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CN107106670A - 用于修饰的t细胞的方法和组合物 - Google Patents

用于修饰的t细胞的方法和组合物 Download PDF

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CN107106670A
CN107106670A CN201580071613.7A CN201580071613A CN107106670A CN 107106670 A CN107106670 A CN 107106670A CN 201580071613 A CN201580071613 A CN 201580071613A CN 107106670 A CN107106670 A CN 107106670A
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CN
China
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cell
cells
modified
antigen
disease
Prior art date
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Application number
CN201580071613.7A
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English (en)
Inventor
赵阳兵
X·刘
C·H·琼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Pennsylvania Penn
Original Assignee
University of Pennsylvania Penn
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Publication date
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Abstract

本发明涉及用于生成修饰的细胞的组合物和方法，所述修饰的细胞具有编码T细胞受体(TCR)的核酸；编码双特异性抗体、亲和分子嵌合受体、双特异性亲和分子或嵌合配体工程化活化受体(CLEAR)的核酸。一个方面包括用于生成修饰的T细胞的方法。还包括用于过继疗法和治疗病症比如自身免疫性疾病的包括修饰的T细胞的方法和药物组合物。

Description

用于修饰的T细胞的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)有权享有均在2014年10月31日提交的美国临时专利申请号62/073,144、62/073,343、62/073,467、62/073,540和62/073,681的优先权，所有所述临时专利申请由此通过引用以其全部并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明在美国国立卫生研究院给予的CA120409下利用政府支持完成。政府拥有本发明中的某些权利。
背景技术
使用嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞的过继细胞转移(ACT)已经显示成为用于癌症治疗的有希望的策略(Louis等，2011,Blood 118:6050-6056；Kochenderfer等，2010,Blood 116:3875-3886和Porter等，2011,N Engl J Med 365:725-733)。
使用慢病毒或逆转录病毒载体的整合关联的安全关注是对用于ACT的细胞修饰的主要关注。正取得一些进步以避免中靶(on-target)或脱靶(off-target)的有害的副作用，比如使用T细胞受体(TCR)或CAR RNA电穿孔进行T细胞的RNA转染(Zhao,2006,Mol Ther13:151-159；Mitchell等，Smits等，2004,Leukemia 18:1898-1902)。通过使RNA和T细胞二者的剂量最小化，这样的方法高效地允许引入多种基因。然而，对于CAR瞬时表达的主要约束是RNA转染的T细胞的亚适的效应物活性和功能。多种T细胞输注和/或显著使用低剂量化疗已经用于改进功能(Barrett等，2013,Hum Gene Ther 24(8):717-27)。
已经做出多种尝试以改进效应物活性和功能，同时避免联合疗法和额外的治疗。在转染过程期间增加RNA对T细胞功能——尤其是体内抗肿瘤活性——形成负面影响(Barrett等，2011,Hum Gene Ther 22:1575-1586)。额外地，也已经在癌症治疗的临床试验中测试了将抗CD3抗原抗体片段与抗肿瘤抗原抗体片段融合的可选的构建体(Bargou等，2008,Science 321:974-977；Klinger等，2012,Blood 119:6226-6233.)。不幸地，这些构建体在功能上严重地受限于短的半衰期、差的靶细胞位点的可及性、和缺乏适当的长期信号传导功能。
因此，对于基于T细胞的过继免疫疗法，存在对修饰T细胞同时生成T细胞——其在体内具有最大的效应物活性和功能——的较安全的方法的需要。
发明内容
如本文描述的，本发明涉及用于修饰T细胞的组合物和方法。
在一方面，本发明包括修饰的T细胞，其包括编码T细胞受体(TCR)——其包括对靶细胞上的抗原的亲和力——的外源性核酸和电穿孔的编码双特异性抗体的RNA，其中T细胞在T细胞的表面上表达TCR和双特异性抗体。
在另一方面，本发明包括用于生成修饰的T细胞的方法，其包括将编码修饰的T细胞受体(TCR)——其包括对靶细胞上的抗原的亲和力——的核酸引入T细胞和引入编码双特异性抗体的核酸，其中电穿孔的T细胞能够表达TCR和双特异性抗体。
在又另一方面，本发明包括本文描述的T细胞在制造用于治疗需要其的对象中的免疫应答的药物中的用途。
在还另一方面，本发明包括用于刺激针对对象中的靶细胞或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用有效量的修饰的T细胞，所述修饰的T细胞包括电穿孔有编码修饰的T细胞受体(TCR)的RNA和编码双特异性抗体的RNA，其中修饰的T细胞表达修饰的TCR和双特异性抗体。
在另一方面，本发明包括用于过继细胞转移疗法的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象以预防或治疗不利于对象的免疫反应，其中修饰的T细胞已经电穿孔有编码修饰的T细胞受体(TCR)的RNA和编码双特异性抗体的RNA。
在又另一方面，本发明包括治疗与对象中增强的免疫性相关联的疾病或病症的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象，其中修饰的T细胞已经电穿孔有编码修饰的T细胞受体(TCR)的RNA和编码双特异性抗体的RNA。
在还另一方面，本发明包括治疗对象中的病症的方法，其包括给对象施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括如本文描述的修饰的T细胞。
在另一方面，本发明包括包含修饰的T细胞的组合物。在另一方面，本发明包括药物组合物，其包括权利要求1的修饰的T细胞和药学上可接受的载体。
在本文描述的本发明的上述方面或任何其它方面的多种实施方式中，TCR包括至少一个二硫键。在一个实施方式中，TCR包括至少一个鼠恒定区。在另一个实施方式中，TCR具有比野生型TCR更高的对靶细胞抗原的亲和力。在又另一个实施方式中，TCR包括TCRα和β链。在一个实施方式中，TCR在至少一个链的C’端处包括共刺激信号传导结构域，比如4-1BB共刺激信号传导结构域。在一个实施方式中，β链包括至少一个N-去糖基化。在一个实施方式中，α链包括至少一个N-去糖基化。
在另一个实施方式中，靶细胞抗原选自病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤细胞相关抗原(TAA)、疾病细胞相关抗原和其任意片段。
在另一个实施方式中，双特异性抗体包括双特异性抗原结合结构域，其选自合成抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段、单结构域抗体、其抗原结合片段、和其任意组合。在又另一个实施方式中，双特异性抗原结合结构域包括第一和第二单链可变片段(scFv)分子，比如第一scFv分子特异于靶细胞上的至少一种抗原和第二scFv分子特异于活化T细胞(activating T cell)上的抗原。
在另一个实施方式中，活化T细胞抗原选自CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、TCR、PD1和PD1L。
在另一个实施方式中，本文描述的T细胞进一步包括电穿孔的编码共刺激分子的核酸。在又另一个实施方式中，T细胞获得自外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系。
在另一个实施方式中，共刺激分子选自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1和PD1L。在又另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括将编码CD3的RNA电穿孔入T细胞。在一个实施方式中，CD3 RNA与TCR核酸被共电穿孔。
在另一个实施方式中，核酸包括体外转录的RNA或合成RNA。在又另一个实施方式中，编码TCR的核酸包括编码TCRα链和TCRβ链的核酸。在一个实施方式中，引入核酸的步骤包括共电穿孔编码TCRα链的RNA和编码TCRβ链的分开的RNA。
在另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括扩展T细胞。在一个实施方式中，扩展包括使用选自flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3和c-kit配体的因子培养T细胞。在一个实施方式中，扩展包括使用编码嵌合膜蛋白的RNA电穿孔T细胞，比如包括抗CD3的单链可变片段(scFv)和胞内结构域——其包括CD28和4-1BB的胞内结构域的片段——的嵌合膜蛋白；并且培养电穿孔的T细胞。
在另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括冷藏T细胞。在一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括在将核酸引入T细胞之前解冻冷藏的T细胞。在又另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括在引入TCR核酸后冷藏T细胞。在还另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括将双特异性抗体表达为膜蛋白。在还另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括冷藏引入双特异性抗体的T细胞。在又另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括诱导靶细胞或组织的裂解。在一个实施方式中，诱导的裂解是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在另一个实施方式中，病症是自身免疫性疾病，比如选自获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、乳糜泻(celiacsprue)-疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、疤痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、CREST综合征、克罗恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎(dermatomyositis-juvenile)、盘状狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、青少年慢性关节炎(斯提耳氏病)、青少年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血(pernacious anemia)、结节性多动炎症、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性全身性硬化症(PSS)，也称为全身性硬化症(SS))、斯耶格伦氏综合征、僵体综合征、系统性红斑狼疮、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、眼葡萄膜炎、白斑病、韦格纳氏肉芽肿病和其任意组合的自身免疫性疾病。在又另一个实施方式中，病症是癌症，比如选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌和其任意组合的癌症。
在一方面，本发明包括修饰的T细胞，其包括编码双特异性抗体——其包括对靶细胞上的抗原和T细胞上的抗原的双特异性——的核酸和编码嵌合配体工程化活化受体(chimeric ligand engineered activation receptor)(CLEAR)的核酸，其中T细胞表达双特异性抗体和CLEAR。
在另一方面，本发明包括本文描述的T细胞在制造用于治疗需要其的对象中的免疫应答的药物中的用途。
在又另一方面，本发明包括用于生成修饰的T细胞的方法，其包括将编码双特异性抗体的核酸和编码嵌合配体工程化活化受体(CLEAR)的核酸引入T细胞，其中T细胞能够表达双特异性抗体和CLEAR。
在还另一方面，本发明包括用于刺激针对对象中的靶细胞或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用有效量的修饰的T细胞，所述修饰的T细胞包括编码嵌合配体工程化活化受体(CLEAR)的核酸和编码双特异性抗体——其具有对靶细胞上的抗原和T细胞上的CLEAR的双特异性——的核酸，其中修饰的T细胞表达CLEAR和双特异性抗体。
在另一方面，本发明包括用于过继细胞转移疗法的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象以预防或治疗不利于对象的免疫反应，其中修饰的T细胞包括编码嵌合配体工程化活化受体(CLEAR)的核酸和编码双特异性抗体——其具有对靶细胞上的抗原和T细胞上的CLEAR的双特异性——的核酸。
在又另一方面，本发明包括治疗与对象中增强的免疫性相关联的疾病或病症的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象，其中修饰的T细胞包括编码嵌合配体工程化活化受体(CLEAR)的核酸和编码双特异性抗体——其具有对靶细胞上的抗原和T细胞上的CLEAR的双特异性——的核酸。
在还另一方面，本发明包括治疗对象中的病症的方法，其包括给对象施用治疗有效量的药物组合物，其包括本文描述的修饰的T细胞。
在另一方面，本发明包括组合物，其包括本文描述的修饰的T细胞。在还另一方面，本发明包括药物组合物，其包括本文描述的修饰的T细胞和药学上可接受的载体。
在本文描述的本发明的上述方面或任何其它方面的多种实施方式中，CLEAR包括胞内活化结构域和胞外结构域。在一个实施方式中，胞内活化结构域包括CD3ζ的胞内活化结构域的一部分。在一个实施方式中，胞外结构域选自抗体的抗原结合结构域、受体的配体结合结构域、抗原和配体。在一个实施方式中，胞外结构域选自CD27、CD28、CD70、CD80、PD1和PD-L1。在一个实施方式中，胞外结构域能够结合至肿瘤抗原。
在另一个实施方式中，CLEAR进一步包括共刺激结构域。在一个实施方式中，共刺激结构域选自CD4、CD8和4-1BB。
在另一个实施方式中，靶细胞抗原选自病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤细胞相关抗原(TAA)、疾病细胞相关抗原和其任意片段。
在另一个实施方式中，双特异性抗体包括选自合成抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段、单结构域抗体、其抗原结合片段、和其任意组合的双特异性抗原结合结构域。在又另一个实施方式中，双特异性抗原结合结构域包括第一和第二单链可变片段(scFv)分子，比如第一scFv分子特异于靶细胞上的至少一种抗原和第二scFv分子特异于T细胞上的抗原。在还另一个实施方式中，双特异性抗体包括对靶细胞上的抗原和T细胞上的CLEAR的双特异性。
在另一个实施方式中，本文描述的T细胞进一步包括编码共刺激分子的核酸，比如选自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1和PD1L的共刺激分子。在还另一个实施方式中，本文描述的T细胞获得自外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系。
在另一个实施方式中，核酸中的至少一种通过选自转导T细胞、转染T细胞、和电穿孔T细胞的方法引入。在又另一个实施方式中，核酸中的至少一种包括体外转录的RNA或合成RNA。
在另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括扩展T细胞。在一个实施方式中，扩展包括使用选自flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3和c-kit配体的因子培养T细胞。在一个实施方式中，扩展包括使用编码嵌合膜蛋白的RNA电穿孔T细胞，比如包括抗CD3的单链可变片段(scFv)和胞内结构域——其包括CD28和4-1BB的胞内结构域的片段——的嵌合膜蛋白；并且培养电穿孔的T细胞。
在另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括冷藏T细胞。在一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括在将核酸引入T细胞之前解冻冷藏的T细胞。在又另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括在引入CLEAR核酸后冷藏T细胞。在还另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括将双特异性抗体表达为膜蛋白。在还另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括冷藏引入双特异性抗体的T细胞。在又另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括诱导靶细胞或组织的裂解。在一个实施方式中，诱导的裂解是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在另一个实施方式中，病症是自身免疫性疾病，比如选自获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、乳糜泻-疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、疤痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、CREST综合征、克罗恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、青少年慢性关节炎(斯提耳氏病)、青少年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动炎症、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性全身性硬化症(PSS)，也称为全身性硬化症(SS))、斯耶格伦氏综合征、僵体综合征、系统性红斑狼疮、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、眼葡萄膜炎、白斑病、韦格纳氏肉芽肿病和其任意组合的自身免疫性疾病。在又另一个实施方式中，病症是癌症，比如选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌和其任意组合的癌症。
在一方面，本发明包括修饰的T细胞，其包括编码亲和分子嵌合受体——其包括对靶细胞上的抗原具有亲和力的小分子胞外结构域——的核酸，其中T细胞表达亲和分子嵌合受体。
在另一方面，本发明包括修饰的细胞，其包括编码双特异性亲和分子——其包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域——的核酸，其中至少一个亲和结构域包括小分子抗原结合结构域并且细胞表达双特异性亲和分子。
在又另一方面，本发明包括用于生成修饰的T细胞的方法，其包括将编码亲和分子嵌合受体——其包括对靶细胞上的抗原具有亲和力的小分子胞外结构域——的核酸引入T细胞群，其中T细胞能够表达亲和分子嵌合受体。
在还另一方面，本发明包括用于生成修饰的细胞的方法，其包括将编码双特异性亲和分子——其包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域——的核酸引入细胞群，其中至少一个亲和结构域包括小分子抗原结合结构域并且细胞表达双特异性亲和分子。
在另一方面，本发明包括本文描述的修饰的T细胞或本文描述的修饰的细胞在制造用于治疗需要其的对象中的免疫应答的药物中的用途。
在又另一方面，本发明包括用于过继细胞转移疗法的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象以预防或治疗不利于对象的免疫反应，其中修饰的T细胞包括编码亲和分子嵌合受体——其包括对靶细胞上的抗原具有亲和力的小分子胞外结构域——的核酸。
在还另一方面，本发明包括用于过继细胞转移疗法的方法，其包括施用修饰的细胞群至需要其的对象以预防或治疗不利于对象的免疫反应，其中修饰的细胞包括编码双特异性亲和分子——其包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域——的核酸，其中至少一个亲和结构域包括小分子抗原结合结构域。
在另一方面，本发明包括治疗与对象中增强的免疫性相关联的疾病或病症的方法，其包括施用修饰的细胞群至需要其的对象，其中修饰的细胞包括编码双特异性亲和分子——其包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域——的核酸，其中至少一个亲和结构域包括小分子抗原结合结构域。
在又另一方面，本发明包括治疗对象中的病症的方法，其包括给对象施用治疗有效量的药物组合物，其包括本文描述的T细胞或本文描述的修饰的细胞。
在另一方面，本发明包括用于刺激针对对象中的靶细胞或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用有效量的修饰的T细胞，其中T细胞包括编码亲和分子嵌合受体——其包括对靶细胞上的抗原具有亲和力的小分子胞外结构域——的核酸。
在又另一方面，本发明包括用于刺激针对对象中的靶细胞或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用有效量的修饰的细胞，其中修饰的细胞包括编码双特异性亲和分子——其包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域——的核酸，其中至少一个亲和结构域包括小分子抗原结合结构域。
在还另一方面，本发明包括组合物，其包括本文描述的修饰的T细胞或本文描述的修饰的细胞。在又另一方面，本发明包括药物组合物，其包括本文描述的修饰的T细胞或本文描述的修饰的细胞和药学上可接受的载体。
在本文描述的本发明的上述方面或任何其它方面的多种实施方式中，靶细胞抗原选自病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤细胞相关抗原(TAA)、疾病细胞相关抗原和其任意片段。
在一个实施方式中，小分子胞外结构域包括缺少二硫桥(disulfide bridge)的螺旋结构。在另一个实施方式中，小分子胞外结构域小于大约10kD。
在另一个实施方式中，亲和分子嵌合受体进一步包括胞内信号传导结构域，比如CD3信号传导结构域。在又另一个实施方式中，亲和分子嵌合受体进一步包括共刺激信号传导结构域，比如4-1BB共刺激信号传导结构域。在还另一个实施方式中，亲和分子嵌合受体进一步包括跨膜结构域，比如CD8跨膜结构域。在又另一个实施方式中，亲和分子嵌合受体进一步包括TCR可变结构域和TCR恒定结构域。
在另一个实施方式中，本文描述的T细胞进一步包括编码共刺激分子的核酸，比如选自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1和PD1L的共刺激分子。在一个实施方式中，CD3包括至少两种不同的CD3链，比如CD3ζ链和CD3ε链。
在另一个实施方式中，能够结合靶细胞抗原的亲和结构域选自小分子抗原结合结构域和抗体的抗原结合结构域。在又另一个实施方式中，能够结合活化T细胞抗原的亲和结构域选自小分子抗原结合结构域和抗体的抗原结合结构域。
在另一个实施方式中，小分子抗原结合结构域包括缺少二硫桥的螺旋结构。在又另一个实施方式中，小分子抗原结合结构域每个小于大约10kD。
在另一个实施方式中，靶细胞抗原选自肿瘤相关抗原(TAA)、细菌抗原、寄生虫抗原、病毒抗原和其任意片段。在又另一个实施方式中，活化T细胞抗原是选自CD3、CD4、CD8、T细胞受体(TCR)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和与CD83特异性地结合的配体、和其任意片段的共刺激分子。
在另一个实施方式中，本文描述的T细胞用于治疗需要其的对象中的免疫应答的方法。在又另一个实施方式中，本文描述的细胞用于治疗需要其的对象中的免疫应答的方法。
在另一个实施方式中，核酸通过选自转导T细胞群、转染T细胞群和电穿孔T细胞群的方法引入。在又另一个实施方式中，核酸的引入包括电穿孔编码亲和分子嵌合受体的RNA。在还另一个实施方式中，核酸通过选自转导细胞群、转染细胞群和电穿孔细胞群的方法引入。在又另一个实施方式中，核酸的引入包括电穿孔编码双特异性亲和分子的RNA。
在另一个实施方式中，本文描述的细胞选自T细胞、B细胞、天然杀伤细胞和抗原呈递细胞。在又另一个实施方式中，T细胞获得自外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系。
在另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括将编码CD3的RNA电穿孔入T细胞。在一个实施方式中，CD3 RNA与编码亲和分子嵌合受体的核酸被共电穿孔。
在另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括在引入亲和分子嵌合受体核酸后冷藏T细胞。在又另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括冷藏T细胞。在还另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括在将亲和分子嵌合受体核酸引入T细胞之前解冻冷藏的T细胞。
在另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括扩展T细胞。在一个实施方式中，扩展包括使用选自flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3和c-kit配体的因子培养T细胞。在一个实施方式中，扩展包括使用编码嵌合膜蛋白的RNA电穿孔T细胞，比如嵌合膜蛋白包括抗CD3的单链可变片段(scFv)和胞内结构域——其包括CD28和4-1BB的胞内结构域的片段；并且培养电穿孔的T细胞。
在另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括使用双特异性亲和分子结合活化T细胞和靶细胞。
在另一个实施方式中，病症是自身免疫性疾病，比如选自获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、乳糜泻-疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、疤痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、CREST综合征、克罗恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、青少年慢性关节炎(斯提耳氏病)、青少年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动炎症、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性全身性硬化症(PSS)，也称为全身性硬化症(SS))、斯耶格伦氏综合征、僵体综合征、系统性红斑狼疮、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、眼葡萄膜炎、白斑病、韦格纳氏肉芽肿病和其任意组合的自身免疫性疾病。在又另一个实施方式中，病症是癌症，比如选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌和其任意组合的癌症。
在另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括诱导靶细胞或组织的裂解。在一个实施方式中，诱导的裂解是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在一方面，本发明包括修饰的T细胞，其包括电穿孔的编码双特异性T细胞衔接器(engager)(BiTE)分子的RNA，其中BiTE分子包括对靶细胞上的抗原和选自CD3、CD4、CD8和TCR的活化T细胞上的抗原的双特异性。
在另一方面，本发明包括用于生成修饰的T细胞的方法，其包括扩展T细胞群，和使用编码双特异性抗体的RNA电穿孔扩展的T细胞，其中电穿孔的T细胞能够表达双特异性抗体。
在又另一方面，本发明包括用于刺激针对对象中的靶细胞或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用有效量的修饰的T细胞，所述修饰的T细胞包括电穿孔的编码双特异性T细胞衔接器(BiTE)分子——其包括对靶细胞上的抗原和选自CD3、CD4、CD8和TCR的活化T细胞上的抗原的双特异性——的RNA。
在还另一方面，本发明包括用于过继细胞转移疗法的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象以预防或治疗不利于对象的免疫反应，其中修饰的T细胞已经被扩展和电穿孔有编码双特异性T细胞衔接器(BiTE)分子——其包括对靶细胞上的抗原和选自CD3、CD4、CD8和TCR的活化T细胞上的抗原的双特异性——的RNA。
在另一方面，本发明包括治疗与对象中增强的免疫性相关联的疾病或病症的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象，其中修饰的T细胞已经被扩展和电穿孔有编码双特异性T细胞衔接器(BiTE)分子——其包括对靶细胞上的抗原和选自CD3、CD4、CD8和TCR的活化T细胞上的抗原的双特异性——的RNA。
在又另一方面，本发明包括治疗对象中的病症的方法，其包括给对象施用治疗有效量的药物组合物，其包括本文描述的修饰的T细胞。
在还另一方面，本发明包括权利要求145的修饰的T细胞在制造用于治疗需要其的对象中的免疫应答的药物中的用途。
在另一方面，本发明包括组合物，其包括本文描述的修饰的T细胞。在又另一方面，本发明包括药物组合物，其包括本文描述的修饰的T细胞和药学上可接受的载体。
在本文描述的本发明的上述方面或任何其它方面的多种实施方式中，靶细胞抗原选自病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤细胞相关抗原(TAA)、疾病细胞相关抗原和其任意片段。
在一个实施方式中，双特异性抗体包括选自合成抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段、单结构域抗体、其抗原结合片段、和其任意组合的双特异性抗原结合结构域。在另一个实施方式中，双特异性抗原结合结构域包括第一和第二单链可变片段(scFv)分子，比如第一scFv分子特异于靶细胞上的至少一种抗原和第二scFv分子特异于活化T细胞上的抗原。
在另一个实施方式中，T细胞获得自外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系。
在另一个实施方式中，RNA包括体外转录的RNA或合成RNA。
在另一个实施方式中，扩展包括使用选自flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3和c-kit配体的因子培养T细胞。在又另一个实施方式中，其中扩展包括使用编码嵌合膜蛋白的RNA电穿孔T细胞，比如嵌合膜蛋白包括抗CD3的单链可变片段(scFv)和胞内结构域——其包括CD28和4-1BB的胞内结构域的片段；并且培养电穿孔的T细胞。
在另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括冷藏扩展的T细胞。在又另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括解冻冷藏的T细胞用于使用编码双特异性抗体的RNA进行电穿孔。在还另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括将双特异性抗体表达为膜蛋白。在又另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括冷藏双特异性抗体电穿孔的T细胞。
在另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括诱导靶细胞或包括靶细胞的组织的裂解。在一个实施方式中，诱导的裂解是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在另一个实施方式中，病症是自身免疫性疾病，比如选自获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、乳糜泻-疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、疤痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、CREST综合征、克罗恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、青少年慢性关节炎(斯提耳氏病)、青少年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动炎症、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性全身性硬化症(PSS)，也称为全身性硬化症(SS))、斯耶格伦氏综合征、僵体综合征、系统性红斑狼疮、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、眼葡萄膜炎、白斑病、韦格纳氏肉芽肿病和其任意组合的自身免疫性疾病。在又另一个实施方式中，病症是癌症，比如选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌和其任意组合的癌症。
在一方面，本发明包括修饰的T细胞，其包括编码T细胞受体(TCR)——其包括对靶细胞上的表面抗原的亲和力——的外源性核酸；和编码共刺激分子的核酸，其中T细胞表达TCR和共刺激分子。
在另一方面，本发明包括用于生成修饰的T细胞的方法，其包括将编码T细胞受体(TCR)的核酸——其包括对靶细胞上的表面抗原的亲和力——引入T细胞，和将编码共刺激分子的核酸引入T细胞，其中T细胞能够表达TCR和共刺激分子。
在又另一方面，本发明包括权利要求173的修饰的T细胞在制造用于治疗需要其的对象中的免疫应答的药物中的用途。
在还另一方面，本发明包括用于刺激针对对象中的靶细胞或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用有效量的修饰的T细胞，其中T细胞已经被扩展和电穿孔有编码修饰的T细胞受体(TCR)——其包括对靶细胞上的表面抗原的亲和力——的RNA。
在另一方面，本发明包括用于过继细胞转移疗法的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象以预防或治疗不利于对象的免疫反应，其中修饰的T细胞已经被扩展和电穿孔有编码修饰的T细胞受体(TCR)——其包括对靶细胞上的表面抗原的亲和力——的RNA。
在又另一方面，本发明包括治疗与对象中增强的免疫性相关联的疾病或病症的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象，其中修饰的T细胞已经被扩展和电穿孔有编码修饰的T细胞受体(TCR)——其包括对靶细胞上的表面抗原的亲和力——的RNA。
在还另一方面，本发明包括治疗对象中的病症的方法，其包括给对象施用治疗有效量的药物组合物，其包括本文描述的修饰的T细胞。
在另一方面，本发明包括组合物，其包括本文描述的修饰的T细胞。在又另一方面，本发明包括药物组合物，其包括本文描述的修饰的T细胞和药学上可接受的载体。
在本文描述的本发明的上述方面或任何其它方面的多种实施方式中，TCR包括至少一个二硫键。在一个实施方式中，TCR包括至少一个鼠恒定区。在另一个实施方式中，TCR具有比野生型TCR更高的对靶细胞抗原的亲和力。在又另一个实施方式中，TCR包括TCRα和β链。在一个实施方式中，TCR在至少一个链的C’端处包括共刺激信号传导结构域，比如4-1BB共刺激信号传导结构域。在一个实施方式中，β链包括至少一个N-去糖基化。在一个实施方式中，α链包括至少一个N-去糖基化。
在另一个实施方式中，编码共刺激分子的核酸被电穿孔入T细胞。在一个实施方式中，共刺激分子选自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1和PD1L。在一个实施方式中，CD3包括至少两种不同的CD3链。在一个实施方式中，不同的CD3链是CD3ζ和ε链。
在另一个实施方式中，靶细胞抗原选自病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤细胞相关抗原(TAA)、疾病细胞相关抗原和其任意片段。
在另一个实施方式中，核酸中的至少一种通过选自转导T细胞、转染T细胞和电穿孔T细胞的方法引入。在又另一个实施方式中，核酸中的至少一种包括体外转录的RNA或合成RNA。
在另一个实施方式中，T细胞获得自外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系。
在另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括扩展T细胞。在一个实施方式中，扩展包括使用选自flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3和c-kit配体的因子培养T细胞。在一个实施方式中，扩展包括使用编码嵌合膜蛋白的RNA电穿孔T细胞，比如嵌合膜蛋白包括抗CD3的单链可变片段(scFv)和胞内结构域——其包括CD28和4-1BB的胞内结构域的片段；并且培养电穿孔的T细胞。
在另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括冷藏T细胞。在又另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括在将编码TCR的核酸引入T细胞之前解冻冷藏的T细胞。在还另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括在引入TCR核酸后冷藏T细胞。
在另一个实施方式中，编码TCR的核酸包括编码TCRα链和TCRβ链的核酸。在一个实施方式中，引入核酸包括共电穿孔编码TCRα链的RNA和编码TCRβ链的分开的RNA。在又另一个实施方式中，引入编码共刺激分子的核酸包括将编码CD3的RNA电穿孔入T细胞。在一个实施方式中，CD3 RNA与TCR核酸被共电穿孔。
在另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括诱导靶细胞或组织的裂解。在一个实施方式中，诱导的裂解是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在另一个实施方式中，病症是自身免疫性疾病，比如选自获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、乳糜泻-疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、疤痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、CREST综合征、克罗恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、青少年慢性关节炎(斯提耳氏病)、青少年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动炎症、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性全身性硬化症(PSS)，也称为全身性硬化症(SS))、斯耶格伦氏综合征、僵体综合征、系统性红斑狼疮、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、眼葡萄膜炎、白斑病、韦格纳氏肉芽肿病和其任意组合的自身免疫性疾病。在又另一个实施方式中，病症是癌症，比如选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌和其任意组合的癌症。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方式的下列详细描述。出于说明本发明的目的，在附图中显示了当前优选的实施方式。然而，应当理解本发明不限于在附图中显示的实施方式的精确布置和手段。
图1是显示共电穿孔有TCR和BiTE的T细胞中的转基因表达的图组。T细胞共电穿孔有CD19.CD3(上组)或4D5.CD3(ErbB2)(中组)BiTE——有或没有CD3ζ和ε。电穿孔后十八小时，对T细胞进行TCR vb13.1和mIgG Fab(或Her2-Fc)的染色。下组显示了电穿孔后3天的TCR(vb13.1)表达。
图2是显示在使用肿瘤刺激的T细胞中上调的CD107a的图组。T细胞共电穿孔有如显示的RNA并且使用对CD19和NY-ESO-1(ESO)具有单或双阳性的肿瘤细胞系进行刺激。在4小时后评估CD107a上调。
图3是显示在使用肿瘤刺激的T细胞中上调的CD107a的图组。T细胞共电穿孔有如显示的RNA并且使用对CD19和NY-ESO-1(ESO)具有单或双阳性的肿瘤细胞系进行刺激。在4小时后评估CD107a上调。
图4是显示使用肿瘤细胞系刺激的电穿孔RNA的T细胞中的IFN-γ产生的图。
图5是显示使用肿瘤细胞系刺激的电穿孔RNA的T细胞中的IL-2产生的图。
图6是显示表达NY-ESO-1 TCR(1G4)和间皮素(mesothelin)BiTE(ss1.CD3)并且由肿瘤细胞刺激的T细胞中的CD107a上调的图组。
图7是显示静脉内注射有Naml6-ESO-CBG细胞(2×106个细胞)的小鼠中的肿瘤生长的图像组。肿瘤细胞注射后五天，如指示的，使用电穿孔RNA的T细胞处理小鼠(5只小鼠/组)。使用生物发光成像对肿瘤生长进行成像。
图8是显示具有增强的T细胞功能的表达双特异性RNA靶向肿瘤相关抗原的T细胞的图。
图9是图组，其显示T细胞上的TCR通过组合T细胞中的双特异性抗体识别关联MHC/肽和表面肿瘤抗原二者而没有HLA限制。
图10，包括图10A和10B，显示了电穿孔入T细胞的双特异性抗体RNA和TCR RNA的一系列构建体。
图11是图组，其显示T细胞通过修饰的NY-ESO-1 TCR和双特异性抗体识别关联抗原(HLA-A2/NY-ESO-1)和CD19或Her2二者。
图12是图解T细胞和靶肿瘤细胞之间的增强的嵌合配体工程化活化受体(CLEAR)的衔接和衔接相同的靶肿瘤细胞的另一个T细胞上的双特异性抗体的图。
图13，包括图13A和13B，是在本发明中生成的CLEAR和双特异性抗体的一系列构建体。
图14是显示在用CD27-BBZ或CD27-Z CLEAR RNA电穿孔后十八小时CD27在T细胞或K562细胞中表达(上组)和在细胞系中的CD70表达(下组)的图组。
图15是显示使用CD70阳性肿瘤细胞系刺激的电穿孔CD27 CLEAR RNA的T细胞中的CD107a上调的图组。
图16是显示电穿孔PD1 CLEAR RNA的T细胞中的PD1表达(上组)和使用PD-L1阳性肿瘤细胞Nalm6-PD-L1刺激后的T细胞中的CD107a上调的图组。
图17是显示使用PD-L1阳性肿瘤细胞Nalm6-PD-L1刺激的电穿孔PD1 CLEAR RNA的T细胞中的细胞因子产生的图。
图18是显示共电穿孔有PD1-Z和一PD-一meso(aPD-ameso)双特异性抗体RNA的T细胞中的转基因表达的图组。
图19是显示使用MESO阳性肿瘤细胞(K562-meso、SK-OV3和PC3)或MESO/PD-L1双阳性肿瘤细胞(PC3-PDL1)刺激的共电穿孔PD1-Z和一PD-一meso双特异性抗体RNA的T细胞中的CD107a上调的图组。
图20是显示使用MESO阳性肿瘤细胞(K562-meso和SK-OV3)刺激的共电穿孔PD1-Z和一PD-一meso双特异性抗体RNA的T细胞中的细胞因子产生的图组。
图21是显示共电穿孔有CD27-Z和一CD27-一ErbB2(aCD27-aErbB2)双特异性抗体RNA(上组)或CD19双特异性抗体RNA(下组)的T细胞中的转基因表达的图组。
图22是显示使用表达CD70和/或ErbB2的肿瘤细胞系刺激的电穿孔CD27-Z和一CD27-一ErbB2双特异性抗体RNA的T细胞中的CD107a上调的图组。
图23是显示使用表达CD70和/或CD19的肿瘤细胞系刺激的电穿孔CD27-Z和一CD27-一CD19双特异性抗体RNA的T细胞中的CD107a上调的图组。
图24是显示电穿孔有如指示的PD1-Z和抗PD1/抗ErbB2双特异性抗体的RNA的T细胞的图组。十八小时后，对电穿孔的T细胞进行抗PD1和抗mIgG Fab的染色。
图25是显示肿瘤细胞系(上组)和电穿孔ErbB2或Pd-L1 RNA的K562细胞(下组，电穿孔后18小时)的图组。对细胞进行PD-L1和ErbB2表达的染色。
图26是显示电穿孔的T细胞使用肿瘤系刺激4小时的图组。CD107a上调通过流式细胞术检测。
图27是显示电穿孔的T细胞使用肿瘤系刺激4小时的图组。CD107a上调通过流式细胞术检测。
图28是显示亲和抗体模拟物(mimetic)构建体的图示的图像。
图29是通过使用抗His抗体染色显示亲和抗体模拟物重定向的(redirected)T细胞(ART)的表达的图组。十毫克的编码针对EGFR(955.BBZ、1853.BBZ或1970.BBZ)或ErbB2(342.BBZ、432-15.BBZ、342-14.BBZ或342-4.BBZ)的ART的RNA被电穿孔入T细胞并且在R10中培养过夜。一百微升的电穿孔的T细胞通过抗His标签抗体染色用于ART表达的流式细胞术检测(下组)并且显示与未电穿孔(无EP)的T细胞相比，电穿孔有所有ARTRNA的T细胞被阳性染色。
图30是显示EGFR和ErbB2 ART的特异性的CD107a上调的图组。使用4种不同的肿瘤细胞系——其表达EGFR和/或ErbB2，如每种肿瘤的名称下方指示的——刺激如图29中显示的电穿孔的T细胞。在4h培育后，通过使用CD107a-PE、CD3-APC和CD8-FITC染色细胞来测量CD107a上调。如图29中显示的，所有EGFR ART仅仅对为EGFR阳性的肿瘤系(SK-OV3、MDA231和MDA468)强烈地反应，而不对EGFR阴性肿瘤MCF7强烈地反应。而所有ErbB2 ART对为ErbB2阳性的肿瘤系(SK-OV3、MDA231和MCF7)强烈地反应，而不对ErbB2阴性肿瘤MDA468强烈地反应。4D5.BBZ和2224.BBZ是分别针对ErbB2和EGFR的CAR。
图31是显示EGFR和ErbB2 ART的特异性的IFN-γ产生的图。使用4种不同的肿瘤细胞系——其表达EGFR和/或ErbB2，如每种肿瘤的名称下方指示的——刺激如图29中显示的电穿孔的T细胞。在过夜培育后，上清液被用于通过ELISA测量INF-γ产生。如该图中显示的，对于由为EGFR阳性的肿瘤系(SK-OV3、MDA231和MDA468)而非EGFR阴性肿瘤MCF7刺激的所有EGFR ART，可以在不同水平下检测到IFN-γ。而所有ErbB2ART对为ErbB2阳性的肿瘤系(SK-OV3、MDA231和MCF7)强烈地反应，而不对ErbB2阴性肿瘤MDA468强烈地反应。4D5.BBZ和2224.BBZ是分别针对ErbB2和EGFR的CAR。
图32是显示EGFR和ErbB2 ART的特异性的IL-2产生的图。使用四种不同的肿瘤细胞系——其表达EGFR和/或ErbB2，如每种肿瘤的名称下方指示的——刺激如图29中显示的电穿孔的T细胞。在过夜培育后，上清液被用于通过ELISA测量IL-2产生。如该图中显示的，对于由为EGFR阳性的肿瘤系(SK-OV3、MDA231和MDA468)而非EGFR阴性肿瘤MCF7刺激的所有EGFR ART，可以在不同水平下检测到IL-2。而所有ErbB2 ART对为ErbB2阳性的肿瘤系(SK-OV3、MDA231和MCF7)强烈地反应，而不对ErbB2阴性肿瘤MDA468强烈地反应。4D5.BBZ和2224.BBZ是分别针对ErbB2和EGFR的CAR。
图33是显示EGFR和ErbB2 ART的特异性的裂解活性的图。在单独实验中，测试两种EGFR和两种ErbB2 ART——与它们的相关的CAR相比——针对为EGFR和ErbB2二者阳性的肿瘤细胞系SK-OV3的杀伤能力。如附图中显示的，ART T细胞与相关的CAR T细胞一样高效地杀伤肿瘤细胞。
图34，包括图34A-34C，是显示亲和抗体模拟物修饰的TCR的图像组。图34A是通过添加亲和抗体模拟物和His-标签序列至TCR的α或β链的N’的亲和抗体模拟物修饰的TCR(Affi-TCR)的图示草图。图34B是显示电穿孔亲和抗体模拟物重定向的TCR(Affi-TCR)RNA的T细胞的Vb13.1 TCR和His-标签检测的图组。T细胞共电穿孔有NY-ESO-1(1G4)TCRα(a)和β(b)，或它们的ErbB2亲和抗体模拟物(342、342.15、342或342.4)修饰。过夜后，vb13.1和His-标签通过流式细胞术检测。图34C显示了ErbB2亲和抗体模拟物序列。
图35是显示电穿孔Affi-TCR RNA的T细胞中的CD107a上调的图组。T细胞共电穿孔有如图34B中指示的TCRα(a)和β(b)，或它们的ErbB2亲和抗体模拟物(342、342.15、342或342.4)修饰，并且使用肿瘤系Nalm-6-ESO(NY-eso-1+，ErbB2-)、A549-ESO(NY-eso-1+，ErbB2+)、SK-OV3(NY-eso-1-，ErbB2+)、A549(NY-eso-1-，ErbB2+)或Nalm6(NY-eso-1-，ErbB2-)刺激，用于CD107a测定。结果显示了具有ErbB2 Affi-TCR的T细胞可以特异性地识别Ny-ESO-1和ErbB2阳性肿瘤二者。
图36，包括图36A-36C，是显示亲和抗体模拟物修饰的CD3ε的图像组。图36A是通过添加亲和抗体模拟物和G4S连接体至任一CD3ε的N’的亲和抗体模拟物修饰的CD3ε的图示草图。图36B是显示T细胞的电穿孔的表格。T细胞共电穿孔有NY-ESO-1(1G4)TCRα(a)和β(b)，或连同ErbB2亲和抗体模拟物(342、342.15、342或342.4)修饰的CD3ε(e)。图36C是显示通过共递送亲和抗体模拟物修饰的CD3ε维持TCR表达和双重靶向的图组。在图36B的T细胞过夜后，通过流式细胞术检测vb13.1表达。
图37是显示电穿孔Affi-TCR RNA的T细胞的CD107a上调的图组。T细胞共电穿孔有如图36B中指示的NY-ESO-1(1G4)TCRα(a)和β(b)，或连同ErbB2亲和抗体模拟物(342、342.15、342或342.4)修饰的CD3ε(e)，并且使用肿瘤系Nalm-6-ESO(NY-eso-1+，ErbB2-)、Nalm6(NY-eso-1-，ErbB2-)、SK-OV3(NY-eso-1-，ErbB2+)或MDA231(NY-eso-1-，ErbB2+)刺激，用于CD107a测定。
图38，包括图38A-38C，展现了双特异性抗体可以通过电穿孔编码双特异性抗体的RNA(双RNA)进入T细胞而分泌。T细胞电穿孔有编码CD19 CAR的RNA(CAR RNA)、博纳吐单抗(Blinatumomab)双RNA(双RNA)、GFP或共电穿孔有CD19 CAR和博纳吐单抗双RNA(CAR RNA/双RNA)二者。电穿孔后十八小时，T细胞使用山羊抗小鼠IgG Fab(mIgG Fab)染色以检测在T细胞上表达的CD19 CAR，或经由结合至CD3在T细胞表面上衔接的双特异性抗体(图38A，上组显示了电穿孔的T细胞的mIgG Fab染色和GFP表达二者)。在电穿孔后立刻，使具有CARRNA或双RNA的T细胞的等分试样与相等数目的GFPRNA T细胞混合并且共培养18小时。然后评估mIgG Fab和GFP(图38A，中组)。电穿孔后十八小时，具有CAR RNA或双RNA的T细胞的等分试样与相等数目的GFP RNA T细胞混合并且经受染色，用于检测mIgG Fab和GFP(图38A，下组)。电穿孔后十八小时，电穿孔有不同RNA的T细胞，或电穿孔有CAR RNA或双RNA的T细胞与电穿孔GFP RNA的T细胞混合持续18h(GFP T，18h)或0h(GFP T，0h)并且然后使用表达CD19的细胞系(Nalm6、K562-CD19和Raji)或为CD19阴性的K562细胞进行刺激。混合物然后进行CD107a染色评估(图38B)。电穿孔后十八小时，在5:1的效应物-靶比值下的四小时的基于流式细胞术(flow based)的细胞毒性T淋巴细胞测定后，电穿孔有单独的CD19 CAR RNA(CAR RNA)或双RNA或与相等数目的电穿孔GFP RNA的T细胞(GFP-T)混合的T细胞进行裂解活性分析(图38C)。
图39，包括图39A-39D，强调了电穿孔双RNA的T细胞的T细胞活化和肿瘤杀伤能力的增加。如指示的，T细胞电穿孔有不同量(μg RNA/0.1ml T细胞)的博纳吐单抗双RNA(双RNA)或CD19 CAR RNA(CAR RNA)。电穿孔后十八小时，在添加或不添加相等数目的电穿孔GFP RNA的T细胞(GFP-T)的情况下，具有双RNA或CAR RNA的T细胞使用CD19阳性细胞系进行刺激并且评估CD107a表达(图39A)。上面描述的T细胞的电穿孔后十八小时，电穿孔的T细胞经受IFN-γ和粒酶B的胞内染色(图39B)。在使用CD19阳性细胞(Nalm6、K562-CD19和Raji)或CD19阴性(K562)细胞系过夜刺激T细胞后，进行IFN-γ的ELISA(图39C)。T细胞电穿孔有博纳吐单抗双RNA(双RNA)或CD19bbz CAR RNA(1、5或10μg RNA剂量/0.1ml的T细胞下的CARRNA)，或共电穿孔有5μg的每个双RNA和CAR RNA(双RNA+CAR RNA)。电穿孔后十八小时，在指示的效应物-靶比值下，使用四小时的基于流式细胞术的细胞毒性T淋巴细胞测定评估裂解活性(图39D)。
图40，包括图40A-40D，展现了电穿孔双RNA的T细胞的延长的肿瘤反应性以及CARRNA T细胞和双RNA T细胞的敏感性。T细胞电穿孔有在1、5和10μg/0.1ml的T细胞下的不同量的博纳吐单抗(Blimatumomab)双RNA并且与电穿孔有10μg剂量的RNA下的CD19BBZ CARRNA的T细胞比较。CD107a染色在电穿孔后的不同天数实施并且结果被标绘为在第3天、第8天和第12天时的CD107a/CD8表达的点图(图40A)、平均荧光强度(MFI)的值(图40B，上组)、或电穿孔后一些天的表达CD107a的细胞的百分数(图40B，下组)。电穿孔有5或10μg的CD19BBZ(19BBZ)或博纳吐单抗(Blina)RNA的T细胞使用K562细胞进行刺激并且电穿孔有减小量的CD19 mRNA。细胞共培养18小时并且上清液经受IFN-γELISA(图40C)。电穿孔有10μg4D5BBZ或4D5-CD3 RNA的T细胞使用K562细胞进行刺激并且电穿孔有减小量的ErbB2(Her2)mRNA。细胞共培养18小时并且上清液经受IFN-γELISA(图40D)。
图41，包括图41A-41D，强调了电穿孔双RNA的T细胞降低对共刺激的依赖性并且增强分裂和增殖。CFSE标记的静息CD4+T细胞电穿孔有不同RNA剂量下的博纳吐单抗双RNA或CD19BBZ RNA(CAR RNA)并且使用照射的K562-CD19细胞(与作为K562-CD86细胞的对照的相等数目的照射的K562细胞混合)，或照射的K562-CD19细胞(与相等数目的照射的K562-CD86细胞混合)进行刺激。监测在刺激后第6天时的CFSE染色(图41A)和T细胞在刺激后不同天数时的数目(图41B)。CFSE标记的CD45RO+(记忆细胞)或CD45RO-(稚细胞)静息CD4 T细胞电穿孔有不同RNA剂量下的博纳吐单抗双RNA或CD19BBZ RNA(CAR RNA)并且使用照射的K562-CD19细胞(与作为K562-CD86细胞的对照的相等数目的照射的K562细胞混合)，或照射的K562-CD19细胞(与相等数目的照射的K562-CD86细胞混合)进行刺激。监测在刺激后第6天时的CFSE染色(图41C)和T细胞在刺激后不同天数时的数目(图41D)。
图42，包括图42A-42E，展示了Nalm-6异种移植模型中的双RNA T细胞的增强的抗肿瘤活性。在NOD/scid/yc(-/-)(NSG)小鼠(n＝5)中静脉内注射Nalm6细胞(1×106，i.v.)后建立白血病。肿瘤细胞注射后七天，小鼠随机选择并且使用电穿孔博纳吐单抗双RNA或CD19BBZ RNA的T细胞处理。使用抗间皮素RNA CAR T细胞(ss1BBZ)处理的小鼠充当对照。T细胞以25e6(1×)作为单一注射被静脉内注射或以第一次注射20e6和第二次与第三次注射5e6的剂量下的T细胞每周注射一次持续三周(3×)。动物在注射后指定的时间点处成像(图42A)。实验的BLI数据以在y轴上指示的总光子通量–SE被标绘；1e5p/sec/cm2/sr表示不具有包含荧光素酶的细胞的小鼠(图42B)。患有如上面描述的建立的白血病的NSG小鼠或未患有白血病的NSG小鼠注射有电穿孔有CD19BBZ或双RNA，或对照ss1BBZ RNA的20e6T细胞。在T细胞注射后第1、3和7天，从每个组的两只小鼠收获骨髓细胞和脾细胞。通过从合并的骨髓细胞和脾细胞耗减小鼠细胞，从每只小鼠纯化T细胞。在使用CD19阳性细胞系K562-CD19刺激18小时(CD137和IFN-γ分泌)和4小时(CD107a)后，T细胞功能分别通过CD137表达(*指示p<0.05)(图42C)、细胞因子产生(经由ELISA)(图42D)和CD107a表达(图42E)进行评估。
图43，包括图43A-43E，图解了针对不同肿瘤抗原的不同双RNA。T细胞电穿孔有双RNA——其使用分别来自完整的人抗CD19(21D4)抗体和完整的人抗CD3 scFv(28F11)抗体的单链可变片段(scFvs)编码完整的人CD19-CD3——的七种不同的构建体之一。在电穿孔的T细胞由CD19阳性细胞系K562-CD19刺激4小时后，通过流式细胞术监测CD107a上调(图43A)。在电穿孔的T细胞由CD19阳性细胞系Nalm6、K562-CD19和Raji刺激18小时后，通过ELISA检测IFN-γ产生。CD19BBZ CAR RNA(CAR RNA)、博纳吐单抗双RNA(Blina-双RNA)和未电穿孔(无EP)被用作对照(图43B)。图43C显示了使用抗小鼠IgGFab抗体(对于抗间皮素和GD2的scFv)或抗人IgG Fab(对于cMet和PSCA)，检测抗间皮素、cMet、PSCA和GD2的电穿孔有双RNA或CAR RNA的T细胞上的scFv。抗间皮素、cMet、PSCA和GD2双RNA或CAR RNA(CAR)的电穿孔有双RNA或CAR RNA的T细胞使用表达间皮素(K562-meso，SK-OV3)、PSCA(K562-PSCA)、cMet(SK-OV3)或GD2(LY5Y)的细胞系刺激4小时，并且通过流式细胞术监测CD107a上调(图43D)。NSG小鼠(n＝6)注射有1e6Nalm6-CBG(i.v.)和7天后注射有5e6慢病毒转导有CD19BBZ或D4F11的T细胞，或20e6电穿孔有CD19BBZ或D4F11 RNA的T细胞。使用电穿孔有ss1BBZCARRNA的T细胞处理的小鼠充当对照。在肿瘤注射后第16和20天，注射有电穿孔RNA的T细胞的小鼠腹膜内施用环磷酰胺(40mg/kg，I.P.)。次日，如描述的，小鼠注射有5e6电穿孔有RNA的T细胞。T细胞注射之前一天和每次连续的后继注射后2天，如图42描述的测量生物发光(图43E)。
图44，包括图44A-44D，显示了电穿孔双RNA的T细胞对程序性细胞死亡1(PD1)和调节性T细胞(Treg)诱导的阻抑抗性更强。T细胞共电穿孔有不同量的CD19BBZ RNA，或CD19-CD3双RNA，并且5μg或10μg的PD1 RNA使用CD19阳性细胞系K652-CD19或Raji进行刺激。通过流式细胞术测量CD107a表达(图44A)和通过ELISA检测IFN-γ产生(图44B)。由新鲜的静息CD4 T细胞纯化的Treg在不同的T效应物-Treg比值下被添加至CFSE标记的电穿孔博纳吐单抗双RNA或CD19BBZ RNA(19BBZ)的静息CD4+T细胞，并且使用K562-CD19细胞进行刺激。刺激后六天，细胞使用抗CD3染色。通过流式细胞术监测CFSE染色(图44C-D)。
图45，包括图45A-45B，显示了脉冲(pulse)有来自电穿孔双RNA的T细胞的上清液的T细胞的表达。T细胞电穿孔有CD19BBZ RNA(CAR RNA)或博纳吐单抗的双RNA(Blina-双RNA)或D4F11 RNA(D4F11-双RNA)。电穿孔后十八小时，从电穿孔双RNA的T细胞收获上清液，并且稀释的(如指示的，10×或100×)上清液被添加至与CD19阳性细胞系Nalm6、K562-CD19或Raji共培养的未电穿孔的T细胞。电穿孔有CAR RNA或双RNA的T细胞是对照。在4小时的刺激后监测CD107a上调。
图46是显示电穿孔双RNA的T细胞具有显著增强的裂解活性的图。T细胞电穿孔有在1、5或10μg的RNA剂量/0.1ml的T细胞下的博纳吐单抗双RNA(双RNA)或CD19bbz CAR RNA。在18小时后，在30:1的T效应物-靶比值下，使用四小时的基于流式细胞术的细胞毒性T淋巴细胞测定测量裂解活性。
图47是显示电穿孔双RNA的T细胞中的CD107a上调的图组。T细胞电穿孔有10μg4D5BBZ或4D5-CD3 RNA，并且使用电穿孔有如指示的减小量的ErbB2(Her2)mRNA的K562细胞系通过共培养它们持续4小时进行刺激。通过流式细胞术检测CD107a上调。
图48，包括图48A-48H，显示了电穿孔双RNA的T细胞。图48A是显示静息CD4+T细胞的CFSE标记的图组，所述细胞电穿孔有在不同RNA剂量下的博纳吐单抗双RNA或CD19BBZRNA(CAR RNA)并且使用照射的K562-CD19细胞(与作为K562-CD86细胞的对照的相等数目的照射的K562细胞混合)(W/O CD86)，或照射的K562-CD19细胞(与相等数目的照射的K562-CD86细胞混合)(W/CD86)进行刺激。显示了第6天时的CFSE稀释。左组显示了CFSE标记的平均荧光强度(MFI)(更高的MFI指示更少的T细胞分裂和增殖)。右组显示了电穿孔有1μg双RNA的T细胞的CFSE稀释的相对百分数。CD3/CD28珠子刺激的T细胞和没有电穿孔的T细胞被分别用作阳性和阴性对照。图48B是显示静息CD4+T细胞的CFSE标记的图，所述细胞电穿孔有在不同RNA剂量下的博纳吐单抗双RNA或CD19BBZ RNA(CAR RNA)并且使用照射的K562-CD19细胞(与作为K562-CD86细胞的对照的相等数目的照射的K562细胞混合)(K562-CD19/K562)，或照射的K562-CD19细胞(与相等数目的照射的K562-CD86细胞混合)(K562-CD19/K562-CD86)进行刺激。显示了从第3天开始的相对CFSE稀释(第6天时的电穿孔有1μg双RNA并且使用K562-CD19/K562细胞进行刺激的T细胞被设定为50％)。图48C是显示CD45RO+(记忆细胞)或CD45RO-(稚细胞)静息CD4 T细胞的CFSE标记的图组，所述细胞电穿孔有在不同RNA剂量下的博纳吐单抗双RNA或CD19BBZ RNA(CAR RNA)并且使用照射的K562-CD19细胞(与作为K562-CD86细胞的对照的相等数目的照射的K562细胞混合)(K562-CD19/K562)，或照射的K562-CD19细胞(与相等数目的照射的K562-CD86细胞混合)(K562-CD19/K562-CD86)进行刺激。从第3天开始的CFSE稀释显示为CFSE的MFI或相对CFSE稀释(第6天时的电穿孔有1μg双RNA并且使用K562-CD19/K562细胞进行刺激的CD45RO+T细胞被设定为50％)。图48D是显示静息CD4+T细胞的CFSE标记的图组，所述细胞电穿孔有在不同RNA剂量下的博纳吐单抗双RNA或CD19BBZ RNA(CAR RNA)并且使用照射的K562-CD19细胞(与作为K562-CD86细胞的对照的相等数目的照射的K562细胞混合)(K19/K562)，或照射的K562-CD19细胞(与相等数目的照射的K562-CD86细胞混合)(K19/K86)进行刺激。刺激后八天，来自培养物的上清液经受ELISA用于IFN-γ和IL-2检测。图48E是显示CD45RO+(记忆细胞)或CD45RO-(稚细胞)静息CD4 T细胞的CFSE标记的图，所述细胞电穿孔有在不同RNA剂量下的博纳吐单抗双RNA或CD19BBZ RNA(CAR RNA)并且使用Raji(CD19+)或K562(Cd19-)细胞刺激18小时。通过ELISA测定IL-2分泌。图48F是显示T细胞的图，所述T细胞是CFSE标记的并且电穿孔有1或5μgCD19BBZ(19BBZ)、或CD19-28Z(19-28Z)或博纳吐单抗(Blina)RNA，被照射的K562、或K562与K562-CD19的1:1混合物或K562-CD19和K562-CD86的1:1混合物刺激。六天后，T细胞经受CFSE稀释的流式细胞术分析。图48G是显示5×105个T细胞在第6天时的总生存力的图，所述细胞电穿孔有5μg CD19BBZ(19BBZ)、或CD19-28Z(19-28Z)或博纳吐单抗(Blina)RNA，并且使用K562细胞与K562-CD19细胞的1:1混合物或K562-CD19细胞和K562-CD86细胞的1:1混合物进行刺激。图48H是显示电穿孔有5μg CD19BBZ(19BBZ)、或CD19-28Z(19-28Z)或博纳吐单抗(Blina)RNA并且在基于流式细胞术的4小时的细胞毒性T淋巴细胞测定中分析的T细胞的图。
图49，包括图49A-49H，显示了电穿孔有双RNA的多种构建体的T细胞的表达水平。图49A是显示电穿孔有七种不同的双RNA构建体——其使用分别来自完整的人抗CD19抗体(21D4)和完整的人抗CD3 scFv抗体(28F11)的scFvs编码完整的人CD19-CD3——之一的T细胞的图。在电穿孔的T细胞使用CD19阳性细胞系Nalm6、K562-CD19和Raji刺激18小时后，通过ELISA检测IL-2产生。CD19BBZ CAR RNA(CAR RNA)、博纳吐单抗双RNA(Blina-双RNA)和未电穿孔(无EP)被用作对照。图49B是显示电穿孔有CD19BBZ RNA(CAR RNA)或博纳吐单抗双RNA(Blina-双RNA)或完整的人CD19-CD3双RNA(D4F11)的T细胞的图。电穿孔后四小时，T细胞使用K562-CD19刺激18小时并且上清液经受Luminex用于多种细胞因子/趋化因子检测。通过将CAR RNA T细胞设定在100％使数据归一化。图49C是显示电穿孔有在1μg或10μg的RNA剂量下的CD19BBZ、博纳吐单抗双RNA、D4BBZ或D4F11双RNA的T细胞的图。细胞使用CD19阳性细胞系K562-CD19或Raji进行刺激，并且通过ELISA检测细胞因子产生(IFN-γ和IL-2)。图49D是显示电穿孔有在1、5或10μg的RNA剂量下的CD19BBZ、博纳吐单抗双RNA、D4BBZ或D4F11双RNA的T细胞的图。细胞使用CD19阳性细胞系K562-CD19、Raji或Nalm6，以及作为对照的CD19阴性系K562-meso进行刺激。通过流式细胞术检测CD107a表达。图49E是显示T细胞的CD107a上调的图，所述T细胞电穿孔有编码EGFRviii CAR(MR1-BBZ或139-BBZ)或EGFRviii双RNA(MR1-双RNA或139-双RNA)的RNA并且使用电穿孔EGFRviii RNA的K562细胞或K562细胞进行刺激。图49F是显示T细胞的CD107a上调的图，所述T细胞电穿孔有编码CD19CAR(CD19BBZ)或ErBB2 CAR(4D5-BBZ)的RNA或ErBB2双RNA(4D5-OKT3)。上组显示了在电穿孔后18小时使用ErBB2融合蛋白(Her2-Fc)的T细胞的染色。下组显示了使用ErBB2阳性/CD19阴性肿瘤细胞系(SK-OV3)或CD19阳性/ErBB2阴性肿瘤细胞系(Nalm6)刺激的T细胞的CD107a染色。图49G是显示ErBB2融合蛋白(Her2-Fc)表达的图组。图49H是显示CD8+细胞中的CD107a表达的图组。
图50是显示共电穿孔有不同量的CD19BBZ RNA或CD19-CD3双RNA和5μg或10μg的PD1 RNA的T细胞的图。细胞使用CD19阳性细胞系Raji进行刺激，并且通过ELISA检测IFN-γ分泌。数据标绘为T细胞相对于没有共引入PD1的细胞的细胞因子产生的百分数。
图51，包括图51A-51D，是表征共电穿孔的T细胞的图组。图51A是流式细胞术图组，其显示了电穿孔双RNA的T细胞的T细胞活化和肿瘤杀伤能力的增加。如指示的，T细胞电穿孔有不同量(μg RNA/0.1ml T细胞)的博纳吐单抗双RNA(双RNA)或CD19 CAR RNA(CARRNA)。电穿孔后十八小时，在添加或不添加相等数目的电穿孔GFP RNA的T细胞(GFP-T)的情况下，具有双RNA或CAR RNA的T细胞使用CD19阳性细胞系进行刺激并且评估CD107a表达。图51B是显示双RNA电穿孔后的IFN-γ和粒酶B表达的图组。上面描述的T细胞的电穿孔后十八小时，电穿孔的T细胞经受IFN-γ和粒酶B的胞内染色(图2B)。图51C是显示IFN-γ的ELISA检测的图。在使用CD19阳性细胞(Nalm6、K562-CD19和Raji)或CD19阴性(K562)细胞系过夜刺激T细胞后，进行IFN-γ的ELISA。图51D是显示在电穿孔和表达双RNA后T细胞的特异性的图。T细胞电穿孔有博纳吐单抗双RNA(双RNA)或CD19bbz CAR RNA(1、5或10μg的RNA剂量/0.1ml的T细胞下的CAR RNA，或共电穿孔有5μg的每种双RNA和CAR RNA(双RNA+CAR RNA)。电穿孔后十八小时，在指定的效应物-靶比值下，使用四小时的基于流式细胞术的细胞毒性T淋巴细胞测定评估裂解活性。
图52是列举电穿孔入T细胞的可溶性融合蛋白RNA的表格。
图53是显示使用抗PD-L1和抗CD28scFv构建双特异性抗体的图示。
图54，包括图54A-54B，是显示电穿孔的T细胞中的细胞因子产生的图组。图54A是显示通过电穿孔有不同的RNA并且通过与肿瘤细胞一起培育活化的T细胞的IL-2产生的图。图54B是显示通过电穿孔有不同的RNA并且通过与肿瘤细胞一起培育活化的T细胞的IFN-γ产生的图。
图55是显示使用抗TGFb受体II和抗CD28scFv构建双特异性抗体的图示。
图56，包括图56A-56B，是显示电穿孔的T细胞的反应性的图组。图56A是显示电穿孔有4D5-CD3双RNA的T细胞对过表达ErbB2的肿瘤细胞反应的图。电穿孔有ErbB2 CAR或双RNA的T细胞使用表达高水平的ErbB2、SK-OV3和N87，或低水平的MFC-7、MDA-231、PC3和A549的肿瘤系进行刺激。CD107a测定显示了表达4D5-6.CD3的T细胞仅对过表达ErbB2的肿瘤细胞反应。图56B是显示图56A的重复实验的结果的图组。
图57是显示电穿孔有4D5-CD3双RNA的T细胞对过表达ErbB2的肿瘤细胞的裂解活性的图组。电穿孔有ErbB2 CAR或双RNA的T细胞被测试其针对过表达ErbB2的肿瘤细胞SK-OV3-CBG或低表达ErbB2的肿瘤细胞mel624(624-CBG)的裂解活性。基于荧光素酶的CTL测定显示了，与亲和调谐的(affinity tuned)BebB2 CAR、4D5-5.BBZ和4D5-3.BBZ一样，表达4D5-6.CD3的T细胞仅对过表达ErbB2的肿瘤细胞SK-OV3反应。
图58是显示用4D5-CD3双RNA慢病毒转导的T细胞对过表达ErbB2的肿瘤细胞反应的图组。用ErbB2 CAR或双RNA转导的T细胞使用表达高水平的ErbB2、SK-OV3和N87，或低水平的MDA-231、PC3和A549的肿瘤系进行刺激。CD107a测定显示了表达4D5-CD3的T细胞仅对过表达ErbB2的肿瘤细胞反应。
图59是显示用4D5-CD3双RNA慢病毒转导的T细胞对过表达ErbB2的肿瘤细胞反应的图组。如指示的用ErbB2 CAR或双RNA转导的T细胞使用表达高水平的ErbB2、SK-OV3和N87，或低水平的MDA-231、PC3和A549的肿瘤系进行刺激。如通过ELISA测定的细胞因子产生指示表达T4D5-CD3的T细胞仅对过表达ErbB2的肿瘤细胞反应。
图60，包括图60A和60C，是显示T细胞治疗的小鼠中的晚期血管化肿瘤的消退的图像组。图60A是显示亲和调谐的ErbB2 BiTE细胞增加治疗指数和诱导小鼠中的晚期血管化肿瘤的消退的图像组。在双肿瘤移入的NSG小鼠中测试通过慢病毒转导用不同亲和力ErbB2CAR或BiTE修饰的T细胞。在第0天，小鼠(n＝4-5)在右胁上植入有PC3-CBG肿瘤细胞(1×106个细胞/小鼠，s.c.)。在第5天，相同的小鼠在左胁上给予SK-OV3-CBG肿瘤细胞(5×106个细胞/小鼠，s.c.)。小鼠在PC3肿瘤接种后第23天使用T细胞(i.v.)处理。T细胞被作为1×107个/小鼠的单一注射施用。使用未转导的T细胞(无TD)处理的小鼠充当对照。动物在PC3肿瘤接种后指定的时间处成像。图60B是显示双肿瘤移植的NSG小鼠模型中的SK-OV3肿瘤大小的图。测量肿瘤大小，并且计算和标绘肿瘤体积。图60C是显示双肿瘤移植的NSG小鼠模型中的PC3肿瘤大小的图。测量肿瘤大小，并且计算和标绘肿瘤体积。
图61，包括图61A-61B，是显示PD1-CD28转换受体(switch receptor)的图像组。图61A是共表达PD1-CD28转换受体和亲和调谐的T4D5-6.CD3 BiTE的构建体的图示。图61B是显示检测用PD1-CD28和T4D5-CD3共表达载体慢病毒转导的T细胞的PD1-CD28转换受体的图组。
图62，包括图62A-62M，是图像组。图62A是显示共表达PD1-CD28转换受体和T4D5-6.CD3亲和调谐的BiTE二者的T细胞的增加的裂解活性的图。图62B-62G是显示通过快速扩展方案(rapid expansion protocol)(REP)生成的电穿孔双RNA的T细胞进一步提高体内抗白血病活性的图像组。评估通过REP或抗CD3/抗CD28珠(Beads)扩展的T细胞的表型(图62B)。REP T细胞或抗CD3/抗CD28珠T细胞电穿孔有不同量的CAR RNA或双RNA并且使用不同的细胞系刺激18小时。通过流式细胞术分析CD137上调(对CD3+ T细胞门控(gated))(图62C)。在电穿孔有不同量的CAR RNA或博纳吐单抗双RNA的REP T细胞(图62D，左组)或抗CD3/抗CD28珠T细胞(图62D，右组)中测量裂解活性。NSG小鼠静脉内注射有1×106Nalm6-CBG并且5天后进行处理：使用30×106个CAR RNA或博纳吐单抗双RNA(Blina)T细胞进行第一处理，接着从Nalm6-CBG注射后第8天开始，每次5×106个，每周两次持续三周。在指定的时间处实施生物发光成像(BLI)(图62E)并且BLI的结果和存活被分别标绘在图62F和图62G中。图62H-62I是显示表达膜结合OKT3的基于K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)生成的图像组。在图62H中图解了表达具有CD8铰链和跨膜(OKT3.8)或具有CD8铰链和CD28跨膜(OKT3.8.28)的膜形式的OKT3的嵌合蛋白的慢病毒载体(pLENS)。基于K562的aAPC——K562-CD86-CD137L(KT)或K562-CD137L(2D11)细胞系——用慢病毒OKT3.8或OKT3.8.28转导，并且使用抗鼠IgG Fab的抗体检测膜结合OKT3的表达(图62I)。图62J是显示转导膜结合OKT3的K562aAPC克隆的表征的图像组。通过限制稀释选择克隆基于来自转导OKT3.8.28的KT aAPC的膜结合(membrane band)OKT3的表达。图62K-62M是显示使用基于K562的人工aAPC的REP的图组。图62K是如下图：其显示了在用于在1:250的T细胞-aAPC比值下刺激T细胞前，负载OKT3的K562-CD86-CD137L(KT)或K562-CD137L(2D11)，或表达膜结合OKT3的KT(KT.OKT)被照射和培养一天(D1)或两天(D2)。图62L是显示进行CD62L和CD28染色的扩展的T细胞——其在REP中独立地扩展——的图组。图62M是显示与KT细胞相比REP实验中的不同B细胞系的图。
图63是显示通过静脉内注射1×106个Naml6-CBG细胞具有建立的白血病的NSG小鼠的图。七天后，小鼠使用20×106个电穿孔RNA的T细胞进行处理。在第13和27天，在用5×106个电穿孔有RNA的T细胞注射之前24小时，在腹膜内使用60mg/kg环磷酰胺处理小鼠。动物在注射后的指定时间点处成像，总光子通量在Y轴上指示(n＝5)。
图64是显示通过静脉内注射1×106个Naml6-CBG细胞具有建立的白血病的NSG小鼠的图。七天后，小鼠使用20×106个电穿孔RNA的T细胞进行处理。在第13和27天，在用5×106个电穿孔有RNA的T细胞注射之前24小时，在腹膜内使用60mg/kg环磷酰胺处理小鼠。动物在注射后的指定时间点处成像，总光子通量在Y轴上指示(n＝5)。
图65是显示电穿孔TCR RNA的T细胞比慢病毒转导的T细胞更好地控制肿瘤生长的图。在第0天静脉内注射2.5×106个A549-ESO/A2肿瘤细胞。从第5天开始治疗。在第5天以10×106的单剂量施用慢病毒-T细胞，并且从第5天开始，将电穿孔RNA的T细胞注射30×106个、10×106个、10×106个和10×106个的四种剂量，每周两次。
图66是显示电穿孔TCR RNA的T细胞控制肿瘤细胞生长的图像组。
图67是显示慢病毒转导的T细胞不像电穿孔TCR RNA的T细胞一样高效地控制肿瘤生长的图像组。
图68是显示比慢病毒转导的T细胞更高效的在肿瘤模型中控制肿瘤生长的图。
图69是显示CD3构建体的图示和显示电穿孔TCR和CD3 RNA的T细胞中的TCR和CD3表达的图的图像组。
图70是显示在电穿孔的T细胞中检测到的TCR(vb13.1)、CD3和TCR(vb13.1)/CD3的表达水平的图。
图71是T细胞中的电穿孔的TCR RNA的表达的图组。
图72是显示1G4野生型(1G4wt)和高亲和力(1G4.LY95a)NY-ESO-1 TCR的慢病毒载体的滴度的表格。
图73是显示1G4野生型(1G4wt)和高亲和力(1G4.LY95a)NY-ESO-1 TCR的不同慢病毒载体的滴度的表格。
图74是显示T细胞的病毒感染效率的表格。
图75是显示共电穿孔有TCR和CD3的T细胞中的转基因表达的图组。
图76是显示共电穿孔有TCR和CD3 RNA的T细胞中的转基因表达的图组。
图77是显示共电穿孔有TCR和CD3的T细胞或电穿孔有TCR并使用CD3珠刺激的T细胞中的转基因表达的图组。
图78是显示电穿孔有TCR RNA(y轴)——有或没有CD3——并且使用Naml6肿瘤细胞(x轴)培育的T细胞的流式细胞术图组。
图79是显示电穿孔有TCR RNA(y轴)——有或没有CD3——并且使用表达OKT的Naml6肿瘤细胞(x轴)培育的T细胞的流式细胞术图组。
图80是显示电穿孔有TCR RNA(y轴)——有或没有CD3——并且使用表达ND340的Naml6肿瘤细胞(x轴)培育的T细胞的流式细胞术图组。
图81是显示电穿孔有CD3δ、γ、ε和ζ——其具有所有单元(4个亚基)或更少(3个亚基、2个亚基或1个亚基)，连同NY-ESO-1 TCR(1G4)α和β链RNA的T细胞中的TCR和CD3表达的流式细胞术图组。在电穿孔后18小时，通过流式细胞术检测CD3和TCR(vb13.1)。
图82是显示在CD3 RNA电穿孔入293细胞系后CD3和TCR表达的平均荧光强度(MFI)的柱形图。
图83是显示使用肿瘤细胞刺激的共电穿孔TCR RNA和CD3 RNA的T细胞中的CD107a上调的流式细胞术图组。
图84是显示使用不同的肿瘤细胞系培育的电穿孔RNA的T细胞中的IFN-γ表达的图组。T细胞电穿孔有NY-ESO-1 TCRα和βRNA连同不同组合的CD3 RNA。细胞与为NY-ESO-1/HLA-A2阳性的Naml6-ESO或624mel肿瘤细胞共培养。在18小时后测量IFN-γ产生水平。
图85是显示使用肿瘤细胞系培育的电穿孔不同RNA的T细胞的IFN-γ表达的图。
图86是显示使用不同肿瘤细胞系培育的电穿孔RNA的T细胞中的IL-2表达的图组。T细胞电穿孔有NY-ESO-1 TCRα和βRNA连同不同组合的CD3 RNA。细胞与为NY-ESO-1/HLA-A2阳性的Naml6-ESO或624mel肿瘤细胞共培养。在18小时后测量IL-2产生水平。
图87是显示TCR由电穿孔有包含4-1BB的TCR或CD3 RNA构建体的T细胞表达的图组。T细胞共电穿孔有1G4 TCRα(或α.BB)和β(α/β或α.BB/β)，或α/β以及CD3ζ或ε——有或没有4-1BB(ζ、ζ.BB、ε、或ε.BB)。在18小时后，通过流式细胞术测定CD3和vb13.1。
图88是显示使用不同肿瘤细胞系培育的电穿孔RNA的T细胞针对多种肿瘤细胞系有效(affective)的图组。提供共刺激信号至TCR或CD3的C端维持T细胞功能并且潜在地给T细胞提供直接的共刺激信号。T细胞共电穿孔有1G4 TCRα(或α.BB)和β(α/β或α.BB/β)，或α/β以及CD3ζ和ε——有或没有4-1BB(ζ、ζ.BB、ε或ε.BB)。十八小时后，通过肿瘤细胞系Naml6-ESO(HLA-A2+/NY-ESO-1+)、A549ENA(HLA-A2+/NY-ESO-1+)、624mel(HLA-A2+/NY-ESO-1+)、526mel(HLA-A2+/NY-ESO-1+)或888mel(HLA-A2+/NY-ESO-1+)刺激T细胞并且测量CD107a产生。
图89是显示Naml6肿瘤细胞(x轴)和电穿孔有编码不同TCR链——有或没有CD3链——的RNA的T细胞(y轴)的流式细胞术图组。
图90是显示624肿瘤细胞(x轴)和电穿孔有编码不同TCR链——有或没有CD3链——的RNA的T细胞(y轴)的流式细胞术图组。
图91是显示526肿瘤细胞(x轴)和电穿孔有编码不同TCR链——有或没有CD3链——的RNA的T细胞(y轴)的流式细胞术图组。
图92是显示888肿瘤细胞(x轴)和电穿孔有编码不同TCR链——有或没有CD3链——的RNA的T细胞(y轴)的流式细胞术图组。
图93，包括图93A-93D，是显示使用具有二硫键的TCR和具有二硫键和N-去糖基化二者的β链的电穿孔的T细胞的取得的最大转基因表达(图93A)和功能的图组。TCRα链的N-去糖基化损害电穿孔的T细胞的功能(图93A-93D)。
图94是显示10×106个Naml6-CBG-ESO-GFP(叩头虫绿)细胞——其在静脉内注射入NOD/SCID小鼠后表达NY-ESO-1和GFP二者——的表达的图。肿瘤接种后五天，如指示的，静脉内注射转导第一CBR(叩头虫红)和电穿孔RNA的T细胞(n＝5)。Wt1G4:野生型1G4 TCR，m1G4：第二二硫键α/第二二硫键α和N-去糖基化β，CD19:CD19BBZ CAR，meso:ss1BBZ CAR，和盐水。
图95是显示TCRα链中的N-去糖基化损害电穿孔RNA的T细胞的功能的图像组。
图96是显示电穿孔有编码包含鼠恒定区的杂合TCR的RNA的T细胞的转基因表达和功能的图像组。
图97是显示小鼠模型中的注射的肿瘤和杂合TCR T细胞随着时间的荧光的图像组。
图98，包括图98A-98D，是图像组，其显示与添加二硫键至TCR或杂合TCR相比，添加二硫键至α和β链或使TCR的β链N-去糖基化增强电穿孔的T细胞的转基因表达和功能。
图99是显示由电穿孔有包含4-1BB的TCR或CD3的T细胞表达的TCR的图像组。T细胞共电穿孔有1G4 TCRα(或α.BB)和β(a/b或a.BB/b)，或a/b以及CD3ζ或ε——有或没有4-1BB(z、z.BB、e或e.BB)。十八小时后，通过流式细胞术测定CD3和vb13.1。
图100是显示共电穿孔有1G4 TCRα(或α.BB)和β(a/b或a.BB/b)，或a/b以及CD3ζ或ε——有或没有4-1BB(z、z.BB、e或e.BB)的T细胞的图像组。十八小时后，T细胞使用肿瘤系Nalm6-ESO(HLA-A2+/NY-ESO-1+)、A549-ESO(HLA-A2+/NY-ESO-1+)、624mel(HLA-A2+/NY-ESO-1+)、526mel(HLA-A2+/NY-ESO-1-)或888mel(HLA-A2-/NY-ESO-1-)进行刺激并且在CD107a测定中进行评估。
图101是显示共电穿孔有1G4 TCRα和β，或a/b以及CD3ε(E)和/或ζ(Z)——有或没有CD27(或CD28)——的T细胞的图像组。十八小时后，T细胞使用肿瘤系Nalm6-ESO(HLA-A2+/NY-ESO-1+)、624mel(HLA-A2+/NY-ESO-1+)、U266(HLA-A2+/NY-ESO-1+)或888mel(HLA-A2-/NY-ESO-1-)进行刺激并且在CD107a测定中进行评估。
图102是图像组，其显示了PD1构建体和在用PD1-CD28转换受体和1G4 TCR——有或没有CD27——慢病毒转导的T细胞中检测PD1和vb13.1。
图103是显示在第0天皮下注射5E6 A549-ESO(转导HLA-A2和NY-ESO-1的A549)的图。在第14天注射1×106个转导的T细胞并测量肿瘤大小。初步结果指示对于单独的TCR(1G4)没有效果，而对于CD27共刺激信号(1G4.CD27)，或PD1-CD28转换受体(PD1-CD28.1G4)，或CD27共刺激信号和PD1-CD28转换受体二者(PD1-CD28.1G4.CD27)肿瘤生长被延迟。
图104是能够非MHC限制的肿瘤抗原识别和功能性关联抗原识别的修饰的TCR的示意图。
图105是显示共电穿孔的T细胞的转基因表达的图像组。七种氨基酸流感(HA1)肽序列被添加至TCRα链或CD3ζ或ε链的N’-端以生成HA1.α(HA1.a)、HA1.ζ(HA1.z)和HA1.ε(HA1.e)。T细胞共电穿孔有修饰的TCR连同编码抗流感——HA1(17-9或26-9)，和肿瘤抗原(CD19或Her2(4D5))的双特异性抗体的RNA。电穿孔后十八小时，通过流式细胞术检查转基因TCR(vb13.1)表达。
图106是显示具有修饰的NY-ESO-1 TCR识别的关联抗原(HLA-A2/NY-ESO-1)连同CD19或Her2的T细胞的图像组。
图107是显示转移有修饰的TCR的T细胞的IFN-γ分泌的图，所述T细胞共引入有双RNA。
图108是显示转移有修饰的TCR的T细胞的IL-2分泌的图，所述T细胞共引入有双RNA。
图109是显示施用至荷瘤小鼠(tumor bearing mice)的具有修饰的TCR和双RNA的T细胞的抗肿瘤活性的图像组。如指示的，小鼠注射有Nalm6-ESO(i.v.)并且使用电穿孔有RNA的T细胞进行处理。
图110，包括图110A-110B，是显示具有修饰的TCR的T细胞的图像组。图110A是通过添加小分子和His-标签序列至TCR的α或β链的N’端的小分子修饰的TCR(Affi-TCR)的图示草图。图110B是显示T细胞共电穿孔有NY-ESO-1(1G4)TCRα(a)和β(b)，或它们的ErbB2小分子(342、342.15、342或342.4)修饰的图像组。在过夜后，通过流式细胞术检测vb13.1和His-标签。
图111是显示电穿孔Affi-TCR RNA的T细胞的CD107上调的图像组。
图112，包括图112A-112C，是显示通过共递送小分子修饰的CD3ε的TCR表达和双重靶向的图像组。图112A是通过添加小分子和G4S连接体至CD3ε链的N’端的小分子修饰的CD3ε的图示草图。图112B是显示共电穿孔有NY-ESO-1(1G4)TCRα(a)和β(b)，或连同ErbB2小分子(342、342.15、342或342.4)修饰的CD3ε(e)的T细胞的表格。图112C是显示在过夜培育后通过流式细胞术检测的vb13.1的表达的图像组。
图113是显示电穿孔Affi-TCR RNA的T细胞的CD107a上调的图像组。T细胞如图101中指示的共电穿孔有NY-ESO-1(1G4)TCRα(a)和β(b)，或连同ErbB2小分子(342、342.15、342或342.4)修饰的CD3ε(e)，并且使用肿瘤细胞Nalm-6-ESO(NY-eso-1+，ErbB2-)、Nalm6(NY-eso-1-，ErbB2-)、SK-OV3(NY-eso-1-，ErbB2+)或MDA231(NY-eso-1-，ErbB2+)进行刺激，并且评估CD107a表达。
具体实施方式
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然可以在测试本发明的实践中使用与本文描述的那些类似或等价的任何方法和材料，但是本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明中，将使用下列术语。
也理解本文使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，并且不意欲是限制性的。
本文使用冠词“一个”和“一种”，指的是一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例而言，“一个要素”意思是一个要素或多于一个要素。
如本文使用的“大约”，当指的是可测量的值比如量、时间期间等时，意思是包括从规定值的±20％或±10％、更优选地±5％、甚至更优选地±1％、和还更优选地±0.1％的变化，因为这样的变化适于进行公开的方法。
如本文使用的“活化”指的是已经被充分地刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应物功能相关联。术语“活化的T细胞”指的是经历细胞分裂的T细胞等。
短语“亲和分子嵌合受体”指的是包括以高亲和力结合至靶蛋白或肽的亲和分子——比如小分子、抗体模拟物、AffibodyTM、或其任意片段——的重组受体。在一些实施方式中，亲和分子嵌合受体包括跨膜结构域和胞内结构域。在一些其它实施方式中，亲和分子嵌合受体包括T细胞受体结构域，比如恒定结构域和可变结构域。
如本文使用的术语“抗体”指的是与抗原特异性地结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是从自然来源或从重组来源获得的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。四聚体可以是天然存在的或由单链抗体或抗体片段重构的。抗体还包括二聚体，其可以是天然存在的或由单链抗体或抗体片段构建的。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab')2，以及单链抗体(scFv)、人源化抗体、和人抗体(Harlow等，1999,In:UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等，1989 In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等，1988,Science 242:423-426)。
术语“抗体片段”指的是完整抗体的一个区域，并且指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab；Fab'；F(ab')2；和Fv片段；线性抗体；scFv抗体；单结构域抗体，比如骆驼科抗体(camelid antibody)(Riechmann,1999,Journal ofImmunological Methods 231:25-38)，其由对靶标展现充分亲和力的VL或VH结构域组成；和由抗体片段形成的多特异性的抗体。抗体片段还包括人抗体或人源化抗体或其人抗体或人源化抗体的片段。
如本文使用的“抗体重链”指的是以它们自然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大的链。
如本文使用的“抗体轻链”指的是以它们自然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小的链。α和β轻链指的是两种主要的抗体轻链同种型。
如本文使用的“双特异性抗体”指的是对至少两种不同抗原表位具有结合特异性的抗体。在一个实施方式中，表位来自相同的抗原。在另一个实施方式中，表位来自两种不同的抗原。用于制造双特异性抗体的方法是本领域已知的。例如，可以使用两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达来重组地产生双特异性抗体。参见，例如，Milstein等(1983)Nature305:537-39。可选地，双特异性抗体可以使用化学键合制备。参见，例如，Brennan等(1985)Science 229:81。双特异性抗体包括双特异性抗体片段。参见，例如，Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6444-48、Gruber等(1994)J.Immunol.152:5368。
如本文使用的术语“合成抗体”的意思是使用重组DNA技术生成的抗体，比如，例如，如本文描述的由噬菌体表达的抗体。该术语也应当解释为意思是已经由DNA分子——其编码抗体并且该DNA分子表达抗体蛋白或规定抗体的氨基酸序列——的合成生成的抗体，其中DNA或氨基酸序列已经使用本领域可获得和熟知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
如本文使用的术语“抗原”或“Ag”定义为激发免疫应答的分子。此免疫应答可以包括抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或二者。技术人员将理解任何大分子——实际上包括所有蛋白质或肽——可以充当抗原。另外，抗原可以由重组或基因组DNA生成。技术人员将理解任何DNA——其包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列——因此编码如本文使用的术语“抗原”。另外，本领域技术人员将理解抗原不必仅仅由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是本发明包括但不限于多于一个基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以不同的组合布置以引起期望的免疫应答。而且，技术人员将理解抗原根本不必由“基因”编码。容易显而易见的是抗原可以被生成、合成或源自生物学样品。这样的生物学样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物学流体。
如本文使用的术语“抗肿瘤效应”指的是生物学效应，其可由肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数目的减少、转移数目的减少、预期寿命的增加、或与癌性病症相关联的各种生理学症状的改善显现。“抗肿瘤效应”也可以由本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤在第一位置发生的能力显现。
根据本发明，术语“自身抗原”意思是由免疫系统识别为异物(foreign)的任何自体抗原。自身抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，其包括细胞表面受体。
如本文使用的，术语“自身免疫疾病”定义为由自身免疫反应导致的障碍。自身免疫疾病是对自体抗原的不适当和过度应答的结果。自身免疫疾病的实例包括但不限于阿狄森氏病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩病、糖尿病(I型)、营养不良性大疱性表皮松解、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、寻常天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病、甲状腺炎、血管炎、白斑病、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等。
如本文使用的术语“自体的”意思是指源自相同个体的任何物质，其随后被再引入该个体。
“同种异体的”指的是衍生自相同物种的不同动物的移植物。
“异种的”指的是衍生自不同物种的动物的移植物。
短语“双特异性亲和分子”指的是包括两种不同的结合特异性的分子并且因而能够同时结合两个靶标、分子或抗原。双特异性亲和分子包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域。在一些实施方式中，一个或多个亲和结构域是小分子抗原结合结构域，其可以包括小分子、抗体模拟物、AffibodyTM或其任意片段。
如本文使用的“双特异性”指的是对至少两种不同的结合表位具有结合特异性的分子。在一个实施方式中，表位来自相同的结合配偶体。在另一个实施方式中，表位来自两种不同的结合配偶体。对不同表位具有双特异性的分子可以包括双特异性抗体。
如本文使用的术语“癌症”定义为以畸变细胞的快速和失控生长表征的疾病。癌细胞可以局部地扩散或通过血流和淋巴系统扩散至身体的其它部分。多种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、甲状腺癌等。
如本文使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”指的是被工程化以在免疫效应细胞上表达和特异性地结合抗原的人工T细胞受体。CAR可以被用作使用过继细胞转移的疗法。T细胞从患者移出并且进行修饰，使得它们表达特异于具体形式的抗原的受体。例如，在一些实施方式中，已经以对肿瘤相关抗原的特异性表达CAR。CAR还可以包括胞内活化结构域、跨膜结构域和胞外结构域——其包括肿瘤相关抗原结合区。在一些方面，CAR包括融合单链可变片段(scFv)衍生的单克隆抗体，其被融合至CD3-ζ跨膜和胞内结构域。CAR设计的特异性可以源自受体的配体(例如，肽)。在一些实施方式中，通过重定向表达特异于肿瘤相关抗原的CAR的T细胞的特异性，CAR可以靶向癌症。
如本文使用的，短语“嵌合配体工程化活化受体”或“CLEAR指的是工程化受体，其至少由用于配体识别的胞外结构域和用于T细胞内的活化信号转导的胞内结构域组成。CLEAR可以被工程化以包括结合至肿瘤或病毒抗原或其它分子的胞外结构域，而胞内结构域在将配体或抗原结合至受体的胞外结构域之后在T细胞内提供活化信号。
术语“嵌合膜蛋白”指的是工程化膜蛋白，其具有源自一种或多种信号传导和/或受体分子的胞外结构域和胞内结构域或能够活化一种或多种信号传导和/或受体分子的胞外结构域和胞内结构域。例如，本文描述的嵌合膜蛋白包括针对CD3的单链可变片段(scFv)和胞内结构域——其包括CD28和4-1BB的胞内结构域的片段。
如本文使用的，术语“保守序列修饰”意欲指的是如此氨基酸修饰，其不显著地影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特性。这样的保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术比如定点诱变和PCR-介导的诱变引入本发明的抗体。保守氨基酸置换是其中氨基酸残基被替换为具有类似侧链的氨基酸残基的置换。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支化侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而，抗体的CDR区内的一种或多种氨基酸残基可以被替换为来自相同侧链家族的其它氨基酸残基，并且可以使用本文描述的功能性测定测试改变的抗体结合抗原的能力。
如本文使用的术语“共刺激配体”包括特异性地结合T细胞上的关联共刺激分子的抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)上的分子，由此除了通过例如将TCR/CD3复合体与负载有肽的MHC分子结合提供的初级信号之外，还提供了介导T细胞应答的信号，所述T细胞应答包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性地结合的配体。共刺激配体也包括，特别是与存在于T细胞上的共刺激分子特异性地结合的抗体，所述共刺激分子比如，但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性地结合的配体。
“共刺激分子”指的是T细胞上的关联结合配偶体，其与共刺激配体特异性地结合，由此介导通过T细胞的共刺激应答，比如，但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
如本文使用的“共刺激信号”指的是与初级信号比如TCR/CD3连接组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
术语“衍生自…”指的是由具体来源生成、合成，或源自具体来源，以便衍生的物质与来源相关。衍生的物质不需要与具体来源相同。在一个实施方式中，抗原衍生自蛋白质。在另一个实施方式中，单链可变片段衍生自单克隆抗体。
“疾病”是动物的健康状态，其中动物不能维持稳态，并且其中如果不改善疾病，则动物的健康继续恶化。相比之下，动物中的“障碍”是健康状态，其中动物能够维持稳态，但是其中动物的健康状态与它没有该障碍时相比不太有利。保持不治疗，障碍不必然引起动物健康状态的进一步降低。
“有效量”或“治疗有效量”在本文可交换地使用，并且指的是对实现具体的生物学结果或提供治疗或预防益处有效的如本文描述的化合物、制剂、材料或组合物的量。这样的结果可以包括但不限于抗肿瘤活性，如通过本领域适合的任何手段测定的。
“编码”指的是多核苷酸比如基因、cDNA或mRNA中的核苷酸的特定序列充当模板来合成生物学过程中的其它多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一种和由其产生的生物学性质。因而，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物学系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列具有同一性并且通常在序列表中提供的编码链，和用作基因或cDNA转录的模板的非编码链两者，都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
如本文使用的“内源的”指的是来自生物体、细胞、组织或系统的或在生物体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。
如本文使用的，术语“外源的”指的是从生物体、细胞、组织或系统引入的或在生物体、细胞、组织或系统外产生的任何物质。
如本文使用的术语“扩展”指的是数目的增加，如T细胞数目的增加。在一个实施方式中，离体扩展的T细胞的数目相对于培养物中原始存在的数目增加。在另一个实施方式中，离体扩展的T细胞的数目相对于培养物中的其它细胞类型的数目增加。如本文使用的术语“离体”指的是已经从活的生物体(例如，人)移出，并且在生物体外(例如，在培养皿、试管或生物反应器中)繁殖的细胞。
如本文使用的术语“表达”定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有本领域已知的并入重组多核苷酸的那些，比如粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(比如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原-结合子序列)，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。就大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)比如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基——其具有期望的特异性、亲和力和能力——替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应的非人残基替换。另外，人源化抗体可以包括既没有在接受者抗体中也没有在输入的CDR或框架序列中发现的残基。做出这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包括基本上所有至少一种和通常两种可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体最佳地还将包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。进一步的细节参见Jones等，Nature,321:522-525,1986；Reichmann等，Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
“全人(fully human)”指的是免疫球蛋白，比如抗体，其中整个分子具有人起源或由与人形式的抗体具有同一性的氨基酸序列构成。
如本文使用的“同一性”指的是两个聚合物分子之间，特别是两个氨基酸分子之间，比如，两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个氨基酸序列在相同位置具有相同残基时；例如，如果两个多肽分子中的每个中的位置均被精氨酸占据，则它们在该位置是同一的。在比对中，两个氨基酸序列在相同位置具有相同残基的同一性或程度经常表达为百分数。两个氨基酸序列之间的同一性是匹配或同一位置的数目的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位置(例如，十个氨基酸长度的聚合物中的五个位置)是同一的，则两个序列是50％同一的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同一的，则两个氨基酸序列是90％同一的。
如本文使用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”定义为起抗体作用的一类蛋白质。由B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。包括在此类蛋白质中的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物，比如唾液、泪液、母乳、胃肠分泌物和呼吸道与生殖泌尿道的粘液分泌物中的初次抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是在大多数对象中的初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它在凝集、补体结合和其它抗体应答中是最有效的免疫球蛋白，并且在抵御细菌和病毒方面是重要的。IgD是不具有已知抗体功能的免疫球蛋白，但是可以充当抗原受体。IgE是在暴露于过敏原之后，通过引起从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体，介导速发过敏性的免疫球蛋白。
如本文使用的术语“免疫应答”定义为当淋巴细胞将抗原分子识别为异物并诱发形成抗体和/或活化淋巴细胞以移除抗原时发生的对抗原的细胞应答。
短语“免疫有效量”、“抗免疫应答有效量”、“免疫应答-抑制有效量”或“治疗量”指的是待施用至对象的本发明的组合物的量，所述量由医师决定，任选地与科学家协商，考虑个体在年龄、重量、免疫应答、疾病/病症的类型、和对象(患者)的健康中的差异，使得在对象中获得期望的结果。
如本文使用的“指导材料”包括出版物、记录、图表或任何其它可以用于传达本发明的组合物和方法的有用性的表达媒介。本发明的试剂盒的指导材料可以例如被附加至包含本发明的核酸、肽和/或组合物的容器，或与包含核酸、肽和/或组合物的容器一起运送。可选地，指导材料可以与容器分开地运送，目的是指导材料和化合物由接受者配合使用。
“分离的”意思是从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是部分或完全与它的自然状态的共存物质分开的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非自然环境，比如，例如，宿主细胞中。
如本文使用的“慢病毒”指的是逆转录病毒科家族的属。在逆转录病毒中慢病毒是唯一能够感染非分裂细胞的；它们可以递送显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，以便它们是基因递送载体的最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。衍生自慢病毒的载体提供了实现显著水平的体内基因转移的工具
如本文使用的术语“修饰的”意思是本发明的分子或细胞的改变的状态或结构。分子可以以许多方式被修饰，包括化学地、结构地和功能地。细胞可以通过引入核酸进行修饰。
如本文使用的术语“调节”意思是与缺少治疗或化合物的对象中的应答水平相比，和或与在其它方面相同但未治疗的对象中的应答水平相比，介导对象中的应答水平中的可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，从而介导对象——优选地，人——中的有益的治疗性应答。
在本发明的背景下，使用常见核酸碱基的下列缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，和“U”指的是尿苷。
除非另外规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括是彼此的简并形式并且编码相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可以在一些形式中包含内含子(一个或多个)。
除非另外规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括是彼此简并形式并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。
术语“可操作地连接”指的是调控序列和异源核酸序列之间的功能连接，其导致异源核酸序列的表达。例如，当第一核酸序列处于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。通常地，可操作地连接的DNA序列是邻近的，并且在必要时在同一的阅读框中接合两个蛋白编码区。
术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意欲指示相对于来自组织或器官的正常细胞的表达水平，来自疾病区如患者的特定组织或器官内的实体瘤的细胞中的肿瘤抗原表达的异常水平。患有以肿瘤抗原过表达表征的实体瘤或血液学恶性肿瘤的患者可以由本领域已知的标准测定来确定。
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括，例如，皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射，或注入技术。
如本文使用的术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。另外，核酸是核苷酸的聚合物。因而，如本文使用的核酸和多核苷酸是可交换的。本领域技术人员具有核酸是可以被水解为单体“核苷酸”的多核苷酸的一般知识。单体核苷酸可以被水解为核苷。如本文使用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可获得的任何手段获得的所有的核酸序列，所述手段非限制性地包括重组手段，即，使用普通克隆技术和PCRTM等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，和通过合成手段。
如本文使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可交换地使用，并且指的是由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，所述肽或蛋白质包括通过肽键相互接合的两个或更多个氨基酸。如本文使用的，该术语指的是短链，其在本领域中也通常被称为例如肽、寡肽和寡聚物；和较长链二者，其在本领域中通常被称为蛋白质，其具有许多类型。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文使用的术语“启动子”定义为起始多核苷酸序列的特异性转录需要的，由细胞的合成机器识别，或合成机器(machinery)引入的DNA序列。
如本文使用的，术语“启动子/调控序列”意思是对于可操作地连接至启动子/调控序列的基因产物的表达需要的核酸序列。在一些情况下，此序列可以是核心启动子序列，并且在其它情况下，此序列还可以包括对于基因产物的表达需要的增强子序列和其它调控元件。例如，启动子/调控序列可以是以组织特异性方式表达基因产物的序列。
“组成型”启动子是如下核苷酸序列，当其与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，引起在细胞的大多数或所有生理学条件下在细胞中产生基因产物。
“诱导型”启动子是如下核苷酸序列，当其与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，引起在基本上仅当对应于启动子的诱导物存在于细胞中时，在细胞中产生基因产物。
“组织-特异性”启动子是如下核苷酸序列，当其与编码基因或由基因规定的多核苷酸可操作地连接时，引起基本上仅如果细胞是对应于启动子的组织类型的细胞，则在细胞中产生基因产物。
“信号转导途径”指的是多种信号转导分子——其在将信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分中发挥作用——之间的生物化学关系。短语“细胞表面受体”包括分子和分子的复合体，其能够跨越细胞的质膜接收信号和传递信号。“细胞表面受体”的实例是人FSHR。
如本文使用的“相似性”指的是两个聚合物分子之间，例如，两个核酸分子之间，比如，两个DNA分子或两个RNA分子，或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个分子二者中的亚基位置均由相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中的每个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是相似的。两个序列之间的相似性是匹配或相似位置的数目的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位置(例如，十个亚基长度的聚合物中的五个位置)是相似的，则两个序列是50％相似的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或相似的，则两个氨基酸序列是90％相似的。
“单链抗体”指的是通过重组DNA技术形成的抗体，其中免疫球蛋白重链和轻链片段经由工程化跨度的氨基酸连接至Fv区。生成单链抗体的多种方法是已知的，包括在美国专利号4,694,778；Bird(1988)Science 242:423-442；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Ward等(1989)Nature 334:54454；Skerra等(1988)Science 242:1038-1041中描述的那些。
术语“小分子”指的是具有大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的肽，其具有结合靶标比如分子或抗原的能力。小分子包括低摩尔质量，比如小于大约12kD、11kD、10kD、9kD、8kD、7kD、6kD、5kD、或其之间的任何摩尔质量或更小。在一些实施方式中，小分子是亲和分子嵌合受体的小分子胞外结构域。在一些实施方式中，小分子是双特异性亲和分子的小分子结合结构域。小分子可以以它们结合靶标的能力和它们的结构表征。在一些实施方式中，小分子包括至少一个螺旋比如α-螺旋，或两个螺旋，三个螺旋或更多。小分子也可以是化学惰性的并且承受高温，比如85℃或更高。
如本文使用的关于抗体的术语“特异性地结合”意思是抗体识别特异性抗原但基本上不识别或结合样品中的其它分子。例如，特异性地结合至来自一个物种的抗原的抗体也可以结合至来自一个或多个物种的抗原。但是，这样的跨物种反应性本身不将抗体的类别改变为特异性的。在另一个实例中，特异性地结合至抗原的抗体也可以结合至不同等位基因形式的抗原。然而，这样的交叉反应性本身不将抗体的类别改变为特异性的。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可以参考抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用使用，意思是该相互作用依赖化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别和结合至特定蛋白结构，而不是一般地识别和结合至蛋白质。如果抗体特异于表位“A”，则在包含标记的“A”和抗体的反应中存在包含表位A(或游离的、未标记的A)的分子将降低结合至抗体的标记的A的量。
术语“刺激”意思是通过结合刺激分子(例如，TCR/CD3复合体)与其关联配体，从而介导信号转导事件——比如，但不限于经TCR/CD3复合体的信号转导——诱导的初次应答。刺激可以介导某些分子的改变的表达，比如TGF-β的下调、和/或细胞骨架结构的重组等。
“刺激分子”，作为本文使用的术语，意思是与存在于抗原呈递细胞上的关联刺激配体特异性地结合的T细胞上的分子。
如本文使用的“刺激配体”意思是如下配体：其当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B-细胞等)上时，可以与T细胞上的关联结合配偶体(在本文称为“刺激分子”)特异性地结合，从而介导T细胞的初次应答，其包括但不限于活化、免疫应答的起始、增殖等。刺激配体在本领域是熟知的，并且包括，特别是MHC I类分子——负载有肽、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体。
术语“对象”意欲包括其中可以引发免疫应答的活的生物体(例如，哺乳动物)。如其中使用的“对象”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括，例如，家畜和宠物，比如绵羊、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物和鼠科哺乳动物。优选地，对象是人。
如本文使用的“基本上纯化的”细胞是大体上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指的是已经与其它细胞类型——在其天然存在状态中与该其它细胞类型正常相关联——分开的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群指的是均质细胞群。在其它情况下，此术语简单地指的是已经与在其天然状态中与该细胞正常相关联的细胞分开的细胞。在一些实施方式中，在体外培养细胞。在其它实施方式中，不在体外培养细胞。
“靶位点”或“靶序列”指的是基因组核酸序列，其限定了在足以发生结合的条件下可以与结合分子特异性地结合的核酸区域。
如本文使用的，术语“T细胞受体”或“TCR”指的是响应于抗原的呈递参与T细胞的活化的膜蛋白的复合体。TCR负责识别结合至主要组织相容性复合体分子的抗原。TCR由alpha(a)和beta(β)链的异二聚体组成，但是在一些细胞中，TCR由γ和δ(γ/δ)链构成。TCR可以以α/β和γ/δ形式存在，其是结构上相似的，但是具有不同的解剖学位置和功能。每个链由两个胞外结构域——可变和恒定结构域——组成。在一些实施方式中，TCR可以在包括TCR的任何细胞上被修饰，包括，例如，辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、天然杀伤T细胞和γδT细胞。
如本文使用的术语“治疗性的”意思是治疗和/或预防。治疗性效果通过疾病状态的阻抑、缓解或根除获得。
如本文使用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指的是如下过程：通过该过程外源性核酸被转移或引入宿主细胞。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经被转染、转化或转导有外源性核酸的细胞。细胞包括原代对象细胞和其子代。
“治疗”疾病，作为本文使用的术语，意思是降低对象经历的疾病或障碍的至少一种迹象或症状的频率或严重度。
如本文使用的短语“在转录控制下”或“可操作地连接的”意思是启动子处于与多核苷酸有关的正确的位置和取向，以控制通过RNA聚合酶的转录的起始和多核苷酸的表达。
“载体”是物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可以用于递送分离的核酸至细胞内部。众多载体在本领域是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关联的多核苷酸、质粒和病毒。因而，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应当解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，比如，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
范围：遍及本公开内容，本发明的多个方面可以以范围格式呈现。应当理解范围格式的描述仅仅出于方便和简洁，并且不应当解释为对本发明的范围的僵硬限制。因此，范围的描述应当被考虑已经具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，比如1至6的范围的描述应当被考虑已经具体地公开了子范围比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这均适用。
描述
本发明包括用于生成能够表达双特异性抗体的修饰的T细胞的方法和组合物。在一些实施方式中，本发明包括用于生成修饰的T细胞的方法。其它实施方式包括修饰的T细胞或修饰的T细胞群。双特异性抗体包括对靶细胞上的抗原和活化T细胞上的抗原——比如CD3、CD4、CD8和TCR——的双特异性。
T细胞受体
本发明包括具有外源性T细胞受体(TCR)的T细胞。在一方面，本发明包括用于生成修饰的T细胞的方法，其包括扩展T细胞群，和将编码修饰的T细胞受体(TCR)——其包括对靶细胞上的抗原的亲和力——的核酸引入扩展的T细胞。在此实施方式中，T细胞能够表达修饰的TCR。
在另一方面，本发明包括用于生成修饰的T细胞的方法，其包括扩展T细胞群，和将编码修饰的T细胞受体(TCR)——其包括对靶细胞上的表面抗原的亲和力——的核酸引入扩展的T细胞。在此实施方式中，T细胞能够表达修饰的TCR。
T细胞受体是响应于抗原的呈递参与T细胞的活化的膜蛋白的复合体。TCR的刺激由抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合体分子(MHC)触发，所述抗原呈递细胞将抗原肽呈递至T细胞并且结合至TCR复合体以诱发一系列胞内信号传导级联。
TCR通常由六种不同的膜结合链——其形成负责配体识别的TCR异二聚体——组成。TCR以α/β和γ/δ形式存在，其是结构上相似的，但是具有不同的解剖学位置和功能。在一个实施方式中，TCR包括TCRα和β链，比如编码TCR的核酸包括编码TCRα链和TCRβ链的核酸。在另一个实施方式中，α或β链或二者包括至少一个N-去糖基化。
每个链由两个胞外结构域——可变和恒定结构域——组成。在一个实施方式中，TCR包括至少一个鼠恒定区。恒定结构域靠近细胞膜，接着是跨膜结构域和短胞质尾。在一个实施方式中，共刺激信号传导结构域是4-1BB共刺激信号传导结构域。可变结构域有助于确定TCR对其具有结合特异性的特定的抗原和MHC分子。转而，T细胞对独特的抗原-MHC复合体的特异性保留在由T细胞表达的特定的TCR中。
恒定和可变结构域中的每个可以包括链内二硫键。在一个实施方式中，TCR包括至少一个二硫键。可变结构域包括类似于抗体的互补决定区(CDR)的高度多态性的环。TCR序列的多样性经由连接的V基因(V)、D基因(D)、J基因(J)、和C基因的体细胞重排生成。
功能性α和γ链多肽由重排的V-J-C区形成，而β和δ链由V-D-J-C区组成。胞外恒定结构域包括近膜区和免疫球蛋白区。
在一个实施方式中，TCR包括野生型TCR、高亲和力TCR和嵌合TCR。当TCR被修饰时，与对野生型TCR相比，它可以具有更高的对靶细胞抗原的亲和力。在其中TCR是嵌合TCR的实施方式中，TCR可以包括嵌合结构域，比如TCR在至少一个链的C’端处包括共刺激信号传导结构域。在其它实施方式中，TCR可以包括修饰的链，比如修饰的α或β链。这样的修饰可以包括但不限于N-去糖基化，改变的结构域(比如工程化的可变区以靶向特异性的抗原或增加亲和力)、添加一个或多个二硫键，源自不同物种的整个链或链的片段、和其任意组合。
在本文的其它地方描述了靶细胞相关抗原的实例，其全部均可以被本发明的TCR靶向。
在一方面，本发明包括修饰的T细胞群，其包括电穿孔的编码修饰的T细胞受体(TCR)——其包括对靶细胞上的抗原的亲和力——的RNA，其中T细胞群在电穿孔有TCR RNA之前被扩展。
在另一方面，本发明包括修饰的T细胞，其包括编码T细胞受体(TCR)——其包括对靶细胞上的抗原的亲和力——的外源性核酸；和电穿孔的编码共刺激分子的核酸，其中T细胞表达TCR和共刺激分子。共刺激分子可以选自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1和PD1L。
在另一方面，本发明包括修饰的T细胞，其包括编码T细胞受体(TCR)——其包括对靶细胞上的表面抗原的亲和力——的外源性核酸；和电穿孔的编码共刺激分子的核酸，其中T细胞表达TCR和共刺激分子。
在又另一方面，本发明包括修饰的T细胞，其包括电穿孔的编码修饰的T细胞受体(TCR)的RNA，其中修饰的T细胞受体(TCR)包括对靶细胞上的抗原的亲和力，并且T细胞群在电穿孔有TCR RNA之前被扩展。
在又另一方面，本发明包括修饰的T细胞，其包括电穿孔的编码修饰的T细胞受体(TCR)的RNA，其中修饰的T细胞受体(TCR)包括对靶细胞上的表面抗原的亲和力，并且T细胞在电穿孔有TCR RNA之前被扩展。
在一个实施方式中，本发明包括将编码修饰的T细胞受体(TCR)——其包括对靶细胞上的抗原的亲和力——的核酸引入扩展的T细胞。在此实施方式中，T细胞能够表达修饰的TCR。
用于工程化和表达T细胞受体的技术包括但不限于产生TCR异二聚体，其包括连接各自的亚基的天然的二硫桥(Garboczi,等，(1996),Nature 384(6605):134-41；Garboczi,等，(1996),J Immunol 157(12):5403-10；Chang等，(1994),PNAS USA 91:11408-11412；Davodeau等，(1993),J.Biol.Chem.268(21):15455-15460；Golden等，(1997),J.Imm.Meth.206:163-169；美国专利号6,080,840)。
在一个实施方式中，TCR包括对靶细胞抗原的特异性。靶细胞抗原可以包括与靶细胞相关联的任何类型的蛋白质。例如，靶细胞抗原可以被选择以识别靶细胞的具体的疾病状态。因而，可以充当TCR的抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫性疾病和癌细胞相关联的那些。在一个实施方式中，靶细胞抗原包括任何肿瘤相关抗原(TAA)和病毒抗原、或其任意片段。
靶细胞抗原可以包括可以由主要组织相容性复合体加工和呈递的任何蛋白质。例如，靶抗原可以与特定的疾病状态相关联。因而，可以充当TCR的靶标的细胞标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫性疾病和癌细胞相关联的那些。在一个实施方式中，靶抗原包括任何肿瘤相关抗原(TAA)和病毒抗原、或其任意片段。
双特异性抗体
本发明包括双特异性抗体。双特异性抗体包括两种不同的结合特异性并且因而结合至两种不同的抗原。在一个实施方式中，双特异性抗体包括结合至第一抗原的第一抗原结合结构域和结合至第二抗原的第二抗原结合结构域。
在另一个实施方式中，双特异性抗体包括抗原结合结构域，其包括第一和第二单链可变片段(scFv)分子。在这样的实施方式中，第一和第二scFv结合靶细胞上的抗原和活化T细胞上的抗原。在另一个实施方式中，第一scFv分子特异于靶细胞上的至少一种抗原和第二scFv分子特异于活化T细胞上的抗原。例如，活化T细胞抗原可以结合CD3、CD4、CD8或TCR。在这些实例中，双特异性抗体识别T细胞抗原并且被称为双特异性T细胞衔接器(BiTE)。
在另一个实施方式中，第一和第二scFv结合靶细胞上的抗原和T细胞上的抗原。例如，T细胞抗原可以包括CLEAR、CD3、CD4、CD8或TCR。在这些实例中，双特异性抗体识别T细胞抗原，比如CD3、CD4、CD8或TCR，并且被称为双特异性T细胞衔接器(BiTE)。在另一个实施方式中，双特异性抗体包括对靶细胞上的抗原和T细胞上的CLEAR的双特异性。
然而，本发明不受使用任何具体的双特异性抗体所限制。而是，可以使用任何双特异性抗体或BiTE。双特异性抗体或BiTE分子还可以表达为对至少一种靶细胞相关抗原具有特异性的膜蛋白。在本文的其它地方描述了靶细胞相关抗原的实例，其全部均可以被本发明的双特异性抗体靶向。也在本文的其它地方描述了用于制造人和人源化抗体的技术。在一个实施方式中，双特异性抗体或BiTE分子包括双特异性抗原结合结构域。在此实施方式中，双特异性抗原结合结构域包括合成抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段、单结构域抗体、其抗原结合片段、和其任意组合。
在一方面，本发明包括修饰的T细胞群，其包括编码双特异性抗体——其包括对靶细胞上的抗原和T细胞上的抗原的双特异性——的核酸，比如RNA。T细胞群在引入核酸之前被扩展。
在一方面，本发明包括修饰的T细胞群，其包括电穿孔的编码双特异性抗体——其包括对靶细胞上的抗原和活化T细胞上的抗原的双特异性——的mRNA。T细胞群在BiTE电穿孔之前被扩展。
在另一方面，本发明包括修饰的T细胞，其包括电穿孔的编码双特异性T细胞衔接器(BiTE)分子的mRNA。在此实施方式中，BiTE分子包括对靶细胞上的抗原和活化T细胞上的抗原——其选自CD3、CD4、CD8和TCR——的双特异性。
在又另一方面，本发明包括修饰的T细胞群，其包括编码双特异性抗体——其包括对靶细胞上的抗原和T细胞上的抗原的双特异性——的核酸，比如RNA。T细胞群可以在引入核酸之前被扩展。
在又另一方面，本发明包括修饰的T细胞，其包括电穿孔的编码双特异性抗体的RNA。双特异性抗体包括对靶细胞上的抗原和活化T细胞上的抗原——其选自CD3、CD4、CD8和TCR——的双特异性。此实施方式还包括T细胞在电穿孔有双特异性抗体mRNA之前被扩展。
在又另一方面，本发明包括修饰的T细胞，其包括编码双特异性抗体的核酸，比如RNA。双特异性抗体包括对靶细胞上的抗原和T细胞上的抗原比如CLEAR的双特异性。此实施方式还包括在电穿孔有双特异性抗体RNA之前扩展T细胞。
在一个实施方式中，本发明包括使扩展的T细胞电穿孔有编码双特异性抗体比如BiTE分子的mRNA。在另一个实施方式中，本发明包括使扩展的T细胞引入有编码双特异性抗体比如BiTE分子的核酸。在这样的实施方式中，T细胞能够表达双特异性抗体。用于工程化和表达双特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983),WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.10:3655(1991))，和“杵臼(knob-in-hole)”工程化(参见，例如，美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可以通过如下制造：工程化用于制造抗体Fc-异二聚体分子的静电转向效应(electrostatic steering effect)(WO 2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980,和Brennan等，Science 229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等，J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))；使用制造双特异性抗体片段的“双抗体(diabody)”技术(参见，例如，Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(scFv)二聚体(参见，例如Gruber等，J.Immunol.,152:5368(1994))；和制备三特异性抗体，例如，如在Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中描述的。具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体——其包括“章鱼抗体”——也包括在本文中(参见，例如US 2006/0025576A1)。双特异性抗体可以通过连接两种不同的抗体或其部分构建。例如，双特异性抗体可以包括来自两种不同抗体的Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv和sdAb。
在一个实施方式中，双特异性抗体和/或BiTE分子包括双特异性抗原结合结构域，其包括第一和第二单链可变片段(scFv)分子。在这样的实施方式中，双特异性抗原结合结构域可以包括对靶细胞上的抗原和T细胞上的抗原的双特异性，比如第一scFv分子特异于靶细胞上的至少一种抗原和第二scFv分子至少特异于T细胞上的抗原。在另一个实施方式中，双特异性抗原结合结构域可以包括对靶细胞上的抗原和活化T细胞上的抗原的双特异性，比如第一scFv分子特异于靶细胞上的至少一种抗原和第二scFv分子特异于活化T细胞上的至少一种抗原。在另一个实施方式中，双特异性抗体表达为膜蛋白。
在一个实施方式中，双特异性抗体包括对靶细胞抗原的特异性。靶细胞抗原可以包括T细胞受体结合的相同的靶细胞抗原或可以包括不同的靶细胞抗原。靶细胞抗原可以包括限定靶细胞的任何类型的配体。例如，靶细胞抗原可以被选择以识别充当与特定疾病状态相关联的靶细胞上的细胞标志物的配体。因而，可以充当BiTE分子中的抗原部分结构域的配体的细胞标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫性疾病和癌细胞相关联的那些。
在一个实施方式中，靶细胞抗原包括任何肿瘤相关抗原(TAA)和病毒抗原、或其任意片段。在此实施方式中，双特异性抗体和/或BiTE分子包括特异性地结合至靶细胞抗原的抗体，比如合成抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段、单结构域抗体、其抗原结合片段、和其任意组合。活化T细胞抗原的实例可以包括肿瘤抗原、病毒抗原和其片段。靶细胞抗原的实例可以包括肿瘤抗原、病毒抗原和其片段。
在一个实施方式中，双特异性抗体和/或BiTE分子包括对活化T细胞上的至少一种抗原的特异性。活化T细胞抗原包括在T细胞的表面上发现的可以活化另一个细胞的抗原。活化T细胞抗原可以包括共刺激分子。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原高效应答所需要的。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和与CD83特异性地结合的配体等。其它共刺激元件也在本发明的范围内。
在一个实施方式中，活化T细胞抗原是CD3、CD4、CD8、T细胞受体(TCR)、或其任意片段。在此实施方式中，双特异性抗体和/或BiTE分子包括特异性地结合至活化T细胞抗原的抗体，比如合成抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段、单结构域抗体、其抗原结合片段、和其任意组合。活化T细胞抗原的实例可以包括抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗TCR和其片段。
在另一个实施方式中，双特异性抗体和/或BiTE分子包括对T细胞上的至少一种抗原的特异性。T细胞抗原包括在T细胞的表面上发现的抗原，比如CLEAR。T细胞抗原可以包括共刺激信号或结构域。共刺激信号或结构域来自除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原高效应答所需要的。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和与CD83特异性地结合的配体等。其它共刺激元件也在本发明的范围内。在一个实施方式中，双特异性抗体包括对靶细胞上的抗原和T细胞上的CLEAR的双特异性。
在另一个实施方式中，T细胞抗原是CD3、CD4、CD8、T细胞受体(TCR)或其任意片段。在此实施方式中，双特异性抗体和/或BiTE分子包括特异性地结合至T细胞抗原的抗体，比如合成抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段、单结构域抗体、其抗原结合片段、和其任意组合。活化T细胞抗原的实例可以包括抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗TCR和其片段。
亲和分子嵌合受体
本发明包括具有亲和分子嵌合受体的修饰的T细胞。在一方面，本发明包括用于生成修饰的T细胞的方法，其包括将编码亲和分子嵌合受体——其包括对靶细胞上的抗原具有亲和力的小分子胞外结构域——的核酸引入T细胞群，其中T细胞能够表达亲和分子嵌合受体。
亲和分子嵌合受体通常由用于抗原识别的小分子胞外结构域比如对靶细胞上的抗原具有亲和力的胞外结构域组成。在一些实施方式中，小分子胞外结构域衍生自抗体模拟物。双特异性亲和分子的小分子胞外结构域通常是具有大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的肽。小分子胞外结构域的摩尔质量可以小于单结构域抗体，比如小于大约10kD。在一个实施方式中，亲和分子嵌合受体包括小于大约10kD的小分子胞外结构域。小分子胞外结构域的摩尔质量可以小于大约12kD、11kD、10kD、9kD、8kD、7kD、6kD、5kD、或其之间的任意摩尔质量或更小。小分子胞外结构域还可以包括缺少二硫桥的螺旋结构。一些小分子胞外结构域包括至少一个α-螺旋、两个α-螺旋、三个α-螺旋或更多。小分子胞外结构域还可以是化学惰性的并且能够承受高温，比如大约85℃或更高。
在一个实施方式中，亲和分子嵌合受体进一步包括胞内信号传导结构域，比如CD3信号传导结构域；跨膜结构域，比如CD8跨膜结构域；和共刺激结构域，比如4-1BB共刺激结构域。
亲和分子嵌合受体还可以基于T细胞受体(TCR)。在此实施方式中，亲和分子嵌合受体包括小分子胞外结构域——其对靶细胞上的抗原具有亲和力，TCR可变结构域，和TCR恒定结构域。TCR可变结构域可以衍生自α或β链或两个链的嵌合。同样，TCR恒定结构域可以衍生自α或β链或两个链的嵌合。恒定和可变结构域中的每个可以包括链内二硫键。在一个实施方式中，TCR包括至少一个二硫键。可变结构域包括类似于抗体的互补决定区(CDR)的高度多态性的环。TCR序列的多样性经由连接的V基因(V)、D基因(D)、J基因(J)和C基因的体细胞重排生成。
在本文的其它地方描述了靶细胞相关抗原的实例，其全部均可以被本发明的亲和分子嵌合受体靶向。
在一方面，本发明包括修饰的T细胞群，其包括编码亲和分子嵌合受体——其包括对靶细胞上的抗原具有亲和力的小分子胞外结构域——的核酸，其中T细胞群表达亲和分子嵌合受体。
在另一方面，本发明包括修饰的T细胞，其包括编码亲和分子嵌合受体——其包括对靶细胞上的抗原具有亲和力的小分子胞外结构域——的核酸，其中T细胞表达亲和分子嵌合受体。
在一个实施方式中，小分子胞外结构域包括对靶细胞抗原的特异性。靶细胞抗原可以包括与靶细胞相关联的任何类型的蛋白质。例如，靶细胞抗原可以被选择以识别靶细胞的具体的疾病状态。因而，细胞表面标志物的实例可以作用以将小分子胞外结构域结合至抗原，比如与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫性疾病和癌细胞相关联的抗原。在一个实施方式中，靶细胞抗原包括任何肿瘤相关抗原(TAA)、细菌抗原、寄生虫抗原、病毒抗原或其任意片段。
靶细胞抗原可以包括可以由主要组织相容性复合体加工和呈递的任何蛋白质。例如，靶抗原可以与特定的疾病状态相关联。因而，可以充当TCR的靶标的细胞标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫性疾病和癌细胞相关联的那些。在一个实施方式中，靶抗原包括任何肿瘤相关抗原(TAA)和病毒抗原、或其任意片段。
双特异性亲和分子
本发明还包括双特异性亲和分子。双特异性亲和分子包括两种不同的结合特异性并且因而能够结合两种靶标、分子或抗原。在一方面，本发明包括修饰的细胞，其包括编码双特异性亲和分子——其包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域——的核酸。在此实施方式中，至少一个亲和结构域包括小分子抗原结合结构域并且细胞表达双特异性亲和分子。在另一个实施方式中，活化T细胞和靶细胞与双特异性亲和分子结合。
双特异性亲和分子的任一个亲和结构域可以包括小分子抗原结合结构域，以便小分子抗原结合结构域可以具有对靶细胞抗原或活化T细胞抗原的亲和力。在一个实施方式中，能够结合靶细胞抗原的亲和结构域选自小分子抗原结合结构域和抗体的抗原结合结构域。在另一个实施方式中，能够结合活化T细胞抗原的亲和结构域选自小分子抗原结合结构域和抗体的抗原结合结构域。在又另一个实施方式中，双特异性亲和分子包括对靶细胞抗原具有亲和力的小分子抗原结合结构域和对活化T细胞抗原具有亲和力的小分子抗原结合结构域。在一个实施方式中，双特异性亲和分子包括对靶细胞抗原具有亲和力的小分子抗原结合结构域和对活化T细胞抗原具有亲和力的抗体的抗原结合结构域。在另一个实施方式中，双特异性亲和分子包括对靶细胞抗原具有亲和力的抗体的抗原结合结构域和对活化T细胞抗原具有亲和力的小分子抗原结合结构域。
在一些实施方式中，双特异性亲和分子的小分子抗原结合结构域包括抗体模拟物或其片段。双特异性亲和分子的小分子抗原结合结构域通常是具有大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的肽。小分子的摩尔质量可以小于单结构域抗体，比如小于大约10kD。在一个实施方式中，双特异性亲和分子包括小于大约10kD的小分子抗原结合结构域。
当亲和结构域是小分子抗原结合结构域时，小分子可以具有小于大约12kD、11kD、10kD、9kD、8kD、7kD、6kD、5kD、或其之间的任意摩尔质量或更小的摩尔质量。对靶细胞抗原具有亲和力的小分子抗原结合结构域的摩尔质量可以大于或小于对活化T细胞抗原具有亲和力的小分子抗原结合结构域的摩尔质量。小分子抗原结合结构域还可以包括缺少二硫桥的螺旋结构。一些小分子抗原结合结构域包括至少一个α-螺旋、两个α-螺旋、三个α-螺旋或更多。小分子抗原结合结构域还可以是化学惰性的并且能够承受高温，比如大约85℃或更高。
在另一个实施方式中，编码双特异性亲和分子的核酸可以进一步包括亲和结构域之间的连接体或间隔区。如本文使用的，术语“连接体”或“间隔区”通常意思是起将一个亲和结构域连接至另一个——将小分子抗原结合结构域连接至另一个小分子抗原结合结构域或将小分子抗原结合结构域连接至抗体抗原结合结构域——功能的任何寡肽或多肽。间隔区或连接体可以包括多至300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸和最优选地25至50个氨基酸。
本发明不被使用仅特定的亲和结构域所限制。而是，可以使用任何亲和结构域。双特异性亲和分子还可以表达为对至少一种靶细胞抗原具有特异性的膜蛋白。在本文的其它地方描述了靶细胞抗原的实例，其全部均可以被本发明的双特异性亲和分子靶向。
在一个实施方式中，双特异性亲和分子包括抗体的抗原结合结构域。在本文的其它地方也描述了用于制造人和人源化抗体或其片段的技术。在此实施方式中，抗体抗原结合结构域包括合成抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段、单结构域抗体、其抗原结合片段、和其任意组合。
在一方面，本发明包括修饰的细胞群，其包括编码双特异性亲和分子——其包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域——的核酸，其中至少一个亲和结构域包括小分子抗原结合结构域并且细胞群表达双特异性亲和分子。修饰的细胞群包括淋巴细胞，比如T细胞、B细胞或天然杀伤细胞；抗原呈递细胞；或非淋巴细胞。在一个实施方式中，细胞群包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞或抗原呈递细胞。
在另一方面，本发明包括修饰的细胞，其包括编码双特异性亲和分子——其包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域——的核酸，其中至少一个亲和结构域包括小分子抗原结合结构域并且细胞表达双特异性亲和分子。修饰的细胞可以选自淋巴细胞，比如T细胞、B细胞或天然杀伤细胞；抗原呈递细胞；或非淋巴细胞。在一个实施方式中，细胞是T细胞、B细胞、天然杀伤细胞或抗原呈递细胞。
在又另一方面，本发明包括生成修饰的细胞的方法，其包括将编码双特异性亲和分子——其包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域——的核酸引入细胞群。在此实施方式中，至少一个亲和结构域包括小分子抗原结合结构域并且细胞表达双特异性亲和分子。在一个实施方式中，细胞群包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞或抗原呈递细胞。用于工程化和表达双特异性亲和分子的技术包括但不限于AffibodyTM分子的工程化(参见等，FEBS Letters 584:2670(2010)；Feldwisch等，J Mol Biol,398(2):232(2010)；美国专利号：8,501,909、8,426,557、8,247,375和7,993,650；和美国公布号：2014/0295521)，和“杵臼”工程化(参见，例如，美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可以通过如下制造：工程化用于制造抗体Fc-异二聚体分子的静电转向效应(WO 2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980和Brennan等，Science 229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等，J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))；使用制造双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见，例如，Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(scFv)二聚体(参见，例如Gruber等，J.Immunol.,152:5368(1994))；和制备三特异性抗体，例如，如在Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中描述的。具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体——其包括“章鱼抗体”——也包括在本文中(参见，例如US 2006/0025576A1)。双特异性抗体可以通过连接两种不同的抗体或其部分构建。例如，双特异性亲和分子的亲和结构域中的一个可以包括来自抗体的Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv或sdAb。
在一个实施方式中，双特异性亲和分子包括能够结合靶细胞抗原的亲和结构域。靶细胞抗原可以包括限定靶细胞的任何类型的配体或抗原。例如，靶细胞抗原可以被选择以识别充当靶细胞上的细胞标志物并且与特定的疾病状态相关联的配体。因而，靶细胞抗原的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、疾病状态、自身免疫性疾病和癌细胞相关联的那些。
在一个实施方式中，靶细胞抗原包括任何肿瘤相关抗原(TAA)、细菌抗原、寄生虫抗原、病毒抗原和其任意片段。当亲和结构域是抗体的抗原结合结构域时，抗体的抗原结合结构域可以包括特异性地结合至靶细胞抗原的抗体，比如合成抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段、单结构域抗体、其抗原结合片段、和其任意组合。
在另一个实施方式中，双特异性亲和分子包括能够结合活化T细胞抗原的亲和结构域。活化T细胞抗原包括在T细胞的表面上发现的可以活化另一种细胞的抗原。活化T细胞抗原可以包括共刺激分子。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原高效应答所需要的。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性地结合的配体等。其它共刺激元件也在本发明的范围内。
在又另一个实施方式中，活化T细胞抗原是CD3、CD4、CD8、T细胞受体(TCR)或其任意片段。在此实施方式中，双特异性抗体和/或BiTE分子包括特异性地结合至活化T细胞抗原的抗体，比如合成抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段、单结构域抗体、其抗原结合片段、和其任意组合。活化T细胞抗原的实例可以包括抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗TCR和其片段。
嵌合配体工程化活化受体
本发明包括具有嵌合配体工程化活化受体的T细胞。在一方面，本发明包括用于生成修饰的T细胞的方法，其包括扩展T细胞群，和引入编码嵌合配体工程化活化受体(CLEAR)的核酸。在此实施方式中，T细胞能够表达CLEAR。
CLEAR通常由用于配体识别的胞外结构域和用于活化信号转导的胞内结构域组成。在一个实施方式中，CLEAR包括胞内活化结构域和胞外结构域。
胞外结构域可以被工程化以便被抗体、受体、配体或其它结合分子识别。在一个实施方式中，胞外结构域特异性地结合至正常地不由健康细胞或组织表达的肿瘤抗原或分子。肿瘤抗原或异常分子的实例包括但不限于病毒、细菌和寄生虫抗原、肿瘤相关抗原(TAA)或其任意片段。在一个实施方式中，胞外结构域选自抗体的抗原结合结构域、受体的配体结合结构域、抗原或配体。在另一个实施方式中，胞外结构域选自CD27、CD28、CD70、CD80、PD1或PD-L1。在又另一个实施方式中，胞外结构域能够结合至肿瘤抗原。
胞内结构域可以被工程化以在T细胞内提供活化信号。胞内结构域的实例包括但不限于来自CD3、有或没有共刺激信号的CD3ζ、CD28、CD4、CD8、4-1BB、TCRα和/或β链的胞内结构域、或任何其胞内结构域的片段。在一个实施方式中，胞内活化结构域包括CD3ζ的胞内活化结构域。在另一个实施方式中，在T细胞内提供的活化信号可以是诱导T细胞的生长、细胞因子产生、裂解活性和其它活性的正信号。在又另一个实施方式中，在T细胞内提供的活化信号可以是关闭T细胞内的活性的负信号，比如抑制生长，诱导衰老和/或无变应性，抑制细胞因子产生、和T细胞的其它活性。
在另一个实施方式中，CLEAR包括共刺激结构域。来自分子的共刺激结构域包括但不限于CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性地结合的配体等。其它共刺激元件也在本发明的范围内。
共刺激分子
在一个实施方式中，本发明的修饰的T细胞进一步包括编码共刺激分子的核酸，以便修饰的T细胞表达共刺激分子。核酸可以通过转导T细胞、转染T细胞或电穿孔T细胞被引入T细胞。在另一个实施方式中，共刺激分子选自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1和PD1L。在又另一个实施方式中，共刺激分子是CD3，并且CD3包括至少两种不同的CD3链，比如CD3ζ链和CD3ε链。在示例性实施方式中，编码共刺激分子比如CD3的RNA被电穿孔入T细胞或者细胞。在另一个实施方式中，编码共刺激分子的核酸比如CD3 RNA与另一种核酸比如编码亲和分子嵌合受体的核酸或RNA共电穿孔。
在另一个实施方式中，TCR被修饰以包括共刺激结构域，其选自来自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1和PD1L的至少一个结构域。
引入核酸
将核酸引入细胞的方法包括物理、生物和化学方法。用于将多核苷酸比如RNA引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。RNA可以使用商业上可获得的方法被引入靶细胞，所述方法包括电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,HamburgGermany)。RNA还可以通过如下方法被引入细胞：使用阳离子脂质体介导的转染、使用脂质转染、使用聚合物封装、使用肽介导的转染、或使用生物射弹粒子递送系统比如“基因枪”(参见，例如，Nishikawa等Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001))。
用于将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的方法，其用于将基因插入哺乳动物，例如，人细胞。其它病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、I型单纯疱疹病毒、腺病毒和腺伴随病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，比如大分子复合体、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的系统——其包括水包油型乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
适于使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,MO获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质的原液可以被保存在大约-20℃下。氯仿被用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，其包括通过生成封闭的脂双层或聚集体而形成的多种单层和多层脂质媒介物。脂质体可以表征为具有囊泡结构，其具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们自发形成。在形成封闭的结构和使水与溶解的溶质陷入脂双层之间前，脂质组分经历自我重排(Ghosh等，1991Glycobiology 5:505-10)。然而，也包括与正常的囊泡结构相比溶液中具有不同结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅仅作为脂质分子的非均一聚集体存在。同样考虑的是脂质转染胺-核酸复合体。
不管用于将外源性核酸引入宿主细胞或以其它方式使细胞暴露于本发明的抑制剂的方法如何，为了确认核酸在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。这样的测定包括，例如，本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，比如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，比如检测特定肽的存在或不存在，例如，通过免疫学手段(ELlSA和蛋白质印迹)或通过本文描述的鉴定试剂的测定，其落入本发明范围内。
在一个实施方式中，编码T细胞受体(TCR)——其包括对靶细胞上的抗原的亲和力——的核酸被引入T细胞。核酸可以通过任何手段被引入，比如转导扩展的T细胞、转染扩展的T细胞和电穿孔扩展的T细胞。
在另一个实施方式中，编码亲和分子嵌合受体或双特异性亲和分子的核酸通过选自如下的方法被引入：转导细胞群、转染细胞群和电穿孔细胞群。
在另一个实施方式中，编码双特异性亲和分子——其包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域——的核酸通过选自如下的方法进入细胞群：转导细胞群、转染细胞群和电穿孔细胞群。
在又另一个实施方式中，编码双特异性抗体——比如BiTE分子——的核酸被引入T细胞。核酸可以通过任何手段被引入，比如转导扩展的T细胞、转染扩展的T细胞和电穿孔扩展的T细胞。
RNA
在一个实施方式中，被引入T细胞的核酸是RNA。在另一个实施方式中，RNA是包括体外转录的RNA或合成RNA的mRNA。使用聚合酶链式反应(PCR)-生成的模板通过体外转录产生RNA。来自任何来源的感兴趣的DNA可以通过PCR直接转化为使用适当的引物和RNA聚合酶的体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是，例如，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成的DNA序列或任何其它适当的DNA来源。体外转录的期望的模板是嵌合膜蛋白。举例而言，模板编码抗体、抗体的片段或抗体的一部分。又举例而言，模板包括胞外结构域——其包括抗体比如抗CD3的单链可变结构域；和共刺激分子的胞内结构域。在一个实施方式中，RNA嵌合膜蛋白的模板编码嵌合膜蛋白，其包括胞外结构域——其包括衍生自共刺激分子的抗体的抗原结合结构域；和衍生自CD28和4-1BB的胞内结构域的一部分的胞内结构域。
PCR可以用于生成体外转录mRNA——其随后被引入细胞——的模板。用于进行PCR的方法是本领域熟知的。用于PCR的引物设计为具有与待用作PCR的模板的DNA的区域基本上互补的区域。如本文使用的“基本上互补”指的是其中引物序列中大部分或所有的碱基是互补的，或一个或多个碱基是非互补的或错配的核苷酸的序列。基本上互补的序列能够与预期DNA靶标在用于PCR的退火条件下退火或杂交。引物可以设计为与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，引物可以设计为扩增在细胞中正常转录的基因部分(开放阅读框)，其包括5'和3'UTR。引物也可以设计为扩增编码感兴趣的具体结构域的基因部分。在一个实施方式中，引物设计为扩增包括所有或部分的5'和3'UTR的人cDNA的编码区。通过本领域熟知的合成方法生成可用于PCR的引物。“正向引物”是包含与待扩增的DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本上互补的核苷酸区域的引物。本文使用的“上游”指的是待扩增的DNA序列相对于编码链的5'位置。“反向引物”是包含与待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区域的引物。本文使用的“下游”指的是待扩增的DNA序列相对于编码链的3'位置。
还可以使用具有促进RNA的稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。RNA优选地具有5'和3'UTR。在一个实施方式中，5'UTR的长度在零和3000个核苷酸之间。待添加至编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同的方法改变，包括但不限于设计用于PCR的引物，其退火至UTR的不同区域。使用此方法，本领域普通技术人员可以修改实现转染转录的RNA之后最佳翻译效率所需要的5'和3'UTR长度。
5'和3'UTR可以是感兴趣的基因的天然存在的内源性5'和3'UTR。可选地，可以通过将UTR序列并入正向和反向引物或通过模板的任何其它修饰添加对感兴趣的基因非内源性的UTR序列。使用对感兴趣的基因非内源性的UTR序列可以有用于修改RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的富AU元件可以降低mRNA的稳定性。因此，3'UTR可以被选择或设计以基于本领域熟知的UTR的性质增加转录的RNA的稳定性。
在一个实施方式中，5'UTR可以包含内源基因的Kozak序列。可选地，当正通过如上面描述的PCR添加对感兴趣的基因非内源性的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有的Kozak序列。Kozak序列可以增加一些RNA转录物的翻译效率，但是似乎不是所有RNA高效翻译所需要的。对于许多mRNA的Kozak序列的要求是本领域已知的。在其它实施方式中，5'UTR可以源自RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒。在其它实施方式中，多种核苷酸类似物可以用于3'或5'UTR以阻碍mRNA的核酸外切酶降解。
为了能够实现从DNA模板合成RNA而不需要基因克隆，转录的启动子应当附加至待转录的序列上游的DNA模板。当作为RNA聚合酶的启动子起作用的序列被添加至正向引物的5'末端时，RNA聚合酶启动子并入待转录的开放阅读框上游的PCR产物。在一个实施方式中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其它地方描述的。其它有用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有的核苷酸序列是本领域已知的。
在一个实施方式中，mRNA具有5'末端上的帽和3'聚腺苷酸尾，其决定核糖体结合、翻译的起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板，例如，质粒DNA上，RNA聚合酶产生不适于在真核细胞中表达的长的多联体产物(concatameric product)。在3'UTR的末端处线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，其在真核转染中无效，即使其在转录之后被聚腺苷酸化。
在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可以使转录物的3'末端延伸超过模板的最后一个碱基(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003))。
将聚A/T一段序列(stretch)整合入DNA模板的常规方法是分子克隆。然而，整合入质粒DNA的聚A/T序列可以引起质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常被缺失和其它畸变高度污染。这使得克隆程序不仅费力且耗时，而且经常不可靠。这就是为什么允许构建具有聚A/T 3'一段序列的DNA模板而没有克隆的方法是高度期望的。
转录的DNA模板的聚A/T区段可以在PCR期间通过使用包含聚T尾——比如100个T尾(大小可以是50-5000个T)——的反向引物产生，或在PCR后通过任何其它方法产生，所述方法包括但不限于DNA连接或体外重组。聚腺苷酸尾也为RNA提供稳定性并且减少它们的降解。通常，聚腺苷酸尾的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一个实施方式中，聚腺苷酸尾在100和5000个腺苷之间。
RNA的聚腺苷酸尾可以在体外转录之后使用聚腺苷酸聚合酶——比如大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶(E-PAP)——进一步延伸。在一个实施方式中，使聚腺苷酸尾的长度从100个核苷酸增加至300和400个核苷酸之间导致RNA的翻译效率增加大约两倍。额外地，不同的化学基团附加至3'末端可以增加mRNA稳定性。这样的附加可以包含修饰的/人工的核苷酸、适配体和其它化合物。例如，ATP类似物可以使用聚腺苷酸聚合酶并入聚腺苷酸尾。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。
5'帽也为RNA分子提供稳定性。在优选的实施方式中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5'帽。使用本领域已知的和本文描述的技术提供5'帽(Cougot,等，Trends inBiochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski,等，RNA,7:1468-95(2001)；Elango,等，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
通过本文公开的方法产生的RNA还可以包含内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是起始帽-独立性核糖体结合至mRNA并且促进翻译起始的任何病毒序列、染色体序列或人工设计的序列。可以包括适于细胞电穿孔的任何溶质，其可以包含促进细胞通透性和生存力的因子，比如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
公开的方法可以在癌症、干细胞、急性和慢性感染、和自身免疫性疾病领域中的基础研究和疗法中应用于调节T细胞活性，其包括评估基因修饰的T细胞杀伤靶癌细胞的能力。
方法还提供了通过改变例如启动子或输入RNA的量在宽的范围内控制表达水平的能力，其使得可能单独地调控表达水平。另外，基于PCR的mRNA生产技术极大地促进具有不同结构和它们的结构域组合的嵌合受体mRNA的设计。例如，相同细胞中的多种嵌合受体上的不同的细胞内效应物/共刺激物(costimulator)结构域的改变允许决定受体组合的结构，其评估抗多抗原靶标的最高水平的细胞毒性，和同时对正常细胞的最低细胞毒性。
本发明的RNA转染方法的一个优势是RNA转染大体上是瞬时和无载体的。RNA转基因可以在简短的体外细胞活化之后被递送至淋巴细胞并且在其中表达，其作为最小的表达盒而不需要任何额外的病毒序列。在这些条件下，转基因整合入宿主细胞基因组是不可能的。由于RNA的转染效率和其均匀修饰整个淋巴细胞群的能力，细胞的克隆不是必需的。
使用体外-转录的RNA(IVT-RNA)的T细胞的基因修饰利用均已经成功在多种动物模型中测试的两种不同的策略。借助脂质转染或电穿孔，使用体外-转录的RNA转染细胞。使用各种修饰稳定IVT-RNA是期望的，以便实现转移的IVT-RNA的延长表达。
一些IVT载体在文献中是已知的，其以标准化方式用作体外转录的模板并且其已经被基因修饰为使得产生稳定的RNA转录物。用于本领域的目前的方案基于具有下列结构的质粒载体：使得能够RNA转录的5'RNA聚合酶启动子，接着是由非翻译区域(UTR)在3'和/或5'为侧翼的感兴趣的基因，和包含50-70个A核苷酸的3'聚腺嘌呤基盒。体外转录之前，环状质粒在聚腺嘌呤基盒下游通过II型限制酶(对应于切割位点的识别序列)线性化。聚腺嘌呤基盒因而对应于转录物中的后面的聚腺苷酸序列。作为此程序的结果，在线性化后一些核苷酸仍作为部分酶切割位点并且延伸或掩盖3'末端处的聚腺苷酸序列。尚不清楚此非生理学突出端是否影响从这样的构建体细胞内产生的蛋白质的量。
RNA具有优于更传统的质粒或病毒方法的许多优势。来自RNA来源的基因表达不需要转录并且在转染后快速地产生蛋白质产物。进一步，由于RNA必须仅接近细胞质而不是细胞核，并且因此典型的转染方法导致极高的转染率。此外，基于质粒的方法需要驱动感兴趣的基因表达的启动子在研究的细胞中是活性的。
在另一方面，RNA构建体通过电穿孔递送入细胞。参见，例如，如在US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中教导的将核酸构建体电穿孔入哺乳动物细胞的制剂和方法。包括电穿孔任何已知的细胞类型所需要的电场强度在内的多个参数在相关研究文献以及领域中的众多专利和申请中通常是已知的。参见例如，美国专利号6,678,556、美国专利号7,171,264和美国专利号7,173,116。用于电穿孔的治疗性应用的设备是商业上可获得的，例如，MedPulserTMDNA电穿孔治疗系统(Inovio/Genetronics,San Diego,Calif.)，并且描述在专利比如美国专利号6,567,694；美国专利号6,516,223、美国专利号5,993,434、美国专利号6,181,964、美国专利号6,241,701和美国专利号6,233,482中；电穿孔也可以用于体外细胞转染，例如，如在US20070128708A1中描述的。电穿孔也可以用于将核酸体外递送入细胞。因此，利用本领域技术人员已知的任何的许多可用的装置和电穿孔系统将包括核酸的表达构建体电穿孔-介导施用入细胞提供了令人激动的递送感兴趣的RNA至靶细胞的新手段。
在一些实施方式中，编码TCR的RNA被电穿孔入细胞。在一个实施方式中，编码TCR的RNA是体外转录的RNA。在一些实施方式中，编码双特异性抗体的mRNA被电穿孔入细胞。在另一个实施方式中，编码双特异性抗体的mRNA是体外转录的mRNA。
在一些实施方式中，编码双特异性抗体的RNA被电穿孔入细胞。在一个实施方式中，编码双特异性抗体的RNA是体外转录的RNA。
在一些实施方式中，编码亲和分子嵌合受体或双特异性亲和分子的RNA被电穿孔入细胞。在一个实施方式中，编码亲和分子嵌合受体或双特异性亲和分子的RNA是体外转录的RNA。
在一个实施方式中，方法包括电穿孔编码TCRα和β链的RNA。TCRα和β链可以在相同的或分开的RNA上编码，比如共电穿孔编码TCRα链的RNA和编码TCRβ链的分开的RNA。当α和β由分开的RNA编码时，RNA可以被共电穿孔。
在一些实施方式中，方法进一步包括电穿孔编码双特异性抗体或BiTE分子的核酸。双特异性抗体核酸可以与TCR RNA共电穿孔。
在另一个实施方式中，方法可以进一步包括电穿孔编码共刺激分子的核酸。共刺激分子核酸可以与TCR RNA共电穿孔。
在一个实施方式中，方法包括电穿孔编码亲和分子嵌合受体的RNA。在另一个实施方式中，方法进一步包括电穿孔编码共刺激分子比如CD3的RNA。亲和分子嵌合受体和共刺激分子可以在相同的或分开的RNA上编码。当亲和分子嵌合受体和共刺激分子由分开的RNA编码时，RNA可以被共电穿孔。
在另一个实施方式中，方法包括电穿孔编码双特异性亲和分子的核酸。共刺激分子核酸还可以与双特异性亲和分子核酸共电穿孔。
嵌合膜蛋白
在一个实施方式中，修饰的T细胞在引入核酸之前被扩展。在另一个实施方式中，修饰的T细胞在电穿孔有编码TCR或双特异性抗体或BiTE分子的RNA之前被扩展。T细胞的扩展可以包括使T细胞电穿孔有编码嵌合膜蛋白的RNA，和培养电穿孔的T细胞。本发明的嵌合膜蛋白包括胞外和胞内结构域。胞外结构域包括靶特异性结合元件，比如抗体。在一个实施方式中，嵌合膜蛋白的胞外结构域靶向包括但不限于TCR、CD3、CD28等的T细胞上的分子。
胞外结构域
本发明包括包含抗原结合结构域的胞外结构域，所述抗原结合结构域包括针对T细胞上的分子的抗体或其片段。分子可以包括共刺激T细胞的任何分子，比如，但不限于TCR、CD3、CD28或其组合。在一个实施方式中，胞外结构域可以包括抗原结合结构域，其包括抗CD3抗体、抗TCR抗体、抗CD28抗体或其组合的CD3结合结构域。
在另一个实施方式中，胞外结构域可以包括结合至抗原的抗体的任何片段，其包括但不限于合成抗体、人抗体、人源化抗体、单结构域抗体、单链可变片段、和其片段的抗原结合结构域。在一些情况下，胞外结构域源自相同的物种——嵌合膜蛋白将最终用于其中——是有利的。例如，对于用于人，嵌合膜蛋白的胞外结构域包括人抗体或其片段可以是有利的。因而，在一个实施方式中，胞外结构域包括人抗体或其片段。
在一个实施方式中，抗体是合成抗体、人抗体、人源化抗体、单结构域抗体、单链可变片段和其抗原-结合片段。
胞内结构域
胞内结构域或胞质结构域包括共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指的是共刺激分子的胞内结构域。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原高效应答所需要的。
嵌合膜蛋白的胞质结构域或胞内信号传导结构域负责活化T细胞的效应物功能中的至少一种。术语“效应物功能”指的是细胞的专有功能。例如，T细胞的效应物功能可以是包括分泌细胞因子的细胞溶解活性或辅助活性。因而，术语“胞内信号传导结构域”指的是转导效应物功能信号并且指导细胞进行专有功能的蛋白质部分。虽然经常可以采用整个胞内信号传导结构域，但是在很多情况下，不必需使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，这样的截短部分可以用于替代完整的链，只要它转导效应物功能信号。术语胞内信号传导结构域因而意思是包括足以转导效应物功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于嵌合膜蛋白的胞内信号传导结构域的非限制性实例包括CD28、4-1BB、T细胞受体(TCR)、共刺激分子的胞内结构域的任何片段，这些序列的任何衍生物或变体，具有相同功能性能力的任何合成序列，和其任意组合。
嵌合膜蛋白的其它结构域
在嵌合膜蛋白的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在嵌合膜蛋白的胞质结构域和跨膜结构域之间，可以并入间隔结构域。如本文使用的，术语“间隔结构域”通常意思是起将跨膜结构域连接至多肽链中的胞外结构域或胞质结构域作用的任何寡肽或多肽。间隔结构域可以包括多至300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸和最优选地25至50个氨基酸。
在一些实施方式中，嵌合膜蛋白进一步包括跨膜结构域。在一些实施方式中，嵌合膜蛋白进一步包括铰链结构域。在一个实施方式中，编码嵌合膜蛋白的mRNA进一步包括跨膜和铰链结构域，比如CD28跨膜结构域和CD8-α铰链结构域。
人抗体
对于在人体内使用抗体，使用人抗体可以是优选的。完全人抗体对于人对象的治疗性处理是特别期望的。人抗体可以通过各种本领域已知的方法制造，所述方法包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法，其包括对这些技术的改进。还参见美国专利号4,444,887和4,716,111；和PCT公布WO 98/46645、WO98/50433、WO 98/24893、WO98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO91/10741；其每篇通过引用以其全部并入本文。人抗体还可以是如此抗体，其中重链和轻链由源自一个或多个人DNA来源的核苷酸序列编码。
人抗体还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体可以被随机地或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。可选地，除人重链和轻链基因之外，人可变区、恒定区和多变区也可以被引入小鼠胚胎干细胞。通过同源重组，可以与引入人免疫球蛋白基因座分开地或同时地使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因非功能性。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中纯合缺失抗体重链J区(JH)基因导致内源性抗体产生的完全抑制。修饰的胚胎干细胞被扩展并且显微注射入胚泡以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。转基因小鼠以正常的方式使用选择的抗原——例如本发明的多肽的全部或部分——进行免疫。针对选择的靶标的抗体可以使用常规的杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得。由转基因小鼠聚藏(harbor)的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，并且随后经历类别转换和体细胞突变。因而，使用这样的技术可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体，包括但不限于IgG1(γ1)和IgG3。对于此技术用于产生人抗体的综述，参见Lonberg和Huszar(Int.Rev.Immunol.,13:65-93(1995))。对于此技术用于产生人抗体和人单克隆抗体以及用于生产这样的抗体的方案的详细讨论，参见，例如，PCT公布号WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735；和美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；和5,939,598，其每篇通过引用以其全部并入本文。此外，可以与公司比如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和Genpharm(San Jose,Calif.)签订合同以使用与上面描述的类似的技术提供针对选择的抗原的人抗体。对于在种系突变小鼠中转移人类种系免疫球蛋白基因阵列在抗原攻击之后将导致产生人抗体的具体讨论，参见，例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等，Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immunol.,7:33(1993)；和Duchosal等，Nature,355:258(1992)。
人抗体也可以源自噬菌体展示文库(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)；Vaughan等，Nature Biotech.,14:309(1996))。噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature,348:552-553(1990))可以用于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因所有组成成分在体外产生人抗体和抗体片段。根据此技术，将抗体V结构域基因符合读框地克隆入丝状噬菌体比如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因，并且在噬菌体颗粒的表面上作为功能性抗体片段展示。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性质的选择也导致选择编码展示那些性质的抗体的基因。因而，噬菌体模拟了B细胞的一些性质。噬菌体展示可以以各种形式进行；对于其综述，参见，例如，Johnson,Kevin S,和Chiswell,David J.,Current Opinionin Structural Biology 3:564-571(1993)。数种来源的V基因片段可以用于噬菌体展示。Clackson等，Nature,352:624-628(1991)从源自未免疫小鼠脾脏的V基因的小的随机组合文库分离了抗唑酮抗体的多样化阵列。可以构建来自未免疫人供体的V基因所有组成成分，并且抗原(包括自体抗原)的多样化阵列的抗体可以大体上遵循下列描述的技术进行分离：Marks等，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.,12:725-734(1993)。还参见美国专利号5,565,332和5,573,905，其每篇通过引用以其全部并入本文。
人抗体也可以通过体外活化的B细胞生成(参见，美国专利号5,567,610和5,229,275，其每篇通过引用以其全部并入本文)。人抗体也可以使用杂交瘤技术体外生成，比如，但不限于Roder等(Methods Enzymol.,121:140-167(1986))描述的。
人源化抗体
可选地，在一些实施方式中，非人抗体是人源化的，其中抗体的特异性序列或区域被修饰以增加与人中天然产生的抗体的相似性。在一个实施方式中，抗原结合结构域是人源化的。
“人源化”抗体保留与原始抗体相似的抗原特异性。然而，使用人源化的某些方法，可以增加抗体对人CD3抗原的结合亲和力和/或特异性——使用“定向进化”的方法，如由Wu等，J.Mol.Biol.,294:151(1999)描述的，其内容通过引用以其全部并入本文。
人源化抗体具有从非人来源引入其的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。因而，人源化抗体包括来自非人免疫球蛋白分子的一个或多个CDR和来自人的框架区。抗体的人源化是本领域熟知的，并且可以大体上遵循Winter与合作者的方法进行(Jones等，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等，Science,239:1534-1536(1988))，其通过将啮齿动物CDR或CDR序列置换为相应的人抗体序列，即CDR-移植(EP 239,400；PCT公布号WO 91/09967；和美国专利号4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，其内容通过引用以其全部并入本文)。在这样的人源化嵌合抗体中，实质上小于完整人可变结构域已经被来自非人物种的相应的序列置换。实际中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基置换的人抗体。抗体的人源化也可以通过贴面(veneering)或表面重建(resurfacing)(EP592,106；EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等，Protein Engineering,7(6):805-814(1994)；和Roguska等，PNAS,91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)实现，其内容通过引用以其全部并入本文。
用于制造人源化抗体的人可变结构域——轻和重二者——的选择降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”方法，啮齿动物抗体的可变结构域的序列针对已知的人可变结构域序列的整个文库进行筛选。最接近于啮齿动物的人序列然后被接受为用于人源化抗体的人框架(FR)(Sims等，J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.,196:901(1987)，其内容通过引用以其全部并入本文)。另一种方法使用源自特定的轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等，J.Immunol.,151:2623(1993)，其内容通过引用以其全部并入本文)。
抗体可以被人源化，且保留对靶抗原的高亲和力以及其它有利的生物学性质。根据本发明的一个方面，人源化抗体通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念性人源化产物的方法来制备。三维免疫球蛋白模型是一般可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。图解和展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。以此方式，FR残基可以从接受者和输入序列选择并组合，使得实现期望的抗体特性，比如对靶抗原的增加的亲和力。一般而言，CDR残基直接地和最实质性地参与影响抗原结合。
T细胞的来源
在扩展之前，从对象获得T细胞的来源。对象的非限制性实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。优选地，对象是人。T细胞可以从大量来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾脏组织、脐带和肿瘤。在某些实施方式中，可以使用本领域可获得的任意数目的T细胞系。在某些实施方式中，T细胞可以使用技术人员已知的任意数目的技术比如Ficoll分离从自对象收集的血液单位获得。在一个实施方式中，来自个体的循环血的细胞通过单采血液成分术或白细胞提取法获得。单采血液成分术产物通常包含淋巴细胞，其包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它成核的白细胞、红细胞和血小板。可以清洗由单采血液成分术收集的细胞以移除血浆级分并将细胞放置在适当的缓冲液或培养基中，用于随后的处理步骤，所述缓冲液或培养基比如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或清洗溶液，其缺少钙并且可以缺少镁或可以缺少许多——如果不是全部的话——二价阳离子。在清洗后，细胞可以重悬在各种生物相容性缓冲液中，比如，例如，无Ca、无Mg的PBS。可选地，可以移除单采血液成分术样品的非期望的组分，并且将细胞直接重悬在培养基中。
在另一个实施方式中，T细胞通过裂解红细胞和耗减单核细胞，例如，通过经过PERCOLLTM梯度的离心，从外周血分离。可选地，T细胞可以从脐带分离。无论如何，T细胞的特定亚群可以进一步通过阳性或阴性选择技术分离。
这样分离的脐带血单核细胞中可以耗减表达某些抗原——其包括但不限于CD34、CD8、CD14、CD19和CD56——的细胞。这些细胞的耗减可以使用分离的抗体、包括抗体的生物学样品比如腹水、结合至物理载体的抗体和细胞结合抗体完成。
通过阴性选择富集T细胞群可以使用针对表面标志物——其对阴性选择的细胞独特——的抗体的组合完成。优选的方法是细胞分选和/或选择，其经由阴性磁性免疫粘附或使用针对在阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物的流式细胞术。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。
对于通过阳性或阴性选择分离期望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，颗粒比如珠)的浓度。在某些实施方式中，可以期望显著地减小珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在进一步的实施方式中，使用多于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50×106个细胞/ml的细胞浓度。在又另一个实施方式中，使用75、80、85、90、95或100×106个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可使用125或150×106个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩展。
在清洗步骤后，T细胞也可以被冷冻，其不需要单核细胞移除步骤。尽管不希望被理论所束缚，但通过移除细胞群中的粒细胞和一定程度的单核细胞，冷冻和随后的解冻步骤提供了更均一的产物。在移除血浆和血小板的清洗步骤后，细胞可以被悬浮在冷冻溶液中。虽然很多冷冻溶液和参数是本领域已知的，并且将在此背景下是有用的，但是在非限制性实例中，一个方法包括使用包含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或其它合适的细胞冷冻培养基。细胞然后以每分钟1℃的速率冷冻至-80℃，并且储存在液氮储罐的蒸汽相中。可以使用受控冷冻的其它方法以及在-20℃下或液氮中即刻不受控的冷冻。
在一个实施方式中，T细胞群包含在细胞比如外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系内。在另一个实施方式中，外周血单核细胞包括T细胞群。在又另一个实施方式中，纯化的T细胞包括T细胞群。
在另一个实施方式中，T细胞分离自细胞比如外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系。在另一个实施方式中，本文描述的方法进一步包括从外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群或T细胞系分离T细胞群。
T细胞的扩展
在一个实施方式中，扩展T细胞进一步包括培养电穿孔的T细胞。在另一个实施方式中，待电穿孔和扩展的T细胞的来源是外周血单核细胞。
通常，T细胞通过与表面接触被增殖，所述表面具有附加至其的刺激CD3/TCR复合体相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。本发明包括扩展电穿孔的T细胞群的新方法，其包括培养电穿孔的群，其中该群内的电穿孔的T细胞扩展至少10倍。嵌合膜蛋白的表达允许与群中的其它细胞相互作用以刺激和激活电穿孔的T细胞的扩展。在一个实施方式中，细胞群中的至少一种细胞表达CD3。不固执于任何具体理论，表达CD3的细胞可以与嵌合膜蛋白——其在电穿孔的细胞的表面上表达——接触和结合。表达嵌合膜蛋白的至少一种细胞可以与表达CD3的另一种细胞相互作用。此相互作用可以刺激电穿孔的T细胞的扩展。
可选地，细胞可以使用在美国专利号5,199,942(通过引用并入本文)中描述的方法离体扩展。扩展，比如在美国专利号5,199,942中描述的，可以是本文描述的其它扩展方法的替代方案或除本文描述的其它扩展方法之外的方法。简言之，对于快速扩展方案(REP)，离体培养和扩展T细胞包括添加细胞生长因子——比如在美国专利号5,199,942中描述的那些，或其它因子比如flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3和c-kit配体——例如如在Dudley等，J.Immunol.,26(4):332-342,2003中描述的那些。在一个实施方式中，扩展T细胞包括使用选自flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3和c-kit配体的因子培养T细胞。
如本文公开的数据所展现的，通过本文公开的方法扩展电穿孔的T细胞可以增加大约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、或更大，和其之间的任何和所有全部或部分整数。在一个实施方式中，T细胞扩展大约20倍至大约50倍的范围。
在培养之后，在将细胞传代至另一个培养设备前，T细胞可以在培养设备中的细胞培养基中培育一段时间或直到细胞达到用于最佳传代的汇合或高细胞密度。培养设备可以具有一般用于体外培养细胞的任何培养设备。一段时间可以是适于细胞体外培养的任何时间。T细胞培养基可以在T细胞培养期间的任何时间被更换。优选地，T细胞培养基大约每2至3天更换一次。然后从培养设备收获T细胞，于是T细胞可以被立即使用或冷藏储存以备后用。在一个实施方式中，本发明包括冷藏扩展的T细胞。冷藏的、扩展的T细胞然后在用RNA电穿孔之前被解冻。在另一个实施方式中，冷藏的T细胞在将核酸引入T细胞之前被解冻。
在一方面，扩展T细胞的方法可以进一步包括分离T细胞和随后的电穿孔，接着培养。在另一个实施方式中，本发明进一步包括冷藏扩展的T细胞。在又另一个实施方式中，冷藏的T细胞被解冻，以便电穿孔有编码双特异性抗体或BiTE分子的RNA。在又另一个实施方式中，冷藏的T细胞被解冻，以便引入亲和分子嵌合受体或双特异性亲和分子核酸。在又另一个实施方式中，冷藏的T细胞被解冻，以便电穿孔有编码TCR的RNA。
如本文描述的培养步骤(与如本文描述的试剂接触)可以非常短，例如少于24小时比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时。如本文进一步描述的培养步骤(与如本文描述的试剂接触)可以较长，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。
多种术语用于描述培养中的细胞。细胞培养物通常指的是取自活的生物体并且在受控条件下生长的细胞。原代细胞培养物是直接取自生物体的细胞、组织或器官并且是在第一次传代培养前的培养物。当它们在促进细胞生长和/或分裂的条件下被放置在生长培养基中时，细胞在培养中被扩展，产生更大的细胞群。当细胞在培养中被扩展时，通常通过细胞数目加倍需要的时间量——另外称为倍增时间——测量细胞增殖速率。
每一轮传代培养被称为传代。当细胞被传代培养时，它们被称为已经被传代。特异性细胞群或细胞系有时称为或表征为其已经被传代的次数。例如，已经被传代十次的培养的细胞群可以被称为P10培养物。原代培养物，即，从组织分离细胞之后的第一次培养物被指定为P0。在第一次传代培养之后，细胞被描述为继代培养物(P1或第1代)。在第二次传代培养后，细胞成为三级培养物(tertiary culture)(P2或第2代)，以此类推。本领域技术人员将理解在传代的时期期间可以存在许多群倍增；因此培养物的群倍增数大于传代数。在传代之间的时期期间的细胞扩展(即，群倍增数)取决于许多因素，包括但不限于接种密度、基质、培养基、和传代之间的时间。
在一个实施方式中，细胞可以被培养数小时(大约3小时)至大约14天或其之间的任何小时的整数值。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15，(Lonza))，其可以包含增殖和生存必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-β、和TNF-α、或技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂比如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、和X-Vivo 20、Optimizer，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或限定的激素组、和/或足够T细胞生长和扩展的量的细胞因子(一种或多种)。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅被包括在实验培养物中，而不在被注入对象的细胞培养物中。靶细胞被维持在支持生长必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
用于培养T细胞的培养基可以包括可以共刺激T细胞的试剂。例如，可以刺激CD3的试剂是CD3的抗体，并且可以刺激CD28的试剂是CD28的抗体。这是因为，如由本文公开的数据所展现的，通过本文公开的方法分离的细胞可以扩展大约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更大。在一个实施方式中，通过培养电穿孔的群，T细胞扩展大约20倍至大约50倍或更多的范围。
在一个实施方式中，方法包括将编码T细胞受体(TCR)——其包括对靶细胞上的表面抗原的亲和力——的核酸引入扩展的T细胞，和将编码共刺激分子的RNA电穿孔入T细胞，其中电穿孔的T细胞能够表达TCR和共刺激分子。
在一个实施方式中，方法进一步包括使用选自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1和PD1L的至少一种共刺激分子刺激扩展的T细胞。刺激可以包括用编码共刺激分子的RNA共电穿孔。在这样的实施方式中，扩展的T细胞进一步用编码CD3的RNA电穿孔或共电穿孔。CD3包括至少两种不同的CD3链，比如CD3ζ和ε链。
在另一个实施方式中，扩展T细胞的方法可以进一步包括分离扩展的T细胞用于进一步的应用。在又另一个实施方式中，扩展的方法可以进一步包括随后电穿孔扩展的T细胞，接着培养。随后的电穿孔可以包括将编码试剂——比如双特异性抗体或BiTE分子——的RNA电穿孔入扩展的T细胞群，其中试剂进一步刺激T细胞。在另一个实施方式中，随后的电穿孔可以包括将编码试剂的核酸引入扩展的T细胞群，比如用编码TCR的核酸转导扩展的T细胞、转染扩展的T细胞或电穿孔扩展的T细胞，其中试剂进一步刺激T细胞。
试剂可以刺激T细胞，比如通过刺激进一步的扩展、效应物功能、或另一种T细胞功能。在一个实施方式中，试剂核酸与嵌合膜蛋白RNA被共电穿孔。在另一个实施方式中，试剂核酸，比如双特异性抗体或BiTE分子RNA或TCR RNA在培养电穿孔的群后被电穿孔。
在进一步的实施方式中，试剂RNA，比如双特异性抗体或BiTE分子RNA，被电穿孔入被冷藏的扩展的T细胞。在另一个实施方式中，试剂核酸，比如TCR RNA，在培养电穿孔的群后被电穿孔。在进一步的实施方式中，试剂核酸，比如TCR RNA，被电穿孔入被冷藏的扩展的T细胞。
在又另一个实施方式中，修饰的T细胞在电穿孔有编码双特异性抗体或BiTE分子的RNA后被冷藏。
在又另一个实施方式中，修饰的T细胞在引入编码TCR的核酸后被冷藏。
在又另一个实施方式中，修饰的T细胞在引入编码嵌合配体工程化活化受体(CLEAR)的核酸后被冷藏。
在又另一个实施方式中，修饰的T细胞在引入编码亲和分子嵌合受体的核酸后被冷藏。
在又另一个实施方式中，修饰的细胞在引入编码双特异性亲和分子的核酸后被冷藏。
疗法
本文描述的修饰的T细胞可以包括在用于治疗的组合物中。组合物可以包括药物组合物并且进一步包括药学上可接受的载体。可以施用包括修饰的T细胞的治疗有效量的药物组合物。
在一方面，本发明包括用于刺激针对对象中的靶细胞或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用有效量的修饰的T细胞。在另一方面，本发明包括用于过继细胞转移疗法的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象以预防或治疗不利于对象的免疫反应。在又另一方面，本发明包括治疗与对象中增强的免疫性相关联的疾病或病症的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象。
在上面的方面的一个实施方式中，修饰的T细胞已经被扩展和电穿孔有编码修饰的T细胞受体(TCR)——其包括对靶细胞上的表面抗原的亲和力——的RNA。在另一个实施方式中，修饰的T细胞已经被扩展和电穿孔有编码修饰的T细胞受体(TCR)的RNA和编码双特异性抗体的RNA，所述双特异性抗体比如双特异性T细胞衔接器(BiTE)分子，其包括对靶细胞上的抗原和活化T细胞上的抗原——选自CD3、CD4、CD8和TCR——的双特异性。在另一个实施方式中，修饰的T细胞包括编码亲和分子嵌合受体——其包括具有对靶细胞上的抗原的亲和力的小分子胞外结构域——的核酸。在另一个实施方式中，修饰的细胞包括编码双特异性亲和分子——其包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域——的核酸，其中至少一个亲和结构域包括小分子抗原结合结构域。在另一个实施方式中，修饰的T细胞已经被扩展和引入有编码嵌合配体工程化活化受体(CLEAR)的核酸和编码双特异性抗体——其对靶细胞上的抗原和T细胞上的CLEAR具有双特异性——的核酸。在另一个实施方式中，修饰的T细胞已经被扩展和电穿孔有编码双特异性T细胞衔接器(BiTE)分子的RNA，所述双特异性T细胞衔接器(BiTE)分子包括对靶细胞上的抗原和活化T细胞上的抗原——选自CD3、CD4、CD8和TCR——的双特异性。
可以施用修饰的T细胞以诱导靶细胞或组织的裂解，比如其中诱导的裂解是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
如本文描述生成的修饰的T细胞具备T细胞功能。进一步，修饰的T细胞可以被施用至哺乳动物，优选地人，以阻抑免疫反应，比如自身免疫性疾病比如糖尿病、牛皮癣、类风湿性关节炎、多发性硬化、GVHD、增强性同种异体移植耐受诱导(enhancing allografttolerance induction)、移植排斥等共有的那些免疫反应。此外，本发明的细胞可以用于任何病症的治疗，其中期望减弱的或以其他方式抑制的免疫应答，尤其是细胞-介导的免疫应答，以治疗或减轻疾病。在一方面，本发明包括治疗对象中的病症，比如自身免疫性疾病，其包括给对象施用治疗有效量的包括修饰的T细胞群的药物组合物。
自身免疫性疾病的实例包括但不限于获得性免疫缺陷综合征(AIDS，其是具有自身免疫组分的病毒性疾病)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、乳糜泻-疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、疤痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、CREST综合征、克罗恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、青少年慢性关节炎(斯提耳氏病)、青少年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动炎症、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性全身性硬化症(PSS)，还称为全身性硬化症(SS))、斯耶格伦氏综合征、僵体综合征、系统性红斑狼疮、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、眼葡萄膜炎、白斑病和韦格纳氏肉芽肿病。
如本文描述生成的修饰的T细胞还可以被扩展并且用于治疗炎性障碍。炎性障碍的实例包括但不限于慢性和急性炎性障碍。炎性障碍的实例包括阿尔茨海默病、哮喘、特异性变态反应、变态反应、动脉粥样硬化、支气管哮喘、湿疹、肾小球性肾炎、移植物抗宿主疾病、溶血性贫血、骨关节炎、败血症、中风、组织和器官移植、血管炎、糖尿病性视网膜病和呼吸机所致肺损伤(ventilator induced lung injury)。
在另一个实施方式中，本文描述的T细胞可以用于制造用于治疗需要其的对象中的免疫应答的药物。在另一个实施方式中，本发明包括本文描述的修饰的细胞用于治疗需要其的对象中的免疫应答的方法中。
本发明的细胞可以被施用至动物，优选地哺乳动物，甚至更优选地人，以治疗癌症。此外，本发明的细胞可以用于治疗与癌症相关的任何病症，尤其是针对肿瘤细胞(一种或多种)的细胞-介导的免疫应答，其中治疗或减轻疾病是期望的。癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、甲状腺癌等。
本发明的细胞可以以剂量和途径施用，并且有时在适当的临床前和临床实验和试验中确定。细胞组合物可以在这些范围内的剂量下被施用多次。本发明的细胞的施用可以与如本领域技术人员确定的可用于治疗期望的疾病或病症的其它方法组合。
待施用的本发明的细胞可以对于经历治疗的对象是自体的、同种异体的或异种的。
本发明的细胞的施用可以以本领域技术人员已知的任何常规方式实施。本发明的细胞可以通过气溶胶吸入、注射、吞咽、输注、植入或移植施用至对象。本文描述的组合物可以被经动脉地、皮下地、皮内地、瘤内地、结内地、髓内地、肌肉内地、通过静脉内(i.v.)注射、或腹膜内地施用至患者。在其它情况下，本发明的细胞被直接注入对象中的炎症部位、对象中的局部疾病部位、淋巴结、器官、肿瘤等。
还可以使用任意数目的基体施用本文描述的细胞。本发明利用这样的基体——在充当人工淋巴器官的新背景内——支持、维持或调节免疫系统，其通常通过T细胞的调节。因此，本发明可以利用那些基体组合物和制剂，其已经展现了在组织工程化中的实用性。因此，可以用于本发明的组合物、装置和方法的基体的类型事实上是无限制的并且可以包括生物学和合成基体二者。在一个具体的实例中，利用由美国专利号5,980,889；5,913,998；5,902,745；5,843,069；5,787,900；或5,626,561陈述的组合物和装置，如同这些专利通过引用以其全部并入本文一样。基体包括一般与如下相关联的特征：当施用至哺乳动物宿主时是相容性的。基体可以由天然和/或合成材料形成。基体可以是不可生物降解的——在期望在动物的体内留下永久性结构或可移动结构比如植入物的情况下；或可生物降解的。基体可以采用海绵、植入物、管、telfa垫、纤维、中空纤维、冻干组分、凝胶、粉末、多孔组合物、或纳米颗粒的形式。此外，基体可以被设计以允许持续释放接种的细胞或产生的细胞因子或其它活性剂。在某些实施方式中，本发明的基体是柔性的和弹性的，并且可以被描述为半固体支架，其对物质比如无机盐、水性流体和包括氧的溶解的气体试剂(gaseousagent)是可透过的。
基体在本文被用作生物相容性物质的实例。然而，本发明不限于基体，并且因而，无论术语基体(一种或多种)在什么地方出现，这些术语应当被解读为包括如下装置和其它物质：其允许细胞滞留或细胞穿越；是生物相容性的；和能够允许大分子穿越直接通过物质，以便物质自身是半透膜或与具体的半透性物质协同使用。
药物组合物
本发明的药物组合物可以包括如本文描述的修饰的T细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包括缓冲液比如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物比如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸比如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂比如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选地配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由如下因素确定，比如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度，但是可以由临床试验确定适当的剂量。
通常可以规定包括本文描述的修饰的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选地105至106个细胞/kg体重的剂量——包括在那些范围内的所有整数值——施用。T细胞组合物也可以以这些剂量施用多次。细胞可以通过使用免疫疗法中公知的注入技术(参见，例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676,1988)施用。具体患者的最佳剂量和治疗方案可以通过监测患者的疾病迹象和相应地调节治疗而由医学领域技术人员容易地确定。
在某些实施方式中，可以期望给对象施用活化的T细胞，并且随后重新抽取(redraw)血液(或进行单采血液成分术)，根据本发明活化来自其的T细胞，并且将这些活化和扩展的T细胞再注入患者。此过程可以每几周实施多次。在某些实施方式中，来自10ml至400ml的血液抽取物的T细胞可以被活化。在某些实施方式中，来自20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml或100ml的血液抽取物的T细胞被活化。不被理论所束缚，使用此多重血液抽取/多重再输注方案，可以选择出某些T细胞群。
在本发明的某些实施方式中，使用本文描述的方法或本领域已知的将T细胞扩展至治疗性水平的其它方法扩展和修饰的细胞，协同任意数目的相关治疗形式(例如，之前、同时或之后)被施用至患者，所述治疗形式包括但不限于使用如下药剂的治疗：比如抗病毒疗法、用于MS患者的西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)或那他珠单抗(natalizumab)治疗，或用于牛皮癣患者的依法利珠单抗(efalizumab)治疗，或用于PML患者的其它治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可以与如下组合使用：化疗，辐射，免疫抑制剂，比如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体，或其它免疫烧蚀剂(immunoablative agent)比如CAM PATH、抗CD3抗体或其它抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇类、FR901228、细胞因子和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶——神经钙蛋白(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。(Liu等，Cell 66:807-815,1991；Henderson等，Immun.73:316-321,1991；Bierer等，Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物协同(例如，之前、同时或之后)骨髓移植、T细胞烧蚀疗法——使用化疗剂比如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺，或抗体比如OKT3或CAMPATH——被施用至患者。在另一个实施方式中，本发明的细胞组合物在B细胞烧蚀疗法——比如与CD20反应的药剂，例如，利妥昔单抗——之后被施用。例如，在一个实施方式中，对象可以经历高剂量化疗的标准治疗，接着进行外周血干细胞移植。在某些实施方式中，在移植之后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术之前或之后施用。
施用至患者的上面治疗的剂量将随着正在治疗的病症的精确性质和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可以根据本领域接受的实践进行。例如，CAMPATH的剂量对于成年患者将一般在1至大约100mg的范围中，通常每天施用，持续1和30天之间的时期。虽然在一些情况下可以使用多至40mg每天的较大的剂量(在美国专利号6,120,766中描述)，但是优选的日剂量是1至10mg每天。
应当理解将在本发明中有用的方法和组合物不限于在实施例中陈述的具体的制剂。下列实施例被提出以便于为本领域普通技术人员提供如何制造和使用细胞，扩展和培养方法，本发明的治疗方法的完整的公开内容和描述，并且不意欲限制本发明人视为其发明的范围。
除非另外指示，本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其充分地在技术人员的见识内。这样的技术在如下文献中充分地说明，比如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,第四版(Sambrook,2012)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait,1984)；“Culture of Animal Cell”(Freshney,2010)；“Methods in Enzymology”“Handbook of Experimental Immunology”(Weir,1997)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller和Calos,1987)；“Short Protocols in Molecular Biology”(Ausubel,2002)；“Polymerase ChainReaction:Principles,Applications and Troubleshooting”,(Babar,2011)；“CurrentProtocols in Immunology”(Coligan,2002)。这些技术适用于产生本发明的多核苷酸和多肽，并且因此，可以在进行和实践本发明中考虑。将在下列部分中讨论具体实施方式的特别有用的技术。
实验实施例
通过参考下列实验实施例进一步详细地描述本发明。除非另外规定，这些实施例仅出于说明目的提供，并且不意欲是限制性的。因而，本发明决不应当解释为限制于下列实施例，而是应当解释为包括由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有的变化。
在没有进一步描述的情况下，相信使用在先的描述和下列说明性实施例，本领域普通技术人员可以制造和利用本发明的化合物，并且实践要求保护的方法。下列工作实施例因此具体地指出本发明的优选的实施方式，并且不解释为以任何方式限制本公开内容的其余部分。
现在描述在实施例1的实验中采用的材料和方法。
原代人淋巴细胞。如描述的，使用包被有CD3和CD28刺激抗体的微珠(LifeTechnologies,Grand Island,NY,Catalog)刺激原代淋巴细胞(Human gene therapy2011,22(12):1575-1586)。T细胞在第10天以1×108细胞/小瓶被冷藏在90％胎牛血清和10％二甲基亚砜(DMSO)的溶液中。
用于mRNA电穿孔和慢病毒转导的TCR构建体的生成。基于由相关出版物(TheJournal of experimental medicine 2005,201(8):1243-1255；J Immunol 2008,180(9):6116-6131)提供的测序信息，通过PCR合成和/或扩增具有不同突变的1G4NY-ESO-1 TCR，并且将其亚克隆入基于pGEM.64A RNA的载体或pTRPE慢病毒载体。
mRNA体外转录和T细胞电穿孔。T7mscript系统试剂盒(CellScript)被用于生成体外转录的(IVT)RNA。如先前描述的，CD3/CD28珠刺激的T细胞使用BTX EM830(HarvardApparatus BTX)电穿孔有IVT RNA(Cancer research 2010,70(22):9053-9061)。简言之，T细胞被清洗三次并且以1-3×108个细胞/ml的终浓度重悬在OPTI-MEM(Invitrogen)中。随后，0.1ml的细胞与10μg IVT RNA(或如指示的)混合并且在2mm小池中进行电穿孔。
ELISA测定。靶细胞，表达CD19的不同的肿瘤细胞系，被清洗和以1×106个细胞/ml悬浮在R10培养基(补充有10％胎牛血清的RPMI 1640；Invitrogen)中。100μl的每种靶细胞类型一式两份添加至96孔圆底板(Corning)。清洗效应T细胞，并且以1×106个细胞/ml重悬在R10培养基中，并且然后100μl的T细胞与指示的孔中的靶细胞组合。此外，包含单独的T细胞的孔被准备作为对照。平板在37℃下培育18至20小时。在培育后，上清液被收获并且经受ELISA测定(eBioscience,88-7316-77；88-7025-77)。
CD107a染色。细胞以1:1的效应细胞：T细胞比值(1×105效应物比1×105靶标)平板接种在96孔板中的160μl的完全RPMI培养基中。添加20μl的藻红蛋白-标记的抗CD107a抗体(BD Biosciences,555801)，并且平板在37℃下培育1小时，然后添加Golgi Stop(3ml RPMI培养基中2μl Golgi Stop，20μl/孔；BD Biosciences,51-2092KZ)并且培育平板持续另外的2.5小时。然后添加5μl FITC-抗CD8和5μl APC-抗CD3并且在37℃下培育30min。在培育后，使用FACS缓冲液清洗样品并且通过流式细胞术进行分析。
基于荧光素酶的CTL测定。生成Naml6-CBG肿瘤细胞并且在基于荧光素酶的细胞毒性T淋巴细胞测定的修改版本中采用。简言之，叩头虫绿荧光素酶(CBG)被克隆入pELNS载体，包装入慢病毒，转导入Naml6肿瘤细胞并且进行CBG表达分选。得到的Naml6-CBG细胞被清洗并且以1×105个细胞/ml重悬在R10培养基中，并且100μl的CBG-标记的细胞与不同比值的T细胞(例如30:1、15:1等)在37℃下培育过夜。将100μl的混合物转移至96孔白色酶标板(luminometerplate)。100μl的底物被添加至细胞并且立即测定发光。
小鼠异种移植研究。如先前描述的，利用某些修改进行研究(Human gene therapy2011,22(12):1575-1586；Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 2009,106(9):3360-3365)。简言之，6-10周龄NOD/SCIDγ(NSG)小鼠在第0天在右胁上被皮下注射1×106个PC3-CBG肿瘤细胞，并且相同的小鼠在第5天在左胁上被给予SK-OV3-CBG肿瘤细胞(5×106个细胞/小鼠，皮下地)。在PC3-CBG肿瘤接种之后第23天，小鼠经由尾静脉使用T细胞进行处理，使得两个肿瘤的体积都是大约200mm3。以1×107个细胞/小鼠(10M)，或3×106个细胞/小鼠(3M)给予慢病毒转导的T细胞。
现在描述在实施例2的实验中采用的材料和方法。
CAR的体外转录(IVT)mRNA和慢病毒载体的构建。使用公共可获得的序列信息通过PCR合成和/或扩增和装配所有基因。基于公共可获得的序列信息，通过替换pGEM-GFP.64A的GFP，将PCR产物亚克隆入基于pGEM.64A的载体以产生基于pGEM.64A的IVT载体。
RNA体外转录(IVT)。使用试剂盒比如mMESSAGET7Ultra(Ambion,Inc)进行体外转录以合成mRNA，从而使用抗-反向帽类似物(Anti-Reverse Cap Analog)(ARCA，7-甲基(3’-O甲基)GpppG)m7G(5’)ppp(5’)G)生成IVT RNA。使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)纯化IVT RNA产物并且纯化的RNA以1-2mg/ml在无RNase的水中洗脱。
T细胞的RNA电穿孔。使用BTX EM830(Harvard Apparatus BTX,Holliston,MA,USA)使纯化的静息T细胞或CD3/CD28珠-刺激的T细胞电穿孔。经受电穿孔的T细胞使用OPTI-MEM(Invitrogen)清洗三次并且以1-3×108个/ml的终浓度重悬在OPTI-MEM中。随后，如描述的，0.1ml的细胞与10μg IVT RNA(或如指示的)混合并且在2mm小池中进行电穿孔(Zhao等，2010,Cancer Res 70:9053-9061)。
对电穿孔的T细胞的CLEAR检测。细胞被清洗并且悬浮在流式活化细胞分选(flowactivated cell sorting)(FACs)缓冲液(PBS加0.1％叠氮化钠和0.4％BSA)中。抗PD1(APC)和抗CD27(PE)被分别用于基于PD1或CD27的CLEAR检测。生物素-标记的多克隆山羊抗小鼠F(ab)2抗体(对于鼠scFv)或抗人抗F(ab)2(对于人scFv)(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)被添加至细胞并且细胞在4℃下培育25分钟并且清洗两次。细胞然后使用藻红蛋白-标记的链亲和素(BD Pharmingen,San Diego,CA)进行染色。
ELISA和Luminex测定。靶细胞被清洗并且以106个细胞/mL悬浮在R10中。每种靶细胞类型的十万个细胞被添加至96孔圆底板(Corning)的2个孔中的每个。效应T细胞培养物被清洗并且以106个细胞/mL悬浮在R10中。十万个效应T细胞与96孔板的指示的孔中的靶细胞组合。此外，准备包含单独的T细胞的孔。平板在37℃下培育18至20小时。在培育后，使用标准方法(Pierce,Rockford,IL)，上清液被收获并且经受ELISA测定。
CD107a染色。细胞以1:1的E:T(1×105效应物：1×105靶标)平板接种在96孔板中的160μl的完全RPMI培养基中。添加20μl的藻红蛋白-标记的抗CD107a抗体(BD Pharmingen,San Diego,CA)，并且平板在37℃下培育1小时，然后添加Golgi Stop并且培育另外的2.5小时。在2.5小时后，添加10μl FITC-抗CD8和APC-抗CD3并且在37℃下培育30min。在培育后，使用FACS缓冲液清洗样品一次。使用BD FacsCalibur(BD Biosciences)进行流式细胞术采集，并且使用FlowJo(Treestar Inc,Ashland,OR)进行分析。
现在描述在实施例3的实验中采用的材料和方法。
原代人淋巴细胞。如先前描述的，使用包被有CD3和CD28刺激抗体的微珠(LifeTechnologies,Grand Island,NY,Catalog)刺激原代淋巴细胞(Barrett,等，Human genetherapy 2011,22(12):1575-1586)。T细胞在第10天以1×108个细胞/小瓶被冷藏在90％胎牛血清和10％二甲基亚砜(DMSO)的溶液中。
用于mRNA电穿孔的ART构建体的生成。EGFR(Friedman等，Journal of molecularbiology 2008,376(5):1388-1402；和Friedman等，Protein engineering,design&selection:PEDS 2007,20(4):189-199)或ErbB2(Fedwisch等，Journal of molecularbiology 2010,398(2):232-247)的下列亲和抗体模拟物重定向的T细胞(ART)序列被用于生成ART。
对于EGFR：
SEQ ID NO:1，ZEGFR955：
VDNKFNKELEKAYNEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
SEQ ID NO:2，ZEGFR942：
VDNKFNKEMLIAMEEIGSLPNLNWGQEQAFILSLWDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
SEQ ID NO:3，ZEGFR1853：
VDNKFNKEFWWASDEIRNLPNLNGWQMTAFIASLADDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
SEQ ID NO:4，ZEGFR1907：
VDNKFNKEMWAAWEEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
对于ErbB2：
SEQ ID NO:5，ZHER2-342
VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
SEQ ID NO:6，ZHER2-342-15
VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRSLYKDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
SEQ ID NO:7，ZHER2-342-14
VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYADPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
SEQ ID NO:8，ZHER2-342-4
VDNKFEKEMRNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
表1：亲和抗体模拟物的亲和力。
ART Kd
ZEGFR955 185nM
ZEGFR942 130nM
ZEGFR1853 9.2nM
ZEGFR1907 5.4nM
ZHER2.342 22pM
ZHER2.342-15 180pM
ZHER2.342-14 76pM
ZHER2.342-4 44pM
如图28中显示的，构建了三种不同种类的ART。
第一种是基于CAR的ART(图28，上组)：其由来自人CD8α的信号肽(SP)、亲和抗体模拟物、6×His标签(His-标签)、人CD8α铰链和跨膜(CD8铰链&TM)、4-1BB胞质结构域(4-1BBCyto)和CD3ζ胞质结构域(ζCyto)组成。第二种是基于TCR的ART(图28下组)：其潜在地可以同时靶向多种肿瘤抗原，其由来自人CD8α的信号肽(SP)、ErbB2亲和抗体模拟物(ZHER2.342、ZHER2.342-15、ZHER2.342-14或ZHER2.342-4)和全长1G4NY-ESO-1 TCRα或β链组成。第三种是基于双特异性T细胞衔接器(BiTE)的ART：其由来自人CD8α的信号肽(SP)、ErbB2亲和抗体模拟物(ZHER2.342、ZHER2.342-15、ZHER2.342-14或ZHER2.342-4)、GS连接体(或EGFR亲和抗体模拟物和GS连接体)和CD3亲和抗体模拟物(或scFv)组成。
所有(下面)亲和抗体模拟物DNA序列由UpGene——一种DNA密码子优化算法的应用——生成，其被用于基于上面的蛋白质序列信息生成PCR引物序列，从而在基于pGEM.64A的RNA体外转录(IVT)载体中合成所有ART构建体(经由重叠PCR)(Zhao,等，Cancerresearch 2010,70(22):9053-9061)。
SEQ ID NO:9，ZEGFR955：
atg gcg ctg ccc gtg acg gcc ctg ctg ctc ccc ctg gca ctg ctt ctg cacgcc gcc cga ccc tct cag gtc gacaac aag ttt aac aag gaa ttg gag aag gcg tacaac gaa atc cgg aac ctg ccc aac ctc aac gga tgg cag atgact gct ttc atc gcgtcc ctg gtg gac gac ccc tcc cag tcg gcg aac ctg ctg gcc gag gcc aag aaa ctgaatgac gcc caa gcc cct aag
SEQ ID NO:10，ZEGFR942：
atg gcg ctg ccc gtg acg gcc cta ctc ctg cca ctg gca ctc ctg ctc cacgcc gcg cgg cca tcc cag gtg gacaac aaa ttc aac aag gag atg ctc atc gca atggaa gaa ata ggc tcc ctc ccc aac ctg aac tgg ggg cag gagcag gcg ttc ata ctctcg ctc tgg gat gac cca agc cag tct gcg aac ctc ctt gcc gag gcg aag aag ctcaatgac gct cag gca ccc aag
SEQ ID NO:11，ZEGFR1853：
atg gcg ctg ccc gtg acg gcc CTC TTG ctg CCC CTG GCC CTC CTG ctc cacGCA GCC AGGCCG AGT CAA GTC gac aac AAG ttt aac aag gaa TTC tgg tgg GCC TCCGAC GAG atc CGCaat CTG ccc AAC CTG AAC ggc tgg cag atg ACC gcc ttc atc GCAAGC ctg GCG gac gac CCTtcc cag agt GCC aac CTG ctg gca gag gcc aag aag ctgAAC GAC GCC CAA GCG CCA aag
SEQ ID NO:12，ZEGFR1907：
atg gcg ctg ccc gtg acg gcc ctg ctg ctg ccg ctc gcc tta ctg ctc cacgcg gct agg ccc tcc cag gtg gataac aag ttc aac aag gag atg tgg gcc gcc tgggag gaa atc cgc aac ctc cca aat ctg aac ggc tgg cag atgaca gca ttc att gcctcc ctg gtg gac gat cca tcg cag tcg gcc aac ctc cta gcc gag gcc aag aag ctgaacgac gcc cag gcg ccc aag CatcatcaccatcatcatAccacgacg
SEQ ID NO:13，ZHER2-342
atg gcg ctg ccc gtg acg gcc ctt ctg ctc ccg ctg gcc ctg ctg ctg catgcc gcc cgc ccc tca caa gtc gacaac aaa ttc aat aag gag atg aga aac gct tactgg gag atc gcc ctg ctt ccc aac ctg aac aac cag cag aaacga gca ttc att cgcagc ctc tac gac gat ccg tcg cag tca gct aat ctc ctc gcc gag gcg aag aag ctgaacgac gcc cag gcc ccc aag
SEQ ID NO:14，ZHER2-342-15
atg gcg ctg ccc gtg acg gcc ctc ctg ctg ccc ctg gcc ctg ctg ctc cacgct gca aga ccc agc cag gtg gacaac aag ttt aac aag gag atg cgc aac gcc tactgg gag atc gcc ctc ctg ccc aac tta acc aac cag caa aaaaga gct ttc att cgttcc ctg tac aaa gac cct tcg cag tcc gcc aat ctg ctt gcc gag gct aag aag ctgaac gacgcg cag gcc ccc aag
SEQ ID NO:15，ZHER2-342-14
atg gcg ctg ccc gtg acg gcc ctc ctg ctg ccc ctc gcg ctc ctg ctc cacgcc gcc cgg ccc tcc caa gtc gacaac aag ttc aat aag gag atg cgg aac gca tactgg gag atc gcc ctg ctg ccg aac ctg aac aac cag cag aagcgt gcc ttt atc aggtct ctc tac gca gat cca agc cag tct gcg aac ctg ctg gcc gag gcg aag aaa ctcaacgac gcg cag gca ccg aag
SEQ ID NO:16，ZHER2-342-4
atg gcg ctg ccc gtg acg gcc ctg ctc ctg ccg ctc gcc ctc tta ctt cacgcc gcg cga ccg tcc cag gtt gacaac aag ttc gag aaa gag atg agg aac gca tactgg gag atc gcc tta ctg cct aat ctg act aac cag cag aagcgc gcc ttc atc cgctcc ctg tac gac gat ccg tcg cag tcc gct aac ttg ctg gcc gag gcc aag aag ctcaacgat gcc caa gcc ccc aag
SEQ ID NO:17，6×His标签：
Catcatcaccatcatcat
SEQ ID NO:18，CD8铰链&TM-BBZ：
AccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgacgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcTAA
SEQ ID NO:19，连接体-CD3 scFv
ggaggtggtggatccgatatcaaactgcagcagtcaggggctgaactggcaagacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaagacttctggctacacctttactaggtacacgatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactacagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagatattatgatgatcattactgccttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcagtcgaaggtggaagtggaggttctggtggaagtggaggttcaggtggagtcgacgacgccgccattcagctgacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagagccagttcaagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaagtggcttctggagtcccttatcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcatactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccaacagtggagtagtaacccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacatcatcaccatcatcattaataa
mRNA体外转录和T细胞电穿孔。mMESSAGET7ULTRA转录试剂盒(Invitrogen)被用于生成IVT RNA。如先前描述的，CD3/CD28珠刺激的T细胞使用BTX EM830(Harvard Apparatus BTX)电穿孔有IVT RNA(Zhao,等，Cancer research 2010,70(22):9053-9061)。简言之，T细胞被清洗三次并且以1-3×108个细胞/ml的终浓度重悬在OPTI-MEM(Invitrogen)中。随后，0.1ml的细胞与10μg IVT RNA(或如指示的)混合并且在2mm小池中进行电穿孔。
ELISA测定。靶细胞被清洗并且以1×106个细胞/ml悬浮在R10培养基(补充有10％胎牛血清的RPMI 1640；Invitrogen)中。100μl的每种靶细胞类型一式两份添加至96孔圆底板(Corning)。清洗效应T细胞，并且以1×106个细胞/ml重悬在R10培养基中，并且然后100μl的T细胞与指示的孔中的靶细胞组合。此外，准备包含单独的T细胞的孔。平板在37℃下培育18至20小时。在培育后，上清液被收获并且经受ELISA测定(eBioscience,88-7316-77；88-7025-77)。
CD107a染色。细胞以1:1的E:T(1×105效应物：1×105靶标)平板接种在96孔板中的160μl的完全RPMI培养基中。添加20μl的藻红蛋白-标记的抗CD107a抗体(BD Biosciences,555801)，并且平板在37℃下培育1小时，然后添加Golgi Stop(3ml RPMI培养基中2μlGolgi Stop，20μl/孔；BD Biosciences,51-2092KZ)并且培育另外的2.5小时。然后添加5μlFITC-抗CD8和5μl APC-抗CD3并且在37℃下培育30min。在培育后，使用FACS缓冲液清洗样品并且通过流式细胞术进行分析。
基于荧光素酶的CTL测定。生成SK-OV3-CBG肿瘤细胞并且如下在基于荧光素酶的CTL测定的修改版本中采用：叩头虫绿荧光素酶(CBG)被克隆入pELNS载体，包装入慢病毒，转导入SK-OV3肿瘤细胞并且进行CBG表达分选。得到的SK-OV3-CBG细胞被清洗并且以1×105个细胞/ml重悬在R10培养基中，并且100μl的CBG-标记的细胞与不同比值的T细胞(例如30:1、15:1等)在37℃下培育8h。100μl的混合物被转移至96孔白色酶标板。100μl的底物被添加并且立即测定发光。
现在描述在实施例4的实验中采用的材料和方法。
CAR的体外转录(IVT)mRNA和慢病毒载体的构建。通过PCR合成和/或扩增和装配所有CAR(CD19、间皮素、cMet、GD2、PSCA、EGFRviii和ErBB2)和编码相同分子的双特异性抗体的RNA(双RNA)。通过替换pGEM-GFP.64A的GFP，将PCR产物亚克隆入基于pGEM.64A的载体(Zhao等，2003,Blood 102:4137-4142)以产生基于pGEM.64A的CAR或双RNA载体。基于从公布的专利号US2013/050275提供的测序信息，通过PCR合成和装配编码博纳吐单抗的DNA和完整的人CD19 CAR(21D4-BBZ)和双RNA(21D4-F11)。
RNA体外转录(IVT)。使用试剂盒比如mMESSAGET7Ultra(Ambion,Inc)进行体外转录以合成mRNA，从而使用抗-反向帽类似物(ARCA，7-甲基(3’-O甲基)GpppG)m7G(5’)ppp(5’)G)生成IVT RNA。使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)纯化IVT RNA产物并且纯化的RNA以1-2mg/ml在无RNase的水中洗脱。
T细胞的RNA电穿孔。使用BTX EM830(Harvard Apparatus BTX,Holliston,MA,USA)使纯化的静息T细胞或CD3/CD28珠-刺激的T细胞电穿孔。经受电穿孔的T细胞使用OPTI-MEM(Invitrogen)清洗三次并且以1-3×108个/ml的终浓度重悬在OPTI-MEM中。随后，如描述的，0.1ml的细胞与10μg IVT RNA(或如指示的)混合并且在2mm小池中进行电穿孔(Zhao等，2010,Cancer Res 70:9053-9061)。
对电穿孔的T细胞的CAR检测。细胞被清洗并且悬浮在流式活化细胞分选(FACs)缓冲液(PBS加0.1％叠氮化钠和0.4％BSA)中。生物素-标记的多克隆山羊抗小鼠F(ab)2抗体(对于鼠scFv)或抗人抗F(ab)2(对于人scFv)(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)被添加至细胞并且细胞在4℃下培育25分钟并且清洗两次。细胞然后使用藻红蛋白-标记的链亲和素(BD Pharmingen,San Diego,CA)进行染色。
ELISA和Luminex测定。靶细胞被清洗并且以106个细胞/mL悬浮在R10中。每种靶细胞类型的十万个细胞被添加至96孔圆底板(Corning)的2个孔中的每个。效应T细胞培养物被清洗并且以106个细胞/mL悬浮在R10中。十万个效应T细胞与96孔板的指示的孔中的靶细胞组合。此外，准备包含单独的T细胞的孔。平板在37℃下培育18至20小时。在培育后，使用标准方法(Pierce,Rockford,IL)，上清液被收获并且经受ELISA测定。
CD107a染色。细胞以1:1的E:T(1×105效应物：1×105靶标)平板接种在96孔板中的160μl的完全RPMI培养基中。添加20μl的藻红蛋白-标记的抗CD107a抗体(BD Pharmingen,San Diego,CA)，并且平板在37℃下培育1小时，然后添加Golgi Stop并且培育另外的2.5小时。在2.5小时后，添加10μl FITC-抗CD8和APC-抗CD3并且在37℃下培育30min。在培育后，使用FACS缓冲液清洗样品一次。使用BD FacsCalibur(BD Biosciences)进行流式细胞术采集，并且使用FlowJo(Treestar Inc,Ashland,OR)进行分析。
基于CFSE的T细胞增殖测定。PBS中10×106个/mL的浓度下的T细胞在室温下被标记3μM下的CFSE持续3.5min。标记被5％FBS(在PBS中)终止并且使用R10清洗两次并且在具有10IU/ml IL-2的R10中培养。在过夜培养后，CFSE标记的T细胞被电穿孔。电穿孔后二至四小时，T细胞使用照射的肿瘤或K562细胞系以1:1下的T：刺激物进行刺激。通过流式细胞术检查CFSE稀释并且在指示的时间对细胞数进行计数。
流式CTL。如先前描述的使用流式细胞术细胞毒性测定的轻微修改版本(Zhao等，2010,Cancer Res 70:9053-9061,Hermans等，2004,J Immunol Methods 285:25-40)。如下生成叩头虫绿荧光素酶(CBG)肿瘤细胞并且在基于荧光素酶的CTL测定中采用：CBG被克隆入pELNS载体，包装入慢病毒，并转导入肿瘤细胞。CBG肿瘤细胞进行CBG表达分选。得到的CBG肿瘤细胞被清洗并且以1×105个细胞/ml重悬在R10培养基中，并且100μl的CBG-标记的细胞与不同比值的T细胞(例如30:1、15:1等)在37℃下培育过夜。100μl的混合物被转移至96孔白色酶标板。100μl的底物被添加至每个孔并且立即测定发光。
小鼠异种移植研究。如先前描述的，利用某些修改进行研究(Barrett等，HumGeneTher22:1575-1586)。简言之，6-10周龄NOD/SCID-？c-/-(NSG)小鼠获得自JacksonLaboratory(Bar Harbor,ME)或在批准的机构动物管理及使用委员会(institutionalanimal care and use committee)(IACUC)协议下室内(in-house)繁育并且维持在无病原体条件下。Nalm-6，一种CD19+人ALL细胞系，转导有CBG(Nalm6-CBG)并且在0.2ml的无菌PBS中以一百万个细胞的剂量经由尾静脉被注射。在注射Nalm-6-CBG后7天，经由尾静脉注射T细胞。
生物发光成像(BLI)。通过BLI监测肿瘤生长。使用Xenogen光谱系统和LivingImage v3.2软件对麻醉的小鼠成像。D-萤光素(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)以15mg/mL的浓度(100μL萤光素溶液/10g小鼠体重)重悬在无菌PBS中，并且以150mg/kg体重的比值经由腹膜内(IP)注射施用至小鼠。M108-Luc的先前的滴定指示至光子发射峰值的时间在大约五分钟，峰值发射持续大约6-10分钟。在萤光素注射后的相同的相对时间点处(6分钟)，在前-后俯卧位置中，每个动物单独地成像(用于光子定量)或以多至5只小鼠的组成像(出于展示目的)。收集数据直到达到线性标度(linear scale)(600至60000个计数)的中列数或达到最大曝光设置(f/分档位(stop)1，大像素合并(binning)和1-2秒)，并且然后转换为光子/秒/cm2/球面度以归一化每个图像的曝光时间、f/分档位、像素合并和动物大小。对于解剖学位置，代表光强度的伪彩色图被叠加在灰度体-表面参考图像之上。出于数据展示目的，不具有包含荧光素酶的细胞的小鼠在最大设置下成像并且获得了3.6×105p/s/cm2/sr的平均值。
现在描述在实施例5的实验中采用的材料和方法。
原代人淋巴细胞。如描述的，使用包被有CD3和CD28刺激抗体的微珠(LifeTechnologies,Grand Island,NY,Catalog)刺激原代淋巴细胞(Human gene therapy2011,22(12):1575-1586)。T细胞在第10天以1×108个细胞/小瓶被冷藏在90％胎牛血清和10％二甲基亚砜(DMSO)的溶液中。
用于mRNA电穿孔和慢病毒转导的构建体的生成。基于由相关出版物(The Journalof experimental medicine 2005,201(8):1243-1255；J Immunol 2008,180(9):6116-6131)提供的测序信息，通过PCR合成和/或扩增具有不同突变的1G4NY-ESO-1 TCR，并且将其亚克隆入基于pGEM.64A RNA的载体或pTRPE慢病毒载体。
ErbB2affibody序列：
SEQ ID NO:5，ZHER2-342(342)
VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
SEQ ID NO:6，ZHER2-342-15(342-15)
VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRSLYKDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
SEQ ID NO:7，ZHER2-342-14(342-14)
VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYADPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
SEQ ID NO:8，ZHER2-342-4(342-4)
VDNKFEKEMRNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
mRNA体外转录和T细胞电穿孔。T7mscript系统试剂盒(CellScript)被用于生成体外转录的(IVT)RNA。如先前描述的，CD3/CD28珠刺激的T细胞使用BTX EM830(HarvardApparatus BTX)电穿孔有IVT RNA(Cancer research 2010,70(22):9053-9061)。简言之，T细胞被清洗三次并且以1-3×108个细胞/ml的终浓度重悬在OPTI-MEM(Invitrogen)中。随后，0.1ml的细胞与10μg IVT RNA(或如指示的)混合并且在2mm小池中进行电穿孔。
ELISA测定。靶细胞，表达CD19的不同的肿瘤细胞系，被清洗并且以1×106个细胞/ml悬浮在R10培养基(补充有10％胎牛血清的RPMI 1640；Invitrogen)中。100μl的每种靶细胞类型一式两份添加至96孔圆底板(Corning)。清洗效应T细胞，并且以1×106个细胞/ml重悬在R10培养基中，并且然后100μl的T细胞与指示的孔中的靶细胞组合。此外，包含单独的T细胞的孔被准备作为对照。平板在37℃下培育18至20小时。在培育后，上清液被收获并且经受ELISA测定(eBioscience,88-7316-77；88-7025-77)。
CD107a染色。细胞以1:1的效应细胞：T细胞比值(1×105效应物比1×105靶标)平板接种在96孔板中的160μl的完全RPMI培养基中。添加20μl的藻红蛋白-标记的抗CD107a抗体(BD Biosciences,555801)，并且平板在37℃下培育1小时，然后添加Golgi Stop(3ml RPMI培养基中2μl Golgi Stop，20μl/孔；BD Biosciences,51-2092KZ)并且培育平板持续另外的2.5小时。然后添加5μl FITC-抗CD8和5μl APC-抗CD3并且在37℃下培育30min。在培育后，使用FACS缓冲液清洗样品并且通过流式细胞术进行分析。
基于荧光素酶的CTL测定。生成Naml6-CBG肿瘤细胞并且在基于荧光素酶的细胞毒性T淋巴细胞测定的修改版本中采用。简言之，叩头虫绿荧光素酶(CBG)被克隆入pELNS载体，包装入慢病毒，转导入Naml6肿瘤细胞并且进行CBG表达分选。得到的Naml6-CBG细胞被清洗并且以1×105个细胞/ml重悬在R10培养基中，并且100μl的CBG-标记的细胞与不同比值的T细胞(例如30:1、15:1等)在37℃下过夜培育。100μl的混合物被转移至96孔白色酶标板。100μl的底物被添加至细胞并且立即测定发光。
小鼠异种移植研究。如先前描述的，利用某些修改进行研究(Human gene therapy2011,22(12):1575-1586；Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 2009,106(9):3360-3365)。简言之，6-10周龄NOD/SCIDγ(NSG)小鼠在第0天在右胁上被皮下注射1×106个PC3-CBG肿瘤细胞，并且相同的小鼠在第5天在左胁上被给予SK-OV3-CBG肿瘤细胞(5×106个细胞/小鼠，皮下地)。在PC3-CBG肿瘤接种之后第23天，小鼠经由尾静脉使用T细胞进行处理，使得两种肿瘤的体积都是大约200mm3。以1×107个细胞/小鼠(10M)或3×106个细胞/小鼠(3M)给予慢病毒转导的T细胞。
现在描述实验的结果。
实施例1：表达TCR和双特异性抗体的T细胞。
通过慢病毒或逆转录病毒载体，使用抗肿瘤抗原TCR重定向的T淋巴细胞处理的癌症患者显示了有希望的结果。在此研究中，RNA被电穿孔入T细胞以测定是否可以研发癌症过继免疫疗法的高效疗法。比较T细胞以评估T淋巴细胞——其在Naml6白血病和A549肺癌小鼠模型中表达外源性TCR和双特异性抗体——的体内效力。
为了改进TCR重定向的T细胞过继免疫疗法，T细胞电穿孔有TCR RNA和双特异性T细胞衔接器(BiTE)。图1显示了共电穿孔有TCR和BiTE的T细胞中的转基因表达。T细胞共电穿孔有CD19.CD3(上组)或4D5.CD3(ErbB2)(中组)BiTE——有或没有CD3ζ和ε。电穿孔后十八小时，对T细胞进行TCR vb13.1和mIgG Fab(或Her2-Fc)的染色。下组显示了电穿孔后3天的TCR(vb13.1)表达。
在共电穿孔的T细胞中功能得以提高。图2和3图解了在使用肿瘤刺激后CD107a在T细胞中上调。T细胞共电穿孔有TCR RNA和BiTE RNA，然后使用具有CD19和NY-ESO-1(ESO)的单或双阳性的肿瘤细胞系进行刺激。IFN-γ和IL-2产生都在共电穿孔的T细胞中增加(图4和5)。而且，CD107a在表达NY-ESO-1 TCR(1G4)和间皮素BiTE(ss1.CD3)的肿瘤刺激的T细胞中上调(图6)。
共表达TCR和BiTE的细胞被注射入白血病小鼠模型。在NOD/SCID(NSG)小鼠模型中，在肿瘤细胞注射后五天，注射表达NY-EOS-1野生型TCR和CD19.CD3 BiTE的电穿孔RNA的T细胞(图7)。发现电穿孔有NY-ESO-1野生型TCR RNA和CD19.CD3 BiTE的T细胞显示了有效的抗肿瘤活性，而具有NY-ESO-1 TCR的T细胞是较不有效的(图8)。
当与T细胞中的双特异性抗体结合时，表达修饰的TCR的T细胞还识别关联MHC/肽和表面肿瘤抗原二者而没有HLA限制(图9)。在图10A和10B中显示了电穿孔入T细胞的双特异性抗体RNA和TCR RNA的一系列构建体。表达修饰的NY-ESO-1 TCR和双特异性抗体的T细胞识别关联抗原(HLA-A2/NY-ESO-1)和CD19或Her2二者(图11)。
实施例2：使用双特异性抗体和CLEAR修饰的T细胞。
使用嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)修饰的T细胞的癌症的过继免疫疗法已经显示为用于癌症治疗的有希望的策略。由于癌症尤其是实体瘤的异源性质，靶向单一肿瘤抗原以治疗癌症很可能导致对靶向抗原阴性或下调靶向抗原的肿瘤细胞的免疫逃逸。因此，同时靶向多种肿瘤抗原具有增强治疗的潜力。代替合并多种单链可变片段(scFv)CAR——其由于结构相似性潜在地相互干扰，研发了通过共引入两种分子靶向多种肿瘤抗原的新方法。新的分子命名为“嵌合配体工程化活化受体(CLEAR)”(靶标-1)并且由胞内T细胞活化信号传导结构域——比如具有或不具有共刺激信号的CD3ζ——和胞外结构域组成。选择胞外结构域以：1)识别抗体或特异性的受体/配体和，2)特异性地结合至肿瘤抗原或在健康组织上不表达的其它分子。细胞还被工程化以表达一侧上的双特异性抗体或融合蛋白结合肿瘤抗原(靶标2)和另一侧上的CLEAR的胞外结构域。这使得T细胞能够识别第二肿瘤表达靶标(图12)。
在这些两种分子被引入T淋巴细胞后，CLEAR靶向靶标-1并且同时结合至分泌的双特异性抗体(或融合蛋白)。通过直接识别靶标-1和/或通过同时衔接在肿瘤细胞上的靶标-2处的CLEAR和分泌的双特异性抗体(或融合蛋白)，T细胞被触发。
作为概念验证，两种受体/配体靶标PD1/PD-L1和CD27/CD70——癌症的免疫疗法中的重要靶标——被选择以生成PD1或CD27 CLEAR。间皮素、ErbB2和CD19被用作靶标2抗原。选择针对PD1(2D3、4A11和4H1)(5)或CD27(C2177、M709和M708)(6)具有不同亲和力的三种scFv，并且使用针对上面提及的所有靶标-2配体的scFv制造双特异性构建体。
还构建了具有不同的共刺激或共同受体信号传导结构域的PD1 CLEAR。使用CD27(CD27-Z)(7)或CD27-4-1BB(CD27-BBZ)信号传导结构域构建CD27 CLEAR(图13A和13B)。所有构建体经由体外转录(IVT)载体被制成RNA，并且IVT RNA被制造和用于电穿孔CD3/CD28珠刺激的T细胞。
靶向PDL1或CD70阳性肿瘤的PD1或CD27 CLEAR重定向的T细胞。
测试表达单独的CD27或PD1 CLEAR的T细胞的功能。发现CD27 CLEAR可以在细胞表面上表达(图14)。当使用表达CD70的肿瘤系刺激T细胞时，T细胞被特异性地活化，其由CD107a表达的显著上调证明(图15)。
为了测试T细胞是否通过使用不同的共刺激(CD28或4-1BB)或共同受体(CD4或CD8)分子发挥作用，通过它们在T细胞上的表达测试五种PD1 CLEAR(图16)并且测定它们针对PDL1阳性细胞系Nalm6-PD-L1的反应性。具有所有PD1 CLEAR的T细胞强烈地响应于PD-L1阳性肿瘤，如由大约50％至大约70％CD107a上调和细胞因子产生所证明的。令人感兴趣地，具有CD4或CD8共同受体信号传导的T细胞PD1 CLEAR显示了与其它PD1 CLEAR:CD28，或4-1BB或没有任何共同信号传导(单独的ζ，PD1-Z)比得上的CD107a表达。IFN-γ和IL-2分泌二者都显著地降低(图17)，这指示具有CD4或CD8共同信号传导的PD1 CLEAR T细胞与其它差异地表现，其可以有利于治疗，其具有较小的由于细胞因子风暴的毒性。
通过使PD1 CLEAR与双特异性抗体结合的eCLEAR靶向多种肿瘤抗原。
通过将PD1 CLEAR(PD1-Z)的RNA和抗PD1和间皮素的双特异性抗体的RNA(2D3-ss1、4A11-ss1和4H1-ss1)二者共电穿孔入T细胞来测试具有PD1eCLEAR的T细胞。流式细胞术染色显示了CLEAR和双特异性抗体均可以被检测到(图18)。更重要地，当这些T细胞使用表达单一或双靶抗原的不同的细胞系进行刺激时，它们以抗原特异性方式识别单一抗原阳性肿瘤系，或双阳性肿瘤系。
与CARc ss1.BBZ相比，具有CLEAR(PD1Z&4A11.ss1)的T细胞在CD107a上调测定中显示了比得上的针对间皮素单阳性细胞系K562-meso的裂解能力。然而，对于肿瘤细胞系PC3-PDL1——其慢病毒转导有PD-L1并且对间皮素(medothelin)是弱阳性的，具有eCLEAR的T细胞比具有ss1.bbz CAR的T细胞具有更高得多的CD107a上调(图19)。
通过ELISA测试刺激的T细胞的细胞因子产生(IFN-γ和IL-2)。虽然转移有CLEARRNA的T细胞显示了与转移ss1.BBZ CAR的T细胞相比一样高或甚至更高的细胞因子产生，但是对于使用单阳性或双阳性靶细胞系刺激的转移CLEAR的T细胞，几乎没有可检测到的IL-2和IFN-γ二者的细胞因子。相比之下，转移有ss1.bbz CAR的T细胞分泌高水平的IL-2和IFN-γ二者(图20)。高裂解能力以及低细胞因子产生的性质可以在治疗癌症患者中具有益处，这是由于可以降低发展出不利的细胞因子风暴的几率。
为了测试CLEAR是否可以高效地靶向肿瘤抗原而不是间皮素，生成了抗PD1与ErbB2(4D5)或CD19或PSCA(2B3)的双特异性抗体构建体。那些新的双特异性抗体的RNA被共电穿孔入T细胞并且与它们相关的CAR(4D5.BBZ、19.BBZ或2B3.BBZ)比较。在这些T细胞使用肿瘤系进行刺激后检查CD107a表达，并且结果显示PD1/CD19 CLEAR(PD1-Z/2D3-CD19、PD1-Z/4A11-CD19)可以识别CD19单阳性肿瘤细胞Nalm6，其与CD19 CAR(19.BBZ)一样高效。CD19CAR T细胞降低它们针对CD19/PDL1双阳性Nalm6-PDL1细胞的反应性(CD107a+/CD8+的52.2％对56.6％)。对于PD1/CD19 CLEAR T细胞，CD107a也轻微地增加。结果还显示，对于PD1/4D5和PD1/2B3 CLEAR二者，当使用双阳性肿瘤刺激T细胞时，CD107a在具有CLEAR的T细胞中比在具有相关的CAR的T细胞中表达更高(图21)。
还测试了针对两种肿瘤抗原ErbB2和CD19的CD27 CLEAR。如图22中显示的，CD27和mIgG Fab二者(上组：具有ErbB2靶标的CD27-z，和下组：具有CD19靶标的CD27-z)的表面染色显示了不同水平下结合至T细胞的CD27和分泌的双特异性抗体二者的转基因表达。当使用肿瘤系——其对CD70和ErbB2是单阳性或双阳性的——刺激T细胞时，观察到抗原特异性T细胞活化。具体地，CD70-/ErbB2+肿瘤MDA231，CD27-Z/M708-4D5显示了大约33.2％的显著增加的CD107a表达，超过大约3％的背景水平(图23)。当具有CD27/CD19 CLEAR的T细胞使用细胞系——其对CD70和CD19是单阳性或双阳性的——进行刺激时(图24)，与CD27/ErbB2所见相同，观察到抗原特异性T细胞活化并且CD27/CD17 CLEAR显示了针对CD27/CD19二者双阳性细胞，或CD70或CD19单阳性细胞的明显的抗肿瘤活性。连同来自PD1/间皮素eCLEAR的结果，本文显示的数据指示了使用CLEAR和双特异性抗体可以间接地靶向肿瘤抗原。因而，两种肿瘤抗原可以被同时靶向而不相互干扰。
使用亲和力降低的抗ErbB2 scFv(4D5-5、4D5-4、4D4-3和4D5-2)以及与PD1 CLEAR和双特异性Ab结合的eCLEAR靶向ErbB2。
抗ErbB2 4D5是不用于基于T细胞的癌症治疗的高亲和力scFv。通过共电穿孔PD1CLEAR(PD1-Z)和抗PD1(2D3、4A11或4H1)与ErbB2(4D5、4D5-2、4D5-3、4D5-4或4D5-5)的双特异性抗体二者的RNA来测试具有PD1 eCLEAR的T细胞。流式细胞术染色显示PD1 CLEAR和双特异性抗体二者在大多数共电穿孔的T细胞中被检测到(图24)。
T细胞然后使用不同的肿瘤细胞系——其表达单一或双靶抗原——或电穿孔有ErbB2和/或PD-L1 RNA的K562细胞进行刺激(图25)。如图26和27中显示的，发现针对ErbB2高表达细胞系SK-OV3和电穿孔ErbB2 RNA的K562，共电穿孔有PD1 CLEAR和抗PD1/抗ErbB2双特异性抗体二者的T细胞显示了与亲和力相关的T细胞活性。4H1-4D5、4H1-4D5-4和4D5-2被发现具有确定的(to be conclusive)不足够的亲和力。
共电穿孔有PD1 CLEAR和双特异性抗体——其具有针对ErbB2 scFv(4D5)、2D3-4D5和4A11-4D5的高亲和力——的T细胞显示了针对PD1阴性和表达低水平ErbB2的肿瘤细胞MCF7的反应性。共电穿孔有PD1 CLEAR和双特异性抗体——其具有针对ErbB2 scFv(4D5)、4D5-5、4D5-4和4D5-3的较低的亲和力——的T细胞显示针对PD1阴性和表达低水平ErbB2的肿瘤细胞MCF7完全没有反应性。这暗示CLEAR和双特异性抗体可以安全地用于治疗患有过表达ErbB2的肿瘤的癌症患者。
SEQ ID NO:20，2D3.ss1：
atgggctggtcttgcatcatcctgtttctggtcgccaccgccaccggggtccacagtgagatcgttctcacccaatcccccgccacactgtcgctctccccaggcgagcgggccacgctgtcgtgtcgcgcgagccagagcgtttcctcctacctcgcctggtaccagcagaagccgggccaggcccctcgcctgctgatctacgatacttcgaatagagccaccggtatccctgcaaggttctccggatccgggtcagggacggatttcaccctgaccatttcctccctggagccagaggatttcgccgtgtactactgccagcagcgcagtaactggcctctgactttcggtggcggcacaaaggtggagatcaaggggggcggcggcagtgggggcgggggcagcgggggcggaggctcgcaggtccagctcgtggagtcggggggggacgtggtccagccaggcaggagcctgaggctgtcatgcgctgcgtccggcctgacgttcaccaactacggcttccactgggtgagacaggcacccgggaagggcctggaatgggtggccgtgatctggtacgacgggagcaagaagtactacgcagactcagtgaagggccgattcaccatcagccgggacaactctaagaacacactgtacctgcagatgaacaatttgcgcgccgaggataccgccgtatattattgcgccacaggcgacgactattggggacagggcaccctggtcacggtaagtagtggaggtggtggatcccaggtacaactgcagcagtctgggcctgagctggagaagcctggcgcttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggctacaccatgaactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggacttattactccttacaatggtgcttctagctacaaccagaagttcaggggcaaggccacattaactgtagacaagtcatccagcacagcctacatggacctcctcagtctgacatctgaagactctgcagtctatttctgtgcaagggggggttacgacgggaggggttttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggcggtggctctagcggtggcggatcggacatcgagctcactcagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgcactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttacgacacatccaaactggcttctggagtcccaggtcgcttcagtggcagtgggtctggaaactcttactctctcacaatcagcagcgtggaggctgaagacgacgcaacttattactgccagcagtggagtaagcaccctctcacgtacggtgctgggacaaagttggaaatcaaataa
SEQ ID NO:21，4A11.ss1：
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SEQ ID NO:22，4H1.ss1：
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SEQ ID NO:23，2D3.BBZ：
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SEQ ID NO:24，4A11.BBZ：
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SEQ ID NO:25，4H1.BBZ：
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SEQ ID NO:26，PD1.28M：
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SEQ ID NO:27，PD1.Z：
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SEQ ID NO:28，2D3.4D5：
atgggctggtcttgcatcatcctgtttctggtcgccaccgccaccggggtccacagtgagatcgttctcacccaatcccccgccacactgtcgctctccccaggcgagcgggccacgctgtcgtgtcgcgcgagccagagcgtttcctcctacctcgcctggtaccagcagaagccgggccaggcccctcgcctgctgatctacgatacttcgaatagagccaccggtatccctgcaaggttctccggatccgggtcagggacggatttcaccctgaccatttcctccctggagccagaggatttcgccgtgtactactgccagcagcgcagtaactggcctctgactttcggtggcggcacaaaggtggagatcaaggggggcggcggcagtgggggcgggggcagcgggggcggaggctcgcaggtccagctcgtggagtcggggggggacgtggtccagccaggcaggagcctgaggctgtcatgcgctgcgtccggcctgacgttcaccaactacggcttccactgggtgagacaggcacccgggaagggcctggaatgggtggccgtgatctggtacgacgggagcaagaagtactacgcagactcagtgaagggccgattcaccatcagccgggacaactctaagaacacactgtacctgcagatgaacaatttgcgcgccgaggataccgccgtatattattgcgccacaggcgacgactattggggacagggcaccctggtcacggtaagtagtggaggtggtggatccgacatccagatgacccagtccccttcctccctctctgcctctgtgggagaccgcgttaccatcacatgccgagcttcccaggacgtgaacacagccgtggcctggtaccagcagaagcccgggaaggcacccaaactcctcatctactccgcctccttcctatacagtggcgtgccttcccgattctccggctccaggagtggcacggactttacgctcaccattagtagcctgcagcccgaagacttcgcgacctactattgtcagcaacactacacgacgccaccaactttcggccagggtaccaaggtcgagattaagcgaaccggcagtaccagtgggtctggcaagcccggcagcggcgagggatccgaggtccagctggtcgagtccggcgggggcctggtgcagccgggcggctcgctgaggttatcttgcgccgccagtggcttcaacatcaaggatacttacatccactgggtgaggcaggctccgggcaagggcctggaatgggtggctaggatctaccctactaacgggtacacacgctacgcagattcggtgaaaggccgcttcactatctccgccgacacctcgaagaacactgcttacctgcagatgaactccctcagggccgaagatactgcagtctactactgctcccgctggggtggggacggcttctacgccatggacgtgtggggtcagggcactctagttacagtgtcatcctaa
SEQ ID NO:29，4A11.4D5：
atgggctggtcctgtatcatattattcctggtcgcgaccgccaccggggtgcactccgacatccagatgactcagtccccatcctccctgtcggcgtccgttggcgaccgggtctcgattacatgccgcgcctcccagggcatctcctcctggctcgcctggtaccagcagaagcctgagaaggcccccaagtcattaatctacgcagcctccaatctgaggtccggcgtgcccagtagattctcgggctccgggtcgggcactgattttaccctcaccatcagttcgctccagccagaggacttcgctacgtactattgccagcagtactattcctacccacgcaccttcgggcagggcaccaaggtcgagatcaagggcggcggcgggtccggcggaggcgggtctggcggtggtggttcgcagctgcagctgcaagagtccgggcctggcctcgtgaagcccagcgagaccctgtcattgacatgcaccgtgagtggggggagtctgtcccgctcctccttcttctggggctggattcgccagccgcccggcaaggggctggaatggatcgggtcgatctactacagtgggtcgacttactacaatccaagtctgaagagccgtgtgaccatctcagtggatacctcgaagaatcagttcagcctgaagctctcctccgtcaccgcggccgatacggcagtgtactactgtgtgcgcgattacgacatcctcactggcgatgaggactactggggtcaaggcaccctagtcacggtgtcgtcgggaggtggtggatccgacatccagatgacccagtccccttcctccctctctgcctctgtgggagaccgcgttaccatcacatgccgagcttcccaggacgtgaacacagccgtggcctggtaccagcagaagcccgggaaggcacccaaactcctcatctactccgcctccttcctatacagtggcgtgccttcccgattctccggctccaggagtggcacggactttacgctcaccattagtagcctgcagcccgaagacttcgcgacctactattgtcagcaacactacacgacgccaccaactttcggccagggtaccaaggtcgagattaagcgaaccggcagtaccagtgggtctggcaagcccggcagcggcgagggatccgaggtccagctggtcgagtccggcgggggcctggtgcagccgggcggctcgctgaggttatcttgcgccgccagtggcttcaacatcaaggatacttacatccactgggtgaggcaggctccgggcaagggcctggaatgggtggctaggatctaccctactaacgggtacacacgctacgcagattcggtgaaaggccgcttcactatctccgccgacacctcgaagaacactgcttacctgcagatgaactccctcagggccgaagatactgcagtctactactgctcccgctggggtggggacggcttctacgccatggacgtgtggggtcagggcactctagttacagtgtcatcctaa
SEQ ID NO:30，4H1.4D5：
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SEQ ID NO:31，2D3.CD19：
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SEQ ID NO:32，4A11.CD19：
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SEQ ID NO:33，4H1.CD19：
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SEQ ID NO:35，4A11.2B3：
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SEQ ID NO:37，C2177.ss1：
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SEQ ID NO:38，M709.ss1：
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SEQ ID NO:39，M708.ss1：
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SEQ ID NO:40，C2177.4D5：
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SEQ ID NO:41，M709.4D5：
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SEQ ID NO:42，M708.4D5：
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SEQ ID NO:43，C2177.BBZ
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SEQ ID NO:44，M709.BBZ：
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SEQ ID NO:45，M708.BBZ：
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SEQ ID NO:46，C2177.CD19：
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SEQ ID NO:47，M709.CD19：
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SEQ ID NO:48，M708.CD19：
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SEQ ID NO:49，PD1.CD8Z：
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SEQ ID NO:50，PD1.CD4Z：
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SEQ ID NO:51，PD1.28Z：
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SEQ ID NO:52，PD1.BBZ：
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实施例3：表达亲和分子嵌合受体或双特异性抗体的T细胞。
图29是通过使用抗His抗体染色显示亲和抗体模拟物重定向的T细胞(ART)的表达的图组。十毫克的编码针对EGFR(955.BBZ、1853.BBZ或1970.BBZ)或ErbB2(342.BBZ、432-15.BBZ、342-14.BBZ或342-4.BBZ)的ART的RNA被电穿孔入T细胞并且在R10中培养过夜。一百微升的电穿孔的T细胞通过抗His标签抗体染色用于ART表达的流式细胞术检测(下组)并且显示与未电穿孔(无EP)的T细胞相比，电穿孔有所有ART RNA的T细胞被阳性染色。
图30是显示EGFR和ErbB2 ART的特异性的CD107a上调的图组。使用4种不同的肿瘤细胞系——其表达EGFR和/或ErbB2，如每种肿瘤的名称下方指示的——刺激如图29中显示的电穿孔的T细胞。在4h培育后，通过使用CD107a-PE、CD3-APC和CD8-FITC染色细胞来测量CD107a上调。如图29中显示的，所有EGFR ART仅仅对为EGFR阳性的肿瘤系(SK-OV3、MDA231和MDA468)强烈地反应，而不对EGFR阴性肿瘤MCF7强烈地反应。而所有ErbB2 ART对为ErbB2阳性的肿瘤系(SK-OV3、MDA231和MCF7)强烈地反应，而不对ErbB2阴性肿瘤MDA468强烈地反应。4D5.BBZ和2224.BBZ是分别针对ErbB2和EGFR的CAR。
图31是显示EGFR和ErbB2 ART的特异性的IFN-γ产生的图。使用4种不同的肿瘤细胞系——其表达EGFR和/或ErbB2，如每种肿瘤的名称下方指示的——刺激如图29中显示的电穿孔的T细胞。在过夜培育后，上清液被用于通过ELISA测量INF-γ产生。对于由为EGFR阳性的肿瘤系(SK-OV3、MDA231和MDA468)而非EGFR阴性肿瘤MCF7刺激的所有EGFR ART，可以在不同水平下检测到IFN-γ。而所有ErbB2 ART对为ErbB2阳性的肿瘤系(SK-OV3、MDA231和MCF7)强烈地反应，而不对ErbB2阴性肿瘤MDA468强烈地反应。4D5.BBZ和2224.BBZ是分别针对ErbB2和EGFR的CAR。
图32是显示EGFR和ErbB2 ART的特异性的IL-2产生的图。使用四种不同的肿瘤细胞系——其表达EGFR和/或ErbB2，如每种肿瘤的名称下方指示的——刺激如图29中显示的电穿孔的T细胞。在过夜培育后，上清液被用于通过ELISA测量IL-2产生。对于由为EGFR阳性的肿瘤系(SK-OV3、MDA231和MDA468)而非EGFR阴性肿瘤MCF7刺激的所有EGFR ART，可以在不同水平下检测到IL-2。而所有ErbB2 ART对为ErbB2阳性的肿瘤系(SK-OV3、MDA231和MCF7)强烈地反应，而不对ErbB2阴性肿瘤MDA468强烈地反应。4D5.BBZ和2224.BBZ是分别针对ErbB2和EGFR的CAR。
图33是显示EGFR和ErbB2 ART的特异性的裂解活性的图。在单独实验中，测试两种EGFR和两种ErbB2 ART——与它们的相关的CAR相比——针对为EGFR和ErbB2二者阳性的肿瘤细胞系SK-OV3的杀伤能力。ART T细胞与相关的CAR T细胞一样高效地杀伤肿瘤细胞。
图34A是通过添加亲和抗体模拟物和His-标签序列至TCR的α或β链的N’的亲和抗体模拟物修饰的TCR(Affi-TCR)的图示草图。
图34B是显示电穿孔亲和抗体模拟物重定向的TCR(Affi-TCR)RNA的T细胞的Vb13.1 TCR和His-标签检测的图组。T细胞共电穿孔有NY-ESO-1(1G4)TCRα(a)和β(b)，或它们的ErbB2亲和抗体模拟物(342、342.15、342或342.4)修饰。过夜后，vb13.1和His-标签通过流式细胞术检测。
图34C显示了ErbB2亲和抗体模拟物序列。
图35是显示电穿孔Affi-TCR RNA的T细胞中的CD107a上调的图组。T细胞共电穿孔有如图34B中指示的TCRα(a)和β(b)，或它们的ErbB2亲和抗体模拟物(342、342.15、342或342.4)修饰，并且使用肿瘤系Nalm-6-ESO(NY-eso-1+，ErbB2-)、A549-ESO(NY-eso-1+，ErbB2+)、SK-OV3(NY-eso-1-，ErbB2+)、A549(NY-eso-1-，ErbB2+)、或Nalm6(NY-eso-1-，ErbB2-)刺激，用于CD107a测定。结果显示了具有ErbB2 Affi-TCR的T细胞可以特异性地识别Ny-ESO-1和ErbB2阳性肿瘤二者。
图36A是通过添加亲和抗体模拟物和G4S连接体至任一CD3ε的N’的亲和抗体模拟物修饰的CD3ε的图示草图。
图36B是显示T细胞的电穿孔的表格。T细胞共电穿孔有NY-ESO-1(1G4)TCRα(a)和β(b)，或连同ErbB2亲和抗体模拟物(342、342.15、342或342.4)修饰的CD3ε(e)。
图36C是显示通过共递送亲和抗体模拟物修饰的CD3ε维持TCR表达和双重靶向的图组。在图36B的T细胞过夜后，通过流式细胞术检测vb13.1表达。
结果显示添加亲和抗体模拟物至CD3ε最低程度地影响NY-ESO-1 TCR表达，如与亲和抗体模拟物修饰的TCR(EP2)的44.5％相比，所有共电穿孔Affi-ε的T细胞(EP3至EP6)显示76.5％至82.9％CD8/vb13.1双阳性。
图37是显示电穿孔Affi-TCR RNA的T细胞的CD107a上调的图组。T细胞共电穿孔有如图36B中指示的NY-ESO-1(1G4)TCRα(a)和β(b)，或连同ErbB2亲和抗体模拟物(342、342.15、342或342.4)修饰的CD3ε(e)，并且使用肿瘤系Nalm-6-ESO(NY-eso-1+，ErbB2-)、Nalm6(NY-eso-1-，ErbB2-)、SK-OV3(NY-eso-1-，ErbB2+)或MDA231(NY-eso-1-，ErbB2+)刺激，用于CD107a测定。
结果暗示添加亲和抗体模拟物至CD3ε可以最低程度地影响识别NY-ESO-1单阳性肿瘤Nalm6-ESO的NY-ESO-1 TCR功能，如与亲和抗体模拟物修饰的TCR(EP2)的33.1％相比，所有共电穿孔Affi-ε的T细胞(EP3至EP6)显示大约49.5％至53.3％CD8/CD107a双阳性。而且，那些共电穿孔Affi-ε的T细胞(EP3至EP6)展现了比亲和抗体模拟物修饰的TCR(EP2)更高的针对ErbB2阳性肿瘤SK-OV3和MDA231细胞的抗肿瘤活性。
实施例4：具有双特异性抗体的双特异性T细胞衔接器(BiTE)修饰的T细胞
功能性BiTE可以从电穿孔双RNA的T细胞分泌并且衔接至具有特异性的肿瘤反应性的T细胞。
测试转移有双RNA(双RNA T)的T细胞的分泌功能性双特异性T细胞衔接器(BiTE)的能力，并且鉴定在电穿孔双RNA的和未电穿孔双RNA的T细胞二者中衔接的BiTE的作用。而且，当共引入CAR RNA和双RNA时，评估T细胞抗肿瘤活性的潜在增加。
首先，使用可以检测鼠起源Fab(mIgGFab)的抗体实施T细胞的表面染色。电穿孔有CAR(CAR RNA)或双RNA的T细胞被发现阳性染色(图38A，上组)。为了测试由双RNA T分泌的博纳吐单抗是否也可以负载至其它T细胞，在电穿孔后立刻(图38A，中组)或在染色前(图38A，下组)，使电穿孔GFP RNA的T细胞(GFP T细胞)与双RNA T或CAR-RNA T混合。发现GFP-RNA T细胞可以染色为mIgGFab阳性，只要它们与双RNA T细胞而不是与CAR19-RNA T共培育，这表明由双RNA T分泌的博纳吐单抗不仅可以衔接至双RNA T细胞，而且可以衔接至其它T细胞。
通过使用CD19阳性肿瘤系(Nalm6、K562-CD19和Raji)刺激T细胞，在四小时的CD107a测定中测试双RNA T细胞或与双RNA T细胞共培育的GFP T细胞的功能。如图38B中显示的，双RNA T细胞的抗原特异性的CD107a上调与CAR-RNA T细胞一样高效。而且，对于GFP-RNA T细胞——与双RNA-T而不是与CAR-RNA T细胞共培育的细胞，也证明了在相似水平的CAR-RNA T细胞和双RNA T细胞下的显著的抗原特异性的CD107a上调。
在四小时的细胞毒性T淋巴细胞杀伤测定中，发现双RNA T细胞与CAR19-RNA T细胞一样高效地杀伤肿瘤(CD19)(图38C)。然而，当这些T细胞与相等量的非肿瘤反应性GFP-RNA T细胞混合时，与GFP-RNA T细胞混合的双RNA T细胞(双RNA/GFP-T细胞)相对于与GFPRNA T细胞混合的CAR19-RNA T细胞(CD19/GFP-T细胞)显示了显著更高的裂解能力。这可能是由于当使CAR19-RNA T细胞与GFP-RNA T细胞混合时减小的E:T比值。虽然使双RNA T细胞与GFP-RNA T细胞混合，但是经由通过使它们与由双RNA T细胞分泌的博纳吐单抗衔接而赋予GFP-RNA T细胞特异性的肿瘤反应性，E:T比值被维持。值得注意的是，博纳吐单抗双RNAT细胞仅当它们被CD19阳性细胞系比如K562-CD19、Nalm6和Raji，而非CD19阴性细胞系K562刺激时活化。这指示以双RNA的形式引入的BiTE将以抗原特异性方式仅活化T细胞。
为了进一步确认BiTE可以由电穿孔双RNA的T细胞产生，十或100倍稀释的从电穿孔的T细胞收获的上清液被添加至未电穿孔的T细胞并且与肿瘤混合用于CD107a测定。发现通过添加从双RNA T细胞收集的上清液，未电穿孔的非肿瘤反应性T细胞变为高度肿瘤反应性的(图45A和45B)。
电穿孔双RNA的T细胞的增加的特异性T细胞活化敏感性和肿瘤杀伤能力和延长的肿瘤反应性。
为了测试双RNA T细胞对肿瘤识别的敏感性，T细胞电穿孔有不同剂量的双RNA并且与CD19 CAR RNA比较。从CD107a上调获得相似的结果(图39A)。
在IFN-γ/粒酶B胞内染色(图39B)和由ELISA测定的IFN-γ产生(图39C)的实验中，当使用低达0.5μg双RNA时，观察到显著的T细胞活化。但是，1-2μg的双RNA保持比得上5-10μg CD19 CAR RNA。尽管双RNA处于低剂量中的0.5μg，但双RNA T细胞和共培育的GFP-RNAT细胞仍显示了高效的抗肿瘤活性。
在四小时的细胞毒性T淋巴细胞测定中，比较具有1、5和10μg的博纳吐单抗双RNA或CD19BBZ CAR RNA的剂量下的不同量的RNA的T细胞的裂解能力。如图39D中显示的，T细胞的杀伤能力显示对于双RNA和CAR RNA二者均与RNA剂量关联。但是，在1:1至30:1的效应物-靶比值下，具有1μg的双RNA的T细胞在与具有10μg CD19BBZ CAR RNA的T细胞相似的水平下杀伤肿瘤(图46)。
为了测试电穿孔有博纳吐单抗RNA的T细胞的功能持续性，与CD19 CAR RNA相比，增加剂量的RNA被电穿孔入T细胞。通过在电穿孔后的不同时间使用CD19+肿瘤系刺激T细胞进行抗原特异性T细胞再活化，接着查看CD107a上调水平。如图39A中已经显示的，电穿孔后第1天，只要RNA剂量超过1μg，双RNA T细胞可以与5-10μg CD19-CAR-T细胞一样高效地被活化。
设置新实验以追踪从电穿孔后第3天开始上至电穿孔后14天的T细胞功能持续性(图40A和40B)。发现电穿孔后第3天，具有5和10μg RNA的双RNA T细胞仍显示非常强的抗肿瘤反应性，其由高CD107a上调所证明，而10μg CAR19-RNA T细胞的抗肿瘤反应性下降至1μg双RNA T细胞水平。在第8天，10μg CAR19-RNA T细胞的肿瘤反应性远低于1μg双RNA T细胞并且降低至几乎阴性水平，而具有5和10μg RNA的双RNA T细胞的肿瘤反应性仍保持在高水平。最显著地，在电穿孔后第12天，对于5和10μg RNA剂量下的双RNA T细胞，显著量的CD107a保持可检测到。该结果指示与通过RNA电穿孔引入的T细胞上表达的功能性CAR相比，BiTE可以以低转换率稳定地负载在T细胞上并且维持T细胞肿瘤反应性持续相对较长的时间量。
为了测试通过双RNA提供至T细胞的BiTE的识别敏感性，表达不同水平的CD19的K562细胞系被用于分别刺激电穿孔有5μg或10μg下的CAR RNA或双RNA的T细胞。如图40C中显示的，CAR RNA和双RNA二者的T细胞识别0.001μg的相同水平下的CD19。表达不同水平的ErbB2的K562细胞系也被用于刺激电穿孔有4D5BBZ CAR RNA或4D5-CD3双RNA的T细胞。与CD19抗原测试发现的相似，ErbB2(4D5)CAR RNA和双RNA二者都可以识别0.1μg水平下的抗原，如由IFN-γ分泌(图40D)和CD107a上调(图47)所证明的。
电穿孔双RNA的T细胞的较少的共刺激依赖性分裂和增殖。
通过使用表达CD19的K562和K562(K562-CD19/K562)或使用K562-CD19和表达CD86的K562(K562-CD19/K562-CD86)刺激博纳吐单抗双RNA T细胞，或CD19 CAR-RNAT细胞来测试T细胞分裂和增殖。当T细胞使用K562-CD19进行刺激而不提供共刺激时，甚至在低至1μg的RNA剂量下，双RNA T细胞可以高效地分裂。相反，CAR-RNA T细胞的分裂保持更不高效的多，其由如下事实所证明：在1μg的RNA剂量下极少检测到T细胞分裂。甚至在10μg的RNA剂量下，CAR-RNA T细胞不如1μg的RNA剂量下的双RNA T细胞一样高效地分裂(图41A和48A)。
双RNA T细胞的T细胞分裂程度与细胞增殖和扩展相关联，其依赖于T细胞分裂和存活二者。如图41B，左组中显示的，仅双RNA T细胞显示了T细胞扩展——甚至在1μgRNA剂量下。CAR-RNA T细胞显示了在所有RNA剂量下没有T细胞扩展。虽然5和10μgRNA剂量下的CAR-RNA T细胞显示了显著的CFSE稀释，但检测不到T细胞扩展。这些结果表明在刺激过程期间不提供额外的共刺激信号，双RNA T细胞仍能够接收足够的刺激信号以维持T细胞分裂、增殖和存活，而由CAR-RNA T细胞接收的刺激信号对大多数分裂细胞的存活是不足够的。
通过添加CD28信号至共刺激，发现CD28共刺激极大地增强CAR-RNA T细胞的分裂(对于所有RNA剂量)和增殖(仅在10μg的RNA剂量下)二者。同时，CD28共刺激在所有双RNA剂量下轻微地增加双RNA T细胞分裂以及增强细胞增殖(图41B、48A和48B)。
为了进一步测试T细胞是否可以使用减少量的双RNA高效地活化和T细胞状态对刺激的影响，使用不同剂量的RNA评估CD45RO+记忆或CD45RO-稚T细胞的CFSE稀释和细胞增殖。发现电穿孔有低达0.2μg的RNA的T细胞可以被高效地活化，如由使用K562-CD86共刺激的CD45RO-稚细胞或CD45RO+记忆细胞的T细胞的CFSE稀释和细胞扩展所证明的(在大多数情况下，与具有5μg CD19BBZ RNA的T细胞等价)(图41C、41D和48C)。这进一步确认了与具有CAR RNA的T细胞相比，具有双RNA的T细胞对T细胞活化更敏感和更少依赖于共刺激。
令人感兴趣地，在双RNA T细胞和CAR-RNA T细胞的CFSE稀释和IFN-γ水平之间发现了正相关，但是在CFSE稀释和IL-2水平之间发现了负相关。在刺激CFSE标记的T细胞后八天，检查培养物上清液中的细胞因子(图41A和48D)。结果，双RNA T细胞显示了更高的IFN-γ产生，其指示更完全的T细胞活化。双RNA T细胞还显示了培养基补充的IL-2(10IU/mL)的更高的消耗，这表明更高水平的T细胞增殖(图48E)。双RNA T细胞的增加的T细胞活化还通过检查一组细胞因子和趋化因子证明，其显示了在测定的大多数细胞因子和趋化因子中的全面增加，而没有极化偏好(图49B)。
为了排除CAR RNA T细胞的CD28共刺激依赖性是由于使用BBZ构型——其中不存在CD28信号传导部分，添加CD19-28Z CAR RNA以评估电穿孔CAR RNA和双RNA的T细胞的分裂和增殖能力。发现在使用CD19+肿瘤系——有或没有额外的CD28共刺激——进行刺激之后，与CD19BBZ CAR RNA T细胞相比，CD19-28Z CAR RNA T细胞的CFSE稀释(图48F)和T细胞扩展(图48G)二者都被轻微地增加。
5μg CD19-28BBZ CAR RNA T细胞的CFSE稀释和细胞扩展评估都显著地低于1μg双RNA T细胞——甚至在存在额外的CD28共刺激下。在四小时的细胞毒性T淋巴细胞测定中，显示电穿孔CD19BBZ和CD19-28Z RNA二者的T细胞具有相似的裂解能力，但是具有博纳吐单抗RNA (Blina)的T细胞显示了比CAR RNA T细胞更强的杀伤能力(图48H)。
双RNA T在白血病小鼠模型中的增强的抗肿瘤活性。
发现表明双RNA T细胞可以具有由与CAR RNA T细胞相比增加的CD107a上调、细胞因子产生、肿瘤裂解能力、和细胞分裂和增殖能力展现的增强的体内功能。在NOD-SCID-？c-/-(NSG)小鼠接受绿色荧光素酶-转导的Nalm6细胞(Nalm6-CBG)后七天，如指示的，使用电穿孔有CD19BBZ RNA CAR(RNA CAR)和/或博纳吐单抗双RNA的T细胞处理小鼠(图42A和42B)。
对于使用单剂量的T细胞处理的小鼠，与使用对照CAR RNA T细胞(ss1BBZ)处理的小鼠相比，CAR RNA T细胞显示了显著的肿瘤负荷减少。由双RNA T细胞或共电穿孔有CARRNA和双RNA二者的T细胞处理的小鼠展现了增强的肿瘤消退——其由大约1-2log肿瘤密度减小证明。当使用多重T细胞剂量注射剂处理荷瘤小鼠时，两组小鼠——使用CAR RNA T细胞和双RNA T细胞处理——的肿瘤负荷都被减小至背景水平。
为了评价双RNA T细胞的增强的体内抗肿瘤活性是否是由于细胞的增强的持续性，给予单一注射的人T细胞的小鼠被处死并且来自骨髓和脾脏的细胞被纯化用于功能分析。在使用CD19阳性细胞系K562-CD19进行刺激后，对T细胞进行CD137表达(图42C)、IFN-γ产生(图42D)和CD107a(图42E)表达的分析。在所有三个功能测定中，在T细胞注射后第1天，CD19BBZ CAR T细胞(CAR RNA T)和CD19双RNA T细胞(双RNA T)展现了对特异性抗原刺激的高反应性。而在注射后第3天，CAR RNA T细胞仍展现了一些抗肿瘤活性，在注射后第7天，CAR RNA和双RNA T细胞二者均缺乏几乎所有抗肿瘤活性。
使用靶向不同肿瘤抗原的不同scFv生成双RNA。
源自小鼠scFv的CAR的免疫原性是威胁CAR疗法的潜在限制。在其中引发不利的免疫应答的情况下，通常，免疫应答针对经常源自小鼠单克隆抗体的胞外抗原识别结构域(Lamer等，Blood 117:72-82,2011)。人抗CD19 scFv(21D4)和人抗CD3 scFv(28F11)被选择以制造完整的人CD19-CD3双RNA。制造每个单链可变片段(scFv)的VH和VL链的初始尝试显示完整的人CD19-CD3双RNA缺乏任何可检测到的功能。制造具有不同VL/VH序列D4-F11HLHL的新构建体。
如图43A中显示的，D4-F11HLHL双RNA的表达展现了超过90％CD107a上调，与之相比，电穿孔有CD19 CAR RNA(CD19BBZ)和博纳吐单抗双RNA(Blina-双RNA)的T细胞分别在78.89％和80.96％下上调CD107a。
为了进一步确认完整的人D4-F11HLHL双RNA的功能，电穿孔的T细胞使用不同的CD19阳性细胞系进行刺激。在与CD19细胞过夜共培养后检测IFN-γ和IL-2水平(图49A)。与表达CD19 CAR RNA或博纳吐单抗双RNA的T细胞相比，表达D4-F11 HLHL的T细胞产生显著更高水平的IFN-γ(图43B)。对于TNF-α、IL-2、IL-10、IFN-γ和GM-CSF，与CD19 CAR RNA T细胞相比，细胞因子产生概况显示从D4-F11双RNA T观察到大约2-5倍的细胞因子产生增加(图49B)。这些结果指示电穿孔有CD19-CD3双RNA的T细胞的T细胞功能的总体增强。
对于CD19 CAR RNA和基于博纳吐单抗的双RNA之间的大多数比较，使用基于FMC63抗CD19 scFv的CAR。尽管难以从FMC63 scFv生成双RNA，但是来自FMC63 scFv的CAR RNA展现了比源自博纳吐单抗抗CD19 svFc(HD37)的双RNA的更大的功能。
为了测定CAR RNA T细胞和双RNA T细胞之间的功能差异是否是由于在CAR和双特异性抗体中使用的不同的scFv，使用抗CD19 scFv(21D4)生成完整的人CAR，D4BBZ，并且与两种CD19 CAR(FMC63 CAR和21D4 CAR)和两种CD19-CD3双RNA(HD37双RNA和21D4双RNA)——1μg和10μg的RNA剂量下——进行比较。IFN-γ和IL-2的细胞因子产生(图49C)和CD107a表达显示了21D4 CAR比得上FMC63 CAR并且轻微地比FMC63 CAR更有功能性。具有21D4双RNA(D4-F11)的T细胞显示了强得多的抗肿瘤活性——其由显著增加的细胞因子产生和CD107a表达证明，尤其是在较低的RNA剂量下(图49D)。
为了测试完整的人CD19双RNA(D4-F11)的抗肿瘤活性，负荷Nalm6-CBG细胞的NSG小鼠(N＝6)使用慢病毒转导CD19BBZ或D4F11的T细胞，或电穿孔19BBZ或D4F11 RNA的T细胞进行处理(图43E)。比较慢病毒转导CD19BBZ或D4F11的T细胞，使用D4F11的慢病毒转导产生比CD19BBZ慢病毒转导更强抗肿瘤活性的T细胞。电穿孔有CD19BBZ CAR RNA和D4F11双RNA的T细胞初始地控制动物中的肿瘤生长(图49E)。然而，残留疾病保留在两组动物中，而接受慢病毒转导的T细胞的动物没少任何残留疾病。
为了测试将其它肿瘤抗原特异性scFv转换为双RNA的可行性和是否可以生成双RNA，来自间皮素、cMet、PSCA或GD2 CAR的scFv被用于生成双RNA。电穿孔有这些双RNA的T细胞上的scFv的表面染色显示了对间皮素、cMet和PSCA而不对GD2阳性染色(图43C)。相似地，在具有相关的CAR RNA的T细胞，以及电穿孔有间皮素、cMet和PSCA双RNA的T细胞中观察到抗原特异性的CD107a上调，而对于GD2双RNA的T细胞没有观察到抗原特异性的CD107a上调(图43D)。
另外，生成了EGFRviii(MR-1和139)和ErbB2(4D5)的三种功能性双RNA(图49F、49G和49H)。因而，八分之七的CAR可以转换为双RNA。
而且，发现当电穿孔有间皮素双RNA的T细胞与间皮素阴性细胞系K562-PSCA、LY5Y和K562一起培育时，存在极少的非特异性T细胞活化。然而，具有间皮素CAR RNA的T细胞显示了频繁的非特异性T细胞活化并且CD107a表达保持超过阴性对照46％至55％(图43D)。这些数据表明将CAR转化为双RNA可以具有潜在的治疗益处，比如预防与一些CAR相关联的中靶或脱靶的毒性。
对双RNA T细胞中的肿瘤相关阻抑的抗性。
当与CAR-RNA T细胞相比时，双RNA T细胞显示了更高的细胞因子产生、增加的增殖、增加的裂解能力和更小的共刺激依赖性。这样的性质指示了双RNA T细胞是全功能的并且较不倾向于肿瘤相关阻抑，比如通过调节性T细胞和来自程序性细胞死亡1(PD1)受体-配体相互作用的影响的阻抑。
为了测试PD1对T细胞功能的影响，T细胞共电穿孔有不同RNA剂量下的CD19双RNA或CAR RNA和PD1 RNA并且使用CD19阳性肿瘤细胞进行刺激。结果显示共电穿孔有5μg或10μg PD1 RNA的T细胞显著地减少CAR-RNA T细胞响应于特异性抗原刺激，减少CD107a表达(图44A)和细胞因子产生(IFN-γ和IL-2)(图44B和50)。然而，T细胞功能最小程度地受1μg和5μg的双RNA下的PD1与10μg PD1 RNA影响，并且在10μg的双RNA下没有对T细胞功能的明显的负影响。
为了测试双RNA T细胞是否可以显示对调节性T细胞(Treg)诱导的阻抑的更大的抗性，纯化的Treg被添加至CFSE标记的T效应细胞。T效应细胞电穿孔有双RNA或CAR RNA并且使用不同T效应物：Treg比值下的CD19阳性细胞系进行刺激。与随着时间展示CFSE信号的稀释的非Treg阻抑的细胞相比，增殖的阻抑被证明为维持CFSE标记的细胞(图44D)。CFSE信号的减少指示电穿孔有4:1和8:1 T效应物：Treg比值二者下的CD19 CAR(19BBZ)的T细胞的Treg阻抑的增殖。然而，使用电穿孔有博纳吐单抗双RNA(双RNA)的T细胞(4:1 T效应物：Treg比值)，更小的Treg阻抑是明显的。对于双RNA T细胞，在8:1 T效应物：Treg比值之上没有观察到显著的Treg阻抑(图44C)。
单分子中的组合刺激(在细胞表面上表达的抗CD3 scFv)和共刺激(CD28和4-1BB)提供了支持高效的T细胞扩展和活化的必需组分。通过共引入共刺激分子，具有中央记忆(central memory)表型与强裂解能力的新的T细胞群对于T细胞治疗效力是两个关键特性，其在当前的T细胞方法中缺乏。
为了测试博纳吐单抗RNA(双RNA)T细胞用于肿瘤识别的敏感性，T细胞电穿孔有不同剂量的双RNA并且与CD19 CAR RNA比较。从CD107a上调获得相似的结果(图51A)。
在使用IFN-γ/粒酶B胞内染色(图51B)和通过ELISA测定的IFN-γ产生(图51C)的实验中，甚至当仅电穿孔0.5μg双RNA时，观察到显著的T细胞活化。但是，1-2μg的双RNA在测定中保持比得上5-10μg CD19 CAR RNA。甚至在0.5μg下的低量的双RNA下，双RNA T细胞和共培育的GFP-RNA T细胞仍显示了高效的抗肿瘤活性。
在四小时的细胞毒性T淋巴细胞测定中，比较具有1、5和10μg的剂量的双RNA或CD19BBZ CAR RNA下的不同量的RNA的T细胞的裂解能力。如图51D中显示的，对于双RNA和CAR RNA二者，T细胞的杀伤能力与RNA剂量相关联。
为了测试电穿孔有双RNA的T细胞的功能持续性，与CD19 CAR RNA相比，增加剂量的RNA被电穿孔入T细胞。在电穿孔后的不同时间下使用CD19+肿瘤细胞系抗原特异性再活化T细胞后，评估CD107a上调水平。在电穿孔后第1天，只要RNA剂量超过1μg，则双RNA T细胞与电穿孔有5-10μg CD19-CAR RNA的T细胞一样高效地被活化(图51A)。
设计具有阻断PD-L1的单链可变片段(scFv)(来自专利号AU2006265108A1)和抗CD28 scFv(1412，US7,585,960 B2)的四种双特异性抗体的构建体并且通过PCR合成(图52)。序列验证的DNA被适当地克隆入基于pGEM.64A的RNA体外转录载体以生成pGEM.10A5-1-1412、pGEM.13G4-1412、pGEM.1b12-1412和pGEM.12A4-1412，参见图53。
通过ELISA检测的细胞因子(IL2，图54A，和IFN-γ，图54B)产生显示了PD1-CD28转换受体10A5-1412(一PDL1-一CD28双RNA)和13G4-1412(一PDL1-一CD28双RNA)通过增加IL-2和IFN-γ二者的分泌显著地提高T细胞功能。功能的转换表明PD1阴性信号被转换为CD28阳性信号。具有双RNA转换受体10A5-1412(一PDL1-一CD28双RNA)和13G4-1412(一PDL1-一CD28双RNA)的T细胞显示了增加的细胞因子产生，这表明这些工程化的T细胞递送正向提高T细胞功能的活化分子。
设计包括抗aTGFbRII-1、抗aTGFbRII-3(来自美国专利号8,147,834)和抗CD28scFv(1412，美国专利号7,585,960)的构建体并且通过PCR合成。序列验证的DNA被适当地克隆入基于pGEM.64A的RNA体外转录载体以生成pGEM.aTGFbR-1-1412和pGEM.aTGFbR-3-1412，参见图55。
图56A是显示电穿孔有4D5-CD3双RNA的T细胞对过表达ErbB2的肿瘤细胞反应的图。电穿孔有ErbB2 CAR或双RNA的T细胞使用表达高水平的ErbB2、SK-OV3和N87，或低水平的MFC-7、MDA-231、PC3和A549的肿瘤系进行刺激。CD107a测定显示了表达4D5-6.CD3的T细胞仅对过表达ErbB2的肿瘤细胞反应。图56B是显示图56A的重复实验的结果的图组。
图57是显示电穿孔有4D5-CD3双RNA的T细胞对过表达ErbB2的肿瘤细胞的裂解活性的图组。电穿孔有ErbB2 CAR或双RNA的T细胞被测试它们针对过表达ErbB2的肿瘤细胞SK-OV3-CBG或低表达ErbB2的肿瘤细胞mel624(624-CBG)的裂解活性。基于荧光素酶的CTL测定显示了，与亲和调谐的BebB2 CAR、4D5-5.BBZ和4D5-3.BBZ一样，表达4D5-6.CD3的T细胞仅对过表达ErbB2的肿瘤细胞SK-OV3反应。
图58是显示用4D5-CD3双RNA慢病毒转导的T细胞对过表达ErbB2的肿瘤细胞反应的图组。用ErbB2 CAR或双RNA转导的T细胞使用表达高水平的ErbB2、SK-OV3和N87，或低水平的MDA-231、PC3和A549的肿瘤系进行刺激。CD107a测定显示了表达4D5-CD3的T细胞仅对过表达ErbB2的肿瘤细胞反应。
图59是显示用4D5-CD3双RNA慢病毒转导的T细胞对过表达ErbB2的肿瘤细胞反应的图组。如指示的用ErbB2 CAR或双RNA的转导的T细胞使用表达高水平的ErbB2、SK-OV3和N87，或低水平的MDA-231、PC3和A549的肿瘤系进行刺激。如通过ELISA测定的细胞因子产生指示表达T4D5-CD3的T细胞仅对过表达ErbB2的肿瘤细胞反应。
图60A是显示亲和调谐的ErbB2 BiTE细胞增加治疗指数和诱导小鼠中的晚期血管化肿瘤的消退的图像组。在双肿瘤移入的NSG小鼠中测试通过慢病毒转导用不同亲和力ErbB2 CAR或BiTE修饰的T细胞。在第0天，小鼠(n＝4-5)在右胁上植入有PC3-CBG肿瘤细胞(1×106个细胞/小鼠，s.c.)。在第5天，相同的小鼠在左胁上给予SK-OV3-CBG肿瘤细胞(5×106个细胞/小鼠，s.c.)。小鼠在PC3肿瘤接种后第23天使用T细胞(i.v.)进行处理。T细胞被作为1×107个/小鼠的单一注射施用。使用未转导的T细胞(无TD)处理的小鼠充当对照。动物在PC3肿瘤接种后指定的时间处成像。图60B是显示双肿瘤移植的NSG小鼠模型中的SK-OV3肿瘤大小的图。测量肿瘤大小，并且计算和标绘肿瘤体积。图60C是显示双肿瘤移植的NSG小鼠模型中的PC3肿瘤大小的图。测量肿瘤大小，并且计算和标绘肿瘤体积。
图61A是共表达PD1-CD28转换受体和亲和调谐的T4D5-6.CD3 BiTE的构建体的图示。图61B是显示检测用PD1-CD28和T4D5-CD3共表达载体慢病毒转导的T细胞的PD1-CD28转换受体的图组。
图62A是显示共表达PD1-CD28转换受体和T4D5-6.CD3亲和调谐的BiTE二者的T细胞的增加的裂解活性的图。
图62B-62G是显示通过用于对直接从正常供体分离的T细胞修饰的Dudley等，J.Immunol.,26(4):332-342,2003的快速扩展方案(REP)生成的电穿孔双RNA的T细胞的图像组。电穿孔双RNA的T细胞进一步提高体内抗白血病活性。在REP条件下，T细胞与一种或多种因子比如flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3和c-kit配体一起培养。评估通过REP或抗CD3/抗CD28珠(Beads)扩展的T细胞的表型(图62B)。REP T细胞或抗CD3/抗CD28珠T细胞电穿孔有不同量的CAR RNA或双RNA并且使用不同的细胞系刺激18小时。通过流式细胞术分析CD137上调(对CD3+ T细胞门控)(图62C)。在电穿孔有不同量的CAR RNA或博纳吐单抗双RNA的REP T细胞(图62D，左组)或抗CD3/抗CD28珠T细胞(图62D，右组)中测量裂解活性。NSG小鼠静脉内注射有1×106Nalm6-CBG和5天后进行处理：使用30×106个CAR RNA或博纳吐单抗双RNA(Blina)T细胞进行第一处理，接着从Nalm6-CBG注射后第8天开始，每次5×106个，每周两次持续三周。在指定的时间处实施生物发光成像(BLI)(图62E)并且BLI的结果和存活被分别标绘在图62F和图62G中。
图62H-62I是显示表达膜结合OKT3的基于K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)生成的图像组。在图62H中图解了表达具有CD8铰链和跨膜(OKT3.8)或具有CD8铰链和CD28跨膜(OKT3.8.28)的膜形式的OKT3的嵌合蛋白的慢病毒载体(pLENS)。基于K562的aAPC——K562-CD86-CD137L(KT)或K562-CD137L(2D11)细胞系——用慢病毒OKT3.8或OKT3.8.28转导，并且使用抗鼠IgG Fab的抗体检测膜结合OKT3的表达(图62I)。
图62J是显示转导膜结合OKT3的K562aAPC克隆的表征的图像组。通过限制稀释选择克隆基于来自转导OKT3.8.28的KT aAPC的膜结合OKT3的表达。
图62K-62M是显示使用基于K562的人工aAPC的REP的图组。图62K是如下图：其显示了在用于在1:250的T细胞：aAPC比值下刺激T细胞前，负载OKT3的K562-CD86-CD137L(KT)或K562-CD137L(2D11)，或表达膜结合OKT3的KT(KT.OKT)被照射和培养一天(D1)或两天(D2)。图62L是显示进行CD62L和CD28染色的扩展的T细胞——其在REP中独立地扩展——的图组。图62M是显示与KT细胞相比REP实验中的不同B细胞系的图。
实施例5：表达修饰的TCR的T细胞。
通过慢病毒或逆转录病毒载体，使用抗肿瘤抗原TCR重定向的T淋巴细胞处理的癌症患者显示了有希望的结果。在此研究中，RNA被电穿孔入T细胞以测定是否可以研发癌症过继免疫疗法的高效疗法。比较T细胞以评估与在Naml6白血病和A549肺癌小鼠模型中表达野生型(wt)TCR或高亲和力TCR的电穿孔RNA的T细胞相比，1)针对肿瘤抗原(NY-ESO-1)表达野生型(wt)TCR或高亲和力TCR的T淋巴细胞和2)慢病毒载体转导的T细胞的体内效力。
为了改进TCR重定向的T细胞过继免疫疗法，T细胞电穿孔有TCR RNA并且细胞被注入白血病小鼠模型。在NOD/SCID(NSG)小鼠模型中，表达NY-EOS-1野生型TCR的慢病毒转导的和电穿孔RNA的T细胞二者都具有与较高亲和力TCR相似的治疗功效(图63、64和65)。HLA-A2+、CD19+白血病细胞系Naml6转导有NY-ESO-1以生成Naml6-ESO肿瘤细胞。一百万Naml6-ESO细胞被注入NSG小鼠并且小鼠在肿瘤接种后第5天或第7天(如指示的)注射有T细胞。使用电穿孔有NY-ESO-1(1G4)野生型TCR RNA(wt1G4)或其高亲和力形式(LY95a)的T细胞处理荷瘤小鼠。发现电穿孔有NY-ESO-1野生型TCR RNA的T细胞显示了有效的抗肿瘤活性，而具有高亲和力NY-ESO-1 TCR的T细胞是较不有效得多(图63)。
在Naml6-ESO白血病和A549肺癌NSG模型二者中，电穿孔TCR(高亲和力或野生型)RNA的T细胞比用高亲和力或野生型TCR的慢病毒转导的T细胞显示了显著更好的癌症治疗功效(图64和65)。与表达高亲和力TCR或野生型TCR的单剂量的慢病毒转导的T细胞相比，多重输注的电穿孔TCR RNA的T细胞控制肿瘤生长更长。这指示电穿孔的T细胞仅具有短暂的治疗效果(图64)。在A549肺模型中测试通过慢病毒转导或RNA电穿孔转移有野生型TCR或高亲和力TCR的T细胞。发现野生型和高亲和力TCR RNA T细胞二者都控制肿瘤，但是与TCRRNA T细胞相比，具有慢病毒转导的野生型或高亲和力TCR的T细胞仅显示了轻微的和最小的治疗(图65)。图66-68进一步显示了电穿孔TCR RNA的T细胞比慢病毒转导的T细胞更高效地控制肿瘤细胞生长。
基于临床前的动物数据，转导慢病毒-TCR的T细胞——野生型和高亲和力二者——以单剂量的RNA表达(图64和65)，其指示慢病毒-TCR RNA T细胞不能如慢病毒-CART细胞一样高效地扩展和持续。这可能是由于缺少适当的共刺激信号。共电穿孔TCR以及CD3RNA进一步增强T细胞抗肿瘤活性，如图69-80中显示的。图69是显示CD3构建体的图示和显示电穿孔TCR和CD3 RNA的T细胞中的TCR和CD3表达的图的图像组。图70和71是显示在电穿孔的T细胞中检测到的TCR(vb13.1)、CD3和TCR(vb13.1)/CD3的表达水平的图。图72-74示出了显示感染效率的表格。图75-80显示了电穿孔有TCR RNA(y轴)——有或没有CD3——并且使用不同的肿瘤细胞系(x轴)培育的T细胞。
CD3是TCR介导的T细胞功能的非常重要的组分。CD3/TCR复合体由六种不同的分子组成。除TCRα和β链之外，还存在四种CD3单位：γ、δ、ε和ζ。通过将编码来自抗NY-ESO-1 TCR(1G4)的TCRα和β链的RNA以及不同组合的CD3亚基共电穿孔入293细胞，发现通过引入所有四种CD3亚基实现了最大的TCR/CD3表达。如图81和82中显示的，最大的T细胞功能通过共引入CD3的所有四种亚基以及TCR RNA实现。CD3和TCR亚基的多种组合显示了或多或少的T细胞功能增强，其中ε和ζ具有最高的功能。与单独的TCR或TCR与其它亚基相比，CD3ζ与TCRRNA显示了显著的功能增强。当仅三种或两种亚基比如δ+ε+ζ、γ+ε+ζ和ε+ζ被共电穿孔时表达CD3/TCR，其指示ε和ζ对TCR/CD3表达是相对必需的(图81和82)。通过共引入1G4α/βTCR以及不同组合的CD3亚基测试肿瘤特异性T细胞功能。图83是显示使用肿瘤细胞刺激的共电穿孔TCR RNA和CD3 RNA的T细胞中的CD107a上调的流式细胞术图组。图84、85和86显示了在使用不同的肿瘤细胞系培育后电穿孔有TCR RNA和不同组合的CD3 RNA的T细胞中的IFN-γ和IL-2表达。
因而，如果共电穿孔多种RNA链带来技术挑战，则在最低限度上，共引入CD3ε和ζ，或单独的CD3ζ，而不是所有四种亚基，可以是潜在的治疗剂。
通过将4-1BB胞内部分直接地融合至1G4 TCRα、CD3ζ和CD3ε的C’端来生成1G4 TCRα-41BB、CD3 ζ-41-BB和CD3 ε-4-1BB构建体。这些修饰的TCR或CD3构建体的RNA电穿孔显示了将4-1BB并入TCR复合体允许TCR表达和功能(图87和88)。添加共刺激信号至TCRα和/或β链或CD3ζ和/或CD3ε的C’端仍维持T细胞功能(图89-92)并且给T细胞潜在地提供直接的共刺激信号。
添加第二二硫键至TCR和从TCRβ链移除N-糖基化位点进一步增强电穿孔TCR RNA的T细胞的体外和体内功能二者(图93和94)。如图93中显示的，在TCRα和/或β链中制造突变并且不同组合的α和β被电穿孔入T细胞。发现了通过添加第二二硫键和从β链移除限定的N-糖基化位点(Sa/S-Db)(图93B)，发现最大转基因表达(图93A)和功能(裂解能力)(图93C和93D)。在动物实验中，具有至α或β链(m1G4)的第二二硫键的T细胞与电穿孔有野生型TCR(wt1G4)的T细胞或CD19 CART细胞进行比较(图94)。发现具有修饰的TCR(m1G4)的T细胞显示了比具有野生型TCR(wt1G4)的T细胞更好的治疗，其指示治疗可以通过使用第二二硫键和/或N-去糖基化修饰TCR而被改进。
令人感兴趣地，添加二硫键至TCRα链损害T细胞功能。图95是显示与添加二硫键至TCR或杂合TCR相比，TCRα链中的N-去糖基化损害电穿孔RNA的T细胞的功能的图像组。
为了确定具有源自小鼠TCR恒定区的恒定区的杂合TCR是否影响功能，包含鼠恒定区的杂合TCR被电穿孔入T细胞。图96是显示电穿孔有编码包含鼠恒定区的杂合TCR的RNA的T细胞的转基因表达和功能的图像组。图97是显示小鼠模型中的注射的肿瘤和杂合TCR T细胞随着时间的荧光的图像组。图98是图像组，其显示了与添加二硫键至TCR或杂合TCR相比，添加二硫键至α和β链，或使TCR的β链N-去糖基化增强电穿孔的T细胞的转基因表达和功能。
添加共刺激信号至TCR或CD3链的C’端维持T细胞功能并且给T细胞提供共刺激信号，其与CAR相似(图99-101)。图102显示了在用PD1-CD28 RNA和1G4 TCR RNA——有或没有CD27——慢病毒转导的T细胞中检测PD1和vb13.1。
图103是显示在第0天皮下注射5E6 A549-ESO(转导HLA-A2和NY-ESO-1的A549)的图。在第14天注射1×106个转导的T细胞并测量肿瘤大小。初步结果指示对于单独的TCR(1G4)没有效果，而对于CD27共刺激信号(1G4.CD27)，或PD1-CD28转换受体(PD1-CD28.1G4)，或CD27共刺激信号和PD1-CD28转换受体二者(PD1-CD28.1G4.CD27)肿瘤生长被延迟。
在图104中显示了能够非MHC限制的肿瘤抗原识别和功能性关联抗原识别的修饰的TCR的示意图。图105和106显示了当与双RNA技术组合时TCR识别关联MHC/肽和表面肿瘤抗原(如CAR分子)二者，而没有HLA限制。此外，IFN-γ(图107)和IL-2(图108)分泌在使用与共引入有双RNA的TCR修饰的T细胞中提高。
与野生型TCR(a+b)、野生型TCR加HA1修饰的CD3ε(a+b HA1-e)或高亲和力TCR(TCRly95)相比，当修饰的TCR与针对HA1和CD19的双RNA (a+b/HA1-e/aHA1-aCD19或HA1-A+b/aHA1-aCD19)一起共递送时，注射有Nalm6-ESO(i.v.)并且使用电穿孔有修饰的TCR的T细胞治疗的小鼠显示了改进的功效(图109)。
用TCRα(a)和β(b)，或ErbB2小分子(342、342.15、342或342.4)共电穿孔T细胞。如图110中显示的，在电穿孔小分子重定向的TCR(Affi-TCR)RNA的T细胞中检测到Vb13.1 TCR和His-标签。电穿孔的T细胞使用肿瘤细胞系Nalm-6-ESO(NY-eso-1+，ErbB2-)、A549-ESO(NY-eso-1+，ErbB2+)、SK-OV3(NY-eso-1-，ErbB2+)、A549(NY-eso-1-，ErbB2+)或Nalm6(NY-eso-1-，ErbB2-)进行刺激。然后评估细胞的CD107a表达。结果显示了具有ErbB2 Affi-TCR的T细胞特异性地识别Ny-ESO-1和ErbB2阳性肿瘤二者(图111)。添加特异于CD3ε的小分子最低程度地影响NY-ESO-1 TCR表达，如图112中显示的。与小分子修饰的TCR T细胞(EP2)的44.5％相比，发现共电穿孔Affi-CD3ε的T细胞是76.5％至82.9％CD8/vb13.1双阳性的(EP3至EP6)。添加特异于CD3ε的小分子最低程度地影响NY-ESO-1 TCR识别NY-ESO-1单阳性肿瘤Nalm6-ESO的能力，如图113中显示的。与小分子修饰的TCR T细胞(EP2)的33.1％相比，发现共电穿孔Affi-CD3ε的T细胞是49.5％至53.3％CD8/CD107a双阳性的(EP3至EP6)。
而且，共电穿孔Affi-CD3ε的T细胞(EP3至EP6)比Affibody修饰的TCR(EP2)显示了针对ErbB2阳性肿瘤SK-OV3和MDA231的更高的抗肿瘤活性(图113)。
其它实施方式
本文引用的每个和每种专利、专利申请和出版物的公开内容由此通过引用以其全部并入本文。虽然已经参照具体的实施方式公开了本发明，但是明显的是，本领域技术人员可以设计本发明的其它实施方式和变型而不背离本发明的真实精神和范围。所附权利要求意欲解释为包括所有这样的实施方式和等价变型。
序列表
<110> 宾夕法尼亚大学
赵阳兵
X·刘
C·琼
<120> 用于修饰的T细胞的方法和组合物
<130> 046483-7033WO1(01036)
<150> 62/073,467, 62/073,540, 62/073,681, 62/073,144, 62/073,343
<151> 2014-10-31
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
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aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 300
tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 360
gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 420
gaggagtacg acgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 480
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 540
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 600
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ccccctcgct aa 672
<210> 19
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 19
ggaggtggtg gatccgatat caaactgcag cagtcagggg ctgaactggc aagacctggg 60
gcctcagtga agatgtcctg caagacttct ggctacacct ttactaggta cacgatgcac 120
tgggtaaaac agaggcctgg acagggtctg gaatggattg gatacattaa tcctagccgt 180
ggttatacta attacaatca gaagttcaag gacaaggcca cattgactac agacaaatcc 240
tccagcacag cctacatgca actgagcagc ctgacatctg aggactctgc ggtctatttc 300
tgtgcaagat attatgatga tcattactgc cttgactact ggggccaagg caccactctc 360
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<210> 20
<211> 1500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 20
atgggctggt cttgcatcat cctgtttctg gtcgccaccg ccaccggggt ccacagtgag 60
atcgttctca cccaatcccc cgccacactg tcgctctccc caggcgagcg ggccacgctg 120
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<210> 21
<211> 1524
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 21
atgggctggt cctgtatcat attattcctg gtcgcgaccg ccaccggggt gcactccgac 60
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<210> 22
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<210> 23
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<223> 亲和抗体模拟物
<400> 23
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<212> DNA
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<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 24
atgggctggt cctgtatcat attattcctg gtcgcgaccg ccaccggggt gcactccgac 60
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<212> DNA
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<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 25
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<210> 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 26
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<210> 27
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<212> DNA
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<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 27
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<210> 28
<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 28
atgggctggt cttgcatcat cctgtttctg gtcgccaccg ccaccggggt ccacagtgag 60
atcgttctca cccaatcccc cgccacactg tcgctctccc caggcgagcg ggccacgctg 120
tcgtgtcgcg cgagccagag cgtttcctcc tacctcgcct ggtaccagca gaagccgggc 180
caggcccctc gcctgctgat ctacgatact tcgaatagag ccaccggtat ccctgcaagg 240
ttctccggat ccgggtcagg gacggatttc accctgacca tttcctccct ggagccagag 300
gatttcgccg tgtactactg ccagcagcgc agtaactggc ctctgacttt cggtggcggc 360
acaaaggtgg agatcaaggg gggcggcggc agtgggggcg ggggcagcgg gggcggaggc 420
tcgcaggtcc agctcgtgga gtcggggggg gacgtggtcc agccaggcag gagcctgagg 480
ctgtcatgcg ctgcgtccgg cctgacgttc accaactacg gcttccactg ggtgagacag 540
gcacccggga agggcctgga atgggtggcc gtgatctggt acgacgggag caagaagtac 600
tacgcagact cagtgaaggg ccgattcacc atcagccggg acaactctaa gaacacactg 660
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gacgactatt ggggacaggg caccctggtc acggtaagta gtggaggtgg tggatccgac 780
atccagatga cccagtcccc ttcctccctc tctgcctctg tgggagaccg cgttaccatc 840
acatgccgag cttcccagga cgtgaacaca gccgtggcct ggtaccagca gaagcccggg 900
aaggcaccca aactcctcat ctactccgcc tccttcctat acagtggcgt gccttcccga 960
ttctccggct ccaggagtgg cacggacttt acgctcacca ttagtagcct gcagcccgaa 1020
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cgctggggtg gggacggctt ctacgccatg gacgtgtggg gtcagggcac tctagttaca 1500
gtgtcatcct aa 1512
<210> 29
<211> 1536
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 29
atgggctggt cctgtatcat attattcctg gtcgcgaccg ccaccggggt gcactccgac 60
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<210> 30
<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 30
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<210> 31
<211> 1505
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 31
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<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 32
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<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 33
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<210> 34
<211> 1497
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 34
atgggctggt cttgcatcat cctgtttctg gtcgccaccg ccaccggggt ccacagtgag 60
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<210> 35
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<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 35
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<210> 36
<211> 1497
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 36
atggggtgga gttgcatcat tctgttcctc gtggcgaccg caacaggcgt gcacagcgag 60
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ctcagttgcg ccgcgtccgg attcacattt tccaactacg ggatgcactg ggtgcgccaa 540
gctccgggaa aggggctgga gtgggtggcc ctgatctggt acgacggttc caataagtac 600
tatgccgata gcgtgaaggg ccggttcacg atatccaggg ataactccaa gaacactctc 660
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atccagctga cccaatcacc gtcgtccctg tctgcctccg tgggcgaccg ggtgacgatc 840
acctgtagtg cctcgagcag tgtacggttc atccactggt accaacagaa gcccggcaag 900
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tcgggaagtg gtagtggcac agacttcact ctcaccatca gttcactcca gccggaggac 1020
tttgccacct actattgcca gcagtggtcc tcgtccccct ttaccttcgg ccagggaaca 1080
aaggtggaaa ttaagggttc gacctccggg gggggctccg gtgggggctc cggcgggggg 1140
ggctcatcgg aggttcagct ggtggagagc ggcggcggcc tggtgcagcc cggcgggagt 1200
ctgcggctgt cctgtgccgc cagcggcttc aacatcaagg actactacat tcactgggtg 1260
cggcaagccc caggcaaggg tctggagtgg gtggcttgga ttgaccctga aaacggcgac 1320
actgagttcg tgccaaaatt ccaggggcgg gcgaccatct ccgccgacac ctccaagaat 1380
acggcctacc tgcagatgaa ctccctgcgc gccgaagaca cagcggtcta ctactgcaag 1440
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<210> 37
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 37
atgggttgga gctgcatcat tctgttcctc gtggcgacgg ctaccggggt gcactcggat 60
atcgtgctga cccagtcgcc ggcaagcctc gccgtgtctc tggggcagag agctacaatc 120
tcatgcaaag ccagtcaaag tgtggattat gcgggggatt cgtacatgaa ctggtatcag 180
cagaagcccg ggcagcctcc caagctgttg atctacgcgg ctagtaacct ggagagcggg 240
atcccagctc ggttctccgg gtccgggtcc ggaaccgact tcaccctcaa catccatccg 300
gtcgaggagg aggatgcggc aacctactac tgccagcagt cgaatgaaga tccgtacact 360
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gggggcggcg gctctcaggt ccagctgcaa cagtcaggcc ctgaactggt aaagcccggc 480
gcttcggtta aaatctcgtg taaggcttcc gggtacgcgt tctcctcctc ctggatgaac 540
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ggcgacacaa actacaatgg caagttcaag gggaaggcta ctctcaccgc agataagtcc 660
tcgtctactg cttacatgca acttagtagc ctcacctcag aggattccgc cgtgtatttc 720
tgcgcccgat ccgattacta tggcgattac ggatttgcat attggggaca aggcaccctg 780
gttacggtca gcgccggagg tggtggatcc caggtacaac tgcagcagtc tgggcctgag 840
ctggagaagc ctggcgcttc agtgaagata tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact 900
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<210> 38
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 38
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggctaccg ccaccggtgt tcactccgat 60
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tacggtgctg ggacaaagtt ggaaatcaaa taa 1533
<210> 39
<211> 1524
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 39
atgggctggt cctgcatcat tctgttcctg gtggccaccg ccacgggggt gcactccgac 60
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<210> 40
<211> 1545
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 40
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<210> 41
<211> 1545
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 41
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggctaccg ccaccggtgt tcactccgat 60
atcgtcatga cccagtcgcc agactccctt gctgtaagcc tgggggagcg cgccaccatc 120
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<210> 42
<211> 1536
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 42
atgggctggt cctgcatcat tctgttcctg gtggccaccg ccacgggggt gcactccgac 60
attcagatga cccagtcccc ctcaagtctg tcagccagtg tgggcgaccg tgtgacaatc 120
acctgcaggg cctctaagtc cgtgtccact tcggggtact cattcatgca ctggtaccag 180
cagaagcccg gcaaagcacc caagctgctg atctacgtgg ggagccgcct ggactatggc 240
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gggtcactcc gactgagctg cgctgcatcc gggttcacct tcagctcgta taccatgagc 540
tgggtgcgcc aggcccccgg gaagggcctg gagtgggtgt ctgtgatcga ccacgggggc 600
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<210> 43
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 43
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<210> 44
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 44
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<210> 45
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 45
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ctccaacccg aagacttcgc gacgtactac tgccaacact cccgcgagct gccctggact 360
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ggcggcggag gaagtgaggt gcagctgctg gagtcgggcg gaggcctggt gcagcctggg 480
gggtcactcc gactgagctg cgctgcatcc gggttcacct tcagctcgta taccatgagc 540
tgggtgcgcc aggcccccgg gaagggcctg gagtgggtgt ctgtgatcga ccacgggggc 600
gggtccacgc attatcccga tagcgtcaag ggccggttca cgatctcgcg cgacaactct 660
aagaatactc tgtacctgca gatgaactcc ctgcgcgccg aagacactgc ggtgtactat 720
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<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 46
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atcgtgctga cccagtcgcc ggcaagcctc gccgtgtctc tggggcagag agctacaatc 120
tcatgcaaag ccagtcaaag tgtggattat gcgggggatt cgtacatgaa ctggtatcag 180
cagaagcccg ggcagcctcc caagctgttg atctacgcgg ctagtaacct ggagagcggg 240
atcccagctc ggttctccgg gtccgggtcc ggaaccgact tcaccctcaa catccatccg 300
gtcgaggagg aggatgcggc aacctactac tgccagcagt cgaatgaaga tccgtacact 360
ttcggcgggg gcaccaagct cgagataaag ggaggaggcg gctctggcgg gggaggatct 420
gggggcggcg gctctcaggt ccagctgcaa cagtcaggcc ctgaactggt aaagcccggc 480
gcttcggtta aaatctcgtg taaggcttcc gggtacgcgt tctcctcctc ctggatgaac 540
tgggtcaagc agcgcccagg aaagggcctg gagtggattg gccggatcta tccgggcgat 600
ggcgacacaa actacaatgg caagttcaag gggaaggcta ctctcaccgc agataagtcc 660
tcgtctactg cttacatgca acttagtagc ctcacctcag aggattccgc cgtgtatttc 720
tgcgcccgat ccgattacta tggcgattac ggatttgcat attggggaca aggcaccctg 780
gttacggtca gcgccggagg tggtggatcc gacatccaga tgacacagac tacatcctcc 840
ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagt 900
aaatatttaa attggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctaccat 960
acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat 1020
tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag 1080
ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt 1140
ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga 1200
cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca 1260
ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg 1320
ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac tataattcag ctctcaaatc cagactgacc 1380
atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgac 1440
gacacagcca tttactactg tgccaaacat tattactacg gtggtagcta cgctatggac 1500
tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc tcctctaa 1538
<210> 47
<211> 1538
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 47
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggctaccg ccaccggtgt tcactccgat 60
atcgtcatga cccagtcgcc agactccctt gctgtaagcc tgggggagcg cgccaccatc 120
aactgtaaag ccagtcagtc cgttgattac gccggcgagt cattcatgaa ctggtaccag 180
cagaagcccg gccagcctcc taagctactg atctacgccg cgtccaatct ggagtcgggc 240
gtcccagacc gcttttccgg cagcgggtcg ggtaccgatt tcaccctgac gatctcctcg 300
ctccaggccg aggatgtggc cgtgtattac tgccagcaga gtaacgagga tccatacacc 360
ttcggccagg gaactaagct cgagatcaaa gggggcggcg gctccggcgg cgggggctcc 420
ggcggagggg gcagtgaggt gcagctggtg cagtctggcg cagaggtgaa gaaacccgga 480
gagtcgctca agatctcgtg caagggctcg ggctacgcct tttcgagttc gtggatgaac 540
tgggtgcgtc agatgcccgg caagggcctg gagtggatgg gccggatcta tgcgggggat 600
gcagataccg cgtactcgcc gtcgtttcag ggccaggtta ccatcagcgc ggacaaaagt 660
atttccacgg cgtacctgca gtggagttcc ctcaaggcgt ccgacaccgc catgtactac 720
tgcgcccgca gtgactacta tggggactac gggtttgcat actggggtca ggggaccctg 780
gtgaccgtgt catcgggagg tggtggatcc gacatccaga tgacacagac tacatcctcc 840
ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagt 900
aaatatttaa attggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctaccat 960
acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat 1020
tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag 1080
ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt 1140
ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga 1200
cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca 1260
ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg 1320
ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac tataattcag ctctcaaatc cagactgacc 1380
atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgac 1440
gacacagcca tttactactg tgccaaacat tattactacg gtggtagcta cgctatggac 1500
tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc tcctctaa 1538
<210> 48
<211> 1529
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 48
atgggctggt cctgcatcat tctgttcctg gtggccaccg ccacgggggt gcactccgac 60
attcagatga cccagtcccc ctcaagtctg tcagccagtg tgggcgaccg tgtgacaatc 120
acctgcaggg cctctaagtc cgtgtccact tcggggtact cattcatgca ctggtaccag 180
cagaagcccg gcaaagcacc caagctgctg atctacgtgg ggagccgcct ggactatggc 240
gtgccttcgc gcttttcggg cagcggatcg ggcactgatt tcactctgac catctcctca 300
ctccaacccg aagacttcgc gacgtactac tgccaacact cccgcgagct gccctggact 360
ttcggacagg gcaccaaggt tgagattaaa ggcgggggcg ggtcaggcgg gggcggctcc 420
ggcggcggag gaagtgaggt gcagctgctg gagtcgggcg gaggcctggt gcagcctggg 480
gggtcactcc gactgagctg cgctgcatcc gggttcacct tcagctcgta taccatgagc 540
tgggtgcgcc aggcccccgg gaagggcctg gagtgggtgt ctgtgatcga ccacgggggc 600
gggtccacgc attatcccga tagcgtcaag ggccggttca cgatctcgcg cgacaactct 660
aagaatactc tgtacctgca gatgaactcc ctgcgcgccg aagacactgc ggtgtactat 720
tgtgccaggc accgcggcaa cccattcgac tactggggcc agggcaccct ggtcacagtc 780
tcctccggag gtggtggatc cgacatccag atgacacaga ctacatcctc cctgtctgcc 840
tctctgggag acagagtcac catcagttgc agggcaagtc aggacattag taaatattta 900
aattggtatc agcagaaacc agatggaact gttaaactcc tgatctacca tacatcaaga 960
ttacactcag gagtcccatc aaggttcagt ggcagtgggt ctggaacaga ttattctctc 1020
accattagca acctggagca agaagatatt gccacttact tttgccaaca gggtaatacg 1080
cttccgtaca cgttcggagg ggggaccaag ctggagatca caggtggcgg tggctcgggc 1140
ggtggtgggt cgggtggcgg cggatctgag gtgaaactgc aggagtcagg acctggcctg 1200
gtggcgccct cacagagcct gtccgtcaca tgcactgtct caggggtctc attacccgac 1260
tatggtgtaa gctggattcg ccagcctcca cgaaagggtc tggagtggct gggagtaata 1320
tggggtagtg aaaccacata ctataattca gctctcaaat ccagactgac catcatcaag 1380
gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa atgaacagtc tgcaaactga cgacacagcc 1440
atttactact gtgccaaaca ttattactac ggtggtagct acgctatgga ctactggggc 1500
caaggaacct cagtcaccgt ctcctctaa 1529
<210> 49
<211> 1029
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 49
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc 540
ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg gcctttatta ttttctgggt gctttactgc 600
aaccacagga accgaagacg tgtttgcaaa tgtccccggc ctgtggtcaa atcgggagac 660
aagcccagcc tttcggcgag atacgtcctg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 720
cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 780
gagtacgacg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 840
aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 900
tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 960
cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1020
cctcgctaa 1029
<210> 50
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 50
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc 540
ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg gcctttatta ttttctgggt gtgtgtcagg 600
tgccggcacc gaaggcgcca agcagagcgg atgtctcaga tcaagagact cctcagtgag 660
aagaagacct gccagtgccc tcaccggttt cagaagacat gtagccccat tctgagagtg 720
aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg tacaagcagg gccagaacca gctctataac 780
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gacgttttgg acaagagacg tggccgggac 840
cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 900
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 960
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1020
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc taa 1053
<210> 51
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 51
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc 540
ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag 600
aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc 660
cgcaagcatt accagcccta tgccccacca cgcgacttcg cagcctatcg ctccgataga 720
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 780
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 840
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 900
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 960
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1020
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgctaa 1056
<210> 52
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲和抗体模拟物
<400> 52
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc 540
ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg gcctttatta ttttctgggt gcggggcaga 600
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 660
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga agatagagtg 720
aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 780
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 840
cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 900
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 960
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1020
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc taa 1053

Claims (214)

1.修饰的T细胞，其包括编码T细胞受体(TCR)的外源性核酸和电穿孔的编码双特异性抗体的RNA，所述T细胞受体(TCR)包括对靶细胞上的抗原的亲和力，其中所述T细胞在所述T细胞的表面上表达所述TCR和双特异性抗体。
2.权利要求1所述的修饰的T细胞，其中所述TCR包括至少一个二硫键。
3.权利要求1所述的修饰的T细胞，其中所述TCR包括TCRα和β链。
4.权利要求3所述的修饰的T细胞，其中所述TCR包括在所述链的至少一个的C’端处的共刺激信号传导结构域。
5.权利要求4所述的修饰的T细胞，其中所述共刺激信号传导结构域是4-1BB共刺激信号传导结构域。
6.权利要求3所述的修饰的T细胞，其中所述β链包括至少一个N-去糖基化。
7.权利要求3所述的修饰的T细胞，其中所述α链包括至少一个N-去糖基化。
8.权利要求1所述的修饰的T细胞，其中所述TCR包括至少一个鼠恒定区。
9.权利要求1所述的修饰的T细胞，其中所述TCR与野生型TCR相比具有对所述靶细胞抗原的更高的亲和力。
10.权利要求1所述的修饰的T细胞，其中所述靶细胞抗原选自病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤细胞相关抗原(TAA)、疾病细胞相关抗原和其任意片段。
11.权利要求1所述的修饰的T细胞，其中所述双特异性抗体包括选自合成抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段、单结构域抗体、其抗原结合片段、和其任意组合的双特异性抗原结合结构域。
12.权利要求11所述的修饰的T细胞，其中所述双特异性抗原结合结构域包括第一单链可变片段(scFv)分子和第二单链可变片段(scFv)分子。
13.权利要求12所述的修饰的T细胞，其中所述第一scFv分子特异于靶细胞上的至少一种抗原和所述第二scFv分子特异于活化T细胞上的抗原。
14.权利要求13所述的修饰的T细胞，其中所述活化T细胞抗原选自CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、TCR、PD1和PD1L。
15.权利要求1所述的修饰的T细胞，进一步包括电穿孔的编码共刺激分子的核酸。
16.权利要求15所述的修饰的T细胞，其中所述共刺激分子选自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1和PD1L。
17.用于生成修饰的T细胞的方法，其包括将编码修饰的T细胞受体(TCR)的核酸引入T细胞和引入编码双特异性抗体的核酸，所述修饰的T细胞受体(TCR)包括对靶细胞上的抗原的亲和力，其中所述T细胞能够表达所述TCR和双特异性抗体。
18.权利要求17所述的方法，其中所述T细胞获得自外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系。
19.权利要求17所述的方法，其中所述核酸包括体外转录的RNA或合成RNA。
20.权利要求17所述的方法，进一步包括扩展所述T细胞。
21.权利要求20所述的方法，其中所述扩展包括使用选自flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3和c-kit配体的因子培养所述T细胞。
22.权利要求20所述的方法，其中所述扩展包括使所述T细胞电穿孔有编码嵌合膜蛋白的RNA并且培养所述电穿孔的T细胞。
23.权利要求22所述的方法，其中所述嵌合膜蛋白包括抗CD3的单链可变片段(scFv)和包括CD28和4-1BB的胞内结构域的片段的胞内结构域。
24.权利要求17所述的方法，进一步包括冷藏所述T细胞。
25.权利要求24所述的方法，在将所述核酸引入所述T细胞之前进一步解冻所冷藏的T细胞。
26.权利要求17所述的方法，其中编码所述TCR的核酸包括编码TCRα链和TCRβ链的核酸。
27.权利要求26所述的方法，其中引入所述核酸包括共电穿孔编码所述TCRα链的RNA和编码所述TCRβ链的分开的RNA。
28.权利要求17所述的方法，进一步包括将编码CD3的RNA电穿孔入所述T细胞。
29.权利要求28所述的方法，其中所述CD3RNA与TCR核酸被共电穿孔。
30.权利要求17所述的方法，进一步包括在引入所述TCR核酸后冷藏所述T细胞。
31.权利要求17所述的方法，进一步包括将所述双特异性抗体表达为膜蛋白。
32.权利要求17所述的方法，进一步包括冷藏引入所述双特异性抗体的T细胞。
33.权利要求1所述的T细胞在制造用于治疗需要其的对象中的免疫应答的药物中的用途。
34.用于刺激针对对象中的靶细胞或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用有效量的修饰的T细胞，所述修饰的T细胞电穿孔有编码修饰的T细胞受体(TCR)的RNA和编码双特异性抗体的RNA，其中所述修饰的T细胞表达所述修饰的TCR和双特异性抗体。
35.权利要求34所述的方法，进一步包括诱导所述靶细胞或组织的裂解。
36.权利要求35所述的方法，其中所述诱导的裂解是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
37.用于过继细胞转移疗法的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象以预防或治疗不利于所述对象的免疫反应，其中所述修饰的T细胞已经电穿孔有编码修饰的T细胞受体(TCR)的RNA和编码双特异性抗体的RNA。
38.治疗与对象中增强的免疫性相关联的疾病或病症的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象，其中所述修饰的T细胞已经电穿孔有编码修饰的T细胞受体(TCR)的RNA和编码双特异性抗体的RNA。
39.治疗对象中的病症的方法，其包括给所述对象施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1所述的修饰的T细胞。
40.权利要求39所述的方法，其中所述病症是自身免疫性疾病。
41.权利要求40所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、乳糜泻-疱疹样皮炎；慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、疤痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、CREST综合征、克罗恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、青少年慢性关节炎(斯提耳氏病)、青少年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动炎症、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性全身性硬化症(PSS)，也称为全身性硬化症(SS))、斯耶格伦氏综合征、僵体综合征、系统性红斑狼疮、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、眼葡萄膜炎、白斑病、韦格纳氏肉芽肿病和其任意组合。
42.权利要求39所述的方法，其中所述病症是癌症。
43.权利要求42所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌和其任意组合。
44.组合物，其包括权利要求1所述的修饰的T细胞。
45.药物组合物，其包括权利要求1所述的修饰的T细胞和药学上可接受的载体。
46.修饰的T细胞，其包括编码双特异性抗体的核酸和编码嵌合配体工程化活化受体(CLEAR)的核酸，所述双特异性抗体包括对靶细胞上的抗原和所述T细胞上的抗原的双特异性，其中所述T细胞表达所述双特异性抗体和CLEAR。
47.权利要求46所述的修饰的T细胞，其中所述CLEAR包括胞内活化结构域和胞外结构域。
48.权利要求46所述的修饰的T细胞，其中所述胞内活化结构域包括CD3ζ的胞内活化结构域的一部分。
49.权利要求46所述的修饰的T细胞，其中所述胞外结构域选自抗体的抗原结合结构域、受体的配体结合结构域、抗原和配体。
50.权利要求46所述的修饰的T细胞，其中所述胞外结构域选自CD27、CD28、CD70、CD80、PD1和PD-L1。
51.权利要求46所述的修饰的T细胞，其中所述胞外结构域能够结合至肿瘤抗原。
52.权利要求46所述的修饰的T细胞，所述CLEAR进一步包括共刺激结构域。
53.权利要求52所述的修饰的T细胞，其中所述共刺激结构域选自CD4、CD8和4-1BB。
54.权利要求46所述的修饰的T细胞，其中所述靶细胞抗原选自病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤细胞相关抗原(TAA)、疾病细胞相关抗原和其任意片段。
55.权利要求46所述的修饰的T细胞，其中所述双特异性抗体包括选自合成抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段、单结构域抗体、其抗原结合片段、和其任意组合的双特异性抗原结合结构域。
56.权利要求55所述的修饰的T细胞，其中所述双特异性抗原结合结构域包括第一可变片段(scFv)分子和第二单链可变片段(scFv)分子。
57.权利要求56所述的修饰的T细胞，其中所述第一scFv分子特异于靶细胞上的至少一种抗原和所述第二scFv分子特异于所述T细胞上的抗原。
58.权利要求46所述的修饰的T细胞，其中所述双特异性抗体包括对所述靶细胞上的抗原和所述T细胞上的所述CLEAR的双特异性。
59.权利要求46所述的修饰的T细胞，进一步包括编码共刺激分子的核酸。
60.权利要求58所述的修饰的T细胞，其中所述共刺激分子选自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1和PD1L。
61.权利要求45所述的T细胞在制造用于治疗需要其的对象中的免疫应答的药物中的用途。
62.用于生成修饰的T细胞的方法，其包括将编码双特异性抗体的核酸和编码嵌合配体工程化活化受体(CLEAR)的核酸引入T细胞，其中所述T细胞能够表达所述双特异性抗体和所述CLEAR。
63.权利要求62所述的方法，其中所述核酸中的至少一种通过选自转导所述T细胞、转染所述T细胞和电穿孔所述T细胞的方法引入。
64.权利要求62所述的方法，其中所述T细胞获得自外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系。
65.权利要求62所述的方法，其中所述核酸中的至少一种包括体外转录的RNA或合成RNA。
66.权利要求62所述的方法，进一步包括扩展所述T细胞。
67.权利要求66所述的方法，其中所述扩展包括使用选自flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3和c-kit配体的因子培养所述T细胞。
68.权利要求66所述的方法，其中所述扩展包括使所述T细胞电穿孔有编码嵌合膜蛋白的RNA，并且培养所述电穿孔的T细胞。
69.权利要求68所述的方法，其中所述嵌合膜蛋白包括抗CD3的单链可变片段(scFv)和包括CD28和4-1BB的胞内结构域的片段的胞内结构域。
70.权利要求62所述的方法，进一步包括冷藏所述T细胞。
71.权利要求70所述的方法，在将所述核酸引入所述T细胞之前进一步解冻所冷藏的T细胞。
72.权利要求62所述的方法，进一步包括在引入所述CLEAR核酸后冷藏所述T细胞。
73.权利要求62所述的方法，进一步包括将所述双特异性抗体表达为膜蛋白。
74.权利要求62所述的方法，进一步包括冷藏引入所述双特异性抗体的T细胞。
75.用于刺激针对对象中的靶细胞或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用有效量的修饰的T细胞，所述修饰的T细胞包括编码嵌合配体工程化活化受体(CLEAR)的核酸和编码双特异性抗体的核酸，所述双特异性抗体具有对所述靶细胞上的抗原和所述T细胞上的所述CLEAR的双特异性，其中所述修饰的T细胞表达所述CLEAR和双特异性抗体。
76.权利要求75所述的方法，进一步包括诱导所述靶细胞或组织的裂解。
77.权利要求76所述的方法，其中所述诱导的裂解是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
78.用于过继细胞转移疗法的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象以预防或治疗不利于所述对象的免疫反应，其中所述修饰的T细胞包括编码嵌合配体工程化活化受体(CLEAR)的核酸和编码特异性抗体的核酸，所述双特异性抗体具有对所述靶细胞上的抗原和所述T细胞上的所述CLEAR的双特异性。
79.治疗与对象中增强的免疫性相关联的疾病或病症的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象，其中所述修饰的T细胞包括编码嵌合配体工程化活化受体(CLEAR)的核酸和编码双特异性抗体的核酸，所述双特异性抗体具有对所述靶细胞上的抗原和所述T细胞上的所述CLEAR的双特异性。
80.治疗对象中的病症的方法，其包括给所述对象施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括权利要求46所述的修饰的T细胞。
81.权利要求80所述的方法，其中所述病症是自身免疫性疾病。
82.权利要求81所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、乳糜泻-疱疹样皮炎；慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、疤痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、CREST综合征、克罗恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、青少年慢性关节炎(斯提耳氏病)、青少年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动炎症、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性全身性硬化症(PSS)，也称为全身性硬化症(SS))、斯耶格伦氏综合征、僵体综合征、系统性红斑狼疮、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、眼葡萄膜炎、白斑病、韦格纳氏肉芽肿病和其任意组合。
83.权利要求80所述的方法，其中所述病症是癌症。
84.权利要求83所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌和其任意组合。
85.组合物，其包括权利要求46所述的修饰的T细胞。
86.药物组合物，其包括权利要求46所述的修饰的T细胞和药学上可接受的载体。
87.修饰的T细胞，其包括编码亲和分子嵌合受体的核酸，所述亲和分子嵌合受体包括具有对靶细胞上的抗原的亲和力的小分子胞外结构域，其中所述T细胞表达所述亲和分子嵌合受体。
88.权利要求87所述的修饰的T细胞，其中所述靶细胞抗原选自病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤细胞相关抗原(TAA)、疾病细胞相关抗原和其任意片段。
89.权利要求87所述的修饰的T细胞，其中所述小分子胞外结构域包括缺少二硫桥的螺旋结构。
90.权利要求87所述的修饰的T细胞，其中所述小分子胞外结构域小于大约10kD。
91.权利要求87所述的修饰的T细胞，其中所述亲和分子嵌合受体进一步包括胞内信号传导结构域。
92.权利要求91所述的修饰的T细胞，其中所述胞内信号传导结构域是CD3信号传导结构域。
93.权利要求87所述的修饰的T细胞，其中所述亲和分子嵌合受体进一步包括共刺激信号传导结构域。
94.权利要求93所述的修饰的T细胞，其中所述共刺激信号传导结构域是4-1BB共刺激信号传导结构域。
95.权利要求87所述的修饰的T细胞，其中所述亲和分子嵌合受体进一步包括跨膜结构域。
96.权利要求95所述的修饰的T细胞，其中所述跨膜结构域是CD8跨膜结构域。
97.权利要求87所述的修饰的T细胞，其中所述亲和分子嵌合受体进一步包括TCR可变结构域和TCR恒定结构域。
98.权利要求87所述的修饰的T细胞，进一步包括编码共刺激分子的核酸。
99.权利要求98所述的修饰的T细胞，其中所述共刺激分子选自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1和PD1L。
100.权利要求99所述的修饰的T细胞，其中所述CD3包括至少两种不同的CD3链。
101.权利要求100所述的修饰的T细胞，其中所述不同的CD3链是CD3ζ和CD3ε链。
102.修饰的细胞，其包括编码双特异性亲和分子的核酸，所述双特异性亲和分子包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域，其中至少一个亲和结构域包括小分子抗原结合结构域并且所述细胞表达所述双特异性亲和分子。
103.权利要求102所述的修饰的细胞，其中能够结合所述靶细胞抗原的所述亲和结构域选自所述小分子抗原结合结构域和抗体的抗原结合结构域。
104.权利要求102所述的修饰的细胞，其中能够结合所述活化T细胞抗原的所述亲和结构域选自所述小分子抗原结合结构域和抗体的抗原结合结构域。
105.权利要求102所述的修饰的细胞，其中所述小分子抗原结合结构域包括缺少二硫桥的螺旋结构。
106.权利要求102所述的修饰的细胞，其中所述小分子抗原结合结构域每个小于大约10kD。
107.权利要求102所述的修饰的细胞，其中所述靶细胞抗原选自肿瘤相关抗原(TAA)、细菌抗原、寄生虫抗原、病毒抗原和其任意片段。
108.权利要求102所述的修饰的细胞，其中所述活化T细胞抗原是选自CD3、CD4、CD8、T细胞受体(TCR)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和与CD83特异性地结合的配体、和其任意片段的共刺激分子。
109.权利要求87所述的修饰的细胞，其用于治疗需要其的对象中的免疫应答的方法。
110.权利要求102所述的修饰的细胞，其用于治疗需要其的对象中的免疫应答的方法。
111.权利要求102所述的修饰的细胞，其中所述细胞选自T细胞、B细胞、天然杀伤细胞和抗原呈递细胞。
112.用于生成修饰的T细胞的方法，其包括将编码亲和分子嵌合受体的核酸引入T细胞群，所述亲和分子嵌合受体包括对靶细胞上的抗原具有亲和力的小分子胞外结构域，其中所述T细胞能够表达所述亲和分子嵌合受体。
113.权利要求112所述的方法，其中所述核酸通过选自转导所述T细胞群、转染所述T细胞群和电穿孔所述T细胞群的方法引入。
114.权利要求115所述的方法，其中所述核酸的引入包括将编码所述亲和分子嵌合受体的RNA电穿孔。
115.权利要求114所述的方法，进一步包括将编码CD3的RNA电穿孔入所述T细胞。
116.权利要求115所述的方法，其中所述CD3RNA与编码所述亲和分子嵌合受体的核酸被共电穿孔。
117.权利要求112所述的方法，其中所述T细胞获得自外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系。
118.权利要求112所述的方法，进一步包括在引入所述亲和分子嵌合受体核酸后冷藏所述T细胞。
119.权利要求112所述的方法，进一步包括扩展所述T细胞。
120.权利要求119所述的方法，其中所述扩展包括使用选自flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3和c-kit配体的因子培养所述T细胞。
121.权利要求119所述的方法，其中所述扩展包括使所述T细胞电穿孔有编码嵌合膜蛋白的RNA，并且培养所述电穿孔的T细胞。
122.权利要求121所述的方法，其中所述嵌合膜蛋白包括抗CD3的单链可变片段(scFv)和包括CD28和4-1BB的胞内结构域的片段的胞内结构域。
123.权利要求112所述的方法，进一步包括冷藏所述T细胞。
124.权利要求123所述的方法，进一步包括在将所述亲和分子嵌合受体核酸引入所述T细胞之前解冻所冷藏的T细胞。
125.用于生成修饰的细胞的方法，其包括将编码双特异性亲和分子的核酸引入细胞群，所述双特异性亲和分子包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域，其中至少一个亲和结构域包括小分子抗原结合结构域并且所述细胞表达所述双特异性亲和分子。
126.权利要求125所述的方法，其中所述核酸通过选自转导所述细胞群、转染所述细胞群和电穿孔所述细胞群的方法引入。
127.权利要求125所述的方法，其中所述细胞群包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞或抗原呈递细胞。
128.权利要求125所述的方法，进一步包括使用所述双特异性亲和分子使所述活化T细胞和所述靶细胞结合。
129.权利要求87所述的修饰的T细胞或权利要求102所述的修饰的细胞在制造用于治疗需要其的对象中的免疫应答的药物中的用途。
130.用于过继细胞转移疗法的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象以预防或治疗不利于所述对象的免疫反应，其中所述修饰的T细胞包括编码亲和分子嵌合受体的核酸，所述亲和分子嵌合受体包括对靶细胞上的抗原具有亲和力的小分子胞外结构域。
131.用于过继细胞转移疗法的方法，其包括施用修饰的细胞群至需要其的对象以预防或治疗不利于所述对象的免疫反应，其中所述修饰的细胞包括编码双特异性亲和分子的核酸，所述双特异性亲和分子包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域，其中至少一个亲和结构域包括小分子抗原结合结构域。
132.治疗与对象中增强的免疫性相关联的疾病或病症的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象，其中所述修饰的T细胞包括编码亲和分子嵌合受体的核酸，所述亲和分子嵌合受体包括对靶细胞上的抗原具有亲和力的小分子胞外结构域。
133.治疗与对象中增强的免疫性相关联的疾病或病症的方法，其包括施用修饰的细胞群至需要其的对象，其中所述修饰的细胞包括编码双特异性亲和分子的核酸，所述双特异性亲和分子包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域，其中至少一个亲和结构域包括小分子抗原结合结构域。
134.治疗对象中的病症的方法，其包括给所述对象施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括权利要求87所述的T细胞或权利要求102所述的修饰的细胞。
135.权利要求134所述的方法，其中所述病症是自身免疫性疾病。
136.权利要求135所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、乳糜泻-疱疹样皮炎；慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、疤痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、CREST综合征、克罗恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、青少年慢性关节炎(斯提耳氏病)、青少年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动炎症、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性全身性硬化症(PSS)，也称为全身性硬化症(SS))、斯耶格伦氏综合征、僵体综合征、系统性红斑狼疮、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、眼葡萄膜炎、白斑病、韦格纳氏肉芽肿病和其任意组合。
137.权利要求134所述的方法，其中所述病症是癌症。
138.权利要求137所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌和其任意组合。
139.用于刺激针对对象中的靶细胞或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用有效量的修饰的T细胞，其中所述T细胞包括编码亲和分子嵌合受体的核酸，所述亲和分子嵌合受体包括对靶细胞上的抗原具有亲和力的小分子胞外结构域。
140.用于刺激针对对象中的靶细胞或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用有效量的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞包括编码双特异性亲和分子的核酸，所述双特异性亲和分子包括能够结合靶细胞上的抗原的亲和结构域和能够结合活化T细胞上的抗原的亲和结构域，其中至少一个亲和结构域包括小分子抗原结合结构域。
141.权利要求139或140中任一项所述的方法，进一步包括诱导所述靶细胞或组织的裂解。
142.权利要求139或140中任一项所述的方法，其中所述诱导的裂解是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
143.组合物，其包括权利要求87所述的修饰的T细胞或权利要求102所述的修饰的细胞。
144.药物组合物，其包括权利要求87所述的修饰的T细胞或权利要求102所述的修饰的细胞和药学上可接受的载体。
145.修饰的T细胞，其包括电穿孔的编码双特异性T细胞衔接器(BiTE)分子的RNA，其中所述BiTE分子包括对靶细胞上的抗原和选自CD3、CD4、CD8和TCR的活化T细胞上的抗原的双特异性。
146.权利要求145所述的修饰的T细胞，其中所述靶细胞抗原选自病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤细胞相关抗原(TAA)、疾病细胞相关抗原和其任意片段。
147.权利要求145所述的修饰的T细胞，其中所述双特异性抗体包括选自合成抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段、单结构域抗体、其抗原结合片段、和其任意组合的双特异性抗原结合结构域。
148.权利要求147所述的修饰的T细胞，其中所述双特异性抗原结合结构域包括第一单链可变片段(scFv)分子和第二单链可变片段(scFv)分子。
149.权利要求148所述的修饰的T细胞，其中所述第一scFv分子特异于靶细胞上的至少一种抗原和所述第二scFv分子特异于活化T细胞上的抗原。
150.用于生成修饰的T细胞的方法，其包括：
扩展T细胞群；和
使用编码双特异性抗体的RNA电穿孔所述扩展的T细胞，其中所述电穿孔的T细胞能够表达所述双特异性抗体。
151.权利要求150所述的方法，其中所述T细胞获得自外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系。
152.权利要求150所述的方法，其中所述RNA包括体外转录的RNA或合成RNA。
153.权利要求450所述的方法，其中所述扩展包括使用选自flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3和c-kit配体的因子培养所述T细胞。
154.权利要求150所述的方法，其中所述扩展包括使所述T细胞电穿孔有编码嵌合膜蛋白的RNA并且培养所述电穿孔的T细胞。
155.权利要求154所述的方法，其中所述嵌合膜蛋白包括抗CD3的单链可变片段(scFv)和包括CD28和4-1BB的胞内结构域的片段的胞内结构域。
156.权利要求150所述的方法，进一步包括冷藏所述扩展的T细胞。
157.权利要求156所述的方法，进一步包括解冻所冷藏的T细胞，以便电穿孔有编码所述双特异性抗体的RNA。
158.权利要求150所述的方法，进一步包括将所述双特异性抗体表达为膜蛋白。
159.权利要求150所述的方法，进一步包括冷藏电穿孔所述双特异性抗体的T细胞。
160.用于刺激针对对象中的靶细胞或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用有效量的修饰的T细胞，所述修饰的T细胞包括电穿孔的编码双特异性T细胞衔接器(BiTE)分子的RNA，所述双特异性T细胞衔接器(BiTE)分子包括对靶细胞上的抗原和选自CD3、CD4、CD8和TCR的活化T细胞上的抗原的双特异性。
161.权利要求160所述的方法，进一步包括诱导所述靶细胞或包括所述靶细胞的组织的裂解。
162.权利要求160所述的方法，其中所述诱导的裂解是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
163.用于过继细胞转移疗法的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象以预防或治疗不利于所述对象的免疫反应，其中所述修饰的T细胞已经被扩展并且电穿孔有编码双特异性T细胞衔接器(BiTE)分子的RNA，所述双特异性T细胞衔接器(BiTE)分子包括对靶细胞上的抗原，和选自CD3、CD4、CD8和TCR的活化T细胞上的抗原的双特异性。
164.治疗与对象中增强的免疫性相关联的疾病或病症的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象，其中所述修饰的T细胞已经被扩展并且电穿孔有编码双特异性T细胞衔接器(BiTE)分子的RNA，所述双特异性T细胞衔接器(BiTE)分子包括对靶细胞上的抗原，和选自CD3、CD4、CD8和TCR的活化T细胞上的抗原的双特异性。
165.治疗对象中的病症的方法，其包括给所述对象施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括权利要求145所述的修饰的T细胞。
166.权利要求165所述的方法，其中所述免疫应答是自身免疫性疾病。
167.权利要求166所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、乳糜泻-疱疹样皮炎；慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、疤痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、CREST综合征、克罗恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、青少年慢性关节炎(斯提耳氏病)、青少年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动炎症、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性全身性硬化症(PSS)，也称为全身性硬化症(SS))、斯耶格伦氏综合征、僵体综合征、系统性红斑狼疮、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、眼葡萄膜炎、白斑病、韦格纳氏肉芽肿病和其任意组合。
168.权利要求165所述的方法，其中所述病症是癌症。
169.权利要求168所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌和其任意组合。
170.权利要求145所述的修饰的T细胞在制造用于治疗需要其的对象中的免疫应答的药物中的用途。
171.组合物，其包括权利要求145所述的修饰的T细胞。
172.药物组合物，其包括权利要求145所述的修饰的T细胞和药学上可接受的载体。
173.修饰的T细胞，其包括编码T细胞受体(TCR)的外源性核酸，所述T细胞受体(TCR)包括对靶细胞上的表面抗原的亲和力；和编码共刺激分子的核酸，其中所述T细胞表达所述TCR和所述共刺激分子。
174.权利要求173所述的修饰的T细胞，其中所述TCR包括至少一个二硫键。
175.权利要求173所述的修饰的T细胞，其中所述TCR包括TCRα和β链。
176.权利要求175所述的修饰的T细胞，其中所述TCR包括在所述链的至少一个的C’端处的共刺激信号传导结构域。
177.权利要求176所述的修饰的T细胞，其中所述共刺激信号传导结构域是4-1BB共刺激信号传导结构域。
178.权利要求175所述的修饰的T细胞，其中所述β链包括至少一个N-去糖基化。
179.权利要求175所述的修饰的T细胞，其中所述α链包括至少一个N-去糖基化。
180.权利要求173所述的修饰的T细胞，其中所述TCR包括至少一个鼠恒定区.
181.权利要求173所述的修饰的T细胞，其中所述编码共刺激分子的核酸被电穿孔入所述T细胞。
182.权利要求181所述的修饰的T细胞，其中所述共刺激分子选自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1和PD1L。
183.权利要求182所述的修饰的T细胞，其中所述CD3包括至少两种不同的CD3链。
184.权利要求183所述的修饰的T细胞，其中所述不同的CD3链是CD3ζ和ε链。
185.权利要求173所述的修饰的T细胞，其中所述TCR与野生型TCR相比具有对所述靶细胞抗原的更高的亲和力。
186.权利要求173所述的修饰的T细胞，其中所述靶细胞抗原选自病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤细胞相关抗原(TAA)、疾病细胞相关抗原和其任意片段。
187.用于生成修饰的T细胞的方法，其包括：
将编码T细胞受体(TCR)的核酸引入T细胞，所述T细胞受体(TCR)包括对靶细胞上的表面抗原的亲和力；和
将编码共刺激分子的核酸引入所述T细胞，其中所述T细胞能够表达所述TCR和所述共刺激分子。
188.权利要求187所述的方法，其中所述核酸中的至少一种通过选自转导所述T细胞、转染所述T细胞和电穿孔所述T细胞的方法引入。
189.权利要求187所述的方法，其中所述T细胞获得自外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系。
190.权利要求187所述的方法，其中所述核酸中的至少一种包括体外转录的RNA或合成RNA。
191.权利要求187所述的方法，进一步包括扩展所述T细胞。
192.权利要求191所述的方法，其中所述扩展包括使用选自flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3和c-kit配体的因子培养所述T细胞。
193.权利要求191所述的方法，其中所述扩展包括使所述T细胞电穿孔有编码嵌合膜蛋白的RNA并且培养所述电穿孔的T细胞。
194.权利要求193所述的方法，其中所述嵌合膜蛋白包括抗CD3的单链可变片段(scFv)和包括CD28和4-1BB的胞内结构域的片段的胞内结构域。
195.权利要求187所述的方法，进一步包括冷藏所述T细胞。
196.权利要求195所述的方法，进一步包括在将编码所述TCR的核酸引入所述T细胞之前解冻所冷藏的T细胞。
197.权利要求187所述的方法，其中编码所述TCR的核酸包括编码TCRα链和TCRβ链的核酸。
198.权利要求198所述的方法，其中引入所述核酸包括将编码所述TCRα链的RNA和编码所述TCRβ链的分开的RNA共电穿孔。
199.权利要求187所述的方法，其中引入编码所述共刺激分子的核酸包括将编码CD3的RNA电穿孔入所述T细胞。
200.权利要求199所述的方法，其中所述CD3RNA与TCR核酸被共电穿孔。
201.权利要求187所述的方法，进一步包括在引入所述TCR核酸后冷藏所述T细胞。
202.权利要求173所述的修饰的T细胞在制造用于治疗需要其的对象中的免疫应答的药物中的用途。
203.用于刺激针对对象中的靶细胞或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用有效量的修饰的T细胞，其中所述T细胞已经被扩展并且电穿孔有编码修饰的T细胞受体(TCR)的RNA，所述修饰的T细胞受体(TCR)包括对靶细胞上的表面抗原的亲和力。
204.权利要求203所述的方法，进一步包括诱导所述靶细胞或组织的裂解。
205.权利要求204所述的方法，其中所述诱导的裂解是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
206.用于过继细胞转移疗法的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象以预防或治疗不利于所述对象的免疫反应，其中所述修饰的T细胞已经被扩展并且电穿孔有编码修饰的T细胞受体(TCR)的RNA，所述修饰的T细胞受体(TCR)包括对靶细胞上的表面抗原的亲和力。
207.治疗与对象中增强的免疫性相关联的疾病或病症的方法，其包括施用修饰的T细胞群至需要其的对象，其中所述修饰的T细胞已经被扩展并且电穿孔有编码修饰的T细胞受体(TCR)的RNA，所述修饰的T细胞受体(TCR)包括对靶细胞上的表面抗原的亲和力。
208.治疗对象中的病症的方法，其包括给所述对象施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括权利要求173所述的修饰的T细胞。
209.权利要求208所述的方法，其中所述免疫应答是自身免疫性疾病。
210.权利要求209所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、乳糜泻-疱疹样皮炎；慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、疤痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、CREST综合征、克罗恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、青少年慢性关节炎(斯提耳氏病)、青少年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动炎症、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性全身性硬化症(PSS)，也称为全身性硬化症(SS))、斯耶格伦氏综合征、僵体综合征、系统性红斑狼疮、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、眼葡萄膜炎、白斑病、韦格纳氏肉芽肿病和其任意组合。
211.权利要求208所述的方法，其中所述病症是癌症。
212.权利要求211所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌和其任意组合.
213.组合物，其包括权利要求173所述的修饰的T细胞。
214.药物组合物，其包括权利要求173所述的修饰的T细胞和药学上可接受的载体。
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