CN102574906A

CN102574906A - T细胞受体

Info

Publication number: CN102574906A
Application number: CN2010800351402A
Authority: CN
Inventors: B·K·雅各布森; N·哈伍德; N·R·利迪
Original assignee: Avidex Ltd
Current assignee: Avidex Ltd
Priority date: 2009-07-03
Filing date: 2010-07-01
Publication date: 2012-07-11
Also published as: MX2012000155A; NL301193I2; NL301193I1; CN104017067A; ZA201109522B; US9068178B2; CA2766505A1; GB0911566D0; EA201270135A1; PT2448963E; US8519100B2; EA026918B1; US20120225481A1; CN104017067B; JP2016039812A; CA2766505C; BR112012000107A2; HK1169422A1; AU2010267758A1; WO2011001152A1

Abstract

一种T细胞受体(TCR)，其具有结合gp 100YLEPGPVTA肽-HLA-A2复合物的特性并包含TCR α可变域和/或TCR β可变域，其特征在于：(i)相对于具有胞外α和β链序列SEQ ID No：2和3的TCR，所述TCR在SEQ ID No：2所示其α链可变域氨基酸1到109和/或在SEQ ID No：3所示其β链可变域氨基酸1到112发生突变；和(ii)所述α可变域与SEQ ID No：2的氨基酸序列1到109有至少90％序列相同性，和/或所述β可变域与SEQ ID No：3的氨基酸序列1到112有至少90％序列相同性；和(iii)所述TCR对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期是参比TCR的至少两倍，所述参比TCR具有胞外α链序列SEQ ID No：45和胞外β链序列SEQ ID No：46。还描述了此类TCR在过继性治疗中的应用，和此类TCR与治疗剂的融合体。

Description

T细胞受体

本发明涉及结合YLEPGPVTA肽(衍生自gp100蛋白)的T细胞受体(TCR)，所述肽以肽-HLA-A2复合物呈递，相对于天然gp100 TCRα和/或β可变域，所述TCR发生突变并且对所述复合物的结合亲和力和/或结合半衰期至少是参比gp100 TCR的两倍。

发明背景

YLEPGPVTA(SEQ ID No：1)肽对应于人糖蛋白100(gp100)的氨基酸残基号280-288。Gp100在黑色素瘤癌细胞上广泛而显著地过量表达。例如，一项研究(Trefzer等.，(2006)Melanoma Res.16(2)：137-45)发现28位黑色素瘤患者的192例黑色素瘤转移灶中有82％表达gp100。几项研究报道了黑色素瘤组织中gp100表达水平较高(Hofbauer等.，(2004)J Immunother.27(1)：73-8，Barrow等.，(2006)Clin Cancer Res.12：764-71)。YLEPGPVTA(SEQ ID No：1)肽由gp100⁺/HLA-A2癌细胞上的I类HLA分子呈递。(Salgaller等.，(1996)Cancer Res 56：4749-4757)。

因此，YLEPGPVTA HLA-A2复合物提供本发明TCR能靶向的癌症标记物。例如，本发明TCR可用于将细胞毒性剂递送至癌细胞的目的，或可转化入T-细胞，从而使得它们能破坏呈递HLA复合物的肿瘤细胞，以便在称为过继性治疗的治疗过程中给予患者。然而，为前一目的，如果TCR具有较高的亲和力和/或较慢的解离速率，从而该TCR能长期驻留在所靶向的肿瘤细胞上，则是理想的。为后一目的，如果TCR对肽-HLA复合物相比于具有该复合物特异性的天然TCR具有较高的亲和力和/或较低的解离速率，但不如前一目的的亲和力那样高，则是理想的。亲和力的急剧增加与TCR基因-修饰的CD8T细胞中抗原特异性丧失相关，从而能导致这些TCR-转染CD8T细胞的非特异性激活，因此中等亲和力TCR是过继性治疗所优选的(参见Zhao等.，(2007)J Immunol.179：5845-54；Robbins等.，(2008)JImmunol.180：6116-31；还参见公布的WO 2008/038002)。本发明提供此类TCR。

采用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名法描述TCR，将其与TCR序列的IMGT公开数据库相关联。天然α-β异源二聚TCR具有α链和β链。广义上，各链包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但该多变区常视作连接区的一部分。各可变区包含嵌合在框架序列中的3个CDR(互补决定区)，其中一个是称为CDR3的超变区。根据框架、CDR1和CDR2序列以及部分确定的CDR3序列，α链可变(Vα)区可分成几类，β链可变(Vβ)区可分成几类。在IMGT命名法中，通过唯一的TRAV编号指代Vα类型。因此，“TRAV17”限定了具有独特框架及CDR1和CDR2序列和CDR3序列的TCR Vα区，所述CDR3序列部分由TCR之间保守性的氨基酸序列确定，但其还包含TCR之间不同的氨基酸序列。“TRBV19”以相同方式限定了具有独特框架及CDR1和CDR2序列的TCR Vβ区，但仅包含部分确定的CDR3序列。

通过独特的IMGT TRAJ和TRBJ命名法类似地确定TCR的连接区，通过IMGT TRAC和TRBC命名法确定恒定区。

IMGT命名法通过缩写TRBD指代β链多变区，如上所述，连锁的TRBD/TRBJ区常一起视作连接区。

αβTCR的α和β链常视作各自具有两个“结构域”，即，可变域和恒定域。可变域由连锁的可变区和连接区构成。因此，在本申请的说明书和权利要求书中，术语“TCR α可变域”指连锁的TRAV和TRAJ区，术语TCR α恒定域指胞外TRAC区或C-末端截短的TRAC序列。类似地，术语“TCR β可变域”指连锁的TRBV和TRBD/TRBJ区，术语TCR β恒定域指胞外TRBC区或C-末端截短的TRBC序列。

TCR领域的工作人员广为知晓并可得到IMGT命名法确定的独特序列。例如，可在IMGT公开数据库中找到。“《T细胞受体手册(T cell receptorFactsbook)》”，(2001)，LeFranc和LeFranc，学术出版社(Academic Press)，ISBN 0-12-441352-8还公开了IMGT命名法确定的序列，但由于其公布日期和随后的时间滞后，有时需要参考IMGT数据库验证其中的信息。

我们证实了天然gp 100 TCR克隆具有以下α链和β链V、J和C基因应用：

α链-TRAV17/TRAJ29/TRAC(天然gp100 TCR α链的胞外序列见SEQID No：2)。

β链：-TRBV19*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2(天然gp100 TCR β链的胞外序列见SEQ ID No：3)。(注意：TRBV19序列具有3个等位基因变体，在IMGT命名法中分别称为TRBV19*01、*02和*03，上述天然gp100TCR克隆具有*01变异。同样，TRBJ2-7序列具有两个已知的变异，上述TCR克隆中存在的是*01序列。还应注意，缺乏”*”限定符表示相关序列仅已知一种等位基因。)

术语“野生型TCR”、“天然TCR”、“野生型gp100 TCR”和“天然gp100TCR”在文本同义使用，指代具有胞外α和β链SEQ ID No：2和3的该天然产生的TCR。

发明详述

本发明提供具有结合YLEPGPVTA(SEQ ID No：1)HLA-A2复合物特性的包含TCR α可变域和/或TCR β可变域的T细胞受体(TCR)，其特征在于所述TCR(i)相对于具有胞外α和β链序列SEQ ID No：2和3的天然gp100TCR，在其α链可变域(SEQ ID No：2的氨基酸1-109)和/或其β链可变域(SEQ ID No：3的氨基酸1-112)中发生突变；和(ii)对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期是参比gp100 TCR的至少两倍，所述参比gp100 TCR具有胞外α链序列SEQ ID No：45和胞外β链序列SEQ ID No：46。

注意，SEQ ID No：45是天然α链胞外序列ID No：2，除了C157取代了T157(即，TRAC的T48)和K113取代了N113。类似地，SEQ ID No：46是天然β链胞外序列ID No：3，除了C169取代了S169(即，TRBC2的S57)，A187取代了C187，D201取代了N201。相比于天然α和β链胞外序列，这些半胱氨酸取代能形成稳定重折叠的可溶性TCR的链间二硫键，即，通过重折叠胞外α和β链形成的TCR。利用稳定的二硫键连接的可溶性TCR作为参比TCR能更方便地评估结合亲和力和结合半衰期。与天然α和β链SEQ ID No：2和3相比，α链SEQ ID No：45和β链SEQ ID No：46中的其它突变是“沉默突变”，意味着相对于天然序列，它们不影响结合亲和力或结合半衰期。因此，如果本发明TCR对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期是参比gp100 TCR的至少两倍，其还隐含符合上述天然gp100 TCR克隆的那些标准。

下文中“具有胞外α链序列SEQ ID No：45和胞外β链序列SEQ ID No：46的参比gp100 TCR”与“参比TCR”或“参比gp100 TCR”同义。

可通过任何合适的方法测定结合亲和力(与平衡参数K_D成反比)和结合半衰期(表示为T1/2)。应该了解，TCR的亲和力翻倍导致K_D减半。T1/2计算为ln2除以解离-速率(k_off)。因此，T1/2翻倍导致k_off减半。TCR的K_D和k_off值通常检测为TCR的可溶性形式，即，截短以除去疏水性跨膜结构域残基的那些形式。因此，应该了解，给定的TCR符合以下要求，即，其对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物具有结合亲和力和/或结合半衰期，如果可溶形式的该TCR符合该要求的话。优选采用相同的试验方案检测给定TCR的结合亲和力或结合半衰期数次，例如3次或更多次，取结果的平均值。在优选的实施方式中，采用本文实施例3的表面等离振子共振(BIAcore)方法进行这些检测。该方法检测到参比gp100 TCR的K_D约为19μM，k_off约为1s^-1(即，T1/2约为0.7s)。

如本文所述，YLEPGPVTA是在HLA A2复合物中呈递的天然gp100_280-288肽。然而，众所周知，略作修饰形式的该肽(YLEPGPVTV(SEQ ID No：6))显示对HLA-A2的结合增强，从而增加了肽-HLA复合物的稳定性(Salgaller等.(1996)Cancer Res 56：4749-57)。因此，变体YLEPGPVTV肽-HLA-A2复合物更适于评估能结合YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的潜在TCR的试验工作。此类TCR结合两类肽HLA复合物的K_D和T1/2和基本上相似。

本发明TCR对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的亲和力和/或结合半衰期是参比gp100 TCR的至少两倍，同时保留了可接受的YLEPGPVTA-HLA-A2复合物特异性，例如，与参比gp100 TCR相似。通常，相比于参比gp 100 TCR，需要作为靶向剂以便将治疗剂，例如细胞毒性或免疫效应剂递送至呈递HLA复合物的细胞的TCR对所述YLEPGPVTA-HLA-A2复合物应具有高很多的亲和力和/或长很多的结合半衰期。如果TCR需要为过继性治疗转染T-细胞，通常要求，例如较低的亲和力和/或较短的结合半衰期(虽然仍分别是参比TCR那些值的至少两倍)。

例如，本发明的TCR对复合物的K_D可以是≤8μM、≤5μM、≤1μM、≤0.1μM、≤0.01μM、≤0.001μM或≤0.0001μM和/或对复合物的结合半衰期(T1/2)可以为≥1.5s、≥3s、≥10s、≥20s、≥40s、≥60s、≥600s或≥6000s。

出于本发明的目的，TCR是具有至少一个TCR α和/或TCR β可变域的部分。它们通常同时包含TCR α可变域和TCR β可变域。它们可以是αβ异源二聚体或是单链形式。为用作靶向剂以便将治疗剂递送至抗原呈递细胞，αβ异源二聚TCR可以是可溶形式(即，不具有胞质结构域的跨膜区)。对于稳定性而言，此类可溶性TCR优选在各恒定域的残基之间引入二硫键，例如WO03/020763中所述。可在一个或多个C末端截短本发明αβ异源二聚体中存在的一个或两个恒定域的，例如最多15、或最多10或最多8个或更少的氨基酸。为用于过继性治疗，可将αβ异源二聚TCR，例如，作为具有胞质和跨膜结构域的全长链转染。如果需要，各恒定域的残基之间可存在引入的二硫键(参见，例如WO 2006/000830)。为用作靶向剂将治疗剂递送至抗原呈递细胞，可溶性TCR可以是单链形式。这些可包括Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ或Vα-L-Vβ-Cβ类型的αβTCR多肽，其中Vα和Vβ分别是TCR α和β可变区，Cα和Cβ分别是TCRα和β恒定区，L是接头序列。过继性治疗可利用全长TCR序列，其掺入跨膜域同时作为天然二硫键和引入的二硫键形式，或作为单链TCR构建物；或/和与其相似的变化形式。

无论何种形式，与具有胞外α和β链序列SEQ ID No：2和3的天然gp100TCR相比，本发明TCR在其α可变域(从SEQ ID No：2的S1延伸到A109)和/或β可变域(从SEQ ID No：3的D1延伸到T112)发生突变。天然gp100TCR或参比gp100 TCR可用作模板，其中引入各种突变导致本发明TCR与YLEPGPVTA-HLA-A2复合物之间相互作用的亲和力高和/或解离速率慢。本发明的实施方式包括与从SEQ ID No：2的S1延伸到A109的α链可变域和/或从SEQ ID No：3的D 1延伸到T112的β链可变域相比，在至少一个互补决定区(CDR)和/或可变域框架区中突变的TCR。

可采用任何合适的方法进行突变，包括但不限于依据聚合酶链式反应(PCR)的那些、依据限制性酶的克隆或不依赖连接的克隆(LIC)方法。许多标准分子生物学教材详述了这些方法。聚合酶链式反应(PCR)诱变和依据限制性酶的克隆的更多细节可参见Sambrook和Russell，(2001)《分子克隆-实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)》(第3版)CSHL出版社。LIC方法的更多信息可见(Rashtchian，(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1)：30-6)。

产生本发明的高亲和力gp100 TCR的一种方法是从展示此类TCR的噬菌体颗粒的多样性文库中选择，例如WO 2004/044004所公开的。

应该注意，包含与参比gp100TCR相似的Vα和Vβ基因使用和由此的可变域氨基酸序列的任何αβTCR均可制备方便的模板TCR。然后可以在编码模板αβTCR的一个或两个可变域的DNA中引入产生本发明的突变型高亲和力TCR所需的改变。本领域技术人员不难了解，可通过许多方法，例如定点诱变来引入必需的突变。

本发明的优选TCR包括其α可变域与SEQ ID No：2的氨基酸序列1-109具有至少90％(例如，至少93％和优选至少94％)序列相同性(即，不到10％(或不到7％或优选不到6％)的天然Vα结构域的残基发生改变)，和/或其β可变域与SEQ ID No：3的氨基酸序列1-112具有至少90％(例如，至少93％和优选至少94％)序列相同性(即，不到10％(或不到7％或优选不到6％)的天然Vβ结构域的残基发生改变)的那些。单个改变包括单个插入、缺失或突变。可通过，例如手工或利用计算机程序进行序列比对来测定序列相同性。

在一些实施方式中，本发明TCR具有从SEQ ID No：2的S1延伸至A109的α链可变域，除了94D、97L、98V或102G位中一个或多个的氨基酸残基发生突变，和/或具有从SEQ ID No：3的D1延伸至T112的β链可变域，除了27L、28N、29H、30D、31A、50Q、51I、52V、53N、54D、61A、94S、95I、96g、97G、98P或100E位中一个或多个的氨基酸残基发生突变。例如，本发明的TCR可具有α链可变域氨基酸残基94S、94T、94R、97M、98M、98Q、98G、98S、98A或102D中的一个或多个(利用SEQID No：2所示编号)和/或β链可变域氨基酸残基27I、28F、29Q、30K、31K、50W、51A、51G、52Q、52Y、52T、53G、53F、54N、54H、61T、94L、95Y、95H、95W、95F、95S、95V、96C、97E、97A、98G、100Q或100P中的一个或多个(利用SEQ ID No：3所示编号)。

本发明的特异性TCR包括含有α链可变域氨基酸序列SEQ ID No：7、8和9之一和/或β链可变域氨基酸序列SEQ ID No：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35之一的那些。因此，含有野生型α链的可变域序列(SEQ IDNo 2的S1-A109)的TCR可与具有SEQ ID No：10-35之一的β链结合。或者，具有SEQ ID No：7-9之一的α链可与野生型β链的可变域序列(SEQ IDNo 3的D1-T112)结合。或者具有SEQ ID No：7-9之一的α链可与具有SEQID No：10-35之一的β链结合。

就靶向应用，主要是它们的高亲和力和缓慢解离速率(即，长半衰期)而言，目前优选的可溶性TCR是包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID No：8(X＝S或A或G)和β链可变域氨基酸序列SEQ ID No：27的那些。此类优选的TCR宜是αβ异源二聚体形式，即，包含TRAC和TRBC结构域。如本文所述，可在一个C-末端或两个C-末端截短此类TRAC和TRBC结构域。例如，可通过删除最多15，或最多10或最多8或更少的氨基酸来截短参比TCRα链的恒定域的C-末端。

上述TCR的表型沉默变体也构成本发明的一部分。术语“表型沉默变体”所指TCR的序列与本发明TCR相同，除了在恒定和/或可变域中掺入改变，但所述改变不会改变与肽-HLA复合物相互作用的亲和力和/或解离速率。此类变体的一个例子是本发明TCR，其中采用SEQ ID NO：2的编号，该TCR α恒定域含有取代130丝氨酸(S)氨基酸残基的苯丙氨酸(F)氨基酸残基。

如上所述，本发明的αβ异源二聚TCR可在它们的恒定域之间引入二硫键。该类型的优选TCR包括具有TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列的那些，除了TRAC的Thr 48和TRBC1或TRBC2的Ser 57被半胱氨酸残基替代，所述半胱氨酸在TCR的TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列之间形成二硫键。

含或不含上文所述的引入的链间键，本发明的αβ异源二聚TCR均可具有TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列，TCR的TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列可通过TRAC的外显子2的Cys4和TRBC1或TRBC2的外显子2的Cys2之间的天然二硫键相连。

如本文所述，本发明的可溶性TCR可与可检测标记物(为诊断目的，其中所述TCR用于检测呈递YLEPGPVTA HLA-A2复合物的细胞的存在)；治疗剂；PK修饰部分(例如，通过PEG化)；或以上的组合结合(共价或其它方式)。

用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI或CT造影剂、或产生可检测产物的酶。

可与本发明TCR结合的治疗剂包括但不限于：放射性化合物、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)、毒素(例如，假单胞菌外毒素，如PE38、卡西霉素(calcimycin)或白喉毒素)、免疫调节抗体片段(例如抗-CD3或抗-CD16)、或免疫调节细胞因子(例如，IL-2)。为确保在所需位置施加毒性效应，毒素可以在连接于TCR的脂质体内，从而使该化合物缓慢释放，或者通过不稳定的接头将毒素偶联于TCR。如此可防止在体内转运期间的破坏作用，确保TCR与相关抗原呈递细胞结合后毒素具有最大作用。

其它合适的治疗剂包括：

●小分子细胞毒性剂，即，能杀伤哺乳动物细胞、分子量低于700道尔顿的化合物。此类化合物还能含有能具有细胞毒性效应的毒性金属。此外，应该了解，这些小分子细胞毒性剂还包含前药，即，在生理条件下分解或转化以释放细胞毒性剂的化合物。此类试剂的例子包括顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡奇霉素、多西他赛、依托泊甙、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、卟吩姆钠(sorfimer sodium)光敏素II、替莫唑胺、拓扑替康、葡糖醛酸三甲曲沙、耳他汀(auristatin)E、长春新碱和阿霉素；

●肽细胞毒素，即，能杀伤哺乳动物细胞的蛋白质或其片段。例如，蓖麻毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌细菌内毒素A、DNA酶和RNA酶；

●放射性核素，即，元素的不稳定同位素，其在衰减的同时发出一种或多种的α或β粒子，或γ射线。例如，碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213；可利用螯合剂促进这些放射性核素与高亲和力TCR或它们的多聚体的结合；

●免疫刺激剂，即，刺激免疫应答的免疫效应分子。例如，细胞因子，如IL-2和IFN-γ；

●超抗原及其突变体；

●TCR-HLA融合体，其中所述HLA决定免疫原性抗原；

●趋化因子，例如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白，等；

●抗体或其片段，包括抗-T细胞或NK-细胞决定抗体(例如，抗-CD3或抗-CD28或抗-CD16)；

●补体激活物；

●异种蛋白结构域、同种异体蛋白质结构域、病毒/细菌蛋白结构域、病毒/细菌肽。

一个优选的实施方式是与抗-CD3抗体或所述抗-CD3抗体的功能片段或变体结合的本发明TCR。适用于本文所述组合物和方法的抗体片段和变体/类似物包括但不限于：小抗体(minibody)、Fab片段、F(ab’)₂片段、dsFv和scFv片段、或其它抗体支架蛋白，例如Nanobodies^TM(由比利时阿比林公司(Ablynx)投入市场的这些构建物包含源自驼科动物(例如骆驼或美洲驼)抗体的合成单一免疫球蛋白可变重链结构域)、结构域抗体(由比利时多曼提斯公司(Domantis)投入市场，包含亲和力成熟的单一免疫球蛋白可变重链结构域或免疫球蛋白可变轻链结构域)、UniBodies(由金迈公司(Genmab)投入市场，UniBodies是修饰的全人IgG4抗体，其中删除了该抗体的绞链区)、三功能抗体(具有两种不同抗原的结合位点的单克隆抗体)、Affibodies(由昂飞公司(Affibody)投入市场，Affibodies依据58-氨基酸残基的蛋白质结构域，其为一个三螺旋束结构域，源自葡萄球菌A蛋白的IgG-结合域之一)、抗脂质运载蛋白(从人脂质运载蛋白合成的抗体模拟物，其还能构建成双靶向蛋白质，即，所谓的双脂质运载蛋白(Duocalins))或DARPins(设计的锚蛋白重复蛋白)(其是依据重复蛋白，例如锚蛋白或富含亮氨酸重复蛋白的抗体模拟物的另一例子，它们是普遍存在的结合分子)。

更具体的本发明TCR-抗CD3融合体包括选自下组的TCR α链氨基酸序列：

(i)TCR α链序列SEQ ID No：45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No：8替代，其中1位的氨基酸是S；

(ii)TCR α链序列SEQ ID No：45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No：8替代，其中1位的氨基酸是A；

(iii)TCR α链序列SEQ ID No：45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No：8替代，其中1位的氨基酸是G；

(iv)TCR α链序列SEQ ID No：45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No：8替代，其中1位的氨基酸是S，依据SEQ ID No：45的编号，该α链的C-末端从F196到S203截短8个氨基酸(包括端点)；

(v)TCR α链序列SEQ ID No：45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No：8替代，其中1位的氨基酸是A，依据SEQ ID No：45的编号，该α链的C-末端从F196到S203截短8个氨基酸(包括端点)；

(vi)TCR α链序列SEQ ID No：45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No：8替代，其中1位的氨基酸是G，依据SEQ ID No：45的编号，该α链的C-末端从F196到S203截短8个氨基酸(包括端点)；

和选自下组的TCR β链-抗-CD3氨基酸序列：

(vii)TCR β链-抗-CD3序列SEQ ID No：36，其中1和2位的氨基酸分别是D和I；

(viii)TCR β链-抗-CD3序列SEQ ID No：36，其中1和2位的氨基酸分别是A和I；

(ix)TCR β链-抗-CD3序列SEQ ID No：36，其中1和2位的氨基酸分别是A和Q；

(x)TCR β链-抗-CD3序列SEQ ID No：36，其中1和2位的氨基酸分别是D和I，108-131位的氨基酸被RTSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG(SEQ ID No：44)替代，254-258位的氨基酸被GGEGGGSEGGGS(SEQ ID No：47)替代；

(xi)TCR β链-抗-CD3序列SEQ ID No：36，其中1和2位的氨基酸分别是D和I，257位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G；

(xii)TCR β链-抗-CD3序列SEQ ID No：36，其中1和2位的氨基酸分别是D和I，256位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G；

(xiii)TCR β链-抗-CD3序列SEQ ID No：36，其中1和2位的氨基酸分别是D和I，255位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G；

(xiv)具有序列SEQ ID No：36的TCR β链-抗-CD3，其中1和2位的氨基酸分别是A和Q，257位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G；

(xv)具有序列SEQ ID No：36的TCR β链-抗-CD3，其中1和2位的氨基酸分别是A和Q，256位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G；

(xvi)具有序列SEQ ID No：36的TCR β链-抗-CD3，其中1和2位的氨基酸分别是A和Q，255位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G；

(xvii)具有序列SEQ ID No：36的TCR β链-抗-CD3，其中1和2位的氨基酸分别是A和I，257位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G；

(xviii)具有序列SEQ ID No：36的TCR β链-抗-CD3，其中1和2位的氨基酸分别是A和I，256位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G；

(xix)具有序列SEQ ID No：36的TCR β链-抗-CD3，其中1和2位的氨基酸分别是A和I，255位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G；

此类TCR-抗CD3融合体的例子是

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(vii)；

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(x)；

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(ix)；

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(v)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(viii)；

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(vii)；

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xi)；

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xii)；

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xiii)；

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xiv)；

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xv)；

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xvi)；

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(v)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xvii)；

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(v)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xviii)；

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(v)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xix)；

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xi)；

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xii)；和

如权利要求18所述的TCR，其中所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xiii)。

由于本发明的αβ异源二聚TCR可用于过继性治疗，本发明还包括呈递本发明TCR的分离细胞，特别是T-细胞。有许多方法适合于用编码本发明的高亲和力TCR的DNA或RNA转染T细胞。(参见，例如Robbins等.，(2008)J.Immunol.180：6116-6131))。表达本发明的高亲和力TCR的T细胞适用于gp100⁺HLA-A2⁺癌症的基于过继性治疗的治疗。本领域技术人员已知进行过继性治疗的许多合适方法。(参见，例如Rosenberg等.，(2008)Nat Rev Cancer 8(4)：299-308)。

为某些目的，本发明的TCR可多聚成包含数个TCR的复合物以形成多价TCR复合物。有许多人蛋白含有可用于产生多价TCR复合物的多聚结构域。例如，利用p53的四聚结构域产生scFv抗体片段的四聚体，与单体scFc片段相比，其显示血清持久性增加和解离速率显著降低。(Willuda等.(2001)J.Biol.Chem.276(17)14385-14392)。血红蛋白也具有可能用于此类应用的四聚结构域。与非多聚野生型或本发明的T细胞受体异源二聚体相比，本发明的多价TCR复合物对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合能力可增强。因此，本发明TCR的多价复合物也属于本发明。本发明的此类多价TCR复合物尤其可用于体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，也可用作产生具有此类应用的其它多价TCR复合物的中间体。

由转染的T细胞表达时，打算用于过继性治疗的本发明TCR被糖基化。本领域熟知，可通过转染基因的突变来修饰转染TCR的糖基化模式。

为给予患者，本发明的TCR和本发明TCR转染的T细胞可与药学上可接受的载体一起在药物组合物中提供。本发明的治疗性或成像TCR、多价TCR复合物和细胞通常作为无菌药物组合物的一部分提供，所述组合物通常包含药学上可接受的载体。该药物组合物可以是任何合适的形式(取决于给予患者的所需方法)。其可采用单位剂型提供，通常在密封的容器中提供，可作为试剂盒的一部分提供。此类试剂盒通常(但非必需)包括使用说明书。其可包括多个所述单位剂型。

可改进药物组合物以便通过任何合适的途径给予，优选胃肠外(包括皮下、肌肉内，或优选静脉内)途径。可通过药学领域已知的任何方法制备此类组合物，例如在无菌条件下将活性成分与一种或多种载体或赋形剂混合。

根据所治疗的疾病或病症、所治疗个体的年龄和情况等，本发明物质的剂量可在很宽范围内变化，最终由医师决定所用的合适剂量。

实施例

以下实施例进一步描述了本发明，其中参考了以下附图。

图1A和2A分别显示具有TRAV17/TRAJ29/TRAC基因使用的天然gp100TCR α链的胞外氨基酸序列，除了K113取代N113(即，TRAC的N4)，和具有TRBV19*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2基因使用的天然gp100 TCR β链的胞外氨基酸序列(分别是SEQ ID No：2和3)。

图1B和2B分别显示编码可溶性野生型gp100TCRα和β链(也称为参比gp100TCR α和β链)的DNA序列。这些序列包含额外的半胱氨酸残基以形成非天然二硫键。阴影部分标出了编码额外的半胱氨酸残基的突变密码子。下划线标出NdeI和HindIII限制性酶识别序列。

图1C和2C分别显示分别从图1B和2B所示DNA序列产生的可溶性野生型gp100TCR或参比gp TCRα和β链胞外氨基酸序列(分别是SEQ ID No：45和46)，但不含为在细菌中有效表达而插入的引入前导甲硫氨酸。引入的半胱氨酸以黑体字和下划线显示。

图3A-C显示高亲和力gp100TCR变体的α链可变域氨基酸序列。突变的残基以黑体字和下划线显示。

图4A-Z显示高亲和力gp100TCR变体的β链可变域氨基酸序列。突变的残基以黑体字和下划线显示。

图5A显示借助高亲和力gp100TCR作T2细胞体外染色的流式细胞术数据，该细胞用YLEPGPVTV(SEQ ID NO：6)变体gp100肽脉冲。

图5B显示借助高亲和力gp100TCR作T2细胞染色的显微图像，该细胞用YLEPGPVTV(SEQ ID NO：6)变体gp100肽脉冲。

图6显示通过接头GGGGS SEQ ID No：48(下划线显示)在gp100TCR β链的N-末端融合的抗-CD3scFv抗体片段(黑体字)的氨基酸序列。所述gp100TCRβ链含有可变区SEQ ID No：27。

图7是显示在非放射性细胞毒性试验中，抗-CD3 scFv-gp100高亲和力TCR使得T细胞重定向以杀伤黑色素瘤细胞系Mel526的应答曲线。

图8A显示用于转导T-细胞的野生型gp100-特异性TCR基因(含猪捷申病毒(Teschovirus)-12A序列的野生型(WT)α链-2A-WT β链构建物，黑体字和下划线显示)的DNA序列。

图8B显示从图8A所示DNA序列产生的用于T-细胞转导的野生型gp100-特异性TCR的氨基酸序列。猪捷申病毒-12A序列以黑体字和下划线显示。

图9a和9b显示在ELISPOT试验中，gp100TCR-转导的T-细胞对一系列靶细胞起反应而释放IFN-γ。这些附图显示与用天然gp100TCR转导的T细胞相比，用高亲和力gp100TCR转导的T细胞的特异性激活增加。

图10显示TCR-pMHC亲和力增加的不同gp100TCR-抗-CD3scFv融合体激活的CD8+ T细胞释放IFN-γ。

图11显示不同gp100 TCR-抗-CD3scFv融合体激活的CD8+ T细胞释放IFN-γ。

图12显示体内模型中平均肿瘤体积的进展情况，该模型利用含人黑色素瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠，并检验gp100高亲和力TCR-抗-CD3scFv融合蛋白的抗肿瘤效力。

实施例1

将参比gp100 TCRα和β链可变区序列克隆入基于pGMT7的表达质粒

从gp100 T细胞克隆分离的总cDNA中PCR扩增参比gp100 TCR可变α和TCR可变β结构域。在α链的情况中，利用α链可变区序列特异性寡核苷酸A1(ggaattccatatgagtcaacaaggagaagaagatcc SEQ ID No：39)和α链恒定区序列特异性寡核苷酸A2(ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg SEQ ID No：40)扩增α链可变区，前者编码限制性位点NdeI，为在细菌中有效启动表达而引入的甲硫氨酸，后者编码限制性位点SalI。在β链的情况中，利用β链可变区序列特异性寡核苷酸B1(tctctcatatggatggtggaattactcaatccccaa SEQ ID No：41)和β链恒定区序列特异性寡核苷酸B2(tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc SEQ ID No：42)扩增β链可变区，前者编码限制性位点NdeI，为在细菌中有效启动表达而引入的甲硫氨酸，后者编码限制性位点AgeI。

通过《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第三版，Sambrook和Russell)中描述的标准方法将α和β可变区克隆入含有Cα或Cβ的基于pGMT7的表达质粒。利用应用生物系统公司(Applied Biosystems)的3730xl DNA分析仪测序质粒。

将NdeI和SalI切割的编码TCR α链的DNA序列连接入用NdeI和XhoI切割的pGMT7+Cα载体。将NdeI和AgeI切割的编码TCR β链的DNA序列连接入也用NdeI和AgeI切割的不同pGMT7+Cβ载体。

连接

将连接的质粒转化入感受态大肠杆菌(Escherichia coli)菌株XL1-蓝色细胞，接种在含有100μg/ml氨苄西林的LB/琼脂板上。37℃温育过夜后，挑取单个菌落，37℃，在含有100μg/ml氨苄西林的10mL LB中振荡生长过夜。利用恰根公司的迷你制备试剂盒(Miniprep kit，Qiagen)纯化克隆的质粒，利用百灵技术公司(Lark Technologies)的自动DNA测序仪测序插入物。

图1C和2C分别显示分别从图1B和2B所示DNA序列产生的可溶性二硫键-连接的参比gp100 TCR α和β链胞外氨基酸序列，但不含为在细菌中有效表达而插入的引入前导甲硫氨酸(分别为SEQ ID NO：45和46)。应注意，半胱氨酸被取代入α和β链的恒定区以在重折叠时提供人工链间二硫键，从而形成异源二聚TCR。引入的半胱氨酸以阴影部分显示。图1B和2B所示DNA序列中的限制性酶识别序列以下划线显示。

实施例2

可溶性参比gp100 TCR的表达、重折叠和纯化

将实施例1中分别制备的含有TCR α-链和β-链的表达质粒各自转化入大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)pLysS，37℃下将单氨苄西林耐受性菌落在TYP(氨苄西林100μg/ml)培养基中培养至OD₆₀₀约为0.6-0.8，然后用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。诱导后3小时用Beckman J-6B以4000rpm离心30分钟收获细胞。在有MgCl₂和DNA酶I存在下，用25ml Bug Buster(诺瓦金公司(NovaGen))裂解细胞沉淀物。用Beckman J2-21离心机以13000rpm离心30分钟以回收包涵体沉淀物。然后进行三次洗涤剂洗涤以除去细胞碎片和膜组分。每次先将包涵体沉淀物在曲通(Triton)缓冲液(50mM Tris-HCI pH8.0，0.5％曲通-X100，200mMNaCI，10mM NaEDTA)中匀浆再以4,000rpm离心15分钟使之沉淀。然后利用以下缓冲液作类似的洗涤以除去洗涤剂和盐：50mM Tris-HCl，1mM NaEDTA，pH 8.0。最终，将包涵体分成30mg等份试样，-70℃冷冻。用6M胍-HCl溶解包涵体蛋白产物对其定量，利用日立(Hitachi)U-2001分光光度计检测OD。然后利用消光系数计算蛋白质浓度。

从冷冻储备物中解冻约30mg TCR β链和60mg TCR α链溶解包涵体，用15ml胍溶液(6M胍-盐酸，50mM Tris HCl pH 8.1，100mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT)稀释以确保完全的链变性。然后将含有完全还原和变性的TCR链的胍溶液注射入以下的1升重折叠缓冲液：100mM Tris pH 8.1，400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5M脲。加入氧化还原对(盐酸半胱胺和二盐酸胱胺)至终浓度分别为6.6mM和3.7mM，约5分钟后加入变性的TCR链。溶液静置约1小时。5℃±3℃下，用透析管状纤维素膜(西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)；产品编号D9402)和10L H₂O对重折叠的TCR透析18-20小时。然后，将透析缓冲液更换为新鲜的10mM Tris pH 8.1(10L)两次，在5℃±3℃下继续透析约8小时。

将透析的重折叠物加载于POROS 50HQ阴离子交换柱，利用Akta纯化仪(GE保健公司(GE Healthcare))用10mM Tris pH 8.1配制的0-500mM NaCl梯度洗脱结合的蛋白质6个柱体积以上，从而将可溶性TCR与错误折叠的、降解产物和杂质分开。将蛋白酶抑制剂的混合物(卡尔生物化学公司(Calbiochem))加入峰组分。将诸组分保存于4℃，通过考马斯-染色的SDS-PAGE分析，然后合并、浓缩。最后，利用在PBS缓冲液(西格玛公司(Sigma))中预平衡的GE保健公司的Superdex 75HR凝胶过滤柱纯化并表征可溶性TCR。合并、浓缩在相对分子量约为50kDa洗脱的峰，然后通过BIAcore表面等离振子共振分析进行表征。

实施例3

结合表征

BIAcore分析

可利用表面等离振子共振生物传感器(BIAcore 3000^TM)分析可溶性TCR与其肽-MHC配体的结合。产生能固定于链霉亲和素包被结合表面(传感器芯片)的可溶性生物素化肽-HLA(“pHLA”)复合物有助于该分析。所述传感器芯片包含能同时检测T细胞受体与4个不同pHLA复合物结合的4个独立流动小室。手工注射pHLA复合物易于操控固定的I类分子的精确水平。

体外重折叠含有亚单位蛋白组分和合成肽的细菌表达包涵体中生物素化I类HLA-A*02分子，然后纯化并在体外进行酶促生物素化(O’Callaghan等(1999)Anal.Biochem.266：9-15)。表达的HLA-A*02-重链具有C-末端生物素化标签，其在合适的构建物替代了该蛋白质的跨膜区和胞质结构域。获得的包涵体表达水平约75mg/升细菌培养物。还在大肠杆菌中从合适构建物表达了作为包涵体的HLA轻链或β2-微球蛋白(β2m)，其水平约为500mg/升细菌培养物。

裂解大肠杆菌细胞，处理包涵体至约80％纯度。将合成肽(gp100YLEPGPVTA)溶解于DMSO至4mg/ml的终浓度。用6M盐酸胍、50mMTris pH 8.1、100mM NaCl、10mM DTT、10mM EDTA使b2m和重链的包涵体各自变性。制备含有0.4M L-精氨酸、100mM Tris pH 8.1、3.7mM二盐酸胱胺、6.6mM盐酸半胱胺的重折叠缓冲液并冷却至＜5℃。优选先将肽加入重折叠缓冲液，然后加入变性的b2m，再加入变性的重链。将gp100YLEPGPVTA肽以4毫克/升(终浓度)加入重折叠缓冲液。然后依次加入30毫克/升的b2m和30毫克/升的重链(终浓度)。使重折叠在4℃进行至少1小时至完成。

用10体积的10mM Tris pH 8.1作透析来更换缓冲液。必需更换缓冲液两次来充分降低溶液的离子强度。然后经1.5μm乙酸纤维素滤膜过滤蛋白质溶液，加载到POROS 50HQ阴离子交换柱上(8ml床体积)。利用Akta纯化仪(GE保健公司的)，用10mM Tris pH 8.1配制的0-500mM NaCl线性梯度液洗脱蛋白。HLA-A*02-肽复合物约在250mM NaCl处洗脱，收集诸峰组分，加入蛋白酶抑制剂混合物(卡尔生物化学公司)，各组分置于冰上冷却。

用相同缓冲液平衡的GE保健公司的快速脱盐柱将生物素化标记的pHLA分子的缓冲液更换为10mM Tris pH 8.1，5mM NaCl。洗脱后立即将含有蛋白质的组分置于冰上冷却，加入蛋白酶抑制剂混合物(卡尔生物化学公司)。然后加入生物素化试剂：1mM生物素、5mM ATP(缓冲至pH 8)、7.5mM MgCl₂和5μg/ml BirA酶(按照O’Callaghan等，(1999)，Anal.Biochem.266：9-15纯化)。然后室温培育混合物过夜。

采用凝胶过滤层析纯化生物素化的pHLA-A*02分子。利用Akta纯化仪(GE保健公司)，用过滤的PBS预平衡GE保健公司Superdex 75HR 10/30柱，加载1ml生物素化反应混合物，用PBS以0.5毫升/分钟过柱。生物素化pHLA-A*02分子在约15ml时作为单峰洗脱。合并含有蛋白质的组分，置在冰上冷却，加入蛋白酶抑制剂混合物。采用考马斯结合试验(PB公司(PerBio))测定蛋白质浓度，将生物素化pHLA-A*02分子的等份试样冷冻保存在-20℃。

此类固定的复合物能结合T-细胞受体和辅助受体CD8αα，可将二者注入可溶相。如果采用可溶相或固定相的TCR，观察到可溶性TCR的pHLA结合特性在质量和数量上相似。这是对可溶性物质的部分活性的重要控制，也提示生物素化的pHLA复合物与非生物素化复合物的生物活性相同。

利用BIAcore 3000^TM表面等离振子共振(SPR)生物传感器检测小型流动小室内传感器表面附近以响应单位(RU)表示的折射率变化，该原理可用于检测受体配体相互作用和分析它们的亲和力以及动力学参数。在25℃下进行BIAcore实验，利用PBS缓冲液(西格玛公司，pH 7.1-7.5)作为运行缓冲液和制备蛋白质样品的稀释液。通过标准胺偶联方法将链霉亲和素固定于流动小室。通过生物素标签固定pHLA复合物。然后使可溶性TCR以恒定流速通过不同流动小室的表面，检测该情况下的SPR响应以进行试验。

平衡结合常数

采用以上BIAcore分析方法测定平衡结合常数。制备参比gp100 TCR的二硫键连接可溶性异源二聚体形式的连续稀释液，以5微升/分钟的恒定流速注射到两个不同的流动小室上；一个包被有约300RU的特异性YLEPGPVTA HLA-A2复合物(或变体肽YLEPGPVTV HLA-A2复合物)，第二个包被有约300RU非特异性HLA-A2-WT1野生型肽(RMFPNAPYL)复合物。利用对照细胞的检测值标准化各浓度的响应。绘制标准化的数据响应与TCR样品浓度的图，根据非线性曲线拟合模型拟合以计算平衡结合常数，K_D。(Price和Dwek，《生物化学家的物理化学原理和问题(Principlesand Problems in Physical Chemistry for Biochemists)》(第二版)，1979，克拉伦登出版社(Clarendon Press)，牛津)。参比gp100 TCR的二硫键连接可溶性形式(实施例2)显示K_D为约19μM。根据同一BIAcore数据，T1/2约为0.8s。

还利用HLA-A*0201加载的gp100 YLEPGPVTA(SEQ ID NO：1)肽的变体肽(YLEPGPVTV-SEQ ID NO：6)重复该亲和力测定。可溶性二硫键连接的参比gp100 TCR对YLEPGPVTV(SEQ ID NO：6)-HLA*0201复合物的亲和力(K_D)(约19μM)与gp100YLEPGPVTA(SEQ ID NO：1)-HLA*0201复合物所得的相似。

动力学参数

还采用以上BIAcore分析方法测定平衡结合常数和解离速率。

通过实验检测解离速率常数k_off和结合速率常数k_on来确定高亲和力TCR的K_D(参见以下实施例4)。平衡常数K_D计算为k_off/k_on。

将TCR注射流过两个不同小室，一个用约300RU的特异性YLEPGPVTA HLA-A*02复合物(或指定时的YLEPGPVTV HLA-A*02复合物)包被，第二个用约300RU的非特异性HLA-A2-肽复合物包被。流速设置为50微升/分钟。通常注射入250μl浓度约等于K_D的10倍的TCR。然后使缓冲液流过直到响应回复到基线或时间过去2小时以上。用Biaevaluation软件计算动力学参数。也将解离相拟合为单指数衰变方程式从而能计算半衰期。

实施例4

产生天然gp100 TCR的高亲和力变体

噬菌体展示是产生gp100 TCR变体的文库以鉴定高亲和力突变体的一种手段。将Li等((2005)Nature Biotech 23(3)：349-354)描述的TCR噬菌体展示和筛选方法应用于实施例2的参比gp100 TCR。通过诱变靶向所有6个gp100TCR CDR区域(参比TCR中与天然TCR中相同)，分别淘选和筛选各CDR文库。

鉴定了亲和力和/或结合半衰期至少是参比gp100 TCR两倍的TCR(因此，隐含表示是天然TCR的至少两倍)，采用SEQ ID No：2中所示编号，其具有一个或多个α链可变域氨基酸残基94S、94T、94R、97M、98M、98Q、98G、98S、98A或102D和/或采用SEQ ID No：3中所示编号，其具有一个或多个β链可变域氨基酸残基27I、28F、29Q、30K、31K、50W、51A、51G、52Q、52Y、52T、53G、53F、54N、54H、61T、94L、95Y、95H、95W、95F、95S、95V、96C、97E、97A、98G、100Q或100P。

高亲和力TCR的α链(SEQ ID No：7、8和9)和β链(SEQ ID No：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35)的可变区的氨基酸序列的具体例子分别示于图3A-C和4A-Z。这些α链仅在CDR3中突变，β链在CDR1、CDR2和CDR3的一个或多个中突变。

采用以上实施例2的方法重折叠TCR异源二聚体(包括在恒定区中引入的半胱氨酸以提供人工链间二硫键)。以此方式制备的TCR由以下部分构成：(a)参比TCR β链以及经突变包含可变域SEQ ID No：7、8和9的α链；(b)参比TCR α链以及经突变包含β链可变域SEQ ID No：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35的β链；和(c)包含突变型可变域的β和α链的各种组合物。

采用上述BIAcore方法分析高亲和力可溶性二硫键连接的gp100 TCR和天然肽YLEPGPVTA HLA-A*02复合物之间的相互作用，结合数据示于表1。表1A显示当利用变体肽YLEPGPVTV HLA-A*02复合物检验时，这些高亲和力TCR的结合数据。

采用上述BIAcore方法分析高亲和力可溶性二硫键连接的gp100 TCR和YLEPGPVTV HLA-A*02复合物之间的相互作用，结合数据示于表2。

表1

表1A：用gp100变体肽-HLA-A2复合物检验的表1的gp100 TCR的结合数据

上表1和1A显示用天然gp100 YLEPGPVTA肽HLA-A*02复合物或变体gp100 YLEPGPVTV肽HLA-A*02复合物检验的各高亲和力TCR获得实验误差内的、非常相似的动力学参数。观察到这一情况后，仅用变体YLEPGPVTV肽HLA-A*02复合物检验了一些高亲和力TCR(参见表2)。预计这些TCR对天然肽HLA-A*02复合物表现出非常相似的动力学参数。

表2

注意：在上表中，含可变域SEQ ID No：8的TCR具有可变氨基酸X，作为S。然而，含可变氨基酸X，作为A的变体具有基本上相似的T_1/2和K_D。

实施例5

利用高亲和力gp100 TCR的体外细胞染色

进行以下试验以证明具有VαSEQ ID No：8(X＝S)和VβSEQ ID No：27的实施例4的可溶性高亲和力gp100TCR能染色用变体YLEPGPVTV(SEQ IDNO：6)肽脉冲的T2细胞。

为本实施例的目的，将生物素标签融合于具有VβSEQ ID No：27的gp100β链的恒定域的C-末端，将整个基因(Vβ+Cβ+生物素标签)插入基于pGMT7的表达质粒。采用实施例2所述方法表达TCR β链-生物素标签。采用实施例2所述方法重折叠αβTCR-生物素标签。采用实施例2所述的方法，在第一阴离子交换步骤纯化重折叠的TCR。然后采用实施例3所述方法生物素化该TCR。最终，如实施例2所述，利用GE保健公司Superdex 75HR凝胶过滤柱纯化生物素化的TCR。

试剂

R10试验培养基：10％FCS(热灭活的，吉布可公司(Gibco)，目录号10108-165)，88％RPMI 1640(吉布可公司，目录号42401-018)，1％谷氨酰胺(吉布可公司，目录号25030-024)和1％青霉素/链霉素(吉布可公司，目录号15070-063)。

FACS缓冲液：PBS/0.5％BSA(普洛迈格公司(Promega)，目录号W3841)，2mM EDTA。

显微术缓冲液：PBS/0.5％BSA(普洛迈格公司，目录号W3841)，400μMCaPO₄，400μM MgPO₄。

流式细胞术方法

37℃/5％ CO₂下，在R10培养基中用一定浓度范围(10^-7到10^-9M)的变体gp100肽(YLEPGPVTV(SEQ ID NO：6))或无关肽(ELAGIGILTV(SEQ IDNO：43))脉冲T2类淋巴母细胞至少90分钟。

脉冲后，用FACS缓冲液洗涤细胞3次，室温下将1x 10⁶个细胞与高亲和力生物素化gp100 TCR(5μg/ml)温育30分钟，用FACS缓冲液洗涤两次，室温下与链霉亲和素-PE(5μg/ml：BD生物科学公司(BD biosciences)，目录号349023)温育20分钟。用FACS缓冲液洗涤后，利用Beckman Coulter FC500流式细胞仪，通过流式细胞术定量测定结合的高亲和力gp100 TCR。包括利用肽-脉冲的T2细胞的对照，其中省去了gp100 TCR，或加入无关TCR。

结果

成功证明可溶性高亲和力gp100 TCR可染色10^-9M到10^-7M YLEPGPVTV(SEQ ID NO：6)变体gp100肽脉冲的T2细胞。显示肽-脉冲T2细胞的检验与对照染色的流式细胞术直方图可参见图5A。(填充曲线是“无TCR”对照)

显微术方法

利用高亲和力生物素化的gp100 TCR，通过荧光显微术目测变体肽YLEPGPVTV(SEQ ID NO：6)-脉冲T2细胞的染色。如上文“流式细胞术”所述进行T2细胞的脉冲和染色。染色和洗涤后，用R10(不含酚红)再洗涤3x10⁴个细胞一次，最后重悬在400μl R10中(不含酚红)，转移至分室载玻片(纽克莱布泰克(Nunc，Lab-tek)，目录号155411)，先静置再作3-维荧光显微术。

利用装有63x油镜(蔡氏公司(Zeiss))的Axiovert 200M(蔡氏公司)显微镜进行荧光显微术。利用含300W氙弧灯(苏氏公司(Sutter))的Lambda LS光源照明，通过在光路中放置0.3和0.6中性滤光片将光强度降至最佳水平。利用TRITC/DiI滤光片组(克罗玛公司(Chroma))分开激发和发射光谱。通过z-栈获取(21平面，1μm间隔)得到细胞的三维图像。利用通用成像公司(UniversalImaging)的Metamorph软件，如Irvine等.，(2002)Nature 419(6909)：845-9和Purbhoo等.，Nature Immunology 5(5)：524-30所述进行图像获取和分析。

结果

图5B显示高亲和力生物素化gp100TCR成功结合YLEPGPVTV(SEQ IDNO：6)肽脉冲的T2细胞。

实施例6

可溶性抗-CD3 scFv-gp100 TCR融合体的表达、重折叠和纯化

SEQ ID No：36(图6)是通过接头，即GGGGS SEQ ID No：48(下划线所示)在gp100 TCR β链的N-末端融合的抗-CD3scFv抗体片段(黑体字)的氨基酸序列，但不含为有效启动蛋白质合成而引入的前导甲硫氨酸。gp100TCR β链含有可变域SEQ ID No：27。

本实施例中，TCR融合体的gp100 TCR α链含有可变域SEQ ID No：8(图3B)，其中X＝S。

如下所示制备以上构建物：

连接

将编码(a)TCR Vα链和(b)融合序列SEQ ID No：36(其中1和2位的氨基酸分别是D和I)的合成基因分别连接入含有T7启动子以便在大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)pLysS中高水平表达的pGMT7+Cα(具有引入的半胱氨酸，从而能形成二硫键)载体和基于pGMT7的表达质粒(Pan等.，Biotechniques(2000)29(6)：1234-8)。应注意，将前导甲硫氨酸引入TCR α链可变域的N-末端和融合序列SEQ ID No：36的N-末端以便有效启动细菌中的蛋白质合成。

表达

将表达质粒分别转化入大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)pLysS中，37℃，在TYP(氨苄西林100μg/ml)培养基中培养单氨苄西林耐受性菌落至OD₆₀₀为约0.6-0.8，然后用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。诱导后3小时，用BeckmanJ-6B以4000rpm离心30分钟收获细胞。在有MgCl₂和DNA酶存在下，用25ml Bug Buster(诺瓦金公司)裂解细胞沉淀物。以4000rpm离心30分钟以回收包涵体沉淀物。然后进行三次洗涤剂洗涤以除去细胞碎片和膜组分。每次先将包涵体沉淀物在曲通缓冲液(50mM Tris-HCI pH8.0，0.5％曲通-X100，200mM NaCI，10mM NaEDTA)中匀浆再用Beckman J2-21以13000rpm离心15分钟使之沉淀。然后利用以下缓冲液作类似的洗涤以除去洗涤剂和盐：50mMTris-HCl pH 8.0，1mM NaEDTA。最终，将包涵体分成30mg等份试样，-70℃冷冻。

重折叠

从冷冻储备物中解冻约20mg TCR α链和40mg scFv-TCR β链溶解包涵体，用20ml胍溶液(6M胍-盐酸，50mM Tris HCl pH 8.1，100mM NaCl，10mMEDTA，10mM DTT)稀释，在37℃水浴中温育30分钟到1小时以确保完全的链变性。然后将含有完全还原和变性的TCR链的胍溶液注射入以下的1升重折叠缓冲液：100mM Tris pH 8.1，400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5M脲。加入氧化还原对(盐酸半胱胺和二盐酸胱胺)至终浓度分别为10mM和1mM，约5分钟后加入变性的TCR α和scFv-TCR β链。溶液静置约30分钟。用透析管状纤维素膜(西格玛-阿尔德里奇公司；产品编号D9402)和10L H₂O对重折叠的scFv-TCR透析18-20小时。然后，将透析缓冲液更换为新鲜的10mM Tris pH 8.1(10L)两次，在5℃±3℃下继续透析约8小时。通过下述3-步纯化方法将可溶性和正确折叠的scFv-TCR与降解产物和杂质分开。

第一纯化步骤

将经透析的重折叠物(10mM Tris pH 8.1中)加载于POROS 50HQ阴离子交换柱，利用Akta纯化仪(GE保健公司)用0-500mM NaCl梯度洗脱结合的蛋白质6个柱体积以上。将诸峰组分(以约20mS/cm的电导率洗脱)保存于4℃。通过快蓝染色剂(Instant Blue Stain)(诺瓦新公司(Novexin))染色的SDS-PAGE分析诸峰组分，然后合并。

第二纯化步骤

阳离子交换纯化

根据scFv-TCR融合体的pI，用20mM MES pH6-6.5稀释对阴离子交换合并组分作缓冲液更换。通过将稀释的合并组分(20mM MES pH6-6.5中)加载到POROS 50HS阳离子交换柱上并利用Akta纯化仪(GE保健公司)，用0-500mM NaCl梯度洗脱结合的蛋白质6个柱体积以上来将可溶性和正确折叠的scFv-TCR与错误折叠的降解产物及杂质分离。将诸峰组分(以约10mS/cm的电导率洗脱)保存于4℃。

最终纯化步骤

先通过快蓝染色剂(诺瓦新公司)染色的SDS-PAGE分析第二纯化步骤的诸峰组分，然后合并。然后浓缩合并的组分以供最终纯化步骤，此时利用在PBS缓冲液(西格玛公司)中预平衡的Superdex S200凝胶过滤柱(GE保健公司)纯化和表征可溶性scFv-TCR。通过快蓝染色剂(诺瓦新公司)染色的SDS-PAGE分析在相对分子量约为78kDa洗脱的峰组分，然后合并。

可通过以下方法改变以上实施例6制备的构建物：用例如选自GGGSGSEQ ID No：49、GGSGG SEQ ID No：50、GSGGG SEQ ID No：51或GGEGGGSEGGGS SEQ ID NO：47的备选接头序列取代GGGGS SEQ ID No：48接头序列，和/或用A取代SEQ ID No：36的氨基酸D1，和/或用Q取代SEQ ID No：36的氨基酸I2，和/或用A或G取代SEQ ID No：8的氨基酸S 1。在另一种变化形式中，可将构成SEQ ID No：36部分的β可变域序列从SEQID No：27变为SEQ ID No：13、17、23或26。

实施例7

非放射性细胞毒性试验

该试验是⁵¹Cr释放细胞毒性试验的比色替代试验，定量测定细胞裂解后释放的乳酸脱氢酶(LDH)。采用30-分钟偶联的酶试验检测培养上清液中释放的LDH，其将四唑盐(INT)转化成红色甲暨产物。形成的颜色量与裂解细胞的数量成比例。利用标准96-孔平板读数计收集490nm的吸光度数据。

材料

-CytoTox96

非放射性细胞毒性试验(普罗迈格公司)(G1780)含有底物混合物、试验缓冲液、裂解溶液和终止溶液。

-试验培养基：10％FCS(热-灭活的，吉布可公司，目录号10108-165)、不含酚红的88％RPMI 1640(英杰公司(Invitrogen)，目录号32404014)，1％谷氨酰胺，200mM(英杰公司，目录号25030024)，1％青霉素/链霉素(英杰公司，目录号15070063)。

-Nunc微孔圆底96孔组织培养板(纽克公司(Nunc)，目录号163320)

-Nunc-免疫平板Maxisorb(纽克公司，目录号442404)

方法

靶细胞制备

该试验所用的靶细胞来自肿瘤细胞系Mel526(黑色素瘤细胞系HLA-A2⁺gp100⁺)和A375(黑色素瘤细胞系HLA-A2⁺ gp100^-)。在试验培养基中制备靶细胞；靶细胞浓度调节至2x 10⁵个细胞/毫升，从而得到1x 10⁴个细胞/孔，50μl。

效应细胞制备

该试验所用的效应细胞是PBMC(外周血单核细胞)。效应物与靶标之比采用50∶1(1x 10⁷个细胞/毫升，从而得到5x 10⁵个细胞/孔，50μl)。

试剂/检验化合物制备

通过试验培养基稀释来制备不同浓度的抗-CD3scFv-gp100 TCR融合体(30nM到0.03pM)。按照实施例6制备抗-CD3scFv-gp100 TCR融合体。

试验制备

采用以下顺序将试验的诸组分加入平板：

-50μl靶细胞(如上所述制备)加入各孔

-50μl效应细胞(如上所述制备)加入各孔

-50μl试剂(如上所述制备)加入各孔。

如下所述制备几个对照：

-效应物自发释放：仅有50μl效应细胞。

-靶细胞自发释放：仅有50μl靶细胞。

-靶最大释放：仅有50μl靶细胞。

-试验培养基对照：仅有150μl培养基。

-裂解溶液的试验培养基体积对照：仅有150μl培养基。

所有孔一式三份制备，终体积为150μl。

以250x g离心平板4分钟，然后在37℃温育24小时。45分钟后收集上清液，将15μl裂解溶液加入靶细胞最大释放和试验培养基体积对照孔。

以250x g离心平板4分钟。将试验平板各孔的50μl上清液转移至平底96孔Nunc Maxisorb板的相应孔。利用试验缓冲液(12ml)重建底物混合物。然后将50μl重建的底物混合物加入平板的各孔。平板盖上铝箔，室温下温育30分钟。将50μl终止溶液加入平板的各孔以终止反应。加入终止溶液后1小时内用ELISA平板读数计记录490nm的吸光度。

计算结果

从实验、靶细胞自发释放和效应细胞自发释放的所有吸光度值中扣除培养基背景的平均吸光度值。

从靶细胞最大释放对照获得的吸光度值中扣除体积校正对照的平均吸光度值。

前两步骤中获得的校正值用于下式以计算细胞毒性百分比：

％细胞毒性＝100x(实验-效应细胞自发-靶细胞自发)/(靶细胞最大-靶细胞自发)

结果

图7显示特异性结合gp100呈递细胞(Mel526细胞)的抗-CD3scFv-gp100高亲和力TCR(如实施例6所述制备)重定向的T细胞对黑色素瘤细胞的特异性杀伤作用。

实施例8

用天然gp100 TCR的高亲和力变体转染T-细胞

(a)通过293T细胞的快速介导瞬时转染(Express-In-mediated transienttransfection)制备慢病毒载体

利用第三代慢病毒包装系统包装含有编码所需TCR的基因的慢病毒载体。利用快速介导转染(Express-In-mediated transfection)(开放生物系统公司(Open Biosystems))用4种质粒(含有实施例8c所述TCR α链-P2A-TCR β链单ORF基因的一种慢病毒载体，和含有构建传染性但非复制型慢病毒颗粒所必需的其它组分的3种质粒)转染293T细胞。

为进行转染，取一T150烧瓶的指数生长期的293T细胞，细胞均匀分布在平板上，汇合度略高于50％。将快速(Express-In)等份试样置于室温下。将3ml无血清培养基(RPMI 1640+10mM HEPES)置于无菌的15ml圆锥管中。将174μl快速试剂直接加入无血清培养基(提供的试剂与DNA重量比是3.6∶1)。颠倒试管3-4次以彻底混合，室温下温育5-20分钟。

在另一1.5ml微型试管中，将15μg质粒DNA加入预混合的包装混合等份试样(含有18μg pRSV.REV(Rev表达质粒)、18μg pMDLg/p.RRE(Gag/Pol表达质粒)、7μg pVSV-G(VSV糖蛋白表达质粒))，通常约22μl，上下抽吸以确保DNA混合物均匀。将约1ml快速/无血清培养基滴加入DNA混合物，然后轻柔上下抽吸，再转移回剩余的快速/无血清培养基。颠倒试管3-4次，室温下温育15-30分钟。

从细胞烧瓶中除去老的培养基。向293T细胞的直立烧瓶的底部直接加入快速/培养基/DNA(3ml)复合物。缓慢放入烧瓶板以覆盖细胞，极其轻柔地摇晃烧瓶以确保均匀分布。1分钟后，加入22ml新鲜培养基(R₁₀+HEPES：RPMI1640，10％热-灭活的FBS，1％青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺，10mM HEPES)，小心移回孵育箱。37℃/5％CO₂下温育过夜。24小时后，收获含有包装的慢病毒载体的培养基。

为收获包装的慢病毒载体，经0.45微米尼龙注射滤器过滤细胞培养物上清液，以10,000g离心培养基18小时(或112,000g，2小时)，除去大多数上清液(小心不要打碎沉淀物)并将沉淀物重悬在剩余的几毫升上清液中(通常是每个试管约2ml到31ml起始体积)。在干冰上快速冷冻1ml等份试样，-80℃保存。

(b)用含有感兴趣基因的包装慢病毒载体转导T细胞

先从健康志愿者的血液中分离人T细胞(根据要求为CD8或CD4或二者)，再用包装的慢病毒载体转导。计数这些细胞，在48孔板中，在含有50U/mlIL-2的R₁₀中以1x10⁶个细胞/毫升(0.5毫升/孔)与预洗涤的抗-CD3/CD28抗体-包被小珠(Dynal T细胞扩增物，英杰公司)温育过夜，比例为3个珠/孔。

刺激过夜后，将0.5ml纯净的包装慢病毒载体加入所需细胞。37℃/5％CO₂下温育3天。转导3天后计数细胞，稀释至0.5x10⁶个细胞/毫升。视需要加入含有IL-2的新鲜培养基。转导后5-7天除去珠。以两天为间隔计数细胞，替换或加入含有IL-2的新鲜培养基。维持细胞在0.5x10⁶-1x10⁶个细胞/毫升。从第3天开始通过流式细胞术分析细胞，从第5天开始用于功能试验(例如，IFNγ释放的ELISPOT)。从第10天开始或在细胞减缓分裂和尺寸变小之时，冷冻储存等份细胞，至少4x10⁶个细胞/小瓶(1x10⁷个细胞/毫升，90％FBS/10％DMSO)。

(c)通过以上方法(a)和(b)进行野生型(wt)TCR基因的T细胞转染

图8A是编码天然gp100TCR的DNA序列(SEQ ID No：37)(为最大人细胞表达作密码子优化)。其是全长α链(TRAV17)-猪捷申病毒-12A-全长β链(TRBV19)单开放读框构建物。2A序列以下划线显示，其前方是编码furin切割位点以促使蛋白水解除去2A序列的核苷酸(下文联系图8B进一步讨论(SEQ ID No 38))。mRNA的蛋白质翻译期间，在2A序列的3’端的肽键跳行(peptide bond skipping)产生两种蛋白：1)αTCR链-2A融合体；2)βTCR链。SEQ ID No：37(图8A)包含NheI和SalI限制性位点(下划线所示)。

图8B是对应于图8A的氨基酸序列(SEQ ID No：38)。

在图8B中：

M1-N20是野生型α链TCR成熟后除去的前导序列；

S21-S223对应于野生型α链序列SEQ ID No：2；

S21-R250对应于野生型α链胞外结构域；

I251-L267是成熟TCR的α链跨膜区；

W268-S270是成熟TCR的α链胞内区；

R273-R276是促进高尔基体中蛋白水解除去P2A序列A281-P299的furin切割位点；

G271、S272、S277到G280、R300是使得furin切割和P2A序列具有全功能的柔性接头；

M301-V319是野生型β链TCR成熟后除去的前导序列；

D320-D561对应于野生型β链序列SEQ ID No：3；

D320-E581对应于野生型β链胞外域；

I582-V603是成熟TCR的β链跨膜区；

K604-G610是成熟TCR的β链胞内区。

(d)用野生型和高亲和力gp100 TCR转染的T-细胞

按照以上(a)和(b)所述的方法，利用对于两种DNA构建物独特的NheI和SalI限制性位点将gp100αwt-2A-βwt TCR基因(SEQ ID No 37(图8A))插入pELNSxv慢病毒载体，产生转染的T-细胞。

类似地，可用与SEQ ID No 37(图8A)相同的基因转染产生T-细胞，除了所述基因编码(a)含野生型α链SEQ ID No：2的可变域序列(S1到A109)的TCR，与具有SEQ ID No：10-35之一的β链可变域结合；或(b)具有SEQID No：7-9之一的α链可变域，与野生型β链SEQ ID No：3的可变域序列(D1到T112)结合；或(c)具有SEQ ID No：7-9之一的α链可变域，与具有SEQ ID No：10-35之一的β链可变域结合。

实施例9

与野生型-亲和力TCR-转导的T细胞对肿瘤细胞系起反应相比，gp100亲和力提高的TCR-转导的T细胞的激活增强

ELISPOT方案

进行以下试验以证明TCR-转导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肿瘤细胞系起反应的激活。利用ELISPOT试验检测的IFN-γ产量作为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)激活的读出值。

试剂

试验培养基：10％FCS(吉布可公司，目录号2011-09)，88％RPMI 1640(吉布可公司，目录号42401)，1％谷氨酰胺(吉布可公司，目录号25030)和1％青霉素/链霉素(吉布可公司，目录号15070-063)。

洗涤缓冲液：0.01M PBS/0.05％吐温20

PBS(吉布可公司目录号10010)

人IFNγELISPOT PVDF-酶试剂盒(迪亚克隆公司(Diaclone)，法国；目录号856.051.020)装有所需的所有其它试剂。(捕捉和检测抗体，脱脂奶粉，BSA，链霉亲和素-碱性磷酸酶和BCIP/NBT溶液以及人IFN-γPVDFELISPOT 96孔板)

方法

靶细胞制备

该方法所用的靶细胞是天然表位呈递细胞：Mel526黑色素瘤、Mel624黑色素瘤、MeWo和SKMel5，它们均是HLA-A2⁺ gp100⁺。A375黑色素瘤(HLA-A2⁺ gp100^-)用作阴性对照细胞系。HLA-A2⁺人原代肝细胞(批次HEP2，得自SC公司(ScienCell))确定为gp100^-(未通过RT-PCR检测gp100mRNA表达)，将其用作阴性对照。利用Megafuge 1.0(赫雷斯公司(Heraeus))以1200rpm、10分钟离心3次来洗涤充足的靶细胞(50,000个细胞/孔)。然后将细胞以10⁶个细胞/毫升重悬在试验培养基中。

效应细胞制备

该方法中所用的效应细胞(T细胞)是CD4+和CD8+ T细胞的1∶1混合物(通过负选择(利用CD4和CD8负分离试剂盒，Dynal)从PBL获得)。用抗CD3/CD28包被珠(T细胞扩增物，英杰公司)刺激细胞，用携带编码感兴趣的完整αβTCR的基因的慢病毒转导(依据实施例8所述和图8B所示的构建物)，在含有50U/ml IL-2的试验培养基中扩增直至转导后10-13天。然后将这些细胞置于试验培养基中，利用Megafuge 1.0(赫雷斯公司)以1200rpm、10分钟离心进行洗涤。然后将细胞以4X所需终浓度重悬在试验培养基中。

ELISPOT

如下所示准备平板：以每块平板10毫升无菌PBS稀释100微升抗-IFN-γ捕捉抗体。然后将100微升的稀释捕捉抗体等份加入各孔。4℃下温育平板过夜。温育后，洗涤平板(程序1，平板类型2，Ultrawash Plus 96-孔板洗涤仪；Dynex)以除去捕捉抗体。然后将无菌PBS配制的100μl 2％脱脂奶加入各孔并在室温下温育平板2小时以封闭平板。然后从平板中洗去脱脂奶(程序1，平板类型2，Ultrawash Plus 96-孔板洗涤仪，Dynex)，通过在纸巾上轻弹和轻拍ELISPOT平板以除去任何剩余的洗涤缓冲液。

然后采用以下顺序将试验的诸组分加入ELISPOT平板：

50μl靶细胞10⁶个细胞/毫升(得到总共50,000个靶细胞/孔)。

可加入50μl可溶性高亲和力gp100 TCR(1.2μM，得到300nM终浓度)以封闭TCR转导T细胞的gp100-特异性激活。

培养基足以得到每孔200ul的最终体积(试验培养基)。

50μl效应细胞(5,000混合CD4/8⁺细胞/孔)。

然后温育平板过夜(37℃/5％CO₂)。第二天，用洗涤缓冲液洗涤平板3次(程序1，平板类型2，Ultrawash Plus 96-孔板洗涤仪，Dynex)，在纸巾上轻拍以除去过量的洗涤缓冲液。然后将100微升检测一抗加入各孔。将550微升蒸馏水加入Diaclone试剂盒提供的检测抗体小瓶来制备检测一抗。然后用10毫升PBS/1％BSA(一块平板所需的体积)稀释100微升该溶液。然后在室温下温育平板至少2小时，再用洗涤缓冲液洗涤3次(程序1，平板类型2，Ultrawash Plus 96-孔板洗涤仪，Dynex)，在纸巾上轻拍平板以除去过量的洗涤缓冲液。

将100微升稀释的链霉亲和素-碱性磷酸酶加入各孔并在室温下温育平板1小时来进行二级检测。向10毫升PBS/1％BSA(一块平板所需的体积)加入10微升链霉亲和素-碱性磷酸酶来制备链霉亲和素-碱性磷酸酶。然后用洗涤缓冲液洗涤平板3次(程序1，平板类型2，Ultrawash Plus 96-孔板洗涤仪，Dynex)，在纸巾上轻拍以除去过量的洗涤缓冲液。然后将随Diaclone试剂盒提供的100微升BCIP/NBT溶液加入各孔。显影期间用箔覆盖平板，静置5-15分钟。在此期间常规检测显影平板的斑点，确定终止反应的最佳时间。在充满自来水的槽中洗涤平板以终止显影反应，甩干，然后将它们拆分为其3个组成部分。然后在50℃干燥平板1小时，再利用免疫斑点平板读数计(CTL；细胞技术有限公司(Cellular Technology Limited))计数膜上形成的斑点。

结果

通过ELISPOT试验(如上所述)检验激活的TCR-转导T细胞对各种gp 100-阳性和对照肿瘤细胞系或对照肝细胞起反应的IFNγ释放。利用Prism(GP公司(Graph Pad))绘制各孔中观察到的ELISPOT斑点数量。

混合的CD4⁺/CD8⁺ T细胞与gp100⁺ HLA-A2⁺肿瘤细胞系Mel526、Mel624、SKMel5或MeWo或与gp100^-HLA-A2⁺ A375或HEP2温育，所述T细胞依据实施例8所述和图8B所示的构建物表达a)TCR No：1(氨基酸序列SEQ ID No：38)、b)TCR No：2或c)TCR No：3，但具有下表所述的TCRα链和β链可变域。通过加入300nM实施例4的gp100 TCR(如实施例2所述制备)进行gp100-特异性封闭，所述TCR具有VαSEQ ID No：8和VβSEQ ID No：27。

图9a显示TCR No：1-转导的T细胞仅对Mel526、Mel624和SKMel5黑色素瘤细胞系起反应而释放IFNγ，被300nM实施例4的gp100 TCR有效阻断，所述TCR具有VαSEQ ID No：8和VβSEQ ID No：27。

亲和力提高的gp100 TCR No：2-转导T细胞显示对这些肿瘤细胞系的反应更强，被300nM实施例4的gp100 TCR有效阻断，所述TCR具有VαSEQ ID No：8和Vβ SEQ ID No：27。

图9b显示TCR No：1-转导的T细胞对Mel526细胞起反应而释放IFNγ，被300nM gp100 TCR有效阻断。对MeWo细胞的IFNγ释放极差。

TCR No：2-转导T细胞和TCR No：3-转导T细胞显示对Mel526和MeWo细胞的反应更强，被300nM gp100 TCR有效阻断。

实施例10

评估具有多种TCR亲和力的几种gp100 TCR-抗-CD3融合体的效力

ELISPOT方案

进行以下试验以比较各种gp100 TCR-抗-CD3融合蛋白对呈递gp100肽-HLA-A2复合物的肿瘤细胞系起反应而激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力。利用ELISPOT试验检测的IFN-γ产量作为T细胞激活的读出值。ELISPOT试验描述于之前的实施例9。

试剂

试验培养基、洗涤缓冲液、PBS和人IFNγELISPOT PVDF-酶促试剂盒如实施例9所述使用。

方法

靶细胞制备

该方法所用的靶细胞是天然表位呈递细胞Mel526黑色素瘤细胞，它是HLA-A2⁺ gp100⁺。利用Megafuge 1.0(赫雷斯公司)以1200rpm、10分钟离心1次来洗涤充足的靶细胞(50,000个细胞/孔)。然后将细胞以10⁶个细胞/毫升重悬在试验培养基中。

效应细胞制备

该方法中所用的效应细胞(T细胞)是CD8+ T细胞(通过负选择(利用CD8负分离试剂盒，Dynal，目录号113.19)从PBL获得)。解冻效应细胞，置于试验培养基中，然后利用Megafuge 1.0(赫雷斯公司)以1200rpm、10分钟离心进行洗涤。然后将细胞以4X所需终浓度重悬在试验培养基中。

试剂/检验化合物制备

用试验培养基稀释来制备不同浓度的各gp100TCR-scFv(从10nM到0.1pM)，从而得到4X终浓度。在结果部分鉴定了所检验的gp100 TCR-scFv融合体，如实施例6所述制备。

ELISPOT

如实施例9所述准备平板。

然后采用以下顺序将试验的诸组分加入ELISPOT平板：

50μl靶细胞10⁶个细胞/毫升(得到总共50,000个靶细胞/孔)。

50μl试剂(TCR-抗-CD3融合体；不同浓度)

50μl培养基(试验培养基)

50μl效应细胞(5,000个CD8+细胞/孔)。

然后温育平板过夜(37℃/5％CO₂)。如实施例9所述洗涤平板、制备一抗并用一抗进行检测。

如实施例9所述进行二级检测和显影。然后在50℃下干燥平板1小时，再利用免疫斑点平板读数计(CTL；细胞技术有限公司)计数膜上形成的斑点。

结果

该实施例中检验的gp100TCR-抗-CD3scFv融合体包含具有SEQ IDNo：2(氨基酸1到109)所示可变域(氨基酸1到109)的gp100 TCR α链序列SEQ ID No：45或具有SEQ ID No：8所示可变域(氨基酸1到109)的gp100TCRα链序列SEQ ID No：45(其中X＝S)，以及SEQ ID No：36所示gp100TCRβ链-抗-CD3scFv，但其中1和2位的氨基酸分别是D和I，其中氨基酸残基108-131被变体接头，即RTSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG(SEQ ID No：44)替代，氨基酸残基254-258被变体接头，即GGEGGGSEGGGS(SEQ ID No：47)替代，具有SEQ ID No：27所示β链可变域，其可变为SEQ ID No：3的可变域(SEQ ID No：3的D1到T112)，或变为SEQ ID No：13的可变域，或变为SEQ ID No：17的可变域，或变为SEQ ID No：23的可变域或变为SEQ ID No：26的可变域，如下表所示。如实施例6所述制备TCR-抗-CD3融合体。

利用Prism(GP公司)绘制各孔中观察到的ELISPOT斑点数与融合构建物浓度的图(参见图10)。从这些剂量应答曲线测定EC50值(在诱导50％最高应答的TCR-抗-CD3融合体浓度下测定EC50)。

图10显示特异性结合gp100呈递细胞的gp100 TCR-抗-CD3融合体特异性激活CD8⁺ T细胞。

下表显示各gp100 TCR-抗-CD3融合体的EC₅₀以及与野生型TCR(TCR编号1)相比，TCR/肽-HLA亲和力的提高。

^*注意：在所检验的最高融合体浓度下，WT TCR(TCRNo：1)-抗-CD3的最大信号不到TCRNo：7-抗-CD3观察到的信号的20％，因此，TCRNo：1-抗-CD3的EC₅₀值无法可靠测定。在所检验的TCRNo：2-抗-CD3融合体的最高浓度下，T细胞激活未达到最高，因此，EC50值无法可靠测定。

该实验在整体上表明具有较高亲和力TCR部分的TCR-抗-CD3融合体更好地激活CD8⁺ T细胞。这些结果证明TCR对gp100肽-HLA-A2复合物的亲和力与TCR-抗-CD3融合体激活CD8⁺ T细胞的效力之间的相关性。与检验的其它TCR融合体相比，TCRNo：7-抗-CD3融合体显示优秀的效力。

实施例11

检验高亲和力gp100-抗-CD3融合体的效力的T细胞重定向试验

ELISPOT方案

进行以下试验以比较各种gp100 TCR-抗-CD3融合蛋白对呈递gp100肽-HLA-A2复合物的肿瘤细胞系起反应而激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力。利用ELISPOT试验检测的IFN-γ产量作为T细胞激活的读出值。

试剂

试验培养基：10％FBS(热灭活)(国际血清实验室(Sera LaboratoriesInternational)，目录号EU-000-F 1)，88％RPMI 1640(英杰公司，目录号42401018)，1％L-谷氨酰胺(英杰公司，目录号25030024)和1％青霉素/链霉素(英杰公司，目录号15070063)。

洗涤缓冲液：0.01M PBS，用1L去离子水(西格玛公司，目录号P3813)/0.05％吐温20(西格玛公司，目录号P7949)稀释一袋

PBS(英杰公司，目录号10010015)

稀释缓冲液：含有10％FBS(热灭活)(国际血清实验室，目录号EU-000-F1)的PBS(英杰公司，目录号10010015)

人IFNγELISPOT PVDF-酶促试剂盒(10块平板)(BD；目录号551849)，其装有PVDF ELISPOT 96孔板、捕捉抗体、检测抗体和链霉亲和素-HRP(辣根过氧化物酶)

AEC底物试剂组(BD，目录号551951)

方法

靶细胞制备

该方法所用的靶细胞是天然表位呈递细胞Mel526黑色素瘤细胞，它是HLA-A2⁺ gp100⁺。A375黑色素瘤(HLA-A2⁺ gp100^-)用作阴性对照细胞系。利用Megafuge 1.0(赫雷斯公司)以1200rpm、10分钟离心1次来洗涤充足的靶细胞(50,000个细胞/孔)。然后将细胞以10⁶个细胞/毫升重悬在试验培养基中。

效应细胞制备

该方法中所用的效应细胞(T细胞)是CD8+ T细胞(通过负选择(利用CD8负分离试剂盒，Dynal，目录号113.19)从PBL获得)。解冻效应细胞，置于试验培养基中，然后利用Megafuge 1.0(赫雷斯公司)以1200rpm、5分钟离心进行洗涤。然后将细胞以每毫升1.6x 10⁵个细胞重悬在试验培养基中得到每孔8,000个细胞，50μl。

试剂/检验化合物制备

用试验培养基稀释来制备不同浓度的各gp100TCR-scFv(从10nM到0.1pM)，从而得到4X终浓度。在结果部分鉴定了所检验的gp100TCR-scFv融合体，如实施例6所述制备。

ELISPOT

如下所示准备平板：每块平板用10毫升无菌PBS稀释50微升抗-IFN-γ捕捉抗体。然后将100微升稀释捕捉抗体等份加入各孔。4℃温育平板过夜。温育后，通过将捕捉抗体弹入水槽中，在蓝辊(blue roll)上轻拍以除去残留的抗体，然后向各孔加入200微升试验培养基并在室温下温育平板两小时以封闭平板。通过将培养基弹入水槽中除去封闭试验培养基，在纸巾上轻拍ELISPOT板除去任何剩余的培养基。

然后采用以下顺序将试验的诸组分加入ELISPOT平板：

50μl靶细胞10⁶个细胞/毫升(得到总共50,000个靶细胞/孔)。

50μl试剂(TCR-抗-CD3融合体；不同浓度)

50μl培养基(试验培养基)

50μl效应细胞(8,000个CD8+细胞/孔)。

然后温育平板过夜(37℃/5％CO₂)。第二天，用洗涤缓冲液洗涤平板3次(程序1，平板类型2，Ultrawash Plus 96-孔板洗涤仪，Dynex)，在纸巾上轻拍以除去过量的洗涤缓冲液。然后将100微升检测一抗加入各孔。将40微升加入10毫升稀释缓冲液(一块平板所需的体积)中来制备检测一抗。然后在室温下温育平板至少2小时，再用洗涤缓冲液洗涤3次(程序1，平板类型2，Ultrawash Plus 96-孔板洗涤仪，Dynex)，在纸巾上轻拍平板以除去过量洗涤缓冲液。

将100微升稀释的链霉亲和素-HRP加入各孔并在室温下温育平板1小时来进行二级检测。将100微升链霉亲和素-HRP加入10毫升稀释缓冲液(一块平板所需的体积)来制备链霉亲和素-HRP。然后用洗涤缓冲液洗涤平板3次(程序1，平板类型2，Ultrawash Plus 96-孔板洗涤仪，Dynex)，再用PBS洗涤两次，所述洗涤通过手动移液，每孔加入200微升并弹入水槽。在纸巾上轻拍平板以除去过量的PBS。然后将100微升AEC底物试剂加入各孔。将10滴AEC色原加入10毫升AEC缓冲液(一块平板所需的体积)来制备底物。显影期间用箔覆盖平板，静置5-15分钟。在此期间常规检测显影平板的斑点，确定终止反应的最佳时间。用去离子水洗涤平板以终止显影反应，拍干，然后将它们拆分为其3个组成部分。然后在室温下风干平板至少1小时，再利用免疫斑点平板读数计(CTL；细胞技术有限公司)计数膜上形成的斑点。

结果

该实施例中检验的gp100 TCR-抗-CD3scFv融合体在下文描述为蛋白质1、2、3和4。

蛋白质1包含具有序列SEQ ID No：45的gp100TCR α链，但含有SEQID No：8所示可变域，其中X＝S，和序列SEQ ID No：36所示gp100 TCRβ链-抗CD3scFv，但1和2位的氨基酸分别是D和I。

蛋白质2包含具有序列SEQ ID No：45的gp100TCR α链，但含有SEQID No：8所示可变域，其中X＝G，但在其C-末端截短了8个氨基酸残基(F 196到S203，包括端点)，和序列SEQ ID No：36所示gp100TCR β链-抗CD3scFv，但1和2位的氨基酸分别是A和Q。

蛋白质3包含具有序列SEQ ID No：45的gp 100TCR α链，但含有SEQID No：8所示可变域，其中X＝A，但在其C-末端截短了8个氨基酸残基(F196到S203，包括端点)，和序列SEQ ID No：36所示gp100 TCR β链-抗CD3scFv，但1和2位的氨基酸分别是A和I。

蛋白质4包含具有序列SEQ ID No：45的gp100TCR α链，但含有SEQID No：8所示可变域，其中X＝G，但在其C-末端截短了8个氨基酸残基(F196到S203，包括端点)，和序列SEQ ID No：36所示gp100 TCR β链-抗CD3scFv，但1和2位的氨基酸分别是D和I。

TCR-抗-CD3融合体如实施例6所述制备。

通过ELISPOT试验(如上所述)检验高亲和力gp100TCR-抗-CD3融合蛋白重定向的激活CD8T细胞的IFNγ释放。利用Prism(GP公司)绘制各孔中观察到的ELISPOT斑点数量(参见图11)。从剂量应答曲线测定EC50值(在诱导50％最高应答的TCR-抗-CD3融合体浓度下测定EC50)。

图11显示特异性结合gp100呈递细胞的gp100 TCR-抗-CD3融合体特异性激活CD8⁺T细胞。该试验能检验4种gp100 TCR-抗-CD3融合蛋白，它们均显示对T细胞的有效重定向和非常相似的潜力，如下表所示。

蛋白质编号	EC₅₀
		1	1.252e-10
2	2.69e-11
		3	5.54e-11
4	3.149e-11

实施例12

高亲和力gp100-抗-CD3融合体的体内效力

高亲和力gp100-抗-CD3融合体对人YLEPGPVTA gp100肽-HLA-A2复合物和人CD3具有特异性，而不结合小鼠gp100肽-HLA复合物或CD3。因此，利用人黑色素瘤异种移植模型，在免疫缺陷小鼠中研究抗肿瘤效力。

Beige/SCID Mel526异种移植模型：

由于Mel526细胞呈递gp100肽-HLA-A2复合物和高亲和力gp100-抗-CD3融合体显示体外重定向裂解Mel526细胞，选择Mel526人黑色素瘤细胞系来建立人异种移植模型。该模型中利用免疫缺陷Beige/SCID小鼠(T，B，NK细胞功能缺陷)。

细胞植入

第0天，在PBS中(200μl/小鼠)将Mel526肿瘤细胞(2x10⁶/小鼠)与人PBMC细胞(5x10⁶/小鼠)混合，皮下注射入各小鼠。源自4位健康人供者的PBMC均匀分布在6组中(每组8只小鼠)。

研究设计：

向每组8只小鼠静脉内注射载体对照(PBS+小鼠血清)或高亲和力gp100TCR-抗-CD3融合体，连续5天，从皮下注射Mel526肿瘤细胞和PBMC或单独注射Mel526细胞后1小时开始。研究设计的细节见下表。该实验中检验的gp100TCR-抗-CD3融合体包含含有α可变域SEQ ID No：8(X＝S)的gp100 TCR α链和SEQ ID No：36所示gp100 TCR β链-抗-CD3scFv，其中1和2位的氨基酸分别是D和I。该TCR-抗-CD3融合体如实施例6所述制备。

研究读数

从肿瘤/PBMC植入之日开始，在整个研究期间检测肿瘤大小和体重(一周三次)。利用外部卡尺，通过检测长度和宽度测定肿瘤尺寸。长度对应于肿瘤的最大水平维度，宽度对应于肿瘤的最短维度。预计了平均肿瘤体积(平均值+SD；平均值+SEM)，示于图中。记录各单独鉴定小鼠的肿瘤生长数据。利用下式计算肿瘤体积：V＝长度x宽度²/2。

结果

图12显示了各研究组的平均肿瘤体积。不含效应细胞注射靶细胞，然后进行载体处理(组1)，连同效应细胞注射靶细胞，然后进行载体处理(组2)，在第11天后开始显示可检测的肿瘤生长。组2中的肿瘤生长率与组1中的肿瘤生长率相似。

高亲和力gp100 TCR-抗-CD3处理在可检测的肿瘤生长中表现出显著的疗效，在PBMC效应细胞存在下诱导Mel 526肿瘤生长的剂量依赖性抑制作用。

Claims

1.一种T细胞受体(TCR)，其具有结合YLEPGPVTA(SEQ ID No：1)HLA-A2复合物的特性并包含TCRα可变域和/或TCR β可变域，其特征在于：

(i)相对于具有胞外α和β链序列SEQ ID No：2和3的TCR，所述TCR在SEQ ID No：2所示其α链可变域氨基酸1到109和/或在SEQ ID No：3所示其β链可变域氨基酸1到112发生突变；和

(ii)所述α可变域与SEQ ID No：2的氨基酸序列1到109有至少90％序列相同性，和/或所述β可变域与SEQ ID No：3的氨基酸序列1到112有至少90％序列相同性；和

(iii)所述TCR对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期是参比TCR的至少两倍，所述参比TCR具有胞外α链序列SEQ IDNo：45和胞外β链序列SEQ ID No：46。

2.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述一个或多个突变在所述α和/或β可变域的一个或多个互补决定区中。

3.如权利要求1或2所述的TCR，其特征在于，所述一个或多个突变在所述α链可变域的互补决定区3中和/或在所述β链可变域的一个或多个互补决定区中。

4.一种TCR，其具有结合YLEPGPVTA(SEQ ID No：1)HLA-A2复合物的特性并具有SEQ ID No：2的氨基酸1到109的α链可变域序列，除了94D、97L、98V或102G位中一个或多个的氨基酸残基发生突变，和/或具有SEQ ID No：3的氨基酸1到112的β链可变域序列，除了27L、28N、29H、30D、31A、50Q、51I、52V、53N、54D、61A、94S、95I、96G、97G、98P或100E位中一个或多个的氨基酸残基发生突变。

5.如权利要求4所述的TCR，其特征在于，所述TCR对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期是参比TCR的至少两倍。

6.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，采用SEQ IDNo：2所示编号，所述TCR包含α链可变域氨基酸残基94S、94T、94R、97M、98M、98Q、98G、98S、98A或102D的一个或多个取代。

7.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，采用SEQ IDNo：3所示编号，所述TCR包含β链可变域氨基酸残基27I、28F、29Q、30K、31K、50W、51A、51G、52Q、52Y、52T、53G、53F、54N、54H、61T、94L、95Y、95H、95W、95F、95S、95V、96C、97E、97A、98G、100Q或100P的一个或多个取代。

8.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID No：7、8和9之一。

9.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID No：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35之一。

10.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR是αβ异源二聚TCR，其具有α和β链恒定域序列，其中半胱氨酸残基取代TRAC的Thr 48和TRBC1或TRBC2的Ser 57，所述半胱氨酸在所述TCR的α和β恒定域之间形成二硫键。

11.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR是αβ异源二聚TCR，其具有α和β链恒定域序列，其中恒定域序列通过TRAC的外显子2的Cys4和TRBC1或TRBC2的外显子2的Cys2之间的天然二硫键相连。

12.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR与可检测标记物、治疗剂、PK修饰部分或任何这些物质的组合结合。

13.如权利要求12所述的TCR，其特征在于，所述治疗剂是共价连接于所述TCR的α或β链的C-或N-末端的抗-CD3抗体。

14.如以上权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，与具有胞外α和β链序列SEQ ID No：2和3的TCR相比，所述TCR具有修饰的糖基化。

15.一种多价TCR复合物，其包含至少两个以上权利要求中任一项所述的TCR。

16.编码权利要求1到14中任一项所述TCR的DNA或RNA。

17.一种分离的细胞，其呈递权利要求1到11中任一项所述的TCR。

18.如权利要求13所述的TCR，其特征在于，所述TCR包含：

选自下组的TCR α链氨基酸序列：

(i)TCRα链序列SEQ ID No：45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No：8替代，其中1位的氨基酸是S；

(v)TCR α链序列SEQ ID No：45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No：8替代，其中1位的氨基酸是A，依据SEQ ID No：45的编号，该α链的C-末端从F196到S203截短8个氨基酸(包括端点)；和

(vi)TCRα链序列SEQ ID No：45，其中氨基酸1-109被序列SEQ ID No：8替代，其中1位的氨基酸是G，依据SEQ ID No：45的编号，该α链的C-末端从F196到S203截短8个氨基酸(包括端点)；

和选自下组的TCR β链-抗-CD3氨基酸序列：

(x)TCR β链-抗-CD3序列SEQ ID No：36，其中1和2位的氨基酸分别是D和I，108-131位的氨基酸被SEQ ID No：44替代，254-258位的氨基酸被SEQID No：47替代；

(xii)TCRβ链-抗-CD3序列SEQ ID No：36，其中1和2位的氨基酸分别是D和I，256位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G；

(xviii)具有序列SEQ ID No：36的TCR β链-抗-CD3，其中1和2位的氨基酸分别是A和I，256位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G；和

(xix)具有序列SEQ ID No：36的TCR β链-抗-CD3，其中1和2位的氨基酸分别是A和I，255位的氨基酸是S，258位的氨基酸是G。

19.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(vii)。

20.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(x)。

21.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(ix)。

22.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(v)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(viii)。

23.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(vii)。

24.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xi)。

25.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xii)。

26.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(i)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xiii)。

27.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xiv)。

28.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xv)。

29.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xvi)。

30.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(v)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xvii)。

31.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(v)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xviii)。

32.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(v)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xix)。

33.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xi)。

34.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xii)。

35.如权利要求18所述的TCR，其特征在于，所述α链氨基酸序列是(vi)，所述β链-抗-CD3氨基酸序列是(xiii)。