CN104926938A - 纯化含Fc区蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及纯化含Fc区蛋白的方法。具体地，本申请提供了通过将具有Fc区的多肽，例如，抗体或抗体融合吸附到Fc结合剂，例如，A蛋白或G蛋白上，然后用二价阳离子盐缓冲液洗涤，以除去杂质，随后回收被吸附的多肽来纯化所述具有Fc区的多肽的方法。本申请的特征还在于洗脱被纯化多肽的方法及纯化系列中该方法的并入。本申请还提供了包括执行该方法的组分和使用说明书的试剂盒。
Description
本申请是国际申请日2006年6月16日、国际申请号PCT/US2006/023478于2007年12月17日进入中国国家阶段、申请号200680021590.X、发明名称“纯化含Fc区蛋白的方法”的申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2005年6月17日提交的申请号为60/691821的临时专利申请“纯化含Fc区蛋白的方法(METHODS OF PURIFYINGFcREGION CONTAINING PROTEINS)”的优先权。该申请的全部内容并入本文。
发明背景
抗体是许多动物，特别是人类的免疫系统的功能强大的组分。重组技术的最新进展使得事实上针对任何靶，例如，癌细胞，细菌和病毒的抗体的产生成为可能。通常地，抗体用已被工程化成表达高水平的所述抗体的细胞系产生。随后，工程化细胞系在包括糖，氨基酸和生长因子及各种蛋白，包括例如，血清蛋白的复杂混合物的培养物中生长。然而，从细胞副产物和培养物组分中分离完全抗体至足以用于研究或用作治疗剂的纯度形成了严峻挑战。如果准备将抗体用作药物向人类给药，则抗体分子的纯化尤为关键。
传统抗体纯化方案(或系列)通常包括色谱步骤，所述色谱步骤利用了与多种杂质的结合或截留相比，抗体分子优先结合或被色谱柱的固相(或官能化固相)截留的能力。已建议或执行的纯化抗体的方案为：首先将含有CH2/CH3区的蛋白结合在固相上所固定的A蛋白上，然后通过用疏水电解质溶剂洗涤固相，除去固相上所结合的杂质，接着从所述固相上回收含有CH2/CH3区的蛋白。然而，这些方案的限制在于用来优先结合含有CH2/CH3区的蛋白的条件同样支持杂质(例如，具有不完全CH2/CH3区的抗体)的结合。在人用治疗剂的开发过程中，这些杂质是非常不希望有的。
因此，存在着改进对具有恒定区的蛋白或多肽，尤其是在细胞培养物中产生的具有Fc区的蛋白(例如，抗体)的纯化的需求。
发明概述
在多个方面，本发明的特征在于将具有Fc区的蛋白从包括该蛋白和一种或多种杂质的源液中分离的方法。在本发明的方法中，将具有Fc区的蛋白(靶蛋白)吸附到Fc结合剂上，然后用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤Fc结合剂，以除去一种或多种杂质。接着在洗脱溶液中从Fc结合剂上回收该蛋白。本发明的方法对除去例如内含子连读变异体类(IRT)，二硫键缺失类(UDB)和/或低分子量变异体类(LMW)这样的杂质尤其有效。本发明的方法在除去例如宿主细胞蛋白(HCP)和DNA这样的杂质方面同样有效。
本发明的方法包括一个或多个色谱分离步骤，另外，还可以包括一个或多个过滤步骤。所述色谱分离步骤可以是连续或不连续的(例如，分批方法)，或者为两者的组合。在多种实施方案中，本方法包括一个或多个过滤步骤，例如，以除去病毒，浓缩和缓冲含有靶蛋白的溶液，以及除去微生物污染物。
在多种实施方案中，含Fc区蛋白是抗原结合多肽(例如，抗体或其片段)或免疫粘附素(例如，TNF受体免疫粘附素)。在多种实施方案中，含Fc区蛋白是抗体融合蛋白，鼠抗体，嵌合抗体或人源化抗体。在优选实施方案中，含Fc区蛋白是人或人源化抗IL-13抗体。或者，在其它实施方案中，含Fc区蛋白可以结合例如Aβ,CD3,CD52,VEGF,EGFR,CD33,CD20,HER-2,TNFα,CD25,RSV,IgE,gp IIb/IIIa,CD11a或α4整联蛋白的抗原。
在多种实施方案中，含Fc区蛋白是重组产生的。在多种实施方案中，含Fc区蛋白是在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组产生的。
在多种实施方案中，所述一种或多种杂质包括一种或多种宿主细胞蛋白，宿主细胞DNA，细胞培养物蛋白，具有Fc区的非所需种类的蛋白及其混合物。例如，在多种实施方案中，具有Fc区的非所需种类的蛋白包括一种或多种具有内含子连读序列的抗体链或其片段，一种或多种具有不正确二硫键的抗体链或其片段，半抗体或其片段，轻链二聚体或其片段和重链二聚体或其片段。
在一个方面，本发明的方法通过首先将具有Fc区的蛋白吸附到Fc结合剂上，然后用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤所述Fc结合剂，以除去一种或多种杂质，随后从所述Fc结合剂上回收所述蛋白，从包括所述蛋白和一种或多种杂质的源液中纯化具有Fc区的蛋白。在多种实施方案中，将所述蛋白吸附到Fc结合剂上的步骤和用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤所述Fc结合剂的步骤在约2℃至约24℃的温度范围内进行。在多种实施方案中，从所述Fc结合剂回收所述蛋白的步骤包括用pH范围为约2.0至约6.5的洗脱缓冲液洗脱所述蛋白。
在多种实施方案中，Fc区结合剂包括一种或多种A蛋白和G蛋白。在优选实施方案中，所述Fc结合剂被固定在固相上。该固相可以包括，例如，一种或多种珠，琼脂糖基质，二氧化硅及其混合物。
用来洗涤Fc结合剂的缓冲液中所存在的二价阳离子盐可以包括，例如，离液序列高的盐。适用于制备所述洗涤缓冲溶液的二价阳离子盐包括但不限于氯化镁，氯化钙，氯化镍及其混合物。在多种实施方案中，适用于制备所述洗涤缓冲溶液的二价阳离子盐包括但不限于二价II族(例如，镁，钙，钡等)阳离子，二价过度金属(例如，铜，镍，锰等)阳离子的硫氰酸盐(SCN-)，高氯酸盐(ClO4 -)，硝酸盐(NO3 -)，氯化盐和溴化盐及这些盐的组合物。
在多种实施方案中，含有二价阳离子盐的缓冲溶液的pH值范围为约4至约9，在某些实施方案中，为约4至约8，约4.5至约7.5，或约6至约8。此处所述范围内所包括的值和范围和/或中间值也希望在本发明的范围内。例如，所述二价阳离子盐的pH值为约7.1至约7.9，约7.2至约7.9，约7.3至约7.7，约7.4至约7.6，约4至约5，约5至约6，约6至约7或约8至约9。
此外，希望以此处所述值作为上限或下限的范围在本发明的范围内。例如，所述二价阳离子盐的pH为至少约(或约)4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5或8。
在多种实施方案中，缓冲溶液所含有的二价阳离子盐的浓度范围为约0.1M至约5M，在某些实施方案，为约0.5M至约3M，约1.0M至约3M或约0.6M至约2.5M。例如，所述二价阳离子缓冲液可以包括至少约0.6M的CaCl2或至少约2M的MgCl2或至少约2M的CaCl2。此处所述范围内所包括的值和范围和/或中间值也希望在本发明的范围内。例如，所述缓冲溶液所含有的二价阳离子盐的浓度为约0.5M至约0.75M，约0.5M至约0.8M，约0.5M至约0.9M，约0.5M至1.0M，约0.5M至2M，约1.5M至约2.0M，约1.5M至约2.5M，约1.5M至约3.0M或约2.5M至约3M。
此外，希望以此处所述值作为上限或下限的范围在本发明的范围内。例如，所述缓冲溶液所含有的二价阳离子盐的浓度为至少约(或约)0.6M，1M，1.5M，2M，2.5M或3M。在多种实施方案中，含有二价阳离子盐的缓冲溶液的温度范围为约2℃至约24℃。
在多种实施方案中，从Fc结合剂回收蛋白的步骤包括用pH范围为约2.0至约6.5，优选约2.0至约4.0，更优选约2.5至约3.5的洗脱缓冲液洗脱所述蛋白。此处所述范围内所包括的值和范围和/或中间值也希望在本发明的范围内。例如，所述洗脱缓冲液的pH为约2至约3或约3至约4。
此外，希望以此处所述值作为上限或下限的范围在本发明的范围内。例如，所述洗脱缓冲液的pH为至少约(或约)2，2.5，3，3.5或4。
在多种实施方案中，所回收的蛋白可以在所述Fc结合剂色谱步骤之前或之后进行另外的纯化步骤。例如，例示性的进一步的纯化步骤包括但不限于：阴离子交换色谱，阳离子交换色谱，固定化金属亲和色谱，疏水相互作用色谱(HIC)，羟基磷灰石色谱，透析，亲和色谱，硫酸铵沉淀，乙醇沉淀，反相HPLC(RP-HPLC)，色谱聚焦，超滤，渗滤，微滤和凝胶过滤。在多种实施方案中，所述Fc结合剂色谱步骤后跟随的是阴离子交换色谱和HIC步骤。在多种实施方案中，所述色谱步骤后还跟随着病毒过滤步骤，超滤/渗滤步骤和/或微生物污染物过滤步骤。
在一个方面，本发明提供了含有杂质的溶液中纯化抗体的方法。在多种实施方案中，所述方法包括，首先将所述蛋白吸附到Fc结合剂上，然后用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤所述Fc结合剂，以除去一种或多种杂质，随后从所述Fc结合剂回收所述蛋白，以产生第一洗脱池(eluent pool)。
在多种实施方案中，所述纯化过程这样继续进行，即，通过使离子交换树脂与所述第一洗脱池使靶蛋白不吸附到树脂上的方式接触，然后回收流过的靶蛋白，以产生第二洗脱池，而对所述第一洗脱池进行离子交换色谱。在多种实施方案中，所述离子交换色谱步骤进一步包括用缓冲洗涤液洗涤所述离子交换树脂，以回收至少一部分任何被吸附的靶蛋白。
在多种实施方案中，所述纯化过程这样继续进行，即，通过将所述靶蛋白吸附到疏水相互作用树脂(例如，经疏水配体官能化的固相)上，用离子强度几乎不洗脱所述靶蛋白的缓冲洗涤液洗涤所述疏水相互作用树脂，然后回收纯化的靶蛋白(通常用离子强度低至足以使所述靶蛋白从所述疏水相互作用树脂上解吸附的洗脱缓冲液)，而对所述第二洗脱池进行疏水相互作用色谱。
在本发明的多个方面的优选实施方案中，Fc结合剂被固定在固相上，其优选在与源液接触之前先用适宜的缓冲液平衡。所述固相优选为包括固定所述Fc结合剂的琼脂糖的柱。在多种实施方案中，所述柱涂覆有试剂，例如甘油，以减少或防止柱的非特异性附着。
在多种实施方案中，经本发明的方法纯化的蛋白可以配制在药学上可接受的载体中，并用于各种诊断，治疗或其它已知的这类分子的用途。
在多个方面，本发明提供了从包括含Fc区蛋白及其内含子连读变异体(IRT)的溶液中将含Fc区蛋白纯化的方法。在特征方面，本发明的方法被用来降低蛋白制品，例如，抗体制品中的一种或多种内含子连读变异体种类的水平。在多种实施方案中，从Fc结合剂回收的蛋白的内含子连读变异体水平比源液中的内含子连读变异体水平小至少5倍，在某些实施方案中，比源液中的内含子连读变异体水平小至少10倍。在多种实施方案中，在含有所述回收自Fc结合剂的蛋白的溶液中，所述内含子连读变异体包括小于约1.0％，0.8％，0.5％，0.2％或0.1％的所述蛋白的种类。
在多个方面，本发明提供了从包括含Fc区蛋白及其低分子量变异体(LMW)的溶液中纯化Fc区蛋白的方法。在特征方面，本发明的方法被用来降低蛋白制品，例如，抗体制品中的一种或多种低分子量变异体类的水平。在多种实施方案中，从Fc结合剂回收的蛋白的低分子量变异体水平比源液中的低分子量变异体水平小至少5倍，在某些实施方案中，比源液中的低分子量变异体水平小至少10倍。在多种实施方案中，在含有所述回收自Fc结合剂的蛋白的溶液中，所述低分子量变异体包括小于约1.0％，0.8％，0.5％，0.2％或0.1％的所述蛋白的种类。
在多个方面，本发明提供了从包括含Fc区蛋白及其二硫键缺失变异体(UDB)的溶液中纯化含Fc区蛋白的方法。在特征方面，本发明的方法被用来降低蛋白制品，例如，抗体制品中的一种或多种二硫键缺失变异体类的水平。在多种实施方案中，从Fc结合剂回收的蛋白的二硫键缺失变异体水平比源液中的二硫键缺失变异体水平小至少5倍，在某些实施方案中，比源液中的二硫键缺失变异体水平小至少10倍。在多种实施方案中，在含有所述回收自Fc结合剂的蛋白的溶液中，所述二硫键缺失变异体包括小于约20％，15％，10％，5％，2％或1％的所述蛋白的种类。
在另一个方面，本发明涉及根据本发明的方法纯化的含Fc区的蛋白。
在另一个方面，本发明提供了适用于实施任何方法的系统，所述方法至少包括首先将蛋白吸附到Fc结合剂上，然后用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤所述Fc结合剂，以除去一种或多种杂质，随后从所述Fc结合剂回收所述蛋白的步骤。
在其它方面，本发明提供了用于实施任何方法的纯化系列，所述方法至少包括首先将蛋白吸附到Fc结合剂上，然后用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤所述Fc结合剂，以除去一种或多种杂质，随后从所述Fc结合剂回收所述蛋白的步骤。
在多个方面，本发明的特征还在于用于实施本发明的一种或多种方法的试剂盒。在多种实施方案中，所述试剂盒包括至少一种试剂和所述试剂盒的使用说明书。例如，试剂盒可以包括一种或多种试剂，例如，Fc结合剂，二价阳离子盐和用于制备含有二价阳离子盐的缓冲洗涤液的试剂，以及所述试剂盒的使用说明书。
发明详述
在进一步描述本发明之前，对本文将要使用的特定术语的定义进行阐述有助于对本发明的理解。将本文所述定义分组只是为了方便参考而不是为了限制。
蛋白相关定义
在多个方面，本发明提供了从包含含Fc区蛋白及其一种或多种连读变异体，例如，内含子连读变异体的溶液中纯化含Fc区蛋白的方法。在特征方面，本发明的方法被用来降低蛋白制品，例如，抗体制品中一种或多种内含子连读(IRT)变异体类的水平。本文中，术语“内含子连读变异体”和“内含子连读变异体类”可以互换使用，指在感兴趣的含Fc区蛋白(例如，靶蛋白)的合成中，多肽链延伸在编码区转录之前被编码区前的内含子中的终止密码子终止的过程的产物。结果是感兴趣的蛋白的具有一个或多个不完全或缺失结构域的变异体(即，内含子连读变异体)。这种内含子可以包含一个以上的终止密码子，从而导致了产生数个不同内含子连读变异体的可能性。
术语“二硫键缺失变异体”或“UDB”是指任何缺失至少一个二硫键的种类。缺失的二硫键可以是链间二硫键或链内二硫键或这两者的组合。
术语“低分子量种类”或“LMW”类是指含Fc区蛋白的变异体，其包括由游离重链，游离轻链，IRT类，半分子和四分之三分子或其混合物组成的蛋白种类。
A蛋白是在大多数金黄色葡萄球菌菌株中发现的约42kD的细胞壁蛋白，其以高亲和力(与人IgG的亲和力约为10-8M)与抗体的Fc区结合。本文所用术语“A蛋白”包括从其天然来源获得的A蛋白，合成产生的A蛋白(例如，通过肽合成，通过重组技术等)及其保留了结合具有CH2/CH3区的蛋白的能力的变异体。
G蛋白是G组链球菌的细胞壁蛋白。G蛋白是以高亲和力与抗体，尤其IgG抗体的Fc区结合的III型Fc受体。本文所用术语“G蛋白”包括从其天然来源获得的G蛋白，合成产生的G蛋白(例如，通过肽合成，通过重组技术等)及其保留了结合具有Fc区的蛋白的能力的变异体。
术语“抗体”或“免疫球蛋白”(本文中可以互换使用)是指具有由两条重链和两条轻链组成的四肽多链基本结构的抗原结合蛋白，所述链通过例如，链间二硫键而被稳定化，所述抗原结合蛋白具有特异性结合抗原的能力。重链和轻链都折叠成结构域。
术语“结构域”是指包括肽环(例如，包括3-4个肽环)的重链或轻链多肽的球形区，所述肽环通过例如，β-折叠片和/或链内二硫键而被稳定化。本文中，根据在“恒定”结构域的情况下，多类成员的结构域内序列变异的相对缺乏，或在“可变”结构域的情况下，多类成员的结构域内的显著变异，结构域进一步被称为“恒定”结构域或“可变”结构域。轻链上的“恒定”结构域可以互换地称为“轻链恒定区”，“轻链恒定结构域”，“CL”区或“CL”结构域。重链上的“恒定”结构域可以互换地称为“重链恒定区”，“重链恒定结构域”，“CH”区或“CH”结构域。轻链上的“可变”结构域可以互换地称为“轻链可变区”，“轻链可变结构域”，“VL”区或“VL”结构域。重链上的“可变”结构域可以互换地称为“重链可变区”，“重链可变结构域”，“VH”区或“VH”结构域。
术语“片段”是指抗体或抗体链的一部分，其包括比完整或完全抗体或抗体链少的氨基酸残基。片段可以通过化学或酶处理完整或完全抗体或抗体链而获得。片段也可以通过重组方法获得。例示性片段包括Fab，Fab'，F(ab')2，Fabc和/或Fv片段。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其结合抗原，或与其衍生自的完整抗体竞争特异性抗原结合。
术语“抗体融合蛋白”和“抗体融合”是指融合蛋白，其包括与至少一种非抗体蛋白部分或多肽融合的抗体的全部或一部分。融合通常通过编码所述蛋白的基因的基因工程化而完成。其它例示性抗体融合蛋白包括结合与另一可溶或细胞生物蛋白的全部或一部分，例如，受体(细胞受体或可溶受体)或其部分，细胞因子或其部分，酶或其部分等融合的抗体的一部分(包括Fc区)的细胞受体。这种包括与另一蛋白融合的抗体的Fc区的抗体融合蛋白在本领域中也被称为Fc融合蛋白。
术语“Fc结合剂”是指能与抗体(例如，IgG抗体)的Fc区结合的分子，其包括但不限于补体蛋白，Fc受体或由细菌衍生的对抗体的Fc区具有高亲和力的蛋白，如A蛋白或G蛋白。
术语“Fc区”是指IgG抗体的C末端区，尤其指所述IgG抗体的重链的C末端区。尽管IgG重链的Fc区的边界可以细微地变化，但Fc区通常被定义为约从IgG重链的氨基酸残基Cys226跨越到羧基端。
色谱相关定义
本文所用术语“源液”是指包含至少一种希望从其它同样存在的物质中纯化出来的靶物质的液体。源液可以是，例如，水溶液，有机溶剂系统或水/有机溶剂混合物或溶液。源液常常为含有许多生物分子(如蛋白，抗体，激素和病毒)，小分子(如盐，糖，脂质等)甚至颗粒物质的复杂混合物或溶液。虽然生物起源的典型源液以水溶液或悬浮液开始，但其也可以含有在例如溶剂沉淀，提取等早期分离步骤中所使用的有机溶剂。包含能通过本发明的多种实施方案纯化的有价值的生物物质的源液的例子包括但不限于来自生物反应器的培养上清液，匀化的细胞悬液，血浆，血浆组分和牛乳。
本文中，术语“靶物质”或“靶蛋白”是指期望从源液中纯化出来的一种或多种含Fc区蛋白。靶物质可以存在于为悬浮液的源液或溶液中。
术语“杂质”是指源液中的不同于靶物质，并且希望从最终的靶物质产品中除去的物质。典型的杂质包括核酸，蛋白(包括内含子连读类，低分子量种类和二硫键缺失类)，肽，内毒素，病毒和小分子。
本文所用术语“固相”是指在纯化过程中与靶物质相互作用，或Fc结合剂可以附着其上的非水基质。适宜的固相材料包括但不限于玻璃，二氧化硅(例如，硅胶)，多糖(例如，多糖基质)，如琼脂糖和纤维素，有机聚合物，如聚丙烯酰胺，甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，例如，AmberliteTM树脂(可购自Rohm&Haas ChemicalCo.,Philadelphia,Pa.)。固相可以选自通常被描述为亲和树脂，离子交换树脂和离子俘获树脂的树脂中的任何一种。固相可以是，例如，纯化柱，离散颗粒的非连续相或其组合。固相可以具有多孔或无孔特性，并且可以是可压缩或不可压缩的。在多种实施方案中，固相是聚合物基质或琼脂糖颗粒或珠。在多种实施方案中，固相可以涂覆有试剂(如甘油)，以防止例如杂质在固相上的非特异性附着。Fc结合固相只需要具有允许Fc结合剂附着到所述固相表面的化学物或结合的配体。优选固相材料对纯化过程，包括抽滤和错流过滤中所采用的条件和所用液体的温度，pH以及其它方面将具有物理和化学可恢复性。
“亲和配体”是指通过与源液组分的结合位点的特异性相互作用而与所述组分选择性或优先结合的分子。在本发明中，亲和配体(例如，Fc结合剂)通常被固定在固定相，如树脂上。可以结合至树脂载体上，以提供可用于本发明的过程的色谱用树脂的亲和配体的例子包括但不限于A蛋白，G蛋白及其选择性结合蛋白Fc区的类似物。使亲和配体与固体载体材料结合的方法是纯化技术领域公知的。参见，例如，参考书Affinity Separations:A Practical Approach(Practical ApproachSeries),Paul Matejtschuk(Editor),Irl Pr:1997；和AffinityChromatography,Herbert Schott,Marcel Dekker,New York:1997。
“亲和色谱用树脂”或“亲和树脂”是指包括具有结合在固相或底物表面的亲和配体的固相或底物的色谱用树脂。
“离子交换色谱用树脂”或“离子交换树脂”是指与带有正或负电荷的配体共价结合，因而具有可用于与所述离子交换树脂所接触的溶液中的离子进行交换的游离平衡离子的固体载体。
“阳离子交换树脂”是指与带负电荷的配体共价结合，因而具有用于与所述树脂所接触的溶液中的阳离子进行交换的游离阳离子的离子交换树脂。本领域已知有很多种阳离子交换树脂，例如，其中共价结合基团是羧酸盐或磺酸盐的阳离子交换树脂。市场上可以买到的阳离子交换树脂包括CMC-纤维素，SP-SephadexTM和Fast S-SepharoseTM(后两者可购自Pharmacia)。
“阴离子交换树脂”是指与带正电荷的基团，如季铵基共价结合的离子交换树脂。市场上可以买到的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素，TMAE，QAE SephadexTM和Fast Q SepharoseTM(后两者可购自Pharmacia)。
本文所用术语“离液序列高的盐”是指包括一种或多种感胶离子序列低，能渗透蛋白水化层，并与其表面直接结合的离子组分的盐。这破坏了共水合缔合(cohydrative association)，从而有利于蛋白的增溶。离液序列高的盐的例子包括但不限于II族元素的卤化盐(例如，氯化钙，氯化镁，氯化钡，溴化钙，溴化镁，溴化钡，碘化钙，碘化镁，碘化钡)。
适宜二价阳离子盐的例子包括但不限于Mn2+，Ni2+或Cu2+，Mg2+，Ca2+和Ba2+与硫氰酸根(SCN-)，高氯酸根(ClO4 -)，硝酸根(NO3 -)，氯离子(Cl-)和溴离子(Br-)的盐及其组合物。
在某些实施方案中，二价阳离子盐包括二价阳离子(例如，Mg2+，Ca2+，Ni2+或Ba2+)。优选用于特征过程的离液序列高的盐有MgCl2，NiCl2和CaCl2。在二价阳离子盐洗涤步骤之后，靶蛋白从亲和色谱基质上洗脱下来。
“缓冲剂”是其存在于溶液中时增加导致pH的单位变化所必须加入的酸或碱的量的物质。缓冲液通过其酸-碱轭合物组分的作用而抵抗pH的变化。与生物试剂一起使用的缓冲液通常能维持恒定浓度的氢离子，以使溶液的pH在生理范围内。术语“生理pH”是指哺乳动物血液的pH(即，7.38或约7.4)。因此，生理pH范围是约7.2-7.6。传统缓冲剂组分包括但不限于有机和无机盐，酸和碱。用于生物分子(例如，蛋白分子)纯化的例示性缓冲剂包括两性离子或“Good”缓冲剂，参见，例如，Good et al.(1966)Biochemistry 5:467和Good and Izawa(1972)Methods Enzymol.24:62。例示性缓冲剂包括但不限于TES，MES，PIPES，HEPES，MOPS，MOPSO，TRICINE和BICINE。
本文中的“平衡缓冲液”是用来制备Fc结合试剂，固相或此两者，用于含有靶蛋白的源液的上样的缓冲液。平衡缓冲液优选是等渗的，并且pH通常在约6至约8的范围内。“上样缓冲液”是用来将含有含Fc区蛋白和杂质的源液上样到Fc结合剂被固定于其上的固相上的缓冲液。通常，平衡和上样缓冲液是相同的。“洗脱缓冲液”是用来从被固定的Fc结合剂上洗脱含Fc区蛋白的缓冲液。优选洗脱缓冲液具有较低的pH，从而破坏Fc结合剂与感兴趣的蛋白间的相互作用。优选低pH的洗脱缓冲液的pH在约2至约5，更优选在约3至约4的范围内。将pH控制在该范围内的缓冲液的例子包括甘氨酸，磷酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐和铵缓冲液及其组合物。优选的这类缓冲液是柠檬酸盐和醋酸盐缓冲液，最优选的是柠檬酸钠或醋酸钠缓冲液。涵盖的其它洗脱缓冲液包括用于洗脱感兴趣的蛋白的高pH缓冲液(例如，pH为9或9以上的缓冲液)或包括例如MgCl2(2mM)的化合物或组合物的缓冲液。
本文用到的“洗涤液”或“洗涤缓冲液”在本文中都是指用来将杂质从结合了靶物质的色谱用树脂上带走的液体。可以相继使用一种以上的洗涤液，例如，设计依次用具有不同特性，如pH，导电率，溶剂浓度等的洗涤液离解和除去与所述色谱用树脂非特异性缔合的不同类型的杂质。
本文中的“洗脱液”或“洗脱缓冲液”是指用来从已经一种或多种洗涤液洗涤过的色谱用树脂上离解靶物质的液体。洗脱液在不使靶物质不可逆变性的条件下将其离解。典型的洗脱液是色谱技术领域公知的，其可以具有较高浓度的盐，游离亲和配体或类似物，或其它促进所述靶物质从所述色谱用树脂离解的物质。“洗脱条件”是指加在被靶物质结合的色谱用树脂上的，从所述色谱用树脂上离解所述靶物质的处理条件，例如，使被所述靶物质结合的色谱用树脂与洗脱液或洗脱缓冲液接触，以产生这种离解。
本文中的“清洗液”或“清洗缓冲液”是指用来在纯化过程完成之后洗涤色谱用树脂的液体。清洗液可以含有洗涤剂，病毒灭活剂或相对高浓度的盐，其pH可以比纯化过程中所使用的液体高或低。其目的是净化色谱用树脂，以使其随时可以再使用。典型的清洗液是色谱技术领域公知的。
本文中的“保存液”或“保存缓冲液”是指色谱用树脂在两次使用之间悬浮于其中的液体。除了缓冲离子外，保存液还含有杀微生物剂或其它防腐剂。这类保存液在色谱技术领域是公知的。
在多个方面，本发明的特征在于通过将具有Fc区的蛋白吸附到Fc结合剂上，然后用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤所述Fc结合剂，以去除一种或多种杂质，随后从所述Fc结合剂回收所述蛋白的过程，从包括所述蛋白和一种或多种杂质的源液中纯化具有Fc区蛋白的方法。适宜的Fc结合剂包括但不限于A蛋白和G蛋白。
本发明的特征在于纯化含Fc区蛋白，例如，抗体的过程。例示性纯化过程包括亲和色谱步骤。所述亲和色谱步骤可以是连续的，不连续的，或为两者的组合。例如，亲和色谱步骤可以不连续过程，例如，分批过程来进行。亲和色谱是靶化合物与固定配体发生生物选择性吸附，随后从固定配体上回收的过程。该过程允许靶化合物的高度特异性和有效的纯化。该过程需要使用具有适当选择性，在允许在温和条件下回收的条件下，通常以10-4-10-8的离解常数范围结合靶化合物(例如，含Fc区蛋白)的配体(例如，Fc结合剂)。所述配体通常被固定在珠状和多孔基质上，所述基质可以是柱填料或分批吸附介质。
优选结合剂是A蛋白。A蛋白结合免疫球蛋白的Fc区。A蛋白由6个区组成，其中5个区结合IgG。其以高亲和力与人IgG1，IgG2和IgG4及小鼠IgG2a，IgG2b和IgG3结合。A蛋白以中等亲和力与人IgD，IgM，IgA和IgE及小鼠IgG1结合。作为亲和配体，A蛋白被使这些区可以自由结合的方始固定在基质上。一分子的固定化A蛋白可以结合至少两分子的IgG。天然和重组形式的A蛋白对IgG的Fc区共有类似的特异性。重组A蛋白(rProtein A)可以被工程化成包括，例如，C末端半胱氨酸，并且可以通过硫酯偶联固定至固相基质上。这种偶联导致A蛋白的结合容量增加。
其它结合剂有G蛋白。G蛋白对IgG具有特异性，其以高亲和力与人IgG1，IgG2，IgG3和IgG4及小鼠IgG1和IgG3结合。G蛋白PLUS对人IgG4和小鼠IgG2a，IgG2b和IgG3具有中度亲和力。重组G蛋白(rProtein G)可以工程化成缺失天然蛋白的白蛋白结合区。重组G蛋白含有2个Fc结合区。
其它结合剂有A/G蛋白。A/G蛋白是兼备A蛋白和G蛋白的IgG结合特性的基因工程蛋白。A/G蛋白是由非病原形式的芽胞杆菌分泌的基因融合产物。A/G蛋白含有4个来自A蛋白和2个来自G蛋白的Fc结合域。A/G蛋白并不象A蛋白一样具有pH依赖性，然而在别的方面却具有A蛋白和G蛋白的累加特性。
A/G蛋白与所有人IgG亚类结合，尤其适合亚类未确定的多克隆或单克隆IgG抗体的纯化。另外，A/G蛋白还与IgA，IgE，IgM和(在较小程度上)IgD结合。A/G蛋白还与所有小鼠IgG亚类结合良好，尤其适合IgG亚类小鼠单克隆抗体的纯化，而不受到IgA，IgM和鼠血清白蛋白的干扰(参见，例如，Sikkema.(1989)Amer.Biotech.Lab 7,42.)。个别小鼠单克隆抗体亚类对嵌合A/G蛋白的亲和力大于对A蛋白或G蛋白的亲和力(参见，例如，Eliasson et al.(1988)J.Biol.Chem.263,4323-4327.)。
在本发明中，固定化Fc结合剂(例如，A蛋白)用二价阳离子盐溶液洗涤，以除去杂质。尤其是，我们发现，作为重组抗体表达技术的结果产生的非预期杂质可以通过二价阳离子盐洗涤步骤除去。
本发明的方法在亲和色谱和二价阳离子洗涤步骤之后可以任选地包括纯化步骤。随后的纯化步骤可以包括离子交换色谱步骤和/或疏水相互作用色谱(HIC)步骤。随后的色谱步骤可以是连续的，不连续的(例如，分批过程)，或者为两者的组合。离子交换色谱根据蛋白总电荷的不同而分离分子。为了结合，靶蛋白必须带有与树脂上所连官能团相反的电荷。例如，通常带有总正电荷的抗体将与含有带负电荷官能团的阳离子交换剂结合良好。由于这种相互作用是离子性的，因此结合必须在低离子强度条件下进行。洗脱通过增加离子强度以破坏所述离子相互作用，或通过改变所述蛋白的pH而完成。
离子交换色谱依靠蛋白的电荷而将其分离，而疏水相互作用色谱则利用了一些蛋白的疏水特性。蛋白上的疏水基团与柱上的疏水基团结合。蛋白的疏水性越强，其与柱的结合就越强。HIC步骤除去了，例如，由宿主细胞衍生的杂质(例如，DNA及其它高和低分子量产物相关种类)。如本文所述，进一步的纯化步骤可以包括病毒去除步骤及超滤和/或渗滤步骤。
在多种实施方案中，含Fc区蛋白是具有与Fc结合剂的Fc受体结合的Fc区的抗体或抗体融合蛋白。用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤Fc结合剂使得杂质，例如，感兴趣的蛋白(例如，源液中的靶物质)的连读变异体和含有恒定区的片段(包括LMW和UDB类)被大量去除。
本发明的方法包括一个或多个色谱分离步骤，另外，还可以包括一个或多个过滤步骤，用于从源液的杂质中分离具有Fc区的蛋白(“靶蛋白”)。例如，在源液与Fc结合剂接触前，可以将所述源液过滤，离心或以其它方式处理，以除去颗粒碎屑等。例如，采用重组技术，蛋白可以在细胞内，壁膜间隙中产生，或者直接分泌到培养基中。如果蛋白在细胞内产生，则可以通过例如，离心或超滤除去颗粒碎屑，即，宿主细胞或溶解的碎片。在蛋白分泌入培养基的情况下，重组宿主细胞可以通过例如，切向流过滤从细胞培养基中分离。
在多种实施方案中，含有靶蛋白的源液与Fc结合剂(优选固定在固相上，并用适宜缓冲液平衡)接触以使得所述靶蛋白吸附到所述Fc结合剂(例如，固定化Fc结合剂)上。源液与Fc结合剂(例如，固定化Fc结合剂)在上样缓冲液中接触，所述上样缓冲液可以与平衡缓冲液相同。当含有杂质的源液流过固相时，靶蛋白被吸附到Fc结合剂上，而其它多种杂质(如所述靶蛋白在重组宿主细胞内产生时的宿主细胞蛋白，或由其它过程衍生的杂质)则流过或非特异性地结合在固相上。在多种实施方案中，Fc结合剂是A蛋白，并且平衡缓冲液可以是含0.15M NaCl的20mM Tris(pH 7.5)。其它适宜的平衡缓冲液包括，例如，具有生理浓度，如范围为约0.5mM至约100mM(例如，10mM，20mM，50mM等)的浓度和生理盐浓度(例如，约0.15mMNaCl)及5.0-9.0的pH的BIS，HEPES等。
固相优选为用于固定Fc结合剂的琼脂糖(例如，Sepharose)珠或颗粒。在多种实施方案中，柱被涂覆以试剂，如甘油，以减少或防止柱的非特异性附着。在多种实施方案中，Fc结合剂是A蛋白。可购自Amersham Biosciences的rmp A蛋白SepharoseTM快速(FF)柱是用于本特征方法的适宜A蛋白柱的例子。
然后用含有二价阳离子盐的缓冲洗涤液洗涤Fc结合剂，以除去固相或Fc结合剂上结合的蛋白变异体类。尤其是，我们发现，二价阳离子盐洗涤步骤的应用可以除去大量的非预期杂质。具体地说，我们发现，靶蛋白的内含子连读变异体，低分子量变异体和二硫键缺失变异体可以用二价阳离子盐洗涤除去。此外，宿主细胞蛋白(HCP)和DNA也可以用二价阳离子盐洗涤除去。在多种实施方案中，洗涤液中的二价阳离子盐包括离液序列高的盐。适宜的离液序列高的盐的例子包括但不限于氯化钙(CaCl2)，氯化镍(NiCl2)和氯化镁(MgCl2)。虽然在洗涤液中可以仅存在单一的二价阳离子盐，但在多种实施方案中，可以使用两种或两种以上的二价阳离子盐。
在多种实施方案中，采用除含有二价阳离子盐的洗涤液之外的洗涤液除去杂质。例如，在多种实施方案中，在用含有二价阳离子盐的洗涤液洗涤Fc结合剂之前，之后或之前和之后都用含有20-50mMTris，0.75-2.0M NaCl，pH为5.0-9.0的溶液和/或含有10mM Tris，pH为7.5的溶液洗涤所述Fc结合剂。
在多种实施方案中，二价阳离子盐优选以约0.5M至约2.5M的浓度加入到pH范围为约5至约9，优选约7至约8的pH缓冲液中。二价阳离子盐的优选浓度包括但不限于0.6M，2.0M和2.5M。适于该目的的缓冲液包括但不限于浓度为20-50mM的Tris或醋酸盐缓冲液。
在洗涤步骤之后，靶蛋白从Fc结合剂上回收。这通常用适宜的洗脱缓冲液完成。靶蛋白可以用例如，低pH，例如，范围为约2至约6.5，优选约2.5至约3.5的洗脱缓冲液从柱上洗脱。
在多种实施方案中，这样回收的靶蛋白可以在药学上可接受的载体中进行配制，并用于各种诊断，治疗或其它已知的这类分子的用途。
在多种实施方案中，被洗脱的靶蛋白制品在Fc结合剂色谱步骤之后可以进行其它纯化步骤。例如，例示性的进一步的纯化步骤包括但不限于：阴离子交换色谱，阳离子交换色谱，疏水相互作用色谱(HIC)，磷灰石色谱，透析，亲和色谱(包括固定化金属亲和色谱)，分子排阻色谱，硫酸铵沉淀，乙醇沉淀，反相HPLC(RP-HPLC)，色谱聚焦，超滤，渗滤和凝胶过滤。在多种实施方案中，所述Fc结合剂色谱步骤后跟随有阴离子交换色谱和HIC步骤。在多种实施方案中，所述色谱步骤后还跟随着病毒过滤步骤，超滤/渗滤步骤和/或微生物污染物过滤步骤。在多种实施方案中，这些另外的色谱步骤可以在所述Fc结合剂色谱步骤之前进行。在多个方面，本文中的方法涉及通过A蛋白色谱从杂质中纯化含Fc区蛋白。
在多种实施方案中，纯化含Fc区蛋白(靶蛋白)的方法从将所述靶蛋白吸附到包括固定在固相上的A蛋白的Fc结合剂上开始，然后用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤所述Fc结合剂，以除去一种或多种杂质，随后从所述A蛋白上回收所述蛋白，以产生第一洗脱池。
在多种实施方案中，所述纯化过程这样继续进行，即，通过阴离子交换树脂与所述第一洗脱池以使得杂质被吸附在所述树脂上，而所述靶蛋白不吸附至树脂上的方式接触，而对所述第一洗脱池进行阴离子交换色谱。因此，所述靶蛋白可以从流过的液体中回收，以产生第二洗脱池。在多种实施方案中，所述阴离子交换色谱步骤进一步包括用缓冲洗涤液洗涤所述阴离子交换树脂，以回收至少一部分被吸附的靶蛋白，然后将其与所述第二洗脱池合并。或者，所述第一洗脱池可以与阴离子交换树脂以抗体被吸附，却允许任何杂质流过这样一种方式接触，然后任选地进行洗涤和洗脱被吸附的抗体。
在多种实施方案中，所述纯化过程这样继续进行，即，通过将所述靶蛋白吸附至疏水相互作用树脂(例如，经疏水配体官能化的固相)上，用离子强度几乎不洗脱所述靶蛋白的缓冲洗涤液洗涤所述疏水相互作用树脂，然后在第三洗脱池上回收所述靶蛋白(通常用离子强度低至足以使所述靶蛋白从所述疏水相互作用树脂上解吸附的洗脱缓冲液)，而对所述第二洗脱池进行疏水相互作用色谱(HIC)。或者，所述第二洗脱池可以与所述HIC柱以所述靶蛋白不被吸附的方式接触，从而回收流过的靶蛋白作为第三洗脱池。
在多种实施方案中，所述纯化过程包括一个或多个过滤步骤，例如，为了除去病毒，浓缩和缓冲含有靶蛋白的溶液，以及去除微生物污染物的过滤步骤。
在多种实施方案中，本发明提供了从包括具有Fc区的蛋白和一种或多种杂质的源液中纯化所述蛋白的方法，其中所述杂质包括一种或多种IRT变异体。在一个实施方案中，本发明的方法提供了源液中IRT变异体水平约2倍至约20倍的降低。优选IRT变异体水平降低至少5倍，更优选IRT变异体水平降低至少10倍。例如，在含有约3-5％IRT抗体变异体(为总的IRT抗体变异体类占所述源液的百分比)的源液(起始样品)中，IRT抗体变异体类可以降低至约0.3％至约0.5％。在多种实施方案中，IRT变异体类被降低至：小于1％，小于0.8％，小于0.5％，小于0.3％，小于0.2％和/或小于0.1％。优选在用于制备蛋白的源液的纯化过程中，IRT变异体被降低至：总IRT变异体类占所述源液的百分比小于1％，小于0.8％，小于0.5％，小于0.3％，小于0.2％和/或小于0.1％。
在多种实施方案中，本发明提供了从包括具有Fc区的蛋白和一种或多种杂质的源液中纯化所述蛋白的方法，其中所述杂质包括一种或多种LMW变异体。在一个实施方案中，本发明提供了源液中LMW变异体水平约2倍至约20倍的降低。优选LMW变异体水平降低至少5倍，更优选LMW变异体水平降低至少10倍。
例如，在具有约20％UDB抗体变异体(为总的UDB抗体变异体类占所述源液的百分比)的源液(起始样品)中，UDB抗体变异体类可以降低至约10％至约2％。在多种实施方案中，UDB变异体类被降低至：小于20％，小于15％，小于10％，小于5％，小于2％或小于1％。优选在用于制备蛋白的源液的纯化过程中，UDB变异体被降低至：总UDB变异体类占所述源液的百分比小于20％，小于15％，小于10％，小于5％，小于2％或小于1％。
例如，在具有约3-5％LMW抗体变异体(为总的LMW抗体变异体类占所述源液的百分比)的源液(起始样品)中，LMW抗体变异体类可以降低至约0.3％至约0.5％。在多种实施方案中，LMW变异体类被降低至：小于1％，小于0.8％，小于0.5％，小于0.3％，小于0.2％和/或小于0.1％。优选在用于制备蛋白的源液的纯化过程中，LMW变异体被降低至：总LMW变异体类占所述源液的百分比小于1％，小于0.8％，小于0.5％，小于0.3％，小于0.2％和/或小于0.1％。
在多种实施方案中，本发明提供了从包括具有Fc区的蛋白和一种或多种杂质的源液中纯化所述蛋白的方法，其中所述杂质包括一种或多种UDB变异体。在一个实施方案中，本发明的方法提供了源液中UDB变异体水平约2倍至约20倍的降低。优选UDB变异体水平降低至少5倍，更优选UDB变异体水平降低至少10倍。
例如，在具有约20％UDB抗体变异体(为总的UDB抗体变异体类占所述源液的百分比)的源液(起始样品)中，UDB抗体变异体类可以降低至约10％至约2％。在多种实施方案中，UDB变异体类被降低至：小于20％，小于15％，小于10％，小于5％，小于2％或小于1％。优选在用于制备蛋白的源液的纯化过程中，UDB变异体被降低至：总UDB变异体类占所述源液的百分比小于20％，小于15％，小于10％，小于5％，小于2％或小于1％。
同样，例如，在含有约3-5％UDB抗体变异体(为总的UDB抗体变异体类占所述源液的百分比)的源液(起始样品)中，UDB抗体变异体类可以降低至约0.3％至约0.5％。在多种实施方案中，UDB变异体类被降低至：小于1％，小于0.8％，小于0.5％，小于0.3％，小于0.2％和/或小于0.1％。优选在用于制备蛋白的源液的纯化过程中，UDB变异体被降低至：总UDB变异体类占所述源液的百分比小于1％，小于0.8％，小于0.5％，小于0.3％，小于0.2％和/或小于0.1％。
用于本发明的纯化方法的蛋白
本文所述将根据本发明进行纯化的具有Fc区的蛋白采用本领域公认的技术，包括例如，合成技术(如重组技术和肽合成或这些技术的组合)制备，或者分离自所述蛋白的内生性来源。在本发明的某些实施方案中，具有Fc区的蛋白是抗原结合多肽，更优选为抗体。所述抗体可以是，例如，多克隆抗体制品，单克隆抗体，重组抗体，嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。产生抗原结合多肽，尤其是抗体的技术在下文中描述。或者，具有Fc区的蛋白可以是抗体的改良形式，如双特异性抗体，抗体轭合物或抗体融合蛋白(例如，Fc融合蛋白)。产生这种抗体的改良形式和抗体融合蛋白的技术也在下文中描述。
多克隆抗体
多克隆抗体可以通过用免疫原免疫适宜的受试者来制备。免疫受试者的抗体效价可以通过标准技术，如通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)用固定化靶抗原，随着时间的推移进行监测。如果需要，可以将针对所述靶抗原的抗体分子从哺乳动物(例如，从血液)中分离出来，并通过公知技术，如A蛋白琼脂糖色谱进一步纯化，以获得所述抗体，例如，IgG，部分。在免疫后适当的时间，例如，当抗抗原抗体的效价最高时，可以从所述受试者获取产生抗体的细胞，用于通过标准技术，如最初由Kohler和Milstein((1975)Nature 256:495-497)描述的杂交瘤技术制备单克隆抗体(也参见，Brown et al.(1981)J.Immunol.127:539-46；Brown et al.(1980)J.Biol.Chem.255:4980-83；Yeh et al.(1976)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:2927-31；和Yeh et al.(1982)Int.J.Cancer 29:269-75)。嵌合多克隆抗体的制备请参见Buechler等的美国专利No.6,420,113。
单克隆抗体
许多用于融合淋巴细胞和无限增殖化细胞系的公知方案中的任何一种都可以应用于产生单克隆抗体的目的(参见，例如，G.Galfre et al.(1977)Nature 266:55052；Gefter et al.Somatic Cell Genet,上文已引用；Lerner,Yale J.Biol.Med.,上文已引用；Kenneth,Monoclonal Antibodies,上文已引用)。此外，本领域技术人员将了解，这些方法的许多变体也将是有用的。通常，无限增殖细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)由与所述淋巴细胞相同的哺乳动物种类衍生而来。例如，鼠杂交瘤可以通过用无限增殖化小鼠细胞系融合经本发明的免疫原性制品免疫的小鼠的淋巴细胞而制得。优选无限增殖细胞系是对含有次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培养基(“HAT培养基”)敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。许多骨髓瘤细胞系中的任何一种都可以根据标准技术用作融合伴侣，例如，P3-NS1/1-Ag4-1，P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤细胞系。这些骨髓瘤细胞系可获自ATCC。通常，用聚乙二醇(“PEG”)将对HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞融合至小鼠脾细胞。然后用HAT培养基对该融合产生的杂交瘤细胞进行选择，所述HAT培养基杀死未融合及非生产性己融合骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞在数天后由于其未转化而死亡)。采用标准ELISA分析法，通过从所述杂交瘤培养上清液中筛选结合靶抗原的抗体而检测产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
重组抗体
除了制备分泌单克隆抗体的杂交瘤外，单克隆抗体还可以通过用靶抗原筛选重组免疫球蛋白组合文库(例如，抗体噬菌体展示文库)，以由此分离结合所述靶抗原的免疫球蛋白文库成员而得到鉴定和分离。产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒可以在市场上买到(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体洗脱，目录号27-9400-01；和StratageneSurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。另外，尤其经得起检验的用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的例子可以在，例如，Ladner et al.美国专利No.5,223,409；Kang et al.PCT国际公开No.WO92/18619；Dower et al.PCT国际公开No.WO 91/17271；Winter et al.PCT国际公开WO 92/20791；Markland et al.PCT国际公开No.WO92/15679；Breitling et al.PCT国际公开WO 93/01288；McCafferty et al.PCT国际公开No.WO 92/01047；Garrard et al.PCT国际公开No.WO92/09690；Ladner et al.PCT国际公开No.WO 90/02809；Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9:1370-1372；Hay et al.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3:81-85；Huse et al.(1989)Science 246:1275-1281；Griffithset al.(1993)EMBO J 12:725-734；Hawkins et al.(1992)J Mol.Biol.226:889-896；Clarkson et al.(1991)Nature 352:624-628；Gram et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3576-3580；Garrad et al.(1991)Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom et al.(1991)Nuc.Acid Res.19:4133-4137；Barbas et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7978-7982；和McCafferty et al.Nature(1990)348:552-554中找到。
嵌合和人源化抗体
另外，重组抗体，如可以采用标准重组DNA技术制备的包括人和非人部分的嵌合和人源化单克隆抗体在本发明的范围内。
术语“人源化免疫球蛋白”或“人源化抗体”是指包括至少一条人源化免疫球蛋白或抗体链(即，至少一条人源化轻链或重链)的免疫球蛋白或抗体。术语“人源化免疫球蛋白链”或“人源化抗体链”(即，“人源化免疫球蛋白轻链”或“人源化免疫球蛋白重链”)是指具有包括基本上来自人免疫球蛋白或抗体的可变框架区和基本上来自非人免疫球蛋白或抗体的互补决定区(CDRs)(例如，至少1个CDR，优选2个CDRs，更优选3个CDRs)的可变区，并进一步包括恒定区(例如，在轻链的情况下，至少1个恒定区或其部分，及在重链的情况下，3个恒定区)的免疫球蛋白或抗体链(分别即，轻链和重链)。术语“人源化可变区”(例如，“人源化轻链可变区”或“人源化重链可变区”)是指包括基本上来自人免疫球蛋白或抗体的可变框架区和基本上来自非人免疫球蛋白或抗体的互补决定区(CDRs)的可变区。
术语“基本上来自人免疫球蛋白或抗体”或“基本上人的”的意思是，当为了对比的目的而与人免疫球蛋白或抗体氨基酸序列比对时，该区与人框架或恒定区序列享有至少80-90％，90-95％或95-99％的同一性(即，局部序列同一性)，从而允许例如，保守置换，共有序列置换，种系置换，回复突变等。保守置换，共有序列置换，种系置换，回复突变等的引入通常被称为人源化抗体或链的“最优化”。术语“基本上来自非人免疫球蛋白或抗体”或“基本上非人的”表示具有与非人生物，例如，非人哺乳动物的同一性为至少80-95％，优选至少90-95％，更优选96％，97％，98％或99％的免疫球蛋白或抗体序列。
因此，人源化免疫球蛋白或抗体或人源化免疫球蛋白或抗体链的所有区或残基，除CDRs外，都与一种或多种天然人免疫球蛋白序列的相应区或残基基本同一。术语“相应区”或“相应残基”是指当第一和第二序列为了对比的目的而进行最优比对时，与所述第一氨基酸或核苷酸序列上的区或残基占有相同(即，相等)位置的所述第二氨基酸或核苷酸序列上的区或残基。
术语“明显同一”表示两个多肽序列通过例如GAP或BESTFIT程序，采用缺省间隙权重(default gap weights)进行最优比对时，享有至少50-60％的序列同一性，优选至少60-70％的序列同一性，更优选至少70-80％的序列同一性，更优选至少80-90％的序列同一性，更优选至少90-95％的序列同一性，更优选至少95％的序列同一性或更高(例如，99％的序列同一性或更高)。术语“基本同一”表示两个多肽序列通过例如GAP或BESTFIT程序，采用缺省间隙权重进行最优比对时，享有至少80-90％的序列同一性，优选至少90-95％的序列同一性，更优选至少95％的序列同一性或更高(例如，99％的序列同一性或更高)。为了序列对比，通常将一个序列作为参考序列，与测试序列进行对比。当采用某种序列比对算法时，将测试和参考序列输入计算机，指定子序列坐标，如果需要，指定序列运算程序参数。然后序列比对算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分序列同一性。
用于对比序列的最优比对可以通过例如，Smith和Waterman的局部同源算法(Adv.Appl.Math.2:482(1981))，Needleman和Wunsch的同源比对算法法(J.Mol.Biol.48:443(1970))，Pearson和Lipman的相似性搜索法(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988))，这些算法的计算机化实施(Wisconsin基因软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.,Madison,WI)，或目检(参见Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology)进行。适于确定百分序列同一性和序列相似性的算法的一个例子是BLAST法，其在Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403(1990)中有描述。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术中心(可通过美国国家卫生研究院NCBI互连网服务器公开进入)公开获得。尽管也可以使用用户参数，但进行序列比对时通常使用缺省程序参数。对于氨基酸序列，BLASTP程序所使用的缺省值是字长(W)为3，期望值(E)为10及BLOSUM62计分矩阵(参见，Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
优选不同一的残基位置是因保守氨基酸置换而不同。为了将氨基酸置换分为保守或非保守置换的目的，将氨基酸分类如下：I类(疏水侧链)：leu，met，ala，val，leu，ile；II类(中性亲水侧链)：cys，ser，thr；III类(酸性侧链)：asp，glu；IV类(碱性侧链)：asn，gln，his，lys，arg；V类(影响链取向的残基)：gly，pro；和VI类(芳香族侧链)：trp，tyr，phe。保守置换涉及同类氨基酸间的置换。非保守置换通过某一类氨基酸的成员与另一类氨基酸的成员交换来构成。
优选人源化免疫球蛋白或抗体结合抗原的亲和力在相应非人源化抗体亲和力的为3，4或5的因数内。例如，如果非人源化抗体的结合亲和力为10-9M，人源化抗体将具有至少3×10-8M，4×10-8M，5×10-8M或10-9M的结合亲和力。当免疫球蛋白链赋予完整免疫球蛋白或抗体(或其抗原结合片段)特异性结合特性或结合亲和力时，则认为其“直接结合抗原”。如果与包括无突变的等效链的抗体(或其抗原结合片段)相比，所述突变(例如，回复突变)以至少一个数量级的程度影响(例如，降低)包括所述链的完整免疫球蛋白或抗体(或其抗原结合片段)的结合亲和力时，则认为所述突变大大影响了重或轻链直接结合抗原的能力。如果突变对包括所述链的完整免疫球蛋白或抗体(或其抗原结合片段)的结合亲和力的影响(例如，降低)仅为包括无所述突变的等效链的抗体(或其抗原结合片段)的亲和力的为2，3或4的因数时，则认为其“几乎不影响(例如，降低)链直接结合抗原的能力”。
术语“嵌合免疫球蛋白”或抗体是指可变区衍生自第一物种，并且恒定区衍生自第二物种的免疫球蛋白或抗体。嵌合免疫球蛋白或抗体可以通过例如基因工程由属于不同物种的免疫球蛋白基因片段构建。如下文定义的那样，术语“人源化免疫球蛋白”或“人源化抗体”不希望包括嵌合免疫球蛋白或抗体。尽管人源化免疫球蛋白或抗体在其结构上是嵌合的(即，包括来自一种以上蛋白的区)，但如本文所述，其包含在嵌合免疫球蛋白或抗体中没有发现的其它特征(即，包括供体CDR残基和受体框架残基的可变区)。
这种嵌合和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生，例如，采用Robinson et al.国际专利申请No.PCT/US86/02269；Akira,et al.欧洲专利申请184,187；Taniguchi,M.,欧洲专利申请171,496；Morrison et al.欧洲专利申请173,494；Neubergeret al.PCT国际公开No.WO 86/01533；Cabilly et al.美国专利No.4,816,567；Cabilly et al.欧洲专利申请125,023；Better et al.(1988)Science 240:1041-1043；Liu et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439-3443；Liu et al.(1987)J.Immunol.139:3521-3526；Sun et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura et al.(1987)Canc.Res.47:999-1005；Wood et al.(1985)Nature 314:446-449；及Shawet al.(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559；Morrison,S.L.(1985)Science 229:1202-1207；Oi et al.(1986)BioTechniques 4:214；Winter,美国专利5,225,539；Jones et al.(1986)Nature 321:552-525；Verhoeyan etal.(1988)Science 239:1534；和Beidler et al.(1988)J.Immunol.141:4053-4060中所描述的方法。
来自转基因动物和噬菌体展示的人抗体
或者，在缺乏内源性免疫球蛋白产生的情况下，现在可能产生经免疫后能产生组成完全的人抗体的转基因动物(例如，小鼠)。例如，已有人描述，嵌合和种系突变小鼠的抗体重链连接区(JH)基因的纯合性缺失导致了对内源性抗体产生的完全抑制。这种种系突变小鼠中人种系免疫球蛋白基因阵列的转移在抗原攻击后导致了人抗体的产生。参见，例如，美国专利6,150,584；6,114,598；和5,770,429。
完全人抗体也可以衍射自噬菌体展示文库(Hoogenboom et al.,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991))。嵌合多克隆抗体也可以获自噬菌体展示文库(Buechler等，美国专利6,420,113)
双特异性抗体和抗体轭合物
双特异性抗体(BsAbs)是对至少2个不同表位具有结合特异性的抗体。这种抗体可以衍生自全长抗体和抗体片段(例如，F(ab)'2双特异性抗体)。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统的全长双特异性抗体的产生以两条免疫球蛋白重链-轻链对的共表达为基础，其中所述两条链具有不同的特异性(Millstein et al.,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重和轻链的随机分配，这些杂交瘤(细胞杂交瘤)产生不同抗体分子的可能混合物(参见，WO 93/08829和Traunecker et al.,EMBO J.,10:3655-3659(1991))。
双特异性抗体还包括交联和“异轭对配合物(heteroconjugate)”抗体。例如，异共轭对配合物中的一个抗体可以与抗生物素蛋白偶联，另一个与生物素或其它有效负载偶联。异共轭对配合物抗体可以用任何合适的交联方法制备。适宜的交联剂是本领域公知的，并在美国专利No.4,676,980中与许多交联技术一起被公开。
在另一个实施方案中，抗体可以以化学方法或基因方法与有效负载，如反应性，可检测性或官能性分子，例如，免疫毒素轭合，产生抗体轭合物。这种有效负载包括，例如，免疫毒素，化学治疗剂和放射性同位素，所有这些都是本领域公知的。
抗体融合蛋白
用于本发明的具有Fc区的蛋白可以是至少含有与非抗体蛋白和多肽融合的抗体的Fc部分的融合蛋白。例如，Fc区可以与受体配体融合，以便产生能结合所述受体，并且具有Fc相关功能(如血清稳定性，Fc受体结合性等)的可溶性融合蛋白。或者，Fc区可以与受体的胞外域融合，以便产生能结合所述受体的配体(从而与天然受体竞争)，并且具有Fc相关功能的可溶性融合蛋白。这种Fc融合蛋白的非限制性例子有依那西普其包括与人IgG1的Fc部分融合的人TNFα受体的胞外配体结合域。抗体融合蛋白(本领域中也称作Fc融合蛋白和Ig融合蛋白)可以采用标准重组DNA技术制备，并且在本领域中已有描述，参见，例如，美国专利No.5,116,964，美国专利No.5,225,538，美国专利No.5,336,603和美国专利No.5,428,130，这些都是Capon等人的专利。
抗IL-13抗体
在优选实施方案中，将根据本发明进行纯化的具有Fc区的蛋白是抗IL-13抗体。抗IL-13抗体在标题均为“抗人IL-13抗体及其应用”的，于2004年6月9日提交的美国临时申请No.60/578,473和2004年6月22日提交的美国临时申请No.60/581,375中有描述。这些申请的内容均引入本文作为参考。优选抗IL-13抗体在本文中以不同方式称为“IMA”。
能结合，中和和/或抑制一种或多种IL-13相关活性，尤其是IL-13的信号功能活性的抗体可用于治疗由IL-13介导的疾病，如过敏性哮喘，非过敏性哮喘及哮喘相关病理，如纤维化，嗜曙红细胞增多和粘液产生。
为IL-13拮抗剂，包括抗体及其抗原结合片段的IL-13结合剂与IL-13，尤其人IL-13以高亲和力和特异性结合。本公开内容的抗体及其抗原结合片段在本文中也分别被称作“抗IL-13抗体”和“其片段”。在一个实施方案中，抗IL-13抗体或其片段降低，中和和/或拮抗至少一种IL-13相关活性。例如，抗IL-13抗体或其片段可以与IL-13，例如，IL-13的表位结合，并干扰相互作用，例如，IL-13与IL-13受体复合物(“IL-13R”)，例如，包括IL-13受体(“IL-13Rα1”)和白细胞介素-4受体α链(“IL-4Rα”)的复合物或其亚基之间的结合。因此，这里所述抗体及其片段可以用来干扰(例如，抑制，阻断或以其它方式减少)相互作用，例如，IL-13与IL-13受体复合物或其亚基之间的结合，从而干扰功能性信号复合物的形成。
其它优选含Fc区蛋白
在另一优选实施方案中，将根据本发明进行纯化的具有Fc区的蛋白是抗Aβ抗体。抗Aβ抗体在标题均为“识别β淀粉样肽的人源化抗体”的PCT公开No.WO 2002/46237和美国专利公开No.20050118651中有描述。这些申请的内容均引入本文作为参考。优选抗Aβ抗体在本文中以不同方式被称为“AAB”和“12A11”。
其它优选的含Fc区蛋白包括已批准人用治疗用途的抗体。这种抗体包括与肿瘤细胞抗原结合的抗体，与细胞因子结合的抗体，与细胞因子受体结合的抗体和与粘着蛋白结合的抗体。因此，在多种实施方案中，含Fc区蛋白可以是结合选自CD3(例如，OKT3)，CD52(例如，阿仑单抗；)，VEGF(例如，贝伐单抗；)，EGFR(例如，西妥昔单抗；)，CD33(例如，吉姆单抗；)，CD20(例如，利妥昔单抗；托西莫单抗；替伊莫单抗；)，HER-2(例如，曲妥珠单抗；)，TNFα(例如，阿达木单抗；英夫利昔单抗；etanercept；)，CD25(例如，达克珠单抗；巴利昔单抗；)，RSV(例如，帕利珠单抗；)，IgE(例如，奥马佐单抗；)，gp IIb/IIIa(例如，阿昔单抗；)，CD11a(例如，依法利珠单抗；)和α4整联蛋白(例如，那他珠单抗；)的抗原的抗体或Fc融合蛋白。
应该了解的是，任何前述单独或组合形式的多肽分子都适合作为根据本发明的含Fc区蛋白制品。
本发明的多个方面和实施方案将通过下列实施例进一步描述。这些实施例只是为了例证而不是为了限制而提供。
实施例
下列实施例仅为了说明性的目的而提供。实施例用3种不同单克隆抗体(称作AAB，12A11和IMA)提供。描述了8个各自代表抗体与杂质去除的组合的独立实验。
材料和方法
除非另有说明，本发明的实施通常采用化学，分子生物学，重组DNA技术，免疫学(特别是，例如，免疫球蛋白技术)的常规技术和标准电泳技术。参见，例如，Sambrook,Fritsch and Maniatis,MolecularCloning:Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；AntibodyEngineering Protocols(Methods in Molecular Biology),510,Paul,S.,Humana Pr(1996)；Antibody Engineering:A Practical Approach(PracticalApproach Series,169),McCafferty,Ed.,Irl Pr(1996)；Antibodies:ALaboratory Manual,Harlow et al.,C.S.H.L.Press,Pub.(1999)；CurrentProtocols in Molecular Biology,eds.Ausubel et al.,John Wiley&Sons(1992)；Bousse et al.,Protein Sizing on a Microchip,Anal.Chem.73,1207-1212(2001)；Knapp et al.,Commercialized and EmergingLab-on-a-Chip Applications；In:Proceedings of theμTAS 2001Symposium,Ramsey,J.M.&van den Berg,A.,7-10(2001)；和Mhatre etal.,Strategies for locating disulfide bonds in a monoclonal antibody viamass spectrometry,Rapid Commun.Mass Spectrom,13(24)2503-2510(1999)。
靶蛋白的产生
含Fc靶蛋白可以通过标准表达方法，例如，用悬浮培养中生长的重组哺乳动物细胞系产生。包含所感兴趣的含Fc蛋白的条件培养基在生产用生物反应器中产生。收集所得产物，并用任何适当的澄清步骤，例如，微滤和0.22μm膜过滤或离心，衬垫过滤和0.22μm膜过滤使之澄清。
靶蛋白的纯化
这里所例示的靶单克隆抗体(AAB，12A11和IMA)的纯化由A蛋白亲和色谱上靶分子的俘获组成。这可以由rmp A蛋白SepharoseTM快速流色谱，A蛋白SepharoseTM快速流色谱或MabSelect A蛋白色谱组成。然后如各实验所述洗涤树脂，洗脱产物并测试杂质水平。
靶蛋白的分析
用反相HPLC(RP-HPLC)测定AAB单克隆抗体样品中存在的IRT的量，用Pro A HPLC法测定IMA单克隆抗体的IRT水平。用分子排阻色谱法(SEC-HPLC)测定单体蛋白(单体IgG)，高分子量(HMW)和低分子量(LMW)类的百分比。进行变性SEC-HPLC分析，以确定样品中二硫键缺失(UDB)类的相对量。供试样品中的HCP水平用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定。
分析测定：IRT和UDB
反相HPLC(AAB IRT分析)
如下法进行RP-HPLC。各样品在40℃于2.5mM DTT存在下孵育60min，使二硫化物还原。在室温于5.5mM碘乙酸存在下孵育，完成烷基化。还原和烷基化之后，所有样品均用5μl 1M的DTT淬灭。该测定法的定量限是0.5％。将约40μg的各还原，烷基化后的样品注入POROS R1/H RP-HPLC柱，在下列条件下运行70min：
柱：Poros R1/H RP-HPLC
柱温：50℃
流动相A：0.1％(w/v)TFA的水溶液
流动相B：0.1％(w/v)TFA的95％乙腈溶液
流速：1.0mL/min
检测波长：217nm
运行时间：70minutes
进样：重复3次，每次40μg
梯度时间表列于表1中。
表1：RP-HPLC法的梯度时间表
| 梯度时间 | ％A | ％B |
| 0-1 | 95 | 5 |
| 2 | 70 | 30 |
| 54 | 60 | 40 |
| 55.1-70 | 95 | 5 |
A蛋白HPLC(IMA IRT分析)
A蛋白-HPLC如下法进行。每次在POROS Pro A柱上的进样总量为100μg，在下列条件下室温运行35min：
柱：Poros Pro A 4.6×50mm
柱温：室温
流动相A：50mM甲酸铵，pH 6.0
流动相B：10mM甲酸铵，0.8％甲酸
流速：2.0mL/min
检测波长：280nm
运行时间：35minutes
进样：重复3次，每次100μg
梯度时间表列于表2中。
表2：Pro A柱的梯度时间表
| 梯度时间 | ％A | ％B |
| 0-5 | 100 | 0 |
| 25-30 | 55 | 45 |
| 30.5-35 | 100 | 0 |
dSEC-HPLC(AAB UDB分析)
变性SEC-HPLC如下法进行。用于变性SEC测定的样品的预处理涉及最终浓度为200μg/mL蛋白，3M胍盐酸盐和100mM pH 7.4的Tris的试剂/样品混合物。样品在80℃加热20min，同时在整个转化过程中混合。对于本试验，采用了2个对照来确定UDB水平。用具有低和高水平UDB的内标作为对照。
色谱/分析条件如下：
柱：Tosoh BioSep G3000SWx1
柱温：室温
流动相：3M胍盐酸盐，25mM NaPO4，pH 6.8
梯度：等梯度
流速：0.5mL/min
检测波长：280nm
运行时间：50min
进样：50μL(10μg)，重复3次
实施例1：用于去除IRT的洗涤缓冲液的对比(AAB)
在本实施例中，含有单克隆抗体AAB的不纯溶液通过吸附到A蛋白柱上，然后用含有CaCl2，MgCl2，NaCl或丙二醇的洗涤缓冲液进行第一次洗涤而得到纯化。
含有单克隆抗体的培养物用与GE HealthcareFPLC色谱系统相连的rmp A蛋白SepharoseTM FF柱(8.9mL)进行小规模纯化。试验1中所述所有rmp A蛋白SepharoseTM FF色谱步骤均采用下列条件(例外情况在单独的实验说明中指出)。
柱尺寸-1.0cm×11.4cm
操作流速-150cm/hr
平衡1-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
冲洗-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(1倍柱体积)
洗涤1-可变(见表3)，但1号运行除外，其未进行洗涤1
洗涤2-20mM Tris，1.0M NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
洗涤3-10mM Tris，75mM NaCl，pH 7.5(7倍柱体积)
洗脱-50mM甘氨酸，75mM NaCl，pH 3.1(6倍柱体积)
净化1-20mM枸橼酸钠，pH 2.7(5倍柱体积)
净化2-6M胍盐酸盐(2倍柱体积)
净化洗涤-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
保存-16％乙醇(5倍柱体积)
运行温度：2-8℃
rmp A蛋白SepahroseTM FF柱用5倍体积的pH 7.5，含150mMNaCl的20mM Tris平衡。以约10mg产物/mL树脂的量向该柱上样。上样后，用1倍体积的平衡缓冲液冲洗和5倍体积的洗涤1的溶液洗涤。所测试的所有洗涤1的溶液都在表3中概述。除1号运行外，所有运行都包括洗涤1。洗涤1之后，用5倍体积的pH 7.5，含1.0M NaCl的20mM Tris和7倍体积的pH 7.5，含75mM NaCl的10mM Tris洗涤。用pH 3.1，含75mM NaCl的50mM甘氨酸将单克隆抗体从柱中洗脱出来。然后产物池用pH 8.5的2M Tris中和至7.9-8.1。然后将柱净化，洗涤和保存。表3列出了由不同运行得到的产物池中所存在的IRT类和LMW的水平。
表3：不同洗涤1的缓冲液的IRT和LMW值
| 运行号 | 条件 | ％LMW | ％IRT |
| 1 | 对照(无洗涤1) | 4.4 | 2.5 |
| 2 | 20％丙二醇，pH7.5 | 4.7 | 2.5 |
| 3 | 50mM Tris，2.0M氯化镁，pH7.5 | 1.6 | 1.5 |
| 4 | 50mM Tris，2.5M氯化镁，pH7.5 | 1.5 | 1.3 |
| 5 | 50mM乙酸酯，2.0M氯化镁，pH4.5 | 0.9 | 0.8 |
| 6 | 50mM Tris，4.0M氯化钠，pH7.5 | 4.4 | 2.5 |
| 7 | 50mM Tris，2.0M氯化钙，pH7.5 | 1.8 | 1.4 |
| 8 | 50mM Tris，2.5M氯化钙，pH7.5 | 0.8 | 0.8 |
结果显示，氯化镁和氯化钙洗涤降低了IRT和LMW类的水平，而氯化钠和丙二醇洗涤未减少IRT或LMW类。
实施例2：用A蛋白色谱结合CaCl2洗涤去除IRT
在本实施例中，用A蛋白色谱和CaCl2洗涤进行了大规模的抗体纯化，以除去IRT类。
含有单克隆抗体的培养物用与Millipore K-Prime 400色谱系统相连的MabSelect A蛋白柱(2.4L)进行中试规模的纯化。如下文所述完成两次MabSelect运行。
柱尺寸-13cm×18cm
操作流速-150cm/hr，300cm/hr
平衡1-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
冲洗-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(2倍柱体积)
洗涤1-1号运行，50mM Tris，2M CaCl2，pH 7.5；2号运行无洗涤1
洗涤2-20mM Tris，1.0M NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
洗涤3-10mM Tris，75mM NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
洗脱-50mM甘氨酸，25mM NaCl，pH 3.1(6倍柱体积)
净化1-50mM甘氨酸，0.5M NaCl，pH 2.7(5倍柱体积)
净化2-6M胍盐酸盐(2倍柱体积)
净化洗涤-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
保存-16％乙醇(5倍柱体积)
运行温度：2-8℃
MabSelect A蛋白柱用5倍柱体积的pH 7.5，含150mM NaCl的20mM Tris平衡。然后该柱以约10mg产物/mL树脂的量上样。然后用2倍柱体积的平衡缓冲液冲洗，5倍柱体积的洗涤1的溶液洗涤。对于运行1，该洗涤1的溶液由50mM Tris，2.0M CaCl2组成，pH为7.5，对于运行2，则将此步完全删去。洗涤1之后，用5倍柱体积的pH 7.5，含1.0M NaCl的50mM Tris和5倍柱体积的pH 7.5，含75mM NaCl的10mM Tris洗涤。用pH 3.1，含25mM NaCl的50mM甘氨酸将单克隆抗体从MabSelect A蛋白柱中洗脱出来。然后产物池用pH 8.5的2M Tris中和至7.8-8.2。然后将柱净化，洗涤和保存。结果见表4。
表4：有或无氯化钙洗涤的中试规模运行的％IRT水平
| 运行号 | 洗涤1的缓冲液 | ％IRT |
| 1 | 50mM Tris，2MCaCl2，pH7.5 | 0.8 |
| 2 | 对照(无) | 1.9 |
结果显示，在中试规模下，氯化钙洗涤从产物池中去除了IRT。
实施例3：IRT的去除(IMA)
本实施例中对与实施例1中所用不同的单克隆抗体(IMA)进行了采用CaCl2洗涤的小规模纯化。
含有不同单克隆抗体(IMA)的培养物用与GE HealthcareExplorer色谱系统相连的MabSelect A蛋白柱(17.3mL)进行小规模纯化。如下文所述完成运行。
柱尺寸-1.1cm×18.2cm(17.3mL)
操作流速-300cm/hr
平衡1-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(5.1倍柱体积)
洗涤1-20mM Tris，1M NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
洗涤2-50mM乙酸钠，0.6M CaCl2，pH 5.0(5倍柱体积)
洗涤3-50mM Tris，5mM NaCl，pH 7.5(3倍柱体积)
洗涤4-10mM Tris，5mM NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
洗脱-50mM甘氨酸，5mM NaCl，pH 3.0(5倍柱体积)
净化-6M胍盐酸盐(5倍柱体积)
净化洗涤-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(6倍柱体积)
保存-16％乙醇(5倍柱体积)
运行温度：18-24℃
MabSelect A蛋白柱用5倍柱体积的pH 7.5，含1M NaCl的20mMTris平衡。然后该柱以约45mg产物/mL树脂的量上样。然后如下洗涤该柱：5倍柱体积的pH 7.5，含1.0M NaCl的20mM Tris，5倍柱体积的pH 5.0，含0.6M CaCl2的50mM乙酸钠，3倍柱体积的pH 7.5，含5mM NaCl的50mM Tris和5倍柱体积的pH 7.5，含5mM NaCl的10mM Tris。用pH 3.0，含5mM NaCl的50mM甘氨酸将产物从MabSelectA蛋白柱中洗脱出来。然后产物池用pH 8.0的2M Tris中和至7.7。然后将柱净化，洗涤和保存。结果见表5，其提供了上样样品和峰样品中IRT类的水平。
表5：有CaCl2洗涤的运行中上样样品和峰样品的％IRT
| 上样样品的％IRT | 峰样品的％IRT |
| 5.8 | 1.1 |
结果显示，0.6M的CaCl2洗涤使IRT减少了5倍。
实施例4：宿主细胞蛋白的去除(IMA)
本实施例中，检验了CaCl2洗涤从含有IMA单克隆抗体的制品中除去宿主细胞蛋白(HCP)的能力。
含有所述单克隆抗体的培养物用与GE HealthcareFPLC色谱系统相连的MabSelect A蛋白柱(19mL)进行小规模纯化。如下文所述完成两次MabSelect运行。
柱尺寸-1.1cm×20.0cm(19mL)
操作流速-300cm/hr
平衡1-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(5.0倍柱体积)
洗涤1-20mM Tris，1M NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
洗涤2-50mM乙酸钠，0.6M CaCl2，pH 5.0(5倍柱体积；只用于运行2)
洗涤3-50mM Tris，5mM NaCl，pH 7.5(2倍柱体积)
洗涤4-10mM Tris，5mM NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
洗脱-50mM甘氨酸，5mM NaCl，pH 3.0(5倍柱体积)
净化-6M胍盐酸盐(5倍柱体积)
净化洗涤-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(6倍柱体积)
保存-16％乙醇(5倍柱体积)
运行温度：18-24℃
MabSelect A蛋白柱用5倍柱体积的pH 7.5，含150mM NaCl的20mM Tris平衡。然后该柱以约45mg产物/mL树脂的量上样。随后用5倍柱体积的pH 7.5，含1.0M NaCl的20mM Tris洗涤该柱，对于运行2，额外用5倍柱体积的pH 5.0，含0.6M CaCl2的50mM乙酸钠进行洗涤。在洗脱之前，接着用5倍柱体积的pH 7.5，含5mM NaCl的50mM Tris和5倍柱体积的pH 7.5，含5mM NaCl的10mM Tris洗涤该柱。用pH 3.0，含5mM NaCl的50mM甘氨酸将产物从MabSelect A蛋白柱中洗脱出来。然后产物池用pH 8.0的2M Tris中和至7.7。然后将柱净化，洗涤和保存。结果见表6，其提供了对照运行和用CaCl2洗涤的运行中存在的HCP类的水平。
表6：用或不用CaCl2洗涤的HCP去除的结果
| 运行号 | 洗涤2的条件 | HCP(PPM) |
| 1 | 无(对照) | 6,124 |
| 2 | 50mM乙酸钠，0.6M CaCl2，pH 5.0 | 2,295 |
结果显示，与对照运行相比，CaCl2洗涤使HCP去除量增大了3倍。
实施例5：DNA的去除(AAB)
检验本实施例检验了CaCl2洗涤从含有AAB单克隆抗体的制品中除去宿主细胞DNA的能力。
含有所述单克隆抗体的培养物用与GE HealthcareFPLC色谱系统相连的MabSelect A蛋白柱(19mL)进行小规模纯化。如下文所述完成三次MabSelect运行。
柱尺寸-1.1cm×20cm
操作流速-300cm/hr
平衡1-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
冲洗-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(2倍柱体积)
洗涤1-50mM Tris，2.0M CaCl2，pH 7.5(5倍柱体积)(仅用于运行2和3)
洗涤2-20mM Tris，1.0M NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)(仅用于运行1和3)
洗涤3-10mM Tris，75mM NaCl，pH 7.5(7倍柱体积)
洗脱-50mM甘氨酸，75mM NaCl，pH 3.0(6倍柱体积)
净化-50mM甘氨酸，0.5M NaCl，pH 2.7(5倍柱体积)
净化洗涤-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
保存-16％乙醇(5倍柱体积)
运行温度：18-24℃
MabSelect A蛋白柱用5倍柱体积的pH 7.5，含150mM NaCl的20mM Tris平衡。然后该柱以约40mg产物/mL树脂的上样量上样。随后用2倍体积的平衡缓冲液冲洗。对于运行2和3，该步骤后接着用5倍柱体积的洗涤1的溶液洗涤。对于运行1和3，用5倍柱体积的洗涤2的溶液洗涤。所有3次运行均用7倍柱体积的洗涤3的溶液洗涤。用pH 3.0，含75mM NaCl的50mM甘氨酸将所述单克隆抗体从MabSelect A蛋白柱中洗脱出来。然后产物池用pH 8.5的2M Tris中和至7.5-8.0。然后将柱净化，洗涤和保存。结果见表7。
表7：用氯化钙洗涤去除DNA
结果显示，与在洗涤液中使用NaCl相比，pH 7.5，含2.0M氯化钙的50mM Tris的加入使DNA的减少量增大了10倍。
实施例6：宿主细胞蛋白(HCP)的去除(12A11)
本实施例在纯化运行中使用了第三种单克隆抗体12A11，并测试了不同洗涤条件去除HCP的能力。
以96孔滤板格式进行高通量筛选(HTS)，以鉴定MabSelect步骤的去除杂质，如HCP的最佳洗涤条件。该筛选改变洗涤用辅料，辅料浓度和pH，以确定其对过程相关杂质，如HCP的影响。
MabSelect树脂用pH 7.3，含10mM NaCl的5mM Tris平衡，并在柱中将产物上样。然后取出树脂，混合，向96孔滤板的各孔中分配50μL树脂。各孔中的树脂用pH为7.3，含有5mM Tris和10mM NaCl的溶液平衡，然后用各自含有不同辅料的洗涤液分3个阶段进行洗涤，每阶段使用300μL洗涤缓冲液。辅料洗涤之后，用pH 7.3，含有5mMTris和10mM NaCl的缓冲液分4个阶段进行第二次洗涤，每阶段300μL。然后产物分3个阶段，每阶段300μL从树脂上洗脱下来。合并第1和第2阶段的洗脱液，测试HCP水平。
树脂体积-50μL
洗涤用辅料-氯化钠，氯化钙，氯化镁
辅料浓度–100，250，500，1000，1500和2000mM
辅料pH-6.0和7.5
洗脱缓冲液-25mM Hepes，10mM NaCl，pH 3.0，25mM Hepes，100mM NaCl，pH 3.0，50mM甘氨酸，10mM NaCl，pH 3.0，50mM甘氨酸，100mM NaCl，pH 3.0和100mM精氨酸，10mM NaCl，pH 3.0，100mM精氨酸，100mM NaCl，pH 3.0
运行温度：18-24℃
结果见表8和9。
表8：用pH 6.0的氯化钠，氯化钙或氯化镁洗涤MabSelect树脂时的HCP值
表9：用pH 7.5的氯化钠，氯化钙或氯化镁洗涤MabSelect树脂时的HCP值
结果显示，与所有辅料浓度下pH 6.0(表8)和pH 7.5(表9)的氯化钠相比，氯化钙和氯化镁都降低了MabSelect峰池中HCP的水平。
实施例7：二硫键缺失类(UDB)的去除
本实施例中检验了CaCl2洗涤去除二硫键缺失类(UDB)的能力。
基本上按实施例1中所述完成两次rmp A蛋白SepharoseTM FF运行。
柱尺寸-1.0cm×11.4cm
操作流速-150cm/hr
平衡1-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
冲洗-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(1倍柱体积)
洗涤1-对于运行1，50mM醋酸盐，2.0M CaCl2，pH 5.0；运行2无洗涤1
洗涤2-20mM Tris，1.0M NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
洗涤3-10mM Tris，75mM NaCl，pH 7.5(7倍柱体积)
洗脱-50mM甘氨酸，75mM NaCl，pH 3.1(6倍柱体积)
净化1-20mM柠檬酸钠，pH 2.7(5倍柱体积)
净化2-6M胍盐酸盐(2倍柱体积)
净化洗涤-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
保存-16％乙醇(5倍柱体积)
运行温度：2-8℃
rmp A蛋白Sepahrose FF柱用5倍体积的pH 7.5，含150mM NaCl的20mM Tris平衡。然后以约10mg产物/mL树脂的上样量向该柱上样。然后用1倍体积的平衡缓冲液冲洗，接着用5倍体积的洗涤1的溶液洗涤。对于运行1，该洗涤1的溶液由50mM醋酸盐，2.0M CaCl2组成，pH为5.0，而对于运行2，则将此步完全删去。洗涤1后，接着用5倍体积的pH 7.5，含1.0M NaCl的20mM Tris和7倍体积的pH 7.5，含75mM NaCl的10mM Tris洗涤。用pH 3.1，含75mM NaCl的50mM甘氨酸将单克隆抗体从rmp A蛋白SepharoseTM FF柱中洗脱出来。然后产物池用pH 8.5的2M Tris中和至7.8-8.2。然后将柱净化，洗涤和保存。结果见表10。
表10：用或未用钙洗涤过的样品的％UDB
| 运行号 | 样品 | ％UDB |
| 1 | 50mM醋酸盐，2.0M CaCl2，pH 5.0 | 9.5 |
| 2 | 无(对照) | 20.8 |
观察到额外用pH 5.0，含2.0M CaCl2的50mM醋酸盐洗涤过的样品中UDB水平减少了两倍。
实施例8：用其它二价阳离子盐洗涤除去HCP和IRT(AAB)
本实施例检验了含有MnCl2或NiCl2的洗涤液从含有AAB单克隆抗体的制品中去除杂质的能力。
进行两次运行，以评价含有其它二价阳离子盐，如MnCl2或NiCl2的洗涤液的作用。同样完成两次对照运行——一次用pH 7.5，含1.0MNaCl的50mM Tris洗涤(期望无IRT或HCP被去除)，另一次用pH7.5，含2.0M CaCl2的50mM Tris洗涤。
含有所述单克隆抗体的培养物用与GE HealthcareFPLC色谱系统相连的MabSelect A蛋白柱(9mL)进行小规模纯化。按下文所述进行MabSelect运行。如下文所描述的那样，4次运行的所有操作参数除了洗涤1是可变的外，其余都相同(表11)。
柱尺寸-1.0cm×11.5cm(9mL)
操作流速-300cm/hr(平衡，洗涤2，洗脱，再生，保存)
操作流速-230cm/hr(上样，冲洗，洗涤1)
平衡1-50mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(5.0倍柱体积)
洗涤1–可变(见表11的比较)
洗涤2-50mM Tris，10mM NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
洗脱-50mM甘氨酸，10mM NaCl，pH 3.0(3倍柱体积)
再生-50mM NaOH，0.5M Na2SO4(5倍柱体积)
保存-16％乙醇，50mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5(5倍柱体积)
运行温度：18-24℃
MabSelect A蛋白柱用5倍柱体积的pH 7.5，含150mM NaCl的50mM Tris平衡。将该柱以约40mg产物/mL树脂的量上样。柱上多余的样品用5倍柱体积的pH 7.5，含150mM NaCl的50mM Tris冲洗出去。然后用表11所述溶液中的一种洗涤该柱。洗脱该柱之前，用5倍柱体积的pH 7.5，含10mM NaCl的50mM Tris洗涤。用pH 3.0，含10mM NaCl的50mM甘氨酸将产物从MabSelect A蛋白柱中洗脱出来。然后产物池用pH 9.0的2M Tris中和至pH 8.0。将柱用5倍柱体积的50mM NaOH，0.5M Na2SO4净化，然后用5倍柱体积的pH 7.5的16％乙醇，50mM Tris，150mM NaCl保存。结果见表11(HCP的去除)和表12(IRT的去除)。
表11：用不同洗涤液去除HCP
| 运行号 | 洗涤1的条件 | HCP(PPM) |
| 1 | 50mM Tris，1.0mM NaCl，pH 7.5 | 17,600 |
| 2 | 50mM乙酸钠，1.5mM MnCl2，pH 5.0* | 10,600 |
| 3 | 50mM乙酸钠，1.5mM NiCl2，pH 5.0* | 4,700 |
| 4 | 50mM Tris，2.0mM CaCl2，pH 7.5 | 6,500 |
*基于MnCl2和NiCl2的溶解性选择pH5.0
表12：用不同洗涤液去除IRT
| 运行号 | 洗涤1的条件 | IRT(％) |
| 1 | 50mM Tris，1.0mM NaCl，pH 7.5 | 2.78 |
| 2 | 50mM乙酸钠，1.5mM MnCl2，pH 5.0* | 0.77 |
| 3 | 50mM乙酸钠，1.5mM NiCl2，pH 5.0* | 0.47 |
| 4 | 50mM Tris，2.0mM CaCl2，pH 7.5 | 0.87 |
*基于MnCl2和NiCl2的溶解性选择pH 5.0
表11显示，用含有二价阳离子的溶液洗涤的运行中存在的HCP类的水平比对照(1.0mM NaCl洗涤)小1.5-3.5倍。表12显示，与含有1.0mM NaCl的洗涤液相比，包含用二价阳离子盐溶液洗涤的步骤的运行也提供了大于3.5倍的IRT去除量。因此，这些结果证明了用其它不同于CaCl2的二价阳离子(例如，用MnCl2或NiCl2)进行盐洗涤也能有效去除杂质。
等同体 通过不超出常规的实验，本领域技术人员将认识到，或能确定本文所述本发明的具体实施方案的许多等同体。这些等同体希望为所附权利要求书所涵盖。
Claims (3)
1.从包括具有Fc区的蛋白和一种或多种杂质的源液中纯化所述具有Fc区的蛋白的方法，其包括步骤：
将所述蛋白吸附在Fc结合剂上；
用含有浓度0.5M至3M的CaCl2的缓冲溶液洗涤与所述蛋白结合的Fc结合剂以减少一种或多种杂质，其中所述一种或多种杂质选自：内含子连读变异体类，二硫键缺失变异体类，低分子量种类，宿主细胞蛋白，或宿主细胞DNA；以及
使用pH范围为2.0至4.0的洗脱缓冲液从所述Fc结合剂洗脱所述蛋白，
其中具有Fc区的蛋白是从源液纯化的。
2.从包括具有Fc区的蛋白和一种或多种内含子连读变异体类的源液中纯化所述具有Fc区的蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：
将所述具有Fc区的蛋白吸附在作为Fc结合剂的亲和配体上；
用含有浓度0.5M至3M的CaCl2的缓冲溶液洗涤亲和配体以减少内含子连读变异体类；以及
使用pH范围为2.0至4.0的洗脱缓冲液从所述亲和配体洗脱具有Fc区的蛋白，
其中具有Fc区的蛋白是从源液纯化的。
3.从包括具有Fc区的蛋白和一种或多种杂质的源液中纯化所述具有Fc区的蛋白的方法，其中所述具有Fc区的蛋白是抗体，所述方法包括下述步骤：
将所述具有Fc区的蛋白吸附在作为Fc结合剂的亲和配体上；
用含有浓度0.5M至3M的CaCl2的缓冲溶液洗涤亲和配体以减少一种或多种杂质，其中所述一种或多种杂质选自：内含子连读变异体类，二硫键缺失变异体类，低分子量种类，宿主细胞蛋白，或宿主细胞DNA；以及
使用pH范围为2.0至4.0的洗脱缓冲液从所述亲和配体洗脱具有Fc区的蛋白，
其中具有Fc区的蛋白是从源液纯化的。
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