CN113801206B - 利用受体识别域诱导抗新冠病毒中和抗体的方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及利用受体识别域诱导抗新冠病毒中和抗体的方法。具体而言，本申请提供了一种针对新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的免疫原性肽，其包括SARS‑CoV‑2病毒刺突蛋白S的RBD区或经半胱氨酸修饰的RBD区；其编码核苷酸分子、包含该核苷酸分子的载体和宿主细胞。本申请还提供了针对新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的疫苗、其制备和应用。本公开的疫苗安全，可持续产生高效价中和抗体，可用于新型冠状病毒感染及其症状的预防和/或治疗。

Description

利用受体识别域诱导抗新冠病毒中和抗体的方法

技术领域

本公开属于生物技术和疫苗领域。具体而言，本公开涉及利用受体识别域诱导抗新冠病毒(SARS-CoV-2)中和抗体的方法。

背景技术

迄今为止，已经确定了三种高致病性人类冠状病毒(CoVs)，包括中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒 (SARS-CoV)和一种2019年新型冠状病毒(SARS-CoV-2，简称新冠病毒)。

新冠病毒的人际传播率已超过SARS-CoV和MERS-CoV。WHO在2020 年3月11日宣布新冠疫情已发生全球大流行。目前，新冠病毒的中间宿主仍然未知，且没有有效的预防或治疗手段。因此，开发预防和治疗新冠病毒的疫苗和药物是亟待解决的关键问题。

众所周知，在感染性疾病的预防中，疫苗自问世以来就是最为有效和经济的措施，而目前常用的预防疫苗大部分都是以活化中和抗体为目标。因此，为了能够开发出预防新冠病毒的疫苗，我们需要寻找一种能够有效活化中和抗体的免疫原。

冠状病毒包含四种结构蛋白，包括突刺蛋白(S蛋白)、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。其中，S蛋白在病毒的附着、融合和进入过程中起着最重要的作用，也是抗体、进入抑制剂和疫苗的主要靶点。S蛋白介导病毒进入宿主细胞，首先通过S1亚基的受体结合域(RBD)与宿主受体结合，然后通过S2亚基融合病毒和宿主细胞膜。

WHO的《COVID-19全球研究路线图》里指出：冠状病毒疫苗免疫后的动物，再次暴露于活病毒时，可能发生更严重的症状。疫苗免疫产生的非中和抗体或较低的抗体水平可能会引起抗体依赖性增强效应(antibody-dependent enhancement,ADE)，增强病毒致病性。概括来说，中和抗体阻断病毒与细胞表面受体结合，中和病毒感染能力；非中和抗体结合病毒但在一些情况下，抗体 Fc段与细胞表面Fc受体结合，使其可以感染表达Fc受体的细胞。因此，为了减少ADE副作用，新冠病毒S蛋白中的RBD区将是最为有效的疫苗研发靶点。

RBD在S蛋白中的天然构象为三聚体，若将RBD单独纯化，那么少了S2 亚基三聚体的支撑，其构象很有可能会被改变。因此如何维持RBD的构象是需要解决的问题。

本领域中迫切需要开发出可有效产生新冠病毒中和抗体的新型疫苗。

发明内容

本公开中采用新冠病毒的RBD特定区域作为免疫原，同时对RBD区进行一系列修饰，例如加入二硫键、融合蛋白、融合细胞因子，进而使其可有效诱导抗SARS-CoV-2的中和抗体。

在本公开的一个方面中，提供了一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的免疫原性肽，其包括SARS-CoV-2病毒刺突蛋白S的RBD区，所述RBD区进一步经半胱氨酸修饰形成sRBD区。

在一些实施方式中，所述经半胱氨酸修饰为在RBD结构域的根部增加一对半胱氨酸，使之能够形成二硫键。

在一些实施方式中，所述免疫原性肽选自：(a)具有SEQ ID NO：2、4、8 或10所示氨基酸序列的多肽；(b)(a)中所述多肽的同源多肽，例如其与SEQ ID NO:2、4、8或10具有高于或等于90％，高于或等于95％，高于或等于96％，高于或等于97％，高于或等于98％，高于或等于99％的同源性；(c)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有免疫原性的由 (a)衍生的蛋白质或多肽。

在一些实施方式中，所述RBD区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述经半胱氨酸修饰的sRBD区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在一些实施方式中，所述RBD区或经半胱氨酸修饰的sRBD区包含在融合肽中，例如与之融合的部分包括：病毒或宿主来源的蛋白，转铁蛋白(Fn)、HIV p24、囊膜病毒的茎部，如流感HA2、艾滋病毒的gp41、抗体Fc段、GM-CSF、 IL-21、CD40L或CD40抗体。

在一些实施方式中，所述融合肽可进一步包括：信号肽、连接肽、标签等元件。例如，信号肽可选自：蛋白自身、CD33、CD8、CD16、小鼠IgG1抗体、流感HA。连接肽可选自：(G4S)₃、(G4S)_n、GSAGSAAGSGEF、(Gly)6、 EFPKPSTPPGSSGGAP、KESGSVSSEQLAQFRSLD、(Gly)8、EGKSSGSGSESKST。标签可选自：His-tag、AviTag、Calmodulin tag、 polyglutamate tag、E-tag、FLAG tag、HA-tag、Myc-tag、S-tag、SBP-tag、Sof-tag 1、Sof-tag3、Strep-tag、TCtag、V5 tag、T7 tag、VSV tag、Xpress tag、3X FLAG tag、Isopep tag、Spytag、Snoop tag和PNE tag。

在一些实施方式中，所述免疫原性肽为sRBD-hFn、sRBD-HA2等。

在一些实施方式中，所述融合肽的序列如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10 所示。

在本公开的一个方面中，提供了一种核苷酸分子，其编码本公开的免疫原性肽。

在一些实施方式中，所述核苷酸分子选自：(i)序列如SEQ ID NO：1、3、 7或9所示的核苷酸分子；(ii)在严格条件下与(i)杂交的分子；(iii)与(i)或(ii) 中序列具有高于或等于90％，高于或等于95％，高于或等于96％，高于或等于 97％，高于或等于98％，高于或等于99％的同源性的核苷酸分子；(iv)在(i)或 (ii)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且能够表达功能性RBD免疫原性肽的核苷酸分子。

在一些实施方式中，RBD区的编码序列如SEQ ID NO:1所示，经半胱氨酸修饰的RBD区的编码序列如SEQ ID NO:3所示，或者所述核苷酸分子的序列如SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:9所示。

在一些实施方式中，所述核苷酸分子还包括编码与RBD区或与经半胱氨酸修饰的RBD区融合的部分的序列。

在本公开的一个方面中，提供了一种载体，其包含本公开的核苷酸分子。

在一些实施方式中，所述载体为：病毒载体，如痘病毒(如天坛株、北美疫苗株、惠氏衍生株、李斯特株、安卡拉衍生株、哥本哈根株和纽约株痘病毒)、腺病毒(如Ad5、Ad11、Ad26、Ad35、Ad68)、慢病毒载体、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、呼肠弧病毒、弹状病毒、森林脑炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒载体。

在本公开的一个方面中，提供了一种宿主细胞，其包含本公开的载体和/ 或能表达本公开的免疫原性肽。

在一些实施方式中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞或昆虫细胞，如HEK293、 HeLa、K562、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、 Cos-7、ARPE-19和MRC-5细胞；High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、 Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、 Hz2E5以及Ao38。

在一些实施方式中，所述宿主细胞为K562。在一些实施方式中，所述K562 细胞包含sRBD-HA2。

由此，本公开中还提供了一种在其细胞膜表面展示本文所述新型冠状病毒 SARS-CoV-2免疫原性肽的细胞。在一些实施方式中，所述细胞包含具有本文所述免疫原性肽编码序列的载体。在一些实施方式中，所述细胞转入了具有免疫原性肽编码序列的载体。在一些实施方式中，所述细胞具有展示所述免疫原性肽的完整膜结构。在一些实施方式中，所述细胞是已灭活的细胞，例如采用物理灭活如X-射线辐射、紫外辐射；或化学灭活如β-丙内酯、甲醛、多聚甲醛固定。

在本公开的一个方面中，提供了一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的疫苗，其包含本公开的免疫原性肽、核苷酸分子、载体和/或宿主细胞。

在本公开的一个方面中，还提供了本公开的免疫原性肽、核苷酸分子、载体和/或宿主细胞在制备用于预防或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2的疫苗中的应用。

在本公开的一个方面中，还提供了本公开的免疫原性肽、核苷酸分子、载体和/或宿主细胞，其用于预防或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2。

在本公开的一个方面中，还提供了一种预防或治疗新型冠状病毒SARS- CoV-2的方法，所述方法包括给予有需要的对象本公开的免疫原性肽、核苷酸分子、载体、宿主细胞和/或疫苗。

在一些实施方式中，所述疫苗为核酸疫苗(DNA或RNA疫苗)、重组蛋白亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、细胞载体疫苗。

在一些实施方式中，所述疫苗包含佐剂或与佐剂联用，所述佐剂包括但不限于：铝佐剂、霍乱毒素及其亚单位、寡脱氧核苷酸、锰离子佐剂、胶体锰佐剂、弗氏佐剂、SAS佐剂、MF59佐剂、QS-21佐剂、Poly I:C及其他TLR配体、GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-7、IL-11、IL-12、IL-18、IL-21等。

在一些实施方式中，所述疫苗的形式适于如下接种方式：肌肉接种、皮内接种、皮下接种、滴鼻、雾化吸入、生殖道、直肠、口服或其任意组合。

在一些实施方式中，采用一种或多种所述疫苗进行接种，例如联合接种或前后序贯接种。

在一些实施方式中，采用一种或多种所述疫苗与其他针对新型冠状病毒的疫苗进行接种，例如所述其他疫苗包括针对冠状病毒S或S1的疫苗，例如所述的S或S1来自于包括但不限于SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、 HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、bat-CoV等。

在一些实施方式中，所述疫苗包含核酸疫苗(DNA或RNA疫苗)与重组人源细胞载体疫苗的组合。

在一些实施方式中，所述疫苗包含pcDNA3.1-sRBD-hFn与 K562-HA2-sRBD的组合。在一些实施方式中，所述疫苗组合中的组分前后序贯接种，优选先接种DNA疫苗。

在本公开的一个方面中，提供了一种制备针对新型冠状病毒SARS-CoV-2 的疫苗的方法，所述方法包括：

(a)提供本公开的免疫原性肽、核苷酸分子、载体和/或宿主细胞；

(b)将(a)中所提供的活性物质与免疫学上或药学上可接受的载体组合。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本公开的发明构思和保护范围。本公开的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本公开作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本公开的实施方案，而不是为了局限本公开的范围。

图1：S蛋白及sRBD-hFn(二硫键改造)真核表达载体的构建及蛋白的表达：

图1A.pcDNA3.1-sRBD-hFn及pcDNA3.1-S真核表达载体质粒构建图谱；

图1B.pcDNA3.1-sRBD-hFn及pcDNA3.1-S蛋白在293T细胞中成功表达。

图2:慢病毒表达载体pHAGE-S-puro及pHAGE-sRBD-HA2-puro的构建及S蛋白和sRBD-HA2在K562细胞膜上展示的表达验证：

图2A.pHAGE-S-puro及pHAGE-sRBD-HA2-puro慢病毒表达载体质粒构建图谱；

图2B.pHAGE-S-puro及pHAGE-sRBD-HA2-puro蛋白成功表达；

图2C.sRBD能够与ACE2受体结合。

图3：RBD蛋白对小鼠结合抗体和中和抗体的诱导效果：

实验所用小鼠为6-8周龄C57/BL6，免疫原为新冠病毒RBD蛋白及 pcDNA3.1-S质粒，所述蛋白质均采用铝佐剂进行加强。

图3A.ELISA方法检测免疫结束后第2周小鼠血清中结合抗体的滴度。横坐标为免疫组别，纵坐标为结合抗体的滴度；

图3B.293T-ACE2细胞检测免疫结束后第4周小鼠血清中中和抗体的滴度。横坐标为免疫组别，纵坐标为中和抗体的滴度(ID₅₀)。*表示p<0.05。

图4：质粒pcDNA3.1-sRBD-hFn对小鼠结合抗体和中和抗体的诱导效果：

实验所用小鼠为6-8周龄C57/BL6，免疫原为新冠病毒S质粒pcDNA3.1-S 及修饰后的RBD质粒pcDNA3.1-sRBD-hFn。

图4A.ELISA方法检测免疫结束后第2周小鼠血清中结合抗体的滴度。横坐标为免疫组别，纵坐标为结合抗体的滴度；

图4B.293T-ACE2细胞检测免疫结束后第2周小鼠血清中中和抗体的滴度。横坐标为免疫组别，纵坐标为中和抗体的滴度(ID₅₀)。

图5：K562-HA2-sRBD及K562-S细胞对小鼠结合抗体和中和抗体的诱导效果：

实验所用小鼠为6-8周龄C57/BL6，免疫原为K562-HA2-sRBD及K562-S。

图5A.ELISA方法检测免疫结束后第2周小鼠血清中结合抗体的滴度。横坐标为免疫组别，纵坐标为结合抗体的滴度；

图5B.293T-ACE2细胞检测免疫结束后第2周小鼠血清中中和抗体的滴度。横坐标为免疫组别，纵坐标为中和抗体的滴度(ID₅₀)。

图6:sRBD-hFn蛋白对小鼠结合抗体和中和抗体的诱导效果：

实验所用小鼠为6-8周龄C57/BL6，免疫原为sRBD-hFn蛋白。

图6A.ELISA方法检测免疫后第1周小鼠血清中结合抗体的滴度。横坐标为免疫组别，纵坐标为结合抗体的滴度；

图6B.293T-ACE2细胞检测免疫结束后第1周小鼠血清中中和抗体的滴度。横坐标为免疫组别，纵坐标为中和抗体的滴度(ID₅₀)。

具体实施方式

本公开涉及疫苗领域，特别涉及一种利用RBD区诱导抗新冠病毒(SARS- Cov-2)中和抗体的方法。采用该病毒的RBD区、改造的RBD区、融合其他蛋白或细胞因子的RBD区作为免疫原，可减少由非中和抗体或较低的抗体水平引起的抗体依赖性增强效果(ADE)，从而预防新冠病毒感染。动物实验结果证实，本公开的疫苗安全，可持续产生高效价中和抗体，可用于新冠病毒的预防和治疗。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本公开提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，在数值或范围上下文中的“约”表示所引用或要求保护的数值或范围的±10％。

应理解，当提供参数范围时，本发明同样提供了在该范围内的所有整数及其十分位小数。例如，“0.1-2.5毫克/天”包括0.1毫克/天、0.2毫克/天、0.3毫克/天等直至2.5毫克/天。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

RBD免疫原性肽及其编码分子

如本文所用，术语“RBD免疫原性肽”、“针对新型冠状病毒SARS-CoV-2 的免疫原性肽”和“本公开/本申请的免疫原性肽”等可互换使用，是指包括 SARS-CoV-2病毒刺突蛋白S的RBD区或经半胱氨酸修饰的RBD区(在本文中亦称sRBD区)、且具有激发结合抗体和中和抗体作用的肽。

在本公开的一些实施方式中，免疫原性肽可为：(a)具有SEQ ID NO：2、 4、8或10所示氨基酸序列的多肽；(b)(a)中所述多肽的同源多肽，例如其与SEQ ID NO:2、4、8或10具有高于或等于90％，高于或等于95％，高于或等于96％，高于或等于97％，高于或等于98％，高于或等于99％的同源性；(c)在 (a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有免疫原性的由(a)衍生的蛋白质或多肽。

在一些情况下，免疫原性肽可包括与RBD区或经半胱氨酸修饰的RBD区连接的其他部分，以例如增强RBD区的稳定性、提高中和抗体应答、形成多聚体、增加细胞应答等。可修饰或未修饰的RBD区连接的部分包括但不限于：病毒或宿主来源的蛋白，转铁蛋白(Fn)、HIVp24、囊膜病毒的茎部，如流感 HA2、艾滋病毒的gp41、抗体Fc段、GM-CSF、IL-21、CD40L或CD40抗体等。例如，所述融合肽的序列如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示。

在一些情况下，融合肽中还可包括信号肽、接头、分子标签等元件。例如，信号肽元件可指具有引导融合蛋白分泌、定位和/或输送功能的氨基酸序列，其长度通常为5-30个氨基酸。在一些实施方式中，信号肽元件可选自：蛋白自身信号肽、CD33蛋白信号肽、CD8蛋白信号肽、CD16蛋白信号肽、小鼠IgG1 抗体信号肽、流感HA蛋白信号肽。例如，连接肽序列(或称接头)可指在本文的融合蛋白中起到连接不同元件作用的短肽，其长度通常为1～50(如5～50、 5～40、10～40)个氨基酸。通常，连接肽不影响或严重影响本发明的融合蛋白形成正确的折叠和空间构象。在一些实施方式中，连接肽元件可选自：(G₄S)₃接头、(G4S)_n、GSAGSAAGSGEF、(Gly)6、EFPKPSTPPGSSGGAP、 KESGSVSSEQLAQFRSLD、(Gly)8、EGKSSGSGSESKST。

免疫原性肽也可包括其变异形式，例如一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、 9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能。

免疫原性肽可在适当的环境和条件下通过重组表达产生，例如由本公开的编码核苷酸分子、载体、宿主细胞产生；也可通过化学合成等方式获得，只要其具有所需的氨基酸序列和免疫原性和反应性。

如本文所用，术语“免疫原性肽编码分子”、“RBD编码序列”等可互换使用，均是指编码本公开所述的免疫原性肽的核苷酸分子。所述核酸分子可选自，例如：(i)序列如SEQID NO：1、3、7或9所示的核苷酸分子；(ii)在严格条件下与(i)杂交的分子；(iii)与(i)或(ii)中序列具有高于或等于90％，高于或等于 95％，高于或等于96％，高于或等于97％，高于或等于98％，高于或等于99％的同源性的核苷酸分子；(iv)在(i)或(ii)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且能够表达功能性RBD免疫原性肽的核苷酸分子。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v) 甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。

本公开的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本公开所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

载体和宿主细胞

本公开还涉及包含RBD编码核苷酸分子的载体，以及用该载体经基因工程产生的宿主细胞。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本公开的编码序列可用来表达或生产重组的免疫原性肽。一般来说有以下步骤：

(1)将本公开的编码核苷酸分子，或将含有核苷酸分子的重组表达载体转入合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质或多肽。

本公开中，术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、动物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

可采用本领域常规方法构建含RBD免疫原性肽编码序列和合适的转录/ 翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本公开中可采用诸如pcDNA3.1载体、pIRES2-EGFP载体、AdMaxTM 等表达系统。

此外，表达载体可包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；动物细胞等。在本公开中，可采用例如选自下组的宿主细胞：HEK293、HeLa、 CHO、K562、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19和MRC-5细胞；High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、 Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5 以及Ao38。

本公开的核苷酸分子在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有 10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

疫苗和免疫偶联物

本文中还提供了一种包含本公开的免疫原性肽、核苷酸分子、载体和/或宿主细胞的疫苗，或称免疫组合物。该疫苗包含其形式能够被给予脊椎动物(优选哺乳动物)的本公开的免疫原性肽和/或核酸分子的配制品，并且其诱导提高免疫力的保护性免疫应答以预防和/或减轻新型冠状病毒和/或其至少一种症状。

术语“保护性免疫应答”或“保护性应答”是指通过免疫原介导的针对传染原或疾病的免疫应答，通过脊椎动物(例如人)展现，预防或减轻感染或减少其至少一种疾病症状。

术语“脊椎动物”或“对象”或“患者”是指脊索动物亚门的任何成员，包括但不限于：人和其他灵长类动物，包括非人灵长类动物诸如黑猩猩和其他猿和猴物种；家畜诸如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物诸如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物诸如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟包括驯养、野生和猎鸟诸如鸡、火鸡和其他鹑鸡类鸟、鸭、鹅。术语“哺乳动物”和“动物”被包括在这个定义中，旨在涵盖成年、幼年以及新生个体。

本文的疫苗可为重组蛋白疫苗、重组DNA疫苗、重组病毒载体疫苗(例如腺病毒载体、痘病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、巨细胞病毒载体)、重组细菌载体疫苗、重组酵母载体疫苗或重组病毒样颗粒疫苗。在一些实施方式中，本文的疫苗选自重组DNA疫苗、重组腺病毒载体、重组痘病毒载体或其中一种或两种或三种的组合。

在一些实施方式中，可采用选自下组的一种或多种疫苗或其组合：重组质粒疫苗(DNA)，如包含与人重组Ferritin或HA2融合的经半胱氨酸修饰的RBD 区编码序列的DNA疫苗(例如pcDNA3.1-sRBD-hFn)；重组蛋白亚单位疫苗 (protein)，如RBD蛋白(不包含二硫键修饰)、与人重组Ferritin或HA2融合的经半胱氨酸修饰的RBD蛋白(sRBD-hFn蛋白、sRBD-HA2蛋白)；重组人源细胞载体疫苗，如K562-HA2-sRBD。

本文的疫苗组合物中包含有效量的本文免疫原。本公开的疫苗组合物中包含足以实现希望的生物效应的量的免疫原。术语“有效量”通常是指可以诱导足以诱导免疫力的保护性免疫应答以预防和/或减轻感染或疾病和/或以减少感染或疾病的至少一种症状的免疫原的量。

本文的疫苗中还可包含佐剂。可采用本领域普通技术人员已知的佐剂，例如Vogel等人，“A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients”(第2版) 中所记载的佐剂(通过引用以其全文结合在此)。已知佐剂的例子包括但不限于：完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、脂多糖(LPS)、RIBI佐剂、 MF-59等。

本文的疫苗组合物还可包括药学上可接受的载体、稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂等辅料。例如，药学上可接受的载体是已知的，并且包括但不限于注射用水、盐溶液、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、无菌等渗水缓冲液及其组合。药学上可接受的载体、稀释剂和其他赋形剂可例如参见《雷明顿药物科学》 (Remngton's Pharmaceutcal Sciences)中。

本文疫苗组合物的形式可适于系统性或局部(尤其是呼吸道内)给予。给予疫苗组合物的方法包括但不限于：肌肉接种、皮内接种、皮下接种、滴鼻、雾化吸入、生殖道、直肠、口服或其任意组合。

在一些实施方式中，本文的疫苗预防、消除或减轻对象中的新型冠状病毒感染或其至少一种症状，例如呼吸道症状(如鼻塞、咽喉痛、声嘶)、头痛、咳嗽、痰、发热、啰音、喘息、呼吸困难、因感染引起的肺炎、严重急性呼吸综合症、肾衰竭等。

本文中还涉及了一种免疫偶联物(也可称免疫缀合物)，其包含本文的免疫原以及与其偶联的其他物质。所述的其他物质可为靶向性物质(如特异性识别特定靶标的部分)、治疗性物质(如药物、毒素、细胞毒剂)、标记性物质(如荧光标记物、放射性同位素标记物)。

在本公开中还提供了一种组合产品，其包括本公开的免疫原性肽、核苷酸分子、载体、宿主细胞和/或疫苗，且还可包含一种或多种有助于更好发挥预防和/或治疗新型冠状病毒感染或其症状的功能或增强前述物质稳定性的其他物质。例如，其他物质可包括针对冠状病毒S或S1的其他疫苗，如来自于包括但不限于SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、 HCoV-NL63、HCoV-HKU1、bat-CoV的S或S1疫苗；受益于T细胞活化和/ 或与T细胞的记忆性免疫反应的疾病或病症的其他活性物质。

免疫方法

本文还提供了一种用于预防和/或治疗新型冠状病毒感染和/或其症状的方法，其包括：至少一次给予预防和/或治疗有效量的本公开的一种或多种疫苗。可采用的接种方式包括但不限于：系统性免疫接种方式，如肌肉注射、皮下注射和皮内注射等；呼吸道内免疫接种方式，如雾化、滴鼻等。在一些实施方式中，初次免疫采用系统性接种或呼吸道内接种，优选系统性接种。

在本公开的一些实施方式中，每两次接种之间的间隔至少为1周，例如2 周、4周、2个月、3个月、6个月或更长间隔。

在一些实施方式中，采用DNA疫苗进行初次免疫，并采用重组病毒疫苗进行一次或多次加强免疫。本公开的免疫方法可采用“初免-加强”或“初免-加强 -再加强”的方式，可采用单一的全身系统免疫或呼吸道局部免疫方式，或采用两种免疫方式的组合。

根据不同载体疫苗的特点，在一些优选的实施方式中，采用重组DNA疫苗进行系统性初免，从而建立全身系统免疫应答，再用其他疫苗(例如重组腺病毒疫苗或重组痘病毒疫苗)进行一次或多种免疫加强，所述免疫加强可包括至少一次呼吸道内免疫加强(例如，采用腺病毒疫苗)。

采用本文的免疫方法可在呼吸道局部和全身系统有效建立的疫苗特异性免疫应答，有助于增强疫苗保护的有效性。

以药物包或试剂盒的形式提供本文的组合产品可，例如可将本文的一种或多种疫苗组合物或其一种或多种成分包装在一个或多个容器中，例如包装在指明组合物的量的密封容器诸如安瓿或小药囊中。可以液体、无菌冻干粉或无水浓缩物等形式提供疫苗组合物，可在临用前用适当液体(例如水、盐水等)对其进行稀释、复原和/或配制以获得用于给予至对象的适当浓度和形式。

本公开中的组合产品可用于在呼吸道内局部诱导高水平抗原特异性CD8+ T细胞应答的特征，使得其在预防呼吸道病原体感染、降低呼吸道病原体致病力和呼吸道肿瘤的预防治疗中均有应用前景。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。本领域技术人员可对本公开做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本公开的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York： Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA 的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本公开方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

下述实验中涉及到的实验动物、免疫方式、免疫原、假病毒及检测方法如下：

I.实验动物：6-8周龄雌性C57/BL6小鼠

II.免疫方式：对小鼠左、右后肢分别进行肌肉注射

III.免疫原的选择：

S及RBD序列均来自Genebank:NC_045512.2，Severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2isolate Wuhan-Hu-1,complete genome；hFn序列来自于Genebank:M97164.1，HA2序列来自于Genebank:AGI60292.1，具体序列见序列表。

1.重组质粒疫苗(DNA)：pcDNA3.1-sRBD-hFn、pcDNA3.1-S、pcDNA3.1 (空载)；

2.重组蛋白亚单位疫苗(protein)：RBD蛋白(不包含二硫键修饰)、 sRBD-hFn蛋白；

3.重组人源细胞载体疫苗：K562、K562-S、K562-HA2-sRBD。

IV.免疫原制备及免疫剂量：

免疫原的制备参见实施例1

在实施例中所采用的免疫原免疫剂量如下：

1.重组质粒疫苗(DNA)：100μg/只小鼠，100μL，溶于无菌生理盐水中；

2.重组蛋白亚单位疫苗(protein)：蛋白质(溶于无菌PBS中)与铝佐剂(Aluminium，InvivoGen，货号5200)按照体积比1:1混合后进行免疫，RBD蛋白，10μg/只小鼠，100μL；sRBD-hFn蛋白，20μg/只小鼠，100μL；

3.重组人源细胞载体疫苗(K562、K562-S、K562-HA2-sRBD)：1E6个细胞/只小鼠，100μL，溶于无菌PBS中。

V.免疫间隔：

具体免疫间隔见下文表格

VI.SARS-CoV2包膜假病毒(Pseudovirus)包装：

1.转染前一天准备293T细胞，用于包装质粒的转染与表达。用DMEM 完全培养基将细胞稀释至5×10⁶个/mL细胞，取1mL稀释好的细胞，铺在10cm 的皿中，37℃，5％CO₂，培养过夜；

2.吸取SARS-CoV2膜蛋白质粒pcDNA3.1-S 4μg和pNL4-3Δenv骨架质粒8μg(NIHAIDS Reagent Program,3418)加入500μL双无(无血清、无双抗，双抗为青链霉素混合液)的DMEM中，室温孵育5min；

3.用双无DMEM将24μL TurboFect(Thermo Fisher Scientific)稀释，终体积为500μL/样品，室温孵育5min；

4.将2与3两者混匀，1000μL/样品终体积，室温孵育20min，孵育结束后加到10cm培养皿的293T细胞中。6h后更换新鲜的15mL完全培养基，继续在细胞培养箱中培养48h；

5.培养结束后，收集10cm皿的细胞培养上清，于15mL离心管里，然后4000g，4℃，离心10min，用0.45μm的滤器过滤到新的15mL离心管中，冻存于-80℃保存，滴定后备用。

VII.构建稳定表达hACE2受体的293T细胞：

1.人工合成人源ACE2(hACE2)序列(Genebank#NCBI_NP_001358344.1), 如SEQ IDNO:13所示，序列5’端带有Age1酶切位点，3’端带有Xba1酶切位点，合成片段与载体质粒pHAGE-MCS-puro使用Age1酶切(Thermo Scientific公司，货号FD1464)与Xba1酶切(ThermoScientific公司，FD0685)，并通过凝胶电泳后切胶回收，采用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒(Promega公司，货号A9282)回收酶切片段。

2.基因回收产物与酶切线性化载体用T4 DNA连接酶的方法连接(ThermoScientific公司，货号2011A)：将连接产物转化至大肠杆菌E.coli Stable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出hACE2基因的慢病毒表达质粒(pHAGE-hACE2-puro)。

3.取10cm皿，在每个皿中接种约5×10⁶个293T细胞，保证第二天转染时使细胞密度达90％为宜；将pHAGE-hACE2-puro，慢病毒包装质粒psPAX 以及VSVG三种质粒，按照质量比1：2：1的比例转染293T细胞。

4. 37℃，5％的孵箱培养48小时左右，具体时间根据细胞情况而定，收集细胞上清。将收集的细胞上清用0.45μm的滤器进行过滤，再用PEG 8000 进行浓缩，即可得到较为纯化的hACE2慢病毒。

5.提前一天铺5×10⁵的293T细胞于12孔板的一个孔内，次日向铺好的细胞中加入步骤2中浓缩的病毒500μL，1000g，离心2小时。

6.离心感染结束后，继续在37℃，5％的孵箱培养12小时左右，将培养基换成添加1μg/mL嘌呤霉素(puro)的细胞培养基培养，最后能够存活的细胞便是整合有hACE2基因的293T细胞，并通过流式分选筛选出稳定表达hACE2 的293T细胞(能与S蛋白结合)。

VIII.检测方法：

采血：

最后一次免疫结束后第4周，将小鼠脱颈处死前，通过摘眼球的方法采集小鼠外周全血，收集于1.5mL EP管中，室温静置使其自然凝血，凝固后的小鼠血清于7000g，离心15min。将小鼠血清转移至新的1.5mL EP管中。实验前需要将样品在56℃灭活30min，来破坏血清内的补体活性。灭活前短暂离心，避免管壁和瓶盖上的样品残存。水浴液面要没过样品液面，但不能超过瓶盖。

ELSIA检测结合抗体：

1.用4℃预冷的ELISA包被液稀释检测的抗原蛋白(S1或者RBD)，至终浓度为1μg/mL。在ELISA板的每孔加入100μL包被抗原溶液，4℃过夜；

2.第二天，取出ELISA板，弃掉包被液，用0.05％的PBST缓冲液洗板3 次，每次220μL；

3.洗涤完毕后，在吸水纸上拍干，每孔用200μL ELISA封闭液(0.5％脱脂奶粉，PBST溶解)进行封闭，室温封闭2h；

4.封闭结束后，用0.05％的PBST洗板3次，每次220μL；

5.对于血清或者血浆，用ELISA样品稀释液(0.5％脱脂奶粉，PBST溶解) 稀释，从1:100起始，进行2倍比稀释。用未免疫的小鼠血清设置为阴性对照。设置Blank孔，只加样品稀释液，每个样品需做2个复孔，每孔终体积为100μL，室温孵育3h；

6.样品孵育结束后，继续用PBST洗板5次，每次220μL；

7.用ELISA封闭液(0.5％脱脂奶粉，PBST溶解)稀释相对应比例的二抗(山羊抗鼠)，每孔加入100μL，室温孵育1-1.5h；

8.二抗孵育结束后，用0.05％的PBST洗板5次，每次220μL；

9.取一对金银片OPD底物，溶解于20mL去离子水中，随后每孔加入100 μL，避光反应5min；

10.显色结束后，用50μL 2nM H₂SO₄进行终止，在酶标仪上读取 OD₄₉₂-OD₆₃₀值；

11.以最后一个稀释度OD492大于2倍的(negative mean+SD)值对应的血清稀释比的倒数作为抗体滴度。

293T-ACE2细胞检测中和抗体：

1.取96孔透明底黑板进行中和实验，第一列设置细胞对照(CC)(150μL)，第二列设置病毒对照(VC)(100μL)，其他均为样品孔，对血清样品进行倍比稀释，最终孔中体积为100μL。

2.除细胞对照组外，每孔加50μL SARS-CoV-2假病毒稀释液，使每孔最终含假病毒为200TCID₅₀。

3.轻轻震荡混匀，将上述96孔底黑板置于细胞培养箱中，37℃，5％CO₂孵育1h。

4.当孵育时间至20min时，开始准备293T-hACE2靶细胞，并用完全培养基将细胞稀释至10⁵个细胞/mL。

5.当孵育时间至1h，向96孔透明底黑板中每孔加100μL靶细胞，使每孔细胞为10⁴个。

6.前后左右轻轻晃动96孔透明底黑板，使孔中的细胞均匀分散，再将板子放入细胞培养箱中，37℃，5％CO₂培养48h。

7.培养48h后，从细胞培养箱中取出96孔透明底黑板，吸掉孔中上清，每孔加入100μL PBS清洗一遍，吸去PBS，每孔加入50μL 1×的裂解缓冲液(购自Promega公司Cat#E153A)，室温在水平摇床上孵育30min使细胞充分裂解；

8.加30μL荧光素酶的底物(购自Promega公司，Cat#E1501)于96孔黑板中，用仪器96微孔板发光-检测仪检测荧光素酶活性。

9.导出荧光素读值，计算中和抑制率，结合中和抑制率结果，利用 GraphpadPrism 5.0软件计算ID₅₀。

实施例1：S及sRBD-hFn(二硫键改造)真核表达载体的构建及蛋白表达

为了研究RBD的功能，我们构建了S及sRBD-hFn的真核表达载体，并在体外细胞系中真核表达出成熟的蛋白质。

首先，我们人工合成了S基因(序列如SEQ ID NO:11所示)、sRBD-hFn 基因(具体序列如SEQ ID NO:7所示，其中sRBD部分基于如SEQ ID NO:3所示的序列，hFn部分基于如SEQID NO:5所示的序列)，合成片段与载体质粒 pcDNA3.1(购自优宝生物)使用BamHI酶切(Thermo Scientific公司，FD0054)与 Not1酶切(Thermo Scientific公司，FD0596)，并通过凝胶电泳后切胶回收，采用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒(Promega公司，货号A9282)回收酶切片段。sRBD-hFn基因在RBD基因部分的N和C端各加了一个半胱氨酸，使之在RBD的根部形成二硫键，稳定RBD的结构。sRBD表达在hFn的N端，两者之间采用接头连接。

随后，基因回收产物与酶切线性化载体用T4 DNA连接酶的方法连接 (ThermoScientific公司，货号2011A)：将连接产物转化至大肠杆菌E.coli Stable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出S及sRBD-hFn的真核表达载体 pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-sRBD-hFn，质粒构建图谱如图1A。

我们进一步检测了S及sRBD-hFn能否在真核细胞系293T中表达。

首先，取6孔板，在每个孔中接种约6×10⁵个293T细胞，保证第二天转染时使细胞密度达90％为宜；用pcDNA3.1、pcDNA3.1-S及 pcDNA3.1-sRBD-hFn分别转染293T细胞(转染试剂TurboFect)。37℃，5％的孵箱培养48小时左右，具体时间根据细胞情况而定，收集细胞，进行蛋白质免疫印迹(WB)鉴定，发现S在细胞中表达，大小为200KD左右；sRBD-hFn 在细胞中表达，大小为55KD左右，而pcDNA3.1对照转染的细胞不能检测到 sRBD-hFn蛋白的表达(图1B)。

所表达的sRBD-hFn的结构为：sRBD表达在hFn的N端，两者之间采用 (G4S)₃连接。

实施例2：慢病毒表达载体pHAGE-S-puro及pHAGE-sRBD-HA2-puro 的构建及S蛋白和sRBD-HA2在K562细胞膜上展示的表达验证

为了验证二硫键修饰后的RBD(sRBD)的构象是否正确，我们构建了慢病毒表达载体pHAGE-S-puro及pHAGE-sRBD-HA2-puro，并将蛋白表达在K562 细胞膜上，验证了蛋白的表达及构象。

首先，我们人工合成了S基因(序列如SEQ ID NO:11所示)，sRBD-HA2 基因(序列如SEQ ID NO:9所示)，合成片段序列5’端带有Not1酶切位点， 3’端带有Xba1酶切位点，合成片段与载体质粒pHAGE-MCS-puro(购自上海鑫湾生物技术有限公司)使用Not1酶切(ThermoScientific公司，FD0596)与Xba1 酶切(Thermo Scientific公司，FD0685)，并通过凝胶电泳后切胶回收，采用 Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒(Promega公司，货号A9282)回收酶切片段。

基因回收产物与酶切线性化载体用T4 DNA连接酶的方法连接(Thermo Scientific公司，货号2011A)：将连接产物转化至大肠杆菌E.coli Stable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出S及sRBD-HA2的慢病毒表达载体 pHAGE-S-puro及pHAGE-sRBD-HA2-puro(图2A)。

将pHAGE-S-puro及pHAGE-sRBD-HA2-puro转染293T细胞，通过蛋白质免疫印迹方法鉴定K562-S细胞中蛋白的表达(图2B)；同时进行流式细胞染色鉴定，发现S蛋白与sRBD-HA2蛋白在细胞膜上有表达，及都能够与受体 ACE2结合，而对照感染的细胞不能检测到相关蛋白的表达，表明二硫键修饰的RBD本身的构象保持的较为完整，不影响其主要功能(图2C)。

实验步骤如下：取6孔板，在每个孔中接种约6×10⁵个293T细胞，保证第二天转染时使细胞密度达90％为宜；用pHAGE-S-puro及pHAGE-sRBD-HA2 -puro分别转染293T细胞(转染试剂TurboFect)。37℃，5％的孵箱培养48小时左右，具体时间根据细胞情况而定，收集细胞，进行蛋白质免疫印迹(WB)鉴定，发现S在细胞中表达，大小为200KD左右；sRBD-HA2在细胞中表达，大小为80KD左右，而pCDNA3.1对照转染的细胞不能检测到sRBD-hFn蛋白的表达(图2B)。准备5×10⁵K562细胞，用500μL完全细胞培养基重悬，放置于12 孔板的一个孔内。再向铺好的细胞中加入浓缩的慢病毒，1000g，离心2小时。离心感染结束后，继续在37℃，5％的孵箱培养48小时左右。取上述感染后的 K562细胞，由于表达载体质粒带有嘌呤霉素抗性，将细胞在嘌呤霉素浓度为4 μg/ml的RPMI(10％FBS)中培养，最后能够存活的细胞便是整合有S基因和 sRBD-HA2的细胞。取上述感染后的细胞，使用蛋白质免疫印迹方法检测S蛋白表达，所用的一抗为ACE2-C-AVI-6his(上海近岸科技有限公司，型号 0331753-4065)，二抗为HRP标记山羊抗人抗体(中杉金桥公司，货号ZB2304)。结果显示，利用蛋白质免疫印迹方法能检测到目的蛋白高表达(图2B)。

流式染色方法使用ACE2-C-AVI-6his(上海近岸科技有限公司，型号 0331753-4065)/PE-streptavidin(BD Pharminge公司，货号563259)进行间接染色后，最后使用流式细胞分选(BD Pharminge公司，型号Arial)富集。结果显示，不断富集后，80％以上的K562-S细胞和K562-HA2-sRBD细胞能够与ACE2 结合，说明二硫键修饰的RBD本身的构象并不影响其主要功能(图2C)。

实施例3：RBD蛋白对小鼠结合抗体和中和抗体的诱导效果

采用RBD蛋白(购买自南京金斯瑞生物科技)免疫C57/BL6小鼠，佐剂为铝佐剂，在完成免疫2周后，评价免疫组合诱导针对RBD蛋白和S1蛋白的结合抗体滴度。同时评价免疫结束4周后，针对SARS-CoV-2假病毒的中和抗体滴度。

实验步骤如下：将小鼠随机分为2组，根据免疫原分别命名为对照组、RBD 组。具体免疫组合如表1所示。RBD组产生针对RBD蛋白和S1蛋白的结合抗体滴度如图3A所示：针对不同蛋白(S1蛋白和RBD蛋白)的结合抗体滴度基本一致，均值都在8000左右，部分小鼠结合抗体没有被诱导起来，其可能的原因在于小鼠的个体差异性。免疫结束后4周，RBD组产生针对SARS-Cov-2 假病毒的中和抗体滴度如图3B所示：除了一只滴度在1000以上，其他的都在200左右，部分小鼠中和抗体未被诱导起来，其可能的原因在于小鼠的个体差异性。

该实验证实，RBD蛋白可诱导结合抗体的产生(其效果与S蛋白诱导相似)，且单纯的RBD蛋白能够活化出较高水平的中和抗体。

表1.RBD蛋白诱导结合抗体及中和抗体实验

实施例4：质粒pcDNA3.1-sRBD-hFn对小鼠结合抗体及中和抗体的诱导效果

根据实施例1得出的结论(质粒能够正确表达出所需蛋白)，采用二硫键修饰后的RBD质粒(pcDNA3.1-sRBD-hFn)免疫C57/BL6小鼠，在完成免疫2周后，评价免疫组合诱导针对RBD蛋白的结合抗体滴度和针对SARS-CoV-2假病毒的中和抗体滴度。

实验步骤如下：将小鼠随机分为2组，根据第二针的免疫原分别命名为对照组和RBD-hFn组。具体免疫组合如表2所示。不同免疫组合产生针对RBD 蛋白的结合抗体滴度如图4A所示：大部分都在2000左右。第二针免疫结束后 2周，不同的免疫组合产生针对SARS-CoV-2假病毒的中和抗体滴度如图4B 所示：除一只中和抗体滴度大于80，其他的都在20左右。

该实验证实，修饰后的RBD重组质粒疫苗能够在小鼠体内诱导出中和抗体。

表2.修饰后的RBD-hFn质粒诱导结合抗体及中和抗体实验

实施例5：K562-HA2-sRBD细胞及K562-S细胞对小鼠结合抗体及中和抗体的诱导效果

根据实施例4中得出的结果，将sRBD-hFn组的10只小鼠分为两组，再次免疫K562-S和K562-HA2-sRBD，在完成免疫2周后，评价免疫组合诱导针对RBD蛋白的结合抗体滴度和针对SARS-CoV-2假病毒的中和抗体滴度。

具体免疫组合如表3所示。免疫结束后2周，不同免疫组合产生针对RBD 蛋白的结合抗体滴度如图5A所示：K562-S组结合抗体滴度大部分在50000左右，K562-HA2-sRBD组结合抗体滴度大部分在80000左右。免疫结束后2周，不同的免疫组合产生针对SARS-CoV-2假病毒的中和抗体滴度如图5B所示：K562-S组中和抗体滴度大部分在350左右，K562-HA2-sRBD组中和抗体滴度有一只达到2000，其他在400左右。

该实验证实，K562-HA2-sRBD细胞相比于K562-S细胞在小鼠体内能够诱导出相对更高的结合抗体及中和抗体。

表3.K562-S及K562-HA2-sRBD诱导结合抗体及中和抗体实验

实施例6：sRBD-hFn蛋白对小鼠结合抗体及中和抗体的诱导效果

采用纯化的sRBD-hFn蛋白免疫C57/BL6小鼠，在完成免疫1周后，评价免疫组合诱导针对RBD蛋白的结合抗体滴度和针对SARS-CoV-2假病毒的中和抗体滴度。

实验步骤如下：将小鼠随机分为2组，根据免疫原分别命名为对照组和 sRBD-hFn组。具体免疫组合如表4所示。免疫结束后一周产生针对RBD蛋白的结合抗体滴度如图6A所示：sRBD-hFn组有三只小鼠的结合抗体达到52000，除一只在3200之外，其他的都大于一万。免疫结束后1周，产生针对 SARS-CoV-2假病毒的中和抗体滴度如图6B所示：有三只有中和抗体，滴度都在十几。

表4.sRBD-hFn蛋白诱导结合抗体及中和抗体实验

在本公开提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本公开的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本公开作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

附表1.序列表对应信息

序列表

<110> 上海市公共卫生临床中心

<120> 利用受体识别域诱导抗新冠病毒中和抗体的方法

<130> 203142 1CNCN

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 807

<212> DNA

<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2 virus)

<400> 1

atgcctaccg agtccatcgt gcgctttccc aatatcacaa acctgtgccc ttttggcgag 60

gtgttcaacg caacccgctt cgcaagcgtg tacgcctgga ataggaagcg catctccaac 120

tgcgtggccg actattctgt gctgtacaac agcgcctcct tctctacctt taagtgctat 180

ggcgtgagcc ccacaaagct gaatgacctg tgctttacca acgtgtacgc cgattccttc 240

gtgatcaggg gcgacgaggt gcgccagatc gcaccaggac agacaggcaa gatcgcagac 300

tacaattata agctgcctga cgatttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa ctctaacaat 360

ctggatagca aagtgggcgg caactacaat tatctgtacc ggctgtttag aaagtctaat 420

ctgaagccat tcgagaggga catctccaca gaaatctacc aggccggctc taccccctgc 480

aatggcgtgg agggctttaa ctgttatttc cctctgcaga gctacggctt ccagccaaca 540

aacggcgtgg gctatcagcc ctaccgcgtg gtggtgctgt cttttgagct gctgcacgca 600

cctgcaacag tgtgcggacc aaagaagagc accaatctgg tgaagaacaa gtgcgtgaac 660

ttcaacttca acggactgac cggcacaggc gtgctgaccg agtccaacaa gaagttcctg 720

ccttttcagc agttcggcag ggacatcgca gataccacag acgccgtgcg cgaccctcag 780

accctggaga tcctggatat cacacca 807

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2 virus)

<400> 2

Met Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

1 5 10 15

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

20 25 30

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

35 40 45

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

50 55 60

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

65 70 75 80

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

85 90 95

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

100 105 110

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

115 120 125

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

130 135 140

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

145 150 155 160

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

165 170 175

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

180 185 190

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

195 200 205

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

210 215 220

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

225 230 235 240

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

245 250 255

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro

260 265

<210> 3

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggtgtgtc ctaccgagtc catcgtgcgc tttcccaata tcacaaacct gtgccctttt 60

ggcgaggtgt tcaacgcaac ccgcttcgca agcgtgtacg cctggaatag gaagcgcatc 120

tccaactgcg tggccgacta ttctgtgctg tacaacagcg cctccttctc tacctttaag 180

tgctatggcg tgagccccac aaagctgaat gacctgtgct ttaccaacgt gtacgccgat 240

tccttcgtga tcaggggcga cgaggtgcgc cagatcgcac caggacagac aggcaagatc 300

gcagactaca attataagct gcctgacgat ttcaccggct gcgtgatcgc ctggaactct 360

aacaatctgg atagcaaagt gggcggcaac tacaattatc tgtaccggct gtttagaaag 420

tctaatctga agccattcga gagggacatc tccacagaaa tctaccaggc cggctctacc 480

ccctgcaatg gcgtggaggg ctttaactgt tatttccctc tgcagagcta cggcttccag 540

ccaacaaacg gcgtgggcta tcagccctac cgcgtggtgg tgctgtcttt tgagctgctg 600

cacgcacctg caacagtgtg cggaccaaag aagagcacca atctggtgaa gaacaagtgc 660

gtgaacttca acttcaacgg actgaccggc acaggcgtgc tgaccgagtc caacaagaag 720

ttcctgcctt ttcagcagtt cggcagggac atcgcagata ccacagacgc cgtgcgcgac 780

cctcagaccc tggagatcct ggatatcaca ccatgc 816

<210> 4

<211> 272

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Val Cys Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn

210 215 220

Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys

225 230 235 240

Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp

245 250 255

Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys

260 265 270

<210> 5

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgacgaccg cgtccacctc gcaggtgcgc cagaactacc accaggactc agaggccgcc 60

atcaaccgcc agatcaacct ggagctctac gcctcctacg tttacctgtc catgtcttac 120

tactttgacc gcgatgatgt ggctttgaag aactttgcca aatactttct tcaccaatct 180

catgaggaga gggaacatgc tgagaaactg atgaagctgc agaaccaacg aggtggccga 240

atcttccttc aggatatcaa gaaaccagac tgtgatgact gggagagcgg gctgaatgca 300

atggagtgtg cattacattt ggaaaaaaat gtgaatcagt cactactgga actgcacaaa 360

ctggccactg acaaaaatga cccccatttg tgtgacttca ttgagacaca ttacctgaat 420

gagcaggtga aagccatcaa agaattgggt gaccacgtga ccaacttgcg caagatggga 480

gcgcccgaat ctggcttggc ggaatatctc tttgacaagc acaccctggg agacagtgat 540

aatgaaagc 549

<210> 6

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp

1 5 10 15

Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala

35 40 45

Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg

50 55 60

Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg

65 70 75 80

Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser

85 90 95

Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn

100 105 110

Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro

115 120 125

His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys

130 135 140

Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly

145 150 155 160

Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu

165 170 175

Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser

180

<210> 7

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggccctcc ccgtgacagc cctgctcctg cctctcgccc tgctgctcca cgccgccaga 60

ccagtgtgcc ctacagagtc tattgtgcgc ttcccaaaca tcacaaacct gtgccctttc 120

ggcgaggtgt tcaacgccac acggttcgcc tctgtgtacg cctggaaccg gaagcggatt 180

tctaactgcg tggccgacta ctctgtgctg tacaacagcg cctctttctc tacattcaag 240

tgctacggcg tgtctccaac aaagctcaac gacctgtgct tcacaaacgt gtacgccgac 300

tctttcgtga ttagaggcga cgaggtgaga cagattgccc caggccagac cggcaagatt 360

gccgactaca actacaagct ccccgacgac ttcacaggct gcgtgattgc ctggaactct 420

aacaacctcg actctaaggt gggcggcaac tacaactacc tgtacaggct gttccggaag 480

tctaacctga agcctttcga gcgggacatt agcaccgaga tttaccaggc cggctctacc 540

ccttgcaacg gcgtggaggg cttcaactgc tacttcccat tgcagtctta cggcttccag 600

cctacaaacg gcgtgggcta ccagccttac cgggtggtgg tgctgtcttt cgagctgctc 660

cacgcccccg ccacagtgtg cggcccaaag aagtctacaa acctggtgaa gaacaagtgc 720

gtgaacttca acttcaacgg cctcacaggc acaggcgtgc tcaccgagtc taacaagaag 780

ttcctgcctt tccagcagtt cggcagggac attgccgaca ccaccgacgc cgtgagggac 840

cctcagacac tagagattct cgacatcacc ccatgctctg gcggcggcgg ctctggcggc 900

ggcggctctg gcggcggcgg cagcaccaca gcctctacat ctcaggtgag gcagaactac 960

caccaggact ctgaggccgc cattaacagg cagattaacc tggaactgta cgcctcttac 1020

gtgtacctgt ctatgtctta ctacttcgac cgggacgacg tggccctgaa gaacttcgcc 1080

aagtacttcc tccaccagtc tcacgaggag agggagcacg ccgagaagct gatgaagctc 1140

caaaaccagc ggggaggccg gattttctta caggacatta agaagcccga ctgcgacgac 1200

tgggagtctg gcctgaacgc gatggagtgc gccctccact tggagaagaa cgtgaaccag 1260

tccctgctgg aactacacaa gctcgccacc gacaagaacg accctcacct gtgcgacttc 1320

attgagaccc actacctcaa cgagcaggtg aaggccatta aagaactcgg cgaccacgtc 1380

acaaacctga gaaagatggg cgcccccgag tccggcctcg ccgagtacct gttcgacaag 1440

cacacactgg gcgactctga caacgagtct 1470

<210> 8

<211> 490

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Val Cys Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro

20 25 30

Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg

35 40 45

Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val

50 55 60

Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys

65 70 75 80

Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn

85 90 95

Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile

100 105 110

Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro

115 120 125

Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp

130 135 140

Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys

145 150 155 160

Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln

165 170 175

Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe

180 185 190

Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln

195 200 205

Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala

210 215 220

Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys

225 230 235 240

Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu

245 250 255

Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala

260 265 270

Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp

275 280 285

Ile Thr Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

290 295 300

Gly Gly Gly Ser Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr

305 310 315 320

His Gln Asp Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu

325 330 335

Tyr Ala Ser Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp

340 345 350

Asp Val Ala Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His

355 360 365

Glu Glu Arg Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg

370 375 380

Gly Gly Arg Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp

385 390 395 400

Trp Glu Ser Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys

405 410 415

Asn Val Asn Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys

420 425 430

Asn Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu

435 440 445

Gln Val Lys Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg

450 455 460

Lys Met Gly Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys

465 470 475 480

His Thr Leu Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser

485 490

<210> 9

<211> 1806

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgaaaacaa ttattgccct gtcttacatt ttctgcctcg tgttcgccga ctacaaggac 60

gacgacgaca agtccctgca ggtgtgccct accgagtcta tcgtgcgctt cccaaacatc 120

acaaacctgt gccctttcgg cgaggtgttc aacgccaccc ggttcgcctc tgtgtacgcc 180

tggaaccgga agcggatttc taactgcgtg gccgactact ccgtgctgta caactctgcc 240

tctttctcca cattcaagtg ctacggcgtg tcccctacca agctgaacga cctgtgcttc 300

accaacgtgt acgccgactc tttcgtgatt aggggcgacg aggtgagaca gattgcccct 360

ggccagacag gcaagatcgc cgactacaac tacaagctcc ctgacgactt cacaggctgc 420

gtgattgcct ggaactctaa caacctggac tctaaggtgg gcggcaacta caactacctg 480

tacagactgt tccggaagtc taacctcaag ccattcgagc gcgacattag caccgagatt 540

taccaggccg gcagcacccc atgcaacggc gtggagggct tcaactgcta cttcccactt 600

caatcttacg gcttccagcc aacaaacggc gtgggctacc agccataccg ggtggtggtg 660

ctgtccttcg agctactcca cgccccagcc acagtgtgcg gcccaaagaa gagcaccaac 720

ctcgtgaaga acaagtgcgt gaacttcaac ttcaacggcc tgacaggcac aggcgtgctc 780

accgagtcta acaagaagtt cctccctttc cagcagttcg gcagggacat cgccgacacc 840

accgacgccg tgcgcgaccc tcagacactc gaaattctgg acatcacccc ttgctctggc 900

ggcggcggct ctggcctgtt cggcgccatt gccggcttca tcgagaacgg ctgggagggc 960

ctcattgacg gctggtacgg cttcaggcac cagaacgccc agggcgaggg cacagccgcc 1020

gactacaagt ccacccagtc cgccattgac cagatcacag gcaagctgaa cagactcatt 1080

gaaaaaacaa accagcagtt cgagctgatt gacaacgagt tcaacgaggt ggagaagcag 1140

attggcaacg tgattaactg gacacgggac tctattacag aggtgtggtc ttacaacgcc 1200

gagttactcg tggcaatgga gaaccagcac acaattgacc tcgccgactc tgagatggac 1260

aagctgtacg agcgggtgaa gagacagctc agagagaacg ccgaggagga cggcacaggc 1320

tgcttcgaga tattccacaa gtgcgacgac gactgcatgg ccagcatccg gaacaacaca 1380

tacgaccact ctaagtaccg ggaggaggcc atgcagaacc gcatccagat tgacccagtg 1440

aagctgtcta gcggctacaa ggacgtggct agcaccacca cacccgcccc tagacctcct 1500

acccccgccc caacaattgc ctctcagcca ctgtctctca gacctgaggc gtgcaggccc 1560

gccgccggcg gcgccgtgca cacacggggc ctcgacttcg cctgcgacat ttacatttgg 1620

gccccactcg ccggcacatg cggcgtgctc ctcctgtctc tggtgatcac actgtactgc 1680

aagcggggca gaaagaagct cctgtacatt ttcaagcagc ctttcatgag acccgtgcag 1740

accacccagg aggaggacgg ctgctcttgc aggttccctg aggaggagga gggcggctgc 1800

gaacta 1806

<210> 10

<211> 602

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Val Phe Ala

1 5 10 15

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Leu Gln Val Cys Pro Thr Glu

20 25 30

Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu

35 40 45

Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys

50 55 60

Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala

65 70 75 80

Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn

85 90 95

Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly

100 105 110

Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp

115 120 125

Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp

130 135 140

Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu

145 150 155 160

Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile

165 170 175

Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu

180 185 190

Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr

195 200 205

Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu

210 215 220

Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn

225 230 235 240

Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly

245 250 255

Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln

260 265 270

Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln

275 280 285

Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser

290 295 300

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

305 310 315 320

Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ala Gln Gly Glu

325 330 335

Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ser Ala Ile Asp Gln Ile

340 345 350

Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Gln Gln Phe Glu

355 360 365

Leu Ile Asp Asn Glu Phe Asn Glu Val Glu Lys Gln Ile Gly Asn Val

370 375 380

Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Ile Thr Glu Val Trp Ser Tyr Asn Ala

385 390 395 400

Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Ala Asp

405 410 415

Ser Glu Met Asp Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg Glu

420 425 430

Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys Phe Glu Ile Phe His Lys Cys

435 440 445

Asp Asp Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg Asn Asn Thr Tyr Asp His Ser

450 455 460

Lys Tyr Arg Glu Glu Ala Met Gln Asn Arg Ile Gln Ile Asp Pro Val

465 470 475 480

Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Val Ala Ser Thr Thr Thr Pro Ala

485 490 495

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

500 505 510

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

515 520 525

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

530 535 540

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

545 550 555 560

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

565 570 575

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

580 585 590

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

595 600

<210> 11

<211> 3843

<212> DNA

<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2 virus)

<400> 11

atgttcgtgt ttctggtgct gctgcctctg gtgagctccc agtgcgtgaa cctgaccaca 60

aggacccagc tgccccctgc ctataccaat tccttcacac ggggcgtgta ctatcccgac 120

aaggtgttcc ggagcagcgt gctgcactcc acacaggatc tgtttctgcc tttcttttct 180

aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg agcggcacca atggcacaaa gcggttcgac 240

aatccagtgc tgccctttaa cgatggcgtg tacttcgcct ccaccgagaa gtctaacatc 300

atcagaggct ggatctttgg caccacactg gacagcaaga cacagtccct gctgatcgtg 360

aacaatgcca ccaacgtggt catcaaggtg tgcgagttcc agttttgtaa tgatccattc 420

ctgggcgtgt actatcacaa gaacaataag tcttggatgg agagcgagtt tcgcgtgtat 480

tcctctgcca acaattgcac atttgagtac gtgtcccagc ccttcctgat ggacctggag 540

ggcaagcagg gcaatttcaa gaacctgagg gagttcgtgt ttaagaatat cgatggctac 600

ttcaaaatct actccaagca caccccaatc aacctggtgc gcgacctgcc acagggcttc 660

tctgccctgg agccactggt ggatctgccc atcggcatca acatcacccg gtttcagaca 720

ctgctggccc tgcacagaag ctacctgaca ccaggcgaca gctcctctgg atggaccgca 780

ggagcagcag cctactatgt gggctatctg cagcccagga ccttcctgct gaagtacaac 840

gagaatggca ccatcacaga cgccgtggat tgcgccctgg atcccctgtc tgagaccaag 900

tgtacactga agagctttac cgtggagaag ggcatctatc agacaagcaa tttcagggtg 960

cagcctaccg agtccatcgt gcgctttccc aatatcacaa acctgtgccc ttttggcgag 1020

gtgttcaacg caacccgctt cgcaagcgtg tacgcctgga ataggaagcg catctccaac 1080

tgcgtggccg actattctgt gctgtacaac agcgcctcct tctctacctt taagtgctat 1140

ggcgtgagcc ccacaaagct gaatgacctg tgctttacca acgtgtacgc cgattccttc 1200

gtgatcaggg gcgacgaggt gcgccagatc gcaccaggac agacaggcaa gatcgcagac 1260

tacaattata agctgcctga cgatttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa ctctaacaat 1320

ctggatagca aagtgggcgg caactacaat tatctgtacc ggctgtttag aaagtctaat 1380

ctgaagccat tcgagaggga catctccaca gaaatctacc aggccggctc taccccctgc 1440

aatggcgtgg agggctttaa ctgttatttc cctctgcaga gctacggctt ccagccaaca 1500

aacggcgtgg gctatcagcc ctaccgcgtg gtggtgctgt cttttgagct gctgcacgca 1560

cctgcaacag tgtgcggacc aaagaagagc accaatctgg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620

ttcaacttca acggactgac cggcacaggc gtgctgaccg agtccaacaa gaagttcctg 1680

ccttttcagc agttcggcag ggacatcgca gataccacag acgccgtgcg cgaccctcag 1740

accctggaga tcctggatat cacaccatgc tccttcggcg gcgtgtctgt gatcacacca 1800

ggcaccaata caagcaacca ggtggccgtg ctgtatcagg acgtgaattg taccgaggtg 1860

cccgtggcaa tccacgcaga tcagctgacc cctacatggc gggtgtactc taccggcagc 1920

aacgtgttcc agacaagagc aggatgcctg atcggagcag agcacgtgaa caatagctat 1980

gagtgcgaca tccctatcgg cgccggcatc tgtgcctcct accagaccca gacaaactcc 2040

ccaaggagag cacggtctgt ggcaagccag tccatcatcg cctataccat gagcctgggc 2100

gccgagaatt ccgtggccta ctccaacaat tctatcgcca tccctaccaa cttcacaatc 2160

tccgtgacca cagagatcct gccagtgagc atgaccaaga catccgtgga ctgcacaatg 2220

tatatctgtg gcgattccac cgagtgctct aacctgctgc tgcagtacgg ctctttttgt 2280

acccagctga atagagccct gacaggcatc gccgtggagc aggacaagaa cacacaggag 2340

gtgttcgccc aggtgaagca aatctacaag accccaccca tcaaggactt tggcggcttc 2400

aacttcagcc agatcctgcc cgatcctagc aagccatcca agcggtcttt tatcgaggac 2460

ctgctgttca acaaggtgac cctggccgat gccggcttca tcaagcagta tggcgattgc 2520

ctgggcgaca tcgccgccag agacctgatc tgtgcccaga agtttaatgg cctgaccgtg 2580

ctgcctccac tgctgacaga tgagatgatc gcccagtaca catctgccct gctggcaggc 2640

accatcacaa gcggatggac cttcggcgca ggagccgccc tgcagatccc ctttgccatg 2700

cagatggcct atcggttcaa cggcatcggc gtgacccaga atgtgctgta cgagaaccag 2760

aagctgatcg ccaatcagtt taactccgcc atcggcaaga tccaggactc tctgagctcc 2820

acagcaagcg ccctgggcaa gctgcaggat gtggtgaatc agaacgccca ggccctgaat 2880

accctggtga agcagctgtc tagcaacttc ggcgccatct cctctgtgct gaatgatatc 2940

ctgagcaggc tggacaaggt ggaggcagag gtgcagatcg accggctgat cacaggcaga 3000

ctgcagtccc tgcagaccta cgtgacacag cagctgatca gggcagcaga gatcagggca 3060

tctgccaatc tggccgccac caagatgagc gagtgcgtgc tgggccagtc caagagagtg 3120

gacttttgtg gcaagggcta tcacctgatg agcttcccac agtccgcccc tcacggagtg 3180

gtgtttctgc acgtgaccta cgtgccagcc caggagaaga acttcaccac agcaccagca 3240

atctgccacg atggcaaggc acactttcct agggagggcg tgttcgtgag caacggcacc 3300

cactggtttg tgacacagcg caatttctac gagccacaga tcatcaccac agacaataca 3360

ttcgtgtccg gcaactgtga cgtggtcatc ggcatcgtga acaataccgt gtatgatcct 3420

ctgcagccag agctggactc ttttaaggag gagctggata agtacttcaa gaatcacacc 3480

agccccgacg tggatctggg cgacatctct ggcatcaatg ccagcgtggt gaacatccag 3540

aaggagatcg acaggctgaa cgaggtggcc aagaatctga acgagtccct gatcgatctg 3600

caggagctgg gcaagtatga gcagtacatc aagtggccct ggtatatctg gctgggcttc 3660

atcgccggcc tgatcgccat cgtgatggtg accatcatgc tgtgctgtat gacaagctgc 3720

tgttcctgcc tgaagggctg ctgttcttgt ggcagctgct gtaagtttga tgaggacgat 3780

agcgagcctg tgctgaaggg cgtgaagctg cactacacca ccggtctgca gctagctcga 3840

gtc 3843

<210> 12

<211> 1281

<212> PRT

<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2 virus)

<400> 12

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn

1010 1015 1020

Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys

1025 1030 1035

Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro

1040 1045 1050

Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val

1055 1060 1065

Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His

1070 1075 1080

Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn

1085 1090 1095

Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln

1100 1105 1110

Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val

1115 1120 1125

Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro

1130 1135 1140

Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn

1145 1150 1155

His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn

1160 1165 1170

Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

1175 1180 1185

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu

1190 1195 1200

Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu

1205 1210 1215

Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met

1220 1225 1230

Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

1235 1240 1245

Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro

1250 1255 1260

Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr Thr Gly Leu Gln Leu

1265 1270 1275

Ala Arg Val

1280

<210> 13

<211> 2415

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atgtcaagct cttcctggct ccttctcagc cttgttgctg taactgctgc tcagtccacc 60

attgaggaac aggccaagac atttttggac aagtttaacc acgaagccga agacctgttc 120

tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aacaccaata ttactgaaga gaatgtccaa 180

aacatgaata atgctgggga caaatggtct gcctttttaa aggaacagtc cacacttgcc 240

caaatgtatc cactacaaga aattcagaat ctcacagtca agcttcagct gcaggctctt 300

cagcaaaatg ggtcttcagt gctctcagaa gacaagagca aacggttgaa cacaattcta 360

aatacaatga gcaccatcta cagtactgga aaagtttgta acccagataa tccacaagaa 420

tgcttattac ttgaaccagg tttgaatgaa ataatggcaa acagtttaga ctacaatgag 480

aggctctggg cttgggaaag ctggagatct gaggtcggca agcagctgag gccattatat 540

gaagagtatg tggtcttgaa aaatgagatg gcaagagcaa atcattatga ggactatggg 600

gattattgga gaggagacta tgaagtaaat ggggtagatg gctatgacta cagccgcggc 660

cagttgattg aagatgtgga acataccttt gaagagatta aaccattata tgaacatctt 720

catgcctatg tgagggcaaa gttgatgaat gcctatcctt cctatatcag tccaattgga 780

tgcctccctg ctcatttgct tggtgatatg tggggtagat tttggacaaa tctgtactct 840

ttgacagttc cctttggaca gaaaccaaac atagatgtta ctgatgcaat ggtggaccag 900

gcctgggatg cacagagaat attcaaggag gccgagaagt tctttgtatc tgttggtctt 960

cctaatatga ctcaaggatt ctgggaaaat tccatgctaa cggacccagg aaatgttcag 1020

aaagcagtct gccatcccac agcttgggac ctggggaagg gcgacttcag gatccttatg 1080

tgcacaaagg tgacaatgga cgacttcctg acagctcatc atgagatggg gcatatccag 1140

tatgatatgg catatgctgc acaacctttt ctgctaagaa atggagctaa tgaaggattc 1200

catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca tttaaaatcc 1260

attggtcttc tgtcacccga ttttcaagaa gacaatgaaa cagaaataaa cttcctgctc 1320

aaacaagcac tcacgattgt tgggactctg ccatttactt acatgttaga gaagtggagg 1380

tggatggtct ttaaagggga aattcccaaa gaccagtgga tgaaaaagtg gtgggagatg 1440

aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata ctgtgacccc 1500

gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac aaggaccctt 1560

taccaattcc agtttcaaga agcactttgt caagcagcta aacatgaagg ccctctgcac 1620

aaatgtgaca tctcaaactc tacagaagct ggacagaaac tgttcaatat gctgaggctt 1680

ggaaaatcag aaccctggac cctagcattg gaaaatgttg taggagcaaa gaacatgaat 1740

gtaaggccac tgctcaacta ctttgagccc ttatttacct ggctgaaaga ccagaacaag 1800

aattcttttg tgggatggag taccgactgg agtccatatg cagaccaaag catcaaagtg 1860

aggataagcc taaaatcagc tcttggagat aaagcatatg aatggaacga caatgaaatg 1920

tacctgttcc gatcatctgt tgcatatgct atgaggcagt actttttaaa agtaaaaaat 1980

cagatgattc tttttgggga ggaggatgtg cgagtggcta atttgaaacc aagaatctcc 2040

tttaatttct ttgtcactgc acctaaaaat gtgtctgata tcattcctag aactgaagtt 2100

gaaaaggcca tcaggatgtc ccggagccgt atcaatgatg ctttccgtct gaatgacaac 2160

agcctagagt ttctggggat acagccaaca cttggacctc ctaaccagcc ccctgtttcc 2220

atatggctga ttgtttttgg agttgtgatg ggagtgatag tggttggcat tgtcatcctg 2280

atcttcactg ggatcagaga tcggaagaag aaaaataaag caagaagtgg agaaaatcct 2340

tatgcctcca tcgatattag caaaggagaa aataatccag gattccaaaa cactgatgat 2400

gttcagacct ccttt 2415

<210> 14

<211> 805

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe

20 25 30

Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp

35 40 45

Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn

50 55 60

Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala

65 70 75 80

Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln

85 90 95

Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys

100 105 110

Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser

115 120 125

Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu

130 135 140

Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu

145 150 155 160

Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu

165 170 175

Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg

180 185 190

Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu

195 200 205

Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu

210 215 220

Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu

225 230 235 240

His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile

245 250 255

Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly

260 265 270

Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys

275 280 285

Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala

290 295 300

Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu

305 310 315 320

Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro

325 330 335

Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly

340 345 350

Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp

355 360 365

Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala

370 375 380

Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe

385 390 395 400

His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys

405 410 415

His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn

420 425 430

Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly

435 440 445

Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe

450 455 460

Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met

465 470 475 480

Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe

500 505 510

Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala

515 520 525

Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile

530 535 540

Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu

545 550 555 560

Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala

565 570 575

Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe

580 585 590

Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr

595 600 605

Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu

610 615 620

Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met

625 630 635 640

Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu

645 650 655

Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val

660 665 670

Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro

675 680 685

Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile

690 695 700

Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn

705 710 715 720

Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln

725 730 735

Pro Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val

740 745 750

Ile Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg

755 760 765

Lys Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile

770 775 780

Asp Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp

785 790 795 800

Val Gln Thr Ser Phe

805

Claims (14)

1.一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的免疫原性肽，其包括SARS-CoV-2病毒刺突蛋白S的RBD区，其中，所述RBD区进一步经半胱氨酸修饰形成sRBD区，且其中所述sRBD在RBD结构域的根部增加一对半胱氨酸，使之能够形成二硫键，

其中，所述RBD区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述经半胱氨酸修饰的sRBD区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.如权利要求1所述的免疫原性肽，其中，所述RBD区或经半胱氨酸修饰的sRBD区包含在融合肽中。

3.如权利要求2所述的免疫原性肽，其中，与所述RBD区或经半胱氨酸修饰的sRBD区融合的部分为病毒或宿主来源的蛋白。

4.如权利要求2所述的免疫原性肽，其中，与所述RBD区或经半胱氨酸修饰的sRBD区融合的部分选自：转铁蛋白Fn、HIV p24、囊膜病毒的茎部、抗体Fc段、GM-CSF、IL-21、CD40L或CD40抗体。

5.如权利要求4所述的免疫原性肽，其中，所述囊膜病毒的茎部选自：流感HA2或艾滋病毒的gp41。

6.如权利要求3所述的免疫原性肽，其中，包含经半胱氨酸修饰的sRBD区的融合肽的序列如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示。

7.一种核苷酸分子，其编码如权利要求1-6中任一项所述的免疫原性肽。

8.如权利要求7所述的核苷酸分子，其中，所述RBD区的编码序列如SEQ ID NO:1所示，所述经半胱氨酸修饰的RBD区的编码序列如SEQ ID NO:3所示。

9.如权利要求7所述的核苷酸分子，其编码包含经半胱氨酸修饰的sRBD区的融合肽，且所述核苷酸分子的序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示。

10.一种载体，其包含如权利要求7-9中任一项所述的核苷酸分子。

11.一种宿主细胞，其包含如权利要求10所述的载体，且能表达如权利要求1-6中任一项所述的免疫原性肽。

12.一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的疫苗，其包含如权利要求1-6中任一项所述的免疫原性肽。

13.如权利要求1-6中任一项所述的免疫原性肽、如权利要求7-9中任一项所述的核苷酸分子、如权利要求10所述的载体和/或如权利要求11所述的宿主细胞在制备用于预防或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2的疫苗中的应用。

14.一种制备针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的疫苗的方法，所述方法包括：

(a)提供包含如权利要求1-6中任一项所述的免疫原性肽、如权利要求7-9中任一项所述的核苷酸分子、如权利要求10所述的载体和/或如权利要求11所述的宿主细胞；

(b)将(a)中所提供的活性物质与免疫学上或药学上可接受的载体组合。