987P、F817P、A892P、A899P、及A942P取代。
根據本發明之包含編碼具有K986P、V987P、F817P、A892P、A899P、及A942P取代之SARS-CoV-2之S蛋白質之基因的DNA構築體具有如SEQ ID NO.：12所示之核苷酸序列。在該等較佳具體實施例中之一者中，根據本發明之包含編碼具有K986P、V987P、F817P、A892P、A899P、及A942P取代之SARS-CoV-2之S蛋白質之基因的DNA構築體具有來自SEQ ID NO.：12之55至3873的核苷酸殘基的核苷酸序列或其片段或其變體。
在較佳具體實施例中，本發明提供包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質(S1蛋白質)之截斷基因之基因的DNA構築體具有如SEQ ID NO.：8或SEQ ID NO.：10所示之核苷酸序列。在較佳具體實施例中，本發明提供包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質(S1蛋白質)之截斷基因之基因的DNA構築體之胺基酸序列，其中該胺基酸序列係SEQ ID NO.：7或SEQ ID NO.：9。
在該等較佳具體實施例中之一者中，本發明提供包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質(S1蛋白質)之截斷基因之基因的DNA構築體具有來自SEQ ID NO.：8之55至2112的核苷酸殘基的核苷酸序列或其片段或其變體。
在該等較佳具體實施例中之一者中，本發明提供包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質(S1蛋白質)之截斷基因之基因的DNA構築體具有來自SEQ ID NO.：10之67至2124的核苷酸殘基的核苷酸序列或其片段或其變體。
在該等較佳具體實施例中之一者中，本發明提供包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之基因的DNA構築體具有在如SEQ ID NO.：4或SEQ ID NO.：6所示之核苷酸序列的整個長度上具有至少95%同一性的核苷酸序列。
在該等較佳具體實施例中之一者中，本發明提供包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之基因的DNA構築體具有在如SEQ ID NO.：12所示之核苷酸序列的整個長度上具有至少95%同一性的核苷酸序列。
在該等較佳具體實施例中之一者中，本發明提供包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質(S1蛋白質)之截斷基因之基因的DNA構築體具有在如SEQ ID NO.：8或SEQ ID NO.：10所示之核苷酸序列的整個長度上具有至少95%同一性的核苷酸序列。
在該等具體實施例中之一者中，本發明提供DNA構築體或其之功能性變體(群)。進一步，本發明對合適的宿主提供具有最佳化核苷酸基因序列之DNA構築體或其之功能性變體(群)。較佳地，根據本發明之合適的宿主係大腸桿菌。
在另一具體實施例中，本發明提供包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之基因或編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之S1區域之基因的載體。根據本發明，可使用可在體內表現目標蛋白質之任何載體。在較佳具體實施例中，根據本發明之載體係pVAX1。其他載體諸如pCDNA 3.1、pCDNA 4.0、pCMV、PCAGG等均可用於表現目標蛋白質。本發明之載體可包括用於在廣泛哺乳動物中高水平表現之人類巨細胞病毒早期立即(human cytomegalovirus immediate-early, CMV)啟動子、用於有效轉錄終止及mRNA之多腺苷酸化之牛生長荷爾蒙(BGH)多腺苷酸化訊息、在大腸桿菌中用於選擇之康黴素(kanamycin)抗性基因、或其合適的組合。
在某些具體實施例中，本發明提供包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之基因或編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之S1區域之基因及編碼訊息肽之基因的載體。在較佳具體實施例中，該訊息肽係IgE訊息肽或t-PA訊息肽。
在該等具體實施例中之一者中，本發明提供製備載體之方法，該載體包含編碼SARS-CoV之S蛋白質之基因或編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之S1區域之基因，其視需要地具有編碼訊息肽之基因。在較佳具體實施例中，該訊息肽係IgE訊息肽或t-PA訊息肽。
在另一具體實施例中，本發明提供包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之基因或編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之S1區域之基因及視需要地具有編碼訊息肽之基因的載體。
在另一具體實施例中，根據本發明製備之載體進一步包含表現SARS-CoV-2之S基因或SARS-CoV-2之S基因之S1區域所需之調節元件(群)。
在又一個具體實施例中，本發明提供將包含SARS-CoV-2之S基因或SARS-CoV-2之S基因之S1區域的DNA構築體投予至個體中之方法。DNA構築體可進一步包含編碼IgE訊息肽之基因或編碼t-PA訊息肽之基因。在較佳具體實施例中，本發明提供投予包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之基因或編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之S1區域之基因，其視需要地具有編碼訊息肽之基因的載體之方法。根據本發明之訊息肽可為IgE訊息肽或t-PA訊息肽。
在本發明之另一具體實施例中，將共同表現S基因及訊息肽之質體DNA(pDNA)載體轉形至合適的大腸桿菌宿主細胞中以大規模生產用於免疫之質體DNA。
在本發明之另一具體實施例中，使用批式或饋料批式(fed-batch)方法之可擴充生產製程可與包含酵母萃取液、胰化蛋白、甘油、及可獲得用於高密度大腸桿菌(
E. coli
)培養之其他合適成分的合適的不同培養基組成物一起使用。此外，根據本發明可使用30℃至42℃之溫度範圍以增加自細菌生物量之質體產率。
在本發明之具體實施例中之一者中，純化製程包含下列步驟中之一或多者：(a)溶解包含質體DNA之宿主細胞；(b)藉由過濾澄清溶解產物以獲得澄清之溶解產物；(c)處理溶解產物以移除內毒素及其他不純物；(d)使用選自親和力層析術(affinity chromatography，AC)、離子交換層析術(ion exchange chromatography，IEC)、及/或疏水性交互作用層析術(hydrophobic interaction chromatography，HIC)的層析術技術中之一或多者來純化具有質體DNA之步驟(c)的經處理溶液；(e)將包含下列步驟中之一或多者的純化質體濃縮：(i)沉澱、(ii)滲濾及/或(iii)冷凍乾燥。
在另一具體實施例中，本發明提供製造質體DNA載體之免疫原性組成物之方法，該質體DNA載體包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之基因或編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之S1區域之基因與編碼前導序列之基因。本發明之免疫原性組成物可在水或鹽水中製備。免疫原性組成物較佳地包含緩衝劑、穩定劑、佐劑、及視需要地其他合適的醫藥賦形劑(群)。在本發明之較佳具體實施例中，該免疫原性組成物由下列所組成：(a)緩衝劑，較佳地為磷酸鹽緩衝液(PBS)；(b)選自自由基清除劑及/或金屬離子螯合劑的穩定劑(群)；(c)選自鹽酸布比卡因(bupivacaine hydrochloride)及/或選自Vi-多醣、酶原及/或聚葡萄胺糖的糖類的其他醫藥賦形劑(群)；及(d)選自氫氧化鋁凝膠(aluminum hydroxide gel)、細菌衍生之佐劑、親脂性佐劑、親水性佐劑、佛氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant, CFA)、佛氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant, IFA)、單磷醯脂質A(mono phosphoryl lipid A)、β植固醇(beta-sitosterol)、及其合適的組合的佐劑(群)。
在該等較佳具體實施例中之一者中，本發明之免疫原性組成物或調配物係液體調配物，其包含緩衝劑及具有來自SARS-CoV-2病毒之棘突蛋白質基因區域的DNA質體構築體。根據本發明之較佳緩衝劑係磷酸鹽緩衝液。
在該等較佳具體實施例中之一者中，本發明之免疫原性組成物或調配物係液體調配物，其包含緩衝劑及具有來自SARS-CoV-2病毒的棘突蛋白質基因區域之S1區域的DNA質體構築體。根據本發明之較佳緩衝劑係磷酸鹽緩衝液。
在該等較佳具體實施例中之一者中，本發明之免疫原性組成物或調配物係脂質體調配物。在此類具體實施例中之一者中，對於質體DNA遞送可使用：使用陽離子脂質(cationic lipid, CL)之脂質包埋或複合方法，該陽離子脂質包含一或多種選自(a) DOTMA(1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙烷)及(b) DOTAP (N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基甲基硫酸銨)的脂質。在該等具體實施例中之一者中，本發明之調配物的陽離子脂質氮(N)對pDNA磷酸鹽(P)之莫耳比係選自1、2、及3。在該等具體實施例中之一者中，對於包含輔助脂質(helper lipid)(群)的調配物，調配物之陽離子脂質對輔助脂質之莫耳比係1:1。
在某些具體實施例中，根據本發明之pDNA脂質體調配物係包含單小瓶(single vial)調配物或兩小瓶(two-vial)調配物。單小瓶調配物可為液體注射劑或注射用之冷凍乾燥粉末。基於兩小瓶之調配物包括一瓶包含pDNA而另一瓶包含脂質分散體。可將兩個小瓶在投予時混合。
包含根據本發明製備之免疫原性組成物或調配物的DNA疫苗在5±3℃下穩定至少6個月且在25±2℃下穩定3個月。
在另一具體實施例中，本發明之DNA構築體或載體係肌內或皮內注射至個體中。根據本發明之免疫方法包括無針頭注射系統(NFIS)或電穿孔器或直接針頭注射中任一者。
在該等具體實施例中之一者中，本發明提供包含本發明之DNA構築體或載體的免疫原性組成物。在進一步具體實施例中，本發明提供製造包含本發明之DNA構築體或載體的免疫原性組成物之方法。
在另一具體實施例中，本發明提供包含DNA構築體或其之功能性變體(群)的免疫原性組成物。
在該等具體實施例中之一者中，本發明提供包含本發明之DNA構築體或載體的疫苗。在較佳具體實施例中，本發明提供包含SARS-CoV-2之S基因或SARS-CoV-2之S基因之S1區域的DNA疫苗。在進一步具體實施例中，本發明提供包含SARS-CoV-2之S基因或SARS-CoV-2之S基因之S1區域及編碼選自IgE訊息肽或t-PA訊息肽的訊息肽之基因的DNA疫苗。
在較佳具體實施例中，根據本發明之疫苗包括：包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之基因的載體、或包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之S1區域之基因的載體。在進一步具體實施例中，根據本發明之疫苗提供包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之基因或編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之S1區域之基因及編碼選自IgE訊息肽或t-PA訊息肽的訊息肽之基因的載體。
在該等具體實施例中之一者中，根據本發明製備之疫苗進入個體中誘導體液性及/或細胞性免疫反應。細胞性反應可藉由ELISA或FACS或ELISpot測量。在該等具體實施例中之一者中，根據本發明製備之疫苗誘導生成抗病毒CD8
+
T細胞反應。在該等具體實施例中之一者中，根據本發明製備之疫苗誘導生成抗病毒CD4
+
T細胞反應。在該等具體實施例中之一者中，根據本發明製備之疫苗誘導IFN-γ表現。
在另一具體實施例中，根據本發明製備之疫苗進入個體中誘導生成冠狀病毒中和抗體。
在另一具體實施例中，本發明藉由投予合適的治療性劑量的根據本發明製備之DNA疫苗來提供治療或預防冠狀病毒或其相關疾病之方法。
在該等具體實施例中之一者中，發現該DNA疫苗為耐受良好且在重複絕對人類劑量(repeated absolute human dose) (6 mg)下無任何明顯的毒性徵象。在該等具體實施例中之一者中，本發明之DNA疫苗係與細胞介素共同遞送以增強病毒感染中有益之Th1免疫反應之產生。
本發明提供包含SARS-CoV-2之S基因的DNA構築體。在本申請案中所指之S基因可為全長S基因、或S基因之合適截斷部分、或S基因之功能性變體(群)，較佳地為S基因之S1區、或包含S基因之部分的合適的受體結合結構域、或可誘導免疫反應的S基因之合適的片段。在較佳具體實施例中，根據本發明之DNA構築體包含SARS-CoV-2之S基因。在較佳具體實施例中，根據本發明之DNA構築體包含SARS-CoV-2之S基因之S1區域。根據本發明之DNA構築體具有如SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 8或SEQ ID No. 10所示之核苷酸序列。由根據本發明製備之DNA構築體表現的胺基酸序列係選自SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7、及SEQ ID NO. 9。本發明亦提供包含可提供更高S基因表現的SARS-CoV-2之S基因的DNA構築體。包含SARS-CoV-2之S基因的該DNA構築體具有耐受熱應力、在室溫下穩定、及在多次凍融循環後穩定之能力。具有耐受熱應力、在室溫下穩定、及在多次凍融循環後穩定之能力的DNA構築體表現具有脯胺酸取代之SARS-CoV-2之融合前穩定S蛋白質之胺基酸序列。根據本發明之該脯胺酸取代係選自K986P、V987P、F817P、A892P、A899P、A942P、及其合適的組合。脯胺酸取代之該等較佳組合中之一者係K986P及V987P。其可稱為2P(二個脯胺酸取代)。脯胺酸取代之另一較佳組合係K986P、V987P、F817P、A892P、A899P、及A942P。其可稱為hexaPro(六個脯胺酸取代)。編碼具有六個脯胺酸取代之SARS-CoV-2之S蛋白質的DNA構築體具有如SEQ ID No. 12所示之核苷酸序列。編碼具有二個脯胺酸取代之SARS-CoV-2之S蛋白質的DNA構築體可藉由密碼子最佳化方法及如本文中實施例所示之本發明之載體來製備。由具有耐受熱應力、在室溫下穩定、及在多次凍融循環後穩定之能力的DNA構築體表現的胺基酸序列，根據本發明係SEQ ID NO.：11 (Hexapro)或SEQ ID NO.：13(2P)。2019-nCoV使用密集醣化棘突(S)蛋白質得以進入宿主細胞。該S蛋白質係以亞穩融合前構形存在的三聚體I類融合蛋白質，其經歷明顯的結構重排以使病毒膜與宿主細胞膜融合。當S1次單元結合至宿主細胞受體時，此過程被觸發。受體結合使融合前三聚體不穩定，導致S1次單元之脫落並使S2次單元轉變成穩定融合後構形(3)。
眾所週知，2019-nCoV S及SARS-CoV S共享相同的功能性宿主細胞受體，ACE2。亦報導ACE2以~15 nM親和力結合至2019- nCoV S細胞外結構域，該親和力比ACE2結合至SARS-CoV S高~10至20倍。2019-nCoV S對人類ACE2之高親和力可能對2019-nCoV能在人與人之間的傳播明顯容易有所貢獻(3)。本發明提供編碼SARS-CoV-2之全長S蛋白質之DNA構築體或編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之S1區域之DNA構築體。
本發明之DNA構築體包括建構攜帶編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之基因的載體。本發明之載體可攜帶SARS-CoV-2抗原、其片段、其變體、或其組合。包含本發明之DNA構築體的載體可為質體DNA(pDNA)。根據本發明之載體可攜帶SARS-CoV-2之S蛋白質之S1區域。載體視需要地可包含編碼IgE訊息肽之基因。訊息肽涉及將表現的S蛋白質或S1蛋白質運輸至細胞膜，從細胞膜將其分泌到間質空間中或其可保持結合在細胞膜上，在此S蛋白質抗原或S蛋白質抗原之S1區域經交叉呈遞給APC。APC藉由直接攝取抗原或藉由吞噬抗原表現體細胞，通過彼等的MHC I及MHC II複合體將抗原呈遞給CD4
+
及CD8
+
T細胞。分泌的蛋白質亦藉由B細胞經由B細胞受體來辨識，並通過MHCII複合體呈遞，誘導病毒中和。
根據本發明較佳的載體係pVAX1 (Invitrogen, USA)。載體pVAX1之建構技術已經確立且該載體已廣泛用於DNA疫苗之建構(4及5)。本發明之載體可進一步包括高水平表現全長S蛋白質或S蛋白質之S1區域所需之調節元件(群)。此類調節元件(群)及包含調節元件之組合的載體完整揭示於例如專利文件WO2008085956、WO 2012046255、及
WO 2007017903中。所屬技術領域中具有通常知識者可藉由所屬技術領域中已知的技術製造包含本發明之新型構築體的表現載體。較佳地，本發明提供攜帶2019-nCoV棘突S蛋白質之全長S基因或S1基因區域與編碼IgE訊息肽之基因的DNA質體載體pVAX1。替代地，t-PA訊息肽可用於製備攜帶S基因或S1基因的質體載體。本發明亦提供製造本發明之載體之方法。進一步，本發明提供將DNA構築體或DNA質體載體注射至肌肉細胞中。其可藉由所屬技術領域中已知的基於標準針頭之技術完成。此種轉染較佳地係藉由無針頭注射系統或藉由電穿孔器系統進行。無針頭注射系統(NFIS)係所屬技術領域中具有通常知識者已知的。NFIS之使用消除在疫苗投予期間針頭之使用，因此消除與尖針(sharp-needle)浪費相關之成本與風險。進一步，NFIS不需要外部能量來源諸如蓄氣筒或電力及彈簧提供裝置動力。相較於針頭及注射筒在跨個體間之皮內累積不一致(如藉由疹(bleb)大小所測量)且在動物物種間變化，此等注射器產生加壓流體流，其以高速滲透入皮膚達2 mm，導致在細胞中均勻的DNA子分散及更高的攝取。無針頭注射系統中之一者可為Pharmajet
®
裝置。該裝置目前在商業上用於某些疫苗接種中，諸如-MMR疫苗、IPV疫苗、及Flu疫苗之疫苗接種。進一步，該裝置已在DNA疫苗之臨床試驗中進行評估(6)。在電穿孔裝置之中，可使用Cliniporator
®
、Trigrid Delivery System、或Cellectra
®
裝置。此等裝置已經廣泛用於數種DNA遞送試驗中，範圍自基因療法至感染性疾病預防(7、8、及9)。質體DNA構築體較佳地為肌內注射至肌肉細胞中。將DNA構築體直接投予至肌肉細胞中，使其作為游離基因體保留在細胞核中而不會被整合至宿主細胞DNA中。在游離基因體中，插入選殖的DNA可使用宿主細胞蛋白質轉譯機器指揮合成編碼全長S蛋白質抗原或S蛋白質抗原之S1區域。根據本發明製備之DNA構築體亦可經由其他非經腸胃途徑投予至個體中。此種非經腸胃途徑係選自皮下、靜脈內、皮內、經皮、及穿皮(transdermal)、以及遞送至組織之間質空間。DNA構築體可經調適用於非經腸胃投予，例如可為無菌且無熱原的可注射之形式。在該等具體實施例中之一者中，本發明提供包含DNA構築體或包含本發明之DNA構築體的載體的免疫原性組成物。此種免疫原性組成物可視需要地包括編碼IgE訊息肽之基因或編碼t-PA訊息肽之基因。本發明進一步提供製造包含本發明之DNA構築體或基於DNA構築體之載體的免疫原性組成物之方法。該方法包括(i)製備DNA構築體或製備包含DNA構築體的載體及(ii)將合適的佐劑及/或合適的醫藥賦形劑添加至步驟(i)之製備中。合適的醫藥賦形劑係選自緩衝劑、穩定劑、佐劑、及其合適的組合。製備DNA構築體包括建構編碼SARS-CoV-2之S蛋白質或SARS-CoV-2之S蛋白質之S1區域，其視需要地具有編碼IgE訊息肽之基因的DNA構築體。在建構編碼SARS-CoV-2之S蛋白質或SARS-CoV-2之S蛋白質之S1區域的DNA構築體中所使用之載體較佳地係pVAX1。根據本發明製備之免疫原性組成物係非經腸胃投予至個體中。此種非經腸胃途徑係選自肌內，皮下、靜脈內、腹膜內、皮內、經皮、及穿皮、以及遞送至組織之間質空間。免疫原性組成物體可經調適用於非經腸胃投予，例如可為無菌且無熱原的可注射之形式。在較佳具體實施例中，本發明提供包含本發明之DNA構築體或包含本發明之DNA構築體的載體的DNA疫苗。DNA疫苗之該DNA構築體包含編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之基因或編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之S1區域之基因。此種疫苗可視需要地包括編碼IgE訊息肽之基因。疫苗可包括SARS-CoV-2抗原肽、SARS-CoV-2抗原蛋白質、其變體、其片段、或其組合。根據本發明製備之疫苗係非經腸胃投予至個體中。此種非經腸胃途徑係選自肌內，皮下、靜脈內、腹膜內、皮內、經皮、及穿皮、以及遞送至組織之間質空間。疫苗可經調適用於非經腸胃投予，例如可為無菌且無熱原的可注射之形式。在該等具體實施例中之一者中，根據本發明製備之疫苗或免疫原性組成物包括包含根據本發明製備之DNA或載體的不同調配物。本發明之免疫原性組成物可在水或鹽水中製備。根據本發明之免疫原性組成物或調配物係用具有不同離子強度之緩衝劑、穩定劑(群)、佐劑(群)、及視需要地其他合適的醫藥賦形劑(群)製備。在本發明之較佳具體實施例中，該免疫原性組成物由下列所組成：(a)緩衝劑；(b)選自自由基清除劑及/或金屬離子螯合劑的穩定劑(群)；(c)選自鹽酸布比卡因及/或選自Vi-多醣、酶原及/或聚葡萄胺糖的糖類的其他醫藥賦形劑(群)；及(d)選自氫氧化鋁凝膠、細菌衍生之佐劑、親脂性佐劑、親水性佐劑、佛氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant, CFA)、佛氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant, IFA)、單磷醯脂質A、β植固醇、及其合適的組合的佐劑(群)。包含pDNA的各種免疫原性組成物係使用具有不同離子強度或不同pH之緩衝劑製備。
較佳地，調配物或免疫原性組成物係pDNA脂質體調配物。在該等具體實施例中之一者中，該調配物係藉由使用陽離子脂質(CL)之脂質包埋方法來製備，該陽離子脂質包含一或多種選自DOTMA(1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙烷)及DOTAP(N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基甲基硫酸銨)的脂質。該調配物可用於質體DNA遞送。當CL與pDNA形成複合物時CL係用作pDNA之載劑且此一複合物將pDNA運輸至細胞液中。形成pDNA脂質體取決於陽離子脂質氮(N)對pDNA磷酸鹽(P)之莫耳比(在此稱為N/P比)。N/P比影響pDNA脂質體之最終特性，諸如大小、表面ζ電位、及再現性，並從而反映彼等的轉染後效率。pDNA脂質體經常藉由添加輔助脂質(群)製備。輔助脂質(群)係中性脂質(群)，將其併入以增強轉染。根據本發明之較佳調配物包含選自1、2、及3的N/P比。對於包含輔助脂質(群)的調配物，根據本發明之陽離子脂質對輔助脂質之莫耳比係1:1。
pDNA脂質體調配物可包含單小瓶調配物或兩小瓶調配物。單小瓶調配物可為液體注射劑或注射用之冷凍乾燥粉末。基於兩小瓶之調配物包括一瓶包含pDNA而另一瓶包含脂質分散體。可將兩個小瓶在投予時混合。
更佳地，本發明之調配物或免疫原性組成物係包含pDNA與磷酸鹽緩衝液的液體調配物。該pDNA構築體包含編碼全長S基因之基因。包含pDNA與磷酸鹽緩衝液的該免疫原性組成物或液體調配物亦可稱為本發明之DNA疫苗，其係最終調配藥物產品。根據本發明製備之最終藥物產品在5±3℃下至少穩定6個月且在25±2℃下進一步穩定3個月。
根據本發明製備之疫苗進入個體中誘導對抗冠狀病毒(較佳地為SARS-CoV-2)之體液性及/或細胞性免疫反應。在該等具體實施例中之一者中，根據本發明製備之疫苗誘導生成抗病毒CD8
+
T細胞反應。誘發的CD8
+
T細胞反應可為多功能性。誘導的細胞性免疫反應可包括誘發CD8
+
T細胞反應，其中CD8
+
T細胞產生IFN-γ、TNF-α、IL-2、或IFN-γ與TNF-α之組合。免疫反應可藉由ELISA來測量，如本申請案中所述。檢測健康個體在免疫之後抗體水平之變化。對疫苗具有反應的個體可標記為血清轉化。血清轉化在本文中定義為對抗S或S1蛋白質之抗體力價自基線或安慰劑組升高四倍。在不同動物模型中對根據本發明製備之DNA疫苗進行體內評估，並已證實在不同動物模型物種中具有誘發對抗SARS-CoV-2，S抗原之免疫原性反應之能力。即使在最後一次給藥後三個月之後，小鼠中對抗棘突抗原之血清IgG水平仍然維持，其表明藉由本發明之DNA疫苗生成長期免疫反應。此亦指明本發明之DNA疫苗當再次暴露時可誘導藉由平衡記憶B細胞及輔助T細胞表現生成強大繼發性記憶免疫反應。進一步，亦可測量包括Th-1及Th-2細胞激素但不限於IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、及IL-10的細胞激素反應。在該等具體實施例中之一者中，根據本發明製備之疫苗提供顯著增加之IFN-γ表現，指明強Th1反應。
本發明之疫苗可進入個體中誘導生成冠狀病毒中和抗體。此外，其可誘導生成與SARS-CoV-2棘突蛋白質反應的免疫球蛋白G (IgG)抗體。用於測試中和抗體之方法可為使用慢病毒(lentivirus)載體或使用VSV載體或使用麻疹載體系統之假型病毒粒子檢定。DNA疫苗接種後的血清中和抗體(neutralizing antibody, Nab)力價，可藉由微中和檢定及Genscript中和抗體檢測套組測試。藉由兩種方法測試的Nab力價值證實，本發明之DNA疫苗生成強大的反應並中和SARS CoV-2病毒，從而賦予對抗感染之保護性免疫。
本發明藉由投予合適的治療性劑量的根據本發明製備之DNA疫苗來提供治療或預防冠狀病毒(較佳地SARS-CoV-2或其相關疾病之方法。疫苗可用於防禦任何數量的SARS-CoV-2菌株，從而治療、預防及/或防禦基於SARS-CoV-2之病理。DNA疫苗可以單劑、兩劑或三劑方案投予，每劑之間間隔14至28天。
在該等具體實施例中之一者中，當皮內以及肌內投予時，本發明之DNA疫苗係安全且耐受的。在大鼠及兔子中，本發明之DNA疫苗係安全的，當皮內投予時高達2mg而當肌內投予時為6 mg劑量。在動物組中任一者均未觀察到治療相關之影響。進一步組織病理學檢查證實在內臟器官中沒有肉眼可見的病灶。
在該等具體實施例中之一者中，本發明之DNA疫苗係與細胞介素共同遞送以增強病毒感染中有益之Th1免疫反應之產生。一種此種細胞激素可為IFN-α、或聚乙烯二醇化(pegylated) IFN-α、或IFNβ，彼等可與本發明之疫苗共同遞送以增強病毒感染中有益之Th1免疫反應之產生。
實施例
提出下列實施例以便對發明所屬技術領域中具有通常知識者提供如何執行本文中請求之DNA構築體、其組成物、其疫苗及方法之揭露及描述。彼等僅意欲純粹舉例說明且不意欲限制本揭露之範圍。本發明之其他DNA構築體可使用如描述於提供的實施例中之方法與一些修改來發展。一些修改對所屬技術領域中具有通常知識者係已知的。
實施例 1 ： SARS-CoV-2 之全長 S 基因或 S1 基因之合成或單離
全長S基因(SEQ ID No.：1)及S基因之S1區域(SEQ ID No.：2)之胺基酸序列係取自NCBI (MN908947.2.)。感興趣之基因經密碼子最佳化以用於在人類中表現並由GeneArt, Germany化學合成。S基因及S基因之S1區域之密碼子最佳化核苷酸序列在本文中上文給定的核苷酸序列中以粗體之方式突顯。
實施例 2 ：建構編碼 S 基因或 S1 基因及 IgE / t-PA 訊息肽之載體
將所有化學合成基因、具有IgE前導序列之全長S基因(SEQ ID No.：3及SEQ ID No.：4)、具有t-PA前導序列之全長S基因(SEQ ID No.：5及SEQ ID No.：6)、具有IgE前導序列之S基因之S1區域(SEQ ID No.：7及SEQ ID No.：8)、具有t-PA前導序列之S基因之S1區域(SEQ ID No.：9及SEQ ID No.：10)用
Nhe
I及
Apa
I限制位消解並插入到用相同限制酶組消解的pVAX1載體中。基因之存在及完整性係藉由Sanger定序及載體之限制酶剖析確定。將攜帶具有IgE前導序列之全長S基因的pVAX1載體命名為ZVTC_COV1(圖1)。將攜帶具有t-PA前導序列之全長S基因的第二載體命名為ZVTC_COV2(圖2)。將攜帶具有IgE前導序列之S基因之S1區域的第三載體命名為ZVTC_COV3(圖3)及將攜帶具有t-PA前導序列之S基因之S1區域的第四載體命名為ZVTC_COV4(圖4)。以相同方式，藉由遵循如在本文實施例1及實施例2中所示之方法製備編碼具有2P取代或具有Hexapro取代之SARS-CoV-2之S蛋白質的質體DNA構築體。將該質體DNA構築體在DH5-α™化學勝任細胞(chemically competent cell)中轉形。在熱休克轉形(heat shock transformation)步驟之後，將攜帶質體DNA構築體的大腸桿菌選殖株藉由平板接種在包含康黴素抗生素之LB瓊脂盤上來單離。挑取單一菌落並接種於包含來自具有康黴素之Hi-Media的LB培養液的燒瓶中。將燒瓶在37℃振盪培養箱中以225 rpm培養20Hr。使用小量製備(miniprep)質體單離套組將來自各選殖株之培養物用於質體單離。用
BamH1 、 Nhe1
及
Apa1
對所有構築體進行限制消解，來確認插入物之預期條帶釋出以選擇陽性選殖株。選擇陽性植選殖株用於製備丙三醇儲液並儲存在-70℃下。
實施例 3 ： DNA 構築體之體外表現分析
DNA疫苗候選物之體外表現係藉由在Vero細胞株中轉染其來確認。對於轉染實驗，將Vero細胞以3×10
5
個細胞/ml之密度接種在6孔盤中並放置在CO
2
培養箱中以獲得80至90%滿盤。在24Hr之後，一旦細胞達到所欲之滿盤時，在具有Lipofectamine 2000試劑(Thermo Fisher)之OptiMEM無血清培養基中進行轉染。對於轉染實驗，使用二種不同濃度(4μg及8μg)的DNA構築體。在轉染之後，用包含FBS的新鮮DMEM培養基(Biowest)補充培養基。在72Hr之後，將盤用1:1的丙酮及甲醇固定。將抗S1兔子多株抗體(Novus)添加至各孔中並培養1小時，隨後用經FITC標記之抗兔子抗體(Merck)培養。使用倒裝顯微鏡(ZeissAX10)捕捉螢光影像。在將Vero細胞用DNA構築體或空質體(對照)轉染之後，藉由免疫螢光法顯示S蛋白質及S1蛋白質表現的螢光影像在此分別如圖5a及圖5b所給出。
實施例 4 ：將載體轉染到宿主細胞中
此實施例描述用編碼S基因或S1基因之載體轉染CHO宿主細胞株。使用2種不同方法在CHO宿主細胞株中進行轉染。
(1) 使用電穿孔法轉染Freestyle CHO-S細胞(Invitrogen)
將Freestyle CHO-S細胞(Invitrogen)用作轉染宿主。將細胞在Lonza的Power CHO 2 CD培養基中常規培養。在轉染前~24小時接種細胞，以使彼等以指數生長期生長。採用Neon轉染系統(Invitrogen)遵循預先最佳化的條件經由電穿孔執行轉染。轉染後，將細胞平板接種於包含1 ml預熱培養基(來自Lonza)的24孔盤中。在5% CO
2
存在下，將細胞在37℃之潮濕培養箱中培養。在1至3週期間內定期監測池中細胞數。將轉染池進一步轉移至6孔盤並接著轉移到T燒瓶/培養管(T-flasks/culti-tube)中。儲存轉染池細胞及上清液用於S基因或S1基因之表現分析。
(2) 使用基於脂質之方法轉染於ExpiCHO S™細胞(Gibco，ThermoFisher)
將ExpiCHO S™細胞常規保持於ExpiCHO™表現培養基中。在轉染前一天，拆分ExpiCHO S™細胞至最終密度為3×10
6
個細胞/ml。第二天，使用ExpiFectamine™CHO試劑根據製造商規程(Gibco，ThermoFisher)執行瞬時轉染。轉染後，添加ExpiFectamine™ CHO Enhancer並在第一天將細胞移至32℃。在第1天及第5天進行進料。當細胞生存力達到＜50%時收取培養物。進一步，儲存細胞及上清液用於表現分析。
實施例 5 ：製備包含 pDNA 的免疫原性組成物或調配物
製備免疫原性組成物-
按照最終調配物濃度，在恆定攪拌下將編碼具有IgE訊息肽(在本文中表示為SEQ ID NO. 4)之S基因的純化質體DNA添加至無菌過濾磷酸鹽緩衝液中。在確保均勻之後，使用0.2µ過濾器將調配原液過濾滅菌。將混合物填充於小瓶中並目視檢查。隔離小瓶並收集品質控制樣本用於測試。將剩餘的小瓶標記並包裝在單一紙箱中且在2至8℃下儲存。
穩定性數據顯示，根據本發明製備之DNA疫苗可在2至8℃下長期儲存且進一步在25℃下儲存3個月。在大流行爆發之背景下，對大規模疫苗接種而言，疫苗之穩定性概況在易於部署及分發方面扮演至關重要的角色。
單小瓶調配物：
脂質分散體係藉由薄膜水合(thin film hydration)法及乙醇注射法(ethanol injection method)製備。向該脂質分散體添加pDNA並混合以形成pDNA脂質體。將pDNA脂質體藉由浴槽式超音波(bath sonication)或均質化或合適的方法解聚集(de-aggregated)。接著將pDNA脂質體藉由IM注射投予。進一步，可將pDNA脂質體調配物冷凍乾燥以穩定所製備的調配物。pDNA脂質體調配物可藉由添加超冷保護劑(諸如蔗糖、乳糖、或甘露醇)而冷凍乾燥。然後，將產品經受冷凍乾燥。在投予時，將pDNA脂質體調配物小瓶用注射用無菌水或合適的緩衝劑重構。接著將重構的pDNA脂質體藉由IM注射投予。
兩小瓶調配物：
製備小瓶1- 脂質分散體係藉由薄膜水合法及乙醇注射法製備。將脂質分散體之粒徑降低至200 nm以下。接著將脂質分散體通過0.2 µ無菌級過濾器過濾並填充入小瓶1 (Vial 1)中。
製備小瓶2(Vial 2)-其包含無菌過濾的pDNA溶液。
pDNA脂質體係在受控室溫下藉由混合小瓶1及小瓶2之內容物製備。接著將pDNA脂質體藉由IM注射投予。
實施例 6 ： DNA 疫苗的動物免疫
DNA疫苗的免疫原性研究在得到機構動物倫理委員會(Institutional Animal Ethics Committee)的倫理批准之後，於近親BALB/C小鼠、豚鼠、及紐西蘭白兔模型中進行。在此研究中使用BALB/c小鼠(5至7週大)、豚鼠(5至7週大)、及紐西蘭白兔(6至12週大)。對於小鼠皮內免疫，在第0天；藉由使用31規格針(31 gauge needle)將25μg及100μg的DNA疫苗投予至皮膚。將用空質體注射之動物用作媒劑對照(vehicle control)。在免疫之後兩週，給予動物第一次追加劑量。同樣地，所有小鼠在第一次追加劑量之後兩週給予第二次追加劑量。對於豚鼠研究，使用相同的給藥及排程進行皮內免疫。在兔子中，DNA疫苗係藉由使用無針頭注射系統(NFIS)以500μg劑量以相同3劑方案及排程投予至皮膚。在第0天(免疫之前)及第28天(在2劑之後)及在第42天(在3劑之後)自動物收集血液以用於血清樣本之免疫學評估。在小鼠模型中，評估疫苗長期免疫原性直至第126天。進一步，評估在第0天、第28天、及第42天之脾細胞的IFN-γ反應。
實施例 7 ：在動物模型中用不同免疫原性組成物之免疫原性研究
根據本發明製備之DNA疫苗以其不同劑量強度及用不同免疫原性組成物測試。藉由IM/ID/SC途徑將25至100 µg的包含：包含編碼全長S基因之基因的質體DNA構築體之SARS-CoV-2 DNA疫苗遞送至小鼠或豚鼠中。如下表4中所述，將25 µg及100 µg的SARS-CoV-2 DNA疫苗皮內投予至Balb/c小鼠及豚鼠。
表4：DNA疫苗之免疫原性研究的研究計畫
| 物種 | 年齡 | 劑量 | 途徑 | 給藥方案 | 採血時間點 |
| Balb/c | 5至7週 | 25 & 100 µg劑量 | 皮內 | 第0天、第14天、第28天 | 第14天，第28天、第35天、第42天 |
| 豚鼠 | 5至8週 | 25 & 100µg劑量 | 皮內 | 第0天、第14天、第28天 | 第14天，第28天、第35天、第42天 |
在第0天將0.1mL/0.05ml/0.5ml的疫苗調配物通過
IM/ID/SC途徑注射在小鼠及豚鼠中。在第14天及第28天重複相同的免疫程序。觀察動物直至56天。為藉由ELISA及其他方法評估免疫原性，動物在第0天、第14天、第28天(免疫之前)採血，且亦在第42天及第56天採血。如實施例8中所述，使用標準ELISA針對SARS-CoV-2之重組S1抗原測試血清樣本。
實施例 8 ：藉由 ELISA 分析對 S 或 S1 蛋白質之抗體反應
在疫苗接種後進行間接ELISA以檢測對抗S及S1蛋白質之IgG抗體。IgG抗體力價之上升4倍被認為係血清轉化。將96孔盤用50ng/孔的SARS-CoV-2之重組純化S1棘突蛋白質(Acro，USA)於磷酸鹽緩衝液(PBS)中在4℃下塗佈過夜，將盤洗滌三次，接著在37℃下用5%脫脂乳(BD Difco)於PBS中阻斷1小時。亦可使用於PBS中之牛血清白蛋白(BSA)代替於PBS中之脫脂乳。接著將盤用PBS洗滌三次，並在37℃下用小鼠及豚鼠血清之連續稀釋液培養並培養2小時。將盤再次洗滌三次並接著用1：2,000稀釋的山葵過氧化酶(HRP)共軛抗小鼠IgG二級抗體(Sigma-Aldrich)稀釋液或1：5,000稀釋的山葵過氧化酶(HRP)共軛抗豚鼠IgG二級抗體(Sigma-Aldrich)培養並在37℃下培養1小時。培養可在RT下執行來代替在37℃下。在使用TMB過氧化酶受質(KPL)對最終洗滌盤顯影之後，用TMB 停止溶液(1 N H
2
SO
4
)停止反應。使用多模式讀取器(multimode reader) (Molecular Devices，USA)在30分鐘內將盤在450 nm波長下讀取。藉由皮內途徑用DNA疫苗候選物之免疫在BALB/c小鼠及豚鼠中以劑量依賴性方式誘發對抗S蛋白質之顯著血清IgG反應，其中在第42天(3次給藥之後)在BALB/C小鼠及豚鼠中平均終點力價(mean end point titre)分別達到~28000及~140000(圖6及圖7)。在最後一次給藥之後約3.5個月研究小鼠長期抗體反應，並檢測到平均終點IgG力價為~18000(圖6)，表明藉由DNA疫苗候選物生成可持續性免疫反應。
實施例 9 ：藉由測量細胞激素產生來分析細胞免疫反應
在最終注射後兩週，自脾臟或單核細胞製備單細胞懸浮液。以三重複方式在96孔盤中每孔接種2至3×10
5
個細胞於補充有10 % FBS之RPMI-1640培養基(Sigma)中。在37℃及5% CO
2
下，將培養物於下列各種條件下刺激60小時：5μg/ml的伴刀豆球蛋白A(陽性對照)、5μg/ml的純化S抗原(特異性抗原)、5μg/ml的BSA(無關聯抗原)、或單獨培養基(陰性對照)。根據製造商規程將20μl的CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent (Promega，USA)添加到各孔中。在37℃下培養4小時後，在490 nm下讀取吸收值。使用刺激指數(stimulation index，SI)估計增殖活性(
poliferative activity)。SI經定義為包含抗原之孔的平均OD 490除以無抗原之孔的平均OD 490。在血清樣本以及在細胞增殖之後獲得的上清液中測得細胞激素反應。藉由ELISA/FACS/ELISpot檢定評估對SARS-CoV-2之細胞免疫反應。根據細胞激素檢測套組提供的標準操作程序執行檢定。
IFN-γELISPOT檢定
對於IFN-γELISPOT檢定，將免疫小鼠之脾臟收集在包含補充有2X抗生素(抗生素、抗黴菌劑，
Thermoscientific)之RPMI 1640 (Thermoscientific)培養基的無菌管中。細胞懸浮液係在無菌培養盤中藉由用10 ml注射器(BD)之柱塞的皿底部壓碎脾臟來製備。接著將5至10 ml的補充有1X抗生素之RPMI-1640培養基添加至其中並將內容物混合均勻。將皿保持靜置2分鐘，並將澄清的上清液緩慢吸出到細胞濾器(BD)中。將濾液收集於無菌管中，並將細胞藉由離心機(Thermo Scientific)以250×g在4℃下離心10分鐘來沉澱。收集包含紅血球(RBC)及脾細胞的沉澱物(pellet)。將2至3 ml RBC溶解緩衝劑(Invitrogen)添加至包含脾細胞之沉澱物中並在室溫下培養5至7分鐘。在培養之後，添加先前添加RBC溶解緩衝劑之三倍體積的補充有10% FBS(Biowest)及1X抗生素之RPMI 1640。將沉澱物用補充有10% FBS及1X抗生素之RPMI 1640洗滌兩次並重新懸浮於包含10% FBS及1X抗生素的RPMI 1640培養基中，並將密度為調整至2.0×10
6
個細胞/ml。取出預先塗佈有純化之抗小鼠IFN-γ捕捉抗體的96孔小鼠IFN-γELISPOT套組(CTL，USA)盤，在CO
2
培養箱中用RPMI+10% FBS+1X抗生素阻斷1小時。接著將盤用PBS洗滌一次並接著將200,000個脾細胞添加至各孔中，並用濃度為5.0μg/孔之12-mer肽池(GenScript)(跨越整個SARS-CoV-2 S蛋白質)以及陰性對照(補充有10% FBS及1X抗生素之RPMI1640及陽性對照(伴刀豆球蛋白A，1μg/孔)在5% CO
2
於37℃下刺激24Hr。在刺激之後，將盤用PBS、隨後用包含0.05% tween的PBS洗滌，並按照隨套組提供的製造商說明書使斑點顯影。將盤乾燥並在ELISPOT Reader S6 Versa，(CTL USA)上計數斑點，並用Immunospot軟體7.0版分析。
DNA疫苗候選物之細胞免疫反應
藉由IFN-γELISpot檢定研究T細胞對抗SARS-CoV-2棘突蛋白抗原之反應。在DNA疫苗投予後第14天、第28天、第42天犧牲BALB/c小鼠組(劑量25μg及100μg)。收取脾細胞，並用跨越SARS-CoV-2棘突蛋白質之12-mer重疊肽池刺激單細胞懸浮液24h。在42天後之免疫小鼠脾細胞中，對於25μg及100μg劑量皆觀察到針對SARS-CoV-2棘突肽池每10
6
個脾細胞為200至300 SFC的IFN-γ表現顯著增加(指明強Th1反應)(圖8)。
實施例 10 ：使用野生型 SARS-CoV-2 藉由病毒中和檢定來分析病毒中和
執行微中和測試(MNT)。將獲自BEI來源，USA的病毒(分離株USA-WA1/2020)在Vero-E6細胞中繼代並滴定。將自免疫動物所收集的血清樣本在56℃下熱滅活30分鐘，隨後用細胞培養基兩倍連續稀釋。將稀釋的血清樣本在96孔盤中以1:1之比例與100 TCID
50
的病毒懸浮液混合，隨後培養1Hr。隨後將此在實驗前24Hr接種在96孔組織培養盤中之Vero-E6細胞(1×10
4
個細胞/孔於150 μl的DMEM+10% FBS中)上吸附1Hr。其後將細胞用150 μl的無血清培養基及150 μl的補充有2% FBS之DMEM培養基洗滌，隨後在5% CO
2
培養箱中於37℃下培養3至5天。在顯微鏡下記錄各孔中之細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)。相較於病毒對照，中和經定義為缺乏CPE。在小鼠、豚鼠、及兔子中藉由DNA疫苗誘發中和抗體。來自DNA疫苗候選物免疫的BALB/c小鼠的血清可中和野生SARS-CoV-2病毒株，其中用25μg及100μg劑量方案在第42天的平均MNT力價分別為40及160(表5)。
實施例 11 ：藉由競爭性抑制 ELISA 來檢測中和抗體
競爭性抑制ELISA係使用SARS-CoV-2中和抗體檢測套組(Genscript)執行。套組可檢測對抗SARS-CoV-2之循環中和抗體，該等抗體可阻斷病毒棘突醣蛋白之受體結合結構域(RBD)與ACE2細胞表面受體之間的交互作用。
將不同動物血清樣本用套組中提供的稀釋緩衝劑連續稀釋。將稀釋的血清樣本以1:1比例與HRP共軛RBD以及與陽性對照及陰性對照在37℃下培養30分鐘。接著將血清及HRP共軛RBD混合物添加至預塗佈有ACE2蛋白質之ELSA盤中。之後，將孔盤在37℃下培養15分鐘，隨後用套組中提供的洗滌溶液洗滌四次。在洗滌步驟之後，將TMB溶液添加至孔中並在室溫下避光培養15分鐘，隨後添加停止溶液。在450 nm下讀取盤。藉由使用Graph pad Prism 8.0.1軟體以非線性迴歸曲線擬合就各稀釋液與血清稀釋液獲得的百分比競爭值作圖來計算血清樣本之抑制濃度(IC50)。使用Genscript中和抗體檢測套組，在25μg及100μg劑量方案在第42天獲得的平均IC50力價分別為82及168。進一步，在BALB/c小鼠之長期免疫原性研究中亦檢測中和抗體。在豚鼠及兔子中亦觀察到中和抗體水平之顯著升高(表5)。
表5：在將DNA疫苗投予至BALB/c小鼠、豚鼠、及紐西蘭白兔之後的血清中和抗體力價
| 物種 | 免疫方案 | 中和檢定 | 第 28 天 中和力價 | 第 42 天 中和力價 |
| BALB/c
小鼠 | 25μg
第0天，第14天，第28天 | 微中和(SARS-CoV-2
USA-WA1/2020)-MNT100 | 20 | 40 |
| 100μg
第0天，第14天，第28天 | 微中和(SARS-CoV-2
USA-WA1/2020)-MNT100 | 40 | 160 |
| 25μg
第0天，第14天，第28天 | Genscript®中和檢定-IC50 | 14 | 82 |
| 100μg
第0天，第14天，第28天 | Genscript®中和檢定-IC50 | 71 | 168 |
| 豚鼠 | 25μg
第0天，第14天，第28天 | 微中和(SARS-CoV-2 USA-WA1/2020)-MNT100 | 20 | 80 |
| 100μg
第0天，第14天，第28天 | 微中和(SARS-CoV-2 USA-WA1/2020)-MNT100 | 40 | 320 |
| 25μg
第0天，第14天，第28天 | Genscript®中和檢定-IC50 | 14 | 129 |
| 100μg
第0天，第14天，第28天 | Genscript®中和檢定-IC50 | 21 | 371 |
| 紐西蘭
白兔 | 藉由NFIS注射500μg
第0天，第14天，第28天 | Genscript®中和檢定-IC50 | 30 | 108 |
實施例 12 ：藉由假型病毒粒子檢定來分析中和抗體
產生並滴定假型病毒。對於此假型病毒系統，骨幹係由VSV假型病毒/慢假型病毒或麻疹假型病毒提供，該等假型病毒沿SARS-CoV-2棘突(S)蛋白質包裝表現匣(expression cassette)。
遵循製造商說明書，將293T細胞使用脂染胺(
lipofectamine)用攜帶SARS-CoV-2棘突蛋白質的質體載體及輔助載體轉染。在轉染之後兩小時，將細胞用PBS洗滌三次，且接著會添加新的完全培養基。感染後之2至15天(取決於使用的假型病毒類型)，收取包含培養上清液的SARS-CoV-2假型病毒，過濾(0.45-μm孔徑)並以2-ml等分試樣儲存在-70℃下直到使用為止。SARS-CoV-2假型病毒之50%組織培養感染性劑量(TCID
50
)係使用來自假型病毒庫的單次使用等分試樣判定。所有的儲備液僅使用一次以避免重複凍融循環可能導致的不一致。對於滴定SARS-CoV-2假型病毒，在96孔培養盤中進行2倍初始稀釋，隨後進行連續3倍稀釋(總共9次稀釋)。最後一列作為沒有添加假型病毒之細胞對照。接著，將96盤用調整至預定濃度的經胰蛋白酶處理之哺乳動物細胞接種。在37℃下於5% CO
2
環境中培養2至9天(取決於使用的假型病毒類型)之後，判定陽性孔。使用Reed-Muench方法計算50%組織培養感染性劑量(TCID
50
)。
實施例 13 ： DNA 質體之製造製程
a) 細胞再現及發酵
將來自工作細胞庫的細胞培養物用於預種(pre-seed)培養基接種。將預種培養基在30±1℃下培養以達成OD為
≥1.5。將預種培養基接種到接種發酵培養基(seed
fermentation media)中並在接種發酵槽中於30±2℃下培養。在目標光學密度達到約≥2.0之後，將接種發酵培養基用於生產發酵槽接種。將培養物在30至42℃，pH為7.0±0.3下培養，其中溶氧濃度藉由級聯攪拌及氧富集來保持在0至100%。在細菌達到生長穩定期(stationary phase)之後終止發酵。將收取的培養液離心並將細胞沉澱物儲存在仍執行溶解的-70℃或低於-70℃下。細胞之溶解係藉由化學方法用包含0.2M NaOH及1% SDS的溶液進行。將經溶解之培養物培養液之pH調整至大約pH 5至13。溶解後，將濃縮、細胞溶解產物藉由連續流離心(continuous flow centrifugation)或深層過濾(depth filtration)澄清並收集作為濾液之經澄清之溶解產物。
b) 純化
純化製程係用細胞溶解起始，其藉由保持在1:5至1:12之範圍內之細胞對緩衝劑之比在再懸浮溶液中懸浮。在再懸浮之後，將包含1% SDS及0.2N NaOH的溶液以相同的細胞對緩衝劑之比添加以用於細胞溶解。溶解後，添加冷卻的乙酸鉀緩衝劑以中和溶液之pH在約pH 5.5。在中和之後，將CaCl
2
添加至相同的反應混合物中，其中目標濃度不小於0.5至1.0M CaCl
2
以移除RNA不純物。CaCl
2
處理後，將反應混合物經受澄清，隨後藉由UF/DF進行緩衝劑交換，以恢復溶液。將經恢復的溶液進一步經受陰離子交換管柱層析術以移除殘留RNA及其他產物相關及製程相關的不純物。
經澄清之溶解產物之純化由數種濃縮/滲濾操作及陰離子交換層析術所組成。使用100至500 kDa MWCO(千道耳頓分子量截留)過濾器對經澄清之溶解產物滲濾。使用中性pH之AEX平衡緩衝劑完成滲濾。使用弱陰離子樹脂與洗提緩衝劑以逐步洗提模式將包含DNA質體的濾液純化。此等運行之操作流速大約為120至250 cm/hr。藉由凝膠電泳法分析自陰離子交換管柱洗提出的質體DNA。
進一步，使用100至500 kDa截留匣於TFF中對陰離子交換洗提液滲濾。溫度保持在2至25℃下。濾液包含目標DNA質體。將經滲濾之溶液通過0.2 μm膜過濾器過濾以得到經純化的DNA質體。
以引用方式併入
本文中提及之專利文件及科學文章之各者的全部揭露為所有目的而以引用方式併入。
等效物
本發明可在不背離其精神或基本特徵之情況下以其他特定形式來實施。因此，前述具體實施例應在所有方面中均視為說明性而非限制本文中所描述之本發明。因此，本發明之範圍係以隨附申請專利範圍加以指明，而非由前述描述來指明，且所有在與申請專利範圍相等之意義及範圍內之變化均意欲包括在內。
日期為2021年_________________月_____________日
SEQ ID No.：2-S蛋白質之S1區域之胺基酸序列
SEQ ID NO.：3-具有IgE前導序列之全長S基因之胺基酸序列
1至18加下底線的胺基酸殘基代表IgE前導序列之胺基酸序列，而19至1289胺基酸殘基代表全長S蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO.：4-具有IgE前導序列之全長S基因之核苷酸序列
1至54加下底線的核苷酸殘基代表IgE前導序列之DNA序列(核苷酸序列)，而55至3873核苷酸殘基代表S基因之DNA序列(核苷酸序列)。
SEQ ID NO.：5-具有t-PA前導序列之全長S基因之胺基酸序列
1至22加下底線的胺基酸殘基代表t-PA前導序列之胺基酸序列，而23至1289胺基酸殘基代表全長S蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO.：6-具有t-PA前導序列之全長S基因之核苷酸序列
1至66加下底線的核苷酸殘基代表t-PA前導序列之DNA序列(核苷酸序列)，而67至3885核苷酸殘基代表S基因之DNA序列(核苷酸序列)。
SEQ ID NO.：7-具有IgE前導序列之S基因之S1區域之胺基酸序列
1至18加下底線的胺基酸殘基代表IgE前導序列之胺基酸序列，而19至702胺基酸殘基代表S蛋白質之全長S1區域之胺基酸序列。
SEQ ID NO.：8-具有IgE前導序列之S基因之S1區域之核苷酸序列
1至54加下底線的核苷酸殘基代表IgE前導序列之DNA序列(核苷酸序列)，而55至2112核苷酸殘基代表S基因之S1區域之DNA序列(核苷酸序列)。
SEQ ID NO.：9-具有t-PA前導序列之S基因之S1區域之胺基酸序列
1至22加下底線的胺基酸殘基代表t-PA前導序列之胺基酸序列，而23至706胺基酸殘基代表S蛋白質之全長S1區域之胺基酸序列。
SEQ ID NO.：10-具有t-PA前導序列之S基因之S1區域之核苷酸序列
1至66加下底線的核苷酸殘基代表t-PA前導序列之DNA序列(核苷酸序列)，而67至2124核苷酸殘基代表S基因之S1區域之DNA序列(核苷酸序列)。
SEQ ID NO.：11-具有IgE前導序列之全長S基因(Hexapro)之胺基酸序列
1至18加下底線的胺基酸殘基代表IgE前導序列之胺基酸序列，而19至1289胺基酸殘基代表全長S蛋白質之胺基酸序列。在19至1289區中進一步加下底線的脯胺酸殘基代表6個脯胺酸取代(K986P、V987P、F817P、A892P、A899P、及A942P)，其在本文中被稱為Hexapro取代(
Hexapro substitution)。
SEQ ID NO.：12-具有IgE前導序列之全長S基因(Hexapro)之核苷酸序列
1至54加下底線的核苷酸殘基代表IgE前導序列之DNA序列(核苷酸序列)，而55至3873核苷酸殘基代表S基因(Hexapro)之DNA序列(核苷酸序列)。
SEQ ID NO.：13-具有IgE前導序列之全長S基因(2P)之胺基酸序列
穩定性數據顯示，根據本發明製備之DNA疫苗可在2至8℃下長期儲存且進一步在25℃下儲存3個月。在大流行爆發之背景下，對大規模疫苗接種而言，疫苗之穩定性概況在易於部署及分發方面扮演至關重要的角色。
單小瓶調配物：
脂質分散體係藉由薄膜水合(thin film hydration)法及乙醇注射法(ethanol injection method)製備。向該脂質分散體添加pDNA並混合以形成pDNA脂質體。將pDNA脂質體藉由浴槽式超音波(bath sonication)或均質化或合適的方法解聚集(de-aggregated)。接著將pDNA脂質體藉由IM注射投予。進一步，可將pDNA脂質體調配物冷凍乾燥以穩定所製備的調配物。pDNA脂質體調配物可藉由添加超冷保護劑(諸如蔗糖、乳糖、或甘露醇)而冷凍乾燥。然後，將產品經受冷凍乾燥。在投予時，將pDNA脂質體調配物小瓶用注射用無菌水或合適的緩衝劑重構。接著將重構的pDNA脂質體藉由IM注射投予。
兩小瓶調配物：
製備小瓶1- 脂質分散體係藉由薄膜水合法及乙醇注射法製備。將脂質分散體之粒徑降低至200 nm以下。接著將脂質分散體通過0.2 µ無菌級過濾器過濾並填充入小瓶1 (Vial 1)中。
製備小瓶2(Vial 2)-其包含無菌過濾的pDNA溶液。
pDNA脂質體係在受控室溫下藉由混合小瓶1及小瓶2之內容物製備。接著將pDNA脂質體藉由IM注射投予。實施例 6 ： DNA 疫苗的動物免疫
DNA疫苗的免疫原性研究在得到機構動物倫理委員會(Institutional Animal Ethics Committee)的倫理批准之後，於近親BALB/C小鼠、豚鼠、及紐西蘭白兔模型中進行。在此研究中使用BALB/c小鼠(5至7週大)、豚鼠(5至7週大)、及紐西蘭白兔(6至12週大)。對於小鼠皮內免疫，在第0天；藉由使用31規格針(31 gauge needle)將25μg及100μg的DNA疫苗投予至皮膚。將用空質體注射之動物用作媒劑對照(vehicle control)。在免疫之後兩週，給予動物第一次追加劑量。同樣地，所有小鼠在第一次追加劑量之後兩週給予第二次追加劑量。對於豚鼠研究，使用相同的給藥及排程進行皮內免疫。在兔子中，DNA疫苗係藉由使用無針頭注射系統(NFIS)以500μg劑量以相同3劑方案及排程投予至皮膚。在第0天(免疫之前)及第28天(在2劑之後)及在第42天(在3劑之後)自動物收集血液以用於血清樣本之免疫學評估。在小鼠模型中，評估疫苗長期免疫原性直至第126天。進一步，評估在第0天、第28天、及第42天之脾細胞的IFN-γ反應。實施例 7 ：在動物模型中用不同免疫原性組成物之免疫原性研究
根據本發明製備之DNA疫苗以其不同劑量強度及用不同免疫原性組成物測試。藉由IM/ID/SC途徑將25至100 µg的包含：包含編碼全長S基因之基因的質體DNA構築體之SARS-CoV-2 DNA疫苗遞送至小鼠或豚鼠中。如下表4中所述，將25 µg及100 µg的SARS-CoV-2 DNA疫苗皮內投予至Balb/c小鼠及豚鼠。
表4：DNA疫苗之免疫原性研究的研究計畫
以引用方式併入
本文中提及之專利文件及科學文章之各者的全部揭露為所有目的而以引用方式併入。
等效物
本發明可在不背離其精神或基本特徵之情況下以其他特定形式來實施。因此，前述具體實施例應在所有方面中均視為說明性而非限制本文中所描述之本發明。因此，本發明之範圍係以隨附申請專利範圍加以指明，而非由前述描述來指明，且所有在與申請專利範圍相等之意義及範圍內之變化均意欲包括在內。
日期為2021年_________________月_____________日
