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JP2024514954A - グリカン修飾核酸、調製方法、及び治療的使用 - Google Patents

グリカン修飾核酸、調製方法、及び治療的使用 Download PDF

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Abstract

Figure 2024514954000001
本開示は、グリコ核酸、例えば、本明細書に記載されるｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡに関する。グリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）に関連する方法及び組成物が提供される。
【選択図】図９

Description

関連出願
本出願は、２０２１年４月２３日に出願された米国仮出願第６３／１７９，０６５号、２０２１年５月１４日に出願された米国仮出願第６３／１８８，９３０号、及び２０２１年５月１７日に出願された米国仮出願第６３／１８９，４９２号の利益を主張し、これらの各々は参照によりその全体が組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、コンピュータで読み取り可能な形式の配列表を含む。コンピュータで読み取り可能な形式は、参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年４月２２日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、７７２２３３＿２０２３２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１６，１７９バイトのサイズである。
連邦政府支援
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された認可番号Ｒ２４ ＧＭ１３７７６３による連邦政府支援を受けてなされたものである。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
本開示は、グリコ核酸、例えば、本明細書に記載されるｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡに関する。グリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）に関連する方法及び組成物が提供される。
グリカンは、細胞間接触から宿主病原体相互作用に及ぶ広範囲の重要な生物学的プロセス及び更には多細胞生物の組織化を調節することが示されている、単糖（単一の糖分子）のポリマーである（例えば、Ｖａｒｋｉ ａｎｄ Ｇａｇｎｅｕｘ，２０１５を参照のこと）。特にグリカンは、細胞表面事象の文脈において重要な細胞機能を調節し、全生物の細胞に存在する（例えば、Ｖａｒｋｉ ａｎｄ Ｇａｇｎｅｕｘ，２０１５を参照のこと）。グリカンは、特に細胞表面事象の文脈において、種々の重要な細胞機能を調節する。例えば、複雑なグリカンは、タンパク質及び脂質のフォールディング及び分泌または膜提示のための重要な輸送を促進する。従って、多数の基本的なプロセス、例えば、胚形成、宿主・病原体認識、及び腫瘍免疫相互作用は、グリコシル化に依存する。グリカンは、現在まで研究された生命界にわたるあらゆる細胞に存在し、哺乳動物においておよそ１０個の単量体炭水化物ユニットから構成される。グリカンは、ＧｌｃＮＡｃ残基に結合したフコースをグリカンのコアまたはグリカンのアームに含み得る。シアル酸残基は、グリカンの末端に見出され得る。加えて、一部のグリカンは、バイセクト型Ｎ－グリカンである。
ＲＮＡは、全生物が必要とする別のバイオポリマーである。ＲＮＡは、基本的に４つの塩基で構成されるが、転写後修飾（ＰＴＭ）がＲＮＡの化学的多様性を劇的に拡張し得る。これまでに１００種超のＰＴＭが同定されている（例えば、Ｆｒｙｅ ｅｔ．ａｌ，２０１８、Ｍａｃｈｎｉｃｋａ ｅｔ．ａｌ，２０１３、Ｎａｃｈｔｅｒｇａｅｌｅ，２０１６を参照のこと）。非標準的または非天然ヌクレオチドの使用がＲＮＡの化学的多様性に更に拍車をかける。ＲＮＡは、メッセンジャーであることに加えて、核及び細胞質ゾル全体で足場、分子デコイ、酵素、及びネットワーク調節因子として機能し得る（例えば、Ｃｅｃｈ ａｎｄ Ｓｔｅｉｔｚ，２０１４；Ｓｈａｒｐ，２００９、Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ，２０１１を参照のこと）。
ＤＮＡは、全ての既知の形態の生命に重要な別のバイオポリマーである。ＤＮＡは、発生、生存、及び生殖のための機能を生物が実行するために必要とされる指示を生物に与える。
ＲＮＡ及びＤＮＡは両方とも核酸であるが、それらには幾つか違いがある。それらの塩基の差異は基本的に限定的である。またそれらは異なる糖を含有する。ＤＮＡは元々細胞の核に閉じ込められているが、ＲＮＡは核を出ることができる。
対象の身体内の特定の細胞に核酸を送達する治療法及び核酸を送達するための組成物が尚も必要性とされている。
本開示は、例えば、生体直交型クリックケミストリーにより連結された、アスパラギン結合型（Ｎ結合型）グリカンと核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）との新規のコンジュゲートに関する。コンジュゲートの生物物理学的特性を調節し得、例えば、生物学的系（例えば、血清）における核酸の安定性を調節し得、及び／または核酸の送達（例えば、特定の膜、細胞小器官への標的化送達）を調節し得る、かかる新規のコンジュゲートを開発することは重要である。一態様では、本開示は、グリカン部分を含む修飾ＲＮＡを含む医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも６個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡを含む。幾つかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。医薬組成物は、核酸及び当該核酸にコンジュゲートされた少なくとも６個の単糖を含む少なくとも１個のグリカン部分を含むグリコ核酸、ならびに薬学的に許容される担体を含み得る。グリカン部分は、少なくとも８個の単糖を含み得る。グリカン部分は、少なくとも１０個の単糖を含み得る。グリカン部分は、Ｎ結合型グリカンまたはＯ結合型グリカンを含み得る。
グリカン部分は、二分岐グリカンを含み得る。二分岐グリカンは、第１の末端残基及び第２の末端残基を含み得る。グリカン部分は、三分岐グリカンを含み得る。三分岐グリカンは、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含み得る。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、シアル酸、フコース、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、ＧｌｃＮＡｃ、マンノース、ガラクトース、シアル酸、フコース、またはそれらの組み合わせを含む。第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つは、シアル酸を含み得る。第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つは、フコースを含み得る。第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つは、ＧｌｃＮＡｃを含み得る。第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つは、マンノースを含み得る。第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つは、ＮｅｕＮＡｃを含み得る。第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つは、ガラクトースを含み得る。
医薬組成物の核酸は、ＲＮＡであり得る。医薬組成物の核酸は、ｓｉＲＮＡであり得る。医薬組成物の核酸は、ｍＲＮＡであり得る。医薬組成物の核酸は、環状ＲＮＡであり得る。医薬組成物の核酸は、ガイドＲＮＡであり得る。医薬組成物の核酸は、アプタマーＲＮＡであり得る。医薬組成物の核酸は、ＤＮＡであり得る。
少なくとも１個のグリカン部分は、表２Ａまたは２Ｂの化合物を含み得る。修飾核酸は表１の核酸を含み得る。少なくとも１個のグリカン部分は、クリックケミストリー反応により修飾核酸にコンジュゲートされていてもよい。核酸は、核酸の末端に共有結合したリンカー基を介してグリカンにコンジュゲートされていてもよい。核酸は、核酸の中央の化学修飾ヌクレオチドに共有結合したリンカーを介してグリカンにコンジュゲートされていてもよい。核酸は、核酸の３’末端または５’末端に位置しない化学修飾ヌクレオチドに共有結合したリンカーを介してグリカンにコンジュゲートされていてもよい。核酸は、核酸の２個のヌクレオチド間に挿入された化学的ハンドルを介してグリカンにコンジュゲートされていてもよい。実施形態では、２個のヌクレオチドには、核酸の３’末端または５’末端のヌクレオチドは含まれない。
別の態様では、式（Ｉ）：
Ａ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
の化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体であって、式中、
Ａは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の核酸であり、
Ｂは、第２のクリックケミストリーハンドルを含むアスパラギン結合型グリカン（Ｎ－グリカン）であり、
Ｌは、第１のクリックケミストリーハンドルと第２のクリックケミストリーハンドルとの間の生体直交型クリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む、当該化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体が本明細書において提供される。
また、式（Ｉ）の化合物を調製する方法であって、第１のクリックケミストリーハンドルを含む核酸Ａを、第２のクリックケミストリーハンドルを含むアスパラギン結合型グリカン（Ｎ－グリカン）である化合物Ｂと反応させることを含み、最初のステップの反応が生体直交型クリックケミストリー条件下で実行される、当該方法も本明細書において提供される。
グリコ核酸化合物は、式（Ｉ）：Ａ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体を有し得、式中、Ａは、第１のクリックケミストリーハンドルを含む核酸であり、Ｂは、第２のクリックケミストリーハンドルを含むアスパラギン結合型グリカン（Ｎ－グリカン）であり、Ｌは、第１のクリックケミストリーハンドルと第２のクリックケミストリーハンドルとの間の生体直交型クリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。Ａは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むＲＮＡであり得る。Ａは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むｓｉＲＮＡであり得る。Ａは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むｍＲＮＡであり得る。Ａは、第１のクリックケミストリーハンドルを含む環状ＲＮＡであり得る。Ａは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むＤＮＡであり得る。
Ａは、表４の「試薬Ａ」下に列挙されるものから選択される第１のクリックケミストリーハンドルを含み得、Ｂは、表４の「試薬Ｂ」下に列挙されるものから選択される第２のクリックケミストリーハンドルを含み得る。Ａは、表４の「試薬Ｂ」下に列挙されるものから選択される第１のクリックケミストリーハンドルを含み得、Ｂは、表４の「試薬Ａ」下に列挙されるものから選択される第２のクリックケミストリーハンドルを含み得る。Ｂは、二分岐グリカンを含むアスパラギン結合型グリカンであり得、ここで、当該二分岐グリカンは、第１の末端残基及び第２の末端残基を含む。Ｂは、三分岐グリカンを含むアスパラギン結合型グリカンであり得、ここで、当該三分岐グリカンは、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む。
第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つは、シアル酸を含み得る。第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つは、フコースを含み得る。第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つは、ＧｌｃＮＡｃを含み得る。第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つは、マンノースを含み得る。第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つは、ＮｅｕＮＡｃを含み得る。第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つは、ガラクトースを含み得る。
本開示は、疾患または状態を処置する方法であって、処置の必要がある対象に、治療上有効量の本明細書において開示される医薬組成物または本明細書において開示されるグリコ核酸を投与することを含む、当該方法にも関する。疾患または状態は、炎症障害、自己免疫疾患、がん、代謝疾患、凝固疾患（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、抗凝固疾患（ａｎｔｉーｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、アレルギー、ウイルス疾患、及び微生物感染症から選択され得る。実施形態では、疾患または状態は、炎症である。実施形態では、疾患または状態は、がんである。実施形態では、疾患または状態は、自己免疫疾患である。実施形態では、疾患または状態は、ＩｇＥ依存性アレルギーである。実施形態では、疾患または状態は、全身性エリテマトーデスである。実施形態では、疾患または状態は、微生物感染症である。実施形態では、疾患または状態は、ウイルス感染症である。実施形態では、疾患または状態は、代謝疾患である。
別の態様では、グリコシル化リボ核酸（グリコＲＮＡ）に関連する方法及び組成物が提供される。ある種の態様では、グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を発現する細胞と、細胞表面グリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）を提示する細胞との間の相互作用を低減するための方法が提供される。幾つかの実施形態では、かかる方法は、ＧＢＰを発現する細胞と細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用が低減されるように、ＧＢＰを発現する細胞及び／または細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞を、ＧＢＰ及び／または細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合する薬剤と接触させることを含む。かかる方法は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで実行され得る。例えば、本開示の方法を実施するのに有用である、コンジュゲート、融合タンパク質、及び組成物も提供される。薬剤をＧＢＰを発現する細胞に標的化する方法、及びｇｌｙｃｏＲＮＡについて生体試料を評価する方法も提供される。
更に本開示は、グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を発現する細胞と細胞表面グリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）を提示する細胞との間の相互作用を低減するための方法であって、ＧＢＰを発現する細胞を、ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されるＧＢＰに結合する可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡと、ＧＢＰを発現する細胞と細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するのに有効な量で接触させることを含む、当該方法に関する。
可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡは、Ｙ ＲＮＡファミリーのＲＮＡを含み得る。可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡは、Ｙ５ ＲＮＡを含み得る。可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡは、ｓｎｏＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡは、可溶性シアル化ＲＮＡを含み得る。可溶性シアル化ＲＮＡは、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、またはそれらの組み合わせを含み得る。可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡは、１種以上の薬剤にコンジュゲートされている。１種以上の薬剤は、治療薬を含み得る。１種以上の薬剤は、検出可能な標識を含む。ＧＢＰは、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）を含む。Ｓｉｇｌｅｃは、Ｓｉｇｌｅｃ－１１を含み得る。Ｓｉｇｌｅｃは、Ｓｉｇｌｅｃ－１４を含み得る。ＧＢＰは、Ｃ型レクチンを含み得る。ＧＢＰは、ガレクチンを含み得る。ＧＢＰは、セレクチンを含み得る。
グリカンレポーターであるＡｃ４ＭａｎＮＡｚが哺乳動物細胞ＲＮＡに取り込まれることを示す概略画像及びブロット画像を示す。ＲＮＡ抽出プロトコールの概略図を示す。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ＝ペルアセチル化Ｎ－アジドアセチルマンノサミン。Ｐｒｏｔ．Ｋ＝プロテイナーゼＫ。ＤＢＣＯ＝ジベンゾシクロオクチン。 グリカンレポーターであるＡｃ４ＭａｎＮＡｚが哺乳動物細胞ＲＮＡに取り込まれることを示す概略画像及びブロット画像を示す。１００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｚで図に示す時間処理されたＨｅＬａ細胞由来のＲＮＡのＲＮＡブロッティングを示す。ＲＮＡ精製後、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚをＤＢＣＯ－ビオチンとコンジュゲートし、ストレプトアビジン－ＩＲ８００（Ｓｔｒｅｐ）で可視化し、赤外スキャナーで撮像した。メンブレンへのＲＮＡ転写前に、全ＲＮＡをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｓｙｂｒ）で染色及び撮像して、品質及びロード量を調べた。その後の全てのブロットをこのように作製し、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚは常に１００μＭで使用した。ｇｌｙｃｏＲＮＡが存在する領域及び非特異的標識化（＊）が認められる。 グリカンレポーターであるＡｃ４ＭａｎＮＡｚが哺乳動物細胞ＲＮＡに取り込まれることを示す概略画像及びブロット画像を示す。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで標識され、インビトロでＴｕｒｂｏ ＤＮアーゼまたはＲＮアーゼカクテル（Ａ／Ｔ１）＋／－ＳＵＰＥＲａｓｅＩｎ（ＲＮアーゼ阻害剤）を用いて処理されたＨｅＬａ ＲＮＡのＲＮＡブロットを示す。 グリカンレポーターであるＡｃ４ＭａｎＮＡｚが哺乳動物細胞ＲＮＡに取り込まれることを示す概略画像及びブロット画像を示す。図に示す日数の３００ｍｇ Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ／ｋｇ／日の腹腔内注射によるＡｃ４ＭａｎＮＡｚインビボ送達後のマウスＲＮＡのＲＮＡブロットを示す。肝臓及び脾臓由来のＲＮＡを分析した。ｍｏｃｋ（ｍ）マウスにはＤＭＳＯのみを注射した。抽出したＲＮＡにＲＮアーゼ処理を実行した。 低分子、非ポリアデニル化、かつ保存された転写物が細胞ｇｌｙｃｏＲＮＡのプールを含むことを示すブロット及び散布図を示す。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで処理されたＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡまたはポリアデニル化（ポリＡ）濃縮されたＲＮＡのブロットを示す。 低分子、非ポリアデニル化、かつ保存された転写物が細胞ｇｌｙｃｏＲＮＡのプールを含むことを示すブロット及び散布図を示す。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで処理されたＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡのシリカベースカラムを使用した分別沈殿による分画後のブロットを示す。 低分子、非ポリアデニル化、かつ保存された転写物が細胞ｇｌｙｃｏＲＮＡのプールを含むことを示すブロット及び散布図を示す。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで処理されたるＨ９ヒト胚性幹細胞（Ｈ９）由来の全ＲＮＡのスクロース密度勾配（１５～３０％スクロース）分画後のブロッティングを示す。インプットプロファイルを勾配の右側に示す。 低分子、非ポリアデニル化、かつ保存された転写物が細胞ｇｌｙｃｏＲＮＡのプールを含むことを示すブロット及び散布図を示す。ＨｅＬａ及びＨ９細胞由来の図２Ｃの低分子ＲＮＡ画分から精製されたＡｃ４ＭａｎＮＡｚ濃縮ＲＮＡの散布図解析を示す。ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、及びＹ ＲＮＡへのリードのマッピングを示す。ＨｅＬａ細胞について各データポイントのサイズとして、及びＨ９細胞について各データポイントの色として有意性スコア（－ｌｏｇ１０（調整済みｐ値）をオーバーレイする。 低分子、非ポリアデニル化、かつ保存された転写物が細胞ｇｌｙｃｏＲＮＡのプールを含むことを示すブロット及び散布図を示す。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで処理された野生型（ＷＴ）またはＹ５ノックアウト（ＫＯ）２９３Ｔ細胞由来の全ＲＮＡの代表的なブロットを示す。図の挿入グラフは、図のブロットの生物学的三重反復の定量化を示す。ｐ値は対応のある両側ｔ検定により算出した。 シアル酸を含有するようにＲＮＡを修飾するグリカンのブロット及びグラフを示す。１．７５ｍＭの９－アジドシアル酸で図に示す時間処理されたＨｅＬａ細胞由来のＲＮＡのブロッティングを示す。 シアル酸を含有するようにＲＮＡを修飾するグリカンのブロット及びグラフを示す。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで標識され、コレラ菌（ＶＣ）シアリダーゼまたは熱不活性化シアリダーゼ（ＶＣ－シアリダーゼ－ＨＩ）で処理されたＨｅＬａ細胞ＲＮＡのブロッティングを示す。 シアル酸を含有するようにＲＮＡを修飾するグリカンのブロット及びグラフを示す。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ及び図に示す濃度のＰ－３ＦＡＸ－Ｎｅｕ５Ａｃで処理されたＨｅＬａ細胞由来のＲＮＡのブロッティングを示す。 シアル酸を含有するようにＲＮＡを修飾するグリカンのブロット及びグラフを示す。図３Ｄ：Ｈ９細胞から非標識の全ＲＮＡを単離し、図に示す酵素と反応させ（酵素なし、ＲＮアーゼカクテル処理、またはシアリダーゼ処理）、切断された代謝産物を除去するために精製し、発蛍光性の１，２－ジアミノ－４，５－メチレンジオキシベンゼン（ＤＭＢ）プローブで処理した。ＨＰＬＣ分析により、特定のシアル酸の存在及び存在量を定量化した。図３Ｄの挿入画像は、各条件での全ＲＮＡのＳｙｂｒゲル画像である。主なシアル酸ピークは＃２及び３である。ピーク１の正体は不明であるが、ＲＮアーゼ感受性である。 シアル酸を含有するようにＲＮＡを修飾するグリカンのブロット及びグラフを示す。生物学的四重反復の４１８８、Ｈ９、及びＨｅＬａ細胞の図３Ｄから得られたＤＭＢの定量化を示すグラフを示す。 異なるセットのＮ－グリカンがｇｌｙｃｏＲＮＡと共に濃縮されることを示すブロット、グラフ、及びスキームを示す。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ、ガラクトース（Ｇａｌ、１０μＭ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ、１００μＭ）、または全てを用いて２４時間標識されたｌｄｌＤ ＣＨＯ細胞由来のＲＮＡのブロッティングを示す。 異なるセットのＮ－グリカンがｇｌｙｃｏＲＮＡと共に濃縮されることを示すブロット、グラフ、及びスキームを示す。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ及び図に示す濃度のＯＳＴの阻害剤であるＮＧＩ－１で２４時間処理されたＨｅＬａ細胞由来のＲＮＡのブロッティングを示す。 異なるセットのＮ－グリカンがｇｌｙｃｏＲＮＡと共に濃縮されることを示すブロット、グラフ、及びスキームを示す。図４Ｂのようなブロッティングであるが、図に示す濃度のキフネンシンを用いたブロッティングを示す。 異なるセットのＮ－グリカンがｇｌｙｃｏＲＮＡと共に濃縮されることを示すブロット、グラフ、及びスキームを示す。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで標識されたＨｅＬａ細胞ＲＮＡをインビトロで図に示す酵素を用いて生物学的三重反復で３７℃にて各１時間処理した後のＡｃ４ＭａｎＮＡｚシグナルを定量化するグラフを示す。 異なるセットのＮ－グリカンがｇｌｙｃｏＲＮＡと共に濃縮されることを示すブロット、グラフ、及びスキームを示す。ＲＮＡ試料からグリカンを遊離させ、その後に、質量分析解析のために遊離グリカンを精製するために使用された方法の概略図を示す。 異なるセットのＮ－グリカンがｇｌｙｃｏＲＮＡと共に濃縮されることを示すブロット、グラフ、及びスキームを示す。２９３、Ｈ９、またはＨｅＬａ細胞のペプチド及びＲＮＡ画分（列）からＰＮＧａｓｅＦ切断により遊離されたグリカン（行）の教師なしクラスタリング解析を示す。グリカンは、含まれる６つの試料のうちの少なくとも１つの生物学的反復において見出されなければならなかった。 異なるセットのＮ－グリカンがｇｌｙｃｏＲＮＡと共に濃縮されることを示すブロット、グラフ、及びスキームを示す。ペプチド及びＲＮＡからＰＮＧａｓｅＦにより放出されたグリカンの主成分分析プロットを示す。 異なるセットのＮ－グリカンがｇｌｙｃｏＲＮＡと共に濃縮されることを示すブロット、グラフ、及びスキームを示す。ペプチドまたはＲＮＡ試料から遊離された、フコースまたはシアル酸修飾を含有するグリカンの比率の一連の棒グラフを示す。横軸の数は、所与のデータセットから各々の修飾を含有すると発見されたグリカンの絶対数である。 ｇｌｙｃｏＲＮＡが生細胞の外部表面に存在することを示す画像及びグラフを示す。核をしっかり精製するように設計された細胞下分画後のＲＮＡ及びタンパク質のブロッティングを示す。非核タンパク質のＧＡＰＤＨ及びβ－チューブリンならびに核のヒストン３リジン４トリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）をウェスタンブロットにより可視化する。 ｇｌｙｃｏＲＮＡが生細胞の外部表面に存在することを示す画像及びグラフを示す。可溶性細胞質ゾルを膜性細胞小器官から分離するように設計された細胞下分画後のＲＮＡ及びタンパク質のブロッティングを示す。膜タンパク質であるＲＰＮ１、Ｓｅｃ６３、及び可溶性β－チューブリンをウェスタンブロットにより可視化する。 ｇｌｙｃｏＲＮＡが生細胞の外部表面に存在することを示す画像及びグラフを示す。１００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｚで２４時間標識され、次いで、１００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｚを含有し、１５０ｎＭのＶＣ－Ｓｉａを含有または非含有の新鮮な培地に３７℃で６０分間曝露されたＨｅＬａ細胞由来のＲＮＡのブロッティングを示す。 ｇｌｙｃｏＲＮＡが生細胞の外部表面に存在することを示す画像及びグラフを示す。生物学的三重反復で図５Ｃに示す実験、及び同様に処理された２９３ＴまたはＫ５６２細胞による実験を定量化するグラフを示す。ｐ値は対応のある両側ｔ検定により算出した。 ｇｌｙｃｏＲＮＡが生細胞の外部表面に存在することを示す画像及びグラフを示す。細胞表面ＲＮＡのレクチンベースの近位標識化の概略図を示す。生細胞を、ストレプトアビジン－ＨＲＰを動員するビオチン化レクチンで染色し、これにより、ストレプトアビジン－ＨＲＰは、過酸化水素の添加後にビオチン－アニリンからニトレンラジカルを生成させることができる。次いで、これらの細胞由来のＲＮＡを抽出し、ビオチン標識化について分析することにより、ＲＮＡがレクチンに近接していたかどうかが明らかとなる。 ｇｌｙｃｏＲＮＡが生細胞の外部表面に存在することを示す画像及びグラフを示す。図５Ｅに記載されるように作製された全ＲＮＡ試料のブロッティングを示す。レーン５及び６は、ビオチン－アニリンシグナルのＲＮアーゼカクテルまたはＶＣ－Ｓｉａに対する任意の感受性を実証するために、（ＲＮＡを精製した後に）インビトロでこれらの酵素を用いて処理された。 ｇｌｙｃｏＲＮＡが生細胞の外部表面に存在することを示す画像及びグラフを示す。図５Ｆに報告される実験と同様の全ＲＮＡ試料のブロッティングを示すが、最初に細胞を、通常はニトレンラジカルに対して不透過性である細胞膜を破壊する低張緩衝液で溶解させた。ｒＲＮＡの標識化がこの図では認められるが、図５Ｆでは認められない。 細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡが選択されたＳｉｇｌｅｃタンパク質への結合に寄与することを示すスキーム及びグラフを示す。ＰＮＧａｓｅＦ遊離実験において同定された２種のグリカンを用いて示される細胞面上のｇｌｙｃｏＲＮＡの模式モデルを示す。抗ｄｓＲＮＡ抗体（Ｊ２）及びＳｉｇｌｅｃ－Ｆｃタンパク質に対する予測結合位置を強調する。 細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡが選択されたＳｉｇｌｅｃタンパク質への結合に寄与することを示すスキーム及びグラフを示す。図に示す酵素または阻害剤で事前に処理し、次いで、Ｊ２抗体で染色したＨｅＬａ単個細胞のＦＡＣＳ分析を示す。ゲーティングされた領域（オレンジ色）は、集団が高蛍光のＪ２結合側にシフトしたことを示す。 細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡが選択されたＳｉｇｌｅｃタンパク質への結合に寄与することを示すスキーム及びグラフを示す。図に示す濃度のＯＳＴ阻害剤ＮＧＩ－１で事前に１２時間処理されたＨｅＬａ単個細胞のＦＡＣＳ分析を示す。垂直破線はＪ２高集団を表し、各試料についてこの領域内の細胞の割合をパーセントとして示す。 細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡが選択されたＳｉｇｌｅｃタンパク質への結合に寄与することを示すスキーム及びグラフを示す。ＲＮアーゼで事前に処理され、次いで、図に示すＳｉｇｌｅｃ－Ｆｃ試薬で染色されたＨｅＬａ単個細胞のＦＡＣＳ分析を示す。 例示的なグリカン部分の構造を示す。ある特定の実施形態では、本開示のグリコ核酸は、図７Ａ～７Ｃに示されるグリカン部分を含む。 例示的なグリカン部分の構造を示す。ある特定の実施形態では、本開示のグリコ核酸は、図７Ａ～７Ｃに示されるグリカン部分を含む。 例示的なグリカン部分の構造を示す。ある特定の実施形態では、本開示のグリコ核酸は、図７Ａ～７Ｃに示されるグリカン部分を含む。 例示的なグリカン部分の構造を示す。ある特定の実施形態では、本開示のグリコ核酸は、図７Ａ～７Ｃに示されるグリカン部分を含む。 例示的なグリカン部分の構造を示す。ある特定の実施形態では、本開示のグリコ核酸は、図７Ａ～７Ｃに示されるグリカン部分を含む。 アルキン修飾された核酸とアジドグリカンとの間の銅触媒アルキン－アジド環化付加（ＣｕＡＡＣ）反応の概略図を示す。核酸は、骨格組成及び長さ及び修飾ヌクレオチドの位置が異なり得ることを示す。３’末端アルキン修飾が示される短鎖（２０ｎｔ）核酸と末端アジドを含有するグリカン（単純なオリゴ糖を有するグリカン（１０個未満の糖）からフコース（三角）及びシアル酸（菱形）で官能化されているより複雑なグリカン構造まで）との間の反応を示す。複数のグリカンを図に示すが、ＣｕＡＡＣ反応では単一の修飾核酸種が単一のグリカン種と反応される。 アルキン修飾された核酸とアジドグリカンとの間の銅触媒アルキン－アジド環化付加（ＣｕＡＡＣ）反応の概略図を示す。アルキン部分を有する修飾ヌクレオチドの例である３’ ５－オクタジイニルｄＵを示す。 グリカン部分が配置され得る核酸の例を示す。核酸は、糖組成（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、長さに幅があってもよく、非天然の組成、例えば、ＬＮＡ、ホスホノチオエート、または他の修飾を含んでもよい。図に示す例示的な核酸には、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、ｍＲＮＡ、アプタマー、ｃｉｒｃＲＮＡ、及びガイドＲＮＡが含まれ、各々がグリカンに結合している。図９は、ｍＲＮＡ、アプタマー、及びｃｉｒｃＲＮＡの描写で示すように、グリカン修飾が末端の５’末端、３’末端、または内部に配置され得ることを示す。 実施例１０における核酸－Ｎ－グリカンコンジュゲートを調製するために使用されたアジド－Ｎ－グリカンを示す。実施例１０で使用されたアジド－Ｎ－グリカンの種類及び濃度を示す：Ａ２Ｇ０－Ａｓｎ－Ｎ３（Ｇ－２８）（５０ｎｍｏｌ）、２，３ＳＡ２－Ａ２Ｇ２－Ａｓｎ－Ｎ３（Ｇ－３５）（５０ｎｍｏｌ）、Ａ２Ｇ２－Ａｓｎ－Ｎ３（Ｇ－２９）（５０ｎｍｏｌ）、及び２，６ＳＡ２－Ａ２Ｇ２－Ａｓｎ－Ｎ３（Ｇ－３０）（５０ｎｍｏｌ）。 実施例１０における核酸－Ｎ－グリカンコンジュゲートを調製するために使用されたアジド－Ｎ－グリカンを示す。Ｇ－２８のＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルを示す。 実施例１０における核酸－Ｎ－グリカンコンジュゲートを調製するために使用されたアジド－Ｎ－グリカンを示す。Ｇ－２９のＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルを示す。 実施例１０における核酸－Ｎ－グリカンコンジュゲートを調製するために使用されたアジド－Ｎ－グリカンを示す。Ｇ－３５のＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルを示す。 実施例１０における核酸－Ｎ－グリカンコンジュゲートを調製するために使用されたアジド－Ｎ－グリカンを示す。Ｇ－３０のＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルを示す。 アルキン－ＲＮＡまたはアルキン－ＤＮＡを、実施例１０における特定のＮ－グリカンであるＧ－２８（５０ｎｍｏｌ）、Ｇ－３５（５０ｎｍｏｌ）、Ｇ－２９（５０ｎｍｏｌ）、及びＧ－３０（５０ｎｍｏｌ）と反応させた後の対応する生成物を示すＳｙｂｒＧｏｌｄ核酸染色を示す。生成されたＮ－グリカン－ＲＮＡまたはＮ－グリカン－ＤＮＡに結合したコンジュゲートに対応する新たなシフトしたバンドを示す。 例示的なｇｌｙｃｏＲＮＡ Ｒ－１～Ｒ－６と相補的なセンス鎖Ｉ－１との間で形成された二重鎖を示すブロットを示す。 ｇｌｙｃｏＲＮＡのＸ－３／Ｉ－４二重鎖と比較した発現を示すグラフを示す。ｇｌｙｃｏＲＮＡのＸ－３／Ｉ－４二重鎖と比較した、ｇｌｙｃｏＲＮＡとの４時間のインキュベーション後のヒトＣＤ１４＋単球におけるＣｙ５シグナルの相対的発現を示す。 ｇｌｙｃｏＲＮＡのＸ－３／Ｉ－４二重鎖と比較した発現を示すグラフを示す。ｇｌｙｃｏＲＮＡとの４時間のインキュベーション後のヒトＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＣｙ５シグナルの相対的発現を示す。 ｇｌｙｃｏＲＮＡのＸ－３／Ｉ－４二重鎖と比較した発現を示すグラフを示す。ｇｌｙｃｏＲＮＡとの４時間のインキュベーション後のヒトＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＣｙ５シグナルの相対的発現を示す。 ｇｌｙｏＲＮＡ（Ｒ－１／Ｉ－１二重鎖、Ｒ－２／Ｉ－１二重鎖、Ｒ－１６／Ｉ－１二重鎖、及びＲ－３／Ｉ－１二重鎖）を使用した細胞シグナル伝達ノックダウン（％βカテニン）を示すグラフを示す。 ＨｅｐＧ２細胞におけるＸ－３／Ｉ－４二重鎖と比較したｇｌｙｃｏＲＮＡのＣｙ５発現の平均蛍光強度を示すグラフを示す。１０ｎＭ濃度で４時間のインキュベーション後のｇｌｙｃｏＲＮＡ二重鎖であるＲ－１／Ｉ－１、Ｒ－２／Ｉ－１、Ｒ－３／Ｉ－１、Ｒ－４／Ｉ－１、Ｒ－５／Ｉ－１、及びＲ－６／Ｉ－１によるＨｅｐＧ２細胞におけるＣｙ５シグナルのＸ－３／Ｉ－４と比較した相対的発現を示す。 ＨｅｐＧ２細胞におけるＸ－３／Ｉ－４二重鎖と比較したｇｌｙｃｏＲＮＡのＣｙ５発現の平均蛍光強度を示すグラフを示す。１００ｎＭ濃度で４時間のインキュベーション後のｇｌｙｃｏＲＮＡ二重鎖であるＲ－１／Ｉ－１、Ｒ－２／Ｉ－１、Ｒ－３／Ｉ－１、Ｒ－４／Ｉ－１、Ｒ－５／Ｉ－１、及びＲ－６／Ｉ－１によるＨｅｐＧ２細胞におけるＣｙ５シグナルのＸ－３／Ｉ－４と比較した相対的発現を示す。 ｇｌｙｃｏｌＲＮＡ二重鎖の内部移行及び／またはＨｅｐＧ２細胞内及び細胞上への局在化を示す、実施例１８に記載されるように取得されたＣｙ５蛍光画像を示す。Ｒ－１／Ｉ－１。 ｇｌｙｃｏｌＲＮＡ二重鎖の内部移行及び／またはＨｅｐＧ２細胞内及び細胞上への局在化を示す、実施例１８に記載されるように取得されたＣｙ５蛍光画像を示す。Ｒ－２／Ｉ－１。 ｇｌｙｃｏｌＲＮＡ二重鎖の内部移行及び／またはＨｅｐＧ２細胞内及び細胞上への局在化を示す、実施例１８に記載されるように取得されたＣｙ５蛍光画像を示す。Ｒ－３／Ｉ－１。 ｇｌｙｃｏｌＲＮＡ二重鎖の内部移行及び／またはＨｅｐＧ２細胞内及び細胞上への局在化を示す、実施例１８に記載されるように取得されたＣｙ５蛍光画像を示す。Ｒ－４／Ｉ－１。 ｇｌｙｃｏｌＲＮＡ二重鎖の内部移行及び／またはＨｅｐＧ２細胞内及び細胞上への局在化を示す、実施例１８に記載されるように取得されたＣｙ５蛍光画像を示す。Ｒ－５／Ｉ－１。 ｇｌｙｃｏｌＲＮＡ二重鎖の内部移行及び／またはＨｅｐＧ２細胞内及び細胞上への局在化を示す、実施例１８に記載されるように取得されたＣｙ５蛍光画像を示す。Ｒ－６／Ｉ－１。
一態様では、本開示は、グリカン部分を含む修飾核酸を含む医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。グリカンは、脂質及びタンパク質を修飾して、全てのドメインの生命において分子間及び分子内相互作用を媒介する。ＲＮＡは、天然に生じるグリコシル化の主要な標的とは考えられていない。驚くべきことに、哺乳動物がＲＮＡをグリコシル化の第３の足場として使用することが本明細書において実証される。一連の化学的及び生化学的手法を使用して、保存された低分子非コードＲＮＡがシアル化グリカンを有することが発見された。これらの「ｇｌｙｃｏＲＮＡ」は、複数の細胞種及び哺乳動物種において、培養細胞において、ならびにインビボにおいて存在した。ｇｌｙｃｏＲＮＡのアセンブリは、標準的なＮ－グリカン生合成機構に依存し、シアル酸及びフコースに富む構造をもたらす。生細胞の解析により、大多数のｇｌｙｃｏＲＮＡが細胞表面に存在し、抗ｄｓＲＮＡ抗体及びＳｉｇｌｅｃ受容体ファミリーのメンバーと相互作用することができることが明らかとなった。まとめると、これらの発見は、細胞外生物学におけるＲＮＡの役割の拡張を指摘する。
グリカンは、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡまたはｇｌｙｃｏＤＮＡを形成させるために、合成化学または酵素プロセスを使用してＲＮＡまたはＤＮＡに結合され得る。具体的には、ＲＮＡまたはＤＮＡに結合するグリカンは、少なくとも１個の単糖を含有する。他の実施形態では、ＲＮＡまたはＤＮＡに結合するグリカンは、少なくとも１０個の単糖を含有する。好ましくは、ＲＮＡまたはＤＮＡに結合するグリカンは、少なくとも６個の単糖を含有する。好ましくは、ＲＮＡまたはＤＮＡに結合するグリカンは、少なくとも１０個の単糖を含有する。グリカンをＲＮＡまたはＤＮＡに結合させることにより、より安定した生物物理学的材料が作製され得る。グリカンは、ＲＮＡの細胞集団への標的化を容易にし得、細胞は内部移行を伴うか、または伴うことなく標的とされ得る。内在性哺乳動物ｇｌｙｃｏＲＮＡのグリカンは、構造的にタンパク質に見出されるものに固有のものであるようである（Ｆｌｙｎｎ ｅｔ．ａｌ，２０１９）。フコシル化、シアル化、及びアシアル化グリカンが含まれる、グリカンの異なる組成が存在し得る。大多数の天然の細胞ｇｌｙｃｏＲＮＡは、細胞表面に存在し、ＲＮＡ種は高度に保存された低分子ＲＮＡである。
核酸、例えば、直鎖状または環状のＤＮＡ及びＲＮＡのグリココンジュゲートは、幾つかの利点を提供する。特に、グリココンジュゲートは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）などの追加の送達媒体を使用する必要なしに、目的の器官または細胞種への送達を標的として投与され得る。ある特定の器官及び細胞種に対する選択性は、核酸へのコンジュゲーション用に適切な一連のグリカンを選択することにより提供され得る。またグリココンジュゲート核酸、特にＲＮＡは、糖化されていない核酸より安定している。
ＲＮＡなどの核酸のグリココンジュゲートによって、細胞標的化及び場合によりエンドソーム脱出がなされ得る。既知の標的化部分、例えば、トリプルＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮａｃ）、化学的に結合した３個の単糖は、ＲＮＡの肝臓などの細胞集団への標的化を容易にし得、最終的に内部移行を可能にする。グリカンは、内部移行を伴うことなく細胞を標的とすることもできる。ｇｌｙｃｏＲＮＡが含まれるグリココンジュゲートは、細胞表面に直接局在し得る。ｇｌｙｃｏＲＮＡが細胞に到達すると、グリココンジュゲートは、細胞表面上の糖受容体に結合し得、細胞のシグナル伝達を活性化し得る。例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡによるＳｉｇｌｅｃ細胞表面受容体の結合は、Ｓｉｇｌｅｃタンパク質の免疫受容体抑制性チロシン（ＩＴＩＭ）ドメインの活性化をもたらし得、これにより、細胞の抑制を引き起こす。ｇｌｙｃｏＲＮＡは細胞内にも送達され得る。環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）またはｍＲＮＡ上のグリカンは、より安定した生物物理学的材料をもたらし得、これはとりわけ、安定性または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）への充填に有用であり得る。
グリカンは、ＲＮＡ、例えば、直鎖状ｍＲＮＡ、環状ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど、またはＤＮＡ、例えば、直鎖状ＤＮＡまたは環状ＤＮＡが含まれる、生体分子にコンジュゲートされ得る。加えて、グリカン成分は、グリコシルトランスフェラーゼを使用することにより酵素的に様々な単糖で修飾され得る（例えば、Ｖａｎ Ｄｅｌｆｔ ｅｔ．ａｌ，２０１５を参照のこと）。更に、グリカン受容体に対するプログラム可能な結合界面を生じさせるためのグリカンの配向は、特定の構造を形成し、修飾ヌクレオチドを特定の位置に含むＲＮＡを使用して規定され得る。
ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡなどのグリコ核酸が作製された後、それは、任意の所望の方法、例えば、非経口投与、例えば、静脈内注射（ＩＶ）、筋肉内注射、脊髄内注射、腹腔内注射、皮下注射、または目的の器官もしくは組織への注射（例えば、硝子体内注射）、局所適用、または例えば、エアロゾル化後の経鼻もしくは経口吸入による身体への投与用に製剤化され得る。ｇｌｙｃｏＲＮＡはＬＮＰに充填され得るか、または裸であり得る。長鎖ＲＮＡが１回の切断で破壊され得るため、裸のＲＮＡを使用する場合は、低分子ＲＮＡ治療薬が良好に機能し得る。裸の高分子ＲＮＡの場合、局所投与が全身送達に最も良好であり得る。
定義
本明細書で定義されない限り、本発明に関して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。更に、文脈により必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。一般に、本明細書に記載される、生化学、酵素学、分子生物学及び細胞生物学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質及び核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される専門用語及びそれらの技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。
本発明の方法及び技術は、特に明記しない限り、通常、当該技術分野において周知であり、本明細書全体を通して引用及び説明される様々な一般的参考文献及びより具体的な参考文献において記載される従来の方法に従って実行される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２、及び２００２の補遺）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）、Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，Ｎ．Ｊ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ Ｉ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ ＩＩ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。
値の範囲が示される場合、その範囲の上限値及び下限値の間の各介在値（文脈が明らかに別様に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１まで）、及びその明示される範囲内の任意の他の明示される値または介在値が本発明の方法及び組成物に包含されると理解されたい。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値がより小さい範囲内に独立して含まれてもよく、これらも、明示される範囲内の任意の具体的に除外される境界値に従って、本発明の方法及び組成物に包含される。明示される範囲がそれらの境界値のうちの一方または両方を含む場合、それらの含まれる境界値のうちの一方または両方を除外する範囲も本発明の方法及び組成物に包含される。
ある特定の範囲は、本明細書において用語「約」により先行される数値を用いて提示される。用語「約」は、それが先行する正確な数、及びその用語が先行する数の付近にあるか、または近似する数の文字によるサポートを提供するために本明細書において使用される。数が具体的に列挙される数の付近にあるかまたは近似するかを決定する際に、その付近にあるか、または近似する列挙されていない数は、それが提示される文脈において、具体的に列挙される数の実質的な等価物を提供する数であり得る。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確に指示されない限り、複数形の指示物を含むことに留意されたい。特許請求の範囲が任意の要素を除外するように作成され得ることに更に留意されたい。従って、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」、「のみ」（“ｓｏｌｅｌｙ”、“ｏｎｌｙ”）などの排他的な用語の使用のため、または「否定的な」（“ｎｅｇａｔｉｖｅ”）限定の使用のための先行記述となるよう意図される。
本明細書に記載の全ての刊行物、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
以下の用語は、特に明記しない限り、以下の意味を有すると理解される。
本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、明示された整数または整数群を含むことを意味するが、任意の他の整数または整数群を除外することを意味しないと理解される。
本明細書で使用する場合、用語「グリコシル化核酸」及び「グリコ核酸」は、本明細書に記載及び開示されるグリカン部分を含む修飾核酸を指すと理解されるべきである。本明細書で使用する場合、用語「グリコシル化リボ核酸」及び「ｇｌｙｃｏＲＮＡ」は、本明細書に記載及び開示されるグリカン部分を含む修飾リボ核酸を指すと理解されるべきである。本明細書で使用する場合、用語「グリコシル化デオキシリボ核酸」及び「ｇｌｙｃｏＤＮＡ」は、本明細書に記載及び開示されるグリカン部分を含む修飾デオキシリボ核酸を指すと理解されるべきである。
本明細書で使用する場合、用語「ポリマー」は、リボヌクレオチドなどの天然または合成単量体から構成される物質を指す。
本明細書で使用する場合、用語「部分」は、分子を指す。例えば、「炭化水素部分」または「オリゴ糖部分」は、一般にグリカン成分を指す。
「修飾された配列」は、天然に存在する核酸分子との少なくとも１つの相違を含む核酸分子である。修飾された配列は、全ての外来性の修飾された異種配列及び未修飾の異種配列（すなわち、修飾された配列を有する生物または細胞以外の生物または細胞に由来する配列）、ならびに修飾されているか、変異されているか、または天然に存在する配列と比較して欠失もしくは挿入を含む、内在性遺伝子、オペロン、コード配列、または非コード配列を包含する。かかる配列は、起源に関係なく、誘導性プロモーターに連結されているか、または天然には連結されていない別の制御配列に連結されている全ての配列も包含する。更にかかる配列は、内在性遺伝子の発現を下方調節またはノックアウトするために使用され得る全ての配列を包含する。これらとしては、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子、相同組換えを引き起こすための構築物、Ｃｒｅ／ｌｏｘ構築物などが挙げられる。
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」または「ヌクレオチド配列」は、少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、ならびに非天然クレオチド類似体、非天然ヌクレオシド間結合体、またはその両方を含むＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を包含する。核酸は、任意のトポロジー構造であり得る。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四本鎖、部分的二本鎖、分岐鎖、ヘアピン状、環状、またはパドロック型の構造であり得る。
特に明記しない限り、かつ一般的な形式である「配列番号」で本明細書に記載される全ての配列の一例として、「配列番号１を含む核酸」は、少なくとも一部が、（ｉ）配列番号１の配列、または（ｉｉ）配列番号１に相補的な配列のいずれかを有する核酸を指す。２つのいずれかの選択は文脈により決定される。例えば、核酸がプローブとして使用される場合、２つのいずれかの選択は、プローブが所望の標的に相補的であるという要件により決定される。
「単離された」ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマーは、その本来の宿主細胞において天然のポリヌクレオチドに天然に付随する他の細胞成分、例えば、天然に付随するリボソーム、ポリメラーゼ、及びゲノム配列から実質的に分離されているものである。
本明細書で使用する場合、「単離された」成分（例えば、糖リガンド）は、それが由来する宿主細胞の細胞成分（膜脂質、染色体、タンパク質）から、または宿主細胞が培養された培地から実質的に分離されているものである。この用語は、生体分子が全ての他の化学物質から分離されていることを必要としないが、ある特定の単離された生体分子はほぼ均一に精製されていてもよい。
本発明の核酸（ポリヌクレオチドとも称される）は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖、ならびに上記の合成形態及び混合ポリマーを包含する。当業者により容易に理解されるように、これらは、化学的もしくは生化学的に修飾されていてもよく、または非天然のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含んでもよい。かかる修飾としては、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上の類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、荷電していない結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）、荷電した結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、及び修飾された結合（例えば、αアノマー核酸など）が挙げられる。水素結合及び他の化学相互作用により指定された配列に結合するポリヌクレオチドの能力を模倣する合成分子も包含される。かかる分子は、当該技術分野において公知であり、例えば、ペプチド結合が、分子の骨格内のリン酸結合の代わりとなるものが挙げられる。他の修飾としては、例えば、リボース環が「ロックド」核酸に見出される修飾などの架橋部分または他の構造を有する類似体が挙げられ得る。
「シグナルを下方調節する」におけるような用語「下方調節」は、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルに関して、糖リガンドとの接触前及び後の標的遺伝子発現のレベルが比較され得るプロセスを意味する。標的遺伝子から発現されたＲＮＡまたはタンパク質の量が糖リガンドとの接触後でより低いと決定される場合、糖リガンドは、標的遺伝子発現を下方調節すると結論され得る。細胞における標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルは、任意の所望の方法により決定され得る。例えば、標的ＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット分析、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）との併用、またはＲＮアーゼ保護アッセイにより決定され得る。タンパク質のレベルは、例えば、ウェスタンブロット分析により決定され得る。
「機能的に連結された」または「作動可能に連結された」発現制御配列は、関心対象の遺伝子を制御するように発現制御配列が関心対象の遺伝子と隣接している連結、及び関心対象の遺伝子を制御するようにトランスでまたはある距離をおいて作用する発現制御配列を指す。この用語は、本明細書に記載されるような合成の足場ドメインにコンジュゲートされたグリカン部分に対しても本明細書において使用される。
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」は、短いポリペプチド、例えば、典型的には、約５０アミノ酸長未満及びより典型的には、約３０アミノ酸長未満のものを指す。本明細書で使用する場合、この用語は、構造を模倣し、従って、生物学的機能を模倣する類似体及び模倣物を包含する。
用語「ポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質及び非天然タンパク質、ならびにそれらの断片、変異体、誘導体、及び類似体を包含する。ポリペプチドは、モノマーまたはポリマーであり得る。更に、ポリペプチドは、多数の異なるドメインを含み得、これらの各々は１つ以上の異なる活性を有する。
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、その起源または誘導源によって、（１）その天然状態で付随する天然で会合している成分と会合していないか、（２）自然界では見出されない純度（ここで、純度は他の細胞物質の存在に対して判断され得る）で存在する（例えば、同じ種由来の他のタンパク質を含まない）か、（３）異なる種由来の細胞により発現されるか、または（４）天然で存在しない（例えば、自然界で見出されるポリペプチドの断片であるか、あるいは自然界で見出されないアミノ酸類似体もしくは誘導体または標準的なペプチド結合以外の結合を含む）、タンパク質またはポリペプチドである。従って、化学合成されるか、または天然に由来する細胞とは異なる細胞機構で合成されるポリペプチドは、その天然で会合している成分から「単離」される。またポリペプチドまたはタンパク質は、当該技術分野において周知のタンパク質精製技術を使用した単離によって、天然で会合している成分を実質的に含まないものとなり得る。このように定義される場合、「単離された」とは、そのように記載されるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはオリゴペプチドが、その天然環境から物理的に取り出されていることを必ずしも必要としない。
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド断片」は、全長ポリペプチドと比較してアミノ末端欠失及び／またはカルボキシ末端欠失を有する、ポリペプチドを指す。好ましい実施形態では、ポリペプチド断片は、その断片のアミノ酸配列が天然に存在する配列内の対応する位置と同一である、連続配列である。断片は、通常、少なくとも５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長であり、好ましくは、少なくとも１２、１４、１６、または１８アミノ酸長であり、より好ましくは、少なくとも２０アミノ酸長であり、より好ましくは、少なくとも２５、３０、３５、４０、または４５アミノ酸長であり、更により好ましくは、少なくとも５０または６０アミノ酸長であり、更により好ましくは、少なくとも７０アミノ酸長である。
本明細書で使用する場合、２０種の通常アミノ酸及びその略語は、慣例的用法に従う。参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ－Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｇｒｅｎ ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，２ｎｄ ｅｄ．１９９１）を参照のこと。２０種の通常アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ－アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えば、α－，α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、及び他の非通常アミノ酸も本発明のポリペプチドの好適な構成要素であり得る。非通常アミノ酸の例としては、以下が挙げられる：４－ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、ε－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリジン、ε－Ｎ－アセチルリジン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリジン、Ｎ－メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン）。本明細書で使用されるポリペプチド表記法では、標準的な用法及び慣習に従い、左端はアミノ末端に対応し、右端はカルボキシ末端に対応する。
本明細書で使用する場合、用語「領域」は、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分を指す。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続した部分と定義される。
本明細書で使用する場合、用語「ドメイン」は、生体分子の公知の機能またはあり得る機能に寄与する当該生体分子の構造を指す。ドメインは、その領域または一部と同一の広がりをもち得る。ドメインは、生体分子の別個の非隣接領域も含み得る。タンパク質ドメインの例としては、限定されるものではないが、Ｉｇドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインが挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「分子」は、限定されるものではないが、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などが含まれる、任意の化合物を意味し、このような化合物は、天然または合成であり得る。
本明細書で使用する場合、用語「単糖」は、２つ以上のより単純な炭水化物に加水分解できない炭水化物分子を指す。単糖の例としては、限定されるものではないが、ＧｌｃＮＡｃ、マンノース、フコース、グルコース、フルクトース、及びガラクトースが挙げられる。
用語「Ｎ結合型グリカン」または「Ｎ－グリカン」は、一般にグリコシルトランスフェラーゼにより、グリカンのＮ－アセチルグルコサミン残基を介して、任意により、アスパラギンまたはアルギニン残基にコンジュゲートされたＮ－グリカンとして、任意によりアミド結合を介して、窒素原子に共有結合しているＮ結合型オリゴ糖構造を指す。これらの「Ｎ結合型グリコシル化部位」は、例えば、標準アミノ酸配列であるアスパラギン－Ｘ－セリン／トレオニンを含有するペプチドの一次構造において生じ、ここで、Ｘは、プロリン及びアスパラギン酸を除く任意のアミノ酸残基である。「Ｎ結合型グリカン」は、Ｎ結合型オリゴ糖構造を指す。Ｎ－グリカンは、タンパク質または足場に結合され得、これらはインビトロまたはインビボで更に操作され得る。一般的なＮ結合型グリカンとしては、通常、複合型、ハイブリッド型、高マンノース型、分岐型、及び多分岐型構造が挙げられる。グリカンに関する用語「Ｎ結合型」は、ヒトにおいて生成されるものと類似するか、または同一である、タンパク質または足場のアスパラギン残基（Ｎ結合型）のアミド窒素に連結されたＮアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基が結合した足場を指し得る。
「Ｏ－グリカン」または「Ｏ結合型グリカン」は、Ｏ結合型オリゴ糖構造を指す。Ｏ－グリカンは、タンパク質または足場に結合され得、これらはインビトロまたはインビボで更に操作され得る。一般的なＯ－ＧａｌＮＡｃコア構造としては、通常、コア１、コア２、及びポリ－Ｎ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）構造が挙げられる。幾つかの実施形態では、Ｏ結合型オリゴ糖類は、セリン残基の酸素原子を介して共有結合している。グリカンに関する用語「Ｏ結合型」は、ヒトにおいて生成されるものと類似するか、または同一である、タンパク質または足場のセリンまたはトレオニン残基の酸素原子に連結されたＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基が結合したコンジュゲートを指し得る。
用語「グリカン」は、オリゴ糖構造を指し、糖タンパク質に見出される主なオリゴ糖構造としては、グルコース（Ｇｌｕ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、及びシアル酸（例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃまたはＮＡＮＡ））が挙げられる。６個の炭素原子を有する単糖に分類されるヘキソース（Ｈｅｘ）、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノースは、質量分析によって容易に識別可能ではなく、これらも存在し得る。Ｎ－グリカンは、「トリマンノシルコア」に付加されている、末端の糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース、及びシアル酸）を含む分岐（「アンテナ」または「アーム」）の数に関して異なる。「Ｍ３」、「Ｍ３ＧＮ２」、「トリマンノースコア」、「五糖コア」、または「パーシマンノースコア」とも称される用語「トリマンノシルコア」は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖構造を指し、ここで、Ｍａｎα１，３アーム及びＭａｎα１，６アームは、ジ－ＧｌｃＮＡｃ構造（ＧｌｃＮＡｃ２）：β１，４ＧｌｃＮＡｃ－β１，４ＧｌｃＮＡｃから延在する。Ｎ－グリカンは、それらの分岐鎖構成成分により分類される（例えば、高マンノース型、複合型、またはハイブリッド型）。
「高マンノース」型Ｎ－グリカンは、ジ－ＧｌｃＮＡｃオリゴ糖構造に４つ以上のマンノース残基を含む。「Ｍ９」は、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を指す。「Ｍ５」は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を指す。
「ハイブリッド」型Ｎ－グリカンは、トリマンノースコアのα１，３マンノース（Ｍａｎα１，３）アームの末端に少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃ残基、及びトリマンノースコアのα１，６マンノース（Ｍａｎα１，３）アームに０個以上のマンノースを有する。ハイブリッド型グリカンの例は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。
「複合」型Ｎ－グリカンは、通常、Ｍａｎα１，３アームに結合した少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃ残基、及びトリマンノースコアのＭａｎα１，６アームに結合した少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃ（場合により、「Ｇ０」またはフコシル化された「Ｇ０Ｆ」と称される）を有する。複合型Ｎ－グリカンは、ガラクトースまたはＮ－アセチルガラクトサミン残基（「Ｇ２」またはフコシル化された「Ｇ２Ｆ」）も有し得、これらは、任意にシアル酸または誘導体で修飾されている（「Ｇ２Ｓ２」またはフコシル化された「Ｇ２ＦＳ２」）（例えば、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を指し、「Ａｃ」はアセチルを指す）。複合型Ｎ－グリカンは、「バイセクト」ＧｌｃＮＡｃ及びコアフコースを含む鎖内置換も有し得る。複合型Ｎ－グリカンは、多くの場合、「多分岐型グリカン」と称されるか、または「多分枝型グリカン」とも称される、三分岐、四分岐、または五分岐型グリカンであり得る複数のアンテナもトリマンノースコア上に有し得る。
本明細書で使用する場合、用語「主に」または変化形、例えば、「主な」または「主たる」は、糖リガンドが除去された（例えば、ＰＮＧアーゼで処理され、グリカンが放出された）後に、質量分析、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳにより分析されるＮ－グリカン総量のうちの最も高いモルパーセント（％）を有すると測定されるグリカン種を意味すると理解される。換言すれば、語句「主に」は、あらゆる他の個々の物質より高いモルパーセントで存在する個々の物質、例えば、特定のグリコフォームと定義される。例えば、組成物が４０モルパーセントのＡ種、３５モルパーセントのＢ種、及び２５モルパーセントのＣ種からなる場合、組成物はＡ種を主に含む。また、用語「豊富な」、「均一な」、「均質な」、及び「から本質的になる」は、１種以上のグリカンに関して「主な」と同義である。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによりポジティブモードで測定されるＮ－グリカンのモル％は、モル％のＮ－グリカン総量に対するモル％の糖の移動を指す。カリウムイオン及びナトリウムイオンなどのある特定のカチオン付加物は、通常、Ｎ－グリカンの質量がそれぞれの付加物の分子質量分増加した溶出ピークを伴う。
「有効量」または「治療上有効量」は、望ましい結果をもたらすのに十分な投与量、例えば、有益なまたは所望の結果（予防結果及び／または治療結果が含まれる）、例えば、対照と比較した医学的状態（例えば、がん、感染性疾患、免疫介在性疾患（例えば、自己免疫障害、炎症性疾患）など）の症状の低減を達成するのに十分な量を意味する。幾つかの実施形態では、がんに関しては、治療上有効量は、腫瘍の成長を遅らせるのに、腫瘍サイズを低減するのに、及び／または同様のことに十分である。有効量は、１回以上の投与で投与され得る。
値の範囲が列挙される場合、値の範囲は、範囲内の各値及び部分範囲を包含することを意図する。例えば、「Ｃ１～６アルキル」は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ１～６、Ｃ１～５、Ｃ１～４、Ｃ１～３、Ｃ１～２、Ｃ２～６、Ｃ２～５、Ｃ２～４、Ｃ２～３、Ｃ３～６、Ｃ３～５、Ｃ３～４、Ｃ４～６、Ｃ４～５、及びＣ５～６アルキルを包含することを意図する。
用語「アルキル」は、１～１０個の炭素原子から有する直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基（「Ｃ１～１０アルキル」）のラジカルを指す。幾つかの実施形態では、アルキル基は、１～９個の炭素原子を有する（「Ｃ１～９アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は、１～８個の炭素原子を有する（「Ｃ１～８アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は、１～７個の炭素原子を有する（「Ｃ１～７アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は、１～６個の炭素原子を有する（「Ｃ１～６アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は、１～５個の炭素原子を有する（「Ｃ１～５アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は、１～４個の炭素原子を有する（「Ｃ１～４アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は、１～３個の炭素原子を有する（「Ｃ１～３アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は、１～２個の炭素原子を有する（「Ｃ１～２アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は、１個の炭素原子を有する（「Ｃ１アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は、２～６個の炭素原子を有する（「Ｃ２～６アルキル」）。Ｃ１～６アルキル基の例としては、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）（例えば、ｎ－プロピル、イソプロピル）、ブチル（Ｃ４）（例えば、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル）、ペンチル（Ｃ５）（例えば、ｎ－ペンチル、３－ペンタニル、アミル、ネオペンチル、３－メチル－２－ブタニル、三級アミル）、及びヘキシル（Ｃ６）（例えば、ｎ－ヘキシル）が挙げられる。アルキル基の追加の例としては、ｎ－ヘプチル（Ｃ７）、ｎ－オクチル（Ｃ８）などが挙げられる。特に明記しない限り、アルキル基の各例は、独立して、非置換（「非置換アルキル」）であるか、または１個以上の置換基（例えば、ハロゲン、例えば、Ｆ）で置換されている（「置換アルキル」）。ある特定の実施形態では、アルキル基は、非置換Ｃ１～１０アルキル（例えば、非置換Ｃ１～６アルキル、例えば、－ＣＨ３（Ｍｅ）、非置換エチル（Ｅｔ）、非置換プロピル（Ｐｒ、例えば、非置換ｎ－プロピル（ｎ－Ｐｒ）、非置換イソプロピル（ｉ－Ｐｒ））、非置換ブチル（Ｂｕ、例えば、非置換ｎ－ブチル（ｎ－Ｂｕ）、非置換ｔｅｒｔ－ブチル（ｔｅｒｔ－Ｂｕまたはｔ－Ｂｕ）、非置換ｓｅｃ－ブチル（ｓｅｃ－Ｂｕ）、非置換イソブチル（ｉ－Ｂｕ）））である。ある特定の実施形態では、アルキル基は、置換Ｃ１～１０アルキル（例えば、置換Ｃ１～６アルキル、例えば、－ＣＦ３、Ｂｎ）である。
用語「ヘテロアルキル」は、親鎖内の（すなわち、隣接した炭素原子の間に挿入された）及び／または親鎖の１つ以上の末端位置（複数可）に配置された、酸素、窒素、または硫黄から選択される少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、１、２、３、または４個のヘテロ原子）を更に含むアルキル基を指す。ある特定の実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１～２０個の炭素原子及び１個以上のヘテロ原子を有する飽和基（「Ｃ１～２０ヘテロアルキル」）を指す。幾つかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１～１８個の炭素原子及び１個以上のヘテロ原子を有する飽和基（「Ｃ１～１８ヘテロアルキル」）である。幾つかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１～１６個の炭素原子及び１個以上のヘテロ原子を有する飽和基（「Ｃ１～１６ヘテロアルキル」）である。幾つかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１～１４個の炭素原子及び１個以上のヘテロ原子を有する飽和基（「Ｃ１～１４ヘテロアルキル」）である。幾つかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１～１２個の炭素原子及び１個以上のヘテロ原子を有する飽和基（「Ｃ１～１２ヘテロアルキル」）である。幾つかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１～１０個の炭素原子及び１個以上のヘテロ原子を有する飽和基（「Ｃ１～１０ヘテロアルキル」）である。幾つかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１～８個の炭素原子及び１個以上のヘテロ原子を有する飽和基（「Ｃ１～８ヘテロアルキル」）である。幾つかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１～６個の炭素原子及び１個以上のヘテロ原子を有する飽和基（「Ｃ１～６ヘテロアルキル」）である。幾つかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１～４個の炭素原子及び１または２個のヘテロ原子を有する飽和基（「Ｃ１～４ヘテロアルキル」）である。幾つかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１～３個の炭素原子及び１個のヘテロ原子を有する飽和基（「Ｃ１～３ヘテロアルキル」）である。幾つかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、親鎖内に１～２個の炭素原子及び１個のヘテロ原子を有する飽和基（「Ｃ１～２ヘテロアルキル」）である。幾つかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、１個の炭素原子及び１個のヘテロ原子を有する飽和基（「Ｃ１ヘテロアルキル」）である。幾つかの実施形態では、本明細書において定義されるヘテロアルキル基は、親鎖内に１個以上のヘテロ原子及び少なくとも１個の不飽和炭素、例えば、カルボニル基を有する部分的に不飽和な基である。例えば、ヘテロアルキル基は、１個以上の炭素原子が不飽和カルボニル基となるように、その親鎖にアミドまたはエステル官能基を含み得る。特に明記しない限り、各ヘテロアルキル基は、独立して、非置換（「非置換ヘテロアルキル」）であるか、または１個以上の置換基で置換されている（「置換ヘテロアルキル」）。ある特定の実施形態では、ヘテロアルキル基は、非置換Ｃ１～２０ヘテロアルキルである。ある特定の実施形態では、ヘテロアルキル基は、非置換Ｃ１～１０ヘテロアルキルである。ある特定の実施形態では、ヘテロアルキル基は、置換Ｃ１～２０ヘテロアルキルである。ある特定の実施形態では、ヘテロアルキル基は、非置換Ｃ１～１０ヘテロアルキルである。
用語「アルケニル」は、２～１０個の炭素原子及び１個以上の炭素－炭素二重結合（例えば、１、２、３、または４個の二重結合）を有する直鎖または分枝鎖の炭化水素基のラジカルを指す。幾つかの実施形態では、アルケニル基は、２～９個の炭素原子を有する（「Ｃ２～９アルケニル」）。幾つかの実施形態では、アルケニル基は、２～８個の炭素原子を有する（「Ｃ２～８アルケニル」）。幾つかの実施形態では、アルケニル基は、２～７個の炭素原子を有する（「Ｃ２～７アルケニル」）。幾つかの実施形態では、アルケニル基は、２～６個の炭素原子を有する（「Ｃ２～６アルケニル」）。幾つかの実施形態では、アルケニル基は、２～５個の炭素原子を有する（「Ｃ２～５アルケニル」）。幾つかの実施形態では、アルケニル基は、２～４個の炭素原子を有する（「Ｃ２～４アルケニル」）。幾つかの実施形態では、アルケニル基は、２～３個の炭素原子を有する（「Ｃ２～３アルケニル」）。幾つかの実施形態では、アルケニル基は、２個の炭素原子を有する（「Ｃ２アルケニル」）。１個以上の炭素－炭素二重結合は、内部（２－ブテニルにおけるように）または末端（１－ブテニルにおけるように）に存在し得る。Ｃ２～４アルケニル基の例としては、エテニル（Ｃ２）、１－プロペニル（Ｃ３）、２－プロペニル（Ｃ３）、１－ブテニル（Ｃ４）、２－ブテニル（Ｃ４）、ブタジエニル（Ｃ４）などが挙げられる。Ｃ２～６アルケニル基の例としては、上述のＣ２～４アルケニル基、及びペンテニル（Ｃ５）、ペンタジエニル（Ｃ５）、ヘキセニル（Ｃ６）などが挙げられる。アルケニルの追加の例としては、ヘプテニル（Ｃ７）、オクテニル（Ｃ８）、オクタトリエニル（Ｃ８）などが挙げられる。特に明記しない限り、各アルケニル基は、独立して、非置換（「非置換アルケニル」）であるか、または１個以上の置換基で置換されている（「置換アルケニル」）。ある特定の実施形態では、アルケニル基は、非置換Ｃ２～１０アルケニルである。ある特定の実施形態では、アルケニル基は、置換Ｃ２～１０アルケニルである。アルケニル基では、立体配置が指定されていないＣ＝Ｃ二重結合（例えば、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ３または
Figure 2024514954000002
 ）は、（Ｅ）－または（Ｚ）－二重結合であり得る。
用語「アルキニル」は、２～１０個の炭素原子及び１個以上の炭素－炭素三重結合（例えば、１、２、３、または４個の三重結合）を有する直鎖または分枝鎖の炭化水素基のラジカル（「Ｃ２～１０アルキニル」）を指す。幾つかの実施形態では、アルキニル基は、２～９個の炭素原子を有する（「Ｃ２～９アルキニル」）。幾つかの実施形態では、アルキニル基は、２～８個の炭素原子を有する（「Ｃ２～８アルキニル」）。幾つかの実施形態では、アルキニル基は、２～７個の炭素原子を有する（「Ｃ２～７アルキニル」）。幾つかの実施形態では、アルキニル基は、２～６個の炭素原子を有する（「Ｃ２～６アルキニル」）。幾つかの実施形態では、アルキニル基は、２～５個の炭素原子を有する（「Ｃ２～５アルキニル」）。幾つかの実施形態では、アルキニル基は、２～４個の炭素原子を有する（「Ｃ２～４アルキニル」）。幾つかの実施形態では、アルキニル基は、２～３個の炭素原子を有する（「Ｃ２～３アルキニル」）。幾つかの実施形態では、アルキニル基は、２個の炭素原子を有する（「Ｃ２アルキニル」）。１個以上の炭素－炭素三重結合は、内部（２－ブチニルにおけるように）または末端（１－ブチニルにおけるように）に存在し得る。Ｃ２～４アルキニル基の例としては、限定されるものではないが、エチニル（Ｃ２）、１－プロピニル（Ｃ３）、２－プロピニル（Ｃ３）、１－ブチニル（Ｃ４）、２－ブチニル（Ｃ４）などが挙げられる。Ｃ２～６アルケニル基の例としては、上述のＣ２～４アルキニル基、及びペンチニル（Ｃ５）、ヘキシニル（Ｃ６）などが挙げられる。アルキニルの追加の例としては、ヘプチニル（Ｃ７）、オクチニル（Ｃ８）などが挙げられる。特に明記しない限り、各アルキニル基は、独立して、非置換（「非置換アルキニル」）であるか、または１個以上の置換基で置換されている（「置換アルキニル」）。ある特定の実施形態では、アルキニル基は、非置換Ｃ２～１０アルキニルである。ある特定の実施形態では、アルキニル基は、置換Ｃ２～１０アルキニルである。
用語「カルボシクリル」または「炭素環式」は、非芳香族環系に３～１４個の環炭素原子（「Ｃ３～１４カルボシクリル」）及び０個のヘテロ原子を有する非芳香族環状炭化水素基のラジカルを指す。幾つかの実施形態では、カルボシクリル基は、３～１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ３～１０カルボシクリル」）。幾つかの実施形態では、カルボシクリル基は、３～８個の環炭素原子を有する（「Ｃ３～８カルボシクリル」）。幾つかの実施形態では、カルボシクリル基は、３～７個の環炭素原子を有する（「Ｃ３～７カルボシクリル」）。幾つかの実施形態では、カルボシクリル基は、３～６個の環炭素原子を有する（「Ｃ３～６カルボシクリル」）。幾つかの実施形態では、カルボシクリル基は、４～６個の環炭素原子を有する（「Ｃ４～６カルボシクリル」）。幾つかの実施形態では、カルボシクリル基は、５～６個の環炭素原子を有する（「Ｃ５～６カルボシクリル」）。幾つかの実施形態では、カルボシクリル基は、５～１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ５～１０カルボシクリル」）。例示的なＣ３～６カルボシクリル基としては、限定されるものではないが、シクロプロピル（Ｃ３）、シクロプロペニル（Ｃ３）、シクロブチル（Ｃ４）、シクロブテニル（Ｃ４）、シクロペンチル（Ｃ５）、シクロペンテニル（Ｃ５）、シクロヘキシル（Ｃ６）、シクロヘキセニル（Ｃ６）、シクロヘキサジエニル（Ｃ６）などが挙げられる。例示的なＣ３～８カルボシクリル基としては、限定されるものではないが、上述のＣ３～６カルボシクリル基、及びシクロヘプチル（Ｃ７）、シクロヘプテニル（Ｃ７）、シクロヘプタジエニル（Ｃ７）、シクロヘプタトリエニル（Ｃ７）、シクロオクチル（Ｃ８）、シクロオクテニル（Ｃ８）、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル（Ｃ７）、ビシクロ［２．２．２］オクタニル（Ｃ８）などが挙げられる。例示的なＣ３～１０カルボシクリル基としては、限定されるものではないが、上述のＣ３－８カルボシクリル基、及びシクロノニル（Ｃ９）、シクロノネニル（Ｃ９）、シクロデシル（Ｃ１０）、シクロデセニル（Ｃ１０）、オクタヒドロ－１Ｈ－インデニル（Ｃ９）、デカヒドロナフタレニル（Ｃ１０）、スピロ［４．５］デカニル（Ｃ１０）などが挙げられる。上記の例が示すように、ある特定の実施形態では、カルボシクリル基は、単環式（「単環式カルボシクリル」）または多環式（例えば、縮合環系、架橋環系、またはスピロ環系、例えば、二環系（「二環式カルボシクリル」）または三環系（「三環式カルボシクリル」）を含む）のいずれかであり、飽和であり得るか、または１個以上の炭素－炭素二重結合もしくは三重結合を含み得る。「カルボシクリル」は、上記に定義したカルボシクリル環が１個以上のアリール基またはヘテロアリール基と縮合している環系であって、結合点がカルボシクリル環に存在する、当該環系も包含し、そのような場合、炭素数は引き続き炭素環系の炭素数を指す。特に明記しない限り、各カルボシクリル基は、独立して、非置換（「非置換カルボシクリル」）であるか、または１個以上の置換基で置換されている（「置換カルボシクリル」）。ある特定の実施形態では、カルボシクリル基は、非置換Ｃ３～１４カルボシクリルである。ある特定の実施形態では、カルボシクリル基は、置換Ｃ３～１４カルボシクリルである。
幾つかの実施形態では、「カルボシクリル」は、３～１４個の環炭素原子を有する単環式飽和カルボシクリル基（「Ｃ３～１４シクロアルキル」）である。幾つかの実施形態では、シクロアルキル基は、３～１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ３～１０シクロアルキル」）。幾つかの実施形態では、シクロアルキル基は、３～８個の環炭素原子を有する（「Ｃ３～８シクロアルキル」）。幾つかの実施形態では、シクロアルキル基は、３～６個の環炭素原子を有する（「Ｃ３～６シクロアルキル」）。幾つかの実施形態では、シクロアルキル基は、４～６個の環炭素原子を有する（「Ｃ４～６シクロアルキル」）。幾つかの実施形態では、シクロアルキル基は、５～６個の環炭素原子を有する（「Ｃ５～６シクロアルキル」）。幾つかの実施形態では、シクロアルキル基は、５～１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ５～１０シクロアルキル」）。Ｃ５～６シクロアルキル基の例としては、シクロペンチル（Ｃ５）及びシクロヘキシル（Ｃ５）が挙げられる。Ｃ３～６シクロアルキル基の例としては、上述のＣ５～６シクロアルキル基、ならびにシクロプロピル（Ｃ３）及びシクロブチル（Ｃ４）が挙げられる。Ｃ３～８シクロアルキル基の例としては、上述のＣ３～６シクロアルキル基、ならびにシクロヘプチル（Ｃ７）及びシクロオクチル（Ｃ８）が挙げられる。特に明記しない限り、各シクロアルキル基は、独立して、非置換（「非置換シクロアルキル」）であるか、または１個以上の置換基で置換されている（「置換シクロアルキル」）。ある特定の実施形態では、シクロアルキル基は、非置換Ｃ３～１４シクロアルキルである。ある特定の実施形態では、シクロアルキル基は、置換Ｃ３～１４シクロアルキルである。
用語「ヘテロシクリル」または「複素環式」は、環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を有する３～１４員の非芳香族環系のラジカルを指し、ここで、各ヘテロ原子は、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される（「３～１４員ヘテロシクリル」）。１個以上の窒素原子を有するヘテロシクリル基において、結合点は、結合価が許す限り、炭素または窒素原子であり得る。ヘテロシクリル基は、単環式（「単環式ヘテロシクリル」）または多環式（例えば、縮合環系、架橋環系、またはスピロ環系、例えば、二環系（「二環式ヘテロシクリル」）または三環系（「三環式ヘテロシクリル」））のいずれかであり得、かつ飽和であり得るか、または１個以上の炭素－炭素二重結合もしくは三重結合を含み得る。ヘテロシクリル多環式環系は、一方または両方の環に１個以上のヘテロ原子を含み得る。「ヘテロシクリル」は、上記に定義したヘテロシクリル環が１個以上のカルボシクリル基と縮合している環系であって、結合点がカルボシクリルもしくはヘテロシクリル環に存在する、当該環系または上記に定義したヘテロシクリル環が１個以上のアリールもしくはヘテロアリール基と縮合している環系であって、結合点がヘテロシクリル環にある、当該環系も包含し、そのような場合、環員数は引き続きヘテロシクリル環系の環員数を指す。特に明記しない限り、各ヘテロシクリルは、独立して、非置換（「非置換ヘテロシクリル」）であるか、または１個以上の置換基で置換されている（「置換ヘテロシクリル」）。ある特定の実施形態では、ヘテロシクリル基は、３～１４員の非置換ヘテロシクリルである。ある特定の実施形態では、ヘテロシクリル群は、３～１４員の置換ヘテロシクリルである。
幾つかの実施形態では、ヘテロシクリル基は、環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を有する５～１０員の非芳香族環系であり、ここで、各ヘテロ原子は、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される（「５～１０員のヘテロシクリル」）。幾つかの実施形態では、ヘテロシクリル基は、環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を有する５～８員の非芳香族環系であり、ここで、各ヘテロ原子は、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される（「５～８員のヘテロシクリル」）。幾つかの実施形態では、ヘテロシクリル基は、環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を有する５～６員の非芳香族環系であり、ここで、各ヘテロ原子は、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される（「５～６員のヘテロシクリル」）。幾つかの実施形態では、５～６員ヘテロシクリルは、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１～３個の環ヘテロ原子を有する。幾つかの実施形態では、５～６員ヘテロシクリルは、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１～２個の環ヘテロ原子を有する。幾つかの実施形態では、５～６員ヘテロシクリルは、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１個の環ヘテロ原子を有する。
１個のヘテロ原子を有する例示的な３員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、アジリジニル、オキシラニル、及びチイラニルが挙げられる。１個のヘテロ原子を有する例示的な４員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、アゼチジニル、オキセタニル、及びチエタニルが挙げられる。１個のヘテロ原子を有する例示的な５員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ジヒドロチオフェニル、ピロリジニル、ジヒドロピロリル、及びピロリル－２，５－ジオンが挙げられる。２個のヘテロ原子を有する例示的な５員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、ジオキソラニル、オキサチオラニル、及びジチオラニルが挙げられる。３個のヘテロ原子を有する例示的な５員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、トリアゾリル、オキサジアゾリル、及びチアジアゾリルが挙げられる。１個のヘテロ原子を有する例示的な６員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピリジニル、及びチアニルが挙げられる。２個のヘテロ原子を有する例示的な６員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、ピペラジニル、モルホリニル、ジチアニル、及びジオキサニルが挙げられる。３個のヘテロ原子を有する例示的な６員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、トリアジニルが挙げられる。１個のヘテロ原子を有する例示的な７員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、アゼパニル、オキセパニル、及びチエパニルが挙げられる。１個のヘテロ原子を有する例示的な８員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、アゾカニル、オキセカニル、及びチオカニルが挙げられる。例示的な二環式ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、インドリニル、イソインドリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチエニル、テトラヒドロベンゾチエニル、テトラヒドロベンゾフラニル、テトラヒドロインドリル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、デカヒドロイソキノリニル、オクタヒドロクロメニル、オクタヒドロイソクロメニル、デカヒドロナフチリジニル、デカヒドロ－１，８－ナフチリジニル、オクタヒドロピロロ［３，２－ｂ］ピロール、インドリニル、フタルイミジル、ナフタルイミジル、クロマニル、クロメニル、１Ｈ－ベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゼピニル、１，４，５，７－テトラヒドロピラノ［３，４－ｂ］ピロリル、５，６－ジヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｂ］ピロリル、６，７－ジヒドロ－５Ｈ－フロ［３，２－ｂ］ピラニル、５，７－ジヒドロ－４Ｈ－チエノ［２，３－ｃ］ピラニル、２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジニル、２，３－ジヒドロフロ［２，３－ｂ］ピリジニル、４，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジニル、４，５，６，７－テトラヒドロフロ［３，２－ｃ］ピリジニル、４，５，６，７－テトラヒドロチエノ［３，２－ｂ］ピリジニル、１，２，３，４－テトラヒドロ－１，６－ナフチリジニルなどが挙げられる。
用語「アリール」は、芳香環系に提供された６～１４個の環炭素原子及び０個のヘテロ原子を有する単環式または多環式（例えば、二環式または三環式）の４ｎ＋２芳香環系（例えば、環系で共有される６、１０、または１４個のπ電子を有する）のラジカルを指す（「Ｃ６～１４アリール」）。幾つかの実施形態では、アリール基は、６個の環炭素原子を有する（「Ｃ６アリール」；例えば、フェニル）。幾つかの実施形態では、アリール基は、１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ１０アリール」；例えば、１－ナフチル及び２－ナフチルなどのナフチル）。幾つかの実施形態では、アリール基は、１４個の環炭素原子を有する（「Ｃ１４アリール」；例えば、アントラシル）。「アリール」は、上記に定義したアリール環が１個以上のカルボシクリルまたはヘテロシクリル基と縮合している環系であって、ラジカルまたは結合点がアリール環に存在する、当該環系も包含し、そのような場合、炭素原子数は引き続きアリール環系の炭素原子数を指す。特に明記しない限り、各アリール基は、独立して、非置換（「非置換アリール」）であるか、または１個以上の置換基で置換されている（「置換アリール」）。ある特定の実施形態では、アリール基は、非置換Ｃ６～１４アリールである。ある特定の実施形態では、アリール基は、置換Ｃ６～１４アリールである。
用語「ヘテロアリール」は、芳香環系に提供された環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を有する５～１４員の単環式または多環式（例えば、二環式、三環式）の４ｎ＋２芳香環系（例えば、環系で共有される６、１０、または１４個のπ電子を有する）のラジカルを指し、ここで、各ヘテロ原子は、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される（「５～１４員ヘテロアリール」）。１個以上の窒素原子を有するヘテロアリール基において、結合点は、結合価が許す限り、炭素または窒素原子であり得る。ヘテロアリール多環式環系は、一方または両方の環に１個以上のヘテロ原子を含み得る。「ヘテロアリール」は、上記に定義したヘテロアリール環が１個以上のカルボシクリルまたはヘテロシクリル基と縮合している環系であって、結合点がヘテロアリール環に存在する、当該環系を包含し、そのような場合、環員数は引き続きヘテロアリール環系の環員数を指す。「ヘテロアリール」は、上記に定義したヘテロアリール環が１個以上のアリール基と縮合している環系であって、結合点がアリールまたはヘテロアリール環に存在する、当該環系も包含し、そのような場合、環員数は縮合した多環式（アリール／ヘテロアリール）環系の環員数を指す。１個の環がヘテロ原子を含有しない多環式ヘテロアリール基（例えば、インドリル、キノリニル、カルバゾリルなど）において、結合点は、いずれかの環、すなわち、ヘテロ原子を有する環（例えば、２－インドリル）またはヘテロ原子を有さない環（例えば、５－インドリル）のいずれかに存在し得る。
幾つかの実施形態では、ヘテロアリール基は、芳香環系に提供された環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を有する５～１０員の芳香族環系であり、ここで、各ヘテロ原子は、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される（「５～１０員ヘテロアリール」）。幾つかの実施形態では、ヘテロアリール基は、芳香環系に提供された環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を有する５～８員の芳香族環系であり、ここで、各ヘテロ原子は、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される（「５～８員ヘテロアリール」）。幾つかの実施形態では、ヘテロアリール基は、芳香環系に提供された環炭素原子及び１～４個の環ヘテロ原子を有する５～６員の芳香族環系であり、ここで、各ヘテロ原子は、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される（「５～６員ヘテロアリール」）。幾つかの実施形態では、５～６員ヘテロアリールは、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１～３個の環ヘテロ原子を有する。幾つかの実施形態では、５～６員ヘテロアリールは、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１～２個の環ヘテロ原子を有する。幾つかの実施形態では、５～６員ヘテロアリールは、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１個の環ヘテロ原子を有する。特に明記しない限り、各ヘテロアリール基は、独立して、非置換（「非置換ヘテロアリール」）であるか、または１個以上の置換基で置換されている（「置換ヘテロアリール」）。ある特定の実施形態では、ヘテロアリール基は、５～１４員の非置換ヘテロアリールである。ある特定の実施形態では、ヘテロアリール基は、５～１４員の置換ヘテロアリールである。
１個のヘテロ原子を有する例示的な５員ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、ピロリル、フラニル、及びチオフェニルが挙げられる。２個のヘテロ原子を有する例示的な５員ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、及びイソチアゾリルが挙げられる。３個のヘテロ原子を有する例示的な５員ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、トリアゾリル、オキサジアゾリル、及びチアジアゾリルが挙げられる。４個のヘテロ原子を有する例示的な５員ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、テトラゾリルが挙げられる。１個のヘテロ原子を有する例示的な６員ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、ピリジニルが挙げられる。２個のヘテロ原子を有する例示的な６員ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、ピリダジニル、ピリミジニル、及びピラジニルが挙げられる。３または４個のヘテロ原子を有する例示的な６員ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、それぞれトリアジニル及びテトラジニルが挙げられる。１個のヘテロ原子を有する例示的な７員ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、アゼピニル、オキセピニル、及びチエピニルが挙げられる。例示的な５，６－二環式ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、イソベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、ベンゾイソフラニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、インドリジニル、及びプリニルが挙げられる。例示的な６，６－二環式ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、ナフチリジニル、プテリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キノキサリニル、フタラジニル、及びキナゾリニルが挙げられる。例示的な三環式ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、フェナントリジニル、ジベンゾフラニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、及びフェナジニルが挙げられる。
接尾辞「－エン」の基への付加は、当該基が二価部分であることを示し、例えば、アルキレンはアルキルの二価部分であり、アルケニレンはアルケニルの二価部分であり、アルキニレンはアルキニルの二価部分であり、ヘテロアルキレンはヘテロアルキルの二価部分であり、ヘテロアルケニレンはヘテロアルケニルの二価部分であり、ヘテロアルキニレンはヘテロアルキニルの二価部分であり、カルボシクリレンはカルボシクリルの二価部分であり、ヘテロシクリレンはヘテロシクリルの二価部分であり、アリーレンはアリールの二価部分であり、ヘテロアリーレンはヘテロアリールの二価部分である。
明示的に別様に示されない限り、基は任意に置換されている。用語「任意に置換された」は、置換または非置換であることを指す。ある特定の実施形態では、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリール基は、任意に置換されている。「任意に置換された」とは、置換されていても置換されていなくてもよい基を指す（例えば、「置換」もしくは「非置換」アルキル、「置換」もしくは「非置換」アルケニル、「置換」もしくは「非置換」アルキニル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロアルキル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロアルケニル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロアルキニル、「置換」もしくは「非置換」カルボシクリル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロシクリル、「置換」もしくは「非置換」アリール、または「置換」もしくは「非置換」ヘテロアリール基）。一般に、用語「置換された」は、基に存在する少なくとも１個の水素が、許容される置換基、例えば、置換時に安定な化合物、例えば、転位、環化、脱離、または他の反応などによる変換を自発的に受けない化合物をもたらす置換基と置き換えられていることを意味する。特に明記しない限り、「置換された」基は、当該基の１つ以上の置換可能な位置に置換基を有し、任意の所与の構造における２つ以上の位置が置換されている場合、置換基は、それぞれの位置で同一であっても異なっていてもよい。用語「置換された」は、有機化合物の全ての許容可能な置換基での置換を包含することが意図され、安定な化合物の形成をもたらす本明細書に記載される置換基のいずれかを包含する。本開示は、安定な化合物に到達するためのあらゆるかかる組み合わせを意図する。本開示の目的のために、窒素などのヘテロ原子は、ヘテロ原子の結合価を満たし、安定な部分の形成をもたらす、水素置換基及び／または本明細書に記載される任意の好適な置換基を有し得る。本開示は、如何様にも、本明細書に記載される例示的な置換基に限定されることを意図しない。
置換される場合、例示的な炭素原子置換基としては、限定されるものではないが、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、－ＳＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＨ、－ＯＲａａ、－ＯＮ（Ｒｂｂ）２、－Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｎ（Ｒｂｂ）３ ＋Ｘ－、－Ｎ（ＯＲｃｃ）Ｒｂｂ、－ＳＨ、－ＳＲａａ、－ＳＳＲｃｃ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＨＯ、－Ｃ（ＯＲｃｃ）３、－ＣＯ２Ｒａａ、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＯＣＯ２Ｒａａ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＮＲｂｂＣＯ２Ｒａａ、－ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、－Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、－ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、－ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、－Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＮＲｂｂＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、－ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、－ＳＯ２Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＳＯ２Ｒａａ、－ＳＯ２ＯＲａａ、－ＯＳＯ２Ｒａａ、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＯＳ（＝Ｏ）Ｒａａ、－Ｓｉ（Ｒａａ）３、－ＯＳｉ（Ｒａａ）３－Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、－Ｃ（＝Ｓ）ＳＲａａ、－ＳＣ（＝Ｓ）ＳＲａａ、－ＳＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、－ＳＣ（＝Ｏ）ＯＲａａ、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、－ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｎ（Ｒｂｂ）２）２、－ＯＰ（＝Ｏ）（Ｎ（Ｒｂｂ）２）２、－ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、－ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、－ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（Ｎ（Ｒｂｂ）２）２、－Ｐ（Ｒｃｃ）２、－Ｐ（ＯＲｃｃ）２、－Ｐ（Ｒｃｃ）３ ＋Ｘ－、－Ｐ（ＯＲｃｃ）３ ＋Ｘ－、－Ｐ（Ｒｃｃ）４、－Ｐ（ＯＲｃｃ）４、－ＯＰ（Ｒｃｃ）２、－ＯＰ（Ｒｃｃ）３ ＋Ｘ－、－ＯＰ（ＯＲｃｃ）２、－ＯＰ（ＯＲｃｃ）３ ＋Ｘ－、－ＯＰ（Ｒｃｃ）４、－ＯＰ（ＯＲｃｃ）４、－Ｂ（Ｒａａ）２、－Ｂ（ＯＲｃｃ）２、－ＢＲａａ（ＯＲｃｃ）、Ｃ１～１０アルキル、Ｃ１～１０ペルハロアルキル、Ｃ２～１０アルケニル、Ｃ２～１０アルキニル、Ｃ１～１０ヘテロアルキル、Ｃ２～１０ヘテロアルケニル、Ｃ２～１０ヘテロアルキニル、Ｃ３～１０カルボシクリル、３～１４員ヘテロシクリル、Ｃ６～１４アリール、及び５～１４員ヘテロアリールが挙げられ、ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールは、独立して、０、１、２、３、４、または５個のＲｄｄ基で置換されており、Ｘ－は、対イオンであるか、
または炭素原子上の２個のジェミナルな水素は、基：＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮ（Ｒｂｂ）２、＝ＮＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、＝ＮＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）ＯＲａａ、＝ＮＮＲｂｂＳ（＝Ｏ）２Ｒａａ、＝ＮＲｂｂ、もしくは＝ＮＯＲｃｃで置換されており、
各Ｒａａは、独立して、Ｃ１～１０アルキル、Ｃ１～１０ペルハロアルキル、Ｃ２～１０アルケニル、Ｃ２～１０アルキニル、Ｃ１～１０ヘテロアルキル、Ｃ２～１０ヘテロアルケニル、Ｃ２～１０ヘテロアルキニル、Ｃ３～１０カルボシクリル、３～１４員ヘテロシクリル、Ｃ６～１４アリール、及び５～１４員ヘテロアリールから選択されるか、または２個のＲａａ基は、連結されて、３～１４員ヘテロシクリルもしくは５～１４員ヘテロアリール環を形成しており、ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールは、独立して、０、１、２、３、４、または５個のＲｄｄ基で置換されており、
各Ｒｂｂは、独立して、水素、－ＯＨ、－ＯＲａａ、－Ｎ（Ｒｃｃ）２、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、－ＣＯ２Ｒａａ、－ＳＯ２Ｒａａ、－Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、－Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、－ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、－ＳＯ２Ｒｃｃ、－ＳＯ２ＯＲｃｃ、－ＳＯＲａａ、－Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、－Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｃｃ、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｎ（Ｒｃｃ）２）２、Ｃ１～１０アルキル、Ｃ１～１０ペルハロアルキル、Ｃ２～１０アルケニル、Ｃ２～１０アルキニル、Ｃ１～１０ヘテロアルキル、Ｃ２～１０ヘテロアルケニル、Ｃ２～１０ヘテロアルキニル、Ｃ３～１０カルボシクリル、３～１４員ヘテロシクリル、Ｃ６～１４アリール、及び５～１４員ヘテロアリールから選択されるか、または２個のＲｂｂ基は、連結されて、３～１４員ヘテロシクリルもしくは５～１４員ヘテロアリール環を形成しており、ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールは、独立して、０、１、２、３、４、または５個のＲｄｄ基で置換されており、Ｘ－は、対イオンであり、
各Ｒｃｃは、独立して、水素、Ｃ１～１０アルキル、Ｃ１～１０ペルハロアルキル、Ｃ２～１０アルケニル、Ｃ２～１０アルキニル、Ｃ１～１０ヘテロアルキル、Ｃ２～１０ヘテロアルケニル、Ｃ２～１０ヘテロアルキニル、Ｃ３～１０カルボシクリル、３～１４員ヘテロシクリル、Ｃ６～１４アリール、及び５～１４員ヘテロアリールから選択されるか、または２個のＲｃｃ基は、連結されて、３～１４員ヘテロシクリルもしくは５～１４員ヘテロアリール環を形成しており、ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールは、独立して、０、１、２、３、４、または５個のＲｄｄ基で置換されており、
各Ｒｄｄは、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、－ＳＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＨ、－ＯＲｅｅ、－ＯＮ（Ｒｆｆ）２、－Ｎ（Ｒｆｆ）２、－Ｎ（Ｒｆｆ）３ ＋Ｘ－、－Ｎ（ＯＲｅｅ）Ｒｆｆ、－ＳＨ、－ＳＲｅｅ、－ＳＳＲｅｅ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２Ｒｅｅ、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、－ＯＣＯ２Ｒｅｅ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、－ＮＲｆｆＣ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、－ＮＲｆｆＣＯ２Ｒｅｅ、－ＮＲｆｆＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、－Ｃ（＝ＮＲｆｆ）ＯＲｅｅ、－ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｒｅｅ、－ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）ＯＲｅｅ、－Ｃ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、－ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、－ＮＲｆｆＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、－ＮＲｆｆＳＯ２Ｒｅｅ、－ＳＯ２Ｎ（Ｒｆｆ）２、－ＳＯ２Ｒｅｅ、－ＳＯ２ＯＲｅｅ、－ＯＳＯ２Ｒｅｅ、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、－Ｓｉ（Ｒｅｅ）３、－ＯＳｉ（Ｒｅｅ）３、－Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｅｅ、－Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｅｅ、－ＳＣ（＝Ｓ）ＳＲｅｅ、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲｅｅ）２、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｒｅｅ）２、－ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒｅｅ）２、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲｅｅ）２、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ペルハロアルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ１～６ヘテロアルキル、Ｃ２～６ヘテロアルケニル、Ｃ２～６ヘテロアルキニル、Ｃ３～１０カルボシクリル、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリールから独立して選択されるか、またはジェミナルな２個のＲｄｄ置換基は、連結されて、＝Ｏもしくは＝Ｓを形成していてもよく、ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールは、独立して、０、１、２、３、４、または５個のＲｇｇ基で置換されており、Ｘ－は、対イオンであり、
各Ｒｅｅは、独立して、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ペルハロアルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ１～６ヘテロアルキル、Ｃ２～６ヘテロアルケニル、Ｃ２～６ヘテロアルキニル、Ｃ３～１０カルボシクリル、Ｃ６～１０アリール、３～１０員ヘテロシクリル、及び３～１０員ヘテロアリールから選択され、ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールは、独立して、０、１、２、３、４、または５個のＲｇｇ基で置換されており、
各Ｒｆｆは、独立して、水素、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ペルハロアルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ１～６ヘテロアルキル、Ｃ２～６ヘテロアルケニル、Ｃ２～６ヘテロアルキニル、Ｃ３～１０カルボシクリル、３～１０員ヘテロシクリル、Ｃ６～１０アリール、及び５～１０員ヘテロアリールから選択されるか、または２個のＲｆｆ基は、連結されて、３～１０員ヘテロシクリルもしくは５～１０員ヘテロアリール環を形成しており、ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、及びヘテロアリールは、独立して、０、１、２、３、４、または５個のＲｇｇ基で置換されており、
各Ｒｇｇは、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、－ＳＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＨ、－ＯＣ１～６アルキル、－ＯＮ（Ｃ１～６アルキル）２、－Ｎ（Ｃ１～６アルキル）２、－Ｎ（Ｃ１～６アルキル）３ ＋Ｘ－、－ＮＨ（Ｃ１～６アルキル）２ ＋Ｘ－、－ＮＨ２（Ｃ１～６アルキル）＋Ｘ－、－ＮＨ３ ＋Ｘ－、－Ｎ（ＯＣ１～６アルキル）（Ｃ１～６アルキル）、－Ｎ（ＯＨ）（Ｃ１～６アルキル）、－ＮＨ（ＯＨ）、－ＳＨ、－ＳＣ１～６アルキル、－ＳＳ（Ｃ１～６アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１～６アルキル）、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２（Ｃ１～６アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１～６アルキル）、－ＯＣＯ２（Ｃ１～６アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１～６アルキル）２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１～６アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１～６アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１～６アルキル）、－ＮＨＣＯ２（Ｃ１～６アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１～６アルキル）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１～６アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（＝ＮＨ）Ｏ（Ｃ１～６アルキル）、－ＯＣ（＝ＮＨ）（Ｃ１～６アルキル）、－ＯＣ（＝ＮＨ）ＯＣ１～６アルキル、－Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｃ１～６アルキル）２、－Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（Ｃ１～６アルキル）、－Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、－ＯＣ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｃ１～６アルキル）２、－ＯＣ（＝ＮＨ）ＮＨ（Ｃ１～６アルキル）、－ＯＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｃ１～６アルキル）２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１～６アルキル）、－ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～６アルキル）２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～６アルキル）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２（Ｃ１～６アルキル）、－ＳＯ２Ｏ（Ｃ１～６アルキル）、－ＯＳＯ２（Ｃ１～６アルキル）、－ＳＯ（Ｃ１～６アルキル）、－Ｓｉ（Ｃ１～６アルキル）３、－ＯＳｉ（Ｃ１～６アルキル）３－Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｃ１～６アルキル）２、Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ（Ｃ１～６アルキル）、Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ（Ｃ１～６アルキル）、－Ｃ（＝Ｓ）ＳＣ１～６アルキル、－ＳＣ（＝Ｓ）ＳＣ１～６アルキル、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＣ１～６アルキル）２、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｃ１～６アルキル）２、－ＯＰ（＝Ｏ）（Ｃ１～６アルキル）２、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＣ１～６アルキル）２、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６ペルハロアルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ１～６ヘテロアルキル、Ｃ２～６ヘテロアルケニル、Ｃ２～６ヘテロアルキニル、Ｃ３～１０カルボシクリル、Ｃ６～１０アリール、３～１０員ヘテロシクリル、５～１０員ヘテロアリールであるか、またはジェミナルな２個のＲｇｇ置換基は、連結されて、＝Ｏもしくは＝Ｓを形成しており、ここで、Ｘ－は対イオンである。
本開示の方法及び組成物がより詳細に記載される前に、本発明の方法及び組成物は、記載される特定の実施形態に限定されず、従って、当然異なり得ると理解されたい。本発明の方法及び組成物の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的とし、限定することを意図しないことも理解されたい。
特に定義しない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。例示的な方法及び材料が以下に記載されるが、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法及び材料が本発明の実施において使用されてもよく、当業者には明らかであろう。本明細書に記載の全ての刊行物及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含め、本発明の明細書が優先する。材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定することを意図しない。
明確にするために別個の実施形態において記載されている本発明の方法及び組成物のある特定の特徴は、組み合わせて単一の実施形態で提供されてもよいことが理解されよう。反対に、簡潔さのために単一の実施形態において記載されている本発明の方法及び組成物の様々な特徴は、別々にまたは任意の好適な副組合せで提供されてもよい。実施形態の全ての組み合わせは、あらゆる組み合わせが個別かつ明示的に開示されたかのように、かかる組み合わせが、実施可能なプロセス及び／または組成物を包含する程度まで、本出願により具体的に包含され、本明細書において開示される。加えて、かかる可変部分を記載する実施形態において列挙される全ての副組合せも、あらゆるかかる副組合せが本明細書において個別かつ明示的に開示されたかのように、本発明の方法及び組成物に具体的に包含され、本明細書において開示される。
本開示を読むことにより当業者に明らかとなるように、本明細書において記載及び例示される個々の実施形態の各々は、本発明の方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他の幾つかの実施形態のいずれかから容易に区別され得るか、またはそれらの特徴と組み合わされ得る別個の構成要素及び特徴を有する。任意の列挙される方法は、列挙される事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実施され得る。
本明細書で使用する場合、用語「塩」は、あらゆる塩を指し、薬学的に許容される塩を包含する。塩としては、酸及び塩基の中和反応により生じるイオン化合物が挙げられる。塩は、当該塩が電気的に中性（正味電荷がない）となるように、１つ以上のカチオン（正に荷電したイオン）及び１つ以上のアニオン（陰イオン）から構成される。本発明の化合物の塩としては、無機酸及び有機酸ならびに塩基から誘導されるものが挙げられる。酸付加塩の例は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、及び過塩素酸により、または有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸により、またはイオン交換などの当該技術分野において公知の他の方法を使用することにより形成される、アミノ基の塩である。他の塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリル酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩、馬尿酸塩などが挙げられる。好適な塩基から誘導される塩としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、及びＮ＋（Ｃ１－４アルキル）４塩が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などが挙げられる。更なる塩としては、対イオンを使用して形成されるアンモニウム、第４級アンモニウム、及びアミンカチオン、例えば、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩、及びアリールスルホン酸塩が挙げられる。
用語「溶媒和物」は、通常、加溶媒分解反応により、溶媒と会合している化合物またはその塩の形態を指す。この物理的会合は水素結合を含みうる。従来の溶媒としては、水、メタノール、エタノール、酢酸、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ジエチルエーテルなどが挙げられる。本明細書に記載される化合物は、例えば、結晶形態で調製され得、溶媒和され得る。好適な溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物が挙げられ、更に化学量論的溶媒和物及び非化学量論的溶媒和物の両方が挙げられる。場合によっては、溶媒和物は、例えば、１つ以上の溶媒分子が結晶質固体の結晶格子に組み込まれている場合、単離することができるであろう。「溶媒和物」は、溶液相溶媒和物及び単離可能な溶媒和物の両方を包含する。代表的な溶媒和物としては、水和物、エタノール付加物、及びメタノール付加物が挙げられる。
用語「水和物」は、水と会合している化合物を指す。通常、化合物の水和物に含有される水分子の数は、水和物における化合物分子の数に対する一定の比率である。従って、化合物の水和物は、例えば、一般式Ｒ×ｘＨ２Ｏにより表され得、式中、Ｒは化合物であり、ｘは０を超える数である。所与の化合物は、例えば、一水和物（ｘは１である）、より低次の水和物（ｘは０より大きく、１未満の数である（例えば、半水和物（Ｒ×０．５Ｈ２Ｏ）））、及び多水和物（ｘは１を超える数である（例えば、二水和物（Ｒ×２Ｈ２Ｏ）及び六水化物（Ｒ×６Ｈ２Ｏ）））が含まれる、２つ以上の種類の水和物を形成し得る。
用語「互変異性体」または「互変異性」は、水素原子の少なくとも１つのホルマール移動及び少なくとも１つの結合価の変化（例えば、単結合から二重結合、三重結合から二重結合、またはその逆）により生じる２つ以上の相互変換可能な化合物を指す。互変異性体の正確な比率は、温度、溶媒、及びｐＨが含まれる、幾つかの因子に依存する。互変異性化（すなわち、互変異性対をもたらす反応）は、酸または塩基により触媒され得る。例示的な互変異性化としては、ケトからエノール、アミドからイミド、ラクタムからラクチム、エナミンからイミン、及びエナミンから（異なる）エナミンへの互変異性化が挙げられる。
同じ分子式を有するが、それらの原子の結合の性質もしくは順序または空間内のそれらの原子の配置が異なる化合物は、「異性体」と称されることも理解されたい。空間内のそれらの原子の配置が異なる異性体は、「立体異性体」と称される。互いに鏡像でない立体異性体は、「ジアステレオマー」と称され、互いに重ね合わすことができない鏡像である立体異性体は、「エナンチオマー」と称される。化合物が不斉中心を有する場合、例えば、当該化合物は４つの異なる基に結合しており、一対のエナンチオマーが可能である。エナンチオマーは、その不斉中心の絶対配置により特徴付けられ得、Ｃａｈｎ及びＰｒｅｌｏｇのＲ－及びＳ－順序付け規則により記載されるか、または分子が偏光面を回転させ、右旋性または左旋性（すなわち、それぞれ（＋）または（－）異性体）として指定される方法により記載される。キラル化合物は、個々のエナンチオマーとして、またはそれらの混合物として存在し得る。等しい比率のエナンチオマーを含有する混合物は「ラセミ混合物」と称される。
多形体：用語「多形体」は、化合物（またはその塩、水和物、もしくは溶媒和物）の特定の結晶充填配列での結晶形態を指す。全ての多形体は、同じ元素組成を有する。異なる結晶形態は、通常、異なるＸ線回折パターン、赤外線スペクトル、融点、密度、硬度、結晶形状、光学的及び電気的特性、安定性、ならびに溶解性を有する。再結晶溶媒、結晶速度、保存温度、及び他の要因により、１つの結晶形態が支配的となり得る。化合物の種々の多形体は、異なる条件下での結晶化により調製され得る。
用語「結晶質」または「結晶形態」は、実質的に三次元秩序を示す固体形態を指す。ある特定の実施形態では、固体の結晶形態は実質的に非晶質でない固体形態である。ある特定の実施形態では、結晶形態の粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）パターンは、１つ以上の鋭く明瞭なピークを含む。
用語「共結晶」は、少なくとも２つの異なる成分（例えば、本明細書において開示される化合物及び酸）を含む結晶構造を指し、ここで、当該成分の各々は独立して、原子、イオン、または分子である。ある特定の実施形態では、いずれの成分も溶媒ではない。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの成分が溶媒である。本明細書において開示される化合物及び酸の共結晶は、本明細書において開示される化合物及び酸から形成される塩と異なる。塩の場合、酸から本明細書において開示される化合物へのプロトン移動（例えば、完全プロトン移動）が室温で起こるような様式で、本明細書において開示される化合物が酸と複合体を形成している。しかしながら、共結晶の場合、酸から本明細書において開示される化合物へのプロトン移動が室温で容易に起こらないような様式で、本明細書において開示される化合物が酸と複合体を形成している。ある特定の実施形態では、共結晶において、酸から本明細書において開示される化合物へのプロトン移動が全く起こらない。ある特定の実施形態では、共結晶において、酸から本明細書において開示される化合物への部分的なプロトン移動が起こる。共結晶は、本明細書において開示される化合物の特性（例えば、溶解性、安定性、製剤の容易さ、または製剤化の容易さ）を改善するのに有用であり得る。
用語「同位体」は、所与の元素の全ての同位体が当該元素の各原子において同数のプロトンを共有するが、それらの同位体は中性子の数が異なるような特定の化学元素の変種を指す。
投与が企図される「対象」としては、限定されるものではないが、ヒト（すなわち、任意の年齢群の男性または女性、例えば、小児の対象（例えば、乳幼児、児童、青年）または成人の対象（例えば、若年成人、中年成人、または高齢成人））及び／または非ヒト動物、例えば、哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル）；商業的に重要な哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、及び／またはイヌ）及び鳥類（例えば、商業的に重要な鳥類、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、及び／またはシチメンチョウ）が挙げられる。ある種の実施形態では、動物は、哺乳動物である。動物は、雄または雌、かつ任意の発生段階であり得る。非ヒト動物は、トランスジェニック動物であり得る。「患者」は、疾患の処置を必要とするヒト対象を指す。
用語「投与する」、「投与すること」、または「投与」は、移植すること、吸収すること、摂取すること、注入すること、吸入すること、または別様に本発明の化合物またはその医薬組成物を導入することを指す。
用語「処置」、「処置する」、及び「処置すること」は、本明細書に記載される「病態」（例えば、疾患、障害、もしくは状態、またはそれらの１つ以上の徴候もしくは症状）を後退させること、軽減すること、その発症を遅延させること、またはその進行を阻害することを指す。幾つかの実施形態では、処置は、１つ以上の徴候または症状が発症したか、または観察された後で投与され得る。他の実施形態では、処置は、疾患または状態の徴候または症状の非存在下で施され得る。例えば、症状発現前に（例えば、症状歴を考慮して、及び／または遺伝因子または他の感受性因子を考慮して）感受性の個体に処置を施してもよい。処置は、例えば、再発を遅延させるか、または予防するために、症状が消退した後も継続され得る。
用語「生体試料」は、組織試料（例えば、組織切片及び組織の針生検）；細胞試料（例えば、細胞学的スミア（例えば、パップスメアまたは血液スミア）または顕微解剖により取得される細胞の試料）；生物体全体の試料（例えば、酵母または細菌の試料）；または細胞分画、細胞片、もしくは細胞小器官（例えば、細胞を溶解させ、遠心分離または別の方法によりその成分を分離することにより取得されるもの）が含まれる、任意の試料を指す。生体試料の他の例としては、血液、血清、尿、精液、糞便、脳脊髄液、間質液、粘液、涙液、汗、膿、生検組織（例えば、外科的生検または針生検により取得される）、乳頭吸引液、母乳、膣液、唾液、スワブ（例えば、口腔スワブ）、または一次生体試料に由来する生体分子を含有する任意の物質が挙げられる。
核酸の特徴
本明細書の他箇所で記載されるように、本開示は、グリカン部分を含む修飾核酸を含む医薬組成物を提供する。本明細書で使用する場合、用語「修飾核酸」は、天然に存在する核酸と比較して１つ以上の方法で化学的に改変された核酸を指す。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、核酸のグリカン部分へのコンジュゲーションを可能にするように修飾される。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、核酸のグリカン部分へのコンジュゲーションを可能にする、ヌクレオチドではない化学的ハンドルを含む。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、第２のクリックケミストリーハンドルを含むグリカン部分とのコンジュゲーションを可能にするクリックケミストリーハンドルを含む。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、ヌクレオチドの塩基に結合したクリックケミストリーハンドルを含む。修飾核酸が直鎖状核酸を含む幾つかの実施形態では、修飾核酸は、ポリヌクレオチド鎖の末端に結合したクリックケミストリーハンドルを含む。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、核酸の骨格に結合したクリックケミストリーハンドルを含む。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、天然に存在するバージョンの類似した核酸と比較して核酸の安定性の増加をもたらすように修飾されている。幾つかの実施形態では、本開示は、対応する未修飾核酸と比較して増加した安定性を有する修飾核酸を作製するための、当該技術分野において公知のあらゆる糖、骨格、及び塩基修飾を意図する。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、Ｏｃｈｏａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０２０，２５（２０），４６５９（これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている少なくとも１つの化学修飾を含む。例えば、修飾核酸は、Ｏｃｈｏａ，ｅｔ ａｌ．により記載されている、その中で開示される図１及び表１における少なくとも１つの修飾を含み得る。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、修飾された骨格を含むｓｉＲＮＡである。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、免疫応答を最小限にするように修飾されている。例えば、修飾核酸は、対象に投与した際に未修飾ｍＲＮＡと比較して軽減された免疫原性反応をもたらす１つ以上の化学的改変を含む修飾ｍＲＮＡであり得る。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、環状ＲＮＡであり、ここで、当該環状ＲＮＡは、セルフライゲーションされていることにより、キャップまたは尾部を欠くことによって、天然に存在するＲＮＡと比較して修飾されている。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、キャッピングされたＲＮＡであり、これにより、５’及び／または３’末端が化学的改変によりキャッピングされている。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、非天然ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチド（例えば、非天然ヌクレオチド）の例としては、限定されるものではないが、ジアミノプリン、Ｓ２Ｔ、５－フルオロウラシル、５－ブロムウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルキューオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｄ４６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６－ジアミノプリンが挙げられる。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、少なくとも１個の非天然ヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、非天然になるように、塩基のうちの少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％が修飾される。幾つかの実施形態では、約１００％または全ての塩基が修飾される。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、少なくとも１個のリン酸基に修飾を含む。幾つかの実施形態では、ホスフェート結合のうちの少なくとも１つは、ホスホロチオネートである。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、少なくとも１個の糖基に修飾を含む。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、少なくとも１個の２－フルオロリボースを含む。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、少なくとも１個の２－メトキシリボースを含む。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、なんらの非天然ヌクレオチドも含まない。例えば、修飾核酸は、天然に存在するヌクレオチドのみを含む核酸部分を含み、修飾核酸は、当該核酸部分がグリカン部分にコンジュゲートされているという点でのみ修飾されている。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、修飾ＲＮＡまたは修飾ＤＮＡを含む。
幾つかの実施形態では、医薬組成物は、裸の修飾核酸である修飾核酸を含む。本明細書で使用する場合、用語「裸の」は、ナノ粒子、例えば、限定されるものではないが、脂質ナノ粒子で製剤化されていない修飾核酸を指す。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、約１５、約２０、約２５、約３０、約５０、約１００、約５００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、もしくは約１００００ヌクレオチド、またはそれらの間で任意の数値及び範囲のヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約５００、少なくとも約１０００、少なくとも約１５００、少なくとも約２０００、少なくとも約２５００、少なくとも約３０００、少なくとも約４０００、少なくとも約５０００、少なくとも約６０００、少なくとも約７０００、少なくとも約８０００、少なくとも約９０００、または少なくとも約１００００ヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、１００００個超のヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、約１５個未満、約２０個未満、約２５個未満、約３０個未満、約５０個未満、約１００個未満、約５００個未満、約１０００個未満、約１５００個未満、約２０００個未満、約２５００個未満、約３０００個未満、約４０００個未満、約５０００個未満、約６０００個未満、約７０００個未満、約８０００個未満、約９０００個未満、または約１００００個未満のヌクレオチドを含む。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、１個以上の非天然ヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、それらが修飾核酸とグリカン部分との間で共有結合を形成することができるように修飾されている１個以上の非天然ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含む。グリカン部分へのコンジュゲーションを可能にする１個以上の修飾ヌクレオチドは、核酸の任意の位置に見出され得る。ある特定の実施形態では、グリカンで修飾されたヌクレオチドの数は異なる。ある特定の実施形態では、グリカンで修飾されたヌクレオチドの数は、１である。他の実施形態では、グリカンで修飾されたヌクレオチドの数は、グリカンで修飾された１個のヌクレオチドからグリカンで修飾された全てのヌクレオチドまでのどこかの範囲である。他の実施形態では、グリカンで修飾されたヌクレオチドの数は、グリカンで修飾された１個のヌクレオチドからグリカンで修飾された全てのヌクレオチドまでのどこかの範囲、ならびにそれらの間の任意の範囲及び個々の値である。ある特定の実施形態では、グリカンで修飾されたヌクレオチドの数は、２である。ある特定の実施形態では、グリカンで修飾されたヌクレオチドの数は、３である。ある特定の実施形態では、グリカンで修飾されたヌクレオチドの数は、５である。ある特定の実施形態では、グリカンで修飾されたヌクレオチドの数は、１０である。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、少なくとも１個の化学修飾された窒素含有塩基を含む。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上の化学修飾された窒素含有塩基を含む。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、修飾ＲＮＡを含む。本開示全体を通して、本明細書に記載される任意の実施形態では、このような実施形態が修飾核酸に言及する場合、当該実施形態が修飾ＲＮＡにも適用可能であることを理解されたい。修飾ＲＮＡは、全てがヘアピンＲＮＡまたは短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、異種核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）、コードＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（長鎖ｎｃＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ）、サテライトＲＮＡ、ウイルスサテライトＲＮＡ、シグナル認識粒子ＲＮＡ、細胞質低分子ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ポリイノシン酸、リボザイム、フレキシザイム、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、スプライスリーダーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ウイルスサテライトＲＮＡ、環状ＲＮＡ、裸のＲＮＡ、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、カハール小体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、Ｘｉｓｔ ＲＮＡ、またはＨＯＴＡＩＲ ＲＮＡであり得る。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、マイクロＲＮＡ結合部分を含む修飾ＲＮＡを含む。幾つかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、ポリペプチドをコードする配列を含む。幾つかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、裸の修飾ＲＮＡである。幾つかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、直鎖状ＲＮＡである。幾つかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、環状ＲＮＡである。幾つかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。幾つかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。
幾つかの実施形態では、ｇｌｙｃｏＲＮＡは、キメラ抗原受容体をコードする配列を含む。キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み得る。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。幾つかの実施形態では、抗原結合ドメインは、膜貫通ドメインに連結されており、当該膜貫通ドメインは、キメラ抗原受容体を産生するように細胞内シグナル伝達ドメインに連結されている。幾つかの実施形態では、抗原結合ドメインは、腫瘍抗原、免疫寛容原、もしくは病原体抗原に結合するか、または抗原は、腫瘍抗原もしくは病原体抗原である。幾つかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体またはその抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｄＡｂ）である。幾つかの実施形態では、抗原結合ドメインは、二重特異性抗体である。幾つかの実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに結合する第１の免疫グロブリン可変ドメイン、及び第２のエピトープに結合する第２の免疫グロブリン可変ドメインを有する。幾つかの実施形態では、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、同一である。幾つかの実施形態では、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、異なる。
幾つかの実施形態では、膜貫通ドメインは、結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを連結する。幾つかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒンジタンパク質（例えば、免疫グロブリンヒンジ）、ポリペプチドリンカー（例えば、ＧＳリンカー）、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ、ＣＤ８ａヒンジ、またはスペーサーである。
幾つかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも一部を含む。幾つかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシンモチーフを含む。幾つかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲｌｌａ、ＦｃＲβ（ＦｃεＲｉｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、またはそれらの任意の組み合わせの少なくとも一部を含む。幾つかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを更に含む。
幾つかの実施形態では、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子、または活性化ＮＫ細胞受容体タンパク質のうちの少なくとも１つ以上を含む。幾つかの実施形態では、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、０Ｘ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮ ＣＥ／ＴＲＡＮＫＬ、ＣＤ２２６、ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ８４、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２２９、ＣＤ １６０、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ１６２、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、Ｂ７－Ｈ３、またはＣＤ８３に結合するリガンドのうちの少なくとも１つ以上を含む。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、修飾ＤＮＡを含む。本開示全体を通して、本明細書に記載される任意の実施形態では、このような実施形態が修飾核酸に言及する場合、当該実施形態が修飾ＤＮＡにも適用可能であることを理解されたい。幾つかの実施形態では、修飾ＤＮＡは、裸の修飾ＤＮＡである。幾つかの実施形態では、修飾ＤＮＡは、直鎖状ＤＮＡである。幾つかの実施形態では、修飾ＤＮＡは、環状ＤＮＡである。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、表１に記載されるものから選択されるヌクレオチド配列を含む。表１に記載される修飾核酸は、任意の塩基修飾、任意の糖修飾、及び／または任意のホスフェート修飾を含み得る。表１における用語「位」は、核酸内の位置を指す。
Figure 2024514954000003
Figure 2024514954000004
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Figure 2024514954000009
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Figure 2024514954000011
Figure 2024514954000012
Figure 2024514954000013
Figure 2024514954000014
Figure 2024514954000015
Figure 2024514954000016
Figure 2024514954000017
Figure 2024514954000018
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、表１のものから選択される配列に対する少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも約９３％の配列同一性、少なくとも約９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、約９６％の配列同一性、約９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、またはそれ以上の配列同一性を有する配列を有するヌクレオチドを含む。
グリカンの特徴
本明細書の他箇所で記載されるように、本開示は、グリカン部分を含む修飾核酸を含む医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、少なくとも１個の単糖を含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、少なくとも２個の単糖を含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、少なくとも３個の単糖を含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、少なくとも４個の単糖を含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、少なくとも５個の単糖を含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、少なくとも６個の単糖を含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、少なくとも７個の単糖を含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、少なくとも８個の単糖を含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、少なくとも９個の単糖を含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、少なくとも１０個の単糖を含む。グリカン部分は、少なくとも約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、またはそれ以上の単糖を含み得る。ある特定の実施形態では、修飾核酸上のグリカン当たりの糖の数は異なる。ある特定の実施形態では、修飾核酸上のグリカン当たりの糖の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０超である。ある特定の実施形態では、修飾核酸上のグリカンのうちの少なくとも１個または全てが、少なくとも約１０個の糖残基を含有する。ある特定の実施形態では、修飾核酸上のグリカンのうちの少なくとも１個または全てが、少なくとも約９個の糖残基を含有する。ある特定の好ましい実施形態では、修飾核酸上のグリカンのうちの少なくとも１個または全てが、少なくとも約６個の糖残基を含有する。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、ＧｌｃＮＡｃ、マンノース、ガラクトース、シアル酸、及びフコース、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、シアル酸、フコース、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、シアル酸を含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、フコースを含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、マンノースを含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、ＧｌｃＮＡｃ（Ｎ－アセチルグルコサミン）を含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、ガラクトースを含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、ＧｌｃＮＡｃ残基に連結されたフコースを含む。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、二分岐グリカンを含み、ここで、当該二分岐グリカンは、第１の末端残基及び第２の末端残基を含む。幾つかの実施形態では、二分岐グリカンの第１の末端残基または第２の末端残基のうちの少なくとも１つは、シアル酸を含む。幾つかの実施形態では、二分岐グリカンの第１の末端残基または第２の末端残基のうちの少なくとも１つは、１つ以上のポリシアル酸末端修飾を含むシアル酸残基を含む。幾つかの実施形態では、二分岐グリカンの第１の末端残基または第２の末端残基のうちの少なくとも１つは、フコースを含む。幾つかの実施形態では、二分岐グリカンの第１の末端残基または第２の末端残基のうちの一方はフコースを含み、他方はシアル酸を含む。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、三分岐グリカンを含み、ここで、当該三分岐グリカンは、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む。幾つかの実施形態では、三分岐グリカンの第１の末端残基、第２の末端残基、または第３の末端残基のうちの少なくとも１つは、シアル酸を含む。幾つかの実施形態では、三分岐グリカンの第１の末端残基、第２の末端残基、または第３の末端残基のうちの少なくとも１つは、１つ以上のポリシアル酸末端修飾を含むシアル酸残基を含む。幾つかの実施形態では、三分岐グリカンの第１の末端残基または第２の末端残基のうちの少なくとも１つは、フコースを含む。幾つかの実施形態では、三分岐グリカンの第１の末端残基、第２の末端残基、または第３の末端残基のうちの少なくとも１つは、シアル酸を含み、残りの末端残基のうちの少なくとも１つは、フコースを含む。
グリカン部分が二分岐グリカンまたは三分岐グリカンを含む幾つかの実施形態では、グリカンは、グリカンのコア領域または基部領域にＧｌｃＮＡｃ残基に連結されたフコースを含む。グリカン部分が二分岐グリカンまたは三分岐グリカンを含む幾つかの実施形態では、グリカンは、グリカンの樹状領域、分岐領域、またはアーム領域のＧｌｃＮＡｃ残基に連結されたフコースを含む。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、バイセクト型グリカンを含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、単糖に結合したＧｌｃＮＡｃ部分を含む二分岐グリカンであって、当該単糖が当該二分岐グリカンの２つの分枝を連結しており、これにより、バイセクト型グリカンを形成している、当該二分岐グリカンを含む。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、グリカンが窒素原子を介して修飾核酸にコンジュゲートされているようなＮ結合型グリカンである。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、非還元末端にＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含み、非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合したコンジュゲーションハンドルを更に含むグリカンを含む。本明細書で使用する場合、用語「非還元末端ＧｌｃＮＡｃ」及び「非還元末端のＧｌｃＮＡｃ」は、グリカン部分の一部であり、当該グリカンの末端を形成するＧｌｃＮＡｃ単糖残基を指す。実例として、例示的な以下のグリカンＧ－１では、ＩＵＰＡＣ名の最後の「ＧｌｃＮＡｃ（ｂ１－」は、非還元末端ＧｌｃＮＡｃである。
ＧｌｃＮＡｃ（ｂ１－２）Ｍａｎ（ａ１－３）［ＧｌｃＮＡｃ（ｂ１－２）Ｍａｎ（ａ１－６）］Ｍａｎ（ｂ１－４）ＧｌｃＮＡｃ（ｂ１－４）［Ｆｕｃ（ａ１－６）］ＧｌｃＮＡｃ（ｂ１－
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、非還元末端にＧｌｃＮＡｃを含み、グリカンの非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合したアスパラギン残基を更に含むグリカンを含む。幾つかの実施形態では、アスパラギン残基は、以下に示すようにグリカンの非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合しており、
Figure 2024514954000019
 式中、＊は、グリカンの非還元末端ＧｌｃＮＡｃへの結合点を示し、＊＊は、修飾ＲＮＡ、または修飾ＲＮＡに結合したリンカー基への結合点を示す。
幾つかの実施形態では、アスパラギン残基は、以下に示すように非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合しており、
Figure 2024514954000020
 式中、＊は、グリカンの非還元末端ＧｌｃＮＡｃへの結合点を示す。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、非還元末端にＧｌｃＮＡｃを含み、非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合したアルギニン残基を更に含むグリカンを含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、非還元末端にＧｌｃＮＡｃを含み、直接的にまたはリンカー基を介して非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合したクリックケミストリーアジドハンドルを更に含むグリカンを含む。幾つかの実施形態では、非還元末端ＧｌｃＮＡｃ及びアジドを架橋しているリンカー基は、１個以上のポリエチレングリコールユニットを含む。幾つかの実施形態では、非還元末端ＧｌｃＮＡｃ及びアジドを架橋しているリンカー基は、１～１０個のＰＥＧユニットを含む。幾つかの実施形態では、非還元末端ＧｌｃＮＡｃ及びアジドを架橋しているリンカー基は、１個のＰＥＧユニットを含む。幾つかの実施形態では、非還元末端ＧｌｃＮＡｃ及びアジドを架橋しているリンカー基は、２個のＰＥＧユニットを含む。幾つかの実施形態では、非還元末端ＧｌｃＮＡｃ及びアジドを架橋しているリンカー基は、３個のＰＥＧユニットを含む。幾つかの実施形態では、非還元末端ＧｌｃＮＡｃ及びアジドを架橋しているリンカー基は、４個のＰＥＧユニットを含む。幾つかの実施形態では、非還元末端ＧｌｃＮＡｃ及びアジドを架橋しているリンカー基は、５個のＰＥＧユニットを含む。
幾つかの実施形態では、非還元末端ＧｌｃＮＡｃ及びアジドを架橋しているリンカー基は、１個以上のペプチド残基を含む。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、非還元末端にＧｌｃＮＡｃを含み、非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合したコンジュゲーションハンドルを更に含むグリカンを含み、ここで、当該コンジュゲーションハンドルは、アミノオキシ－ＰＥＧ３－アジド：
Figure 2024514954000021
 を含む、または全体として、アミノオキシ－ＰＥＧ３－アジドとグリコ核酸コンジュゲートの核酸部分に結合したアルキン部分との間のクリックケミストリー反応の生成物であるグリコ核酸コンジュゲートに関連する。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、非還元末端にＧｌｃＮＡｃを含み、以下に示すような非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合したアミノオキシ－ＰＥＧ３－アジドを更に含むグリカンを含み、
Figure 2024514954000022
 式中、＊は、グリカンの非還元末端ＧｌｃＮＡｃへの結合点を示す。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、非還元末端にＧｌｃＮＡｃを含み、以下に示すような非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合したリンカーを更に含むグリカンを含み、
Figure 2024514954000023
 式中、＊は、グリカンの非還元末端ＧｌｃＮＡｃへの結合点を示し、＊＊は、修飾ＲＮＡ、または修飾ＲＮＡに結合したリンカー基への結合点を示す。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、図７Ａ～７Ｃに示されるものから選択されるグリカンを含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、図７Ａに示されるものから選択されるグリカンを含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、図７Ｂに示されるものから選択されるグリカンを含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、図７Ｃに示されるものから選択されるグリカンを含む。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、以下の表２Ａに記載されるものから選択されるグリカンを含む。
Figure 2024514954000024
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、単一の単糖の置き換えにより表２Ａに列挙されるグリカンと異なるグリカンであるか、またはそれを含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、２個の単糖の置き換えにより表２Ａに列挙されるグリカンと異なるグリカンであるか、またはそれを含む。非限定的な例として、グリカン部分は、マンノースがガラクトースと置き換えられている（またはその逆である）が、一方で残りのグリカン部分は変化なしである、表２Ａに列挙されるグリカンを含み得る。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合したコンジュゲーションハンドルを更に含む、表２Ａに記載されるグリカンを含む。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合したアスパラギン残基を更に含む、表２Ａに記載されるグリカンを含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、以下に示すような非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合したアスパラギン残基を更に含む、表２Ａに記載されるグリカンのいずれかで例示されるグリカンを含み、
Figure 2024514954000025
 式中、＊は、グリカンの非還元末端ＧｌｃＮＡｃへの結合点を示し、＊＊は、修飾ＲＮＡ、または修飾ＲＮＡに結合したリンカー基への結合点を示す。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、以下に示すような非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合したアスパラギン残基を更に含む、表２Ａに記載されるグリカンを含み、
Figure 2024514954000026
 式中、＊は、グリカンの非還元末端ＧｌｃＮＡｃへの結合点を示す。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合したアルギニン残基を更に含む、表２Ａに記載されるグリカンを含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、直接的にまたはリンカー基を介して非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合したクリックケミストリーアジドハンドルを更に含む、表２Ａに記載されるグリカンを含む。幾つかの実施形態では、非還元末端ＧｌｃＮＡｃ及びアジドを架橋しているリンカー基は、１個以上のペプチド残基を含む。幾つかの実施形態では、非還元末端ＧｌｃＮＡｃ及びアジドを架橋しているリンカー基は、１個以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ユニットを含む。幾つかの実施形態では、非還元末端ＧｌｃＮＡｃ及びアジドを架橋しているリンカー基は、１～１０個のＰＥＧユニットを含む。幾つかの実施形態では、非還元末端ＧｌｃＮＡｃ及びアジドを架橋しているリンカー基は、１個のＰＥＧユニットを含む。幾つかの実施形態では、非還元末端ＧｌｃＮＡｃ及びアジドを架橋しているリンカー基は、２個のＰＥＧユニットを含む。幾つかの実施形態では、非還元末端ＧｌｃＮＡｃ及びアジドを架橋しているリンカー基は、３個のＰＥＧユニットを含む。幾つかの実施形態では、非還元末端ＧｌｃＮＡｃ及びアジドを架橋しているリンカー基は、４個のＰＥＧユニットを含む。幾つかの実施形態では、非還元末端ＧｌｃＮＡｃ及びアジドを架橋しているリンカー基は、５個のＰＥＧユニットを含む。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合したコンジュゲーションハンドルを更に含む、表２Ａに記載されるグリカンを含み、ここで、当該コンジュゲーションハンドルは、アミノオキシ－ＰＥＧ３－アジド：
Figure 2024514954000027
 を含む、または全体として、アミノオキシ－ＰＥＧ３－アジドとグリコ核酸コンジュゲートの核酸部分に結合したアルキン部分との間のクリックケミストリー反応の生成物であるグリコ核酸コンジュゲートに関連する。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、以下に示すような非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合したアミノオキシ－ＰＥＧ３－アジドを更に含む、表２Ａに記載されるグリカンを含み、
Figure 2024514954000028
 式中、＊は、グリカンの非還元末端ＧｌｃＮＡｃへの結合点を示す。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、以下に示すような非還元末端ＧｌｃＮＡｃに共有結合したリンカーを更に含む、表２Ａに記載されるグリカンを含み、
Figure 2024514954000029
 式中、＊は、グリカンの非還元末端ＧｌｃＮＡｃへの結合点を示し、＊＊は、修飾ＲＮＡ、または修飾ＲＮＡに結合したリンカー基への結合点を示す。
幾つかの実施形態では、グリカン部分は、以下の表２Ｂに記載されるものから選択されるアジド官能化グリカンを含む。
Figure 2024514954000030
Figure 2024514954000031
Figure 2024514954000032
グリカン－核酸コンジュゲーションの特徴
上記のように、一態様では、本開示は、ｉ）修飾核酸；及びｉｉ）修飾核酸にコンジュゲートされた少なくとも１個のグリカン部分を含むグリコ核酸を提供する。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、窒素原子を介してグリカン部分にコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、アミド結合を介してグリカン部分にコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、グリカン部分は、Ｎ結合型グリカンであり、ここで、当該グリカンは、Ｎ－アセチルグルコサミン残基を介してアスパラギンまたはアルギニン残基のアミド窒素で結合している。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、クリックケミストリー反応によりグリカンにコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、修飾核酸部分及びグリカン部分が、第１及び第２のハンドルの間のクリックケミストリー反応により形成される化学部分により共有結合されるように、当該修飾核酸部分は当該第１のクリックケミストリーハンドルを含み、当該グリカン部分は当該第２のクリックケミストリーハンドルを含む。幾つかの実施形態では、修飾核酸部分及びグリカン部分が、アジドハンドルとアルキンハンドルとの間のクリックケミストリー反応により形成される化学部分により共有結合されるように、当該修飾核酸部分は当該アルキンハンドルを含み、当該グリカン部分は当該アジドハンドルを含む。幾つかの実施形態では、修飾核酸部分及びグリカン部分が、アジドハンドルとアルキンハンドルとの間のクリックケミストリー反応により形成されるトリアゾールにより共有結合されるように、当該修飾核酸部分は当該アルキンハンドルを含み、当該グリカン部分は当該アジドハンドルを含む。幾つかの実施形態では、修飾核酸部分及びグリカン部分が、アジドハンドルとアルキンハンドルとの間のクリックケミストリー反応により形成される化学部分により共有結合されるように、当該修飾核酸部分は当該アジドハンドルを含み、当該グリカン部分は当該アルキンハンドルを含む。幾つかの実施形態では、修飾核酸部分及びグリカン部分が、アジドハンドルとアルキンハンドルとの間のクリックケミストリー反応により形成されるトリアゾールにより共有結合されるように、当該修飾核酸部分は当該アジドハンドルを含み、当該グリカン部分は当該アルキンハンドルを含む。
幾つかの実施形態では、リボースが、クリックケミストリー反応を受けることができるアジド部分で修飾されるように、修飾核酸部分は、当該リボースの修飾を含む。幾つかの実施形態では、リボースが、クリックケミストリー反応を受けることができるアルキン部分で修飾されるように、修飾核酸部分は、当該リボースの修飾を含む。幾つかの実施形態では、リボースは、２’ＯＨ、３’ＯＨ、及び５’ＯＨから選択される位置で修飾される。
幾つかの実施形態では、グリカン部分の非還元末端は、クリックケミストリー反応を受けることができるアジド部分を含む。幾つかの実施形態では、グリカン部分の非還元末端は、クリックケミストリー反応を受けることができるアルキン部分を含む。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、強い非共有結合性相互作用によりグリカンにコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、高親和性ビオチン／ストレプトアビジン相互作用によりグリカンにコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、ビオチン及びストレプトアビジン部分が相互作用するように、修飾核酸は当該ビオチン部分を含み、グリカンは当該ストレプトアビジン部分を含む。幾つかの実施形態では、ビオチン及びストレプトアビジン部分が相互作用するように、修飾核酸は当該ストレプトアビジン部分を含み、グリカンは当該ビオチン部分を含む。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、修飾核酸の末端に共有結合したリンカー基を介してグリカンにコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、ポリヌクレオチドの中央の化学修飾ヌクレオチドに共有結合したリンカーを介してグリカンにコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、修飾核酸は、ポリヌクレオチドの中央の２個のヌクレオチドの間に挿入された化学的ハンドルを介してグリカンにコンジュゲートされる。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、核酸とグリカン部分との間に切断可能なリンカーを含む。幾つかの実施形態では、切断可能なリンカーは、ｐＨ依存的に切断可能な結合である。幾つかの実施形態では、切断可能なリンカーは、ジスルフィド結合である。幾つかの実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチド切断部位である。幾つかの実施形態では、切断可能なリンカーは、ｃｉｔ－ｖａｌリンカーである。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、２種以上のグリカン部分とコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、２種以上のグリカン部分は、異なるグリカン部分である。幾つかの実施形態では、核酸は、２種以上の化学的に異なるグリカンへのカップリングを可能にする直交型修飾で修飾されたヌクレオチドを含む。例えば、核酸は、２種以上の化学的に異なるグリカンへの選択的なコンジュゲーションを可能にする２種以上の異なるコンジュゲーションハンドルで修飾され得、ここで、各々のグリカンは、異なる相補的なコンジュゲーションハンドルを含む。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、生体直交型反応により１種以上のグリカンにコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、生体直交型反応は、生体直交型クリックケミストリー反応である。幾つかの実施形態では、生体直交型反応は、歪み促進型アジド－アルキン環化付加を含む。幾つかの実施形態では、生体直交型反応は、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン及びテトラジンの反応を含む。
例示的なグリカン－核酸コンジュゲート
一態様では、本開示は、式（Ｉ）：
Ａ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
の化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体であって、式中、
Ａは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の核酸であり、
Ｂは、第２のクリックケミストリーハンドルを含むアスパラギン結合型グリカン（Ｎ－グリカン）であり、
Ｌは、第１のクリックケミストリーハンドルと第２のクリックケミストリーハンドルとの間の生体直交型クリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。
式（Ｉ）の特定の実施形態では、Ａはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の核酸であり、Ｂはアスパラギン結合型グリカン（Ｎ－グリカン）であり、Ｌはリンカーを含む、当該化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体を提供する。ある特定の実施形態では、Ｌは、本明細書に記載される任意のリンカーである。
式（Ｉ）の特定の実施形態では、Ａはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の核酸であり、Ｂはアスパラギン結合型グリカン（Ｎ－グリカン）であり、Ｌは、第１のクリックケミストリーハンドルと第２のクリックケミストリーハンドルとの間の生体直交型クリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。
式（Ｉ）の特定の実施形態では、Ａはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の核酸であり、Ｂはアスパラギン結合型グリカン（Ｎ－グリカン）であり、Ｌは、第１のクリックケミストリーハンドルと第２のクリックケミストリーハンドルとの間の生体直交型クリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含み、ここで、当該第１のクリックケミストリーハンドルは、当該クリックケミストリー反応の前にＡに結合され、当該第２のクリックケミストリーハンドルは、当該クリックケミストリー反応の前にＢに結合された。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、（例えば、第１のクリックケミストリーハンドルを含む）ＤＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、（例えば、第１のクリックケミストリーハンドルを含む）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡまたはｃｐＤＮＡ）、マイクロサテライトＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡまたはｍＤＮＡ）、キネトプラストＤＮＡ（ｋＤＮＡ）、プロウイルス、リゾゲン、反復ＤＮＡ、サテライトＤＮＡ、またはウイルスＤＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、第１のクリックケミストリーハンドルを含む、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡまたはｃｐＤＮＡ）、マイクロサテライトＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡまたはｍＤＮＡ）、キネトプラストＤＮＡ（ｋＤＮＡ）、プロウイルス、リゾゲン、反復ＤＮＡ、サテライトＤＮＡ、またはウイルスＤＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、以下の配列を含むＤＮＡである：
５’－ＧＧＣ ＴＧＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ＴＧＣ ＡＧＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＡＣ ＡＡＣ ＴＡＡ ＴＴＧ ＡＴＣ ＡＣＡ ＡＣＣ ＡＧＴ ＴＡＣ ＡＧＡ ＴＴＴ ＣＴ／ｉ５ＯｃｔｄＵ／ＴＧＴ ＴＣＣ ＴＴＣ ＴＣＣ ＡＣＴ ＣＣＣ ＡＣＴ ＧＣＴ ＴＣＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＴＡＧ ＣＣＴ Ｔ－３’（配列番号１）。
ある特定の実施形態では、Ａは、配列番号１の全長配列に対する少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を有する。ある特定の実施形態では、Ａは、配列番号１の全長配列に対する少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有する。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、第１のクリックケミストリーハンドルを含む低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、（例えば、２’位に）修飾を含むｓｉＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、２’ＯＭｅ修飾、（例えば、２’での）フッ素修飾、ホスホロチオエート修飾からなる群から選択される修飾を含むｓｉＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、２’ＯＭｅ修飾、フッ素修飾、ホスホロチオエート修飾からなる群から選択される修飾を含み、第１のクリックケミストリーハンドルも含むｓｉＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、ｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、ガイドＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むガイドＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）である。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、第１のクリックケミストリーハンドルを含む環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）である。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、アプタマーＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むアプタマーＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡもしくは短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、異種核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）、コードＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（長鎖ｎｃＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ）、サテライトＲＮＡ、ウイルスサテライトＲＮＡ、シグナル認識粒子ＲＮＡ、細胞質低分子ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ポリイノシン酸、リボザイム、フレキシザイム、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、スプライスリーダーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、またはウイルスサテライトＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、第１のクリックケミストリーハンドルを含む、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡもしくは短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、異種核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）、コードＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（長鎖ｎｃＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ）、サテライトＲＮＡ、ウイルスサテライトＲＮＡ、シグナル認識粒子ＲＮＡ、細胞質低分子ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ポリイノシン酸、リボザイム、フレキシザイム、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、スプライスリーダーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、またはウイルスサテライトＲＮＡである。ある特定の実施形態では、Ａは、以下の全長配列に対する少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を有する：
ＡＧＵＵＧＧＴＣＣＧＡＧＵＧＵＵＧＵＧＧＧＵＵＡＵＵＧＵＵＡＡＧＵＵ／ｉ５ＯｃｔｄＵ／ＡＵＵＵＡＡＣＡＵＵＧＵＣＵ ＣＣＣＣＣＣＡＣＡＡＣＣＧＣＧＣＵＵＧＡＣＵＡＧＣＵＵＧＣＵＧ（配列番号２）。
ある特定の実施形態では、Ａは、配列番号２の全長配列に対する少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有する。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、配列番号２を含むＲＮＡである。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、生体直交型クリックケミストリー反応（例えば、銅触媒アジド－アルキン環化（ＣｕＡＡＣ）、歪み促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン（ＴＣＯ）－テトラジンライゲーション、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン－テトラジンライゲーション、アルケン－テトラジンライゲーション、一級アミンとＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）との間の架橋、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン－アジドカップリング、またはシクロプロパン－アジドカップリング、アジドのＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション）により形成されたリンカーを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、生体直交型クリックケミストリー反応（例えば、銅触媒アジド－アルキン環化（ＣｕＡＡＣ）、歪み促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン（ＴＣＯ）－テトラジンライゲーション、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン－テトラジンライゲーション、一級アミンとＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）との間の架橋、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン－アジドカップリング、またはシクロプロペン－アジドカップリング、アジドのＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション）により形成されたリンカーを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、第１のクリックケミストリーハンドルと第２のクリックケミストリーハンドルとの間の生体直交型クリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、以下の表３または４に示される、第１のクリックケミストリーハンドルと第２のクリックケミストリーハンドルとの間の生体直交型クリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、銅触媒アジド－アルキン環化（ＣｕＡＡＣ）であるクリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、銅フリー反応であるクリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、歪み促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン（ＴＣＯ）－テトラジンライゲーション、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン－テトラジンライゲーション、アジドのＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション、一級アミンとＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）との間の架橋、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン－アジドカップリング、またはシクロプロパン－アジドカップリングであるクリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、歪み促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）であるクリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン（ＴＣＯ）－テトラジンライゲーションまたはｔｒａｎｓ－シクロオクテン－テトラジンライゲーションであるクリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン（ＴＣＯ）－テトラジンライゲーションであるクリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン－テトラジンライゲーションであるクリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、アジドのＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション、一級アミンとＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）との間の架橋、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン－アジドカップリング、またはシクロプロパン－アジドカップリングであるクリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、アジドのＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションであるクリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、一級アミンとＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）との間の架橋であるクリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン－アジドカップリングであるクリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、シクロプロパン－アジドカップリングであるクリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む。
クリックケミストリーハンドル（ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｈａｎｄｌｅ）またはクリックケミストリーハンドル（ｃｌｉｃｋ－ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｈａｎｄｌｅ）は、クリックケミストリー反応に参加し得る反応物質または反応性基であり得る。例えば、歪みアルキン（例えば、シクロオクチン）は、それが歪み促進型環化付加に参加し得るため、クリックケミストリーハンドルである。一般に、クリックケミストリー反応は、互いに反応し得るクリックケミストリーハンドルを含む少なくとも２つの分子を必要とする。互いに反応性であるこのようなクリックケミストリーハンドルペアは、場合により、本明細書においてパートナークリックケミストリーハンドルと称される。例えば、アジドは、シクロオクチンまたは任意の他のアルキンに対するパートナークリックケミストリーハンドルである。本発明の幾つかの態様に従った使用に好適な、例示的なクリックケミストリーハンドル（クリックケミストリーハンドル１及びクリックケミストリーハンドル２）は、本明細書、例えば、表３及び４に記載される。他の好適なクリックケミストリーハンドルは、当業者に公知である。クリックケミストリーによりコンジュゲートされる２つの分子について、当該分子のクリックケミストリーハンドルは、例えば、クリックケミストリーハンドルのうちの一方の反応性部分が、もう一方のクリックケミストリーハンドルの反応性部分と反応して、共有結合を形成し得るという点で、互いに反応性である。クリックケミストリーハンドルのかかる反応ペアは、当業者に周知であり、限定されるものではないが、表３に記載されるものが挙げられる。
Figure 2024514954000033
表３は、クリックケミストリーハンドル及び反応の例を提供する。Ｒ、Ｒ１、及びＲ２は、ソルターゼ認識モチーフを含む任意の分子を表し得る。幾つかの実施形態では、Ｒ、Ｒ１、及びＲ２の各出現は、独立して、ＲＲ－ＬＰＸＴ－［Ｘ］ｙ－または－［Ｘ］ｙ－ＬＰＸＴ－ＲＲであり、ここで、Ｘの各出現は、独立して、任意のアミノ酸残基を表し、ｙの各出現は、０～１０（両端を含む）の整数であり、ＲＲの各出現は、独立して、タンパク質または薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、検出可能な標識、結合作用物質、低分子など）、及び任意に追加のリンカーを表す。
幾つかの実施形態では、金属触媒の非存在下で反応して、共有結合を形成し得るクリックケミストリーハンドルが使用される。かかるクリックケミストリーハンドルは、当業者に周知であり、Ｂｅｃｅｒ，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ａｎｄ Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｅｙｏｎｄ Ｍｅｔａｌ－Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００９） ４８：４９００－４９０８に記載されているクリックケミストリーハンドルが挙げられる。以下の表４を参照のこと。
Figure 2024514954000034
Figure 2024514954000035
ある特定の実施形態では、Ａは、アルキンである第１のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、Ａは、アルキンである第１のクリックケミストリーハンドルを含み、例えばここで、当該アルキンは、以下の構造：
Figure 2024514954000036
 を含む。
ある特定の実施形態では、核酸Ａは、核酸の塩基に結合したアルキンである第１のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、Ａは、以下の構造：
を含み、Ａは、ＲＮＡまたはＤＮＡである。ある特定の実施形態では、Ａは、アルケン（ビニル）である第１のクリックケミストリーハンドルを含み、Ｂは、テトラジンである第２のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、Ａは、Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｃｏｐｅ ｏｆ ＲＮＡ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｖｉｎｙｌ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．” ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１４，８（２０１９）：１６９８－１７０７（参照により本明細書に組み込まれる）におけるアルケン（ビニル）（例えば、Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．における図２Ｂ及び／または２Ｃ）である第１のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、Ａは、Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｃｏｐｅ ｏｆ ＲＮＡ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｖｉｎｙｌ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．” ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１４，８（２０１９）：１６９８－１７０７（参照により本明細書に組み込まれる）の（例えば、Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．における図２Ｂ及び／または２Ｃの）アルケン（ビニル）である第１のクリックケミストリーハンドル、及び（例えば、Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．における図３Ａの）テトラジンである第２のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、Ａは、アルケンである第１のクリックケミストリーハンドルを含み、ここで、Ａは、
Figure 2024514954000038
 を含む。
ある特定の実施形態では、Ｌは、置換もしくは非置換アルキレン、アルクニレン（ａｌｋｎｙｌｅｎｅ）、置換もしくは非置換アルケニレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換カルボシクリレン、置換もしくは非置換ヘテロシクリレン、置換もしくは非置換アリーレン、置換もしくは非置換ヘテロアリーレン、－Ｏ－、－Ｎ（ＲＡ）－、－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＡ－、－ＮＲＡＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲＡＣ（＝Ｏ）ＲＡ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＲＡ－、－ＮＲＡＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲＡＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ）－、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲＡ－、－ＮＲＡＳ（Ｏ）２－、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含み、各ＲＡは、独立して、水素または置換もしくは非置換アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｌは、置換もしくは非置換アルキレン、アルクニレン（ａｌｋｎｙｌｅｎｅ）、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換カルボシクリレン、置換もしくは非置換ヘテロシクリレン、置換もしくは非置換アリーレン、置換もしくは非置換ヘテロアリーレン、－Ｏ－、－Ｎ（ＲＡ）－、－Ｓ－、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含み、各ＲＡは、独立して、水素または置換もしくは非置換アルキルである。
ある特定の実施形態では、Ｌは、置換もしくは非置換アルキレン、アルクニレン（ａｌｋｎｙｌｅｎｅ）、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換カルボシクリレン、置換もしくは非置換ヘテロシクリレン、置換もしくは非置換アリーレン、置換もしくは非置換ヘテロアリーレン、－Ｏ－、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。
ある特定の実施形態では、Ｌは、置換もしくは非置換アルキレン、アルクニレン（ａｌｋｎｙｌｅｎｅ）、置換もしくは非置換カルボシクリレン、置換もしくは非置換ヘテロシクリレン、置換もしくは非置換アリーレン、置換もしくは非置換ヘテロアリーレン、－Ｏ－、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。
ある特定の実施形態では、Ｌは、置換もしくは非置換アルキレン、アルクニレン（ａｌｋｎｙｌｅｎｅ）、置換もしくは非置換カルボシクリレン、置換もしくは非置換ヘテロシクリレン、置換もしくは非置換アリーレン、置換もしくは非置換ヘテロアリーレン、－Ｏ－、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれを含む。
ある特定の実施形態では、Ｌは、置換または非置換ヘテロアリーレンであるか、またはそれを含む。ある特定の実施形態では、Ｌは、置換または非置換５～６員ヘテロアリーレンであるか、またはそれを含む。ある特定の実施形態では、Ｌは、ヘテロアリール環に２～３個の窒素原子を有する置換または非置換５～６員ヘテロアリーレンであるか、またはそれを含む。ある特定の実施形態では、Ｌは、ヘテロアリール環に２～３個の窒素原子を有する置換または非置換５員ヘテロアリーレンであるか、またはそれを含む。ある特定の実施形態では、Ｌは、置換または非置換トリアゾールであるか、またはそれを含む。
ある特定の実施形態では、Ｌは、置換または非置換ヘテロシクリレンを含む。ある特定の実施形態では、Ｌは、置換または非置換カルボシクリレンに縮合した置換または非置換ヘテロシクリレンを含む。ある特定の実施形態では、Ｌは、置換または非置換シクロオクチレンに縮合した置換または非置換ヘテロシクリレンを含む。ある特定の実施形態では、Ｌは、置換または非置換シクロオクチレンに縮合した置換または非置換６員ヘテロシクリレンを含む。ある特定の実施形態では、Ｌは、置換または非置換シクロオクチレンに縮合した置換または非置換ジヒドロピリダジンを含む。ある特定の実施形態では、Ｌは、非置換シクロオクチレンに縮合した置換ジヒドロピリダジンを含む。ある特定の実施形態では、Ｌは、オクタヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジンを含む。
ある特定の実施形態では、Ｌは、置換または非置換カルボシクリレンに縮合した置換または非置換ヘテロアリーレンを含む。ある特定の実施形態では、Ｌは、置換または非置換シクロオクチレンに縮合した置換または非置換ヘテロアリーレンを含む。ある特定の実施形態では、Ｌは、置換または非置換シクロオクチレンに縮合した置換または非置換５員ヘテロアリーレンを含む。ある特定の実施形態では、Ｌは、置換または非置換シクロオクチレンに縮合した置換または非置換トリアゾールを含む。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、以下の式：
Figure 2024514954000039
 のものであり、式中、＊は、Ａへの結合点を示し、＃は、Ｂへの結合点を示す。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、以下の式：
Figure 2024514954000040
 のものであり、式中、＊は、Ａへの結合点を示し、＃は、Ｂへの結合点を示す。ある特定の実施形態では、Ｌは、以下の式：
Figure 2024514954000041
 のものであり、式中、＊は、Ａへの結合点を示し、＃は、Ｂへの結合点を示す。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、核酸Ａの塩基に結合している。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、核酸Ａのリボースの２’ＯＨ位、リボースもしくはデオキシリボースの３’ＯＨ位、またはリボースもしくはデオキシリボースの５’ＯＨ位に結合している。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、核酸Ａのリボースの２’ＯＨ位に結合している。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、核酸Ａのリボースまたはデオキシリボースの３’ＯＨ位に結合している。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、核酸Ａの内部、核酸Ａの３’末端、または核酸Ａの５’末端に結合している。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、核酸Ａの内部に結合している。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）であり、Ｌは、Ａの内部に結合している。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、核酸Ａのリボースまたはデオキシリボースの５’ＯＨ位に結合している。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＬは、Ｎ－グリカンＢの非還元末端に結合している。ある特定の実施形態では、Ｂは、一分岐Ｎ－グリカン、二分岐Ｎ－グリカン、三分岐Ｎ－グリカン、または五分岐Ｎ－グリカンであるＮ－グリカンである。ある特定の実施形態では、Ｂは、一分岐Ｎ－グリカンであるＮ－グリカンである。ある特定の実施形態では、Ｂは、二分岐のＮ－グリカンであるＮ－グリカンである。ある特定の実施形態では、Ｂは、三分岐Ｎ－グリカンであるＮ－グリカンである。ある特定の実施形態では、Ｂは、五分岐Ｎ－グリカンであるＮ－グリカンである。ある特定の実施形態では、Ｂは、シアル酸を含むＮ－グリカンである。ある特定の実施形態では、Ｂは、以下の式：
のＮ－グリカンである。当業者により理解されるように、Ｎ－グリカンＢ及び式（Ｉ）の化合物における記号の構造は、通常、グリカン化学における標準命名法の範囲内で示される通りであり、例えば、ここで、四角はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を表し、暗色の丸はＤ－マンノース（Ｍａｎ）を表し、三角はＬ－フコース（Ｆｕｃ）を表し、明色の丸はＤ－ガラクトース（Ｇａｌ）を表し、菱形はシアル酸を表し、更なる例として、記号による糖鎖表示法（ＳＮＦＧ）で示されるようなグリカンがＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、図９に示されるものである。幾つかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、図９に示されるものであり、ここで、ＡはｓｉＲＮＡである。幾つかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、図９に示されるものであり、ここで、ＡはＡＳＯである。幾つかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、図９に示されるものであり、ここで、ＡはｍＲＮＡである。幾つかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、図９に示されるものであり、ここで、Ａはアプタマーである。幾つかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、図９に示されるものであり、ここで、Ａは環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）である。幾つかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、図９に示されるものであり、ここで、ＡはガイドＲＮＡである。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、配列番号１または配列番号２を含み、ここで、ｉ５ＯｃｔｄＵは、Ｇ－２８にコンジュゲートされて、
を形成している。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、配列番号１または配列番号２を含み、ここで、ｉ５ＯｃｔｄＵは、Ｇ－３５にコンジュゲートされて、
を形成している。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、配列番号１または配列番号２を含み、ここで、ｉ５ＯｃｔｄＵは、Ｇ－２９にコンジュゲートされて、
を形成している。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、配列番号１または配列番号２を含み、ここで、ｉ５ＯｃｔｄＵは、Ｇ－３０にコンジュゲートされて、
を形成している。
幾つかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、上記の化合物のいずれか、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体である。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｙ ＲＮＡｓ ａｒｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｔ ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｗｉｔｈ Ｎ－ｇｌｙｃａｎｓ，ｂｉｏＲｘｉｖ，Ｓｅｐ．３０，２０１９に開示されている（例えば、図４、図１～４のいずれかにおいて開示されている）核酸－グリカンコンジュゲートではない。
例示的なグリカン－核酸コンジュゲートの作製方法
本開示は、式（Ｉ）：
Ａ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
の化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体を調製する方法であって、式中、
Ａは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の核酸であり、
Ｂは、第２のクリックケミストリーハンドルを含むアスパラギン結合型グリカン（Ｎ－グリカン）であり、
Ｌは、第１のクリックケミストリーハンドルと第２のクリックケミストリーハンドルとの間の生体直交型クリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含み、
当該方法が、当該第１のクリックケミストリーハンドルを含む、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の前記核酸Ａを、当該第２のクリックケミストリーハンドルを含むアスパラギン結合型グリカン（Ｎ－グリカン）である化合物Ｂと反応させる第１のステップを含み、当該第１のステップの反応は、生体直交型クリックケミストリー条件下で実行される、当該方法を提供する。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を調製する方法において、置換基Ａ、Ｂ、及びリンカーＬは、本明細書に記載される通りである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を調製する方法において、Ａは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、ＡＳＯ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、またはアプタマーＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を調製する方法において、Ａは、（例えば、第１のクリックケミストリーハンドルを含む）ＤＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、（例えば、第１のクリックケミストリーハンドルを含む）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、またはアプタマーＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡまたはｃｐＤＮＡ）、マイクロサテライトＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡまたはｍＤＮＡ）、キネトプラストＤＮＡ（ｋＤＮＡ）、プロウイルス、リゾゲン、反復ＤＮＡ、サテライトＤＮＡ、またはウイルスＤＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、第１のクリックケミストリーハンドルを含む、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡまたはｃｐＤＮＡ）、マイクロサテライトＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡまたはｍＤＮＡ）、キネトプラストＤＮＡ（ｋＤＮＡ）、プロウイルス、リゾゲン、反復ＤＮＡ、サテライトＤＮＡ、またはウイルスＤＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を調製する方法において、Ａは、配列番号１を含むＤＮＡである。ある特定の実施形態では、Ａは、配列番号１の全長配列に対する少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を有する。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を調製する方法において、Ａは、配列番号１の全長配列に対する少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有する。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を調製する方法において、ＡはＤＮＡであり、ここで、当該ＤＮＡは配列番号１を含む。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を調製する方法において、Ａは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、第１のクリックケミストリーハンドルを含む低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）で、Ａは、２’ＯＭｅ修飾、フッ素修飾、ホスホロチオエート修飾からなる群から選択される修飾を含むｓｉＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）で、Ａは、２’ＯＭｅ修飾、フッ素修飾、ホスホロチオエート修飾からなる群から選択される修飾を含み、第１のクリックケミストリーハンドルを含むｓｉＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、ｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、ガイドＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むガイドＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）である。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、第１のクリックケミストリーハンドルを含む環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）である。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、アプタマーＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むアプタマーＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡもしくは短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、異種核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）、コードＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（長鎖ｎｃＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ）、サテライトＲＮＡ、ウイルスサテライトＲＮＡ、シグナル認識粒子ＲＮＡ、細胞質低分子ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ポリイノシン酸、リボザイム、フレキシザイム、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、スプライスリーダーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、またはウイルスサテライトＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、第１のクリックケミストリーハンドルを含む、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡもしくは短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、異種核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）、コードＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（長鎖ｎｃＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ）、サテライトＲＮＡ、ウイルスサテライトＲＮＡ、シグナル認識粒子ＲＮＡ、細胞質低分子ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ポリイノシン酸、リボザイム、フレキシザイム、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、スプライスリーダーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、またはウイルスサテライトＲＮＡである。ある特定の実施形態では、Ａは、配列番号２の全長配列に対する少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を有する。ある特定の実施形態では、Ａは、配列番号２の全長配列に対する少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有する。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を調製する方法において、Ａは、配列番号２を含むＲＮＡである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を調製する方法において、ＡはＲＮＡであり、ここで、当該ＲＮＡは配列番号２を含む。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を調製する方法において、第１のステップは、生体直交型クリックケミストリー反応、例えば、以下のクリックケミストリー反応の条件下で実行される：銅触媒アジド－アルキン環化（ＣｕＡＡＣ）、歪み促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ、例えば、シクロオクチン－アジド環化付加、シクロオクテン－テトラジン環化付加）、テトラシクロオクチン（ＴＣＯ）－テトラジンライゲーション、またはアジドのＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション。ある特定の実施形態では、第１のステップは、上記の表３または４に示される反応の条件下で実行される。ある特定の実施形態では、第１のステップは、ＣｕＡＡＣの条件下で実行され、アルキン修飾核酸Ａを水で希釈し、任意に９０～１００℃の温度で約１～５分間変性させて、反応混合物を作製することを含む。ある特定の実施形態では、第１のステップは、銅フリークリックケミストリー反応（例えば、表４における反応１～１３のうちの１つ）の条件下で実行され、修飾核酸Ａ（例えば、アルケン修飾ＤＮＡ、アルキン修飾ＲＮＡ、アルケン修飾ＤＮＡ、アルキン修飾ＲＮＡ）を水で希釈して、反応混合物を作製することを含む。ある特定の実施形態では、第１のステップは、ＣｕＡＡＣの条件下で実行され、９０～１００℃の温度で約１～５分間変性させることなく、アルキン修飾核酸Ａを水で希釈して、反応混合物を作製することを含む。ある特定の実施形態では、第１のステップは、ＣｕＡＡＣの条件下で実行され、アルキン修飾核酸Ａを水で希釈することを含み、変性が９０～１００℃（例えば、約９５℃）の温度で約１～５分間（例えば、約２分間）実施されて、反応混合物が作製される。ある特定の実施形態では、第１のステップは、ＣｕＡＡＣの条件下で実行され、アルキン修飾核酸Ａを水で９０μＭ～１２５μＭまたは９５μＭ～１１５μＭ、例えば、１００μＭ～１２５μＭ（例えば、１００μＭ）の最終濃度に希釈することを含む。ある特定の実施形態では、第１のステップは、ＳＰＡＡＣ、例えば、シクロオクチン－アジド環化付加の条件下で実行され、アルキン修飾（例えば、歪みアルキン修飾、例えば、シクロオクチン修飾）核酸Ａを水で１μＭ～１１５μＭまたは５～１００μＭ、例えば、１μＭ～１００μＭの最終濃度に希釈することを含む。ある特定の実施形態では、アルキン修飾核酸Ａは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）反応の条件を使用して、５’末端が内部アミノ修飾体（／ｉＵｎｉＡｍＭ／）（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで利用可能な核酸の内部アミノ修飾体）で修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡをＤＩＢＡＣ（ジベンゾアザシクロオクチンまたは「ＤＢＣＯ」（ジベンゾシクロオクチン））にカップリングすることにより調製される。
ある特定の実施形態では、第１のステップの後に、反応混合物を氷上に配置するステップ、続いて、ＭｇＣｌ（例えば、２００μＭのＭｇＣｌ）及び中性緩衝液（例えば、ｐＨ７．０のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））中で折り畳ませるステップが続く。ある特定の実施形態では、第１のステップの後に、反応混合物を氷上に配置するステップ、続いて、ＭｇＣｌ（例えば、２００μＭのＭｇＣｌ）及び中性緩衝液（例えば、ｐＨ７．０のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））中で３５～３９℃にて約５～１０分間折り畳ませるステップが続く。ある特定の実施形態では、本方法は、反応混合物にリガンドの２－（４－（（ビス（（１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）酢酸（ＢＴＴＡＡ）を添加し、室温、例えば、約１８～７５℃（例えば、１８～２３℃、２０～２５℃、２５～４０℃、４０～５０℃、５０～５５℃、５５～６０℃、６０～７０℃、７０～７５℃）でインキュベートするステップを更に含む。ある特定の実施形態では、本方法は、Ａ（例えば、約１０μＭのＡ、約１０～２０μＭのＡ）、Ｂ（例えば、約２０μＭまたは約２０～３０μＭのＢ）、及び任意にＣｕ－ＢＴＴＡＡ（例えば、約１００～１１０μＭのＣｕ－ＢＴＴＡＡ）を反応させるステップを更に含む。ある特定の実施形態では、本方法は、Ａ（例えば、約１０μＭのＡ）、Ｂ（例えば、約２０μＭのＢ）、及びＣｕ－ＢＴＴＡＡ（例えば、約１００～１１０μＭのＣｕ－ＢＴＴＡＡ）を反応させるステップを更に含む。ある特定の実施形態では、本方法は、Ａ（例えば、約１０μＭのＡ）、Ｂ（例えば、約２０μＭのＢ）、任意のＣｕ－ＢＴＴＡＡ（例えば、約１００～１１０μＭのＣｕ－ＢＴＴＡＡ）、及びアスコルビン酸ナトリウムを緩衝液（例えば、ＰＢＳ）と共に、約１８～７５℃（例えば、１８～２３℃、２０～２５℃、２５～４０℃、４０～５０℃、５０～５５℃、５５～６０℃、６０～７０℃、７０～７５℃）で少なくとも約６～４８時間反応させるステップを更に含む。ある特定の実施形態では、本方法は、Ａ（例えば、約１０～２０μＭのＡ）、Ｂ（例えば、約２０～３０μＭのＢ）、任意のＣｕ－ＢＴＴＡＡ（例えば、約１００～１１０μＭのＣｕ－ＢＴＴＡＡ）、及びアスコルビン酸ナトリウムを緩衝液（例えば、ＰＢＳ）と共に、約１８～７５℃（例えば、１８～２３℃、２０～２５℃、２５～４０℃、４０～５０℃、５０～５５℃、５５～６０℃、６０～７０℃、７０～７５℃）で少なくとも約６～４８時間反応させるステップを更に含む。ある特定の実施形態では、本方法は、シクロオクチン（例えば、ＤＩＢＡＣ／ＤＢＣＯ）を含む第１のクリックケミストリーハンドルとしてＡ（例えば、約１～１００μＭのＡ）、Ｂ（例えば、第２のクリックケミストリーハンドルとしてアジドを含む、例えば、約１００～１０００μＭのＢ）、任意のＣｕ－ＢＴＴＡＡ（例えば、約１００～１１０μＭのＣｕ－ＢＴＴＡＡ）、アスコルビン酸ナトリウムを、反応物中の緩衝液または溶媒のいずれかの０～５０％（例えば、２５～５０％）の緩衝液（例えば、ＰＢＳ）及び溶媒（例えば、アセトニトリル、ＤＭＳＯ）と共に、約１８～７５℃（例えば、１８～２３℃、２０～２５℃、２５～４０℃、４０～５０℃、５０～５５℃、５５～６０℃、６０～７０℃、７０～７５℃）で少なくとも約６～４８時間反応させるステップを更に含む。
ある特定の実施形態では、本方法は、シクロオクチン（例えば、ＤＩＢＡＣ／ＤＢＣＯ）を含む第１のクリックケミストリーハンドルとしてＡ（例えば、約１～１００μＭのＡ）、Ｂ（例えば、第２のクリックケミストリーハンドルとしてアジドを含む、例えば、約１００～１０００μＭのＢ）、反応物中の緩衝液または溶媒のいずれかの０～５０％（例えば、２５～５０％）最終濃度までの緩衝液（例えば、ＰＢＳ）及び溶媒（例えば、アセトニトリル、ＤＭＳＯ）を、約１８～７５℃（例えば、１８～２３℃、２０～２５℃、２５～４０℃、４０～５０℃、５０～５５℃、５５～６０℃、６０～７０℃、７０～７５℃）で少なくとも約６～４８時間反応させるステップを更に含む。
ある特定の実施形態では、本方法は、第１のクリックケミストリーハンドルとしてアルケンを含むＡ（例えば、約１～１００μＭのＡ）、Ｂ（例えば、約１００～１０００μＭのＢ）、任意のＣｕ－ＢＴＴＡＡ（例えば、約１００～１１０μＭのＣｕ－ＢＴＴＡＡ）、反応物中の緩衝液または溶媒のいずれかの０～５０％（例えば、２５～５０％）最終濃度までの緩衝液（例えば、ＰＢＳ）及び溶媒（例えば、アセトニトリル、ＤＭＳＯ）を、約１８～７５℃（例えば、１８～２３℃、２０～２５℃、２５～４０℃、４０～５０℃、５０～５５℃、５５～６０℃、６０～７０℃、７０～７５℃）で少なくとも約６～４８時間反応させるステップを更に含む。ある特定の実施形態では、本方法は、Ａ（例えば、約１０～２０μＭのＡ）、Ｂ（例えば、約２０～３０μＭのＢ）、任意のＣｕ－ＢＴＴＡＡ（例えば、約１００～１１０μＭのＣｕ－ＢＴＴＡＡ）、反応物中の緩衝液または溶媒のいずれかの０～５０％（例えば、２５～５０％）最終濃度までの緩衝液（例えば、ＰＢＳ）及び溶媒（例えば、アセトニトリル、ＤＭＳＯ）を、約１８～７５℃（例えば、１８～２３℃、２０～２５℃、２５～４０℃、４０～５０℃、５０～５５℃、５５～６０℃、６０～７０℃、７０～７５℃）で少なくとも約６～２４時間反応させるステップを更に含む。ある特定の実施形態では、本方法は、Ａ（例えば、約１０～２０μＭのＡ）、Ｂ（例えば、約２０～３０μＭのＢ）、任意のＣｕ－ＢＴＴＡＡ（例えば、約１００～１１０μＭのＣｕ－ＢＴＴＡＡ）、反応物中の緩衝液または溶媒のいずれかの０～５０％（例えば、２５～５０％）最終濃度までの緩衝液（例えば、ＰＢＳ）及び溶媒（例えば、アセトニトリル、ＤＭＳＯ）を、約１８～７５℃（例えば、１８～２３℃、２０～２５℃、２５～４０℃、４０～５０℃、５０～５５℃、５５～６０℃、６０～７０℃、７０～７５℃）で少なくとも約２４～４８時間反応させるステップを更に含む。ある特定の実施形態では、第１のステップは、歪み促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン（ＴＣＯ）－テトラジンライゲーション、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン－テトラジンライゲーション、アジドのＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション、一級アミンとＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）との間の架橋、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン－アジドカップリング、またはシクロプロパン－アジドカップリングであるクリックケミストリー反応の条件下で実行される。ある特定の実施形態では、第１のステップは、歪み促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）であるクリックケミストリー反応の条件下で実行される。ある特定の実施形態では、第１のステップは、第１のクリックケミストリーハンドルとしてのシクロオクチン（例えば、ＤＩＢＡＣ／ＤＢＣＯ）と第２のクリックケミストリーハンドルとしてのアジドとの間の反応を伴う、歪み促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）であるクリックケミストリー反応の条件下で実行される。ある特定の実施形態では、第１のステップは、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン（ＴＣＯ）－テトラジンライゲーションまたはｔｒａｎｓ－シクロオクテン－テトラジンライゲーションであるクリックケミストリー反応の条件下で実行される。ある特定の実施形態では、第１のステップは、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン（ＴＣＯ）－テトラジンライゲーションであるクリックケミストリー反応の条件下で実行される。ある特定の実施形態では、第１のステップは、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン－テトラジンライゲーションであるクリックケミストリー反応の条件下で実行される。ある特定の実施形態では、第１のステップは、アジドのＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション、一級アミンとＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）との間の架橋、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン－アジドカップリング、またはシクロプロパン－アジドカップリングであるクリックケミストリー反応の条件下で実行される。ある特定の実施形態では、第１のステップは、アジドのＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションであるクリックケミストリー反応の条件下で実行される。ある特定の実施形態では、第１のステップは、一級アミンとＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）との間の架橋であるクリックケミストリー反応の条件下で実行される。ある特定の実施形態では、第１のステップは、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン－アジドカップリングであるクリックケミストリー反応の条件下で実行される。ある特定の実施形態では、第１のステップは、シクロプロパン－アジドカップリングであるクリックケミストリー反応の条件下で実行される。ある特定の実施形態では、本方法は、例えば、反応をクエンチするために、約１０～２５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（例えば、約１５～２０ｍＭのＥＤＴＡ、約１８～２０ｍＭのＥＤＴＡ、約２０～２２ｍＭのＥＤＴＡ、約２０ｍＭのＥＤＴＡ）を添加するステップを更に含む。ある特定の実施形態では、本方法は、式（Ｉ）の化合物のＮ－グリカンの酵素変換反応のステップを更に含み、例えば、シアリルトランスフェラーゼもしくはフコシルトランスフェラーゼによる糖（複数可）（例えば、糖）の付加、またはマンノシダーゼによる切断（例えば、既存の糖（複数可）の切断）を含む。ある特定の実施形態では、本方法は、式（Ｉ）の化合物の沈殿及び／または例えば、シリカベースのＲＮＡもしくはＤＮＡ脱塩カラムによるカラム精製のステップを更に含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を調製する方法において、第１のクリックケミストリーハンドル及び第２のクリックケミストリーハンドルは、本明細書に記載される通りである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を調製する方法において、第１のクリックケミストリーハンドル及び第２のクリックケミストリーハンドルは、表３または４に示されるクリックケミストリーハンドルペアのうちの１つである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を調製する方法において、第１のクリックケミストリーハンドル及び第２のクリックケミストリーハンドルは、ＣｕＡＡＣに使用されるクリックケミストリーハンドルである。ある特定の実施形態では、第１のクリックケミストリーハンドルは、アルキンまたはアジドである。ある特定の実施形態では、第１のクリックケミストリーハンドルは、アルキン（例えば、歪みのないアルキン、歪みアルキン）である。ある特定の実施形態では、第１のクリックケミストリーハンドルは、以下の式を含むアルキンである。ある特定の実施形態では、核酸Ａは、核酸の塩基に結合したアルキンである第１のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、Ａは、以下の構造：
を含み、Ａは、ＲＮＡまたはＤＮＡである。
ある特定の実施形態では、核酸Ａは、核酸のリボースの２’ＯＨ位に結合したアルキンである第１のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を調製する方法において、第１のクリックケミストリーハンドル及び第２のクリックケミストリーハンドルは、銅フリー生体直交型クリックケミストリー反応に使用されるクリックケミストリーハンドル、例えば、表４の反応１～１３に示されるクリックケミストリーハンドルパートナー（例えば、アジド－シクロオクチン、アジド－活性アルキン、テトラジン－アルケン、テトラゾール－アルケン、チオール－アルケン）である。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を調製する方法において、第１のクリックケミストリーハンドル及び第２のクリックケミストリーハンドルは、それぞれシクロオクチン及びアジドである。ある特定の実施形態では、第１のクリックケミストリーハンドル及び第２のクリックケミストリーハンドルは、表４に示されるアルケン－テトラジンの逆ディールス・アルダー［４＋２］環化付加またはアルケン－テトラゾールの１，３－双極子環化付加（光クリック）に使用されるクリックケミストリーハンドルである。ある特定の実施形態では、第１のクリックケミストリーハンドルは、アルケン（例えば、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン、ノルボルネン、シクロプロペン、１－メチルシクロプロペン（ＭＣｐ））である。ある特定の実施形態では、Ａは、アルケン（例えば、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン、ノルボルネン、及び１－メチルシクロプロペン（ＭＣｐ））である第１のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、Ａは、アルケン（ビニル）である第１のクリックケミストリーハンドルを含み、Ｂは、テトラジンである第２のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、Ａは、Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｃｏｐｅ ｏｆ ＲＮＡ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｖｉｎｙｌ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．” ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１４，８（２０１９）：１６９８－１７０７（参照により本明細書に組み込まれる）におけるアルケン（ビニル）（例えば、Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．における図２Ｂ及び／または２Ｃ）である第１のクリックケミストリーハンドルを含み、Ｂは、テトラジン（例えば、Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．における図３Ａ）である第２のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、核酸Ａは、核酸Ａのリボースの２’ＯＨ位、リボースもしくはデオキシリボースの３’ＯＨ位、またはリボースもしくはデオキシリボースの５’ＯＨ位に結合したアルキン（例えば、歪みのないアルキン、歪みアルキン）である第１のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、核酸Ａのリボースの２’ＯＨ位に結合したアルキン（例えば、歪みのないアルキン、歪みアルキン）である第１のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、核酸Ａのリボースまたはデオキシリボースの３’ＯＨ位に結合したアルキン（例えば、歪みのないアルキン、歪みアルキン）である第１のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、核酸Ａの内部、核酸Ａの３’末端、または核酸Ａの５’末端に結合したアルキン（例えば、歪みのないアルキン、歪みアルキン）である第１のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）におけるＡは、核酸Ａの内部に結合したアルキン（例えば、歪みのないアルキン、歪みアルキン）である第１のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、Ａは、シクロオクチン（例えば、ＤＩＢＡＣ、ＤＢＣＯ）である第１のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、Ａは、シクロオクチン（例えば、ＤＩＢＡＣ、ＤＢＣＯ）である第１のクリックケミストリーハンドルを含み、Ｂは、アジドである第２のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、Ａは、アルケンである第１のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、Ａは、Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｃｏｐｅ ｏｆ ＲＮＡ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｖｉｎｙｌ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．” ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１４，８（２０１９）：１６９８－１７０７（参照により本明細書に組み込まれる）におけるアルケン（ビニル）（例えば、Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．における図２Ｂ及び／または２Ｃ）である第１のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、Ａは、アルケンである第１のクリックケミストリーハンドルを含み、ここで、Ａは、
Figure 2024514954000048
 を含む。
ある特定の実施形態では、第１のクリックケミストリーハンドルは、アジドである。ある特定の実施形態では、核酸Ａは、核酸の塩基に結合したアジドである第１のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、第２のクリックケミストリーハンドルは、アルキン（例えば、歪みのないアルキン、歪みアルキン）である。ある特定の実施形態では、化合物Ｂは、Ｎ－グリカンの非還元末端に結合した第２のクリックケミストリーハンドル（例えば、表３または４のハンドル）を含む。ある特定の実施形態では、化合物Ｂは、Ｎ－グリカンの非還元末端に結合したアルキンまたはアジドである第２のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、化合物Ｂは、Ｎ－グリカンの非還元末端に結合したアルキンである第２のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、化合物Ｂは、Ｎ－グリカンの非還元末端に結合したアジドである第２のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、Ａは、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合したアルキン（例えば、歪みのないアルキン、シクロオクチン）である第１のクリックケミストリーハンドルを含み、化合物Ｂは、Ｎ－グリカンに結合したアジドである第２のクリックケミストリーハンドルを含む。ある特定の実施形態では、Ａは、アルキン（例えば、歪みのないアルキン、シクロオクチン）である第１のクリックケミストリーハンドルを含み、化合物Ｂは、Ｎ－グリカンの非還元末端に結合したアジドである第２のクリックケミストリーハンドルを含む。
ある特定の実施形態では、Ｂは、一分岐Ｎ－グリカン、二分岐Ｎ－グリカン、三分岐Ｎ－グリカン、または五分岐Ｎ－グリカンであるＮ－グリカンである。ある特定の実施形態では、Ｂは、シアル酸を含むＮ－グリカンである。ある特定の実施形態では、化合物Ｂは、以下の式：
のものである。
ある特定の実施形態では、化合物Ｂは、Ｇ－２８、Ｇ－３５、Ｇ－２９、またはＧ－３０である。
ある特定の実施形態では、化合物Ｂは、表２Ｂの化合物である。
ある特定の実施形態では、化合物Ｂは、フルオロスルフリルアジドにより媒介されるジアゾ転位により、アミノ－Ｎ－グリカンを対応するアジド－Ｎ－グリカンに変換することによって調製される。ある特定の実施形態では、アジド－Ｎ－グリカンである化合物Ｂは、以下の式：
Figure 2024514954000050
 のアミノＮ－グリカンに、フルオロスルフリルアジド、水、塩基（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）を、塩基性ｐＨ（例えば、約８．５～９．５、約９．０）で室温（例えば、約１８～２３℃）にて約１～２時間（例えば、１時間）添加することによって調製される。ある特定の実施形態では、アジド－Ｎ－グリカンである化合物Ｂは、以下のスキーム１により調製される。
スキーム１．アジド－Ｎ－グリカン（例示的な化合物Ｂ）の調製
Figure 2024514954000051
ある特定の実施形態では、調製される式（Ｉ）の化合物は、図９に示される化合物である。ある特定の実施形態では、調製される式（Ｉ）の化合物は、本明細書の他箇所で開示される化合物である。
グリコ核酸の使用
一態様では、本開示の修飾されたグリコ核酸を利用する方法及びプロセスが本明細書において提供される。
一実施形態では、本開示は、単離細胞または複数の単離細胞が本開示の修飾されたグリコ核酸と接触される方法を提供する。一実施形態では、本開示は、単離された細胞または複数の単離された細胞を提供すること、本開示に記載されるようなグリカンを含む修飾核酸を提供すること、及び当該修飾核酸を当該単離された細胞または複数の細胞と接触させることを含む、処理された細胞または複数の細胞を作製する方法を提供し、ここで、当該単離された細胞または複数の細胞は、当該修飾核酸に結合することができる。幾つかの実施形態では、グリカンを含む修飾核酸は、ｓｉＲＮＡなどの低分子修飾ＲＮＡを含む。幾つかの実施形態では、グリカンを含む修飾核酸は、ｍＲＮＡなどの高分子修飾ＲＮＡを含む。幾つかの実施形態では、単離された細胞または複数の細胞と接触させることは、エレクトロポレーションを更に含む。
一実施形態では、本開示は、適切な細胞を本開示のグリコ核酸と接触させることを含む、キメラ抗原受容体を生成させる方法を提供し、ここで、当該グリコ核酸は、キメラ抗原受容体ポリペプチドをコードする配列を含む修飾ＲＮＡを含む。幾つかの実施形態では、本方法は、薬学的に許容される担体及び本開示の修飾ＲＮＡを含む、有効量の医薬組成物を対象に投与することを含み、ここで、当該修飾ＲＮＡは、キメラ抗原受容体ポリペプチドをコードする配列を含む。
幾つかの実施形態では、本開示のグリコ核酸は、細胞に内部移行する。幾つかの実施形態では、本開示のグリコ核酸は、類似した未修飾核酸より高い効率で細胞に内部移行する。幾つかの実施形態では、本開示のグリコ核酸は、類似した未修飾核酸より少なくとも約１０％多く、少なくとも約１５％多く、少なくとも２０％多く、少なくとも約２５％多く、少なくとも約３０％多く、少なくとも約３５％多く、少なくとも約４０％多く、少なくとも約４５％多く、少なくとも５０％多く、少なくとも５５％多く、少なくとも６０％多く、少なくとも６５％多く、少なくとも７０％多く、少なくとも７５％多く、少なくとも８０％多く、少なくとも８５％多く、少なくとも９０％多く、少なくとも９５％多く、少なくとも１００％多く、または少なくとも２００％多く細胞に内部移行する。
幾つかの実施形態では、本開示のグリコ核酸は、細胞の表面に結合する。幾つかの実施形態では、細胞表面結合は、細胞シグナル伝達における少なくとも１つの変化をもたらす。幾つかの実施形態では、細胞表面へのグリコ核酸の結合は、少なくとも１つの細胞シグナル伝達経路を増強する。幾つかの実施形態では、細胞表面へのグリコ核酸の結合は、少なくとも１つの細胞シグナル伝達経路を減弱する。
投与経路、製剤化、及び薬力学的効果
グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡを含む、対象への投与に好適である医薬組成物が本明細書において提供される。医薬組成物は、一般に、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡ、及び薬学的に許容される担体を、対象への投与に好適な形態で含む。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物、及び組成物を投与するために使用される特定の方法により部分的に決定される。従って、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡを含む医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。医薬組成物は、一般に、無菌で、実質的に等張に、かつ米国食品医薬品局による全ての医薬品優良製造規則（ＧＭＰ）に完全準拠で製剤化される。
好適な担体の例としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、及び５％のヒト血清アルブミンが挙げられる。薬学的活性物質のためのかかる媒体及び化合物の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体または化合物が本明細書に記載されるグリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡと適合しない場合を除いて、組成物におけるそれらの使用が意図される。補助的治療薬も組成物に組み込まれ得る。通常、医薬組成物は、その意図される投与経路と適合可能となるように製剤化される。グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡは、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、筋肉内経路により、または吸入剤として投与され得る。グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡは、任意に、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡが対象とする疾患、障害、または状態を処置するのに少なくとも部分的に効果的である他の治療薬と組み合わせて投与され得る。
非経口、皮内、皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：無菌の希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗菌化合物、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート化合物、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはホスフェート、及び張度の調整のための化合物、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムにより調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または多人数用バイアルに入れられ得る。
注射用途に好適な医薬組成物としては、無菌の水溶液（水溶性である場合）または分散体、及び無菌の注射剤または分散体の用時調製のための無菌の粉末が挙げられる。静脈内投与に好適なキャリアとしては、生理的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合も、組成物は、通常、無菌かつ注射針通過が容易な程度まで流動的である。組成物は、製造及び保管条件下で安定でなければならず、かつ細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び好適なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。所望の流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散体の場合に必要な粒子サイズを維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の活動の防止は、様々な抗細菌化合物及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、等張化合物、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを本発明の組成物中に含むのが好ましい。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に入れることにより引き起こされ得る。
無菌注射剤は、所望される場合、本明細書において列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡを有効量でかつ適切な溶媒中に組み込むことにより調製され得る。
一般に、分散体は、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡを基本的な分散媒及び任意の所望の他の成分を含有する無菌のビヒクル中に組み込むことにより調製される。無菌注射剤を調製するための無菌粉末の場合、調製法は、事前に滅菌濾過された溶液から活性成分及び任意の更なる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥及びフリーズドライである。グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡは、グリコ核酸の持続放出またはパルス放出を可能にするような様式で製剤化され得る、蓄積注射またはインプラント製剤の形態で投与され得る。
無菌注射剤は、所望される場合、本明細書において列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡを有効量でかつ適切な溶媒中に組み込むことにより調製され得る。
一般に、分散体は、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡを基本的な分散媒及び任意の所望の他の成分を含有する無菌のビヒクル中に組み込むことにより調製される。無菌注射剤を調製するための無菌粉末の場合、調製法は、事前に滅菌濾過された溶液から活性成分及び任意の更なる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥及びフリーズドライである。グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡは、グリコ核酸及び／またはそれらのペイロード（複数可）（例えば、コードタンパク質）の持続放出またはパルス放出を可能にするような様式で製剤化され得る、蓄積注射またはインプラント製剤の形態で投与され得る。
吸入による投与について、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡは、任意の好適なデバイスを使用して任意の好適な形態で、例えば、好適な噴霧剤、例えば、二酸化炭素などの気体を含有する加圧された容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレー、またはネブライザー、ネブライザーを使用したエアロゾル、または乾燥粉末吸入器を使用して乾燥粉末として送達され得る。
グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡは、坐剤形態（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する）のまたは直腸送達のための保留浣腸形態医薬組成物として調製され得る。
幾つかの実施形態では、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡは、グリコ核酸が対象の身体から排出される速度を減少させる担体と共に調製される。例えば、インプラント剤及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤が好適である。生分解性、生体適合性のポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸が使用され得る。かかる製剤の調製方法は、当業者にとって明らかである。
一実施形態では、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡを含む医薬組成物は、医薬組成物から恩恵を受ける対象に静脈内投与される。他の実施形態では、組成物は、例えば、リンパ管内注射もしくは結節内注射（例えば、Ｓｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８ ＰＮＡＳ １０５（４６）：１７９０８を参照のこと）によりリンパ系に、または筋肉内注射により、皮下投与により、胸腺もしくは肝臓への直接注入により投与される。
本明細書に記載されるグリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡを送達するために、薬学的に許容される担体が使用され得る。薬学的に許容される担体は、一般に、化合物を治療に有用なものまたは製品として有用なものにするように、当該化合物と共に使用される。一般に、任意の物質について、薬学的に許容される担体は、対象への送達のために当該物質と組み合わされる材料である。
従来の薬学的担体、水性、粉末状、または油性基剤、増粘剤などが必要とされ得るか、または所望され得る。場合によっては、担体は、例えば、不溶性化合物を液体送達のために可溶化するために送達に必須であるか、その活性が保たれるように物質のｐＨを制御する緩衝剤であるか、または貯蔵容器内の物質の損失を防ぐ希釈剤である。しかしながら、他の場合には、担体は利便性を図るものであり、例えば、投与の利便性を高める液体である。本明細書に記載される化合物の薬学的に許容される塩は、当業者に公知の方法により合成され得る。
通常、薬学的に許容される組成物は、夾雑物を含まないように高度に精製されており、生体適合性でありかつ有毒でなく、対象への投与に適している。水がキャリアの構成成分である場合、水は、夾雑物（例えば、エンドトキシン）を含まないように高度に精製及び処理される。
薬学的に許容されるキャリアは、限定されるものではないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び／または鉱油であり得る。医薬組成物は、滑沢剤、湿潤剤、甘味剤、調味料、乳化剤、沈殿防止剤、及び／または防腐剤を更に含み得る。
具体的な例では、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡは、適切な緩衝液、例えば、抗凝固性クエン酸デキストロースＡ（ＡＣＤ－Ａ）、クエン酸リン酸デキストロース（ＣＰＤ）、クエン酸リン酸デキストロースデキストロース（ＣＰ２Ｄ）、またはクエン酸リン酸デキストロースアデニン（ＣＰＤＡ－１）などのＦＤＡ認可の抗凝固性保存溶液中に保存され得る。組成物は最長２１日間保存され得る。
他の例では、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡは、認可された添加剤溶液、例えば、ＡＳ－１（Ａｄｓｏｌ）、ＡＳ－３（Ｎｕｔｒｉｃｅｌ）、ＡＳ－５（Ｏｐｔｉｓｏｌ）、またはＡＳ－７（ＳＯＬＸ）中に保存され得る。
本明細書に記載されるグリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡを含む医薬組成物を収容している容器、ならびに対象への医薬組成物の静脈内注射のためのアプリケーターを含む医療器具が提供される。
本明細書に記載されるグリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡを含む医薬組成物、ならびに対象への医薬組成物の静脈内注射のための医療器具を含む医療用キットが提供される。
幾つかの実施形態では、脂質成分ならびにグリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡを含むナノ粒子は、例えば、非経口もしくは局所投与または局所適用により投与され得る。幾つかの実施形態では、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡにより発現されたタンパク質の少なくとも一部は、局所投与により所望の標的組織または標的細胞の位置に局在化される。
少なくとも１つのナノ粒子を含む医薬組成物の対象への投与は、局所投与または局所適用により１個以上の細胞を当該医薬組成物と接触させることを含み得る。
幾つかの実施形態では、投与方法は、エレクトロポレーションを与えることを含む。幾つかの実施形態では、本方法は、本明細書の他箇所で開示及び記載される、グリカン部分を含む修飾ＲＮＡを提供すること、ならびに対象にエレクトロポレーションを与えることを含む。
幾つかの実施形態では、本明細書において開示される医薬組成物は、当該医薬組成物を必要とするヒト対象への全身投与用に製剤化される。幾つかの実施形態では、本明細書において開示される医薬組成物は、当該医薬組成物を必要とする哺乳動物対象への全身投与用に製剤化される。幾つかの実施形態では、本明細書において開示される医薬組成物は、当該医薬組成物を必要とするヒト対象への複数回全身投与用に製剤化される。幾つかの実施形態では、本明細書において開示される医薬組成物は、当該医薬組成物を必要とする哺乳動物対象への複数回全身投与用に製剤化される。
幾つかの実施形態では、グリカンにコンジュゲートされた修飾核酸を含む医薬組成物は、対象に投与される場合、持続性の薬力学的効果をもたらす。幾つかの実施形態では、グリカンにコンジュゲートされた修飾核酸を含む医薬組成物は、対象への投与後に少なくとも１週間、薬力学的効果をもたらす。幾つかの実施形態では、グリカンにコンジュゲートされた修飾核酸を含む医薬組成物は、対象への投与後に少なくとも１ヶ月間、薬力学的効果をもたらす。幾つかの実施形態では、グリカンにコンジュゲートされた修飾核酸を含む医薬組成物は、対象への投与後に少なくとも３ヵ月間、薬力学的効果をもたらす。幾つかの実施形態では、グリカンにコンジュゲートされた修飾核酸を含む医薬組成物は、対象への投与後に少なくとも６ヵ月間、薬力学的効果をもたらす。幾つかの実施形態では、グリカンにコンジュゲートされた修飾核酸を含む医薬組成物は、対象への投与後に少なくとも１年間、薬力学的効果をもたらす。幾つかの実施形態では、グリカンにコンジュゲートされた修飾核酸を含む医薬組成物は、対象への投与後に少なくとも１８ヵ月間、薬力学的効果をもたらす。幾つかの実施形態では、修飾核酸コンジュゲートは、グリカンにコンジュゲートされていない同等の核酸と比較して対象の身体内での循環時間の増加をもたらす。幾つかの実施形態では、修飾核酸コンジュゲートは、グリカンにコンジュゲートされていない同等の核酸と比較して対象の身体での増加した半減期を有する。幾つかの実施形態では、修飾核酸コンジュゲートは、グリカンにコンジュゲートされていない同等の核酸と比較して対象の身体での増加した安定性を有する。
別の態様では、本開示は、ナノ粒子組成物の一部として製剤化された本開示のグリコ核酸を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、グリコ核酸は、ナノ粒子の内部またはナノ粒子内に存在する。別の実施形態では、グリコ核酸は、ナノ粒子の表面に存在する。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は、ＬＮＰ、例えば、限定されるものではないが、特許出願公開ＷＯ２０１７０４９２４５Ａ２、ＷＯ２０１９０８９８２８Ａ１、及びＵＳ２０１７０２１０６９７Ａ１（これらの各々は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものである。別の実施形態では、ナノ粒子は、ポリマーナノ粒子である。別の実施形態では、ナノ粒子は、ポリマーナノ粒子、例えば、限定されるものではないが、Ｂｅｇｉｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．（Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０２０ Ｊｕｌ；１０（７）：１４０３）に記載されるものである。別の態様では、本開示は、本開示のグリコ核酸を含むナノ粒子製剤を製造するプロセスを提供する。一実施形態では、グリコ核酸ナノ粒子を作製するプロセスは、核酸を提供すること、核酸がグリカンにコンジュゲートされて、グリカン部分を含む修飾核酸が生成されるような条件下で当該核酸を当該グリカンと接触させること、及び次いで、グリコ核酸を含むナノ粒子が形成されるような条件下でグリカン部分を含む当該修飾核酸をナノ粒子と接触させることを含む。幾つかの実施形態では、上記ナノ粒子は、ＬＮＰである。
幾つかの実施形態では、本開示のグリコ核酸は、血清安定性を示す。幾つかの実施形態では、グリカンの核酸へのコンジュゲーションは、コンジュゲート全体に安定性を付与し、その結果、コンジュゲートは、コンジュゲートされたグリカンを欠く同じ核酸より長い血清中有効寿命を有する。一態様では、本開示は、本開示のグリコ核酸を含む血清を作製する方法であって、少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸を提供すること、及び血清を提供することを含み、当該グリカンが当該血清中での当該核酸の安定化をもたらす、当該方法を提供する。
投与量
ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びその医薬組成物の投薬及び投与頻度は、様々な因子、例えば、疾患の重症度、患者の年齢、性別、及び食事、任意の炎症の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的因子に基づいて主治医により決定され得る。一つの例では、静脈内投与は、最小限に有効な用量で開始され、用量は、好ましい効果が観察されるまで、事前に選択した時間経過を通じて増加される。その後に、投与量の段階的な増加は、発生し得る任意の有害作用を考慮すると同時にこれに見合う効果の増加をもたらすレベルに限定される。
好適な投与量の非限定的な例は、例えば、１×１０１０～１×１０１４、１×１０１１～１×１０１３、または５×１０１１～５×１０１２個のｇｌｙｃｏＲＮＡの範囲であり得る。具体例としては、約５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２個、またはそれ以上のｇｌｙｃｏＲＮＡが挙げられる。各用量のｇｌｙｃｏＲＮＡは、１日１回、週１回、週２回、月１回、または月２回などの時間間隔で投与され得る。
有効なレベルのｇｌｙｃｏＲＮＡを含有する医薬組成物が提供される。かかる組成物は、複数個のｇｌｙｃｏＲＮＡ、例えば、１×１０３個のｇｌｙｃｏＲＮＡ、または１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、もしくは１×１０１２個超のｇｌｙｃｏＲＮＡを含有する。具体的な例では、ｇｌｙｃｏＲＮＡは、生理食塩液中１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％超の質量対容量比（％ｍ／ｖ）の濃度で投与され得る。患者への投与時間は、１０分～４時間またはそれ以上の範囲であり得る。
本明細書に記載されるｇｌｙｃｏＲＮＡを含む医薬組成物を含む剤形が提供される。幾つかの実施形態では、剤形は、静脈内注射のための懸濁液として製剤化される。
ｇｌｙｃｏＲＮＡの薬学的に許容される懸濁液は、好ましくは、約１０～約２５０ｍｌの容量で包装される。包装は、輸注に好適なシリンジまたは静注用バックであり得る。懸濁液の投与は、例えば、静注用バックなどからの点滴を任意に使用して、静脈内または動脈内注射により、実行される。通常、腕への静脈内投与または中心静脈カテーテルによる投与が実行される。５０ｍｌを超える投与では、点滴の使用が好ましい。
ある特定の実施形態では、本明細書において開示されるナノ粒子は、所望の治療効果を得るために、１日当たり、対象の体重当たり約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇのｇｌｙｃｏＲＮＡを送達するのに十分な投与量レベルで１日に１回以上投与され得る。
幾つかの実施形態では、本明細書において開示されるナノ粒子は、単回投与で対象に投与される。幾つかの実施形態では、本明細書において開示されるナノ粒子は、固定の投与量で複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の）投与で投与される。この段落の各々の実施形態では、「複数回投与」は、互いに短時間（１～５分）、中時間（６～３０分）、または長時間（３０分超、数時間、または更には数日）隔てられ得る。
ナノ粒子は、疾患、障害、及び／または状態を処置するのに効果的な任意の投与量の投与を使用して対象に投与され得る。必要とされる正確な投与量は、対象の年齢及び全身状態、疾患の重症度、特定の製剤、その投与様式、その活性様式などに応じて対象毎に異なる。しかしながら、１日の組成物の合計使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決定され得ることが理解されよう。任意の特定の患者での具体的な薬学的に有効な用量レベルは、疾患の重症度、用いられる特定の組成物、患者の年齢、体重、健康状態、性別、及び食事、投与時間、投与経路、処置期間、ならびに医学分野において周知の同様の因子が含まれる、種々の因子に依存する。
疾患、障害、及び状態
一態様では、対象における標的の存在、非存在、濃度の上昇または低下に関連する疾患、障害、または状態を処置または予防するために、当該標的の濃度を調節する方法が本明細書において提供される。本明細書で使用する場合、用語「標的」は、疾患、障害、もしくは状態の病因に関与するか、または疾患、障害、もしくは状態の症状を示す分子または他の化学物質を指す。対象は、疾患、障害、もしくは状態に罹患していてもよく、または疾患、障害、もしくは状態を発症するリスクを有していてもよい。本明細書において提供される方法は、本明細書に記載される好適なグリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡの、標的の濃度を実質的に調節するのに有効な量での投与を含み、これにより、疾患、障害、または状態が予防または処置される。幾つかの実施形態では、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡは、医薬組成物として製剤化される。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、非経口投与、例えば、対象への静脈内注射用に製剤化される。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、対象への局所投与用に製剤化される。組成物は、任意の所望のレジメンで、例えば、対象への１回の投与により対象に投与され得るか、または一定の期間にわたって複数回の投与が実行され得る。例えば、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上の投与が対象に提供され得る。幾つかの実施形態では、投与は、例えば、疾患、障害、または状態に関連する症状が持続する限り、必要に応じて提供され得る。幾つかの実施形態では、対象の余命の間に反復投与が必要とされ得る。処置期間は異なり得、例えば、１年以内、６ヵ月、３ヵ月、２ヵ月、１ヵ月、２週間、１週間、３日、２日、または１日以内であり得る。
幾つかの実施形態では、組成物は、疾患、障害、もしくは状態が処置されるか、またはその症状が低減されるように、処置期間にわたって少なくとも２回投与される。幾つかの実施形態では、組成物は、疾患、障害、もしくは状態が処置されるか、またはその症状が予防されるように、処置期間にわたって少なくとも２回投与される。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、標的の濃度が処置期間の間に実質的に減少するように、処置期間にわたって十分な回数投与される。標的が自己抗体である幾つかの実施形態では、医薬組成物は、標的自己抗体の濃度が処置期間の間に実質的に減少し、その結果、自己抗体により媒介される疾患、障害、または状態の１つ以上の症状が予防、低減、または遅延されるように、処置期間にわたって十分な回数投与される。幾つかの実施形態では、標的の濃度を減少させることは、ピーク濃度を減少させることを含み、一方で他の例では、平均濃度を減少させることを含む。幾つかの実施形態では、処置期間の間の実質的な減少は、ヒト対象における処置前もしくは処置後期間を比較するか、または処置を受けている集団でなされた測定を、マッチする未処置の対照集団と比較することにより決定され得る。幾つかの実施形態では、標的の濃度は、処置期間の一部または全体で少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、または９９．９９％超減少する。幾つかの実施形態では、標的の濃度は、投与から約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０分間、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、もしくは２３時間、または１、２、３、４、５、もしくは６日間、または約１、２、３、４、５、もしくは６週間以内に少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、または９９．９９％超減少する。
幾つかの実施形態では、医薬組成物は、標的の濃度が、ｉ）ヒト対象による標的の内因性クリアランス速度、またはｉｉ）ヒト対象による標的の内因性産生速度、またはｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の両方を超える速度で減少するように、処置期間にわたって十分な回数投与される。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、標的の濃度が少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、または６ヵ月超の間に実質的に減少するように、処置期間に十分な回数投与される。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも処置期間の間は、標的の濃度が一定期間実質的に減少するように、処置期間に十分な回数投与される。
幾つかの実施形態では、医薬組成物は、標的の濃度を、疾患、障害、または状態の症状と関連するレベル未満に効果的に低減するのに十分な頻度で投与される。
幾つかの実施形態では、処置期間内における投与間の時間間隔は、ｇｌｙｃｏＲＮＡの数が、投与される医薬組成物中に存在するｇｌｙｃｏＲＮＡの数の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％未満に減少する期間以内である。
グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡを投与することにより処置または予防され得る、標的に関連する疾患、障害、及び病態は、本明細書に記載される。
グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡを投与することによる治療的有用性のために調節される標的に関連する疾患、障害、及び病態としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：抗自己抗体媒介性疾患、補体調節異常関連疾患、免疫複合体関連疾患、アミロイドーシス、感染因子または病原体に関連する疾患（例えば、細菌、真菌、ウイルス、寄生虫感染症）、毒性タンパク質に関連する疾患、脂質の蓄積に関連する疾患、哺乳動物アポトーシス細胞、哺乳動物壊死細胞、哺乳動物異常細胞、または哺乳動物発癌細胞に関連する疾患、及び代謝疾患。
幾つかの実施形態では、治療効果のために調節され得る標的（例えば、分子または実体）に関連する疾患または状態の処置または予防のための方法が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、本方法は、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡ、またはグリコ核酸を含む組成物、好ましくは医薬組成物を投与する必要がある対象に、分子または実体に関連する疾患または状態を処置または予防するのに有効な量で投与することを含む。
敗血症、自己免疫疾患、がん、及び微生物感染症が含まれる、炎症及び炎症に関連する疾患の処置または予防のための方法であって、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及び／またはｇｌｙｃｏＤＮＡを投与する必要がある対象に、炎症または関連疾患を処置または予防するのに有効な量で投与することを含む、当該方法が提供される。幾つかの実施形態では、ｇｌｙｃｏＲＮＡは、ケモカインまたはサイトカイン受容体をコードする配列を含む。
炎症部位でのケモカイン恒常性を調節するための方法であって、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及び／またはｇｌｙｃｏＤＮＡを投与する必要がある対象に、炎症部位でのケモカイン恒常性を調節するのに有効な量で投与することを含む、当該方法が提供される。幾つかの実施形態では、グリコ核酸は、ケモカイン受容体をコードする配列を含むｇｌｙｃｏＤＮＡまたはｇｌｙｃｏＲＮＡである。
更に、毒素クリアランスを誘発する方法が提供される。この方法は、例えば、抗体、ｓｃＦｖ、またはナノボディなどの毒素と相互作用することができるペプチドをコードする配列を含むグリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及び／またはｇｌｙｃｏＤＮＡを投与する必要がある対象に、血液循環から毒素を除去するのに有効な量で投与することを含む。かかる方法を用いることにより、毒素を隔離し、さもなければ血管系内で生じるであろう組織損傷の量を低減し、より急激さを抑えた様式でその病原性効果を消失させ得る。
幾つかの実施形態では、限定されるものではないが、代謝疾患、がん、凝固疾患（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、及び抗凝固疾患（ａｎｔｉーｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）が含まれる、疾患を処置する方法が提供される。本方法は、本明細書において提供されるペプチドをコードする配列を含むグリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及び／またはｇｌｙｃｏＤＮＡの医薬組成物を投与する必要がある対象に、当該対象における代謝疾患、がん、凝固疾患（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、または抗凝固疾患（ａｎｔｉーｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）を処置するのに十分な量で投与することを含む。
幾つかの実施形態では、疾患、障害、または状態は、代謝疾患である。幾つかの実施形態では、疾患、障害、または状態は、がんである。幾つかの実施形態では、疾患、障害、または状態は、凝固疾患（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）である。幾つかの実施形態では、疾患、障害、または状態は、抗凝固疾患（ａｎｔｉーｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）である。幾つかの実施形態では、疾患、障害、または状態は、自己免疫疾患である。幾つかの実施形態では、疾患、障害、または状態は、ＩｇＥ依存性アレルギーである。幾つかの実施形態では、疾患、障害、または状態は、全身性エリテマトーデスである。幾つかの実施形態では、疾患、障害、または状態は、ウイルス感染症である。
幾つかの実施形態では、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及び／またはｇｌｙｃｏＤＮＡは、標的の発現を増加させる。幾つかの実施形態では、ｇｌｙｃｏＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む環状ＲＮＡを含む。
別の態様では、本明細書において開示される疾患、障害、及び状態の処置に使用される、本開示のグリコ核酸を含む医薬組成物が提供される。更に他の態様では、本明細書において開示される疾患、障害、及び状態を処置するための薬剤の製造に使用される、本開示のグリコ核酸を含む医薬組成物が提供される。
併用療法
一実施形態では、本発明は、治療上有効量のグリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及び／またはｇｌｙｃｏＤＮＡを対象への投与することにより、当該対象におけるがん細胞を死滅させる方法を対象とする。この実施形態の一態様では、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡは、静脈内投与される。この実施形態の別の態様では、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡは、対象の腫瘍に投与される。この実施形態の更に別の態様では、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＤＮＡは、腫瘍の近傍に投与されるか、または腫瘍への送達を可能にするビヒクルで全身投与される。
別の実施形態では、本発明は、治療上有効量のグリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及び／またはｇｌｙｃｏＤＮＡを対象に投与することにより、当該対象におけるがんを処置する方法を対象とする。この実施形態の一態様では、ｇｌｙｃｏＲＮＡは、静脈内投与される。この実施形態の別の態様では、ｇｌｙｃｏＲＮＡは、対象の腫瘍に投与される。この実施形態の更に別の態様では、ｇｌｙｃｏＲＮＡは、腫瘍の近傍に投与されるか、または腫瘍への送達を可能にするビヒクルで全身投与される。
がん（及びがん細胞）は、対象が罹患する任意のがんである。かかるがんとしては、肝臓癌、大腸癌、膵臓癌、肺癌、及び膀胱癌が挙げられる。肝臓癌は、原発性肝臓癌または別の組織から肝臓に転移したがんであり得る。原発性肝臓癌としては、肝細胞癌及び肝芽腫が挙げられる。転移性癌としては、大腸癌及び膵臓癌が挙げられる。
一実施形態では、本発明は、治療上有効量の免疫チェックポイント阻害剤を、治療上有効量のグリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及び／またはｇｌｙｃｏＤＮＡと共に対象に投与することにより、当該対象におけるがん細胞を死滅させる方法を対象とする。この実施形態の一態様では、免疫チェックポイント阻害剤のグリコ核酸（例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ）との投与は、グリコ核酸（例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ）の有効性を増加させる。
別の実施形態では、本発明は、治療上有効量の免疫チェックポイント阻害剤を、治療上有効量のグリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及び／またはｇｌｙｃｏＤＮＡと共に対象に投与することにより、当該対象におけるがんを処置する方法を対象とする。この実施形態の一態様では、免疫チェックポイント阻害剤のグリコ核酸（例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ）との投与は、グリコ核酸（例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ）の有効性を増加させる。
上記のように、免疫チェックポイント阻害剤ならびにグリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及び／またはｇｌｙｃｏＤＮＡは、静脈内投与されるか、対象の腫瘍に投与されるか、腫瘍の近傍に投与されるか、または腫瘍への送達を可能にするビヒクルで全身投与される。
この実施形態の一態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞上の受容体、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｌａｇ３、及びＴｉｍ３と、それらの受容体のリガンドとの間の相互作用を遮断するモノクローナル抗体である。特定の態様では、モノクローナル抗体は、ＰＤ１またはＰＤＬ１に対するモノクローナル抗体である。
モノクローナル抗体の例としては、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、及びイピリムマブを含む。この実施形態の更に別の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞上の受容体、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｌａｇ３、及びＴｉｍ３と、それらの受容体のリガンドとの間の相互作用を遮断する低分子である。特定の態様では、低分子は、ＰＤ１とＰＤＬ１との間の結合を遮断する。ＢＭＳ２０２及び類似のリガンドは、かかる低分子の例である。
グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及び／またはｇｌｙｃｏＤＮＡ分子と共に投与される免疫チェックポイント阻害剤は、上記のようなモノクローナル抗体または低分子である。免疫チェックポイント阻害剤は、グリコ核酸分子の組み合わせの前に、後に、またはそれと同時に投与され得る。
別の実施形態では、この医薬組成物は、本明細書に記載されるような免疫チェックポイント阻害剤と共に使用される。従って、本発明のこの実施形態は、免疫チェックポイント阻害剤、ならびにグリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及び／またはｇｌｙｃｏＤＮＡを本明細書に記載されるような薬学的に許容される担体中に含む医薬組成物を含む治療薬の組み合わせを対象とする。
幾つかの実施形態では、修飾核酸は、修飾核酸に作動可能に連結された少なくとも１種の治療用部分を更に含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１種の治療用部分は、抗体、低分子、同位体、酵素、またはペプチドからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、少なくとも１種の治療用部分は、クリックケミストリー反応により修飾核酸に作動可能に連結されている。幾つかの実施形態では、少なくとも１種の治療用部分は、高親和性ビオチン／ストレプトアビジン相互作用により修飾核酸に作動可能に連結されている。幾つかの実施形態では、少なくとも１種の治療用部分は、修飾核酸の末端に共有結合したリンカー基を介して修飾核酸に作動可能に連結されている。幾つかの実施形態では、少なくとも１種の治療用部分は、ポリヌクレオチドの中央の化学修飾ヌクレオチドに共有結合したリンカーを介して修飾核酸に作動可能に連結されている。幾つかの実施形態では、少なくとも１種の治療用部分は、ポリヌクレオチドの中央の２個のヌクレオチドの間に挿入された化学的ハンドルを介して修飾核酸に作動可能に連結されている。
ある特定の実施形態では、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及び／またはｇｌｙｃｏＤＮＡは、毒素または放射性ヌクレオチドにコンジュゲートされている。幾つかの実施形態では、毒素または放射性ヌクレオチドにコンジュゲートされたこのようなグリコ核酸は、標的細胞上の受容体に結合し、細胞を死滅させる。
必要に応じて、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及び／またはｇｌｙｃｏＤＮＡは、標的化抗体または抗体断片にコンジュゲートされ得る。これは、所望の細胞または器官へのグリコ核酸の標的化の増強をもたらし得、グリコ核酸を更に安定化し得る（例えば、血清半減期を増加させ得る）。
別の実施形態では、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及び／またはｇｌｙｃｏＤＮＡを含む医薬組成物は、化学療法薬と共に使用される。医薬組成物と共に投与され得、細胞傷害効果を有する化学療法薬の実例としては、以下が挙げられる：アザリビン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン－１、ブスルファン、カンプトセシン、１０－ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン、イリノテカン、カルボプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノマイシングルクロニド、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシン、エチニルエストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エトポシドグルクロニド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルタミド、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、ゲムシタビン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、フェニル酪酸塩、プレドニゾン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキサン、タキソール、プロピオン酸テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビンブラスチン、ビノレルビン、及びビンクリスチン。
幾つかの実施形態では、化学療法薬は、パノビノスタット、アクチノマイシン、オールトランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、ドセタキセル、５－フルオロウラシル、デオキシフルオロウリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、アドリアマイシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、ナイトロジェンマスタード、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、及びヒドロキシカンプトテシンからなる群から選択される。
幾つかの実施形態では、化学療法薬は、ドセタキセル、パノビノスタット、５－フルオロウラシル、パクリタキセル、シスプラチン、イリノテカン、トポテカン、及びエトポシドからなる群から選択される。
必要に応じて、治療用部分、例えば、放射性同位体、化学療法薬、または本明細書において開示される治療薬のいずれかが、グリコ核酸、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ及び／またはｇｌｙｃｏＤＮＡにコンジュゲートされ得る。
用語「化学療法薬」は、がんを処置するために使用され得る生体化合物（高分子）または化学的化合物（低分子）である。化学療法薬の種類としては、限定されるものではないが、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣＩ）、アルキル化剤、代謝拮抗薬、アルカロイド、細胞傷害性／抗がん抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、チューブリン阻害剤、タンパク質、抗体、キナーゼ阻害剤などが挙げられる。化学療法薬としては、標的療法のための化合物及び従来の化学療法の非標的化化合物が挙げられる。
化学療法薬の非限定的な例としては、以下が挙げられる：エルロチニブ、アファチニブ、ドセタキセル、アドリアマイシン、５－ＦＵ（５－フルオロウラシル）、パノビノスタット、ゲムシタビン、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ベバシズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、メトホルミン、テモゾロミド、タモキシフェン、ドキソルビシン、ラパマイシン、ラパチニブ、ヒドロキシカンプトテシン、トラメチニブ。化学療法薬の更なる例としては、以下が挙げられる：オキサリプラチン、ボルテゾミブ、スニチニブ、レトロゾール、イマチニブ、ＰＩ３Ｋ阻害剤、フルベストラント、ロイコボリン、ロナファルニブ、ソラフェニブ、ゲフィチニブ、クリゾチニブ、イリノテカン、トポテカン、バルルビシン、ベムラフェニブ、テルビビニブ（ｔｅｌｂｉｖｉｎｉｂ）、カペシタビン、バンデタニブ、クロラムブシル、パニツムマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、テムシロリムス、エベロリムス、パゾパニブ、カンホスファミド、チオテパ、シクロホスファミド；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン；エチレンイミン、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、メチルメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチルフォスファミド、トリエチルチオフォスファミド、及びトリメチレンメラミンが含まれる）；ブラタシン、ブラタシノン；ブリオスタチン；カリスタチン、ＣＣ－１０６５（その合成アナログであるアドゼレシン、カルゼレシン、ビゼレシンが含まれる）、クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン、デュオカルマイシン（合成アナログであるＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１が含まれる）；エロイテロビン；パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、ビス－クロロエチル－メチルアミン、メクロレタミノキシド（Ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｏｘｉｄｅ）、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラムスチン、ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアミシン、カリケアミシンγ１Ｉ、カリケアミシンωＩ１、ジネマイシン、ジネマイシンＡ；二リン酸、例えば、クロドロネート、エスペラミシン、ならびにネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オールトランスレチノイン酸、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、アクチノマイシンＣ、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、デオキシフルオロウリジン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２－ピロリン－ドキソルビシン、エオキシドキソルビシン（ｅｏｘｙ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサート；葉酸アナログ、例えば、ジメチル葉酸、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート、プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、６－ニトロウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗アドレナリン作動薬、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補助剤、例えば、ホリナート；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルチン、ジアジクオン、エフロルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン、ロニダミン、メイタンシノイド、マイタンシン、アンサミトシン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジン；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）、ラゾキサン、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロ－トリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ－２トキシン、ベルカリンＡ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン；ジブロモマンニトール；ジブロモズルシトール；ピポブロマン、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；チオグアニン；６－メルカプトプリン；メトトレキサート；ビンブラスチン；エトポシド、イホスファミド、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン；ペメトレキセド；テニポシド、エダトレキサート、ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロン酸塩；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ＤＭＦＯ、レチノイド、例えば、レチノイン酸；ならびにそれらの薬学的に許容される塩または誘導体。
グリカン結合タンパク質を発現する細胞に関連する方法
本開示の態様は、グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を発現する細胞と細胞表面グリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）を提示する細胞との間の相互作用を低減するための方法を含む。本方法は、細胞がそれらの表面上にｇｌｙｃｏＲＮＡを提示し、かかるｇｌｙｃｏＲＮＡが細胞表面に発現されたＧＢＰにより認識されるという本明細書に初めて記載された予想外の発見に部分的に基づく。従って、本開示の恩恵を受けて、ＧＢＰとｇｌｙｃｏＲＮＡとの間の相互作用に関連する種々の方法及び薬剤が考えられ、本明細書において提供されることが理解されよう。かかる方法及び薬剤は、限定されるものではないが、研究、治療、及び診断の場面が含まれる、種々の文脈において有用である。
幾つかの実施形態により、ＧＢＰを発現する細胞と細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するための方法であって、当該ＧＢＰを発現する細胞を、当該ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されたＧＢＰに結合する可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡと、当該ＧＢＰを発現する細胞と当該細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するのに有効な量で接触させることを含む、当該方法が提供される。この文脈において、「可溶性」とは、ＧＢＰを発現する細胞との接触が開始される時にｇｌｙｃｏＲＮＡが細胞膜と会合していないことを意味する。本明細書で使用する場合、「相互作用を低減する」または「低減された相互作用」は、接触の非存在下でのＧＢＰを発現する細胞と細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用と比較したものである。可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡには、ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されたＧＢＰへの可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡの結合が、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞の表面に提示されたｇｌｙｃｏＲＮＡに結合するＧＢＰの能力に干渉する（例えば、これを阻害する）ものが含まれる。
種々のｇｌｙｃｏＲＮＡが用いられ得る。ある特定の実施形態では、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡには、Ｙ ＲＮＡファミリーからのグリコシル化（例えば、シアル化）ＲＮＡが含まれ、Ｙ ＲＮＡファミリーの非限定的な例としては、Ｙ５ ＲＮＡが挙げられる。本方法において有用である追加のｇｌｙｃｏＲＮＡとしては、グリコシル化（例えば、シアル化）核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。ｇｌｙｃｏＲＮＡは、種々のグリカンを含み得る。ある特定の実施形態では、ｇｌｙｃｏＲＮＡは、Ｎ－グリカンを含む。幾つかの実施形態によれば、ｇｌｙｃｏＲＮＡがＮ－グリカンを含む場合、かかるｇｌｙｃｏＲＮＡはＯ－グリカンを含まない。ある特定の実施形態では、ｇｌｙｃｏＲＮＡは、シアル化グリカン、例えば、シアル化Ｎ－グリカンを含む。シアル化グリカンとしては、限定されるものではないが、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、またはそれらの組み合わせでシアル化されたグリカンが挙げられる。
可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡは、１種以上の薬剤にコンジュゲートされ得る。関心対象の薬剤をＲＮＡにコンジュゲートさせるための種々の戦略が、関心対象の薬剤を可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡにコンジュゲートさせるために用いられ得る。非限定的な例としては、Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．９：７１－８、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２：１１８０５－１１８１７、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．（２００９） Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．６：７４７－７５１、Ｓｕｇｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６） Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ ２３７：１－１３、及び他の文献（それらの開示はそれらの全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものが挙げられる。
ある特定の実施形態では、ｇｌｙｃｏＲＮＡの関心対象の１種以上の薬剤との安定した会合を促進するために、ｇｌｙｃｏＲＮＡは、ＭＳ２－ＲＮＡステムループモチーフ（ＭＳ２）を有するか、またはこれを含むように遺伝子操作されている。このようなモチーフは、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＳ２－ＣＰ）に結合することが示されており、従って、ｇｌｙｃｏＲＮＡのＭＳ２－ＣＰを含む薬剤との非共有結合性の会合をもたらす。
ある特定の実施形態では、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡは、１種以上の治療薬にコンジュゲートされる。本明細書で使用する場合、「治療薬」は、哺乳動物などの動物またはヒトの標的部位で所望の生物学的効果をもたらし得る生理学的または薬理学的に活性な物質である。治療薬は、任意の無機または有機化合物であり得る。治療薬は、哺乳動物などの動物またはヒトにおける疾患、障害、または細胞増殖の発生または進行を減少させ得るか、抑制し得るか、軽減し得るか、減らし得るか、停止させ得るか、または安定化し得る。例としては、限定されるものではないが、ペプチド、タンパク質、核酸（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びＤＮＡが含まれる）、ポリマー、及び低分子が挙げられる。種々の実施形態では、治療薬は、特徴付けられていてもよく、特徴付けられていなくてもよい。
幾つかの実施形態によれば、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡは、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが結合するＧＢＰを発現する細胞の殺傷、細胞増殖の予防、及び／または同様のことをもたらす１種以上の薬剤にコンジュゲートされる。かかる薬剤は異なり得、細胞分裂阻害剤及び細胞毒性剤、例えば、標的細胞に内部移行されて、または内部移行されることなく標的細胞を死滅させることができる薬剤が挙げられる。幾つかの実施形態では、薬剤は、エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、及びビンカアルカロイドから選択される細胞毒性剤である。ある特定の実施形態によれば、細胞毒性剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ－１０６５、ＣＰＴ－１１（ＳＮ－３８）、トポテカン、ドキソルビシン、モルホリノ－ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、ドラスタチン－１０、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリケアミシン、メイタンシノイド、マイタンシン、マイタンシンＤＭ１、マイタンシンＤＭ４、ＤＭ－１、アウリスタチン、または他のドラスタチン誘導体、例えば、アウリスタチンＥもしくはアウリスタチンＦ、ＡＥＢ（ＡＥＢ－０７１）、ＡＥＶＢ（５－ベンゾイル吉草酸ＡＥエステル）、ＡＥＦＰ（抗体－エンドスタチン融合タンパク質）、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、エロイテロビン、ネトロプシン、またはそれらの任意の組み合わせである。
ある特定の実施形態では、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡは、検出可能な標識を含む。使用され得る検出可能な標識としては、限定されるものではないが、蛍光標識、比色分析標識、化学発光標識、酵素結合試薬、多色試薬、アビジン－ストレプトアビジン結合検出試薬などが挙げられる。
幾つかの実施形態によれば、検出可能な標識は、蛍光標識である。蛍光標識は、蛍光検出器により検出可能な標識部分である。例えば、関心対象の分析物（例えば、ＧＢＰを発現する細胞のＧＢＰ）への蛍光標識の結合は、当該関心対象の分析物が蛍光検出器により検出されることを可能にする。蛍光標識の例としては、限定されるものではないが、試薬と接触すると蛍光を発する蛍光分子、電磁放射線（例えば、ＵＶ、可視光、Ｘ線など）を照射される場合に蛍光を発する蛍光分子、光音響イメージングにより検出可能な蛍光標識などが挙げられる。
幾つかの実施形態によれば、検出可能な標識は、インビボイメージング剤である。本明細書で使用する場合、語句「インビボイメージング」は、生きている哺乳動物全体のｇｌｙｃｏＲＮＡ（及びこれにより、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが結合するＧＢＰ及び／またはＧＢＰを発現する細胞）を検出する方法を指す。光学的に検出可能な薬剤、例えば、蛍光剤（例えば、インドシアニングリーン（ＩＣＧ））、生物発光剤（例えば、ルシフェラーゼ、例えば、ナノルシフェラーゼ）、及び放射性標識薬剤がインビボイメージングにより検出され得る。インビボイメージングは、哺乳動物またはその中の組織もしくは細胞の２次元及び３次元画像を得るために使用され得る。電荷結合素子カメラ、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、ＣＭＯＳ、または３次元断層撮影装置が、インビボイメージングを実行するために使用され得る。例えば、Ｂｕｒｄｅｔｔｅ ＪＥ（２００８） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．４０：２５３－２６１は、インビボイメージングのためのコンピュータ断層撮影、磁気共鳴イメージング、超音波検査、陽電子放出断層撮影、単一光子放出コンピュータ断層撮影などの使用を概説している。生きている動物におけるルシフェラーゼ発現のリアルタイムイメージングのために検出可能な標識を使用する方法は、本明細書において開示される主題の方法に使用するために容易に適合され得る（例えば、Ｇｒｅｅｒ ＬＦ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ １７：４３－７４）。生きている動物における蛍光タンパク質のインビボイメージングは、例えば、Ｈｏｆｆｍａｎ（２００２） Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ９：７８６－７８９に記載されている。幾つかの実施形態では、インビボイメージングは、生体組織を透過するように設計された波長の光を発する標識を検出することにより実行され得る。かかる標識としては、長波長で発光する蛍光色素またはタンパク質、例えば、限定されるものではないが、約６００ｎｍ～約８００ｎｍ、約６５０ｎｍ～約８００ｎｍ、または約７００ｎｍ～約８００ｎｍの範囲で発光する色素またはタンパク質が含まれる、赤外及び近赤外色素またはタンパク質が挙げられる。あるいは、生体組織を透過する光を発するように設計された標識としては、限定されるものではないが、赤方偏移型ルシフェラーゼが含まれる、非蛍光性試薬が挙げられ得る。
インビボイメージングは、コンピュータ断層撮影、磁気共鳴イメージング、超音波検査、陽電子放出断層撮影、単一光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）も必要とし得る（詳細についてはＢｕｒｄｅｔｔｅ ＪＥ（２００８） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．，４０：２５３－２６１を参照のこと）。ＳＰＥＣＴは、主題の方法において統合Ｘ線ＣＡＴ（ＣＴ）スキャナー（ＳＰＥＣＴ／ＣＴ）を用いて使用されてもよい。上記のもののような多数のインビボイメージング法による情報は、対象におけるｇｌｙｃｏＲＮＡ（及びこれにより、ＧＢＰを発現する細胞）の３次元分布を提供し得る。
幾つかの実施形態によれば、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡは、インビボイメージング剤を含み、当該インビボイメージング剤は、光音響イメージング剤である。光音響イメージング（ＰＡＩ）は、バリスティック光イメージングの従来の深度限界及び拡散光イメージングの解像限界を克服する 。これは、パルスレーザー光の吸収に応答して発生する音波を使用して、数センチメートルの深度で吸収された光エネルギー密度の非侵襲的画像を約１００μｍの分解能で提供する。この多用途かつスケーラブルなイメージング手法は、全身に導入されたコントラスト剤を用いて生物学的プロセスの可視化を可能にする分子イメージングに有用であることが判明している。光音響イメージングに有用である薬剤としては、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３：６３９－６５０に記載されるものが挙げられる。ある特定の実施形態では、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡは、光音響イメージング剤を含み、当該光音響イメージング剤は、静脈内投与しても安全であるトリカルボシアニン色素インドシアニングリーン（ＩＣＧ）である。
ある特定の実施形態では、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが結合するＧＢＰは、レクチンを含む。幾つかの非限定的な例では、ｇｌｙｃｏＲＮＡは、シアル化グリカンを含み、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが結合するＧＢＰは、シアログリカン結合レクチンである。シアログリカン結合レクチンの非限定的な例としては、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）が挙げられる。
Ｓｉｇｌｅｃは、機能がグリカンリガンドにより調節される免疫調節受容体のファミリーである。ヒトにおけるＳｉｇｌｅｃファミリーは、限定的な造血系列細胞のセットに発現する１５のファミリーメンバーからなり、オリゴデンドロサイト及びシュワン細胞上に発現するＳｉｇｌｅｃ－４（ＭＡＧ）ならびに胎盤栄養芽細胞上に発現するＳｉｇｌｅｃ－６が含まれる例外が知られている。Ｓｉｇｌｅｃは、それらの最外部のＮ末端Ｖ－セットドメインにより、糖タンパク質及び糖脂質上のシアル酸含有グリカンリガンドを、固有であるが、重複する特異性で認識する。それらのリガンドの認識は、それらの細胞質尾部の免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）により細胞シグナル伝達に影響を及ぼし得る。大多数のＳｉｇｌｅｃにおいて、これらのＩＴＩＭはホスファターゼを動員する能力を有し、従って、これらのメンバーは抑制型Ｓｉｇｌｅｃと称される。例外としては、このようなモチーフを欠くＳｉｇｌｅｃ－１及びＭＡＧ、ならびに膜貫通領域の正に荷電したアミノ酸により免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有するアダプタータンパク質と会合している活性化型Ｓｉｇｌｅｃ（Ｓｉｇｌｅｃ－１４～１６）が挙げられる。
Ｓｉｇｌｅｃは、哺乳動物種間でのそれらの遺伝的相同性に基づいて２つのグループに分類され得る。第１のグループは全ての哺乳動物に存在し、Ｓｉｇｌｅｃ－１（シアロアドヘシン）、Ｓｉｇｌｅｃ－２（ＣＤ２２）、Ｓｉｇｌｅｃ－４、及びＳｉｇｌｅｃ－１５からなる。第２のグループは、ＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃからなり、これには、Ｓｉｇｌｅｃ－３（ＣＤ３３）、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１４、及び－１６が含まれる。単球、単球由来マクロファージ、及び単球由来樹状細胞は、ほとんど同じＳｉｇｌｅｃプロファイル、すなわち、Ｓｉｇｌｅｃ－３、－７、－９の高発現、Ｓｉｇｌｅｃ－１０の低発現、及びＩＦＮ－αによる刺激時のＳｉｇｌｅｃ－１の発現を有する。対照的に、マクロファージは、それらの分化状態に応じて主にＳｉｇｌｅｃ－１、－３、－８、－９、－１１、－１５、及び－１６の発現を有する。通常の樹状細胞は、単球由来樹状細胞と同様に、Ｓｉｇｌｅｃ－３、－７、及び－９を発現するが、これに加えて、低レベルのＳｉｇｌｅｃ－２及びＳｉｇｌｅｃ－１５も発現する。形質細胞様樹状細胞は、Ｓｉｇｌｅｃ－１及びＳｉｇｌｅｃ－５を発現する。単球由来樹状細胞上のＳｉｇｌｅｃ－７及びＳｉｇｌｅｃ－９発現は、ＬＰＳでの４８時間の刺激後に下方調節が観察されるが、単球由来マクロファージでは、ＬＰＳによる誘導時にＳｉｇｌｅｃ発現が変化しない。Ｓｉｇｌｅｃは、他の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、好塩基球、好中球、及びＮＫ細胞上にも存在する。Ｓｉｇｌｅｃに関する詳細は、例えば、Ａｎｇａｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１５） Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．３６（１０）：６４５－６６０、Ｌｕｂｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８） Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２８０７、Ｂｏｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６） Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５（３）：５９８－６０８、及びＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０） Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８（１）：３６５－３９５（それらの開示はそれらの全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。
ある特定の実施形態では、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが結合するＧＢＰは、ＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃを含む。１つの非限定的な例では、ＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃは、Ｓｉｇｌｅｃ－１１である。別の非限定的な例では、ＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃは、Ｓｉｇｌｅｃ－１４である。
ある特定の実施形態では、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが結合するＧＢＰは、Ｃ型レクチンを含む。Ｃ型レクチンは、少なくとも１つのＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の存在により定義されるタンパク質のスーパーファミリーであり、広範なレパートリーのリガンドを認識し、多種多様な生理学的機能を調節する。ほとんどの研究は、抗微生物自然及び適応免疫応答において機能するＣ型レクチンの能力に注目が集中しているが、これらのタンパク質が自己免疫疾患において主要な役割を有し、多細胞生物の多数の他の側面に寄与するという認識が増している。Ｃ型レクチンという用語は、Ｃａ２＋依存的炭水化物結合レクチン及びＣａ２＋非依存的炭水化物結合レクチンを区別するために導入された。Ｃ型レクチンは、少なくとも１つの炭水化物認識ドメインを共有し、これは、保存された残基モチーフを含み、ＣＬＲの炭水化物特異性を決定するコンパクトな構造モジュールである。自然免疫と適応免疫の双方の連関におけるそれらの役割で特に関心対象となるのは、遺伝子のナチュラルキラークラスターのテロメア領域に限局されるデクチン１及びデクチン２ファミリーの遺伝子である。これらの２グループのＣ型レクチンは、主に骨髄細胞系列の細胞、例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、及び好中球により発現される。Ｃ型レクチンは、内部移行及びＴ細胞への提示のための抗原取り込み受容体として機能するだけでなく、複数のシグナル伝達経路を開始させ、ＮＦ－κＢ、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）、及び／またはインフラマソームの活性化ももたらす。次に、これは炎症促進性または抗炎症性のサイトカイン及びケモカインの産生を引き起こし、続いて適応免疫応答を微調整する。Ｃ型レクチンに関する詳細は、例えば、Ｚｅｌｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２００５） ＦＥＢＳ Ｊ．２７２：６１７９－６２１７、Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ ＆ Ｇｒｉｎｈｕｉｓ（２００９） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９：４６５－４７９；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８：３７４－３８９、Ｄａｍｂｕｚａ ＆ Ｂｒｏｗｎ （２０１５） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：２１－７、及びＣｈｉｆｆｏｌｅａｕ （２０１８） Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２２７（それらの開示はそれらの全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。幾つかの実施形態によれば、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが結合するＧＢＰは、デクチン－１、レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体－１（ＬＯＸ－１）、Ｃ型レクチン様受容体－１（ＣＬＥＣ－１）、Ｃ型レクチン様受容体－２（ＣＬＥＣ－２）、骨髄抑制性Ｃ型レクチン様受容体（ＭＩＣＬ）、ＣＬＥＣ９Ａ、ＤＣ免疫受容体（ＤＣＩＲ）、デクチン－２、血液ＤＣ抗原－２（ＢＤＣＡ－２）、マクロファージ誘導性Ｃ型レクチン（ＭＩＮＣＬＥ）、マクロファージガラクトースレクチン（ＭＧＬ）、及びアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）から選択されるＣ型レクチンを含む。
ある特定の実施形態では、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが結合するＧＢＰは、セレクチンを含む。セレクチンは、白血球輸送、ならびに白血球、血小板、及び内皮細胞の特異的な腫瘍細胞との接着性相互作用を媒介する膜貫通Ｃ型レクチンである。これらのレクチンは、内皮細胞（Ｅセレクチン）、白血球（Ｌ－セレクチン）、及び血小板（Ｐ－セレクチン）上に存在し、幾つかの腫瘍型で豊富に発現されるＳＬｅＸ及びＳＬｅＡグリコエピトープを含有するグリカンに優先的に結合する。セレクチンは、ＴＭＥにおける白血球動員、腫瘍促進性炎症、及び転移能の獲得の文脈において機能的に関連する。Ｐ－セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）は、それが活性化血小板とがん細胞との間の相互作用を媒介し、これにより腫瘍形成に寄与するため、腫瘍成長及び転移に関与する。Ｅセレクチン（ＣＤ６２Ｅ）も、転移カスケードの異なる事象におけるがん細胞接着性において主要な役割を果たし、腫瘍細胞の血管外漏出を促進する。最後に、白血球に恒常的に発現するＬ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）は、腫瘍白血球相互作用を調節し、塞栓形成を助けることにより細胞接着及び血行性転移を促進する。セレクチンに関する詳細は、例えば、Ｃａｇｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６） Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．６：１０９、Ｂａｒｔｈｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ １１（１１）：１４７３－９１、及びＣｈｅｎ ＆ Ｇｅｎｇ（２００６） Ａｒｃｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｈｅｒ Ｅｘｐ ５４（２）：７５－８４（それらの開示はそれらの全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。幾つかの実施形態によれば、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが結合するＧＢＰは、Ｐ－セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）、Ｅセレクチン（ＣＤ６２Ｅ）、及びＬ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）から選択されるセレクチンを含む。
ある特定の実施形態では、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが結合するＧＢＰは、ガレクチンを含む。ガレクチンは、高度に保存されたグリカン結合可溶性レクチンのファミリーであり、保存された炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）及び共通の構造的折り畳みにより定義される。Ｖａｓｔａ ＧＲ （２０１２） Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ９４６：２１－３６。哺乳動物ガレクチンは、構造的特徴に基づいて以下の３種類に分類されている：１つのＣＲＤを含有し、単量体として存在するか、または非共有結合性相互作用により二量体化するプロトタイプガレクチン（Ｇａｌ－１、－２、－５、－７、－１０、－１１、－１３、－１４、及び－１５）、リンカーペプチドにより連結された２つの異なるＣＲＤを含有する二価ガレクチンとして存在するタンデムリピート型ガレクチン（Ｇａｌ－４、－６、－８、－９、及び－１２）、及び最後にガレクチンファミリー唯一のキメラ型メンバーであるＧａｌ－３。ガレクチンは、腫瘍形成及び転移において異なる事象を調節する。ガレクチンは、エフェクターＴ細胞のアポトーシス、クローン増殖の調節、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能、及びサイトカイン分泌の制御により免疫回避及び免疫回避に寄与する。一部のガレクチンについては、悪性形質転換の間に発現レベルも変化し、このことは、がんの進行におけるそれらの役割を確認するものである。ほとんど全ての悪性腫瘍細胞により多量に分泌されるＧａｌ－１は、免疫抑制性腫瘍形成性微小環境の主要な促進因子として特徴付けられている。ファミリーの別のメンバーであるＧａｌ－３は、多数の腫瘍において顕著な腫瘍形成効果を示した。Ｇａｌ－１と同様に、Ｇａｌ－３シグナル伝達は、特定のグリカンと相互作用し、抗腫瘍反応を弱めることにより、免疫抑制性ＴＭＥの方にバランスを傾けるのに寄与する。この点に関して、Ｇａｌ－３は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のアネルギーを促進することが示された。幾つかの実施形態によれば、グリカン結合部分は、Ｇａｌ－１、Ｇａｌ－２、Ｇａｌ－３、Ｇａｌ－４、Ｇａｌ－５、Ｇａｌ－６、Ｇａｌ－７、Ｇａｌ－８、Ｇａｌ－９、Ｇａｌ－１０、Ｇａｌ－１１、Ｇａｌ－１２、Ｇａｌ－１３、Ｇａｌ－１４、及びＧａｌ－１５から選択されるガレクチンのグリカン結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが結合するＧＢＰは、Ｇａｌ－１を含む。幾つかの実施形態によれば、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが結合するＧＢＰは、Ｇａｌ－３を含む。
ある種の態様では、ＧＢＰを発現する細胞と細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するための方法であって、当該ＧＢＰを発現する細胞を、当該ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されるＧＢＰに結合し、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合すると確認された薬剤と、当該ＧＢＰを発現する細胞と当該細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するのに有効な量で接触させることを含む（すなわち、当該ＧＢＰは、接触させる前に、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合するＧＢＰとして同定されたＧＢＰである）、当該方法が提供される。薬剤は、ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されたＧＢＰへの薬剤の結合が、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞の表面に提示されたｇｌｙｃｏＲＮＡに結合するＧＢＰの能力に干渉する（例えば、これを阻害する）ものである。
幾つかの実施形態によれば、ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されたＧＢＰに結合する薬剤は、ＧＢＰのリガンドである。本明細書で使用する場合、「リガンド」は、生体分子と複合体を形成して、生物学的目的を果たす物質である。リガンドは、ＧＢＰを発現する細胞の表面上のＧＢＰと複合体を形成する循環因子、分泌因子、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、ペプチド、ポリペプチド、低分子、及び核酸から選択される物質であり得る。ある特定の実施形態では、薬剤がリガンドである場合、リガンドは、ＧＢＰとの複合体形成が発生するが、かかる複合体形成の正常な生物学的結果が生じないように修飾される。
ある特定の実施形態では、ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されたＧＢＰに結合する薬剤は、低分子である。「低分子」は、１０００原子質量単位（ａｍｕ）以下の分子量を有する化合物を意味する。幾つかの実施形態では、低分子は、７５０ａｍｕ以下、５００ａｍｕ以下、４００ａｍｕ以下、３００ａｍｕ以下、または２００ａｍｕ以下である。ある特定の実施形態では、低分子は、ポリマーに存在するような反復単位分子でできていない。
幾つかの実施形態によれば、ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されたＧＢＰに結合する薬剤は、抗体である。「抗体」は、任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭなど）、全長抗体（例えば、四量体から構成される抗体（また四量体は２つの重鎖及び軽鎖ポリペプチド二量体から構成される））；単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）；限定されるものではないが、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、（ｓｃＦｖ’）２、及びダイアボディが含まれる、ＧＢＰに対する特異的結合性を保持する抗体断片（例えば、全長抗体または単鎖抗体の断片）；キメラ抗体；モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（例えば、ヒト化全長抗体、ヒト化半抗体、またはヒト化抗体断片、例えば、ヒト化ｓｃＦｖ）；ならびに抗体の抗原結合部分及び非抗体タンパク質を含む融合タンパク質を意味する。ある特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、Ｆｖ、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’から選択される。抗体は、例えば、インビボイメージング剤、放射性同位体、検出可能な生成物を生成する酵素、蛍光タンパク質などで検出可能に標識され得る。抗体は、更に他の部分、例えば、特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対のメンバー）などにコンジュゲートされ得る。
ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されるＧＢＰに結合する薬剤は、１種以上の特定のＧＢＰを結合するように選択され得る。かかる薬剤の非限定的な例としては、１種以上のＳｉｇｌｅｃ（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ－１１、Ｓｉｇｌｅｃ－１４、及び／または同様のもの）、１種以上のＣ型レクチン、１種以上のガレクチン、及び／または１種以上のセレクチンに結合するものが挙げられる。薬剤は、ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されるＧＢＰの同定されたｇｌｙｃｏＲＮＡ結合特性と組み合わせて、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞上に提示されるｇｌｙｃｏＲＮＡの種類（複数可）に基づいて選択され得る。１つの非限定的な例では、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞がシアル化グリカンを含むｇｌｙｃｏＲＮＡを提示し、ＧＢＰを発現する細胞が１種以上のＳｉｇｌｅｃ（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ－１１、Ｓｉｇｌｅｃ－１４、及び／または同様のもの）を発現する場合、選択される薬剤は、当該Ｓｉｇｌｅｃのうちの１つ以上に結合し、当該Ｓｉｇｌｅｃのシアル化グリカンを含む当該ｇｌｙｃｏＲＮＡとの相互作用を遮断するものであり得る。様々な種類のＧＢＰに結合し、ＧＢＰ結合を遮断することができる抗体、リガンド、及び他の薬剤が公知であり、本開示の方法を実施する場合に用いられ得る。一例として、Ｓｉｇｌｅｃ遮断抗体が利用可能であり、例えば、Ｐｉａ Ｌｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．（２０２０） Ｃｅｌｌ ９（１２）：２６９１（その開示は全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ある種の態様では、グリカンＧＢＰを発現する細胞と細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するための方法であって、当該細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞を、当該細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合し、及び／またはこれを編集する薬剤と、当該ＧＢＰを発現する細胞と当該細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するのに有効な量で接触させることを含む、当該方法が提供される。
幾つかの実施形態によれば、薬剤は、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを編集する。ある特定の実施形態では、このような薬剤は、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡからグリカンを除去する酵素を含む。一例として、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡがシアル化グリカンを含む場合、シアリダーゼを含む薬剤が用いられ得る。好適なシアリダーゼとしては、限定されるものではないが、原核生物シアリダーゼ及び真核生物シアリダーゼが挙げられる。用いられ得る原核生物シアリダーゼとしては、細菌シアリダーゼが挙げられる。本開示のコンジュゲートに有用である細菌シアリダーゼの１つの例は、ネズミチフス菌シアリダーゼ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２９７６８）である。本開示のコンジュゲートに有用である細菌シアリダーゼの別の例は、コレラ菌シアリダーゼ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０Ｃ６Ｅ９）である。用いられ得る真核生物シアリダーゼとしては、例えば、哺乳動物シアリダーゼ及び非哺乳動物真核生物シアリダーゼが挙げられる。関心対象の哺乳動物シアリダーゼ（または哺乳動物ノイラミニダーゼ）としては、霊長類由来のもの、例えば、ヒトまたは非ヒトノイラミニダーゼが挙げられる。ある特定の実施形態では、シアリダーゼは、ヒトシアリダーゼである。幾つかの実施形態によれば、ヒトシアリダーゼは、ヒトノイラミニダーゼ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９９５１９）、ヒトノイラミニダーゼ２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｙ３Ｒ４）、ヒトノイラミニダーゼ３（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＵＱ４９）、及びヒトノイラミニダーゼ４（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＷＷＲ８）から選択される。シアリダーゼは、野生型シアリダーゼの誘導体、例えば、切断型誘導体、対応する野生型シアリダーゼより多くのアミノ酸を含む誘導体、１つ以上のアミノ酸置換（例えば、１つ以上の保存的置換、１つ以上の非保存的置換、天然アミノ酸の非天然アミノ酸との置換、及び／または同様のもの）を含む誘導体などであってもよいことが理解されよう。誘導体は、元の野生型シアリダーゼのグリコシドヒドロラーゼ活性の少なくとも一部を保持する。
ある特定の実施形態では、シアリダーゼを含む薬剤が用いられる場合、シアリダーゼは、標的化部分、例えば、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞の表面の細胞表面分子（例えば、腫瘍抗原、細胞表面受容体、及び／または同様のもの）に結合する抗体、リガンドなどと結合（例えば、コンジュゲート、融合など）されてもよい。かかる薬剤の非限定的な例としては、米国特許出願第ＵＳ２０１９／０２４８９１９号（その開示は全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものが挙げられる。
幾つかの実施形態によれば、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを編集する薬剤が用いられる場合、薬剤はリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）を含む。本開示の方法を実施するのに有用であるＲＮアーゼの非限定的な例としては、ＲＮアーゼＡ、Ｔ１ ＲＮアーゼ、Ｔ２ ＲＮアーゼ、及びＲＮアーゼ１が挙げられる。幾つかの実施形態では、ＲＮアーゼは、ヒトＲＮアーゼであり、その非限定的な例としては、ヒトＲＮアーゼ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０７９９８）が挙げられる。
ある特定の実施形態では、薬剤は、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合するが、これを編集しない。幾つかの実施形態によれば、このような薬剤は、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合する抗体である。好適な抗体としては、限定されるものではないが、抗二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）抗体が含まれる抗ＲＮＡ抗体が挙げられる。用いられ得る抗ｄｓＲＮＡ抗体の１つの非限定的な例は、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙから利用可能であり、ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合することが本明細書の実施例セクションにおいて実証されたＪ２抗体、またはＪ２抗体の結合特性を有する抗体、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡへの結合についてＪ２抗体と競合する抗体である。
幾つかの実施形態によれば、薬剤が細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合するが、これを編集しない場合、薬剤は、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合するグリカン結合部分を含む。例えば、薬剤は、細胞表面に提示されたｇｌｙｃｏＲＮＡへの細胞表面ＧＢＰの結合を妨害（例えば、遮断）する、ｇｌｙｃｏＲＮＡに対する可溶性の「デコイ受容体」であり得る。ある特定の実施形態では、グリカン結合部分は、シアログリカン結合レクチンのシアログリカン結合ドメインを含む。シアログリカン結合部分の非限定的な例としては、Ｓｉｇｌｅｃ（例えば、限定されるものではないが、Ｓｉｇｌｅｃ－１１、Ｓｉｇｌｅｃ－１４などが含まれる、ＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃ）のシアログリカン結合ドメインを含むものが挙げられる。レクチンの「グリカン結合ドメイン」または「シアログリカン結合ドメイン」は、対応するグリカン（複数可）への結合を担う、レクチンまたはそのグリカン／シアログリカン結合バリアント（例えば、グリカン／シアログリカン結合断片）のドメインを意味する。Ｓｉｇｌｅｃは、例えば、シアロシドリガンドの結合を担う細胞外Ｎ末端ＶセットＩｇ（Ｉｇ－Ｖ）ドメインを含む。Ｓｉｇｌｅｃ及び他のレクチンのアミノ酸配列及びドメイン（例えば、細胞外ドメイン）は、公知であり、任意のかかるドメインは、所望される場合、グリカン結合部分に含まれ得る。
本開示の態様は、薬剤をＧＢＰを発現する細胞に標的化する方法であって、当該ＧＢＰを発現する細胞を、当該薬剤と安定的に結合した可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡと接触させることを含む、当該方法を更に含む。ある特定の実施形態では、「安定的に結合した」は、結合の平均半減期が４℃のＰＢＳ中で１日以上である、２つの実体間の物理的結合を意味する。幾つかの実施形態では、２つの実体間の物理的結合は、４℃のＰＢＳ中で１日以上、１週間以上、１ヵ月以上、例えば、６ヵ月以上、例えば、１年以上の平均半減期を有する。幾つかの実施形態によれば、安定した結合は、２つの実体間の共有結合、２つの実体間の非共有結合（例えば、イオンまたは金属結合）、または他の種類の化学親和力、例えば、水素結合、ファンデルワールス力などにより生じる。
幾つかの実施形態によれば、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡと安定的に結合した（例えば、コンジュゲートされた）薬剤は、治療薬である。例えば、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡは、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合する細胞表面ＧＢＰを発現する細胞への治療薬の標的化送達のために用いられ得る。ある特定の実施形態では、薬剤は、ＧＢＰを発現する細胞を調節する薬剤である。「薬剤を調節する」とは、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡがＧＢＰを発現する細胞のＧＢＰに結合した際に、ＧＢＰを発現する細胞の１つ以上の活性を調節する（例えば、誘発または阻害する）薬剤を意味する。幾つかの実施形態では、ＧＢＰを発現する細胞を調節する薬剤は、ＧＢＰを発現する細胞の表面上の細胞表面分子（例えば、受容体）に結合し、細胞表面分子を介してシグナル伝達（活性化または抑制性シグナル伝達であり得る）を誘発する。幾つかの実施形態によれば、例えば、ＧＢＰを発現する細胞の増殖を停止させるか、またはこれを死滅させることが望ましい場合、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡに安定的に結合した（例えば、コンジュゲートされた）薬剤は、本明細書の他箇所で記載される細胞分裂阻害剤または細胞毒性剤である。
ある特定の実施形態では、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡに安定的に結合した（例えば、コンジュゲートされた）薬剤は、検出可能な標識を含み、その非限定的な例は本明細書の他箇所で記載されている。かかる方法は、例えば、インビトロ及び／またはインビボで、例えば、インビボイメージングにより、ＧＢＰを発現する細胞を検出することが望ましい場合、有用である。
本開示の態様は、ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されたＧＢＰを介してシグナル伝達を誘発するための方法であって、当該ＧＢＰを発現する細胞を可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡと接触させることを含み、ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されたＧＢＰへの当該可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡの結合が、ＧＢＰを介してシグナル伝達を誘発する、当該方法を更に含む。可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡは、本明細書の他箇所に記載される可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡコンジュゲートのいずれかが含まれる、本明細書の他箇所に記載されるｇｌｙｃｏＲＮＡ特性のうちの１つまたは任意の組み合わせを有し得る。ある特定の実施形態では、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡは、それらがグリカン結合レクチンに結合し、それを介してシグナル伝達を誘発するように選択される。グリカン結合レクチンは、シアログリカン結合レクチンであり得、その非限定的な例としては、Ｓｉｇｌｅｃが挙げられる。Ｓｉｇｌｅｃ（複数可）は、本明細書の他箇所に記載されるＳｉｇｌｅｃのいずれかであり得る。ある特定の実施形態では、１種以上のＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃ（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ－１１、Ｓｉｇｌｅｃ－１４、及び／または同様のもの）に結合する可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが用いられる。
ＧＢＰを発現する細胞と細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するための、薬剤をＧＢＰを発現する細胞に標的化するための、ＧＢＰを発現する細胞などの表面に発現されたＧＢＰを介してシグナル伝達を誘発するための、本明細書に記載される方法のいずれかは、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで実行され得る。
インビボでの実施形態について、幾つかの実施形態では、接触させることが、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡを投与する必要がある個体（例えば、ＧＢＰを発現する細胞と細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用の低減を必要とする個体）に、当該個体におけるＧＢＰを発現する細胞と細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するのに有効な量で投与することを含む方法が提供される。また一例として、接触させることが、薬剤を投与する必要がある個体（例えば、ＧＢＰを発現する細胞と細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用の低減を必要とする個体）に、当該個体におけるＧＢＰを発現する細胞と細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するのに有効な量で投与することを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、接触させることが、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡを投与する必要がある個体（例えば、ＧＢＰを介したシグナル伝達を必要とする個体）に投与することを含む方法であって、当該個体におけるＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されたＧＢＰへの当該可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡの結合が、ＧＢＰを介したシグナル伝達を誘発する、当該方法が提供される。可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡ（そのコンジュゲートが含まれる）及び本明細書に記載される他の薬剤のいずれかが適切な投与経路により投与され得、その非限定的な例としては、（例えば、錠剤形態、カプセル形態、液体形態などでの）経口投与、（例えば、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、硬膜外注射による）非経口投与、局所投与、鼻腔内投与、または腫瘍内投与が挙げられる。
本明細書に記載されるインビボでの実施形態のいずれかによれば、可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡを投与する必要がある個体は、医学的状態を有し得、それの非限定的な例としては、がん、自己免疫障害、炎症性疾患、感染性疾患、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
本開示の態様は、生体試料をグリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）について評価する方法であって、当該生体試料に対してｇｌｙｃｏＲＮＡ検出アッセイを実行することを含む、当該方法を更に含む。幾つかの実施形態では、試料は、細胞試料、すなわち、細胞を含む試料である。細胞試料は、生体組織または培養細胞の採取物などに由来し得る。細胞試料は、当該細胞試料が得られる供給源に応じて、様々な異なる種類（２種以上、３種以上、４種以上、５種以上などが含まれる）の細胞を含有する不均一性であり得るか、または本質的に１種類の細胞を含有する実質的な均一性であり得る。試料が細胞試料である場合、アッセイは、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡ検出アッセイであり得る。本開示の恩恵を受けて、種々の細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡ検出アッセイが実行され得ることが理解されよう。ある特定の実施形態では、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡ検出アッセイは、細胞試料の細胞をｇｌｙｃｏＲＮＡ結合剤と接触させること、及び試料中の細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡへのｇｌｙｃｏＲＮＡ結合剤の結合について評価することを含む。幾つかの実施形態によれば、ｇｌｙｃｏＲＮＡ結合剤は、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合する抗体である。好適な抗体としては、限定されるものではないが、抗二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）抗体が含まれる抗ＲＮＡ抗体が挙げられる。用いられ得る抗ｄｓＲＮＡ抗体の１つの非限定的な例は、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙから利用可能であり、ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合することが本明細書の実施例セクションにおいて実証されたＪ２抗体、またはＪ２抗体の結合特性を有する抗体、例えば、ｇｌｙｃｏＲＮＡへの結合についてＪ２抗体と競合する抗体である。
ある特定の実施形態では、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡ検出アッセイは、細胞試料の細胞をリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）と接触させて、存在する場合、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを消化すること、及び細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡの分解について評価することを含む。本開示の方法を実施するのに有用であるＲＮアーゼの非限定的な例としては、ＲＮアーゼＡ、Ｔ１ ＲＮアーゼ、Ｔ２ ＲＮアーゼ、及びＲＮアーゼ１が挙げられる。幾つかの実施形態では、ＲＮアーゼは、ヒトＲＮアーゼであり、その非限定的な例としては、ヒトＲＮアーゼ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０７９９８）が挙げられる。
生体試料をｇｌｙｃｏＲＮＡについて評価する方法は、生体試料に対して遊離ｇｌｙｃｏＲＮＡ検出アッセイを実行することを含み得る。「遊離ｇｌｙｃｏＲＮＡ」は、細胞から遊離された（例えば、分泌された、脱落した、及び／または同様のこと）ＲＮＡを意味する。遊離ｇｌｙｃｏＲＮＡ検出アッセイは、細胞試料または非細胞性試料で実行され得る。
生体試料をｇｌｙｃｏＲＮＡについて評価する方法は、細胞培養培地試料、組織試料、体液試料などが含まれる、種々の生体試料で実行され得る。幾つかの実施形態では、試料は、限定されるものではないが、ヒトまたは動物の組織、器官、組織培養物、バイオリアクター試料、真核生物、原核生物が含まれる、任意の生細胞または生物から採取された任意の固体または液体試料である。例えば、試料は、例えば、羊水、房水、ガラス体液、胆汁、血液、血漿、血清、脳脊髄液、耳垢、乳糜、消化粥、内リンパ、外リンパ、滲出液、糞便、胃液、リンパ液、粘液、囲心腔液、腹膜液、胸膜液、膿、粘膜分泌物、唾液、皮脂、漿液、精液、血清、恥垢、痰、滑液、汗、涙液、尿、膣分泌物、膣排泄物、嘔吐物などであり得るか、またはそれらから採取され得る。
本開示の方法において使用される試料は、任意の便利な手段により採取され得る。一部の例では、有用な細胞試料は、生検材料であり得るか、または生検材料に由来し得る。生検組織は、健常な組織または患部組織（例えば、がん組織が含まれる）から採取され得る。がんの種類及び／または実行される生検の種類に応じて、試料は、固体組織生検または液体生検により調製され得る。
一部の例では、試料は、外科的生検により調製され得る。限定されるものではないが、例えば、切採生検、切開生検、ワイヤーを用いた位置特定による生検などが含まれる、外科的生検のための任意の便利かつ適切な技術が、本明細書に記載される方法に用いられる試料の採取のために利用され得る。一部の例では、外科的生検は、例えば、限定されるものではないが、腫瘍切除、乳房切除、リンパ節手術、腋窩リンパ節郭清、センチネルリンパ節手術などが含まれる、試料を採取すること以外の主要な目的がある外科的処置の一部として達成され得る。
様々な他の生検技術が、本明細書に記載される試料として使用される生検組織を得るために用いられ得る。非限定的な例として、試料は、針生検により採取され得る。限定されるものではないが、例えば、穿刺吸引（ＦＮＡ）、コア針生検、定位コア生検、吸引式生検などが含まれる、針生検のための任意の便利かつ適切な技術が、試料の採取に利用され得る。
本開示の態様は、グリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）を産生させる方法であって、ｇｌｙｃｏＲＮＡが産生される条件下でｇｌｙｃｏＲＮＡ産生細胞を培養すること、及び産生されたｇｌｙｃｏＲＮＡを単離することを含む、当該方法を更に含む。かかる方法は、限定されるものではないが、本開示のコンジュゲート及び／または医薬組成物に組み込むための可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡの産生が含まれる、種々の文脈において有用である。本開示の可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡ産生方法を実施するのに有用な培養条件、単離方法などは、以下の実施例セクションで詳細に記載される。
幾つかの実施形態では、関心対象のｇｌｙｃｏＲＮＡの産生は、所与の種類（野生型または糖鎖改変型）の細胞の生産（例えば、大規模生産）を含み得、次いで、当該細胞は最初に膜を単離するために生化学的に分画され、続いて、ＲＮＡが化学的手段（例えば、沈殿）によりタンパク質及び他の生体分子から分離される。ある特定の実施形態では、ｇｌｙｃｏＲＮＡをＲＮＡ－膜調製物中の任意の他のＲＮＡから精製するために、レクチンまたは他のグリカン結合タンパク質を使用してグリカンが濃縮される。幾つかの実施形態では、精製後の糖鎖操作が実行され、その非限定的な例としては、シアル酸、フコース、及び／または同様のもの除去または付加が挙げられる。
幾つかの実施形態では、細胞培養／生産段階において、本方法は、以下のうちの１つまたは任意の組み合わせを含み得る：細胞に過剰なヌクレオチドを提供して、ＲＮＡ生合成の流量を、過剰なヌクレオチドの非存在下での流量と比較して増加させること；細胞に過剰な糖（例えば、過剰なグルコース、ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、またはそれらの任意の組み合わせ）を提供して、グリカン生合成の流量を、過剰な糖の非存在下での流量と比較して増加させること；細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡの蓄積を増強するために、細胞における１つ以上の細胞膜代謝回転経路を阻害すること；及びグリカン生合成経路の一部を阻害して、ＲＮＡグリカンの生成を助けること、例えば、Ｏ－グリカン生成を阻害して、Ｎ－グリカン生成を助けること。
本開示の態様は、細胞表面上でのグリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）の提示を操作する方法を更に含む。ある特定の実施形態では、かかる方法は、細胞がその表面上に１種類以上の関心対象のｇｌｙｃｏＲＮＡを提示するように、１種以上のリボ核酸及び／またはグリカン生合成酵素をコードする１種以上の発現構築物を細胞に導入することを含む。幾つかの実施形態によれば、１種類以上の提示されたｇｌｙｃｏＲＮＡは、細胞を一意に同定するために利用される。例えば、１種以上の細胞は、当該１種以上の細胞を一意に同定する「バーコード」として機能するための１種以上の遺伝子改変型ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示するように遺伝子操作され得る。
コンジュゲート、融合タンパク質、及び組成物
本開示の態様は、コンジュゲート、融合タンパク質、及び組成物を更に含む。幾つかの実施形態では、コンジュゲート、融合タンパク質、及び組成物は、本明細書の他箇所に記載される方法のいずれかが含まれる、本開示の方法のいずれかの実施に有用である。本明細書における方法セクションに記載されるコンジュゲート、融合タンパク質、及び組成物のいずれかが本開示により提供される。
ある種の態様では、本明細書の他箇所に記載される薬剤のいずれかにコンジュゲートされた本明細書の他箇所に記載される可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡのいずれかが提供される。一例として、薬剤は、治療薬、検出可能な標識を含む薬剤などであり得る。
幾つかの態様には、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）にコンジュゲートされた標的化部分（例えば、抗体、リガンド、低分子、アプタマー、及び／または同様のもの）が提供される。コンジュゲートに用いられ得るＲＮアーゼの非限定的な例としては、ＲＮアーゼＡ、Ｔ１ ＲＮアーゼ、Ｔ２ ＲＮアーゼ、及びＲＮアーゼ１が挙げられる。ある特定の実施形態では、ＲＮアーゼは、ヒトＲＮアーゼである。幾つかの実施形態によれば、ＲＮアーゼは、ヒトＲＮアーゼ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０７９９８）である。
ある特定の態様では、ＲＮアーゼに融合された標的化部分（例えば、抗体、リガンド及び／または任意の他のタンパク質性標的化部分）を含む融合タンパク質が提供される。例えば、標的細胞の表面上のｇｌｙｃｏＲＮＡを分解させることが望ましい場合、標的化部分は、ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示するかかる細胞の表面上に発現される分子に特異的に結合する能力に基づいて選択され得る。
本開示の可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質のいずれかを含む組成物も提供される。ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、液体媒体中に存在する本開示の可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質のいずれかを含む。液体媒体は、例えば、水、緩衝液などの水性液体媒体であり得る。１種以上の添加剤、例えば、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）、緩衝剤（Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など、可溶化剤、界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０など）、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、グリセロール、キレート剤などが、かかる組成物中に存在し得る。
本開示の態様は、医薬組成物を更に含む。幾つかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、本開示の可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質のいずれか、ならびに薬学的に許容される担体を含む。
可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質は、治療投与のための種々の製剤に組み込まれ得る。より具体的には、可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質は、適切な薬学的に許容される賦形剤または希釈剤と組み合わせることにより医薬組成物に製剤化され得、固体、半固体、液体、またはガス形態の調製物、例えば、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、軟膏、溶剤、注射剤、吸入剤、及びエアロゾルに製剤化され得る。
個体への投与用の（例えば、ヒトへの投与に好適な）可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質の製剤は、通常無菌であり、更に、選択された投与経路による患者への投与に禁忌を示す検出可能な発熱物質または他の夾雑物を含まなくてもよい。
医薬剤形において、可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質は、それらの薬学的に許容される塩の形態で投与されてもよく、またはそれらは、単独でもしくは他の薬学的に活性な化合物と適切に会合させて、同様にそれらと組み合わせて使用されてもよい。以下の方法及び担体／賦形剤は、単に例にすぎず、本発明を限定するものではない。
経口調製物の場合、可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質は、単独で使用され得るか、または錠剤、散剤、顆粒、もしくはカプセルを製造するための適切な添加剤、例えば、従来の添加剤、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、もしくはジャガイモデンプン；結合剤、例えば、結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシデンプンもしくはゼラチン；崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、もしくはカルボキシメチルセルロースナトリウム；滑沢剤、例えば、タルクもしくはステアリン酸マグネシウム；ならびに必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、及び香味剤と組み合わせて使用され得る。
可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質は、非経口投与（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、大脳内、脳室内、クモ膜下腔内、皮下投与など）用に製剤化され得る。ある種の態様では、可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質は、可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質を、水性または非水性溶媒、例えば、植物油または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、より高次の脂肪酸またはプロピレングリコールのエステル中で、かつ必要に応じて、従来の添加剤、例えば、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、及び防腐剤と共に溶解させるか、懸濁させるか、または乳化することにより注射用に製剤化される。
可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質を含む医薬組成物は、所望の純度を有する可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、界面活性剤、緩衝液、及び／または等張化剤と混合することにより調製され得る。許容可能な担体、賦形剤、及び／または安定剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対し無毒性であり、これらとしては、緩衝剤、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニン、及びクエン酸；防腐剤（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロロ－ｍ－クレゾール、メチルもしくはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、またはそれらの組み合わせ）；アミノ酸、例えば、アルギニン、グリシン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、及びそれらの組み合わせ；単糖、二糖、及び他の炭水化物；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、ゼラチンもしくは血清アルブミン；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ－メチルグルコサミン、ガラクトサミン、及びノイラミン酸；及び／または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成された液体形態であり得、ここで、凍結乾燥調製物は、投与前に無菌溶液で再構成される。凍結乾燥組成物を再構成するための標準的な手順は、ある容量（通常、凍結乾燥中に除去された容量に等しい容量）の純水を添加して戻すことである。しかしながら、抗菌剤を含む溶液が、非経口投与用の医薬組成物を作製するために使用されてもよい。
水性製剤は、例えば、約４．０～約７．０、もしくは約５．０～約６．０の範囲のｐＨ、または代替的に約５．５のｐＨで、ｐＨ緩衝液中に調製され得る。この範囲内のｐＨに好適な緩衝液の例としては、リン酸、ヒスチジン、クエン酸、コハク酸、酢酸緩衝液、及び他の有機酸緩衝液が挙げられる。緩衝液の濃度は、例えば、緩衝液及び製剤の所望の張度に応じて、約１ｍＭ～約１００ｍＭまたは約５ｍＭ～約５０ｍＭであり得る。
製剤の張度を調節するために、等張化剤が含まれ得る。例示的な等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、及びアミノ酸、糖の群からの任意の成分、ならびにそれらの組合せが挙げられる。幾つかの実施形態では、水性製剤は等張であるが、高張または低張溶液が好適であってもよい。用語「等張」は、生理的塩類溶液または血清などの、比較される幾つかの他の溶液と同じ張度を有する溶液を意味する。等張化剤は、約５ｍＭ～約３５０ｍＭの量で、例えば、１００ｍＭ～３５０ｍＭの量で使用され得る。
凝集を低減するために、及び／または製剤中の粒子の形成を最小限にするために、及び／または吸着を低減するために、界面活性剤も製剤に添加され得る。例示的な界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。好適なポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例は、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（商標）の商標下で販売）及びポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０（商標）の商標下で販売）である。好適なポリエチレン－ポリプロピレンコポリマーの例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ６８またはＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（商標）の名称で販売されているものである。好適なポリオキシエチレンアルキルエーテルの例は、Ｂｒｉｊ（商標）の商標下で販売されているものである。界面活性剤の例示的な濃度は、約０．００１％～約１％ｗ／ｖの範囲であり得る。
凍結乾燥処理中の不安定化条件から可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質を保護するために、凍結乾燥保護物質も添加され得る。例えば、公知の凍結乾燥保護物質としては、糖（グルコース及びスクロースが含まれる）；ポリオール（マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールが含まれる）；及びアミノ酸（アラニン、グリシン、及びグルタミン酸が含まれる）が挙げられる。凍結乾燥保護物質は、例えば、約１０ｍＭ～５００ｎＭの量で含まれ得る。
幾つかの実施形態では、医薬組成物は、可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質、ならびに上記で特定された成分（例えば、界面活性剤、緩衝液、安定剤、等張化剤）のうちの１つ以上を含み、１種以上の防腐剤、例えば、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロロ－ｍ－クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、及びそれらの組み合わせを本質的に含まない。他の実施形態では、防腐剤は、例えば、約０．００１～約２％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で製剤中に含まれる。
キット
本開示の態様は、キットを更に含む。ある特定の実施形態では、キットは、本開示の方法、例えば、ＧＢＰを発現する細胞と細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するためのインビトロ、インビボ、またはエクスビボでの方法、薬剤をＧＢＰを発現する細胞に標的化するための方法、ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されたＧＢＰを介したシグナル伝達を誘発するための方法などを実施するのに有用である。
従って、本開示のキットは、他箇所に記載されているが、簡潔さのためにここでは再度述べない可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質のいずれかが含まれる、本開示の可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質のいずれかを含み得る。キットは、医薬組成物中に存在する可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質を含み得る。本開示のキットが医薬組成物を含む場合、キットは、単位用量（例えば、アンプル）または複数回投与形態で存在するある量の組成物を含み得る。従って、ある特定の実施形態では、キットは、本開示の可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質のいずれかを含む１以上の（例えば、２以上の）単位用量（例えば、アンプル）の医薬組成物を含み得る。本明細書で使用する場合、用語「単位用量」は、単位投与量としてヒト及び動物対象に好適な物理的に分離した単位を指し、各単位が、所望の治療効果をもたらすのに十分な量で計算された所定量の組成物を含有する。単位用量の量は、様々な因子、例えば、用いられる特定の可溶性のｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート、及び／または融合タンパク質、達成されるべき効果、ならびに可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡ、コンジュゲート及び／または融合タンパク質に伴う個体における薬力学的作用に依存する。更なる他の実施形態では、キットは、単一の複数回投与量の組成物を含み得る。
ある特定の実施形態では、本開示のキットは、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで、ＧＢＰを発現する細胞と細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用するために、薬剤をＧＢＰを発現する細胞に標的化するための方法に、ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されたＧＢＰを介したシグナル伝達を誘発するための方法に、及び／またはその他のために、キットの内容物を使用するための使用説明書を含む。
キットに含まれる使用説明書（例えば、取扱説明書（ＩＦＵ））は、好適な記録媒体に記録されていてもよい。例えば、使用説明書は、基材、例えば、紙またはプラスチックなどに印刷されていてもよい。従って、使用説明書は、キットまたはその構成要素などの容器のラベルに添付文書としてキットに存在してもよい（すなわち、包装または下位包装に付随してもよい）。他の実施形態では、使用説明書は、好適なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ポータブルフラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケットなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。更なる他の実施形態では、実際の使用説明書はキットに存在しないが、使用説明書をリモートソースから、例えば、インターネットを通じて入手するための手段が提供される。この実施形態の例は、使用説明書を閲覧でき、及び／または使用説明書をダウンロードできるウェブアドレスを記載したキットである。使用説明書と同様に、使用説明書を入手するための手段が好適な基材に表示される。
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される式（Ｉ）の化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、多形体、共結晶、互変異性体、立体異性体、同位体標識誘導体、もしくはプロドラッグ、及び任意に賦形剤を含む組成物を提供する。ある特定の実施形態では、組成物は、ヒトに対する用途（例えば、医学的用途、産業用途、研究用途）に使用される。ある特定の実施形態では、組成物は、ヒト以外の獣医学的用途に使用される（例えば、非ヒト動物（例えば、家畜、伴侶動物）に使用される）。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）、商業的に重要な哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、またはイヌ）、または鳥類（例えば、商業的に重要な鳥類、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、またはシチメンチョウ））である。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、研究動物（例えば、霊長類、ラット、マウス、イヌ、魚類）である。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、魚類、爬虫類、または両生類である。非ヒト動物は、任意の発生段階の雄または雌であり得る。ある特定の実施形態では、非ヒト伴侶動物は、イヌである。ある特定の実施形態では、非ヒト伴侶動物は、ネコである。ある特定の実施形態では、非ヒト伴侶動物は、鳥類である。本明細書に記載される組成物は、当該技術分野において公知の任意の方法により調製され得る。別の態様では、本明細書に記載される化合物または組成物及び（例えば、対象に当該化合物またはその組成物を投与するための、または生体試料を当該化合物またはその組成物と接触させるための）使用説明書を含む第１の容器を含むキットが提供される。キットは、容器（例えば、バイアル、アンプル、ボトル、シリンジ、及び／またはディスペンサー容器、または他の好適な容器）を更に含み得る。幾つかの実施形態では、提供されるキットは、本明細書に記載される化合物または組成物の希釈または懸濁のための賦形剤を含む第２の容器を任意に更に含み得る。
例示的な実施形態：セクションＡ
以下に記載される実施形態は、本明細書において意図される発明の例示であることを意図する。
１．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡと、を含む医薬組成物。
２．前記グリカン部分が、シアル酸、フコース、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
３．前記グリカン部分が、ＧｌｃＮＡｃ、マンノース、ガラクトース、シアル酸、及びフコース、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
４．全身投与の必要があるヒト対象への全身投与用に製剤化された、実施形態１に記載の医薬組成物。
５．全身投与の必要がある哺乳動物対象への全身投与用に製剤化された、実施形態１に記載の医薬組成物。
６．複数回の全身投与の必要があるヒト対象への複数回の全身投与に好適な、実施形態１に記載の医薬組成物。
７．複数回の全身投与の必要がある哺乳動物対象への複数回の全身投与に好適な、実施形態１に記載の医薬組成物。
８．前記グリカン部分が、第１の末端残基及び第２の末端残基を含む二分岐のＮ結合型グリカンを含み、前記第１または第２の末端残基のうちの少なくとも１つがシアル酸を含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
９．前記グリカン部分が、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む三分岐のＮ結合型グリカンを含み、前記第１または第２または第３の末端残基のうちの少なくとも１つがシアル酸を含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
１０．前記グリカン部分が、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む三分岐のＮ結合型グリカンを含み、前記第１または第２または第３の末端残基のうちの少なくとも１つが１つ以上のポリシアル酸末端修飾を含むシアル酸残基を含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
１１．前記グリカン部分が、前記グリカンのコアまたは基部に存在するＧｌｃＮＡｃ残基に連結されたフコースを含む二分岐のＮ結合型グリカンを含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
１２．前記グリカン部分が、樹状部分またはアームに存在するＧｌｃＮＡｃ残基に連結されたフコースを含む二分岐のＮ結合型グリカンを含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
１３．前記グリカン部分が、２本以上のアームを含み、前記アームのうちの２本の間にＧｌｃＮＡｃを有し、これにより、バイセクト型グリカンを形成している二分岐のＮ結合型グリカンを含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
１４．前記グリカン部分が、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む三分岐のＮ結合型グリカンを含み、前記第１及び第２の末端残基のうちの少なくとも１つがフコースを含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
１５．前記グリカン部分が、第１の末端残基及び第２の末端残基を含む二分岐のＮ結合型グリカンを含み、少なくとも１つの末端残基がシアル酸を含み、少なくとも１つの末端残基がフコースを含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
１６．前記グリカン部分が、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む三分岐のＮ結合型グリカンを含み、少なくとも１つの末端残基がシアル酸であり、１つの末端残基がフコースである、実施形態１に記載の医薬組成物。
１７．前記グリカン部分がＮ結合型グリカンを含み、前記ＲＮＡが修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
１８．前記グリカン部分がＮ結合型グリカンを含み、核酸が修飾ヌクレオチドを含み、前記修飾ヌクレオチドの核酸内での位置が異なり得る、実施形態１に記載の医薬組成物。
１９．前記グリカン部分がＮ結合型グリカンを含み、核酸が修飾ヌクレオチドを含み、前記修飾が２種以上のグリカンを結合させるように直交型である、実施形態１に記載の医薬組成物。
２０．前記修飾ＲＮＡが、少なくとも約１５、２０、２５、３０、５０、１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００個のヌクレオチド、または１００００個超のヌクレオチドを含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
２１．前記修飾ＲＮＡが非天然ヌクレオチドを含まない、実施形態１に記載の医薬組成物。
２２．前記修飾ＲＮＡが、約１５、２０、２５、３０、または５０個未満のヌクレオチドを含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
２３．前記修飾ＲＮＡが、マイクロＲＮＡ結合部分を含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
２４．前記修飾ＲＮＡが、ポリペプチドをコードする配列を含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
２５．前記修飾ＲＮＡに作動可能に連結された治療用部分を更に含み、前記治療用部分が、抗体、低分子、同位体、酵素、及びペプチドから選択される、実施形態１に記載の医薬組成物。
２６．修飾ＲＮＡが、ＲＮＡとグリカンとの間に切断可能なリンカーを含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
２７．修飾ＲＮＡが、ＲＮＡとグリカンとの間に切断可能なリンカーを含み、前記切断可能なリンカーが、ｐＨ依存性、ジスルフィド結合、ペプチド切断部位、またはｃｉｔ－ｖａｌリンカーである、実施形態１に記載の医薬組成物。
２８．長時間の薬力学的効果をもたらす方法であって、長時間の薬力学的効果をもたらす必要がある対象にグリカンで修飾されたＲＮＡを投与することを含む、前記方法。
２９．がんを処置する方法であって、がんを処置する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡと、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
３０．自己免疫疾患を処置する方法であって、自己免疫疾患を処置する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡと、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
３１．ＩｇＥ依存性アレルギーを処置する方法であって、ＩｇＥ依存性アレルギーを処置する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡと、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
３２．全身性エリテマトーデスを処置する方法であって、全身性エリテマトーデスを処置する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡと、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
３３．ウイルス感染症を処置する方法であって、ウイルス感染症を処置する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡと、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
３４．キメラ抗原受容体を送達する方法であって、キメラ抗原受容体を送達する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡであって、キメラ抗原受容体ポリペプチドをコードする配列を含む、前記修飾ＲＮＡと、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
３５．細胞または複数の細胞を作製する方法であって、
ａ）単離された細胞または複数の単離された細胞を提供することと、
ｂ）グリカンを含む修飾ＲＮＡの調製物を提供することと、
ｃ）前記修飾ＲＮＡを前記単離された細胞または前記複数の細胞に接触させることであって、前記単離された細胞または前記複数の細胞が前記修飾ＲＮＡに結合することができる、前記接触させることと、
を含む、前記方法。
３６．細胞または複数の細胞を作製する方法であって、
ａ）単離された細胞または複数の単離された細胞を提供することと、
ｂ）グリカンを含む低分子修飾ＲＮＡの調製物を提供することと、
ｃ）前記低分子修飾ＲＮＡを前記単離された細胞または前記複数の細胞に接触させることであって、前記単離された細胞または前記複数の細胞が前記低分子修飾ＲＮＡに結合することができる、前記接触させることと、
を含む、前記方法。
３７．細胞または複数の細胞を作製する方法であって、
ａ）単離された細胞または複数の単離された細胞を提供することと、
ｂ）グリカンを含む調製物を提供することと、
ｃ）前記高分子修飾ＲＮＡを前記単離された細胞または前記複数の細胞に接触させることであって、前記単離された細胞または前記複数の細胞が前記高分子修飾ＲＮＡに結合することができる、前記接触させることと、
を含む、前記方法。
３８．修飾ＲＮＡを作製する方法であって、
ａ）ＲＮＡを提供することと、
ｂ）前記ＲＮＡの前記グリカンへのコンジュゲーションにより前記ＲＮＡが修飾されるような条件下で前記ＲＮＡをグリカンと接触させることと、
を含む、前記方法。
３９．脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を作製する方法であって、
ａ）ＲＮＡを提供することと、
ｂ）前記ＲＮＡの前記グリカンへのコンジュゲーションにより前記ＲＮＡが修飾されるような条件下で前記ＲＮＡをグリカンと接触させることと、
ｃ）ＬＮＰが形成されるような条件下で前記修飾ＲＮＡを脂質と接触させることと、
を含む、前記方法。
４０．修飾ＲＮＡを作製する方法であって、
ａ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡを提供することと、
ｂ）ＬＮＰを提供することと、
ｃ）前記修飾ＲＮＡがＬＮＰの内部及び／または表面に存在するような条件下で前記修飾ＲＮＡを前記ＬＮＰと接触させることと、
を含む、前記方法。
４１．ＲＮＡナノ粒子（ＲＮＡ ＮＰ）を作製する方法であって、
ａ）ＲＮＡを提供することと、
ｂ）前記ＲＮＡの前記グリカンへのコンジュゲーションにより前記ＲＮＡが修飾されるような条件下で前記ＲＮＡをグリカンと接触させることと、
ｃ）ＲＮＡ ＮＰが形成されるような条件下で前記修飾ＲＮＡをナノ粒子と接触させることと、
を含む、前記方法。
４２．修飾ＲＮＡを作製する方法であって、
ａ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡを提供することと、
ｂ）ナノ粒子を提供することと、
ｃ）前記修飾ＲＮＡがナノ粒子の内部及び／または表面に存在するような条件下で前記修飾ＲＮＡを前記ナノ粒子と接触させることと、
を含む、前記方法。
４３．修飾ＲＮＡを送達する方法であって、
ａ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡを提供することと、
ｂ）エレクトロポレーションを与えることと、
を含む、前記方法。
４４．少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡを含む修飾ＲＮＡであって、細胞表面受容体を調節する、前記修飾ＲＮＡを作製する方法であって、前記受容体を含有する細胞を前記修飾ＲＮＡと接触させることを含む、前記方法。
４５．修飾ＲＮＡを作製する方法であって、
ａ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡを提供することと、
ｂ）血清を提供することであって、前記グリカンが前記血清中での前記ＲＮＡの安定化をもたらす、前記提供することと、
を含む、前記方法。
４６．修飾ＲＮＡを作製する方法であって、
ａ）ＲＮＡを提供することと、
ｂ）前記ＲＮＡを、グリカンであって、Ｎ－アセチルガラクトサミンを含む、前記グリカンと、前記ＲＮＡの前記グリカンへのコンジュゲーションにより前記ＲＮＡが修飾されるような条件下で接触させることと、
を含む、前記方法。
４７．少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む裸の修飾ＲＮＡを含む医薬組成物。
４８．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡと、
を含む医薬組成物。
４９．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも２個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡと、
を含む医薬組成物。
５０．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも３個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡと、
を含む医薬組成物。
５１．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも４個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡと、
を含む医薬組成物。
５２．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも５個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡと、
を含む医薬組成物。
５３．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも６個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡと、
を含む医薬組成物。
５４．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも７個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡと、
を含む医薬組成物。
５５．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも８個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡと、
を含む医薬組成物。
５６．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも９個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＲＮＡと、
を含む医薬組成物。
５７．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸と、
を含む医薬組成物。
５８．前記グリカン部分が、シアル酸、フコース、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
５９．前記グリカン部分が、ＧｌｃＮＡｃ、マンノース、ガラクトース、シアル酸、及びフコース、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
６０．全身投与の必要があるヒト対象への全身投与用に製剤化された、実施形態５７に記載の医薬組成物。
６１．全身投与の必要がある哺乳動物対象への全身投与用に製剤化された、実施形態５７に記載の医薬組成物。
６２．複数回の全身投与の必要があるヒト対象への複数回の全身投与に好適な、実施形態５７に記載の医薬組成物。
６３．複数回の全身投与の必要がある哺乳動物対象への複数回の全身投与に好適な、実施形態５７に記載の医薬組成物。
６４．前記グリカン部分が、第１の末端残基及び第２の末端残基を含む二分岐のＮ結合型グリカンを含み、前記第１または第２の末端残基のうちの少なくとも１つがシアル酸を含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
６５．前記グリカン部分が、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む三分岐のＮ結合型グリカンを含み、前記第１または第２または第３の末端残基のうちの少なくとも１つがシアル酸を含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
６６．前記グリカン部分が、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む三分岐のＮ結合型グリカンを含み、前記第１または第２または第３の末端残基のうちの少なくとも１つが１つ以上のポリシアル酸末端修飾を含むシアル酸残基を含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
６７．前記グリカン部分が、前記グリカンのコアまたは基部に存在するＧｌｃＮＡｃ残基に連結されたフコースを含む二分岐のＮ結合型グリカンを含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
６８．前記グリカン部分が、樹状部分またはアームに存在するＧｌｃＮＡｃ残基に連結されたフコースを含む二分岐のＮ結合型グリカンを含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
６９．前記グリカン部分が、２本以上のアームを含み、前記アームのうちの２本の間にＧｌｃＮＡｃを有し、これにより、バイセクト型グリカンを形成している二分岐のＮ結合型グリカンを含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
７０．前記グリカン部分が、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む三分岐のＮ結合型グリカンを含み、前記第１及び第２の末端残基のうちの少なくとも１つがフコースを含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
７１．前記グリカン部分が、第１の末端残基及び第２の末端残基を含む二分岐のＮ結合型グリカンを含み、少なくとも１つの末端残基がシアル酸を含み、少なくとも１つの末端残基がフコースを含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
７２．前記グリカン部分が、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む三分岐のＮ結合型グリカンを含み、少なくとも１つの末端残基がシアル酸であり、１つの末端残基がフコースである、実施形態５７に記載の医薬組成物。
７３．前記グリカン部分がＮ結合型グリカンを含み、前記核酸が修飾ヌクレオチドを含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
７４．前記グリカン部分がＮ結合型グリカンを含み、核酸が修飾ヌクレオチドを含み、前記修飾ヌクレオチドの核酸内での位置が異なり得る、実施形態５７に記載の医薬組成物。
７５．前記グリカン部分がＮ結合型グリカンを含み、核酸が修飾ヌクレオチドを含み、前記修飾が２種以上のグリカンを結合させるように直交型である、実施形態５７に記載の医薬組成物。
７６．前記修飾核酸が、少なくとも約１５、２０、２５、３０、５０、１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００個のヌクレオチド、または１００００個超のヌクレオチドを含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
７７．前記修飾核酸が非天然ヌクレオチドを含まない、実施形態５７に記載の医薬組成物。
７８．前記修飾核酸が、約１５、２０、２５、３０、または５０個未満のヌクレオチドを含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
７９．前記修飾核酸が、マイクロ核酸結合部分を含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
８０．前記修飾核酸が、ポリペプチドをコードする配列を含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
８１．前記修飾核酸に作動可能に連結された治療用部分を更に含み、前記治療用部分が、抗体、低分子、同位体、酵素、及びペプチドから選択される、実施形態５７に記載の医薬組成物。
８２．修飾核酸が、ヌクレオチドとグリカンとの間に切断可能なリンカーを含む、実施形態５７に記載の医薬組成物。
８３．修飾核酸が、核酸とグリカンとの間に切断可能なリンカーを含み、前記切断可能なリンカーが、ｐＨ依存性、ジスルフィド結合、ペプチド切断部位、またはｃｉｔ－ｖａｌリンカーである、実施形態５７に記載の医薬組成物。
８４．持続性の薬力学的効果をもたらす方法であって、持続性の薬力学的効果をもたらす必要がある対象にグリカンで修飾された核酸を投与することを含む、前記方法。
８５．がんを処置する方法であって、がんを処置する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸と、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
８６．自己免疫疾患を処置する方法であって、自己免疫疾患を処置する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸と、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
８７．ＩｇＥ依存性アレルギーを処置する方法であって、ＩｇＥ依存性アレルギーを処置する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸と、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
８８．全身性エリテマトーデスを処置する方法であって、全身性エリテマトーデスを処置する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸と、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
８９．ウイルス感染症を処置する方法であって、ウイルス感染症を処置する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸と、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
９０．キメラ抗原受容体を送達する方法であって、キメラ抗原受容体を送達する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸であって、キメラ抗原受容体ポリペプチドをコードする配列を含む、前記修飾核酸と、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
９１．細胞または複数の細胞を作製する方法であって、
ａ）単離された細胞または複数の単離された細胞を提供することと、
ｂ）グリカンを含む修飾核酸の調製物を提供することと、
ｃ）前記修飾核酸を前記単離された細胞または前記複数の細胞に接触させることであって、前記単離された細胞または前記複数の細胞が前記修飾核酸に結合することができる、前記接触させることと、
を含む、前記方法。
９２．細胞または複数の細胞を作製する方法であって、
ａ）単離された細胞または複数の単離された細胞を提供することと、
ｂ）グリカンを含む低分子修飾核酸の調製物を提供することと、
ｃ）前記低分子修飾核酸を前記単離された細胞または前記複数の細胞に接触させることであって、前記単離された細胞または前記複数の細胞が前記低分子修飾核酸に結合することができる、前記接触させることと、
を含む、前記方法。
９３．細胞または複数の細胞を作製する方法であって、
ａ）単離された細胞または複数の単離された細胞を提供することと、
ｂ）グリカンを含む高分子修飾核酸の調製物を提供することと、
ｃ）前記高分子修飾核酸を前記単離された細胞または前記複数の細胞に接触させることであって、前記単離された細胞または前記複数の細胞が前記高分子修飾核酸に結合することができる、前記接触させることと、
を含む、前記方法。
９４．修飾核酸を作製する方法であって、
ａ）核酸を提供することと、
ｂ）前記核酸の前記グリカンへのコンジュゲーションにより前記核酸が修飾される条件下で前記核酸を前記グリカンと接触させることと、
を含む、前記方法。
９５．脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を作製する方法であって、
ａ）核酸を提供することと、
ｂ）前記核酸の前記グリカンへのコンジュゲーションにより前記核酸が修飾される条件下で前記核酸を前記グリカンと接触させることと、
ｃ）ＬＮＰが形成されるような条件下で前記修飾核酸を脂質と接触させることと、
を含む、前記方法。
９６．修飾核酸を作製する方法であって、
ａ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸を提供することと、
ｂ）ＬＮＰを提供することと、
ｃ）前記修飾核酸がＬＮＰの内部及び／または表面に存在するような条件下で前記修飾核酸を前記ＬＮＰと接触させることと、
を含む、前記方法。
９７．核酸ナノ粒子を作製する方法であって、
ａ）核酸を提供することと、
ｂ）前記核酸の前記グリカンへのコンジュゲーションにより前記核酸が修飾される条件下で前記核酸を前記グリカンと接触させることと、
ｃ）核酸ナノ粒子が形成されるような条件下で前記修飾核酸をナノ粒子と接触させることと、
を含む、前記方法。
９８．修飾核酸を作製する方法であって、
ａ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸を提供することと、
ｂ）ナノ粒子を提供することと、
ｃ）前記修飾核酸がナノ粒子の内部及び／または表面に存在するような条件下で前記修飾核酸を前記ナノ粒子と接触させることと、
を含む、前記方法。
９９．修飾核酸を送達する方法であって、
ａ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸を提供することと、
ｂ）エレクトロポレーションを与えることと、
を含む、前記方法。
１００．修飾核酸を作製する方法であって、
ａ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸を提供することと、
ｂ）血清を提供することであって、前記グリカンが前記血清中での前記核酸の安定化をもたらす、前記提供することと、
を含む、前記方法。
１０１．少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸を含む修飾核酸であって、細胞表面受容体を調節する、前記修飾核酸を作製する方法であって、前記受容体を含有する細胞を前記修飾核酸と接触させることを含む、前記方法。
１０２．修飾核酸を作製する方法であって、
ａ）核酸を提供することと、
ｂ）前記核酸を、グリカンであって、Ｎ－アセチルガラクトサミンを含む、前記グリカンと接触させることと、
を含む、前記方法。
１０３．少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む裸の修飾核酸を含む医薬組成物。
１０４．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸と、
を含む医薬組成物。
１０５．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも２個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸と、
を含む医薬組成物。
１０６．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも３個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸と、
を含む医薬組成物。
１０７．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも４個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸と、
を含む医薬組成物。
１０８．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも５個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸と、
を含む医薬組成物。
１０９．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも６個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸と、
を含む医薬組成物。
１１０．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも７個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸と、
を含む医薬組成物。
１１１．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも８個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸と、
を含む医薬組成物。
１１２．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも９個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾核酸と、
を含む医薬組成物。
１１３．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡと、
を含む医薬組成物。
１１４．前記グリカン部分が、シアル酸、フコース、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１１５．前記グリカン部分が、ＧｌｃＮＡｃ、マンノース、ガラクトース、シアル酸、及びフコース、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１１６．全身投与の必要があるヒト対象への全身投与用に製剤化された、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１１７．全身投与の必要がある哺乳動物対象への全身投与用に製剤化された、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１１８．複数回の全身投与の必要があるヒト対象への複数回の全身投与に好適な、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１１９．複数回の全身投与の必要がある哺乳動物対象への複数回の全身投与に好適な、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１２０．前記グリカン部分が、第１の末端残基及び第２の末端残基を含む二分岐のＮ結合型グリカンを含み、前記第１または第２の末端残基のうちの少なくとも１つがシアル酸を含む、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１２１．前記グリカン部分が、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む三分岐のＮ結合型グリカンを含み、前記第１または第２または第３の末端残基のうちの少なくとも１つがシアル酸を含む、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１２２．前記グリカン部分が、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む三分岐のＮ結合型グリカンを含み、前記第１または第２または第３の末端残基のうちの少なくとも１つが１つ以上のポリシアル酸末端修飾を含むシアル酸残基を含む、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１２３．前記グリカン部分が、前記グリカンのコアまたは基部に存在するＧｌｃＮＡｃ残基に連結されたフコースを含む二分岐のＮ結合型グリカンを含む、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１２４．前記グリカン部分が、樹状部分またはアームに存在するＧｌｃＮＡｃ残基に連結されたフコースを含む二分岐のＮ結合型グリカンを含む、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１２５．前記グリカン部分が、２本以上のアームを含み、前記アームのうちの２本の間にＧｌｃＮＡｃを有し、これにより、バイセクト型グリカンを形成している二分岐のＮ結合型グリカンを含む、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１２６．前記グリカン部分が、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む三分岐のＮ結合型グリカンを含み、前記第１及び第２の末端残基のうちの少なくとも１つがフコースを含む、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１２７．前記グリカン部分が、第１の末端残基及び第２の末端残基を含む二分岐のＮ結合型グリカンを含み、少なくとも１つの末端残基がシアル酸を含み、少なくとも１つの末端残基がフコースを含む、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１２８．前記グリカン部分が、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む三分岐のＮ結合型グリカンを含み、少なくとも１つの末端残基がシアル酸であり、１つの末端残基がフコースである、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１２９．前記グリカン部分がＮ結合型グリカンを含み、前記ＤＮＡが修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１３０．前記グリカン部分がＮ結合型グリカンを含み、核酸が修飾ヌクレオチドを含み、前記修飾ヌクレオチドの核酸内での位置が異なり得る、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１３１．前記グリカン部分がＮ結合型グリカンを含み、核酸が修飾ヌクレオチドを含み、前記修飾が２種以上のグリカンを結合させるように直交型である、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１３２．前記修飾ＤＮＡが、少なくとも約１５、２０、２５、３０、５０、１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００個のヌクレオチド、または１００００個超のヌクレオチドを含む、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１３３．前記修飾ＤＮＡが非天然ヌクレオチドを含まない、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１３４．前記修飾ＤＮＡが、約１５、２０、２５、３０、または５０個未満のヌクレオチドを含む、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１３５．前記修飾ＤＮＡが、マイクロＲＮＡ結合部分を含む、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１３６．前記修飾ＤＮＡが、ポリペプチドをコードする配列を含む、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１３７．前記修飾ＤＮＡに作動可能に連結された治療用部分を更に含み、前記治療用部分が、抗体、低分子、同位体、酵素、及びペプチドから選択される、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１３８．修飾ＤＮＡが、ＤＮＡとグリカンとの間に切断可能なリンカーを含む、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１３９．修飾ＤＮＡが、ＤＮＡとグリカンとの間に切断可能なリンカーを含み、前記切断可能なリンカーが、ｐＨ依存性、ジスルフィド結合、ペプチド切断部位、またはｃｉｔ－ｖａｌリンカーである、実施形態１１３に記載の医薬組成物。
１４０．持続性の薬力学的効果をもたらす方法であって、持続性の薬力学的効果をもたらす必要がある対象にグリカンで修飾されたＤＮＡを投与することを含む、前記方法。
１４１．がんを処置する方法であって、がんを処置する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡと、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
１４２．自己免疫疾患を処置する方法であって、自己免疫疾患を処置する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡと、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
１４３．ＩｇＥ依存性アレルギーを処置する方法であって、ＩｇＥ依存性アレルギーを処置する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡと、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
１４４．全身性エリテマトーデスを処置する方法であって、全身性エリテマトーデスを処置する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡと、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
１４５．ウイルス感染症を処置する方法であって、ウイルス感染症を処置する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡと、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
１４６．キメラ抗原受容体を送達する方法であって、キメラ抗原受容体を送達する必要があるヒト対象に、
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡであって、キメラ抗原受容体ポリペプチドをコードする配列を含む、前記修飾ＤＮＡと、
を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
１４７．細胞または複数の細胞を作製する方法であって、
ａ）単離された細胞または複数の単離された細胞を提供することと、
ｂ）グリカンを含む修飾ＤＮＡの調製物を提供することと、
ｃ）前記修飾ＤＮＡを前記単離された細胞または前記複数の細胞に接触させることであって、前記単離された細胞または前記複数の細胞が前記修飾ＤＮＡに結合することができる、前記接触させることと、
を含む、前記方法。
１４８．細胞または複数の細胞を作製する方法であって、
ａ）単離された細胞または複数の単離された細胞を提供することと、
ｂ）グリカンを含む低分子修飾ＤＮＡの調製物を提供することと、
ｃ）前記低分子修飾ＤＮＡを前記単離された細胞または前記複数の細胞に接触させることであって、前記単離された細胞または前記複数の細胞が前記低分子修飾ＤＮＡに結合することができる、前記接触させることと、
を含む、前記方法。
１４９．細胞または複数の細胞を作製する方法であって、
ａ）単離された細胞または複数の単離された細胞を提供することと、
ｂ）グリカンを含む高分子修飾ＤＮＡの調製物を提供することと、
ｃ）前記高分子修飾ＤＮＡを前記単離された細胞または前記複数の細胞に接触させることであって、前記単離された細胞または前記複数の細胞が前記高分子修飾ＤＮＡに結合することができる、前記接触させることと、
を含む、前記方法。
１５０．修飾ＤＮＡを作製する方法であって、
ａ）ＤＮＡを提供することと、
ｂ）前記ＤＮＡの前記グリカンへのコンジュゲーションにより前記ＤＮＡが修飾されるような条件下で前記ＤＮＡをグリカンと接触させることと、
を含む、前記方法。
１５１．脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を作製する方法であって、
ａ）ＤＮＡを提供することと、
ｂ）前記ＤＮＡの前記グリカンへのコンジュゲーションにより前記ＤＮＡが修飾されるような条件下で前記ＤＮＡをグリカンと接触させることと、
ｃ）ＬＮＰが形成されるような条件下で前記修飾ＤＮＡを脂質と接触させることと、
を含む、前記方法。
１５２．修飾ＤＮＡを作製する方法であって、
ａ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡを提供することと、
ｂ）ＬＮＰを提供することと、
ｃ）前記修飾ＤＮＡがＬＮＰの内部及び／または表面に存在するような条件下で前記修飾ＤＮＡを前記ＬＮＰと接触させることと、
を含む、前記方法。
１５３．ＤＮＡナノ粒子（ＤＮＡ ＮＰ）を作製する方法であって、
ａ）ＤＮＡを提供することと、
ｂ）前記ＤＮＡの前記グリカンへのコンジュゲーションにより前記ＤＮＡが修飾されるような条件下で前記ＤＮＡをグリカンと接触させることと、
ｃ）ＤＮＡ ＮＰが形成されるような条件下で前記修飾ＤＮＡをナノ粒子と接触させることと、
を含む、前記方法。
１５４．修飾ＤＮＡを作製する方法であって、
ａ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡを提供することと、
ｂ）ナノ粒子を提供することと、
ｃ）前記修飾ＤＮＡがナノ粒子の内部及び／または表面に存在するような条件下で前記修飾ＤＮＡを前記ナノ粒子と接触させることと、
を含む、前記方法。
１５５．修飾ＤＮＡを送達する方法であって、
ａ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡを提供することと、
ｂ）エレクトロポレーションを与えることと、
を含む、前記方法。
１５６．修飾ＤＮＡを作製する方法であって、
ａ）少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡを提供することと、
ｂ）血清を提供することであって、前記グリカンが前記血清中での前記ＤＮＡの安定化をもたらす、前記提供することと、
を含む、前記方法。
１５７．少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡを含む修飾ＤＮＡであって、細胞表面受容体を調節する、前記修飾ＤＮＡを作製する方法であって、前記受容体を含有する細胞を前記修飾ＤＮＡと接触させることを含む、前記方法。
１５８．修飾ＤＮＡを作製する方法であって、
ａ）ＤＮＡを提供することと、
ｂ）前記ＤＮＡを、グリカンであって、Ｎ－アセチルガラクトサミンを含む、前記グリカンと接触させることと、
を含む、前記方法。
１５９．少なくとも１０個の単糖を含むグリカン部分を含む裸の修飾ＤＮＡを含む医薬組成物。
１６０．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも１個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡと、
を含む医薬組成物。
１６１．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも２個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡと、
を含む医薬組成物。
１６２．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも３個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡと、
を含む医薬組成物。
１６３．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも４個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡと、
を含む医薬組成物。
１６４．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも５個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡと、
を含む医薬組成物。
１６５．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも６個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡと、
を含む医薬組成物。
１６６．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも７個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡと、
を含む医薬組成物。
１６７．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも８個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡと、
を含む医薬組成物。
１６８．
ａ）薬学的に許容される担体と、
ｂ）少なくとも９個の単糖を含むグリカン部分を含む修飾ＤＮＡと、
を含む医薬組成物。
１６９．前記医薬組成物がＬＮＰまたは他の核酸送達媒体を含まないという条件の、先行実施形態のいずれか１項に記載の医薬組成物。
例示的な実施形態：セクションＢ
以下に記載される実施形態は、本明細書において意図される発明の例示であることを意図する。
１．グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を発現する細胞と細胞表面グリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）を提示する細胞との間の相互作用を低減するための方法であって、
前記ＧＢＰを発現する細胞を、前記ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されたＧＢＰに結合する可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡと、前記ＧＢＰを発現する細胞と前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するのに有効な量で接触させることを含む、前記方法。
２．前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが、Ｙ ＲＮＡファミリーのＲＮＡを含む、実施形態１に記載の方法。
３．前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡがＹ５ ＲＮＡを含む、実施形態２に記載の方法。
４．前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが、ｓｎｏＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１～３のいずれか１項に記載の方法。
５．前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが可溶性シアル化ＲＮＡを含む、実施形態１～４のいずれか１項に記載の方法。
６．前記可溶性シアル化ＲＮＡが、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態５に記載の方法。
７．前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが、１種以上の薬剤にコンジュゲートされている、実施形態１～６のいずれか１項に記載の方法。
８．前記１種以上の薬剤が治療薬を含む、実施形態７に記載の方法。
９．前記１種以上の薬剤が検出可能な標識を含む、実施形態７または実施形態８に記載の方法。
１０．前記ＧＢＰが、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）を含む、実施形態１～９のいずれか１項に記載の方法。
１１．前記ＳｉｇｌｅｃがＳｉｇｌｅｃ－１１を含む、実施形態１０に記載の方法。
１２．前記ＳｉｇｌｅｃがＳｉｇｌｅｃ－１４を含む、実施形態１０または実施形態１１に記載の方法。
１３．前記ＧＢＰがＣ型レクチンを含む、実施形態１～１２のいずれか１項に記載の方法。
１４．前記ＧＢＰがガレクチンを含む、実施形態１～１３のいずれか１項に記載の方法。
１５．前記ＧＢＰがセレクチンを含む、実施形態１～１４のいずれか１項に記載の方法。
１６．グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を発現する細胞と細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するための方法であって、
前記ＧＢＰを発現する細胞を、前記ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されるＧＢＰに結合し、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合すると確認された薬剤と、前記ＧＢＰを発現する細胞と前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するのに有効な量で接触させることを含む、前記方法。
１７．前記薬剤が、前記ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現される前記ＧＢＰのリガンドである、実施形態１６に記載の方法。
１８．前記薬剤が、前記ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現される前記ＧＢＰに結合する抗体である、実施形態１６に記載の方法。
１９．前記薬剤が結合する前記ＧＢＰが、１種以上のシアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）である、実施形態１６～１８のいずれか１項に記載の方法。
２０．前記１種以上のＳｉｇｌｅｃが、Ｓｉｇｌｅｃ－１１を含む、実施形態１９に記載の方法。
２１．前記１種以上のＳｉｇｌｅｃが、Ｓｉｇｌｅｃ－１４を含む、実施形態１９または実施形態２０に記載の方法。
２２．前記薬剤が結合する前記ＧＢＰが、Ｃ型レクチンを含む、実施形態１６～２１のいずれか１項に記載の方法。
２３．前記薬剤が結合する前記ＧＢＰが、ガレクチンを含む、実施形態１６～２２のいずれか１項に記載の方法。
２４．前記薬剤が結合する前記ＧＢＰが、セレクチンを含む、実施形態１６～２３のいずれか１項に記載の方法。
２５．グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を発現する細胞と細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するための方法であって、
前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞を、前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合し、及び／またはこれを編集する薬剤と、前記ＧＢＰを発現する細胞と前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するのに有効な量で接触させることを含む、前記方法。
２６．前記薬剤が前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを編集する、実施形態２５に記載の方法。
２７．前記薬剤が、前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡからグリカンを除去する酵素である、実施形態２６に記載の方法。
２８．前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡが細胞表面シアル化ＲＮＡを含み、前記薬剤がシアリダーゼを含む、実施形態２７に記載の方法。
２９．前記薬剤がリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）を含む、実施形態２６に記載の方法。
３０． 前記ＲＮアーゼが、ＲＮアーゼＡ、Ｔ１ ＲＮアーゼ、またはＴ２ ＲＮアーゼである、実施形態２９に記載の方法。
３１．前記ＲＮアーゼがヒトＲＮアーゼである、実施形態２９または実施形態３０に記載の方法。
３２．前記ヒトＲＮアーゼがヒトＲＮアーゼ１である、実施形態３１に記載の方法。
３３．前記薬剤が、前記薬剤を前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞に標的化する標的化部分に安定的に結合している、実施形態２５～３２のいずれか１項に記載の方法。
３４．前記標的化部分が、抗体、リガンド、アプタマー、または低分子である、実施形態３３に記載の方法。
３５．前記薬剤が前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合する、実施形態２５に記載の方法。
３６．前記薬剤が前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合する抗体である、実施形態３５に記載の方法。
３７．前記抗体が抗ＲＮＡ抗体である、実施形態３６に記載の方法。
３８．前記抗ＲＮＡ抗体が抗二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）抗体である、実施形態３７に記載の方法。
３９．前記薬剤が、前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合するグリカン結合部分を含む、実施形態３５に記載の方法。
４０．薬剤をグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を発現する細胞に標的化する方法であって、
前記ＧＢＰを発現する細胞を、前記薬剤と安定的に結合した可溶性グリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）と接触させることを含む、前記方法。
４１．前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが前記薬剤にコンジュゲートされている、実施形態４０に記載の方法。
４２．前記薬剤がＧＢＰを発現する細胞を調節する薬剤である、実施形態４０または実施形態４１に記載の方法。
４３．前記薬剤が治療薬である、実施形態４０または実施形態４１に記載の方法。
４４．前記薬剤が検出可能な標識を含む、実施形態４０または実施形態４１に記載の方法。
４５．前記方法が
インビトロ、インビボ、またはエクスビボで実行される、実施形態１～４４のいずれか１項に記載の方法。
４６．前記方法がインビボで実行され、前記接触させることが、前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡを投与する必要がある個体に、前記個体における前記ＧＢＰを発現する細胞と前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するのに有効な量で投与することを含む、実施形態１～１５のいずれか１項に記載の方法。
４７．前記方法がインビボで実行され、前記接触させることが、前記薬剤を投与する必要がある個体に、前記個体における前記ＧＢＰを発現する細胞と前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するのに有効な量で投与することを含む、実施形態１６～３９のいずれか１項に記載の方法。
４８．前記方法がインビボで実行され、前記接触させることが、前記薬剤と安定的に結合した前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡを個体に投与することを含む、実施形態４０～４４のいずれか１項に記載の方法。
４９．前記投与することが、非経口または経口投与によるものである、実施形態４６～４８のいずれか１項に記載の方法。
５０．
可溶性グリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）と、
薬学的に許容される担体と、
を含む医薬組成物。
５１．前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが、Ｙ ＲＮＡファミリーのＲＮＡを含む、実施形態５０に記載の医薬組成物。
５２．前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡがＹ５ ＲＮＡを含む、実施形態５１に記載の医薬組成物。
５３．前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが、ｓｎｏＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態５０～５２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
５４．前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが可溶性シアル化ＲＮＡを含む、実施形態５０～５３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
５５．前記可溶性シアル化ＲＮＡが、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態５４に記載の医薬組成物。
５６．前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが、１種以上の薬剤にコンジュゲートされている、実施形態５０～５５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
５７．前記１種以上の薬剤が治療薬を含む、実施形態５６に記載の医薬組成物。
５８．前記１種以上の薬剤が検出可能な標識を含む、実施形態５６または実施形態５７に記載の医薬組成物。
５９．
１種以上の薬剤にコンジュゲートされた、実施形態５１～５５のいずれか１項に記載の可溶性グリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）を含む、コンジュゲート。
６０．前記１種以上の薬剤が治療薬を含む、実施形態５９に記載のコンジュゲート。
６１．前記１種以上の薬剤が検出可能な標識を含む、実施形態５９または実施形態６０に記載のコンジュゲート。
６２．
リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）にコンジュゲートされた標的化部分を含む、コンジュゲート。
６３．前記標的化部分が、抗体、リガンド、アプタマー、または低分子である、実施形態６２に記載のコンジュゲート。
６４．リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）に融合された標的化部分を含む融合タンパク質。
６５．前記標的化部分が抗体またはリガンドである、実施形態６４に記載の融合タンパク質。
６６．前記ＲＮアーゼが、ＲＮアーゼＡ、Ｔ１ ＲＮアーゼ、またはＴ２ ＲＮアーゼである、実施形態６２もしくは実施形態６３に記載のコンジュゲート、または実施形態６４もしくは実施形態６５に記載の融合タンパク質。
６７．前記ＲＮアーゼがヒトＲＮアーゼである、実施形態６２～６６のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたは融合タンパク質。
６８．前記ヒトＲＮアーゼがヒトＲＮアーゼ１である、実施形態６７に記載のコンジュゲートまたは融合タンパク質。
６９．生体試料をグリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）について評価する方法であって、前記生体試料に対してｇｌｙｃｏＲＮＡ検出アッセイを実行することを含む、前記方法。
７０．前記生体試料が細胞試料である、実施形態６９に記載の方法。
７１．前記アッセイが、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡ検出アッセイである、実施形態７０に記載の方法。
７２．前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡ検出アッセイが、前記細胞試料の細胞をｇｌｙｃｏＲＮＡ結合剤と接触させること、及び前記試料中の細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡへの前記ｇｌｙｃｏＲＮＡ結合剤の結合について評価することを含む、実施形態７１に記載の方法。
７３．前記ｇｌｙｃｏＲＮＡ結合剤が、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合する抗体である、実施形態７２に記載の方法。
７４．前記抗体が抗ＲＮＡ抗体である、実施形態７３に記載の方法。
７５．前記抗ＲＮＡ抗体が抗二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）抗体である、実施形態７４に記載の方法。
７６．前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡ検出アッセイが、前記細胞試料の細胞をリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）と接触させて、存在する場合、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを消化すること、及び細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡの分解について評価することを含む、実施形態７１に記載の方法。
７７．前記アッセイが、遊離ｇｌｙｃｏＲＮＡ検出アッセイである、実施形態６９または実施形態７０に記載の方法。
７８．前記生体試料が組織試料または体液試料である、実施形態６９～７７のいずれか１項に記載の方法。
７９．前記生体試料が生検試料である、実施形態６９～７８のいずれか１項に記載の方法。
８０．グリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）を産生させる方法であって、
ｇｌｙｃｏＲＮＡが産生される条件下でｇｌｙｃｏＲＮＡ産生細胞を培養することと、
産生されたｇｌｙｃｏＲＮＡを単離することと、
を含む、前記方法。
８１．前記産生されたｇｌｙｃｏＲＮＡを単離することが、前記細胞により産生された膜ｇｌｙｃｏＲＮＡを単離することを含む、実施形態８０に記載の方法。
８２．前記産生されたｇｌｙｃｏＲＮＡを単離することが、前記細胞により産生された形質膜ｇｌｙｃｏＲＮＡを単離することを含む、実施形態８１に記載の方法。
８３．前記細胞により産生された前記形質膜ｇｌｙｃｏＲＮＡを単離することが、前記細胞の形質膜から前記ｇｌｙｃｏＲＮＡを切断することを含む、実施形態８２に記載の方法。
８４．前記産生されたｇｌｙｃｏＲＮＡを単離することが、前記細胞により産生された遊離ｇｌｙｃｏＲＮＡを単離することを含む、実施形態８０に記載の方法。
８５．前記細胞により分泌された遊離ｇｌｙｃｏＲＮＡを単離することを含む、実施形態８４に記載の方法。
８６．前記細胞に過剰なヌクレオチドを提供して、ＲＮＡ生合成の流量を、過剰なヌクレオチドの非存在下での流量と比較して増加させることを含む、実施形態８０～８５のいずれか１項に記載の方法。
８７．前記細胞に過剰な糖を提供して、グリカン生合成の流量を、過剰な糖の非存在下での流量と比較して増加させることを含む、実施形態８０～８６のいずれか１項に記載の方法。
８８．前記過剰な糖が、過剰なグルコース、ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態８７に記載の方法。
８９．細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡの蓄積を増強するために、前記細胞における１つ以上の細胞膜代謝回転経路を阻害すること、及び蓄積した細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを単離することを含む、実施形態８０～８８のいずれか１項に記載の方法。
９０．グリカン生合成経路の一部を阻害して、ＲＮＡグリカンの生成を助けることを含む、実施形態８０～８９のいずれか１項に記載の方法。
９１．Ｏ－グリカン生成を阻害して、Ｎ－グリカン生成を助けることを含む、実施形態９０に記載の方法。
９２．細胞表面上でのグリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）の提示を操作する方法であって、
前記細胞がその表面上に１種類以上の関心対象のｇｌｙｃｏＲＮＡを提示するように、１種以上のリボ核酸及び／またはグリカン生合成酵素をコードする１種以上の発現構築物を前記細胞に導入することを含む、前記方法。
９３．１種類以上の提示されたｇｌｙｃｏＲＮＡが、前記細胞を一意に同定するために利用される、実施形態９２に記載の方法。
例示的な実施形態：セクションＣ
１．式（Ｉ）：
Figure 2024514954000052
 の化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体であって、式中、
Ａは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の核酸であり、
Ｂは、第２のクリックケミストリーハンドルを含むアスパラギン結合型グリカン（Ｎ－グリカン）であり、
Ｌは、第１のクリックケミストリーハンドルと第２のクリックケミストリーハンドルとの間の生体直交型クリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む、前記化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体。
２．ＡがＤＮＡである、実施形態１に記載の化合物。
３．ＡがＲＮＡである、実施形態１に記載の化合物。
４．Ａがアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である、実施形態１～３のいずれか１項に記載の化合物。
５．ＡがｓｉＲＮＡである、実施形態１または３に記載の化合物。
６．Ａが、２’ＯＭｅ修飾、フッ素修飾、ホスホロチオエート修飾からなる群から選択される修飾を含むｓｉＲＮＡである、実施形態１または３に記載の化合物。
７．ＡがｍＲＮＡである、実施形態１または３に記載の化合物。
８．ＡがガイドＲＮＡである、実施形態１または３に記載の化合物。
９．Ａが環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）である、実施形態１または３に記載の化合物。
１０．ＡがアプタマーＲＮＡである、実施形態１または３に記載の化合物。
１１．前記クリックケミストリー反応が、銅触媒アジド－アルキン環化（ＣｕＡＡＣ）である、実施形態１～１０のいずれか１項に記載の化合物。
１２．前記クリックケミストリー反応が、歪み促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）である、実施形態１～１０のいずれか１項に記載の化合物。
１３．前記クリックケミストリー反応が、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン（ＴＣＯ）－テトラジンライゲーションまたはｔｒａｎｓ－シクロオクテン－テトラジンライゲーションである、実施形態１～１０のいずれか１項に記載の化合物。
１４．前記クリックケミストリー反応が、アジドのＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション、一級アミンとＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）との間の架橋、ｔｒａｎｓ－シクロオクチン－アジドカップリング、またはシクロプロパン－アジドカップリングである、実施形態１～１０のいずれか１項に記載の化合物。
１５．Ｌが、以下の式：
Figure 2024514954000053
 のものであり、式中、＊が、Ａへの結合点を示し、＃が、Ｂへの結合点を示す、実施形態１～１３のいずれか１項に記載の化合物。
１６．Ｌが、以下の式：
Figure 2024514954000054
 のものであり、式中、＊が、Ａへの結合点を示し、＃が、Ｂへの結合点を示す、実施形態１～１１または１５のいずれか１項に記載の化合物。
１７．Ｌが核酸Ａの塩基に結合している、実施形態１～１６のいずれか１項に記載の化合物。
１８．Ｌが、前記核酸Ａのリボースの２’ＯＨ位に結合している、実施形態１～１６のいずれか１項に記載の化合物。
１９．Ｌが、前記核酸Ａのデオキシリボースまたはリボースの３’ＯＨ位に結合している、実施形態１～１６のいずれか１項に記載の化合物。
２０．Ｌが、前記核酸Ａのデオキシリボースまたはリボースの５’ＯＨ位に結合している、実施形態１～１６のいずれか１項に記載の化合物。
２１．ＬがＢの非還元末端に結合している、実施形態１～２０のいずれか１項に記載の化合物。
２２．前記Ｎ－グリカンが一分岐Ｎ－グリカンである、実施形態１～２１のいずれか１項に記載の化合物。
２３．前記Ｎ－グリカンが二分岐Ｎ－グリカンである、実施形態１～２１のいずれか１項に記載の化合物。
２４．前記Ｎ－グリカンが三分岐Ｎ－グリカンである、実施形態１～２１のいずれか１項に記載の化合物。
２５．前記Ｎ－グリカンが四分岐Ｎ－グリカンである、実施形態１～２１のいずれか１項に記載の化合物。
２６．前記Ｎ－グリカンがシアル酸を含む、実施形態１～２５のいずれか１項に記載の化合物。
２７．前記Ｎ－グリカンが、以下の式：
のものである、実施形態１～２６のいずれか１項に記載の化合物。
２８．Ａが、５’－ＧＧＣ ＴＧＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ＴＧＣ ＡＧＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＡＣ ＡＡＣ ＴＡＡ ＴＴＧ ＡＴＣ ＡＣＡ ＡＣＣ ＡＧＴ ＴＡＣ ＡＧＡ ＴＴＴ ＣＴ／ｉ５ＯｃｔｄＵ／ＴＧＴ ＴＣＣ ＴＴＣ ＴＣＣ ＡＣＴ ＣＣＣ ＡＣＴ ＧＣＴ ＴＣＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＴＡＧ ＣＣＴ Ｔ－３’（配列番号１）の全長配列に対する少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有する、実施形態１、２、４、または１１～２７のいずれか１項に記載の化合物。
２９．Ａが、ＡＧＵＵＧＧＴＣＣＧＡＧＵＧＵＵＧＵＧＧＧＵＵＡＵＵＧＵＵＡＡＧＵＵ／ｉ５ＯｃｔｄＵ／ＡＵＵＵＡＡＣＡＵＵＧＵＣＵＣＣＣＣＣＣＡＣＡＡＣＣＧＣＧＣＵＵＧＡＣＵＡＧＣＵＵＧＣＵＧ（配列番号２）の全長配列に対する少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有する、実施形態１または３～２８のいずれか１項に記載の方法。
３０．Ａが、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、ｍＲＮＡ、アプタマーＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、もしくはガイドＲＮＡ、または
配列番号１であって、以下の構造：
を形成するようにｉ５ＯｃｔｄＵがコンジュゲートされている、前記配列番号１、もしくは
配列番号２であって、以下の構造：
を形成するようにｉ５ＯｃｔｄＵがコンジュゲートされている、前記配列番号２、もしくは
配列番号１であって、以下の構造：
を形成するようにｉ５ＯｃｔｄＵがコンジュゲートされている、前記配列番号１、
配列番号２であって、以下の構造：
を形成するようにｉ５ＯｃｔｄＵがコンジュゲートされている、前記配列番号２、もしくは
配列番号１であって、以下の構造：
を形成するようにｉ５ＯｃｔｄＵがコンジュゲートされている、前記配列番号１、もしくは
配列番号２であって、以下の構造：
を形成するようにｉ５ＯｃｔｄＵがコンジュゲートされている、前記配列番号２、もしくは
配列番号１であって、以下の構造：
を形成するようにｉ５ＯｃｔｄＵがコンジュゲートされている、前記配列番号１、もしくは
配列番号２であって、以下の構造：
を形成するようにｉ５ＯｃｔｄＵがコンジュゲートされている、前記配列番号２である場合、前記式（Ｉ）の化合物が、図９に示される式のもの、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体である、実施形態１～２９のいずれか１項に記載の化合物。
３１．式（Ｉ）：
Figure 2024514954000064
 の化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体であって、式中、
Ａは、第１のクリックケミストリーハンドルを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の核酸であり、
Ｂは、第２のクリックケミストリーハンドルを含むアスパラギン結合型グリカン（Ｎ－グリカン）であり、
Ｌは、第１のクリックケミストリーハンドルと第２のクリックケミストリーハンドルとの間の生体直交型クリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む、前記化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体を調製する方法であって、
前記第１のクリックケミストリーハンドルを含む、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の核酸Ａを、前記第２のクリックケミストリーハンドルを含むアスパラギン結合型グリカン（Ｎ－グリカン）である化合物Ｂと反応させる第１のステップを含み、
前記第１のステップの反応が、生体直交型クリックケミストリー条件下で実行される、前記方法。
３２．前記第１のステップが、銅触媒アジド－アルキン環化（ＣｕＡＡＣ）、歪み促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ、テトラシクロオクチン（ＴＣＯ）－テトラジンライゲーション、またはアジドのＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションである前記クリックケミストリー反応の条件下で実行される、実施形態３１に記載の方法。
３３．前記第１のステップが前記ＣｕＡＡＣの条件下で実行され、反応混合物を作製するために、アルキン修飾核酸Ａを水で希釈し、任意に９０～１００℃の温度で約１～５分間変性させることを含む、実施形態３１に記載の方法。
３４．アルキン修飾核酸Ａの水での前記希釈が、１００ｕＭ～１２５μＭの最終濃度への希釈である、実施形態３３に記載の方法。
３５．前記変性が、約９５℃の温度で２分間実施される、実施形態３３または３４に記載の方法。
３６．前記反応混合物を氷上に配置することを更に含み、続いて、ＭｇＣｌ及び中性のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））中で３５～３９℃にて約５～１０分間折り畳ませるステップが続く、実施形態３１～３５のいずれか１項に記載の方法。
３７．前記反応混合物にリガンドの２－（４－（（ビス（（１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）酢酸（ＢＴＴＡＡ）を添加し、約１８～２３℃でインキュベートすることを更に含む、実施形態３１～３６のいずれか１項に記載の方法。
３８．Ａ、Ｂ、Ｃｕ－ＢＴＴＡＡ、及びアスコルビン酸ナトリウムをＰＢＳと共に、約２０～２４℃で少なくとも約６～４８時間反応させることを更に含む、実施形態３１～３７のいずれか１項に記載の方法。
３９． 約１０μＭのＡ、約２０μＭのＢ、及び約１００～１１０μＭのＣｕ－ＢＴＴＡＡを反応させることを含む、実施形態３８に記載の方法。
４０．約１５～２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加することを更に含む、実施形態３１～３９のいずれか１項に記載の方法。
４１．前記式（Ｉ）の化合物の前記Ｎ－グリカンの酵素変換反応のステップを更に含む、実施形態３１～４０のいずれか１項に記載の方法。
４２．前記酵素変換反応が、シアリルトランスフェラーゼまたはフコシルトランスフェラーゼによる糖の付加を含む、実施形態４１に記載の方法。
４３．前記酵素変換反応がマンノシダーゼ切断を含む、実施形態４１に記載の方法。
４４．前記式（Ｉ）の化合物の沈殿を更に含む、実施形態３１～４３のいずれか１項に記載の方法。
４５．ＡがＤＮＡである、実施形態３１～４４のいずれか１項に記載の方法。
４６．ＡがＲＮＡである、実施形態３１～４４のいずれか１項に記載の方法。
４７．ＡがＡＳＯである、実施形態３１～４６のいずれか１項に記載の方法。
４８．ＡがｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、またはアプタマーＲＮＡである、実施形態３１～４７のいずれか１項に記載の方法。
４９．前記第１のクリックケミストリーハンドルがアルキンである、実施形態３１～４８のいずれか１項に記載の方法。
５０．前記アルキンが、以下の式：
Figure 2024514954000065
 を含む、実施形態４９に記載の方法。
５１．前記核酸Ａが、前記核酸の塩基に結合したアルキンである前記第１のクリックケミストリーハンドルを含む、実施形態３１～５０のいずれか１項に記載の方法。
５２．Ａが以下の構造：
Figure 2024514954000066
 を含み、ＡがＲＮＡまたはＤＮＡである、実施形態３１～５１のいずれか１項に記載の方法。
５３．前記核酸Ａが、前記核酸のリボースの２’ＯＨ位に結合したアルキンである前記第１のクリックケミストリーハンドルを含む、実施形態３１～５２のいずれか１項に記載の方法。
５４．前記核酸Ａが、前記核酸のデオキシリボースまたはリボースの３’ＯＨ位に結合したアルキンである前記第１のクリックケミストリーハンドルを含む、実施形態３１～５２のいずれか１項に記載の方法。
５５．前記核酸Ａが、前記核酸のデオキシリボースまたはリボースの５’ＯＨ位に結合したアルキンである前記第１のクリックケミストリーハンドルを含む、実施形態３１～５２のいずれか１項に記載の方法。
５６．前記第１のクリックケミストリーハンドルがアジドである、実施形態３１～４８のいずれか１項に記載の方法。
５７．前記核酸Ａが、前記核酸の塩基に結合したアジドである前記第１のクリックケミストリーハンドルを含む、実施形態５６に記載の方法。
５８．前記第２のクリックケミストリーハンドルがアルキンである、実施形態３１～５７のいずれか１項に記載の方法。
５９．前記化合物Ｂが、前記Ｎ－グリカンの非還元末端に結合したアルキンである前記第２のクリックケミストリーハンドルを含む、実施形態３１～５８のいずれか１項に記載の方法。
６０．前記第２のクリックケミストリーハンドルがアジドである、実施形態３１～５７のいずれか１項に記載の方法。
６１．前記化合物Ｂが、前記Ｎ－グリカンの非還元末端に結合したアジドである前記第２のクリックケミストリーハンドルを含む、実施形態３１～５７または６０のいずれか１項に記載の方法。
６２．前記化合物Ｂが、以下の式：
Ｇ－２８、Ｇ－２９、Ｇ－３５、またはＧ－３０である、実施形態３１～６１のいずれか１項に記載の方法。
６３．前記化合物Ｂが、Ｇ－２８、Ｇ－２９、Ｇ－３５、またはＧ－３０である、実施形態３１～６２のいずれか１項に記載の方法。
６４．前記ＤＮＡが、５’－ＧＧＣ ＴＧＧ ＴＣＣ ＧＡＧ ＴＧＣ ＡＧＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＡＣ ＡＡＣ ＴＡＡ ＴＴＧ ＡＴＣ ＡＣＡ ＡＣＣ ＡＧＴ ＴＡＣ ＡＧＡ ＴＴＴ ＣＴ／ｉ５ＯｃｔｄＵ／ＴＧＴ ＴＣＣ ＴＴＣ ＴＣＣ ＡＣＴ ＣＣＣ ＡＣＴ ＧＣＴ ＴＣＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＴＡＧ ＣＣＴ Ｔ－３’（配列番号１）の配列を含む、実施形態３１～４５、４７、または４９～６３のいずれか１項に記載の方法。
６５．前記ＲＮＡが、ＡＧＵＵＧＧＴＣＣＧＡＧＵＧＵＵＧＵＧＧＧＵＵＡＵＵＧＵＵＡＡＧＵＵ／ｉ５ＯｃｔｄＵ／ＡＵＵＵＡＡＣＡＵＵＧＵＣＵＣＣＣＣＣＣＡＣＡＡＣＣＧＣＧＣＵＵＧＡＣＵＡＧＣＵＵＧＣＵＧ（配列番号２）の配列を含む、実施形態３１～４４または４６～６３のいずれか１項に記載の方法。
６６．Ａが、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、ｍＲＮＡ、アプタマーＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、もしくはガイドＲＮＡ、または
配列番号１であって、以下の構造：
を形成するようにｉ５ＯｃｔｄＵがコンジュゲートされている、前記配列番号１、もしくは
配列番号２であって、以下の構造：
を形成するようにｉ５ＯｃｔｄＵがコンジュゲートされている、前記配列番号２、もしくは
配列番号１であって、以下の構造：
を形成するようにｉ５ＯｃｔｄＵがコンジュゲートされている、前記配列番号１、もしくは
配列番号２であって、以下の構造：
を形成するようにｉ５ＯｃｔｄＵがコンジュゲートされている、前記配列番号２、もしくは
配列番号１であって、以下の構造：
を形成するようにｉ５ＯｃｔｄＵがコンジュゲートされている、前記配列番号１、もしくは
配列番号２であって、以下の構造：
を形成するようにｉ５ＯｃｔｄＵがコンジュゲートされている、前記配列番号２、もしくは
配列番号１であって、以下の構造：
を形成するようにｉ５ＯｃｔｄＵがコンジュゲートされている、前記配列番号１、もしくは
配列番号２であって、以下の構造：
を形成するようにｉ５ＯｃｔｄＵがコンジュゲートされている、前記配列番号２である場合、前記式（Ｉ）の化合物が図９に示される式のもの、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体である、実施形態３１～６５のいずれか１項に記載の化合物。
６７．実施形態１～６６のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩、溶媒和物、水和物、多形体、共結晶、互変異性体、立体異性体、同位体標識誘導体、もしくはプロドラッグ、及び任意に賦形剤を含む組成物。
６８．
実施形態１～６６のいずれか１項に記載の化合物、または実施形態６７に記載の組成物、及び
対象に前記化合物またはその組成物を投与するための、または生体試料を前記化合物またはその組成物と接触させるための使用説明書を含むキット。
例示的な実施形態：セクションＤ
１．
ａ）
ｉ）核酸と、
ｉｉ）前記核酸にコンジュゲートされた、少なくとも６個の単糖を含む少なくとも１個のグリカン部分と、
を含むグリコ核酸と、
ｂ）薬学的に許容される担体と、
を含む医薬組成物。
２．前記少なくとも１個のグリカン部分が、少なくとも８個の単糖を含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
３．前記少なくとも１個のグリカン部分が、少なくとも１０個の単糖を含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
４．前記少なくとも１個のグリカン部分がＮ結合型グリカンを含む、先行実施形態のいずれか１項に記載の医薬組成物。
５．前記少なくとも１個のグリカン部分がＯ結合型グリカンを含む、実施形態１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
６．前記少なくとも１個のグリカン部分が二分岐グリカンを含み、前記二分岐グリカンが第１の末端残基及び第２の末端残基を含む、先行実施形態のいずれか１項に記載の医薬組成物。
７．前記少なくとも１個のグリカン部分が三分岐グリカンを含み、前記三分岐グリカンが、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む、実施形態１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
８．前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがシアル酸を含む、実施形態６または７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
９．前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがフコースを含む、実施形態６または７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
１０．前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがＧｌｃＮＡｃを含む、実施形態６または７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
１１．前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがマンノースを含む、実施形態６または７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
１２．前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがＮｅｕＮＡｃを含む、実施形態６または７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
１３．前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがガラクトースを含む、実施形態６または７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
１４．前記核酸がＲＮＡである、先行実施形態のいずれか１項に記載の医薬組成物。
１５．前記核酸がｓｉＲＮＡである、実施形態１４に記載の医薬組成物。
１６．前記核酸がｍＲＮＡである、実施形態１４に記載の医薬組成物。
１７．前記核酸が環状ＲＮＡである、実施形態１４に記載の医薬組成物。
１８．前記核酸がガイドＲＮＡである、実施形態１４に記載の医薬組成物。
１９．前記核酸がアプタマーＲＮＡである、実施形態１４に記載の医薬組成物。
２０．前記核酸がＤＮＡである、実施形態１～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
２１．前記少なくとも１個のグリカン部分が、表２Ａまたは２Ｂの化合物を含む、先行実施形態のいずれか１項に記載の医薬組成物。
２２．前記修飾核酸が表１の核酸を含む、先行実施形態１～２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
２３．前記少なくとも１個のグリカン部分が、クリックケミストリー反応により前記修飾核酸にコンジュゲートされている、先行実施形態のいずれか１項に記載の医薬組成物。
２４．前記核酸が、前記核酸の末端に共有結合したリンカー基を介して前記グリカンにコンジュゲートされている、先行実施形態のいずれか１項に記載の医薬組成物。
２５．前記核酸が、前記核酸の中央の化学修飾ヌクレオチドに共有結合したリンカーを介して前記グリカンにコンジュゲートされている、実施形態１～２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
２６．前記核酸が、前記核酸の３’末端または５’末端に位置しない化学修飾ヌクレオチドに共有結合したリンカーを介して前記グリカンにコンジュゲートされている、実施形態１～２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
２７．前記核酸が、前記核酸の２個のヌクレオチド間に挿入された化学的ハンドルを介してグリカンにコンジュゲートされている、実施形態１に記載の医薬組成物。
２８．前記２個のヌクレオチドに、前記核酸の３’末端または５’末端のヌクレオチドは含まれない、実施形態２７に記載の医薬組成物。
２９．前記グリコ核酸が、式（Ｉ）：
Ａ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
の化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体であって、式中、
Ａが、第１のクリックケミストリーハンドルを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の核酸であり、
Ｂが、第２のクリックケミストリーハンドルを含むアスパラギン結合型グリカン（Ｎ－グリカン）であり、
Ｌが、前記第１のクリックケミストリーハンドルと前記第２のクリックケミストリーハンドルとの間の生体直交型クリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む、前記化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体を含む、実施形態１に記載の医薬組成物。
３０．式（Ｉ）：
Ａ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
のグリコ核酸化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体であって、式中、
Ａは、第１のクリックケミストリーハンドルを含む核酸であり、
Ｂは、第２のクリックケミストリーハンドルを含むアスパラギン結合型グリカン（Ｎ－グリカン）であり、
Ｌは、前記第１のクリックケミストリーハンドルと前記第２のクリックケミストリーハンドルとの間の生体直交型クリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む、前記グリコ核酸化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体。
３１．Ａが第１のクリックケミストリーハンドルを含むＤＮＡである、実施形態３０に記載のグリコ核酸。
３２．Ａが第１のクリックケミストリーハンドルを含むｓｉＲＮＡである、実施形態３０に記載のグリコ核酸。
３３．Ａが第１のクリックケミストリーハンドルを含むｍＲＮＡである、実施形態３０に記載のグリコ核酸。
３４．Ａが第１のクリックケミストリーハンドルを含む環状ＲＮＡである、実施形態３０に記載のグリコ核酸。
３５．Ａが第１のクリックケミストリーハンドルを含むＤＮＡである、実施形態３０に記載のグリコ核酸。
３６．Ａが、表４の「試薬Ａ」下に列挙されるものから選択される第１のクリックケミストリーハンドルを含み、Ｂが、表４の「試薬Ｂ」下に列挙されるものから選択される第２のクリックケミストリーハンドルを含む、実施形態３０に記載のグリコ核酸。
３７．Ａが、表４の「試薬Ｂ」下に列挙されるものから選択される第１のクリックケミストリーハンドルを含み、Ｂが、表４の「試薬Ａ」下に列挙されるものから選択される第２のクリックケミストリーハンドルを含む、実施形態３０に記載のグリコ核酸。
３８．Ｂが、二分岐グリカンを含むアスパラギン結合型グリカンであり、前記二分岐グリカンが、第１の末端残基及び第２の末端残基を含む、実施形態３０～３７のいずれか１項に記載のグリコ核酸。
３９．Ｂが、三分岐グリカンを含むアスパラギン結合型グリカンであり、前記三分岐グリカンが、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む、実施形態３０～３７のいずれか１項に記載のグリコ核酸。
４０．前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがシアル酸を含む、実施形態３８または３９に記載のグリコ核酸。
４１．前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがフコースを含む、実施形態３８または３９に記載のグリコ核酸。
４２．前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがＧｌｃＮＡｃを含む、実施形態３８または３９に記載のグリコ核酸。
４３．前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがマンノースを含む、実施形態３８または３９に記載のグリコ核酸。
４４．前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがＮｅｕＮＡｃを含む、実施形態３８または３９に記載のグリコ核酸。
４５．前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがガラクトースを含む、実施形態３８または３９に記載のグリコ核酸。
４６．疾患または状態を処置する方法であって、処置する必要がある対象に、治療上有効量の実施形態１～２９のいずれか１項に記載の医薬組成物または実施形態３０～４５のいずれか１項に記載のグリコ核酸を投与することを含み、前記疾患または状態が、炎症障害、自己免疫疾患、がん、代謝疾患、凝固疾患（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、抗凝固疾患（ａｎｔｉーｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、アレルギー、ウイルス疾患、及び微生物感染症から選択される、前記方法。
４７．前記疾患または状態が、炎症である、実施形態４６に記載の方法。
４８．前記疾患または状態が、がんである、実施形態４６に記載の方法。
４９．前記疾患または状態が、自己免疫疾患である、実施形態４６に記載の方法。
５０．前記アレルギーがＩｇＥ依存性アレルギーである、実施形態４６に記載の方法。
５１．前記自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである、実施形態４６に記載の方法。
５２．前記疾患または状態が、微生物感染である、実施形態４６に記載の方法。
５３．前記疾患または状態が、ウイルス感染症である、実施形態４６に記載の方法。
５４．前記疾患または状態が、代謝疾患である、実施形態４６に記載の方法。
５５．疾患または状態を処置するための薬剤を製造するための、実施形態１～２９のいずれか１項に記載の医薬組成物または実施形態３０～４５のいずれか１項に記載のグリコ核酸の使用であって、前記疾患または状態が、炎症障害、自己免疫疾患、がん、代謝疾患、凝固疾患（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、抗凝固疾患（ａｎｔｉーｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、アレルギー、ウイルス疾患、及び微生物感染症から選択される、前記使用。
５６． 疾患または状態を処置する必要がある対象における疾患または状態を処置するための、請求項１～２９のいずれか１項に記載の医薬組成物または実施形態３０～４５のいずれか１項に記載のグリコ核酸の使用であって、前記疾患または状態が、炎症障害、自己免疫疾患、がん、代謝疾患、凝固疾患（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、抗凝固疾患（ａｎｔｉーｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、アレルギー、ウイルス疾患、及び微生物感染症から選択される、前記使用。
５７．グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を発現する細胞と細胞表面グリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）を提示する細胞との間の相互作用を低減するための方法であって、
前記ＧＢＰを発現する細胞を、前記ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されたＧＢＰに結合する可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡと、前記ＧＢＰを発現する細胞と前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するのに有効な量で接触させることを含む、前記方法。
５８．前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが、Ｙ ＲＮＡファミリーのＲＮＡを含む、実施形態５７に記載の方法。
５９．前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡがＹ５ ＲＮＡを含む、実施形態５８に記載の方法。
６０．前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが、ｓｎｏＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態５７～５９のいずれか１項に記載の方法。
６１．前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが、可溶性シアル化ＲＮＡを含む、実施形態５７～５９のいずれか１項に記載の方法。
６２．前記可溶性シアル化ＲＮＡが、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態６１に記載の方法。
６３．前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが、１種以上の薬剤にコンジュゲートされている、実施形態５７～６２のいずれか１項に記載の方法。
６４．前記１種以上の薬剤が治療薬を含む、実施形態６３に記載の方法。
６５．前記１種以上の薬剤が検出可能な標識を含む、実施形態６３または６４に記載の方法。
６６．前記ＧＢＰが、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）を含む、実施形態５７～６５のいずれか１項に記載の方法。
６７．前記ＳｉｇｌｅｃがＳｉｇｌｅｃ－１１を含む、実施形態６６に記載の方法。
６８．前記ＳｉｇｌｅｃがＳｉｇｌｅｃ－１４を含む、実施形態６６に記載の方法。
６９．前記ＧＢＰがＣ型レクチンを含む、実施形態５７～６５のいずれか１項に記載の方法。
７０．前記ＧＢＰがガレクチンを含む、実施形態５７～６５のいずれか１項に記載の方法。
７１．前記ＧＢＰがセレクチンを含む、実施形態５７～６５のいずれか１項に記載の方法。
以下の実施例は、例証として提供されるものであり、限定するために提供されるものではない。
実施例１．グリカン代謝レポーターは、細胞ＲＮＡに組み込まれる
シアログリカンで修飾されたＲＮＡ（以下ｇｌｙｃｏＲＮＡと称される）の存在可能性を調べるために、ＨｅＬａ細胞を１００μＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｚで最長４８時間標識し、次いで、化学的及び酵素的にＲＮＡを高純度で抽出するための厳密なプロトコール（ＲＮＡを暖めたＴＲＩｚｏｌ（酸性フェノール及びグアニジン塩）で抽出し、次いで、エタノール沈殿し、シリカカラムにより脱塩し、高濃度プロテイナーゼＫ消化によりタンパク質汚染物質を取り除き、シリカカラムで再精製する（図１Ａ））を使用した。アジド標識された成分を可視化するために、変性条件（５０％ホルムアミド）で５５℃にてＲＮＡ試料をジベンゾシクロオクチン－ビオチン（ＤＢＣＯ－ビオチン）に添加することにより、銅（Ｃｕ）フリークリックケミストリーを使用し、続いて、変性ゲル電気泳動により分離し、ブロッティングにより分析した（図１Ｂ）。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ及び時間に依存した様式で、ビオチン化化学種が非常に高分子量（ＭＷ）（１０キロベース超）の領域に観察された。近年、高用量のアジド糖は非酵素的タンパク質標識化をもたらし得ることが報告されたが、全ＲＮＡの最高２０ｍＭのＡｃ４ＭａｎＮＡｚとのインビトロでのインキュベーションは、高分子量領域のＲＮＡについて以前に観察されたビオチン化分子種をもたらさなかった。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで標識された細胞ＲＮＡの一部の実験においてもより可変的に見られ得る、インビトロでのわずかなバックグラウンド標識が２８Ｓ ｒＲＮＡについて認められた（例えば、図１Ｂ）が、かかるバックグラウンド標識は、推定ｇｌｙｃｏＲＮＡ種において観察されなかった。更に、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで標識されたＨｅＬａ細胞由来のＲＮＡのＤＮアーゼでの処理は、ｇｌｙｃｏＲＮＡのシグナルに影響を及ぼさなかったが、ＲＮアーゼカクテル（Ａ及びＴ１）での処理により、ビオチン化ｇｌｙｃｏＲＮＡだけでなく全ＲＮＡが効果的に消化された（図１Ｃ）。この効果は、ＲＮアーゼ酵素活性を必要とした、阻害剤であるＳＵＰＥＲａｓｅＩｎによるＲＮアーゼの事前の阻害が、ビオチン化ｇｌｙｃｏＲＮＡを完全にレスキューした（図１Ｃ）。従って、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで処理された細胞は、アガロースゲル上で高分子量種として移動する細胞ＲＮＡにアジド標識を組み込む。
同じ代謝標識アプローチを使用して、他の細胞種及び動物におけるｇｌｙｃｏＲＮＡの存在を調べた。ヒト胚性幹細胞（Ｈ９）、ヒト骨髄性白血病株（Ｋ５６２）、ヒトリンパ芽球腫細胞株（ＧＭ１２８７８）、マウスＴ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞株（Ｔ－ＡＬＬ ４１８８）、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）は、全てｇｌｙｃｏＲＮＡの存在の証拠を示した。Ｈ９及び４１８８の細胞は、他の細胞種と比べて全ＲＮＡ量当たりで顕著により多くのＡｃ４ＭａｎＮＡｚでの標識化を示した。次に、この標識化がインビボで発生し得るかどうかを評価した。このために、マウスへのＡｃ４ＭａｎＮＡｚの腹腔内注射を２、４、または６日間実行した。分析に十分な全ＲＮＡが得られた器官である肝臓及び脾臓において、用量依存的な、かつＲＮアーゼ感受性のＲＮＡのＡｃ４ＭａｎＮＡｚ標識化が、培養細胞由来のｇｌｙｃｏＲＮＡと同じＭＷ領域で観察された（図１Ｄ）。これらのデータは、ｇｌｙｃｏＲＮＡは、組織培養の人為的結果ではなく、複数の細胞種及び組織型にわたって、かつ様々な存在量で広く生じることを示唆する。
実施例２．低分子非コードＲＮＡとしてのｇｌｙｃｏＲＮＡ
試験された全ての細胞種及び器官におけるｇｌｙｃｏＲＮＡが、変性アガロースゲル電気泳動により非常に緩徐に移動することが分かった（図１Ａ～１Ｄ）。ｇｌｙｃｏＲＮＡが本当に高分子ＲＮＡであるならば、それらはおそらくポリアデニル化（ポリＡ）されているだろうと仮説が立てられた。しかしながら、ポリＡ濃縮により抽出されたＲＮＡから、ｇｌｙｃｏＲＮＡを一貫して精製することができなかった（図２Ａ）。これは、ポリＡ濃縮処理の間のｇｌｙｃｏＲＮＡ切断または分解に起因するものではなかった。代替的な濃縮戦略として、鎖長依存的なＲＮＡ沈殿及びシリカカラムへの結合を利用して、「低分子」（２００ｎｔ未満）から「高分子」（２００ｎｔ超）の転写物を分離する市販の分画法を使用した（材料及び方法を参照のこと）。驚くべきことに、ｇｌｙｃｏＲＮＡは、全ＲＮＡのうちの低分子ＲＮＡ集団のみと共に分画された（図２Ｂ）。別の分画戦略を用いてこの観察結果を確認するために、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで標識されたＲＮＡをスクロース勾配に加え、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色により全ＲＮＡ及びｇｌｙｃｏＲＮＡの分布を分析した。スクロース勾配により、主要な目に見えるＲＮＡ、例えば、低分子ＲＮＡ／ｔＲＮＡ、１８Ｓ ｒＲＮＡ、及び２８Ｓ ｒＲＮＡが強く分離された（図２Ｃ）。ｇｌｙｃｏＲＮＡは、低分子ＲＮＡと共に分画されたが、依然としてアガロースゲルにおいて非常に緩徐な移動（高い見かけの分子量）を示した（図２Ｃ）。ｇｌｙｃｏＲＮＡの異常な移動挙動は、その結合したグリカンにより引き起こされる可能性がある。
実施例３．転写物の共通セットが多様な細胞種においてグリコシル化される
ｇｌｙｃｏＲＮＡ転写物を同定するために、スクロース勾配を利用して、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで標識されたＨ９及びＨｅＬａ細胞から低分子ＲＮＡ画分のみを単離した。ＲＮＡシークエンシングライブラリーを、低分子ＲＮＡ（インプット）及びストレプトアビジンプルダウン後の濃縮されたｇｌｙｃｏＲＮＡから生成させた。生物学的反復試験は、試料全体で高度な一致を示し、リードの大部分は、予想通りに非ポリアデニル化低分子ＲＮＡにマッピングされた。次に、どんなＲＮＡがＡｃ４ＭａｎＮＡｚ処理により選択的に標識されたかを評価した。インプットでのｔＲＮＡ及び非ｔＲＮＡ転写物の発現は、ＨｅＬａ細胞とＨ９細胞との間で正に相関していた。Ｙ ＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、及びｔＲＮＡのセットがＨ９及びＨｅＬａ細胞の両方において濃縮されること発見された。ＨｅＬａ及びＨ９細胞ｇｌｙｃｏＲＮＡの濃縮値は、これらの細胞種が異なる系列であるにもかかわらず強い正の相関を示した（図２Ｄ）。従って、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ濃縮は、ｇｌｙｃｏＲＮＡ候補としての１９３種のＲＮＡ転写物を明らかにする。
修飾されることが発見されたＲＮＡは、多数の確立された、かつ重要な細胞内役割を有する。Ｙ ＲＮＡファミリーは、それらの結合タンパク質及びリボ核タンパク質（ＲＮＰ）が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫疾患に関連する抗原であることが知られているため、（同定された幾つかのｇｌｙｃｏＲＮＡ転写物の中でも）目立っていた。これらのＲＮＡは、脊椎動物において高度に保存されており、特に５Ｓ ｒＲＮＡに対する細胞質ＲＮＰサーベイランスに寄与すると考えられる。これらの特徴を考慮して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による遺伝子ノックアウトにより、ｇｌｙｃｏＲＮＡとしてのＹ５を確認することを目的とした。Ｙ５ゲノム遺伝子座の５’及び３’領域を標的とした２種のシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用して２９３Ｔ Ｙ５ノックアウト細胞株を作製した。単細胞クローンを単離し、ＫＯを以下の特徴付けで選択した：Ｙ５遺伝子座のＰＣＲ増幅により、２つの異なる挿入／欠失に対応する２種のアンプリコンが得られた。ＫＯは観察可能なＹ５転写物を生成せず、以前に報告されたＹ ＲＮＡ冗長性と一貫して大きな増殖異常を示さなかった。Ｙ５ ＫＯ細胞のＡｃ４ＭａｎＮＡｚ標識化は、なんらの見かけの分子量の変化なしに、ＷＴ細胞と比較したビオチンシグナル量の有意な減少（約３０％、ｐ＝０．０３３）をもたらした（図２Ｅ）。ｇｌｙｃｏＲＮＡシグナルの減少は、シークエンシングデータと一致し、これにより、Ｙ５が、強く濃縮されるが、他にも存在するｇｌｙｃｏＲＮＡ候補のプールの中の１つのｇｌｙｃｏＲＮＡ候補として同定された。
実施例４．ｇｌｙｃｏＲＮＡにおけるシアル酸の標識での検出及び標識なしでの検出
次に、ｇｌｙｃｏＲＮＡ上のグリカン構造を明らかにすることを試みた。ヒト細胞におけるＡｃ４ＭａｎＮＡｚ代謝の主要な経路は、シアル酸への変換、次いで、ＣＭＰ－シアル酸への変換、及び最後にグリカンの末端への付加を伴う。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚが予想外の代謝経路に入る可能性を除外するために、ＣＭＰ－シアル酸に直接変換される９－アジドシアル酸（９Ａｚ－シアル酸）を代謝標識として使用した。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ標識化と一致して、９Ａｚ－シアル酸は、緩徐に移動する細胞ＲＮＡの同様の時間依存的標識化をもたらした（図３Ａ）。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで標識された細胞ＲＮＡのコレラ菌シアリダーゼ（ＶＣ－Ｓｉａ）での処理は、ＲＮＡ試料の完全性に影響を及ぼすことなくビオチンシグナルを完全に消失させたが、熱不活性化（ＨＩ）ＶＣ－Ｓｉａは、シグナルを低減することができなかった（図３Ｂ）。シアロシド生合成の細胞透過性代謝阻害剤であるＰ－３ＦＡＸ－Ｎｅｕ５Ａｃを使用することにより、標準的シアル酸生合成酵素の寄与を評価した。ＨｅＬａ細胞のＰ－３ＦＡＸ－Ｎｅｕ５Ａｃでの処理は、全ｇｌｙｃｏＲＮＡシグナルの用量依存的減少及びこれに付随するブロット上でのより高い見かけの分子量へのシフトをもたらした（図３Ｃ）。ｇｌｙｃｏＲＮＡのこの移動性の減少（ゲルにおいてより高い位置に現れること）は、タンパク質で観察されてきたように、おそらくより少ないシアル酸、及びこれによるｇｌｙｃｏＲＮＡ分子当たりのより小さい負電荷により生じる。
ｇｌｙｃｏＲＮＡがシアル化されていることを確認するために、代謝レポーターに依存しない別の方法を使用した。発蛍光性の１，２－ジアミノ－４，５－メチレンジオキシベンゼン（ＤＭＢ）プローブは、ＨＰＬＣ蛍光法による検出及び定量化のために、遊離シアル酸を誘導体化するために使用される。ＨｅＬａ、Ｈ９、及び４１８８細胞由来の天然の全ＲＮＡをＤＭＢ標識処理に供し、一般に動物において見出される２つの形態のシアル酸であるＮｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕ５Ｇｃの存在を観察した（図３Ｄ）。これらのピークは、試料がＶＣ－ＳｉａまたはＲＮアーゼで前処理される場合に消失した。このことは、ｇｌｙｃｏＲＮＡがシアル酸含有グリカンで修飾されるという説を裏付ける。注目すべきことに、ゲノムＤＮＡから遊離されるシアル酸は、ＤＭＢアッセイを使用して検出することができなかった。
Ｈ９、ＨｅＬａ、及び４１８８細胞は、それぞれ定量的に、全ＲＮＡ１μｇ当たり約４０、２０、及び２０ピコモル（ｐｍｏｌ）のシアル酸総量を有することが発見された（図３Ｅ）。４１８８細胞由来のｇｌｙｃｏＲＮＡは、より多くのＮｅｕ５Ｇｃを含有していたが、Ｈ９細胞は主にＮｅｕ５Ａｃを含有し、ＨｅＬａ細胞は同程度のレベルのＮｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕ５Ｇｃを有していた（図３Ｅ）。重要なことに、この定量的分析は、これらの細胞株で観察されたＡｃ４ＭａｎＮＡｚによる標識強度において観察された差と一致する。ヒト細胞は、Ｎｅｕ５ＡｃのＮｅｕ５Ｇｃへの変換を担う機能的ＣＭＡＨ遺伝子を欠くが、マウス細胞にはこの経路が存在する。それに対応して、マウス４１８８細胞由来のｇｌｙｃｏＲＮＡにおいて、ＨｅＬａまたはＨ９細胞と比較してより高レベルのＮｅｕ５Ｇｃが発見された（図３Ｅ）。ＨｅＬａ ｇｌｙｃｏＲＮＡにおけるＮｅｕ５Ｇｃの存在は、おそらく増殖培地中のウシ血清に由来し、Ｈ９細胞は無血清培地中で増殖した。
実施例５．標準的Ｎ－グリカン生合成機構がｇｌｙｃｏＲＮＡ生成に寄与する
２つの主なクラスのグリカンであるＮ－グリカン及びＯ－グリカンがタンパク質上に存在し、両方がシアル化され得る。ｇｌｙｃｏＲＮＡ構造が糖タンパク質に結合しているグリカンの構造と関連するかどうか決定するために、遺伝学的、薬理学的、及び酵素学的方法の組み合わせを使用した。変異ＣＨＯ細胞株ｌｄｌＤは、ＵＤＰ－グルコース（Ｇｌｃ）／ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ－ガラクトース（Ｇａｌ）／ＧａｌＮＡｃに相互変換する能力を欠く。従って、最小増殖培地では、細胞がＵＤＰ－Ｇａｌ（Ｎ－グリカン伸長に必要とされる）及びＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ（Ｏ－グリコシル化を開始するために必要とされる）を産生することができないため、ｌｄｌＤ ＣＨＯ細胞由来の糖タンパク質は、伸長が阻害されたＮ－及びＯ－グリカンを有する。最少培地で増殖させた、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで処理されたｌｄｌＤ ＣＨＯ細胞では、ｇｌｙｃｏＲＮＡの標識化がほとんど観察されなかった（図４Ａ）。しかしながら、培地へのガラクトースの補足は、ｇｌｙｃｏＲＮＡ標識化を復元し、しかし、ＧａｌＮＡｃの補足は、ｇｌｙｃｏＲＮＡ標識化を復元せず、ガラクトース及びＧａｌＮＡｃの両方の補給は、標識化の強度を更に高めた（図４Ａ）。この結果は、ｌｄｌＤ ＣＨＯ細胞株の表現型を模倣する、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によるＵＤＰ－ガラクトース－４－エピメラーゼ（ＧＡＬＥ）の標的化ノックアウトを有するヒトＫ５６２細胞株を使用して再現された。これらの結果のパターンは、これらの細胞種における糖タンパク質を標識する場合に観察されたものと同様であった。このことは、ｇｌｙｃｏＲＮＡのグリカンがタンパク質に見出されるグリカンと構造的に関連することを示唆する。
次に、ｇｌｙｃｏＲＮＡ生合成に対するグリコシル化阻害剤の効果を調べた。オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）は、Ｓｅｃ／トランスロコンを通したタンパク質の移行の間に十四糖グリカンを新生ポリペプチドのアスパラギン残基に転移させることによりタンパク質のＮ－グリコシル化を媒介する。ＯＳＴの特異的かつ強力な低分子阻害剤であるＮＧＩ－１のｇｌｙｃｏＲＮＡ生成に対する効果を調べた。かかる処理は、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚによるｇｌｙｃｏＲＮＡ標識化の用量依存的な喪失を引き起こした（図４Ｂ）。このことは、ＯＳＴがｇｌｙｃｏＲＮＡに結合したグリカンの生合成に関与することを示唆する。キフネンシン及びスワインソニン（それぞれＮ－グリカントリミング酵素であるα－マンノシダーゼＩ及びＩＩの阻害剤）を用いて、下流のＮ－グリカンプロセシングステップも撹乱させた。これらの処理も、Ｐ－３ＦＡＸ－Ｎｅｕ５Ａｃで見られた結果に類似した、より高用量でのｇｌｙｃｏＲＮＡの見かけの分子量の増加を伴う、アジド糖による標識化の用量依存的な喪失を引き起こした（図４Ｃ）。高マンノースグリカンのプロセシングの妨害により、正味の負電荷がより小さい低シアル化ｇｌｙｃｏＲＮＡが生成され、これにより移動性が減少したと仮説が立てられた。
ｇｌｙｃｏＲＮＡ上のグリカン構造を更に明らかにするために、エンドグリコシダーゼのパネルを用いた。最初に、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで標識されたＨｅＬａ細胞から精製されたＲＮＡを各酵素に曝露させ、次いで、可視化のためにビオチンと反応させた（図４Ｄ）。タンパク質とＮ－グリカンとの間のアスパラギンの側鎖アミド結合を切断するＰＮＧアーゼＦでのｇｌｙｃｏＲＮＡの処理は、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ標識化によるシグナルを強く消失させた。エンドＦ２は、二分岐及び高マンノース構造を優先的に切断する一方で、エンドＦ３は、フコシル化された二分岐及び三分岐構造（両方がグリカンのキトビオースコア内に存在する）を優先的に切断する。エンドＦ２またはＦ３でのｇｌｙｃｏＲＮＡの処理は、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚによる標識化の部分的喪失をもたらした。しかしながら、高マンノース構造に対してより選択的なエンドＨｆは、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚシグナルに影響を及ぼさなかった（図４Ｄ）。これらのＮ－グリカン消化酵素とは対照的に、Ｏ－グリコシダーゼ（コア１及びコア３Ｏ－グリカンを標的とする）またはムチナーゼ（ＳｔｃＥ）による処理は、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚによる標識化の強度に対して影響を及ぼさなかった（図４Ｄ）。先の実験のように、ＶＣ－Ｓｉａは、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ依存的標識を完全に除去した（図４Ｄ）。
実施例６．質量分析は、ＲＮＡ上のグリカンの異なる組成を明らかにする
上記のデータは、ｇｌｙｃｏＲＮＡは、少なくとも１個の末端シアル酸残基を有する複合型Ｎ－グリカンで修飾されていることを示唆する。ＲＮＡに結合したグリコフォームのより正確な見解を生み出すために、ＰＮＧアーゼＦにより媒介される低分子ＲＮＡプールからのグリカン遊離に基づくワークフローを利用し、続いて、多孔質黒鉛化炭素液体クロマトグラフィー－ＭＳ法によりそれらのグリカンを分析した（ＰＧＣ－ＬＣ－ＭＳ、図４Ｄ）。２９３Ｔ、Ｈ９、及びＨｅＬａ細胞由来の低分子ＲＮＡプールからグリカンを遊離させ、並行して、細胞タンパク質のグリカンプロファイルと比較するために、ペプチド試料を同様に処理した。各試料について２回の生物学的反復実験を実行した。両方の反復実験で存在した１０７種の固有のグリカンが、６種類の試料のうちの少なくとも１つにおいて発見された（図４Ｅ、材料及び方法を参照のこと）。同定されたグリカンの階層的クラスタリング及び主成分分析は、ペプチドから遊離されたグリカンが、ＲＮＡから放出されたものと比較される場合に、クラスター化のされ方が異なることを明らかにした。更に、ＲＮＡに見出された一連の固有のグリカンは、ペプチド上のものと比較してより小さく、限定された（図４Ｆ及び４Ｇ）。ＲＮＡグリカンをペプチドグリカンと区別する特徴を調べると、２９３Ｔ及びＨ９細胞は、これらと同じ細胞由来のペプチドと比較してより高比率のフコースで修飾されたグリカンをＲＮＡ上に有しているのが認められた。対照的に、ＨｅＬａ細胞由来のｇｌｙｃｏＲＮＡのグリカンは、ＨｅＬａ細胞由来のペプチドグリカンと比較してシアル酸修飾を含有する傾向が強かった。全体として、ＰＮＧアーゼＦから遊離されたグリカンのＰＧＣ－ＬＣ－ＭＳデータは、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚによる標識化及びＤＭＢプローブ実験と一致する。重要なことに、ＭＳベースの手法は濃縮または可視化のためにシアル酸を必要としないため、多くの場合、フコシル化されており、場合によっては、アシアル化されているグリカン組成の拡張されたセットを明らかにすることができた。
実施例７．ｇｌｙｃｏＲＮＡは細胞膜と会合する
次に、ｇｌｙｃｏＲＮＡの細胞内局在を評価した。シアル化グリカンの生合成は、細胞質ゾル（ＭａｎＮＡｃのＮｅｕ５Ａｃへのプロセシング）、核（ＣＭＰへのＮｅｕ５Ａｃの付加）、及び分泌経路（シアリルトランスフェラーゼがグリカンの末端にシアル酸を付加する）が含まれる、多数の細胞内区画において起こる。Ｙ ＲＮＡは主に細胞質に局在化し、小部分が核に局在化することが報告されている。他の主要なクラスのｇｌｙｃｏＲＮＡ転写物、例えば、ｔＲＮＡ及びｓｎ／ｓｎｏＲＮＡは、典型的にそれぞれ可溶性細胞質ゾル及び核に局在する。ｇｌｙｃｏＲＮＡが細胞内のどこに分布するかを決定するために、以下の２つの生化学的方法を使用した：膜性細胞小器官及び細胞質ゾルから核を単離する１つ目の方法及び膜性細胞小器官から可溶性細胞質区画を分離する２つ目の方法（材料及び方法を参照のこと）。Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで標識されたＨｅＬａ細胞由来の核内ＲＮＡは、検出可能なアジド標識された分子種をもたらさなかったが、膜画分は排他的にｇｌｙｃｏＲＮＡを含有していた（図５Ａ及び５Ｂ）。このことは、ｇｌｙｃｏＲＮＡが膜性細胞小器官と密接に関連していることを示唆する。
膜性細胞小器官は正確なトポロジー構造を有するため、次に、単離された膜に関して、ｇｌｙｃｏＲＮＡのトポロジカルな組織化が明らかに存在するかどうかを評価した。粗製の細胞膜及び膜に包まれた細胞小器官を、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚで標識された２９３Ｔ細胞から単離し、膜区画を透過処理するためのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００による前処理を行い、または行わずに、ＶＣ－Ｓｉａによる消化に供した。ｇｌｙｃｏＲＮＡが膜区画の内腔にトポロジカルに限定される場合、ＶＣ－Ｓｉａは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の添加後にのみこの分子種に到達するであろう。大部分のｇｌｙｃｏＲＮＡシグナルは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００なしでＶＣ－Ｓｉａによる影響を受けたが、少量の、しかし再現可能なプールは、透過化処理後のみに到達可能であったことが発見された。従って、一部のｇｌｙｃｏＲＮＡは膜性細胞小器官の内腔に存在するようであるが、大部分がこのアッセイにおいて影響を受けやすいか、または膜の表面に存在するようである。
実施例８．ｇｌｙｃｏＲＮＡは生細胞の表面に接近する
上記の実験においてＶＣ－Ｓｉａの影響を受けやすいことは、ｇｌｙｃｏＲＮＡが細胞内小胞または膜性細胞小器官の内腔に蓄積しないことを示唆するが、ｇｌｙｃｏＲＮＡがどの膜表面に存在し得るかを正確に明らかにしない。グリコポリマーの標準的輸送及び局在化を考慮して、ＲＮＡのグリコシル化は、形質膜に輸送され、生細胞の細胞外表面に提示される能力をＲＮＡに与え得ると仮説が立てられた。この仮説に対して、関連性がなく、かつ相補的な２つの手法により取り組んだ。
最初に、ＶＣ－Ｓｉａのシアル酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ上のものが含まれる）を切断する強力かつ特異的な活性、及び生細胞の表面から選択的にシアル酸を切断する確立された能力を利用した。ＨｅＬａ生細胞の培養培地にＶＣ－Ｓｉａを添加した後のＡｃ４ＭａｎＮＡｚシグナルの変化を評価し、わずか２０分でｇｌｙｃｏＲＮＡレベルの減少が見られた（図５Ｃ）。６０分でこの実験を繰り返すと、最も大きな差が観察され（図５Ｄ）、接着細胞（ＨｅＬａ及び２９３Ｔ）及び懸濁細胞（Ｋ５６２）の両方でこの実験を実行することにより、全ての場合で、ＶＣ－ＳｉａがｇｌｙｃｏＲＮＡのレベルを有意に減少させることができることが示された。これらのデータは、短時間かつインタクトな形質膜がある環境で、ＶＣ－Ｓｉａが、細胞から精製される５０％超の大部分のｇｌｙｃｏＲＮＡにアクセスすることを示す。
ｇｌｙｃｏＲＮＡが生細胞表面に局在するという観察結果を確認するために、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚの代謝への取り込みとは無関係な標識化ワークフローを必要とした。これを達成するために、ペルオキシダーゼ触媒近位標識化技術を、ビオチン－アニリンが、タンパク質標識化に望ましいビオチンフェノールと比較して、ＲＮＡに対する顕著に高い反応性を有するという発見と組み合わせた。生細胞に結合するための細胞表面親和性のあるツールとしてレクチンを利用する非遺伝学的方法を用いた。レクチンは、次いで、ペルオキシダーゼをリクルートし得、結合したグリカンの近くのＲＮＡにビオチン－アニリンを沈着させ得る（図５Ｅ）。一般的な細胞表面結合試薬としてレクチンが広く使用されているにもかかわらず、それらは特異的なグリコフォーム結合特徴を有し、従って、図３及び４のデータに基づいて、ｇｌｙｃｏＲＮＡの近くに結合しないはずであるレクチン（高マンノース構造に特異的なＣｏｎＡ）及びｇｌｙｃｏＲＮＡに直接結合するはずのレクチン（ＭＡＡＩＩ、シアル酸；ＷＧＡ、Ｎ－グリカン＋／－シアル酸）を選択した。
最初に、このアッセイをＨｅＬａ生細胞表面タンパク質に対して評価した。予想通りに、３つ全てのレクチンが、ストレプトアビジン－ＨＲＰをリクルートし、ビオチン－アニリンを活性化し、細胞表面タンパク質の特異的な標識化パターンをもたらすことができたが、ストレプトアビジン－ＨＲＰのみでは、ロバストな標識化を引き起こすことができなかった。この実験及びその後の全ての実験は、小胞輸送、膜リサイクル、または細胞外成分の取り込みを低減するか、またはなくすために厳密に４℃で実施した。次に、これらの細胞由来のＲＮＡを分析し、細胞がＭＡＡＩＩまたはＷＧＡで染色される場合に、高分子量バンドの特異的な標識化が引き起こされるが、ＣｏｎＡでは引き起こされないことが発見された。このシグナルは部分的にＲＮアーゼ感受性であった（８９％の喪失、図５Ｆ）。精製されたＲＮＡ材料をシアリダーゼで処理すると、シグナルの量の大きな減少なしに、ビオチンシグナルのゲルのウェル方向へのほぼ定量的なシフトが観察された（図５Ｆ）。このことは、ビオチン－アニリンが直接的にＲＮＡを共有結合的に修飾し、グリカン、特にシアル酸がアガロースゲルにおけるｇｌｙｃｏＲＮＡの非常に異常な移動に寄与するという見解を支持する。
生細胞ではなく、細胞可溶化物で近接ライゲーションアッセイを繰り返すことにより、（ビオチン－アニリンの活性化ニトレンラジカルに対して）不透過性の形質膜がなくても、ＭＡＡＩＩ及びＷＧＡがｇｌｙｃｏＲＮＡを依然として標識したことが示された。しかしながら、３つ全てのレクチンがｒＲＮＡバンドを弱く、しかし一貫して標識した（図５Ｇ）。生細胞での実験におけるこれらのｒＲＮＡバンドの非存在及び高分子量のｇｌｙｃｏＲＮＡバンドと比較したそれらの強度は、大部分の細胞ｇｌｙｃｏＲＮＡが細胞表面に存在することを再び示唆する。ビオチン－アニリン標識に曝露された全ＲＮＡは、アニリンプローブまたは他の分子種によるＲＮＡの共有結合による修飾におそらく起因して、ＲＮアーゼで完全に消化されなかった（図５Ｆ及び５Ｇ、左の第５レーン）。完全なＲＮアーゼ感受性がこれらの実験において観察されなかった理由はこれであると考えられる。要約すれば、本明細書において報告されたＲＮＡグリカンを説明する化学的実験結果、遺伝学的実験結果、及び質量分析による結果と一致して、生細胞表面上の複合型Ｎ－グリカンの近くのＲＮＡの近位に基づく標識化によりｇｌｙｃｏＲＮＡが検出される。
実施例９．Ｓｉｇｌｅｃ受容体及び抗ＲＮＡ抗体は、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを認識する
細胞表面に局在するバイオポリマーは、多くの場合、シスでまたは細胞間接合部においてトランスで結合パートナーとの分子相互作用に関与する。ｇｌｙｃｏＲＮＡが細胞表面に存在するため、それらもこの種の相互作用に関与し得ると仮説が立てられた。抗体または組換えタンパク質ベースの親和性試薬のような細胞表面生物学を研究するための既存の試薬が、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡと相互作用し得るかどうかを評価した（図６Ａ）。
ＲＮＡを標的とする抗体は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に関連する。加えて、抗ＲＮＡ抗体は研究ツールとして使用され、例えば、抗二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）抗体Ｊ２は、ＲＮＡの二本鎖領域に対する特異性を有し（ｄｓＤＮＡとの交差反応性なし）、多くの場合、ＲＮＡウイルスに感染した細胞を同定するために使用される。Ｊ２抗体は、最小で約４０ｂｐの長さを有するｄｓＲＮＡに結合することが報告されている。ｇｌｙｃｏＲＮＡは、二重鎖ＲＮＡ領域を有すると予測されるが、これらは一般的に４０ｂｐ未満の長さである。そうではあるが、Ｊ２が、Ａｃ４ＭａｎＮＡｚシークエンシング（図２Ａ～２Ｅ）により濃縮されることが発見された低分子ＲＮＡ、例えば、Ｙ５ ＲＮＡに結合することができるかどうかを、電気泳動移動度シフトアッセイを使用して試験した。Ｊ２抗体は、インビトロで遊離Ｙ５ ＲＮＡをシフトさせることができた。このシフトはＪ２に特異的であり、アイソタイプ対照抗体を使用すると観察されなかった。更に、Ｊ２により誘発されるシフトは、長鎖ｄｓＲＮＡを模倣する競合ポリ（Ｉ：Ｃ）の存在下で消失した。
Ｊ２がＹ５のようなｇｌｙｃｏＲＮＡのＲＮＡ成分に結合することができることが確認されたため、細胞表面ＲＮＡを探索するフローサイトメトリーアッセイを確立した。全ての実験を生細胞で実行し、実験ワークフローの柔軟性のために、抗体を結合させ、バックグラウンドを洗い落とした後にのみ固定した。組換え起源の細胞解離酵素を使用する必要があった。例えば、一般的に使用されるトリプシンの粗製調製物は、顕著なＲＮアーゼ活性を有し、従って、ＲＮＡを急速に破壊する（材料及び方法を参照のこと）。
培養したＨｅＬａ細胞集団の約２０％がＪ２染色で陽性を示した（図６Ｂ）。この結合は、細胞のＲＮアーゼＡでの前処理により大きく消失し、ＲＮアーゼＡに特異的なタンパク質阻害剤を添加して、活性を阻害することにより復元された（図６Ｂ）。同様の結果が、２９３Ｔ（接着）細胞及びＫ５６２（懸濁）細胞を使用して観察された。細胞表面を染色したＪ２の分布を確認するために、Ｊ２で染色したＨｅＬａ細胞の共焦点イメージングを実行し、これにより、細胞の周縁部におけるシグナルが実証され、このシグナルはＲＮアーゼＡ処理に感受性を示した。次に、図４で以前に行われたようにＯＳＴを撹乱させることにより、Ｊ２が細胞表面上のｇｌｙｃｏＲＮＡを検出したかどうかを調べた。ＨｅＬａ細胞をＯＳＴ阻害剤のＮＧＩ－１で１２時間処理し、細胞表面へのＪ２結合の用量依存的な喪失が観察された（図６Ｃ）。このことは、図４Ａ～４Ｈで報告された全細胞ＲＮＡブロッティング実験と一致しており、Ｊ２抗体により認識される細胞表面ＲＮＡの大部分がその表面局在化のためにＮ－グリコシル化に依存することを示唆する。
最後に、ｇｌｙｃｏＲＮＡが、リガンドが細胞表面糖タンパク質及び糖脂質であると慣例に基づいて推定されるグリカン結合性受容体と相互作用することができるかどうかを決定しようと試みた。上記のように、ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合しているＮ－グリカンは、高度にシアル化されている。従って、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）受容体ファミリーのメンバーが、ｇｌｙｃｏＲＮＡを認識することができるかどうかを調べた。注目すべきことに、Ｓｉｇｌｅｃは、ヒトにおけるシアロシド結合タンパク質の最も大きなファミリーであり、１４個のメンバーが全てのクラスの免疫細胞に分布する。免疫修飾におけるそれらの役割は確立されており、宿主病原体相互作用、がん免疫回避、自己免疫疾患との遺伝的関連性が挙げられる。個々のＳｉｇｌｅｃファミリーメンバーの生理学的リガンドは、幾つかの条件において同定されているが、ほとんどの場合、免疫シナプスでＳｉｇｌｅｃ結合を補助するグリココンジュゲートは十分に特徴付けられていない。リガンドを特徴付けようとする全ての試みにおいて、Ｓｉｇｌｅｃのリガンドは糖タンパク質または糖脂質であると推察されている。
ヒトＳｉｇｌｅｃ受容体が細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡに結合することができるかどうか決定するために、可溶性Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆｃ試薬を使用し、フローサイトメトリーによりそれらの細胞への結合を調査した。最初に、１２種の市販のＳｉｇｌｅｃ－Ｆｃ試薬のうちの９種がバックグラウンドを超えてＨｅＬａ細胞に結合することができると結論付けられた。これらの９種のうち、２種のＳｉｇｌｅｃ－Ｆｃ試薬、Ｓｉｇｌｅｃ－１１及びＳｉｇｌｅｃ－１４の結合がＲＮアーゼＡ処理に対する感受性を示した（図６Ｄ）。これらのデータは、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡが直接的なＳｉｇｌｅｃ受容体リガンドであり得ることを示唆する。
実施例１～９での材料及び方法
化学的代謝レポーター及び阻害剤
アジド標識された糖であるＮ－アセチル－９－アジド－９－デオキシ－ノイラミン酸（９Ａｚシアル酸、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）及びＮ－アジドアセチルマンノサミン－テトラアシル化（Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ、Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ）の保存液を、無菌のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中５００ｍＭで作成した。非標識の糖であるＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ、Ｓｉｇｍａ）及びＤ－（＋）－ガラクトース（Ｇａｌ、Ｓｉｇｍａ）の保存液を、それぞれ滅菌水中５００ｍＭ及び５０ｍＭで作成した。細胞実験では、ＭａｎＮＡｚを１００μＭの最終濃度で使用した。ＭａｎＮＡｚでのインビトロ実験では、０、２、または２０ｍＭ（細胞内濃度の２００倍まで）のＭａｎＮＡｚを３７℃で２時間使用した。９Ａｚシアル酸を用いた細胞内実験では、１．７５ｍＭの最終濃度を６～４８時間使用した。Ｇａｌ及びＧａｌＮＡｃをそれぞれ１０μＭ及び１００μＭで培地添加剤として使用し、標識化のためのＭａｎＮＡｚと同時に添加した。
グリカン生合成阻害剤の全ての作業溶液を、ＤＭＳＯ中の以下の濃度で作成し、－８０℃で保存した：１０ｍＭのＮＧＩ－１（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭのキフネンシン（Ｋｉｆ、Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭのスワインソニン（Ｓｗａｉｎ、Ｓｉｇｍａ）、５０ｍＭのＰ－３ＦＡＸ－Ｎｅｕ５Ａｃ（Ｔｏｃｒｉｓ）。全ての化合物を細胞に対して２４時間使用し、標識化のためのＭａｎＮＡｚと同時に添加した。
マウスモデルにおける代謝レポーター
全ての実験を、実験動物ケアに関するスタンフォード大学管理委員会（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）により確立されたガイドラインに従って実行した。Ｃ５７Ｂｌ／６匹のマウスは、研究室で交配及び飼育した。１００ｍｇのＭａｎＮＡｚを８３０μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中７０％のＤＭＳＯ中溶解し、３７℃に５分間加熱し、次いで、０．２２μｍのＵｌｔｒａｆｒｅｅ ＭＣ遠心式フィルターユニット（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して無菌濾過することによりＭａｎＮＡｚを調製した。この溶液を－２０℃で保存した。雄のＣ５７Ｂｌ／６マウス（８～１２週齢）に、１００μＬのＭａｎＮＡｚ（３００ｍｇのＭａｎＮＡｚ／ｋｇ／ｄａｙに用量設定した）を１日１回腹腔内注射し、一方で対照マウスは、ビヒクルのみを投与された。２、４、及び６日目に、マウスを安楽死させ、それらの肝臓及び脾臓を採取した。器官をナイロン製セルストレーナーを通して加圧し、ＰＢＳで再懸濁して、単個細胞懸濁液を作成した。ＲＮＡを下記のように回収した。
ＲＮＡ抽出及び精製方法
この研究を通じて分析されるＲＮＡが可能な限り純粋なものとなるように、特定の一連のステップを実行した。最初に、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を第１のステップとして使用して、細胞または組織を溶解し、変性させた。ピペット操作によるＴＲＩｚｏｌ中での均質化後、試料を３７℃でインキュベートして、非共有結合性相互作用を更に変性させた。０．２倍容量の１００％クロロホルムを添加し、ボルテックスして混合し、最後に１２，０００ｘｇで４℃にて１５分間遠心することにより相分離を起こさせた。水相を慎重に取り出し、新しいチューブに移し、２倍容量の１００％エタノール（ＥｔＯＨ）と混合した。この溶液をＺｙｍｏ ＲＮＡ精製・濃縮カラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で以下のように精製した：試料溶液をＺｙｍｏカラムに添加し、１０，０００ｘｇで２０秒間遠心し、素通り画分は常に廃棄した。１ｘ４００μＬのＲＮＡ Ｐｒｅｐ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）及び２ｘ４００ｕＬのＲＮＡ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の３回に分けて洗浄を実行し、１０，０００ｘｇで２０秒間遠心した。ＲＮＡを溶出させるために、２容量の純水を使用した。次に、２５μｇの精製されたＲＮＡに対して１μｇのプロテイナーゼＫ（ＰＫ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、これを３７℃で４５分間インキュベートすることにより、ＲＮＡをタンパク質消化に供した。ＰＫによる消化後、ＲＮＡを上記のようにＺｙｍｏ ＲＮＡ精製・濃縮カラムを用いて再び精製した。この研究において作成された全てのＲＮＡ試料は、少なくとも最初にこれらの２ステップにより精製し、続いて、これらの最初の２回の精製に加えて酵素的分画またはＲＮＡ分画を行った。Ｚｙｍｏ－Ｓｐｉｎ ＩＣ及びＩＩＩＣＧカラムは、それぞれ約５０及び３５０μｇまでの全ＲＮＡに結合することが発見された。各実験におけるカラムは、精製される必要があるＲＮＡ量に基づいて選択した。
低分子対高分子ＲＮＡの分別沈殿では、Ｚｙｍｏ ＲＮＡ精製・濃縮カラムのプロトコールを記載される通りに使用した。要約すると、水溶液中のＲＮＡを１容量の１００％ＥｔＯＨ中５０％のＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒと混合した。この混合物をＺｙｍｏシリカカラムに加えた。素通り画分は低分子ＲＮＡを含有し、一方で、カラムは高分子ＲＮＡを保持していた。素通り画分を１容量の１００％ＥｔＯＨと混合し、新しいＺｙｍｏカラムに結合させ、上記のように精製した。
ポリアデニル化ＲＮＡ種を濃縮するために、上記のように精製された最初のＲＮＡを、Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｉｓｔ ＭＡＧ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のインプットとして使用した。Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ） ＭａｇＢｅａｄｓを等分し、Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １で２回洗浄した。ＲＮＡ（１５μｇの全ＲＮＡ）を１ｘＢｉｎｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中の６００ｎｇ／μＬにし、洗浄したビーズに添加し、７０℃に５分間加熱した。試料を２５℃に６０分間冷却し、磁石を当て、上清を除去し、Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １を用いて２回及びＷａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２を用いて１回洗浄した。ＲＮＡ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎをビーズに添加し、試料を７０℃に加熱することによりポリＡ濃縮されたＲＮＡを溶出させた。溶出ステップを２回実行し、得られたポリＡ ＲＮＡを、Ｚｙｍｏ ＲＮＡ精製・濃縮カラムにより上記のように精製した。
ＲＮＡ試料及び細胞の酵素処理
様々なエンド及びエキソヌクレアーゼならびにグリコシダーゼを、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはグリカンを消化するために使用した。全ての消化を２０μＬ中２０μｇの全ＲＮＡに対して３７℃で６０分間実行した。ＲＮＡを消化するために、１μＬのＲＮアーゼカクテル（０．５Ｕ／μＬのＲＮａｓｅＡ及び２０Ｕ／μＬのＲＮアーゼＴ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＫＣｌ、及び０．１ｍＭのＭｇＣｌ２と共に使用した。ＲＮアーゼカクテルのＲＮアーゼ活性を阻害するために、ＲＮＡ溶液に添加する前に、１μＬのＲＮアーゼカクテルを８μＬのＳＵＰＥＲａｓｅＩｎ（２０Ｕ／μＬ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と２５℃にて１５分間予め混合した。ＤＮＡを消化するために、２μＬのＴＵＲＢＯ ＤＮアーゼ（２Ｕ／μＬ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、１ｘＴＵＲＢＯ ＤＮアーゼ緩衝液（製造により提供されない成分）と共に使用した。グリカンを消化するために、２μＬのα２－３，６，８ノイラミニダーゼ（５０Ｕ／μＬ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ）をＧｌｙｃｏＢｕｆｆｅｒ １（ＮＥＢ）と共に、または２μＬのエンドＨｆ（１，０００Ｕ／μＬ、ＮＥＢ）をＧｌｙｃｏＢｕｆｆｅｒ ３（ＮＥＢ）と共に、または２μＬのＰＮＧアーゼＦ（５００Ｕ／μＬ、ＮＥＢ）をＧｌｙｃｏＢｕｆｆｅｒ ２（ＮＥＢ）と共に、または２μＬのエンドＦ２（８Ｕ／μＬ、ＮＥＢ）をＧｌｙｃｏＢｕｆｆｅｒ ３（ＮＥＢ）と共に、または２μＬのエンドＦ３（８Ｕ／μＬ、ＮＥＢ）をＧｌｙｃｏＢｕｆｆｅｒ ４（ＮＥＢ）と共に、または２μＬのＯ－グリコシダーゼ（４０，０００Ｕ／μＬ、ＮＥＢ）をＧｌｙｃｏＢｕｆｆｅｒ ２（ＮＥＢ）と共に、または１μＬの０．５μｇ／μＬのＳｔｃＥを２０ｍＭのＥＤＴＡと共にもしくはそれなしで使用した。生細胞の処理について、ＶＣ－Ｓｉａを以前に記載されたように発現させ、精製し、完全増殖培地中１５０ｎＭの最終濃度で細胞に３７℃で２０～６０分間添加した。
ＲＮＡへの銅フリークリックコンジュゲーション
ビオチンのアジド糖（ＭａｎＮＡｚ及び９Ａｚ－Ｓｉａ）へのコンジュゲートの間に溶液中に銅が存在することを回避するために、全ての実験において銅フリー条件を使用した。全ての実験でジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－ビオチン（ＤＢＣＯ－ビオチン、Ｓｉｇｍａ）を環化付加のアルキン部分として使用した。ＳＰＡＡＣを実行するために、純水中のＲＮＡを、１容量の「色素フリー」のＧｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（ｄｆ－ＧＬＢＩＩ、９５％のホルムアミド、１８ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０２５％のＳＤＳ）及び５００μＭのＤＢＣＯ－ビオチンと混合した。通常、これらの反応物は、１０μＬのｄｆ－ＧＬＢＩＩ、９μＬのＲＮＡ、１μＬの１０ｍＭ保存液のＤＢＣＯ試薬であった。ＲＮＡ及び任意の他の存在し得る夾雑物を変性させるために、試料を５５℃で１０分間コンジュゲートさせた。８０μＬの水、次いで、２容量（２００μＬ）のＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｚｙｍｏ）を添加し、ボルテックスし、最後に３容量（３００μＬ）の１００％ＥｔＯＨを添加し、ボルテックスすることにより反応を停止させた。この結合反応物を上記のようにＺｙｍｏカラムにより精製し、下記のようにゲル電気泳動により分析した。
ＲＮＡゲル電気泳動、ブロッティング、及びイメージング
ＭａｎＮＡｚで標識されたＲＮＡのブロッティング分析を、概念的にはノーザンブロットと同様に、以下の変更を加えて実行した。精製、濃縮、または酵素により消化され、上記のようにＤＢＣＯ－ビオチン試薬にコンジュゲートされたＲＮＡを凍結乾燥し、続いて、１ｘＳｙｂｒＧｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する１５μＬのｄｆ－ＧＬＢＩＩ中に再懸濁した。変性させるために、ＲＮＡを５５℃で１０分間インキュベートし、３分間氷に突っ込んだ。次いで、試料を１％アガロース／ホルムアルデヒド変性ゲル（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｍａｘ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、１１０Ｖで４５分間電気泳動した。次いで、ＵＶゲルイメージャーを使用してゲル内の全ＲＮＡを可視化した。０．４５μｍのニトロセルロース膜（ＮＣ、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したことを除いて、ＲＮＡの転写をＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｍａｘ のプロトコールに従って２５℃で２時間行った。このことは、ほとんどの正に荷電したナイロン膜が赤外線（ＩＲ）スペクトルにおいて強いバックグラウンドを有するため、後続のイメージングに重要である。転写後、ＵＶ－Ｃ光（０．１８Ｊ／ｃｍ２）を使用してＲＮＡをＮＣに架橋させた。次いで、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ）（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＮＣ膜を２５℃にて４５分間ブロッキングした。ＴＢＳまたはＰＢＳで製造されたブロッキングバッファーは、両方ともＬｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから販売されており、このステップでは同様に機能することに留意されたい。ブロッキング後、ストレプトアビジン－ＩＲ８００（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＯｄｙｓｓｅｙ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中に１：１０，０００で希釈し、２５℃で３０分間ＮＣ膜を染色した。過剰なストレプトアビジン－ＩＲ８００を、１ｘＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ）での３回の連続的な洗浄により、それぞれ２５℃で５分間膜から洗い落とした。ＮＣ膜を１ｘＰＢＳで短時間リンスして、Ｔｗｅｅｎ－２０を除去し、その後、７００及び８００ｎｍチャネルの両方でシグナル強度を自動検出するように設定されたソフトウェアを備えたＬｉＣｏｒのＯｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘスキャナー（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でスキャンした。スキャン後、ＬｉＣｏｒソフトウェア（適切な場合）用いて８００ｎｍチャンネルで画像を定量化し、エクスポートした。
シアル酸検出のためのＤＭＢアッセイ
別途注記のない限り、全ての化学物質はＳｉｇｍａにより供給された。ＲＮＡまたはＤＮＡ上の天然シアル酸を、４，５－メチレンジオキシ－１，２－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＤＭＢ）で誘導体化し、確立された方法に従って逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により検出した。要約すると、ＲＮＡ試料を凍結乾燥し、１００μｇ（またはそうでなければ特定の図において示される）の各試料を２Ｍの酢酸中に溶解した。シアル酸を８０℃でのインキュベーションにより２時間加水分解し、次いで、室温に冷却し、その後、ＤＭＢ緩衝液（７ｍＭのＤＭＢ、０．７５Ｍのβ－メルカプトエタノール、１８ｍＭのＮａ２ＳＯ４、１．４Ｍの酢酸）を添加した。誘導体化を５０℃で２時間実行した。０．２ＭのＮａＯＨ添加後、試料を遠心分離により１０ｋＤａのＭＷＣＯフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過し、使用するまで暗下で－２０℃にて保存した。Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＥＣ－Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用し、水中のアセトニトリルの以下の勾配を用いて逆相ＨＰＬＣにより分離を実行した：Ｔ（０分）：２％；Ｔ（２分）：２％；Ｔ（５分）：５％；Ｔ（２５分）：１０％；Ｔ（３０分）：５０％；Ｔ（３１分）：１００％；Ｔ（４０分）：１００％；Ｔ（４１分）：２％；Ｔ（４５分）：２％。ＤＭＢ誘導体化シアル酸を、３７３ｎｍでの励起及び４４８ｎｍでの発光のモニタリングにより検出した。シアル酸標準物質として、Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ；Ｊｕｌｉｃｈ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｎ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ；Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）、３－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－２－ノヌロソン酸（ＫＤＮ；Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）、及びＧｌｙｋｏ Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｎｅｌ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）が含まれた。
細胞小器官分画
非常に純粋な核の単離
核はＥＲに複雑に結び付いており、混合することなくきれいに核をＥＲから生化学的に分離するという難題をもたらしている。Ｇａｇｎｏｎらは、結合したＥＲ膜が大きく残存することなく処理後に哺乳動物の核をきれいに回収するプロトコールを記載している。作業手順を追ったこの公開された説明に変更を加えることなく、このプロトコールをＭａｎＮＡｚで標識された接着ＨｅＬａ細胞に対して実行した。核のストリンジェントな単離のために、一部の核画分自体が処理の間に溶解し、非核画分が汚染される。従って、このプロトコールの分画結果を試験する場合は、核に残存するシグナルのみを考慮する。上清におけるシグナルは、部分的に混合されたＥＲ、ゴルジ、細胞質ゾル、一部の核、及び他の細胞内区画である。プロトコールに従って分画した後、ＴＲＩｚｏｌを使用して、ＲＮＡを抽出及び処理した。
細胞質ゾル及び粗製の膜画分の単離
ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ（登録商標） Ｎａｔｉｖｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をＭａｎＮＡｚで標識された接着ＨｅＬａ細胞に使用した。このキットは、以下の連続した溶解ステップを使用する：可溶性の細胞質ゾルタンパク質及びＲＮＡを穏やかに遊離させる第１のステップ、ならびに形質膜、ゴルジ、及びＥＲなどの膜性細胞小器官を破裂させる第２のステップ。溶解緩衝液が穏やかであるため、ＥＲ／ゴルジが核分画に残存し、従って、このキットにより作成された試料の分析は、膜性画分と比較して効果的に分離された可溶性細胞質画分に限定された。具体的には、最初に培養ＨｅＬａ細胞から増殖培地を除去し、次いで、細胞を氷冷したＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（プロテアーゼ阻害剤を補足した）を培養プレートに添加し、振動させながら細胞を４℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、この緩衝液を「細胞質」として採取した。その後に、Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（プロテアーゼ阻害剤を補足した）を細胞に添加し、４℃で３０分間振動させた。この緩衝液を「ＥＲ／膜」として採取した。次いで、これらの画分を上記のようにＴＲＩｚｏｌで抽出し、処理した。
膜保護アッセイ
Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ａｂ６５４００、Ａｂｃａｍ）を使用して以下のように粗製の膜を大規模に単離した：最初に、培養細胞から増殖培地を除去し、次いで、細胞を氷冷した１ｘＰＢＳで２回洗浄した。２回目のＰＢＳ洗浄で、細胞をプレートから擦り取り、４００ｘｇで４℃にて４分間遠心沈殿した。細胞ペレットを、３ｘ１５ｃｍプレートの８０％コンフルエントな２９３Ｔ細胞当たり２ｍＬのＨｏｍｏｇｅｎｉｚｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｍｉｘ中に再懸濁した。細胞懸濁液を氷上にて５５ストロークでダウンスホモジナイズし、全容量の細胞懸濁液が同様に処理されるまでこれを繰り返した。次いで、ホモジネートを７００ｘｇで４℃にて１０分間遠心した。このペレットは核分画であり、上清を新しいチューブに移し、１０，０００ｘｇで４℃にて３０分間再度遠心した。この遠心により生成されたペレットは粗製の膜であり、上清は可溶性の細胞質ゾルであった。保護アッセイでは、通常、各生物学的反復試験に１０ｘ１５ｃｍのプレートを使用した。粗製の膜ペレットを８００μＬのＫＰＢＳ（１３６ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ＫＯＨでｐＨ７．２５に調整した）、１２５ｍＭのスクロース、及び２ｍＭのＭｇＣｌ２中に再懸濁し、４回の反応に分け、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００または１５０ｎＭのＶＣ－Ｓｉａ（上記のように自製）と共にまたはそれなしで３７℃にて１時間インキュベートした。シアル酸レベルのＤＭＢ分析のために、上記のようにＲＮＡをＴＲＩｚｏｌで抽出し、処理した。
タンパク質親和性ツール：抗体及びレクチン
ニトロセルロース膜でのブロッティングのために、以下を示される濃度で使用した：１：１０００のＧＡＰＨＤ（Ａ３００－６４１Ａ、Ｂｅｔｈｙｌ）、１：３０００のβ－チューブリン（ａｂ１５５６８、Ａｂｃａｍ）、１：５０００のＨ３Ｋ４ｍｅ３（ａｂ８５８０、Ａｂｃａｍ）、１：１０００のＲＰＮ１（Ａ３０５－０２６Ａ、Ｂｅｔｈｙｌ）、１：１０００のＳｅｃ６３（Ａ３０５－０８４Ａ、Ｂｅｔｈｙｌ）。ＬｉＣｏｒ ＩＲ色素（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にコンジュゲートされた適切な二次抗体を０．１ｎｇ／μＬの最終濃度で使用した。以下のビオチン化レクチンは全てＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓから購入した：ビオチン－小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）、ビオチン－コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、及びビオチン－Ｍａａｃｋｉａ ＡｍｕｒｅｎｓｉｓレクチンＩＩ（ＭＡＡＩＩ）。Ｐｉｅｒｃｅ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｓｔｒｅｐ－ＨＲＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をアニリン標識化実験に使用した。
ＲＮＡのスクロース勾配分画
スクロース勾配分画のインプットとして使用されたＲＮＡは、上記のように予め抽出し、ＰＫで処理し、ＤＢＣＯ－ビオチンとクリック反応させた。ＲＮＡを、ＭｃＣｏｎｋｅｙの方法に従って１５～３０％のスクロース勾配中で沈降させた。典型的には、２５０～５００μｇの全ＲＮＡを凍結乾燥し、次いで、５０ｍＭのＮａＣｌ及び１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を含有する５００μＬの緩衝液中に溶解した。１５～３０％の直線的スクロース勾配を、ＢｉｏＣｏｍｐ １０７ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍａｓｔｅｒを使用して１×３．５インチのポリプロピレンチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ）内に調製した。溶解したＲＮＡを事前に冷却した勾配上に重層し、次いで、これをＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ７０－Ｋ ＵｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅでＳＷ３２ Ｔｉローターを使用して８０，０００ｘｇ（２５，０００ｒｐｍ）で４℃にて１８時間遠心分離した。Ｂｒａｎｄｅｌ勾配分画システムを使用して勾配を分画し、０．７５ｍＬの画分を回収した。その後、上記のようにＴＲＩｚｏｌを使用して、分画したＲＮＡをスクロース溶液から抽出し、アガロースゲル電気泳動またはディープシークエンシングにより分析した。
ＭａｎＮＡｚで標識されたＲＮＡの濃縮、ディープシークエンシング、解析
ＭａｎＮＡｚを含有するグリカンで修飾された転写物を同定するために、配列解析の前に２ラウンドの選別をＲＮＡ試料に対して実行した。ＭａｎＮＡｚで標識されたＨ９またはＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡを、上記のように抽出し、精製し、ＤＢＣＯ－ビオチンにコンジュゲートさせた。シークエンシング実験のために、細胞培養段階（異なる継代数）での生物学的二重反復を行った。最初の濃縮をスクロース勾配分画により達成し、遠心分離後、低分子ＲＮＡを含有する画分をプールし、ＴＲＩｚｏｌ抽出した。２回目の濃縮を、以前に公開されたように、以下の特定のステップを用いてストレプトアビジンビーズに対する選択的親和性により達成した。１反応当たり１０μＬのＭｙＯｎｅ Ｃ１ストレプトアビジンビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、Ｂｉｏｔｉｎ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）中５０ｎｇ／μＬのグリコーゲン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２５℃にて１時間ブロッキングした。Ｈ９及びＨｅＬａ細胞由来のビオチン化された低分子ＲＮＡを解凍し、インプットライブラリー構築用に１５０ｎｇの各々を確保した。次に、２５μｇのビオチン化された低分子ＲＮＡを、７５０μＬのＢｉｏｔｉｎ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ中に希釈（約３３ｎｇ／μＬの最終濃度）し、ブロッキングしたＭｙＯｎｅ Ｃ１ビーズと４℃で２時間混合した。ビーズを以下の通りに洗浄して、非結合ＲＮＡを除去した：１ｍＬのＣｈＩＲＰ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（２ｘＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ）で２回、１ｍＬのＢｉｏｔｉｎ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで２回、及びＮＴ２ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００５％のＮＰ－４０）で２回（全て２５℃で各３分間）。
インプット試料対ビーズで濃縮された試料について、後者がビーズ支持体にすでに結合していることを考慮して、ディープシークエンシングライブラリーを構築するために、同じ酵素を使用し、異なるステップを用いる２つのアプローチを取った。
インプットライブラリー
ＭｙＯｎｅ Ｃ１による捕捉前の単離された１５０ｎｇの低分子ＲＮＡを凍結乾燥し、次いで、Ｔ４ ＰＮＫミックス（２μＬの５ｘ緩衝液（５００ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＤＴＴ）、１μＬのＴ４ ＰＮＫ（ＮＥＢ）、１μＬのＦａｓｔＡＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．５μＬのＳＵＰＥＲａｓｅＩｎ、及び５．５μＬの水）を３７℃で４５分間添加した。次に、３’ライゲーションミックス（１μＬの３μＭ Ｌ３－Ｂｉｏ＿Ｌｉｎｋｅｒ、１μＬのＲＮＡリガーゼＩ（ＮＥＢ）、１μＬの１００ｍＭ ＤＴＴ、１μＬの１０ｘＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、及び６μＬの５０％ＰＥＧ８０００（ＮＥＢ））をＴ４ ＰＮＫ反応物に添加し、２５℃で４時間インキュベートすることにより事前にアデニル化された３’リンカーをライゲーションした。ライゲーションされていないＬ３－Ｂｉｏ＿Ｌｉｎｋｅｒは、２μＬのＲｅｃＪ（ＮＥＢ）、１．５μＬの５’デアデニレース（ＮＥＢ）、３μＬの１０ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ １（ＮＥＢ）を添加し、反応物を３７℃で６０分間インキュベートすることにより消化した。ライゲーションされたＲＮＡを上記のようにＺｙｍｏカラムで精製し、凍結乾燥した。ｃＤＮＡ合成、ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの濃縮、ｃＤＮＡ溶離 、ｃＤＮＡ環状化、ｃＤＮＡ精製、第１ステップのＰＣＲ、ＰＡＧＥ精製、及び第２ステップのＰＣＲを以前に記載されたように行った。
ビーズで濃縮されたライブラリー
ＭａｎＮＡｚで標識された低分子ＲＮＡに結合し、洗浄されたＭｙＯｎｅ Ｃ１ビーズを、以下の変更を加えて以前に記載されたように処理した。ビーズ上でのライゲーションステップについて、ビーズに捕捉された全てのＲＮＡがシークエンシングライブラリーに含まれるように、非ビオチン化３’リンカーオリゴ（Ｌ３－リンカー）を使用した。第２ステップのＰＣＲを完了した後、インプット試料及びビーズで濃縮された試料の両方について、ｄｓＤＮＡライブラリーをＨｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡバイオアナライザーチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で定量化し、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した。
データ解析
シークエンシングデータを、赤外線ＣＬＩＰデータを解析するように設計されたパイプラインを用いてほとんど以前に記載されたように処理した。この研究で使用された特定のバージョンのパイプラインは、オンラインで見つかり得る。具体的には、生リードからＰＣＲ重複を除去し、アダプター配列をトリミングした。次に、ｔＲＮＡ遺伝子座へのリードのマッピングに取り組むために、ｂｏｗｔｉｅ２を使用して最初にリードを成熟ｔＲＮＡ参照配列にマッピングした。成熟ｔＲＮＡ参照配列はＧｔＲＮＡｄｂから取得し、ＦＡＳＴＡ形式のＤＮＡ配列に変換した。同一配列を除去し、各ｔＲＮＡ配列の３’末端にＣＣＡを付加した。１ヵ所にのみマッピングされたリードを、得られたＳＡＭファイルのＮＭ及びＸＳフィールドの値を使用して抽出した（ｇｒｅｐ －Ｅ “＠｜ＮＭ：” ＊．ｓａｍ｜ｇｒｅｐ －ｖ “ＸＳ：”）。次に、リードをヒト反復ＲＮＡ（例えば、ｓｎＲＮＡ及びｒＲＮＡ）のカスタム配列索引にマッピングし、最後にヒトゲノム参照配列（ＧＣＲｈ３８）にマッピングした。２回の生物学的反復試験の各々からの各ＲＮＡ転写物（例えば、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡなど）の１ヵ所にマップされたリードの数を使用して、インプット試料と濃縮された試料（ＭａｎＮＡｚまたはＥＤＣによる捕捉法）との間の倍率変化をＤＥＳｅｑ２ツールで算出した。Ｒを使用して統計解析を実行し、ｇｇｐｌｏｔを使用してプロットを生成した。
Ｙ５のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウト及び特徴付け
ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ配列は、ＣＨＯＰＣＨＯＰオンラインウェブツールを使用して設計した。Ｙ５遺伝子座に隣接するガイドを選択した。対応するオリゴをＩＤＴから注文した。オリゴを以前に記載されたようにＧｉｂｓｏｎアセンブリ反応（ＮＥＢ）を使用して、Ｚｈａｎｇ研究室で作製された、Ｃａｓ９を発現するガイドＲＮＡプラスミドｐＸ４５８（Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローニングした。ｐＸ４５８プラスミドにコードされるヒトＹ５遺伝子座に隣接する２種のｓｇＲＮＡを、リポフェクタミン３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して６ウェルフォーマットで同時形質移入した。遺伝子導入した細胞を、ＢＤ ｉｎｆｌｕｘセルソーター（Ｓｔａｎｆｏｒｄ ＦＡＣＳ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）を使用してＧＦＰ発現に基づいて９６ウェルプレートに単一細胞ソートした。クローン細胞株を増殖させ、標的対立遺伝子の配列に基づく遺伝子型判定のためにゲノムＤＮＡを単離した。このために、ｇＲＮＡ標的部位を含む３００～５００塩基対領域を増幅し、ＰＣＲ産物をサンガーシークエンスした。大きな欠失を引き起こす編集事象を有するクローンをその後の実験に選択し、発現のＫＯ欠失をノーザンブロッティング（下記）により確認した。倍増時間を評価するために、２９３ＷＴ及びＫＯ細胞を上記のように培養し、最初に１２ウェルプレート当たり２０，０００個の細胞を三重反復で播種した。２４時間間隔で細胞をトリプシン処理し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ ＦＬ自動セルカウンター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して計数した。
低分子ＲＮＡのノーザンブロッティング
低分子ＲＮＡの検出を、従来のノーザンブロッティング及び放射標識ロックド核酸（ＬＮＡ）による検出により達成した。Ｙ５ ＲＮＡまたは５Ｓ ｒＲＮＡに相補的なＬＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を注文し、５’末端を以下のように標識した。２００ｐｍｏｌのＬＮＡを、３μＬのＴ４ ＰＮＫ（ＮＥＢ）、７μＬの１０ｘＴ４ ＰＮＫ緩衝液、及び１μＬの［γ－３２Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）（γ－ＡＴＰ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に添加して７０μＬの反応液にした。ＬＮＡを３７℃で３時間インキュベートし、その後、Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ－Ｓｐｉｎ ６カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して遊離γ－ＡＴＰを取り除いた。カラムを２５℃にし、事前に充填された緩衝液を１０００ｘｇで２分間遠心して除去した。試料を乾燥したカラムマトリックスに加え、１０００ｘｇで４分間遠心することにより精製した。１２％尿素－ＰＡＧＥゲル（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を流し、１０Ｗで１５分間プレランし、その後、様々な細胞種由来の２μｇの全ＲＮＡを、１５Ｗでゲルを泳動することにより分離した。電気泳動後、セミドライ式転写装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、０．５ｘＴｒｉｓ／ホウ酸／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）緩衝液を用いて１８Ｖの一定電圧で４℃にて９０分間、ＲＮＡをＨｙＢｏｎｄ Ｎ＋（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に転写した。次に、ＲＮＡを膜に架橋させ、２ｍＬのＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ Ｐｌｕｓ（Ｓｉｇｍａ）緩衝液中で６５℃にて６０分間プレハイブリダイズした。次いで、標識したＬＮＡプローブをＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ Ｐｌｕｓ緩衝液に添加し（通常、どの回のメンブレンハイブリダイゼーションでも２５％の標識ＬＮＡプローブを使用した）、６５℃で３～１６時間インキュベートした（より長時間またはより短時間のハイブリダイゼーションで結果の変化なし）。メンブレンを２ｘ２．５ｍＬのＬｏｗ Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｕｆｆｅｒ（０．１％のＳＤＳ、２ｘＳＳＣ（生理食塩水－クエン酸ナトリウム））で２回リンスし、次いで、２．５ｍＬのＨｉｇｈ Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｕｆｆｅｒ（０．１％のＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ）で３７℃にて５分間、２回洗浄した。洗浄した膜をストレージ蛍光スクリーンに露光し、最後にＧＥ Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０スキャナーで撮像した。
ＲＮＡ試料からのグリカン遊離
低分子ＲＮＡを上記のように単離した。ＲＮＡ試料を２種のグリコシダーゼで逐次的に消化した。実験試料について通常、Ｈ９ ＥＳ、ＨｅＬａ、または２９３ＦＴ細胞由来の２５μｇの低分子ＲＮＡを、１０μＬの１ｘＧｌｙｃｏＢｕｆｆｅｒ ２（ＮＥＢ）、７．５μＬのＰＮＧａｓｅＦ（ＮＥＢ）中に再懸濁し、水で１００μＬの最終反応容量にした。ＰＮＧａｓｅＦによる切断を３７℃で一晩行った。消化後、遊離されたグリカンをＰＧＣ ＳＰＥカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して脱塩した。ＳＰＥカラムを最初に８０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）＋０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で５回洗浄し、次いで、０．１％のＴＦＡで洗浄した。試料を水で５００μＬにし、カラムを２回通過させた。ＳＰＥを０．１％のＴＦＡで１回洗浄し、最後に０．１％ＴＦＡ中１５％のＡＣＮ、０．１％ＴＦＡ中３５％のＡＣＮ中に逐次的に溶出させた。ＡＣＮをＳｐｅｅｄＶａｃ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）で取り出し、溶出液をプールし、凍結乾燥により乾燥させた。乾燥後、ＭＳ分析のために試料を５μＬのＬＣ－ＭＳグレードの水（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁した。
ペプチド試料からのグリカン遊離
ペプチドは、Ｈ９ ＥＳ、ＨｅＬａ、または２９３ＦＴ細胞由来の全細胞可溶化物から生成させた。具体的には、１００μｇのタンパク質可溶化物を、Ｓ－Ｔｒａｐミニカラム（Ｐｒｏｔｉｆｉ）を使用してトリプシンペプチドに処理した。可溶化溶液を５％ＳＤＳ及び５ｍＭ ＤＴＴの最終濃度にし、９５℃に５分間加熱し、２５℃に５分間冷却し、次いで、２５ｍＭのヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）を添加して、暗下で２５℃にて３０分間アルキル化した。次に、リン酸（Ｓｉｇｍａ）を１．２％最終濃度まで添加し、次いで、８倍容量の結合緩衝液（９０％メタノール中１００ｍＭの炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ））を添加し、ボルテックスして、混合することにより試料を酸性化した。次に、タンパク質試料を１０部に分けて４０００ｘｇで遠心分離することによりＳ－Ｔｒａｐカラムに結合させ、全試料容量がカラムマトリックスを通過するまで遠心を繰り返した。結合緩衝液での３回の洗浄を実行して、カラムをリンスした。５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム（Ｓｉｇｍａ）中のトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）の溶液を、１μｇのトリプシン対２０μｇのタンパク質可溶化物の比率でカラムマトリックスに加えることによりペプチドを生成させた。消化を４７℃で９０分間進行させた。ペプチドを５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム中０．１％のギ酸及び５０％アセトニトリル中０．１％のギ酸を逐次的に加えることにより溶出させた。ＲＮＡについて上記したようにＮ－グリカンをペプチド試料から遊離させた。ＰＮＧａｓｅＦによる消化後、ペプチド混合物を０．２％のギ酸で５００μＬにし、１０ｍｇ Ｃ－１８ ポリマーＳＰＥ（Ｓｔｒａｔａ－Ｘ）カラムにそれらを通過させることにより脱グリコシル化ペプチドを除去した。遊離グリカンは素通り画分であり、これを保存した。ＲＮＡ試料と平行して遊離グリカンをＰＧＣ ＳＰＥを用いて脱塩し、最後に試料をＭＳ分析のために５μＬのＬＣ－ＭＳグレードの水（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁した。
クロマトグラフィー質量分析
質量分析データを以下の条件を使用して取得した。各乾燥試料を１０Ｌの５ｍＭ ギ酸アンモニウムで再構成し、３μＬの試料を、５μＬの注入ループを備えたＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ ＵＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に注入した。分離を、市販のフューズドシリカカラム（ＩｎｔｅｇｒａＦｒｉｔ、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）に５μｍの多孔性グラファイトカーボン（Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ、ＰＧＣ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を手作業で充填することにより作成され、ステンレス製エミッター（３０μＭ ＩＤ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続されたキャピラリーカラム（１００μｍ ＩＤ、長さ１８ｃｍ）を用いて実行した。使用された移動相は、５ｍＭのギ酸アンモニウム（Ａ）及び２：１のイソプロパノール：アセトニトリル（Ｂ）であった。流速は１００％Ａで１０００ｎＬ／分を５．５分間、次いで、０．５分間かけて３００ｎＬ／分に減少させ、続いて、１分間にわたる１５％／分、２５分間にわたる１．４％／分、８分間にわたる６．２５％／分の直線勾配、続いて、１００％Ｂで２分間保持し、１００％Ａで１０００ｎＬ／分にて５分間再平衡化した（その後の注入での注入時間を含む）。注入バルブを分析の５．５分時点で切り替えて、勾配の間、試料ループを流路から切り離した。
質量分析計
全ての質量分析データを、Ｌｕｍｏｓ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて取得した。ポジティブモードでのエレクトロスプレーイオン化を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎａｎｏｆｌｅｘイオン源を使用して２．２ｋＶのイオン源電圧をステンレス製エミッター（３０μＭ ＩＤ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に印加してナノスプレー条件（３００ｎＬ／分）下で実行した。キャピラリー温度は３００℃であった。Ｓ－レンズ ＲＦレベルの設定は６０％であった。
遊離グリカンの非標的型スクリーニング
データ依存的なフラグメンテーションを、Ｏｒｂｉｔｒａｐのフルスキャンモードでの検出（ｍ／ｚ ５００～２５００）により、１２０，０００の分解能設定、２５０％の正規化ＡＧＣターゲット、及び５０ミリ秒の最大イオン注入時間設定で実行した。ＭＳ２スペクトルを、ｍ／ｚ １．６の四重極選択幅、２５％のＨＣＤフラグメンテーション、１５０００の分解能設定でのＯｒｂｉｔｒａｐ検出、４００％の正規化ＡＧＣターゲット、及び２２ミリ秒の最大イオン注入時間で取得した。データ依存的パラメータは、以下の通りだった：２．５×１０４の強度閾値、３０秒以内の３回のリピートカウント、２０秒の除外時間、及び除外される同位体について±５ｐｐｍの除外質量幅。以前に公開された内在性ＲＮＡ付加物及びそれらの１３Ｃ同位体置換体からなる質量除外リストを使用した。３秒のサイクル時間を使用し、プロファイルモードでデータを収集した。
解析
グリカン遊離試料をＧｌｙｃｏＮｏｔｅにより解析した。要約すると、．ｒａｗファイルを．ｍｇｆファイルに変換し、ＧｌｙｏＮｏｔｅ ＧＵＩにロードした。パラメータを全てのグリカン遊離ファイルに使用した。ＧｌｙｃｏＮｏｔｅ出力ファイルは、手動で確認したグリカン構造及び注釈付けたスペクトルを含んでいた。
ビオチン－アニリンによるＲＮＡのレクチンに対する近接性に依存した標識化
生細胞標識化
ＨｅＬａ細胞を通常、１０ｃｍのプレートで上記のように培養した。細胞を氷冷した１ｘＰＢＳで２回リンスし、これを洗浄後に毎回廃棄し、Ｌｅｃｔｉｎ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＬＢＢ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、２．５％のＦＢＳ）で４℃にて１５分間ブロッキングした。次いで、ブロッキングバッファーを廃棄し、ＬＢＢ＋レクチン＋Ｓｔｒｅｐ－ＨＲＰと交換した。通常、４ｍＬのこれを５μｇ／ｍＬのビオチン化レクチン及び６μｇ／ｍＬのＳｔｒｅｐ－ＨＲＰの濃度で調製し、これらの成分は、ＬＢＢの添加前に最初に氷上で３０分間混合した。ＬＢＢ＋レクチン＋Ｓｔｒｅｐ－ＨＲＰによる染色を４℃で４５分間行い、その後、細胞を氷冷した１ｘＰＢＳ＋１ｍＭ ＣａＣｌ２＋１ｍＭ ＭｇＣｌ２（ＰＢＳ＋＋）で２回リンスした。この直後に、３５０μＭのビオチン－アニリン（Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧＭＢＨ）を含有する３ｍＬのＰＢＳ＋＋を各プレートに添加し、氷上で１分間インキュベートした。次いで、プレートをベンチトップに移し、Ｈ２Ｏ２を１ｍＭの最終濃度で添加した。この反応を正確に２分間発生させ、その後、プレートを氷上に戻し、ＰＢＳ＋＋／ビオチン－アニリン／Ｈ２Ｏ２を吸引し、細胞をＱｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ：ＰＢＳ＋＋中の５ｍＭのトロロックス、１０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、及び１０ｍＭのアジ化ナトリウム（Ｆａｚａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１９に記載の通り）で素早く、しかし穏やかに２回リンスした。Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを除去した後、ＴＲＩｚｏｌをプレートに直接添加し、ＲＮＡを酵素消化及びブロッティングのために上記のように抽出及び処理した。
可溶化液中での標識化
ＨｅＬａ細胞を生細胞標識化プロトコールと同様に増殖させ、洗浄した。細胞可溶化物を、１０ｃｍのプレート１つ毎に、ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する氷冷した５００μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）を添加し、細胞を擦り落とし、氷上で上下に１０回ピペッティングすることにより作成した。次いで、各１０ｃｍプレートからの可溶化物を、事前に複合体形成させた同じ比率のビオチン化レクチン及びＳｔｒｅｐ－ＨＲＰと氷上で４５分間インキュベートした。続いて、可溶化物を２５℃に２分間温め、３５０μＭのビオチン－アニリンを２５℃で１分間各チューブに添加し、次いで、１ｍＭのＨ２Ｏ２を添加して、反応を開始させた。各反応を正確に２分間進行させ、その後、５ｍＭのトロロックス、１０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、及び１０ｍＭのアジ化ナトリウムを直接添加した。ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ ＬＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、生細胞試料と平行した処理で標識された可溶化物試料から抽出した。
細胞剥離試薬の最適化
細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡでのＦＡＣＳプロトコール（下記）を確立する過程で、トリプシンを使用した標準的な細胞剥離方法が細胞ＲＮＡのほぼ完全な破壊をもたらすのが認められた。なぜこれが起きたか理解し、ＲＮＡを破壊しない方法を見つけるために、以下の品質維持実験を実行した。
第１に、組織培養に使用されたトリプシン及びＴｒｙｐＬＥ試薬の全タンパク質分析を実行した。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＴＣＣ、及びＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからトリプシン保存液の製品を購入し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離し、Ａｃｑｕａｓｔａｉｎタンパク質染色試薬（Ｂｕｌｌｄｏｇ Ｂｉｏ）で染色し、ＬｉＣｏｒでスキャンして、これらの試薬のあらゆるタンパク質成分を可視化した。全てのトリプシン製品が約２５ｋＤａの全長トリプシンタンパク質に対応するバンドを含んでいたが、全ての保存液が一連の正体不明のより低分子量のバンドも含んでいた。
第２に、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのウェブサイトのＴｒｙｐＬＥは、その「優れた純度が特異性を増強し、一部のトリプシン抽出物に存在する他の酵素により引き起こされ得る細胞への傷害を低減する」ため、「動物由来成分を含まない組換え酵素」である。ＴｒｙｐＬＥは、トリプシンとほぼ同程度の分子量で泳動されるが、これらの低分子量バンドのいずれも含まないことが発見された。
第３に、これらの試薬が細胞ＲＮＡに引き起こす相対的な損傷を評価した。ＨｅＬａ細胞を上記のように６ウェルプレートで増殖させ、１ｘＰＢＳでリンスし、次いで、２５０μＬの１ｘＰＢＳ、トリプシン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＴｒｙｐＬＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で３７℃にて５分間インキュベートした。このインキュベーション後、試料を７５０μＬのＴＲＩｚｏｌ ＬＳで直接溶解させるか、または７５０μＬの１ｘＰＢＳ中に再懸濁し、３００ｘｇで５分間遠心する、上清を廃棄し、次いで、細胞ペレットをＴＲＩｚｏｌ ＬＳ中で溶解させた。この実験の結果は、ＰＢＳ及びＴｒｙｐＬＥがＲＮＡ分解を引き起こさないが、トリプシン溶液は、細胞がＰＢＳで事前に洗浄されない場合、ＲＮＡを完全に破壊すること、及びトリプシンが存在する場合、ＴＲＩｚｏｌで抽出された場合であっても、細胞ＲＮＡが依然として大量に分解されることを示す。
従って、細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを分析するための実験を実行する場合は、ＲＮアーゼ混入について慎重に試験されたＴｒｙｐＬＥまたは他の試薬を使用されなければならない。
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析
細胞を上記のように増殖させ、接着性である場合、ＴｒｙｐＬＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて３７℃で４分間剥離した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（１ｘＰＢＳ中０．５％のウシ血清アルブミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））中に再懸濁し、計数し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液当たり２００，０００個の細胞に等分し、氷上で３０分間インキュベートしてブロッキングした。ＲＮアーゼで消化する場合、ＲＮアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ）を示される濃度（通常２μＭ）でブロッキングバッファーに添加した。ブロッキング後、細胞を５分間２５℃にし、次いで、４℃かつ３５０ｘｇで５分間遠心した。細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、上記のように遠心した。（１）細胞表面ＲＮＡまたは（２）細胞表面シアル酸を染色するために、２つの同様のアプローチを取った。（１）のアッセイでは、細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中１０μｇ／ｍＬの抗Ｊ２抗体（Ｓｃｉｃｏｎｓ）中に氷上で３０分間再懸濁し、上記のように遠心し、上記のように１回洗浄した。次いで、細胞を、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中８μｇ／ｍＬのヤギ抗マウス－ＩＲ６８０抗体（ＬｉＣｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて氷上かつ暗下にて３０分間染色し、上記のように遠心し、上記のように１回洗浄した。最後に、細胞を１００μＬのＦｌｕｏｒｏＦｉｘ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）中で２５℃にて暗下で３０分間固定した。細胞を最後に上記のように１回洗浄し、分析のためにＦＡＣＳ緩衝液中で４℃にて保存した。（２）のアッセイでは、組換えヒトＳｉｇｌｅｃ－Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ断片特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と氷上１時間、事前に複合体形成させた（両方ともＦＡＣＳ緩衝液中１．５μｇ／ｍＬ）。細胞を１００μＬの事前に複合体形成させたＳｉｇｌｅｃ－Ｆｃ－二次抗体の溶液中に再懸濁させ、暗下で氷上にて３０分間インキュベートし、１回洗浄し、上記のように固定まで直接処理した。ＦＡＣＳデータをＦｌｏＪｏソフトウェアで解析及び可視化した。
定量化及び統計解析
ＲＮＡ－ｓｅｑ統計値をＲパッケージ「ＤＥＳｅｑ２」により決定した。
実施例１０．グリコ核酸合成の一般的手順
共有結合でコンジュゲートされた天然グリカンを有する核酸を、銅触媒を用いたアジド－グリカンとアルキン－核酸との間の典型的な銅触媒クリック反応（ＣｕＡＡＣ）を使用することにより作製した。ＲＮＡ及びＤＮＡ反応物を、単一内部修飾された３’ ５－オクタジニルｄＵ（ＩＤＴ）を使用して合成した。アルキンを含有する修飾核酸を水中に１００μＭの最終濃度まで希釈し、９５℃で２分間変性させ、氷上で配置し、２００μＭのＭｇＣｌ及びＰＢＳ（ｐＨ７．０）中で３７℃にて５分間折り畳ませた。ＣｕＳＯ４を水で構成し、リガンドの２－（４－（（ビス（（１－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）アミノ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）酢酸（ＢＴＴＡＡ）に添加し、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＣｕＡＡＣ反応を、アルキン－核酸（１０μＭ）、アジド－グリカン（２０μＭ）をＣｕ・ＢＴＴＡＡ（それぞれ１００ｕＭの最終濃度）と共に、及びアスコルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）を１ｘＰＢＳと共に逐次的に添加することにより組み立てた。クリック反応を３５℃で１時間インキュベートした。クリック反応を２０ｍＭのＥＤＴＡで停止させた。次いで、反応物をＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ（登録商標） ＲＮＡ精製・濃縮キットを使用して精製し、１０μｌで溶出させた。この溶出液を、９５％のホルムアミド、１８ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０２５％のＳＤＳローディング色素を１ｘＳＹＢＲ Ｇｏｌｄと共に使用して５５℃で１０分間変性させた。１％のアガロース及び１．１％のホルムアルデヒドゲルを使用して、コンジュゲートされたグリカン－核酸とコンジュゲートされていないグリカン－核酸との間の強度及び移動の差を可視化した。アジド－グリカン（ａｚｉｄｏ－ｇｌｙｃａｎ）（アジド－グリカン（ａｚｉｄｅ－ｇｌｙｃａｎ））は、実施例１１で後述するように調製される。
アジド－グリカンの特徴付けは、ＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＭＳにより達成した。アルキン－ＤＮＡ及びアルキン－ＲＮＡの特徴付けは、ＵＶ－Ｖｉｓ及びゲル電気泳動により達成した。合成Ｎ－グリカン－ＲＮＡ及び合成Ｎ－グリカン－ＤＮＡの特徴付けは、シアル酸糖の化学的標識化、ゲル電気泳動、ＲＮＡ／ＤＮＡ転写、及びメンブレンに転写されたＲＮＡ／ＤＮＡ上のシアル酸糖のイメージングにより達成した。実施例１０では、合成Ｎ－グリカン－ＲＮＡ及び合成Ｎ－グリカン－ＤＮＡは、シリカベースの標準的なＲＮＡ／ＤＮＡ脱塩カラムを使用して過剰な試薬から精製される。
ある特定の実施形態では、歪みアルキン修飾核酸は、５’末端が内部アミノ修飾体（／ｉＵｎｉＡｍＭ／）（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで利用可能な核酸の内部アミノ修飾体）で修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば、配列番号１または２のＲＮＡまたはＤＮＡ）を、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）反応の条件を使用して、ＤＩＢＡＣ（ジベンゾアザシクロオクチンまたは「ＤＢＣＯ」（ジベンゾシクロオクチン））にカップリングすることにより調製される。その後に、歪みアルキン（ＤＩＢＡＣ／ＤＢＣＯ）修飾ＲＮＡまたは歪みアルキン（ＤＩＢＡＣ／ＤＢＣＯ）修飾ＤＮＡは、アジド－Ｎ－グリカンに結合される。アジド－グリカン（ａｚｉｄｏ－ｇｌｙｃａｎ）（アジド－グリカン（ａｚｉｄｅ－ｇｌｙｃａｎ））は、実施例１１で後述するように調製される。
実施例１１．対応する例示的なアミノ－Ｎ－グリカンからの例示的なアジド－Ｎ－グリカンの調製
以下の表５に示すフルオロスルフリルアジドにより媒介されるジアゾ転位により、アミノ－Ｎ－グリカンをアジド－Ｎ－グリカンに変換する容易かつ効率的な方法が提供される。この方法は、単純な単糖からオリゴ糖、Ｎ－グリカン、及び複雑な糖ペプチドに及ぶ基質範囲を示し、ほぼ定量的収率で対応するアジド－Ｎ－グリカンをもたらす。
実施例１２．アジドグリカンの合成の一般的手順
材料及び方法
遊離還元末端グリカンは、Ｇｌｙｃｏｂｉａ，Ｉｎｃ．、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹから入手し、当該技術分野において公知の文献の手順に従って作製された。
アミノオキシ－ＰＥＧ３－アジド付加
遊離還元末端を有するグリカンを、１０倍モル過剰のアミノオキシ－ＰＥＧ３－アジドリンカーとインキュベートした。反応を１ｘＰＢＳ（ｐＨ４．０）中で６５℃にて３０時間実行した。反応物をＰＧＣ ＳＰＥカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））を使用して脱塩した。カラムを１ｍＬのアセトニトリル、続いて、１ｍＬのＨ２Ｏでプレコンディショニングした。反応混合物を水で５００μＬまで希釈し、カラムに通した。反応混合物をロードした後、カラムを８００μＬの５０／５０のアセトニトリル及びＨ２Ｏ中１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３で溶出した。アセトニトリルを減圧下で除去し、凍結乾燥により乾燥させた。
Figure 2024514954000077
アスパラギンのアジド官能化
蒸留水中のアスパラギン結合型Ｎ－グリカンの溶液に、Ｎａ２ＣＯ３（２０当量）及びＦＳＯ２Ｎ３（４０当量）を添加した。混合物を室温で１時間回転させた。ＭＡＬＤＩ質量分析は完全な変換を示した。反応混合物を３０分間減圧下に置き、次いで、凍結乾燥した。残留物（白色粉末）をミニＱ水で再構成し、次いで、プレコンディショニングしたＣａｒｂ ＳＰＥチューブにロードした。チューブを蒸留水（１０×１．２ｍＬ）で洗浄し、次いで、１００ｍＭの（ＮＨ４）２ＣＯ３を含有する５０％アセトニトリル（４×１．２ｍＬ）で溶出した。溶出液を合わせ、凍結乾燥して、目的のアジドグリカンを得た。
Figure 2024514954000078
実施例１３．アジドグリカン及び修飾ｓｉＲＮＡのクリックケミストリーカップリングの一般的手順
グリカン－ｓｉＲＮＡ
３’末端がＤＢＣＯで官能化されたｓｉＲＮＡは、ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（登録商標）またはＡｘｏｌａｂｓ（登録商標）から購入し、当該技術分野における十分に確立された方法により作製された。３’末端にＤＢＣＯがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡを、１０倍過剰のアジド官能化グリカンとインキュベートした。コンジュゲーション反応を３７℃で一晩実行した。コンジュゲートされたｇｌｙｃｏＲＮＡをＨＰＬＣにより精製した。ｇｌｙｃｏＲＮＡコンジュゲートのＨＰＬＣ精製を、メタノール中の２００ｍＭ ＨＦＩＰ＋１６ｍＭ ＴＥＡを使用して実行した。機器モデル：Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣ；カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、２．１×１００ｍｍ、２．７μｍ。コンジュゲートされたｇｌｙｃｏＲＮＡを凍結乾燥により乾燥した。次いで、ｇｌｙｃｏＲＮＡを水で１００μＭの濃度に再懸濁した。次いで、ｇｌｙｃｏＲＮＡを、Ａｎｎｅａｌｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）中で相補的なセンス鎖にアニールした。アニーリング反応のために、試料を９５℃に加熱し、約６時間かけて室温にゆっくり冷却した。アニールした二重鎖を、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））を使用して１５００ｇで２分間の遠心分離により脱塩した。
表６Ｃに記載されるｇｌｙｃｏＲＮＡを、上記の一般的手順を使用して作製した。
Figure 2024514954000079
次いで、ｇｌｙｃｏＲＮＡを上記の一般的手順を使用してＩ－１にアニールした。図１２は、ｇｌｙｃｏＲＮＡ Ｒ－１～Ｒ－６及びコンジュゲートされていないｓｉＲＮＡ Ｉ－２と、ｓｉＲＮＡ Ｉ－１との二重鎖の形成を示すブロットである。
同様に、アジド官能化グリカンの代わりに単糖が使用された比較化合物Ｘ－１及びＸ－２を、上記の一般的手順を使用して合成した。次いで、コンジュゲートされた単糖を上記の一般的手順を使用してＩ－１にアニールした。
Figure 2024514954000080
更に、比較化合物Ｘ－３を、固相合成法を使用して合成した。次いで、コンジュゲートした化合物を、上記の一般的手順を使用してＩ－４にアニールした。
Figure 2024514954000081
実施例１４．ｇｌｙｃｏＲＮＡを使用した細胞シグナル伝達ノックダウン
実験前に２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレート内の１ｍＬの増殖培地中で１００，０００個細胞で２４時間培養した。２μｌのリポフェクタミンを１００μｌの無血清培地に添加し、それとは別にｇｌｙｃｏ－ｓｉＲＮＡ二重鎖を無血清培地に５０ｎＭ最終濃度で添加した。これらの２つの混合物（リポフェクタミン及び希釈した二重鎖）を室温で一緒に添加し、２０分間インキュベートした。培地を培養した２９３Ｔ細胞から吸引し、１００μｌの新鮮な培地と交換した。２０μｌのリポフェクタミン－ｇｌｙｃｏ－ｓｉＲＮＡ混合物を各ウェルに添加し、一晩インキュベートした。ＲＮＡを、ＲＮＡ溶解緩衝液（Ｚｙｍｏ）、続いて、ＲＮＡ分取、洗浄、及び溶出緩衝液を使用して細胞から精製し、それぞれ１０，０００ｇで２分間遠心した（Ｚｙｍｏ）。ＲＮＡを定量化した後、１回のｑＰＣＲ反応当たり５０ｎｇを含むようにこれを１０ｎｇ／μＬに希釈した。試料を二重反復で分析し、各試料は生物学的反復を含んだ。ｑＰＣＲプライマーは、βカテニン遺伝子及びＰＰＩＢに対するものであり、１２５ｎＭのプライマー、１ｘＴａｑポリメラーゼマスターミックス、ＭＭＬＶ ＲＴ酵素（１反応当たり０．５単位）、及び１ｘＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを使用して増幅した。試料を最初に５０℃で３０分間インキュベートし、次いで、９５℃で１０分間、続いて、９５℃で３０秒間を４０サイクル、６０℃で１分間インキュベートした。βカテニンのＣｔ値をＰＰＩＢのＣｔ値のそれで正規化して、相対存在量（％βカテニンｍＲＮＡ）を記録した（図１４）。
実施例１５．ｇｌｙｃｏＲＮＡフローアッセイ（ＨｅｐＧ２細胞）
ＨｅｐＧ２細胞を培養培地で維持した（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ、全ての試薬がＧｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから供給された）。細胞数及び生存率を、トリパンブルー色素排除法を使用してＶｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲセルカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ）で評価した。９６ウェルＶ底プレートのウェル１つ当たり２ｘ１０５個の生細胞を１００μＬの総容量のアッセイ緩衝液（追加の血清またはタンパク質を含有しない細胞培養培地、Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に蒔いた。細胞を１ｘＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で遠心分離により洗浄し、追加のＰＢＳ中に再懸濁した。１００μＬのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｙｅｌｌｏｗ細胞染色剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の使用説明書に従って添加し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、試料をＰＢＳで上記のように遠心分離により洗浄した。細胞をブロッキング緩衝液（１ｘＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ中１０％のＨｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）中に再懸濁し、（Ｃｙ５シグナルの喪失を最小限にするために）暗下で室温にて５分間インキュベートした。Ｃｙ５標識二重鎖ｇｌｙｃｏＲＮＡを１０μＭの保存液から追加のアッセイ緩衝液で希釈し、０．１、１、１０、及び１００ｎＭの濃度でプレートに加えた（生物学的反復を含む）。次いで、細胞を標準的な細胞培養インキュベーター内で暗下にて３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。次いで、試料をアッセイ緩衝液で遠心分離により１回洗浄した。次いで、９６ウェルハイスループットモードのＣＹＴＫＩＣＫ付属装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＡＴＴＵＮＥ ＮｘＴフローサイトメーターで固定されてない細胞を直ちに捕捉した。ＦＣＳファイルは、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウエア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して解析した。関心対象の細胞集団を前方散乱及び側方散乱特性の両方を使用して同定し、前方散乱の領域に対する高さを比較することによりダブレットを除外した。生細胞を生／死細胞染色による除外に基づいて同定した。関心対象の全ての陽性細胞集団のＣｙ５発現について、ヒストグラムオーバーレイ及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、Ｘ－３／Ｉ－４二重鎖ｇｌｙｃｏＲＮＡで処理された細胞に対して比較した。Ｘ－３／Ｉ－４二重鎖と比較し、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）でグラフ化した、試験されたｇｌｙｃｏＲＮＡの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を図１５Ａ及び１５Ｂに示す。
実施例１６．ＨｅｐＧ２細胞におけるｓｉＲＮＡにより媒介されるノックダウン
ウェル１つ当たり１ｘ１０５個のＨｅｐＧ２細胞を９６ウェル平底プレートに蒔き、Ｃｙ５標識二重鎖ｇｌｙｃｏＲＮＡ（Ｒ－１～Ｒ－６）の希釈物と無血清ＤＭＥＭ培地中で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を吸引により除去し、ＰＢＳで１回洗浄した。乾燥ペレットをＲＮＡ抽出まで－８０℃で凍結させた。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を製造者の使用説明書に従って使用して細胞から単離した。全ＲＮＡを水（１４μＬの総容量）中に溶出させ、アリコートをＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量化した。１試料当たり１００ｎｇのＲＮＡを使用し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標） ＩＶ ｃＤＮＡ合成システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をオリゴ（ｄＴ）プライマーと共に製造者の使用説明書に従って使用して、ＢｉｏＲａｄサーモサイクラーを使用してｃＤＮＡを合成した。遺伝子発現は、β－カテニン及びＧＡＰＤＨに対するＴａｑＭａｎマルチプレックスプローブを使用して評価した（β－カテニンプローブセットのアッセイＩＤ：Ｈｓ００３５５０４５＿ｍ１、内在性ヒトＧＡＰＤＨ対照：４３２６３１７、両方ともＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した）。ウェル１つ当たり１０ｎｇのｃＤＮＡ試料を光学的に透明な９６ウェルＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に生物学的反復及び技術的反復で加え、２０ｘＴａｑＭａｎプローブ及び２ｘＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の使用説明書に従って、ウェル１つ当たり２０μＬの総反応容量となるように添加した。試料をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ ＰｒｏリアルタイムＰＣＲシステムで以下の増幅パラメータを使用して増幅した：ステージ１：５０℃で２分間；ステージ２：９５℃で１０分間；ステージ３：９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０回繰り返す。β－カテニンの遺伝子発現は、ΔΔＣＴ法を使用してＧＡＰＤＨ発現及び未処理の対照細胞と比較して算出した。ここで、１未満の値は、β－カテニンのｓｉＲＮＡにより媒介されるノックダウンを示す。
実施例１７．ｇｌｙｃｏＲＮＡフローアッセイ（ＰＢＭＣ）
健常なヒトドナー由来の凍結末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。これらの細胞を液体窒素超低温フリーザーの気相で使用するまで保存した。バイアルを３７℃のウオーターバスで素早く解凍し、ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１回洗浄し、続いて、遠心分離（５００ｘｇ、５分）によりＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で更に２回洗浄した。細胞数及び生存率を、トリパンブルー色素排除法を使用してＶｉ－Ｃｅｌｌ（商標） ＸＲセルカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ）で評価した。９６ウェル丸底プレートのウェル１つ当たり４×１０５個の生細胞を１００μＬの総容量のアッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ、Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に蒔いた。Ｃｙ５標識二重鎖ｇｌｙｃｏＲＮＡを１０μＭの保存液から追加のアッセイ緩衝液で希釈し、０．１、１、１０、及び１００ｎＭの濃度でプレートに加えた（生物学的反復を含む）。次いで、細胞を標準的な細胞培養インキュベーター内で暗下にて３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離により（上記のように）１回洗浄し、１０％Ｆｃブロック（ヒトＦｃブロック、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加したアッセイ緩衝液中に、ウェル１つ当たり１００μＬの総容量で再懸濁した。プレートを（Ｃｙ５シグナルの喪失を最小限にするために）暗下で室温にて３０分間インキュベートした。選択した免疫細胞マーカーに対する抗体（抗ＣＤ３ クローンＯＫ３ ＡＦ４８８、抗ＣＤ４ クローンＯＫＴ４ Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔ ６００、抗ＣＤ８ クローンＯＫＴ８ Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔ ７０２、抗ＣＤ１４ クローンＭＥＭ－１５ ＮｏｖａＦｌｕｏｒ Ｙｅｌｌｏｗ ７００、及び抗ＣＤ１９ クローンＨＩＢ１９ ＰＥ－ｅＦｌｕｏｒ ６１０、全てＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した）を製造者の推奨量に従って、Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔ染色緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して添加した。細胞を暗下で室温にて１時間インキュベートし、その後、（上記のように）アッセイ緩衝液で１回洗浄した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ細胞染色剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の使用説明書に従って添加し、室温で２分間インキュベートした。次いで、ＡＴＴＵＮＥ ＮｘＴフローサイトメーター及び９６ウェルハイスループットモードのＣＹＴＫＩＣＫ付属装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で固定されてない細胞を直ちに捕捉した。ＦＣＳファイルは、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して解析した。リンパ球を前方散乱及び側方散乱特性の両方を使用して同定し、前方散乱の領域に対する高さを比較することによりダブレットを除外した。生細胞を生／死細胞染色による除外に基づいて同定した。単球をＣＤ１４陽性染色法により同定し、Ｂ細胞をＣＤ１９陽性染色法に基づいて同定した。Ｔ細胞を、最初にＣＤ３陽性染色、次いで、ＣＤ４対ＣＤ８染色により同定した。関心対象の全ての陽性細胞集団のＣｙ５発現について、ヒストグラムオーバーレイ及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、Ｉ－４／Ｘ－３二重鎖で処理された細胞に対して比較した。Ｘ－３／Ｉ－４二重鎖と比較し、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）でグラフ化した発現データを記録した。図１３Ａ～１３Ｃを参照のこと。
実施例１８．ＨｅｐＧ２イメージングアッセイ
１日目に、ＨｅｐＧ２細胞をＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）を使用して分離し、計数した。２０００個の生細胞／５０μＬの完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ＰＥＮ／ＳＴＲＥＰ、Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を３８４ウェルガラス底イメージングプレート（ＣＯＲＮＩＮＧＲ（登録商標））に蒔いた。細胞を標準的な組織培養インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２にて一晩インキュベートした。２日目に、培養培地を各ウェルから除去し、ＯｐｔｉＭＥＭで希釈した５０μＬの１：１０００のＣｅｌｌＭａｓｋ Ｇｒｅｅｎ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及び１：２０，０００のＨｏｅｃｈｓｔを各ウェルに添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で５分間インキュベートし、次いで、５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭで穏やかに３回洗浄した。ＯｐｔｉＭＥＭを除去し、５０μＬの１００ｎＭ Ｃｙ５標識二重鎖ｇｌｙｃｏＲＮＡを細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１６時間インキュベートした。プレートを、４０Ｘ水対物レンズを備えたＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ＳｙｓｔｅｍでＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、及びＣｙ５チャンネルでイメージングした。図１６Ａ～１６Ｆは、上記のように取得されたＣｙ５蛍光画像であり、ｇｌｙｃｏｌＲＮＡ二重鎖の内部移行及び／またはＨｅｐＧ２細胞内及び細胞上への局在化を示す。Ｒ－１／Ｉ－１（図１６Ａ）；Ｒ－２／Ｉ－１（図１６Ｂ）；Ｒ－３／Ｉ－１（図１６Ｃ）；Ｒ－４／Ｉ－１（図１６Ｄ）；Ｒ－５／Ｉ－１（図１６Ｅ）；及びＲ－６／Ｉ－１（図１６Ｆ）。
上記の実施例は本開示の原理を示す。当業者は、本明細書において明示的に説明または示されていなくても、本発明の原理を具現化し、本発明の趣旨及び範囲内に含まれる、様々な構成を考案することができることが理解されよう。更に、本明細書に記載された全ての例及び条件付きの文言は、主に、本発明の原理及び当該技術分野の発展に対して本発明者が貢献する概念を読者が理解するのを助けるためのものであることが意図され、かかる具体的に記載された例及び条件に限定されることなく解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、及び実施形態、ならびに本発明の具体例に関して述べている本明細書の全ての記載は、本発明の構造的等価物及び機能的等価物の両方を包含することが意図される。加えて、かかる等価物は、現在知られている等価物、及び将来開発される等価物、すなわち、構造に関係なく同じ機能を実行する開発される任意の要素の両方を包含ことが意図される。従って、本発明の範囲は、本明細書に示され、記載された例示的な実施形態に限定されることを意図しない。

Claims (71)

  1. ａ）
    ｉ）核酸と、
    ｉｉ）前記核酸にコンジュゲートされた、少なくとも６個の単糖を含む少なくとも１個のグリカン部分と、
    を含むグリコ核酸と、
    ｂ）薬学的に許容される担体と、
    を含む医薬組成物。
  2. 前記少なくとも１個のグリカン部分が、少なくとも８個の単糖を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記少なくとも１個のグリカン部分が、少なくとも１０個の単糖を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 前記少なくとも１個のグリカン部分が、Ｎ結合型グリカンを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  5. 前記少なくとも１個のグリカン部分が、Ｏ結合型グリカンを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  6. 前記少なくとも１個のグリカン部分が二分岐グリカンを含み、前記二分岐グリカンが第１の末端残基及び第２の末端残基を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  7. 前記少なくとも１個のグリカン部分が三分岐グリカンを含み、前記三分岐グリカンが、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  8. 前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがシアル酸を含む、請求項６または７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. 前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがフコースを含む、請求項６または７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  10. 前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがＧｌｃＮＡｃを含む、請求項６または７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  11. 前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがマンノースを含む、請求項６または７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  12. 前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがＮｅｕＮＡｃを含む、請求項６または７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  13. 前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがガラクトースを含む、請求項６または７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  14. 前記核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の医薬組成物。
  15. 前記核酸がｓｉＲＮＡである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  17. 前記核酸が環状ＲＮＡである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  18. 前記核酸がガイドＲＮＡである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  19. 前記核酸がアプタマーＲＮＡである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  20. 前記核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の医薬組成物。
  21. 前記少なくとも１個のグリカン部分が、表２Ａまたは２Ｂの化合物を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  22. 前記修飾核酸が表１の核酸を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  23. 前記少なくとも１個のグリカン部分が、クリックケミストリー反応により前記修飾核酸にコンジュゲートされている、請求項１に記載の医薬組成物。
  24. 前記核酸が、前記核酸の末端に共有結合したリンカー基を介して前記グリカンにコンジュゲートされている、請求項１に記載の医薬組成物。
  25. 前記核酸が、前記核酸の中央の化学修飾ヌクレオチドに共有結合したリンカーを介して前記グリカンにコンジュゲートされている、請求項１に記載の医薬組成物。
  26. 前記核酸が、前記核酸の３’末端または５’末端に位置しない化学修飾ヌクレオチドに共有結合したリンカーを介して前記グリカンにコンジュゲートされている、請求項１に記載の医薬組成物。
  27. 前記核酸が、前記核酸の２個のヌクレオチド間に挿入された化学的ハンドルを介してグリカンにコンジュゲートされている、請求項１に記載の医薬組成物。
  28. 前記２個のヌクレオチドに、前記核酸の３’末端または５’末端のヌクレオチドは含まれない、請求項２７に記載の医薬組成物。
  29. 前記グリコ核酸が、式（Ｉ）：
    Ａ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
    の化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体であって、式中、
    Ａが、第１のクリックケミストリーハンドルを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の核酸であり、
    Ｂが、第２のクリックケミストリーハンドルを含むアスパラギン結合型グリカン（Ｎ－グリカン）であり、
    Ｌが、前記第１のクリックケミストリーハンドルと前記第２のクリックケミストリーハンドルとの間の生体直交型クリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む、前記化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  30. 式（Ｉ）：
    Ａ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
    のグリコ核酸化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体であって、式中、
    Ａは、第１のクリックケミストリーハンドルを含む核酸であり、
    Ｂは、第２のクリックケミストリーハンドルを含むアスパラギン結合型グリカン（Ｎ－グリカン）であり、
    Ｌは、前記第１のクリックケミストリーハンドルと前記第２のクリックケミストリーハンドルとの間の生体直交型クリックケミストリー反応により形成されたリンカーを含む、前記グリコ核酸化合物、またはその塩、共結晶、互変異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、多形体、もしくは同位体濃縮誘導体。
  31. Ａが第１のクリックケミストリーハンドルを含むＲＮＡである、請求項３０に記載のグリコ核酸。
  32. Ａが第１のクリックケミストリーハンドルを含むｓｉＲＮＡである、請求項３０に記載のグリコ核酸。
  33. Ａが第１のクリックケミストリーハンドルを含むｍＲＮＡである、請求項３０に記載のグリコ核酸。
  34. Ａが第１のクリックケミストリーハンドルを含む環状ＲＮＡである、請求項３０に記載のグリコ核酸。
  35. Ａが第１のクリックケミストリーハンドルを含むＤＮＡである、請求項３０に記載のグリコ核酸。
  36. Ａが、表４の「試薬Ａ」下に列挙されるものから選択される第１のクリックケミストリーハンドルを含み、Ｂが、表４の「試薬Ｂ」下に列挙されるものから選択される第２のクリックケミストリーハンドルを含む、請求項３０に記載のグリコ核酸。
  37. Ａが、表４の「試薬Ｂ」下に列挙されるものから選択される第１のクリックケミストリーハンドルを含み、Ｂが、表４の「試薬Ａ」下に列挙されるものから選択される第２のクリックケミストリーハンドルを含む、請求項３０に記載のグリコ核酸。
  38. Ｂが、二分岐グリカンを含むアスパラギン結合型グリカンであり、前記二分岐グリカンが、第１の末端残基及び第２の末端残基を含む、請求項３０～３７のいずれか１項に記載のグリコ核酸。
  39. Ｂが、三分岐グリカンを含むアスパラギン結合型グリカンであり、前記三分岐グリカンが、第１の末端残基、第２の末端残基、及び第３の末端残基を含む、請求項３０～３７のいずれか１項に記載のグリコ核酸。
  40. 前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがシアル酸を含む、請求項３８または３９に記載のグリコ核酸。
  41. 前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがフコースを含む、請求項３８または３９に記載のグリコ核酸。
  42. 前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがＧｌｃＮＡｃを含む、請求項３８または３９に記載のグリコ核酸。
  43. 前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがマンノースを含む、請求項３８または３９に記載のグリコ核酸。
  44. 前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがＮｅｕＮＡｃを含む、請求項３８または３９に記載のグリコ核酸。
  45. 前記第１の末端残基、前記第２の末端残基、及び前記第３の末端残基が存在する場合、そのうちの少なくとも１つがガラクトースを含む、請求項３８または３９に記載のグリコ核酸。
  46. 疾患または状態を処置する方法であって、処置する必要がある対象に、治療上有効量の請求項１～２９のいずれか１項に記載の医薬組成物または請求項３０～４５のいずれか１項に記載のグリコ核酸を投与することを含み、前記疾患または状態が、炎症障害、自己免疫疾患、がん、代謝疾患、凝固疾患（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、抗凝固疾患（ａｎｔｉーｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、アレルギー、ウイルス疾患、及び微生物感染症から選択される、前記方法。
  47. 前記疾患または状態が、炎症である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記疾患または状態が、がんである、請求項４６に記載の方法。
  49. 前記疾患または状態が、自己免疫疾患である、請求項４６に記載の方法。
  50. 前記アレルギーがＩｇＥ依存性アレルギーである、請求項４６に記載の方法。
  51. 前記自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項４６に記載の方法。
  52. 前記疾患または状態が、微生物感染である、請求項４６に記載の方法。
  53. 前記疾患または状態が、ウイルス感染症である、請求項４６に記載の方法。
  54. 前記疾患または状態が、代謝疾患である、請求項４６に記載の方法。
  55. 疾患または状態を処置するための薬剤を製造するための、請求項１～２９のいずれか１項に記載の医薬組成物または請求項３０～４５のいずれか１項に記載のグリコ核酸の使用であって、前記疾患または状態が、炎症障害、自己免疫疾患、がん、代謝疾患、凝固疾患（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、抗凝固疾患（ａｎｔｉーｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、アレルギー、ウイルス疾患、及び微生物感染症から選択される、前記使用。
  56. 疾患または状態を処置する必要がある対象における疾患または状態を処置するための、請求項１～２９のいずれか１項に記載の医薬組成物または請求項３０～４５のいずれか１項に記載のグリコ核酸の使用であって、前記疾患または状態が、炎症障害、自己免疫疾患、がん、代謝疾患、凝固疾患（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、抗凝固疾患（ａｎｔｉーｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、アレルギー、ウイルス疾患、及び微生物感染症から選択される、前記使用。
  57. グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）を発現する細胞と細胞表面グリコシル化リボ核酸（ｇｌｙｃｏＲＮＡ）を提示する細胞との間の相互作用を低減するための方法であって、
    前記ＧＢＰを発現する細胞を、前記ＧＢＰを発現する細胞の表面に発現されたＧＢＰに結合する可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡと、前記ＧＢＰを発現する細胞と前記細胞表面ｇｌｙｃｏＲＮＡを提示する細胞との間の相互作用を低減するのに有効な量で接触させることを含む、前記方法。
  58. 前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが、Ｙ ＲＮＡファミリーのＲＮＡを含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡがＹ５ ＲＮＡを含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが、ｓｎｏＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５７～５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが、可溶性シアル化ＲＮＡを含む、請求項５７～５９のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記可溶性シアル化ＲＮＡが、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記可溶性ｇｌｙｃｏＲＮＡが、１種以上の薬剤にコンジュゲートされている、請求項５７～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記１種以上の薬剤が治療薬を含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記１種以上の薬剤が検出可能な標識を含む、請求項６３または６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記ＧＢＰが、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）を含む、請求項５７～６５のいずれか１項に記載の方法。
  67. 前記ＳｉｇｌｅｃがＳｉｇｌｅｃ－１１を含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記ＳｉｇｌｅｃがＳｉｇｌｅｃ－１４を含む、請求項６６に記載の方法。
  69. 前記ＧＢＰがＣ型レクチンを含む、請求項５７～６５のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記ＧＢＰがガレクチンを含む、請求項５７～６５のいずれか１項に記載の方法。
  71. 前記ＧＢＰがセレクチンを含む、請求項５７～６５のいずれか１項に記載の方法。
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