CN103748219A - 具有纤维素酶活性的多肽以及编码它的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有纤维素酶活性的分离多肽。本发明还涉及核酸构建体、载体以及包含这些多核苷酸的宿主细胞，连同生产和使用这些多肽的方法。

Description

具有纤维素酶活性的多肽以及编码它的多核苷酸

参考序列表

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发明背景

发明领域

本发明涉及具有纤维素酶活性的多肽以及编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及核酸构建体、载体以及包含这些多核苷酸的宿主细胞连同生产和使用这些多肽的方法。

相关技术说明

蛰龙介属魔玉虫(Terebella lapidaria)(林奈(Linaeus)，1767)是只在海洋环境中生活的一种多毛动物。标本典型地长3-9cm并且直径4-5mm。

蛰龙介属魔玉虫(T.lapidaria)是将沙粒粘结在一起形成管状生境的管构建者。使用它们的多个带槽的触须，它们以有机材料、藻类和或小动物为食。蛰龙介属魔玉虫是具有广泛生态分布的海洋物种，可以发现于深达30-40m的潮间带和潮下带，潮间带和潮下带两者都是移动基体，例如沙、泥沙以及泥，而且还可以发现在硬基体上，例如岩层。

像很多食沙和岩屑的多毛动物一样，蛰龙介(Terebella)具有有力的消化生物表面活性剂的系统，并且该消化系统产生的酶已经明显演化至在中性pH或近中性pH的表面活性剂环境中有效发挥作用。

本发明提供了具有纤维素酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。

发明概述

本发明涉及具有纤维素酶活性的分离多肽，这些分离多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60%序列一致性的一种多肽；

(b)在中等严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长补体杂交的多核苷酸编码的一种多肽；

(c)与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其基因组DNA序列具有至少60%序列一致性的多核苷酸编码的一种多肽；

(d)在一个或多个(例如若干个)位置处包含一个取代、删除、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体；以及

(e)具有纤维素酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段。

本发明还涉及包含选自下组的GH9催化结构域的分离多肽，该组由以下各项组成：

(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸1至428具有至少60%序列一致性的一个催化结构域；

(b)在中等严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸12至1295，(ii)其基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长补体杂交的多核苷酸编码的一个催化结构域；

(c)与SEQ ID NO:1的核苷酸12至1295或其基因组DNA序列具有至少60%序列一致性的多核苷酸编码的一个催化结构域；

(d)在一个或多个(例如若干个)位置处包含一个取代、删除、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸1至428的变体；以及

(e)具有纤维素酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的GH9催化结构域的一个片段。

本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载体；包含这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。

本发明还涉及包含本发明的纤维素的组合物，特别是洗涤剂组合物，以及用于织物处理和用于纸浆与纸处理的组合物。

附图简要说明

图1示出对于纤维素酶的pH最佳值，使用具有还原糖试验的PASC确定。该酶展示广泛的pH最佳值并且对于此酶，最佳pH值为6。从pH6至9，活性为超过80%的最大活性。菱形，PASC+酶；三角形，PASC–酶。

图2示出蛰龙介属魔玉虫的温度曲线，在0.1M磷酸钠，pH7的0.2%AZCL-HE-纤维素上确定。

图3示出与两种商品，Endolase和Whitezym相比，蛰龙介属纤维素酶的洗涤性能，柱标记为U33M5。

定义

纤维素酶：术语“纤维素酶”是指催化β-1,4-葡聚糖中连接两个葡糖基残基的β-1,4-键水解的内切β-1,4-葡聚糖酶活性(EC3.2.1.4.)。为了本发明的目的，根据实例中描述的程序确定纤维素酶活性。

本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的纤维素酶活性的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%。

葡聚糖内切酶：术语“葡聚糖内切酶”是指内切-1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，它催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键，混合的β-1,3葡聚糖(例如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖)中的β-1,4键，以及含有纤维素组分的其他植物材料的内切水解。可以通过测量底物粘度的减小，或通过还原糖试验确定还原端增加来确定葡聚糖内切酶活性(Zhang(张)等人，BiotechnologyAdvances(生物技术进展)24:452-481)。为了本发明的目的，根据Ghose(高斯)，1987，Pure and Appl.Chem(纯粹化学和应用化学)59:257-268的程序，在pH5，40℃下，使用羧甲基纤维素作为底物，确定葡聚糖内切酶活性。

等位变体：术语“等位变体”是指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可变形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽没有变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

结合域：术语“纤维素结合域”是指介导酶结合至纤维素底物的非晶区域的酶的区域。纤维素结合域(CBD)典型地发现于葡聚糖内切酶的N末端亦或C末端末尾。

催化结构域：术语“催化结构域”是指含有酶的催化机构的酶的区域。

cDNA：术语“cDNA”是指可以通过得自真核或原核细胞的，从成熟的、剪接的mRNA分子的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录子是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”是指多核苷酸，其直接明确多肽的氨基酸序列。编码序列的边界通常由开放读码框确定，其以起始密码子例如ATG、GTG或TTG开始，并以终止密码子例如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”是指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。各个控制序列可以相对于编码多肽的多核苷酸是原生的(native)(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。这样的控制序列包括但不局限于前导序列，聚腺苷酸化序列，前肽序列，启动子，信号肽序列，和转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。可以为这些控制序列提供为了特定限制性位点引入的接头，促进这些控制序列与编码多肽的多核苷酸编码区连接。

表达：术语“表达”包括产生多肽涉及的任何步骤，包括但不局限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。

表达载体：术语“表达载体”是指包括编码多肽的多核苷酸并且可操作地与提供了其表达的控制序列相连接的线性或环状DNA分子。

片段：术语“片段”是指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端删除的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽或催化结构域；其中，该片段具有纤维素酶活性。在一个方面，片段含有至少300个氨基酸残基，例如含有SEQ ID NO:2的氨基酸3-428的片段。

高等严格条件：术语“高等严格条件”是指进行12至24小时的标准DNA印迹(Southern blotting)程序之后，长度为至少100个核苷酸的探针，在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交并杂交。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

宿主细胞：术语“宿主细胞”是指对转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型，其具有包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

分离的：术语“分离的”是指处于非天然出现的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然出现的物质，(2)任何物质，包括但不局限于从与其性质上相关的一种或多种或所有天然发生的组分至少部分除去的任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然中发现的物质，由人手工修饰的物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如编码该物质的基因的多个拷贝；使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

低等严格条件：术语“低等严格条件”是指进行12至24小时的标准DNA印迹程序之后，长度为至少100个核苷酸的探针，在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交并杂交。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。

成熟多肽：术语“成熟多肽”是指在翻译和任何翻译后修饰(例如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。在一个方面,成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至428。本领域已知，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽的混合物(即，具有不同的C末端和/或N末端氨基酸)。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”是指编码具有纤维素酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面,成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸12至1295，或其基因组DNA序列。

中等严格条件：术语“中等严格条件”是指进行12至24小时的标准DNA印迹程序之后，长度为至少100个核苷酸的探针，在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交并杂交。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。

中高等严格条件：术语“中高等严格条件”是指进行12至24小时的标准DNA印迹程序之后，长度为至少100个核苷酸的探针，在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交并杂交。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。

核酸构建体：术语“核酸构建体”是指从天然存在的基因中分离的、或以自然中不会另外出现的方式被修饰成包含核酸区段的、或合成的单链亦或双链的核酸分子，它包含一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”是指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，这样使得控制序列指导编码序列的表达。

纯化的：术语“纯化的”是指从语气天然相关的至少一种组分除去的多肽或多核苷酸。例如，如通过SDS-PAGE确定的，多肽可以是至少1%纯，例如至少5%纯、至少10%纯、至少20%纯、至少40%纯、至少60%纯、至少80%纯、至少90%纯或至少95%纯，并且如通过琼脂糖电泳确定的，多核苷酸可以是至少1%纯，例如至少5%纯、至少10%纯、至少20%纯、至少40%纯、至少60%纯、至少80%纯、至少90%纯、或至少95%纯。

序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

为了本发明的目标，使用Needleman(尼德曼)-Wunsch(翁施)算法(Needleman(尼德曼)和Wunsch(翁施)，1970，J.Mol.Biol.(分子生物学期刊)48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，例如像在EMBOSS包中的Needle(尼德尔)程序中实施(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite(欧洲分子生物学开放软件套装)，Rice(赖斯)等人，2000，Trends Genet(遗传学趋势)，16:276-277)，优选是版本5.0.0或更新版本。使用的参数是空位开放罚分10，空位拓展罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长一致性”的Needle(尼德尔)的输出(使用–nobrief选项获得)被用作百分比一致性并且被计算如下：

(一致的残基X100)/(比对长度-比对中的空位总数)

为了本发明的目标，使用Needleman(尼德曼)-Wunsch(翁施)算法(Needleman(尼德曼)和Wunsch(翁施)，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性，如在EMBOSS包中的Needle(尼德尔)程序中实施(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套装)，Rice(赖斯)等人，2000，同上)，优选是版本5.0.0或更新版本。使用的参数是空位开放罚分10，空位拓展罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长一致性”的Needle(尼德尔)的输出(使用–nobrief选项获得)被用作百分比一致性并且被计算如下：

(一致的脱氧核糖核酸X100)/(比对长度-比对中的空位总数)

子序列：术语“子序列”是指具有从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端删除的一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中子序列编码具有纤维素酶活性的片段。在一个方面,子序列含有至少900个核苷酸(例如SEQ IDNO:1的核苷酸9至1293)。

变体：术语“变体”是指包含一个变更(即在一个或多个位置处取代、插入、和/或删除一个或多个(例如若干个)氨基酸残基)的具有纤维素酶活性的一个多肽。取代是指用不同的氨基酸替换占据一个位置的氨基酸；删除是指除去占据一个位置的氨基酸；并且插入是指添加与占据一个位置的氨基酸相邻的氨基酸。

非常高等严格条件：术语“非常高等严格条件”是指进行12至24小时的标准DNA印迹程序之后，长度为至少100个核苷酸的探针，在42℃下在5XSSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交并杂交。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。

非常低等严格条件：术语“非常低等严格条件”是指进行12至24小时的标准DNA印迹程序之后，长度为至少100个核苷酸的探针，在42℃下在5XSSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交并杂交。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。

发明详述

具有纤维素酶活性的多肽

在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2成熟多肽具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的分离多肽，这些多肽具有纤维素酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽只有不超过十个氨基酸不同，例如九个氨基酸、八个氨基酸、七个氨基酸、六个氨基酸、五个氨基酸、四个氨基酸、三个氨基酸、两个氨基酸、或一个氨基酸。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位变体或由它们组成；或是其具有纤维素酶活性的片段。在另一个方面，多肽包含SEQID NO:2的成熟多肽或由其构成。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ IDNO:2的氨基酸1至428或由其构成。

在另一个实施例中，本发明涉及在非常低等严格条件、低等严格条件、中等严格条件、中高等严格条件、高等严格条件、或非常高等严格条件下与以下杂交的多核苷酸编码的具有纤维素酶活性的分离多肽：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长补体(Sambrook(萨姆布鲁克)等人，1989，Molecular Cloning,A LaboratoryManual(分子克隆实验指南)，第二版，Cold Spring Harbor(冷泉港)，纽约)。

SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段可根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的株系的、编码具有纤维素酶活性的多肽的DNA。具体而言，标准DNA印迹程序之后，这样的探针可以用于与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定并分离其中的相应基因。这样的探针可以大大短于整个序列，但是长度应该至少为15个，例如至少25个、至少35个、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针都可使用。典型地将探针进行标记，用于检测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)。本发明涵盖此类探针。

可以从制备自此类其他株系的基因组DNA或cDNA文库中筛选出与上述探针杂交的并且编码具有纤维素酶活性的多肽的DNA。来自此类其他株系的基因组或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术而进行分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他合适的载体材料上。为鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列同源的克隆或DNA,在DNA印迹法中优选使用载体材料。

对于本发明的目标，杂交是指，在非常低等到非常高等的严格条件下，多核苷酸杂交到对应于以下的标记的核酸探针上：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)或其基因组DNA序列；(iv)其全长补体；或(v)其一个子序列。在这些条件下，核酸探针杂交的分子可以使用例如X射线胶片而进行检测。

在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸12至1295。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其一个片段的一个多核苷酸。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1或其基因组序列。

对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，非常低等严格条件被定义为最佳进行12至24小时的标准DNA印迹程序之后，在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交并杂交。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。

对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，低等严格条件被定义为最佳进行12至24小时的标准DNA印迹程序之后，在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交并杂交。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。

对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，中等严格条件被定义为最佳进行12至24小时的标准DNA印迹程序之后，在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交并杂交。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。

对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，中高等严格条件被定义为最佳进行12至24小时的标准DNA印迹程序之后，在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和亦或35%甲酰胺中预杂交并杂交。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。

对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，高等严格条件被定义为最佳进行12至24小时的标准DNA印迹程序之后，在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交并杂交。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，非常高等严格条件被定义为最佳进行12至24小时的标准DNA印迹程序之后，在42℃下在5X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交并杂交。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。

在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其基因组DNA序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的多核苷酸编码的具有纤维素酶活性的分离多肽。

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如若干个)位置处包含一个取代、删除、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体。优选地，氨基酸改变的性质小，即不会显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地是一个至约30个氨基酸的小段删除；小段氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；高达约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能而促进纯化的小段延伸，例如多组氨酸序列段、抗原性表位或结合结构域。

保守取代的实例在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组内。总体上不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且例如由H.Neurath(诺伊拉特)和R.L.Hill(希尔)描述于The Proteins(蛋白质)中，Academic Press(学术出版社)，纽约。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变本质是多肽的物理化学特性的改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性、改变最佳pH、等。

可以根据本领域已知程序来鉴定多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham(坎宁安)和Wells(威尔斯)，1989，Science(科学)244:1081-1085)。在后一技术中，在分子中的每个残基处引入单一的丙氨酸突变，并对得到的突变体分子检验纤维素酶活性从而鉴定对分子活性至关重要的氨基酸残基。还参见Hilton(希尔顿)等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例如de Vos(德福斯)等人，Science(科学)255:306-312；Smith(史密斯)等人，1992,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)224:899-904；Wlodaver(沃勒达尔)等人，FEBS Lett.(欧洲生物化学学会联盟通讯)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴别必需氨基酸。

在SEQ ID NO:2的氨基酸1至428的序列中的必需氨基酸位于位置Asp56、Asp69和Glu216。因此不应取代或删除这些位置。

可以使用诱变、重组、和/或改组的已知方法，随后是相关筛选程序，例如由Reidhaar(雷德哈尔)-Olson(奥尔森)和Sauer(萨奥尔)，1988,Science(科学)241:53-57；Bowie(鲍伊)和Sauer(萨奥尔)，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625披露的那些，进行单个或多个氨基酸取代、删除和/或插入并对其进行检验。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman(洛曼)等人，1991,Biochemistry(生物化学)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)以及区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire(德比希尔)等人，1986,Gene(基因)46:145；Ner(内尔)等人，1988,DNA7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness(内斯)等人，1999,Nature Biotechnology(自然生物技术)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

在一个实施例中，引入SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸取代、删除和/或插入的个数不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、或9。

多肽可以是杂合多肽，其中一个多肽的区域融合在另一多肽的区域的N末端或C末端。

多肽还可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在本发明的多肽的N-末端或C-末端。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽,其中在翻译后产生融合多肽(Cooper(库珀)等人，1993,EMBOJ.(欧洲分子生物学学会杂志)12:2575-2583；Dawson(道森)等人，1994,Science(科学)266:776-779)。

融合多肽可以进一步包括两个多肽之间的一个切割位点。在融合多肽分泌时，切割该位点释放两个多肽。切割位点的实例包括但不局限于以下各项中披露的位点：Martin(马丁)等人，2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.(工业微生物学与生物技术杂志.)3:568-576;Svetina(斯韦蒂纳)等人，2000,J.Biotechnol.(生物技术期刊)76:245-251;Rasmussen(拉斯马森)-Wilson(威尔逊)等人，1997,Appl.Environ.Microbiol.(应用与环境微生物学)63:3488-3493；Ward(华德)等人，1995,Biotechnology(生物技术)13:498-503；以及Contreras(孔特拉斯)等人，1991,Biotechnology(生物技术)9:378-381；Eaton(伊顿)等人，1986,Biochemistry(生物化学)25:505-512；Collins(柯林斯)-Racie(莱斯)等人，1995,Biotechnology(生物技术)13:982-987；Carter(卡特)等人，1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics(蛋白质:结构、功能和遗传学)6:240-248；以及Stevens(史蒂文斯)，2003,Drug Discovery World(世界药物发现)4:35-48。

具有纤维素酶活性的多肽的来源

本发明的具有纤维素酶活性的多肽可以获得自任何属的微生物。为了本发明的目标，结合给定来源，如在此使用，术语“获得自”应指由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的株系产生的多核苷酸编码的多肽。在一个方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。

该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是革兰氏阳性菌多肽，例如具有纤维素酶活性的芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、肠球菌、土芽孢杆菌、乳酸杆菌、乳球菌、海洋芽胞杆菌、葡萄球菌、链球菌、或链霉菌多肽，或革兰氏阴性菌多肽，例如弯曲杆菌、大肠杆菌、黄质菌、梭菌、螺杆菌、泥杆菌、奈瑟菌、假单胞菌、沙门氏菌、或脲原体多肽。

在一个方面，该多肽是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌多肽。

在另一方面，该多肽是马链球菌、化脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽疫亚种多肽。

在另一方面，该多肽是不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰链丝菌、或变铅青链霉菌多肽。

该多肽还可以是真菌多肽。例如，该多肽可以是酵母多肽，例如假丝酵母、克鲁维酵母菌、毕赤酵母、子囊菌、裂殖酵母、或亚罗酵母多肽；或丝状真菌多肽，例如或一种丝状真菌多肽例如支顶孢、落叶松蕈、支链孢、曲霉、短梗霉、一种轮纹病菌(Botryospaeria)、拟蜡菌、毛喙壳属菌、金孢子菌、麦角菌、旋孢腔菌、拟鬼伞属菌、家白蚁、棒囊孢壳菌、栗疫属菌、隐球酵母、壳色单隔孢属菌、黑耳属菌、一种真菌(Filibasidium)、镰刀菌、赤霉菌、全鞭毛虫、腐质霉、耙齿菌、香菇、小球腔菌、大毁壳属菌、一种嗜热菌(Melanocarpus)、亚灰树花菌、毛霉菌、蚀丝霉属菌、新美鞭菌、脉孢菌、拟青霉属菌、青霉菌、平革菌、梨囊鞭菌属、一种真菌(Poitrasia)、假黑盘菌、一种鞭毛虫(Pseudotrichonympha)、根毛霉、裂褶菌、柱顶孢霉、踝节菌、嗜热子囊菌、梭孢壳菌、弯颈霉、木霉属菌、长毛盘菌、轮枝孢属菌、小包脚菇、或炭角菌多肽。

在另一个方面，该多肽是卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁费酵母、诺地酶母、或卵形酵母多肽。

在另一个方面中，该多肽是解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、一种霉菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、一种真菌(Chrysosporium lucknowense)、一种真菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌、一种真菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、一种真菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白囊耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、无色梭孢壳、一种真菌(Thielavia albomyces)、一种真菌(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳、一种真菌(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳、卵孢梭孢壳、一种真菌(Thielaviaperuviana)、毛梭孢壳、瘤孢梭孢壳、耐热梭孢壳、太瑞斯梭孢壳霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉多肽。

在其他方面，该多肽衍生自海洋生物，例如多毛动物，例如蛰龙介属物种，例如蛰龙介属魔玉虫(Terebella lapidaria)。

将理解，对于上述物种，本发明涵盖了完全和不完全状态以及其他分类学上的等效物，例如无性型，不管它们所已知的种类名称是什么。本领域普通技术人员将容易地识别鉴定适当等效物。

在多个培养物保藏，例如美国种质保存中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)、荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)、以及农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(NRRL)中，对于公众而言，这些物种的株系是容易获得的。该多肽可以被鉴定或获得自其他来源，包括使用上述探针从自然界(例如土壤、堆肥、水、等)分离的微生物。用于从自然生境分离微生物的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用这个或这些探针检测到编码多肽的多核苷酸，那么可以通过利用本领域普通技术人员熟知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如Sambrook(萨姆布鲁克)等人，1989，同上)。

多核苷酸

本发明还涉及本发明的分离的编码多肽的多核苷酸，如以上所述。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域已知的并且包括分离自基因组DNA或cDNA或其组合。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以是有效的，例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选，以检测具有共享的结构特征的克隆DNA片段。参见例如Innis(英尼斯)等人，1990，PCR:A Guide to Methods and Application(PCR：方法和应用的指导)，Academic Press(学术出版社)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。该多核苷酸可以克隆自蛰龙介属株系或相关有机体，并且因此，例如可以是该多核苷酸多肽编码区的等位基因的或物种的变体。

对于合成基本上类似于该多肽的多肽而言，编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰可以是必需的。术语“基本上类似于”该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽在一些工程化方式方面可以不同于从其天然来源分离的多肽，例如具体活性、热稳定性、最佳pH、等方面不同的变体。可以如下构建这些变体：在呈现为在SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其基因组DNA序列(例如其子序列)的多核苷酸的基础上，和/或通过引入不导致多肽的氨基酸序列变化的核苷酸取代，但是其对应于旨在用于产生该酶的宿主有机体的密码子使用，或通过引入可以引起不同氨基酸序列的核苷酸取代。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如Ford(福特)等人，1991，Protein Expressionand Purification(蛋白表达与纯化)2:95-107。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列可比较的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是启动子序列，由宿主细胞识别的多核苷酸，用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸。启动子序列包含介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的、和杂交的启动子，并且可以获得自编码细胞外或细胞内多肽的基因，对于宿主细胞而言，是同源的亦或异源的。

在细菌宿主细胞中，适合指导本发明的核酸构建体转录的启动子的实例是获得自以下各项的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon(埃贡)等人，1988，Gene(基因)69:301-315)，天蓝色链霉菌琼脂酶基因(dagA)、

和原核β-内酰胺酶基因(Villa(维拉)-Kamaroff(卡玛诺夫)等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)75:3727-3731)，连同tac启动子(DeBoer(德波尔)等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)80:21-25)。另外的启动子描述于“Useful proteins from recombinant bacteria(来自重组细菌的有用蛋白)”，Gilbert(吉尔伯特)等人，1980，Scientific American(科学美国人)，242:74-94；以及Sambrook(萨姆布鲁克)等人，1989，同上。

在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下各项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶–样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢菌Daria(达莉亚)(WO00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(奎恩)(WO00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶I、里氏木霉葡聚糖内切酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶III、里氏木霉葡聚糖内切酶IV、里氏木霉葡聚糖内切酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，连同NA2-tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；及其突变的、截短的、和杂交的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，Yeast(酵母)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的合适的转录终止子序列。该终止子序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的3’末端。本发明中可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何终止子。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸去氢酶。Romanos(罗马诺斯)等人，1992，同上，描述了酵母宿主细胞的其他有用的终止子。

控制序列还可以是一个合适的前导序列，当被转录时是对于通过宿主细胞来翻译而言重要的mRNA的一个非翻译区。该前导序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5’末端。可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何前导序列。

丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从以下各项的基因中获得的：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

酵母宿主细胞的合适的前导子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何多腺苷酸化序列。

丝状真菌宿主细胞的优选的多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶。

Guo(郭)&Sherman(谢尔曼)，1995，Mol.Cellular Biol.(分子与细胞生物学杂志)15:5983-5990描述了酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列。

控制序列还可以是编码连接至多肽的N末端的信号肽并指导该多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区域。该多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含在翻译读码框内与编码该多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。该编码序列不天然地包含一个信号肽编码序列时，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码序列。

细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB11837麦芽淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。Simonen(西蒙纳)和Palva(帕尔瓦)，1993，Microbiological Reviews(微生物学评论)57:109-137描述了另外的信号肽。

丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉葡聚糖内切酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

酵母宿主细胞有用的信号肽是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。Romanos(罗马诺斯)等人，1992，同上，描述了其他有用的信号肽编码序列。

控制序列还可以是编码位于多肽的N末端的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原一般是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在多肽的N末端处信号肽序列和前肽序列都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻多肽的N末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的N末端。

还会令人希望的是，添加相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。在原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤存在下，被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以接合在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这类位点处插入或取代编码该多肽的多核苷酸。可替代地，通过将该多核苷酸或者包含该序列的核酸构建体插入到用于表达的适当载体中可以表达该多核苷酸。在产生该表达载体过程中，将编码序列定位在该载体中，这样使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可为可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可为线性的或闭合的环状质粒。

该载体可以是一种自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，该载体的复制与染色体复制无关，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒、或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含了有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)、或转座子。

该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不局限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)、连同其等效物。优选在曲霉细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。

该载体优选包含允许将该载体整合到宿主细胞基因组中或者该载体在细胞中不依赖该基因组而自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组在一个或多个染色体内的一个或多个精确位置处整合到该宿主细胞的基因组中的额外的多核苷酸。为了增加在一个精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，通过非同源重组可以将该载体整合到该宿主细胞的基因组内。

对于自主复制，该载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞内进行自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞内起作用的介导自主复制的任何质粒复制因子。术语“复制起点”或“质粒复制因子”是指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞内使用的复制起点的实例是2微米的复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems(格姆斯)等人，1991,Gene(基因)98:61-67;Cullen(卡伦)等人，1987,Nucleic AcidsRes.(核酸研究)15:9163-9175;WO00/24883)。根据WO00/24883中披露的方法可以实现AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个额外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个可扩增的选择性标记基因与该多核苷酸可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其中通过在适当选择性试剂存在下培养细胞可以选择包含扩增的选择性标记基因拷贝和由此额外的多核苷酸拷贝的细胞。

用于连接上文所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通技术人员来说是熟知的(参见，例如Sambrook(萨拉布鲁克)等人，1989，同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早先所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在重组产生本发明的多肽中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何格兰氏阳性细菌或格兰氏阴性细菌。格兰氏阳性细菌包括但不局限于芽孢杆菌、梭菌、肠球菌、土芽孢杆菌、乳酸杆菌、乳球菌、海洋芽胞杆菌、葡萄球菌、链球菌、以及链霉菌。格兰氏阴性细菌包括但不局限于弯曲杆菌、大肠杆菌、黄质菌、梭杆菌、螺杆菌、泥杆菌、奈瑟菌、假单胞菌、沙门氏菌、以及尿素原体。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不局限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不局限于似马链球菌、化脓链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽疫亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不局限于不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰链丝菌、以及变铅青链霉菌细胞。

通过原生质体转化(参见例如，Chang(常)和Cohen(科恩)，1979，Mol.Gen.Genet.(分子和普通遗传学)168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young(杨格)和Spizizen(斯皮宰曾)，1961，J.Bacteriol.(细菌学杂志)81:823-829；或者Dubnau(杜博楠)和Davidoff-Abelson(大卫多夫-阿贝尔森)，1971，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，Shigekawa(茂川)和Dower(道尔)，1988，Biotechniques(生物技术)6:742-751)、或者轭合(参见，例如Koehler(凯勒)和Thorne(索恩)，1987，J.Bacteriol.(细菌学杂志)169:5271-5278)可以实现将DNA引入到芽孢杆菌细胞中。通过原生质体转化(参见例如，Hanahan(哈那汗)，1983,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower(道尔)等人，1988,Nucleic Acids Res.(核酸研究)16:6127-6145)可以实现将DNA引入到大肠杆菌细胞中。通过原生质体转化和电穿孔(参见例如Gong(龚)等人，2004,Folia Microbiol.(Praha)(FOLIA微生物(布拉格))49:399-405)，轭合(参见例如，Mazodier(马佐迪耶)等人，1989,J.Bacteriol.(细菌学杂志)171:3583-3585)，或转导(参见例如，Burke(伯克)等人，2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)98:6289-6294)可以实现将DNA引入到链霉菌细胞中。通过电穿孔(参见例如，Choi(崔)等人，2006,J.Microbiol.Methods(微生物学方法杂志)64:391-397)或轭合(参见例如，Pinedo(皮内多)和Smets(斯梅茨)，2005,Appl.Environ.Microbiol.(应用与环境微生物学)71:51-57)可以实现将DNA引入到假单胞菌细胞中。通过天然感受态(参见例如，Perry(佩里)和Kuramitsu(仓光)，1981，Infect.Immun.(感染与免疫)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，Catt(卡特)和Jollick(朱力克)，1991，Microbios(微生物)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，Buckley(巴克利)等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.(应用与环境微生物学)65:3800-3804)或者轭合(参见，例如，Clewell(克拉维尔)，1981，Microbiol.Rev.(微生物学评论)45:409-436)可以实现将DNA引入到链球菌细胞中。然而，可以使用在本领域已知的任何方法将DNA引入到宿主细胞中。

该宿主细胞还可以是真核细胞，例如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

该宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用，“真菌”包括子囊菌门、担子菌门、壶菌门、以及接合菌门(如由Hawksworth(霍克斯沃思)等人在Ainsworthand Bisby’s Dictionary of The Fungi(真菌的Ainsworth(安斯沃斯)和Bisby(比斯比)词典，第8版，CAB International,University Press(CAB国际大学出版社)，剑桥，英国中定义)连同卵菌门(如在Hawksworth(霍克斯沃思)等人，1995，同上，第171页中引用)以及所有有丝分裂真菌((霍克斯沃思)等人，1995，同上)。

该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用，“酵母”包括产子囊孢子酵母(内孢霉目)、产担子酵母，以及属于半知菌(芽生菌)的酵母。因为酵母的分类在将来可能改变，所以对于本发明的目标，酵母酵母应如在Biologyand Activities of Yeast(酵母生物学和活性)(Skinner(斯金纳)，F.A.,Passmore(帕斯莫尔)，S.M.,以及Davenport(达文波特)，R.R.，编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series(应用细菌学研讨会系列)第9期，1980)中所述进行定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母、汉逊酵母、克鲁维酵母菌、毕赤酵母、酵母菌属酵母、裂殖酵母、或亚罗酵母细胞，例如产乳糖酶酵母、卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁费酵母、诺地酶母、卵形酵母、或亚罗解脂酵母细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括所有丝状形式的细分真菌门和卵菌门(如由Hawksworth(霍克斯沃思)等人，1995，同上所定义)。丝状真菌的特征一般在于由甲壳素、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝伸长来进行的并且碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，酵母(例如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽而进行的，并且碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是支顶孢属真菌、曲霉、短梗霉、烟管菌属真菌、拟蜡菌、金孢子菌、鬼伞菌、革盖菌、隐球酵母、一种真菌(Filibasidium)、镰刀菌、腐质霉、大毁壳属真菌、毛霉菌、蚀丝霉、新美鞭菌、脉孢菌、拟青霉、青霉菌、平革菌、白腐菌、梨囊鞭菌属、侧耳属真菌、裂褶菌、踝节菌、嗜热子囊菌、梭孢壳菌属真菌、弯颈霉、栓菌、或木霉细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌、干拟蜡菌、一种真菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌、一种真菌(Ceriporiopsispannocinta)、一种真菌(Ceriporiopsisrivulosa)、一种真菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌、一种真菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、一种真菌(Chrysosporiumlucknowense)、一种真菌(Chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌、一种真菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛云芝菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射纹革菌、杏鲍菇、太瑞斯梭孢壳霉、长绒毛栓菌、韩国白腐菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木细胞。

可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化以及本身已知的一种方式进行细胞壁再生的一个过程来转化真菌细胞。用于转化曲霉和木霉宿主细胞的合适程序描述于EP238023，Yelton(约尔顿)等人，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)81:1470-1474,以及Christensen(克里斯滕森)等人，1988,Bio/Technology(生物/技术)6:1419-1422中。Malardier(马拉迪耶)等人，1989，Gene(基因)78:147-156和WO96/00787描述了用于转化镰刀菌物种的合适方法。可以使用Becker(贝克尔)和Guarente(瓜伦特)在Abelson,J.N.(阿贝尔森)和Simon,M.I.(西蒙)编辑，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology(对酵母遗传学和分子生物学的指导)，Methods in Enzymology(酶学方法)，194卷，pp182-187,Academic Press,Inc.(学院出版社有限公司)，纽约；Ito(伊藤)等人，1983,J.Bacteriol.(细菌学杂志)153:163；以及Hinnen(希南)等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)75:1920中描述的程序来转化酵母。

产生方法

基于鉴定为SEQ ID NO:1的核苷酸序列，可以从多种载体，例如GeneArt公司(GENEART AG BioPark,Josef-Engert-Str.11(约瑟夫-恩哥特街11号)，93053，Regensburg(雷根斯堡)，德国)或DNA2.0(DNA2.0,1430O'BrienDrive(奥布赖恩驱动)，Suite E(套装E)，Menlo Park(门洛帕克)，加利福尼亚州94025，美国，获得合成基因。合成基因可以被设计成结合额外的DNA序列，例如限制酶切位点或同源重组区，以促进指导克隆到表达载体中。

可替代地，使用合成的寡核苷酸引物，例如(SEQ ID NO:3)和(SEQ IDNO:4)，可以使用一个简单的PCR反应来扩增来自SEQ ID NO:1基因的全长开放读码框。然后可以将该基因克隆到表达载体中，例如，如以上所述，并且在宿主细胞，例如在米曲霉中表达。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包括：(a)培养细胞，该细胞处于其野生型形式，在有益于产生该多肽的条件下产生该多肽；以及(b)回收该多肽。在一个优选的方面，该细胞是蛰龙介细胞。在一个更优选的方面，该细胞是蛰龙介属魔玉虫(Terebella lapidaria)细胞。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包括：(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；以及(b)回收该多肽。

使用本领域熟知的方法，在适合产生该多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过在合适的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，在实验室或工业发酵罐中，进行摇瓶培养、以及小规模或大规模发酵(包括连续，分批，补料分批，或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的程序，在包含碳源和氮源以及无机盐的合适的营养培养基中进行培养。合适的培养基从商业供应商处可获得，或者可根据公开的组成(例如，在美国模式培养物保藏所目录中)来制备。如果多肽分泌到培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。

可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法可包括使用特异抗体、形成酶产物、或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可以通过常规程序，包括，但不局限于离心，过滤，提取，喷雾干燥，蒸发，或沉淀，从营养培养基中回收该多肽。

可以通过本领域已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不局限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及大小排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、溶解度差(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或者提取(参见，例如ProteinPurification(蛋白纯化)，J.-C.Janson(詹森)和Lars Ryden(拉尔斯赖登)编辑，VCH Publisher(VCH出版社)，纽约，1989)。

在一个替代方面，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。

植物

本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，该分离的植物包含本发明的多核苷酸，以用来按可回收的量表达并且产生多肽或结构域。多肽或结构域可从植物或植物部分回收。可替代地，可以像这样使用含有多肽或结构域的植物或植物部分，以改善食品或饲料的质量，例如改善营养价值，适口性和流变性质，或破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，例如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草例如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草例如剪股颖属(Agrostis)和谷物例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱、和玉蜀黍(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草，豆类，例如羽扇豆、马铃薯、甜菜、豌豆、菜豆和大豆，以及十字花的植物(十字花科)、例如花椰菜、油菜籽，以及紧密相关的模式生物拟南芥。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎连同包含这些部分的单个组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特定的植物细胞区室，例如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论组织来源，也被认为是植物部分。同样，植物部分，例如分离以促进本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。

还包括在本发明的范围内的是这类植物、植物部分、和植物细胞的后代。

可以根据本领域已知方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。简而言之，通过将编码该多肽或结构域的一个或多个表达构建体结合到植物宿主基因组或叶绿体基因组中并且将所得改性植物或植物细胞繁殖成转基因的植物或植物细胞构建植物或植物细胞。

表达构建体方便的是核酸构建体，它包含编码多肽或结构域的多核苷酸，该多核苷酸可操作地与选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当调节序列连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定其中已经整合了此表达构建体的宿主细胞有用的选择性标记和将此构建体引入到所讨论的植物中所必需的DNA序列(后者取决于要使用的DNA引入方法)。

例如基于希望在何时、何处、和怎样表达该多肽或结构域来确定调节序列，例如启动子和终止子序列以及任选的信号序列或转运序列的选择。例如编码多肽或结构域的基因的表达可以是组成性的或可诱导的，或者可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以被靶向至特定组织或植物部分，例如种子或叶。例如，由Tague(塔格)等人，1988,Plant Physiology(植物生理学)86:506描述的调节序列。

对于组成性表达，可以使用玉蜀黍泛素1、或水稻肌动蛋白1启动子(Franck(弗兰克)等人，1980,Cell(细胞)21:285-294；Christensen(克里斯滕森)等人，1992,Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)18:675-689；Zhang(张)等人，1991,Plant Cell(植物细胞)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织(例如种子、马铃薯块茎、和果实)(Edwards(爱德华兹)和Coruzzi(科鲁兹)，1990,Ann.Rev.Genet.(遗传学年鉴)24:275-303)，或来自代谢库组织(例如分生组织)(Ito(伊藤)等人，1994,Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)24:863-878)，种子特异性启动子，例如来自水稻的谷蛋白，醇溶谷蛋白，球蛋白，或白蛋白启动子(Wu(吴)等人，1998,Plant CellPhysiol.(植物与细胞生理学)39:885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(Conrad(康拉德)等人，1998,J.Plant Physiol.(植物生理学杂志)152:708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen(陈)等人，1998,Plant Cell Physiol.(植物与细胞生理学)39:935-941)，来自欧洲油菜的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO91/14772中所述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，例如来自水稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka(京冢)等人，1993,Plant Physiol.(植物生理学))，102:991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra(密特拉)和Higgins(希金斯)，1994,Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)26:85-93)，来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya(加贺)等人，1995,Mol.Gen.Genet.(分子和普通遗传学)248:668-674)，或伤口可诱导的启动子，例如马铃薯pin2启动子(Xu(徐)等人，1993,Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)22:573-588)。同样，启动子可通过非生物处理，例如温度、干旱、或盐度变化来诱导，或通过外源施加激活启动子的物质，例如乙醇，雌激素，植物激素例如乙烯、脱落酸、和赤霉酸、以及重金属来诱导。

还可使用启动子增强子元件，从而在植物中达到多肽或结构域的更高表达。例如，启动于增强子元件可以是位于启动子和编码多肽或结构域的多核苷酸序列之间的内含子。例如Xu(徐)等人，1993，同上,披露了使用水稻肌动蛋白1基因的第一内含子来增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其他部分可选自本领域可用的那些。

可以根据本领域已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(Gasser(加塞尔)等人，1990,Science(科学)244:1293；Potrykus(波特里库斯)，1990,Bio/Technology(生物/技术)8:535;Shimamoto(岛本)等人，1989,Nature(自然)338:274)。

当前，根瘤土壤杆菌介导的基因转移是用于产生转基因双子叶植物的所选方法(对于综述，参见Hooykas(霍伊卡)和Schilperoort(舍勒博特)，1992，PlantMolecular Biology(植物分子生物学)19:15-38)并且可以用于转化单子叶植物，尽管对于这些植物而言通常使用其他转化方法。当前，用于产生转基因单子叶植物的所选方法是胚性愈伤组织或发育的胚的粒子轰击(用转化DNA包被的微观金或钨颗粒)(Christou(克里斯托)，1992,Plant J.(植物杂志)2:275-281；Shimamoto(岛本)，1994,Curr.Opin.Biotechnol.(生物技术新见)5:158-162；Vasil(瓦西尔)等人，1992,Bio/Technology(生物/技术)10:667-674)。如Omirulleh(奥米如列)等人，1993,Plant Molecular Biology(植物分子生物学)21:415-428中所述，单子叶植物转化的替代方法基于原生质体转化。根据本披露使用的额外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204中所述的那些(这二者都通过引用以其全文结合在此)。

转化后，根据本领域熟知的方法,选出已结合了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常转化程序被设计成通过使用例如用两种分开的T-DNA构建体共转化或通过特异性重组酶进行的选择基因的位点特异性切除，在再生期间亦或在后代中选择性清除选择基因。

除了用本发明的构建体直接转化具体的植物基因型之外，可以通过将具有构建体的植物与缺乏构建体的第二植物杂交来制成转基因植物。例如，可以通过杂交，而不需要曾经直接转化给定品种的植物，将编码多肽或结构域的构建体引入到具体的那一植物品种中。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此类后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过用供体植物系给起始系异体授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204中。

可以通过回交转换的过程产生植物。例如，植物包括被称为回交转换的基因型、系、近交种、或杂种的植物。

遗传标记可以用于协助将本发明的一种或多种转基因从一种遗传背景渗入到另一种遗传背景中。相对于常规育种，标记辅助选择提供了很多优点，其中它可以用于避免由表型变异引起的错误。此外，遗传标记可以提供关于具体杂交的个体后代中的精英种质的相对程度的数据。例如，当具有希望的性状(否则会具有非农艺学上希望的遗传背景)的植物与精英亲本杂交时，遗传标记可以用于选择不仅拥有感兴趣的性状、而且还具有较大比例的希望的种质的后代。以此方式，将一个或多个性状渗入具体的遗传背景所需的世代数被最小化。

本发明还涉及产生本发明多肽或结构域的方法，该方法包括：(a)在有益于产生多肽或结构域的条件下，培养包含编码该多肽或结构域的多核苷酸的转基因植物或植物细胞，以及(b)回收该多肽或结构域。

洗涤剂组合物

在一个实施例中，本发明针对洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含结合一种或多种额外的清洁组合物组分的本发明的酶。额外的组分的选择在普通技术人员技术内并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。

组分的选择可以包括(用于纺织品保养)有待清洁的纺织品的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制的考虑。尽管根据一种具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括额外的功能性。

本发明的酶

在本发明的一个实施例中，可以将本发明的多肽以对应于以下的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升的洗涤液体0.001-100mg的蛋白，例如0.01-100mg的蛋白，优选是0.005-50mg的蛋白，更优选是0.01-25mg的蛋白，甚至更优选是0.05-10mg的蛋白，最优选是0.05-5mg的蛋白，并且甚至最优选是0.01-1mg的蛋白。

可以使用常规稳定剂稳定本发明的清洁剂组合物的一种或多种酶，这些常规稳定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO92/19709和WO92/19708中所述配置该组合物。

本发明的多肽还可以结合到WO97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，通过引用将其结合在此。

表面活性剂

洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的，或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1%至60%的水平存在，例如约1%至约40%、或约3%至约20%、或约3%至约10%。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1%至约40%，例如从约5%至约30%(包括从约5%至约15%)、或从约20%至约25%的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)，LAS的异构体，支链烷基苯磺酸盐(BABS)，苯基链烷磺酸盐，α-烯烃磺酸盐(AOS)，烯烃磺酸盐，链烯烃磺酸盐，链烷-2,3-二基双(硫酸盐)，羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐，烷基硫酸盐(AS)(例如十二烷基硫酸钠(SDS))，脂肪醇硫酸盐(FAS)，伯醇硫酸盐(PAS)，醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)，仲链烷磺酸盐(SAS)，石蜡烃磺酸盐(PS)，酯磺酸盐，磺化的脂肪酸甘油酯，α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))，烷基琥珀酸或烯基琥珀酸，十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)，氨基酸的脂肪酸衍生物，磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯，及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1%至约40%的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)、二甲基双十八烷基氯化铵(DSDMAC)、和烷基苄基二甲基铵，及其组合，烷基季铵化合物，烷氧基化的季铵(AQA)。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2%至约40%的非离子型表面活性剂，例如从约0.5%至约30%，特别是从约1%至约20%、从约3%至约10%，例如从约3%至约5%、或从约8%至约12%。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品，及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1%至约40%的半极化表面活性剂。半极化表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲胺氧化物、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲胺氧化物和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺，及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1%至约40%的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、和磺基甜菜碱，及其组合。

助水溶剂

助水溶剂是一种化合物，该化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)，然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如Hodgdon(霍奇登)和Kaler(卡勒)的综述，Current Opinion in Colloid&Interface Science(胶体&界面科学新见)，12:121-128。助水溶剂并不显示一个临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集并且脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。很多助水溶剂反而示出一个连续型聚集过程，其中聚集的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相状态、稳定性、和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。洗涤剂组合物中助水溶剂的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高黏度。

洗涤剂可以包含按重量计0-5%，例如约0.5%至约5%、或约3%至约5%的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠、及其组合。

增效剂和助增效剂

洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65%，例如约5%至约50%的洗涤剂增效剂或助增效剂、或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，增效剂的水平典型地是40%-65%，特别是50%-65%。增效剂剂和/或助增效剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螫合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何增效剂和/或助增效剂。增效剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自Hoechst(赫斯特公司)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚胺基二乙醇(DEA)和2,2’,2”-次氨基三乙醇(TEA)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。

洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-50%，例如约5%至约40%的洗涤剂助增效剂、或其混合物。洗涤剂组合物可以只包括助增效剂，或结合一种增效剂，例如沸石增效剂。助增效剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或链烯基琥珀酸。额外的特定实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N、N-二乙酸(SLDA)、氨基乙磺酸-N、N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)，及其组合和盐。另外的示例性增效剂和/或助增效剂描述于例如WO09/102854、US5977053中

漂白系统

洗涤剂可以包括一个漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。合适的漂白系统组分包括漂白催化剂，光漂白剂(photobleach)，漂白活化剂，过氧化氢源(例如过碳酸钠和过硼酸钠)，预成型的过酸及其混合物。合适的预成型过酸包括，但不局限于：过氧羧酸及盐、过碳酸及盐、过亚氨酸及盐、过氧单硫酸及盐，例如过硫酸氢钾制剂(R)、及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，该系统可以包括例如无机盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是单-或四-水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐，结合形成漂白活化剂的过酸。漂白活化剂在此指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待于在此使用的合适的漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些，合适的实例是四乙酰乙二胺(TAED)、3,5,5三甲基己酰氧基苯磺酸钠、双过氧化十二酸、4-(十二烷基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(3,5,5-三甲基己酰氧基)苯磺酸盐(ISONOBS)、四乙酰乙二胺(TAED)和4-(壬酰氧基)苯磺酸盐(NOBS)，和/或WO98/17767中披露的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP624154中，并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像Triacin(特雷森))具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三乙酸甘油酯在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的增效能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、亚胺、或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，例如6-(邻苯二甲酰基氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：

(iii)及其混合物；其中每个R¹独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选每个R¹独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选每个R1独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-三癸基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO2007/087258、WO2007/087244、WO2007/087259、WO2007/087242中。合适的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌

聚合物

洗涤剂可以包含按重量计0-10%，例如0.5%-5%、2%-5%、0.5%-2%或0.2%-1%的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物的功能可以是如以上提到的助增效剂，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污物释放、染料转移抑制、油污清洁和/或抗发泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的上述特性和/或多于一种的下述主旨。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(乙烯亚胺)、羧甲基菊糖(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水改性CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯和聚氧乙烯对苯二甲酸乙二酯的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基磺酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO2006/130575中。也考虑了上述聚合物的盐。

织物着色剂

本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物着色剂，例如染料或色素，当所述织物与包含所述洗涤剂组合物的洗涤液接触时，这些配制在洗涤剂组合物中的织物着色剂可以沉积在织物上，由此通过可见光的吸收/反射来改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物着色剂改变表面的色彩。合适的织物着色剂包括染料和染料-黏土轭合物，并且还可以包括色素。合适的染料包括小分子染料和聚合物染料。合适的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO2005/03274、WO2005/03275、WO2005/03276和EP1876226中(将其通过引用结合在此)。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt%至约0.2wt%、从约0.00008wt%至约0.05wt%、或甚至从约0.0001wt%至约0.04wt%的织物着色剂。该组合物可以包括从0.0001wt%至0.2wt%的织物着色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。合适的着色剂还披露于例如WO2007/087257、WO2007/087243中。

(额外的)酶

洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种额外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。

一般说来，所选择的一种或多种酶的特性应与所选择的清洁剂相容(即最佳pH，与其他酶的和非酶的成分的相容性等)，并且这一种或多种酶应以有效量存在。

纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。合适的的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳菌属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757以及WO89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰刀菌产生的真菌纤维素酶

尤其合适的纤维素酶是具有颜色保护益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，例如描述于WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中的那些。

可商购的纤维素酶包括可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM、和Carezyme^TM(Novozymes A/S(诺维信公司))、Clazinase^TM、和PuradaxHA^TM(Genencor International Inc.(杰能科国际公司))、以及KAC-500(B)^TM(KaoCorporation(花王株式会社)。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选微生物来源。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，尤其是衍生自芽孢杆菌的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO89/06279中)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和描述于WO89/06270与WO94/25583中的镰刀菌蛋白酶。

有用的蛋白酶的实例是描述于WO92/19729，WO98/20115，WO98/20116和WO98/34946中的变体，尤其是在一个或多个以下位置处发生取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、和274。

优选的可商购蛋白酶包括Alcalase^TM、Savinase^TM、Primase^TM、Duralase^TM、Esperase^TM、和Kannase^TM(Novozymes A/S(诺维信公司))，Maxatase^TM、Maxacal^TM、Maxapem^TM、Properase^TM、Purafect^TM、Purafect OxP^TM、FN2^TM、和FN3^TM(Genencor International Inc.(杰能科国际公司))。

脂肪酶和角质酶：合适的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。实例包括来自嗜热真菌的脂肪酶，例如来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)，如描述于EP258068和EP305216中，来自腐质霉，例如像描述于WO96/13580中的腐蚀菌(H.insolens)的角质酶，假单胞菌脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、斯氏假单胞菌(GB1,372,034)、荧光假单胞菌、假单胞菌属株系SD705(WO95/06720和WO96/27002)、威斯康星假单胞菌(WO96/12012)，芽孢杆菌脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois(达特斯)等人，BiochemicaetBiophysicaActa(生物化学与生物物理学报)，1131:253-360)，嗜热脂肪芽胞杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(WO91/16422)。

其他实例是脂肪酶变体，例如描述于WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079、WO97/07202、WO00/060063、WO2007/087508和WO2009/109500中的那些。

优选的可商购脂肪酶包括Lipolase^TM、Lipolase Ultra^TM和Lipex^TM；Lecitase^TM、Lipolex^TM；Lipoclean^TM、Lipoprime^TM(Novozymes A/S(诺维信公司))。其他可商购的脂肪酶包括Lumafast(Genencor Int Inc(杰能科国际公司))；Lipomax(Gist-Brocades公司/Genencor Int Inc(杰能科国际公司))以及来自Solvay(苏威公司)的芽胞杆菌脂肪酶。

淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌，例如地衣芽孢杆菌的特定株系的α-淀粉酶，更加详细地描述于GB1,296,839中。

有用的淀粉酶的实例是描述于WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873、和WO97/43424中的变体，尤其是具有一个或多个以下位置中的取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、和444。

可商购的淀粉酶是Stainzyme^TM、Natalase^TM、Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM和BAN^TM(Novozymes A/S(诺维信公司))、Rapidase^TM和Purastar^TM(来自Genencor International Inc.(杰能科国际公司))。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞菌，例如灰盖鬼伞的过氧化物酶及其变体，如描述于WO93/24618、WO95/10602、和WO98/15257中的那些。

可商购的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(Novozymes^TM(诺维信公司))。

这一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而被包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即独立添加剂或组合添加剂，可以被配制为，如粒料、液体、浆料、等。优选的洗涤剂添加剂配制品为粒料，尤其是无尘粒料；液体，特别是稳定的液体；或浆料。

可以产生无尘粒料，例如像在US4,106,991和4,661,452中所披露的，并且可以任选地通过本领域已知方法进行包被。蜡质包被材料的实例是具有1000至20000的平均分子量的聚(环氧乙烷)产物；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中醇包含从12至20个碳原子并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单和二以及三酸甘油酯。GB1483591中给出了适于通过流化床技术而应用的成膜包被材料的实例。例如，液体酶制剂可根据既定方法通过添加多元醇例如丙二醇，糖或糖醇、丙醇酸或硼酸来稳定。受保护的酶可根据EP238,216中披露的方法制备。

辅料

还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污物再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解剂(disintegrationagent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC、和/或多元醇例如丙二醇)、织物整理剂包括黏土、填充剂/加工助剂、荧光剂增白剂/光增亮剂、泡沫促进剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污物助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂、和芯吸剂，单独亦或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择很好地在普通技术人员知识内。

分散剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地粉状洗涤剂可以包括分散剂。合适的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中多羧酸包含至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。例如合适的分散剂描述于Powdered Detergents,Surfactant science series(粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列)71卷中，Marcel Dekker,Inc.(马塞尔·德克尔公司)。

染料转移抑制剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不局限于聚乙烯吡咯酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，按组合物重量计，染料转移抑制剂可以按以下水平存在：从约0.0001%至约10%、从约0.01%至约5%或甚至从约0.1%至约3%。

荧光增白剂-本发明的洗涤剂组合物将优选地还包含额外的组分,这些组分可以给正清洁的物品着色,例如荧光增白剂或光增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01%至约0.5%的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些:二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐，4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐和2-(二苯乙烯基-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是Tinopal(天来宝)DMS和Tinopal(天来宝)CBS，从Ciba-Geigy AG(汽巴–嘉基股份有限公司)，巴塞尔，瑞士可得。Tinopal(天来宝)DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。Tinopal(天来宝)CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选的是，荧光增白剂是可商购的Parawhite KX，由Paramount Mineralsand Chemicals(派拉蒙矿物和化学品公司)，孟买，印度供应。适合用于本发明的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。

合适的荧光增白剂水平包括从约0.01、从0.05、从约0.1或甚至从约0.2wt%的较低水平至0.5或甚至0.75wt%的较高水平。

污物释放聚合物-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些污物释放聚合物有助于从织物，例如棉的或聚酯基织物上除去污物，特别是从聚酯基织物上除去疏水污物。例如污物释放聚合物可以是非离子的或阴离子的对苯二酸酯基聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如Powdered Detergents,Surfactantscience series(粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列)71卷中，第7章，MarcelDekker,Inc.(马塞尔·德克尔公司)。污物释放聚合物的另一类型是两亲烷氧基化的油污清洁聚合物，该聚合物包括一个芯结构和多个附接至该芯结构的烷氧基化基团。芯结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如详述于WO2009/087523中(将其通过引用结合在此)。此外，随机接枝共聚物是合适的污物释放聚合物。合适的接枝共聚物更详细地描述于WO2007/138054、WO2006/108856和WO2006/113314中(将其通过引用结合在此)。其他污物释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如描述于EP1867808或WO2003/040279中的那些(将这二者都通过引用结合在此)。合适的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。合适的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、兼性离子改性的纤维素、及其混合物。合适的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素、及其混合物。

抗再沉淀剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉淀剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯酮(PVP)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。以上在污物释放聚合物下描述的纤维素基聚合物的功能还可以是抗再沉淀剂。

其他合适的辅料包括但不局限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂、和用于液体清洁剂的结构剂和/或结构弹性剂。

洗涤剂产品的配制品

本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如棒、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉、颗粒、膏、凝胶、或规则压缩的或浓缩的液体。

洗涤剂配制品形式：层(相同或不同的相)、袋、对比用于机器剂量单位的形式。

袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及,羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60%。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜可以是共混物组合物，该共混物组合物包括水可降解的并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由Gary,Ind.，US(盖里，印第安纳州，美国)的Chris Craft In.Prod.(克里斯克拉夫特工业产品公司)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与包含固体的室不同。参考文献：(US2009/0011970A1)。

可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解特性曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。

这些形式的定义/特征

非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20%并且最高达95%的水，例如高达约70%的水、高达约65%的水、高达约55%的水、高达约45%的水、高达约35%的水。其他类型的液体，包括但不局限于链烷醇、胺、二醇、醚和多元醇，可以包含在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包含从0-30%的有机溶剂。

液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。

颗粒洗涤剂配制品

如描述于WO09/092699、EP1705241、EP1382668、WO07/001262、US6472364、WO04/074419或WO09/102854中的，可以配制颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂配制品描述于WO09/124162、WO09/124163、WO09/117340、WO09/117341、WO09/117342、WO09/072069、WO09/063355、WO09/132870、WO09/121757、WO09/112296、WO09/112298、WO09/103822、WO09/087033、WO09/050026、WO09/047125、WO09/047126、WO09/047127、WO09/047128、WO09/021784、WO09/010375、WO09/000605、WO09/122125、WO09/095645、WO09/040544、WO09/040545、WO09/024780、WO09/004295、WO09/004294、WO09/121725、WO09/115391、WO09/115392、WO09/074398、WO09/074403、WO09/068501、WO09/065770、WO09/021813、WO09/030632、WO09/015951、WO2011025615、WO2011016958、WO2011005803、WO2011005623、WO2011005730、WO2011005844、WO2011005904、WO2011005630、WO2011005830、WO2011005912、WO2011005905、WO2011005910、WO2011005813、WO2010135238、WO2010120863、WO2010108002、WO2010111365、WO2010108000、WO2010107635、WO2010090915、WO2010033976、WO2010033746、WO2010033747、WO2010033897、WO2010033979、WO2010030540、WO2010030541、WO2010030539、WO2010024467、WO2010024469、WO2010024470、WO2010025161、WO2010014395、WO2010044905、WO2010145887、WO2010142503、WO2010122051、WO2010102861、WO2010099997、WO2010084039、WO2010076292、WO2010069742、WO2010069718、WO2010069957、WO2010057784、WO2010054986、WO2010018043、WO2010003783、WO2010003792、WO2011023716、WO2010142539、WO2010118959、WO2010115813、WO2010105942、WO2010105961、WO2010105962、WO2010094356、WO2010084203、WO2010078979、WO2010072456、WO2010069905、WO2010076165、WO2010072603、WO2010066486、WO2010066631、WO2010066632、WO2010063689、WO2010060821、WO2010049187、WO2010031607、WO2010000636中，

产生组合物的方法

本发明还涉及产生组合物的方法。

用途

本发明还针对用于使用其组合物的方法。

衣物/纺织品/织物(家庭洗涤/工业化洗涤)

硬表面清洁(ADW、洗车、工业表面)

用于洗涤剂。本发明的多肽可以被添加至洗涤剂组合物中并且因此变成洗涤剂组合物的组分。

例如，可以将本发明的洗涤剂组合物配制为手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理受污染织物的洗衣添加剂组合物和漂洗时添加的织物柔软剂组合物，或配制为用于普通家庭硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗洗碟操作。

在一个特定方面，本发明提供了包含本发明的多肽的洗涤剂添加剂，如在此所述。

基因可从任何原核的、真核的、或其他来源中获得。

本发明进一步通过以下实例进行描述，这些实例不应被解释成限制本发明的范围。

实施例

株系

米曲霉MT3568株系用于编码具有纤维素酶活性的多肽的蛰龙介属魔玉虫(T.lapidaria)基因的表达。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(WO2002/40694)，其中通过用pyrG基因破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)修复pyrG营养缺陷体。

培养基和溶液

LB平板由10g细菌用胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠、15g细菌培养用琼脂、以及加至1升的去离子水组成。

LB培养基由10g细菌用胰蛋白胨、5g酵母提取物、和10g氯化钠、以及加至1升的去离子水组成。

YP培养基由10g酵母提取物、20g细菌用蛋白胨、以及加至1升的去离子水组成。

SOC培养基：将20g细菌用胰蛋白胨、5g酵母提取物和0.5g NaCl溶于1升水中。添加10ml250mM KCl并且调节pH至7.0。将培养基高压灭菌。在冷却至60℃后，添加18ml无菌过滤的20%葡萄糖和5ml2M MgCl₂溶液。

COVE培养基：20ml盐溶液

20g琼脂

218g山梨醇

H₂O补足1l

高压灭菌并且然后添加：

50ml20%葡萄糖

10mM NaNO₃。

盐溶液：26g KCl

26g MgSO₄7H²O

76gKH₂PO₄

50ml微量元素溶液

H₂O补足1l

蔗糖培养基：20ml盐溶液

342g蔗糖

H₂O补足1l

高压灭菌并且然后添加：

10mM NaNO₃

ST0.6M山梨醇

100mM Tris/HCl pH7.0

STC1.2M山梨醇

10mM CaCl₂

10mM Tris/HCl pH7.5

PEG60%(W/V)PEG4000(BDH)，在水中

在微波炉中10-20秒，直至它溶解，

冷却至室温然后添加

10mM CaCl₂

10mM Tris/HCl pH7.5

Topagar：20ml盐溶液

342g蔗糖

6g低熔琼脂糖

(BioWhittaker Molecular Applications(生物惠泰科分子应用公司)1-800-341-1574)

重要的是用几滴以下项调节pH至6

4M NaOH

H₂O补足1L

高压灭菌

使用前，煮沸并且冷却至约40°

Amds选择：添加10mM Acetamid(乙酰胺)和15mM CsCl

amdS选择平板：20g琼脂

20ml盐溶液

342g蔗糖

用几滴4M NaOH调节pH至6

H₂O补足1l

高压灭菌

10ml1M乙酰胺

15ml1M CsCl

方法

最适温度

将适当稀释的50μL样品与0.1M磷酸钠中的750μL AZCL-HE-纤维素混合。在热混合器(1400rpm搅拌，20min)中，在涵盖20℃至80℃的温度下孵育样品。孵育后，通过离心除去未水解的底物，并且将来自各样品的200μL上清液转移至96孔微量滴定板中。使用PowerWave微量滴定读板仪确定在600nm处的吸光度。将活性表示为吸光度单位。

比活性分析

关于PASC(无定形的纤维素、磷酸膨胀的纤维素)的比活性

将20g PASC(无定形的纤维素、磷酸膨胀的纤维素)(10%w/v)离心10min，5000rpm。除去上清液，并且在40mL0.1M磷酸钠缓冲液中重新悬浮沉淀，随后是类似离心步骤。在20mL0.1M磷酸钠缓冲液中重新悬浮不溶物。在40℃预孵育底物溶液5min，并且添加500μL酶溶液。

底物(μL)	缓冲液(μL)	酶溶液/glu标准物(μL)
			500	1500	500

混合样品并且在40℃孵育20min。通过添加500μL2%NaOH停止反应。在5000rpm离心样品15min。将1000μL上清液与500μL PHBAH-溶液混合。煮沸样品10min并且冷却。对所有样品测量A410。通过用具有已知浓度(0-50mg/L)的葡萄糖替换酶溶液，做出标准曲线。对每个酶稀释物还添加酶空白(在添加2%NaOH后添加酶)。

PHBAH溶液

100mL2%NaOH中的1g PHBAH。添加100μL铋溶液。

铋溶液

1mol硝酸铋

1mol K/Na-酒石酸

3mol NaOH(固体)

100mL H₂O

使用CMC7LF对羧甲基纤维素的比活性进行确定。制备1%CMC的母液。将1500μL底物与500μL稀释的酶混合。在温和的水浴上，在40℃孵育样品20min。20min后，添加1000μL PHBAH/铋(1.5g PHBAH+5g K/Na酒石酸盐+100mL2%NaOH)终止剂。煮沸样品10min并且立即在冰上冷却。在410nm处读取吸光度。还使用葡萄糖(0至50mg/L)混合标准曲线。

洗涤性能

在24FH和25℃，在具有脏洗涤剂(在1/2剂量Liquid Persil small&mightynon-Bio(宝莹少量且有利型非生物液)中的5ppm碳黑)的mini-TOM中，洗涤性能被测试为抗再沉淀测试。

在250ml烧杯中进行实验。将8片预洗的wfk80A(预洗程序参见下文)，5x5cm，在烧杯中与flotte：100ml，1.25mL/L洗涤剂，24FH(13.45°dH)(Ca2+/Mg2+=2:1，无HCO3)，pH如在洗涤剂中，5ppm碳黑和酶样品一起加载。摇动烧杯，在25℃的温度，125-150rpm持续3小时。在流动的自来水中冲洗小块布样(swatch)。

存在8个小块布样。1h和2h后，从加载中除去一个小块布样。即在3h中包括6个小块布样。

碳：通过在50mL flotte中分散100mg碳黑制成碳黑的母液，提供了2mg每mL的浓度。flotte包含5ppm碳，即每升flotte添加2.5ml母液。在添加至洗涤剂溶液前连同在分配flotte期间，搅拌混合物半个小时。

测试/分析

在脏洗涤剂中孵育1h、2h和3h后，在500nm进行小块布样的Macbeth(麦克白)颜色目测。在所有情况下，通过2-6层织物进行测量。每个小块布样测量2次，1次在前面并且1次在包的部位，其中孔大并且观察D65日光。

预洗wfk80A

退浆：在自来水中，按Miele(米勒)60℃棉标准洗涤程序洗涤，用4g/L IECA*，不含CMC和酶，以及1.2mg ep/L(0.09g/L或2.2%)去渍酶(Stainzyme)(Novozymes A/S(诺维信公司)，Bagsvaerd(贝格斯瓦尔德)，丹麦)。

预洗：在自来水中，按Miele(米勒)95℃棉标准洗涤程序进行洗涤，具有额外冲洗，用4g/L IEC A*，不含CMC和酶。

冲洗：在去离子水中按Miele(米勒)标准冲洗程序冲洗。

实例1：蛰龙介GH9纤维素酶的分离

在基于海洋有机体的DNA测序项目中，海洋多毛动物蛰龙介属魔玉虫(Terebella lapidaria)收集自Ria de Formosa，The Algarve(埃尔加夫)，葡萄牙南部。分离核酸材料，并且根据厂商说明书，在照明(illumine)HTS序列中，用RNA-sep技术，对两个通道的蛰龙介RNA进行测序。

在具有SEQ ID NO:1中披露的核苷酸序列的项目中鉴定GH9水解酶。该基因编码具有GH9纤维素酶结构的428个氨基酸的多肽，GH9纤维素酶具有SEQ ID NO:2中示出的氨基酸序列。

实例2：蛰龙介GH9纤维素酶的表达

制备表达构建体

使用以下引物对蛰龙介纤维素的编码序列进行PCR克隆

TLGH9F GTGAAGCGTACGCGTTACGACTACGCCGATGCGCTGG(SEQ ID NO:3)

TLGH9R AGATCTCGAGAAGCTTATCACAAGCCCAGACTGAGGAGACC(SEQ ID NO:4)

这些引物包含MluI和HindIII限制酶切位点，用于将分离的片段整合到选择的表达载体中。TLGH9F的下划线区域表示用于假丝酵母B脂肪酶信号-prepro区和预测的GH9的成熟肽之间的框内融合的MluI位点。

根据厂商说明书，通过来自Clontech(克隆技术公司)(分类号(cat.Nr)634913)的Marathon(马拉松)cDNA扩增试剂盒产生cDNA片段。将所得cDNA片段用作模板。

将以上引物用于由100ng蛰龙介属魔玉虫(Terebella lapidaria)cDNA组成的PCR反应，在TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA)，pH8.0)中将cDNA稀释至100ng/μl。将PTC-200DNA引擎(engine)(MJ Research Inc(MJ研究公司)，Waltham(沃尔瑟姆)，马萨诸塞州，美国)用于进行该PCR反应。将延长子长PCR预混合液(Extensor Long PCR Master Mix)，缓冲液1，ReddyMix^TM版(ABGene Ltd.(AB基因公司)，Epsom(埃普索姆)，英国)用于PCR扩增。预混合液(master mix)包含缓冲液、dNTP和热稳定的聚合酶共混物。

PCR反应由以下组成：20μl延长子长PCR预混合液、缓冲液1、ReddyMix^TM版，1μl引物TLGH9F(100μM)、1μl引物TLGH9R(100μM)、1μl蛰龙介属魔玉虫(T.lapidaria)cDNA、以及17μl去离子水，总体积40μl。PCR条件为：1个循环，在95℃持续2分钟。30个循环，每个在94℃持续10秒，55℃持续30秒，以及在68℃持续1分钟；以及1个循环，在68℃持续10分钟。然后将样品保持在10℃，直至从PCR仪中移出。

使用40mM Tris碱、20mM乙酸钠、1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切下1.3kb产物带，并且根据厂商说明书，使用illustra 

PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(GEHealthcare Life Sciences(通用电气医疗集团生命科学部)，Brondby(布隆德比)，丹麦)进行纯化。然后使用IN-FUSION^TM克隆试剂盒，将片段克隆到MleI和HindIII消化的pDau222中，生成质粒pGH9-7-2。

使用的载体是pDau222，一种基于pDau109(WO2005/042735)的曲霉表达质粒。为了从pDau109产生pDau222，将以下BamHI-HindIII侧翼插入片段用于替换pDau222的BamHI-HindIII插入片段：

GGATCCACCATGAAGCTACTCTCTCTGACCGGTGTGGCTGGTGTGCTTGCGACTTGCGTTGCAGCCACTCCTTTGGTGAAGCGTACGCGTGCGCATCACCATCACCATCACTAAGCTT(SEQ ID NO:5)。

下划线部分分别表示BamHI、MluI和HindIII限制酶切位点。用粗体示出表示KexB切割位点的密码子。插入片段使感兴趣的信号更少编码区能够经由MluI克隆位点的利用，与一种真菌(Candida anartica)脂肪酶B(CalB)分泌信号和pre pro区融合。最佳地放置CalB区的ATG起始密码子，用于自NA2-tpi启动子的表达。在MluI位点和HindIII位点之间放置感兴趣的编码区会导致分泌性蛋白被KexB加工蛋白酶进一步切割为成熟蛋白。自ATG起始密码子的插入片段的翻译如下：

MKLLSLTGVAGVLATCVAATPLVKRTRAHHHHHH(SEQ ID NO:6)

CalB信号的可切割区是加下划线的，并且KexB蛋白酶切割位点以黑体示出。展示的多组氨酸可用于His-Tag C端融合，或可以通过感兴趣的编码区的终止密码子的存在从表达中省略。

将pGH9-7-2基因克隆到MleI HindIII消化的pDau222中，导致蛰龙介属魔玉虫(Terebella lapidaria)开放读码框的转录，该转录是在NA2-tpi双启动子控制下进行的。NA2-tpi是来自编码黑曲霉中性α-淀粉酶的基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的未翻译的前导子替换了未翻译的前导子。

为了克隆分离的PCR片段，在10μl去离子水中，按2:1的摩尔比，将300ng的pDau222预切割物与MluI和HindIII混合。从框内融合(In-Fusion)反应管试剂盒中除去铝密封，并且添加包含片段和载体的10μl混合物，并且小心混合。在室温(约25℃)下孵育该混合物30分钟，并且此后将该管转移至冰上。用40μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA pH8.0)稀释框内融合反应混合物，并且储存在-20℃直至使用。

使用厂商说明书，将稀释的反应混合物转化至感受态融合蓝(Fusion Blue)感受态细胞(Clontech Inc.(克隆技术公司))。将4μl稀释的反应混合物轻轻地与50μl冻融的感受态细胞混合，并且将混合物在冰上孵育30分钟。在水浴中，在42℃，将这些细胞热休克45s，并且此后放回至冰上持续1分钟。在热显示后，将250μl SOC培养基添加至这些细胞中，并且在220rpm摇动下，将该混合物在37℃孵育90分钟。将20μl的这些细胞平铺在LB+50μg/ml氨苄青霉素上，将剩余细胞平铺在另一平板上，并且将这些平板在37℃孵育过夜。

第二天，在LB平板上出现若干菌落。挑选10个随机的菌落，并且在3mlLB+100μg/ml氨苄青霉素中生长过夜，根据厂商说明书，使用来自5Prime公司的“FASTPlasmid微型试剂盒”，从这些菌落制备质粒DNA。将分离的质粒测序，以确认序列(数据未示出)。选择具有正确序列的一个菌落，并且在37℃，225rpm，在50ml LB+50μg/ml氨苄青霉素中孵育过夜。根据厂商的方案，使用Qiagen Compact Prep midi试剂盒，分类号：12743，从培养物制备质粒DNA。

曲霉表达宿主的转化

使用以下方案，将2.5μg制备的表达构建体转化到米曲霉MT3568中：

*用所讨论的株系(MT3568)接种琼脂斜面(COVE培养基)，并且在37℃生长该株系约6天(直至其完全形成孢子)。可以将斜面冷冻储存约2个月。

*将5-10ml YP培养基添加至该斜面，并且悬浮这些孢子。将该孢子悬浮液转移至500ml Nalgene塑料摇瓶中，该摇瓶包含100ml蔗糖培养基。在30℃下孵育烧瓶20小时(270rpm)。

*通过miracloth滤布(Calbiochem(卡尔生化公司)，分类号475855)过滤收集菌丝体，并且使用200ml0.6M MgSO₄对其进行洗涤。使用塑料移液器从菌丝体吸出剩余液体。

*将1-2g菌丝体转移至Nalgene塑料锥形瓶中。添加包含750mg

200G(Novozymes(诺维信公司)，Bagsvaerd(贝格斯瓦尔德)，丹麦)(批次KM6290020)的15ml1.2M MgSO₄，10mM NaH₂PO₄pH5.8，并且悬浮菌丝体。放置在冰上5分钟。添加1ml12mg/ml BSA(经灭菌过滤的)。

在37℃孵育悬浮液1.5-2小时，并且经常通过显微术监测原生质体。

*通过mira cloth滤布将原生质体悬浮液过滤至25ml NUNC管(或类似物)中，并且用5ml ST覆盖悬浮液(小心地不与下层混合)，并且通过离心使原生质体成带(2500rpm，15min，慢加速)。使用P1000移液器回收原生质体的界面带，并且转移至新鲜的管中。

*用两体积的STC稀释原生质体，随后离心(2500rpm，5min)。用STC洗涤原生质体两次(使用重悬浮和离心)，并且然后在STC中重悬浮为浓度约5x107个原生质体/ml。在多数情况下，在4-5ml STC中重悬浮将给出正确浓度。

*对于每次转化，将DNA添加至管的底部，并且添加100μl原生质体。在孵育10分钟后(室温)，添加250μl PEG，并且将该管用手轻轻混合。孵育30分钟后(37℃)，添加4ml topagar培养基(温度40℃)。将原生质体涂板至选择性平板上。

*将平板在37℃孵育，直至转化清晰可见并且开始形成孢子。

挑选16个转化体，并且在26℃，在包含750ml/孔的YP+2%葡萄糖的dep孔微量滴定板中生长4天。在微量滴定板中，测试来自转化体的上清液对AZCL-He-纤维素的纤维素活性。将50μl上清液与200μl AZCL-He-c纤维素混合物(0.2M MOPS缓冲液中的0.1%AZCL-He-纤维素，pH7.0)混合，并且在26℃孵育过夜。在这一测定中，来自所有转化体的上清液具有活性，证明蛰龙介GH9纤维素酶对AZCL-He-纤维素具有活性。

实例3-纤维素酶的纯化和特征化

纤维素酶的纯化

在26℃，在225rpm下的摇瓶中，在1升YP+2%葡萄糖培养基中，生长在实例2中制备的一个转化体4天，并且收集上清液用于克隆的纤维素的纯化。

通过0.2μm PES瓶顶过滤器对培养液进行灭菌过滤。使用超滤(Sartorium10kDa PES膜)浓缩800ml培养液，生成250ml浓缩物，将其与40mMTris-HCl，pH8.0中的等体积的2M(NH₄)₂SO₄溶液混合。通过离心除去沉淀，并且将流体加载到16ml苯基琼脂糖凝胶HP柱上。通过用结合缓冲液(20mMTris-HCl，pH8.0中的1M(NH₄)₂SO₄溶液)洗涤除去未结合的材料。通过线性下降梯度(NH₄)₂SO₄(1.0M至0.0M)进行洗脱。收集10ml的部分，并且对AZCL-HE-纤维素的内切葡聚糖酶活性进行分析。

使用0.2%AZCL-HE-纤维素进行活性分析。简言之，将50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5中的750μL底物浆料与0μL样品一起孵育。在热混合器上，用全搅拌(1400rpm，40℃)孵育样品20min。显影为蓝色的样品被处理为葡聚糖内切酶阳性。使用SDS-PAGE分析葡聚糖内切酶阳性部分的纯度。合并评估为纯的部分。

通过测量A₂₈₀确定蛋白浓度，并且和ε=127590M^-1cm^-1，理论分子量为47601g/mol。使用软件GPMAW(Lighthouse software(灯塔软件有限公司)，丹麦)计算这些参数。

基于从SDS-PAGE的视觉确定，估算的纯度为>95%纯。表观分子量为50kDa，与预期分子量一致的一个值。

纯化制剂的蛋白浓度估算为0.77mg/mL。

最佳pH

使用无定形的纤维素(PASC)和还原糖定量确定最佳pH。在pH6处观察到最大活性，但是从pH5至9，该酶还展示>50%活性(参见图1错误！未发现参考源)。

比活性

底物	比活性	条件
			CMC	270IU/mg	还原端，pH7.0,40℃
PASC	11IU/mg	还原端，pH7.0,40℃

因此，使用PHBAH作为试剂，通过测量还原糖的释放获得对CMC的活性。分析揭示了270IU/mg的比活性。描述于2008-07497-20中的很多葡聚糖内切酶对CMC具有远远更低的比活性。然而，CMC是一种人工纤维素底物。更“现实生活”的底物是磷酸膨胀的纤维素，它被认为主要由无定形的纤维素组成。对此底物观察到的比活性为11IU/mg。作为比较，对特异腐质霉纤维素酶，已经报道了约80IU/mg(WO9117243)。

温度曲线

在图2中呈现了温度曲线。酶并未示出是低温纤维素酶的任何迹象。与其相反，最适温度是60℃，并且在70℃，它展示了其最大活性的70%。

实例4-洗涤性能

使用抗再沉淀测试来对蛰龙介纤维素酶的洗涤性能进行测试，其中在补充有碳黑的洗涤剂溶液中洗涤白色棉织物。早先已经示出，在这些相当有压力的洗涤条件下，添加葡聚糖内切酶可以减少粘附到织物上的碳黑的量。将纺织品以三个洗涤循环进行洗涤，以最大化洗涤效果。

测试了本发明的纤维素酶并且与商购内切葡聚糖酶

(GH7)和木葡聚糖酶(GH44)(这二者都在Novozymes A/S(诺维信公司)，丹麦下可得)进行了比较。

测试结果表明，Endolase示出防止碳黑沉积在纺织品上的最强能力。Whitezyme和蛰龙介属魔玉虫(T.lapidaria)示出了类似响应(参见图3)。

在此所描述和要求的本发明并不局限于在此所披露的特定方面的范围，因为这些方面是旨在作为本发明的若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员来说从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims (15)

1.具有纤维素酶活性的一种分离多肽，该分离多肽选自下组，该组由以下各项构成：

(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性；

(b)一种多肽，该多肽是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸在低严格条件下、中等严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下或非常高严格条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或其全长补体杂交；

(c)一种多肽，该多肽是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列或其基因组DNA序列具有至少60%，例如，至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性；或

(d)在一个或多个(例如若干个)位置处包含一个取代、删除、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种变体；以及

(e)具有纤维素酶活性的(a)、(b)或(c)的多肽的一个片段。

2.如权利要求1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列一致性。

3.如权利要求1或2所述的多肽，该多肽是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸在低严格条件下、低-中严格条件下、中等严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)或其基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长补体杂交。

4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，该多肽是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其基因组DNA序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列一致性。

5.如权利要求1-4中任一项所述的多肽，包含SEQ ID NO:2或由其构成。

6.如权利要求1-4中任一项所述的多肽，包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其构成。

7.如权利要求6所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至428。

8.如权利要求1-4中任一项所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2的一个片段，其中该片段具有纤维素酶活性。

9.一种组合物，该组合物包含权利要求1-8中任一项所述的多肽。

10.如权利要求9所述的组合物，是一种洗涤剂组合物。

11.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-8中任一项所述的多肽。

12.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求11所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内产生的一个或多个控制序列上。

13.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如权利要求11所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列上。

14.一种产生如权利要求1-8中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：

(a)培养一种细胞，该细胞在其野生型形式中在有益于产生该多肽的条件下产生该多肽；并且

(b)回收该多肽。

15.一种产生具有纤维素酶活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求14所述的宿主细胞；并且

(b)回收该多肽。

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