ES2402650T3 - Métodos de purificación de anticuerpos anti A beta - Google Patents

Abstract

Método para purificar un anticuerpo anti-Aß que tiMétodo para purificar un anticuerpo anti-Aß que tiMétodo para purificar un anticuerpo anti-Aß que tiene una región Fc desde un líquido de partida que ene una región Fc desde un líquido de partida que ene una región Fc desde un líquido de partida que comprende el anticuerpo y una o más impurezas, quecomprende el anticuerpo y una o más impurezas, quecomprende el anticuerpo y una o más impurezas, que comprende las etapas de: adsorber el anticuerpo a comprende las etapas de: adsorber el anticuerpo a comprende las etapas de: adsorber el anticuerpo a un agente de unión a Fc que comprende una o más d un agente de unión a Fc que comprende una o más d un agente de unión a Fc que comprende una o más de la Proteína A y la proteína G; lavar el agente de la Proteína A y la proteína G; lavar el agente de la Proteína A y la proteína G; lavar el agente de unión a Fc con una solución tampón que contiene e unión a Fc con una solución tampón que contiene e unión a Fc con una solución tampón que contiene CaCl2 a una concentración de 0,5 M a 3 M para elimCaCl2 a una concentración de 0,5 M a 3 M para elimCaCl2 a una concentración de 0,5 M a 3 M para eliminar una o más impurezas; y recuperar el anticuerpinar una o más impurezas; y recuperar el anticuerpinar una o más impurezas; y recuperar el anticuerpo desde el agente de unión a Fc eluyendo el anticuo desde el agente de unión a Fc eluyendo el anticuo desde el agente de unión a Fc eluyendo el anticuerpo en un tampón de elución con un pH en un intererpo en un tampón de elución con un pH en un intererpo en un tampón de elución con un pH en un intervalo comprendido entre 2 y 4. valo comprendido entre 2 y 4. valo comprendido entre 2 y 4.

Description

Metodos de purificacion de anticuerpos anti A beta. SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica la prioridad sobre la solicitud de patente provisional de Estados Unidos quot;METHODS OF PURIFYING Fc REGION CONTAINING PROTEINSquot;, presentada el 17 de junio de 2005 con numero de serie 60/691821. ANTECEDENTES DE LA INVENCION La enfermedad de Alzheimer (quot;EAquot;) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la aparicion de placas de amiloide, ovillos neurofibrilares y perdida neuronal significativa. La proteina �-amiloide (tambien conocida como peptido Ar), el principal componente de las placas seniles, ha sido implicada en la patogenesis de la enfermedad de Alzheimer (Selkoe (1989) Cell 58:611-612; Hardy (1997) Trends Neurosci. 20:154-159). Se ha demostrado que la �-amiloide es directamente toxica para las neuronas cultivadas (Lorenzo y Yankner (1996) Ann. NYAcad. Sci. 777:89-95) e indirectamente toxica a traves de diversos mediadores (Koh et al., (1990) Brain Research 533:315-320; Mattson et al., (1992) J. Neurosciences 12:376-389). Ademas, los modelos in vivo, incluyendo un modelo en ratas y el de raton PDAPP, han vinculado la �-amiloide a deficits de aprendizaje, modificacion de la funcion cognitiva, e inhibicion de la potenciacion del hipocampo a largo plazo (Chen et al., (2000) Nature 408:975-985; Walsh et al., (2002) Nature 416:535-539). Por lo tanto, gran parte del interes se ha centrado en las terapias que modifican los niveles de �-amiloide para reducir potencialmente la gravedad o incluso eliminar la propia enfermedad. Una estrategia de tratamiento de la EA que ha surgido recientemente en respuesta a estudios exitosos en modelos experimentales en ratas y en raton PDAPP, es la de la inmunizacion pasiva de individuos para proporcionar inmunoglobulinas tales como anticuerpos especificos para la �-amiloide. (Vease, por ejemplo, Bard et al., (2000) Nat. Med. 6:916-919 y Bard et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 100:2023-2028). Recientemente, se ha demostrado tambien que la reduccion de Abeta mediante inmunizacion pasiva protege contra la perdida progresiva de la degeneracion sinaptica en un modelo de raton transgenico de la enfermedad de Alzheimer. (Buttini et al., (2005) J. Neurosci. 25:9096-101). Los recientes avances en la tecnologia recombinante han permitido la produccion de anticuerpos contra virtualmente cualquier diana, por ejemplo, celulas cancerosas, bacterias, y virus. Por lo general, un anticuerpo se produce mediante una linea celular que ha sido modificada por ingenieria genetica para expresar el anticuerpo a niveles altos. La linea celular modificado por ingenieria genetica se desarrolla posteriormente en un cultivo que comprende una mezcla compleja de azucares, aminoacidos y factores de crecimiento, asi como diversas proteinas, incluyendo por ejemplo, proteinas de suero. Sin embargo, separar los anticuerpos completos a partir de subproductos celulares y componentes del cultivo con una pureza suficiente para su uso en investigacion o como productos terapeuticos plantea un tremendo desafio. La purificacion de las moleculas de anticuerpos es especialmente critico si los anticuerpos van a ser utilizados como un farmaco para la administracion a seres humanos. Los esquemas (o trenes) de purificacion tradicionales de anticuerpos comprenden con frecuencia una etapa de cromatografia, que aprovecha la capacidad de la molecula de anticuerpo para ser retenida por o unirse preferentemente a la fase solida (o fase solida funcionalizada) de una columna de cromatografia en comparacion con la union o la retencion de diversas impurezas. Se han propuesto o llevado a cabo esquemas para purificar anticuerpos que primero se unen a proteinas que contienen una region CH2/CH3 a Proteina A inmovilizada sobre una fase solida, seguido de la eliminacion de las impurezas unidas a la fase solida mediante el lavado de la fase solida con un disolvente electrolito hidrofobo y la posterior recuperacion de las proteinas que contienen una region CH2/CH3 desde la fase solida. Sin embargo, estos sistemas estan limitados en lo referente a que las condiciones utilizadas para unirse preferentemente a las proteinas que contienen una region CH2/CH3 tambien soportan la union de las impurezas (por ejemplo, anticuerpos con regiones CH2/CH3 incompletas). En el desarrollo de la terapeutica humana, tales impurezas resultan muy poco deseables. Por consiguiente, existe la necesidad de mejorar la purificacion de proteinas o polipeptidos que tengan regiones constantes, en concreto, proteinas que tengan regiones Fc (por ejemplo, anticuerpos), producidas en cultivo celular. El documento EE.UU. 2004/229330 describe un metodo para la purificacion y captura de alta eficiencia de una proteina marcada a partir de una preparacion de proteinas, especialmente una proteina marcada en baja cantidad.

RESUMEN DE LA INVENCION

La presente invencion presenta metodos de purificacion de anticuerpos que se unen a Ar. Los metodos de la invencion resultan especialmente adecuados para la purificacion de anticuerpos desarrollados para su administracion a seres humanos. En concreto, la invencion presenta la purificacion de anticuerpos anti-Ar producidos en cultivo celular.

En diversos aspectos, la presente invencion presenta metodos para separar un anticuerpo anti-Ar, de un liquido de partida que comprende el anticuerpo y una o mas impurezas. En los metodos de la invencion, el anticuerpo que se une a Ar se adsorbe a un agente de union a Fc que comprende una o mas de la Proteina A y la proteina G y a continuacion el agente de union a Fc se lava con una solucion tampon que contiene CaCl2 0,5 M a 3,4 M para eliminar una o mas impurezas. A continuacion se recupera la proteina desde el agente de union a Fc en una solucion de elucion de pH 2 a 4. Los metodos de la invencion resultan especialmente utiles para eliminar impurezas tales como las especies de variantes de ultralectura de intrones (IRT), las especies con menos enlaces disulfuro (UDB) y/o las especies de variantes de bajo peso molecular (LMW). Los metodos de la invencion tambien resultan eficaces para eliminar impurezas tales como ADN y proteinas de la celula hospedadora (HCP).

Los metodos de la presente invencion comprenden una o mas etapas de separacion cromatografica y ademas pueden comprender una o mas etapas de filtracion. Los etapas de separacion cromatografica pueden ser continuas o discontinuas (por ejemplo, un procedimiento por lotes), o una combinacion de ambas. En diversas formas de realizacion, los metodos comprenden una o mas etapas de filtracion, por ejemplo, para eliminar los virus, concentrar y tamponar la solucion que contiene la proteina diana, y para eliminar contaminantes microbianos.

En diversas formas de realizacion, el anticuerpo anti-Ar es un anticuerpo murino, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. En algunas formas de realizacion, el anticuerpo anti-Ar es un anticuerpo que se une especificamente al epitopo dentro de los restos 1-7, 1-5, 3-7, 3-6, 13-28, 15-24, 16-24, 16-21, 19-22, 33-40, 33-42 de Ar. Unos anticuerpos anti-Ar ejemplares se unen especificamente a un epitopo dentro de los restos 1-10 de Ar, tal como, por ejemplo, dentro de los restos 1-7, 1-5, 3-7 o 3-6 de Ar. Otros anticuerpos anti-Ar ejemplares se unen especificamente a un epitopo dentro de los restos 13-28 de Ar, tal como, por ejemplo, dentro de los restos 16-21 o 19-22 de Ar. Otros anticuerpos anti-Ar ejemplares mas se unen especificamente a un epitopo del extremo C-terminal de Ar tal como, por ejemplo, 33-40 o 33-42 de Ar. En algunas formas de realizacion, el anticuerpo anti-Ar se une a un epitopo discontinuo que incluye los restos dentro de 1-7 y dentro de 13-28 de Ar. Otras formas de realizacion presentan fragmentos Fab, Fab'(2) o Fv de anticuerpos anti-Ar. En algunas de tales formas de realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo biespecifico o un anticuerpo creado mediante el proceso descrito en la publicacion de patente internacional N° WO03/070760.

En una forma de realizacion preferente, el anticuerpo es un anticuerpo anti-Ar humanizado, y en determinadas formas de realizacion, es un anticuerpo anti-Ar seleccionado del grupo que consiste en 3D6, 10D5, 12B4, 12A11, 15C11 y 266. El isotipo del anticuerpo puede ser IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o cualquier otro isotipo farmaceuticamente aceptable. En las formas de realizacion preferentes, el isotipo es IgG1 humana o IgG4 humana.

En diversas formas de realizacion, el anticuerpo que se une a Ar se produce por recombinacion. En diversas formas de realizacion, el anticuerpo que se une a Ar se produce por recombinacion en una celula de ovario de hamster chino (CHO).

En diversas formas de realizacion, la una o mas impurezas comprenden una o mas de una proteina de la celula hospedadora, ADN de la celula hospedadora, una proteina de cultivo celular, una especie no deseada de la proteina de union a Ar, y mezclas de las mismas. Por ejemplo, en diversas formas de realizacion, las especies no deseadas de la proteina de union a Ar comprenden uno o mas de cadenas de anticuerpos o fragmentos de las mismas que tienen una secuencia de ultralectura de intrones, uno o mas de cadenas de anticuerpos o fragmentos de las mismas que tienen un enlace disulfuro incorrecto, un semi-anticuerpo o fragmento del mismo, un dimero de cadena ligera o fragmento del mismo, y un dimero de cadena pesada o fragmento del mismo.

Los metodos de la presente invencion purifican un anticuerpo anti-Ar, a partir un liquido de partida que comprende el anticuerpo y una o mas impurezas adsorbiendo primero el anticuerpo a un agente de union a Fc que comprende una o mas de la Proteina A y la proteina G, seguido de lavado del agente de union a Fc con una solucion tampon que contiene CaCl2 O.5MT a 3 M para eliminar una o mas impurezas, y recuperar posteriormente el anticuerpo desde el agente de union a Fc en un tampon de elucion a pH 2 a 4. En diversas formas de realizacion, las etapas de adsorcion del anticuerpo a un agente de union a Fc y el lavado del agente de union a Fc con una solucion tampon que contiene CaCl2, se realizan a una temperatura en el intervalo comprendido entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 24°C.

El agente de union a la region Fc comprende una o mas de la Proteina A y la proteina G. En una forma de realizacion preferente, el agente de union a Fc esta inmovilizado sobre una fase solida. Esta fase solida puede comprender, por ejemplo, una o mas de una perla, una matriz de agarosa, silice, y mezclas de los mismos.

En diversas formas de realizacion, la solucion tampon que contiene el CaCl2 tiene un valor de pH en el intervalo comprendido entre aproximadamente 4 y aproximadamente 9, y en algunas formas de realizacion, entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8, entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 7,5 o entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8. Los valores y los intervalos incluidos y/o intermedios dentro de los intervalos expuestos en el presente documento tambien pretenden estar dentro del alcance de la presente invencion. Por ejemplo, un valor de pH entre aproximadamente 7,1 y aproximadamente 7,9, entre aproximadamente 7,2 y aproximadamente 7,9, entre aproximadamente 7,3 y aproximadamente 7,7, entre aproximadamente 7,4 y aproximadamente 7,6, entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 6, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 7, o entre aproximadamente 8 y aproximadamente 9.

Ademas, los intervalos con los valores enumerados en el presente documento como limite superior o inferior pretenden estar dentro del alcance de la presente invencion. Por ejemplo, un pH de al menos aproximadamente (o aproximadamente) 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, u 8.

La solucion tampon tiene una concentracion de CaCl2 divalente en el intervalo comprendido entre aproximadamente 0,5 M y aproximadamente 3 M, entre aproximadamente 1,0 M y aproximadamente 3 M o entre aproximadamente 0,6 M y aproximadamente 2,5 M. Por ejemplo, el tampon puede comprender CaCl2 al menos aproximadamente 0,6 M, o CaCl2 al menos aproximadamente 2 M. Los valores e intervalos incluidos y/o intermedios dentro de los intervalos expuestos en el presente documento tambien pretenden estar dentro del alcance de la presente invencion. Por ejemplo, la solucion tampon tiene una concentracion de CaCl2 entre aproximadamente 0,5 M y aproximadamente 0,75 M, entre aproximadamente 0,5 M y aproximadamente 0,8 M, entre aproximadamente 0,5 M y aproximadamente 0,9 M, entre aproximadamente 0,5 M y 1,0 M, entre aproximadamente 0,5 M y 2 M, entre aproximadamente 1,5 M y aproximadamente 2,0 M, entre aproximadamente 1,5 M y aproximadamente 2,5 M, entre aproximadamente 1,5 M y aproximadamente 3,0 M, o entre aproximadamente 2,5 M y aproximadamente 3 M.

Ademas, los intervalos con los valores enumerados en el presente documento como limite superior o inferior pretenden estar dentro del alcance de la presente invencion. Por ejemplo, la solucion tampon tiene una concentracion de CaCl2 de al menos aproximadamente (o aproximadamente) 0,6 M, 1 M, 1,5 M, 2 M, 2,5 M, o 3 M. En diversas formas de realizacion, la solucion tampon que contiene CaCl2 tiene una temperatura en el intervalo comprendido entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 24°C.

La etapa de recuperacion del anticuerpo desde el agente de union a Fc comprende eluir el anticuerpo utilizando un tampon de elucion con un pH en el intervalo comprendido entre 2,0 y aproximadamente 4,0, mas preferentemente en el intervalo comprendido entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 3,5. Los valores e intervalos incluidos y/o intermedios dentro de los intervalos expuestos en el presente documento tambien pretenden estar dentro del alcance de la presente invencion. Por ejemplo, el tampon de elucion tiene un pH de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 3 o entre aproximadamente 3 y aproximadamente 4.

Ademas, los intervalos con los valores enumerados en el presente documento como limite superior o inferior pretenden estar dentro del alcance de la presente invencion. Por ejemplo, el tampon de elucion tiene un pH de al menos aproximadamente (o aproximadamente) 2, 2,5, 3, 3,5 o 4.

En diversas formas de realizacion, los anticuerpos recuperados pueden someterse a etapas de purificacion adicionales ya sea antes, o despues de, la etapa de cromatografia del agente de union a Fc. Por ejemplo, las etapas de purificacion adicionales ejemplares incluyen, pero no se limitan a: cromatografia de intercambio anionico, cromatografia de intercambio cationico, cromatografia de afinidad por iones metalicos inmovilizados, cromatografia de interaccion hidrofoba (HIC), cromatografia con hidroxiapatita, dialisis, cromatografia de afinidad, precipitacion con sulfato de amonio, precipitacion con etanol, HPLC de fase inversa (RP-HPLC), cromatofocalizacion, ultrafiltracion, diafiltracion, microfiltracion, y filtracion en gel. En diversas formas de realizacion, la etapa de cromatografia del agente de union a Fc va seguida de una cromatografia de intercambio anionico y una etapa de HIC. En diversas formas de realizacion, las etapas de cromatografia van seguidas adicionalmente de una etapa de filtracion de virus, una etapa de ultrafiltracion/diafiltracion, y/o una etapa de filtracion de contaminantes microbianos.

En un aspecto, la presente invencion proporciona metodos para purificar un anticuerpo anti-Ar, a partir de una solucion del mismo que contiene impurezas y recuperar posteriormente la proteina desde el agente de union a Fc para producir una primera combinacion de eluyentes.

En diversas formas de realizacion, el proceso de purificacion continua sometiendo la primera combinacion de eluyentes a cromatografia de intercambio ionico poniendo en contacto una resina de intercambio ionico con la primera combinacion de eluyentes de manera que el anticuerpo diana no se adsorba a la resina y recuperando el anticuerpo diana del flujo continuo para producir una segunda combinacion de eluyentes. En diversas formas de realizacion, la etapa de cromatografia de intercambio ionico comprende adicionalmente lavar la resina de intercambio ionico con una solucion de lavado tamponada para recuperar al menos una parte de cualquier anticuerpo diana adsorbido.

En diversas formas de realizacion, el proceso de purificacion continua sometiendo la segunda combinacion de eluyentes a cromatografia de interaccion hidrofoba adsorbiendo el anticuerpo diana a una resina de interaccion hidrofoba (por ejemplo, una fase solida funcionalizada con ligandos hidrofobos), lavando la resina de interaccion hidrofoba con una solucion de lavado tamponada con una fuerza ionica que practicamente no eluye la proteina diana y recuperando la proteina diana purificada (por lo general utilizando un tampon de elucion con una fuerza ionica lo suficientemente baja como para desorber la proteina diana desde la resina de interaccion hidrofoba).

En las formas de realizacion preferentes de los diversos aspectos de la invencion, el agente de union a Fc esta inmovilizado sobre una fase solida, que se equilibra preferentemente con un tampon adecuado antes del contacto con el liquido de partida. La fase solida es, preferentemente, una columna que comprende agarosa que inmoviliza el agente de union a Fc. En diversas formas de realizacion, la columna se recubre con un reactivo, tal como glicerol, para disminuir o evitar la adherencia no especifica a la columna.

En diversas formas de realizacion, los anticuerpos purificados mediante los metodos de la presente invencion pueden formularse en un vehiculo farmaceuticamente aceptable y utilizarse para diversos usos diagnosticos, terapeuticos u otros usos conocidos para tales moleculas.

En diversos aspectos, la presente invencion proporciona metodos para purificar un anticuerpo anti-Ar, a partir de una solucion que contiene el anticuerpo y las variantes de ultralectura de intrones (IRT) del mismo. En aspectos destacados, los metodos de la presente invencion se utilizan para reducir los niveles de una o mas especies de variantes de ultralectura de intrones en una preparacion de anticuerpos. En diversas formas de realizacion, la proteina recuperada desde el agente de union a Fc tiene un nivel de variantes de ultralectura de intrones que es al menos 5 veces inferior al nivel de variantes de ultralectura de intrones en el liquido de partida, y en algunas formas de realizacion al menos 10 veces inferior al nivel de variantes de ultralectura de intrones en el liquido de partida. En diversas formas de realizacion, las variantes de ultralectura de intrones comprenden menos de aproximadamente el 1,0%, 0,8%, 0,5%, 0,2% o 0,1% de las especies de dicha proteina en la solucion que contiene dicha proteina recuperada desde el agente de union a Fc.

En diversos aspectos, la presente invencion proporciona metodos para purificar un anticuerpo anti-Ar, a partir de una solucion que contiene la proteina y variantes de bajo peso molecular (LMW) de la misma. En aspectos destacados, los metodos de la presente invencion se utilizan para reducir los niveles de una o mas especies de variantes de bajo peso molecular en una preparacion de anticuerpos. En diversas formas de realizacion, la proteina recuperada desde el agente de union a Fc tiene un nivel de variantes de bajo peso molecular que es al menos 5 veces inferior al nivel de variantes de bajo peso molecular en el liquido de partida, y en algunas formas de realizacion al menos 10 veces inferior al nivel de variantes de bajo peso molecular en el liquido de partida. En diversas formas de realizacion, las variantes de bajo peso molecular comprenden menos de aproximadamente el 1,0%, 0,8%, 0,5%, 0,2% o 0,1% de las especies de dicha proteina en la solucion que contiene dicha proteina recuperada desde el agente de union a Fc.

En diversos aspectos, la presente invencion proporciona metodos para purificar un anticuerpo anti-Ar, a partir de una solucion que contiene la proteina y variantes con menos enlaces disulfuro (UDB) de la misma. En aspectos destacados, los metodos de la presente invencion se utilizan para reducir los niveles de una o mas especies de variantes con menos enlaces disulfuro en una preparacion de anticuerpos. En diversas formas de realizacion, la proteina recuperada desde el agente de union a Fc tiene un nivel de variantes con menos enlaces disulfuro que es al menos 5 veces inferior al nivel de variantes con menos enlaces disulfuro en el liquido de partida, y en algunas formas de realizacion al menos 10 veces inferior al nivel de variantes con menos enlaces disulfuro en el liquido de partida. En diversas formas de realizacion, las variantes con menos enlaces disulfuro comprenden menos de aproximadamente el 20%, 15%, 10%, 5%, 2% o 1% de las especies de dicha proteina en la solucion que contiene dicha proteina recuperada desde el agente de union a Fc.

En otros aspectos, la presente invencion proporciona un tren de purificacion para llevar a cabo cualquiera de los metodos que comprenden al menos las etapas de adsorber primero el anticuerpo anti-Ar a un agente de union a Fc como se ha definido anteriormente, seguido de lavado del agente de union a Fc con una solucion tampon que contiene CaCl2 0,5 M a 3 M para eliminar una o mas impurezas, y recuperar posteriormente la proteina desde el agente de union a Fc en un tampon de elucion a pH 2 a 4.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra las secuencias completas de aminoacidos de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti-Ar 3D6 humanizado version 2 (hu3D6.v2), SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente. Las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (CDR), es decir, CDR1, CDR2, y CDR3 estan, respectivamente, en las posiciones de resto 24-39, 55-61 y 94-102 (panel superior). Las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (CDR), es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 estan, respectivamente, en las posiciones de resto 40-44, 50-65 y 99-108 (panel inferior). Los enlaces disulfuro intramoleculares predichos se ilustran mediante las conexiones de los restos de cisteina implicados. Las cisteinas que se esperaban formasen enlaces disulfuro intermoleculares estan subrayadas y se indica la conectividad. El sitio de consenso de N-glicosilacion de la cadena pesada del anticuerpo se indica en cursiva en las posiciones de resto 299-301 (panel inferior). La lisina C-terminal de la cadena pesada predicha se muestra entre parentesis.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Antes de describir adicionalmente la invencion, puede resultar util para su comprension exponer las definiciones de determinados terminos que se utilizan en el presente documento. Las definiciones expuestas en el presente documento han sido agrupadas solamente para facilitar la referencia y no a modo de limitacion.

Definiciones relacionadas con las proteinas

La presente invencion presenta metodos de purificacion de anticuerpos que se unen a Ar. En concreto, la invencion presenta la purificacion de anticuerpos, producidos en cultivo celular. En diversos aspectos, la presente invencion proporciona metodos para purificar un anticuerpo anti-Ar, a partir de una solucion que contiene el anticuerpo y una o mas variantes ultraleidas del mismo, tales como, por ejemplo, variantes de ultralectura de intrones. En aspectos destacados, los metodos de la presente invencion se utilizan para reducir los niveles de una o mas especies de variantes de ultralectura de intrones (IRT) en una preparacion de anticuerpos. Las expresiones quot;variante de ultralectura de intronesquot;, y quot;especies de variantes de ultralectura de intronesquot; se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren al producto de un proceso en el que, durante la sintesis de la proteina de union a Ar, la elongacion de la cadena polipeptidica es interrumpida antes de la transcripcion de una region codificadora por un codon de terminacion en el intron antes de la region codificadora. El resultado es una variante de la proteina de interes (es decir, una variante de ultralectura de intrones) con uno o mas dominios incompletos o faltantes. Tales intrones pueden contener mas de un codon de terminacion que da como resultado la posibilidad de producir varias variantes de ultralectura de intrones diferentes.

La expresion quot;variante con menos enlaces disulfuroquot; (o quot;UDBquot;) se refiere a cualquier especie en la que falta al menos un enlace disulfuro. El enlace disulfuro que falta puede ser un enlace disulfuro intercatenario o un enlace disulfuro intracatenario o una combinacion de los dos.

La expresion quot;especie de bajo peso molecularquot; o especie quot;LMWquot; se refiere a variantes de la proteina de union a Ar, por ejemplo, anticuerpos anti-Ar, que incluyen una especie de proteina que consiste en una cadena pesada libre, una cadena ligera libre, una especie IRT, media molecula, y tres cuartos de molecula, o mezclas de las mismas.

La Proteina A es una proteina de pared celular de aproximadamente 42 kD en la mayoria de cepas de Staphylococcus aureus que se une con alta afinidad (aproximadamente 10-8 M para la IgG humana) a la region Fc de los anticuerpos. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion quot;Proteina Aquot; abarca la Proteina A recuperada desde una fuente nativa de la misma, la Proteina A producida mediante sintesis (por ejemplo, mediante sintesis peptidica, mediante tecnicas recombinantes, etc.), y variantes de la misma que conservan la capacidad de unirse a proteinas con una region CH2/CH3.

La proteina G es una proteina de pared celular de estreptococos del grupo G. La proteina G es receptor de Fc de tipo III que se une con alta afinidad a la region Fc de los anticuerpos, en concreto, los anticuerpos IgG. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion quot;proteina Gquot; abarca la proteina G recuperada desde una fuente nativa de la misma, la Proteina G producida mediante sintesis (por ejemplo, mediante sintesis peptidica, mediante tecnicas recombinantes, etc.), y variantes de la misma que conservan la capacidad de unirse a proteinas con una region Fc.

Las expresiones quot;proteina -amiloidequot;, quot;peptido -amiloidequot;, quot;� -amiloidequot;, quot;Arquot; y quot;peptido Arquot; se utilizan indistintamente en el presente documento.

La expresion quot;proteina de union a Arquot;, tal como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a una proteina capaz de unirse especificamente al(a los) peptido(s) A o al(a los) epitopo(s) dentro de dicho(s) peptido(s) A �, o que tiene una afinidad de union apreciable por Ar. En las formas de realizacion ejemplares, la proteina de union a Ar contiene una region Fc de manera que puede unirse a un agente de union a Fc de acuerdo con los metodos de la invencion.

El termino quot;anticuerpoquot; o quot;inmunoglobulinaquot; (utilizados indistintamente en el presente documento) se refiere a una proteina de union al antigeno que tiene una estructura de cadena de cuatro polipeptidos basica que consiste en dos cadenas ligeras y dos pesadas, estando estabilizadas dichas cadenas, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro intercatenarios, que tiene la capacidad de unirse especificamente al antigeno. Las cadenas pesada y ligera estan plegadas en dominios. El termino quot;anticuerpoquot; o quot;inmunoglobulinaquot; incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos), anticuerpos quimericos, anticuerpos con injerto de CDR, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, y anticuerpos monocatenarios (scFv). La expresion quot;anticuerpo monoclonalquot; o quot;composicion de anticuerpo monoclonalquot;, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una poblacion de moleculas de anticuerpo que contienen solamente una especie de un sitio de union al antigeno capaz de reconocer y unirse a un epitopo concreto de un antigeno diana, por ejemplo, un(os) epitopo(s) de Ar. De esta manera, una composicion de anticuerpo monoclonal presenta por lo general una unica afinidad y especificidad de union por un antigeno diana concreto con el que inmununorreacciona. Los anticuerpos no humanos pueden quot;humanizarsequot; mediante las tecnicas descritas, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N° 5.225.539. En un metodo, se insertan CDR no humanas en una secuencia de consenso de la region estructural del anticuerpo o anticuerpo humano. A continuacion pueden introducirse cambios adicionales en la region estructural del anticuerpo para modular la afinidad o la inmunogenicidad.

La expresion quot;anticuerpo anti-Arquot; pretende referirse a un anticuerpo que tiene especificidad de union por un peptido Ar de la proteina precursora del amiloide humana (APP). El peptido Ar tambien se conoce en la tecnica como peptido beta amiloide. El peptido Ar es un fragmento interno de aproximadamente 4 kD de 39-43 aminoacidos de la APP (A� 39, A� 40, A� 41, Ar42 y A 43, respectivamente). La expresion quot;anticuerpo anti-Arquot; pretende abarcar los anticuerpos que tienen especificidad de union por cualquiera de estas formas de peptido Ar. Los anticuerpos anti-Ar especificos de interes incluyen, pero no se limitan a, 3D6, 10D5, 12B4, 12A11, 15C11 y 266, y las versiones humanizadas de los mismos. Se describen anticuerpos anti-Ar ejemplares en la solicitud de EE.UU. con N° de serie 10/010.942, presentada el 6 de diciembre de 2001 (publicacion de patente de EE.UU. N° 20030165496A1; vease tambien la publicacion PCT N° WO 2002/46237A2); la solicitud de EE.UU. con N° de serie 10/388.389, presentada el 12 de marzo de 2003 (publicacion de patente de EE.UU. N° 20040087777A1; vease tambien la publicacion PCT N° WO 2004/080419A2); la solicitud de EE.UU. con N° de serie 10/388.214, presentada el 12 de marzo de 2003 (publicacion de patente de EE.UU. N° 20040082762A1; vease tambien la publicacion PCT N° WO 2003/077858A2); la solicitud de EE.UU. con N° de serie 10/858.855, presentada el 01 de junio de 2004 (publicacion de patente de EE.UU. N° 20050118651A1; vease tambien la publicacion PCT N° WO 2004/108895A2); y la solicitud de EE.UU. con N° de serie 11/304.986, presentada el 15 de diciembre de 2005 (publicacion de patente de EE.UU. N° 2006165682; vease tambien el documento PCT/US05/45515);

Se describen anticuerpos anti-Ar ejemplares adicionales en la solicitud de EE.UU. con N° de serie 10/226.435, presentada el 26 de febrero de 2001 (publicacion de patente de EE.UU. N° 20040043418A1; vease tambien la publicacion PCT N° WO 01/062801A2), la solicitud de EE.UU. con N° de serie 10/487.322, presentada el 14 de agosto de 2002 (publicacion de patente de EE.UU. N° 20040192898A1; vease tambien la publicacion PCT N° WO 03/416466A2); la solicitud de EE.UU. con N° de serie 10/476.265, presentada el 26 de abril de 2002 (publicacion de patente de EE.UU. N° 20050090648A1; vease tambien la publicacion PCT N° WO 02/088306A2); la solicitud de EE.UU. con N° de serie 10/497.475, presentada el 26 de abril de 2002; (publicacion de patente de EE.UU. N° 20050142131A1; vease tambien la publicacion PCT N° WO 02/088307A2); y la solicitud de EE.UU. con N° de serie 10/505.313, presentada el 20 de febrero de 2003; (publicacion de patente de EE.UU. N° 20050169925; vease tambien la publicacion PCT N° WO 03/070760A2).

La expresion quot;fragmento de anticuerpoquot; se refiere a una parte o porcion de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos restos de aminoacidos que un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos pueden obtenerse por medio de tratamiento quimico o enzimatico de un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos tambien pueden obtenerse por medios recombinantes. Fragmentos ejemplares incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fabc y/o Fv. Se describen metodos para la construccion de fragmentos Fab, por ejemplo, en Huse, et al., (1989) Science 246:1275-1281). Pueden producirse otros fragmentos de anticuerpo mediante tecnicas conocidas en la tecnica, que incluyen, pero no se limitan a: (i) un fragmento F(ab')2 producido por la digestion con pepsina de una molecula de anticuerpo; (ii) un fragmento Fab generado mediante la reduccion de los puentes disulfuro de un fragmento F(ab')2; (iii) un fragmento Fab' generado por el tratamiento de la molecula de anticuerpo con papaina y un agente reductor, y (iv) fragmentos Fv. La expresion quot;fragmento de union al antigenoquot; se refiere a un fragmento de polipeptido de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une al antigeno o compite con el anticuerpo intacto del que proviene, por la union especifica al antigeno.

El termino quot;dominioquot; se refiere a una region globular de un polipeptido de cadena pesada o ligera que comprende bucles peptidicos (por ejemplo, que comprende de 3 a 4 bucles peptidicos) estabilizados, por ejemplo, mediante lamina plegada y/o enlace disulfuro intracatenario. Los dominios se denominan adicionalmente en el presente documento quot;constantesquot; o quot;variablesquot;, en base a la ausencia relativa de variacion de secuencia dentro de los dominios de los diversos miembros de la clase en el caso de un dominio quot;constantequot;, o la variacion significativa dentro de los dominios de los diversos miembros de la clase en el caso de un dominio quot;variablequot;. Los dominios quot;constantesquot; de la cadena ligera se denominan indistintamente quot;regiones constantes de la cadena ligeraquot;, quot;dominios constantes de la cadena ligeraquot;, regiones quot;CLquot; o dominios quot;CLquot;. Los dominios quot;constantesquot; de la cadena pesada se denominan indistintamente quot;regiones constantes de la cadena pesadaquot;, quot;dominios constantes de la cadena pesadaquot;, regiones quot;CHquot; o dominios quot;CHquot;. Los dominios quot;variablesquot; en la cadena ligera se denominan indistintamente quot;regiones variables de la cadena ligeraquot;, quot;dominios variables de la cadena ligeraquot;, regiones quot;VLquot; o dominios quot;VLquot;. Los dominios quot;variablesquot; de la cadena pesada se denominan indistintamente quot;regiones variables de la cadena pesadaquot;, quot;dominios variables de la cadena pesadaquot;, regiones quot;VHquot; o dominios quot;VHquot;.

El termino quot;regionquot; tambien puede referirse a una parte o porcion de una cadena de anticuerpo o dominio de cadena de anticuerpo (por ejemplo, una parte o porcion de una cadena pesada o ligera o una parte o porcion de un dominio constante o variable, tal como se definen en el presente documento), asi como a partes o porciones mas discretas de dichas cadenas o dominios. Por ejemplo, las cadenas ligera y pesada o los dominios variables de la cadena ligera y pesada incluyen quot;regiones determinantes de la complementariedadquot; o quot;CDRquot; intercaladas entre las quot;regiones estructuralesquot; o quot;FRquot;, tal como se definen en el presente documento.

El termino quot;conformacionquot; se refiere a la estructura terciaria de una proteina o polipeptido, tal como, por ejemplo, un anticuerpo, una cadena de anticuerpo, un dominio o una region del mismo. Por ejemplo, la expresion quot;conformacion de la cadena ligera (o pesada)quot; se refiere a la estructura terciaria de una region variable de la cadena ligera (o pesada), y la expresion quot;conformacion del anticuerpoquot; o quot;conformacion del fragmento de anticuerpoquot; se refiere a la estructura terciaria de un anticuerpo o fragmento del mismo.

La expresion quot;union especificaquot; de un anticuerpo se refiere a que el anticuerpo presenta una afinidad apreciable por un antigeno o epitopo concreto y, generalmente, no presenta reactividad cruzada significativa. En las formas de realizacion ejemplares, el anticuerpo no presenta reactividad cruzada (por ejemplo, no presenta reaccion cruzada con peptidos no Ar o con epitopos remotos o distantes en Ar). Union preferente o quot;apreciablequot; incluye la union con una afinidad de al menos 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, o 10-10 M. Resultan mas preferentes las afinidades superiores a 10-7 M, preferentemente superiores a 10-8 M. Los valores intermedios de los expuestos en el presente documento tambien pretenden estar dentro del alcance de la presente invencion y una afinidad de union preferente puede indicarse como un intervalo de afinidades, por ejemplo, de 10-6 M a 10-10 M, preferentemente de 10-7 M a 10-10 M, mas preferentemente de 10-8 M a 10-10 M. Un anticuerpo que quot;no presenta reactividad cruzada significativaquot; es uno que no se unira apreciablemente a una entidad no deseable (por ejemplo, una proteina, polipeptido, o peptido no deseable). Por ejemplo, un anticuerpo que se une especificamente a Ar se unira apreciablemente a Ar pero no reaccionara significativamente con peptidos o proteinas no Ar (por ejemplo, peptidos o proteinas no Ar incluidos en las placas). Un anticuerpo especifico para un epitopo concreto no presentara reaccion cruzada significativa, por ejemplo, con epitopos remotos o diferentes en el mismo peptido o proteina. La union especifica puede determinarse de acuerdo a cualquier medio reconocido en la tecnica para determinar tal union. Preferentemente, la union especifica se determina de acuerdo con el analisis de Scatchard y/o los ensayos de union competitiva.

Aparte de las inmunoglobulinas o anticuerpos quot;biespecificosquot; o quot;bifuncionalesquot;, se entiende que una inmunoglobulina o anticuerpo tiene cada uno de sus sitios de union identicos. Un quot;anticuerpo bifuncionalquot; o quot;biespecificoquot; es un anticuerpo hibrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/ligera diferentes y dos sitios de union diferentes. Pueden producirse anticuerpos biespecificos mediante una variedad de metodos que incluyen la fusion de hibridomas o la union de fragmentos Fab'. Vease, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al, J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

Un quot;antigenoquot; es una molecula (por ejemplo, una proteina, polipeptido, peptido, carbohidrato o molecula pequena) que contiene un determinante antigenico al que se une especificamente un anticuerpo.

El termino quot;epitopoquot; o la expresion quot;determinante antigenicoquot; se refiere a un sitio en un antigeno al que se une especificamente un anticuerpo o inmunoglobulina (o fragmento de union al antigeno de la misma). Los epitopos pueden formarse a partir de aminoacidos contiguos o aminoacidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteina. Los epitopos formados a partir de aminoacidos contiguos se conservan por lo general al ser expuestos a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epitopos formados por plegamiento terciario se pierden por lo general al ser tratados con disolventes desnaturalizantes. Un epitopo incluye por lo general al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoacidos en una conformacion espacial unica. Los metodos para determinar la conformacion espacial de los epitopos incluyen, por ejemplo, la cristalografia de rayos X y la resonancia magnetica nuclear bidimensional. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).

Ademas de los anticuerpos anti-Ar descritos anteriormente, otras proteinas de union a Ar incluyen proteinas de fusion de anticuerpo. Las expresiones quot;proteina de fusion de anticuerpoquot; y quot;fusion de anticuerpoquot; se refiere a una proteina de fusion que incluye la totalidad o una porcion de un anticuerpo fusionado a al menos un polipeptido o una porcion de proteina no-anticuerpo. La fusion se logra generalmente por ingenieria genetica del gen que codifica dicha proteina. Las proteinas de fusion de anticuerpo ejemplares adicionales incluyen la porcion de union al receptor celular de un anticuerpo (incluyendo la region Fc) fusionada a la totalidad o a una parte de otra proteina biologica celular o soluble, por ejemplo un receptor (celular o soluble) o parte del mismo, una citoquina o porcion de la misma, una enzima o porcion de la misma, etc. En concreto, una proteina de fusion de anticuerpo de la invencion puede comprender la region Fc de un anticuerpo fusionada a un polipeptido o porcion de proteina no-anticuerpo que es capaz de unirse a Ar.

La expresion quot;agente de union a Fcquot; se refiere a una molecula que es capaz de unirse a la region Fc de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo IgG) que incluye, pero no se limita a, una proteina del complemento, un receptor de Fc o una proteina proveniente de bacterias, tal como la Proteina A o la Proteina G, que tiene alta afinidad por la region Fc de un anticuerpo.

La expresion quot;region Fcquot; se refiere a una region C-terminal de un anticuerpo IgG, en concreto, la region C-terminal de la(s) cadena(s) pesada(s) de dicho anticuerpo IgG. Aunque los limites de la region Fc de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, una region Fc se define por lo general por abarcar desde aproximadamente el resto de aminoacido Cys226 al extremo carboxilo-terminal de una(s) cadena(s) pesada(s) de la IgG.

Definiciones relacionadas con la cromatografia

La expresion quot;liquido de partidaquot;, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un liquido que contiene al menos una sustancia diana que se trata de purificar a partir de otras sustancias tambien presentes. Los liquidos de partida pueden ser, por ejemplo, soluciones acuosas, sistemas de disolventes organicos, o soluciones o mezclas de disolventes acuosos/organicos. Los liquidos de partida son con frecuencia soluciones o mezclas complejas que contienen muchas moleculas biologicas (tales como proteinas, anticuerpos, hormonas y virus), moleculas pequenas (tales como sales, azucares, lipidos, etc.) e incluso material particulado. Mientras que un liquido de partida tipico de origen biologico puede comenzar como una solucion o suspension acuosa, tambien puede contener disolventes organicos utilizados en etapas de separacion anteriores tales como extracciones, precipitaciones de disolvente, y similares. Los ejemplos de liquidos de partida que pueden contener sustancias biologicas valiosas susceptibles de purificacion mediante diversas formas de realizacion de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, un sobrenadante de cultivo de un biorreactor, una suspension celular homogeneizada, plasma, fracciones de plasma, y leche.

La expresion quot;sustancia dianaquot; o quot;proteina dianaquot; o quot;anticuerpo dianaquot; se refiere en el presente documento a la una o mas proteinas de union a Ar deseadas, por ejemplo, anticuerpos anti-Ar, a purificar a partir del liquido de partida. La sustancia diana puede estar presente en el liquido de partida como una suspension o en solucion.

El termino quot;impurezasquot; se refiere a materiales en el liquido de partida que son diferentes de la(s) sustancia(s) diana y que se desea excluir del(de los) producto(s) de sustancia diana final(es). Las impurezas tipicas incluyen acidos nucleicos, proteinas (incluyendo las especies de ultralectura de intrones, las especies de bajo peso molecular y las especies con menos enlaces disulfuro), peptidos, endotoxinas, virus y moleculas pequenas.

El termino quot;subproductoquot; incluye productos no deseados, que desvirtuan, o disminuyen la proporcion de proteina terapeutica de la invencion.

La expresion quot;especies de alto peso molecularquot; se refiere a complejos de proteinas que tienen un peso molecular que es superior a la proteina deseada de la invencion. En el caso de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo IgG, tales agregados son superiores a aproximadamente 150 kD.

La expresion quot;especies de bajo peso molecularquot; se refiere a proteinas, por ejemplo, productos de degradacion, que tienen un peso molecular que es inferior a la proteina deseada de la invencion. En el caso de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo IgG, tales productos de degradacion son inferiores a aproximadamente 150 kD.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion quot;fase solidaquot; se refiere a una matriz no acuosa con la que interactua una sustancia diana durante la purificacion o a la que puede adherirse un agente de union a Fc. Los materiales de fase solida adecuados incluyen, pero no se limitan a, vidrio, silice (por ejemplo, gel de silice), polisacaridos (por ejemplo, una matriz de polisacaridos) tales como agarosa y celulosa, polimeros organicos tales como poliacrilamida, metacrilato de metilo, y copolimeros de poliestireno-divinilbenceno tales como por ejemplo la resina Amberlite™ (disponible en el mercado en Rohm y Haas Chemical Co., Philadelphia, Pa). La fase solida puede seleccionarse de entre cualquiera de los grupos de resinas comunmente descritas como resinas de afinidad, de intercambio ionico y de captura de iones. La fase solida puede ser, por ejemplo, una columna de purificacion, una fase discontinua de particulas discretas, o una combinacion de las mismas. La fase solida puede ser de caracter poroso o no poroso, y puede ser compresible o incompresible. En diversas formas de realizacion, la fase solida es una matriz polimerica o una particula o perla de agarosa. En diversas formas de realizacion, la fase solida puede estar recubierta con un reactivo (tal como glicerol), por ejemplo, para evitar la adherencia no especifica de impurezas a la fase solida. Una fase solida que se une a Fc solamente necesita poseer una quimica o un ligando asociado que permita que el agente de union a Fc se adhiera a la superficie de la fase solida. Los materiales de fase solida preferentes seran fisicamente y quimicamente resistentes a las condiciones empleadas en el proceso de purificacion que incluye bombeo y filtracion de flujo tangencial, y temperaturas, pH, y otros aspectos de los liquidos empleados.

quot;Ligando de afinidadquot; se refiere a un resto que se une selectivamente o preferencialmente a un componente del liquido de partida a traves de una interaccion especifica con un sitio de union del componente. En la presente invencion, el ligando de afinidad (por ejemplo, un agente de union a Fc) esta inmovilizado por lo general en una fase solida tal como una resina. Ejemplos de ligandos de afinidad que pueden unirse al soporte de resina para proporcionar resinas de cromatografia utiles en el proceso de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, Proteina A, Proteina, G, y sus analogos, que se unen selectivamente a una region Fc de la proteina. Los metodos para unir ligandos de afinidad a materiales de soporte solidos son bien conocidos en la tecnica de purificacion. Veanse, por ejemplo, los textos de referencia Affinity Separations: A Practical Approach (Practical Approach Series), Paul Matejtschuk (Editor), Irl Pr: 1997; y Affinity Chromatography, Herbert Schott, Marcel Dekker, Nueva York: 1997.

quot;Resina de cromatografia de afinidadquot; o quot;resina de afinidadquot; se refiere a una resina de cromatografia que comprende un sustrato o fase solida con ligandos de afinidad unidos a sus superficies.

quot;Resina de cromatografia de intercambio ionicoquot; o quot;resina de intercambio ionicoquot; se refiere a un soporte solido al que estan unidos covalentemente ligandos que llevan una carga positiva o negativa, y que por lo tanto tiene contraiones libres disponibles para el intercambio con los iones en una solucion con la que se pone en contacto la resina de intercambio ionico.

quot;Resinas de intercambio cationicoquot; se refiere a una resina de intercambio ionico con ligandos cargados negativamente unidos covalentemente, y que por lo tanto tiene cationes libres para el intercambio con los cationes en una solucion con la que se pone en contacto la resina. En la tecnica se conoce una gran variedad de resinas de intercambio cationico, por ejemplo, aquellas en las que los grupos unidos covalentemente son carboxilato o sulfonato. Las resinas de intercambio cationico disponibles en el mercado incluyen CMC-celulosa, SP-Sephadex™, y Fast S-Sepharose™ (estas dos ultimas se encuentran disponibles en el mercado en Pharmacia).

quot;Resinas de intercambio anionicoquot; se refiere a una resina de intercambio ionico con grupos cargados positivamente unidos covalentemente, tales como grupos amino cuaternarios. Las resinas de intercambio anionico disponibles en el mercado incluyen celulosa DEAE, TMAE, QAE Sephadex™ y Fast Q Sepharose™ (estas dos ultimas se encuentran disponibles en el mercado en Pharmacia).

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion quot;sal caotropicaquot; se refiere a una sal que comprende uno o mas componentes ionicos que se encuentran en las posiciones inferiores de la serie liotropica que son capaces de penetrar las capas de hidratacion de las proteinas y se unen directamente a sus superficies. Esto interrumpe la asociacion de cohidratacion, favoreciendo la solubilizacion de las proteinas. Los ejemplos de sales caotropicas incluyen, pero no se limitan a, sales de haluro de los elementos del Grupo II (por ejemplo, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, cloruro de bario, bromuro de calcio, bromuro de magnesio, bromuro de bario, yoduro de calcio, yoduro de magnesio, yoduro de bario).

Los ejemplos de sales de cationes divalentes adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de Mn2+, Ni2+

o Cu2+, Mg2+, Ca2+ y Ba2+ con tiocianato (SCN), perclorato (ClO4-), nitrato (NO3-), cloruro (Cl-), y bromuro (Br-); y combinaciones de los mismos.

En determinadas formas de realizacion, la sal de cation divalente comprende un cation divalente (por ejemplo, Mg2+, Ca2+, Ni2+ o Ba2+). Las sales caotropicas preferentes para su uso en los procesos destacados son MgCl2, CaCl2 y NiCl2. Despues de la etapa de lavado de la sal de cation divalente, la proteina diana se eluye desde la matriz de cromatografia de afinidad.

Un quot;tamponquot; es una sustancia que, gracias a su presencia en la solucion, aumenta la cantidad de acido o alcali que debe anadirse para provocar el cambio de unidad en el pH. Una solucion tamponada resiste los cambios de pH por la accion de sus componentes conjugados acido-base. Las soluciones tamponadas para su uso con reactivos biologicos son generalmente capaces de mantener una concentracion constante de iones hidrogeno de manera que el pH de la solucion se encuentre dentro de un intervalo fisiologico. La expresion quot;pH fisiologicoquot; se refiere al pH de la sangre de mamiferos (es decir, 7,38 o aproximadamente 7,4). Por lo tanto, un intervalo de pH fisiologico es de aproximadamente 7,2 a 7,6. Los componentes de tampon tradicionales incluyen, pero no se limitan a, sales organicas e inorganicas, acidos y bases. Los tampones ejemplares para su uso en la purificacion de moleculas biologicas (por ejemplo, moleculas de proteinas) incluyen los tampones zwitterionicos o de quot;Goodquot;, vease, por ejemplo, Good et al., (1966) Biochemistry 5:467 y Good e Izawa (1972) Methods Enzymol. 24:62. Los tampones ejemplares incluyen, pero no se limitan a TES, MES, PIPES, HEPES, MOPS, MOPSO, TRICINE y BICINE.

El quot;tampon de equilibradoquot; del presente documento es un tampon utilizado para preparar el reactivo de union a Fc, la fase solida, o ambos, para la carga del liquido de partida que contiene la proteina diana. El tampon de equilibrado es preferentemente isotonico y tiene comunmente un pH en el intervalo comprendido entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8. El quot;tampon de cargaquot; es un tampon utilizado para cargar el liquido de partida que contiene la proteina de union a Ar, por ejemplo, el anticuerpo anti-Ar, y las impurezas sobre la fase solida en la que esta inmovilizado el agente de union a Fc. Con frecuencia, los tampones de equilibrado y carga son el mismo. El quot;tampon de elucionquot; se utiliza para eluir la proteina de union a Ar desde el agente de union a Fc inmovilizado. Preferentemente, el tampon de elucion tiene un pH bajo y por lo tanto interrumpe las interacciones entre el agente de union a Fc y la proteina de interes. Preferentemente, el tampon de elucion de pH bajo tiene un pH en el intervalo comprendido entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5, lo mas preferentemente en el intervalo comprendido entre aproximadamente 3 y aproximadamente 4. Ejemplos de tampones que controlan el pH dentro de este intervalo incluyen tampones de glicina, fosfato, acetato, citrato y amonio, asi como combinaciones de estos. Los tampones preferentes son tampones de citrato y acetato, lo mas preferente tampones de citrato sodico o acetato sodico. Se contemplan otros tampones de elucion que incluyen tampones de pH elevado (por ejemplo, los que tienen un pH de 9 o mas) o tampones que comprenden un compuesto o composicion tal como MgCl2 (2 mM) para eluir la proteina de interes.

quot;Liquido de lavadoquot; o quot;tampon de lavadoquot; tal como se utiliza en el presente documento se refieren en el presente documento al liquido utilizado para arrastrar las impurezas desde la resina de cromatografia a la que se une la sustancia diana. Puede emplearse mas de un liquido de lavado secuencialmente, por ejemplo, con liquidos de lavado sucesivos que tienen propiedades variables tales como el pH, la conductividad, la concentracion de disolvente, etc., disenados para disociar y eliminar diversos tipos de impurezas que se asocian de manera no especifica con la resina de cromatografia.

quot;Liquido de elucionquot; o quot;tampon de elucionquot; se refiere en el presente documento al liquido que se utiliza para disociar la sustancia diana desde la resina de cromatografia despues de haber sido lavada con uno o mas liquidos de lavado. El liquido de elucion actua para disociar la sustancia diana sin desnaturalizarla de modo irreversible. Los liquidos de elucion tipicos son bien conocidos en la tecnica de la cromatografia y puede tener concentraciones de sales mas altas, analogos o ligandos libres de afinidad libres, u otras sustancias que promueven la disociacion de la sustancia diana desde la resina de cromatografia. quot;Condiciones de elucionquot; se refiere a las condiciones del proceso impuestas a la resina de cromatografia unida a la sustancia diana que disocian la sustancia diana desde la resina de cromatografia, tal como poner en contacto la resina de cromatografia unida a la sustancia diana con un liquido de elucion o tampon de elucion para producir tal disociacion.

quot;Liquido de limpiezaquot; o quot;tampon de limpiezaquot; se refiere en el presente documento al liquido que se utiliza para lavar la resina de cromatografia despues de la finalizacion del proceso de purificacion. El liquido de limpieza puede contener un detergente, un agente de inactivacion de virus, o concentraciones relativamente altas de sales, y puede tener un pH superior o inferior al de los liquidos utilizados durante el proceso de purificacion. Su fin es descontaminar la resina de cromatografia para que quede lista para su reutilizacion. Los liquidos de limpieza tipicos son bien conocidos en la tecnica de la cromatografia.

quot;Liquido de almacenamientoquot; o quot;tampon de almacenamientoquot; se refiere en el presente documento al liquido en el que se suspende la resina de cromatografia entre usos. Los liquidos de almacenamiento, ademas de los iones de tamponamiento, tambien pueden contener microbicidas u otros conservantes. Tales liquidos de almacenamiento son bien conocidos en la tecnica de la cromatografia.

En diversos aspectos, la presente invencion presenta metodos para purificar anticuerpos anti-Ar, desde un liquido de partida que comprende la proteina y una o mas impurezas adsorbiendo la proteina a un agente de union a Fc, seguido del lavado del agente de union a Fc con una solucion tampon que contiene CaCl2 0,5 M a 3 M para eliminar una o mas impurezas, y recuperar posteriormente la proteina desde el agente de union a Fc. Los agentes de union a Fc son la Proteina A y la proteina G.

La presente invencion presenta procesos para la purificacion de anticuerpos anti-Ar. Los procesos de purificacion ejemplares incluyen una etapa de cromatografia de afinidad. La etapa de cromatografia de afinidad puede ser continua, discontinua, o una combinacion de ambas. Por ejemplo, la etapa de cromatografia de afinidad puede realizarse como un proceso discontinuo, tal como, por ejemplo, un proceso por lotes. La cromatografia de afinidad es el proceso de adsorcion bioselectiva y posterior recuperacion de un compuesto diana desde un ligando inmovilizado. Este proceso permite la purificacion altamente especifica y eficaz del compuesto diana. El proceso requiere la utilizacion de un ligando adecuadamente selectivo (por ejemplo, un agente de union a Fc) que se una al compuesto diana (por ejemplo, un anticuerpo anti-Ar) generalmente con una constante de disociacion en el intervalo comprendido entre 10-4 a 10-8, al tiempo que permita la recuperacion en condiciones moderadas. El ligando esta inmovilizado generalmente sobre una matriz porosa de perlas que puede estar en forma de medio de adsorcion discontinuo o relleno de columna.

Un agente de union preferente es la Proteina A. La Proteina A se une a la region Fc de las inmunoglobulinas. La Proteina A consiste en seis regiones, cinco de las cuales se unen a la IgG. Se une con alta afinidad a las IgG1, IgG2 e IgG4 humanas, asi como a las IgG2a, IgG2b e IgG3 de raton. La Proteina A se une con afinidad moderada a las IgD, IgM, IgA e IgE humanas, asi como a la IgG1 de raton. Como ligando de afinidad, la Proteina A esta inmovilizada en una matriz de manera que estas regiones sean libres para unirse. Una molecula de Proteina A inmovilizada puede unirse a por lo menos dos moleculas de IgG. Las versiones nativa y recombinante de la Proteina A comparten una especificidad similar por la region Fc de la IgG. La Proteina A recombinante (rProteina A) puede modificarse por ingenieria genetica para que incluya, por ejemplo, una cisteina C-terminal, y puede inmovilizarse por medio de acoplamiento tioester a una matriz en fase solida. Tal acoplamiento da como resultado una mayor capacidad de union de la Proteina A.

Un agente de union alternativo es la Proteina G. La Proteina G es especifica para la IgG, uniendose con alta afinidad por las IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas, asi como las IgG1 e IgG3 de raton. La Proteina G PLUS tiene una afinidad moderada por la IgG4 humana y las IgG2a, IgG2b e IgG3 de raton. La proteina G recombinante (rProteina G) puede modificarse por ingenieria genetica para suprimir la region de union a la albumina de la proteina nativa. La Proteina G recombinante contiene dos regiones de union de Fc.

Un agente de union alternativo es la Proteina A/G. La Proteina A/G es una proteina obtenida por ingenieria genetica que combina los perfiles de union a la IgG de la Proteina A y de la proteina G. Se trata de un producto de fusion genica secretado por una forma no patogena de Bacillus. La Proteina A/G contiene cuatro dominios de union a Fc de la Proteina A y dos de la Proteina G. La Proteina A/G no es tan dependiente del pH como la Proteina A, pero por lo demas tiene las propiedades aditivas de la Proteina A y G.

La Proteina A/G se une a todas las subclases de IgG humana, especialmente adecuadas para la purificacion de anticuerpos IgG policlonales o monoclonales cuyas subclases no han sido determinadas. Ademas, se une a la IgA, IgE, IgM, y (en menor medida) a la IgD. La Proteina A/G tambien se une bien a todas las subclases de IgG de raton, especialmente adecuadas para la purificacion de anticuerpos monoclonales de raton de las subclases de IgG, sin interferencia por parte de las IgA, IgM y la albumina de suero de raton. (Vease, por ejemplo, Sikkema (1989) Amer. Biotech. Lab 7, 42). Las subclases individuales de anticuerpos monoclonales de raton pueden tener mayor afinidad por la Proteina A/G quimerica que por la Proteina A o que por la Proteina G. (Vease, por ejemplo, Eliasson et al., (1988) J. Biol. Chem. 263, 4323-4327.)

En la presente invencion, el agente de union a Fc inmovilizado (por ejemplo, la Proteina A) se lava con una solucion de CaCl2 para eliminar las impurezas. En concreto, se ha descubierto que las impurezas no deseables producidas como resultado de las tecnologias de expresion de anticuerpos recombinantes pueden eliminarse mediante una etapa de lavado con CaCl2.

Los metodos de la presente invencion pueden incluir opcionalmente etapas de purificacion posteriores a la cromatografia de afinidad y la etapa de lavado con CaCl2. Las etapas de purificacion posteriores pueden incluir una etapa de cromatografia de intercambio ionico y/o una etapa de cromatografia de interaccion hidrofoba (HIC). Las etapas de cromatografia posteriores pueden ser continuas, discontinuas (por ejemplo, tal como un proceso por lotes), o una combinacion de ambas. La cromatografia de intercambio ionico separa las moleculas en base a las diferencias entre la carga global de las proteinas. La proteina diana debe tener una carga opuesta a la del grupo funcional unido a la resina a fin de unirse. Por ejemplo, los anticuerpos, que generalmente tienen una carga global positiva, se unen bien a los intercambiadores de cationes, que contienen grupos funcionales cargados negativamente. Debido a que esta interaccion es ionica, la union debe tener lugar en condiciones de baja concentracion ionica. La elucion se consigue aumentando la fuerza ionica para romper la interaccion ionica, o cambiando el pH de la proteina. Mientras que la cromatografia de intercambio ionico se basa en las cargas de proteinas para aislarlas, la cromatografia de interaccion hidrofoba utilizan las propiedades hidrofobas de algunas proteinas. Los grupos hidrofobos de la proteina se unen a grupos hidrofilos de la columna. Cuanto mas hidrofoba sea una proteina, con mas fuerza se unira a la columna. La etapa de HIC elimina, por ejemplo, las impurezas provenientes de la celula hospedadora (por ejemplo, ADN y otras especies relacionadas con productos de alto y bajo peso molecular). Las etapas de purificacion adicionales pueden incluir etapas de eliminacion de virus asi como etapas de ultrafiltracion y/o diafiltracion, como se describe en el presente documento.

La proteina que contiene la region Fc es un anticuerpo o una proteina de fusion de anticuerpo que tiene una region Fc que se une a un receptor de Fc del agente de union a Fc. El uso de la solucion tampon que contiene un CaCl2 para lavar el agente de union a Fc permite una mayor eliminacion de impurezas, tales como, por ejemplo, las variantes de ultralectura y fragmentos que contienen la region constante (incluyendo las especies LMW y UDB), de la proteina de interes (por ejemplo, la sustancia diana en el liquido de partida).

Los metodos de la presente invencion comprenden una o mas etapas de separacion cromatografica y ademas pueden comprender una o mas etapas de filtracion para separar un anticuerpo que se une a Ar (la quot;proteina dianaquot;) de las impurezas en un liquido de partida.

Por ejemplo, el liquido de partida puede filtrarse, centrifugarse o procesarse de otro modo para eliminar los restos de particulas y similares antes de poner el contacto el liquido de partida con el agente de union a Fc. Por ejemplo, mediante tecnicas recombinantes, las proteinas pueden producirse intracelularmente, en el espacio periplasmico, o secretarse directamente al medio de cultivo. Si la proteina se produce intracelularmente, los restos de particulas, sean celulas hospedadoras o fragmentos lisados, pueden eliminarse, por ejemplo, por centrifugacion o ultrafiltracion. Cuando la proteina se secreta al medio, las celulas hospedadoras recombinantes pueden separarse del medio de cultivo celular, por ejemplo, por filtracion de flujo tangencial.

En diversas formas de realizacion, el liquido de partida que contiene la proteina diana se pone en contacto con un agente de union a Fc (preferentemente inmovilizado sobre una fase solida y equilibrado con un tampon adecuado) de manera que la proteina diana se adsorba al agente de union a Fc (por ejemplo, un agente de union a Fc inmovilizado). El liquido de partida se pone en contacto con el agente de union a Fc (por ejemplo, un agente de union a Fc inmovilizado) en un tampon de carga que puede ser el mismo que el tampon de equilibrado. A medida que el liquido de partida que contiene las impurezas fluye a traves de la fase solida, la proteina diana se adsorbe al agente de union a Fc y las diversas otras impurezas (tales como proteinas de la celula hospedadora, cuando la proteina diana se produce en una celula hospedadora recombinante, u otras impurezas provenientes del proceso) fluyen a traves de o se unen inespecificamente a la fase solida. En diversas formas de realizacion, el agente de union a Fc es la Proteina A, y el tampon de equilibrado puede ser Tris 20 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,5. Otros tampones de equilibrado adecuados incluyen, por ejemplo, BIS, HEPES, etc., a concentraciones fisiologicas, por ejemplo, una concentracion en el intervalo comprendido entre aproximadamente 0,5 mM y aproximadamente 100 mM (por ejemplo, 10 mM, 20 mM, 50 mM, etc.), y concentraciones salinas fisiologicas (por ejemplo, aproximadamente NaCl 0,15 mM), y a un pH de 5,0-9,0.

La fase solida es, preferentemente, una particula o perla de agarosa (por ejemplo, Sepharose) para inmovilizar el agente de union a Fc. En diversas formas de realizacion, la columna se recubre con un reactivo, tal como glicerol, para disminuir o evitar la adherencia no especifica a la columna. En diversas formas de realizacion, el agente de union a Fc es la Proteina A. La columna rmp Protein A Sepharose™ Fast Flow (FF), disponible en el mercado en Amersham Biosciences, es un ejemplo de columna de Proteina A adecuada para su uso en las metodologias presentadas.

A continuacion se lava el agente de union a Fc con una solucion de lavado tamponada que contiene CaCl2 para eliminar las especies de variantes de proteinas unidas a la fase solida o al agente de union a Fc. En concreto, se ha descubierto que el uso de la etapa de lavado con CaCl2 puede eliminar una cantidad significativa de impurezas no deseables. Concretamente, se ha descubierto que las variantes de ultralectura de intrones, las variantes de bajo peso molecular y las variantes con menos enlaces disulfuro de un anticuerpo anti-Ar pueden eliminarse mediante un lavado con CaCl2. Ademas, el ADN y las proteinas de la celula hospedadora (HCP) tambien pueden eliminarse mediante el lavado con CaCl2.

En diversas formas de realizacion, para eliminar las impurezas se utilizan soluciones de lavado ademas de la solucion de lavado que contiene CaCl2. Por ejemplo, en diversas formas de realizacion se utiliza una solucion de Tris 20 mM a 50 mM, NaCl 0,75 M a 2,0 M, pH 5,0-9,0, y/o una solucion de Tris 10 mM, pH 7,5 para lavar el agente de union a Fc antes de, despues de, o antes y despues de lavar el agente de union a Fc con la solucion de lavado que contiene la sal de cation divalente.

En diversas formas de realizacion, el CaCl2 se anade preferentemente a una concentracion entre aproximadamente 0,5 M y aproximadamente 2,5 M a una solucion tamponada con un pH en el intervalo comprendido entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9, y preferentemente un pH en el intervalo comprendido entre aproximadamente 7 y aproximadamente 8. Las concentraciones preferentes del CaCl2 incluyen, pero no se limitan a, 0,6 M, 2,0 M y 2,5 M. Los tampones adecuados para este fin incluyen, pero no se limitan a, tampones de acetato o Tris a una concentracion de 20 mM a 50 mM.

Despues de la(s) etapa(s) de lavado, se recupera la proteina diana desde el agente de union a Fc. Esto se consigue normalmente utilizando un tampon de elucion adecuado. La proteina diana se eluye desde la columna utilizando un tampon de elucion con un pH bajo, por ejemplo, en el intervalo comprendido entre aproximadamente 2 y aproximadamente 4, y preferentemente en el intervalo comprendido entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 3,5.

En diversas formas de realizacion, la proteina diana asi recuperada puede formularse en un vehiculo farmaceuticamente aceptable y utilizarse para diversos usos diagnosticos, terapeuticos u otros usos conocidos para tales moleculas.

En diversas formas de realizacion, la preparacion de la proteina diana eluida puede someterse a etapas de purificacion adicionales despues de la etapa de cromatografia del agente de union a Fc. Por ejemplo, las etapas de purificacion adicionales ejemplares incluyen, pero no se limitan a: cromatografia de intercambio anionico, cromatografia de intercambio cationico, cromatografia de interaccion hidrofoba (HIC), cromatografia con hidroxiapatita, dialisis, cromatografia de afinidad (incluyendo la cromatografia de afinidad por iones metalicos inmovilizados), cromatografia de exclusion por tamano (SEC), precipitacion con sulfato de amonio, precipitacion con etanol, HPLC de fase inversa (RP-HPLC), cromatofocalizacion, ultrafiltracion, diafiltracion y filtracion en gel. En diversas formas de realizacion, la etapa de cromatografia del agente de union a Fc va seguida de una etapa de cromatografia de intercambio anionico y de HIC. En diversas formas de realizacion, las etapas de cromatografia van seguidas adicionalmente de una etapa de filtracion de virus, una etapa de ultrafiltracion/diafiltracion, y una etapa de filtracion de contaminantes microbianos. En diversas formas de realizacion, estas etapas de purificacion adicionales pueden llevarse a cabo antes de la etapa de cromatografia del agente de union a Fc.

En diversas formas de realizacion, los metodos para purificar un anticuerpo anti-Ar, comienzan con la adsorcion de la proteina diana a un agente de union a Fc que comprende la Proteina A inmovilizada sobre una fase solida, seguido del lavado del agente de union a Fc con una solucion tampon que contiene CaCl2 para eliminar una o mas impurezas, y la posterior recuperacion de la proteina a partir de la Proteina A para producir una primera combinacion de eluyentes.

En diversas formas de realizacion, el proceso de purificacion continua sometiendo la primera combinacion de eluyentes a cromatografia de intercambio anionico poniendo en contacto una resina de intercambio anionico con la primera combinacion de eluyentes de manera que las impurezas se adsorban a la resina, mientras que la proteina diana no se adsorbe a la resina. Por lo tanto, puede recuperarse la proteina diana desde el flujo continuo para producir una segunda combinacion de eluyentes. En diversas formas de realizacion, la etapa de cromatografia de intercambio anionico comprende adicionalmente el lavado de la resina de intercambio anionico con una solucion de lavado tamponada para recuperar al menos una porcion de la proteina diana adsorbida, que a continuacion se combina con la segunda combinacion de eluyentes. Como alternativa, puede ponerse en contacto la primera combinacion de eluyentes con la resina de intercambio anionico de tal forma que el anticuerpo se adsorba; permitiendo el flujo continuo de cualquier impureza, opcionalmente seguido de lavado y elucion del anticuerpo adsorbido.

En diversas formas de realizacion, el proceso de purificacion continua sometiendo la segunda combinacion de eluyentes a HIC adsorbiendo la proteina diana a una resina de interaccion hidrofoba (por ejemplo, una fase solida funcionalizada con ligandos hidrofobos), lavando la resina de interaccion hidrofoba con una solucion de lavado tamponada con una fuerza ionica que practicamente no eluya la proteina diana, y recuperando la proteina diana (por lo general utilizando un tampon de elucion con una fuerza ionica lo suficientemente baja para desorber la proteina diana desde la resina de interaccion hidrofoba) en una tercera combinacion de eluyentes. Como alternativa, puede ponerse en contacto la segunda combinacion de eluyentes con la columna de HIC de tal manera que la proteina diana no se adsorba, recuperando la proteina diana del flujo continuo como una tercera combinacion de eluyentes.

En diversas formas de realizacion, el proceso de purificacion incluye una o mas etapas de filtracion, por ejemplo, para eliminar los virus, concentrar y tamponar la solucion que contiene la proteina diana, y para eliminar los contaminantes microbianos.

En diversas formas de realizacion, la presente invencion proporciona metodos para purificar un anticuerpo anti-Ar, desde un liquido de partida que comprende la proteina y una o mas impurezas en el que las impurezas comprenden una o mas variantes IRT. En una forma de realizacion, los metodos proporcionan aproximadamente una reduccion de los niveles de variantes IRT de 2 a aproximadamente 20 veces los del liquido de partida. Preferentemente, los niveles de variantes IRT se reducen al menos 5 veces y mas preferentemente los niveles de variantes IRT se reducen al menos 10 veces. Por ejemplo, en un liquido de partida (muestra de partida) tiene aproximadamente un 3%-5% de variantes de anticuerpos IRT (como porcentaje del total de especies en el liquido de partida) las especies de variantes de anticuerpos IRT pueden reducirse a entre aproximadamente un 0,3% y aproximadamente un 0,5%. En diversas formas de realizacion, las especies de variantes IRT se reducen a: menos de un 1%, menos de un 0,8%, menos de un 0,5%, menos de un 0,3%, menos de un 0,2%, y/o menos de un 0,1%. Preferentemente, en la purificacion de un liquido de partida para la preparacion de una proteina, las variantes IRT se reducen a: menos de un 1%, menos de un 0,8%, menos de un 0,5%, menos de un 0,3%, menos de un 0,2%, y/o menos de un 0,1% como porcentaje del total de especies en el liquido de partida.

En diversas formas de realizacion, la presente invencion proporciona metodos para purificar un anticuerpo anti-Ar, desde un liquido de partida que comprende la proteina y una o mas impurezas en el que las impurezas comprenden una o mas variantes LMW. En una forma de realizacion, los metodos proporcionan aproximadamente una reduccion de los niveles de variantes LMW de 2 a aproximadamente 20 veces los del liquido de partida. Preferentemente, los niveles de variantes LMW se reduce al menos 5 veces y mas preferentemente los niveles de variantes LMW se reducen al menos 10 veces. Por ejemplo, en un liquido de partida (muestra de partida) que tiene aproximadamente un 3%-5% de variantes de anticuerpos LMW (como porcentaje del total de especies en el liquido de partida) las especies de variantes de anticuerpos LMW pueden reducirse a entre aproximadamente un 0,3% y aproximadamente un 0,5%. En diversas formas de realizacion, las especies de variantes LMW se reducen a: menos de un 1%, menos de un 0,8%, menos de un 0,5%, menos de un 0,3%, menos de un 0,2%, y/o menos de un 0,1%. Preferentemente, en la purificacion de un liquido de partida para la preparacion de una proteina, las variantes LMW se reducen a: menos de un 1%, menos de un 0,8%, menos de un 0,5%, menos de un 0,3%, menos de un 0,2%, y/o menos de un 0,1% como porcentaje del total de especies en el liquido de partida.

En diversas formas de realizacion, la presente invencion proporciona metodos para purificar un anticuerpo anti-Ar, desde un liquido de partida que comprende la proteina y una o mas impurezas en el que las impurezas comprenden una o mas variantes UDB. En una forma de realizacion, los metodos proporcionan una reduccion de los niveles de variantes UDB de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 veces los del liquido de partida. Preferentemente, los niveles de variantes UDB se reduce al menos 5 veces, y mas preferentemente los niveles de variantes UDB se reduce al menos 10 veces.

Por ejemplo, en un liquido de partida (muestra de partida) que tiene aproximadamente un 20% de variantes de anticuerpos UDB (como porcentaje del total de especies en el liquido de partida) las especies de variantes de anticuerpos UDB pueden reducirse a entre aproximadamente un 10% y aproximadamente un 2%. En diversas formas de realizacion, las especies de variantes UDB se reducen a: menos de un 20%, menos de un 15%, menos de un 10%, menos de un 5%, menos de un 2%, o menos de un 1%. Preferentemente, en la purificacion de un liquido de partida para la preparacion de una proteina, las variantes UDB se reducen a: menos de un 20%, menos de un 15%, menos de un 10%, menos de un 5%, menos de un 2%, o menos de un 1% como porcentaje del total de especies en el liquido de partida.

Ademas, por ejemplo, en un liquido de partida (muestra de partida) que tiene aproximadamente un 3%-5% de variantes de anticuerpos UDB (como porcentaje del total de especies en el liquido de partida) las especies de variantes de anticuerpos UDB pueden reducirse a entre aproximadamente un 0,3% y aproximadamente un 0,5 %. En diversas formas de realizacion, las especies de variantes UDB se reducen a: menos de un 1%, menos de un 0,8%, menos de un 0,5%, menos de un 0,3%, menos de un 0,2%, y/o menos de un 0,1%. Preferentemente, en la purificacion de un liquido de partida para la preparacion de una proteina, las variantes UDB se reducen a: menos de un 1%, menos de un 0,8%, menos de un 0,5%, menos de un 0,3%, menos de un 0,2%, y/o menos de un 0,1% como porcentaje del total de especies en el liquido de partida.

Protefnas de union a Af para su uso en los metodos de purificacion de la invencion

Las proteinas de union a Ar, por ejemplo, los anticuerpos anti-Ar, a purificar de acuerdo con la invencion como se describe en el presente documento, pueden prepararse mediante tecnicas que estan bien establecidas en la tecnica e incluyen, por ejemplo, tecnicas de sintesis (tales como tecnicas recombinantes y la sintesis peptidica o una combinacion de estas tecnicas), o pueden aislarse a partir de una fuente endogena de la proteina. En diversas formas de realizacion, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, una preparacion de anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. Las tecnicas para la produccion de anticuerpos se describen mas adelante. En otras formas de realizacion, la proteina de union a Ar puede ser una proteina de fusion de anticuerpo que comprende una region Fc de anticuerpo fusionada a una porcion de una proteina o polipeptido que es capaz de unirse a Ar. La preparacion de proteinas de fusion de anticuerpo tambien se describe mas adelante.

Anticuerpos policlonales

Pueden prepararse anticuerpos policlonales inmunizando a un sujeto adecuado con un inmunogeno. El titulo de anticuerpos en el sujeto inmunizado puede supervisarse a lo largo del tiempo mediante tecnicas convencionales, tales como con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) mediante un antigeno diana inmovilizado. Si se desea, las moleculas de anticuerpo dirigidas contra el antigeno diana pueden aislarse del mamifero (por ejemplo, de la sangre) y purificarse adicionalmente mediante tecnicas bien conocidas, tales como la cromatografia con Proteina A-Sepharose para obtener el anticuerpo, por ejemplo, IgG, fraccion. En un momento apropiado despues de la inmunizacion, por ejemplo, cuando los titulos de anticuerpo anti-antigeno son mas altos, pueden obtenerse del sujeto las celulas productoras de anticuerpos y utilizarse para preparar anticuerpos monoclonales mediante tecnicas convencionales, tales como la tecnica del hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497) (veanse tambien, Brown et al., (1981.) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al., (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al., (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 76:2927-31; y Yeh et al., (1982) Int. J. Cancer 29:269-75). Para la preparacion de anticuerpos policlonales quimericos, vease Buechler et al., patente de EE.UU. N° 6.420.113.

Anticuerpos monoclonales

Puede aplicarse cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos utilizados para fusionar linfocitos y lineas celulares inmortalizadas con el fin de generar un anticuerpo monoclonal (vease, por ejemplo, G. Galfre et al., (1977) Nature 266:55052; Gefter et al., Somatic Cell Genet, citado supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., citado supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citado supra). Ademas, el experto en la materia entendera que existen muchas variaciones de tales metodos que tambien resultarian utiles. Por lo general, la linea celular inmortal (por ejemplo, una linea celular de mieloma) deriva de la misma especie de mamifero que los linfocitos. Por ejemplo, pueden crearse hibridomas murinos fusionando linfocitos de un raton inmunizado con una preparacion inmunogena de la presente invencion con una linea celular de raton inmortalizada. Las lineas celulares inmortales preferentes son lineas celulares de mieloma de raton que son sensibles al medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina (quot;medio HATquot;). Puede utilizarse cualquiera de una serie de lineas celulares de mieloma como pareja de fusion de acuerdo con las tecnicas convencionales, por ejemplo, las lineas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas lineas de mieloma estan disponibles en la ATCC. Por lo general, las celulas de mieloma de raton sensibles a HAT se fusionan a esplenocitos de raton mediante polietilenglicol (quot;PEGquot;). A continuacion, las celulas de hibridoma resultantes de la fusion se seleccionan utilizando medio HAT, que mata las celulas de mieloma no fusionadas y fusionadas infructuosamente (los esplenocitos no fusionados mueren despues de varios dias porque no se transforman). Las celulas de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invencion se detectan cribando los sobrenadantes del cultivo de hibridoma para los anticuerpos que se unen a un antigeno diana mediante un ensayo ELISA convencional.

Anticuerpos recombinantes

Como alternativa a la preparacion de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, puede identificarse y aislarse un anticuerpo monoclonal cribando una biblioteca de inmunoglobulinas combinatoria recombinante (por ejemplo, una biblioteca de presentacion de anticuerpos en fagos) con un antigeno diana para aislar de ese modo los miembros de la biblioteca de inmunoglobulinas que se unen al antigeno diana. Los kits para la generacion y el cribado de bibliotecas de presentacion en fagos estan disponibles en el mercado (por ejemplo, el

Recombinant Phage Antibody System de Pharmacia, catalogo N° 27-9400-01; y el SurffAPT Phage Display Kit de Stratagene, catalogo N° 240612). Ademas, pueden encontrarse ejemplos de metodos y reactivos especialmente adecuados para su uso en la generacion y el cribado de una biblioteca de presentacion de anticuerpos, por ejemplo en Ladner et al., patente de EE.UU. N° 5.223.409; Kang et al., publicacion internacional PCT N° WO92/18619; Dower et al., publicacion internacional PCT N° WO 91/17271; Winter et al., publicacion internacional PCT WO 92/20791; Markland et al., publicacion internacional PCT N° WO 92/15679; Breitling et al., publicacion internacional PCT WO 93/01288; McCafferty et al., publicacion internacional PCT N° WO 92/01047; Garrard et al., publicacion internacional PCT N°WO 92/09690; Ladner et al., publicacion internacional PCT N° WO 90/02809; Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al., (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al., (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al., (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al., (1991) Nature 352:624-628; Gram et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:3576-3580; Garrad et al., (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al., (1991) Nuc. Acid. Res. 19:4133-4137; Barbas et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88:7978-7982; y McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554.

Anticuerpos quimericos y humanizados

Ademas, los anticuerpos recombinantes, tales como los anticuerpos monoclonales quimericos y humanizados, que comprenden porciones humanas y no humanas, que pueden crearse mediante tecnicas convencionales de ADN recombinante, se encuentran dentro del alcance de la invencion.

La expresion quot;inmunoglobulina humanizadaquot; o quot;anticuerpo humanizadoquot; se refiere a una inmunoglobulina o a un anticuerpo que incluye al menos una cadena de anticuerpo o inmunoglobulina humanizada (es decir, al menos una cadena ligera o pesada humanizada). La expresion quot;cadena de inmunoglobulina humanizadaquot; o quot;cadena de anticuerpo humanizadoquot; (es decir, una quot;cadena ligera de inmunoglobulina humanizadaquot; o quot;cadena pesada de inmunoglobulina humanizadaquot;) se refiere a una cadena de anticuerpo o inmunoglobulina (es decir, una cadena ligera

o pesada, respectivamente) que tiene una region variable que incluye una region estructural variable sustancialmente de un anticuerpo o inmunoglobulina humana y regiones determinantes de la complementariedad (CDR) (por ejemplo, al menos una CDR, preferentemente dos CDR, mas preferentemente tres CDR) sustancialmente de un anticuerpo o inmunoglobulina no humana, e incluye adicionalmente regiones constantes (por ejemplo, al menos una region constante o parte de la misma, en el caso de una cadena ligera, y tres regiones constantes en el caso de una cadena pesada). La expresion quot;region variable humanizadaquot; (por ejemplo, quot;region variable de la cadena ligera humanizadaquot; o quot;region variable de la cadena pesada humanizadaquot;) se refiere a una region variable que incluye una region estructural variable sustancialmente de un anticuerpo o inmunoglobulina humana y regiones determinantes de la complementariedad (CDR) sustancialmente de un anticuerpo o inmunoglobulina no humana.

La expresion quot;sustancialmente de un anticuerpo o inmunoglobulina humanaquot; o quot;sustancialmente humano/aquot; se refiere a que cuando se alinean con una secuencia de aminoacidos de anticuerpo o inmunoglobulina humana para fines de comparacion, la region comparte al menos un 80%-90%, un 90%-95%, o un 95%-99% de identidad (es decir, identidad de secuencia local) con la secuencia de la region constante o region estructural humana, permitiendo, por ejemplo, para sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencia de consenso, sustituciones de linea germinal, retromutaciones, y similares. La introduccion de sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencia de consenso, sustituciones de linea germinal, retromutaciones, y similares, se denomina con frecuencia quot;optimizacionquot; de una cadena o anticuerpo humanizado. La expresion quot;sustancialmente de un anticuerpo o inmunoglobulina no humanaquot; o quot;sustancialmente no humano/aquot; se refiere a que tiene una secuencia de anticuerpo o inmunoglobulina identica en al menos un 80%-95%, preferentemente en al menos un 90%-95%, mas preferentemente un 96%, 97%, 98%, o 99% a la de un organismo no humano, por ejemplo, un mamifero no humano.

Por consiguiente, todas las regiones o restos de un anticuerpo o inmunoglobulina humanizada, o de una cadena de anticuerpo o inmunoglobulina humanizada, salvo las CDR, son sustancialmente identicas a las correspondientes regiones o restos de una o mas secuencias de inmunoglobulina humana nativa. La expresion quot;region correspondientequot; o quot;resto correspondientequot; se refiere a una region o resto en un segundo aminoacido o secuencia de nucleotidos que ocupa la misma posicion (es decir, equivalente) que una region o resto en un primer aminoacido o secuencia de nucleotidos, cuando las secuencias primera y segunda se alinean de manera optima para fines de comparacion.

La expresion quot;identidad significativaquot; se refiere a que dos secuencias de polipeptidos, cuando se alinean de manera optima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando pesos de hueco por defecto, comparten al menos un 50%-60% de identidad de secuencia, preferentemente al menos un 60%-70% de identidad de secuencia, mas preferentemente al menos un 80%-90% de identidad de secuencia, incluso mas preferentemente al menos un 90%-95% de identidad de secuencia, y aun mas preferentemente al menos un 95% de identidad de secuencia o mas (por ejemplo, un 99% de identidad de secuencia o mas). La expresion quot;identidad sustancialquot; se refiere a que dos secuencias de polipeptidos, cuando se alinean de manera optima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando pesos de hueco por defecto, comparten al menos un 80%-90% de identidad de secuencia, preferentemente al menos un 90%-95% de identidad de secuencia, y mas preferentemente al menos un 95% de identidad de secuencia o mas (por ejemplo, un 99% de identidad de secuencia o mas). Para la comparacion de secuencias, por lo general una secuencia actua como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparacion de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se indican las coordenadas de subsecuencia, en caso necesario, y se indican los parametros del programa de algoritmo de secuencia. A continuacion, el algoritmo de comparacion de secuencia calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, en base a los parametros del programa indicados.

La alineacion optima de secuencias para la comparacion puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homologia local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homologia de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el metodo de busqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspeccion visual (vease en general Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology). Un ejemplo de algoritmo que resulta adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). El software para realizar los analisis BLAST esta a disposicion del publico a traves del Centro Nacional de Informacion sobre Biotecnologia (accesible al publico a traves del servidor de internet del NCBI de los Institutos Nacionales de la Salud). Por lo general, pueden utilizarse los parametros del programa por defecto para realizar la comparacion de secuencias, aunque tambien pueden utilizarse parametros personalizados. Para las secuencias de aminoacidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:10915 (1989)).

Preferentemente, las posiciones de resto que no son identicas difieren por sustituciones conservadoras de aminoacidos. Para fines de clasificacion de las sustituciones de aminoacidos como conservadoras o no conservadoras, los aminoacidos se agrupan de la siguiente manera: Grupo I (cadenas laterales hidrofobas): leu, met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrofilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales acidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales basicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (restos que influyen en la orientacion de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromaticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadoras implican sustituciones entre aminoacidos de la misma clase. Las sustituciones no conservadoras constituyen el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra.

Preferentemente, los anticuerpos o inmunoglobulinas humanizadas se unen al antigeno con una afinidad que esta dentro de un factor de tres, cuatro, o cinco de aquel del anticuerpo no humanizado correspondiente. Por ejemplo, si el anticuerpo no humanizado tiene una afinidad de union de 10-9 M, los anticuerpos humanizados tendran una afinidad de union de al menos 3 x 10-8 M, 4 x 10-8 M, 5 x 10-8 M, o 10-9 M. Se dice que una cadena de inmunoglobulina quot;dirige la union al antigenoquot; cuando confiere a un anticuerpo o inmunoglobulina intacta (o fragmento de union al antigeno de la misma) una afinidad de union o propiedad de union especifica. Se dice que una mutacion (por ejemplo, una retromutacion) influye sustancialmente en la capacidad de una cadena pesada o ligera para dirigir la union al antigeno si afecta (por ejemplo, disminuye) la afinidad de union de un anticuerpo o inmunoglobulina intacta (o fragmento de union al antigeno de la misma) que comprende dicha cadena en al menos un orden de magnitud en comparacion con la del anticuerpo (o fragmento de union al antigeno del mismo) que comprende una cadena equivalente que carece de dicha mutacion. Una mutacion quot;no influye sustancialmente en (por ejemplo, disminuye) la capacidad de una cadena para dirigir la union al antigenoquot; si influye en (por ejemplo, disminuye) la afinidad de union de anticuerpo o inmunoglobulina intacta (o fragmento de union al antigeno de la misma) que comprende dicha cadena en solamente un factor de dos, tres, o cuatro de la del anticuerpo (o fragmento de union al antigeno del mismo) que comprende una cadena equivalente que carece de dicha mutacion.

La expresion quot;anticuerpo o inmunoglobulina quimericaquot; se refiere a un anticuerpo o inmunoglobulina cuyas regiones variables provienen de una primera especie y cuyas regiones constantes provienen de una segunda especie. Los anticuerpos o inmunoglobulinas quimericas pueden construirse, por ejemplo, mediante ingenieria genetica, a partir de segmentos de genes de inmunoglobulinas pertenecientes a diferentes especies. Las expresiones quot;inmunoglobulina humanizadaquot; o quot;anticuerpo humanizadoquot; no pretenden incluir anticuerpos o inmunoglobulinas quimericas, como se define mas adelante. Aunque los anticuerpos o inmunoglobulinas humanizadas son quimericas en su construccion (es decir, comprenden regiones de mas de una especie de proteina), incluyen caracteristicas adicionales (es decir, regiones variables que comprenden restos CDR del donante y restos de region estructural del aceptor) que no se encuentran en los anticuerpos o inmunoglobulinas quimericas, tal como se definen en el presente documento.

Tales anticuerpos monoclonales humanizados y quimericos pueden producirse mediante tecnicas de ADN recombinante conocidas en la tecnica, por ejemplo mediante los metodos descritos en Robinson et al., solicitud internacional N° PCT/US86/02269; Akira, et al., solicitud de patente europea 184.187; Taniguchi, M., solicitud de patente europea 171.496; Morrison et al., solicitud de patente europea 173.494; Neuberger et al., publicacion internacional PCT N° WO 86/01533; Cabilly et al., patente de EE.UU. N° 4.816.567; Cabilly et al., solicitud de patente europea 125.023; Better et al., (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84:3439-3443; Liu et al., (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84:214-218; Nishimura et al., (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al., (1985) Nature 314:446-449, y Shaw et al., (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S.L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al., (1986) BioTechniques 4:214; Winter, patente de EE.UU. 5.225.539; Jones et al., (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., (1988) Science 239:1534, y Beidler et al., (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.

Anticuerpos humanos de animales transgenicos y de presentacion en fagos

Como alternativa, ya es posible producir animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunizacion, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de produccion de inmunoglobulina endogena. Por ejemplo, se ha descrito que la delecion homocigotica del gen de la region de union de la cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones quimericos y con mutaciones en la linea germinal da como resultado la inhibicion completa de la produccion de anticuerpos endogenos. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulina de la linea germinal humana a tales ratones con mutaciones en la linea germinal da como resultado la produccion de anticuerpos humanos tras la exposicion al antigeno. Veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N° 6.150.584; N° 6.114.598; y N° 5.770.429.

Tambien pueden obtenerse anticuerpos totalmente humanos de bibliotecas de presentacion en fagos (Hoogenboom et al, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)). Tambien pueden obtenerse anticuerpos policlonales quimericos de bibliotecas de presentacion en fagos (Buechler et al., patente de EE.UU. N° 6.420.113).

Anticuerpos biespecfficos y conjugados de anticuerpos

Los anticuerpos biespecificos (BsAbs) son anticuerpos que tienen especificidades de union para al menos dos epitopos diferentes. Tales anticuerpos pueden derivar de anticuerpos de longitud completa o de fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos F(ab)'2). Los metodos para crear anticuerpos biespecificos son conocidos en la tecnica. La produccion tradicional de anticuerpos biespecificos de longitud completa se basa en la coexpresion de dos pares de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la mezcla aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de moleculas de anticuerpo diferentes (vease, el documento WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)).

Los anticuerpos biespecificos tambien incluyen anticuerpos entrecruzados o quot;heteroconjugadosquot;. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina u otra carga util. Los anticuerpos heteroconjugados pueden crearse mediante cualquier metodo de entrecruzamiento conveniente. En la tecnica son bien conocidos agentes de entrecruzamiento adecuados y se describen en la patente de EE.UU. N° 4.676.980, junto con una serie de tecnicas de entrecruzamiento.

En otra forma de realizacion mas, el anticuerpo puede conjugarse, quimica o geneticamente, a una carga util tal como un resto funcional, detectable o reactivo, por ejemplo, una inmunotoxina para producir un conjugado de anticuerpos. Tales cargas utiles incluyen, por ejemplo, inmunotoxinas, agentes quimioterapeuticos y radioisotopos, todos los cuales son bien conocidos en la tecnica.

Protefnas de fusion de anticuerpo

Una proteina de union a Ar que tiene una region Fc tal como se utiliza en la invencion puede ser una proteina de fusion que contiene al menos la porcion Fc de un anticuerpo fusionada a un polipeptido o proteina no anticuerpo que es capaz de unirse a Ar. Por lo tanto, se crea una proteina de fusion soluble que es capaz de unirse a Ar y que tiene funciones relacionadas con Fc (tales como la estabilidad en suero, la union al receptor de Fc y similares). Pueden prepararse, y han sido descritas en la tecnica, proteinas de fusion de anticuerpo (tambien denominadas en la tecnica proteinas de fusion Fc o proteinas de fusion Ig) mediante tecnicas convencionales de ADN recombinante, vease por ejemplo la patente de EE.UU. N° 5.116.964, la patente de EE.UU. N° 5.225.538, la patente de EE.UU. N° 5.336.603 y la patente de EE.UU. N° 5.428.130, todas de Capon et al.

Anticuerpos anti-Af

En general, los anticuerpos de la presente invencion incluyen una variedad de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloidogenicas, en concreto, la enfermedad de Alzheimer, dirigiendolos contra el peptido Ar.

Las expresiones quot;anticuerpo Arquot;, quot;anticuerpo anti-Arquot; y quot;anti-Arquot; se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un anticuerpo que se une a uno o mas epitopos o determinantes antigenicos de la proteina precursora del amiloide humana (APP), la proteina Ar, o ambas. Los epitopos o determinantes antigenicos ejemplares pueden encontrarse dentro de la APP, pero se encuentran preferentemente dentro del peptido Ar de la APP. Existen multiples isoformas de la APP, por ejemplo, APP695, APP751 y APP770. A los aminoacidos dentro de la APP se les asignan numeros de acuerdo con la secuencia de la isoforma APP770 (vease, por ejemplo, el N° de acceso del GenBank P05067). Son ejemplos de isotipos especificos de APP que actualmente se sabe que existen en los seres humanos el polipeptido de 695 aminoacidos descrito por Kang et al., (1987) Nature 325:733-736, que se indica como la APP quot;normalquot;; el polipeptido de 751 aminoacidos descrito por Ponte et al., (1988) Nature 331:525-527 (1988) y Tanzi et al., (1988) Nature 331:528-530, y el polipeptido de 770 aminoacidos descrito por Kitaguchi et al., (1988) Nature 331:530-532. Como resultado del procesamiento proteolitico de la APP por diferentes enzimas secretasa in vivo o in situ, la Ar se encuentra tanto en una quot;forma cortaquot;, de 40 aminoacidos de longitud, como en una quot;forma largaquot;, con una longitud de entre 42 y 43 aminoacidos. La forma corta, A 40, consiste en los restos 672-711 de la APP. La forma larga, por ejemplo, Ar42 o A 43, consiste en los restos 672-713 o 672-714, respectivamente. Parte del dominio hidrofobo de la APP se encuentra en el extremo carboxilo de la Ar, y puede explicar la capacidad de la Ar para agregarse, especialmente en el caso de la forma larga. El peptido Ar puede encontrarse en, o purificarse a partir de, los fluidos corporales de seres humanos y otros mamiferos, por ejemplo, el liquido cefalorraquideo, incluyendo individuos normales e individuos que padecen de trastornos amiloidogenicos.

Las expresiones quot;proteina -amiloidequot;, quot;peptido -amiloidequot;, quot;� -amiloidequot;, quot;Arquot; y quot;peptido Arquot; se utilizan indistintamente en el presente documento. El peptido Ar (por ejemplo, A�39, A�40, A �41, Ar42 y A�43) es un fragmento interno de 4 kDa de 39-43 aminoacidos de la APP. El A �40, por ejemplo, consiste en los restos 672-711 de la APP y el Ar42 consiste en los restos 672-713 de la APP. Los peptidos Ar incluyen peptidos resultantes de la escision de la APP por la secretasa y peptidos sinteticos que tienen la misma o esencialmente la misma secuencia que los productos de escision. Pueden obtenerse peptidos Ar a partir de una variedad de fuentes, por ejemplo, tejidos, lineas celulares o fluidos corporales (por ejemplo suero o liquido cefalorraquideo). Por ejemplo, puede obtenerse un Ar a partir de celulas que expresan APP tales como las celulas de ovario de hamster chino (CHO) transfectadas de forma estable con APP717V�F, como se describe, por ejemplo, en Walsh et al., (2002), Nature, 416, pags. 535-539. Puede obtenerse una preparacion de Ar a partir de fuentes de tejido mediante los metodos descritos anteriormente (vease, por ejemplo, Johnson-Wood et al., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94:1550). Como alternativa, pueden sintetizarse peptidos Ar mediante los metodos que son bien conocidos para los expertos en la materia. Vease, por ejemplo, Fields et al., Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W.H. Freeman y Co., Nueva York, NY, 1992, p. 77). Por lo tanto, los peptidos pueden sintetizarse mediante las tecnicas automatizadas de Merrifield de sintesis en fase solida con el grupo a-amino protegido por cualquiera de las quimicas t-Boc o F-moc utilizando aminoacidos de cadena lateral protegida en, por ejemplo, un sintetizador de peptidos de Applied Biosystems Modelo 430A o 431. Pueden sintetizarse antigenos peptidicos mas largos mediante tecnicas de ADN recombinante bien conocidas. Por ejemplo, puede sintetizarse o clonarse molecularmente un polinucleotido que codifica el peptido o peptido de fusion e insertarse en un vector de expresion adecuado para la transfeccion y la expresion heterologa mediante una celula hospedadora adecuada. El peptido Ar tambien se refiere a secuencias Ar relacionadas que son el resultado de mutaciones en la region Ar del gen normal.

Pueden encontrarse epitopos o determinantes antigenicos ejemplares a los que se une un anticuerpo Ar dentro de la proteina precursora del amiloide humana (APP), pero se encuentran preferentemente dentro del peptido Ar de la APP. Los epitopos o determinantes antigenicos ejemplares dentro del Ar se encuentran situados dentro del extremo N-terminal, la region central, o el extremo C-terminal de Ar. Un quot;epitopo del extremo N-terminalquot;, es un epitopo o determinante antigenico situado dentro de, o que incluye, el extremo N-terminal del peptido Ar. Epitopos del extremo N-terminal ejemplares incluyen los restos dentro de los aminoacidos 1-10 o 1-12 de Ar, preferentemente de los restos 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 2-6, 2-7, 3-6 o 3-7 de Ar42. Otros epitopos del extremo N-terminal ejemplares se inician en los restos 1-3 y finalizan en los restos 7-11 de Ar. Epitopos del extremo N-terminal ejemplares adicionales incluyen los restos 2-4, 5, 6, 7 u 8 de Ar, los restos 3-5, 6, 7, 8 o 9 de Ar, o los restos 4-7, 8, 9 o 10 de Ar42. Los quot;epitopos centralesquot; son epitopos o determinantes antigenicos que comprende los restos situados dentro de la porcion central o media del peptido Ar. Epitopos centrales ejemplares incluyen los restos dentro de los aminoacidos 13-28 de Ar, preferentemente de los restos 14-27, 15-26, 16-25, 17-24, 18-23 o 19-22 de Ar. Otros epitopos centrales ejemplares incluyen los restos dentro de los aminoacidos 16-24, 16-23, 16-22, 16-21, 18-21, 19-21, 19-22, 19-23 o 19-24 de Ar. Los epitopos o determinantes antigenicos quot;del extremo C-terminalquot; se encuentran situados dentro de o incluyendo el extremo C-terminal del peptido Ar e incluyen los restos dentro de los aminoacidos 33-40, 33-41 o 33-42 de Ar. Los quot;epitopos del extremo C-terminalquot; son epitopos o determinantes antigenicos que comprende los restos situados dentro del extremo C-terminal del peptido Ar (por ejemplo, dentro de aproximadamente los aminoacidos 30-40 o 30-42 de Ar). Determinantes antigenicos o epitopos del extremo C-terminal ejemplares adicionales incluyen los restos 33-40 o 33-42 de Ar.

Cuando se dice que un anticuerpo se une a un epitopo dentro de los restos especificados, tales como los 3-7 de Ar, lo que se quiere decir es que el anticuerpo se une especificamente a un polipeptido que contiene los restos especificados (es decir, los 3-7 de Ar en este un ejemplo). Tal anticuerpo no esta necesariamente en contacto con cada resto dentro de los 3-7 de Ar. Tampoco cada sustitucion o delecion de aminoacidos dentro de los 3-7 de Ar influye necesariamente de manera significativa en la afinidad de union. En diversas formas de realizacion, un anticuerpo Ar es especifico para el extremo. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion quot;especifico para el extremoquot; se refiere a un anticuerpo que se une especificamente a los restos N-terminal o C-terminal de un peptido Ar pero que no reconoce los mismos restos cuando estan presentes en una especie Ar mas larga que comprende los restos o en la APP. En diversas formas de realizacion, un anticuerpo Ar es quot;especifico para el extremo C-terminal.quot; Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion quot;especifico para el extremo C-terminalquot; se refiere a que el anticuerpo reconoce especificamente un extremo C-terminal libre de un peptido Ar. Ejemplos de anticuerpos Ar especificos para el extremo C-terminal incluyen aquellos que: reconocen un peptido Ar que termina en el resto 40 pero no reconocen un peptido Ar que termina en el resto 41, 42, y/o 43; reconocen un peptido Ar que termina en el resto 42, pero no reconocen un peptido Ar que termina en el resto 40, 41 y/o 43, etc.

En una forma de realizacion, el anticuerpo Ar puede ser un anticuerpo 3D6 o una variante del mismo, o un anticuerpo 10D5 o una variante del mismo, ambos de los cuales se describen en la publicacion de patente de EE.UU. N° 20030165496A1, la publicacion de patente de EE.UU. N° 20040087777A1, la publicacion de patente internacional N° WO02/46237A3 y la publicacion de patente internacional N° WO04/080419A2. La descripcion de los anticuerpos 3D6 y 10D5 tambien puede encontrarse, por ejemplo, en la publicacion de patente internacional N° WO02/088306A2 y en la publicacion de patente internacional N° WO02/088307A2. Anticuerpos 3D6 adicionales se describen en la solicitud de patente de EE.UU. N° 11/303.478 y en la solicitud internacional N° PCT/US05/45614. El 3D6 es un anticuerpo monoclonal (AcMo) que se une especificamente a un epitopo del extremo N-terminal situado en el peptido �-amiloide humano, especificamente, los restos 1-5. En comparacion, el 10D5 es un AcMo que se une especificamente a un epitopo del extremo N-terminal situado en el peptido -amiloide humano, especificamente, los restos de 3-6. Una linea celular que produce el anticuerpo monoclonal 3D6 (RB96 3D6.32.2.4) fue depositada en la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20108, EE.UU. el 8 de abril de 2003 conforme a los terminos del Tratado de Budapest, y tiene el numero de deposito PTA-5130. Una linea celular que produce el anticuerpo monoclonal 10D5 (RB44 10D5.19.21) fue depositada en la ATCC el 8 de abril de 2003 conforme a los terminos del Tratado de Budapest, y tiene el numero de deposito PTA-5129.

Son anticuerpos 3D6 variantes ejemplares aquellos que tienen, por ejemplo, una cadena ligera humanizada que comprende las secuencias de aminoacidos de la region variable expuestas como SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:5 y una cadena pesada humanizada que comprende las secuencias de aminoacidos de la region variable expuestas como SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6. Otros anticuerpos 3D6 variantes ejemplares son aquellos que tienen, por ejemplo, una secuencia de aminoacidos de la cadena ligera humanizada expuesta como SEQ ID NO:7 y una secuencia de aminoacidos de la cadena pesada humanizada expuesta como SEQ ID NO:8.

Son anticuerpos 10D5 variantes ejemplares aquellos que tienen, por ejemplo, una cadena ligera humanizada que comprende las secuencias de aminoacidos de la region variable expuestas como SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:11 y una cadena pesada humanizada que comprende las secuencias de aminoacidos de la region variable expuestas como SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:12. Otros anticuerpos 10D5 variantes ejemplares son aquellos que tienen, por ejemplo, una secuencia de aminoacidos de la cadena ligera humanizada expuesta como SEQ ID NO:13 y una secuencia de amino acidos de la cadena pesada humanizada expuesta como SEQ ID NO:14. Tales anticuerpos variantes se describen adicionalmente en el documento WO02/088307A2.

En otra forma de realizacion, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 12B4 o una variante del mismo, como se describe en la publicacion de patente de EE.UU. N° 20040082762A1 y en la publicacion de patente internacional N° WO03/077858A2. El 12B4 es un AcMo que se une especificamente a un epitopo del extremo N-terminal situado en el peptido �-amiloide humano, especificamente, los restos 3-7.

Son anticuerpos 12B4 variantes ejemplares aquellos que tienen, por ejemplo, una cadena ligera humanizada (o cadena ligera) que comprende las secuencias de aminoacidos de la region variable expuestas como SEQ ID NO:15 o SEQ ID NO:17 y una cadena pesada humanizada que comprende las secuencias de aminoacidos de la region variable expuestas como SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 o SEQ ID NO:19.

En otra forma de realizacion mas, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 12A11 o una variante del mismo, como se describe en la publicacion de patente de EE.UU. N° 20050118651A1, la solicitud de patente de EE.UU. con N° de serie 11/303.478, la publicacion de patente internacional N° WO04/108895A2, y la solicitud de patente internacional con N° de serie PCT/US05/45614. El 12A11 es un AcMo que se une especificamente a un epitopo del extremo N-terminal situado en el peptido �-amiloide humano, especificamente, los restos 3-7. Una linea celular que produce el anticuerpo monoclonal 12A11 fue depositada en la ATCC el 13 de diciembre de 2005, conforme a los terminos del Tratado de Budapest, y tiene el numero de deposito PTA-7271.

Son anticuerpos 12A11 variantes ejemplares aquellos que tienen, por ejemplo, una cadena ligera humanizada que comprende la secuencia de la region variable de aminoacidos expuesta como SEQ ID NO:20 y una cadena pesada humanizada que comprende las secuencias de aminoacidos de la region variable expuestas como SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, o SEQ ID NO:41.

En otra forma de realizacion mas, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 6C6, o una variante del mismo, tal como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. N° 11/305.899 y en la solicitud internacional N° PCT/US05/45860. El 6C6 es un AcMo que se une especificamente a un epitopo del extremo N-terminal situado en el peptido -amiloide humano, especificamente, los restos 3-7. Una linea celular que produce el anticuerpo 6C6 fue depositada el 1 de noviembre de 2005, en la ATCC conforme a los terminos del Tratado de Budapest y se le asigno el numero de acceso PTA-7200.

En otra forma de realizacion mas, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 2H3 como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. N° 11/305.899 y en la solicitud internacional N° PCT/US05/45860. El 2H3 es un AcMo que se une especificamente a un epitopo del extremo N-terminal situado en el peptido �-amiloide humano, especificamente, los restos de 2-7.

En otra forma de realizacion mas, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 3A3 como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. N° 11/305.899 y en la solicitud internacional N° PCT/US05/45860. El 3A3 es un AcMo que se une especificamente a un epitopo del extremo N-terminal situado en el peptido �-amiloide humano, especificamente, los restos 3-7.

Las lineas celulares que producen los anticuerpos 2H3 y 3A3, que tienen los numeros de acceso de la ATCC PTA-7267 y PTA-7269, respectivamente, fueron depositadas el 13 de diciembre de 2005, conforme a los terminos del Tratado de Budapest.

En otra forma de realizacion mas, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 15C11 o una variante del mismo, como se describe en una solicitud de patente de EE.UU. N° 11/304.986 y en la solicitud de patente internacional N° PCT/US05/45515 titulada quot;Humanized Antibodies that Recognize Beta Amyloid Peptidequot;. El 15C11 es un AcMo que se une especificamente a un epitopo central situado en el peptido -amiloide humano, especificamente, los restos 19-22. Una linea celular que produce el anticuerpo monoclonal 15C11 fue depositada en la ATCC el 13 de diciembre de 2005, conforme a los terminos del Tratado de Budapest, y tiene el numero de deposito PTA-7270.

En otra forma de realizacion mas, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 266 como se describe en la publicacion de patente de EE.UU. N° 20050249725A1 y en la publicacion de patente internacional N° WO01/62801A2. El 266 es un AcMo que se une especificamente a un epitopo central situado en el peptido

�-amiloide humano, especificamente, los restos 16-24. Una linea celular que produce el anticuerpo monoclonal 266 fue depositada en la ATCC el 20 de julio de 2004, conforme a los terminos del Tratado de Budapest, y tiene el numero de deposito PTA-6123.

Son anticuerpos 266 variantes ejemplares aquellos que tienen, por ejemplo, una cadena ligera humanizada que comprende las secuencias de aminoacidos de la region variable expuestas como SEQ ID NO:42 o SEQ ID NO:44 y una cadena pesada humanizada que comprende las secuencias de aminoacidos de la region variable expuestas como la SEQ ID NO:43 o SEQ ID NO:45. Otros anticuerpos 266 variantes ejemplares son aquellos que tienen, por ejemplo, una secuencia de aminoacidos de la cadena ligera humanizada expuesta como SEQ ID NO:46 y una secuencia de amino acidos de la cadena pesada humanizada expuesta como SEQ ID NO:47. Tales anticuerpos variantes se describen adicionalmente en la publicacion de patente de EE.UU. N° 20050249725A1 y en la publicacion de patente internacional N°WO01/62801A2.

En otra forma de realizacion mas, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 2B1, o una variante del mismo, como se describe en una solicitud de patente de EE.UU. N° 11/305.899 y en la solicitud de patente internacional N° PCT/US05/45860 titulada quot;A� Antibodies for Use in Improving Cognitionquot;. El 2B1 es un AcMo que se une especificamente a un epitopo central situado en el peptido -amiloide humano, especificamente, los restos 19-23.

En otra forma de realizacion mas, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 1C2, o una variante del mismo, como se describe en una solicitud de patente de EE.UU. N° 11/305.899 y en la solicitud de patente internacional N° PCT/US05/45860 titulada quot;A� Antibodies for Use in Improving Cognitionquot;. El 1C2 es un AcMo que se une especificamente a un epitopo central situado en el peptido -amiloide humano, especificamente, los restos 16-23.

En otra forma de realizacion mas, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 9G8, o una variante del mismo, como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. N° 11/304.986 y en la solicitud de patente internacional N° PCT/US05/45515. El 9G8 es un AcMo que se une especificamente a un epitopo central situado en el peptido

�-amiloide humano, especificamente, los restos 16-21.

Las lineas celulares que producen los anticuerpos 2B1, 1C2 y 9G8 fueron depositadas el 1 de noviembre de 2005, en la ATCC conforme a los terminos del Tratado de Budapest y se les asigno los numeros de acceso PTA-7202, PTA-7199 y PTA-7201, respectivamente.

Los anticuerpos que se unen especificamente a los epitopos del extremo C-terminal situados en el peptido

�-amiloide humano, para su uso en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, el 369.2B, como se describe en la patente de EE.UU. N° 5.786.180, titulada quot;Monoclonal antibody 369.2B specific for r A4 peptidequot;. Una descripcion adicional de los anticuerpos para su uso en la presente invencion puede encontrarse, por ejemplo, en Bussiere et al., (Am. J. Pathol. 165(3):987-95 (2004)), Bard et al., (PNAS 100(4):2023-8 (2003)), Kajkowski et al., (J. Biol. Chem. 276(22):18748-56 (2001)), Games et al., (Ann. NY Acad. Sci. 920:274-84 (2000)), Bard et al., (Nat. Med.

6(8):916-9 (2000)), y en la solicitud de patente internacional N°WO03015691A2 titulada quot;Effecting rapid improvement of cognition in a subject having Alzheimer's disease, Down's syndrome, cerebral amyloid angiopathy, or mild cognitive impairment, comprises administering anti-A beta antibodyquot;. Una descripcion adicional de fragmentos de anticuerpos para su uso en la presente invencion puede encontrarse, por ejemplo, en Bales et al., (Resumen P4-396, pagina S587, presentado en la Poster Session P4: Therapeutics and Therapeutic Strategies-Therapeutic Strategies, Amyloid-Based) y en Zameer et al., (Resumen P4-420, pagina S593, presentado en la Poster Session P4: Therapeutics and Therapeutic Strategies-Therapeutic Strategies, Amyloid-Based).

Los anticuerpos para su uso en la presente invencion pueden producirse mediante sintesis o por recombinacion. Por ejemplo, el anticuerpo puede producirse mediante un proceso de cultivo celular recombinante, utilizando, por ejemplo, celulas CHO, celulas NIH 3T3, celulas PER.C6®, celulas NS0, celulas VERO, fibroblastos de embrion de pollo, o celulas BHK. Ademas, la presente invencion contempla los anticuerpos con modificaciones menores que conservan la propiedad funcional primaria de union al peptido Ar. En una forma de realizacion concreta, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado 3D6 anti-peptido Ar que se une selectivamente al peptido Ar. Mas concretamente, el anticuerpo humanizado 3D6 anti-peptido Ar se disena para unirse especificamente a un epitopo del extremo NH2-terminal, por ejemplo, los restos de aminoacidos 1-5, situados en el peptido �-amiloide 1-40

o 1-42 humano encontrado en depositos de placas en el cerebro (por ejemplo, en pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer).

Un anticuerpo humanizado anti-peptido Ar ejemplar es un 3D6 humanizado version 2 (h3D6v2). Las secuencias completas de aminoacidos de las cadenas pesada y ligera de h3D6v2 predichas a partir de las secuencias de ADN de los vectores de expresion correspondientes se muestran en la Figura 1 (en la que los restos se numeran comenzando por el extremo NH2-terminal de las cadenas ligera y pesada como resto numero 1) y en la SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente. El ultimo resto de aminoacidos codificado por la secuencia de ADN de la cadena pesada, Lys449, no se ha observado en la forma madura, la forma secretada de h3D6v2 y, sin animo de limitarse a ninguna teoria en particular, se supone que se elimina durante el procesamiento intracelular por proteasas celulares de CHO. Por lo tanto, el extremo COOH-terminal de la cadena pesada de h3D6v2 es opcionalmente Gly448. Se ha observado el procesamiento de la lisina del extremo COOH-terminal en anticuerpos provenientes del plasma y recombinantes y no parece afectar a su funcion (Harris (1995) J. Chromatogr. A. 705:129-134). El h3D6v2 purificado se modifica postraduccionalmente por adicion de glicanos ligados a N a la porcion Fc de la cadena pesada, que se sabe contiene un unico sitio de consenso de N-glicosilacion. El sitio de N-glicosilacion presenta tres estructuras principales de oligosacaridos neutros de dos antenas complejos, observadas comunmente en el sitio de N-glicosilacion analogo de las proteinas IgG de mamiferos.

Otro anticuerpo humanizado anti-peptido Ar ejemplar es el 3D6 humanizado version 1 (hu3D6v1) que tiene la secuencia expuesta en la Figura 1, pero para una sustitucion D�Y en la posicion 1 de la cadena ligera, una sustitucion S�A en la posicion 75 de la cadena pesada (posicion 74 segun la numeracion de Kabat), una sustitucion T �S en la posicion 78 de la cadena pesada (posicion 77 segun la numeracion de Kabat), y una sustitucion V�L en la posicion 93 de la cadena pesada (posicion 89 segun la numeracion de Kabat),

Los diversos aspectos y formas de realizacion de la presente invencion se describen adicionalmente por medio de los siguientes Ejemplos. Los ejemplos se ofrecen a modo de ilustracion y no a modo de limitacion.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se ofrecen solamente a efectos ilustrativos. Los ejemplos se proporcionan utilizando dos anticuerpos monoclonales anti-Ar diferentes. Se describen seis experimentos separados, que representa cada uno una combinacion de extraccion de anticuerpos e impurezas.

Materiales y Metodos

En general, la practica de la presente invencion emplea, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de quimica, biologia molecular, tecnologia de ADN recombinante, inmunologia (especialmente, por ejemplo, la tecnologia de las inmunoglobulinas), y tecnicas convencionales de electroforesis. Veanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992). Bousse et al., Protein Sizing on a Microchip, Anal. Chem. 73, 1207-1212 (2001); Knapp et al., Commercialized and Emerging Lab-on-a-Chip Applications; En: Proceedings of the ITAS 2001 Symposium, Ramsey, J.M. y Van den Berg, A., 7-10 (2001); y Mhatre et al., Strategies for locating disulfide bonds in a monoclonal antibody via mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom, 13(24) 2503-2510 (1999).

Produccion del anticuerpo diana

El anticuerpo diana puede producirse, por ejemplo, utilizando una linea celular recombinante de mamifero desarrollada en un cultivo en suspension. El medio acondicionado que contiene el anticuerpo de interes se genera en un biorreactor de produccion. El producto resultante puede cosecharse y aclararse con cualquier etapa de aclarado apropiada tal como, por ejemplo, microfiltracion y filtracion de 0,22 Im o centrifugacion, o filtracion por lecho o filtracion de 0,22 Im.

Purificacion del anticuerpo diana

La purificacion de los anticuerpos monoclonales diana ejemplificados en el presente documento (AAB o 12A11) consiste en la captura de la molecula diana en la cromatografia de afinidad con Proteina A. Esto puede consistir en rmp Protein A Sepharose™ Fast Flow, Protein A Sepharose™ Fast Flow, o MabSelect Protein A. A continuacion se lava la resina como se describe para cada uno de los experimentos y el producto se eluye y se somete a ensayo para determinar los niveles de impurezas.

Analisis del anticuerpo diana

Para cuantificar la cantidad de IRT presente en las muestras de anticuerpo monoclonal AAB, se utilizo la HPLC de fase inversa (RP-HPLC). Para determinar el porcentaje de especies de proteina monomerica (IgG monomerica), de alto peso molecular (HMW) y de bajo peso molecular (LMW), se utilizo la cromatografia de exclusion por tamano (SEC-HPLC). Para determinar la cantidad relativa de especies con menos enlaces disulfuro (UDB) en las muestras se llevo a cabo un analisis SEC-HPLC desnaturalizante. Los niveles de HCP en las muestras de ensayo se determinaron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Ensayos analfticos: IRT y UDB

HPLC de fase inversa (Analisis IRT de AAB)

La RP-HPLC se llevo a cabo de la siguiente manera. Se realizo la reduccion disulfuro de cada muestra por incubacion a 40°C durante 60 minutos en presencia de DTT 2,5 mM. Se realizo la alquilacion por incubacion a temperatura ambiente en presencia de acido yodoacetico 5,5 mM. Despues de la reduccion y la alquilacion, se inactivaron todas las muestras con 5 Il de DTT 1 M. El limite de cuantificacion para este ensayo es de 0,5%. Se inyectaron aproximadamente 40 Ig de cada muestra reducida y alquilada en una columna de RP-HPLC POROS R1/H y se procesaron durante 70 minutos en las siguientes condiciones:

Columna: POROS Rl/H RP-HPLC

Temperatura de la columna: 50°C

Fase movil A: TFA al 0,1% (p/v) en agua;

Fase movil B: TFA al 0,1% (p/v) en acetonitrilo al 95%;

Caudal: 1,0 ml/min

Deteccion: 217 nm

Tiempo de ciclo: 70 minutos

Inyeccion: por triplicado de 40 Ig cada una

Los tiempos de gradiente se enumeraron como en la TABLA 1.

Tabla�1:�Tiempod�de�raadiente�paaa�el�mttodo�RP-HPLC

Tiempo�de�raadiente

%de�A %de�

0-1

95 5

2

70 30

54

60 40

55,1-70

95 5

dSEC-HPLC (Analisis UDB de AAB)

La SEC-HPLC desnaturalizante se llevo a cabo de la siguiente manera. El pretratamiento de las muestras para el ensayo SEC desnaturalizante implica una mezcla de reactivo/muestra a unas concentraciones finales de 200 Ig/ml de proteina, guanidina HCl 3 M, y Tris 100 mM, a un pH de 7,4. Las muestras se calentaron a 80°C durante 20 minutos mientras se mezclaban por inversion. Para este ensayo, se emplean dos testigos para permitir un agrupamiento de los niveles de UDB. Como testigos se utilizaron las referencias internas con niveles bajos y altos de UDB.

Las condiciones cromatograficas/de ensayo fueron las siguientes:

Columna: Tosoh BioSep G3000 SWXL

Temperatura de la columna: Ambiente

Fase movil: guanidina HCl 3 M, NaPO4 25 mM, pH 6,8

Gradiente: isocratico

Caudal: 0,5 ml/min

Deteccion: 280 nm

Tiempo de ciclo: 50 minutos

Inyeccion: por triplicado 50 Il (10 Ig)

EJEMPLO 1: Comparacion de los tampones de lavado para la eliminacion de IRT

En este ejemplo, se purifico una solucion impura que contenia el anticuerpo monoclonal anti-Ar AAB por adsorcion sobre una columna de Proteina A seguido de un primer lavado con un tampon de lavado que contenia CaCl2, MgCl2, NaCl o propilenglicol. Se purifico a pequena escala el cultivo que contenia el anticuerpo monoclonal, utilizando una columna rmp Protein A Sepharose™ FF (8,9 ml) conectada a un sistema de cromatografia GEHealthcare AKTA FPLC. Para todas las etapas de cromatografia rmp Protein A Sepharose™ FF descritas en el experimento 1, se utilizaron las siguientes condiciones. (Las excepciones se indican en las descripciones experimentales individuales).

Dimensiones de la columna -1,0 cm x 11,4 cm Caudal operativo -150 cm/hr Equilibrado 1 -Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (5 volumenes de columna) Lavado abundante - Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (1 volumen de columna) Lavado 1 - Variable (Vease la Tabla 2) excepto para el ciclo n° 1, que no tuvo Lavado 1 Lavado 2 - Tris 20 mM, NaCl 1,0 M, pH 7,5 (5 volumenes de columna) Lavado 3 - Tris 10 mM, NaCl 75 mM, pH 7,5 (7 volumenes de columna) Elucion - Glicina 50 mM, NaCl 75 mM, pH 3,1 (6 volumenes de columna) Regeneracion 1 - citrato sodico 20 mM, pH 2,7 (5 volumenes de columna) Regeneracion 2 - guanidina HCl 6 M (2 volumenes de columna) Lavado de regeneracion - Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (5 volumenes de columna) Almacenamiento - Etanol al 16% (5 volumenes de columna) Temperatura del ciclo: 2°C-8°C

Los ciclos de columna rmp Protein A Sepahrose™ FF se equilibraron con 5 volumenes de columna de Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. La columna se cargo a aproximadamente 10 mg de producto/ml de resina. La carga fue seguida de lavado abundante de 1 volumen de columna con de tampon de equilibrado y 5 volumenes de columna con la solucion de Lavado 1. Todas las soluciones de Lavado 1 sometidas a ensayo se esbozan en la Tabla

2. El Lavado 1 se incluyo en todas los ciclos excepto para el ciclo n° 1. El Lavado 1 fue seguido de 5 volumenes de columna de Tris 20 mM, NaCl 1,0 M, pH 7,5 y 7 volumenes de columna de Tris 10 mM, NaCl 75 mM, pH 7,5. El anticuerpo monoclonal se eluyo desde la columna con glicina 50 mM, NaCl 75 mM, pH 3,1. A continuacion se neutralizo la combinacion de productos a 7,9-8,1 con Tris 2 M pH 8,5. A continuacion las columnas se regeneraron, se lavaron y se almacenaron. La Tabla 2 enumera los niveles de las especies IRT y LMW presentes en las combinaciones de productos de los diversos ciclos. Los lavados con cloruro de magnesio y cloruro de calcio redujeron los niveles de las especies IRT y LMW.

Tabla 2: �aaloaed�de IRT y LWW �paaa�di�eadod�tampone� de�La�ado1

n°�de�ciclo

Condici6n % de�LW� % de�IRT

1

Testigo (sin Lavado 1) 4,4 2,5

2

Propilenglicol al 20%, pH 7,5 4,7 2,5

3

Tris 50 mM, cloruro de magnesio 2,0 M, pH 7,5 1,6 1,5

4

Tris 50 mM, cloruro de magnesio 2,5 M, pH 7,5 1,5 1,3

5

Acetato 50 mM, cloruro de magnesio 2,0 M, pH 4,5 0,9 0,8

6

Tris 50 mM, cloruro sodico 4,0 M, pH 7,5 4,4 2,5

7

Tris 50 mM, cloruro de calcio 2,0 M, pH 7,5 1,8 1,4

8

Tris 50 mM, cloruro de calcio 2,5 M, pH 7,5 0,8 0,8

Los resultados mostraron que los lavados con cloruro de magnesio y cloruro de calcio reducian los niveles de las especies IRT y LMW, mientras que los lavados con cloruro sodico y propilenglicol no reducian las especies IRT o LMW.

EJEMPLO 2: Cromatografia con Proteina A con lavado con CaCl2 para la eliminacion de IRT

En este ejemplo, se llevo a cabo una purificacion de anticuerpo a mayor escala mediante cromatografia con Proteina A con un lavado con CaCl2 para eliminar las especies IRT.

Se purifico a escala piloto el cultivo que contenia el anticuerpo monoclonal utilizando una columna MabSelect Protein A (2,4 l) conectada a un sistema de cromatografia Millipore K-Prime 400. Los dos ciclos de MabSelect se realizaron como se describe a continuacion.

Dimensiones de la columna -13 cm x 18 cm Caudal operativo - 150 cm/hr, 300 cm/hr Equilibrado 1 -Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (5 volumenes de columna) Lavado abundante - Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (2 volumenes de columna) Lavado 1 - Tris 50 mM, CaCl2 2 M pH 7,5 para el ciclo n° 1 y sin Lavado 1 para el ciclo n° 2 Lavado 2 - Tris 20 mM, NaCl 1,0 M, pH 7,5 (5 volumenes de columna) Lavado 3 - Tris 10 mM, NaCl 75 mM, pH 7,5 (5 volumenes de columna) Elucion - Glicina 50 mM, NaCl 25 mM, pH 3,1 (6 volumenes de columna) Regeneracion 1 - glicina 50 mM, NaCl 0,5 M, pH 2,7 (5 volumenes de columna) Regeneracion 2 - guanidina HCl 6 M (2 volumenes de columna). Lavado de regeneracion - Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (5 volumenes de columna) Almacenamiento - Etanol al 16% (5 volumenes de columna) Temperatura del ciclo: 2°C-8°C

La columna MabSelect Protein A se equilibro con 5 volumenes de columna de Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. A continuacion se cargaron las columnas a aproximadamente 10 mg de producto/ml de resina. Esto fue seguido de lavado abundante de 2 volumenes de columna con tampon de equilibrado y 5 volumenes de columna de solucion de Lavado 1. Esta solucion de Lavado 1 consistia en Tris 50 mM, CaCl2 2,0 M, pH 7,5 para el ciclo 1, mientras que se omitio completamente para el ciclo 2. A continuacion, el Lavado 1 fue seguido de 5 volumenes de columna de Tris 50 mM, NaCl 1,0 M, pH 7,5 y 5 volumenes de columna de Tris 10 mM, NaCl 75 mM, pH 7,5. El anticuerpo monoclonal se eluyo desde la columna MabSelect Protein A con glicina 50 mM, NaCl 25 mM, pH 3,1. A continuacion, se neutralizo la combinacion de productos a 7,8-8,2 con Tris 2 M pH 8,5. A continuacion, las columnas se regeneraron, se lavaron y se almacenaron. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3: �Ni�eled �de %de�IRT�en�ciclod a�edcala piloto �con y�din�la�ado con cloauao �de�calcio

N° �de�ciclo

Tamp6n de�La�ado1 % de�IRT

1

Tris 50 mM, CaCl2 2 M, pH 7,5 0,8

2

Testigo (Ninguno) 1,9

Los resultados mostraron que a escala piloto el lavado con cloruro de calcio eliminaba la IRT de la combinacion de productos.

EJEMPLO 3: Eliminacion de ADN

En este ejemplo, se examino la capacidad de un lavado con CaCl2 para eliminar el ADN de la celula hospedadora desde una preparacion que contenia el anticuerpo monoclonal AAB.

Se purifico a pequena escala el cultivo que contenia el anticuerpo monoclonal, utilizando una columna MabSelect Protein A (19 ml) conectada a un sistema de cromatografia GE Healthcare AKTA FPLC. Los tres ciclos de MabSelect se realizaron como se describe a continuacion.

Dimensiones de la columna -1,1 cm x 20 cm Caudal operativo - 300 cm/hr Equilibrado 1 -Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (5 volumenes de columna) Lavado abundante - Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (2 volumenes de columna) Lavado 1 - Tris 50 mM, CaCl2 2,0 M, pH 7,5 (5 volumenes de columna) (Ciclos 2 y 3 solamente) Lavado 2 - Tris 20 mM, NaCl 1,0 M, pH 7,5 (5 volumenes de columna) (Ciclos 1 y 3 solamente) Lavado 3 - Tris 10 mM, NaCl 75 mM, pH 7,5 (7 volumenes de columna) Elucion - Glicina 50 mM, NaCl 75 mM, pH 3,0 (6 volumenes de columna) Regeneracion -glicina 50 mM, NaCl 0,5 M, pH 2,7 (5 volumenes de columna) Lavado de regeneracion - Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (5 volumenes de columna) Almacenamiento - Etanol al 16% (5 volumenes de columna) Temperatura del ciclo: 18°C-24°C

Los ciclos de columna MabSelect Protein A se equilibraron con 5 volumenes de columna de Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. A continuacion se cargaron las columnas a una carga de aproximadamente 40 mg de producto/ml de resina. Esto fue seguido de lavado abundante de 2 volumenes de columna con tampon de equilibrado. Para los ciclos 2 y 3, esta etapa fue seguida de 5 volumenes de columna de solucion de Lavado 1. Para los ciclos 1 y 3, se utilizaron 5 volumenes de columna de solucion de Lavado 2. Los 3 ciclos emplearon 7 volumenes de columna de solucion de Lavado 3. El anticuerpo monoclonal se eluyo desde la columna MabSelect Protein A con glicina 50 mM, NaCl 75 mM, pH 3,0. A continuacion, se neutralizo la combinacion de productos a 7,5-8,0 con Tris

2 M pH 8,5. A continuacion, las columnas se regeneraron, se lavaron y se almacenaron. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: Eliminaci6n�de�ADN con�la�ado con cloauao�de �calcio

n°�de�ciclo

La�ado1 La�ado2 ADN�pnrmml� ADN�pppm)

1

Ninguno (testigo) Tris 20 mM, NaCl 1 M, pH 7,5 3,6 0,37

2

Tris 50 mM, CaCl2 2 M, pH 7,5 Ninguno 0,9 0,09

3

Tris 50 mM, CaCl2 2 M, pH 7,5 Tris 20 mM, NaCl 1 M, pH 7,5 0,3 0,03

reduccion 10 veces mayor de ADN en comparacion con el uso de NaCl en la solucion de lavado.

EJEMPLO 4: Eliminacion de proteinas de la celula hospedadora

En este ejemplo, se utilizo un segundo anticuerpo monoclonal anti-Ar, 12A11, en los ciclos de purificacion en los que se sometieron a ensayo diversas condiciones de lavado para determinar la capacidad para eliminar las proteinas de la celula hospedadora (HCP).

Se realizo un cribado de alto rendimiento (HTS) en un formato de placa de filtro de 96 pocillos para identificar las mejores condiciones de lavado para la eliminacion de impurezas tales como HCP para la etapa de MabSelect. Este cribado variaba los excipientes de lavado, la concentracion de excipiente, y el pH para determinar su efecto sobre las impurezas relacionadas con el proceso tales como las HCP.

La resina MabSelect se equilibro mediante Tris 5 mM, NaCl 10 mM, pH 7,3 y se cargo con el producto en una columna. A continuacion se descompacto la resina, se mezclo y se distribuyeron 50 IL de resina a cada pocillo de una placa de filtro de 96 pocillos. Se equilibro la resina de cada pocillo en solucion de Tris 5 mM, NaCl 10 mM, pH 7,3, y a continuacion se lavo con cada una de las diversas soluciones de lavado con excipientes en 3 etapas, utilizando cada una 300 Il de tampon de lavado. Despues del lavado con excipientes, se realizo un segundo lavado con tampon de Tris 5 mM, NaCl 10 mM, pH 7,3 en 4 etapas de 300 Il cada una. A continuacion se eluyo el producto desde la resina en 3 etapas de 300 Il cada una. Las etapas de elucion 1 y 2 se combinaron y sometieron a ensayo para determinar los niveles de HCP.

Volumen de resina - 50 Il Excipientes de lavado -cloruro sodico, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, Concentraciones de los excipientes - 100, 250, 500, 1.000, 1.500, y 2.000 mM pH de los excipientes -6,0 y 7,5 Tampones de elucion - Hepes 25 mM, NaCl 10 mM, pH 3,0, Hepes 25 mM, NaCl 100 mM, pH 3,0, glicina 50 mM, NaCl 10 mM, pH 3,0, glicina 50 mM, NaCl 100 mM, pH 3,0 y arginina 100 mM, NaCl 10 mM, pH 3,0, arginina 100 mM, NaCl 100 mM, pH 3,0 Temperatura del ciclo: 18°C-24 ° C

Los resultados se muestran en la Tabla 5 y en la Tabla 6.

Tabla 5: �aaloaed�de�HCP�paaa la�aedina WabSelect�la�ada�con�cloauao�d6dico0 cloauao�de�calcio0 o �cloauao de marnedioa�pH�,0�

Tamp6n de�eluci6n

Conc.�de�NaCl de�eluci6n�pmW) Conc.�de excipiente de�la�ado pmW) Excipiente�de la�ado

NaCl

CaCl2 WrCl2

HCP�pppm)

Glicina 50 mM

10 100 46.800 28.500 30.800

HEPES 25 mM

250 35.300 17.900 22.000

arginina 100 mM

500 40.900 17.700 18.400

Glicina 50 mM

1000 34.300 12.600 14.200

HEPES 25 mM

1500 37.000 7.800 10.700

arginina 100 mM

2000 43.900 5.800 9.300

Tabla ,: �aaloaed�de�HCP�paaa la�aedina WabSelect�la�ada�con�cloauao�d6dico0 cloauao de�calcio0 o �cloauao de marnedio a pH�:05

Tamp6n de�eluci6n

Conc.�de�NaCl de�eluci6n�pmW) Conc.�de excipiente de�la�ado pmW) Excipiente�de la�ado

NaCl

CaCl2 WrCl2

HCP�pppm)

Glicina 50 mM

100 100 27.900 17.900 21.800

HEPES 25 mM

250 24.700 16.600 18.200

arginina 100 mM

500 26.500 14.000 17.300

Glicina 50 mM

1000 30.100 14.500 17.700

HEPES 25 mM

1500 35.300 12.000 12.500

arginina 100 mM

2000 41.700 8.200 11.700

Los resultados mostraron que tanto el cloruro de calcio como el cloruro de magnesio reducian el nivel de HCP en la combinacion de pico del Mab-Select en comparacion con el cloruro sodico a pH 6,0 (Tabla 5) y el pH 7,5 (Tabla 6).

EJEMPLO 5: Eliminacion de las especies con menos enlaces disulfuro (UDB)

En este ejemplo, se examino la capacidad del lavado con CaCl2 para eliminar las especies con menos enlaces disulfuro (UDB).

Se realizaron dos ciclos de rmp Protein A Sepharose™ FF basicamente como se describe en el ejemplo 1.

Dimensiones de la columna -1,0 cm x 11,4 cm Caudal operativo -150 cm/hr Equilibrado 1 -Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (5 volumenes de columna) Lavado abundante - Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (1 volumen de columna) Lavado 1 - Acetato 50 mM, CaCl2 2,0 M, pH 5,0 para el ciclo 1; ninguno para el ciclo 2 Lavado 2 - Tris 20 mM, NaCl 1,0 M, pH 7,5 (5 volumenes de columna) Lavado 3 - Tris 10 mM, NaCl 75 mM, pH 7,5 (7 volumenes de columna) Elucion - Glicina 50 mM, NaCl 75 mM, pH 3,1 (6 volumenes de columna) Regeneracion 1 - citrato sodico 20 mM, pH 2,7 (5 volumenes de columna) Regeneracion 2 - guanidina HCl 6 M (2 volumenes de columna) Lavado de regeneracion - Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (5 volumenes de columna) Almacenamiento - Etanol al 16% (5 volumenes de columna) Temperatura del ciclo: 2°C-8°C

Las columnas rmp Protein A Sepharose FF Se equilibraron con 5 volumenes de columna de Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. A continuacion se cargaron las columnas a una carga de aproximadamente 10 mg de producto/ml de resina. Esto fue seguido de lavado abundante de 1 volumen de columna con tampon de equilibrado y a continuacion 5 volumenes de columna de solucion de Lavado 1. Esta solucion de Lavado 1 consistio en acetato 50 mM, CaCl2 2,0 M, pH 5,0 para el ciclo 1, mientras que se omitio completamente para el ciclo 2. A continuacion, el Lavado 1 fue seguido de 5 volumenes de columna de Tris 20 mM, NaCl 1,0 M, pH 7,5 y 7 volumenes de columna de Tris 10 mM, NaCl 75 mM, pH 7,5. El anticuerpo monoclonal se eluyo desde la columna rmp Protein A Sepharose™ FF con glicina 50 mM, NaCl 75 mM, pH 3,1. A continuacion, se neutralizo la combinacion de productos a 7,8-8,2 con Tris 2 M pH 8,5. A continuacion, las columnas se regeneraron, se lavaron y se almacenaron. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla�::%�de�BDa�paaa�lad�muedtaad�la�adad�con�y�din�calcio

n°�de�ciclo

Wuedtaa % de�BD�

1

Acetato 50 mM, CaCl2 2,0 M, pH 5,0 9,5

2

Ninguno (Testigo) 20,8

Se observo una reduccion 2 veces mayor en los niveles de UDB para el ciclo que tenia el lavado adicional con acetato 50 mM, CaCl2 2,0 M, pH 5,0.

EJEMPLO 6: Eliminacion de HCP e IRT con lavados con otras sales de cationes divalentes

En este ejemplo, se examino la capacidad de los lavados que contenian MnCl2 o NiCl2 para eliminar las impurezas de una preparacion que contenia el anticuerpo monoclonal anti-Ar AAB.

Se realizaron dos ciclos para evaluar el efecto de los lavados que contenian otras sales de cationes divalentes tales como MnCl2 y NiCl2. Se realizaron tambien dos ciclos testigo -uno mediante lavado con Tris 50 mM,

NaCl 1,0 M, pH 7,5 (sin eliminacion esperada de IRT o HCP) y otro mediante lavado con Tris 50 mM, CaCl2 2,0 M, pH 7,5.

Se purifico a pequena escala el cultivo que contenia el anticuerpo monoclonal, utilizando una columna MabSelect Protein A (9 ml) conectada a un sistema de cromatografia GE Healthcare AKTA FPLC. Los ciclos de MabSelect se realizaron como se describe a continuacion. Como se describe a continuacion, todos los parametros operativos eran identicos para los cuatro ciclos salvo para el Lavado 1, que fue variable (Tabla 8).

Dimensiones de la columna -1,0 cm x 11,5 cm (9 ml)

Caudal operativo - 300 cm/h (Equilibrado, Lavado 2, Elucion, Regeneracion, Almacenamiento)

Caudal operativo -230 cm/h (Carga, Lavado abundante, Lavado 1)

Equilibrado 1 -Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (5,0 volumenes de columna)

Lavado 1 - Variable (Vease la Tabla 8 para la composicion)

Lavado 2 - Tris 50 mM, NaCl 10 mM, pH 7,5 (5 volumenes de columna)

Elucion - Glicina 50 mM, NaCl 10 mM, pH 3,0 (3 volumenes de columna)

Regeneracion - NaOH 50 mM, Na2SO4 0,5 M (5 volumenes de columna)

Almacenamiento - Etanol al 16%, Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (5 volumenes de columna)

Temperatura del ciclo: 18°C-24°C

Se equilibro la columna MabSelect Protein A con 5 volumenes de columna de Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. La columna se cargo a aproximadamente 40 mg de producto/ml de resina. La carga restante se elimino de la columna con 5 volumenes de columna de Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. A continuacion se lavo la columna con una de las soluciones descritas en la Tabla 11. Antes de la elucion, se lavo la columna con 5 volumenes de columna de Tris 50 mM, NaCl 10 mM, pH 7,5. El producto se eluyo desde la columna MabSelect Protein A con glicina 50 mM, NaCl 10 mM, pH 3,0. La combinacion de productos se neutralizo a pH 8,0 con Tris 2 M pH 9,0. La columna se regenero con 5 volumenes de columna de NaOH 50 mM, Na2SO4 0,5 M, a continuacion se almaceno con 5 volumenes de columna de etanol al 16%, Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. Los resultados se muestran en la Tabla 8 (eliminacion de HCP) y en la Tabla 9 (eliminacion de IRT).

Tabla �: Eliminaci6n de�HCP �con�di�eadad�dolucioned�de la�ado

n°�de�ciclo

Condici6n del�La�ado1 HCP�pPPW)

1

Tris 50 mM, NaCl 1,0 M, pH 7,5 17.600

2

acetato sodico 50 mM, MnCl2 1,5 M, pH 5,0� 10.600

3

acetato sodico 50 mM, NiCl2 1,5 M, pH 5,0� 4,700

4

Tris 50 mM, CaCl2 2,0 M, pH 7,5 6.500

� se eligio un pH 5,0 debido a la solubilidad del MnCl2 y del NiCl2

Tabla �: �Eliminaci6n �de IRT con�di�eadad dolucioned �de la�ado

n°�de�ciclo

Condici6n del�La�ado1 IRT�p%)

1

Tris 50 mM, NaCl 1,0 M, pH 7,5 2,78

2

acetato sodico 50 mM, MnCl2 1,5 M, pH 5,0� 0,77

3

acetato sodico 50 mM, NiCl2 1,5 M, pH 5,0� 0,47

4

Tris 50 mM, CaCl2 2,0 M, pH 7,5 0,87

� se eligio un pH 5,0 debido a la solubilidad del MnCl2 y del NiCl2

La Tabla 8 muestra que el nivel de HCP presentes en los ciclos que fueron lavados con soluciones que contenian cationes divalentes tenia 1,5-3,5 veces menos HCP que el testigo (lavado con NaCl 1,0 M). La Tabla 9 muestra que los ciclos que contenian los lavados con soluciones de sales de cationes divalentes tambien proporcionaban una eliminacion de IRT � 3,5 veces mayor en comparacion con el ciclo con soluciones de lavado que contenian NaCl 1,0 M. Por lo tanto, estos resultados demostraron que los lavados con sales con otros cationes divalentes (por ejemplo, con MnCl2 o NiCl2), diferentes de CaCl2, tambien eran eficaces en la eliminacion de impurezas.

Equivalentes Los expertos en la materia reconoceran, o seran capaces de determinar, mediante tan solo una experimentacion rutinaria, muchos equivalentes a las formas de realizacion especificas de la invencion descritas en el presente documento. Tales equivalentes pretenden quedar abarcados por las siguientes reivindicaciones.

LISTADO DE SECUENCIAS

�110� Neuralab Limited, et al.

�120� METODOS DE PURIFICACION DE ANTICUERPOS ANTI A BETA �130� ELN-053PC

�150� 60/691,821 �151� 2005-06-17

�160� 47

�170� Patente en version 3.3

�210� 1 �211� 219 �212� PRT �213� Secuencia Artificial

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Constructo Sintetico �400� 1 �210� 2 �211� 449

�212� PRT �213� Secuencia Artificial

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Constructo Sintetico �400� 2

�210� 3 �211� 113 �212� PRT �213� Secuencia Artificial

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�220� �221� MOD�RES �222� (1) �223� Asp o Tyr

�220� �221� MOD�RES �222� (7) �223� Ser o Thr

�220� �221� MOD�RES �222� (10) �223� Ser o Thr

�220� �221� MOD�RES �222� (15) �223� Leu, Ile, o Val

�220� �221� MOD�RES �222� (50) �223� Arg o Lys �220� �221� MOD�RES �222� (88) �223� Val o Leu

�220� �221� MOD�RES �222� (109) �223� Val o Leu

�400� 3

�210� 4 �211� 119 �212� PRT �213� Secuencia Artificial

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�220� �221� MOD�RES �222� (3) �223� Gln, Lys, o Arg

�220� �221� MOD�RES �222� (78) �223� Ser o Thr

�220� �221� MOD�RES �222� (87) �223� Arg o Lys �220� �221� MOD�RES �222� (88) �223� Ala, Ser, o Thr

�220� �221� MOD�RES �222� (114) �223� Leu, Thr, Ile, o Val

�400� 4

�210� 5 �211� 113 �212� PRT �213� Secuencia Artificial

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 5 �210� 6 �211� 119 �212� PRT �213� Secuencia Artificial

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 6 �210� 7 �211� 219 �212� PRT �213� Secuencia Artificial

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 7

�210� 8 �211� 449 �212� PRT �213� Secuencia Artificial

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 8

�210� 9 �211� 113 �212� PRT �213� Secuencia Artificial

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�220� �221� MOD�RES �222� (3) �223� Val o Leu

�220� �221� MOD�RES �222� (7) �223� Ser o Thr

�220� �221� MOD�RES �222� (14) �223� Thr o Ser

�220� �221� MOD�RES �222� (17) �223� Gln, Asp, o Asn

�220� �221� MOD�RES �222� (30) �223� Ile o Val

�220� �221� MOD�RES �222� (50) �223� Arg o Lys

�220� �221� MOD�RES �222� (88) �223� Val o Leu �220� �221� MOD�RES �222� (105) �223� Gly o Ala

�220� �221� MOD�RES �222� (109) �223� Val o Leu

�400� 9

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�220� �221� MOD�RES �222� (1) �223� Gln o Glu

�220� �221� MOD�RES �222� (2) �223� Val o Ala �220� �221� MOD�RES �222� (64) �223� Ser o Thr

�220� �221� MOD�RES �222� (77) �223� Lys o Arg

�220� �221� MOD�RES �222� (78) �223� Ser o Thr

�220� �221� MOD�RES �222� (83) �223� Thr o Ser

�220� �221� MOD�RES �222� (84) �223� Met, Ile, o Leu

�220� �221� MOD�RES �222� (86) �223� Asn, Ser, o Thr

�220� �221� MOD�RES �222� (87) �223� Met, Val, o Leu

�220� �221� MOD�RES �222� (118) �223� Leu o Ser

�400� 10 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 11 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 12 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 13

�210� 14 �211� 453 �212� PRT �213� Secuencia Artificial

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 14

�210� 15 �211� 132 �212� PRT �213� Secuencia Artificial

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�220� �221� SE�AL �222� (1)..(20)

�220� �221� mat�peptido �222� (21)..(132)

�400� 15

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�220� �221� SE�AL �222� (1)..(19)

�220� �221� mat�peptido �222� (20)..(142)

�400� 16

�220� �221� SE�AL �222� (1) .. (19)

�220� �221� mat�peptido �222� (20)..(131)

�400� 17 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�220� �221� SE�AL �222� (1)..(19)

�220� �221� mat�peptido �222� (20)..(142)

�400� 18 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�220� �221� SE�AL �222� (1)..(19)

�220� �221� mat�peptido �222� (20)..(142)

�400� 19 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 20 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 21 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 22 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 23 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 24

�210� 25 �211� 120 �212� PRT �213� Secuencia Artificial

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 25 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 26 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 27

�210� 28 �211� 120 �212� PRT �213� Secuencia Artificial

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 28 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 29 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 30 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 31 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 32 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 33 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 34

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 35 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 36 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 37

�210� 38 �211� 120 �212� PRT �213� Secuencia Artificial

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 38 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 39 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 40

�210� 41 �211� 120 �212� PRT �213� Secuencia Artificial

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 41 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�220� �221� MOD�RES �222� (2) �223� Val o Ile

�220� �221� MOD�RES �222� (7) �223� Ser o Thr

�220� �221� MOD�RES �222� (14) �223� Thr o Ser

�220� �221� MOD�RES �222� (15) �223� Leu o Pro

�220� �221� MOD�RES �222� (30) �223� Ile o Val

�220� �221� MOD�RES �222� (50) �223� Arg, Gln, o Lys �220� �221� MOD�RES �222� (88) �223� Val o Leu

�220� �221� MOD�RES �222� (105) �223� Gln o Gly

�220� �221� MOD�RES �222� (108) �223� Lys o Arg

�220� �221� MOD�RES �222� (109) �223� Val o Leu �400� 42

�220�

�223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�220� �221� MOD�RES �222� (1) �223� Glu o Gln

�220� �221� MOD�RES �222� (7) �223� Ser o Leu

�220� �221� MOD�RES �222� (46) �223� Glu, Val, Asp, o Ser

�220� �221� MOD�RES �222� (63) �223� Thr o Ser

�220� �221� MOD�RES �222� (75) �223� Ala, Ser, Val, o Thr

�220� �221� MOD�RES �222� (76) �223� Lys o Arg

�220� �221� MOD�RES �222� (89) �223� Glu o Asp

�220� �221� MOD�RES �222� (107) �223� Leu o Thr

�400� 43 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 44

�210� 45 �211� 112 �212� PRT �213� Secuencia Artificial

�220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 45 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 46 �220� �223� Descripcion de Secuencia Artificial: Anticuerpo Sintetico Humanizado

�400� 47

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Metodo para purificar un anticuerpo anti-Ar que tiene una region Fc desde un liquido de partida que comprende el anticuerpo y una o mas impurezas, que comprende las etapas de:

   adsorber el anticuerpo a un agente de union a Fc que comprende una o mas de la Proteina A y la proteina G; lavar el agente de union a Fc con una solucion tampon que contiene CaCl2 a una concentracion de 0,5 M a 3 M para eliminar una o mas impurezas; y recuperar el anticuerpo desde el agente de union a Fc eluyendo el anticuerpo en un tampon de elucion con un pH en un intervalo comprendido entre 2 y 4.

2. 2.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicha una o mas impurezas estan seleccionadas del grupo que consiste en: especies de variantes de ultralectura de intrones (IRT), especies con menos enlaces disulfuro (UDB) y especies de bajo peso molecular (LMW).

3. 3.

   Metodo segun la reivindicacion 2, en el que dicha una o mas impurezas es una IRT.

4. 4.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo esta seleccionado del grupo que consiste en: una fusion de anticuerpos, un anticuerpo murino, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano.

5. 5.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-Ar humanizado.

   ,. Metodo segun la reivindicacion 5, en el que el anticuerpo anti-Ar humanizado esta seleccionado del grupo que consiste en:

   una version humanizada del anticuerpo 3D6 producido por la linea celular PTA-5130 depositada en la ATCC; una version humanizada del anticuerpo 10D5 producido por la linea celular PTA-5129 depositada en la ATCC; una version humanizada del anticuerpo 12A11 producido por la linea celular PTA-7271 depositada en la ATCC; una version humanizada del anticuerpo 266 producido por la linea celular PTA-6123 depositada en la ATCC; y una version humanizada del anticuerpo 15C11 producido por la linea celular PTA-7270 depositada en la ATCC.

   :. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo que tiene una region Fc se produce por recombinacion.

   �.

   Metodo segun la reivindicacion 7, en el que el anticuerpo que tiene una region Fc se produce por recombinacion en una celula de ovario de hamster chino (CHO).

   �.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el agente de union a Fc esta inmovilizado sobre una fase solida.

   1�. Metodo segun la reivindicacion 9, en el que la fase solida comprende una o mas de una perla, un gel, una resina, y una particula.

6. 11.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la solucion tampon que contiene el CaCl2 tiene un valor de pH en un intervalo comprendido entre 4 y 8.

7. 12.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la solucion tampon que contiene el CaCl2 tiene un valor de pH en un intervalo comprendido entre 7,3 y 7,7.

8. 13.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la solucion tampon tiene una concentracion de CaCl2 en un intervalo comprendido entre 1,5 M y 2,0 M.

9. 14.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la solucion tampon comprende CaCl2 2 M.

10. 15.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que las etapas de adsorcion del anticuerpo a un agente de union a Fc y lavado del agente de union a Fc se realizan a una temperatura en el intervalo comprendido entre 2°C y 24°C.

    1,. Metodo segun la reivindicacion 2, en el que la una o mas impurezas comprenden adicionalmente uno o mas de una proteina de la celula hospedadora, un ADN de la celula hospedadora, una proteina de cultivo celular, y mezclas de las mismas.

    1:. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa de recuperacion del anticuerpo desde el agente de union a Fc comprende eluir la proteina utilizando un tampon de elucion con un pH en un intervalo comprendido entre 2,5 y 3,5.

    1�. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el metodo comprende adicionalmente una etapa de cromatografia seleccionada del grupo que consiste en: cromatografia de intercambio anionico, cromatografia de intercambio cationico, cromatografia de afinidad por iones metalicos inmovilizados y cromatografia de interaccion hidrofoba (HIC).

    1�. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el metodo comprende adicionalmente una etapa de purificacion adicional seleccionada del grupo que consiste en: cromatografia con hidroxiapatita, dialisis, cromatografia de afinidad, precipitacion con sulfato de amonio, precipitacion con etanol, HPLC de fase inversa (RP-HPLC), y cromatofocalizacion.

    2�. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la una o mas impurezas comprenden una o mas variantes de ultralectura de intrones del anticuerpo y la solucion de elucion que contiene el anticuerpo tiene un nivel de variantes de ultralectura de intrones que es al menos 5 veces inferior al nivel de variantes de ultralectura de intrones en el liquido de partida.

11. 21.

    Metodo segun la reivindicacion 20, en el que una solucion que contiene el anticuerpo recuperado en la solucion de elucion tiene un nivel de variantes de ultralectura de intrones que es al menos 10 veces inferior al nivel de variantes de ultralectura de intrones en el liquido de partida.

12. 22.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la una o mas impurezas comprenden una o mas variantes de ultralectura de intrones del anticuerpo y las variantes de ultralectura de intrones comprenden menos de un 1% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

13. 23.

    Metodo segun la reivindicacion 22, en el que las variantes de ultralectura de intrones comprenden menos de un 0,8% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

14. 24.

    Metodo segun la reivindicacion 23, en el que las variantes de ultralectura de intrones comprenden menos de un 0,5% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

15. 25.

    Metodo segun la reivindicacion 24, en el que las variantes de ultralectura de intrones comprenden menos de un 0,2% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

    2,. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la una o mas impurezas comprenden una o mas especies de bajo peso molecular del anticuerpo y las especies de bajo peso molecular comprenden menos de un 1% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

    2:. Metodo segun la reivindicacion 26, en el que las especies de bajo peso molecular comprenden menos de un 0,8% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

    2�. Metodo segun la reivindicacion 27, en el que las especies de bajo peso molecular comprenden menos de un 0,5% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

    2�. Metodo segun la reivindicacion 28, en el que las especies de bajo peso molecular comprenden menos de un 0,2% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

    3�. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la una o mas impurezas comprenden uno o mas variantes con menos enlaces disulfuro del anticuerpo y las variantes con menos enlaces disulfuro comprenden menos de un 15% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

16. 31.

    Metodo segun la reivindicacion 30, en el que las variantes con menos enlaces disulfuro comprenden menos de un 10% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

17. 32.

    Metodo segun la reivindicacion 31, en el que las variantes con menos enlaces disulfuro comprenden menos de un 5% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

18. 33.

    Metodo segun la reivindicacion 32, en el que las variantes con menos enlaces disulfuro comprenden menos de un 2% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

19. 34.

    Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteina de union a Ar es un anticuerpo 3D6 humanizado que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:1 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de los restos 1-448 de la SEQ ID NO:2.

20. 35.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo es del isotipo IgM, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

    3,. Metodo segun la reivindicacion 35, en el que el anticuerpo es del isotipo IgG1 humano.