CN102858964B

CN102858964B - 多肽

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Publication number: CN102858964B
Application number: CN201180019130.4A
Authority: CN
Inventors: G·盖德纳克; A-M·拉斯穆森; E·M·I·苏索
Original assignee: Duarte Co
Current assignee: Ultimovacs ASA
Priority date: 2010-02-16
Filing date: 2011-02-15
Publication date: 2018-10-02
Anticipated expiration: 2031-02-15
Also published as: ES2751092T3; RU2581800C2; KR102035199B1; US20170232087A1; CY1122178T1; JP6444336B2; US9657068B2; US20130129760A1; US20170232088A1; US20230277641A1; US10383928B2; EP2536830B1; US11998595B2; PT2536830T; CN108383894A; RS59462B1; US20200121771A1; JP2016183169A; EP3581649A1; PL2536830T3

Abstract

一种含有SEQ.ID NOS.2、3、4、7或8的序列的多肽。所述多肽可以具有其含有至少8个氨基酸的免疫原性片段，其中，所述免疫原性片段不是SEQ.ID NOS.6或11‑16中的一个。所述多肽可以含有与后述多肽或免疫原性片段具有至少80%的序列一致性的序列。所述多肽在长度上小于100个氨基酸，且不含有SEQ.ID NOS.10、46、56、57或59‑62中的任何一条序列，且不由SEQ.ID NOS.58的序列组成。所述多肽在癌症的治疗或预防中是有效的。

Description

多肽

技术领域

本发明涉及一种多肽和一种由编码该多肽的核苷酸序列组成的核酸分子。本发明还涉及一种多肽的混合物（cocktail）和一种核酸分子的混合物。本发明进一步涉及一种含有这种多肽、核酸分子或其混合物的药物组合物。另外，本发明涉及在患者中治疗或预防癌症的方法，该方法包括用所述多肽、核酸分子或混合物对患者进行给药。

背景技术

癌症是以个体中新的且异常生长的细胞为特征的疾病。癌症通过多步过程发展，所述多步过程包括几个允许癌细胞发展的突变事件，也就是说，细胞表现了入侵和转移的特性。一般来说，有两类能发生突变并且引发癌症的基因：致癌基因和肿瘤抑制基因。致癌基因的激活赋予细胞新的特性，例如，极度活跃地生长和分裂、防止程序性细胞死亡、丧失对正常组织界限的遵守和在不同组织环境中定植的能力。可以使肿瘤抑制基因失活从而使得细胞丧失其正常功能，例如，精确的DNA复制、组织中细胞周期、定位和粘附的控制，以及免疫系统防护细胞间的相互作用。

对于癌症的治疗和预防已提议有多种方法。一种方法是含有肿瘤特异性抗原的片段的抗原肽（antigenic peptide）的使用。当用这种抗原肽对个体进行给药时，会引起对表达肿瘤特异性抗原的细胞的MHC I类或II类限制性T细胞应答。

可以理解的是，为了这种T细胞应答的发生，该抗原多肽必须在MHC分子上递呈。在人类中，MHC分子存在很大程度的差异。特别的，不同个体具有对多肽具有不同亲和力（binding affinity）的不同HLA等位基因。因此，具有一个特定HLA等位基因的个体可以具有结合特定序列的多肽的MHC分子，然而，缺少HLA等位基因的其他个体具有不能结合并递呈所述多肽的MHC分子（或者，至少是，他们的MHC分子对所述多肽具有很低的亲和力，且因此以相对较低的水平递呈所述多肽）。

还提议了一种提供含有编码这种抗原肽的核酸分子的疫苗。这种疫苗通过相同的原则运作（operate），除了用该疫苗对需要治疗的个体进行给药之后，该核酸分子经转录（如果该核酸分子是DNA分子）和翻译而合成肽，然后所述肽被上述MHC分子结合并递呈。

端粒酶是在真核细胞中具有复制线性DNA链端粒区3’端功能的酶，因为这些区不能以通常的方式通过DAN聚合酶进行延伸。端粒酶含有端粒酶反转录酶亚基（telomerasereverse transcriptase subunit）（人“TERT”或“hTERT”）和端粒酶RNA。在真核细胞内，为了延伸DNA链的3’端，通过利用端粒酶RNA作为模板，端粒酶反转录酶亚基将重复序列添加到染色体的3’端。

据观察，在所有人类肿瘤的绝大多数中，端粒酶是激活的。这种情况发生据信是因为：没有端粒酶的表达，细胞的端粒会渐渐缺失，并且随着细胞的每一轮细胞分裂，染色体的完整性下降，这最终导致细胞的凋亡。因此，对于癌细胞的发展，端粒酶的表达通常是必须的，因为没有这种表达，由于缺失（default）通常会发生程序性细胞死亡。鉴于在癌症中端粒酶激活的作用，端粒酶被认为是肿瘤特异性抗原，因此作为癌症治疗的潜在靶点。

WO03/038047公开了一种称为T672的肽，据报道该肽会引发来自健康供体的细胞的增殖T细胞应答。还公开了多种其它的hTERT肽，但并未进行任何实验测试。

WO00/02581公开了引起MHC I类和/或II类限制性T细胞应答的端粒酶的多肽。公开的多肽中的一种（具有的氨基酸序列为EARPALLTSRLRFIPK，也被称为GV1001）在英国胰腺癌患者中作为疫苗治疗正在进行III期临床试验（Telo Vac）。

WO02/094312公开了某些来源于hTERT的多肽。

Liu JP等（2009，Telomerase in cancer immunotherapy.Biochim BiophysActa.9月12日）综述了26种已显示能诱导对hTERT阳性肿瘤细胞的有效免疫应答的多肽。

之前也已经将hTERT mRNA转染的树突状细胞（dendritic cells）用于治疗转移性前列腺癌（metastatic prostate cancer）患者（Su et al,2005,Telomerase mRNA-transfected dendritic cells stimulate antigen-specific CD8+and CD4+T cellresponses in patients with metastatic prostate cancer.J Immunol.174(6):3798-807）。Su等成功地证明了测定为分泌IFNγ的CD8+T细胞和hTERT靶的CTL-介导杀伤力（CTL-mediated killing of hTERT targets）的hTERT特异性T细胞应答的产生。4名患者还经历了局部临床应答（partial clinical responses）。然而在这些研究中未表征hTERT表位。

对癌症的治疗，仍需要其他的抗原多肽（和编码这种多肽的核苷酸分子），例如，在个体中能够引起更有效的免疫应答的多肽和/或在更大比例的人群中存在的通过HLA等位基因递呈的多肽。

本发明旨在探索解决上述问题中的一个或多个。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了一种多肽，该多肽包括选自以下的序列：

i)SEQ.ID NOS.2、3、4、7、8或9；

ii)含有至少8个氨基酸的i)的免疫原性片段（immunogenic fragment）的序列，其中，所述免疫原性片段不是SEQ.ID NOS.6或11-16中的一个；或者

iii)与i)或ii)具有至少80%的序列一致性的序列，

其中，所述多肽在长度上小于100个氨基酸，并且，所述多肽不含有SEQ.ID NOS.10或56。

优选地，所述多肽不含有SEQ.ID NOS.46、57或59-62中的任何一条序列，并且不由SEQ.ID NOS.58的序列组成。

所述多肽是分离的，也就是说，所述多肽不形成天然存在的蛋白（hTERT）中的一部分。

在具有适合显示所述多肽的HLA等位基因的健康患者中，所述多肽能引起T细胞应答。

优选地，根据本发明的第一方面，定义所述多肽的序列为选自以下的序列：

i)SEQ.ID NO.1；

ii)含有至少8个氨基酸的i)的免疫原性片段的序列，其中，所述免疫原性片段不是SEQ.ID NOS.6、11-16或56中的一个；以及

iii)与i)或ii)具有至少80%的序列一致性的序列，

其中，所述多肽在长度上小于100个氨基酸，也就是说，所述多肽可以含有整合了SEQ.ID NOS.2和3的序列的SEQ.ID NO.1的序列，并且不需要除SEQ.ID NOS.2和3外的序列。

优选地，所述多肽不由SEQ ID NO.58的序列组成。

优选地，所述免疫原性片段具有SEQ.ID NOS.17-40中的任意一条序列。

优选地，所述多肽在长度上小于或等于80、50、30、20或11个氨基酸。

根据本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，该核酸分子由编码根据本发明的多肽的核苷酸序列组成。

所述核酸分子是分离的，也就是说，所述核酸分子不形成天然存在的基因（端粒酶基因）中的一部分。

根据本发明的第三方面，提供了一种多肽的混合物，该多肽的混合物含有至少两种不同多肽，所述多肽包括选自由以下组成的组中的序列：

i)SEQ.ID NOS.2-7；

ii)含有至少8个氨基酸的i)的免疫原性片段的序列；以及

iii)与i)或ii)具有至少80%的序列一致性的序列，

其中，各条多肽在长度上小于100个氨基酸。优选地，所述至少两种多肽是不同的是就i)中定义的序列不同于各条多肽而言的。

优选地，定义至少一条多肽的序列包括选自由以下组成的组中的序列：

i)SEQ.ID NOS.1、7、8、9或10；

ii)含有至少8个氨基酸的i)的免疫原性片段的序列；以及

iii)与i)或ii)具有至少80%的序列一致性的序列，

其中，所述多肽在长度上小于100个氨基酸。例如，所述多肽中的一条可以含有整合了SEQ.ID NOS.2和3的序列的SEQ.ID NO.1的序列，并且不需要除SEQ.ID NOS.2和3外的序列。

优选地，所述至少两种不同的多肽包括多肽的混合物，所述多肽的混合物选自由以下混合物组成的组中：

i)混合物：含有SEQ.ID NO.1的序列或与SEQ.ID NO.1具有至少80%的序列一致性的序列或含有至少8个氨基酸的SEQ.ID NO.1的免疫原性片段的多肽；含有SEQ.ID NO.7的序列或与SEQ.ID NO.7具有至少80%的序列一致性的序列或含有至少8个氨基酸的SEQ.IDNO.7的免疫原性片段的多肽；以及含有SEQ.ID NO.9的序列或与SEQ.ID NO.9具有至少80%的序列一致性的序列或含有至少8个氨基酸的SEQ.ID NO.9的免疫原性片段的多肽；

ii)混合物：含有SEQ.ID NO.1的序列或与SEQ.ID NO.1具有至少80%的序列一致性的序列或含有至少8个氨基酸的SEQ.ID NO.1的免疫原性片段的多肽；含有SEQ.ID NO.8的序列或与SEQ.ID NO.8具有至少80%的序列一致性的序列或含有至少8个氨基酸的SEQ.IDNO.8的免疫原性片段的多肽；以及含有SEQ.ID NO.9的序列或与SEQ.ID NO.9具有至少80%的序列一致性的序列或含有至少8个氨基酸的SEQ.ID NO.9的免疫原性片段的多肽；

iii)混合物：含有SEQ.ID NO.1的序列或与SEQ.ID NO.1具有至少80%的序列一致性的序列或含有至少8个氨基酸的SEQ.ID NO.1的免疫原性片段的多肽；含有SEQ.ID NO.8的序列或与SEQ.ID NO.8具有至少80%的序列一致性的序列或含有至少8个氨基酸的SEQ.IDNO.8的免疫原性片段的多肽；以及含有SEQ.ID NO.10的序列或与SEQ.ID NO.10具有至少80%的序列一致性的序列或含有至少8个氨基酸的SEQ.ID NO.10的免疫原性片段的多肽；

其中，各条多肽在长度上小于100个氨基酸。

优选地，所述或各条免疫原性片段具有SEQ.ID NOS.17-40中的任意一条序列。

根据本发明的第四方面，提供了一种核酸分子的混合物，该核酸分子的混合物含有至少两种不同的由编码多肽的核酸序列组成的核酸分子，所述多肽包括选自由以下组成的组中的序列：

i)SEQ.ID NOS.2-7；

ii)含有至少8个氨基酸的i)的免疫原性片段的序列；以及

iii)与i)或ii)具有至少80%的序列一致性的序列，

其中，所述多肽在长度上小于100个氨基酸。优选地，所述至少两种核酸分子是不同的是就i)中定义的序列不同于各条核酸分子而言的。

优选地，定义至少一条核酸分子由编码多肽的核酸序列组成，所述多肽包括选自由以下组成的组中的序列：

i)SEQ.ID NOS.1、7、8、9或10；

ii)含有至少8个氨基酸的i)的免疫原性片段的序列；以及

iii)与i)或ii)具有至少80%的序列一致性的序列，

其中，所述多肽在长度上小于100个氨基酸。例如，核酸分子可以由编码多肽的核酸序列组成，所述多肽含有整合了SEQ.ID NOS.2和3序列的SEQ.ID NO.1的序列，并且所述多肽不需要另外含有SEQ.ID NOS.2和3的序列。

优选地，所述至少两种不同的核酸分子包括核酸分子的混合物，所述核酸分子的混合物选自由以下混合物组成的组中：

i)混合物：由编码多肽的核酸序列组成的核酸分子，该多肽含有SEQ.IDNO.1的初级序列（primary sequence）或与初级序列具有至少80%的序列一致性的次级序列（secondary sequence）或含有至少8个氨基酸的初级序列或次级序列的免疫原性片段；由编码多肽的核酸序列组成的核酸分子，该多肽含有SEQ.ID NO.7的初级序列或与初级序列具有至少80%的序列一致性的次级序列或含有至少8个氨基酸的初级序列或次级序列的免疫原性片段；以及由编码多肽的核酸序列组成的核酸分子，该多肽含有SEQ.ID NO.9的初级序列或与初级序列具有至少80%的序列一致性的次级序列或含有至少8个氨基酸的初级序列或次级序列的免疫原性片段；

ii)混合物：由编码多肽的核酸序列组成的核酸分子，该多肽含有SEQ.ID NO.1的初级序列或与初级序列具有至少80%的序列一致性的次级序列或含有至少8个氨基酸的初级序列或次级序列的免疫原性片段；由编码多肽的核酸序列组成的核酸分子，该多肽含有SEQ.ID NO.8的初级序列或与初级序列具有至少80%的序列一致性的次级序列或含有至少8个氨基酸的初级序列或次级序列的免疫原性片段；以及由编码多肽的核酸序列组成的核酸分子，该多肽含有SEQ.ID NO.9的初级序列或与初级序列具有至少80%的序列一致性的次级序列或含有至少8个氨基酸的初级序列或次级序列的免疫原性片段；

iii)混合物：由编码多肽的核酸序列组成的核酸分子，该多肽含有SEQ.ID NO.1的初级序列或与初级序列具有至少80%的序列一致性的次级序列或含有至少8个氨基酸的初级序列或次级序列的免疫原性片段；由编码多肽的核酸序列组成的核酸分子，该多肽含有SEQ.ID NO.8的初级序列或与初级序列具有至少80%的序列一致性的次级序列或含有至少8个氨基酸的初级序列或次级序列的免疫原性片段；以及由编码多肽的核酸序列组成的核酸分子，该多肽含有SEQ.ID NO.10的初级序列或与初级序列具有至少80%的序列一致性的次级序列或含有至少8个氨基酸的初级序列或次级序列的免疫原性片段；

其中，各条多肽在长度上小于100个氨基酸。

根据本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物含有本发明的多肽、本发明的核酸分子、本发明的多肽的混合物或本发明的核酸分子的混合物以及药学可接受的佐剂（adjuvant）、稀释剂（diluent）或赋形剂（excipient）和可选择的其他治疗成分（therapeutic ingredient）。

优选地，所述多肽、核酸分子、多肽的混合物或核酸分子的混合物的含量在50-200μg之间。

根据本发明的第六方面，提供了一种在患者中治疗或预防癌症的方法，该方法包括用本发明的多肽、本发明的核酸分子、本发明的多肽的混合物、本发明的核酸分子的混合物或本发明的药物组合物对患者进行给药。

根据本发明的第七方面，提供本发明的多肽、本发明的核酸分子、本发明的多肽的混合物、本发明的核酸分子的混合物或本发明的药物组合物在医药中的用途。

优选地，所述多肽、核酸分子、多肽的混合物、核酸分子的混合物或药物组合物用于治疗或预防癌症。

根据本发明的第八方面，提供了本发明的多肽、本发明的核酸分子、本发明的多肽的混合物、本发明的核酸分子的混合物或本发明的药物组合物在制备治疗或预防癌症的药物（medicament）中的应用。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在此可交换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语用在其中一个或多个氨基酸残基为被修饰的残基或非天然存在的残基（例如，相应天然存在的氨基酸的人工合成模拟物（artificial chemical mimetic））的氨基酸聚合物上，也用在天然存在的氨基酸聚合物上。

本文使用的术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，也指与天然存在的氨基酸具有相似功能的氨基酸类似物（analogues）和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码，以及翻译后在细胞中被修饰的的氨基酸（例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸（gamma-carboxyglutamate）和O-磷酸丝氨酸）。短语“氨基酸类似物”指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构（结合氢、羧基、氨基以及R基的α碳），但是具有被修饰的R基或被修饰的骨架（例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍）的化合物。短语“氨基酸模拟物”指与天然存在的氨基酸结构不同但功能相似的化合物。

本文使用的术语“片段”涉及多肽，指形成多肽一部分的连续氨基酸。多肽的“免疫原性片段”是如之前定义的片段，在用所述片段对个体进行给药时，能引起免疫应答（例如T细胞应答）。

术语“基因”、“多聚核苷酸”和“核酸分子”在此可交换使用，指多个核苷酸的聚合物。所述核酸分子可以包括天然存在的核酸，或可以包括人工合成的核酸，例如，肽核酸（peptide nucleic acids）、吗啉（morpholin）和锁核酸（locked nucleic acid）以及乙二醇核酸和苏阿糖核酸。

本文使用的术语“核苷酸”指天然存在的核苷酸和可被细胞酶识别的合成的核苷酸类似物。

本文使用的术语“治疗”指任何局部的或全部的治疗，并且包括：抑制疾病或症状（即阻止疾病或症状的发展），和缓解疾病或症状（即使得疾病或症状减轻）。

在本说明书中，两条序列之间的“一致性”百分比是使用BLASTP算法2.2.2版（Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Jinghui Zhang,ZhengZhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997),"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a newgeneration of protein database search programs",Nucleic Acids Res,25:3389-3402）利用默认参数确定的。具体地，可以从网上利用URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/进入BLAST算法。

附图说明

图1为柱状图，概括了在接种hTERT mRNA转染的DC的胰腺癌患者中检测到的hTERTT细胞应答。在整个接种期间不同时间点的样品中，检测到了对24种重叠hTERT 15-mer肽的T细胞应答。通过³H-胸苷整合测定了对载肽PBMC应答的增殖。认为＞2的刺激指数为免疫应答。

图2为系列图表，显示了通过流式细胞术对接种的癌症患者的hTERT特异性HLA-A2限制性CD8+T细胞的检测。在分离后PBMC不预先进行抗原刺激而直接染色，在结合（gated）在CD8+、CD3+细胞的细胞上显示五聚体（Pentamer）染色。图中显示了具有不相关五聚体（HIV-肽）的背景染色，hTERT五聚体图显示了在胰腺癌患者中的两种新型hTERT肽（A）（被称为720GLL的肽，对应于SEQ.ID NO.3；被称为728RLT的肽，对应于SEQ.ID NO.6）和在肺癌患者中检测到的第三hTERT肽（B）（被称为613RPA的肽，对应于SEQ.ID NO.5）的染色，后者两个不同的时间点相差5年。分析了45000个CD8+T细胞。

图3为显示了应答于GV1001肽（SEQ.ID NO.10）、663-677（15-mer）（SEQ.ID NO.2）和660-689（30-mer）（SEQ.ID NO.1）的T细胞增殖的图。用刺激指数衡量肽特异性增殖高于背景的倍数。

图4为显示了证明对降低的肽浓度的应答中肽特异性增殖的CD4+T细胞克隆结果的图，认为高于2的值是阳性应答。

图5为显示了直接在来自患者血样的外周血单核细胞（PBMC）中对SEQ.ID NOS.3、4和6的9-或10-mer肽特异性的CD8+T淋巴细胞的检测结果。在最后两名患者中未检测肽615-624（SEQ.ID NO.4）。所述患者为HLA-A2+。具有不相关的五聚体的背景染色＜0.05%。

图6为显示了在肺癌患者中对9-mer肽613-621（SEQ.ID NO.5）特异性的CD8+T淋巴细胞的检测结果图，所述患者在接种GV1001（SEQ.ID NO.10）后完全缓解了几年。所述患者为HLA-B7+。随后，每6个月对患者进行接种，且患者经历了完全缓解6年后仍能检测到对hTERT肽613-621特异性的稳定CD8+T细胞群。在某些时间点，检测到了对另一CTL表位，672-681（SEQ ID.NO.25）特异性的第二较小CTL群。

图7为显示了在接种GV1001（SEQ.ID NO.10）的黑色素瘤患者中对hTERT重叠肽库的T细胞应答的图。

图8为显示了在接种GV1001（SEQ.ID NO.10）的肺癌患者中对hTERT重叠肽库的T细胞应答的图。

图9为显示了在接种GV1001（SEQ.ID NO.10）的结肠癌患者中对hTERT重叠肽库的T细胞应答的图。

图10为显示了在第二名接种GV1001（SEQ.ID NO.10）的黑色素瘤患者中对hTERT重叠肽库的T细胞应答的图。

图11为显示了在接种hTERT mRNA转染的DC的胰腺癌患者中对hTERT重叠肽库的T细胞应答的图。显示的为与图1中相同的患者的结果。

图12为显示了在接种hTERT mRNA转染的DC的肺癌患者中对hTERT重叠肽库的T细胞应答的图。

图13为显示了在第三名未接种的黑色素瘤患者中对hTERT重叠肽库自发的T细胞应答的图。

图14为显示了来自图7-13中所选hTERT肽的结果的概况图。

图15为显示了在四名肺癌患者中对所选hTERT肽的T细胞应答的图。

图16为显示了在六名黑色素瘤患者中对所选hTERT肽的T细胞应答的图。

图17为散点图，显示了诱导免疫应答的肽的数量与每名患者存活的月数的关系。

图18为显示了测试的不同患者的存活时间（survival）的图，并根据对所选hTERT肽的肽序列的免疫应答分为两组。对除GV1001之外的0-1条肽应答的患者被分为一组，对2条以上条肽应答的患者被分为另一组。使用独立组t-检验分析两组的存活时间。对存活时间的相等性（equality）的初步测试表明了两组的存活时间明显不同。因此，在不假设相等存活时间下进行两样品的t-检验。使用不等方差t-检验，t(6,1)=-3,22，p=0.018。使用WINKSSDA软件（Texasoft,Cedar Hill,TX.）完成了统计，统计结论（Statisticaldecisions）制定为p=0.05。基于这些数据，0-1条肽的组的平均（SD）存活时间为10,7(3,9455)，N=10，且≥2条肽的组的平均（SD）存活时间为51,5714(33,3909)，N=7。

具体实施方式

概括地，本发明涉及一种端粒酶蛋白的多肽，该端粒酶蛋白的多肽含有选自SEQ.ID NOS.2、3、4、7、8和9的序列，其中，所述多肽在长度上小于100个氨基酸，并且不含有多肽GV1001（即SEQ.ID NO.10）、SEQ.ID NO.56（由Schroers等报道，2002）、SEQ ID NOS.46、57或59-61（在WO03/038047中报道）中的任意一条或SEQ ID NO.62（在WO00/02581中报道）的序列。所述多肽还不由SEQ ID NO.58的序列（在WO03/038047报道）组成。

特别优选地，所述多肽含有SEQ.ID NO.1（整合了SEQ.ID NOS.2和3的序列）、SEQ.ID NO.6（整合了SEQ.ID NOS.8和9的序列）和SEQ.IDNO.7的序列的多肽。

在一些实施方式中，所述多肽由SEQ.ID NOS.1-9中列出的一条序列组成。在其它的实施方式中，所述多肽含有SEQ.ID NOS.1-9中列出的一条序列中的一条和额外的N和/或C端的氨基酸，该额外的N和/或C端的氨基酸不同于天然存在的端粒酶中存在的氨基酸。

在其他的实施方式中，提供上述多肽的免疫原性片段，所述免疫原性片段含有至少8个氨基酸，其中，所述片段不是SEQ.ID NOS.6或11-16的多肽中的任何一条，也不是具有SEQ.ID NO.56的序列的片段多肽。典型的免疫原性片段包括SEQ.ID NOS.17-40中列出的多肽，所述典型的免疫原性片段被预测具有对某些HLA I类等位基因的MHC分子的亲和力。可以理解的是，SEQ.ID NOS.17-40的多肽均为SEQ.ID NO.1的多肽的免疫原性片段。

人端粒酶（hTERT）的序列列于GenBank），序号（accession no）AF015950。注意到SEQ.ID NOS.1-9中的每一个均存在于端粒酶660-705位置的氨基酸内，这对应于人端粒酶反转录酶亚基的活性位点。据信，一旦引发对反转录酶亚基区域中表位的免疫应答，任何肿瘤细胞中编码该区域的端粒酶基因部分均会发生突变，从而能避免免疫应答，还会损害编码的端粒酶蛋白的酶活力。因此通过将端粒酶的该区域作为靶点，癌细胞克隆通过突变端粒酶基因而存活的可能性变小。

在一些实施方式中，如上述定义的多个多肽彼此共价结合而形成大型多肽（largepolypeptide）甚至环形多肽（cyclic polypeptide）。

在本发明上述描述的实施方式中，提供单一序列的多肽。然而，在其它的实施方式中，提供多肽的混合物，其中，该混合物包括至少两种不同的含有SEQ.ID NOS.2-7的序列的多肽。在一些实施方式中，该混合物含有所述多肽的免疫原性片段，其中，该免疫原性片段含有至少8个氨基酸。所述多肽在长度上小于100个氨基酸。

特别优选地，所述混合物中的多肽含有SEQ.ID NOS.1、7、8或9的序列。特别优选地，所述混合物中的多肽含有SEQ.ID NOS.1、7和9；SEQ.IDNOS.1、8和9；或SEQ.ID NOS.1、8和10的序列。因此，在本发明的范围内，混合物中的一条多肽含有SEQ.ID NO.10（即，被称为GV1001的肽的序列）的序列。优选地，所述免疫原性片段为SEQ.ID NOS.17-40。

优选地，所述至少两种多肽是不同的，是基于选自SEQ.ID NOS.1-10的不同序列而言的。

特别优选地，在多肽的混合物中，所述混合物中的多肽能够被1个以上的HLA等位基因的MHC分子结合。例如，在一种实施方式中，所述混合物含有能够被等位基因HLA-A*0201的MHC分子结合的第一多肽和能够被等位基因HLA-A-A*03的MHC分子结合的第二多肽。在一些实施方式中还理解为所述混合物含有具有不同序列的两条以上的多肽（例如，3、4或5条多肽）。

在进一步的实施方式中，提供的所述或各条多肽不与上述多肽中的一条具有确切的序列一致性，反而，所述多肽与以上列出的多肽具有至少80%的序列一致性，特别优选地，所述序列与以上列出的序列具有至少90%、95%或99%的序列一致性。仍优选地，任何氨基酸序列的插入或置换会导致原始氨基酸侧链性能的保守，也就是说，置换或修饰是“保守的”。

提供功能相似的氨基酸的保守替换表为本领域技术人员所公知。例如，氨基酸侧链的特性为疏水氨基酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、亲水氨基酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T），以及具有如下共同的官能团或特性的侧链：脂肪族侧链（G、A、V、L、I、P）；含有侧链（S、T、Y）的羟基；含有侧链（C、M）的硫原子；含有侧链（D、N、E、Q）的羧酸和氨基化合物；含有侧链（R、K、H）的碱基；以及含有侧链（H、F、Y、W）的芳香烃。另外，如下8组中，每组包括彼此保守置换的氨基酸（例如，见Creighton,Proteins(1984)）。

1）丙氨酸（A），甘氨酸（G）；

2）天冬氨酸（D），谷氨酸（E）；

3）天冬酰胺（N），谷氨酸盐（Q）；

4）精氨酸（R），赖氨酸（K）；

5）异亮氨酸（I），亮氨酸（L），蛋氨酸（M），缬氨酸（V）；

6）苯基丙氨酸（F），酪氨酸（Y），色氨酸（W）；

7）丝氨酸（S），苏氨酸（T）；以及

8）半胱氨酸（C），蛋氨酸（M）。

在一些实施方式中，改变所述或各条多肽的序列以改变（例如，增强）多肽对特定HLA等位基因的MHC分子的亲和力。在其它的实施方式中，在所述多肽的N-和/或C-端进一步含有除了上述列出的氨基酸之外的氨基酸，这种额外的氨基酸也可以用来改变（例如，增强）多肽对MHC分子的亲和力。

必要的是，所述或各条多肽（尤其是以上列出的序列被改变的多肽）能诱导细胞毒性T淋巴细胞（“CTL”）应答。也就是说当被抗原递呈细胞（例如，树突状细胞）递呈时，所述多肽能够诱导CTLs。

CTL可诱导性的证明可以通过诱导携带人MHC抗原（例如，B淋巴细胞，巨噬细胞或树突状细胞）的抗原递呈细胞或来自人外周血单核白细胞的更特异性的树突状细胞来实现，在经所述多肽刺激之后，与CD8+细胞混合，然后测定CTL抵抗靶细胞所产生和释放的IFN-γ。作为反应体系，可以使用生产的转基因动物来表达人HLA抗原（例如，在BenMohamedL，Krishnan R,Longmate J,Auge C,Low L,Primus J,Diamond DJ,Hum Immunol 61(8):764-79,2000 Aug,Related Articles,Books,Linkout Induction of CTL response by aminimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice:dependence on HLAclass II restricted T(H)response中描述的抗原）。例如，用⁵¹Cr放射性标记的靶细胞，通过靶细胞释放的放射性（radioactivity）计算细胞毒素的活性。可选择地，CTL可诱导性可以通过测定在携带固定肽的抗原递呈细胞存在的情况下由CTL产生和释放的IFN-γ来检测，并使用抗-IFN-γ单克隆抗体观察培养基上的抑菌圈。

在本发明一些其他的实施方式中，所述或各条多肽与其它物质相连，但仍保留它们诱导CTL应答的能力。这种其它物质包括脂质、糖、糖链、乙酰基、天然的和合成的聚合物等。在某些实施方式中，所述多肽包括如糖基化、侧链氧化或磷酸化的修饰。

在一些实施方式中，所述或各条多肽通过本领域技术人员公知的传统方法生产。可选择地，所述多肽为通过切割（例如，使用溴化氰，随后纯化；也可以使用酶切）产生的端粒酶蛋白片段。在进一步的实施方式中，所述多肽为重组表达多肽的形式，例如，制备含有可表达形式的编码多肽的多核苷酸（例如，对应启动序列的调控序列的下游）的适当载体，并转化至合适的宿主细胞。然后培养所述宿主细胞以产生目的多肽。在其它的实施方式中，所述多肽通过使用体外翻译系统在体外产生。

在本发明可选择的实施方式中，提供由编码以上列出的多肽的核苷酸序列组成的核酸分子。

在本发明进一步的实施方式中，提供一种核酸分子的混合物，其中，所述混合物含有至少两种不同的核酸分子，所述核酸分子含有编码SEQ.IDNOS.2-7的序列的多肽的核苷酸序列。在可选择的实施方式中，所述多肽为含有至少8个氨基酸的SEQ.ID NOS.2-7中的一条的片段。在可选择的变体中，所述多肽的序列与上述多肽的序列不同，而是与其具有至少80%的序列一致性。总之，所述多肽在长度上小于100个氨基酸。优选地，所述编码的多肽含有SEQ.ID NOS.1、7、8或9的序列。特别优选地，在所述混合物中编码的多肽含有SEQ.IDNOS.1、7和9；SEQ.ID NOS.1、8和9；或SEQ.ID NOS.1、8和10的序列。在一些实施方式中，一条编码的多肽因此含有SEQ.ID NO.10的序列（即GV1001肽的序列）。仍优选地，所述编码的免疫原性片段为SEQ.ID NOS.17-40的序列。优选地，所述至少两条核酸分子是不同的是基于选自SEQ.ID NOS.1-10中的不同序列而言的。

能够理解的是，由于遗传密码的退化，编码特定多肽的核酸分子可以具有一系列的多核苷酸序列。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCT都编码氨基酸丙氨酸。

所述核酸分子可以为DNA或RNA或它们的派生物（derivatives）。

在本发明进一步的实施方式中，提供一种含有上述多肽、核酸分子或多肽的混合物或核酸分子的混合物的药物组合物。另外，所述药物组合物含有药学可接受的佐剂、稀释剂或赋形剂。在特定的实施方式中，所述药物组合物含有本发明的多肽和本发明的核酸分子的混合物。

典型的佐剂包括弗氏完全或不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、明矾、霍乱毒素和沙门氏菌毒素。特别优选的佐剂为GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor））。典型的稀释剂和赋形剂包括无菌水、生理盐水、培养液和磷酸缓冲液。

在某些实施方式中，所述多肽或核酸分子被连接到免疫原性载体（immunogeniccarrier）上。典型的免疫原性载体包括匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet haemocyanin）、牛血清白蛋白、卵清蛋白和鸡免疫球蛋白（fowl immunoglobulin）。

在一些实施方式中，所述药物组合物还含有其他的治疗成分，典型的其他治疗成分包括白细胞介素-2（IL2）、白细胞介素-12（IL12）、其他的端粒酶多肽（也就是说除上述讨论的多肽外的端粒酶的多肽）、化疗药物、止痛药、抗炎剂和其它的抗癌剂。

在一些实施方式中，提供含有共轭脂肽（lipopeptide conjugate）形式的多肽的药物组合物，众所周知，所述共轭脂肽能够诱导高亲和力的细胞毒素T细胞应答（Deres,1989,Nature 342）。

所述药物组合物另外组分的进一步详情可以从Remington’s PharmaceuticalSciences and US Pharmacopoeia,1984,Mack Publishing Company,Easton,PA,USA中找到。

在使用中，用以上解释的多肽、核酸分子、肽混合物、核酸分子混合物或药物组合物（下文中，“药剂”）对需要治疗的患者进行给药。可选择地，为了提供对癌症的防护免疫，在有任何癌症症状前用产品对个体进行给药。

在所述药剂含有多肽的实施方式中，所述多肽被抗原递呈细胞吞噬，可以经过抗原加工，然后在细胞表面上和MHC I类和II类分子以复合体的形式递呈。通过与T细胞表面上的T细胞受体的相互作用，引发CD4+或CD8+T细胞应答。在所述药剂含有核酸分子的实施方式中，所述核酸分子也被吞噬然后进行转录（如果所述核酸分子为DNA），并通过内源性细胞通路合成编码的多肽。随后，如前所述，所述编码的多肽经加工并在MHC分子上递呈以引发T细胞应答。因此所述药剂可以用作疫苗来引发CD4+或CD8+T细胞免疫。

原则上，可以使用所述药剂的任何给药方式，但优选注射。例如，可以将所述药剂直接注射到患者的肿瘤中。然而，在一些实施方式中，如果被治疗的癌症在患者的鼻子或嘴中，那么所述药剂通过喷射（spray）和吸入（inhalation）的方式进行给药。

所述药剂的合适剂量为50-200μg，尽管可以偶尔需要此范围外的剂量（例如，1-500μg）。优选在100和150μg之间的剂量。在一些实施方式中，每周或每月用所述药剂对患者进行给药。在某种实施方式中，追求“积极的（aggressive）”的治疗方案（regimen），该方案包括在第一周的治疗中用所述药剂给药3次，然后每周给药进行一个月，然后每月给药进行6个月，随之，每六个月进行单独给药。

原则上，遭受任何类型癌症（其中端粒酶基因是被激活的）的患者均可以使用所述药剂。这种癌症包括但并不限于乳腺癌（breast cancer）、前列腺癌（prostate cancer）、胰腺癌（pancreatic cancer）、结直肠癌（colorectal cancer）、肺癌（lung cancer）、恶性黑色素瘤（malignant melanoma）、白血病（leukaemias）、淋巴瘤（lymphomas）、卵巢癌（ovarian cancer）、宫颈癌（cervical cancer）和胆道癌（biliary tract carcinomas）。如前所述，在大多数癌症中均会表达端粒酶，所以，本发明的药剂的疗效并不限于任何特殊类型的癌症。

能够理解的是，根据引发的T-淋巴细胞应答的类型，优选不同长度的多肽。更特别地，为了引发CD8+T细胞应答，所述多肽必须在MHC I类分子上递呈，该MHC I类分子通常仅结合长度为8-10个氨基酸残基的多肽。另一方面，为了引发CD4+T细胞应答，需要所述多肽在MHC II类分子上递呈，因为所述多肽通常可以更长，通常的长度为15-24个氨基酸残基。注意到本发明的一些多肽（例如，SEQ.ID NO.1的多肽）长于通常结合于MHCI类或II类分子中的多肽的长度。这种长度的肽已显示能诱导更强烈的免疫应答，例如，通过在HPV和宫颈癌疫苗上的群组作用（groups working）（Welters等，2008）。不希望受到理论的约束，据信，用这种多肽对患者进行给药后，多肽被细胞吞噬，在蛋白酶体中经历蛋白质降解（proteolytic degradation），然后在MHC I类或II类分子上递呈。因此，这种多肽可以引发MHC I类和/或MHC II类分子限制性的T细胞应答。还能够注意到的是，较长的多肽比较短的多肽在患者中保留更长的一段时间，因此，所述多肽可以在较长的一段时间内引发免疫应答。这对于具有相对低的MHC亲和力的多肽尤为重要。

还能够理解的是，所述端粒酶为“自身蛋白（self protein）”，也就是说，所述酶在人体内是天然存在的蛋白。因此，个体通常通过加工产生对端粒酶的多肽某种程度上的免疫耐受性，从而在T细胞发育期间，个体胸腺中与这种多肽反应的T细胞被破坏。因此，在本发明的一些实施方式中，需要本发明的具有相对低的MHC亲和力的多肽。这是因为具有较低MHC亲和力的多肽将较低程度地与成熟的T细胞接触，所以，所有与所述多肽反应的个体的T细胞从个体的T细胞库（T-cell repertoire.）中被除去的可能性较低。因此，在一些实施方式中，具有相对低MHC亲和力的多肽能更容易的克服免疫耐受性。

在本发明的一些实施方式中，用本发明的一种多肽进行给药会导致“表位扩展（epitope spreading）”，从而引发对端粒酶蛋白的其他多肽的免疫应答，这与端粒酶蛋白中给药的多肽是相近的。

实施例

实施例1

接种hTERT转染的DCs之后，表征了患者的T细胞识别的hTERT表位。接种引起了涉及CD4+Th细胞和CD8+T细胞的多种且大范围的免疫应答。据信，这种应答对肿瘤消退（regression）起作用并在患者中观察到了长期的存活者。

材料和方法

患者

一名复发胰腺导管腺癌（ductal adenocarcinoma of the pancreas）的62岁的女性，在照顾性使用（compassionate use）的基础上给其接种载有hTERT mRNA的树突状细胞。该治疗由挪威药品局（Norwegian Medicines Agency）和医学研究伦理地区委员会（Regional Committee for Medical Research Ethics）批准，依照世界医药协会的《赫尔辛基宣言》（World Medical Association Declaration of Helsinki）执行，获得了患者的书面知情同意。

mRNA转染的DCs的制备

按照之前的描述（Kyte et al,2006 and Mu LJ et al 2003）生成DCs。简要地，将从白细胞去除术产物（leukapheresis product）中获得的单核细胞与粒细胞-巨噬细胞克隆刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素-4（IL-4）培养5天。通过方波电穿孔（square waveelectroporation）用hTERT-mRNA转染产生的未成熟的DCs（Kyte et al,2006,-Larssen S等，2002），然后与促成熟细胞因子（cytokines facilitating maturation）（白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNFα）和前列腺素-E₂（PGE2））培养2天。为得到充足的对照DCs，小部分DCs为虚拟转染，即，在不存在mRNA的情况下进行电穿孔。如前所述（Kyte等，2006），通过流式细胞术评估DC表型。具有成熟DC表型的DCs，表达HLA II类、CD86和CD83，但不表达CD14。通过台盼蓝染色（trypan blue staining）评估，所述DC的存活率（viability）大于85%。

第二批和第三批疫苗为快速DC（Alldawi等2005，Tanaka等2006，Ho等2006）。单核细胞与GM-CSF和IL-4培养2天，然后在电穿孔前用与培养常规DC相同的方法使其成熟1天，然后将DCs在过夜后进行冷冻。

疫苗

所述疫苗含有5×10⁶个载有hTERT mRNA的自体单核细胞来源的树突状细胞。所述患者接受4次每周一次的注射，随之每月一次的强化注射。

临床监控

如前所述（Kyte等，2006 Gene therapy），根据NCI-通用毒性标准（NCI-commontoxicity criteria），对不良反应进行记录和分级，仅观察到了轻微的副作用，没有与治疗相关的III–IV级毒性。在接种之前以及在接种期间的每3个月，通过临床检测和CT扫描评估目标肿瘤应答。根据实体肿瘤应答评估标准（Response Evaluation Criteria in SolidTumors（RECIST））对所述肿瘤应答进行分类（Therasse P等，2000）。

DTH

免疫监测(Immunomonitoring）

在四种标准接种前、5周后以及12周后获得外周血单核细胞（PBMCs）。还在每次每月一次的强化接种前获得PBMCs。如前所述（Kyte等，2005），分离和冷冻所述PBMCs。解冻的PBMCs在体外用tDCs（不用虚拟DCs）刺激一次并培养，然后如前所述（Kyte等2006），在T细胞增殖试验（³H胸苷）中进行测试，所述T细胞被测试3次。使用被辐射的tDCs和虚拟-转染的DC对照（虚拟DCs）或者有或没有hTERT肽的PBMC作为APCs，包括仅用T细胞的阴性对照。

用重叠hTERT 15-mer肽库或30-mer hTERT肽（均来自ProImmune）刺激来自不同时间点的PBMCs，并在增殖试验中进行测试，该测试使用如上述在（Bernhardt et al 2006）中描述的被辐射的PBMCs作为APCs。

流式细胞术

五聚体染色在新鲜的或冷冻的患者PBMCs上完成。由ProImmune制造藻红蛋白共轭五聚体（Phycoerythrin-conjugated pentamers）并检测对脉络丛脑膜炎病毒（CMV）肽NLVPMTATV特异性的HLA-A2阳性T细胞系的非特性染色，使用制造商推荐的工作剂量。使用带HIV肽SLYNTVATL-A*0201的五聚体作为阴性对照。在室温（RT）下使用五聚体对细胞染色10min，在包括含有0.1%人血清白蛋白（HSA）和0.1%叠氮化钠的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）的染色缓冲液中进行洗涤。然后在获取细胞前，细胞经抗-CD4-异硫氰酸荧光素（FITC）、抗-CD19-FITC（eBioscience）、抗-CD8-PerCP和抗-CD3-海水蓝（PB）（eBioscience）室温染色15min，在染色缓冲液中洗涤一次并重悬在相同的缓冲液中。对于胞内染色，12天肽刺激的T细胞在10ug/ml的布雷菲德菌素A（BD生物科学）和BD高尔基抑制剂（BD Golgistop，BD生物科学）的存在下刺激过夜，BD高尔基抑制剂用Epstein-Barr病毒转化的B淋巴母细胞（lymphoblastoid）细胞系（EBV-LCL）稀释1/1000倍，所述细胞系以肽和T细胞的目标比为5:1载有肽，未载肽的靶细胞和单独的T细胞作为阴性对照。然后根据制造商的说明书使用BDCytofix/Cytoperm试剂盒用CD3（eBioscience）、CD4、CD8、IFN-（eBioscience）、IL-2和TNF-α对细胞进行染色。最后，细胞重悬在含有1%多聚甲醛的染色缓冲液中。除非另行注明，用于胞内细胞因子染色的所有抗体和试剂均购自BD Pharmingen。使用BD LSR II流式细胞仪，每个样品获得了250000株淋巴细胞，并使用FlowJo软件（Treestar Inc.,Ashland,OR,USA）分析数据。

结果

通过吉西他滨（gemcitabine）治疗，患者的病得到稳定，但是5个月后由于副作用暂停了所述治疗。然后作为可选择的治疗，给她提供DC接种。接种18个月后，她的病得到了完全缓解并维持到了接种30个月后（诊断后44个月）。该患者由确诊管腺癌的能独立判断的病理学家进行复诊和检查。

不进行手术的胰腺癌患者平均存活时间（median survival）为8-10个月，在本例中远远超过了该时间。第一批疫苗包括5×10⁶个常规的DCs（Kyte et al2006），用15份疫苗对患者进行给药。由于对疫苗的免疫应答和稳定疾病的证实，制备了新批次的疫苗，且2批和3批为快速DC，分别用10和17份载有hTERT mRNA的5×10⁶个DCs的疫苗进行给药。

接种3个月后及稳定的6个月，可以在体外测定对DC疫苗增殖T细胞应答。证明了对hTERT转染的DCs的免疫应答的存在，希望研究哪个hTERT表位对诱导免疫应答起作用，这通过测量对hTERT肽库（图1）的T细胞增殖和体外PBMCs的五聚体染色进行测定。

在来自重叠肽库的6条15-mer hTERT肽和1条30-mer hTERT肽中检测到了增殖T细胞应答。接种前后，在未受刺激的PBMCS中均检测到了hTERT-五聚体阳性CD8+T细胞的存在，其百分比从0.15%到1.25%。接种24个月后，在新鲜的PBMCs中1.25%的CD8+T细胞群显示为五聚体阳性（图2A），并且在体外肽刺激后增长到了约3%（数据未示出）。

使用30-mer hTERT肽（含有至少两个T辅助表位和720GLL-五聚体中的CTL表位）在体外刺激一轮后，我们能检测到少量的多功能CD4+T细胞，载有相同肽的自体EBV-转染的B-细胞应答中分泌的IFN-γ，IL-4和TNF-α。载肽靶细胞刺激后的CD8+T细胞群与非载肽靶细胞刺激后的CD8+T细胞群相比没有区别（数据未示出）。观察到的IL-2的高背景水平可能是由于能表达hTERT的转染的B细胞系提供的一些刺激。不幸的是，由于每次实验中T细胞的量的限制，没能完成另外的功能试验。

讨论

在本实施例中，报道了具有特殊疾病过程的经化学疗法和接种hTERTmRNA转染的自体DC治疗的胰腺癌患者。

这里描述的患者在复发性胰腺癌根治手术（radical surgery）后已经生存了4年多。为了确认原始诊断的正确性，原发肿瘤由能独立判断的病理学家重新诊断。

2006年1月根治手术后，2006年12月所述患者旧病复发，通过CT评估伴随在肝门（liver hilus）、躯干髂肌（truncus iliacus）和在后腹腔（retroeritoneum）中的淋巴结肿大。

所述患者对显示肿瘤缩小的化学疗法和CT扫描反应良好。但是，化学疗法5个月后，患者发生了严重的不良反应，治疗停止。

在这种临床环境中，为了巩固化学疗法的有益效果，在照顾性使用的基础上给患者提供了载有hTERT mRNA的自体DC治疗。

有趣地，在化学疗法结束后，获得了长期的疾病稳定和潜在的完全缓解，而并没有发生进行性疾病。分开的两个连续6个月的PET扫描，显示了在胰腺癌和转移病灶（metastatic lesions）位点中新陈代谢沉默的肿瘤组织。这些吸引人的发现表明了使用的免疫疗法策略在患者中诱导了临床相关的免疫应答。因此，在患者中对hTERT的免疫应答的证明和深入研究是重要的。此外，由于完全缺乏来自使用全长hTERT mRNA接种研究中关于对hTERT详细的免疫应答的信息，因此，为了下一代hTERT疫苗的开发，鉴定临床相关的hTERT表位是重要的。

发现了具有新CTL表位的高频CD8+T细胞结合五聚体。这两个表位为HLA-A*0201限制性的并且之前未描述过。有趣地，9-mer表位（720GLL，SEQ.ID NO.3）被嵌入到15-mer肽（720，PGLLGASVLGLDDIH-SEQ.IDNO.55）中，这与Schroers等，2002之前描述的肽R672（SEQ.ID NO.56）长度相同，但在hTERT的C-端方向改变了一个氨基酸。因此，可能两条15-mer肽中相同的氨基酸残基对T细胞应答起作用。重要地，在增殖试验中，相同的15-mer肽（720）也被来自本文报道的患者的T细胞识别，表明了这种hTERT肽片段可以在这名患者中诱导CD4+和CD8+T细胞应答。此外，其它的5条15-mer肽被来自这名患者的T细胞识别了，这些肽中的三条之前未报道过。总之，这些结果证明了这种疫苗能够诱导对这名患者中至少10种不同的hTERT表位的T细胞应答。表位的数量可能还要多，因为仅使用了来自重叠肽库的有限数量的肽，并没有覆盖整个序列，并且仅很少的五聚体限于HLA-A*0201递呈的肽。

这表明了不存在对hTERT肽的广泛耐受性，并且使用hTERT mRNA转染的DCs的接种策略是有效的。

上述结果还证明了来自这名患者的T细胞能识别含有两条15-mer肽和1条9-mer肽的30-mer hTERT肽，同时产生3种Th1关联的细胞因子。之前已经证明了这种多功能性能够给予更好的感染防护。Darrah等，2007显示了通过同时产生干扰素-γ（IFN-、白细胞介素-2和TNF-α）的CD4⁺ T细胞的频率，预测了在接种的老鼠中对硕大利什曼原虫感染（Leishmania major）的防护程度。

这名患者非常异常的临床过程表明了接种和产生的免疫应答可能对肿瘤和转移产生影响。这是极有可能的，因为已经证明hTERT mRNA DC疫苗诱导了对hTERT广泛且复合的免疫应答。结果，对剩余肿瘤细胞的免疫攻击可能涉及由hTERT特异性的CTLs对肿瘤细胞的直接杀伤、T辅助细胞因子产物（IFN-γ，TNF-α）对癌细胞、肿瘤相关基质（tumour-associated stroma）、肿瘤新血管系统（tumour neovasculature）的作用以及腺瘤中存在的其它肿瘤抗原进行的自发免疫应答的扩增。这可能发生在hTERT特异性的Th细胞与MHCII类阳性抗原递呈细胞相遇时，所述MHC II类阳性抗原递呈细胞携带肿瘤抗原到原位或肿瘤引流淋巴结（draining lymph nodes）中。

实施例2

给一名IV期的肺癌患者接种了编码hTERT的mRNA转染的来自自体的单核细胞DC，以在开始新的I/II期临床试验前调查安全性、耐受性和免疫应答。该患者首先接受了四次每周一次的接种，随后每月一次的进行5×10⁶DC皮内注射的强化接种。在四次标准接种前、5周后、12周后和之后每月一次的接种后获得外周血单核细胞（PBMC）。解冻的PBMC在体外由转染的DC进行刺激。用辐射转染的DC和虚拟转染的DC作为对照完成T细胞的增殖试验，另外，通过五聚体染色监控hTERT特异性的CD8+T细胞。治疗对轻微的副作用耐受性良好，并且与预期的生存时间（12周）相比患者经历了延长的生存时间（72周）。接种后，患者在体外对载有mRNA的DC应答中显示了特异性的T细胞增殖。在接种后的样品中通过五聚体染色检测到稳定的hTERT特异性的CD8+T细胞群。进一步检测了来自接种后不同时间点的样品对一组24条重叠肽的抵抗，并且检测了对多条肽的T细胞应答（图12）。还在未接种的癌症患者和之前接种GV1001端粒酶肽（SEQ.ID NO.10）的癌症患者中鉴定到了对这些表位的T细胞应答，显示出高度的免疫原性和HLA混乱（HLA promiscuity）。这些在实施例1和2中的临床试验显示了接种hTERT-mRNA转染的DC是安全的，并且能诱导在CD4+和CD8+T细胞中对几种端粒酶T细胞表位的强烈免疫应答。

实施例3

为了鉴定能诱导有用的抗肿瘤免疫应答的肽，鉴定并按来自几名接种的患者（接种GV1001肽或编码hTERT的mRNA转染的树突状细胞）和未接种的患者的检查数据归类了适合诱导T细胞应答的端粒酶的肽。表9提供了所选患者的概要、接种状态和他们的临床应答。在一名接种GV1001（SEQ.ID NO.10）的患者中，在特定的时间点，对肽660-689（30-mer）（SEQ.ID NO.1）的T细胞应答比对疫苗肽本身的甚至更强烈（见图3），但也有其他患者显示出对这种疫苗肽的强烈免疫应答。在表1中列出了鉴定到的肽。在6名测试了反应性的正常血液供体中的任何一名中均未发现对这些肽的T细胞应答。

表1

还从患者中获得了对所有显示在表1中的15-或30-氨基酸的肽特异性的T细胞克隆。显示这些克隆来鉴定天然加工的肽（数据未显示）和对降到10ng/ml的非常低浓度的肽的应答（见图4），这意味着它们具有对它们靶点的高亲和力，为了能在较低肽浓度的体内诱导强烈的免疫应答这是重要的。

SEQ.ID NO.1的30-mer多肽在几乎所有测试的癌症患者中都显示了反应性，因此其似乎具有很强的免疫原性。这种肽即含有能够被如GV1001疫苗（SEQ.ID NO.10）的CD4+T辅助细胞识别的基序（motifs），也含有能被CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）识别的基序。来自肽刺激的患者的T淋巴细胞中，均在体外检测到了这两种类型的应答。

使用荧光标记的试剂（五聚体）能结合对上述9-或10-mer肽特异性的CD8+T淋巴细胞，在多数主要接种GV1001（SEQ.ID NO.10）的癌症患者中均检测到了这些细胞的存在。被HLA-A2分子（存在于约50%的白种人中）（图5）和HLA-B7分子（存在于20%的白种人中）（图6）递呈时能够检测到这些9-或10-mer肽，这意味着它们都存在于大部分的白种人中。

另外，列在表1中的15-和30-mer肽在几乎所有的测试患者中显示了反应性，这意味着对于递呈它们的HLA II类等位基因，它们是混杂的（promiscuous），并且它们适合于几乎所有的人群，而不需要任何HLA筛选（见表2）。

表2

在接种GV1001（SEQ.ID NO.10）的患者中同样诱导反应性，这些肽也诱导了在接种hTERT mRNA转染的树突状细胞的一名肺癌患者和一名胰腺癌患者的细胞中的T细胞应答。使用的mRNA不提供全长的hTERT肽的翻译，但覆盖了其大部分，并且表1中列出的肽在这些患者中诱导了最强烈的应答。

实施例4

确定了来自除实施例1和2中记载的患者外的5名患者的T细胞对hTERT肽库（包括表1中的多肽）的T细胞应答。方法和之前实施例1或Bernhardt等，2006中描述的相同。简言之，在增殖试验中测试特异性的T细胞应答前，用重叠hTERT肽库刺激来自接种期间的不同时间点的PBMCs。结果显示在图7-13中，表3中显示了肽的一览表。

表3

在图7-13中的柱状图显示了在7名患者（胰腺癌患者为实施例1中记载的患者）中对hTERT重叠肽库的应答。

肽613-627与GV1001（SEQ.ID NO.10）具有非常相似的序列，并且假定能被识别GV1001的同样的细胞识别，但是肽613-627与疫苗肽不同。

没有测试最后两名患者对30-mer 660-689（SEQ.ID NO.1）的应答，因为这种肽是在测试后合成的。SEQ.ID NO.1的肽在接种GV1001的肺癌患者中引起了很强烈的应答。从含有这种肽的培养基中获得的75%的T细胞克隆是特异性的，这表明了这种克隆在患者中以高频率存在，这与在图6的柱状图中显示hTERT-特异性的CD8+T细胞的患者为同一名肺癌患者。

根据他们特别的临床过程选择测试的患者（除了显示的未接种的患者），检测到的对表1列出的肽的强烈应答表明了这些肽是临床相关的表位。

实施例5

分析了预测结合不同HLA I类等位基因（使用MHC配体和肽基序的SYFPEITHI数据库完成预测）的免疫原性片段的SEQ.ID NO.1（30-mer660-689）的多肽的序列，结果见表4。

表4

实施例6

对实施例4中研究的患者进行了比较。简言之，癌症诊断和接种hTERT疫苗后，7名患者被认为是临床应答者（clinical responders）。基于延长的生存时间和临床应答的结合确定这些患者。临床应答可以是稳定的疾病（SD）、局部应答（PR）或完全应答（CR）。接种的黑色素瘤患者在包括临床试验时被诊断为IV期，但没有脑转移（brain metastases）；肺癌患者P5被诊断为IV期；不能动手术的肺癌和结肠癌患者P1（该患者为不能动手术的结肠癌晚期）；肺癌患者P6为预期寿命为12周的IV期肺癌患者；胰腺癌患者P1旧病复发，为不能动手术的胰腺癌且预期寿命为8-10个月。给其中四名患者（称为黑色素瘤P7-P8、肺癌P5和结肠癌P1）接种GV1001肽（SEQ ID NO.10）；给第五名患者（称为肺癌P6）和第六名患者（称为胰腺癌1）接种编码hTERT的mRNA转染的树突状细胞。第7名患者（黑色素瘤患者P9）在研究时未进行接种，而在癌症的发展中发生了自发的应答。（第八名即最后一名患者也被认为是临床应答者，但来自这名患者的样品未用于研究）。

然后如实施例1所示的确定每名患者对一系列肽的增殖T细胞应答。结果列于表5中并如图14所示，在图14中，引用表6中的肽名称（显示的肽726和GV1001的结果仅用于比较）。

表5

表6

前肽名称	序列号
		719-20	1
725	7
		718	8
728	9
		GV1001	10

观察到所有的患者对GV1001（即它们具有SI>2）都有应答。由于在接种树突状细胞的患者中（肺癌P7和胰腺癌P1）由自发MLC引起的高背景，SI值与其他患者的相比要低。

实施例7

研究了肺癌诊断和GV1001（SEQ ID NO.10）肽接种后的四名非临床应答者（clinical non-responders）。这些患者都是接种GV1001的IV期肺癌患者。与其他对疫苗产生免疫应答的患者相比，这些患者是从对GV1001产生免疫应答但仍患进行性疾病和短寿命的患者中随机选取的。在每个时间点通过与实施例1相同的方法确定每名患者对一系列肽的增殖T细胞应答。还显示了在研究阶段每名患者对肽GV1001的峰值应答，这确定了每名患者对GV1001接种发生了免疫地应答。

结果列于表7中并如图15所示，并引用表6中的肽名称。

表7

四名患者都对SEQ ID NOS.1、7、8和9的肽显示了很低的应答或未显示应答。

实施例8

研究了黑色素瘤诊断和GV1001肽（SEQ ID NO.10）接种后的六名非临床应答者。这些患者都是IV期黑色素瘤患者，并且都包括在相同的GV1001接种试验中，而黑色素瘤患者P7和P8为长期存活者（见实施例6）。这些患者是从对疫苗显示了免疫应答的患者中随机选取的，但仍只经历了短期的存活。其中5名患者还患有进行性疾病，且1名称为黑色素瘤患者P3的患者经相当的疾病稳定期后仍只有短期的存活时间。在一个时间点通过与实施例1相同的方法确定每名患者对一系列肽的增殖T细胞应答。还显示了在研究阶段每名患者对肽GV1001的峰值应答，这确定了每名患者对接种GV1001发生了免疫地应答。

结果列于表8中并如图16所示，并引用表6中的肽名称。

表8

六名患者都对SEQ ID NOS.1、7、8和9的肽显示了很低的应答或未显示应答。

实施例1-8的结论

表9中提供了在实施例1-8中研究的患者的概况。所有患者都对GV1001肽发生了免疫地应答。根据患者的临床应答（包括稳定的疾病（SD）、肿瘤退化（PR或CR）和出人意料的长的存活时间），将这些患者分为临床应答者或非临床应答者。临床应答者和非临床应答者选自相同或相似的接种试验中。

表9

+表示患者仍存活

PD=进行性疾病

SD=稳定的疾病

PR=局部应答

CR=完全应答

TTP=进展时间（time to progression）

这里显示的数据有力地表明了用SEQ.ID NOS.1-9的任何肽对个体进行给药均将至少在某些个体中诱导对给药的肽的T细胞应答。在用其它hTERT肽疫苗或转染的树突状细胞进行给药的患者中对SEQ.ID NOS.1-9的肽的T细胞应答的存在证明了SEQ.ID NOS.1-9的肽可以被患者的MHC分子结合与递呈，并且证明了当肽被递呈时，患者具有的T细胞能够与肽结合。因此，当用SEQ.ID NOS.1-9的肽对个体进行给药时，对所述肽的T细胞应答是可以预期的。

此外，实施例6-8中提供的数据证明了本文描述的对SEQ ID NOS.1、7、8和9的hTERT肽的T细胞应答与不同类型癌症患者中的有利临床应答相关。在一些以同样的方式通过hTERT疫苗治疗并对该疫苗产生应答的短期存活者中，只零星地观察到对SEQ ID NOS.1、7、8和9的hTERT肽的应答。同样注意到的是，其中的一些短期存活者对肽GV1001的应答是强烈的。我们理解这些结果意味着单独对单一肽（即GV1001）的应答不足以提供临床应答/长期存活，因为大部分具有对这种肽的免疫应答的患者存活时间很短。

这通过显示在图17中的散点图分析确定，图17比较了已证明产生免疫应答的患者的hTERT肽的数量与患者的存活时间。如图17所示，较长的存活时间与对较多数量的hTERT肽的免疫应答有明显的相关性。

另外，显示在图18中的分析证明了与对除GV1001的0条或1条hTERT肽显示出免疫应答的患者相比，对除GV1001的2条以上条hTERT肽的产生应答的患者具有统计学意义上增长的生存时间。

而且，本文公开的数据提供了有力的证据表明在有利的免疫应答中SEQID NOS.1、7、8和9的hTERT肽具有重要的作用。因此，与单独接种GV1001肽相比，这些新型肽在更多的患者中引发了临床相关的免疫应答且因此使得较高比例的患者的生存时间得到延长。

我们证明了在临床应答者中对SEQ ID NOS.1、7、8和9的肽的应答在接种无关的肽后自然上升，这与临床表现不好的患者相反。据信这种自然免疫背后的机理是这些肽通过抗原递呈细胞的递呈，所述抗原递呈细胞吞噬携带hTERT的死亡肿瘤细胞并通过它的蛋白水解作用加工hTERT肽来产生一组自然加工的hTERT肽，该肽对应于本文描述的SEQ IDNOS.1、7、8和9的肽。证明了取自患者的T细胞能够识别多种相同的肽，该患者已经免疫接种了hTERT mRNA转染的抗原递呈细胞（树突状细胞），并且这些患者在接种后表现特别好，进一步强化了这种观念。通过接种本发明的已经临床确认的肽或这种肽的混合物能够促进或诱导这些应答，将可能在更大比例的患者中诱导临床应答和延长生存时间。

实施例9

还检测了实施例1-8的结果中最有效的肽的组合，因此组合适当的肽以产生肽的混合物。观察到SEQ.ID NOS:1、7和9的肽由于以下原因具有互补效应。

表10中显示了每条SEQ.ID NOS:1、7和9的MHC结合基序和序列的免疫原性片段。

表10

肽	序列	MHC结合基序
			SEQ ID NO.1	ALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRA	Th(HLA-DR*01、04、07、15)
	SVLNYERARRPGLLG	Th(HLA-DR*01、04、07、15)
				FSVLNYERARRPGLL	Th(HLA-DR*01、04、07、15)
	ARRPGLLGASVLGLD	Th(HLA-DR*01、04、07、15)
				RARRPGLLGASVLGL	Th(HLA-DR*01、04、07、15)
	VLNYERARRPGLLGA	Th(HLA-DR*01、04、07、15)
				RPGLLGASVLGLDDI	Th(HLA-DR*01、04、07、15)
	VLNYERARRPGLLGA	Th(HLA-DR*01、04、07、15)
				GLLGASVLGL	CTL(HLA-A2、-B7)

肽	序列	MHC结合基序
				GLLGASVLG	CTL(HLA-A2、-B7)
	LLGASVLGL	CTL(HLA-A2、-B7)
				ALFSVLNYE	CTL(HLA-A2、-B7)
	RPGLLGASVL	CTL(HLA-A2、-B7)
				RPGLLGASV	CTL(HLA-A2、-B7)
SEQ ID NO.7	RTFVLRVRAQDPPPE	Th(HLA-DR*01、11、15)
				RVRAQDPPPE	CTL(HLA-A3)
	FVLRVRAQD	CTL(HLA-A3)
			SEQ ID NO.9	AERLTSRVKALFSVL	Th(HLA-DR*03、11)
	RLTSRVKAL	CTL(HLA-A2、-A3、-B44)
				RVKALFSVL	CTL(HLA-A2、-A3、-B44)
	AERLTSRVK	CTL(HLA-A2、-A3、-B44)
				ERLTSRVKAL	CTL(HLA-A2、-A3、-B44)

从表10可以看出，SEQ.ID NOS:1、7和9的肽和它们的免疫原性片段能结合广泛的递呈Th或CTL表位的HLA分子。因此，这些肽能在非常广泛的患者群中产生免疫应答。

另外，证明了SEQ.ID NOS:1、7和9的肽在实施例6中记载的临床应答者患者中具有免疫原性，并且在临床应答者中比非临床应答者中具有相对更强烈的免疫应答。

更具体地，对于SEQ ID NO 1的肽，与在1/10的非临床应答者中存在免疫应答相比，在7/7的临床应答者中存在免疫应答。通过五聚体分析，一些应答的长期存活者还显示了CTL应答。

对于SEQ ID NO 7的肽，与在1/10的非临床应答者中存在免疫应答相比，在5/7的临床应答者中存在免疫应答。

对于SEQ ID NO:9的肽，与在0/10的非临床应答者中存在免疫应答相比，在3/7的临床应答者中存在免疫应答，除了其中3名患者的五聚体分析显示CTL应答外，3名中的1名还显示出增殖应答。

因此，结果的分析证明了SEQ.ID NOS:1、7和9的肽的混合物预期在广泛的人群中具有高水平的疗效。

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Claims

1.一种多肽，该多肽的序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示。

2.一种核酸分子，该核酸分子由编码权利要求1所述的多肽的核苷酸序列组成。

3.一种多肽的混合物，该多肽的混合物含有至少第一和第二不同的多肽，其中，第一多肽为权利要求1所述的多肽，第二多肽包括选自由SEQ ID NOS. 2-7所组成的组中的序列：

其中，各条多肽在长度上小于100个氨基酸。

4.一种多肽的混合物，该多肽的混合物含有至少第一和第二不同的多肽，其中，第一多肽为权利要求1所述的多肽，第二多肽包括选自由SEQ ID NOS. 1、7、8、9和10所组成的组中的序列：

其中，所述多肽在长度上小于100个氨基酸。

5.根据权利要求4所述的多肽的混合物，其中，所述至少第一和第二不同的多肽包括序列如SEQ ID NO. 1所示的多肽、具有SEQ ID NO. 7的序列的多肽以及具有SEQ ID NO. 9的序列的多肽的混合物：

其中，各条多肽在长度上小于100个氨基酸。

6.一种核酸分子的混合物，该核酸分子的混合物含有至少第一和第二不同的核酸分子，其中，第一核酸分子由编码权利要求1所述的多肽的核酸序列组成，第二核酸分子由编码以下多肽的核酸序列组成，该多肽包括选自由：SEQ ID NOS. 2-7所组成的组中的序列：

其中，所述多肽在长度上小于100个氨基酸。

7.一种核酸分子的混合物，该核酸分子的混合物含有至少第一和第二不同的核酸分子，其中，第一核酸分子由编码权利要求1所述的多肽的核酸序列组成，第二核酸分子由编码多肽的核酸序列组成，所述多肽包括选自由SEQ ID NOS. 1、7、8、9和10所组成的组中的序列：

其中，所述多肽在长度上小于100个氨基酸。

8.根据权利要求7所述的核酸分子的混合物，其中，所述至少第一和第二不同的核酸分子包括由编码序列如SEQ ID NO. 1所示的多肽的核酸序列组成的核酸分子、由编码具有SEQ ID NO. 7的序列的多肽的核酸序列组成的核酸分子，以及由编码具有SEQ ID NO. 9的序列的多肽的核酸序列组成的核酸分子的混合物：

其中，各条多肽在长度上小于100个氨基酸。

9.一种药物组合物，该药物组合物含有权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3-5中任意一项所述的多肽的混合物或权利要求6-8中任意一项所述的核酸分子的混合物以及药学可接受的佐剂、稀释剂或赋形剂和可选择的其他治疗成分。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，所述多肽、核酸分子、多肽的混合物或核酸分子的混合物的含量在1-500µg之间。

11.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，所述多肽、核酸分子、多肽的混合物中的多肽、或核酸分子的混合物中的核酸分子与免疫原性载体连接。

12.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，所述多肽或多肽的混合物中的多肽与其它物质相连。

13.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，多肽或多肽的混合物中的多肽以共轭脂肽的形式存在。

14.权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3-5中任意一项所述的多肽的混合物、权利要求6-8中任意一项所述的核酸分子的混合物或权利要求9-13中任意一项所述的药物组合物在制备治疗或预防表达端粒酶的癌症的药物中的用途，

其中，所述癌症选自由：肺癌、黑色素瘤、结肠癌和胰腺癌组成的组中。