CN103492568B

CN103492568B - 用于siRNA的半乳糖簇‑药代动力学调节剂靶向部分

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Publication number: CN103492568B
Application number: CN201180060354.XA
Authority: CN
Inventors: P·海德威格; T·霍夫曼; E·基塔斯; P·莫尔; I·鲁尔; L·瓦利斯; D·B·罗泽玛; D·L·刘易斯; D·H·维基菲尔德
Original assignee: Arrowhead Research Corp
Current assignee: Arrowhead Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2010-12-17
Filing date: 2011-12-15
Publication date: 2017-04-12
Anticipated expiration: 2031-12-15
Also published as: AU2011343664B2; MX346144B; SG189474A1; JP6261144B2; US20120157509A1; EP2652134A2; CA2816155A1; AU2016200000A1; WO2012083046A3; EP2652134A4; AU2011343664A1; MX2013006748A; CA2816155C; JP2014504295A; AU2016200000B2; RU2013117288A; KR20130132475A; WO2012083046A2; US20160102120A1; US9796756B2

Abstract

本发明涉及体内靶向递送RNA干扰(RNAi)多核苷酸到细胞的组合物。相较于单独配体靶向，药代动力学调节剂改善体内靶向。靶向配体‑药代动力学调节剂靶向部分靶向的RNAi多核苷酸能单独或与共靶向的递送聚合物共同给予。

Description

用于siRNA的半乳糖簇-药代动力学调节剂靶向部分

背景技术

将多核苷酸和其他基本不能穿透细胞膜的化合物递送到活细胞受到细胞复杂膜系统的限制。反义、RNAi和基因治疗中使用的药物是相对高亲水性的聚合物，且通常带较高负电荷。这些物理特征均严格限制其直接扩散穿过细胞膜。基于此原因，多核苷酸递送的主要障碍是将多核苷酸递送穿过细胞膜到达细胞质或细胞核。

一种已经用于体内递送小核苷酸的方法是将所述核酸与小靶向分子或脂质或固醇结合。虽然已在这些偶联物中观察到一些递送和活性，但这些方法需要的核酸剂量非常大。

还已开发大量转染试剂，其能实现体外将多核苷酸相当有效地递送到细胞。然而，用这些相同转染试剂体内递送多核苷酸很复杂且由于体内毒性、不利的血清相互作用和弱靶向而变得无效。体外作用良好的转染试剂、阳离子聚合物和脂质，通常形成大的阳离子静电颗粒并使细胞膜不稳定。体外转染试剂的正电荷有助于通过电荷之间（静电）的相互作用与核酸结合，因此形成核酸/转染试剂复合物。正电荷还有益于载剂与细胞非特异性结合以及膜融合、去稳定化或破坏。膜的去稳定化有利于递送基本不能渗透细胞膜的多核苷酸穿过细胞膜。虽然这些特性有利于核酸体外转移，但它们会造成体内毒性和靶向失效。阳离子电荷与血清组分相互作用，导致多核苷酸转染试剂相互作用的不稳定、较低的生物利用率和弱靶向。体外有效的转染试剂膜活性在体内常导致毒性。

为了体内递送，载剂(核酸和结合的递送剂)应较小，直径低于100nm，优选低于50nm。低于20nm或低于10nm的甚至更小复合物会更有用。大于100nm的递送载剂体内很少能到达血管细胞之外的细胞。静电相互作用形成的复合物在暴露于生理盐浓度或血清组分时倾向于聚集或瓦解。此外，体内递送载剂上的阳离子电荷导致不良血清相互作用和因此造成弱生物利用率。有趣的是，高负电荷还会通过妨碍靶向所需的相互作用来抑制靶向的体内递送，即，靶向配体与细胞受体的结合。因此，体内分布和靶向需要接近中性的载剂。没有仔细调控的情况下，膜的破坏或去稳定活性在体内使用时有毒。用核酸递送平衡载剂毒性在体外比体内更容易实现。

Rozema等在美国专利公开20040162260中显示了可逆调控膜活性多胺的膜破坏活性。该膜活性多胺提供破坏细胞膜的方式。pH依赖性可逆调控提供限制靶细胞内吞体活性，从而限制毒性的方法。其方法依赖于含2-丙酸-3-甲基马来酸酐的多胺上的胺修饰。

该修饰通过伯胺转变为羧基对(β羧基和γ羧基)将聚阳离子转变为聚阴离子，并可逆地抑制多胺的膜活性。Rozema等(Bioconjugate Chem.2003,14,51-57)报道了β羧基不显示完全明显的负电荷且其自身不能抑制膜活性。已报道添加γ羧基基团对有效抑制膜活性是必需的。为了能共递送核酸与递送载剂，所述核酸共价连接所述递送聚合物。它们能用其生物学上不稳定的偶联递送系统将多核苷酸体外递送到细胞。然而，由于所述载剂带有较高负电荷，且核酸和修饰的聚合物都具有高负电荷密度，所以此系统对体内递送无效。所述负电荷可能会抑制细胞特异靶向，并通过网状内皮系统(RES)增加非特异摄取。

Rozema等在美国专利公开20080152661中通过消除所述经修饰膜活性聚合物的高负电荷浓度而改良了美国专利公开20040162260的方法。通过用中性亲水靶向基团(半乳糖)和位阻稳定基团(PEG)替代2-丙酸-3-甲基马来酸酐的γ羧基，Rozema等能保持总体水溶性并可逆抑制膜活性，同时纳入有效的体内肝细胞靶向。如前，所述多核苷酸共价连接所述转染聚合物。通过阻止所述多核苷酸从所述转染聚合物上解离，保持所述多核苷酸与转染聚合物的共价结合以确保体内给予期间将所述多核苷酸与转染聚合物共递送到所述靶细胞中。需要多核苷酸和转染聚合物的共递送，这是由于转染聚合物提供将所述多核苷酸从所述细胞外或内吞区室内穿过细胞膜转运到细胞质中。美国专利公开20080152661证明了用该新改良生理响应多聚偶联物将多核苷酸，特别是RNAi寡核苷酸体内高效递送到肝细胞中。

然而，所述核酸与多胺的共价结合本身具有局限性。用于结合核酸和掩蔽剂的转染聚合物修饰被电荷相互作用复杂化。带负电核酸与带正电聚合物的结合倾向于聚集，从而限制了混合物的浓度。可通过存在过量的聚阳离子或聚阴离子来克服聚集。然而，该溶液限制了核酸和聚合物可配制的比率。此外，带负电核酸结合到未修饰的阳离子聚合物上引起所述复合物的浓缩和聚集，抑制聚合物修饰。所述聚合物的修饰形成阴性聚合物，削弱所述核酸的结合。

Rozema等还改进了美国专利公开20080152661、美国临时申请61/307,490所述的技术。在美国临时申请61/307,490中，Rozema等显示，通过谨慎选择靶向分子并使合适靶向分子独立地连接siRNA和递送聚合物，所述siRNA和所述递送聚合物能偶联而仍保持2种元件体内有效靶向细胞，且实现所述siRNA的有效功能性靶向递送。在美国专利公开20080152661和美国临时申请61/307,490中使用的所述递送复合物是相对较大的合成聚合物、聚(乙烯基醚)和聚(丙烯酸盐)。所述较大聚合物能通过用于细胞特异性结合的2种靶向配体和用于增加掩蔽的PEG进行修饰。较大聚合物对有效递送是必需的，可能是通过膜活性增加和对于细胞内吞体中核酸保护的改良。较大聚阳离子与膜和阴离子RNA的相互作用更加强烈。

我们目前开发了使用改良RNA干扰多核苷酸靶向部分的改善siRNA递送系统。

发明内容

在一个优选实施方式中，本发明涉及用于体内递送RNA干扰多核苷酸到靶细胞中的组合物，所述组合物包括：与靶向配体-药代动力学调节剂靶向化合物偶联的RNA干扰多核苷酸(siRNA-偶联物)。所述靶向配体-药代动力学调节剂靶向化合物相较于单独靶向配体具有改进的体内循环和靶向性质。示范性靶向配体包括去唾液酸糖蛋白受体配体和叶酸。所述药代动力学调节剂在结合所述靶向配体时提供增强的组织靶向。然后可以单独地或联合递送分子注射siRNA。

在一个优选的实施方式中，我们描述包含具有16个或更多碳原子的疏水基团的药代动力学调节剂。当结合靶向配体时，所述靶向配体-药代动力学调节剂提供改善的siRNA体内递送。示例性合适疏水基团可选自下组：胆固醇、棕榈酰基、十六醇-8-烯酰基、油酰基、(9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基、二辛酰基和C16-C20酰基。具有少于16个碳原子的疏水基团在增强多核苷酸靶向上不太有效。

用作多核苷酸靶向部分的药代动力学调节剂可选自下组：胆固醇、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基和芳炔基，其各可为线性、分支或环形。药代动力学调节剂优选烃类，仅包括碳和氢原子。然而，可允许保持疏水性的取代或杂原子，例如氟。

在一个实施方式中，本发明涉及用于体内递送RNA干扰多核苷酸到肝细胞中的组合物，所述组合物包括：ASGPr靶向的可逆掩蔽膜活性多胺(递送聚合物)和偶联半乳糖簇药代动力学调节剂靶向部分的RNA干扰多核苷酸(siRNA-偶联物)。所述递送聚合物和所述siRNA-偶联物分开合成并可在单独容器或单一容器中提供。所述RNA干扰多核苷酸没有偶联所述聚合物。

在一个实施方式中，所述膜活性多胺包括：由含胺单体、较低疏水性单体和较高疏水性单体的随机多聚化形成的两亲性聚合物。含胺的单体包含选自下组的胺基侧基：伯胺和仲胺。所述较低疏水性单体包含有1-6个碳原子的疏水侧基。所述较高疏水性单体包含有12-36或更多个碳原子的疏水侧基。选择胺基团与疏水基团的比率以形成具有膜破坏活性的水溶性聚合物，优选≥1个胺单体/疏水单体。在一个实施方式中，所述聚合物具有60-80%的胺单体。疏水基团可选自下组：烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基和芳炔基（其各可为线性、分支或环形）、固醇、类固醇和类固醇衍生物。疏水基团优选烃类，仅包括碳和氢原子。然而，可允许保持疏水性且包括例如氟的取代或杂原子。特别合适的膜活性多胺包括聚乙烯基醚随机三元共聚物或聚丙烯酸随机三元共聚物。

在一个优选的实施方式中，ASGPr靶向的可逆遮蔽蜂毒肽包括通过所述蜂毒肽上的伯胺和含ASGPr配体的遮蔽剂反应可逆修饰的蜂毒肽。若修饰基团的切割使胺恢复则所述胺为可逆修饰。所述蜂毒肽的可逆修饰可逆地抑制所述蜂毒肽的膜活性。用掩蔽剂修饰聚合物胺还优选中和胺的电荷。优选的包含ASGPr配体的遮蔽剂包含具有双取代马来酸酐胺反应基团的半乳糖胺或半乳糖胺衍生物。酐与胺的反应可逆修饰所述胺形成马来酰胺酸或马来酸。在所述掩蔽状态，可逆掩蔽的蜂毒肽未表现膜破坏活性。抑制膜活性并提供细胞靶向功能即形成可逆遮蔽蜂毒肽，需要对所述蜂毒肽上的胺进行多于80%或多于90%的可逆修饰。

在一个优选实施方式中，可逆掩蔽膜活性多胺包括通过聚合物上的胺和掩蔽剂之间的反应可逆修饰的本发明膜活性多胺。若修饰基团的切割使胺恢复则所述胺为可逆修饰。膜活性多胺的可逆修饰会可逆抑制膜活性多胺的膜活性。优选地，掩蔽剂还可提供靶向功能和/或避免血清相互作用的功能。用掩蔽剂修饰聚合物胺还优选中和胺的电荷。优选的掩蔽剂包含具有双取代马来酸酐胺反应基团的半乳糖胺或半乳糖胺衍生物或聚乙二醇。酐与胺的反应可逆修饰所述胺形成马来酰胺酸或马来酸。在所述掩蔽状态，可逆的掩蔽膜活性多胺未表现膜破坏活性。抑制膜活性并提供细胞靶向功能（即形成可逆掩蔽的膜活化聚合物）可能需要用掩蔽剂对多胺上超过50%、超过55%、超过60%、超过65%、超过70%、超过75%、或超过80%的胺进行可逆修饰。所述膜活性多胺的膜活性抑制和/或体内靶向需要修饰多于50%的聚合物胺。

可将药学上可接受的载体或稀释剂内的RNAi多核苷酸偶联物和递送聚合物给予哺乳动物。在一个实施方式中，所述递送聚合物和RNAi多核苷酸偶联物在给予所述哺乳动物前可在溶液中合并。在另一实施方式中，所述递送聚合物和所述RNAi多核苷酸偶联物可在单独的溶液中共给予所述哺乳动物。在另一实施方式中，所述递送聚合物和所述RNAi多核苷酸偶联物可依次给予所述哺乳动物。对于依次给予，所述递送聚合物可在给予所述RNAi多核苷酸偶联物之前给予。或者，对于依次给予，所述RNAi多核苷酸偶联物可在给予所述递送聚合物之前给予。

结合附图，根据下列详细描述，本发明的其他目的、特征和优点显而易见。

附图说明

图1.两亲聚(乙烯醚)随机三元共聚物的聚合化反应图解。

图2.显示siRNA-胆固醇偶联物对基因敲除的影响。

图3.显示疏水物大小对siRNA-疏水物偶联物靶向肝脏的影响。

图4.显示就数种疏水基团而言siRNA-疏水物偶联物对基因敲除的影响。

图5.显示递送聚合物对siRNA-疏水物偶联物递送到肝脏的影响。

图6.GalNAc簇与RNA的连接。

图7.显示血浆中siRNA与不同药代动力学调节剂相连的持久性。

发明详述

本文描述改进的RNA干扰多核苷酸靶向部分。本发明的多核苷酸靶向部分包括与药代动力学调节剂联合的靶向配体。在一个优选的实施方式中，所述靶向配体和所述药代动力学调节剂彼此共价连接，然后与所述siRNA共价连接。在一个优选的实施方式中，通过生理上不稳定的共价键连接siRNA。

在一个优选的实施方式中，我们描述由疏水基团构成的药代动力学调节剂。更具体地，药代动力学调节剂由具有16个或更多碳原子的疏水基团组成。示例性合适疏水基团可选自下组：胆固醇、棕榈酰基、十六醇-8-烯酰基、油酰基、(9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基、二辛酰基和C16-C20酰基。具有少于16个碳原子的疏水基团在增强多核苷酸靶向上不太有效。

靶向配体和药代动力学调节剂相连以通过支架分子形成靶向配体-药代动力学调节剂靶向部分。所述靶向部分支架可以是能够使所述靶向配体与所述药代动力学调节剂相连并且还能连接所述RNAi多核苷酸的任何小分子。一个示范性支架是赖氨酸或鸟氨酸。赖氨酸或鸟氨酸分子包括两个胺基团和一个羧基基团，通过所述胺基团可连接靶向配体和所述药代动力学调节剂，通过所述羧基基团可以实现与所述RNAi多核苷酸的连接。举例而言，也可以合成能够共价连接所述半乳糖簇和所述siRNA多核苷酸的药代动力学调节剂。

本文描述体内递送RNA干扰（RNAi）多核苷酸到哺乳动物靶细胞的改良方法。之前，体内递送多核苷酸需要所述多核苷酸与所述递送载剂的物理结合。所述多核苷酸静电结合递送载剂如聚阳离子/核酸复合物、被所述递送载剂包封如脂质体和稳定的核酸-脂质颗粒(SNALP)、或共价连接递送载剂如动态聚偶联物(Rozema等，2007)。令人惊讶的是，我们发现通过使用合适的RNAi多核苷酸偶联分子和合适的靶向递送聚合物，所述RNAi多核苷酸可与所述递送聚合物分离且仍实现所述多核苷酸的有效肝细胞递送。

分离多核苷酸与递送肽在配制、合成和生产上提供了优势。

a)通过消除对多核苷酸和聚合物结合(通过共价连接或电荷之间的相互作用)的需求，所述聚合物和多核苷酸的浓度和二者的比率仅受到组分溶解度的限制，而不是所述结合复合物的溶解度或生产复合物的能力。溶解度提高使多核苷酸或递送聚合物浓度增加，因此增加了剂量。

b)所述多核苷酸和递送聚合物可在给予前的任何时候混合，或甚至分开给予。因此，分离使所述组分以溶液或干燥形式分别储存。

c)相比更大的内在不稳定的非共价递送系统，可使用更小更稳定的制剂。

d)没有共价结合带负电多核苷酸或不需要共价结合带负电多核苷酸时，掩蔽递送聚合物的生产更容易。

e)在多核苷酸没有物理结合递送聚合物时生产被简化且需要更少的步骤。

本发明包含下述通式结构的偶联递送系统：

(M¹–L)_x–P–(L–M²)_y+N-T,

式中，N是RNAi多核苷酸，T是靶向配体-药代动力学调节剂多核苷酸靶向部分，P是膜活性多胺，并且，包括靶向部分(例如对用于递送至肝的唾液酸糖蛋白受体具有亲和性的半乳糖或半乳糖衍生物)的遮蔽剂M¹与P通过生理上可逆连接L(例如马来酰胺酸连接)共价连接。L的切割在多胺P上恢复未修饰的胺。遮蔽剂M²是可选的。若存在，M²是通过生理可逆连接L如马来酰胺酸连接与P共价连接的亲水位阻稳定剂。x和y各为整数。在其未修饰状态中，P是膜活性多胺。本领域中已经描述了适合于体内递送多核苷酸的膜活性多胺。递送聚合物(M¹–L)_x–P–(L–M²)_y非膜活性。P胺通过结合M¹和任选M²的可逆修饰来可逆地抑制或灭活P的膜活性并降低P的净正电荷。足够的掩蔽剂结合P以抑制聚合物的膜活性。x+y的值大于多胺P上50%，优选大于60%，更优选大于70%的胺，通过没有任何掩蔽剂时P上的胺含量测定。如果P是膜活性肽，例如蜂毒肽，则x+y的值大于多胺P上胺的80%，更优选大于90%，如没有任何遮蔽剂存在时P上的胺含量所确定。可逆连接L切割后恢复了未修饰的胺，从而P回复为其未修饰的膜活性状态。选择可逆连接L的可逆键，从而所述切割在所需的生理条件下发生，例如存在于所需组织、器官或亚细胞位置中。优选的可逆连接是对pH不稳定的连接。分别合成或生产(M¹–L)_x–P–(L–M²)_y（ASGPr靶向的可逆掩蔽膜活性聚合物（掩蔽聚合物））和T-N（多核苷酸聚合物）。T或N都不直接或间接与P、L、M¹或M²共价连接。多核苷酸或多核苷酸偶联物与所述掩蔽或未掩蔽聚合物的静电或疏水连接不是体内肝脏递送多核苷酸所需。掩蔽聚合物和多核苷酸偶联物可在同一容器中或分开的容器中提供。其可在给予前合并、共同给予或依次给予。

聚合物

本发明的聚合物为两亲膜活性多胺。聚合物是通过称为单体的较小单元一起重复结合建立的分子。聚合物可为使用单一单体的同聚物或聚合物可为使用两种或更多不同单体的共聚物或异聚物。聚合物的主链由原子组成，其键为聚合物长度延伸所需。聚合物的侧链由原子组成，其键不是聚合物长度延伸所需。

更具体地，本发明的聚合物为两亲膜活性随机共聚物。随机共聚物中的单体没有沿着主链的定义或排列，书面表示为例如–A_x–B_y–或–A_x–B_y–C_z–。所述聚合物的一般组成反映了输入单体比率。然而，一种单体与另一种的精确比率在各主链间不同。单体的分布还可根据单一聚合物的长度而不同。而且，单体的化学特性可能影响其纳入到随机共聚物中的比例及其在所述聚合物中的分布。虽然单体在随机聚合物中的比率取决于单体的输入率，但所述输入率不精确匹配纳入单体的比率。

两亲性

本领域熟知并了解两亲性或两亲聚合物，其具有亲水(极性，水溶性)和疏水(非极性，亲脂性，水不溶性)基团或部分。

亲水基团定性指示所述化学部分偏好水。通常，所述化学基团为水溶性，且为水的氢键供体或受体。亲水基团可以带电荷或不带电荷。带电基团可带正电(阴离子)或带负电(阳离子)或二者(两性离子)。亲水基团的例子包括下述化学部分：碳水化合物、聚氧乙烯、某些肽、寡核苷酸、胺、酰胺、烷氧基酰胺、羧酸、硫磺和羟基。

疏水基团定性指示所述化学部分避开水。通常此类化学基团非水溶性，且不倾向于形成氢键。亲脂基团溶于脂肪、油、脂质和非极性溶剂且只有很小或没有能力形成氢键。含两个(2)或更多碳原子的烃类、某些取代烃、胆固醇和胆固醇衍生物为疏水基团和化合物的示例。

如本文所用，涉及两性聚合物时，部分定义为当一个共价键断裂并由氢代替时衍生的分子。例如，丁胺中碳和氮键间断裂并由氢替代会产生氨(亲水)和丁烷(疏水)。若在氮-碳键处切割1,4-二氨基丁烷并用氢替代，所得分子再次是氨(2×)和丁烷。然而，1,4,-二氨基丁烷不视作两性，因为疏水部分的的形成需要两个键的断裂。

如本文所用，表面活性聚合物降低水的表面张力和/或与其他相的界面张力，从而正吸附于液/气界面。表面活性特征通常源于物质分子是两亲性或两性。

膜活性

如本文所用，膜活性聚合物是表面活性的两亲性聚合物，其能在生物膜上诱导一种或多种下述影响：膜变化或破坏从而使膜不透性分子进入细胞或穿过膜，在膜上形成孔，膜分裂，或所述膜的破坏或溶解。如本文所用，膜或细胞膜包括脂双层。膜的变化或破坏可用至少一个下述试验中的聚合物活性来进行功能性定义：红血细胞裂解(溶血)、脂质体渗漏、脂质体融合、细胞融合、细胞裂解、和内吞体释放。可引起细胞膜裂解的膜活性聚合物也称为膜裂解聚合物。优选在质膜上引起内吞体或溶酶体破坏的聚合物被认为是内吞体裂解性。膜活性聚合物对细胞膜的影响可以是短暂的。膜活性聚合物具有对膜的亲和性，并引起双层结构的变性或变形。膜活性聚合物可为合成的或非天然两亲性聚合物。

如本文所述，膜活性聚合物不同于称为细胞渗透肽的一类聚合物或例如源自HIVTAT蛋白的富含精氨酸的肽、触角肽、VP22肽、转运蛋白、富含精氨酸的人工肽、富含胍盐的人工小聚合物等化合物所代表的聚合物。虽然细胞渗透化合物看起来能转运一些分子穿过膜，从脂双层的一侧到其另一侧，明显不需要胞吞也不需要破坏膜的完整性，但其机制尚不理解。

多核苷酸递送到细胞中由膜活性聚合物介导，其破坏或使质膜或内囊泡膜(如内吞体或溶酶体)不稳定，包括在膜上形成孔、或破坏内吞体或溶酶体囊泡从而允许所述囊泡的内含物释放到细胞胞质中。

内吞体裂解

内吞体裂解性聚合物是响应pH变化的聚合物，能引起内吞体的破坏或裂解，或者使通常细胞膜不透性化合物如多核苷酸或蛋白从细胞内膜包裹的囊泡如内吞体或溶酶体中释放。内吞体裂解聚合物在生理相关pH范围内（通常pH5.5-8）物理化学性质发生变化。该变化可为电荷、疏水性、或亲水性改变引起的所述聚合物溶解度或与其他分子或膜相互作用的能力发生变化。示例性内吞体裂解聚合物具有pH不稳定基团或键。可逆掩蔽膜活性聚合物中掩蔽剂通过pH不稳定键结合聚合物，所以可被认为是内吞体裂解聚合物。

蜂毒肽是蜂毒中天然产生的一种小两亲性膜活性肽。蜂毒肽可从生物来源分离或可合成。合成的聚合物“由人”通过化学过程配制或生产且不是通过天然发生的生物过程产生。本文中使用的蜂毒肽包括天然产生的蜂毒肽家族的多种蜜蜂毒液肽，所述蜂毒肽家族可以在以下物种的毒液中找到：西方蜜蜂(Apis mellifera)、中国蜜蜂(Apis cerana)、额斑黄胡蜂(Vespula maculifrons)、大胡蜂(Vespa magnifica)、墨胸胡蜂(Vespa velutinanigrithorax)、马蜂属HQL-2001(Polistes sp.HQL-2001)、小蜜蜂(Apis florae)、大蜜蜂(Apis dorsata)、中华蜜蜂(Apis cerana cerana)、亚非马蜂(Polistes hebraeus)。本文中使用的蜂毒肽还包括具有与天然产生的蜂毒肽相同或类似氨基酸序列的合成肽。具体而言，蜂毒肽氨基酸序列包括表1中所示的那些。合成的蜂毒肽可包含天然产生的L形式氨基酸或对映体D形式氨基酸(反(inverso))。然而，蜂毒肽应基本包括所有L形式或所有D形式的氨基酸。所述蜂毒肽氨基酸序列也可以是逆向(逆(retro))。逆蜂毒肽可以具有L形式氨基酸或D形式氨基酸(逆反)。两个蜂毒肽也可以共价连接以形成蜂毒肽二聚物。蜂毒肽可以具有连接所述肽的氨基末端或羧基末端的修饰基团。然而，本文所用的蜂毒肽不包括含有彼此共价连接或与另一个聚合物或支架共价连接的两个以上蜂毒肽的链或聚合物。

疏水基团优选烃类，仅包括碳和氢原子。然而，可允许保持疏水性且包括例如氟的非极性取代或非极性杂原子。所述术语包括脂族基团、芳族基团、酰基、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基和芳炔基，其各可为线性、分支或环形。所述术语疏水基团还包括：固醇、类固醇、胆固醇和类固醇及胆固醇的衍生物。如本文所用，低疏水性单体或基团包括具有二(2)-六(6)个碳原子的疏水基团。如本文所用，中等疏水性单体或基团包括具有七(7)-十一(11)个碳原子的疏水基团。如本文所用，高疏水性单体或基团包括具有十二(12)-三十六(36)个或更多碳原子的疏水基团。

选择胺基团与疏水基团的比率以形成具有膜破坏活性的水溶性聚合物。本发明的优选膜活性聚合物在≥1mg/mL、≥5mg/mL、≥10mg/mL、≥15mg/mL、≥20mg/mL、≥25mg/mL、和≥30mg/mL时可溶于水。本发明的优选膜活性聚合物为表面活性。本发明的膜活性聚合物优选大小范围为约3kDa～约300kDa。由于所述聚合物是两亲性的，其在水溶液中自结合，临界缔合浓度为≤1mg/mL。

在一个实施方式中，所述膜活性多胺三元共聚物的单体纳入率为约4～8个胺单体：3～5个低疏水性单体：1个高疏水性单体。在另一实施方式中，所述膜活性多胺的单体纳入率为约5.4～7.5个胺单体：3～3.5个低疏水性单体：1个高疏水性单体。在另一实施方式中，所述膜活性多胺的单体纳入率为约6个胺单体：约3个低疏水性单体：约1个高疏水性单体。在一个实施方式中，所述疏水单体的疏水基团由烷基组成。

在一个实施方式中，所述胺/低疏水性基团共聚物用进料率为约4～8个胺单体：约3～5个低级烷基单体的单体合成。在另一实施方式中，所述胺/低疏水性基团共聚物用进料率为约15个胺单体：4个低疏水性基团单体的单体合成。

在一个实施方式中，所述胺/低疏水性基团/高疏水性基团三元共聚物用进料率为约4～8个胺单体：约3～5个低级烷基单体：1个高级烷基单体的单体合成。在另一实施方式中，所述胺/低疏水性基团/高疏水性基团三元共聚物可用进料率为约15个胺单体：4个低疏水性单体：1个高疏水性基团单体的单体合成。

在一个实施方式中，特别合适的膜活性多胺包括具有含胺单体、含丁基单体和含高疏水性基团单体的共聚物，其中所述高疏水性基团含12～18碳原子。特别合适的膜活性多胺包括聚乙烯基醚随机三元共聚物或聚丙烯酸随机三元共聚物。

掩蔽

本发明的递送聚合物包括可逆修饰的两亲性膜活性多胺，其中可逆修饰抑制膜活性、中和多胺以降低正电荷并形成几乎中性电荷的聚合物、提供细胞类型特异性靶向，并抑制所述聚合物的非特异性相互作用。所述多胺的可逆修饰是通过该多胺上胺的可逆修饰。

本发明的膜活性多胺能破坏质膜或溶酶体/内吞体膜。所述膜活性是多核苷酸细胞递送的必要特征。然而，所述聚合物体内给予时膜活性产生毒性。多胺还容易与许多阴离子组分体内相互作用，导致不需要的生物分布。因此，体内使用需要可逆掩蔽所述多胺的膜活性。所述掩蔽通过掩蔽剂与膜活性多胺的可逆结合形成可逆掩蔽膜活性聚合物即递送聚合物来实现。除了抑制膜活性外，所述掩蔽剂使聚合物免于非特异相互作用，减少血清相互作用，增加循环时间并提供细胞特异性相互作用即靶向。

掩蔽剂的必要特征总体为：抑制聚合物的膜活性、使聚合物免于非特异相互作用（降低血清相互作用、增加循环时间）和提供体内肝细胞靶向。所述膜活性多胺在未修饰(未掩蔽)状态时为膜活化，而在修饰(掩蔽)状态时非膜活化(灭活)。足够数量的掩蔽剂连接聚合物以实现所需水平的灭活。用合适的聚合物活性试验容易测定通过掩蔽剂结合的所需聚合物修饰水平。例如，若聚合物在给定试验中具有膜活性，则充足水平的掩蔽剂连接所述聚合物以在该试验中实现所需水平的膜活性抑制。掩蔽需要修饰所述聚合物上≥50%、≥60%、≥70%或≥80%的胺基团，如没有任何掩蔽情况下对聚合物上胺的定量所检测。掩蔽剂的优选特征还包括其结合所述聚合物会降低聚合物的正电荷，从而形成更中性的递送聚合物。理想上所述掩蔽聚合物保持水溶性。

如本文所用，若修饰的聚合物没有在体内表现膜活性或显示细胞特异性(即肝细胞)靶向，则膜活性多胺被掩蔽。若切割连接掩蔽剂和聚合物的键使得聚合物上的胺恢复从而回复膜活性，则所述膜活性多胺被可逆掩蔽。

另一必要特征是掩蔽剂通过生理可逆键共价结合膜活性多胺。通过使用生理可逆连接或键，所述掩蔽剂能在体内从聚合物上切割，从而暴露所述聚合物且恢复所述未掩蔽聚合物的活性。通过选择合适的可逆连接，可在所述膜活性聚合物被递送或靶向所需细胞类型或细胞位置后形成恢复其活性的偶联物。连接的可逆性提供所述膜活性多胺的选择性激活。可逆共价连接包括可选自下组的可逆或不稳定键：生理不稳定键、细胞生理上不稳定键、pH不稳定键、pH极不稳定键和极端pH不稳定键。

本发明优选的掩蔽剂能修饰水溶液中的聚合物(与该聚合物形成可逆键)。优选的胺反应基团包含双取代的马来酸酐。优选的掩蔽剂由下述结构表示：

其中R¹是烷基如甲基(-CH₃)、乙基(-CH₂CH₃)、或丙基(-CH₂CH₂CH₃)(以形成取代的烷基马来酸酐)，且R²包括靶向配体或位阻稳定剂。

在一个实施方式中，所述靶向配体包括ASGPr靶向部分。在另一个实施方式中，所述位阻稳定剂包括PEG。

存在过量掩蔽剂时，膜活性多胺可偶联掩蔽剂。给予递送聚合物前可从偶联的递送聚合物中去除过量的掩蔽剂。

位阻稳定剂

如本文所用，位阻稳定剂是非离子亲水聚合物(天然、合成或非天然)，相对不含位阻稳定剂的聚合物，其阻止或抑制结合其的聚合物的分子内或分子间相互作用。位阻稳定剂阻碍结合其的聚合物参与静电相互作用。静电相互作用是两种或更多物质之间由于正电荷和负电荷之间的吸引力产生的非共价结合。位阻稳定剂能抑制与血液组分的相互作用，和因而的调理作用、噬菌作用以及被网状内皮系统摄入。因此位阻稳定剂能提高结合其的分子循环时间。位阻稳定剂还能抑制聚合物的聚集。优选的位阻稳定剂是聚乙二醇(PEG)或PEG衍生物。如本文所用，PEG优选具有约1-500个乙二醇单体、2-20个乙二醇单体、5-15个乙二醇单体或约10个乙二醇单体。如本文所用，PEG的平均分子量优选为约85-20,000道尔顿(Da)、约200-1000Da、约200-750Da或约550Da。如本文所用，相对不含位阻稳定剂的聚合物，位阻稳定剂阻止或抑制水溶液中结合其的聚合物的分子间或分子内相互作用。

配体

靶向基团或靶向配体用于靶向或递送聚合物或化合物至靶细胞或组织，或特定细胞类型。靶向基团增强分子和靶细胞的结合。因此，靶向基团能增强其结合的偶联物的药代动力学或生物分布性质，以改良所述偶联物的细胞分布和细胞摄取。所述膜活性聚合物可以直接地或通过间隔子连接一个或多个靶向基团。靶向基团例如配体与细胞或细胞受体的结合可引发内吞。靶向基团可以是单价的、二价的、三价的、四价的或具有更高价。靶向基团可以选自下组：对细胞表面分子有亲和性的化合物、细胞受体配体，以及抗体、抗体片段，以及对细胞表面分子具有亲和性的抗体模拟物。优选的靶向基团包括细胞受体配体。已使用多种配体将靶药物和基因靶向至细胞和特异性细胞受体。细胞受体配体可选自下组：碳水化合物、多糖、糖类(包括但不限于半乳糖、半乳糖衍生物、甘露糖和甘露糖衍生物)、维生素、叶酸、生物素、适体和肽(包括但不限于含RGD的肽、胰岛素、EGF和转铁蛋白)。靶向基团的例子包括通过使用唾液酸糖蛋白或半乳糖残基靶向唾液酸糖蛋白受体的那些。例如，含ASGP受体的肝细胞。因此，含半乳糖的靶向基团可以用于靶向肝细胞。含半乳糖的靶向基团包括但不限于：半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、寡糖和糖簇(例如，Tyr-Glu-Glu-(氨基己基GalNAc)₃、基于赖氨酸的半乳糖簇和基于胆烷的半乳糖簇)。其它合适的偶联物可包括能结合唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)上发现的碳水化合物识别结构域(CRD)的寡糖。示例性偶联物部分包括美国专利号6,525,031中提供的寡糖和/或碳水化合物复合物。

ASGPr靶向部分

靶向部分或基团提高其结合的偶联物的药动学或生物分布特性以改良所述偶联物的细胞特异分布和细胞特异摄取。半乳糖和半乳糖衍生物用于通过结合肝细胞表面表达的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)以将分子体内靶向肝细胞。如本文所用，ASGPr靶向部分包括半乳糖和对ASGPr的亲和性等于或超过半乳糖的半乳糖衍生物。半乳糖靶向部分与ASGPr的结合有助于将递送聚合物细胞特异靶向肝细胞以及递送聚合物内吞到肝细胞中。

ASGPr靶向部分可选自下组：乳糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、和N-异丁酰基-半乳糖胺(Iobst,S.T.和Drickamer,K.J.B.C.1996,271,6686)。ASGPr靶向部分可为单体(如具有单半乳糖胺)或多亚基(如具有多半乳糖胺)。

在一些实施方式中，所述半乳糖靶向部分通过PEG接头连接胺反应基团，结构如下所示：

其中n为1-19的整数。

在一个实施方式中，所述膜活性多胺通过ASGPr靶向部分掩蔽剂结合多胺上≥50%、≥60%、≥70%或≥80%的胺而被可逆掩蔽。在另一实施方式中，所述膜活性多胺通过ASGPr靶向部分掩蔽剂和PEG掩蔽剂结合多胺上≥50%、≥60%、≥70%或≥80%的胺而被可逆掩蔽。在另一实施方式中，ASGPr靶向部分掩蔽剂包括通过PEG接头连接胺反应基团的ASGPr靶向部分。对于用ASGPr靶向部分掩蔽剂和PEG掩蔽剂来掩蔽膜活性多胺，PEG与ASGPr靶向部分之比为约0-4:1，更优选约0.5～2:1。在另一实施方式中，有约1.3～2个PEG掩蔽剂：约1个半乳糖衍生物掩蔽剂。

表面电荷

ζ电势是悬浮颗粒表现出的物理特性，与表面电荷密切相关。在水性介质中，样品pH是影响ζ电势的最重要因素之一。当电荷是基于碱/酸的质子化/去质子化时，所述电荷是pH依赖性。因此，ζ电势值必需包括溶液条件，特别是pH才有意义。对于一般颗粒，ζ电势幅度表明胶体系统的电势稳定性。若所有悬浮颗粒都具有较大负或正ζ电势，则其倾向于排斥彼此，且颗粒没有聚集的趋势。然而，若颗粒具有低ζ电势值，则没有阻止颗粒聚集并絮凝的力。一般颗粒稳定和不稳定悬浮之间的通用分界线常为+30或-30mV。ζ电势大于+30mV或小于-30mV的颗粒通常被认为稳定。本发明所述的递送聚合物在生理盐和pH8下表现出20mV到-20mV的ζ电势，但其在水溶液中为胶体稳定且不絮凝。

膜活性多胺的正电荷或ζ电势通过掩蔽剂修饰而降低。聚合物电荷特别是正电荷会导致与血清组分或非靶细胞发生不想要的相互作用。表面正电荷还通过提高聚合物与带负电细胞膜的相互作用而在膜活性中起作用。因此，优选具有接近中性净电荷或ζ电势的递送聚合物进行体内多核苷酸递送。本发明的递送聚合物，即通过ASGPr靶向部分掩蔽剂和位阻稳定掩蔽剂的可逆结合而掩蔽的膜活性多胺，具有接近中性的表观表面电荷且在血清中稳定。更具体地，本发明的递送聚合物在pH8时测量的ζ电势为+30--30mV、+20--20mV、+10--10mV、或+5--5mV。预期所述偶联物在pH7时的净电荷比pH8时更正。净电荷或表面电荷是体内应用的重要因素。

不稳定连接

连接或接头是两种原子之间的联系，所述联系通过一种或多种共价键将一种化学基团或感兴趣的区段连接另一种化学基团或感兴趣的区段。例如，连接可联合掩蔽剂和聚合物。连接的形成可将两种单独分子联为单一分子或其可将两种原子联到相同分子上。所述连接的电荷可为中性或带有正或负电荷。可逆或不稳定连接包括可逆或不稳定键。连接可任选地包括增加两种相连原子之间距离的间隔子。间隔子还可增加连接的灵活性和/或长度。间隔子可包括但不限于：烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基，其各可包括一种或多种杂原子、杂环、氨基酸、核苷酸和糖。间隔基团为本领域熟知，前述列表不意在限制本发明的范围。

可逆或不稳定键是除了与氢原子共价键之外的共价键，其能在不破坏或切割同一分子中其他共价键的条件下被选择性破坏或切割。更具体地，可逆或不稳定键是在合适条件下比同一分子中其他不稳定共价键更不稳定(热力学)或更快速破坏(动力学)的共价键。分子内不稳定键的切割会形成两个分子。对于本领域技术人员，键的切割或不稳定通常用术语键切割的半衰期(t_1/2)(切割一半键所需的时间)来讨论。因此，可逆或不稳定键涵盖能比分子中其他键的选择性切割更快的键。

合适的条件由不稳定键的类型决定且为有机化学领域熟知。不稳定键可对pH、氧化或还原条件或试剂、温度、盐浓度、存在酶(如酯酶，包括核酸酶和蛋白酶)或存在添加试剂敏感。例如，提高或降低pH是pH不稳定键的合适条件。

不稳定基团发生转化的比例可由改变含所述不稳定基团的分子的化学成分来控制。例如，在不稳定基团旁添加具体化学部分(如电子受体或供体)可影响会发生化学转化的具体条件(如pH)。

如本文所用，生理不稳定键是在哺乳动物体内正常遇到或类似于遇到的那些条件下能切割的不稳定键。选择生理不稳定键从而其在存在于某些生理条件时发生化学转化(如切割)。

如本文所用，细胞生理不稳定键是在哺乳动物细胞内条件下可切割的不稳定键。哺乳动物细胞内条件包括哺乳动物细胞内发现的或类似其内所遇到的化学条件如pH、温度、氧化或还原条件或试剂和盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括哺乳动物中正常存在的酶活性如蛋白水解酶或水解酶。细胞生理不稳定键还可响应给予药学上可接受外源试剂而切割。合适条件下切割生理不稳定键的半衰期少于45分钟被认为非常不稳定。合适条件下切割生理不稳定键的半衰期少于15分钟被认为极度不稳定。

化学转化(不稳定键的切割)可通过向细胞添加药学上可接受的试剂来起始，或可在含有所述不稳定键的分子接触合适的胞内和/或胞外环境时自发产生。例如，pH不稳定键可在分子进入酸化内吞体中时被切割。因此，pH不稳定键可视作内吞体可切割的键。酶可切割的键可在暴露于酶如内吞体或溶酶体或胞质中存在的那些酶时被切割。二硫键可在分子进入细胞质的更高还原性环境时被切割。因此，二硫键可视作胞质可切割键。

如本文所用，pH不稳定键是在酸性条件下(pH<7)选择性断裂的不稳定键。该键还可称为内吞体不稳定键，因为细胞内吞体和溶酶体的pH小于7。术语pH不稳定包括pH不稳定键、pH极不稳定键和极端pH不稳定键。

酐与胺的反应形成酰胺和酸。对于许多酐来说，逆反应(形成酐和胺)非常慢且能量上不利。然而，若酐是环酐，则其与胺的反应产生酰胺酸分子，其中所述酰胺和所述酸在同一分子中。两种反应基团(酰胺和羧酸)存在于同一分子中加速了逆反应。具体地，伯胺与马来酸酐和马来酸酐衍生物的产物马来酰胺酸回复成胺和酐比其非环化类似物快1×10⁹-1×10¹³倍(Kirby1980)。

胺与酐的反应形成酰胺和酸。

胺与环酐的反应形成酰胺酸。

形成胺和酐的酰胺酸切割是pH依赖性且在酸性pH下显著加速。可利用该pH依赖性反应以形成可逆pH不稳定键和接头。顺式-乌头酸用作该pH敏感性接头分子。γ-羧酸酯首先偶联分子。第二步中，α或β羧酸盐偶联第二分子，形成两分子之间pH敏感的偶联。pH5时该接头切割的半衰期为8～24小时。

顺式-乌头酸酐和马来酸酐的结构。

发生切割的pH受所述不稳定部分中添加的化学成分控制。马来酸转变为胺和马来酸酐的速率显著依赖马来酸酐系统的取代(R2和R3)。R2是甲基时的转变速率比R2和R3是氢时高50倍。当R2和R3处都被烷基取代时(如2,3-二甲基马来酸酐)，该速率显著提高：比未取代马来酸酐快10,000倍。用2,3-二甲基马来酸酐对胺修饰形成的马来酰胺酸键被切割以恢复pH5时具有4～10分钟半衰期的酸酐和胺。预期若R2和R3是大于氢的基团，则酰胺酸转变为胺和酸酐的速率会比R2和/或R3是氢时更快。

pH极不稳定键：pH极不稳定键在pH5时的切割半衰期小于45分钟。pH极不稳定键的构造在化学领域熟知。

极端pH不稳定键：极端pH不稳定键在pH5时的切割半衰期小于15分钟。极端pH不稳定键的构造在化学领域熟知。

双取代的环酸酐特别用于本发明掩蔽剂和膜活性多胺的结合。其提供生理pH不稳定键，容易修饰胺并在细胞内吞体和溶酶体内所见pH减少下切割后恢复所述胺。第二，与胺反应后产生的α或β羧酸基团似乎仅构成聚合物预期负电荷的约1/20(Rozema等，Bioconjugate Chemistry2003)。因此，用双取代马来酸酐修饰多胺能有效中和多胺的正电荷，而不是产生具有高负电荷的多胺。接近中性的聚合物优选用于体内递送。

天然产生的聚合物是天然可发现的聚合物。示例包括多核苷酸、蛋白、胶原和多醣(淀粉、纤维素、糖胺聚糖、几丁质、琼脂、琼脂糖)。天然聚合物可从生物来源分离或可合成。合成的聚合物“由人”通过化学过程配制或生产且不是通过天然发生的生物过程产生。非天然聚合物不是从天然产生(动物或植物)的材料或单体(如氨基酸、核苷酸和糖)制备的合成聚合物。聚合物可完全或部分天然、合成或非天然。

RNAi多核苷酸偶联物

我们已经发现RNAi多核苷酸和靶向配体药代动力学分子靶向部分的偶联，和上述共给予RNAi多核苷酸偶联物与递送聚合物提供了改良的RNAi多核苷酸体内递送。功能性递送表示所述RNAi多核苷酸递送到细胞并预期具有生物学活性、基因表达的序列特异性抑制。给予哺乳动物脉管系统的许多分子(包括多核苷酸)通常由肝脏从身体中清除。肝脏对多核苷酸的清除中所述多核苷酸发生降解或另外加工以从身体中去除且其中所述多核苷酸没有引起基因表达的序列特异性抑制，所述清除不视作功能性递送。

通过共价连接所述RNAi多核苷酸和所述靶向配体-药代动力学调节剂靶向部分形成RNAi多核苷酸偶联物。可以合成或修饰所述多核苷酸使其含有反应基团A。可以合成或修饰所述靶向部分使其含有反应基团B。选择反应基团A和B，从而其能用本领域已知的方法通过共价键而连接。

所述靶向部分还可连接所述RNAi多核苷酸的3′或5′末端。对于siRNA多核苷酸，所述靶向部分可连接有义链或反义链，尽管优选有义链。在一些实施方式中，所述siRNA通过含有反应基团A(例如伯胺基团)的短烷基链连所述接靶向部分。然后，反应基团A偶联靶向部分上的反应基团B(例如羧基基团)。

为了靶向肝内的肝细胞，优选的靶向配体是半乳糖簇。半乳糖簇包含具有2～4种末端半乳糖衍生物的分子。如本文所用，术语半乳糖衍生物包括半乳糖和对去唾液酸糖蛋白受体的亲和性等于或超过半乳糖的半乳糖衍生物。末端半乳糖衍生物通过其C-1碳连接分子。去唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)对肝细胞独特并结合分支的半乳糖末端糖蛋白。优选的半乳糖簇具有各自对去唾液酸糖蛋白受体具有亲和性的3种末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物。更优选的半乳糖簇具有3种末端N-乙酰-半乳糖胺。本领域其他常见术语包括三触角型(tri-antennary)半乳糖、三价半乳糖和半乳糖三聚体。已知三触角型半乳糖衍生物簇以比二触角型或单触角型半乳糖衍生物结构更强的亲和性结合ASGPr(Baenziger和Fiete,1980,Cell,22,611-620；Connolly等,1982,J.Biol.Chem.,257,939-945)。需要多价以获得nM亲和性。与递送聚合物共给予时，结合对去唾液酸糖蛋白受体具有亲和性的单半乳糖衍生物不能将RNAi多核苷酸功能性体内递送到肝细胞中。

半乳糖

半乳糖簇含各自连接中央分支点的三种半乳糖衍生物。所述半乳糖衍生物通过所述糖的C-1碳结合中央分支点。半乳糖衍生物优选通过接头或间隔子连接所述分支点。优选的间隔子是灵活的亲水间隔子(美国专利5885968；Biessen等J.Med.Chem.1995Vol.39p.1538-1546)。优选的灵活亲水间隔子是PEG间隔子。优选的PEG间隔子是PEG₃间隔子。分支点可为任何小分子，其允许所述三种半乳糖衍生物结合，还允许所述分支点结合RNAi多核苷酸。示例性分支点基团是二赖氨酸。二赖氨酸分子含三种胺基(可通过其结合三种半乳糖衍生物)和羧基反应基团(二赖氨酸可通过其结合RNAi多核苷酸)。分支点与RNAi多核苷酸的结合可通过接头或间隔子发生。优选的间隔子是灵活的亲水间隔子。优选的灵活亲水间隔子是PEG间隔子。优选的PEG间隔子是PEG₃间隔子(三个乙烯单元)。所述半乳糖簇还可用本领域已知方法连接所述RNAi多核苷酸的3′或5′末端。对于具有2条链的RNAi多核苷酸，例如siRNA，所述半乳糖簇可连接任一链。

优选的半乳糖衍生物是N-乙酰-半乳糖胺(GalNAc)。对去唾液酸糖蛋白受体具有亲和性的其他糖可选自含有以下的列表：半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。已研究大量半乳糖衍生物对去唾液酸糖蛋白受体的亲和性(参见例如:Iobst,S.T.和Drickamer,K.J.B.C.1996,271,6686)或其易用本领域一般方法确定。

半乳糖簇的一个实施方式

分支点和核酸之间有PEG间隔子的半乳糖簇

多核苷酸

术语多核苷酸，或核酸或多聚核酸是本领域术语，指含有至少两种核苷酸的聚合物。核苷酸是多核苷酸聚合物的单体单元。具有少于120个单体单元的多核苷酸常称为寡核苷酸。天然核酸具有去氧核醣-或核糖-磷酸盐主链。非天然或合成的多核苷酸是体外或在无细胞系统中聚合的多核苷酸且含有相同或相似的碱基但可含有天然核糖或脱氧核糖磷酸盐主链以外的主链类型。多核苷酸可用本领域已知的任何方法合成。本领域已知的多核苷酸主链包括：PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯、磷酸二酰胺(phosphorodiamidates)、吗啉代、和天然核酸的其他磷酸主链变体。碱基包括嘌呤和嘧啶，其还包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物。嘌呤和嘧啶的合成类似物包括但不限于将新反应基团置于核苷酸上的修饰,例如但不限于胺、乙醇、硫醇、羧酸盐和卤代烷。术语碱基包含任何已知的DNA和RNA碱基类似物。多核苷酸还可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、合成的核苷酸或任何合适组合。多核苷酸可体外聚合，其可为重组体，包括嵌合序列或这些基团的衍生物。多核苷酸还可包括在5′末端和3′末端、或5′和3′末端均有的末端帽部分。所述帽部分可为但不限于倒置的脱氧脱碱基部分、倒置的脱氧胸苷部分、胸苷部分、或3′甘油修饰。

RNA干扰(RNAi)多核苷酸是能诱导RNA干扰的分子，其通过与哺乳动物细胞的RNA干扰通路组成部分相互作用以序列特异方式降解或抑制转基因的信使RNA(mRNA)转录本翻译。两种主要RNAi多核苷酸是小(或短)干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNA)。RNAi多核苷酸可选自下组：siRNA、微RNA、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码能诱导RNA干扰的表达盒。siRNA包括的双链结构通常含15-50个碱基对，优选21-25个碱基对，并具有与细胞内所表达靶基因或RNA中编码序列相同(完美互补的)或几乎相同(部分互补的)的核苷酸序列。siRNA还具有3′双核苷酸突出。siRNA可由形成发夹结构的两个退火多核苷酸或单核苷酸组成。本发明的siRNA分子包含有义区域和反义区域。在一个实施方式中，偶联物的siRNA从两种寡核苷酸片段中组装，其中一种片段包含所述siRNA分子反义链的核苷酸序列，且第二片段包含所述siRNA分子有义链的核苷酸序列。在另一实施方式中，有义链通过接头分子如多核苷酸接头或非核苷酸接头连接反义链。微RNA(miRNA)是约22个核苷酸长度的非编码小RNA基因产物，指导其mRNA靶标的破坏或翻译抑制。若miRNA和靶mRNA之间是部分互补，则所述靶mRNA的翻译被抑制。若广泛互补，则所述靶mRNA被切割。对于miRNA，所述复合物结合通常位于mRNA3′UTR的靶位点，其通常仅与所述miRNA部分同源。“种子区域”为miRNA5′末端的一段约七(7)个连续核苷酸，与其靶标形成完美碱基配对-在miRNA特异性中起关键作用。RISC/miRNA复合物与mRNA的结合可导致蛋白翻译抑制或mRNA的切割和降解。近期数据表明若沿着全长miRNA和其靶标有完美同源性而不是仅在种子区域显示完美碱基配对，则mRNA切割优选发生(Pillai等，2007)。

RNAi多核苷酸表达盒可在细胞中转录产生小发夹RNA，其能作为siRNA、分离的有义和反义链线性siRNA或miRNA行使功能。RNA聚合酶III转录的DNA含有选自下表的启动子：U6启动子、H1启动子和tRNA启动子。RNA聚合酶II启动子包括U1、U2、U4和U5启动子、snRNA启动子、微RNA启动子和mRNA启动子。

已知miRNA序列的列表可在研究组织维护的数据库中找到，如维尔康姆基金会桑格研究所(Wellcome Trust Sanger Institute)、宾州生物信息中心(Penn Center forBioinformatics)、斯隆凯特林癌症纪念纪念中心(Memorial Sloan Kettering CancerCenter)和欧洲分子生物实验室等。已知的有效siRNA序列和关联结合位点也在相关文献中充分记述。RNAi分子容易用本领域已知的技术设计和生产。此外，计算工具可用于增加发现有效和特异性序列基序的可能性(Pei等2006，Reynolds等2004，Khvorova等2003，Schwarz等2003，Ui-Tei等2004，Heale等2005，Chalk等2004，Amarzguioui等2004)。

本发明的多核苷酸可被化学修饰。该化学修饰的非限制性示例包括：硫代磷酸酯核苷酸间连接、2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、和倒置脱氧脱碱基残基掺入。用于各种多核苷酸结构时，这些化学修饰显示在细胞中保持多核苷酸活性，同时增加这些化合物的血清稳定性。化学修饰的siRNA还可使人中干扰素活性激活的可能性最小化。

在一个实施方式中，本发明的化学修饰RNAi多核苷酸包括具有两条链的双链体，其一或二者可化学修饰，其中各链为约19～约29核苷酸。在一个实施方式中，本发明的RNAi多核苷酸包括一种或多种修饰的核苷酸，同时保持在细胞内介导RNAi或在体外系统中重建的能力。RNAi多核苷酸可经修饰，其中化学修饰包括一个或多个(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)核苷酸。本发明的RNAi多核苷酸可包括修饰的核苷酸，其占RNAi多核苷酸中所存在核苷酸总数的某一百分比。同样，本发明的RNAi多核苷酸通常可在约5～约100%(如5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的核苷酸位置)的核苷酸位置上包括修饰的核苷酸。给定RNAi多核苷酸中存在的修饰核苷酸的实际百分比取决于所述RNAi多核苷酸中存在的核苷酸总数。若RNAi多核苷酸是单链，则修饰百分比可基于单链RNAi多核苷酸中存在的核苷酸总数。同样，若RNAi多核苷酸是双链，则修饰百分比可基于有义链、反义链或有义和反义链二者中存在的核苷酸总数。此外，给定RNAi多核苷酸中存在的修饰核苷酸的实际百分比还可取决于所述RNAi多核苷酸中存在的嘌呤和嘧啶核苷酸总数。例如，其中RNAi多核苷酸中存在的所有嘧啶核苷酸和/或所有嘌呤核苷酸经过修饰。

RNAi多核苷酸调控基因编码的RNA表达。由于多种基因可彼此共有一定程度的序列同源性，所以RNAi多核苷酸可设计为靶向具有足够序列同源性的一类基因。因此，RNAi多核苷酸可包括与不同基因靶标之间共有或对特异基因靶标独特的序列互补的序列。因此，RNAi多核苷酸可设计为靶向具有数种基因之间同源性的RNA序列的保守区域，从而靶向基因家族中的数种基因(如不同基因同种型、剪接变体、突变基因等)。在另一实施方式中，RNAi多核苷酸可设计为靶向对单一基因中特异RNA序列独特的序列。

术语互补指多核苷酸与另一多核苷酸序列通过常规沃森克里克或其他非常规类型形成氢键的能力。涉及本发明的多核苷酸分子时，多核苷酸分子与其靶标(有效结合位点)或互补序列的结合游离能量足以推进所述多核苷酸的相关功能，如酶的mRNA切割或翻译抑制。核酸分子结合游离能量的测定为本领域熟知(Frier等1986，Turner等1987)。互补百分比表示第一多核苷酸分子中毗连链的碱基百分比，所述分子可与第二多核苷酸序列(如十分之五、六、七、八、九、十即50%、60%、70%、80%、90%和100%互补)形成氢键(如沃森克里克碱基配对)。完美互补表示多核苷酸序列的毗连链中所有碱基与第二多核苷酸序列中相同数量的连续碱基形成氢键。

抑制、下调或敲减基因表达表示如用所述基因转录的RNA水平或从所述RNA翻译的多肽、蛋白或蛋白亚基水平所测量,所述基因的表达低于没有阻断本发明多核苷酸偶联物时观察到的水平。用本发明组合物所递送多核苷酸进行的基因表达抑制、下调或敲减优选低于存在对照失活核酸(序列杂乱的核酸或钝化错配的核酸)时或所述多核苷酸未偶联掩蔽聚合物时观察到的水平。

体内给予

药理学和毒理学中，给予途径是使药物、液体、毒剂或其他物质接触身体的途径。通常，用于治疗哺乳动物的药物和核酸给予方法为本领域熟知，且可用于给予本发明组合物。本发明化合物可通过任何合适途径在根据所述途径适当调整的制剂中应用，最优选肠胃外。因此，可通过注射，例如静脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内注射给予本发明化合物。因此，本发明还提供含有药学上可接受载体或赋形剂的药物组合物。

给予的肠胃外途径包括脉管内(静脉内、动脉内)、肌肉内、实质内、皮内、真皮下(subdermal)、皮下(subcutaneous)、肿瘤内、腹膜内、鞘内、硬膜下、硬膜外和淋巴内注射，使用注射器和针或导管。本文所述脉管内表示称为脉管的管状结构内，其连接体内的组织或器官。所述管状结构的腔内，体液流向或流自身体部分。体液的示例包括血液、脑脊液(CSF)、淋巴液或胆汁。脉管的示例包括冠状动脉、细动脉、毛细管、小静脉、窦状小管、静脉、淋巴管、胆管和唾液腺管或其他外分泌腺管。脉管内途径包括通过诸如动脉或静脉等血管的递送。血液循环系统提供药物的全身扩散。

所述组合物在药学上可接受载体溶液中注射。药学上可接受指药理学/毒理学角度上哺乳动物可以接受的那些特性和/或物质。短语药学上可接受指给予哺乳动物时生理上可耐受且通常不产生过敏或其他不利或毒性反应的分子实体、组合物和特性。本文所用术语“药学上可接受”优选指被联邦或州政府管理机构批准，或美国药典或其它公认药典所列用于动物应用，更具体用于人。

RNAi多核苷酸靶向部分偶联物可与所述递送聚合物共同给予。共同给予表示将RNAi多核苷酸和递送聚合物给予哺乳动物，从而两者同时存在于该哺乳动物内。

RNAi多核苷酸靶向部分偶联物和递送聚合物可同时给予或其可依次递送。对于同时给予，其可在给予前混合。对于依次给予，RNAi多核苷酸靶向部分偶联物或递送聚合物可先给予。

治疗效果

RNAi多核苷酸可递送用于研究目的或用于在治疗细胞中产生变化。RNAi多核苷酸的体内递送用于研究试剂和各种治疗、诊断、靶标确认、基因组开发、基因工程改造和药物基因组应用。我们公开的RNAi多核苷酸递送引起肝细胞中内源基因表达的抑制。多核苷酸递送后测量的报告(标记)基因表达水平指示其他多核苷酸递送后基因表达水平相似的合理预期。本领域普通技术人员认为有益的治疗水平在疾病之间不同。例如，血友病A和B分别由X连锁的凝结因子VIII和IX缺陷引起。其临床过程受到因子VIII或IX的正常血清水平百分比极大影响：<2%、严重；2～5%，中度；和5～30%轻度。因此，严重患者中循环因子的正常水平从1%增加到2%可视为有益。高于6%的水平阻止自发流血但不阻止那些手术或损伤的继发性流血。相似地，基因的抑制不需要100%以提供治疗益处。基因治疗领域普通技术人员能基于标记基因结果的充分水平来合理预期疾病特异性基因表达的有益水平。血友病示例中，若标记基因以与因子VIII正常水平的2%体积相当的水平表达产生蛋白，则可合理预期编码因子VIII的基因还会以相似水平表达。因此，报告或标记基因通常用作细胞内蛋白表达的有用范例。

肝脏是基因治疗最重要的靶组织，因为其在代谢(如各种血胆脂醇过多中的脂蛋白代谢)和循环蛋白(如血友病中的凝结因子)分泌中起关键作用。此外，常见获得性疾病如慢性肝炎和硬化且也可能用基于多核苷酸的肝脏疗法治疗。影响或被肝脏影响的许多疾病或病症可通过敲减(抑制)肝脏中基因表达来治疗。该肝脏疾病和病症可选自含有以下的列表：肝癌(包括肝细胞癌，HCC)、病毒感染(包括肝炎)、代谢紊乱(包括高脂血症和糖尿病)、纤维症和急性肝损伤。

待给予的递送聚合物和RNAi多核苷酸偶联物的量(剂量)可凭经验确定。我们显示用0.1-10mg/kg动物体重的siRNA-偶联物和5-60mg/kg动物体重的递送聚合物能有效敲减基因表达。小鼠中的优选量为0.25-2.5mg/kg siRNA-偶联物和10-40mg/kg递送聚合物。更优选地，给予约12.5-20mg/kg递送组合物。RNAi多核苷酸偶联物的量容易提高，因为其通常在大剂量下无毒。

如本文所用，体内表示生物体内部发生且更具体的表示与部分或死亡个体相反的完整、活多细胞生物体(动物)如哺乳动物的活组织中或其上进行的过程。

实施例

实施例1.聚乙烯基醚随机共聚物

A.用于纳入含胺单体的乙烯基醚单体。2-乙烯氧基乙基邻苯二甲酰亚胺通过2-氯乙基乙烯基醚(25g，0.24mol；CAS#110-75-8)与邻苯二甲酰亚胺钾(25g，0.135mol；CAS#1074-82-4)在100°C N,N-二甲基甲酰胺(DMF，75mL)中反应制备，用四正丁基溴化铵(0.5g；CAS#1643-19-2)作为相转移催化剂。所述溶液加热6小时然后在水中析出并过滤。然后该固体从甲醇中重结晶两次产生白色晶体。

B.合成水溶性、两亲性、膜活性聚(乙烯基醚)多胺三元共聚物。在氮气层下将Xmol%的胺保护乙烯基醚(如2-乙烯氧基乙基邻苯二甲酰亚胺)加入经烘箱干燥圆底烧瓶中的无水二氯甲烷内。向此溶液中加入Ymol%的低疏水性基团(如丙基、丁基)乙烯基醚和任选的Zmol%高疏水性基团(如十二烷基、十八烷基)乙烯基醚(图1)。将所述溶液置于-50～-78°C浴中，使2-乙烯氧基乙基邻苯二甲酰亚胺沉淀。向此溶液中加入10mol%BF₃·(OCH₂CH₃)₂，然后在-50～-78°C反应2～3小时。添加含氢氧化铵的甲醇溶液终止聚合。聚合物减压干燥然后于1,4-二噁烷/甲醇(2/1)中析出。每邻苯二甲酰亚胺加入20mol当量的肼以移除胺上的保护基团。溶液回流3小时然后减压干燥。得到的固体溶于0.5mol/L HCl并回流15分钟以形成聚合物的盐酸盐，用蒸馏水稀释，并再回流1小时。然后用NaOH中和所述溶液，冷却至室温(RT)、转移到分子纤维素透析袋中，用蒸馏水透析，然后冻干。可用尺寸排阻或其他色谱进一步纯化所述聚合物。聚合物的分子量用柱根据标准过程评估，包括分析尺寸排阻色谱和多角度光散射(SEC-MALS)尺寸排阻色谱。

C.合成DW1360。从2-乙烯氧基乙基邻苯二甲酰亚胺(5g，23.02mmol)、丁基乙烯基醚(0.665g，6.58mmol)、和十八烷基乙烯基醚(0.488g，1.64mmol)单体合成胺/丁基/十八烷基聚(乙烯基醚)三元共聚物。在氩气层下将2-乙烯氧基乙基邻苯二甲酰亚胺加入含磁力搅拌棒的200mL经烘箱干燥圆底烧瓶中的36mL无水二氯甲烷内。向此溶液中加入丁基乙烯基醚和正十八烷基乙烯基醚。室温下(RT)所述单体完全溶解获得澄清的匀质溶液。然后将含澄清溶液的反应容器置于通过加入干冰到ACS级变性酒精和乙二醇的1:1溶液而生成的-50°C浴中，能形成邻苯二甲酰亚胺单体的可见沉淀。冷却约1.5分钟后，加入BF₃·(OCH₂CH₃)₂(0.058g,0.411mmol)以起始聚合反应。聚合开始后邻苯二甲酰亚胺单体溶解。-50°C进行反应3小时。通过添加5mL溶于甲醇的1%氢氧化铵停止聚合。然后通过旋转蒸发移除溶剂。

然后所述聚合物在30mL1,4-二噁烷/甲醇(2/1)中溶解。向此溶液中加入肼(0.147g,46mmol)并将混合物加热回流3小时。然后用旋转蒸发移除溶剂，得到的固体在20mL的0.5mol/L HCl中析出并回流15分钟，用20mL蒸馏水稀释，并再回流1小时。然后用NaOH中和所述溶液，冷却至室温、转移到3,500分子量的纤维素透析袋中，用蒸馏水透析24小时(2×20L)，然后冻干。

虽然描述了含所示乙烯基醚单体的聚合物，本发明不局限于这些具体单体。

D.合成水溶性、两亲性、膜活性聚(丙烯酸酯)多胺三元共聚物

聚丙烯酸酯和聚丙烯酸甲酯异聚物可用常用自由基反应方案合成(如本文所用,聚甲基丙烯酸酯多胺是聚丙烯酸酯多胺属的亚属)：

式中R是独立的氢或甲基基团且X代表聚合物中以所需比例存在的所需单体侧基。

对于聚合物合成，合适的单体包括但不限于：

BOC-保护的含胺单体(M)：

其中n=1～4，且BOC保护基团的移除产生伯胺。

低疏水性基团单体(N)：

其中n=1～5，且一个或多个碳可为不饱和。

高疏水性基团单体(O)：

其中n=8～24，且一个或多个碳可为不饱和。

使用上述单体，膜活性异聚物可用下述组合物合成：M可为50～90mol%；N可为10～50mol%；O可为0～10mol%。

E.合成水溶性、两亲性、膜活性聚(丙烯酸酯)多胺三元共聚物

R、R′和R′′是独立的氢或甲基

x=2、3或4

y=0、1、2、3、4或5[甲基(C1)–己基(C6)]

z=整数≥8[癸基(C10)或更大]

a、b和d是选定整数，从而聚合物具有上述所需单体比例。

Xmol%的胺保护丙烯酸酯单体、Y mol%的低疏水性基团丙烯酸酯单体和任选的Zmol%高疏水性基团丙烯酸酯单体加入配有搅拌棒的反应管。加入合适的溶剂(如乙腈或二噁烷)，然后加入合适的催化剂(如AIBN)，用N₂吹扫反应混合物。然后所述反应管加帽并转移到油浴中加热(如60°C)足够的时间以聚合(如3小时)。粗聚合物可用合适的方法纯化，包括但不限于透析、柱色谱和沉淀，然后移除BOC保护基团。所述BOC保护基团通过与冰醋酸中的2M HCl反应来去除。去除所述BOC保护基团产生聚合物伯胺和水溶性膜活性聚丙烯酸酯多胺。然后聚合物可用合适的方法纯化，包括透析、柱色谱和沉淀。

合成(Ant40911-323-28,Ant40911-35-2)。2,2′-偶氮二(2-甲基丙腈)(AIBN,自由基引发剂)、乙腈和二噁烷购自西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)。过滤丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯单体以去除引发剂。3-(BOC-氨基)1-丙醇(TCI)与烯丙酰氯(CAS814-68-6)反应产生BOC-氨基丙烯酸丙酯(BAPA)。

在配有搅拌棒的2L圆底烧瓶中将2-(2-氨基乙氧基)乙醇(21.1g,202.9mmol)溶于350mL二氯甲烷。在单独的1L烧瓶中，BOC酐(36.6g，169.1mmol)溶于660mL二氯甲烷。2L圆底烧瓶装有额外漏斗并将BOC酐溶液在6小时内加入烧瓶中。该反应搅拌过夜。在2L分液漏斗中，用各300ml的10%柠檬酸、10%K₂CO₃、饱和NaHCO₃和饱和NaCl清洗产物。产物即BOC保护的2-(2-氨基乙氧基)乙醇用Na₂SO₄干燥、重力过滤、并用旋转蒸发和高真空蒸发DCM。

配有搅拌棒并用氩气吹扫的500mL底烧瓶中加入BOC保护的2-(2-氨基乙氧基)乙醇(27.836g，135.8mmol)，然后加入240mL无水二氯甲烷。加入双异丙基乙基胺(35.5mL，203.7mmol)，并将该系统置于干冰/丙酮浴中。用10mL二氯甲烷稀释烯丙酰氯(12.1mL，149.4mmol)，并逐滴加入到氩气吹扫系统中。该系统保持在氩气中，并降至室温和搅拌过夜。各用100mL的dH₂O、10%柠檬酸、10%K₂CO₃、饱和NaHCO₃和饱和NaCl清洗产物。产物即BOC-氨基乙氧基丙烯酸乙酯(BAEEA)用Na₂SO₄干燥、重力过滤、并用旋转蒸发来蒸发DCM。在29cm二氧化硅上用直径7.5cm柱通过柱色谱纯化所述产物。所用溶剂系统为己烷中的30%乙酸乙酯。Rf：0.30。收集组分并用用旋转蒸发和高真空移除溶剂。所得BAEEA产量为74%。BAEEA在冰箱内保存。

聚合物40911-323-28：70%BAPA、25%甲基丙烯酸丁酯(CAS97-88-1)、5%甲基丙烯酸十八烷基酯(CAS4813-57-4)、(3%AIBN催化剂)摩尔进料率(0.0139总摩尔)。将BAPA(9.739mmol)(A)、甲基丙烯酸丁酯(3.478mmol)(B)、和甲基丙烯酸十八烷基酯(0.6957mmol)(D)加入配有搅拌棒的20mL反应管中。加入乙腈(16mL)，然后加入AIBN(0.4174mmol)。重复上述步骤以串联运行两次反应。该反应混合物用N₂吹扫30分钟。然后反应管加帽并转移到油浴中60°C加热3小时。移出所述管且合并内容物。粗聚合物沉淀在去离子水中，并与纯三氟乙酸(40ml)反应1.5小时去除BOC保护基团且产生伯胺和水溶性膜活性聚丙烯酸酯多胺。将200mL去离子水(dH₂O)加入反应，所述溶液转移到截留3500MW的纤维素透析袋中，用高盐透析24小时，然后用dH₂O透析18小时。内容物蒸发至干，溶于100mL dH₂O中并冻干。干燥的聚合物以25mg/ml溶于50%MeOH/100mM甲酸铵/0.2%甲酸溶液中。粗聚合物溶液(250mg，10mL)的三次注射在S-200丙烯葡聚糖凝胶介质上纯化，使用流速为5.0毫升/分钟的XK50/30厘米柱。所述柱经压缩并按照生产商说明使用。(通用电气医疗集团(GEHealthcare)，说明书56-1130-82Al，52-2086-00AK)。用岛津(Shimadzu)RID-10A折射率收集仪检测聚合物洗脱。收集且合并各运行中23分钟～28分钟的组分。蒸发溶剂并将纯化的聚合物冻干2次。

聚合物Ant40911-35-2：80%BAEEA、15%甲基丙烯酸丁酯、5%丙烯酸十八烷基酯、(3%AIBN催化剂)摩尔进料率(0.013913总摩尔)。将BAEEA(A)(11.13mmol)、甲基丙烯酸丁酯(B)(2.086mmol)和丙烯酸十八烷基酯(D)(0.6957mmol)加入配有搅拌棒的20mL反应管中。加入二噁烷(16ml)，然后加入AIBN(0.4174mmol)。重复上述步骤以串联运行两次反应。该反应混合物用N₂吹扫30分钟。然后反应管加帽并转移到油浴中60°C加热3小时。移出所述管且合并内容物。用旋转蒸发和高真空蒸发二噁烷，粗聚合物以70mg/ml溶于89.8%二氯甲烷/10%四氢呋喃/0.2%三乙基胺溶液。粗聚合物溶液(700mg,10mL)的三次注射在Jordi凝胶二乙烯苯104柱上纯化(内径：22mm，长度：500mm)，使用流速为5.0毫升/分钟。用岛津(Shimadzu)RID-10A折射率收集仪检测聚合物洗脱。收集且合并15.07分钟～17.13分钟的组分。用旋转蒸发来蒸发溶剂。

约10mg聚合物溶于0.5mL的89.8%二氯甲烷、10%四氢呋喃、0.2%三乙基胺中。用连接岛津Prominence HPLC的Wyatt Helos II多角度光散射检测器测量分子量和多分散性(PDI)，使用Jordi5μ7.8×300混合床LS DVB柱。获得172,000分子量和1.26的PDI。

纯化的BOC-保护聚合物与纯三氟乙酸(7mL)反应1.5小时(或与冰醋酸中的2M HCl反应0.5小时)去除BOC保护基团并产生胺。将40mL dH₂O加入反应，所述溶液转移到截留3500MW的纤维素透析袋中，用高盐透析24小时，然后用dH₂O透析18小时。内容物蒸发至干，溶于20～30mL dH₂O中并冻干两次。聚合物溶液在2～8°C保存。

连接胺和聚合物主链的碳原子数量和所述接头是否分支会影响胺的pKa和胺附近的位阻效应。例如，对于上述聚合物，乙胺的pKa约为8.1、丙胺的pKa约为9.3、戊胺的pKa约为10.2。胺的pKa或胺附近的位阻效应影响掩蔽基团结合所述胺的不稳定性。对于马来酸酐与胺的可逆结合，胺较高的pKa使酐从胺中以更低速度释放。而且，胺附近增加的位阻障碍，如异丙基接头可增加胺的pKa。

聚合物Lau41305-38-17-19：80%BAPA、20%甲基丙烯酸乙酯(CAS97-63-2)、(3%AIBN催化剂)摩尔进料率(0.0105总摩尔)。将BAPA(A)(8.40mmol)和甲基丙烯酸丁酯(B)(2.10mmol)加入配有搅拌棒的15mL反应管中。加入乙腈(11.5ml)，然后加入AIBN(0.315mmol)。重复上述步骤以串联运行两次反应。该反应混合物用N₂吹扫30分钟。然后反应管加帽并转移到油浴中60°C加热3小时。移出所述管且合并内容物。用旋转蒸发和高真空蒸发乙腈，粗聚合物以50mg/ml溶于74.8%二氯甲烷/25%四氢呋喃/0.2%三乙基胺溶液。粗聚合物溶液(500mg，10mL)的三次注射在Jordi凝胶氟化二乙烯苯10⁴ 柱上纯化(内径：22mm，长度：500mm)，所用流速为5.0毫升/分钟。用岛津(Shimadzu)RID-10A折射率收集仪检测聚合物洗脱。收集且合并17.16分钟～19.18分钟的组分。用旋转蒸发来蒸发溶剂。纯化的BOC-保护聚合物与冰醋酸(7mL)中的2M HCl反应1.5小时去除BOC保护基团并产生胺。将40mLdH₂O加入反应，所述溶液转移到截留3500MW的纤维素透析袋中，用高盐透析24小时，然后用dH₂O透析18小时。内容物蒸发至干，溶于30mL dH₂O中并冻干两次。

F.从(保护的)胺单体、低疏水性基团单体、和高疏水性基团十八烷基中合成的相似聚合物预期在本发明实施中有效。

聚合物鉴定

实施例2。DW1360的表征。

A.两亲性分析。1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH，英杰公司(Invitrogen))荧光(λ_ex=350nm；λ_em=452nm)在疏水环境增强。该荧光团用于分析DW1360聚合物。将0.5μM(终浓度)DPH加入含10μgDW1360的0.5mL50mMHEPES缓冲液中，pH8.0。然后通过测量DPH荧光来测试所述溶液在疏水环境下的DPH积累。存在偶联物时DPH荧光的增加表明所述聚合物形成疏水环境。

B.分子量。聚合物分子量(质量)(MW)在联用optilab rEX的Wyatt Dawn HeleosII上以批处理方式测定。聚合物在合适溶剂中以不同浓度析出，各加载到Wyatt系统上。然后Astra软件计算折射率变化作为浓度的函数(dn/dc)，其在Zimm图中用于计算MW。测定的纯化DW1360平均分子量为4000～6000Da。纯化丙烯酸盐聚合物平均分子量约为100～120kDa。

C.颗粒测量和ζ电势。聚合物的ζ电势用马尔文(Malvern)Zetasizer nano系列(Nano ZS)仪器测量。CDM-掩蔽聚合物的ζ电势在0～-30mV变化，更优选主要为0～-20mV。ζ电势在pH8缓冲的等张葡萄糖中用残余HEPES测量。pH7时，由于一些胺质子化，预期偶联物会得到一些正电荷。

D.CDM-试剂修饰后偶联物中胺基的定量。如上所述合成DW1360聚合物，然后用14重量当量的HEPES碱和7重量当量的CDM-NAG与CDM-PEG2:1wt:wt混合物处理(平均11单元)。1小时后，通过用100mM NaHCO₃中的三硝基苯磺酸(TNBS)处理来测量马来酸酐衍生物处理偶联物的胺含量。根据未经马来酰胺酸修饰的聚合物归一化时，测定经修饰胺含量为总量的约75%。修饰的程度可由改变添加的马来酸酐量或改变反应条件而变化。

E.脂质体裂解。10mg蛋卵磷脂用含100mM羧基荧光素(CF)和10mMHEPES pH7.5的1mL缓冲液水合。然后挤压脂质体通过100-nm孔聚碳酸酯滤器(加州普莱森顿核孔公司(Nucleopore))。用Sepharose(琼脂糖凝胶)4B-200通过尺寸排阻色谱去除未捕获的CF，使用pH8的10mM HEPES和0.1mol/L NaCl洗脱。200μL装载CF的脂质体等分试样加入到1.8mL等张缓冲液中。囊泡悬浮液中加入0.25μg聚合物30分钟后测量荧光(λ_激发=488，λ_发射=540)。各实验结束时，通过添加40μL的1%曲通(Triton)X-100溶液破坏囊泡以测定最大裂解。

实施例3。蜂毒肽两亲聚合物肽。

表1.蜂毒肽显示具有高膜活性。

n.d.–未测试。

^a–二油酰磷脂酰乙醇胺

^b–用CDM、CDM-gal或CDM-PEG其组合的修饰抑制了膜活性。

遮蔽剂

实施例4。遮蔽剂。

A.合成2-丙酸-3-甲基马来酸酐掩蔽剂前体(羧基二甲基马来酸酐或CDM)。

2-丙酸-3-甲基马来酸酐

向50mL无水四氢呋喃中的氢化钠(0.58g，25mmol)悬浮液加入2-膦基丙酸三乙酯(7.1g，30mmol)。氢气逸出停止后，加入含2-酮戊二酸二甲酯(3.5g,20mmol)的10mL无水四氢呋喃并搅拌30分钟。然后加入10mL水，通过旋转蒸发去除四氢呋喃。得到的固体和水混合物用3×50mL乙醚提取。合并醚提取物，用硫酸镁干燥并浓缩为浅黄色油。用2:1的醚：己烷洗脱通过硅胶色谱来纯化所述油，产生4g(82%产量)纯三酯。然后通过在含4.5g(5当量)氢氧化钾的50ml50/50水和乙醇混合物中溶解所述三酯形成2-丙酸-3-甲基马来酸酐。溶液加热回流1小时。旋转蒸发去除乙醇，并用盐酸将溶液酸化为pH2。然后用200mL乙酸乙酯提取该水溶液、分离、用硫酸镁干燥、浓缩为白色固体。然后该固体从二氯甲烷和己烷中重结晶，产生2g(80%产率)2-丙酸-3-甲基马来酸酐。

通过用草酰氯将CDM转变为其酸性氯化物然后加入硫醇、酯、或胺和吡啶可从CDM合成硫酯、酯和酰胺。使用本领域标准方法，CDM和其衍生物容易用靶向配体、位阻稳定剂、带电基团和其他反应基团修饰。得到的分子能用于可逆修饰胺。

通过修饰CDM来合成掩蔽剂以产生优选的电荷中性试剂：

其中R1包括ASGPr靶向配体或位阻稳定剂(例如PEG)。

B.含ASGPr靶向基团的掩蔽剂。最广泛研究的肝细胞靶向配体是基于葡萄糖，其由肝细胞上的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)结合。结合半乳糖或半乳糖衍生物显示有助于肝细胞靶向一些高度水溶性、不带电的聚合物，包括：寡糖壳聚糖、聚苯乙烯衍生物和聚丙烯酰胺HPMA。ASGPr靶向基团容易通过修饰葡萄糖残基用乳糖(半乳糖-葡萄糖二糖)生成。乳糖酸(LBA，其中葡萄糖被氧化为葡糖酸的乳糖衍生物)容易用标准酰胺偶联技术纳入马来酸酐衍生物。

CDM-乳糖

C.合成位阻稳定剂CDM-PEG和靶向基团CDM-NAG(N-乙酰半乳糖胺)。向50mL二氯甲烷中的CDM(300mg，0.16mmol)溶液中加入草酰氯(2g，10重量当量)和二甲基甲酰胺(5μL)。反应进行过夜，然后通过旋转蒸发去除多余的草酰氯和二氯甲烷，产生CDM酰基氯。酰基氯溶于1mL二氯甲烷。向该溶液中加入1.1摩尔当量的聚乙二醇单甲醚(平均MW550)用于CDM-PEG或(氨基乙氧基)乙氧基-2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖苷(即氨基双乙氧基-乙基NAG)用于CDM-NAG，和溶于10mL二氯甲烷的吡啶(200μL，1.5当量)。然后搅拌1.5小时。然后移除溶剂，将得到的固体溶于5mL水中并用0.1%TFA水/乙腈梯度通过反相HPLC纯化。

优选地，含有5～20个乙烯单元的PEG结合双取代的马来酸酐。更优选地，含有10～14个乙烯单元的PEG结合双取代的马来酸酐。PEG可具有不同长度且平均长度为5～20或10～14个乙烯单元。或者，PEG可为单分散、均匀或分开；具有例如精确的11或13个乙烯单元。

如上所述，PEG间隔子可位于酐基和ASGPr靶向基团之间。优选的PEG间隔子含1～10个乙烯单元。

含烷基间隔子的CDM-NAG

可逆的聚合物修饰

实施例5。膜活性多胺的可逆修饰/掩蔽；即用CDM-NAG或CDM-NAG加CDM-PEG混合物修饰膜活性聚合物。向等张葡萄糖中的×mg膜活化多胺溶液(如上述的DW1360)中加入14×mg的HEPES游离碱，然后加入7×mg CDM-NAG或2.3×mg CDM-NAG和4.6×mg CDM-PEG的混合物，总计7×双取代马来酸酐掩蔽剂。然后溶液室温孵育至少30分钟，再给予动物。CDM-NAG或CDM-PEG与多胺的反应产生：

式中R是聚合物且R1包括ASGPr靶向部分或位阻稳定剂。所述酐和聚合物胺之间的反应中产生的羧基酐表现出约1/20的预期电荷(Rozema等Bioconjugate Chemistry2003)。因此，膜活性多胺被有效中和而不是转变为带高负电荷的聚阴离子。

实施例6。含CDM-NAG蜂毒肽的可逆修饰/遮蔽。修饰前，从0.1%冰醋酸水溶液冻干5×mg CDM-NAG。向干燥的NAG衍生物添加溶于0.2×mL等张葡萄糖的×mg蜂毒肽和10×mgHEPES游离碱溶液。在CDM-NAG完全溶解后，随之使所述溶液室温孵育至少30分钟，再给予动物。CDM-NAG和所述肽反应生成：

式中，R是蜂毒肽，R1包括ASGPr靶向部分NAG。所述酐和聚合物胺之间的反应中产生的羧基酐表现出约1/20的预期电荷(Rozema等Bioconjugate Chemistry2003)。因此，膜活性多胺被有效中和而不是转变为带高负电荷的聚阴离子。

siRNA-偶联物

实施例7。GalNAc簇的合成。

A.{2-[2-(2-羟基乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸苄酯的合成

2-[2-(2-羟基-乙氧基)-乙氧基]-乙醇(62.2g,414mmol)在氩气下溶解于875mL的abs.DMF并冷却至0°C。

小心加入NaH(12.1g,277mmol，矿物油中55%)，移除冰浴并于80°C持续搅拌1小时。反应混合物冷却至环境温度并用通过滴液漏斗作为DMF溶液(20mL)加入的溴乙酸(18.98g，137mmol)处理。75°C再处理30分钟后，加入纯的溴甲基苯(23.36g，137mmol)并进行30分钟酯化。冷却、小心倒在碎冰上、用乙酸乙酯提取、用水清洗、Na₂SO₄干燥，并蒸发所有溶剂，然后通过快速色谱(SiO₂，乙酸乙酯/庚烷＝8/2)产生6.41g黄色油形式的标题化合物。MS(ISP)：299.2[M+H]⁺。

B.(3aR,5R,6R,7R,7aR)-6-乙酰氧基-5-乙酰氧基甲基-2-甲基-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃[3,2-d]噁唑-7-基乙酸酯。

将市售可得的(2S,3R,4R,5R,6R)-4,5-二乙酰氧基-6-乙酰氧基甲基-3-乙酰基氨基-四氢-吡喃-2-基乙酸酯(10.0g，26mmol)溶解于116mL abs.CH₂Cl₂并用三氟甲磺酸三甲基硅酯处理(14.27g，64mmol)。反应于45°C进行过夜。冷却至0°C后，加入三乙基胺(4.88mL，35mmol)，混合物用CH₂Cl₂稀释并用NaHCO₃-溶液和水清洗。Na₂SO₄干燥并蒸发溶剂产生10.3g褐色油形式的标题化合物，其直接用于下一步而不需进一步纯化。MS(ISP)：330.0[M+H]⁺。

C.(2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-二乙酰氧基-6-乙酰氧基甲基-3-乙酰氨基-四氢-吡喃-2-基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酸苄酯。

上述制备的(3aR,5R,6R,7R,7aR)-6-乙酰氧基-5-乙酰氧基甲基-2-甲基-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃并[3,2-d]噁唑-7-基乙酸酯(10.3g,26mmol)和{2-[2-(2-羟基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸苯甲酯(8.62g,29mmol)混合在520mL CH₂Cl₂中并用63g的4埃分子筛处理。1小时后加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(6.13g，28mmol)。反应混合物于环境温度搅拌整个周末。加入三乙基胺(5.21mL，37mmol)，分子筛滤除，用CH₂Cl₂稀释滤出液并用NaHCO₃-溶液和水清洗。Na₂SO₄干燥并蒸发溶剂，然后通过快速色谱(SiO₂，乙酸乙酯/AcOH/MeOH/水=60/3/3/2)产生15.7g褐色油形式的标题化合物。MS(ISP)：626.6[M-H]^-。

D.(2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-二乙酰氧基-6-乙酰氧基甲基-3-乙酰氨基-四氢-吡喃-2-基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-醋酸。

上述制备的(2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-二乙酰氧基-6-乙酰氧基甲基-3-乙酰基氨基-四氢-吡喃-2-基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酸苄酯(15.7g，25mmol)溶于525mL乙酸乙酯中并在1个大气压的H₂下于环境温度在1.6g Pd/C(10%)中氢化3小时。硅藻土(celite)过滤并蒸发溶剂，然后通过快速色谱(SiO₂，CH₂Cl₂/MeOH=80/20)产生6.07g褐色胶形式的标题化合物。MS(ISP)：536.5[M-H]^-。

E.乙酸酯保护的GalNAc簇苄酯

上述制备的(2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-二乙酰氧基-6-乙酰氧基甲基-3-乙酰基氨基-四氢-吡喃-2-基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酸(2.820g，5.246mmol)和盐酸(S)-6-氨基-2-((S)-2,6-二氨基-己酰基氨基)-己酸苯甲酯(制备见下，0.829g，1.749mmol)溶于32mL CH₂Cl₂和3.2mL DMF的混合物中，用Hünig碱(2.096ml，12.25mmol)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(0.714g，5.248mmol)和盐酸1-(3-二甲基-氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1.006g，5.248mmol)顺序处理，并于环境温度搅拌过夜。通过i.V.移除所有挥发物，粗反应混合物用制备型HPLC(38次运行，Gemini，5μ，C18)纯化产生冻干后的1.650g白色粉末标题产物。MS(ISP)：1945.8[M+Na]⁺。

F.乙酸酯保护的GalNAc簇游离酸(糖羟基保护)。(17S,20S)-1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基氧基)-20-(1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四-氢-2H-吡喃-2-基氧基)-11-氧代-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十六烷-16-基)-17-(2-(2-(2-(2-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-乙酰胺基)-11,18-二氧代-3,6,9-三氧杂-12,19-二氮杂二十一-21-烷酸

上述制备的GalNAc簇苄酯(0.674g,0.350mmol)溶于50mL MeOH并在1个大气压的H₂下于环境温度在0.065g Pd/C(10%)中氢化4小时。硅藻土过滤并蒸发溶剂留下0.620g白色泡沫形式的标题化合物。MS(ISP)：1917.0[M+2H]²⁺。

实施例8。半乳糖簇分支点，盐酸(S)-6-氨基-2-((S)-2,6-二氨基-己酰基氨基)-己酸苄酯的合成。A.(S)-6-叔丁氧羰基氨基-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-己酸苄酯。

(S)-6-叔丁氧羰基氨基-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-己酸(5.00g，10.67mmol)和苯基-甲醇(2.305g，21.34mmol)溶于25mL CH₂Cl₂并用N-羟基苯并三唑(1.933g，11.74mmol)、盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC，2.250g，11.74mmol)和乙基-二异丙基-胺(2.137ml，12.49mmol)依次处理。搅拌90分钟后，环境温度下i.V.移除挥发物，残留物用乙酸乙酯吸收，用水、NH₄Cl-溶液和盐水清洗，Na₂SO₄干燥并蒸发。然后粗混合物溶于20mL乙醇中，添加10mL水沉淀产物。过滤干燥产生5.669g标题化合物，用乙醇/己烷重结晶产生4.27g纯苄酯。MS(ISP)：559.2[M+H]⁺。

B.(S)-2-((S)-2,6-二-叔丁氧基羰基氨基-己酰基氨基)-6-叔丁氧基羰基氨基-己酸苄酯。

上述制备的(S)-6-叔丁氧基羰基氨基-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基-氨基)-己酸苄酯(4.270g，7.643mmol)溶解于15mL THF并用15mL二乙胺处理。在环境温度4小时后，MS和TLC指示缺乏原料。溶剂蒸发和甲苯的共沸干燥产生4.02g游离胺，其直接用于下一步。

市售可得的(S)-2,6-二-叔丁氧基羰基氨基-己酸(3.177g，9.17mmol)溶解于13mLCH₂Cl₂并在0°C用乙基-二异丙基-胺(4.71mL，27.5mmol)、O-(1,2-二氢-2-氧代-吡啶基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TPTU，2.725g，9.172mmol)处理。15分钟之后，使用溶于极少CH₂Cl₂和1.57mL乙基-二异丙基-胺(1,2当量)的上述制备胺溶液，使该反应在环境温度下进行2小时。i.v.移除所有挥发物，用乙酸乙酯吸收残留物，用NaHCO₃-溶液、NH₄Cl-溶液和水清洗，Na₂SO₄干燥并蒸发。快速色谱(SiO₂，庚烷/乙酸乙酯＝4/6)然后从庚烷/最少量的乙酸乙酯中结晶产生4.516g白色固体的标题化合物。MS(ISP)：665.4[M+H]⁺。

C.三盐酸(S)-6-氨基-2-((S)-2,6-二氨基-己酰基氨基)-己酸苄基酯。

上述制备的(S)-2-((S)-2,6-二-叔丁氧羰基氨基-己酰基氨基)-6-叔丁氧羰基氨基-己酸苄酯(4.516，6.793mmol)溶于含4mol/L HCl的二噁烷中。数分钟后放出气体并形成沉淀。环境温度3小时后，小心蒸发反应混合物并谨慎干燥产生3.81g灰白色泡沫的标题化合物，其不用进一步纯化即用于实施例7。E.上述的GalNAc簇苄酯。MS(ISP)：365.3[M+H]⁺。

实施例9。多核苷酸靶向部分。通过使GalNAc簇和药代动力学调节剂连接赖氨酸或鸟氨酸支架分子上的胺，生成多核苷酸靶向部分。然后所述支架上的羧基可共价连接RNAi多核苷酸如siRNA。

实施例10。GalNAc簇-棕榈酰靶向部分。

A.(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-6-十六烷酰基氨基-己酸苄酯。

市售可得的Fmoc-Lys(棕榈酰)-OH(0.899g，1.481mmol)悬浮于15mLCH₂Cl₂并用苄醇(0.320g，0.305mL，2.96mmol，2eq.)、羟基苯并三唑(HOBT，0.268g，1.63mmol，1.1eq.)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺HCl(EDC，0.312g，1.63mmol，1.1eq.)和N-乙基-二异丙胺(0.224g，0.297mL，1.733mmol，1.17eq.)依次处理。然后搅拌该黄色溶液2小时。倾倒至碎冰/NH₄Cl溶液，用乙酸乙酯萃取，用水清洗，Na₂SO₄干燥并蒸发所有溶剂，然后通过快速色谱(SiO₂，乙酸乙酯/庚烷=1/1)得到0.692g灰白色固体状的标题化合物。MS(ISP)：697.6[M+H]⁺。

B.(S)-2-氨基-6-十六烷酰基氨基-己酸苄酯

使上述制备的(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-6-十六烷酰基-氨基-己酸苄酯(0.692g，0.993mmol)溶于15mL THF并用19mL二乙胺(约18eq.)处理。在环境温度3小时后，i.v.去除所有易挥发物，并通过快速色谱(SiO₂，CH₂Cl₂/MeOH(10%))纯化粗反应混合物，产生0.355g白色固体状的标题化合物。MS(ISP)：475.3[M+H]⁺。

C.

上述制备的GalNAc簇游离酸(实施例7F)(17S,20S)-1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基氧基)-20-(1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)-四氢-2H-吡喃-2-基氧基)-11-氧代-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十六烷-16-基)-17-(2-(2-(2-(2-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基氧基)乙氧基)乙氧基)-乙氧基)乙酰胺基)-11,18-二氧代-3,6,9-三氧杂-12,19-二氮杂-二十一-21-烷酸(0.185g，0.101mmol)溶于2.0mLCH₂Cl₂并用1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt，0.014g，0.101mmol，1当量)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺·HCl(EDC，0.019g，0.101mmol，1当量)和N-乙基-二异丙胺(0.013g，0.017mL，0.101mmol，1当量)依次处理。在环境温度下搅拌15分钟之后，添加溶于极少CH₂Cl₂的(S)-2-氨基-6-十六烷酰基氨基-己酸苄酯(0.048g，0.101mmol，1当量)，使反应进行2小时。

然后，蒸发所述溶剂并通过快速色谱(SiO₂，CH₂Cl₂/MeOH(7%～>10%))纯化所得粗混合物，产生0.133g白色泡沫状标题化合物。MS(ISP)：1167.1[M+2Na]²⁺/2。

D.

上述制备的苄酯(0.130g，0.057mmol)溶解于5mL MeOH中，并在1个大气压的H₂下于环境温度用0.024g Pd/C(10%)氢化3小时。硅藻土过滤并蒸发溶剂，剩余0.123g无色油状标题化合物。MS(ISP)：2221.0[M+Na]⁺。

实施例11。含鸟氨酸接头(C16)的GalNAc簇棕榈酰的合成

制备方式与实施例10类似但使用Fmoc-L-Orn(棕榈酰)-OH替代白色泡沫状Fmoc-Lys(棕榈酰)-OH。MS(ISP)：1093.1[M+2H]²⁺/2。

实施例12。GalNAc簇(E)-十六醇-8-烯酰基(C16)的合成

A.(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-6-((E)-十六醇-8-烯酰基氨基)-己酸2-三甲基硅烷基-乙酯

Fmoc-Lys((E)-十六醇-8-烯酰基)-OH(0.500g，0.827mmol)悬于15mLCH₂Cl₂中并用2-(三甲基甲硅烷基)乙醇(0.196g，0.236mL，1.65mmol，2当量)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt，0.123g，0.909mmol，1.1当量)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺HCl(EDC，0.174g，0.909mmol，1.1当量)和N-乙基-二异丙胺(0.125g，0.164mL，0.967mmol，1.17当量)依次处理。然后搅拌该黄色溶液整个周末。倾倒至碎冰/HCL溶液上，用乙酸乙酯萃取，用水清洗，Na₂SO₄干燥并蒸发所有溶剂，然后通过快速色谱(SiO₂，CH₂Cl₂/MeOH=9/1)并从AcOEt/庚烷结晶来递送0.488g灰白色半固体标题化合物。MS(ISP)：705.6[M+H]⁺。

B.(S)-2-氨基-6-((E)-十六醇-8-烯酰氨基)-己酸2-三甲基硅烷基-乙酯。

上述制备的(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-6-((E)-十六醇-8-烯酰氨基)-己酸2-三甲基硅烷基-乙酯(0.488g，0.690mmol)溶于15mL THF中，并用1.35mL二乙胺(约18eq.)处理。环境温度3小时后，i.v.去除所有易挥发物，并通过快速色谱(SiO₂，CH₂Cl₂/MeOH(10%))纯化粗反应混合物，产生0.259g黄色油状标题化合物。MS(ISP)：483.6[M+H]⁺。

C.GalNAc簇(E)-十六醇-8-烯酰基(C16)

如上所述制备上面的化合物，使用(S)-2-氨基-6-((E)-十六醇-8-烯酰氨基)-己酸2-三甲基硅烷基-乙酯并如下裂解保护基团：在倒数第二个步骤之后，所得2-三甲基硅烷基-乙酯(245mg，0.107mmol，Eq:1.00)组合(5mL)的THF abs.，得到无色溶液。在0°C添加四叔丁基氟化胺三水合物(168mg，0.533mmol，Eq:5.00)，然后将所述反应物储存在冰箱内过夜。倾倒至碎冰上，乙酸乙酯萃取，用水清洗，Na₂SO₄干燥并蒸发所有溶剂，产生黏稠油体。溶解于乙腈和水并冻干，最终得到0.120g白色固体状标题化合物。MS(ISP)：1121.5[M+2Na]²⁺/2。

实施例13。GalNAc簇油烯(C18)的合成

制备方式类似于上述实施例，但使用(S)-2-(三甲基甲硅烷基)乙基2-氨基-6-油酰胺己酸替代灰白泡沫的(S)-2-氨基-6-((E)-十六碳-8-烯酰氨基)-己酸2-三甲基硅烷基-乙酯。MS(ISP)：1113.6[M+2H]²⁺/2。

实施例14。GalNAc簇(9E,12E)-十八碳9,12-二烯酰基(C18)的合成。

制备方式类似于上述实施例，但是用(S)-2-(三甲基甲硅烷基)乙基2-氨基-6-((9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰氨基)己酸替代黄色冻干固体的(S)-2-氨基-6-((E)-十六碳-8-烯酰氨基)-己酸。MS(ISP)：1134.55[M+2Na]²⁺/2。

实施例15。GalNAc簇辛酰基(C8)的合成。

制备方式如上所述，但使用Fmoc-Lys(辛酰基)-OH替代浅黄色泡沫的Fmoc-Lys(棕榈酰)-OH。MS(ISP)：1044.5[M+2H]²⁺/2。

实施例16。GalNAc簇月桂酰(C12)的合成。

制备方式如上所述，但使用Fmoc-Lys(月桂酰)-OH替代浅黄色泡沫的Fmoc-Lys(棕榈酰)-OH。MS(ISP)：2166.04[M+Na]⁺。

实施例17。GalNAc簇-C20-酰基的合成。

制备方式如上所述，但是用Fmoc-Lys(二十酰基)-OH替代浅黄色泡沫状的Fmoc-Lys(棕榈酰)-OH。MS(ISP)：1150.58[M+2Na]²⁺/2。

实施例18。GalNAc簇-C24-酰基的合成。

如上所述制备，但使用Fmoc-Lys(二十四酰基)-OH替代浅黄色泡沫的Fmoc-Lys(棕榈酰)-OH。MS(ISP)：2312.24[M+H]⁺。

实施例19。GalNAc簇二辛酰基(2xC8)的合成。

A.(S)-6-((S)-2,6-二-叔丁氧基羰基氨基-己酰基氨基)-2-(9H-芴-9-基-甲氧基羰基氨基)-己酸。

Fmoc-Lys-OH(1.393g，3.78mmol，Eq:1.00)溶解于圆底烧瓶中的CH₂Cl₂(16mL)，得到浅黄色溶液。添加Huenig碱(1.955g，2.57mL，15.1mmol，Eq:4.00)和三甲基氯硅烷(0.863g，1.00mL，7.94mmol，Eq:2.10)，然后搅拌所述反应混合物20分钟。

Boc-Lys(Boc)-OH(1.31g，3.78mmol，Eq:1.00)溶于第二个圆底烧瓶中的DMF(16mL)，得到无色溶液。添加Huenig碱(0.587mg，0.77mL，4.54mmol，Eq:1.20)和TPTU[125700-71-2](1.123g，3.78mmol，Eq:1.00)，然后搅拌该反应混合物15分钟。随后，添加来自第一个烧瓶的含有相应甲硅烷酯单硅烷胺的溶液，再使该反应搅拌2小时。将所述混合物倾倒于碎冰/NH₄Cl上，AcOEt萃取两次，用H₂O和盐水清洗，Na₂SO₄干燥并蒸发至干。快速色谱SiO₂(含8%MeOH的CH₂Cl₂)得到2.324g灰白色泡沫的标题化合物。MS(ISP)：697.5[M+H]⁺，719.4[M+Na]⁺。

B.(S)-6-((S)-2,6-二-叔丁氧基羰基氨基-己酰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基-羰基氨基)-己酸苄酯。

上述制备的(S)-6-((S)-2,6-二-叔丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-己酸(2.32g，3.33mmol，Eq:1.00)和苯基-乙醇(0.720g，6.66mmol，Eq:2.00)溶于30mL CH₂Cl₂中，并用1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt，0.498g，3.66mmol，Eq:1.10)、盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC，0.702g，3.66mmol，Eq:1.10)和乙基-二异丙胺(0.503g，0.66mL，3.90mmol，Eq:1.17)依次处理。搅拌120分钟之后，i.v.去除易挥发物。随后快速色谱(含8%MeOH的CH₂Cl₂)产生2.573g浅黄色蜡状固体的标题化合物。MS(ISP)：787.5[M+H]⁺。

C.(S)-6-((S)-2,6-二氨基-己酰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-己酸苄酯。

上述制备的(S)-6-((S)-2,6-二-叔丁氧基羰基氨基-己酰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-己酸苄酯(盐酸盐形式，0.613g，0.779mmol，Eq:1.00)溶于二噁烷(4mL)，然后用3.89mL含4M HCl的二噁烷(Eq:10)处理。3小时后，MS指示不存在原料。i.v.去除所有挥发物，获得0.519g盐酸盐形式的标题化合物，其不需进一步纯化即可用于下个步骤。MS(ISP)：587.3[M+H]⁺。

D.(S)-6-((S)-2,6-二-辛酰基氨基-己酰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基-羰基氨基)-己酸苄酯。

上述制备的(S)-6-((S)-2,6-二氨基-己酰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基-羰基氨基)-己酸苄酯(0.519g，0.771mmol，Eq:1.00)和辛酸(0.234g，1.619mmol，Eq:2.10)溶于12mL CH₂Cl₂中，然后用1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt，0.220g，1.619mmol，Eq:2.10)、盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC，0.310g，1.619mmol，Eq:2.10)和乙基-二异丙胺(0.498g，0.666mL，3.855mmol，Eq:5.00)依次处理。搅拌180分钟后，将所述混合物倾倒于碎冰上，AcOEt萃取两次，用水清洗，MgSO₄干燥并蒸发至干。由AcoEt/己烷结晶，产生0.453g白色固体标题化合物。MS(ISP)：839.8[M+H]⁺，861.8[M+Na]⁺。

E.(S)-2-氨基-6-((S)-2,6-二-辛酰基氨基-己酰基氨基)-己酸苄酯。

上述制备的(S)-6-((S)-2,6-二-辛酰基氨基-己酰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-己酸苄酯(0.450g，0.536mmol)悬于2.2mL THF中，并用2.2mL二乙胺(约40当量)处理。在环境温度下剧烈搅拌24小时后，i.v.去除所有挥发物，用EtOEt研磨所述粗反应产物两次，以产生0.258g白色固体标题化合物。MS(ISP)：617.5[M+H]⁺。

F.GalNAc簇-二辛酰基(2xC8)

制备方式如上所述，但使用(S)-2-氨基-6-((S)-2,6-二-辛酰基氨基-己酰基氨基)-己酸苄酯替代白色泡沫的(S)-2-氨基-6-十六酰基氨基-己酸苄酯。MS(ISP)：2342.19[M+H]⁺。

实施例20.多核苷酸靶向部分-siRNA的合成。

A.材料.干燥甲醇(MeOH)、甲醇钠、安伯来特（Amberlite）IR-120、硫酸钠、干燥N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、干燥二氯甲烷(DCM)、N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)和乙酸钠溶液(3M，pH5.2)购自西格玛-艾尔德里奇化学品有限公司(Sigma Aldrich Chemie GmbH)(德国特克恩)。用于RP-HPLC的乙酸三乙胺(TEAA)缓冲液(2.0M，pH7.0)和乙腈(ACN)(HPLC品质)购自Biosolve公司(荷兰法尔肯丝瓦德)。乙醇(EtOH)(p.a.)购自默克公司(Merck)(德国达姆施塔特)。使用出自Optilab HF(Membra Pure，德国)系统的纯水。Resource RPC3mL柱(10×0.64cm；15μm粒径)购自GE医疗保健公司(GE Healthcare)(德国弗莱堡)。HPLC纯化使用Explorer100(GE医疗保健公司(GE Healthcare))完成。

B.GalNAc簇-RNA偶联物的合成。化合物1(150mg，0.082mmol)溶于干燥的甲醇(5.5mL)并加入42μL甲醇钠(MeOH中的25%溶液)。氩气下室温搅拌混合物2小时。加入等量甲醇和部分阳离子交换树脂安伯来特IR-120生成约7.0的pH。过滤去除安伯来特，用Na₂SO₄干燥所述溶液，并减压去除所述溶剂。以定量产率获得白色泡沫化合物2。TLC(SiO₂，DCM/MeOH5:1+0.1%CH₃COOH):R_f2=0.03；使用MeOH中的硫酸溶液(5%)然后加热以检测。ESI-MS，直接注射，负模式；[M-H]^-1 _计算：1452.7；[M-H]^1- _测量：1452.5。

化合物1

化合物2

化合物2(20mg，0.014mmol)和吡啶以及二氯甲烷共蒸发。残留物溶于干燥DMF(0.9mL)并氩气下搅拌加入溶于DMF(1.6mg，0.014mmol)的N-羟基琥珀酰亚胺溶液。0°C缓慢加入溶于DMF(3.2mg，0.016mmol)的DCC。反应升温至室温，并搅拌过夜。化合物3不需进一步纯化即可用于偶联配有C-6氨基接头的RNA，即化合物4。

化合物3

化合物4

B.GalNAc簇-PK-RNA偶联物的合成。具有化合物1所代表通用结构的化合物溶于干燥MeOH并添加甲醇钠(9当量)(MeOH中的25%溶液)。氩气下室温搅拌混合物2小时。所述反应混合物用甲醇稀释，然后，添加部分阳离子交换树脂安伯来特IR-120以生成约7.0的pH。过滤去除安伯来特，用Na₂SO₄干燥所述溶液，并减压去除所述溶剂。以定量产率获得白色泡沫状具有化合物2所代表通用结构的化合物。

化合物1

化合物2

下一步中，通过NHS形成活化具有化合物2所代表通用结构的化合物。化合物2和吡啶以及二氯甲烷共蒸发。残留物溶于干燥DMF并在氩气下搅拌加入溶于DMF(1.0当量)的N-羟基琥珀酰亚胺溶液。0°C缓慢加入溶于DMF(1.1当量)的DCC。反应升温至室温，并持续搅拌过夜。所得的具有化合物3所代表通用结构的激活化合物无需进一步纯化即可用于偶联RNA。通过含六个碳的氨基-接头(由化合物4代表)使所述多核苷酸靶向部分偶联RNA的5′末端。

化合物3

化合物4

C.合成氨基改性的RNA。有义链5′-末端含C-6-氨基接头的RNA用标准亚磷酰胺化学法在固相上以1215μmol的量级生成，使用Oligopilot100(德国弗赖堡的通用电气医疗集团)和可控多孔玻璃作为固体支持物(美国宾夕法尼亚州阿斯顿的引物合成公司(Prime Synthesis))。用相应的亚膦酰胺、2′-O-甲基亚膦酰胺和TFA-己基氨基接头酰胺(德国汉堡的西格玛-艾尔德里奇(Sigma-Aldrich)SAFC公司)生成含2′-O-甲基核苷酸的RNA。用本领域已知方法(Wincott F.,等,NAR1995,23,14,2677-84)完成切割和去保护以及纯化。氨基-修饰的RNA用阴离子交换HPLC(纯度：96.1%)鉴定并用ESI-MS([M+H]¹⁺ _计算：6937.4；[M+H]¹⁺ _测量：6939.0)确认相同性。序列：5′-(NH₂C₆)GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA-3′；u,c：相应碱基的2′-O-甲基核苷酸，s：硫代磷酸酯。

D.GalNAc簇RNA偶联物(化合物4)的合成。5′-末端装有C-6-氨基接头的RNA(2.54μmol)经冻干并溶于250μL硼酸钠缓冲液(0.1M硼酸钠，pH8.5，0.1MKCl)和1.1mL DMSO。加入8μL DIPEA后，向RNA溶液缓慢连续搅拌加入溶于DMF的化合物3(理论上0.014mmol)溶液。在35℃搅拌反应混合物过夜。用RP-HPLC(ResourceRPC3mL、缓冲液：A：水中的100mM乙TEAA，B：95%ACN中的100mM TEAA，梯度：20CV中5%B～22%B）监控该反应。用溶于EtOH的乙酸钠(3M)于-20°C沉淀RNA后，所述RNA偶联物用上述条件纯化。收集纯化部分且所需偶联物(化合物4)用乙酸钠/EtOH沉淀。以59%产率(1.50μmol)分离偶联物4。化合物4的纯度用阴离子交换HPLC(纯度：91.7%)分析并用ESI-MS([M+H]¹⁺ _计算：8374.4；[M+H]¹⁺ _测量：8376.5)确认相同性。

E.GalNAc簇-PK-RNA偶联物(化合物4)的一般合成。5′-末端装有C-6氨基接头的RNA从水中冻干并以1:4比例溶于硼酸钠缓冲液(0.1M硼酸钠，pH8.5，0.1MKCl)和DMSO的混合物。加入DIPEA后，向RNA溶液缓慢连续搅拌加入溶于DMF的化合物3(6当量)溶液。在35℃搅拌反应混合物过夜。用RP-HPLC(ResourceRPC3mL、缓冲液：A：水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA，2.0M，pH7.0)，B：95%ACN中的100mM TEAA，梯度：20CV中5%B～70%B）监控该反应。用溶于EtOH的乙酸钠(3M，pH5.2)于-20°C沉淀RNA后，所述RNA偶联物用上述条件纯化。收集纯组分，用乙酸钠/EtOH沉淀所需通用结构4的偶联物以生成纯RNA偶联物。

F.siRNA的退火。含RNA正义链的化合物4用2′-O-甲基-改性的反义RNA链退火：反义链：5′-uuGGAUcAAAu-AuAAG-A-uUCcscsU-3′。针对载脂蛋白BmRNA的siRNA偶联物通过下述过程生成：混合退火缓冲液(20mM磷酸钠，pH6.8；100mM氯化钠)中的等摩尔互补链溶液，在85-90°C水浴中加热3分钟，并在3-4小时内冷却到室温。用天然凝胶电泳确认形成双链体。

体内siRNA递送

实施例21。RNAi多核苷酸体内给予和肝细胞递送。RNAi多核苷酸偶联物和掩蔽聚合物如上所述合成。6-8周龄小鼠(C57BL/6或ICR品系，各约18～20g)获自HSD公司(HarlanSprague Dawley，印第安纳州印第安纳波利斯)。注射前至少饲养小鼠2天。用哈兰(Harlan)Teklad啮齿动物饲料进行自由采食(哈兰公司(Harlan)，威斯康星州麦迪逊)。RNAi多核苷酸偶联物和掩蔽聚合物如上所述合成。用0.2mL递送聚合物溶液和0.2mL siRNA偶联物注射小鼠尾静脉。对于同时注射聚合物和siRNA，注射前将所述siRNA偶联物加入到修饰的聚合物中，然后注射0.4mL总量。所述组合物生理条件下可溶且不聚集。聚合物和siRNA分别注射时，聚合物在0.2mL制剂溶液中注射，siRNA在0.2mL等张葡萄糖中注射。溶液通过输注到尾静脉注射。注射到其他脉管中如眼球后注射等效。

测定血清ApoB水平。小鼠禁食4小时(大鼠16小时)然后通过下颌下出血收集血清。用标准夹心ELISA方法测定血清ApoB蛋白水平。简言之，多克隆山羊抗小鼠ApoB抗体和兔抗小鼠ApoB抗体(生物设计国际公司(Biodesign International))分别用作捕获和检测抗体。之后应用HRP偶联的山羊抗兔IgG抗体(西格玛(Sigma))以结合ApoB/抗体复合物。然后通过Tecan Safire2(欧洲奥地利)酶标仪测量450nm处四甲基联苯胺(TMB，西格玛)比色显影的吸光度。

血浆因子VII(F7)活性测量。通过下颌下出血收集血液(9体积)制备小鼠的血浆样品，按照标准程序装入含0.109mol/L柠檬酸钠抗凝血剂(1体积)的微量离心管中。血浆F7活性使用BIOPHEN VII试剂盒(俄亥俄州梅森的海丰生物医药公司(Hyphen BioMed)/阿尼拉公司(Aniara))用生色法按照生产商推荐测量。比色显影的吸光度通过Tecan Safire2酶标仪在405nm处测量。

实施例22。siRNA具有下述序列：

apoB siRNA:

正义5′GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA3′(SEQ ID1)

反义5′uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCcscsU3′(SEQ ID2)

因子VII siRNA

正义5′GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfCfUfUfACfdTdT3′(SEQ ID3)

反义5′GUfAAGACfUfUfGAGAUfGAUfCfCfdTsdT3′(SEQ ID4)

小写字母=2′-O-CH₃取代

s=硫代磷酸酯连接

核苷酸后的f=2′-F取代

核苷酸前的d=2′-脱氧

半乳糖簇-PK靶向的siRNA

实施例23.用siRNA-半乳糖簇-药代动力学调节剂偶联物与掩蔽DW1360递送聚合物共给予将siRNA体内递送到肝细胞。如上所述用所示剂量的siRNA和聚合物制备siRNA和递送聚合物并给予。

A.共同给予siRNA偶联物和掩蔽的Lau41305-38-17-19递送聚合物。Lau41305-38-17-19用7重量当量的2:1CDM-PEG:CDM-NAG改性。2′F/MeO充分稳定的因子VII siRNA偶联GalNAc₃-棕榈酰靶向部分或其它指示靶向部分。将siRNA偶联物和Lau41305-38-17-19递送聚合物共同给予进入20gm ICR小鼠(n=3)引起血清因子VII蛋白水平降低，指示所述siRNA递送至肝细胞并抑制因子VII基因表达。有效递送需要递送聚合物和靶向部分偶联RNAi多核苷酸(表2)。未偶联siRNA中没有观察到显著敲减。没有共给予递送聚合物时未观察到靶基因敲减。所述GalNAc₃-棕榈酰靶向配体相较于GalNAc₃靶向部分或胆固醇多核苷酸靶向部分使siRNA至肝细胞的递送改善。

表2.注射siRNA-GalNAc簇偶联物加递送聚合物后体内靶基因的敲减，聚合物剂量的影响。

^amg siRNA或聚合物/kg动物体重

^b相对%蛋白

B.siRNA偶联物和已掩蔽蜂毒肽递送肽的共同给予。Tyr-蜂毒肽用5重量当量的CDM-NAG改性。2′F/MeO充分稳定的因子VII siRNA偶联GalNAc₃-棕榈酰靶向部分或其它所示靶向部分。将siRNA偶联物和Tyr-蜂毒肽递送肽共同给予进入20gm ICR小鼠(n=3)引起血清因子VII蛋白水平降低，指示所述siRNA递送至肝细胞并抑制因子VII基因表达。有效递送需要递送肽和靶向部分偶联RNAi多核苷酸(表3)。未偶联siRNA中没有观察到显著敲减。没有共给予递送聚合物时未观察到靶基因敲减。所述GalNAc₃-棕榈酰靶向配体相较于胆固醇多核苷酸靶向部分使siRNA至肝细胞的递送改善。

表3.注射siRNA-GalNAc簇偶联物加递送聚合物后体内靶基因的敲减，聚合物剂量的影响。

^amg siRNA或肽/kg动物体重

^b相对%蛋白

C.与已掩蔽DW1360递送聚合物共同递送时，疏水基团尺寸对siRNA-半乳糖簇-药代动力学调节剂共聚物的影响。DW1360用7重量当量的2:1CDM-PEG:CDM-NAG改性。2′F/MeO充分稳定的apoB siRNA偶联具有所示疏水PK基团的GalNAc₃-PK靶向部分。将siRNA偶联物和DW1360递送肽共同给予进入20gm ICR小鼠(n=3)引起血清ApoB蛋白水平降低，指示所述siRNA递送至肝细胞并抑制ApoB基因表达。有效递送需要递送肽和靶向部分偶联RNAi多核苷酸(表4)。用所含PK基团有16～20个碳原子(疏水基团具有15～19个碳原子)的多核苷酸靶向配体观察到最优递送。

表4.注射siRNA-GalNAc簇偶联物加递送聚合物后体内靶基因的敲减，聚合物剂量的影响。

^amg siRNA或聚合物/kg动物体重

^b相对%蛋白

实施例24.所给予siRNA-GalNAc簇-PK的体内生物分布。含有不同疏水侧链的六个不同GalNAc簇-PK靶向部分共价偶联针对ApoB的siRNA。以2.5mg/kg的剂量静脉内注射(i.v.推注)这些偶联物进入雄性Wistar大鼠(表5)。在给药后5、15、30、60、90、120、240和360分钟从不同动物收集血液样品(就各时间点而言n=2)。血液抽取后立即生成EDTA血浆，然后用蛋白酶K处理(美国的艾比森德生物技术公司(Epicentre Biotechnologies))。在给药后1.5和6小时从处死的动物(n=2)收获肝和脾组织样品(500mg)。碾碎冰冻组织段以得到细粉末。对各组织部分称重并用裂解混合物(Lysis Mixture)(美国的Panomics公司)、蛋白酶K(美国的艾比森德生物技术公司()和SONOPULS HD2070(德国的班德林公司(Bandelin))超声均质器均质化。最终得到的组织裂解物的浓度约为50mg/mL。

使用专有寡核苷酸检测方法测定所述血浆和组织样品中的siRNA浓度。简言之，所述siRNA定量基于互补荧光(Atto-425)标记的PNA-探针与所述siRNA反义链双链体的杂交和基于AEX-HPLC的分离。通过荧光检测针对外部校准曲线完成定量，所述外部校准曲线由系列稀释的相应非偶联ApoB双链体生成。该双链体由所述PK实验中测试的就所有偶联物而言常见的相同反义链组成。将血浆样品(0.2～2μL)和组织样品(约1mg)注射至HPLC系统。

所述组织结果示于针对肝脏的表5中。在肝脏中发现最低浓度的siRNA，所述siRNA具有缺乏PK调节剂的靶向部分(没有额外疏水链)。在所述靶向部分含有疏水侧链PK调节剂的所有偶联物的siRNA浓度在肝脏中较高。1.5小时后就除GalNAc簇以外具有两个辛酰基侧链的靶向部分检测到最高浓度。给药后6小时，除GalNAc簇以外具有C₂₀-酰基侧链的靶向部分显示最高的肝浓度。因此，通过在疏水侧链改造入所述靶向基团时调节PK性质能增加GalNAc-偶联siRNA的肝摄取。

尽管该特定机制尚未知，PK调节剂有可能造成血浆蛋白结合的增加，从而延长循环时间。然后，延长的循环时间引起组织靶向增加。相反地，缺乏PK调节剂，该siRNA更快速地通过肾过滤而从循环中清除。

分布性质可能与侧链的疏水性部分相关。无PK调节剂和C8PK调节剂的情况下，从血液循环中更迅速清除，肝靶向分布最低，且显示最少的靶基因敲减。相反，具有16～20个碳原子的PK调节剂存在下，从血液循环的清除不那么快速，肝靶向分布较高，且显示增加的靶基因消减(图7)。

表5.给药后1.5小时肝脏中的siRNA

多核苷酸靶向部分	肝脏中的siRNA(ng/g)^a
		GalNAc簇(C8)	396±204
GalNAc簇(2x C-8)	2463±1014
		GalNAc簇(C20)	1725±1753
GalNAc簇(C24)	767±25
		GalNAc簇(C-16)	990±326
GalNAc-簇	189±22

^a注射后1.5小时

实施例25.通过使用药代动力学调节剂增加的肿瘤靶向。siRNA偶联单独叶酸或单独胆固醇或叶酸-胆固醇药代动力学调节剂。将5mg siRNA注射进入KB异种移植小鼠。然后，分离肿瘤并测定siRNA的存在。注射后两小时，相比偶联单独叶酸或单独胆固醇的siRNA(少于100ng/g)，在采用siRNA偶联叶酸-胆固醇药代动力学调节剂的肿瘤中发现显著较多的siRNA(>500ng/g)。

注射后六小时，该差异更加显著，约500ng/g相比<50ng/g。

KB异种移植模型：KB细胞获自ATCC并在来自吉布可（GIBCO）/英杰公司的无叶酸RPMI1640培养基(#27016)(补充10%FBS)中生长。KB细胞应在注射入宿主小鼠之前于无叶酸培养基中培养两周。无胸腺裸-Foxn1^nu小鼠(Fox Chase Nude)获自哈兰实验室(Harlanlaboratory)。给所述小鼠喂食不含叶酸的食物(DYET#17772，来自宾夕法尼亚州伯利恒的Dyets责任有限公司18017)2～3周，然后接种肿瘤。亚融合的KB细胞用胰蛋白酶消化，用PBS冲洗并以1百万个/100μL悬浮于PBS中。在左齿面下皮下接种1～2百万个细胞，然后用数显卡尺一周两次监视肿瘤生长。当肿瘤尺寸为5～8mm并从而预计良好血管化时(通常为7～10天)，给小鼠注射siRNA。

siRNA定量：碾磨冰冻状态下的组织样品，然后使15～25mg冰冻粉末悬于1mL稀释于无核酸酶水的1:3裂解溶液(Panomics公司/昂飞(Affymetrix))。样品用超声棒声处理，然后用蛋白酶K(Panomics公司/昂飞)在65°C处理30分钟。在蛋白酶K处理后，向200μL组织超声处理物添加20μL3M KCl，以沉淀SDS。样品在冰上放置10分钟，然后以4000rcf在4°C离心15分钟。收集上清用于定量siRNA。使100μL上清与靶向所述反义链的5μL10μM Atto610-PNA-探针溶液混合。添加杂交缓冲液(50mM TRIS-Cl，pH8.0)至终体积200μL。样品在热循环仪中95°C孵育15分钟，然后降低温度至50°C以允许杂交并再孵育15分钟。由同一条件下的siRNA稀释系列生成校准曲线，然后，将所有样品放入HPLC自动进样器。将100μL体积的样品注射入在50°C加热的Dionex DNAPac PA-1004×250mm柱。用二元梯度以1mL/min的流速洗脱样品。缓冲液A：10mM Tris，30%ACN，100mM NaCl，pH7。缓冲液B：10mM Tris，30%ACN，900mMNaCl，pH7。

样品使用岛津(Shimadzu)RF-10Axl荧光检测仪(激发：436nm，发射：484nm)分析。

Claims

1.一种与靶向配体-药代动力学调节剂靶向化合物偶联的siRNA，具有下式

其中所述亲酯链选自下组：辛酰基、十二烷酰基、棕榈酰基、十六碳-8-烯酰基、油酰基、(9E,12E)-十八-9,12-二烯酰基、二辛酰基、C₂₀-酰基和C₂₄-酰基；

所述RNA包含siRNA。

2.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述亲酯链是辛酰基。

3.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述亲酯链是十二烷酰基。

4.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述亲酯链是棕榈酰基。

5.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述亲酯链是十六碳-8-烯酰基。

6.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述亲酯链是油酰基。

7.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述亲酯链是(9E,12E)-十八-9,12-二烯酰基。

8.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述亲酯链是二辛酰基。

9.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述亲酯链是C₂₀-酰基。

10.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述亲酯链是C₂₄-酰基。

11.包含如权利要求1-10中任一项所述的siRNA的组合物，其特征在于，所述组合物还包括多核苷酸递送聚合物。

12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述多核苷酸递送聚合物包括可逆改性的膜活性多胺。

13.如权利要求1-10中任一项所述的siRNA或权利要求11-12中任一项所述的组合物，其特征在于，所述siRNA包含一个或多个修饰核苷酸。