CN103388004A - OsGRF6蛋白在调控植物株高中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种OsGRF6蛋白在调控植物株高中的应用。本发明提供OsGRF6蛋白或其编码基因在调控植物株高中的应用，所述OsGRF6蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述应用中，所述OsGRF6蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。本发明的实验证明，本发明在粳稻中花十号中克隆到了一个GRF家族成员的基因OsGRF6，利用农杆菌介导法转化水稻ZH10号愈伤组织，获得了阳性转基因水稻株系，分析转基因株系和其对应的野生型表型，发现转基因水稻表现出明显的矮化特性。

Description

OsGRF6蛋白在调控植物株高中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种OsGRF6蛋白在调控植物株高中的应用。

背景技术

水稻是我国的主要粮食作物，近十来年，随着经济的发展，耕地面积减少，稳定和提高水稻总产量唯有依靠单产的提高。而水稻株型改良对提高单产具有重要的作用。水稻株高是控制水稻产量的重要农艺性状，主要由水稻节间的伸长调节。水稻最上节间的伸长可以促进幼穗的抽出，进而开花、授粉和灌浆。植株过高容易引起倒伏而减产。矮化育种是水稻育种上的一个重大突破，黄耀祥院士于50年代总结提出作物生态育种决策，开创水稻矮化育种，促进我国籼稻矮秆化，被誉为“中国矮秆水稻之父”。70年代发现和利用新的具有sd-g的矮性基因源，开创丛生快长高光效、高产株型育种，达到穗数和穗重在较高水平上的结合，使稻谷产量大大提高。因此，发掘和鉴定控制水稻株高的基因，开展株高基因定位、克隆及作用机理等方面的研究，实现对于水稻株高的定向改良，具有十分重要的理论意义和应用价值。

水稻植株矮化一般认为是矮秆基因的作用导致水稻植株形态学或细胞学的变化，如节间变短和细胞个数减少等；同时，基因的表达还受到外部环境和内源条件的影响。而植物激素几乎参与水稻生长发育的整个过程，它们既可以独立地发挥生理作用，也可以通过与其他激素或基因的相互作用来精确地调节植物的发育。目前通过对拟南芥和其他植物矮秆突变体的研究表明，赤霉素和油菜素类固醇(Brassinosteroid,BR)是决定植株高度的两个重要的激素，少数植物矮化突变与生长素(Auxin,IAA)有关。水稻矮化突变体dwarf1(d1)是GA钝感型突变体，表现为矮化、叶宽且呈墨绿色、花序紧密。研究表明，水稻dwarf1基因编码的是GTP结合蛋白，该蛋白在植物的生长发育中发挥着重要作用。水稻slr1突变体是由于SLR1基因失去功能的突变而导致的突变体，SLR1基因编码的产物是GA信号传导的抑制剂，与拟南芥的GA1和RGA、小麦的Rht、玉米的d8及大麦的SLN1基因编码的产物类似，都是调控株高的一类蛋白。SLR1蛋白定位于细胞核，在细胞核中发挥作用，来调控GA信号传导，GA上游信号能促进SLR1蛋白的快速降解，从而使GA信号能传导到下游。brd1的矮化突变体表现为典型的BR缺乏症状：茎秆严重矮化，株高只有10-30cm；叶片弯曲僵硬，呈畸形；根冠、穗形和谷粒等偏小。在外施BR复合物后能恢复部分生长性状，是BR缺失型突变体。Mori等发现，在黑暗中，brd1表现出结构型光形态建成的特性，及暗中去黄化。内源BR含量分析发现，BR合成途径中的BR-6-氧化酶减少，进一步分析发现，水稻中BR-6-氧化酶基因os-BR6ox缺失了0.2kb片段。

通过基因工程手段调控农作物生长，可以使生产成本更低廉、效益更高。近年来，已经克隆了很多与株高密切相关的基因。如拟南芥中的GA1、RGA，玉米中的d8，小麦的Rht，大麦中的SLN1，水稻中的Dwarf1等，利用这些基因控制GA或者BR的生物合成或者信号传导从而获得适合的株高，将是未来生产的重要。

OsGRF（Oryza sativa-GROWTH-REGULATING FACTOR）家族类蛋白是一类植物所特有的具有转录因子特性的蛋白，目前研究的较少。OsGRF1基因首先在水稻中被克隆，该基因具有明显的细胞核定位，其表达受到赤霉素的快速诱导，在拟南芥植株中过量表达水稻中的OsGRF1基因会导致拟南芥花序轴发育受抑制，推测该基因可能和GA信号传导途径有关。到目前为止，水稻基因组中GRF基因家族已有12个成员被鉴定出来。在拟南芥基因组中已经报道的GRF类基因一共有9个成员。AtGRF类基因在调控拟南芥叶片发育中起着重要的作用，该类基因的C末端具有明显的转录激活活性。在酵母双杂交筛库寻找AtGRF类蛋白的互作蛋白时，找到了互作蛋白AtGIF1。AtGIF1通过N末端结构域与AtGRF1蛋白进行互作。通过突变体研究发现gif1呈现叶片以及花瓣变窄的表型，而GRF基因表达量的减少会加剧这种表型。拟南芥中一共有三个GIF基因，它们的三突变体会导致花器官发育异常，叶片变窄小。

目前，GRF类基因家族在水稻中的研究还比较少，该类基因参与的生物学过程还不清楚。2000年，研究人员发现OsGRF1基因受GA的诱导表达，且具有明显的细胞核定位，可能作为转录因子形式功能。

发明内容

本发明的一个目的是提供OsGRF6蛋白或其编码基因的应用。

本发明提供的应用为OsGRF6蛋白或其编码基因在调控植物株高中的应用，所述OsGRF6蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

上述应用中，所述OsGRF6蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

上述应用中，所述调控植物株高为降低植物株高。

上述应用为将所述OsGRF6蛋白的编码基因导入目的植物中，得到株高小于所述目的植物的转基因植物。

上述应用中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将所述OsGRF6蛋白的编码基因导入目的植物中，得到株高小于所述目的植物的转基因植物。

上述方法中，所述OsGRF6蛋白的编码基因通过重组载体导入目的植物中。

上述方法中，所述重组载体为将所述OsGRF6蛋白的编码基因插入表达载体中，得到表达OsGRF6蛋白的载体。

上述重组载体具体为将所述OsGRF6蛋白的编码基因插入表达载体pUN1301的Kpn I和BamH I之间，得到表达上述蛋白的重组载体。

本发明的第三个目的是提供一种重组载体。

本发明提供的重组载体，为将所述OsGRF6蛋白的编码基因插入表达载体中，得到表达OsGRF6蛋白的载体。

上述重组载体具体为将上述基因插入表达载体pUN1301的Kpn I和BamH I之间，得到表达上述蛋白的重组载体。

本发明的实验证明，本发明在粳稻中花十号中克隆到了一个GRF家族成员的基因OsGRF6，将该基因的开放阅读框反向连接到pUN1301载体中，构建了该基因的反义表达载体，利用农杆菌介导法转化水稻ZH10号愈伤组织，经潮霉素筛选和PCR检测，获得了阳性转基因水稻株系，分析反义转基因株系和其对应的野生型表型，发现转基因水稻表现出明显的矮化特性。

附图说明

图1为RT-PCR方法扩增到OsGRF6的全长cDNA

图2为转基因水稻的Real-time-PCR鉴定

图3为OsGRF6反义转基因水稻表型观察

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、OsGRF6基因的克隆

基于本实验室前期水稻相关基因的筛选结果，选定其中一个感兴趣的EST片段。通过利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）和TIGR（http://www.tigr.org）两个网站的检索，得到该EST对应的基因组序列，利用Gramme（http://www.gramene.org）数据库分析得到其完整的cDNA序列。

根据数据库分析的结果设计引物，5′端引物：5′-GG GGTACCatgcagggtgcaatggc-3′(下划线序列为Kpn I位点)，3′端引物：5′GA AGATCTcaccaggcggatgctcggatg-3′(下划线序列为BglII位点)，以粳稻中花十号三叶期幼苗总RNA反转录的cDNA为模板，采用RT-PCR方法扩增到1371bp全长cDNA。具体操作过程如下：

选取三叶期中花十号水稻（Oryza sativa L.cv Zhonghua 10）（李梅芳，水稻花培品种-中花10号，农业科技通讯，1998年第1期第26页，公众可从中国科学院植物研究所获得，以下简称为野生型水稻。）幼苗100mg为材料，在液氮中研磨，将液氮中研碎的冻干粉转入到含1ml Trizol试剂（Invitrogen）的1.5ml离心管中，充分混匀；室温25℃放置5分钟；每管中加入0.2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15秒，25℃温育2~3分钟；12,000rpm，4℃，离心15分钟；把上清的水相0.5ml转移到一个新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，室温放置10分钟使RNA沉淀；12,000rpm，4℃，离心10分钟；去上清，将RNA沉淀用1ml 75%乙醇清洗2次，超净台吹至半干；用50μl DEPC-ddH₂O重悬沉淀，60℃水浴10分钟，以溶解RNA沉淀。将此RNA溶液分装后-70℃保存，备做反转录的模板。

取1μl上述RNA样品，用DEPC-ddH₂O稀释100倍，用分光光度计测定RNA浓度。参照RT-PCR试剂盒（Promega）说明书，根据RNA的定量结果，取2μg该RNA，加1.0μgOligo dT引物，用DEPC-ddH₂O补充至15μl，混匀后70℃变性5分钟，冰浴5分钟。短暂离心后，加入25μl反转录混合物（5μl M-MLV 5×Reaction Buffer，6μl dNTP Mixture(2.5mM)，1μl M-MLV Reverse Transcriptase，0.5μl RNase Inhibitor，12.5μl DEPC-ddH₂O）。混匀后，42℃水浴1小时完成反转录过程；75℃水浴10分钟使反转录酶失活，得到含有第一链cDNA的混合物。

取1μl上述第一链cDNA作为PCR的模板，按以下体系进行PCR反应：0.2μl LATaq（5U/μl）、10μl 2×GC buffer，1.8μl dNTPs,0.5μl 5′端引物(10μM)，0.5μl 3′端引物(10μM)，加ddH₂O终体积20μl。引物序列如前，PCR程序为：94°C预变性3分钟后进入PCR循环，循环参数为94°C 30秒变性→58°C 30秒复性→72°C 1分钟延伸,30个循环后在72°C继续合成10分钟。

扩增的PCR产物经过0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示，得到分子量大约1.4kb的条带，把该条特异的琼脂糖凝胶电泳条带用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收该片断。

取3.5μl上述回收片段，加入T4-DNA连接酶1μl（3U/μl）、2×连接酶缓冲液5μl、pTeasy载体（Promega）0.5μl（50mg/ml）4℃连接过夜，得到连接产物，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含羧苄青霉素的抗性平板筛选得到转化子，提取转化子的质粒，选用pGEM-T Easy载体上的T7和SP6启动子序列为引物，测序，结果该质粒中的PCR产物具有序列表中序列1自5’端第1-1368位核苷酸，将该PCR产物的基因命名为OsGRF6，编码区为序列表中序列1自5’端第1-1368位核苷酸所示的DNA分子；将该基因编码的蛋白命名为OsGRF6，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2，将含有该PCR产物的质粒命名为pTeasy-OsGRF6。

实施例2、OsGRF6基因的功能鉴定

一、表达载体的获得

1、pUN1301载体的构建

1）剪取约0.2g玉米（品种名：中作-中单8,北京中农作科技发展有限公司）幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800μL新配制的提取缓冲液(含0.1M Tris-HCl pH8.0，50mM EDTA，0.5M NaCl，1%SDS和1％β-巯基乙醇)，剧烈振荡使其全部悬浮；65℃水浴30分钟，每5分钟颠倒混匀一次；然后加入250μL预冷的5M乙酸钾水溶液，立即颠倒混匀，冰浴5分钟；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm离心5分钟；收集上清液，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，室温放置40分钟；4℃12000rpm离心15分钟,弃上清；沉淀用70%、100%乙醇各洗一次；干燥后，溶于20μL含100μg/mL RNase的ddH₂O中，得到玉米基因组DNA。

2）取上述玉米基因组DNA溶液2μL作为模板，在带有Hind III识别位点的5′引物（GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG）和带有BamHI识别位点的3′引物（CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG）为引物，进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃3分钟；再94℃45秒，62℃45秒，72℃2分钟，共35个循环，最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，表明得到长度约为2kb的扩增片段，与预期结果相符，回收该目的片段，得到的片段经测序验证，具有序列表中序列5所示的核苷酸，为玉米泛素启动子（UbiPro）。

（玉米泛素启动子（UbiPro）也可以人工合成获得。）

3）用限制性内切酶Sac I和EcoR I将Noster poly A终止序列（277bp）从质粒载体pBI 121（北京拜尔迪生物技术有限公司目录号：MP-091）上切下，连接到载体pUC19（北京百泰克生物技术有限公司目录号：DP7801）的Sac I和EcoR I位点间，得到重组载体，命名为pUC19-Noster。再用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切pUC19-Noster，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收线性化的载体大片段，并将该回收片段与2）中经Hind III和BamH I双酶切获得的带有粘性末端的玉米泛素启动子（UbiPro）相连，得到重组载体，命名为pUN19。

4）用限制性内切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切（37°C条件下，先加入EcoR I进行部分酶切，酶切时间为半小时，65°C下20分钟使EcoR I酶失活,后加入HindIII完全酶切3小时即可)从3）购建的重组载体pUN19切下包含UbiPro和Noster的长度约为2.3kb的片段，将该片段克隆入质粒载体pCAMBIA1301(BiovectorCo.,LTD公司目录号Biovec-11)的EcoR I和HindIII位点处，得到重组载体，命名为pUN1301。

2、OsGRF6过表达载体pUN1301-OsGRF6的构建

按照上述转化克隆载体的方法把pUN1301转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含潮霉素抗性平板筛选得到含有重组质粒pUN1301的大肠杆菌菌株。参照上述克隆载体碱裂解法从上述大肠杆菌中分离提取pUN1301质粒，备用。

用限制性内切酶Kpn I和BamH I对质粒pUN1301进行双酶切，酶切体系为：质粒10μl、10x酶切缓冲液5μl、Kpn I 1μl（10U/μl）、BamH I 0.8μl（10U/μl），加ddH₂O补充反应体系至50μl，37℃酶切4小时。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，回收线性化的pUN1301大片段，溶于20μl ddH₂O中。

用限制性内切酶Kpn I和BlII对质粒pTeasy-OsGRF6进行双酶切。酶切体系为：质粒10μl，酶切缓冲液5μl、Kpn I 1μl（10U/μl）、加ddH₂O补充反应体系至50μl，37℃酶切4个小时。再加入BlII0.2μl（10U/μl），37℃酶切20分钟。用0.8%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，用AxyPrep公司所的DNA凝胶回收试剂盒回收该片断，回收1371bp的OsGRF6cDNA片段，备用。

取回收的1371bp的OsGRF6cDNA溶液10μl、回收的载体pUN1301溶液6μl，与T4DNA连接酶2μl(3U/μl)、10x连接酶缓冲液2μl混和，16℃连接16小时，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，结果该质粒为将序列表中的序列表中序列1自5’端第1-1368位核苷酸插入pUN1301的Kpn I和BlII酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pUN1301-OsGRF6，即为植物表达载体，在该表达载体中采用玉米泛素启动子（UbiPro）启动目的基因OsGRF6在植物中超表达。

二、转基因水稻的获得

将上述pUN1301-OsGRF6质粒用电击法转化农杆菌EHA105（Hiei Y，Ohta S,KomariT,Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J 6:271-282，公众可从中国科学院植物研究所获得。），经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆的超表达工程菌，提取阳性克隆的超表达工程菌的质粒，为pUN1301-OsGRF6，将该阳性克隆的超表达工程菌命名为EHA105/pUN1301-OsGRF6。

将EHA105/pUN1301-OsGRF6侵染中花十号水稻（Oryza sativa L.cv Zhonghua 10，以下简称为野生型水稻）愈伤组织，将侵染后的愈伤组织用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤4-5遍，无菌滤纸吸干后转至N₆D₂S₁培养基上，筛选一代。两周后，转移至N₆D₂S₂培养基上筛选二代（2周/代）。取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至预分化培养基上，在分化培养箱（12小时光周期，白天28℃，夜晚25℃）中培养7天；然后转移至分化培养基上，在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮苗。待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培，得到22株T0代转OsGRF6水稻。

所用培养基如下表1：

表1所用培养基配方

三、转基因水稻的鉴定

1、GUS组织化学染色

将T0代转OsGRF6水稻的叶片分别放到GUS染色液中，抽气几分钟，然后置于37℃温育过夜，染色后的组织用70%乙醇脱色。呈蓝色的即为阳性植株。GUS染色液（pH 7.0）组分为：100mM Na₃PO₄(pH 7.0)，0.1%Triton X-100，10mM EDTA，0.5mM亚铁氰化钾，0.5mM铁氰化钾，1mg/ml X-Gluc。

结果为得到18株GUS阳性T0代转OsGRF6水稻。

2、定量PCR鉴定

编号为A4#、A6#和A12#GUS阳性T0代转OsGRF6水稻的RNA提取以及第一链cDNA的获得参照实施例1中的方法进行。利用荧光实时定量PCR法，以基因特异序列为引物对转基因植株中OsGRF6的表达丰度进行检测。用于定量分析的试剂为SYBRGreen Realtime PCR Master Mix（TOYOBO）。所用仪器为美国Stratagene公司实时荧光定量PCR仪Mx3000P。吸取1μl第一链cDNA溶液，稀释50倍作为模板，按以下体系进行PCR反应：10μl SYBR Green Realtime PCR Master Mix,4μl模板,1μl 5′端引物(10μM)(5′-GCCTGGTGTGAGCTTCTTGAT-3′)，1μl 3′端引物(10μM)(5′-TCGTTTCCTCATGCCTGTCAT-3′)，加ddH2O终体积20μl。用Ubiqutin作为内参，其5′端引物：5′-AACCAGCTGAGGCCCAAGA-3′，3′端引物为：5′-AACCAGTCCATGAACCCGG-′。PCR程序为：预变性2分钟,进入PCR循环，循环参数为94°C 15秒→58°C 15秒→72°C 15秒，共40个循环。

结果如图2所示，在Ubiqutin基因作为内参的情况下，编号为A4#、A6#和A12#GUS阳性T0代转OsGRF6水稻中的OsGRF6表达丰度有了不同程度的下调，说明目的基因连接的载体已经成功转入水稻。

因此，可以看出，经过GUS和RT-PCR鉴定均为阳性的为阳性T0代转OsGRF6水稻，共得到18株T0代转OsGRF6水稻。

采用同样的方法将空载体pUN1301转入野生型水稻中，得到T0代转空载体水稻，按照上述方法鉴定，OsGRF6基因没有过量表达，说明为阳性。

将上述阳性T0代转OsGRF6水稻和T0代转空载体水稻分别收种、播种，传代直到得到阳性T2代转OsGRF6水稻和T2代转空载体水稻。

四、转基因水稻的表型观察

将野生型水稻、编号为A4#（GRF-A4）、A6#（GRF-A6）和A12#（GRF-A12）T2代转OsGRF6水稻和T2代转空载体水稻的种子播在花卉营养土和蛭石的混合物里（两者的混合比例为9:1），30℃萌发后放在温室里（25-32℃）培养至三叶期，经过室外壮苗后，5月中旬移栽到室外水稻网室中进行培养至抽穗期。

每个株系6株，实验重复三次，结果取平均值。

对植株株高进行观察，结果如下：

拍照如图3所示，可以看出编号为A4#、A6#和A12#阳性T2代转OsGRF6水稻株高明显低于野生型水稻。

在播种后约第120天统计野生型水稻、编号为A4#、A6#和A12#T2代转OsGRF6水稻株高，具体如下：

野生型水稻、编号为A4#、A6#和A12#阳性T2代转OsGRF6水稻株高分别为106.8厘米、80.6厘米、77.80厘米和75.60厘米。

T2代转空载体水稻和野生型水稻结果无显著差异。

Claims (9)

1.OsGRF6蛋白或其编码基因在调控植物株高中的应用，所述OsGRF6蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述OsGRF6蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控植物株高为降低植物株高。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述应用为将所述OsGRF6蛋白的编码基因导入目的植物中，得到株高小于所述目的植物的转基因植物。

5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。

6.一种培育转基因植物的方法，为将权利要求1-5中任一所述的应用中的所述OsGRF6蛋白的编码基因导入目的植物中，得到株高小于所述目的植物的转基因植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述OsGRF6蛋白的编码基因通过重组载体导入目的植物中。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述重组载体为将所述OsGRF6蛋白的编码基因插入表达载体中，得到表达OsGRF6蛋白的载体。

9.一种重组载体，为将权利要求1-5中任一所述的应用中的所述OsGRF6蛋白的编码基因插入表达载体中，得到表达OsGRF6蛋白的载体。

Images