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CN103930557A - 利用发酵法制造目标物质的方法 - Google Patents

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CN103930557A
CN103930557A CN201280055558.9A CN201280055558A CN103930557A CN 103930557 A CN103930557 A CN 103930557A CN 201280055558 A CN201280055558 A CN 201280055558A CN 103930557 A CN103930557 A CN 103930557A
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山本洋子
山田和辉
横田康介
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Ajinomoto Co Inc
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Abstract

本发明提供一种利用发酵法制造目标物质的方法，所述方法通过在含有木糖作为碳源的培养基中培养具有生产作为目标物质的2-酮戊二酸或其衍生物的能力、具有由木糖生成木糖酸的能力、且可赋予或增强木糖酸脱水酶活性、2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶活性及2-酮戊二酸半醛脱氢酶活性的细菌，使目标物质在该培养基中生成蓄积并从该培养基中采集目标物质来制造目标物质。

Description

利用发酵法制造目标物质的方法
技术领域
本发明涉及一种利用使用微生物的发酵法制造L-氨基酸等目标物质的方法，详细而言，涉及一种以木糖作为原料并通过发酵法制造目标物质的方法。
背景技术
为了通过使用细菌的发酵法制造L-氨基酸等目标物质，有使用野生型细菌(野生株)的方法、使用由野生株衍生的营养缺陷株的方法、使用由野生株以各种药物抗性突变株的形式衍生的代谢调节突变株的方法、使用具有营养缺陷株和代谢调节突变株这两者的性质的菌株的方法等。
例如，L-谷氨酸主要通过使用属于短杆菌属、棒状杆菌属、微杆菌属的所谓的棒状杆菌型细菌的L-谷氨酸生产菌或它们的突变株的发酵法来制造(例如参照非专利文献1)。作为利用使用其它的菌株的发酵法制造L-谷氨酸的方法，已知有使用芽孢杆菌属、链霉菌属、青霉菌属等微生物的方法(例如参照专利文献1)、使用假单胞菌属、节杆菌属、沙雷氏菌属、假丝酵母属等微生物的方法(例如参照专利文献2)、使用芽孢杆菌属、产气气杆菌(现在为产气肠杆菌)等微生物的方法(例如参照专利文献3)、使用大肠杆菌的突变株的方法(例如参照专利文献4)等。另外，也公开有一种使用属于克雷伯氏菌属、欧文氏菌属或泛菌属、肠杆菌属的微生物制造L-谷氨酸的方法(例如参照专利文献5～7)。
近年来，目标物质的发酵生产使用重组DNA技术。例如通过增强编码L-氨基酸生物合成系酶的基因的表达(专利文献8、专利文献9)、或增强碳源向L-氨基酸生物合成体系流入(专利文献10)来提高细菌的L-氨基酸生产率。
历来在利用发酵法的物质的工业生产中是使用糖类，具体而言葡萄糖、果糖、蔗糖、废糖蜜、淀粉水解物等作为碳源，但价格较为高昂，近年来，也开展了源自植物的生物质原料等的使用。
作为这样的生物质原料，目前主要使用淀粉、油脂等可食用部分的原料，但将来需要向非可食用部分原料，具体而言为纤维素/半纤维素、木质素等转移。非非可食用部分的纤维素/半纤维素可以经过使用热或酸等的前处理工艺、利用纤维素酶的糖化处理工艺等转化为五碳糖、六碳糖等糖而用作发酵的原料(专利文献11、12)。在将这样的五碳糖、六碳糖的混合糖作为氨基酸发酵等的原料的情况下，已知大肠杆菌优先同化葡萄糖，结果，显示二阶段增殖(两期生长)，或确认到生长延迟的现象(非专利文献2、3)。
在大肠杆菌中，已知有利用xylA基因编码的木糖异构酶、xylB基因编码的木酮糖激酶的木糖同化途径，已知可导入到大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌中由木糖生产L-氨基酸(非专利文献5、专利文献13、非专利文献7)。
另一方面，报告在新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)或沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)中存在有不经由这些现有已知的途径、而是由木糖经由木糖酸通过5个阶段到达2-酮戊二酸的途径(非专Caulobacter crescentus利文献6)。另外，已知有在大肠杆菌中表达该途径的例子(非专利文献8、专利文献14)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第3,220,929号说明书
专利文献2：美国专利第3,563,857号说明书
专利文献3：日本特公昭32-9393号公报
专利文献4：日本特开平5-244970号公报
专利文献5：日本特开2000-106869号公报
专利文献6：日本特开2000-189169号公报
专利文献7：日本特开2000-189175号公报
专利文献8：美国专利第5,168,056号说明书
专利文献9：美国专利第5,776,736号说明书
专利文献10：美国专利第5,906,925号说明书
专利文献11：日本特表平9-507386号公报
专利文献12：日本特表平11-506934号公报
专利文献13：欧洲专利第1577396号说明书
专利文献14：美国专利第7,923,226号说明书
非专利文献
非专利文献1：明石邦彦等著，氨基酸发酵、学会出版中心、195～215页、1986年
非专利文献2：Nichols N.N.et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.2001Jul；56(1-2):120-125
非专利文献3：Gonzalez,R.,Biotechnol.Prog.2002Jan-Feb；18(1):6-20
非专利文献4：Song S.et al.,J.Bacteriol.1997Nov；179(22):7025-7032
非专利文献5：Tao H.,et al.,J.Bacteriol.2001May；183(10):2979-2988
非专利文献6：Stephens,C.et al.,J.Bacteriol.2007Mar；189(5):2181-2185
非专利文献7：Gopinath,V.et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.2011Jul28
非专利文献8：Huaiwei,L et al.,Bioresour Technol.2011Aug22
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于，提供一种可在含有木糖的培养基中高效地生产L-谷氨酸等目标物质的微生物、及使用该微生物制造目标物质的方法。
解决问题的手段
本发明人以选育具有五碳糖、六碳糖同化能力的氨基酸产生细菌为目的，利用由木糖经由木糖酸到2-酮戊二酸的途径对微生物的选育进行了研究。结果发现，表达该途径的微生物可高效地同化木糖，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
1.一种制造目标物质的方法，包括在含有木糖作为碳源的培养基中培养具有生产目标物质的能力的细菌而使目标物质在该培养基中生成蓄积，并从该培养基收集目标物质，其中，
所述目标物质为2-酮戊二酸或其衍生物，
所述细菌具有从木糖生成木糖酸的能力，且被赋予或增强了木糖酸脱水酶活性、2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶活性及2-酮戊二酸半醛脱氢酶活性。
2.如上所述的方法，其中，所述细菌通过以能够表达的形式导入分别编码木糖酸脱水酶、2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶及2-酮戊二酸半醛脱氢酶的基因而被赋予或增强了所述酶活性。
3.如上所述的方法，其中，编码木糖酸脱水酶、2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶及2-酮戊二酸半醛脱氢酶的基因来源于属于柄杆菌属(Caulobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、草螺菌属(Herbaspirillum)、游动放线菌属(Actinoplanes)、贪铜菌属(Cupriavidus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、卓贝尔氏黄杆菌属(Zobellia)、热杆菌属(Thermobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、盐单胞菌属(Halomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)或曲霉属(Asperillus)的微生物。
4.如上所述的方法，其中，所述细菌由于下述任一项特征而能够从木糖生成木糖酸：
(A)被赋予或增强了木糖脱氢酶活性、或木糖脱氢酶及木糖酸内酯酶活性；或
(B)具有能够催化从木糖生成木糖酸的反应的葡萄糖脱氢酶活性。
5.如上所述的方法，其中，所述葡萄糖脱氢酶以吡咯并喹啉醌作为辅酶，且所述细菌由于具有吡咯并喹啉醌生产能力或者由于在含有吡咯并喹啉醌的培养基中进行培养而具有葡萄糖脱氢酶活性。
6.如上所述的方法，其中，所述细菌由于以能够表达的形式导入了编码木糖脱氢酶的基因、或编码木糖脱氢酶及木糖酸内酯酶的基因而能够从木糖产生木糖酸。
7.如上所述的方法，其中，所述细菌还经过修饰而降低了2-酮戊二酸脱氢酶的活性。
8.如上所述的的方法，其中，所述细菌还经过修饰而降低了琥珀酸脱氢酶的活性。
9.如上所述的方法，其中，所述细菌为肠细菌或棒状杆菌型细菌。
10.如上所述的方法，其中，所述细菌为泛菌属(Pantoea)细菌。
11.如上所述的方法，其中，所述细菌为Pantoea ananatis。
12.如上所述的方法，其中，所述细菌为埃希氏菌属细菌。
13.如上所述的方法，其中，所述细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)。
14.如上所述的方法，其中，所述细菌为棒状杆菌属(Corynebacterium)细菌。
15.如上所述的方法，其中，所述细菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
16.如上所述的方法，其中，所述2-酮戊二酸衍生物为选自L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸、L-脯氨酸、腐胺及γ-氨基丁酸的物质。
附图说明
图1是表示利用icd基因缺陷株的源自新月柄杆菌的NXA操纵子表达株生长互补试验的结果的图，E1-αKG、M9-αKG、M9-Xyl、E1-Xyl分别表示含有2-酮戊二酸或木糖作为单一碳源的M9基础培养基及E1合成培养基。
图2是表示表达大肠杆菌ccrNXA操纵子的大肠杆菌L-谷氨酸产生细菌的L-谷氨酸生产培养的结果的图。
图3是表示利用以大肠杆菌固有的木糖同化途径缺陷株为宿主的ccrNXA操纵子表达株的L-谷氨酸生产培养的结果的图。
图4是表示利用中拷贝型载体的ccrNXA操纵子表达株的L-谷氨酸生产培养的结果的图；
图5是表示利用源自各种微生物的xylD同源基因表达株的L-谷氨酸生产培养的结果的图，Atu、Hse、Amis、Aor分别表示根癌土壤杆菌、织片草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)、米苏里游动放线菌(Actinoplanesmissouriensis)、米曲霉；
图6是表示利用源自各种微生物的xylX同源物表达株的L-谷氨酸生产培养的结果的图，Art、Atu、Cne、Zga、Tco、Selo分别表示球形节杆菌、根癌土壤杆菌、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、食半乳聚糖卓贝尔氏黄杆菌(Zobellia galactanivorans)、Thermobacillus composti、伊乐假单胞菌(Pseudomonas elodea)。
图7是表示利用源自各种微生物的xylA同源物表达株的L-谷氨酸生产培养的结果的图，Hbo、Abr分别表示玻利维亚盐单胞菌(Halomonas boliviensis)和巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)。
具体实施方式
本发明为一种一种制造目标物质的方法，包括在含有木糖作为碳源的培养基中培养具有生产目标物质的能力的细菌而使目标物质在该培养基中生成蓄积，并从该培养基收集目标物质，其中，
所述目标物质为2-酮戊二酸或其衍生物，
所述细菌具有从木糖生成木糖酸的能力，且被赋予或增强了木糖酸脱水酶活性、2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶活性及2-酮戊二酸半醛脱氢酶活性。
目标物质为2-酮戊二酸(α-酮戊二酸、αKG)或其衍生物。作为2-酮戊二酸的衍生物，可以举出：L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸、L-脯氨酸、腐胺及γ-氨基丁酸。
所谓“目标物质生产能力”是指当在培养基中培养用于本发明的细菌时具有以能够从细胞或培养基中回收上述目标物质的程度产生上述目标物质的能力。优选地，是指具有与在相同条件下培养的野生株或非修饰株相比，产生更大量的目标物质的能力。细菌可以具有2种以上的目标物质的产生能力。
另外，上述目标物质含有游离体及/或其盐，例如硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐、钾盐。
<1>本发明的细菌
本发明的细菌为具有由木糖生成木糖酸的能力，且被赋予或增强了木糖酸脱水酶活性、2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶活性及2-酮戊二酸半醛脱氢酶活性的细菌。
本发明的细菌可以为原本不具有木糖酸脱水酶活性、2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶活性及2-酮戊二酸半醛脱氢酶活性，但被赋予了这些酶活性的细菌，也可以为原本具有这些酶活性，而被增强了这些酶活性的细菌。
由木糖生成木糖酸的能力例如可通过以下的任一者或两者来实现：
1)赋予或增强木糖脱氢酶活性；或
2)具有可催化由木糖生成木糖酸的反应的葡萄糖脱氢酶活性。
作为符合1)的微生物，可以举出：埃希氏菌属细菌、棒状杆菌型细菌，作为符合2)的微生物，可以举出：泛菌属细菌等。
关于1)，在木糖脱氢酶活性的基础上，还可以增强木糖酸内酯酶。
属于各属的细菌在后文中描述。
由木糖生成的木糖酸可利用木糖酸脱水酶、2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶及2-酮戊二酸半醛脱氢酶转化为2-酮戊二酸。利用木糖酸脱水酶、2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶及2-酮戊二酸半醛脱氢酶到2-酮戊二酸的途径也称为Weimberg途径(J.Biol.Chem.,236:629-636)。在本说明书中，有时将Weimberg途径及除Weimberg途径以外通过木糖脱氢酶及/或木糖酸内酯酶由木糖到木糖酸的途径统称为NXA(新的木糖同化)途径。
细菌是否具有Weimberg途径或是否导入有Weimberg途径可通过测定细菌提取物的木糖酸脱水酶、2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶及2-酮戊二酸半醛脱氢酶的酶活性，或者确认该细菌可同化木糖酸(在未保持Weimberg途径的菌株中木糖酸会蓄积)来加以确定。另外，细菌是否NXA保持途径或是否导入有NXA途径可以通过在上述各酶的基础上还测定木糖脱氢酶及/或木糖酸内酯酶的酶活性来确定。另外，这些酶活性也可以通过测定由木糖生成的木糖酸来确定。
在本发明中，所谓木糖酸脱水酶(xylonate dehydratase)是可逆地催化以下反应的酶(EC4.2.1.82)，也称为D-木-糖醛酸脱水酶(D-xylo-aldonatedehydratase)、D-木糖酸脱水酶(D-xylonate dehydratase)和D-木糖酸水裂合酶(D-xylonate hydro-lyase)。
D-木糖酸→2-脱氢-3-脱氧-D-木糖酸+H2O
木糖酸脱水酶活性例如可以通过以下操作测定：在混合D-木糖酸溶液和受试试样使其反应后，加入包含1％盐酸氨基脲(semicarbazide hydrochloride)水溶液和1.5％乙酸钠水溶液的反应停止液而停止反应，测定稀释液的250nm处的吸收(Dahms,A.S.,et al.,Methods Enzymol.1982；90Pt E:302-5)。
在本发明中，所谓2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶(2-keto-3-deoxy-xylonatedehydratase)为可逆地催化以下的反应的酶(EC4.2.1.-)。
2-脱氢-3-脱氧-D-木糖酸→2-酮戊二酸半醛+H2O
2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶活性例如可以通过以下操作测定：在混合作为底物的2-酮-3-脱氧木糖酸溶液和受试试样使其反应后，测定2-酮-3-脱氧木糖酸的减少。
在本发明中，所谓2-酮戊二酸半醛脱氢酶(2-酮戊二酸半醛脱氢酶)为可逆地催化以下的反应的氧化还原酶(EC1.2.1.26)。
2-酮戊二酸半醛+NAD(P)→2-酮戊二酸+NAD(P)H
2-酮戊二酸半醛脱氢酶活性例如可通过测定NAD(P)的还原来测定活性。例如可以通过在焦磷酸(pH8.5)、NAD(P)和受试试样的混合液中加入2-酮戊二酸半醛，并测定340nm处的吸收，来测定该酶的活性(Adams,E.,et al,(1967)J.Biol.Chem.242,1802-1814)。
木糖脱氢酶(D-木糖-1-脱氢酶、D-xylose1-dehydrogenase)为戊糖和葡糖醛酸的相互转化酶之一，是可逆地催化以下反应的氧化还原酶(EC1.1.1.175)。
D-木糖+NAD(P)+→D-木糖酸内酯+NAD(P)H+H+
D-木糖-1-脱氢酶活性例如可以通过以下的操作测定：混合木糖、受试试样及NAD(P)使其反应，测定340nm处的吸收(Stephens,C.et al.,J.Bacteriol.,2007,189(5):181-2185)。
新月柄杆菌的木糖脱氢酶可催化D-木糖→木糖酸的活性。
在本发明中，所谓木糖酸内酯酶(xylonolactonase)为可逆地催化以下的反应的酶(EC3.1.1.68)。
D-木糖酸内酯→D-木糖酸
木糖酸内酯酶活性例如可以通过混合木糖酸内酯和受试试样使其反应，利用氧肟酸盐法定量残留的木糖酸内酯来测定(Appl.Microbiol.Biotechnol.,29:375-379,1988；Appl.Microbiol.,Biotechnol.,27:333-336,1988)。
编码木糖酸脱水酶、2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶及2-酮戊二酸半醛脱氢酶各酶的基因只要是具有Weimberg途径的微生物的即可，例如可以举出：源自属于柄杆菌属(Caulobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、土壤杆菌(Agrobacterium)属、草螺菌属(Herbaspirillum)、游动放线菌属(Actinoplanes)、贪铜菌属(Cupriavidus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、卓贝尔氏黄杆菌属(Zobellia)、热杆菌属(Thermobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、盐单胞菌属(Halomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)等的细菌、或属于曲霉属(Aspergillus)的丝状真菌等微生物的基因。
作为柄杆菌属细菌，可以举出新月柄杆菌。
作为新月柄杆菌，已知有CB-15株、CB-13株，分别作为ATCC19089、ATCC33532保存于美国典型培养物保藏中心(地址P.O.Box1549Manassas,VA20108,美国)。另外，也可使用NA-1000株(J.Bacteriol.,192:3678-88(2010))、K31菌株。
新月柄杆菌CB15株、NA1000株、K31株的基因组序列分别登录为GeneBank Accession Nos.AE005673、CP001340、CP000927。
源自新月柄杆菌CB15株、NA1000株及K31株的各酶的基因在Genebank中以下述的基因符号登录。
表1
另外，源自新月柄杆菌的木糖脱氢酶基因及2-酮戊二酸半醛脱氢酶基因有时分别记为ccrxylB、ccrxylA。
进而，作为NXA途径(新的木糖同化)的酶，除柄杆菌属以外，例如可以举出：红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)[里氏木霉(Trichoderma ressei)]的木糖脱氢酶(FEMS Microbiol Lett.277,249-254(2007)；枯草芽孢杆菌的ycbD(2-酮戊二酸半醛脱氢酶,类型III)；恶臭假单胞菌的2-酮戊二酸半醛脱氢酶,类型II、巴西固氮螺菌的2-酮戊二酸半醛脱氢酶，类型I、类型II、类型III(以上参考J.Bac.Chem.,282,6685-6695,2007)及它们的同源物。
特别是，关于木糖酸脱水酶，可以使用埃希氏菌属细菌例如大肠杆菌的yjhG基因、yagF基因。大肠杆菌的yjhG基因示于SEQ ID NO:34，yagF基因示于SEQ ID NO:36。另外，关于木糖酸脱水酶，可以使用属于土壤杆菌属、草螺菌属、游动放线菌属、曲霉属的微生物，例如根癌土壤杆菌、织片草螺菌、米苏里游动放线菌、米曲霉的xylD基因同源物。
另外，关于2-酮-3-脱氧木糖酸脱氢酶，可以使用属于土壤杆菌属、假单胞菌属、卓贝尔氏黄杆菌属属、热杆菌属、节杆菌属的细菌，例如根癌土壤杆菌A、钩虫贪铜菌、伊乐假单胞菌、食半乳聚糖卓贝尔氏黄杆菌、Thermobacillus composti、球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)的xylX基因同源物。
此外，关于2-酮戊二酸半醛脱氢酶，可以使用属于固氮螺菌属、盐单胞菌属、芽孢杆菌属的细菌的基因，例如巴西固氮螺菌、玻利维亚盐单胞菌的xylA基因同源物、或枯草芽孢杆菌的ycbD。
上述的各基因的碱基序列及它们编码的氨基酸序列示于表11。
如后所述，在新月柄杆菌中，NXA途径的5个酶的基因具有操纵子结构。相同操纵子的碱基序列以AAK22808_Caulobacter_crescentus的登录号登录于Genebank。SEQ ID NO:23表示该操纵子的碱基序列。该操纵子编码的2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶、2-酮戊二酸半醛脱氢酶、木糖脱氢酶及木糖酸内酯酶的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:24～27。另外，该操纵子中的xylD基因的碱基序列及由其编码的木糖酸脱水酶的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:28及29。SEQ ID NO:28的碱基序列相当于SEQ ID NO:23的5509～7296位。
另外，xylX的起始密码子有人提出有两处，但在SEQ ID NO:23中，将1175～1177位记为起始密码子。xylD的起始密码子也有人提出有两处，可以将SEQ ID NO:28的1～3位或者13～15位用作起始密码子。在13～15位为起始密码子的情况下，SEQ ID NO:29的木糖酸脱水酶的氨基酸序列从5位的Leu开始。
葡萄糖脱氢酶原本为可逆地催化以下的反应的酶(EC1.1.1.119)，所谓“可催化由木糖生成木糖酸的反应的葡萄糖脱氢酶”是指可以通过以吡咯并喹啉醌作为辅酶来将D-木糖转化为D-木糖酸内酯的酶。
β-D-葡萄糖+NADP→D-葡萄糖酸-1,5-内酯+NADPH+H+
吡咯并喹啉醌可以利用微生物原本具有的能力生产，也可以添加到培养基中(Appl Environ Microbiol.2009May；75(9)2784-2791)。
在本发明中，作为生产2-酮戊二酸或其衍生物的细菌，优选预先使2-酮戊二酸的分解途径弱化或者消失。作为2-酮戊二酸的分解途径的弱化或消失，优选预先使α-酮戊二酸脱氢酶及/或琥珀酸脱氢酶的活性弱化或者消失。在本发明中，所谓α-酮戊二酸脱氢酶(以下，有时称为“α-KGDH”)活性是指催化将α-酮戊二酸(2-氧戊二酸)氧化脱碳酸而生成琥珀酰-CoA(succinyl-CoA)的反应的活性。上述反应可通过α-KGDH(E1o：α-酮戊二酸脱氢酶,EC:1.2.4.2)、二氢硫辛酰胺S-琥珀酰转移酶(E2o：dihydrolipoamide-S-succinyltransferase；EC:2.3.1.61)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3：dihydrolipoamide dehydrogenase；EC:1.8.1.4)3种酶催化。即，这3种亚单位分别催化以下的反应，将催化合并这3个反应的反应的活性称为α-KGDH活性。α-KGDH活性的确认可以通过Shiio等的方法(Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda,Agric.Biol.Chem.,44(8),1897-1904,1980)测定。
E1o:2-氧戊二酸+[二氢硫辛酰胺赖氨酸残基琥珀酰转移酶]硫辛酰赖氨酸＝[二氢硫辛酰赖胺酸残基琥珀酰转移酶]S-琥珀酰二氢硫辛酰赖氨酸+CO2
E2o：CoA+酶N6-(S-琥珀酰二氢硫辛酰)赖氨酸＝琥珀酰-CoA+酶N6-(二氢硫辛酰)赖氨酸
E3:蛋白质N6-(二氢硫辛酰)赖氨酸+NAD+＝蛋白质N6-(硫辛酰)赖氨酸+NADH+H+
需要说明的是，α-KGDH也称为氧戊二酸脱氢酶(oxoglutaratedehydrogenase)、2-氧戊二酸脱氢酶(2-oxoglutarate dehydrogenase)。
在肠杆菌科例如Pantoea ananatis中，该3种具有各自的酶活性的亚单位蛋白质形成复合物。然后，各亚单位分别被sucA、sucB及lpd编码，sucA、sucB基因存在于琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白基因(sdhB)的下游(美国专利第6,331,419号)。另外，美国专利第6,331,419号中将这些基因记为成团肠杆菌AJ13355的基因，但该菌株后来被重新分类为Pantoea ananatis。
作为编码肠道细菌的α-KGDH的基因，在EP2100957A1中公开有Pantoeaananatis的sucA、sucB及存在于下游的sucC基因的碱基序列及各亚单位的氨基酸序列。另外，Genebank NP_415254、NP_415255中分别公开有编码大肠杆菌的α-KGDH的sucA、sucB及sucC基因。
另外，在棒状杆菌型细菌中，E1o亚单位被odhA基因(也称为sucA基因，作为GeneBank Accession No.NC_003450的NCgl1084登录)编码，E3亚单位由lpd基因(GeneBank Accession No.Y16642)编码。另一方面，推测E2o亚单位与E1o亚单位一起作为双功能性蛋白质被odhA基因编码(参考Usuda et al.,Microbiology1996142,3347-3354)、或者被作为不同于odhA基因的作为GeneBank Accession No.NC_003450的NCgl2126登录的基因编码。因此，在本发明中，odhA基因可以是编码E1o亚单位的基因，还可以同时编码E2o。
在EP2100957A1中公开有乳发酵短杆菌的odhA基因的碱基序列及E1o亚单位的氨基酸序列(WO2006/028298)、上述GeneBank Accession No.NC_003450的NCgl2126的碱基序列及该序列所编码的E2o亚单位的氨基酸序列、及上述GeneBank Accession No.NC_003450的NCgl1084的碱基序列及该序列所编码的E1o亚单位的序列。
在本发明中，有时将编码各α-KGDH亚单位的基因及含有它们的基因簇统称为“编码α-KGDH的基因”。
琥珀酸脱氢酶(以下有时记为“SDH”)为可逆地催化EC:1.3.99.1的以下的反应的酶。在本发明中，所谓SDH活性是指催化该反应的活性。
琥珀酸+FAD→富马酸+FADH2
SDH根据微生物种的不同，由3个或4个亚单位结构构成，可以通过进行修饰以使其中至少一种蛋白质无法正常地发挥来使活性降低或缺失。具体而言，SDH由以下的亚单位(括弧内为编码亚单位的基因名)构成，根据生物种的不同，有单独由sdhC或者由sdhC和sdhD编码膜锚定蛋白质的情况。
SDHA：黄素蛋白质亚单位(sdhA)
SDHB：Fe-S蛋白质亚单位(sdhB)
SDHC：膜锚定蛋白质(sdhC)
SDHD：膜锚定蛋白质(sdhD)
另外，SDH亚单位复合物有时具有SDH和富马酸还原酶两者的活性。例如，棒状杆菌型细菌的SDH亚单位复合物具有SDH和富马酸还原酶两者的活性(WO2005/021770)。
SDH活性的确认可以通过以2,6-二氯靛酚(DCIP)的还原为指标测定来进行。具体的方法记载于Tatsuki Kurokawa and Junshi Sakamoto,Arch Microbiol(2005)183:317-324。
在本发明中，有时将编码SDH亚单位各自的基因及含有它们的操纵子统称为“编码SDH的基因”。
在WO2008/075483中公开有Pantoea ananatis的基因的碱基序列及各亚单位作为编码肠细菌的SDH的基因。
作为编码棒状杆菌型细菌的SDH的基因，例如公开有谷氨酸棒状杆菌的sdh操纵子(GeneBank Accession No.NCgl0359(sdhC)NCgl0360(sdhA)NCgl0361(sdhB))、及黄色短杆菌的sdh操纵子(日本特开2005-095169号、EP1672077A1、WO2008/075483)的序列。
为了使α-KGDH、SDH的活性降低或缺陷，可以应用后述的关于降低催化从L-谷氨酸的生物合成途径中分支而生成其它的化合物的反应的酶的活性的方法。
进而，本发明的微生物的将木糖摄取到细胞内的酶的活性可以是得到增强的。
作为将木糖摄取到细胞内的酶，可以举出D-木糖透性酶，作为编码D-木糖透性酶的基因，可以举出xylE基因。将编码D-木糖透性酶的源自大肠杆菌的xylE基因的碱基序列及该基因编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:30、31。
进而，作为本发明的微生物，优选预先使木糖异构酶(xylA)及/或木酮糖激酶(xylB)弱化。大肠杆菌的木糖异构酶(xylA)、木酮糖激酶(xylB)基因分别公开于NC000913.1gi:16131436、16131435。
此外，在本发明中，木糖酸有时在培养基中蓄积，在大肠杆菌中，特别优选进一步增强木糖酸脱水酶的活性。例如，活性优选增强10μmol/min/mg蛋白质以上，优选15μmol/min/mg蛋白质以上，进一步优选17μmol/min/mg蛋白质以上。
下面说明对微生物赋予目标酶的活性或增大微生物的目标酶的活性的方法。
在微生物原本不具有目标酶的活性的情况下，可以通过将编码该酶的基因导入到该微生物中来赋予相同酶活性。而在微生物具有目标酶的活性的情况下，可以通过导入编码目标酶的外来基因、增大编码目标酶的内源性的基因的拷贝数、或修饰目标酶基因的表达控制序列(如启动子等)等而增大该基因的表达量，来增大目标酶活性。在本发明中，所谓“导入目标酶基因”不仅包括向原本不具有目标酶活性的微生物中导入目标酶基因，而且也包括在具有该酶活性的微生物中导入外来基因、以及在具有目标酶活性的微生物中导入内源性基因来增大内源性的目标酶基因的表达量。
为了导入目标酶基因，例如将该基因克隆到适当的载体上，使用得到的载体转化宿主微生物。
作为用于转化的载体，可以举出能够在使用的微生物中自主复制的质粒。例如，作为能够在属于肠道细菌群的微生物中自主复制的质粒，可以举出：pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29、pTWV228、pTWV229(pHSG、pSTV、pTWV可从Takara-bio公司获得)、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218(pMW可从Nippongene公司获得)等。另外，作为棒状杆菌型细菌用的质粒，可以举出：pAM330(日本特开昭58-67699号公报)、pHM1519(日本特开昭58-77895号公报)、pSFK6(参照日本特开2000-262288号公报)、pVK7(美国专利申请公开说明书2003-0175912)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(日本特开昭58-192900号公报)、pCG1(日本特开昭57-134500号公报)、pCG2(日本特开昭58-35197号公报)、pCG4、pCG11(日本特开昭57-183799号公报)、pHK4(日本特开平5-7491号公报)等。
作为转化法，例如可以举出：关于大肠杆菌K-12所报告那样的用氯化钙处理受体菌细胞来增加DNA的透过性的方法(Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.1970,53,159-162)、关于枯草芽孢杆菌所报告那样的从增殖阶段的细胞制备感受态细胞并导入DNA的方法(Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E..,1997.Gene1:153-167)等。或者，也可应用关于枯草芽孢杆菌、放线菌类及酵母已知那样的在容易导入重组DNA的原生质体或原生质球的状态下将DNA受体菌的细胞的重组DNA导入DNA受体细菌的方法(Chang,S.andChoen,S.N.,1979.Mol.Gen.Genet.168:111-115；Bibb,M.J.,Ward,J.M.andHopwood,O.A.1978.Nature274:398-400；Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.1978.Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1929-1933)。另外，也可以通过电脉冲法(日本特开平2-207791号公报)来进行微生物的转化。
另外，目标酶基因的导入也可通过向宿主微生物中的染色体上导入来实现。为了在微生物的染色体上导入目标酶基因，也可使用转座子或Mini-Mu随机地导入到染色体上的方法(日本特开平2-109985号公报、US5,882,888、EP805867B1)，将以多拷贝存在于染色体DNA上的序列用作靶标通过同源重组来进行。作为多拷贝存在于染色体DNA上的序列，可利用重复DNA、转座因子的端部存在的反向重复序列。或者，也可通过使用Red驱动整合法(WO2005/010175)将目标基因导入到染色体上。另外，也可通过使用P1噬菌体等噬菌体的转导或利用接合转移载体向染色体上导入目标基因。另外，如WO03/040373中所记载的那样，也可将目标物质生产所不需要的基因作为靶导入目标酶基因。可以采用这样的方法向靶序列导入一个拷贝或多拷贝的目标酶基因。
可以通过使用具有与目标基因或与其一部分互补的序列的探针进行Southern杂交来确认这些基因转移到染色体上。
目标基因导入的拷贝数只要为1个拷贝以上即可，但优选为2个拷贝以上，更优选为3个拷贝以上，进一步优选为5个拷贝以上。在目标基因中，特别是木糖酸脱水酶基因优选导入2个拷贝以上。
进而，目标酶基因如下所述可通过组合进行对启动子等表达调节序列的替换、变异来优化活性。特别是对于木糖酸脱水酶基因而言，优选作为上述的多拷贝化的替代或联用手段，通过对表达调节序列的替换、变异使其更高表达。
作为增大目标酶基因的表达量的方法，可以举出通过将染色体DNA上或质粒上的目标酶基因的启动子等表达调节序列替换为具有适当强度者来增强该基因的表达的方法。例如，经常使用的启动子已知有thr启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、pL启动子、tac启动子等。另外，也可以使用后述实施例中使用的tac启动子的变异体(PtacA启动子、PtacB启动子)。启动子的强度的评价法及强有力的启动子的例子记载于Goldstein和Doi的论文(Goldstein,M.A.and Doi R.H.1995.Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128)等。
另外，如国际公开WO00/18935中所公开的那样，也可在基因的启动子区域中导入数个碱基的碱基替换，将其修饰为适当的强度的序列。表达调节序列的替换例如可以与使用温度敏感性质粒的基因替换同样地进行。作为可以用于大肠杆菌或Pantoea ananatis的具有温度敏感性复制起点的载体，例如可以举出WO99/03988号国际公开小册子中记载的温度敏感性质粒pMAN997及其衍生物等。另外，也可以通过利用λ噬菌体的Red重组酶(Redrecombinase)的被称为“Red驱动整合(Red-driven integration)”的方法(Datsenko,K.A.and Wanner,B.L.,2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97:6640-6645)、组合Red驱动整合法和源自λ噬菌体的切出系统(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.J.Bacteriol.184:5200-5203(2002))的方法(参照WO2005/010175号)等使用直链DNA的方法来进行表达调节序列的替换。另外，表达调节序列的修饰可以与提高如上所述的基因的拷贝数的方法组合。
进而，已知核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔序列、特别是起始密码子的接近上游的序列中的多个核苷酸的替换对mRNA的翻译效率造成非常大的影响，可通过对它们进行修饰来提高翻译量。
在向上述扩增质粒或染色体上导入目标基因的情况下，用于表达这些基因的启动子可以为任意启动子，只要在使用的微生物中发挥功能即可，可以为所使用的基因本身的启动子，也可以为经修饰的启动子。也可通过适宜选择在使用的微生物中强有力地发挥功能的启动子或使启动子的-35、-10区域接近共有序列来调节基因的表达量。
目标酶的活性是否增强可以通过比较修饰株和亲本株或非修饰株的目标酶的活性来加以确认。若修饰株的酶活性相比亲本株或者非修饰株上升，则酶的活性增强。另外，在亲本株不具有目标酶的活性的情况下，若可在修饰株中检测出目标酶的活性，则相同酶的活性增强。
目标酶基因可以通过以基于上述的序列信息或其微生物中公知的基因或蛋白质的序列信息制作的寡核苷酸为引物的PCR法、或以基于上述序列信息制作的寡核苷酸为探针的杂交法，从保持目标酶的微生物的染色体DNA或染色体DNA文库中获得。
另外，目标酶及编码它的基因只要保持酶活性，可以为它们的同源物、人工修饰体等或具有保守性突变的蛋白质或编码它的基因。
将如上所述的同源物、人工修饰体、或具有保守性突变的蛋白质或编码它们的基因记为保守性变异体。
作为目标酶的保守性变异体，例如可以为具有在上述各酶的氨基酸序列中含有在1或者多个位置替换、缺失、插入或附加等1个或者数个氨基酸的序列的蛋白质。
所谓“1或者数个”也根据氨基酸残基的蛋白质的立体结构中的位置及氨基酸残基的种类而不同，但具体而言是指优选1～20个，更优选1～10个，进一步优选1～5个。另外，保守性突变的代表性例子为保守性替换。所谓保守性替换，在替换部位为芳香族氨基酸的情况下，为在Phe、Trp、Tyr间相互替换的突变，在替换部位为疏水性氨基酸的情况下，为在Leu、Ile、Val间相互替换的突变，在为极性氨基酸的情况下，为在Gln、Asn间相互替换的突变，在为碱性氨基酸的情况下，为在Lys、Arg、His间相互替换的突变，在为酸性氨基酸的情况下，为在Asp、Glu间相互替换的突变，在为具有羟基的氨基酸的情况下，为在Ser、Thr间相互替换的突变。作为看作保守性替换的替换，具体而言，可以举出：从Ala向Ser或Thr的替换、从Arg向Gln、His或Lys的替换、从Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的替换、从Asp向Asn、Glu或Gln的替换、从Cys向Ser或Ala的替换、从Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的替换、从Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的替换、从Gly向Pro的替换、从His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的替换、从Ile向Leu、Met、Val或Phe的替换、从Leu向Ile、Met、Val或Phe的替换、从Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的替换、从Met向Ile、Leu、Val或Phe的替换、从Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的替换、从Ser向Thr或Ala的替换、从Thr向Ser或Ala的替换、从Trp向Phe或Tyr的替换、从Tyr向His、Phe或Trp的替换、及从Val向Met、Ile或Leu的替换。另外，如上所述的氨基酸的替换、缺失、插入、添加或倒位等中也含有由于基因来源的微生物的个体差异、物种不同的情况等天然产生的突变(突变体或变异体)而产生的情况。这样的蛋白质可以通过例如利用位点特异性突变法对野生型基因的碱基序列进行修饰，使得所编码的蛋白质的特定位点的氨基酸残基含有替换、缺失、插入或添加而获得。
进而，具有如上所述的保守性突变的蛋白质可以为相对于氨基酸序列整体例如具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更优选97％以上、更优选98％以上、特别优选99％以上的同源性，且具有与野生型蛋白质同等的功能的蛋白质。另外，在本说明书中，“同源性”(homology)有时指“同一性”(identity)。
野生型的目标酶基因若为编码如上所述的氨基酸序列的基因，则不限于新月柄杆菌及沃氏嗜盐富饶菌等的基因，可以为将任意的密码子替换为与其等价的密码子的基因。
另外，野生型基因可以为在严格条件下与可由上述的各酶基因的互补序列或其互补序列制备的探针杂交、且编码具有与野生型的目标酶同等的功能的蛋白质的DNA。在此，所谓“严格条件”是指可形成所谓的特异性杂交体，而不形成非特异性杂交体的条件。例如，同源性高的DNA，例如具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更优选97％以上、更优选98％以上、特别优选99％以上的同源性的DNA彼此杂交，且低于该同源性的DNA彼此不杂交的条件、或者在作为通常的Southern杂交的清洗条件即60℃、1×SSC、0.1％SDS、优选0.1×SSC、0.1％SDS、进一步优选68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度、温度下清洗1次、更优选2～3次的条件。
作为探针，也可以使用各基因的互补序列的一部分。这样的探针可以利用以基于公知的基因序列制作的寡核苷酸为引物，以含有这些碱基序列的DNA片段为模板，通过PCR制作。例如，在使用300bp左右的长度的DNA片段作为探针的情况下，杂交的清洗的条件可以是50℃、2×SSC、0.1％SDS。
关于上述的各蛋白质的保守性变异体及编码它们的基因的记载也可同样地适用于就后述的目标物质产生细菌所记载的其它的基因。
用于本发明的微生物可以为原本具有目标物质生产能力的微生物，也可以为通过利用变异法或重组DNA技术等的选育而被赋予了目标物质产生能力的微生物。
作为本发明中所使用的微生物，可以举出细菌例如埃希氏菌属、泛菌属、肠杆菌属等属于肠杆菌科的微生物、及谷氨酸棒状杆菌、乳发酵短杆菌等棒状杆菌型细菌、枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌属细菌，但并不限于这些微生物。
在本发明中，所谓“棒状杆菌型细菌”，以往被分类为短杆菌属，但目前也包含分类为棒状杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991))，另外，包含与棒状杆菌属非常近缘的短杆菌属细菌。作为这样的棒状杆菌型细菌的例子，可以举出以下的细菌。
嗜乙酰乙酸棒状杆菌
醋谷氨酸棒状杆菌
解烷棒状杆菌
帚石南棒状杆菌
谷氨酸棒状杆菌
百合棒状杆菌
栖糖蜜棒杆菌
嗜热产氨棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)
力士棒状杆菌
散枝短杆菌((Brevibacterium divaricatum)
黄色短杆菌
Brevibacterium immariophilum
乳发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)
玫瑰色短杆菌
解糖短杆菌
生硫短杆菌
产氨短杆菌
白色短杆菌
蜡状短杆菌
嗜氨微杆菌
具体而言，可以例示如下所述的菌株。
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870
醋谷氨酸棒状杆菌ATCC15806
解烷棒状杆菌ATCC21511
帚石南棒状杆菌ATCC15991
谷氨酸棒状杆菌ATCC13020、ATCC13032、ATCC13060
百合棒状杆菌ATCC15990
栖糖蜜棒杆菌ATCC17965
热产氨棒状杆菌AJ12340(FERM BP-1539)
力士棒状杆菌ATCC13868
散枝短杆菌ATCC14020
黄色短杆菌ATCC13826,ATCC14067
Brevibacterium immariophilumATCC14068
乳发酵短杆菌ATCC13869(谷氨酸棒状杆菌ATCC13869)
玫瑰色短杆菌ATCC13825
解糖短杆菌ATCC14066
生硫短杆菌ATCC19240
产氨短杆菌ATCC6871、ATCC6872
白色短杆菌ATCC15111
蜡状短杆菌ATCC15112
嗜氨微杆菌ATCC15354
为了获得这些细菌，例如可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC:住所P.O.Box1549,Manassas,VA20108,1,美国)订购。即，每个菌株分别被给予对应的登录号，可以利用该登录号订购(http://www.atcc.org/)。对应于各菌株的登录号记载于美国典型培养物保藏中心的目录中。另外，AJ12340菌株于1987年10月27日基于布达佩斯条约以FERM BP-1539保藏号保藏在通商省工业技术院生命工学工业技术研究所(现独立行政法人产品评价技术基盘机构专利生物保藏中心住所：邮编305-5466日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。
属于肠杆菌科的微生物没有特别限定，只要是属于埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、沙门氏菌属、摩根氏菌属等，且具有产生目标物质的能力的微生物即可。具体而言，可利用NCBI(美国国家生物技术信息中心)数据库中所记载的分类属于肠杆菌科的微生物(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg？mode＝Tree&id＝1236&lvl＝3&keep＝1&srchmode＝1&unlock)。在肠杆菌科的亲本株中，优选使用埃希氏菌属细菌、肠杆菌属细菌、泛菌属细菌。
埃希氏菌属细菌的亲本株没有特别限定，具体而言，可利用Neidhardt等的著作(Neidhardt,F.C.et al.,Escherichia coli and Salmonella Typhimurium,American Society for Microbiology,Washington D.C.,1029table1)中所举出的菌株。其中例如大肠杆菌。大肠杆菌具体包括，例如：源自原型野生株K12株的大肠杆菌W3110(ATCC27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC47076)等。
特别地，泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌、肠杆菌属细菌是被分类为γ-变形菌的细菌，在分类学上非常近缘(J Gen Appl Microbiol1997Dec；43(6)355-361、International Journal of Systematic Bacteriology,Oct.1997,p1061-1067)。近年来，通过DNA-DNA杂交实验等，属于肠杆菌属的细菌可再分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)或分散泛菌(Pantoea dispersa)等(International Journal of Systematic Bacteriology,July1989；39(3).p.337-345,)。属于欧文氏菌属的细菌可再分类为菠萝泛菌(Pantoea ananas)、斯式泛菌(参照International Journal of Systematic Bacteriology,Jan1993；43(1).p.162-173)。菠萝泛菌后来被重新分类为Pantoea ananatis。
作为肠杆菌属细菌，可以举出：成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)(目前被重新分类为Pantoea ananatis等)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等。具体而言，可以使用欧洲专利申请公开952221号说明书中所例示的菌株。作为肠杆菌属的代表性株，可以举出成团肠杆菌ATCC12287株(目前可再分类为Pantoea ananatis)。
作为泛菌属细菌的代表性菌株，可以举出：Pantoea ananatis、斯式泛菌(Pantoea stewartii)、成团泛菌、柠檬泛菌(Pantoea citrea)。具体而言，可以举出下述的菌株。
Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)(欧洲专利申请公开0952221号说明书)
Pantoea ananatis AJ13356株(FERM BP-6615)(欧洲专利申请公开0952221号说明书)
另外，这些菌株在欧洲专利申请公开0952221号说明书中被记载为成团肠杆菌，但如上所述，现在它们基于16S rRNA的碱基序列分析被重新分类为Pantoea ananatis。
Pantoea ananatis AJ13355菌株是从静冈县磐田市的土壤中分离的、能够在低pH下在含有L-谷氨酸及碳源的培养基中增殖的菌株。另外，从该菌株中选择出的粘性物质产量低的突变株为SC17株(美国专利第6,596,517号)。AJ13355菌株于1998年2月19日以保藏号FERM P-16644保藏在通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心，住所：邮编305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，于1999年1月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，被给予保藏号FERM BP-6614。另外，SC17株被给予内部编号AJ416，于2009年2月4日在产业技术综合研究所专利生物保藏中心(现独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心，住所：邮编305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)做出国际保藏，被给予保藏号FERM BP-11091。
进而，作为Pantoea ananatis的L-谷氨酸产生细菌，可以举出：SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株及NA1株。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株是向SC17sucA株(sucA基因缺陷的SC17株，美国专利第6,596,517号)中导入质粒RSFCPG和质粒pSTVCB而得到的菌株，质粒RSFCPG含有源自大肠杆菌的柠檬酸合酶基因(gltA)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(prpC)及谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)，而质粒pSTVCB含有源自乳发酵短杆菌的柠檬酸合酶基因(gltA)。AJ13601株是从该SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株中选择的、在低pH下对高浓度的L-谷氨酸显示抗性的菌株。而NP106株是使质粒RSFCPG+pSTVCB从AJ13601株中脱落而得到的菌株(WO2010/027045)。AJ13601菌株于1999年8月18日以保藏号FERM P-17516保藏在通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(目前名称：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心，住所：邮编305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，于2000年7月6日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，被给予保藏号FERM BP-7207。同株在分离时鉴定为成团肠杆菌，作为成团肠杆菌保藏，但可通过16S rRNA的碱基序列分析等被重新分类为Pantoea ananatis。
NA1菌株相当于具有RSFPPG(WO2008/020654)的NP106株(WO2010/027045)，上述RSFPPG具有将上述RSFCPG的gltA基因替换为甲基柠檬酸合酶基因(prpC)的结构。
作为欧文氏菌属细菌，可以举出解淀粉欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌，作为克雷伯氏菌属细菌，可以举出植生克雷伯氏菌。具体而言，可以举出下述的菌株。
解淀粉欧文氏菌ATCC15580菌株
胡萝卜软腐欧文氏菌ATCC15713菌株
植生克雷伯氏菌AJ13399菌株(FERM BP-6600)(欧洲专利申请公开955368号说明书)
植生克雷伯氏菌AJ13410菌株(FERM BP-6617)(欧洲专利申请公开955368号说明书)
下面，对赋予如上所述的微生物目标物质生产能力的方法、或增强如上所述的微生物的目标物质生产能力的方法进行说明。
为了赋予目标物质生产能力，可以应用历来在棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等氨基酸产生细菌的育种中采用的方法，如获得营养缺陷性突变株、目标物质的类似物抗性株或代谢控制突变株，及创造目标物质的生物合成系统酶的表达增强的重组株等(参照《氨基酸发酵》(アミノ酸発酵)、(株)学会出版中心、1986年5月30日初版发行，第77～100页)。在此，在目标物质产生细菌的育种中，所赋予的营养缺陷性、类似物抗性、代谢控制突变等性质可以是单独一种，也可以为2种或3种以上。另外，表达被增强的目标物质生物合成系统酶可以是单独一种，也可以是2种或3种以上。进而，营养缺陷性、类似物抗性、代谢控制变异等性质的赋予和生物合成系统酶的增强可以组合进行。
为了获得具有目标物质生产能力的营养缺陷性突变株、类似物抗性株、或代谢控制突变株，可以通过利用通常的变异处理即X射线及紫外线的照射、或N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等突变剂处理等处理亲本株或野生株，从得到的突变株中选择显示营养缺陷性、类似物抗性、或代谢控制变异，且具有目标物质生产能力的菌株来得到。另外，目标物质产生细菌也可以通过利用基因重组来增强目标物质的生物合成系统酶的酶活性来进行。
下面，对赋予目标物质生产能力的方法、及可赋予目标物质生产能力的微生物进行例示。
作为用于通过育种赋予或增强目标物质产生能力的方法，例如可以举出修饰以增强编码参与目标物质生物合成的酶的基因的表达的方法。例如，作为参与L-谷氨酸生物合成的酶，例如可以举出：谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合酶(gltBD)、乌头酸水合酶(acnA、acnB)、柠檬酸合酶(gltA)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶(aceEF、lpdA)、丙酮酸激酶(pykA、pykF)、磷酸烯醇式丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油变位酶(pgmA、pgmI)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA、pfkB)、葡萄糖磷酸异构酶(pgi)、甲基柠檬酸合酶(prpC)等。另外，酶名的后面的括弧内为基因名(在以下的记载中也相同)。
上述的基因的表达的增强可以通过关于上述的NXA途径的酶活性的增强所记载的方法来进行。
修饰而增强了上述酶基因中的柠檬酸合酶基因、丙酮酸脱氢酶基因及/或谷氨酸脱氢酶基因的表达的微生物的例子包括WO00/18935号小册子、欧洲专利申请公开1010755号说明书等中所记载的微生物。
用于赋予L-谷氨酸产生能力的修饰可以通过使催化从L-谷氨酸的生物合成途径中分支而生成其它的化合物的反应的酶的活性降低或缺陷来进行。作为催化从L-谷氨酸的生物合成途径分支而生成L-谷氨酸以外的化合物的反应的酶，可以举出：2-氧酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、1-脯氨酸脱氢酶、乙酰CoA水解酶(WO2006/057450)等。
作为使目标酶的活性降低或者缺陷的方法，只要通过通常的突变处理法或基因重组技术向基因组上的上述酶的基因导入细胞中的该酶的活性降低或缺陷这样的突变即可。这样的变异的导入例如可通过利用基因重组使编码基因组上的酶的基因缺陷或对启动子、Shine-Dalgano(SD)序列等表达调节序列进行修饰等来实现。另外，也可通过向编码基因组上的酶的区域导入氨基酸替换(错义变异)、及导入终止密码子(无义变异)、导入一～二个碱基的添加/缺失的移码突变、使基因的一部分或者全部区域缺失来实现(J.Biol.Chem.272:8611-8617(1997))。另外，也可以通过构建编码突变酶的基因并利用同源重组等在该基因中替换基因组上的正常基因、或将转位子、IS因子导入到该基因中使酶活性降低或缺陷，所述变异酶的编码区域的整体或一部分缺失。
例如，为了利用基因重组导入使上述的酶的活性降低或缺陷的突变，可使用如下所述的方法。可以通过对目标基因的部分序列进行修饰，制作不会产生正常地发挥功能的酶的突变型基因，用含有该基因的DNA转化为属于肠杆菌科的细菌，引起突变型基因和基因组上的基因重组，来将基因组上的目标基因替换为突变型。这样的利用同源重组的基因替换有被称为“Red驱动整合(Red-driven integration)”的方法(Datsenko,K.A,and Wanner,B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97:6640-6645(2000))、组合Red驱动整合法和源自λ噬菌体的切出系统(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.J.Bacteriol.184:5200-5203(2002))的方法(参照WO2005/010175号、俄罗斯申请2006134574号)等使用直链状DNA的方法、及使用含有温度敏感性复制起点的质粒的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号公报)。另外，如上所述的利用同源重组的基因替换产生的位点特异性突变导入也可以使用在宿主上不具有复制能力的质粒来进行。
进而，作为对棒状杆菌型细菌赋予L-谷氨酸产生能力的方法，也可使用扩增yggB基因(NCgl1221；NP_600492.Reportssmall-conductance...[gi:19552490])的方法、导入向编码区域内导入了突变的突变型yggB基因的方法(WO2006/070944)。
另外，作为提高L-谷氨酸产生能力的方法，可以举出导入编码D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮酶(D-xylulose-5-phosphate phosphoketolase)及/或果糖-6-磷酸磷酸酮酶(fructose-6-phosphate phosphoketolase)的基因(将这些统称为磷酸酮酶)的方法。例如作为磷酸酮醇酶活性上升的微生物，可以举出以下的微生物(WO2006/016705)。
乳发酵短杆菌ATCC13869ΔsucA(pVK9-xfp)、
乳发酵短杆菌ATCC13869ΔsucA(pVK9-PS2_xpkA)
L-谷氨酸产生能力也可以通过增强6-磷酸葡糖酸脱水酶活性或者2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶活性、或这两者的活性来赋予。作为使6-磷酸葡萄糖酸脱水酶活性、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶活性上升的微生物，可以举出日本特开2003-274988中所公开的微生物。另外，L-谷氨酸产生能力也可以通过扩增L-谷氨酸排出基因yhfK、ybjL基因来赋予(WO2005/085419、WO2008/133161)。
可以使用具有在酸性条件下培养时在液体培养基中蓄积超过L-谷氨酸饱和浓度的量的L-谷氨酸的能力(以下有时称为在酸性条件下的L-谷氨酸蓄积能力)的微生物作为用于本发明的L-谷氨酸生产微生物。例如可以通过利用欧洲公开公报1078989号记载的方法获得在低pH环境下对L-谷氨酸的抗性提高的菌株来赋予蓄积超过饱和浓度的量的L-谷氨酸的能力。
其它赋予或增强L-谷氨酸产生能力的方法包括，例如：赋予对有机酸类似物或呼吸抑制剂等的抗性的方法、及赋予对细胞壁合成抑制剂的敏感性的方法。例如可以举出：赋予单氟乙酸抗性的方法(日本特开昭50-113209)、赋予腺嘌呤抗性或胸腺嘧啶抗性的方法(日本特开昭57-065198)、弱化脲酶的方法(日本特开昭52-038088)、赋予丙二酸抗性的方法(日本特开昭52-038088)、赋予对苯并吡喃酮或萘醌类的抗性的方法(日本特开昭56-1889)、赋予HOQNO抗性的方法(日本特开昭56-140895)、赋予α-酮丙二酸抗性的方法(日本特开昭57-2689)、赋予胍抗性的方法(日本特开昭56-35981)、赋予对青霉素的敏感性的方法(日本特开平4-88994)等。
作为这样的抗性菌的具体例子，可以举出如下所述的菌株。
黄色短杆菌AJ3949(参照FERMBP-2632、日本特开昭50-113209)
谷氨酸棒状杆菌AJ11628(参照FERM P-5736、日本特开昭57-065198)
黄色短杆菌AJ11355(参照FERM P-5007、日本特开昭56-1889号公报)
谷氨酸棒状杆菌AJ11368(参照FERM P-5020、日本特开昭56-1889号公报)
黄色短杆菌AJ11217(参照FERM P-4318、日本特开昭57-2689号公报)
谷氨酸棒状杆菌AJ11218(参照FERM P-4319、日本特开昭57-2689号公报)
黄色短杆菌AJ11564(参照FERM P-5472、日本特开昭56-140895公报)
黄色短杆菌AJ11439(参照FERM P-5136、日本特开昭56-35981号公报)
谷氨酸棒状杆菌H7684(参照FERM BP-3004、日本特开平04-88994号公报)
乳发酵短杆菌AJ11426(参照FERM P-5123、日本特开平56-048890号公报)
谷氨酸棒状杆菌AJ11440(参照FERM P-5137、日本特开平56-048890号公报)
乳发酵短杆菌AJ11796(参照FERM P-6402、日本特开平58-158192号公报)
具有L-谷氨酰胺产生能力的微生物的优选的例子是增强了谷氨酸脱氢酶活性的细菌、增强了谷氨酰胺合成酶(glnA)活性的细菌、破坏了谷氨酰胺酶基因的细菌(欧洲专利申请公开1229121号、1424398号说明书)。谷氨酰胺合成酶的活性增强也可通过破坏谷氨酰胺腺嘌呤基转移酶(glnE)、破坏PII控制蛋白质(glnB)来实现。另外，属于埃希氏菌属、具有谷氨酰胺合成酶的397位的酪氨酸残基被替换为其它的氨基酸残基而成的突变型谷氨酰胺合成酶的菌株是优选的L-谷氨酰胺产生细菌的例子(美国专利申请公开第2003-0148474号说明书)。
赋予或增强L-谷氨酰胺生产能力的其它方法包括：赋予6-重氮-5-氧-正亮氨酸抗性的方法(日本特开平3-232497)、赋予嘌呤类似物抗性及甲硫氨酸亚砜抗性的方法(日本特开昭61-202694)、赋予α-酮马来酸抗性的方法(日本特开昭56-151495)等。具有L-谷氨酰胺产生能力的棒状杆菌型细菌的具体例子包括以下的微生物。
黄色短杆菌AJ11573(FERM P-5492、日本特开昭56-161495)
黄色短杆菌AJ11576(FERM BP-10381、日本特开昭56-161495)
黄色短杆菌AJ12212(FERM P-8123、日本特开昭61-202694)
具有L-脯氨酸产生能力的微生物包括例如：携带解除了L-脯氨酸导致的反馈抑制的γ-谷氨酰激酶的细菌、及弱化了L-脯氨酸分解体系的细菌。使用编码解除了L-脯氨酸导致的反馈抑制的γ-谷氨酰激酶的DNA修饰细菌的方法公开于Dandekar,A.M.,Uratsu,S.L.,J.Bacteriol.,170,12,5943-5(1988)。另外，获得L-脯氨酸分解体系弱化的细菌的方法包括例如向脯氨酸脱氢酶基因中导入使酶活性降低的突变的方法。具有L-脯氨酸产生能力的细菌的例子包括：大肠杆菌NRRL B-12403株及NRRL B-12404株(英国专利2075056)、VKPM B-8012株(美国专利公开2002-0058315)，以及保持德国专利3127361号中所公开的质粒突变体及Bloom F.R.等的文献(The15th Miami wintersymposium,1983,p.34)中所公开的质粒突变体的菌株等。
另外，优选的具有L-脯氨酸产生能力的微生物包括：大肠杆菌702菌株(VKPMB-8011)(它是针对3,4-脱羟基脯氨酸、及氮杂环丁烷-2-羧酸酯具有抗性的菌株)；702ilvA菌株(VKPMB-8012株)(它是702株的ilvA缺陷株)；以及增强了b2682及b2683、b1242或b3434基因所编码的蛋白质的活性的大肠杆菌等(日本特开2002-300874号公报)。
属于棒状杆菌型细菌的L-脯氨酸产生细菌包括例如：DL-3,4-脱氢脯氨酸抗性株(FERM BP-1219.美国专利4224409号公报)、柠檬酸合成酶活性上升为其亲本株的1.4倍以上的菌株(FERM P-5332、FERM P-5333、FERM P-5342、FERMP-5343专利1426823号)、被赋予了乙酸营养缺陷的菌株(FERMP-5931)。
具有L-精氨酸产生能力的微生物包括例如：针对α-甲基甲硫氨酸、对氟苯基丙氨酸、D-精氨酸、精氨酸氧肟酸、AEC(S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸)、α-甲基丝氨酸、β-2-噻吩基丙氨酸、或磺胺胍具有抗性的大肠杆菌突变株(参照日本特开昭56-106598号公报)等。另外，大肠杆菌237菌株(俄罗斯专利申请第2000117677号)也是优选的L-精氨酸产生株，它是一种保持具有对L-精氨酸导致的反馈抑制抗性的变异、且具有活性较高的N-乙酰谷氨酸合酶的L-精氨酸产生细菌。该菌株于2000年4月10日以保藏号VKPM B-7925保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms(VKPM),GNII Genetika)，于2001年5月18日转为基于布达佩斯条约的国际保藏。还可以使用大肠杆菌382菌株(日本特开2002-017342号公报)，它是237株的衍生物，是一种提高了乙酸同化能力的L-精氨酸产生细菌。大肠杆菌382株于2000年4月10日以VKPM B-7926的保藏号保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)。
另外，作为具有L-精氨酸产生能力的微生物，可以使用提高了编码参与L-精氨酸生物合成的酶的基因的表达量的微生物。例如，L-精氨酸生物合成系统酶包括例如选自N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰谷氨酰基磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)、鸟氨酸氨基甲酰基转移酶(argF)、精氨琥珀酸合酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)、氨基甲酰基磷酸合酶(carAB)中的1或2种以上的酶。就N-乙酰谷氨酸合酶(argA)而言，更优选使用相当于野生型的15位～19位的氨基酸序列被替换、解除了L-精氨酸导致的反馈抑制的突变型基因(欧洲申请公开1170361号说明书)。
属于棒状杆菌型细菌的L-精氨酸产生细菌没有特别限制，只要具有L-精氨酸产生能力即可，包括例如：棒状杆菌型细菌野生株；针对磺胺药、2-噻唑丙氨酸或α-氨基-β-羟基戊酸等药物具有抗性的棒状杆菌型细菌；除2-噻唑丙氨酸抗性以外，还具有L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸或L-色氨酸营养缺陷的棒状杆菌型细菌(日本特开昭54-44096号)；针对酮丙二酸、氟丙二酸或单氟乙酸具有抗性的棒状杆菌型细菌(日本特开昭57-18989号)；对精氨醇具有抗性的棒状杆菌型细菌(日本特开昭62-24075号)；或对X-胍(X为脂肪酸或脂肪链的衍生物)具有抗性的棒状杆菌型细菌(日本特开平2-186995号)等。
另外，具有L-精氨酸产生能力的棒状杆菌型细菌可以作为对5-氮杂脲嘧啶、6-氮杂脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、5-氟脲嘧啶、5-溴脲嘧啶、5-氮杂胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶等具有抗性的突变株；对精氨酸氧肟酸、2-硫脲嘧啶具有抗性的突变株、对精氨酸氧肟酸及6-氮杂脲嘧啶具有抗性的突变株(日本特开昭49-126819号)；对组氨酸类似物或色氨酸类似物具有抗性的突变株(日本特开昭52-114092号)；对甲硫氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、腺嘌呤、鸟嘌呤或脲嘧啶(或脲嘧啶前体)中的至少一个具有缺陷性的突变株(参照日本特开昭52-99289号)；对精氨酸氧肟酸具有抗性的突变株(日本特公昭51-6754号)；具有琥珀酸营养缺陷或对核酸碱基类似物具有抗性的突变株(日本特开昭58-9692号)；精氨酸分解能力缺陷、对精氨酸的拮抗物及刀豆氨酸具有抗性、赖氨酸营养缺陷的突变株(日本特开昭52-8729号)；对精氨酸、精氨酸氧肟酸、高精氨酸、D-精氨酸、刀豆氨酸有抗性，或对精氨酸氧肟酸及6-氮杂脲嘧啶有抗性的突变株(日本特开昭53-143288号)；及对刀豆氨酸有抗性的突变株(日本特开昭53-3586号)等的形式育种。
作为具有L-精氨酸产生能力的棒状杆菌型细菌的具体例子，可以举出如下所述的菌株。
黄色短杆菌AJ11169(FERM P-4161)
乳发酵短杆菌AJ12092(FERM P-7273)
黄色短杆菌AJ11336(FERM P-4939)
黄色短杆菌AJ11345(FERM P-4948)
乳发酵短杆菌AJ12430(FERM BP-2228)
进而，可以使用精氨酸阻遏物ArgR缺陷的菌株(美国专利申请公开2002-0045223号)、细胞内的谷氨酰胺合成酶活性上升的菌株(美国专利申请公开2005-0014236号公报)。
L-瓜氨酸、L-鸟氨酸的生物合成途径也与L-精氨酸共通，可以通过使N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)的酶活性上升来赋予L-瓜氨酸和L-鸟氨酸的产生能力(国际公开2006-35831号小册子)。
作为γ-氨基丁酸(GABA；gamma-aminobutiric acid)产生细菌，可以使用增强了谷氨酸脱羧酶的活性的菌株(Microb Cell Fact.2010Nov12；9:85.AminoAcids.2010Nov；39(5):1107-16US20100324258号公报)。
作为腐胺产生细菌，可以使用增强了4-羟基丁酸还原酶、琥珀酰-CoA还原酶(形成醛的)、及4-羟基丁酸脱氢酶的菌株(WO2011047101号公报)、增强了γ-氨基丁醛脱氢酶的菌株(FEBS Lett.2005Aug1；579(19):4107-12.)。
<2>目标物质的制造方法
可以通过在含有木糖作为碳源的培养基中培养如上所述的细菌，使目标物质在该培养基中生成蓄积并从该培养基中采集目标物质来制造目标物质。
用于培养的培养基可以使用含有碳源、氮源、无机盐类、其它的根据需要的氨基酸、维生素等有机微量营养素的通常的培养基。合成培养基或天然培养基均可使用。
作为碳源，只要含有木糖，可使用其它的碳源，例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、淀粉水解物、糖蜜等糖类，除此以外，也可以单独使用乙酸、柠檬酸等有机酸、乙醇等醇类，或者与其它的碳源组合使用。
木糖和其它的碳源的混合比率可以是任意的，但木糖:其它的碳源(重量比)优选为1:0.1～100，更优选为1:0.1～10，更优选为1:0.1～5，更优选为1:1～5，进一步优选为1:1～3。
作为培养基中的碳源的浓度，只要选用适于制造目标物质的浓度，可以以任意的浓度使用。培养基中的碳源浓度优选为0.1w/v％～50w/v％左右，更优选为0.5w/v％～40w/v％左右，特别优选为1w/v％～30w/v％左右。
木糖、或木糖与六碳糖(如葡萄糖)的混合物，可以从生物质未充分利用的供给源中得到。这些五碳糖、六碳糖可利用蒸气及/或浓酸水解、稀酸水解、使用酶(如纤维素酶)的水解、或碱处理从植物生物质中游离。在基质为纤维素类材料的情况下，纤维素同时或另外被水解为糖而用于目标物质的生产。半纤维素由于通常比纤维素容易水解为糖，因此，优选预先水解纤维素类材料分离五碳糖，接着通过利用蒸汽、酸、碱、纤维素酶或它们的组合处理水解纤维素而生成六碳糖。
本发明的培养基中所含的木糖还可以通过使微生物拥有自葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的转化途径，将各种己糖转化为木糖(D-木糖)来供给。
作为氮源，可以使用氨、脲、硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、乙酸铵等铵盐或硝酸盐等。作为有机微量营养素，可使用氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸、以及含有这些物质的胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白分解物等，优选补充在使用在生长时需求氨基酸等的营养缺陷性突变株的情况下所需求的营养素。作为无机盐类，可使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。
培养优选在发酵温度20～45℃下将pH控制为3～9进行通气培养。在pH调整中可以使用无机或者有机的酸性或者碱性物质、以及氨气等。优选在这样的条件下培养10小时～120小时左右，由此在培养液中或菌体内蓄积目标物质。
另外，在目标物质为L-谷氨酸的情况下，也可以使用调整为L-谷氨酸析出的条件的液体培养基进行培养，以在生成蓄积L-谷氨酸的同时使之在培养基中析出。L-谷氨酸析出的条件包括例如pH5.0～4.0、优选pH4.5～4.0、进一步优选pH4.3～4.0、特别优选pH4.0。另外，为了同时实现酸性条件下的生长的提高及L-谷氨酸的高效析出，pH优选为5.0～4.0，更优选为4.5～4.0，进一步优选为4.3～4.0。另外，上述pH下的培养可以为培养的整个期间，也可以为其一部分。
所采集的目标物质除目标物质以外可以含有微生物菌体、培养基成分、水分、及微生物的代谢副产物。所采集的目标物质的纯度为50％以上，优选为85％以上，特别优选为95％以上(JP1214636B、USP5,431,933、4,956,471、4,777,051、4946654、5,840,358、6,238,714、US2005/0025878))。
从培养结束后的培养液中采集目标物质的方法只要按照公知的回收方法进行即可。例如可通过组合现有众所周知的离子交换树脂法(Nagai,H.etal.:Separation Science and Technology,39(16),3691-3710)、膜分离法(日本特开平9-164323号、日本特开平9-173792号)、结晶法(WO2008/078448、WO2008/078646)、其它的方法来采集目标物质。
另外，在目标物质在培养基中析出的情况下，可以通过离心分离或过滤等回收。另外，在培养基中析出的目标物质可以在将溶解于培养基中的目标物质结晶后一并分离。
实施例
下面，利用实施例对本发明更进一步具体地进行说明。
将以下的实施例中使用的培养基组成示于以下。
[LB培养基]
细菌胰蛋白胨(Bacto tryptone)10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl5g/L、pH7.0
[LBGM9]
在LB培养基中添加基础培养基成分(葡萄糖5g/L、硫酸镁2mM、磷酸二氢钾3g/L、氯化钠0.5g/L、氯化铵1g/L、磷酸氢二钠6g/L)而成。
[MSII-葡萄糖培养基]
A区
葡萄糖       40g/L
MgSO4·7H2O  0.5g/L
B区
(NH4)2SO4    20g/L
KH2PO4       2g/L
NaCl         0.5g/L
酵母提取物2g/L
在120℃下，分别对A区、B区进行高压灭菌20分钟后混合。
※微量成分
[MSII-木糖培养基]
将MSII-葡萄糖培养基的葡萄糖(40g/L)替换为木糖(40g/L)而成。
[MSII-GX培养基]
将MSII-葡萄糖培养基的葡萄糖(40g/L)替换为葡萄糖(20g/L)与木糖(20g/L)的混合物而成。
[MSII-SX培养基]
将MSII-葡萄糖培养基的葡萄糖(40g/L)替换为蔗糖(20g/L)和木糖(20g/L)的混合物而成。
[E1合成培养基]
A区
pH任意
过滤器除菌
B-1区
碳源                 50(或100)mM
过滤器除菌
B-2区
硫胺素-HCl           1mM
过滤器(0.22μm)灭菌后添加到B-1中
C区
MES-NaOH(pH6.8)      50mM
过滤器(0.22μm)除菌
A～C区全部制备5倍浓度的溶液，作为原液。
[CM-Dex培养基]
使用KOH将pH调整为7.5。
[Glc培养基]
使用KOH将pH调整为8.0。
[Xyl培养基(限制生物素)]
将Glc培养基的葡萄糖(80g/L)替换为木糖(80g/L)，进而除去生物素而成。
[ＭS培养基]
A区
葡萄糖或木糖         40g/L
葡萄糖和木糖(1:1)    40g/L
MgSO4·7H2O          1g/L
B区
在120℃下，分别对A区、B区进行高压灭菌20分钟后混合，加入日本药典碳酸钙50g/L。
[实施例1]向Pantoea ananatis导入NXA途径
(1)NXA途径导入用质粒pTWV228Ptac_ccrNXA的构建
作为报告有NXA途径的公知的细菌，已知有新月柄杆菌(Stephens,C.etal.,J.Bacteriol.2007,189(5):181-2185)。为了获得编码新月柄杆菌的NXA途径的各酶的基因，采用以下的方法。
新月柄杆菌的基因组约为4Mb，5个基因构成操纵子结构(Journal ofBacteriology,189:2181-2185,2007)。从新月柄杆菌的基因组公开菌株(CB-15(ATCC19089)。可从ATCC中获得)中提取基因组，尝试构建各基因的克隆和表达载体。
利用Clontech In-Fusion克隆试剂盒(Clontech In-Fusion Cloning Kit)进行表达载体的构建。
通过PCR对以下的4个DNA片段进行扩增，其中i)、ii)、iii)以新月柄杆菌CB-15(ATCC19089)的染色体DNA为模板，iv)以pMW119为模板。括弧内表示用于PCR的引物。
i)tac启动子序列(以下记为“Ptac”)(PtwvPtacf：SEQ ID NO:1、0823Ptacr：SEQ ID NO:2)
ii)含有xylX、ccrxylA、ccrxylB及xylC的片段(Ptac0823f：SEQ ID NO:3、0819r：SEQ ID NO:4)
iii)xylD和其下游约120bp区域(0819f：SEQ ID NO:5、219cc0819r：SEQID NO:6)
iv)pMW119/SmaI(219f：SEQ ID NO:7、219r：SEQ ID NO:8)
接下来，以纯化的i)、ii)的PCR产物为模板，以PtwvPtacf及0819r为引物，通过PCR对这些PCR产物结合而成的片段Ptac_xylXccrAccrBC进行扩增。使用Clontech In-Fusion克隆试剂盒对得到的Ptac_xylXccrAccrBC、上述iii)及iv)的PCR产物三者进行In-Fusion反应，用反应物转化大肠杆菌JM109菌株，从转化体获得目标质粒pMW119Ptac_ccrNXA。
接着，以pMW119Ptac_ccrNXA为模板，以PtwvPtacf及219CC0819r为引物，对含有Ptac的ccrNXA操纵子进行扩增。对得到的扩增产物和用SmaI消化而成的pTWV228进行In-Fusion反应，以反应物转化大肠杆菌JM109菌株，由转化体获得目标质粒pTWV228Ptac_ccrNXA。
(2)在pUT399上搭载卡那霉素抗性Mini-Mu的质粒pUT-MuKm的构建
pUT399为具有R6K的复制起点、含有接合转移所需要的mob区域、无法在不具有pir基因的菌株中复制的质粒(可从Biomedal公司获得：参照R.Simon.,et al.,BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER1983,784-791、美国专利第7090998号)。
pCE1134(日本特开平2-109985号公报)为含有MudII1734的质粒，在Mini-Mu单元内搭载有Km抗性基因和lacXYZ基因。利用以下的方法制备从pCE1134的Mini-Mu单元内缺失了lacXYZ区域的DNA片段，并克隆到pUT399中。
以pCE1134为模板，使用引物attL-F(SEQ ID NO:9)和nptII-R(SEQ IDNO:10)，利用PCR获得含有MuCts(编码左端和转座酶的MuAB基因的阻遏物)和Km抗性基因的片段。另外，同样地以pCE1134为模板，使用引物attR-F(SEQ ID NO:11)和attR-R(SEQ ID NO:12)，获得含有右端的片段。以这2个片段为模板，使用引物attL-F和attR-R进行交叉PCR，将得到的约2.3kb的片段导入到pUT399的SmaI位点。这样得到质粒pUT-MuKm。
如上所述构建的Mini-Mu单元由于在转移单元内具有Km抗性基因和作为克隆位点的8碱基识别的NotI位点，因此，可克隆各种基因。
(3)pTWV228Ptac_ccrNXA的药物抗性基因的替换
利用λRed法将pTWV228Ptac_ccrNXA的氨苄青霉素抗性基因替换为卡那霉素抗性基因。
以pUT_MuKm为模板，使用引物Ap-Km-fw(SEQ ID NO:13)和Ap-Km-rv(SEQ ID NO:14)对含有卡那霉素抗性基因的序列(ntpII片段)进行扩增。
PCR反应使用PrimeSTAR HS聚合酶(Takara-bio)按照该酶中所附带的规程进行。
在具有pTWV228Ptac_ccrNXA的大肠杆菌JM109中导入作为辅助质粒的RSF_Red_TER(US20090286290A1、WO2008/075483)，在37℃下，在50ml LB(含有1mM IPTG、100mg/L氨苄青霉素、25mg/L氯霉素)培养基中培养直至OD660值达到0.4。
上述RSF_Red_TER为用于引发λ依赖性整合(Red-驱动整合)(λRed法)的辅助质粒，可以通过lacI基因诱导λ的gam、bet及exo各基因的表达。另外，该质粒含有果聚糖蔗糖酶基因(sacB)，利用该基因使质粒在含有蔗糖的培养基中从细胞上脱落。另外，该质粒还含有氯霉素抗性基因。
收集如上培养的菌体后，用10％甘油溶液离心清洗2次，悬浮在1mL10％甘油溶液中。然后，以上述得到的ntpII片段利用电穿孔法转化，在含有40mg/L的卡那霉素的LB琼脂培养基中挑选转化体。将得到的转化体在LB(含有1mM IPTG、10％蔗糖、40mg/L卡那霉素)琼脂培养基中进行亚培养，在37℃下培养过夜，获得单一克隆。确认了所得的转化体无法在含有100mg/L的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长，并确认了pTWV228Ptac_ccrNXA的氨苄青霉素抗性基因被替换成了卡那霉素抗性基因。将得到的质粒命名为pTWVPtac_ccrNXA_Km。
(4)含有xylD的质粒的构建
利用Clontech In-Fusion克隆试剂盒进行构建。
首先，以将每个基因克隆到pUC18中而得到的质粒为模板，以xylD_IFS_5742-10-5(SEQ ID NO:15)和xylD_IFS_5742-10-6(SEQ ID NO:16)为引物，通过PCR对含有xylD的DNA片段进行扩增。具体而言，采用以下的方法克隆到除去SfiI位点的pUC18中。
通过以新月柄杆菌CB-15株的基因组DNA为模板、以CC0819-01F_4691-88-7(SEQ ID NO:17)和CC0819-01R_5659-9-1(SEQ ID NO:18)、以及CC0819-02F_5659-9-2(SEQ ID NO:19)和CC0819-02R_4691-88-10(SEQ ID NO:20)为引物，通过PCR分别扩增出了1130bp及653bp的片段。接下来，采用体外组装法(Nature Methods6(5),343-345,2009)对用SmaI消化过的pUC18与上述2个扩增片段进行组装，得到除去了SfiI位点并插入有xylD基因的pUC18-xylD。
另一方面，按照常规方法用SmaI消化pSTV28-Ptac-Ttrp。对xylD基因的DNA片段和载体DNA片段进行In-Fusion反应，用反应物转化大肠杆菌JM109菌株，从转化体得到目标质粒pSTVPtac_xylD_Ttrp。
pSTV28-Ptac-Ttrp如下构建。
合成具有tac启动子(其具有SEQ ID NO:32的序列)与trp终止子的序列的DNA片段(PtacTtrp)，将其连接到pMW219载体的KpnI-BamHI之间，由此得到pMW219-Ptac-Ttrp。等量混合分别用KpnI及BamHI消化的pSTV28和pMW219-Ptac-Ttrp，连接反应后，转化JM109，由显示Cm抗性的菌落提取质粒。对于得到的质粒，确认了分别具有一条约400bp和3kb(准确地说是389bp和2994bp)的条带，这是KpnI和BamHI双酶切反应所推测的片段长度，由此得到了pSTV28-Ptac-Ttrp。
(4)利用导入有NXA途径的Pantoea ananatis的L-谷氨酸生产
用上述pTWVPtac_ccrNXA_Km利用电穿孔法(参照美国专利6682912号)转化Pantoea ananatis NA1菌株。对于导入了pTWVPtac_ccrNXA_Km的菌株，使用在LBGM9中添加卡那霉素至最终浓度为40mg/L的平板培养基。
在添加了药物的LBGM9平板中，刮下1/6平板量的在34℃下培养过夜的Pantoea ananatis NA1菌株及各转化株的菌体，接种于装有5ml MSII-木糖或MSII-GX培养基的粗试验管中，在34℃、120rpm下培养48小时，测定残糖、L-谷氨酸(Glu)及木糖酸的蓄积量。将结果示于表2、表3。
表2(MSII-GX培养基中的Glu生产)
表3(MSII-木糖培养基中的Glu生产)
在葡萄糖和木糖的混合碳源(MSII-GX培养基)中培养Pantoea ananatisNA1菌株时，谷氨酸收率为25.7％(表2)。此时，观察到木糖酸的蓄积，说明木糖可大部分转化为木糖酸。在Pantoea ananatisNA1株中观察到木糖酸的蓄积，推测这是Pantoea ananatis的葡萄糖脱氢酶的活性所致。
另一方面，在向Pantoea ananatis NA1菌株中导入了pTWVPtac_ccrNXA_Km而成的菌株中，用葡萄糖和木糖的混合碳源(MSII-GX培养基)培养时，与亲本株相比，显示非常高的谷氨酸收率(收率69.9％)。若考虑到亲本株几乎不由木糖生成谷氨酸，且假定pTWVPtac_ccrNXA_Km导入株的来自葡萄糖的谷氨酸收率与亲本株相同，则来自木糖的经由NXA途径的谷氨酸收率可估计为86％左右。实际上，在以木糖为单一碳源培养时(MSII-木糖)，pTWVPtac_ccrNXA_Km导入株生成Glu的收率为80％(表3)。
[实施例2]向大肠杆菌中导入NXA途径
(1)大肠杆菌中的NXA途径表达
使用异柠檬酸脱氢酶(TCA循环中的酶，由异柠檬酸生成αKG)的缺陷株(Δicd)，尝试在以木糖为单一碳源的基础培养基中通过生长互补表达NXA途径。由于icd基因缺陷株无法生成αKG，因此在以木糖为单一碳源的基础培养基中无法生长，但若通过导入NXA途径而能够由木糖生成αKG，则可在该培养基中生长。
具体而言，通过以属于Keio Collection菌株的icd基因缺陷菌株JW1122株(http://cgsc.biology.yale.edu/Person.php？ID＝99553、可从在耶鲁CGSC(大肠杆菌遗传保藏中心)的大肠杆菌遗传资源中心获得)为宿主菌株，利用质粒导入并表达NXA途径，来研究NXA途径在大肠杆菌中是否能够发挥功能。
表4中示出构建的质粒和icd基因缺陷株中的生长互补的结果。确认了导入源自新月柄杆菌的NXA途径操纵子(xylX、ccrxylA、ccrxylB、xylC、xylD)和tac启动子的组合而得到的质粒pMW119Ptac_ccrNXA(实施例1中制作)的菌株在以木糖为单一碳源的M9基础培养基(平板)(Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))中可生长。
在液体培养中也进行了同样的研究。使用36连培养装置，经时测定在含有木糖或αKG作为单一碳源的M9基础培养基及E1合成培养基中的生长(O.D.)。将结果示于图1。与在平板上培养相同，载体对照株在木糖单一碳源的M9及E1培养基中未生长，而NXA途径导入株良好地生长。根据这些结果认为，本菌株通过NXA途径同化木糖而生长，即，源自新月柄杆菌的NXA途径在大肠杆菌中也发挥作用。
表4
(2)在大肠杆菌L-谷氨酸生产株中的NXA途径表达
使用αKGDH缺陷株MG1655ΔsucA(美国专利申请公开第20050106688号)作为大肠杆菌L-谷氨酸产生细菌株。向该菌株中导入pMW119Ptac_ccrNXA或作为对照的pMW119，得到MG1655ΔsucA/pMW119Ptac_ccrNXA及MG1655ΔsucA/pMW119。在添加葡萄糖(40g/L)、木糖(40g/L)、或葡萄糖及木糖(各20g/L)作为碳源的MS培养基中烧瓶培养这些菌株。仅含有葡萄糖作为碳源的培养基培养24小时，其它的培养基培养48小时。结果示于图2。图中所记载的菌株名所带的325、425及513表示克隆号。
在将碳源设为葡萄糖及木糖的混合体系的情况下，对照菌株(MG1655ΔsucA/pMW119)蓄积了15～16g/L的L-谷氨酸，与此相对，在ccrNXA操纵子表达株(MG1655ΔsucA/pMW119Ptac_ccrNXA)中的L-谷氨酸蓄积为12g/L左右，发现L-谷氨酸的蓄积、收率降低的倾向。在木糖单独作为碳源的情况下也是如此。关于副产物，对有机酸类及木糖酸进行了分析。结果可知，主要是乙酸和木糖酸蓄积。
(3)大肠杆菌中的NXA途径的限速点分析
如上所述，在大肠杆菌L-谷氨酸产生株中，由于在ccrNXA操纵子表达株的培养上清中检测到作为NXA途径的中间体的木糖酸，因此认为导入的木糖的一部分经由NXA途径的可能性较高。另外，推测了以下的问题。
i)被摄取到菌体内的木糖可通过大肠杆菌固有的木糖同化体系和NXA途径两个方面得到利用，但由于固有体系的第一个酶——木糖异构酶(XylA)与NXA途径的第一个酶——木糖脱氢酶(XDH)的活性或者底物特异性的差异，有一定量的木糖被固有体系利用，由此经由NXA途径的代谢流的流量较少的可能性。
ii)NXA途径上具有限速点或者不明的旁路途径，因而无法生成αKG的可能性。
关于i)，考虑了通过将ccrNXA操纵子表达载体由低拷贝型(pMW119)变更为中拷贝型(pTWV228)，使NXA途径的各个酶的量增加，使底物到NXA途径的摄入量增加而得到改善的可能性。
关于ii)，考虑了通过进行基于限速点的分析及其结果的育种改良而得到改善的可能性。
在上述的基础上，实施：
a)以大肠杆菌的固有木糖同化途径缺陷株(ΔsucAΔxylA)为宿主，使ccrNXA操纵子表达，来构建强制性地使碳通量经由NXA途径的菌株，并进行培养评价；及
b)使用中拷贝型载体的ccrNXA操纵子表达载体的构建和使用其表达载体的菌株的构建及培养评价、以及
c)分析限速点。
使用引物xylA-H1P1-5742-5-1(SEQ ID NO:21)及xylA-H2P2-5742-5-2(SEQ ID NO:22)，利用λ-Red法使大肠杆菌固有木糖同化基因xylA从MG1655ΔsucA中缺陷，得到MG1655ΔsucAΔxylA菌株。在该菌株中导入pMW119Ptac_ccrNXA，得到缺陷了xylA的ccrNXA操纵子表达株。
图3中示出在与(3)同样地培养缺陷了xylA的ccrNXA操纵子表达株时的L-谷氨酸培养结果。图3中，“ccrNXA”表示pMW119Ptac_ccrNXA，其后的数字表示克隆号。
ΔsucAΔxylA菌株的载体对照株无法同化木糖，仅能从葡萄糖形成菌体和生产L-谷氨酸，与此相对，在ccrNXA操纵子表达株中，发现了木糖的消耗和认为是源自木糖的L-谷氨酸产生。另一方面，可知L-谷氨酸蓄积量不及模型菌株(ΔsucA株)，且NXA途径的代谢中间体木糖酸有蓄积。该结果显示，NXA途径整体的代谢通量有可能不足。另外，未发现αKG的副生，因此认为GDH的活性表达所需要的NADPH的供给在该阶段不成问题。
接下来，使用中拷贝型载体构建ccrNXA操纵子表达载体。以pMW119Ptac_ccrNXA为模板，以PtwvPtacf(SEQ ID NO:1)和0819r(SEQ IDNO:4)为引物，对含有tac启动子区域的ccrNXA操纵子进行扩增。用SmaI消化pTWV228，与含有tac启动子区域的ccrNXA操纵子的PCR片段一起进行In-Fusion反应，用反应物转化大肠杆菌JM109菌株，由转化体获得目标质粒pTWVPtac_ccrNXA。将该质粒导入到MG1655ΔsucA菌株中，与(3)同样地对得到的菌株进行培养。将结果示于图4。图中，“ΔsucA”表示MG1655ΔsucA菌株，“/pTWV”及“/v”分别保持pTWV228。另外，pTWV110～pTWV119表示pTWV228Ptac_ccrNXA的克隆号。
在仅以葡萄糖为碳源的情况下，中拷贝型ccrNXA操纵子表达株与对照株积累大约同等的L-谷氨酸，而另一方面，在葡萄糖及木糖的混合培养系中发现L-谷氨酸蓄积反而降低的倾向。另外，发现兄弟株的表现也参差不齐。考虑的原因之一是中拷贝型表达载体的脱落。另外，与上述的菌株同样地观察到了木糖酸的蓄积。
为了确认NXA途径的各酶的活性是否因ccrNXA操纵子的拷贝数增加而增加，测定作为NXA途径的最初的酶的XDH活性。将结果示于表5。表5中所记载的菌株的“7513”及“1110”分别表示克隆号。
表5XDH(木糖脱氢酶)活性测定结果
菌株 比活性(μmol/min/mg-蛋白) 相对活性
MG1655ΔsucA/pMW119 ND
MG1655ΔsucA/pMWccrNXA7513 21.5 1.0
MG1655ΔsucA/pMW228 ND
MG1655ΔsucA/pMWccrNXA1110 140.4 6.5
ND：未检测到
注：作为将ccrNXA7513的比活性设为1时的相对活性表示。
在中拷贝表达载体导入株中，与低拷贝表达载体导入株相比，XDH活性上升约7倍。未确认到在实际的菌体内木糖在大肠杆菌固有的木糖异构酶(XylA)与XDH的分叉点处是如何分配的，由此依然认为NXA途径的第一个酶XDH活性有可能不足。但是，鉴于即使XDH活性上升也未见L-谷氨酸蓄积提高等效果，以及有木糖酸的蓄积等，认为NXA途径的任一个或多个酶有可能是限速性的。
因此，对NXA途径的限速点进行了分析。鉴于作为代谢中间体的木糖酸蓄积，认为至少限速点可能存在于从木糖酸到αKG的途径中，而非从木糖到木糖酸的代谢途径中。另外，从ccrNXA操纵子的结构上看，从木糖到木糖酸的途径由位于操纵子的第三位和第四位的基因编码，与此相对的是，从木糖酸到αKG的途径由位于操纵子的第一位、第二位、第五位的基因编码。XDH位于操纵子的第三位，其活性可在体外检测到，若检测到由位于操纵子的第五位的基因编码的酶(XylD)的活性，则也可以作为NXA操纵子整体被转录、翻译的旁证。因此，推测从木糖酸到αKG的3个反应中的某一个为限速点，进行如下所述的实验。
如下制作分别单独表达xylD、xylX及ccrxylA基因的质粒pSTVPtac_xylD_Ttrp、pSTVPtac_xylX_Ttrp及pSTVPtac_ccrxylA_Ttrp。
pSTV28-Ptac-xylX-Ttrp的制作：利用通过将除去了SfiI位点的xylX克隆到pUC18中而得的质粒即pUC18-xylX为模板，以xylX-IFS-5742-10-1(SEQ IDNO:38)及xylX-IFA-5742-10-2(SEQ ID NO:39)用作引物进行PCR制作xylX片段，采用in-fusion克隆法将扩增的片段克隆到用SmaI消化的pSTV28-Ptac-Ttrp中。
pSTV28-Ptac-ccrxylA-Ttrp的制作：利用通过将除去了SfiI位点的ccrxylA克隆到pUC18中而得的质粒即pUC18-ccrxylA为模板，以xylX-IFS-5742-10-3(SEQ ID NO:40)及xylX-IFA-5742-10-4(SEQ ID NO:41)作为引物进行PCR制作ccrxylA片段，采用in-fusion克隆法将扩增的片段克隆到用SmaI消化的pSTV28-Ptac-Ttrp中。
pSTV28-Ptac-xylD-Ttrp的制作：利用通过将除去了SfiI位点的xylD克隆到pUC18中而得的质粒即pUC18-xylD为模板，以xylX-IFS-5742-10-5(SEQ IDNO:42)及xylX-IFA-5742-10-6(SEQ ID NO:43)作为引物进行PCR制作xylD片段，采用in-fusion克隆法将扩增的片段克隆到用SmaI消化的pSTV28-Ptac-Ttrp中。
上述质粒pUC18-xylX、pUC18-ccrxylA、pUC18-xylD分别如下制作。
以新月柄杆菌CB-15株的基因组DNA为模板，以CC0823-01F_4691-87-1(SEQ ID NO:44)及CC0823-01R_4691-87-2(SEQ IDNO:45)、以及CC0823-02F_4691-87-3(SEQ ID NO:46)及CC0823-02R_4691-87-4(SEQ ID NO:47)为引物进行PCR分别对900bp及280bp的片段进行扩增。接下来，采用体外组装法(Nature Methods6(5),343-345,2009)将用SmaI消化的pUC18和上述2个扩增片段组装，由此得到除去了SfiI位点并插入有xylX基因的pUC18-xylX。
以新月柄杆菌CB-15株的基因组DNA为模板，以CC0822-01F_4691-87-5(SEQ ID NO:48)及CC0822-01R_5659-8-7(SEQ ID NO:49)、CC0822-02F_5659-8-8(SEQ ID NO:50)及CC0822-02R_5659-8-9(SEQ IDNO:51)、CC0822-03F_5659-8-10(SEQ ID NO:52)及CC0822-03R_5659-8-11(SEQ ID NO:53)、CC0822-04F_5659-8-12(SEQ ID NO:54)及CC0822-04R_5659-8-13(SEQ ID NO:55)、以及CC0822-05F_5659-8-14(SEQ ID NO:56)及CC0822-05R_4691-87-14(SEQ IDNO:57)为引物进行PCR，分别扩增了11v02(175bp)、12v02(325bp)、13v02(260bp)、14v02(193bp)及15v02(544bp)这5个片段。接着，以11v02及12v02的2片段为模板，以CC0822-01F_4691-87-5及CC0822-02R_5659-8-9为引物进行交叉PCR连结这2个片段。同样地，利用以13v02及14v02这2个片段为模板，以CC0822-03F_5659-8-12及CC0822-04R_5659-8-13为引物进行交叉PCR连结这2个片段。用体外组装法(Nature Methods6(5),343-345,2009)将上述15v02片段与这2个片段连结。利用以得到的连结片段为模板，以CC0822-01F_4691-87-5及CC0822-05R_4691-87-14作为引物进行PCR对连结片段进行扩增。接下来，采用体外组装法(Nature Methods6(5),343-345,2009)组合用SmaI消化而成的pUC18和上述连结片段，得到除去了SfiI位点并插入有ccrxylA基因的pUC18-ccrxylA。
以新月柄杆菌CB-15株的基因组DNA为模板，以CC0819-01F_4691-88-7(SEQ ID NO:17)及CC0819-01R_5659-9-1(SEQ ID NO:18)、以及CC0819-02F_5659-9-2(SEQ ID NO:19)及CC0819-02R_4691-88-10(SEQ ID NO:20)为引物进行PCR分别扩增了1130bp及653bp的片段。接下来，采用体外组装法(Nature Methods6(5),343-345,2009)将用SmaI消化的pUC18和上述2个扩增片段组装，得到除去了SfiI位点并插入有xylD基因的pUC18-xylD。
从ccrNXA操纵子表达株(MG1655ΔsucA/pTWV228Ptac_ccrNXA)和保持分别单独表达上述xylD、xylX、ccrxylA基因的质粒的菌株(MG1655ΔsucA/pSTVPtac_xylD_Ttrp、MG1655ΔsucA/pSTVPtac_xylX_Ttrp、及びMG1655ΔsucA/pSTVPtac_ccrxylA_Ttrp)制备粗酶提取液，在源自ccrNXA操纵子表达株的粗酶提取液中分别加入来自载体保持株或xylD、xylX、ccrxylA各基因的单独表达株的粗酶提取液，测定来自木糖酸的αKG生成活性。将结果示于表6。表6中，菌株名带有的“1110”表示克隆号。表6来自木糖酸的αKG生成活性测定结果
注：作为将ccrNXA1110和pSTV28-Ptac-Ttrp混合体系的比活性设为1时的相对活性表示。
在添加了xylD基因单独表达株的粗酶提取液的体系中，观察到αKG生成活性的上升。由该结果显示，xylD基因编码的木糖酸脱水酶(XylD)有可能成为在大肠杆菌中利用异种表达构建的NXA途径上的限速点。
根据酶活性的测定，在ccrNXA操纵子表达株中，通过进一步增强xylD基因的表达，有可能改善途径整体的代谢通量，因此，通过将xylD基因表达载体导入到ccrNXA操纵子表达株中，构建xylD基因表达增强株，实施以葡萄糖及木糖为碳源的L-谷氨酸生产培养评价。作为ccrNXA操纵子表达株，使用MG1655ΔsucA/pMW119Ptac_ccrNXA和MG1655ΔsucA/pTWV228Ptac_ccrNXA。
培养与(3)同样地进行。
结果示于表7。在xylD基因表达增强株中，L-谷氨酸蓄积及收率大幅地提高，L-谷氨酸蓄积达到23～25g/L(相对于对照株15～16g/L)，另外，基于消耗糖的收率达到57～60％(相对于对照株37～40％)。另外，在xylD基因表达增强株中未发现作为代谢中间体的木糖酸。另一方面，仅在搭载了中拷贝型的ccrNXA操纵子表达载体的表达株中发现xylD基因表达增强的效果，在利用低拷贝型载体的表达株中未发现ylD基因表达增强的效果。根据这些结果认为，载体的拷贝数增加引起的NXA途径整体的活性增加和xylD基因表达再增强引起的本途径的限速点的解除与L-谷氨酸生成量的提高相关。另外，测定xylD基因表达增强株的来自木糖酸的αKG生成活性，结果，与增强前相比，αKG生成活性上升约10倍(表8)。表7、表8中所记载的菌株名带有的“1110”、“17”、“19”分别表示克隆号。
表7ccrNXA操纵子+xylD表达株L-Glu培养评价结果
菌株 L-Glu(g/L) 收率(％) O.D.600
MG1655ΔsucA/pTWV228 15.7 37.6 23.9
MG1655ΔsucA/pTWVccrNXA1110 16.3 39.2 16.6
MG1655ΔsucA/pTWVccrNXA/pSTVPtacTtrp 16.3 39.2 22.9
MG1655ΔsucA/pTWVccrNXA/xylD17 25.4 61.1 14.3
MG1655ΔsucA/pTWVccrNXA/xylD19 24.2 58.1 16.0
表8来自木糖酸的αKG生成活性测定结果
注：与MG1655ΔsucA/pTWVccrNXA1110的结果不同批次的实验值。
ND：未检测到
注：作为将ccrNXA1110的比活性设为1时的相对活性表示。
[实施例3]向谷氨酸棒状杆菌导入NXA途径
(1)NXA途径导入用质粒pVK9Peftu_ccrNXA的构建
利用Clontech In-Fusion Cloning HD Kit(Clontech公司)构建在延伸因子Tu(EF-Tu)基因tuf的启动子序列(WO2008114721、SEQ ID NO:33、以下记为“Peftu”)的下游连结有xylD的序列的质粒。首先，以谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株的染色体DNA为模板，使用引物Peftu(Pst)(SEQ ID NO:58)和Peftu_Rv(SEQ ID NO:59)进行PCR，得到含有Peftu序列的片段。PCR反应使用PrimeSTAR HS聚合酶，按照该酶附带的规程进行。
另外，以pTWV228Ptac_ccrNXA为模板，使用引物Peftu_xylXABCD_fw(SEQ ID NO:60)和Peftu_xylXABCD_rv(SEQ ID NO:61)进行PCR，得到含有新月柄杆菌的xylXABCD序列的片段。PCR反应中使用PrimeSTAR GXL聚合酶，按照该酶附带的规程进行PCR反应。
接下来，将上述得到的Peftu片段和含有xylXABCD的片段与用PstI和BamHI处理后的pVK9混合，按照Clontech In-fusion HD克隆试剂盒的规程进行in-fusion反应。pVK9是对pHSG299(Takara-bio)的AvaII部位进行平末端化、并插入用BamHI及KpnI切出pHK4(日本特开平05-007491)中所含的棒状杆菌型细菌内可自主复制的区域并进行平末端化的片段而成的穿梭载体(日本特开2007-97573、美国专利申请公开20050196846号)。用上述in-fusion反应液转化大肠杆菌JM109。在将卡那霉素以最终浓度50mg/L添加到LB培养基中而成的琼脂培养基中挑选转化体。从得到的转化体获得目标质粒pVK9Peftu_ccrNXA。
(2)利用导入有NXA途径的谷氨酸棒状杆菌的L-谷氨酸生产
在上述pVK9Peftu_ccrNXA中利用电脉冲法(日本特开平2-207791)转化谷氨酸棒状杆菌ATCC13869株。使用将卡那霉素以最终浓度25mg/L添加到CM-Dex培养基而成的琼脂培养基挑选导入了pVK9Peftu_ccrNXA的菌株。另外，作为对照株，也利用同样的方法挑选将pVK9转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株而成的菌株。
通过使用坂口烧瓶进行培养来验证得到的转化株的木糖同化能力及L-谷氨酸产生能力。在以最终浓度25mg/L添加了卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基中，刮取在31.5℃下培养一昼夜的转化株的1/6板量的菌体，接种于装有Glc培养基20mL的坂口烧瓶中，添加预先干热灭菌的碳酸钙1g后，在31.5℃、120rpm下振荡培养24小时。将得到的培养液1mL接种于装有Xyl培养基(限制生物素)20mL的坂口烧瓶中，添加预先干热灭菌的碳酸钙1g后，在31.5℃、120rpm下进行振荡培养73小时。将结果示于表9。
在谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株中导入了pVK9的菌株在Xyl培养基中几乎未增殖，也未观察到L-谷氨酸生产。另一方面，在谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株中导入了pVK9Peftu_ccrNXA的菌株在Xyl培养基中增殖，蓄积L-谷氨酸。由该结果发现，通过在棒状杆菌型细菌中导入NXA途径，木糖同化能力提高，进而可由木糖生成L-谷氨酸。
表9以木糖为碳源时的L-谷氨酸生产
(3)xylD基因表达再增强株的构建
鉴于在保持pVK9Peftu_ccrNXA的谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株中蓄积有木糖酸，推测xylD基因产物的活性不足。因此，在pVK9Peftu_ccrNXA质粒上进一步导入1个拷贝的xylD基因，由此构建再增强xylD基因的NXA途径表达用质粒。
(4)xylD基因表达用质粒pVS7PmsrA_xylD的构建
利用Clontech In-Fusion Cloning HD Kit构建在msrA(肽甲硫氨酸亚砜还原酶A)基因的启动子序列(以下记为“PmsrA”)的下游连结有新月柄杆菌的xylD基因的序列的质粒。
首先，以谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株的染色体DNA为模板，使用引物PmsrA(Pst)(SEQ ID NO:62)和PmsrAR(SEQ ID NO:63)进行PCR，得到含有PmsrA序列的片段。另外，以pTWV228Ptac_ccrNXA为模板，使用引物PmsrA_xylD_fw(SEQ ID NO:64)和Peftu_xylXABCD_rv进行PCR，得到含有新月柄杆菌的xylD基因序列的片段。PCR反应使用PrimeSTAR HS聚合酶，按照该酶附带的规程进行。
接下来，将上述得到的PmsrA片段和含有xylD基因的片段与用PstI和BamHI处理后的穿梭载体pVS7(构建方法示于以下)混合，按照ClontechIn-fusion HD克隆试剂盒的方案进行in-fusion反应后，以该反应液转化大肠杆菌JM109。在将大观霉素以最终浓度25mg/L添加到LB培养基中而成的琼脂培养基中挑选转化体。从得到的转化体获得目标质粒pVS7PmsrA_xylD。
pVS7是将pVC7(日本特开2000-201692、EP1004671)的氯霉素抗性基因替换为大观霉素抗性基因而成的质粒。大观霉素抗性基因可以通过由BacillusGenetic Stock Center(BGSC)市售的大肠杆菌ECE101E株制备质粒pDG1726，从该质粒中以盒的形式取出抗性基因来获得。以pDG1726为模板，使用引物SpcR-F(SEQ ID NO:65)和SpcR-R(SEQ ID NO:66)利用PCR对大观霉素抗性基因进行扩增。将得到的基因片段与SmaI处理后的pVC7混合，按照Takara-bio株式会社的Ligation Mix<Mighty Mix>的规程进行连接反应，以该反应液转化大肠杆菌JM109。在将大观霉素以最终浓度25mg/L添加到LB培养基中而成的琼脂培养基中挑选转化体。从得到的转化体获得在pVC7中插入有大观霉素抗性基因的pVC7-spc。进而，以pVC7-spc为模板，使用引物spc(GTG start)-F(SEQ ID NO:67)和spc(stop)-R(SEQ ID NO:68)进行PCR，对大观霉素抗性基因进行扩增。
另一方面，以pVC7为模板，使用引物Spc-pVC7-Cm-F(SEQ ID NO:69)和Spc-pVC7-Cm-R(SEQ ID NO:70)进行PCR，得到从pVC7中除去了氯霉素抗性基因的DNA片段。混合该DNA片段和上述由pVC7-spc制备的大观霉素抗性基因的DNA片段，按照Clontech In-fusion HD克隆试剂盒的规程进行in-fusion反应后，以该反应液转化大肠杆菌JM109。在将大观霉素以最终浓度25mg/L添加到LB培养基中而成的琼脂培养基中挑选转化体。从得到的转化体获得目标pVS7。
(5)xylD基因再增强质粒pVK9Peftu_ccrNXA+D的构建
以pVS7PmsrA_xylD为模板，使用引物ME_Spc_fw(SEQ ID NO:71)和ME_Peftu_xylXABCD_rv(SEQ ID NO:72)对含有大观霉素抗性基因(Spc)和PmsrA_xylD的DNA片段进行扩增。将得到的DNA片段按照Epicentre公司的Ez-Tn5TM Custom Transposome Construction Kit的方案在体外插入到pVK9Peftu_ccrNXA中，转化大肠杆菌DH5α。在分别以最终浓度50mg/L、25mg/L添加卡那霉素和大观霉素而成的LB琼脂培养基中挑选转化体。通过从得到的转化体中提取质粒并确认质粒上的Spc-PmsrA_xylD序列周边的碱基序列，将确认了Spc-PmsrA_xylD序列的插入处不在Peftu_ccrNXA序列上的粒设为pVK9Peftu_ccrNXA+D。
(6)xylD基因被再增强的NXA途径导入株的L-谷氨酸生产
用电脉冲法向谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株中导入pVK9Peftu_ccrNXA+D，涂布于含有卡那霉素25mg/L的CMDex琼脂培养基中。采用与(2)同样的方法对在31.5℃下培养后生长而得到的菌株验证L-谷氨酸产生能力。将其结果示于表10。
在保持pVK9Peftu_ccrNXA+D的菌株中，与保持pVK9Peftu_ccrNXA的菌株相比，D-木糖酸的蓄积量较少，另一方面，蓄积有更多的L-谷氨酸。由此显示，可以通过再增强xylD基因来更高效地经由NXA途径从D-木糖生产L-谷氨酸。
表10xylD基因再增强的NXA途径导入株的L-谷氨酸生产
[实施例4]
(1)NXA途径基因的代替
在以上的实施例中显示，可利用报告有NXA途径的公知的细菌新月柄杆菌的基因xylX、ccrxylA、ccrxylB、xylC、xylD经由NXA途径由木糖生成谷氨酸。在以下的实施例中，验证从新月柄杆菌以外的生物种获得的xylD、xylX、ccrxylA的同源基因是否可代替新月柄杆菌的基因。选择表11中所示的生物种作为基因源。同时示出各基因的基因符号(Genebank)。另外，表12中示出各基因的碱基序列及被它们编码的氨基酸序列的序列表中的SEQ ID NO。表12中，“原始的”表示天然型基因的碱基序列，“优化后”表示根据大肠杆菌的密码子出现频率(密码子选择)优化密码子而得到的碱基序列。
另外，在以下的记载中，有时将xylD、xylX及xylA各基因同源编码的酶分别记为XylD、XylX、XylA。
表11
表12
(2)XylD、XylX、XylA活性检测用质粒pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylD_Km、pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylX_Km、pTWVPtac_ccrNXA_ΔccrxylA_Km的构建
利用Clontech In-Fusion克隆试剂盒进行构建。
首先，以pTWVPtac_ccrNXA_Km为模板，以Ptac_xylXABC_F(SEQ IDNO:111)和Ptac_xylXABC_R(SEQ ID NO:112)为引物，采用PCR对除去xylD的DNA片段进行扩增。按照Clontech In-fusion HD克隆试剂盒的规程对PCR产物进行In-Fusion反应，用反应物转化大肠杆菌JM109菌株，从转化体获得目标质粒pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylD_Km。
pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylX_Km以Ptac_xylABCD_F(SEQ ID NO:113)和Ptac_xylABCD_R(SEQ ID NO:114)为引物，pTWVPtac_ccrNXA_ΔccrxylA_Km以Ptac_xylXBCD_F(SEQ ID NO:115)和Ptac_xylXBCD_R(SEQ ID NO:116)为引物，利用与上述同样的方法构建。
(3)XylD、XylX、XylA活性检测用的Pantoea ananatis的构建
用上述pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylD_Km通过电穿孔法转化Pantoeaananatis NA1株。将构建的菌株命名为Pantoea ananatis NA2ΔxylD。Pantoeaananatis NA2ΔxylD的培养使用在LBGM9中以最终浓度40mg/L添加卡那霉素、以最终浓度12.5mg/L添加四环素而成的平板培养基。
同样地用pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylX_Km或者pTWVPtac_ccrNXA_ΔccrxylA_Km转化Pantoea ananatis NA1株，构建Pantoeaananatis NA2ΔxylX株、Pantoea ananatis NA2ΔccrxylA株。
(4)xylD、xylX、xylA同源物表达质粒的构建
yjhG、yagF表达用质粒pSTV28-Ptac-yjhG-Ttrp、pSTV28-Ptac-yagF-Ttrp如下制作。
pSTV28-Ptac-yjhG-Ttrp的制作：以大肠杆菌MG1655菌株的基因组DNA为模板，以yjhG_F(SEQ ID NO:117)及yjhG_R(SEQ ID NO:118)为引物，通过PCR对yjhG片段进行扩增，采用In-Fusion克隆法将扩增的片段克隆到用SmaI消化的pSTV28-Ptac-Ttrp中。
pSTV28-Ptac-yagF-Ttrp是以yagF_F(SEQ ID NO:119)及yagF_R(SEQ IDNO:120)作为引物，利用与上述同样的方法制作。
xylD(Hse)表达用质粒pSTV28-Ptac-xylD(Hse)-Ttrp如下制作。合成具有tac启动子、xylD(Hse)及trp终止子的序列的DNA片段(Ptac-xylD(Hse)-Ttrp)，与用EcoRV消化而成的pUC57载体(从Thermo Scientific公司购入)连结，由此得到pUC57-Ptac-xylD(Hse)-Ttrp。在合成DNA片段时，以适于大肠杆菌中的表达的方式实施密码子优化。等量混合分别用EcoRI和KpnI消化过的pSTV28和pUC57-Ptac-xylD(Hse)-Ttrp，连接反应后，转化JM109，从显示有Cm抗性的菌落提取质粒，得到pSTV28-Ptac-xylD(Hse)-Ttrp。
分别表达xylD(Amis)、xylD(Aor)、xylX(Cne)、xylX(Zga)、xylX(Tco)、xylA(Abr)、ycbD的质粒pSTV28-Ptac-xylD(Amis)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylD(Aor)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Cne)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Zga)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Tco)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylA(Abr)-Ttrp、pSTV28-Ptac-ycbD-Ttrp也采用同样的方法制作。但是，对YcbD不实施密码子优化。
xylD(Atu)表达用质粒pSTV28-Ptac-xylD(Atu)-Ttrp如下所述制作。合成具有tac启动子、xylD(Atu)及trp终止子的序列的DNA片段(Ptac-xylD(Atu)-Ttrp)，与用EcoRV消化的pJET1.2载体(从Thermo Scientific公司购入)连结，由此得到pJET1.2-Ptac-xylD(Atu)-Ttrp。在合成DNA片段时，以适于大肠杆菌中的表达的方式实施密码子优化。等量混合分别用EcoRIKpnI消化的pSTV28和pJET1.2-Ptac-xylD(Atu)-Ttrp，连接反应后，转化JM109，从显示有Cm抗性的菌落提取质粒，得到pSTV28-Ptac-xylD(Atu)-Ttrp。
分别表达xylX(Atu)、xylA(Hbo)的质粒pSTV28-Ptac-xylX(Atu)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylA(Hbo)-Ttrp也采用同样的方法制作。
xylX(Art)表达用质粒pSTV28-Ptac-xylX(Art)-Ttrp如下制作。合成具有tac启动子、xylX(Art)及trp终止子的序列的DNA片段(Ptac-xylX(Art)-Ttrp)，与用EcoRV消化的pCC1载体(从Epicentre公司购入)连结，由此得到pCC1-Ptac-xylX(Art)-Ttrp。在合成DNA片段时，以适于在大肠杆菌中的表达的方式实施密码子优化。等量混合分别用EcoRI和KpnI消化的pSTV28和pCC1-Ptac-xylX(Art)-Ttrp，连接反应后，转化JM109，从显示有Cm抗性的菌落提取质粒，得到pSTV28-Ptac-xylX(Art)-Ttrp。
(5)XylD同源物的活性检测
使用pSTV28-Ptac-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylD-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylD(Atu)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylD(Hse)-Ttrp、pSTV28-Ptac-yjhG-Ttrp、pSTV28-Ptac-yagF-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylD(Amis)-Ttrp或者pSTV28-Ptac-xylD(Aor)-Ttrp，利用电穿孔法(参照美国专利6682912号)转化Pantoea ananatisNA2ΔxylD菌株。各转化株的培养使用在LBGM9中以最终浓度40mg/L添加卡那霉素、以最终浓度12.5mg/L添加四环素、以最终浓度25mg/L添加氯霉素而成的平板培养基。
在添加了药物的LBGM9板中，刮取在34℃培养过夜的各转化株的1/6平板量的菌体，接种于装有MSII-SX培养基5ml的粗试验管中，在34℃、120rpm下培养48小时，测定L-谷氨酸(Glu)的蓄积量。将结果示于图5。
向Pantoea ananatis NA2ΔxylD中导入了pSTV28-Ptac-Ttrp的菌株的L-谷氨酸蓄积量为6.9g/L，与此相对，其它的转化株蓄积有11.1g/L～23.1g/L的L-谷氨酸。认为导入了pSTV28-Ptac-Ttrp的菌株几乎不从木糖生成L-谷氨酸，而其它的转化株可经由NXA途径从木糖生成L-谷氨酸。即，表示xylD也可用源自新月柄杆菌以外的任何生物种的xylD同源物代替。
(6)XylX同源物的活性检测
用pSTV28-Ptac-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Art)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Atu)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Cne)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Zga)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Tco)-Ttrp或者pSTV28-Ptac-xylX(Selo)-Ttrp，通过电穿孔法转化Pantoea ananatis NA2ΔxylX株。各转化株的培养使用在LBGM9中以最终浓度40mg/L添加卡那霉素、以最终浓度12.5mg/L添加四环素、以最终浓度25mg/L添加氯霉素而成的平板培养基。
在添加了药物的LBGM9板中，刮取在34℃培养过夜的各转化株的1/6平板量的菌体，接种于装有MSII-SX培养基5ml的粗试验管中，在34℃、120rpm下培养48小时，测定L-谷氨酸(Glu)的蓄积量。将结果示于图6。
向Pantoea ananatisNA2ΔxylX中导入了pSTV28-Ptac-Ttrp的菌株的L-谷氨酸蓄积量为8.7g/L，与此相对，其它的转化株蓄积有20.5g/L～27.8g/L的L-谷氨酸。认为在导入了pSTV28-Ptac-Ttrp的菌株几乎不从木糖生成L-谷氨酸，而其它的转化株可经由NXA途径由木糖生成L-谷氨酸。即，表明xylX也可用源自新月柄杆菌以外的任何生物种的xylX同源物代替。
(7)XylA同源物的活性检测
用pSTV28-Ptac-Ttrp、pSTV28-Ptac-ccrxylA-Ttrp、pSTV28-Ptac-ycbD-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylA(Hbo)-Ttrp或者pSTV28-Ptac-xylA(Abr)-Ttrp利用电穿孔法转化Pantoea ananatis NA2ΔccrxylA株。各转化株的培养使用在LBGM9中以最终浓度40mg/L添加卡那霉素、以最终浓度12.5mg/L添加四环素、以最终浓度25mg/L添加氯霉素而成的平板培养基。
在添加了药物的LBGM9平板中，刮取在34℃培养过夜的各转化株的1/6平板量的菌体，接种于装有MSII-SX培养基5ml的粗试验管中，在34℃、120rpm下培养48小时，测定L-谷氨酸(Glu)的蓄积量。结果示于图7。
向Pantoea ananatisΔccrxylA中导入了pSTV28-Ptac-Ttrp的菌株的L-谷氨酸蓄积量为1.0g/L，与此相对，其它的转化株蓄积有18.1g/L～30.7g/L的L-谷氨酸。认为导入了pSTV28-Ptac-Ttrp的菌株几乎不从木糖生成L-谷氨酸，而其它的转化株可经由NXA途径由木糖生成L-谷氨酸。即，表示xylA也可用源自新月柄杆菌以外的任何生物种的ccrxylA同源物代替。
工业实用性
根据本发明，可以使用木糖原料利用发酵法高效地制造目标物质。

Claims (16)

1.一种制造目标物质的方法，包括在含有木糖作为碳源的培养基中培养具有生产目标物质的能力的细菌而使目标物质在该培养基中生成蓄积，并从该培养基收集目标物质，其中，
所述目标物质为2-酮戊二酸或其衍生物，
所述细菌具有从木糖生成木糖酸的能力，且被赋予或增强了木糖酸脱水酶活性、2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶活性及2-酮戊二酸半醛脱氢酶活性。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述细菌通过以能够表达的形式导入分别编码木糖酸脱水酶、2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶及2-酮戊二酸半醛脱氢酶的基因而被赋予或增强了所述酶活性。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，编码木糖酸脱水酶、2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶及2-酮戊二酸半醛脱氢酶的基因来源于属于柄杆菌属(Caulobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、草螺菌属(Herbaspirillum)、游动放线菌属(Actinoplanes)、贪铜菌属(Cupriavidus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、卓贝尔氏黄杆菌属(Zobellia)、热杆菌属(Thermobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、盐单胞菌属(Halomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)或曲霉属(Asperillus)的微生物。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述细菌由于下述任一项特征而能够从木糖生成木糖酸：
(A)被赋予或增强了木糖脱氢酶活性、或木糖脱氢酶及木糖酸内酯酶活性；或
(B)具有能够催化从木糖生成木糖酸的反应的葡萄糖脱氢酶活性。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述葡萄糖脱氢酶以吡咯并喹啉醌作为辅酶，且所述细菌由于具有吡咯并喹啉醌生产能力或者由于在含有吡咯并喹啉醌的培养基中进行培养而具有葡萄糖脱氢酶活性。
6.如权利要求4所述的方法，其中，所述细菌由于以能够表达的形式导入了编码木糖脱氢酶的基因、或编码木糖脱氢酶及木糖酸内酯酶的基因而能够从木糖产生木糖酸。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述细菌还经过修饰而降低了2-酮戊二酸脱氢酶的活性。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述细菌还经过修饰而降低了琥珀酸脱氢酶的活性。
9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述细菌为肠细菌或棒状杆菌型细菌。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述细菌为泛菌属(Pantoea)细菌。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述细菌为Pantoea ananatis。
12.如权利要求9所述的方法，其中，所述细菌为埃希氏菌属细菌。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述细菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)。
14.如权利要求9所述的方法，其中，所述细菌为棒状杆菌属(Corynebacterium)细菌。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述细菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
16.如权利要求1～15中任一项所述的方法，其中，所述2-酮戊二酸衍生物为选自L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸、L-脯氨酸、腐胺及γ-氨基丁酸的物质。
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