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CN118108833A - 引入外源二硫键的tcr恒定区及其产品和应用 - Google Patents

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CN118108833A
CN118108833A CN202410285177.4A CN202410285177A CN118108833A CN 118108833 A CN118108833 A CN 118108833A CN 202410285177 A CN202410285177 A CN 202410285177A CN 118108833 A CN118108833 A CN 118108833A
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CN
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tcr
constant region
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tcr constant
cells
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刘光娜
苏丹
王珏
王梦杰
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Tisha Hefei Biotechnology Co ltd
Hunan University
Original Assignee
Tisha Hefei Biotechnology Co ltd
Hunan University
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Abstract

本发明提供引入外源二硫键的TCR恒定区及其产品和应用，属于生物医药领域，所述的TCR恒定区上包括用于引入外源二硫键的点突变，其包括位于α链的与参与内源二硫键形成的氨基酸位点间隔特定数量氨基酸的点突变1，或，位于β链与参与内源二硫键形成的氨基酸位点间隔特定数量氨基酸的点突变2。本发明为提高工程化TCR的稳定性、表达率、功效效能及安全性等方面提供新的解决策略，对于TCR‑T细胞疗法、TCR嵌合受体修饰的细胞疗法、TCR抗体、双抗等生物医药领域具有重要意义。

Description

引入外源二硫键的TCR恒定区及其产品和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及引入外源二硫键的TCR恒定区及其产品和应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗已经成为继手术、放射治疗和化学治疗之后的又一重要抗肿瘤治疗方法。基于T细胞的创新型免疫疗法在肿瘤免疫治疗领域表现出巨大的潜力，该类疗法通过基因工程技术对T细胞进行修饰，赋予其识别和消灭肿瘤细胞的能力。其中嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞和T细胞受体(TCR)编辑T细胞是最具代表性的细胞疗法。
TCR是T细胞表面表达的免疫球蛋白样受体，由两条肽链(α、β或γ、δ)组成，可特异性识别由MHC呈递的抗原表位并介导免疫反应。目前已知的TCR种类有两种，其中由α和β两条肽链组成的TCR称为αβTCR，由γ和δ两条肽链组成的TCR称为γδTCR。外周血中，表达αβTCR的T细胞占总T细胞的90％-95％。αβTCR的每条肽链由可结合抗原的可变区(V region)和高度保守的恒定区(C region)组成，其中恒定区又包括胞外区、跨膜区及胞内区三个部分。在细胞膜上表达的αβTCR需结合6个CD3亚基形成TCR-CD3复合物，从而维持其膜展示的稳定性并通过CD3分子的胞内域向胞内传递信号。
TCR-T疗法中涉及的TCR-T细胞大多数为转入外源αβTCR的T细胞。目前TCR-T细胞疗法存在的重要问题之一是外源导入的TCR与内源性TCR发生错配，即转入的TCR的α或β链与内源性TCR的β或α链之间的错误配对。这种TCR错配现象被认为广泛存在于TCR-T疗法中。这会导致，一方面，引入的功能性TCR的表达率降低，使TCR-T的疗效受到影响；另一方面，错配形成的TCR异源二聚体可能会产生对自身抗原的识别能力，从而导致自身免疫性(on-target)或交叉反应(off-target)毒性，即对自身健康组织的攻击和杀伤，引发未知的安全风险。
目前常用的解决表达和错配的方法包括：(1)将转入的外源TCR分子的恒定区替换为鼠源TCR的恒定区，但引入鼠源的TCR恒定区蛋白片段会使得回输的TCR-T细胞在患者体内引发宿主抗移植物病(HvGD)，导致TCR-T细胞被排斥清除，大大削弱治疗效果和二次回输的可行性。(2)定点突变TCR两条链的恒定区中对应的一对氨基酸，从而引入榫卯结构或额外的二硫键，但这种策略单独应用时的效果有限。(3)改变TCR结构，制造TCR-CD3嵌合分子或单链TCR以避免转入TCR与内源TCR错配，但由于肽段间互作结果不明易导致TCR丧失原有结构和功能，该策略目前已基本不再采用。
除了TCR-T疗法外，目前也报道了一些TCR嵌合受体编辑的T细胞疗法，其中TCR嵌合受体的形式包括：将TCR的恒定区与羊驼源、鼠源或人源的抗体的可变区进行融合表达；将包含恒定区和可变区的完整TCR与羊驼源、鼠源或人源的抗体的可变区进行融合表达。
在增强外源TCR的链间配对、提高TCR在细胞上色表达效率上，现有技术多有不足，仍需要优化和改进。
发明内容
为了解决现有技术中存在的种种不足，本发明提供了一种新的技术方案用于TCR结构的优化。具体地，筛选到能够形成链间外源二硫键的氨基酸突变用于TCR改造，并结合现有技术中公开的其他优化方式，以其提高TCR的应用效果。
基于本发明总的构思，本发明保护的方面是多样的，包括但不限于：用于引入外源二硫键的TCR恒定区点突变及其组合构建的TCR恒定区、TCR、TCR嵌合受体、TCR融合蛋白的应用及产品，相应的基因工程产品、临床方向的应用及产品等。
本发明中，“TCR恒定区”包括TCRα链恒定区(TRAC)和β链恒定区(TRBC)，其可以是人恒定区或衍生自另一物种，例如鼠。现有技术公开了，在恒定区添加二硫键可促进TCRα和β链的正确配对(Kuball J等Blood.2007 Mar 15；109(6)：2331-8)。本发明中野生型TCR的氨基酸序列的位置按照国际免疫遗传学信息系统(IMGT)的命名规则进行编号。例如，TCRα链恒定区(TRAC)中的某个氨基酸，IMGT中列出的位置编号为48，则本文中将其描述为TRAC第48位氨基酸；TCRβ链恒定区(TRBC)中的某个氨基酸，IMGT中列出的位置编号为57，则本文中将其描述为TRBC第57位氨基酸；其他以此类推。本发明中，其他氨基酸的序列位置编号有特殊说明的，则按特殊说明。
本发明中，“TCR”指“T细胞受体”，包括天然TCR以及TCR变体、片段和构建体。因此该术语包括包含TCRα链和TCRβ链的异二聚体以及多聚体和单链构建体；任选地包含其它结构域和/或部分，只要所述TCR保留其识别抗原靶标的能力。在TCR的天然形式中，其作为T细胞表面上的若干蛋白质的复合物存在。T细胞受体由两条(单独的)蛋白质链组成，这些蛋白质链由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生，并被称为α链和β链。TCR的每条链具有一个N末端免疫球蛋白样(Ig)-可变(V)区/结构域，一个Ig-恒定(C)区/结构域，将链锚定在质膜中的跨膜/细胞膜跨越区域，和C-末端的短细胞质尾。抗原特异性是由α和β链的可变区(TRAV和TRBV)赋予的。
本发明的“TCR嵌合受体”，其基本结构包含前述的TCR恒定区和抗原识别区域的组合，其中抗原识别结构域可以来自于抗体、受体、配体、多肽抗原等能够和目标分子相结合的功能性分子，其中抗体包括但不限于单链抗体可变区(scFv)、纳米抗体(VHH)、识别pMHC复合物的类TCR抗体等。TCR嵌合受体能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。所述TCR嵌合受体中抗原识别域来源于抗体可以针对如下抗原中的一种或多种：CD19、CD20、CEA、GD2(又称B4GALNT1，β1,4-乙酰基-氨基半乳糖基转移酶1)、FR(Flavin还原酶)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PMEL前黑素小体蛋白)、CA9(碳酸酐酶IX)、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1(又称粘蛋白-A)、ERBB2、NY-ESO-1(又称CTAG1B，癌/睾丸抗原1B)、MAGE(黑素瘤相关抗原E1)家族蛋白、BAGE(B黑素瘤抗原家族)家族蛋白、GAGE(生长激素释放因子)家族蛋白、AFP(α-胎蛋白)、MUC1(mucin 1，钙粘蛋白1)、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3(又称ST8SIA1，ST8α-N-乙酰基-神经酰胺α-2,8-唾液酸转换酶1)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3，激肽释放酶相关的肽酶3)、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY(又称FUT3)、EpCAM、MSLN(间皮素)、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125(又称MUC16，mucin 16，钙粘蛋白16)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(又称SERPINB3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR，维生素D(1,25-二氢维生素D3)受体)、β2-MG(β-2-微球蛋白)和PROGRP(GRP胃泌素释放肽)、NY-ESO-1、MAGE-A1/3/4/6、MAGE-C2、MART-1、WT1、PRAME、gp100、MCPyV、hTG、TRAIL、HERV-E、HA-1、Tyrosinase、TGFβRII、HBV、HPV、CMV、EBV、HIV、AFP；所述TCR嵌合受体中抗原识别域来源于受体或配体可以是以下一种或者多种：APRIL、TACI、FLT3、NKG2D等；所述TCR嵌合受体中抗原识别域来源于多肽抗原可以是以下一种或者多种多肽抗原：DSG1/3、DARPins、adnectin peptides、被自身反应性BCR识别的抗原肽等。
本发明的“融合蛋白”是指利用基因工程、化学修饰等方法将某种具有生物学活性的功能蛋白分子与其它天然蛋白(融合伴侣)融合而产生的一种新型多结构域人工蛋白。可以优化蛋白性能。功能蛋白分子一般为内源性配体或其受体，主要包括细胞因子，生长因子，激素，酶或肽等活性物质，融合伴侣常见的有免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)，白蛋白或转铁蛋白等。其中基于抗体Fc段(fragment crystallizable,Fc)的融合蛋白应用最为广泛。
本发明的“TCR融合蛋白”是指包含本发明的TCR恒定区单独或与抗原识别域或功能结构域进行组合，通过基因工程、化学修饰等方法将某种具有生物学活性的功能蛋白分子与其它天然蛋白(融合伴侣)融合而产生的一种新型多结构域人工蛋白。其中TCR恒定区为本发明中所述的TCR改造结构，可包含或不包含TCR恒定区的跨膜区及胞内区及其衍生的截断体；抗原识别域为目标分子相结合的功能性分子包括但不限于抗体、受体、配体、多肽抗原等；功能结构域可以为能够激活相关发挥功能细胞的结构域，例如靶向CD3的抗体用于激活T细胞，IgG1或抗CD16抗体与NK细胞结合用于诱导ADCC效应，或PD1/TIM3/LAG3等免疫抑制分子抗体或配体，以改善肿瘤微环境的抑制作用。
本发明中“核酸分子”与多核苷酸、核酸以相同的含义使用，并且还包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。
本发明的“载体”指将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；CRISPR/CAS质粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。
本发明的“细胞”包括动物个体内的细胞和培养的细胞。可以理解为细胞是生命活动的基本单位。一般来说，细菌等绝大部分微生物以及原生动物由一个细胞组成，即单细胞生物；高等植物与高等动物则是多细胞生物。细胞可分为两类：原核细胞、真核细胞。
本发明中，“INESS-TCR”表示在人源或鼠源TCR恒定区的基础上引入筛选得到的外源二硫键，或引入外源二硫键再结合其他突变从而增加TCR的配对和膜展示效率。
本发明中，所述的“截短体”为蛋白或多肽变体的一种，所述的变体可以是具有替代、缺失或插入氨基酸的突变。具体地，所述的截短体可以是从多肽的一端或两端去除一个或多个氨基酸。因此，理论上可通过操作编码多肽的基因来生成变体肽。变体可通过改变多肽的基本组成或特征，但不改变其至少某些药理学活性而生成。在一些实施方案中，与突变前的肽或其部分相比，截短体具有缺失的氨基酸不超过20个。在一些实施方案中，截短体具有的缺失的氨基酸不超过15个。在一些实施方案中，截短体具有的缺失的氨基酸不超过10个。在一些实施方案中，截短体具有的缺失的氨基酸不超过8个。在一些实施方案中，截短体具有的缺失的氨基酸不超过5个。在一些实施方案中，截短体具有的缺失的氨基酸不超过3个。在一些实施方案中，截短体具有的缺失的氨基酸不超过2个。在一些实施方案中，截短体具有的缺失的氨基酸不超过1个。在另一些实施方案中，截短体是利用本文所公开的方法和技术来构建的。
在多种来源的TCR恒定区基础上，如本领域技术人员所知晓，可能能够在其C-末端和/或N-末端截短1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基，而不显著影响TCR的结合性质，这对本领域技术人员而言是明显的。此类截短体包括但不限于将TCR恒定区的胞内区截短，只保留胞外区和跨膜区；或将TCR恒定区的胞内区和跨膜区截短，只保留胞外区等。如现有技术专利号为CN116034113A中披露的对恒定区N端进行截断后恒定区仍具有功能；再如ShuheiIshikura等人(doi.org/10.1074/jbc.M110.127936)中披露的现有技术α链恒定区胞内的丝氨酸残基可以被改变后其仍具有相应功能。本发明包括了所有这类变体。
第一方面，本发明提供了：
引入外源二硫键的TCR恒定区，包括：
(1)位于α链的点突变1，选自：
与参与内源二硫键形成的氨基酸位点在氨基酸序列在N端方向间隔3、5、41、42、78、82个氨基酸的位点，或，C端方向间隔4、6、24、31、38、39个氨基酸的位点中的任一或多突变为C；
和/或；
(2)位于β链的点突变2，选自：
与参与内源二硫键形成的氨基酸位点在氨基酸序列：N端方向间隔1、45、72、76、104、111、112、116个氨基酸的位点，或，C端方向间隔17、18、24、31个氨基酸的位点中的任一或多突变为C。
所述的TCR恒定区的来源可以是多样的，包括但不限于：人源、鼠源、兔源、马源、猴源、猪源、鸡源、猫源、狗源、羊源等。
作为优选，所述的TCR恒定区可以选自以下(A、B、C)任一：
A、所述的TCR恒定区为人源TCR恒定区，所述的人源TCR恒定区包括：
hTRAC基础上包括突变1，和，hTRBC基础上包括突变2；
所述的突变1选自：P89C，M134C，F20C，V127C，V100C，L12C，R53C，K102C中的任一或多；
所述的突变2选自：A19C，V163C，Y149C，A156C，A129C，F14C，S54C，T85C中的任一或多；
所述的hTRAC的的氨基酸序列为GenBank编号为AAO72258.1的序列的第135-255位；
所述的hTRBC选自hTRBC1或hTRBC2；
所述的hTRBC1的GenBank编号为AAA60713.1的序列的第61-237位；
所述的hTRBC2的UniProtKB编号为C25777；
B、所述的TCR恒定区为鼠源TCR恒定区，所述的鼠源TCR恒定区包括：
mTRAC基础上包括突变3，和，mTRBC基础上包括突变4；
所述的突变3选自：S87C，T131C，L116C，V123C，T96C，L12C，K53C，K98C中的任一或多；
所述的突变4选自：A22C，V159C，Y145C，A152C，A125C，F14C，S54C，T81C中的任一或多；
所述的mTRAC的氨基酸序列为GenBank编号为AAP88970.1的序列的第136-272位；
所述的mTRBC选自mTRBC1或mTRBC2；
所述的mTRBC1的UniProtKB编号为P01852；
所述的mTRBC2的UniProtKB编号为P01851；
C、A或B中的TCR恒定区的截短体。
以上所述TCR恒定区的突变前序列(用数据库编号指代的序列)在本发明中有时也称为野生型序列。
在一些具体的实施例中，所述的hTRBC选自hTRBC1，所述的mTRBC选自mTRBC1。
以上所述的TCR恒定区中，所述的hTRAC中参与内源二硫键形成的氨基酸位点为95C；hTRBC中参与内源二硫键形成的氨基酸位点为131C；所述的mTRAC中参与内源二硫键形成的氨基酸位点为91C；mTRBC中参与内源二硫键形成的氨基酸位点为127C。
更优选地，所述的TCR恒定区可以选自以下任一：
1)所述的人源TCR恒定区中：
所述的突变1选自：CYS1-P89C，CYS2-M134C，CYS3-F20C，CYS4-V127C，CYS5-V100C，CYS7-L12C，CYS8-R53C，CYS9-K102C中的任一；
所述的突变2选自CYS1-A19C，CYS2-V163C，CYS3-Y149C，CYS4-A156C，CYS5-A129C，CYS7-F14C，CYS8-S54C，CYS9-T85C8中的任一；
所述的突变1和突变2中相同编号为一配对的外源二硫键形成位点；
所述的人源TCR恒定区中包括任一个或多个外源二硫键形成位点；
2)所述的鼠源TCR恒定区中：
所述的突变3选自：mCYS1-S87C，mCYS2-T131C，mCYS3-L116C，mCYS4-V123C，mCYS5-T96C，mCYS7-L12C，mCYS8-K53C，mCYS9-K98C8中的任一；
所述的突变4选自：mCYS1-A22C，mCYS2-V159C，mCYS3-Y145C，mCYS4-A152C，mCYS5-A125C，mCYS7-F14C，mCYS8-S54C，mCYS9-T81C8中的任一；
所述的突变3和突变4中相同编号为一配对的外源二硫键形成位点；
所述的鼠源TCR恒定区中包括任一个或多个外源二硫键形成位点；
3)如1)所述的人源TCR恒定区或2)中所述的鼠源TCR恒定区的截短体。
在一些具体的实施例中，人源和鼠源TCR恒定区中可突变形成二硫键的氨基酸残基位点列表见表1：
表1：
根据以上任意描述的TCR恒定区，其上还可以选择性地包括内源二硫键的突变，所述的内源二硫键突变后不形成二硫键。在此种描述下的TCR恒定区，其包含前述氨基酸位点突变，选择性包括或不包括参与内源性二硫键形成的氨基酸位点的突变。所述的参与内源性二硫键形成的氨基酸位点可以是现有技术中已经公开或未公开的位点，不局限于本发明所公开的具体的氨基酸位点。在一些实施例中，如在hTRAC中，其参与内源性二硫键形成的氨基酸为95C，在mTRAC中，其参与内源性二硫键形成的氨基酸为，在hTRBC1和hTRBC2中参与内源二硫键形成的氨基酸位点为131C，mTRBC1和mTRBC1中参与内源二硫键形成的氨基酸位点为127C，因此相对应的可以对这些位点进行突变以引入内源二硫键的突变。
所述的内源二硫键的突变的要求为突变后不形成二硫键，在一些情况下可以理解为二硫键对应的氨基酸位置由能够形成二硫键的氨基酸突变为不能形成二硫键的氨基酸。在一般理解中，所述的能够形成二硫键的氨基酸一般指C(半胱氨酸)，但现有技术中已公开或尚未公开的其他可能性也在本发明保护范围内；所述的不能形成二硫键的氨基酸其也不具有唯一指向性，能够达到破坏内源二硫键目的的突变类型均可。在一些具体的实施例中，所述的突变可以是由C突变为A。更为具体的可以是C91A、C95A、C127A或C131A任意一种或多种。
在一些具体的实施例中，所述的内源二硫键位点的突变选自以下任一：
(1)mTRAC包括C91A，和，mTRBC包括C127A；
(2)hTRAC包括C95A，和，hTRBC包括C131A。
根据以上任意描述的TCR恒定区，其上还可以选择性地包括现有技术中已经公开或未公开的其他氨基酸的突变，作为示例，还可以包括以下任一或多：
(1)hTRAC上包括T48C，和，hTRBC上包括S57C；或；mTRAC上包括T48C，和，mTRBC上包括S57C；用于形成外源二硫键；
(2)hTRAC上包括S61R，和，hTRBC上包括R79G；或；mTRAC上包括G61R，和，mTRBC上包括R75G；用于形成Knob-into-hole结构；
(3)hTRAC上包括P91S、E92D、S93V、S94P中的任一或多；和/或，hTRBC上包括E18R、S22A、F133I、V136A、Q139H中的任一或多；
(4)hTRAC上包括S115L、G119V、F120L中的任一或多；或，mTRAC上包括S112L、M114I、G115V、G61R中的任一或多。
本领域技术人员也可以根据本发明的记载，在TCR恒定区的野生型序列基础上设计这样的组合突变：
包括：内源二硫键位点的突变中的任一或多，和/或，现有技术已经公开的形成外源二硫键的突变中的任一或多；和/或，包括现有技术已经公开的其他突变重点任一或多。
上述的组合突变包括但不限于以下形式：
mTRAC包括C91A，和，mTRBC包括C127A，和，mTRAC上包括T48C，和，mTRBC上包括S57C；
mTRAC包括C91A，和，mTRBC包括C127A，和，mTRAC上包括G61R，和，mTRBC上包括R75G；
mTRAC包括C91A，和，mTRBC包括C127A，和，mTRAC上包括S112L、M114I、G115V、G61R中的任一或多；
hTRAC包括C95A，和，hTRBC包括C131A，和，hTRAC上包括T48C，和，hTRBC上包括S57C
hTRAC包括C95A，和，hTRBC包括C131A，和，hTRAC上包括P91S、E92D、S93V、S94P中的任一或多；和/或，hTRBC上包括E18R、S22A、F133I、V136A、Q139H中的任一或多；
hTRAC包括C95A，和，hTRBC包括C131A，和，hTRAC上包括S115L、G119V、F120L中的任一或多；
hTRAC上包括T48C，和，hTRBC上包括S57C，和，hTRAC上包括S61R，和，hTRBC上包括R79G，和/或，hTRAC上包括P91S、E92D、S93V、S94P中的任一或多，和/或，hTRBC上包括E18R、S22A、F133I、V136A、Q139H中的任一或多；
hTRAC上包括S61R，和，hTRBC上包括R79G，和，hTRAC上包括P91S、E92D、S93V、S94P中的任一或多，和/或，hTRBC上包括E18R、S22A、F133I、V136A、Q139H中的任一或多；
hTRAC上包括T48C，和，hTRBC上包括S57C，和，hTRAC上包括S115L、G119V、F120L中的任一或多；
hTRAC上包括S61R，和，hTRBC上包括R79G，和，hTRAC上包括S115L、G119V、F120L中的任一或多；
hTRAC上包括P91S、E92D、S93V、S94P中的任一或多，和/或，hTRBC上包括E18R、S22A、F133I、V136A、Q139H中的任一或多，和，hTRAC上包括S115L、G119V、F120L中的任一或多。
本领域技术人员可以在以上突变的基础上，与前述的A、B、C所呈现TCR恒定区进行组合获得TCR恒定区，此类组合也在本发明保护的范围内。
第二方面，本发明提供了：
所述的TCR恒定区在构建TCR、TCR嵌合受体或TCR融合蛋白中的应用及对应产品。
所述的产品即TCR、TCR嵌合受体或TCR融合蛋白。
所述的产品中至少包括前述的TCR恒定区或其截短体。
所述的产品还可以选择性包括抗原识别区域：所述抗原识别区域为能够与其它蛋白、多肽、小分子化合物进行结合的野生型或人工合成的完整蛋白或其截短体。如本领域技术人员所知晓，抗原识别区域包含但不限于TCR可变区、抗体可变区、受体或配体；抗原识别区域的选择可以由本领域技术人员根据实际需要进行确定。优选地，抗原识别区域靶向的抗原类型包括但不限于：CD19、CD20、CD22、CD23、BCMA、CD79A、TRBC1、TRBC2、GPRC5D、CD123、CD33、CLL1、Siglec6、CD70、GCC、GPC3、Claudin18.2、Claudin6、MSLN、GD2、IL-13Rα2、CD7、Gucy2c、B7H3、EpCAM、CEA、CEACAM-1、EGFR、EGFRVIII、DLL3、Nectin4、NY-ESO-1、MAGE-A1/3/4/6、MAGE-C2、MART-1、WT1、PRAME、gp100、MCPyV、hTG、TRAIL、HERV-E、HA-1、Tyrosinase、TGFβRII、HBV、HPV、CMV、EBV、HIV、AFP、HER2、MSLN、KK-LC-1、KRAS突变体、P53突变体、骨髓增生性白血病蛋白(MPL)、CD30、CD32、CD99、CD138、CD179b、CD200R、CD276、CD324、Fc受体样5(FcRH5)、CD171、CS 1(信号传导淋巴细胞激活分子家族7，SLAMF7)、C型凝集素样分子1(CLL1)、钙粘蛋白1、钙粘蛋白6、钙粘蛋白16、钙粘蛋白17、钙粘蛋白19、表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、人白细胞抗原A2(HLA A2)、B细胞成熟抗原(BCMA)、Tn抗原、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、肿瘤相关糖蛋白(TAG)72、CD38、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、B7 H3(CD276)、KIT、白介素13受体亚基α2(IL13Ra2)、白介素11受体亚基α(IL11Ra)、间皮素(MSLN)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Lewis Y、CD24，血小板衍生生长因子受体β(PDGFRβ)、蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)、唾液酸糖脂阶段特异性胚胎抗原4(SSEA 4)、CD20、免疫球蛋白Fc区、组织因子、叶酸受体α、表皮生长因子受体2(ERBB2)、钙粘蛋白1(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经小粘附分子(NCAM)、蛋白酶、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、延伸因子2突变型(ELF2M)、Ephrin B2、胰岛素样生长因子I受体(IGF 1受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、潜伏膜蛋白2(LMP2)、黑素细胞蛋白gpl00、bcr abl、酪氨酸酶、促红细胞生成素产生肝细胞癌A2(EphA2)、岩藻糖基化单唾液酸神经节苷脂(岩藻糖基GM1)、唾液酸化Lewis a(sLea)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)、邻乙酰基GD2神经节苷脂、叶酸受体β、TEM1/CD248、肿瘤内皮标记相关蛋白7(TEM7R)、claudin 6(CLDN6)、甲状腺刺激激素受体(TSHR)、T细胞受体(TCR)β1恒定链、TCRβ2恒定链、TCRγδ、G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、CXORF61蛋白、CD97、CD179a、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、聚唾液酸、胎盘特异性1(PLAC1)、糖类抗原GloboH、乳腺分化抗原NY BR 1、uroplakin2(UPK2)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、肾上腺素受体β3(ADRB3)、泛连接蛋白3(PANX3)、G蛋白偶联受体20(GPR20)、淋巴细胞抗原6家族成员K(LY6K)、嗅觉受体家族51亚家族E成员2(OR51E2)、T细胞受体γ链可变阅读框蛋白(TARP)、Wilms肿瘤抗原1蛋白(WT1)、肿瘤睾丸抗原NY ESO 1、肿瘤 睾丸抗原LAGE 1a、legumain、人乳头瘤病毒(HPV)E6、HPV E7、人T淋巴营养病毒(HTLV1)Tax、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒糖蛋白(KSHV)K8.1蛋白、爱泼斯坦 巴尔病毒(EBV)编码的糖蛋白350(EBB gp350)、HIV1包膜糖蛋白gp120、多元自动化基因组工程(MAGE)A1、易位Ets白血病病毒(ETV)蛋白6 AML、精子蛋白17、X抗原家族成员(XAGE)1、跨膜酪氨酸蛋白激酶受体Tie 2、黑色素瘤肿瘤 睾丸抗原MAD CT 1、黑色素瘤肿瘤 睾丸抗原MAD CT 2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、生存速和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原1(PCTA 1)/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、δ 样3(DLL3)、滋养层细胞表面抗原2(TROP2)、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)、鸟苷酸环化酶C(GCC)、甲胎蛋白(AFP)、肉瘤易位断裂点、肾上腺素受体、黑色素瘤凋亡抑制剂(ML IAP)、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、N 乙酰氨基葡萄糖基转移酶V(NA17)、配对盒蛋白Pax 3(PAX3)、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、v myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)、Ras同源家族成员C(RhoC)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP 2)、细胞色素P4501B1(CYP1B1)、CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点的调节物(Brother of theRegulator of Imprinted Sites))、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)、PAX5、前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY TES1)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、A激酶锚蛋白4(AKAP4)、滑膜肉瘤、X断裂点2(SSX2)、晚期糖基化终产物受体(RAGE 1)、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、热休克蛋白70 2突变型(mut hsp70 2)、CD79a、CD79b、CD72、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、IgA受体Fc片段(FCAR)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、CD300分子样家族成员f(CD300LF)、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、多巴胺受体、含EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EGF like module containingmucin like hormone receptor like 2，EMR2)、淋巴细胞抗原75(LY75)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、Fc受体样5(FCRL5)、免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、FITC、促黄体生成激素受体(LHR)、卵泡刺激素受体(FSHR)、绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)、CC趋化因子受体4(CCR4)、神经节苷脂GD3、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM)家族成员6(SLAMF6)、SLAMF4中的任一或多个的组合。
具体地，所述的抗原识别区域可以选自以下：
(1)抗原识别区域可以是TCR可变区。所述TCR可变区用于靶向包括但不限于前述的所有可行的抗原类型；所述TCR的来源可以是人源、鼠源、兔源、马源、猴源、猪源、鸡源、猫源、狗源、羊源等，与本发明中任一TCR恒定区或其截短体融合表达后，可以形成能够发挥功能的TCR。TCR可变区的选择可以由本领域技术人员根据实际需要进行确定。
(2)抗原识别区域可以是抗体可变区，所述抗体可变区用于靶向包括但不限于前述的所有可行的抗原类型；所述抗体来源可以是人源、鼠源、兔源、马源、猴源、猪源、鸡源、猫源、狗源、羊源等，所述抗体可变区的选择可以由本领域技术人员根据实际需要进行确定。
(3)抗原识别区域为受体或配体，所述受体包括但不限于：VEGFR2、ERBB2、PDGFRβ、EGFR、TSHR、HAVCR1、GPR20、ADRB3、RAGE 1、LAIR1、FCAR、LHR、FSHR、CGHR、CCR4、PD-1等本发明公开或未公开的受体类型，所述配体包括但不限于：PD-L1、乙酰胆碱、表皮生长因子、血小板生长因子、促红细胞生成素、生长激素等多肽类激素、类固醇激素、维生素D3、甲状腺素、维甲酸、肾上腺素、多巴胺、苯丙胺、地西泮、阿立哌唑等本发明已经公开或未公开的配体类型。配体与受体的选择可以由本领域技术人员根据实际需要进行确定。
所述的产品还可以选择性包括跨膜区。所述跨膜区一般指蛋白质序列中跨越细胞膜的区域，有时也指跨膜蛋白质的包埋在细胞膜磷脂双分子层中的部分。通常可以是α-螺旋结构，约20-25个氨基酸残基。构成他的蛋白质的氨基酸大部分是疏水性氨基酸。跨膜区的选择可以由本领域技术人员根据实际需要进行确定，优选地，跨膜区的来源蛋白包括但不限于：CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、LCK、ICOS、DAP10、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL-2R、IL-4R、IL-7R、IL-10R、IL-12R、IL-15R、IL-21R、CD5、CD2、CD22、CD27、CD28、CD40、CD64、CD66、CD69、CD16、CD79、CD89、CD40L、HVEM、CD46、CD8、CD97、GITR、CD30、SLAMF1-9、DAP10、MyD88、KIR2DS、KIR3DS、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、ICAM、PD-1、FcR的跨膜区或其保留跨膜功能的突变体中任一种或多种。
在一些具体的实施例中，所述跨膜区为TCR的跨膜区，其特征在于可以与CD3分子的跨膜区相互作用，形成TCR-CD3复合体，TCR-CD3复合体中的两个多态型亚单位主要功能是识别结合MHC分子的抗原；CD3分子的主要功能是参与TCR-CD3复合体的装配和稳定以及信号转导。可选地，所述的跨膜区为人源TCRα链的跨膜区或其突变序列；所述的突变序列可以在TCRα链的跨膜区基础上包括S115L、G119V、F120L中的任一或多，突变位点为hTRAC内。可选地，所述的跨膜区为鼠源TCRα链的跨膜区或其突变序列；所述的突变序列可以在TCRα链的跨膜区基础上包括S112L、M114I、G115V、G61R中的任一或多，突变位点为mTRAC内。本发明的保护范围也包含其他未陈述的跨膜区突变类型。
所述的产品还可以选择性包括胞内信号转导结构域。所述胞内信号转导结构域为胞内结构域的一部分，可以发挥T细胞信号转导功能，通常可以是T细胞受体TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链，含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs)。实际上，本领域技术人员可以根据需要选择以下来源：CD3、CD28、4-1BB、CD27、ICOS、OX40、γC、IL-2RA、IL-2RB、IL-4R、IL-7RA、IL-9R、IL-15RA、IL-21R、TSLPR、ZAP-70、PLCγ等。
在本发明一些具体的实验中，作为示例，以靶向NY-ESO-1的TCR和靶向的p53(R175H)的TCR为例应用了上述的各种TCR恒定区序列，即将靶向NY-ESO-1的TCR的可变区(V区，TRBV编码序列为SEQ ID NO.85，TRAV编码序列为SEQ ID NO.86)或靶向p53(R175H)的TCR的可变区(V区，TRBV编码序列为SEQ ID NO.87，TRAV编码序列为SEQ ID NO.88)与上述的各种TCR恒定区序列进行了拼接，并将拼接得到的完整TCR基因转入细胞中，从而分析各种TCR的配对和膜展示效率以及对肿瘤细胞的杀伤功能。涉及到的TCR恒定区包括7组，具体说明如下：
(1)INESS-hTCR：为在天然人源TCR(hTCR)恒定区基础上分别引入表1中人源序列对应的9对外源突变二硫键(每个TCR中只包含1对外源二硫键，共有9个TCR序列)。包含的9个TCR选自如下：
①TRBC内包含的突变位点为：CYS1B(A19C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ IDNO:1；TRAC内包含的突变位点为：CYS1A(P89C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
②TRBC内包含的突变位点为：CYS2B(V163C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ IDNO:3；TRAC内包含的突变位点为：CYS2A(M134C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
③TRBC内包含的突变位点为：CYS3B(Y149C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ IDNO:5；TRAC内包含的突变位点为：CYS3A(F20C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:6。
④TRBC内包含的突变位点为：CYS4B(A156C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ IDNO:7；TRAC内包含的突变位点为：CYS4A(V127C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:8。
⑤TRBC内包含的突变位点为：CYS5B(A129C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ IDNO:9；TRAC内包含的突变位点为：CYS5A(V100C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:10。
⑥TRBC内包含的突变位点为：CYS6B(S57C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ IDNO:11；TRAC内包含的突变位点为：CYS6A(T48C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:12。
⑦TRBC内包含的突变位点为：CYS7B(F14C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ IDNO:13；TRAC内包含的突变位点为：CYS7A(L12C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:14。
⑧TRBC内包含的突变位点为：CYS8B(S54C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ IDNO:15；TRAC内包含的突变位点为：CYS8A(R53C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:16。
⑨TRBC内包含的突变位点为：CYS9B(T85C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ IDNO:17；TRAC内包含的突变位点为：CYS9A(K102C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:18。
(2)INESS-sTCR：为在(1)的基础上，再引入其它突变。其中的8个TCR为：在人源TCR恒定区的基础上引入筛选到的外源突变二硫键，再引入4857突变，或mm突变，或TMa突变，或同时包含4857、mm和TMa突变。具体信息如下：
①TRBC内包含的突变位点有CYS5B(A129C)，S57C，优选地，对应核苷酸序列为SEQID NO:19；TRAC内包含的突变位点有CYS5A(V100C)，T48C，优选地，对应核苷酸序列为SEQID NO:20。
②TRBC内包含的突变位点有CYS5B(A129C)，mmB(E18R,S22A,F133I,V136A,Q139H)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:21；TRAC内包含的突变位点有：CYS5A(V100C)，mmA(P91S,E92D,S93V,S94P)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:22。
③TRBC内包含的突变位点有：CYS5B(A129C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ IDNO:23；TRAC内包含的突变位点有：CYS5A(V100C)，hTMa(S115L,G119V,F120L)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:24。
④TRBC内包含的突变位点有：CYS5B(A129C)，S57C，mmB(E18R,S22A,F133I,V136A,Q139H)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:25；TRAC内包含的突变位点有：CYS5A(V100C)，T48C，mmA(P91S,E92D,S93V,S94P)，hTMa(S115L,G119V,F120L)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:26。
⑤TRBC内包含的突变位点有：CYS9B(T85C)，S57C，优选地，对应核苷酸序列为SEQID NO:27；TRAC内包含的突变位点有：CYS9A(K102C)，T48C，优选地，对应核苷酸序列为SEQID NO:28。
⑥TRBC内包含的突变位点有：CYS9B(T85C)，mmB(E18R,S22A,F133I,V136A,Q139H)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:29；TRAC内包含的突变位点有：CYS9A(K102C)，mmA(P91S,E92D,S93V,S94P)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:30。
⑦TRBC内包含的突变位点有：CYS9B(T85C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ IDNO:31；TRAC内包含的突变位点有：CYS9A(K102C)，hTMa(S115L,G119V,F120L)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:32。
⑧TRBC内包含的突变位点有：CYS9B(T85C)，S57C，mmB(E18R,S22A,F133I,V136A,Q139H)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:33；TRAC内包含的突变位点有：CYS9A(K102C)，T48C，mmA(P91S,E92D,S93V,S94P)，hTMa(S115L,G119V,F120L)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:34。
(3)INESS-mutEC-hTCR：为在(1)的基础上，再引入内源二硫键位点突变。包含9个TCR：在人源TCR恒定区的基础上引入筛选到的外源突变二硫键，再引入内源二硫键位点突变，从而去除TCR的天然内源二硫键。具体信息如下：
①TRBC内包含的突变位点为：CYS1B(A19C)，C131A，优选地，对应核苷酸序列为SEQID NO:35；TRAC内包含的突变位点为：CYS1A(P89C)，C95A，优选地，对应核苷酸序列为SEQID NO:36。
②TRBC内包含的突变位点为：CYS2B(V163C)，C131A，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:37；TRAC内包含的突变位点为：CYS2A(M134C)，C95A，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:38。
③TRBC内包含的突变位点为：CYS3B(Y149C)，C131A，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:39；TRAC内包含的突变位点为：CYS3A(F20C)，C95A，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:40。
④TRBC内包含的突变位点为：CYS4B(A156C)，C131A，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:41；TRAC内包含的突变位点为：CYS4A(V127C)，C95A，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:42。
⑤TRBC内包含的突变位点为：CYS5B(A129C)，C131A，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:43；TRAC内包含的突变位点为：CYS5A(V100C)，C95A，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:44。
⑥TRBC内包含的突变位点为：CYS6B(S57C)，C131A，优选地，对应核苷酸序列为SEQID NO:45；TRAC内包含的突变位点为：CYS6A(T48C)，C95A，优选地，对应核苷酸序列为SEQID NO:46。
⑦TRBC内包含的突变位点为：CYS7B(F14C)，C131A，优选地，对应核苷酸序列为SEQID NO:47；TRAC内包含的突变位点为：CYS7A(L12C)，C95A，优选地，对应核苷酸序列为SEQID NO:48。
⑧TRBC内包含的突变位点为：CYS8B(S54C)，C131A，优选地，对应核苷酸序列为SEQID NO:49；TRAC内包含的突变位点为：CYS8A(R53C)，C95A，优选地，对应核苷酸序列为SEQID NO:50。
⑨TRBC内包含的突变位点为：CYS9B(T85C)，C131A，优选地，对应核苷酸序列为SEQID NO:51；TRAC内包含的突变位点为：CYS9A(K102C)，C95A，优选地，对应核苷酸序列为SEQID NO:52。
(4)INESS-mutEC-sTCR：为在(3)的基础上，再引入其它突变。其中的8个TCR为：在人源TCR恒定区的基础上引入筛选到的外源突变二硫键，和内源二硫键位点突变，再引入4857突变，或mm突变，或TMa突变，或同时包含4857、mm和TMa突变。具体信息如下：
①TRBC内包含的突变位点有：CYS5B(A129C)，C131A，S57C，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:53；TRAC内包含的突变位点有：CYS5A(V100C)，C95A，T48C，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:54。
②TRBC内包含的突变位点有：CYS5B(A129C)，C131A，mmB(E18R,S22A,F133I,V136A,Q139H)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:55；TRAC内包含的突变位点有：CYS5A(V100C)，C95A，mmA(P91S,E92D,S93V,S94P)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:56。
③TRBC内包含的突变位点有：CYS5B(A129C)，C131A，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:57；TRAC内包含的突变位点有：CYS5A(V100C)，C95A，hTMa(S115L,G119V,F120L)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:58。
④TRBC内包含的突变位点有：CYS5B(A129C)，C131A，S57C，mmB(E18R,S22A,F133I,V136A,Q139H)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:59；TRAC内包含的突变位点有：CYS5A(V100C)，C95A，T48C，mmA(P91S,E92D,S93V,S94P)，hTMa(S115L,G119V,F120L)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:60。
⑤TRBC内包含的突变位点有：CYS9B(T85C)，C131A，S57C，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:61；TRAC内包含的突变位点有：CYS9A(K102C)，C95A，T48C，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:62。
⑥TRBC内包含的突变位点有：CYS9B(T85C)，C131A，mmB(E18R,S22A,F133I,V136A,Q139H)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:63；TRAC内包含的突变位点有：CYS9A(K102C)，C95A，mmA(P91S,E92D,S93V,S94P)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:64。
⑦TRBC内包含的突变位点有：CYS9B(T85C)，C131A，优选地，对应核苷酸序列为SEQID NO:65；TRAC内包含的突变位点有：CYS9A(K102C)，C95A，hTMa(S115L,G119V,F120L)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:66。
⑧TRBC内包含的突变位点有：CYS9B(T85C)，C131A，S57C，mmB(E18R,S22A,F133I,V136A,Q139H)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:67；TRAC内包含的突变位点有：CYS9A(K102C)，C95A，T48C，mmA(P91S,E92D,S93V,S94P)，hTMa(S115L,G119V,F120L)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:68。
(5)INESS-mul-TCR：在(3)的基础上，选择其中三对二硫键(CYS5，CYS6，CYS9)进行组合突变。其中的4个TCR为：在人源TCR恒定区的基础上引入内源二硫键位点突变，再引入CYS5+CYS6两对二硫键位点突变，或再引入CYS9+CYS6两对二硫键位点突变，或再引入CYS5+CYS9两对二硫键位点突变，或再引入CYS5+CYS6+CYS9三对二硫键位点突变。具体信息如下：
①TRBC内包含的突变位点为：C131A，CYS5B(A129C)，CYS6B(S57C)；TRAC内包含的突变位点为：C95A，CYS5A(V100C)，CYS6A(T48C)。
该项与(4)中的①相同。
②TRBC内包含的突变位点为：C131A，CYS6B(S57C)，CYS9B(T85C)；TRAC内包含的突变位点为：C95A，CYS6A(T48C)，CYS9A(K102C)。
该项与(4)中的⑤相同。
③TRBC内包含的突变位点为：C131A，CYS5B(A129C)，CYS9B(T85C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:69；TRAC内包含的突变位点为：C95A，CYS5A(V100C)，CYS9A(K102C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:70。
④TRBC内包含的突变位点为：C131A，CYS5B(A129C)，CYS6B(S57C)，CYS9B(T85C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:71；TRAC内包含的突变位点为：C95A，CYS5A(V100C)，CYS6A(T48C)，CYS9A(K102C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:72。
(6)INESS-mTCR：在天然鼠源TCR(mTCR)恒定区的基础上分别引入表1中鼠源序列对应的9对外源突变二硫键(每个TCR中只包含1对外源二硫键，共有9个TCR序列)。其中2个TCR具体信息如下：
①TRBC内包含的突变位点有：mCYS5B(A125C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ IDNO:73；TRAC内包含的突变位点有：mCYS5A(T96C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:74。
②TRBC内包含的突变位点有：mCYS9B(T81C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ IDNO:75；TRAC内包含的突变位点有：mCYS9A(K98C)，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:76。
(7)INESS-mutEC-mTCR：为在(6)基础上进行内源二硫键位点突变，去除了鼠源TCR内源二硫键位点。其中2个TCR具体信息如下：
①TRBC内包含的突变位点有：mCYS5B(A125C)，C127A，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:77；TRAC内包含的突变位点有：mCYS5A(T96C)，C91A，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:78。
②TRBC内包含的突变位点有：mCYS9B(T81C)，C127A，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:79；TRAC内包含的突变位点有：mCYS9A(K98C)，C91A，优选地，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:80。
本发明所述的TCR的氨基酸序列还可以是以上具体点突变后的序列具有80％以上相似性且二硫键位置相同的氨基酸序列中的任一或多。
图1为引入外源二硫键的T细胞受体INESS-TCR示意图。图1的A中展示了INESS-TCR的结构示意图。INESS-TCR为引入外源二硫键的TCR。根据是否突变内源二硫键，是否与TCR恒定区的其他优化进行组合，以及TCR恒定区不同来源，共分为7组。图1的B中展示了INESS-TCR的序列示意图，INESS-TCR所含TCR的α和β多肽链基因序列通过furin和P2A蛋白酶切位点多肽段相连，两条多肽链将一同被转录并翻译表达成蛋白质，之后再被furin和p2A对应的蛋白酶切割成独立的两条肽链，两条肽链可通过链间形成二硫键而组装成完整的TCR，TCR与T细胞膜上的CD3分子个亚基组装成TCR-CD3复合体，从而稳定地在细胞膜上表达。INESS-TCR将TCR两条肽链空间结构上相邻的氨基酸残基分别突变为半胱氨酸，两个半胱氨酸之间形成二硫键，从而促进TCR双链之间的结合和TCR在细胞膜上的表达效率。
基于前述TCR恒定区和TCR，本发明同时提供一种嵌合抗体，包含前述的TCR恒定区或TCR。
如本领域一般认知，所述的嵌合抗体可以是嵌合单抗或嵌合双抗。
本发明同时提供包括前述的TCR恒定区、TCR或TCR嵌合抗体的融合蛋白。
第三方面，本发明提供前述TCR恒定区、TCR或TCR嵌合抗体或融合蛋白相应的基因工程产物、临床方向的应用及产品。
所述的基因工程产物选自以下任一：
(1)核酸分子，编码：前述的TCR恒定区或TCR恒定区截短体，或，含相应TCR恒定区或截短体的产品；
(2)表达载体：包括(1)所述核酸分子，或，表达前述的TCR恒定区或含相应TCR恒定区的产品；
(3)细胞：转入(2)所述表达载体，或，表达或分泌前述的TCR恒定区或含相应TCR恒定区的产品；
优选地，所述的细胞选自：T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞；细胞来源为病人自体、健康志愿者、脐带血或体外诱导的多功能干细胞。
基于密码子简并性，在知晓氨基酸序列的情况下，本领域技术人源可以设计多种核酸分子对其进行表达，因此本发明所保护的核酸分子涵盖所有可能性。
所述的表达载体的类型可以在现有技术中任意已公开或未公开的类型中进行选择，能够实现相应产物的表达即可。优选地可以是病毒载体或动物表达载体，进一步优选可以是慢病毒表达载体或哺乳动物表达载体。
所述的细胞包括前述的载体或者表达前述的TCR恒定区、TCR或TCR嵌合抗体或融合蛋白。
所述的细胞可以是现有技术中已公开或未公开的细胞类型。
所述的临床方向的应用可以是制备下游产品中的应用，
所述的下游产品选自以下任一：
(1)检测试剂，用于结合抗原作出判断或获取其结合的抗原；
(2)药物，用于预防或治疗疾病，优选地，所述的疾病包含肿瘤、自身免疫病、病毒感染、真菌感染或细菌感染。
本发明同时提供基于前述应用的下游产品，
所述的下游产品选自以下任一：
(1)检测试剂，包括或不包括辅料；
(2)药物，包括或不包括辅料。
所述的药物中的辅料一般为药用辅料。
所述药用辅料是指生产药品和调配处方时，使用的赋形剂和附加剂，是指除活性成分外，在安全性方面已进行了合理的评估，并且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋型、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分。根据其来源可分为天然物、半合成物和全合成物。根据其作用与用途可分为：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、湿润剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏着剂、抗氧剂、螯合剂、渗透促进剂、pH调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等；根据其给药途径可分为口服、注射、黏膜、经皮或局部给药、经鼻或口腔吸入给药和眼部给药等。同一药用辅料可用于不同给药途径的药物制剂，且有不同的作用和用途。
所述的诊断试剂用于结合抗原作出诊断；具体地可以用于检测或者诊断：NY-ESO-1、MAGE-A1/3/4/6、MAGE-C2、MART-1、WT1、PRAME、gp100、MCPyV、hTG、TRAIL、HERV-E、HA-1、Tyrosinase、TGFβRII、HBV、HPV、CMV、EBV、HIV、AFP、HER2、MSLN、KK-LC-1、KRAS、P53、CD19、CD20、CD22、BCMA、CD79A、TRBC1、TRBC2、GPRC5D、CD123、CD33、CLL1、Siglec6、CD70、GCC、GPC3、Claudin18.2、Claudin6、MSLN、GD2、IL13Rα2、CD7、Gucy2c、B7H3、EpCAM、CEA、CEACAM-1、EGFR、EGFRVIII、DLL3、Nectin4或其相关疾病中的任一或多。
在一些具体的实施例中，可以用于检测或诊断NY-ESO-1或突变型p53相关疾病。
所述的药物优选地，用于预防或治疗肿瘤、自身免疫病、病毒感染、真菌感染或细菌感染。
进一步优选地，所述的药物用于治疗或预防：可利用NY-ESO-1、MAGE-A1/3/4/6、MAGE-C2、MART-1、WT1、PRAME、gp100、MCPyV、hTG、TRAIL、HERV-E、HA-1、Tyrosinase、TGFβRII、HBV、HPV、CMV、EBV、HIV、AFP、HER2、MSLN、KK-LC-1、KRAS、P53、CD19、CD20、CD22、BCMA、CD79A、TRBC1、TRBC2、GPRC5D、CD123、CD33、CLL1、Siglec6、CD70、GCC、GPC3、Claudin18.2、Claudin6、MSLN、GD2、IL13Rα2、CD7、Gucy2c、B7H3、EpCAM、CEA、CEACAM-1、EGFR、EGFRVIII、DLL3、Nectin4中的任一或多作为治疗靶点的相关疾病。
在一些具体的实施例中，所述的药物用于治疗或预防NY-ESO-1或突变型p53相关疾病。
所述的NY-ESO-1相关疾病包括但不限于：乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、卵巢癌、粘液样/圆细胞脂肪肉瘤、神经母细胞瘤、滑膜肉瘤等。所述的突变型p53相关疾病广泛存在于各种肿瘤中，包括但不限于：卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、急性髓系白血病、淋巴瘤等。
本发明同时保护基于上述产品的检测方法或治疗方法。
具体地，提供一种检测抗原的方法，包括：使用前述的检测试剂与待测物接触进行检测。
具体地，提供一种疾病治疗方法，包括：向有需要的病人施用前述的药物。
本发明使用的术语“治疗或预防”一般是指获得需要的药理和/或生理效应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状，可以是预防性的；和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用，可以是治疗性的。本文使用的“治疗或预防”包括但不限于：(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生的疾病或症状；(b)抑制疾病的症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。
本发明的有益效果：
本发明通过对TCRα和β链恒定区的蛋白结构的分析，筛选出空间上相邻的九对氨基酸残基，分别突变为半胱氨酸，从而在TCRα和β链引入新的二硫键。通过实验验证了这九对半胱氨酸中的4对均能提高外源TCR的配对和在T细胞上的表达效率，并能够增强TCR-T细胞对肿瘤的杀伤功能。且与目前已报道的优化策略相组合后，能够显著提高TCR的上膜表达效率和TCR-T的杀伤功能。
除此之外，TCR的两条链间存在天然二硫键，它对于α和β链形成二聚体，从而维持天然TCR结构稳定方面起着重要作用。而外源导入的TCR链也能够与内源的TCR链形成此天然二硫键，这也是导致错配的最主要原因。因而本发明中通过将TCRα和β链恒定区中参与形成天然二硫键的氨基酸进行突变，再通过基因编辑分别引入新筛选出的9对氨基酸残基，以促进TCR两条链间形成新的二硫键，以此增强外源TCR的独立配对从而减少错配。实验验证删除内源二硫键后，TCR的在细胞表面的表达率显著下降。而引入的4对氨基酸残基，能够促进TCR两条链间形成新的二硫键而恢复TCR的在细胞表面的表达水平，其中2对氨基酸残基的引入能够使TCR的配对和上膜表达效率显著高于原始未删除内源二硫键的TCR。且再与目前已报道的优化策略相组合后，能够显著提高TCR的上膜表达效率和TCR-T的杀伤功能。相比于已报道的优化策略，突变形成天然二硫键的氨基酸再引入新的二硫键，更能有效地解决外源和内源TCR链间的错配，从而提高安全性。
除了对于人源TCR恒定区的改造，对鼠源TCR恒定区也进行了改造，分别在野生型TCR恒定区和突变了参与内源二硫键形成的氨基酸位点的TCR恒定区引入筛选得到的外源二硫键氨基酸突变，从而提高利用鼠源TCR恒定区的TCR的上膜表达效率和肿瘤杀伤功能。
最后，也在突变内源二硫键的人源TCR恒定区基础上，构建了引入不同组合的外源二硫键，证明将我们筛选的新的二硫键进行组合后，对于提高TCR的配对和上膜以及功能有更好的促进作用。
本发明为提高工程化TCR的稳定性、表达率、功效效能及安全性等方面提供新的解决策略，对于TCR-T细胞疗法、TCR嵌合受体修饰的细胞疗法、TCR抗体、双抗等生物医药领域具有重要意义。本发明中涉及的TCR-T细胞免疫疗法，有望在临床上向众多实体瘤患者供更为安全、有效的选择。
附图说明
图1为引入外源二硫键的T细胞受体INESS-TCR示意图。
图2为INESS-hTCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式伪彩图。A为靶向NY-ESO-1TCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式伪彩图，B为靶向p53(R175H)TCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式伪彩图。
图3为INESS-hTCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式直方图。A为靶向NY-ESO-1TCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式直方图，B为靶向p53(R175H)TCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式直方图。
图4为INESS-hTCR在人原代T细胞中的功能检测结果，A为携带NY-ESO-1抗原靶细胞死亡百分比，B为共培养上清中细胞因子IL-2含量，C为共培养上清中细胞因子IFN-γ含量，D为携带p53(R175H)抗原靶细胞死亡百分比。
图5为INESS-sTCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式伪彩图。
图6为INESS-sTCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式直方图。
图7为INESS-sTCR在人原代T细胞中的功能检测结果，A为靶细胞死亡百分比，B为共培养上清中细胞因子IL-2含量，C为共培养上清中细胞因子IFN-γ含量。
图8为INESS-mutEC-hTCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式伪彩图。
图9为INESS-mutEC-hTCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式直方图。
图10为INESS-mutEC-hTCR在人原代T细胞中的功能检测结果，A为靶细胞死亡百分比，B为共培养上清中细胞因子IL-2含量，C为共培养上清中细胞因子IFN-γ含量。
图11为INESS-mutEC-sTCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式伪彩图。
图12为INESS-mutEC-sTCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式直方图。
图13为INESS-mutEC-sTCR在人原代T细胞中的功能检测结果，A为靶细胞死亡百分比，B为共培养上清中细胞因子IL-2含量，C为共培养上清中细胞因子IFN-γ含量。
图14为INESS-mul-TCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式伪彩图。
图15为INESS-mul-TCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式直方图。
图16为INESS-mul-TCR在人原代T细胞中的功能检测结果，A为靶细胞死亡百分比，B为共培养上清中细胞因子IL-2含量，C为共培养上清中细胞因子IFN-γ含量。
图17为INESS-mTCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式伪彩图。
图18为INESS-mTCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式直方图。
图19为INESS-mTCR在人原代T细胞中的功能检测结果，A为靶细胞死亡百分比，B为共培养上清中细胞因子IL-2含量，C为共培养上清中细胞因子IFN-γ含量。
图20为INESS-mutEC-mTCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式伪彩图。
图21为INESS-mutEC-mTCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测的流式直方图。
图22为INESS-mutEC-mTCR在人原代T细胞中的功能检测结果，A为靶细胞死亡百分比，B为共培养上清中细胞因子IL-2含量，C为共培养上清中细胞因子IFN-γ含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
应当注意，如本文中及所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。因此，术语“一个”、“一种”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”可以互换使用。类似地，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。
除非另有说明或定义，否则术语“包含”及其变体诸如“包括”和“含有”应理解为意味着包括所述元素或步骤，但不排除任何其他元素或步骤。为了本发明的目的，术语“由...组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中将组定义为包括或包含至少一定数量的实施方案，则还应被理解为公开了优选仅由这些实施方案组成的组。
如本文所用的术语“T细胞受体”或“TCR”包括天然TCR以及TCR变体、片段和构建体。因此该术语包括包含TCRα链和TCRβ链的异二聚体以及多聚体和单链构建体；任选地包含其它结构域和/或部分，只要所述TCR保留其识别抗原靶标的能力。
除非另有说明，本发明的实施采用分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其均在本领域技术人员知晓的范围内。
下面详细描述本发明的实施例，以便为本领域普通技术人员提供如何进行和利用本发明的试验、筛选和治疗方法的充分公开和说明，需要说明的是，这些实施例仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
实施例中应用了本发明中的各种TCR恒定区与靶向NY-ESO-1或p53(R175H)的TCR可变区进行组合以得到完整的TCR，并对其进行了功能上的验证。
人源TCR(hTCR)相关的实验中，利用了包含全人源的TCR恒定区的TCR：TP-2和TP-66和包含在全人源的TCR恒定区的基础上突变了内源二硫键的TCR：TP-9作为对照。TP-9为在TP-2序列的基础上，分别把α链的恒定区的第95个氨基酸位点(半胱氨酸)位点突变为精氨酸，把β链的恒定区的第131个氨基酸位点(半胱氨酸)突变为精氨酸，以帮助去除α链和β链之间天然形成的二硫键。
鼠源TCR(mTCR)相关的实验中，利用了包含全鼠源的TCR恒定区的TCR：TP-16M和包含在全鼠源的TCR恒定区的基础上突变了内源二硫键的TCR：TP-17M作为对照。
实施例中涉及到的TCR均含有两条多肽链，基因序列通过furin和p2A蛋白酶切位点多肽段相连，两条多肽链将一同被转录并翻译成一条融合多肽，之后再被furin和p2A对应的蛋白酶切割成为两个独立的蛋白亚基，这两个亚基间通过二硫键共价结合。整个TCR基因通过限制性内切酶切位点XbaI和BamHI插入进慢病毒表达载体pCDH中。该载体携带氨苄抗性、EF-1α启动子以及RFP荧光报告基因。
实施例1 INESS-hTCR的构建
具体构建方法如下：
1.TCR恒定区序列确定
INESS-hTCR包含的TCR恒定区为在原始人源TCR(hTCR)恒定区序列的基础上，分别把α链和β链的恒定区的CYS1～9位点处氨基酸残基突变为半胱氨酸。hTCR的α链和β链的恒定区(C区)及靶向NY-ESO-1和p53(R175H)的TCR的可变区(V区)的基因序列均在擎科生物公司合成；并将包含靶向NY-ESO-1的TCR V区的质粒命名为TP-WTHC1～TP-WTHC9，将包含靶向p53(R175H)的TCR V区的质粒命名为P53-WTHC1～P53-WTHC9。
2.INESS-hTCR质粒的构建
构成各质粒的片段分别从合成的基因片段上通过PCR克隆获得，相对应的位点突变由引物带入，所有PCR引物都带有与前后序列片段或载体同源的15～20bp碱基。pCDH载体通过XbaI和BamHI进行酶切。将PCR产物和线性化载体进行琼脂糖凝胶电泳并利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)进行回收，回收后的各片段和线性化载体通过pEASY*-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物技术股份有限公司)进行重组连接。重组连接产物转化至DH5α菌株，并使涂布至含氨苄的LB平板上过夜生长。挑单克隆菌进行测序。将测序正确的克隆菌液接种在LB液体培养基中，过夜培养，并提取质粒，再次测序正确后进行后续实验。
实施例2 INESS-hTCR的功能验证
1.慢病毒包装
将携带目标基因的pCDH质粒与包装质粒pMDLg、pRSV-Rev、pMD2.G(质粒购买于Addgene)按4:2:1:1比例转染进293T细胞(使用PEI转染)。收集48小时和72小时的细胞培养基上清，并通过PEG8000将病毒浓缩20倍，浓缩后的病毒立即使用或置于-80℃冰箱保存。
2.人原代T细胞的分离、培养和慢病毒感染。
取得人外周血细胞，分离出其中的单核细胞(PBMC)，在含10％灭活血清的RPMI1640培养基中培养4h，取悬浮于上清中的细胞铺种在用CD3(5μg/mL)的抗体和Retronectin(5μg/mL)coat 14h后的孔板内，激活24h后，加入慢病毒液进行感染。感染方法为32℃，1500rpm离心1.5小时。感染后，在含10％灭活血清和200IU/mL IL-2的RPMI 1640培养基中培养至足够数量。
3.INESS-hTCR在人原代T细胞中表达效率和上膜水平检测。
取感染5天后的细胞，用MHC抗原肽复合物四聚体NY-ESO-1Tetramer或p53(R175H)Tetramer染色，之后进行流式检测，分析表达效率及上膜水平。结果见图2-图3。
4.INESS-hTCR在人原代T细胞中的功能验证。
NY-ESO-1阳性靶细胞为Huh7-0201-NY-ESO-1-luc/GFP细胞(Huh7细胞为人肝癌细胞系，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号SCSP-526；稳转入NY-ESO-1(Uniprotpk编号：P78358-1)、Luciferase(Uniprotpk编号：P08659)和GFP基因(Uniprotpk编号：P42212)，从而构建得到)，p53(R175H)阳性靶细胞为KLE-luc/GFP细胞(KLE细胞为来源于人类子宫内膜腺癌肿瘤细胞系，该细胞内p53蛋白的175位氨基酸由R突变为H，购自武汉普诺赛生命科技有限公司，目录号CL-0133；稳转入Luciferase(Uniprotpk编号：P08659)和GFP基因(Uniprotpk编号：P42212)，从而构建得到)。将上述得到的T细胞与对应靶细胞按照一定的效靶比(NY-ESO-1相关效靶比为1:9；p53(R175H)相关效靶比为4:1)进行共培养。24小时后，用萤火虫荧光素酶试剂盒(购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司)检测存活的靶细胞量，计算靶细胞死亡百分比(图4中A，D)，用ELISA试剂盒(购自赛默飞世尔科技公司)检测共培养上清中细胞因子IL-2和IFN-γ(图4中B，C)。
实施例3 INESS-sTCR的构建
1.TCR恒定区序列确定
INESS-sTCR为在实施例1中TP-WTHC5序列的基础上，对α链和β链的恒定区分别进行4857突变，mm突变，TMa突变或同时进行三种突变，并依次命名为TP-WTHC5-4857，TP-WTHC5-mm，TP-WTHC5-TMa和TP-WTC5；在实施例1中TP-WTHC9序列的基础上，对α链和β链的恒定区分别进行4857突变，mm突变，TMa突变或同时进行三种突变，并依次命名为TP-WTHC9-4857，TP-WTHC9-mm，TP-WTHC9-TMa和TP-WTC9。
2.INESS-sTCR质粒的构建
构成各质粒的片段分别从TP-WTHC5或TP-WTHC9质粒上PCR克隆获得。相对应的位点突变由引物带入，所有PCR引物都带有与前后序列片段或载体同源的15～20bp碱基。pCDH载体通过XbaI和BamHI进行酶切。将PCR产物和线性化载体进行琼脂糖凝胶电泳并利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)进行回收，回收后的各片段和线性化载体通过pEASY*-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物技术股份有限公司)进行重组连接。重组连接产物转化至DH5α菌株，并使涂布至含氨苄的LB平板上过夜生长。挑单克隆菌进行测序。将测序正确的克隆菌液接种在LB液体培养基中，过夜培养，并提取质粒，再次测序正确后进行后续实验。
实施例4 INESS-sTCR的功能验证
与实施例2同理。结果见图5-图7。
实施例5 INESS-mutEC-hTCR的构建
1.TCR恒定区序列确定
INESS-mutEC-hTCR为在实施例1中9种TCR：TP-WTHC1～TP-WTHC9序列的基础上，分别把α链的恒定区的第95个氨基酸位点(半胱氨酸)位点突变为精氨酸，把β链的恒定区的第131个氨基酸位点(半胱氨酸)突变为精氨酸，以解除α链和β链之间天然形成的二硫键，并命名为TP-HC1～TP-HC19；
2.INESS-mutEC-hTCR质粒的构建
构成各质粒的片段分别从TP-WTHC1～9质粒上PCR克隆获得。相对应的位点突变由引物带入，所有PCR引物都带有与前后序列片段或载体同源的15～20bp碱基。pCDH载体通过XbaI和BamHI进行酶切。将PCR产物和线性化载体进行琼脂糖凝胶电泳并利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)进行回收，回收后的各片段和线性化载体通过pEASY*-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物技术股份有限公司)进行重组连接。重组连接产物转化至DH5α菌株，并使涂布至含氨苄的LB平板上过夜生长。挑单克隆菌进行测序。将测序正确的克隆菌液接种在LB液体培养基中，过夜培养，并提取质粒，再次测序正确后进行后续实验。
实施例6 INESS-mutEC-hTCR的功能验证
与实施例2同理。结果见图8-图10。
实施例7 INESS-mutEC-sTCR的构建
1.TCR恒定区序列确定
INESS-mutEC-sTCR为在实施例2中8种TCR序列：TP-WTHC5-4857，TP-WTHC5-mm，TP-WTHC5-TMa，TP-WTC5，TP-WTHC9-4857，TP-WTHC9-mm，TP-WTHC9-TMa，TP-WTC9的基础上，分别把α链的恒定区的第95个氨基酸位点(半胱氨酸)位点突变为精氨酸，把β链的恒定区的第131个氨基酸位点(半胱氨酸)突变为精氨酸，以解除α链和β链之间天然形成的二硫键，并分别命名TP-HC5-4857，TP-HC5-mm，TP-HC5-TMa，TP-C5，TP-HC9-4857，TP-HC9-mm，TP-HC9-TMa，TP-C9。
2.INESS-mutEC-sTCR质粒的构建
构成各质粒的片段分别从实施例2中的8个质粒上PCR克隆获得。相对应的位点突变由引物带入，所有PCR引物都带有与前后序列片段或载体同源的15～20bp碱基。pCDH载体通过XbaI和BamHI进行酶切。将PCR产物和线性化载体进行琼脂糖凝胶电泳并利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)进行回收，回收后的各片段和线性化载体通过pEASY*-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物技术股份有限公司)进行重组连接。重组连接产物转化至DH5α菌株，并使涂布至含氨苄的LB平板上过夜生长。挑单克隆菌进行测序。将测序正确的克隆菌液接种在LB液体培养基中，过夜培养，并提取质粒，再次测序正确后进行后续实验。
实施例8 INESS-mutEC-sTCR的功能验证
与实施例2同理。结果见图11-图13。
实施例9 INESS-mul-TCR的构建
1.TCR恒定区序列确定
INESS-mul-TCR包含4种TCR：TP-HC56，TP-HC69，TP-HC59，TP-HC569。TP-HC56为实施例7中的TP-HC5-4857；TP-HC69为实施例7中的TP-HC6-4857；在TP-HC5序列的基础上，进行CYS9突变，并命名为TP-HC59；在TP-HC56序列的基础上，进行CYS9突变，并命名为TP-HC569。
2.INESS-mul-TCR质粒的构建
构成各质粒的片段分别从TP-HC5质粒上克隆获得。相对应的位点突变由引物带入，所有PCR引物都带有与前后序列片段或载体同源的15～20bp碱基。pCDH载体通过XbaI和BamHI进行酶切。将PCR产物和线性化载体进行琼脂糖凝胶电泳并利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)进行回收，回收后的各片段和线性化载体通过pEASY*-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物技术股份有限公司)进行重组连接。重组连接产物转化至DH5α菌株，并使涂布至含氨苄的LB平板上过夜生长。挑单克隆菌进行测序。将测序正确的克隆菌液接种在LB液体培养基中，过夜培养，并提取质粒，再次测序正确后进行后续实验。
实施例10 INESS-mul-TCR的功能验证
与实施例2同理。结果见图14-图16。
实施例11 INESS-mTCR的构建
1.TCR恒定区序列确定
INESS-mTCR包含的TCR恒定区为在原始鼠源TCR(mTCR)恒定区序列的基础上，分别把α链和β链的恒定区的mCYS1～9位点处氨基酸残基突变为半胱氨酸。mTCR的α链和β链的恒定区(C区)及靶向NY-ESO-1的TCR的可变区(V区)的基因序列均在擎科生物公司合成。本实施例中包含2种TCR：TP-WTMC5，TP-WTMC9。TP-WTMC5包含的TCR恒定区为在mTCR恒定区序列的基础上，进行mCYS5突变；TP-WTMC5包含的TCR恒定区为在mTCR恒定区序列的基础上，进行mCYS9突变。对照组为TP-16M：包含原始鼠源TCR(mTCR)恒定区序列。TP-16M的核苷酸序列为SEQ ID NO:81(TRBC)、SEQ ID NO:82(TRAC)。
2.INESS-mTCR质粒的构建
构成各质粒的片段分别从合成的基因片段上通过PCR克隆获得，相对应的位点突变由引物带入，所有PCR引物都带有与前后序列片段或载体同源的15～20bp碱基。pCDH载体通过XbaI和BamHI进行酶切。将PCR产物和线性化载体进行琼脂糖凝胶电泳并利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)进行回收，回收后的各片段和线性化载体通过pEASY*-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物技术股份有限公司)进行重组连接。重组连接产物转化至DH5α菌株，并使涂布至含氨苄的LB平板上过夜生长。挑单克隆菌进行测序。将测序正确的克隆菌液接种在LB液体培养基中，过夜培养，并提取质粒，再次测序正确后进行后续实验。
实施例12INESS-mTCR的功能验证
与实施例2同理。结果见图17-图19。
实施例13INESS-mutEC-mTCR的构建
1.TCR恒定区序列确定
INESS-mutEC-mTCR包含2种TCR：TP-MC5，TP-MC9；对照组为TP-17M。TP-17M为在实施例11中的TP-16M序列的基础上，分别把α链的恒定区的第91个氨基酸位点(半胱氨酸)位点突变为精氨酸，把β链的恒定区的第127个氨基酸位点(半胱氨酸)突变为精氨酸，以帮助去除α链和β链之间天然形成的二硫键，TP-17M的核苷酸序列为SEQ ID NO:83(TRBC)、SEQID NO:84(TRAC)。在TP-17M序列的基础上，进行mCYS5突变，并命名为TP-MC5；在TP-17M序列的基础上，进行mCYS9突变，并命名为TP-MC9。
2.INESS-mutEC-mTCR质粒的构建
构成各质粒的片段分别从TP-17M质粒上通过PCR克隆获得，相对应的位点突变由引物带入，所有PCR引物都带有与前后序列片段或载体同源的15～20bp碱基。pCDH载体通过XbaI和BamHI进行酶切。将PCR产物和线性化载体进行琼脂糖凝胶电泳并利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)进行回收，回收后的各片段和线性化载体通过pEASY*-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物技术股份有限公司)进行重组连接。重组连接产物转化至DH5α菌株，并使涂布至含氨苄的LB平板上过夜生长。挑单克隆菌进行测序。将测序正确的克隆菌液接种在LB液体培养基中，过夜培养，并提取质粒，再次测序正确后进行后续实验。
实施例14INESS-mutEC-mTCR的功能验证
与实施例2同理。结果见图20-图22。

Claims (14)

1.引入外源二硫键的TCR恒定区，其特征在于，包括：
(1)位于α链的点突变1，选自：
与参与内源二硫键形成的氨基酸位点在氨基酸序列在N端方向间隔3、5、41、42、78、82个氨基酸的位点，或，C端方向间隔4、6、24、31、38、39个氨基酸的位点中的任一或多突变为C；
和/或；
(2)位于β链的点突变2，选自：
与参与内源二硫键形成的氨基酸位点在氨基酸序列：N端方向间隔1、45、72、76、104、111、112、116个氨基酸的位点，或，C端方向间隔17、18、24、31个氨基酸的位点中的任一或多突变为C。
2.根据权利要求1所述的TCR恒定区，其特征在于，所述的TCR恒定区选自以下任一：
A、所述的TCR恒定区为人源TCR恒定区，所述的人源TCR恒定区包括：
hTRAC基础上包括突变1，和，hTRBC基础上包括突变2；
所述的突变1选自：P89C，M134C，F20C，V127C，V100C，L12C，R53C，K102C中的任一或多；
所述的突变2选自：A19C，V163C，Y149C，A156C，A129C，F14C，S54C，T85C中的任一或多；
所述的hTRAC的氨基酸序列在UniProtKB编号为A0A5H1ZRS8；
所述的hTRBC选自hTRBC1或hTRBC2；
所述的hTRBC1的氨基酸序列在UniProtKB编号为A0A5H1ZRT1；
所述的hTRBC2的氨基酸序列在UniProtKB编号为A0A5H1ZRR3或A0A0G2JMB4；
B、所述的TCR恒定区为鼠源TCR恒定区，所述的鼠源TCR恒定区包括：
mTRAC基础上包括突变3，和，mTRBC基础上包括突变4；
所述的突变3选自：S87C，T131C，L116C，V123C，T96C，L12C，K53C，K98C中的任一或多；
所述的突变4选自：A22C，V159C，Y145C，A152C，A125C，F14C，S54C，T81C中的任一或多；
所述的mTRAC的氨基酸序列为UniProtKB编号为A0A991BQX6；
所述的mTRBC选自mTRBC1或mTRBC2；
所述的mTRBC1的UniProtKB编号为P01852；
所述的mTRBC2的UniProtKB编号为P01851；
C、A或B中的TCR恒定区的截短体。
3.根据权利要求2所述的TCR恒定区，其特征在于，选自以下任一：
1)所述的人源TCR恒定区中：
所述的突变1选自：CYS1-P89C，CYS2-M134C，CYS3-F20C，CYS4-V127C，CYS5-V100C，CYS7-L12C，CYS8-R53C，CYS9-K102C中的任一；
所述的突变2选自CYS1-A19C，CYS2-V163C，CYS3-Y149C，CYS4-A156C，CYS5-A129C，CYS7-F14C，CYS8-S54C，CYS9-T85C8中的任一；
所述的突变1和突变2中相同编号为一配对的外源二硫键形成位点；
所述的人源TCR恒定区中包括任一个或多个外源二硫键形成位点；
2)所述的鼠源TCR恒定区中：
所述的突变3选自：mCYS1-S87C，mCYS2-T131C，mCYS3-L116C，mCYS4-V123C，mCYS5-T96C，mCYS7-L12C，mCYS8-K53C，mCYS9-K98C8中的任一；
所述的突变4选自：mCYS1-A22C，mCYS2-V159C，mCYS3-Y145C，mCYS4-A152C，mCYS5-A125C，mCYS7-F14C，mCYS8-S54C，mCYS9-T81C8中的任一；
所述的突变3和突变4中相同编号为一配对的外源二硫键形成位点；
所述的鼠源TCR恒定区中包括任一个或多个外源二硫键形成位点；
3)如1)所述的人源TCR恒定区或2)中所述的鼠源TCR恒定区的截短体。
4.根据权利要求3所述的TCR恒定区，其特征在于，还包括内源二硫键位点的突变，所述的内源二硫键位点突变后不形成内源二硫键；
优选地，所述的内源二硫键位点突变为A；
进一步优选，所述的内源二硫键位点的突变选自以下任一：
(1)mTRAC包括C91A，和，mTRBC包括C127A；
(2)hTRAC包括C95A，和，hTRBC包括C131A。
5.根据权利要求4所述的TCR恒定区，其特征在于，还包括以下任一或多：
(1)hTRAC上包括T48C，和，hTRBC上包括S57C；或；mTRAC上包括T48C，和，mTRBC上包括S57C；用于形成外源二硫键；
(2)hTRAC上包括S61R，和，hTRBC上包括R79G；或；mTRAC上包括G61R，和，mTRBC上包括R75G；用于形成Knob-into-hole结构；
(3)hTRAC上包括P91S、E92D、S93V、S94P中的任一或多；和/或，hTRBC上包括E18R、S22A、F133I、V1 6A、Q139H中的任一或多；
(4)hTRAC上包括S115L、G119V、F120L中的任一或多；或，mTRAC上包括S112L、M114I、G115V、G61R中的任一或多。
6.权利要求1-5任一项所述的TCR恒定区在构建TCR、TCR嵌合受体或TCR融合蛋白中的应用。
7.包括权利要求1-5任一项所述的TCR恒定区的产品，其特征在于，所述的产品选自：TCR、TCR嵌合受体或TCR融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，还包括TCR可变区；优选地，TCR可变区靶向的抗原类型包括NY-ESO-1、MAGE-A1/3/4/6、MAGE-C2、MART-1、WT1、PRAME、gp100、MCPyV、hTG、TRAIL、HERV-E、HA-1、Tyrosinase、TGFβRII、HBV、HPV、CMV、EBV、HIV、AFP、HER2、MSLN、KK-LC-1、KRAS突变体、P53突变体中的任一或多。
9.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，还包括抗原识别区域：包含抗体、受体或配体；优选地，抗原识别区域靶向的抗原类型包括CD19、CD20、CD22、BCMA、CD79A、TRBC1、TRBC2、GPRC5D、CD123、CD33、CLL1、Siglec6、CD70、GCC、GPC3、Claudin18.2、Claudin6、MSLN、GD2、IL13Rα2、CD7、Gucy2c、B7H3、EpCAM、CEA、CEACAM-1、EGFR、EGFRVIII、DLL3、Nectin4中的任一或多。
10.一种基因工程产物，其特征在于，选自以下任一：
(1)核酸分子，编码：权利要求1-5任一项所述的TCR恒定区或权利要求7-9任一项所述的产品；
(2)表达载体：包括(1)所述核酸分子，或，表达权利要求1-5任一项所述的TCR恒定区或权利要求7-9任一项所述的产品；
(3)细胞：转入(2)所述表达载体，或，表达或分泌权利要求1-5任一项所述的TCR恒定区或权利要求7-9任一项所述的产品；
优选地，所述的细胞选自：T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞；细胞来源为病人自体、健康志愿者、脐带血或体外诱导的多功能干细胞。
11.权利要求1-5任一项所述的TCR恒定区或权利要求7-9任一项所述的产品或权利要求10所述的基因工程产物在制备下游产品中的应用，其特征在于，所述的下游产品选自以下任一：
(1)检测试剂，用于结合抗原作出判断或获取其结合的抗原；
(2)药物，用于预防或治疗疾病，优选地，所述的疾病包含肿瘤、自身免疫病、病毒感染、真菌感染或细菌感染。
12.一种下游产品，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的TCR恒定区或权利要求7-9任一项所述的产品或权利要求10所述的基因工程产物，所述的下游产品选自以下任一：
(1)检测试剂，包括或不包括辅料；
(2)药物，包括或不包括辅料。
13.一种抗原检测方法，其特征在于，包括：使用权利要求12所述的产品中的检测试剂与待测物接触进行检测。
14.一种疾病预防或治疗方法，其特征在于，向有需要的病人施用权利要求12所述的产品中的药物。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104017067A (zh) * 2009-07-03 2014-09-03 英美偌科有限公司 T细胞受体
CN107108717A (zh) * 2015-05-20 2017-08-29 广州市香雪制药股份有限公司 一种可溶且稳定的异质二聚tcr
US20180355012A1 (en) * 2014-11-07 2018-12-13 Guangdong Xiangxue Life Science, Ltd. Soluble heterodimeric t cell receptor, and preparation method and use thereof
CN112239495A (zh) * 2020-10-29 2021-01-19 上海药明生物技术有限公司 稳定的tcr结构及应用
CN115947824A (zh) * 2022-11-09 2023-04-11 北京可瑞生物科技有限公司 突变的人源t细胞受体恒定区、t细胞受体及t细胞受体修饰的细胞及应用
CN116034113A (zh) * 2019-12-30 2023-04-28 华夏英泰（北京）生物技术有限公司 一种增强型t细胞受体star及其应用
CN116648256A (zh) * 2020-12-21 2023-08-25 酵活生物制药有限公司 稳定化的tcr构建体及使用方法
CN117659163A (zh) * 2022-09-08 2024-03-08 香雪生命科学技术（广东）有限公司 一种识别afp的高亲和力t细胞受体及其应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104017067A (zh) * 2009-07-03 2014-09-03 英美偌科有限公司 T细胞受体
US20180355012A1 (en) * 2014-11-07 2018-12-13 Guangdong Xiangxue Life Science, Ltd. Soluble heterodimeric t cell receptor, and preparation method and use thereof
CN107108717A (zh) * 2015-05-20 2017-08-29 广州市香雪制药股份有限公司 一种可溶且稳定的异质二聚tcr
CN116034113A (zh) * 2019-12-30 2023-04-28 华夏英泰（北京）生物技术有限公司 一种增强型t细胞受体star及其应用
CN112239495A (zh) * 2020-10-29 2021-01-19 上海药明生物技术有限公司 稳定的tcr结构及应用
CN116648256A (zh) * 2020-12-21 2023-08-25 酵活生物制药有限公司 稳定化的tcr构建体及使用方法
CN117659163A (zh) * 2022-09-08 2024-03-08 香雪生命科学技术（广东）有限公司 一种识别afp的高亲和力t细胞受体及其应用
CN115947824A (zh) * 2022-11-09 2023-04-11 北京可瑞生物科技有限公司 突变的人源t细胞受体恒定区、t细胞受体及t细胞受体修饰的细胞及应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CYRILLE J. COHEN ET AL.: ""Enhanced Antitumor Activity of T Cells Engineered to Express TCell Receptors with a Second Disulfide Bond"", 《CANCER RES.》, vol. 67, no. 8, 15 April 2007 (2007-04-15), pages 3898, XP002581931, DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-06-3986 *
FLAVIO SADIO ET AL.: ""Stabilization of soluble high-affinity T-cell receptor with de novodisulfide bonds"", 《FEBS LETTERS》, vol. 594, 8 October 2019 (2019-10-08), pages 477 - 490 *
LOGESVARAN KRSHNAN ET AL.: "A conservedαβtransmembrane interface forms the core of a compact T-cell receptor–CD3 structure within the membrane", 《PNAS》, 10 October 2016 (2016-10-10), pages 6649 *
王易: ""基于TCR恒定区结构改造的TCR-T细胞制备的优化及LDL-R表达为质控指标的评价方法的研究"", 《中国学位论文全文数据库》, 7 June 2024 (2024-06-07), pages 1 - 67 *
芮魏 等: "TCR-T细胞疗法的开发与产业化", 《中国新药杂志》, vol. 29, no. 21, 31 December 2020 (2020-12-31), pages 2443 - 2449 *
苏畅: ""恒定区结构域替换对TCR分子功能的影响"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》, 15 January 2017 (2017-01-15), pages 1 - 68 *

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