CN101772494B

CN101772494B - 4-嘧啶磺酰胺衍生物

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Publication number: CN101772494B
Application number: CN2008801016796A
Authority: CN
Inventors: 马汀·波利; 克里斯多夫·博斯; 亚历山大·崔柏
Original assignee: Actelion Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Aidu West Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2007-08-17
Filing date: 2008-08-15
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2028-08-15
Also published as: CY1113255T1; BRPI0815360B8; FR24C1047I2; MX2010001837A; ES2394584T3; TWI411437B; EP2190837A1; LTPA2024534I1; BRPI0815360B1; AU2008290234B2; CA2695511C; NL301304I2; CN101772494A; AU2008290234A1; BRPI0815360A8; HRP20120878T1; RU2010109543A; EP2190837B1; PL2190837T3; NO2024053I1

Abstract

本发明关于一种结构式I的化合物及其盐

Description

4-嘧啶磺酰胺衍生物

本发明关于{5-(4-溴-苯基)-6-[2-(5-溴-嘧啶-2-基氧基)-乙氧基]-嘧啶-4-基}-磺酰胺及其盐，一种制备该化合物的方法及其在医药中的用途。

{5-(4-溴-苯基)-6-[2-(5-溴-嘧啶-2-基氧基)-乙氧基]-嘧啶-4-基}-磺酰胺具有式I

式I化合物为一种内皮素受体抑制剂且适用为内皮素受体拮抗剂。式I化合物为先前在WO 02/053557中揭示的结构族中新成员。

申请者现在吃惊的发现式I化合物当与WO 02/053557中具体公开的结构相近的化合物相比时，具有改良的性质。具体而言，式I化合物虽然表现内皮素受体拮抗剂活性，但相对于相应的烷基化衍生物，在体内表现更长半衰期及较低清除率。此使得式I化合物特别适于长效性医药组合物。

因其有能力抑制内皮素结合，因此式I化合物可用于治疗与因内皮素提高血管收缩、增生或发炎相关的疾病。此等疾病的实例为高血压、肺高血压、冠心病、心功能不全、肾及心肌缺血、肾衰竭、大脑缺血、痴呆、偏头痛、蛛网膜下腔出血、雷诺氏综合症(Raynaud′s syndrome)、指头溃疡及门静脉高血压。其亦可用于治疗或预防动脉粥样硬化、气囊或支架血管成形术后再狭窄、发炎、胃及十二指肠溃疡、癌、黑素瘤、前列腺癌、前列腺肥大、勃起障碍、听力损失、黑内障(amaurosis)、慢性支气管炎、哮喘、肺纤维化、革兰氏阴性败血病、休克、镰刀形红细胞贫血病、肾小球肾炎、肾绞痛、青光眼、结缔组织疾病，治疗及预防糖尿病并发症、脉管或心脏手术或器官移植后的并发症、环孢菌素治疗并发症、疼痛、高血脂及目前已知与内皮素相关的其它疾病。

式I化合物及其医药上可接受的盐因此可作为药物，例如用于肠内或胃肠外给药的医药组合物形式。

术语″医药上可接受的盐″指无毒性、无机或有机酸及/或碱加成盐。参考″Salt selection for basic drugs″，Int.J.Pharm.(1986)，33，201-217。

本发明因此首先关于式I化合物或其盐(具体而言，医药上可接受的盐)。

本发明还关于式I化合物或其医药上可接受的盐作为药物。

本发明进一步关于一种医药组合物，该医药组合物包含作为活性成分的式I化合物或其医药上可接受的盐，及至少一种治疗上无活性的赋形剂。

此外，式I化合物及其医药上可接受的盐可用于制备药物，及适于治疗高血压、肺动脉高血压(尤其肺高动脉压)、冠心病、心功能不全、肾及心肌缺血、肾衰竭、大脑缺血、痴呆、偏头痛、蛛网膜下腔出血、雷诺氏综合症、指头溃疡或门静脉高血压及用于治疗或预防动脉粥样硬化、气囊或支架血管成形术后再狭窄、发炎、胃及十二指肠溃疡、癌、黑素瘤、前列腺癌、前列腺肥大、勃起障碍、听力损失、黑内障、慢性支气管炎、哮喘、肺纤维化、革兰氏阴性败血病、休克、镰刀形红细胞贫血病、肾小球肾炎、肾绞痛、青光眼、结缔组织疾病、糖尿病并发症、脉管或心脏手术或器官移植后的并发症、环孢菌素治疗并发症、疼痛、高血脂。

更具体而言，式I化合物及其医药上可接受的盐可用于制备药物，且适于治疗选自由高血压、肺高血压(包括肺动脉高血压)、糖尿病性动脉病变、心力衰竭、勃起障碍及心绞痛组成的组中的疾病。

根据本发明特别优选的变体，式I化合物及其医药上可接受的盐可用于制备药物，且适于治疗高血压(尤其高动脉压)。

根据本发明另一项特别优选的变体，式I化合物及其医药上可接受的盐可用于制备药物，且适于治疗肺高血压(尤其肺高动脉压)。

式I化合物可如WO 02/053557中描述或申请书中以下部分描述(尤其实施例)制造。

医药组合物制法可按照本领域的技术人员熟悉的方式进行(参考例如Remington，The Science and Practice ofPharmacy，21st Edition(2005)，Part 5，″PharmaceuticalManufacturing″[published by Lippincott Williams &Wilkins])，将所述式I化合物或其医药上可接受的盐(任选地与其它具治疗价值的物质组合)与适宜的无毒性、无活性且治疗上可兼容的固体或液态载体(如需要，可使用常用的医药佐药)一起形成盖伦剂型。

式I化合物可根据本发明利用以下所述步骤制造。

式I化合物制法

缩写：

本申请书及实施例全文均采用以下缩写：

Ac 乙酰基

aq. 水性

br. 宽

Boc 叔丁氧基羰基

t-Bu 叔丁基

DAD 二极管阵列监测器

DBU 1，8-重氮双环(5.4.0)十一碳-7-烯

DCM 二氯甲烷

DMAP 4-二甲胺基吡啶

DME 1，2-二甲氧基乙烷

DMF N，N-二甲基甲酰胺

DMSO 二甲亚砜

EA 乙酸乙酯

ET 内皮素

ether 乙醚

Hex 己烷

HV 高真空条件

LC 液相层析法

MeOH 甲醇

MS 质谱分析

NMR 核磁共振

org. 有机

rt 室温

TEA 三乙胺

THF 四氢呋喃

TLC 薄层层析

t_R 滞留时间

一般制备方法

式I化合物可根据下文所示一般反应顺序，采用实施例所示方法或类似方法制造。最佳反应条件随使用的特定反应物或溶剂而变，但此反应条件可由本领域的技术人员按照常规最佳步骤确定。仅叙述一些产生式I化合物的合成可能性。

因此得到的式I化合物(如需要)可经标准方法转化为其盐，且尤指其医药上可接受的盐。

式I化合物可由式I-1化合物裂解保护基团PG后得到

其中PG代表适宜的保护基团。适宜的保护基团PG为例如苯甲基，其可经例如BCl₃或BBr₃裂解(例如在如氯仿的溶剂中)，或4-甲氧基-或2，4-二甲氧基苯甲基，其可经例如硝酸铈铵(例如在如乙腈与水的混合物的溶剂中)或2，3-二氯-5，6-二氰-苯醌(例如在如DCM、1，2-二氯乙烷、丙酮或甲苯的溶剂中，在水存在或不存在下)氧化裂解。

由式I-2化合物与式I-3化合物反应可制备式I-1化合物

其中G₁代表活性基团，如氯或溴原子，或甲磺酰基或乙磺酰基，其是在强碱存在下(例如LiH、NaH、CaH₂等)，于溶剂中(例如THF、DMF、二噁烷等或其混合物)中进行。有几种式I-3化合物可通过商购获得，其它可由本领域的技术人员应用标准方法制备。

式I-2化合物制法可由式I-4化合物

(其中G₂代表活性基团，例如卤原子，优选氯)与乙二醇在碱存在下(例如叔丁醇钾、NaH、LiH等)，在另一种溶剂(例如1，2-乙二醇二甲醚、THF、二噁烷等)存在或不存在下，尤其在1，2-乙二醇二甲醚存在下，优选在高温下(例如50-100℃之间，尤其在80-100℃之间)进行反应。

由式I-5化合物与式I-6化合物反应可制备式I-4化合物，

其是在碱存在下进行，例如叔丁醇钾、TE A、乙基-二异丙基胺等，或优选是与式I-6化合物的盐(优选钾盐)反应，其是在溶剂中(例如DMSO、DMF、THF等或其混合物)，在另一种碱存在或不存在下，于温度20-80℃之间，优选在20-40℃之间进行。

可例如：以POCl₃、PCl₃、PCl₅或其混合物、或POBr₃处理式I-7化合物，制备式I-5化合物

其是在氯化四乙铵、三乙胺、或二甲基-或二乙基苯胺存在或不存在下，及在另一种溶剂存在或不存在下，例如氯仿、1，2-二氯乙烷、甲苯、二甲苯、或乙腈，在高温下(例如60-120℃之的间)进行。

可由式I-8化合物与甲脒或其盐反应，制备式I-7化合物

其中R代表烷基，优选是甲基或乙基，其是类似文献中步骤进行(例如A.Gomtsyan等人，J.Me d.Chem.(2002)，45，3639-3648；W.Neidhart等人，Chimia(1996)，50，519-524)。

类似文献的步骤(例如J.Lee，J.-H.Lee，S.Y.Kim，N.A.Perry，N.E.Lewin，J.A.Ayres，P.M.Blumberg，Bioorg.Med.Chem.14(2006)，2022-2031)，由自商购得到的4-溴苯基乙酸制备式I-8的2-(4-溴-苯基)-丙二酸酯。

可类似文献方法(e.g.G.Dewynter et al.，Tetrahedron(1993)，49，65-76；S.Ghassemi，K.Fuchs，MolecularDiversity(2005)，9，295-299；J.-Y.Winum et al.，OrganicLetters(2001)，3，2241-2243)以三步骤法由氯磺酰异氰酸酯制备式I-6磺酰胺。在第一步中，由氯磺酰异氰酸酯与叔丁醇反应；在第二步中，与适当胺PG-NH₂反应生成式I-6化合物的经Boc保护的中间物。在第三步中，在酸性条件下裂解Boc-基团，得到式I-6化合物。或者，式I-6化合物可以类似文献中所示步骤(例如：R.E.Olson，et al.，J.Med.Chem.(1999)，42，1178-1192，and literature cited therein)，通过将适当的式I-9胺磺酰基氯中间物与氨反应而得到

本发明制法：

本发明因此关于一种制备上述式I化合物的方法，该方法包含以下步骤：

a)由式I-2_B化合物与式I-3化合物反应

其中G₁代表氯或溴原子或甲磺酰基或乙磺酰基(尤其氯原子)，其是在强碱存在下进行，及

b)利用BCl₃或BBr₃去除步骤a)中得到的式I-1_B化合物的苯甲基

上述方法中步骤a)优选是在选自由THF、DMF及二噁烷的溶剂组成的组中或选自由THF、DMF及二噁烷组成的溶剂混合物(例如THF与DMF混合物)中进行。上述方法步骤a)中强碱优选为由LiH、NaH及CaH₂组成的组。对于步骤a)，该反应优选在温度20℃至溶剂沸点间进行，尤其在温度20℃-70℃之间。

上述方法步骤b)优选自由氯仿及DCM组成的组中的溶剂中、或氯仿及DCM混合物中(例如氯仿)，优选在温度20℃-40℃之间，尤其在温度20℃至30℃之间进行。

根据上述方法的优选变体，式I-2_B化合物将由″一般制备方法″部分中，基于该同一部分中所述的另一步骤所定义的式I-4化合物(PG为苯甲基)制备。根据该变体，式I-4化合物本身可优选由式I-5化合物及式I-6化合物(其中PG为苯甲基)制备，此二者均如″一般制备方法″部分中基于同一部分中所述的另一步骤所定义(PG为苯甲基)(该式I-5化合物及式I-6化合物可由″一般制备方法″部分中所述的另一步骤制备)。

上述方法也用于制备式I化合物的盐(具体而言，医药上可接受的盐)。在此情况下，该方法包括转化步骤b中得到的式I化合物为其盐(具体而言，其医药上可接受的盐)的额外步骤。

本发明的特定实施方式在以下实施例中描述，其更详细阐述本发明且未限制其范围。

实施例

以下实施例根据下述步骤制备。所有化合物通过以下方式表征：¹H-NMR(300MHz)及偶尔采用¹³C-NMR(75MHz)(Varian Oxford，300MHz；化学位移是相对于所用溶剂，以ppm表示；多峰性：s＝单峰，d＝双峰，t＝三峰，m＝多峰)，LC-MS(Finnigan Navigator with HP 1100二元泵与DAD，管柱：4.6×50mm，Develosil RP Aqueous，5μm，120A，梯度：5-95％乙腈的水溶液，1min，含0.04％三氟乙酸，流量：4.5ml/min)，t_R为分钟；TLC(TLC-板来自Merck，硅胶60 F₂₅₄)及偶尔采用熔点定性。

制备A：苯甲基磺酰胺钾盐：

A.i.苯甲基磺酰胺：

氯磺酰异氰酸酯(14.14g)溶于DCM(50mL)中及冷却至0℃。在30分钟内添加叔丁醇(9.6mL)的DCM(50mL)溶液。在室温下再搅拌30分钟。然后，因此将得到的溶液在一小时内加入苯甲基胺(10.7g)及TEA(15.32mL)的DCM(200mL)溶液中。继续在室温下搅拌10小时。混合物在真空下浓缩，溶于EA(500mL)及经水(2×40mL)与盐水(30mL)冲洗，用MgSO₄干燥，过滤。滤液真空浓缩及粗产物从EA中结晶及在HV下干燥得到N-苯甲基-N′-叔-丁氧羰基磺酰胺(13.68g)。¹HNMR(CDCl₃)：δ1.46(s，9H)；4.25(s，2H)；5.42(s br.，1H)；7.30-7.40(m，5H)。

LC-MS：t_R＝0.90min，[M+H]⁺＝287.09。

该物质溶于二噁烷(20ml)及在室温下于1小时内加入4MHCl的二噁烷溶液(120mL)。先搅拌混合物8小时后才蒸发溶剂，残留物在HV下干燥，得到灰白色粉末的苯甲基磺酰胺(9.47g)。

¹H NMR(D₆-DMSO)：δ4.05(d，J＝6.4Hz，2H)；6.60(s，2H)；7.04(s，J＝6.4Hz，1H)；7.20-7.36(m，5H)。

LC-MS：t_R＝0.60min，[M+H+CH₃CN]⁺＝228.17。

A.ii.苯甲基磺酰胺钾盐：

将叔丁醇钾(10.8g)小心加入苯甲基磺酰胺(17.98g)的MeOH(300mL)溶液中。蒸发溶剂前，混合物在室温下搅拌15分钟。在HV下干燥残留的残质，得到灰白色粉末的苯甲基磺酰胺钾盐(21.73g)。

制备B：5-(4-溴-苯基)-4，6-二氯-嘧啶：

B.i.4-溴苯基乙酸甲酯：

滴加亚硫酰氯(34.2mL)于4-溴苯基乙酸(50g)的甲醇(250ml)溶液中，其中反应混合物温度保持在0-5℃。完全加入后，停止冷却，及使混合物回至室温。真空去除溶剂前，先继续搅拌75分钟。黄色油溶于苯中及再浓缩。残质溶于EA，经水、盐水、2N Na₂CO₃、及再一次经盐水冲洗。有机提取物用MgSO₄干燥、过滤、浓缩及在HV、于85℃下干燥30分钟，得到所需产物，为黄色油状物(52.4g)。

¹H-NMR(D₆-DMSO)：δ3.60(s，3H)；3.67(s，2H)；7.22(d，8.5，2H)；7.50(d，J＝8.5Hz，2H)。

B.ii.2-(4-溴苯基)-丙二酸二甲酯：

40℃下，将中间物B.i(52g)的THF(100mL)溶液在40分钟内小心加入NaH(15.6g)的无水THF(450mL)悬浮液中。在无加热下连续搅拌70分钟及温度降至27℃。待气体停止释出后，滴加碳酸二甲酯(76.42mL)，同时混合物温度保持在29-31℃之间。在室温下持续搅拌22小时。混合物冷却至-10℃，然后经HCl水溶液调节至pH 6-7后，在真空下去除大量THF。残质溶于EA(700mL)，用1N HCl水溶液冲洗3次及经盐水冲洗一次，用MgSO₄干燥。蒸发大部分EA后，加入己烷。使产物在4℃下过夜而析出结晶。收集晶体、经己烷冲洗及干燥得到所需产物，为浅黄色晶体(45.9g)。

¹H-NMR(D₆-DMSO)：δ3.66(s，6H)；5.07(s，1H)；7.30-7.34(m，2H)；7.55-7.59(m，2H)。

B.iii.5-(4-溴苯基)-嘧啶-4，6-二醇：

0℃下，将中间物B.ii(11.73g)的MeOH(100mL)溶液中加入到钠(2.83g)的甲醇(100mL)溶液中。混合物于室温下搅拌18小时后，加入甲脒盐酸盐(4.10g)。悬浮液在室温下搅拌4小时。去除溶剂及残质悬浮于10％柠檬酸水溶液(100mL)中及搅拌10分钟。收集白色沉淀，用10％柠檬酸水溶液、水冲洗，从环己烷中蒸发三次及在HV、于40℃下干燥得到5-(4-溴苯基)-嘧啶-4，6-二醇，为浅米色粉末(9.90g)。

¹H-NMR(D₆-DMSO)：δ7.43-7.48(m，2H)，7.50-7.55(m，2H)，8.13(s，1H)，12.1(s br.，2H)。

LC-MS：t_R＝0.62min，[M+H]⁺＝266.89/268.89(溴-同位素)。

B.iv.5-(4-溴-苯基)-4，6-二氯-嘧啶：

将N，N-二甲基苯胺(13.5mL)小心加入到5-(4-溴苯基)-嘧啶-4，6-二醇(9.90g)的POCl₃(130mL)悬浮液中。加热混合物至130℃2小时。真空浓缩深褐色溶液，残质注入冰/水中。悬浮液经2N HCl及水稀释，搅拌20分钟。收集形成的沉淀及用水冲洗。固体物质溶于EA，经1N HCL水溶液及盐水冲洗。有机相用MgSO₄干燥及蒸发。物质进一步经硅胶管柱层析法纯化，用Hex∶EA为95∶5至1∶1洗脱，然后在-20℃下，从Hex/EA中结晶，得到4，6-二氯-5-(4-溴苯基)-嘧啶，为浅黄色晶体(8.3g)。

¹H-NMR(D₆-DMSO)：δ7.39-7.44(m，2H)，7.72-7.76(m，2H)，8.94(s，1H)。

LC-MS：t_R＝1.02min。

实施例1：{5-(4-溴-苯基)-6-[2-(5-溴-嘧啶-2-基氧基)-乙氧基]-嘧啶-4-基}-磺酰胺：

1.i.苯甲基-胺磺酸[6-氯-5-(4-溴苯基)-嘧啶-4-基]-酰胺：

将5-(4-溴苯基)-4，6-二氯-嘧啶(4.00g，13.2mmol)与苯甲基磺酰胺钾盐(7.38g，32.9mmol)的DMSO(30mL)溶液在室温下搅拌24小时后，用10％柠檬酸水溶液(200mL)稀释。形成的悬浮液过滤。收集的固体用水冲洗及在HV、于40℃下干燥48小时，得到所需产物，为白色粉末(6.15g)。

¹H NMR(CDCl₃)：δ4.23(d，J＝5.9Hz，2H)；5.94(t br.，J＝6Hz，1H)；7.05(d，J＝8.2Hz，2H)；7.20-7.35(m，5H)；7.68(d，J＝8.2Hz，2H)；8.61(s，1H)。

LC-MS：t_R＝1.02min，[M+H]⁺＝452.95。

1.ii.苯甲基-胺磺酸[5-(4-溴苯基)-6-(2-羟乙氧基)嘧啶-4-基]-酰胺

将叔丁醇钾(18.5g，164.5mmol)分批加入中间物1.i(7.46g，16.4mmol)的乙二醇(50mL)悬浮液中。混合物变热及浓稠，并用DME(75mL)稀释。在95℃下搅拌混合物24小时后，用水(50mL)及10％柠檬酸水溶液(250mL)稀释前将混合物冷却至室温。乳状悬浮液用EA(2×300mL)提取。合并的有机提取物用MgSO₄干燥、经过滤及浓缩滤液。残留的结晶固体悬浮于MeOH中，经收集，经MeOH冲洗及于HV下干燥得到所需产物，为白色结晶粉末(6.49g)。

¹H NMR(CDCl₃)：δ2.50(t br.，J＝6Hz，1H)；3.80-3.88(m，2H)；4.20(d，J＝5.9Hz，2H)；4.46-4.50(m，2H)；5.99(t br.，J＝6.4Hz，1H)；6.85(s br.，1H)；7.12(d，J＝8.2Hz，2H)；7.23-7.34(m，5H)；7.64(d，J＝8.2Hz，2H)；8.44(s，1H)。

LC-MS：t_R＝0.93min，[M+H]⁺＝479.08。

1.iii.苯甲基-胺磺酸[5-(4-溴苯基)-6-{2-(5-溴-嘧啶-2-基氧基)-乙氧基}-嘧啶-4-基]-酰胺：

将NaH(1.77g，40.6mmol，55％矿物油分散液)小心加入中间物1.ii(6.49g，13.5mmol)的THF(120mL)溶液中。将混合物搅拌10分钟后，加入2-氯-5-溴-嘧啶(3.93g，20.3mmol)。混合物用DMF(15mL)稀释，然后在室温下搅拌20分钟。加热混合物至60℃且搅拌3小时后，再一次冷却至室温。反应用水及10％柠檬酸水溶液(250mL)中止，混合物用EA提取(2×300mL)。有机提取物用水冲洗。合并，用MgSO₄干燥，过滤及蒸发滤液溶剂。粗产物从MeOH/醚中结晶。收集结晶物，用另一份MeOH/醚冲洗及于HV下干燥得到所需产物，为白色粉末(6.47g)。

¹H NMR(CDCl₃)：δ4.20(d，J＝6.4Hz，2H)；4.59-4.64(m，2H)；4.69-4.74(m，2H)；5.98(t br.，J＝6.4Hz，1H)；6.83(s br.，1H)；7.06-7.10(m，2H)；7.24-7.34(m，5H)；7.54-7.58(m，2H)；8.44(s，1H)；8.50(s，2H)。

LC-MS：t_R＝1.06min，[M+H]⁺＝634.98。

1.iv.{5-(4-溴-苯基)-6-[2-(5-溴-嘧啶-2-基氧基)-乙氧基]-嘧啶-4-基}-磺酰胺：

将三溴化硼(25.5mL，1M DCM)溶液缓慢加入中间物1.iii(6.50g，10.2mmol)的氯仿(250mL)溶液中。混合物变浑浊及分离油状残留物。在室温下搅拌混合物。在6、24及33小时后，加入另一部分BBr₃溶液(5mL)。在最后一次加入BBr₃后，再激烈搅拌该米色悬浮液2小时，然后小心添加MeOH中止反应。混合物变得温热及澄清。溶液以冷水(0℃，2×150mL)冲洗。冲洗液用DCM再提取。合并的有机提取液再经水冲洗、用MgSO₄干燥、过滤及浓缩。粗产物经CC在硅胶上，通过庚烷：EA为1∶1的乳剂洗脱纯化，然后从DCM中结晶。经纯化的结晶物在HV下，于45℃干燥48小时，得到所需产物，为白色结晶粉末(1.62g)。

¹H NMR(CDCl₃)：δ4.60-4.65(m，2H)，4.71-4.74(m，2H)，5.50(s br，2H)，7.10(s br，1H)，7.13-7.17(m，2H)，7.55-7.59(m，2H)，8.49(s，2H)，8.50(s，1H)。

LC-MS：t_R＝0.93min，[M+H]⁺＝544.70。

本发明化合物的药理学性质

1)对内皮素与携载人类ET受体的CHO细胞的膜的结合的抑制作用

实验方法：

对于竞争结合实验，使用表达人类重组体ET_A或ET_B受体的CHO细胞的膜。以重组体CHO细胞制备微粒体膜，如以前的描述进行结合实验(Breu V.，et al，FEBS Lett.(1993)，334，210)。

实验在200μL 50mM pH 7.4包含25mM MnCl₂、1mMEDTA及0.5％(w/v)BSA的Tris/HCl缓冲液中，于聚丙烯微量滴定板中进行。在20℃下，使用8pM[¹²⁵I]ET-1(4000cpm)及浓度逐渐增加的无标记的拮抗剂孵育包含0.5μg蛋白质的膜2小时。分别估计未经及经100nM ET-1处理的样品的最大及最小结合性。2小时后，膜在包含GF/C滤器的滤板上过滤(Unifilterplates来自瑞士苏黎士Canberra Packard S.A.公司)。在每孔中加入50μL闪烁液(MicroScint 20，瑞士苏黎士Canberra Packard S.A.公司)，滤板于微板计数器中计数(TopCount，瑞士苏黎士Canberra Packard S.A.公司)。

溶解所有测试化合物，稀释及加入DMSO中。实验在已发现不会明显干扰结合性的2.5％DMSO存在下进行。IC₅₀为抑制50％ET-1特定结合的拮抗剂浓度。已发现参考化合物的IC₅₀值如下：ET_A细胞：对于ET-1为0.075nM(n＝8)及对于ET-3为118nM(n＝8)；ET_B细胞：对于ET-1为0.067nM(n＝8)及对于ET-3为0.092nM(n＝3)。

结果：

式I化合物得到的IC₅₀值示于下表1中。

表1

2)对内皮素所诱发已分离的大鼠主动脉环(ET_A受体)及大鼠气管环(ET_B受体)收缩的抑制性

实验方法：

由内皮素拮抗剂对内皮素-1所引起大鼠主动脉环(ET_A受体)收缩及对由角蝰毒素S6c所引起大鼠气管环(ET_B受体)收缩的抑制作用分析内皮素拮抗剂的功能性抑制力。成年Wistar大鼠经麻醉及放血。胸主动脉或气管被切除、解剖且切成3-5mm环节。温和擦破内膜表面去除内皮/上皮。每个环悬浮于保持在37℃、10mL填充有Krebs-Henseleit溶液(以mM计：NaCl 115，KCl 4.7，MgSO₄ 1.2，KH₂PO₄ 1.5，NaHCO₃ 25，CaCl₂ 2.5，葡萄糖10)及经95％O₂及5％CO₂充气的离体器官浴槽中。环与测力传感器连接及记录等长张力(法国巴黎EMKATechnologies SA公司)。拉伸环至3g(主动脉)或2g(气管)的静止张力。与测试化合物或其媒剂孵育10分钟后，加入累积剂量的ET-1(主动脉)或角蝰毒素S6c(气管)。计算浓度比，评估测试化合物的功能性抑制力，即不同浓度测试化合物所引起EC₅₀的右移。EC₅₀为达到最大收缩力的一半值时所需要的内皮质浓度，pA₂为引起EC₅₀数值移动两倍时的拮抗剂浓度的负对数值。

结果：

式I化合物得到的pA₂数值(n＝3)示于下表2中。

表2

大鼠口服单一剂量后的药物动力学

实验方法：

进行实验的动物

体重为200-250g的Wistar雄性大鼠在适应至少7天后，进行药物动力学实验。所有动物培养在根据NIH方针的条件下。在实验前两天，大鼠用氯胺酮(90mg/kg)及甲苯噻嗪2％(10mg/kg)混合物腹腔注射麻醉。在无菌条件下，将导管植入颈静脉中以允许多次采血。全身麻醉恢复后，在标准实验条件下，将动物单独地收容于具有钢丝网顶端及标准化软木材垫的Makrolon型-3笼中。在恢复期及整个实验期间，动物可自由获取水及食物。

实验步骤

药物动力学实验在Wistar大鼠(m＝2-3)颈静脉插管供连续采血后进行。测试化合物通过强饲法以10mg/kg的剂量口服。然后在24小时期间，于预定时间点处采血及离心制备血浆。血浆中药物浓度利用连接质谱分析的液相层析法进行定量分析(定量限值：4.6ng/mL)。利用非分区分析评价药物动力学。

结果：

在大鼠中测量式I化合物及WO 02/053557的参考化合物的半衰期t_1/2及清除率CL，见下表3。

表3

人体口服多剂量后的药物动力学

实验方法：

该实验以双盲、以安慰剂为对照组、随机、上升剂量进行I期实验。

加入该实验的受试者

每种测试量剂量包括筛检期间核查合格的8位健康男性，进行临床研究。

合格受试者必须符合以下所有标准：

·男性年龄在20至50(含)岁之间；

·依据病历且经筛选评价为健康者；

·体质量指数在18至28kg/m²之间；

·正常血压(BP)及脉搏率(PR)，即10分钟仰卧后，SBP：100-140mmHg，DBP：50-90mmHg及PR：45-90bpm(包含限值)；

·12-导联心电图无临床上相关异常；

·血液学、生物化学及尿分析实验结果未超出临床上相关程度的标准范围；

·药物筛检呈阴性结果(可卡因、大麻素类、鸦片制剂、苯并二氮呯、巴比妥酸盐、三环抗抑郁药、美沙酮、及安非他命)；

·可使用当地语言与调查员交流的能力，并理解及遵守研究要求。

合格者必需不具以下任一淘汰标准：

·在筛选前3年内，酒精中毒或药物滥用的病历或临床现象；

·筛选前3年内，任何病史或临床现象及/或存在会干扰研究药物的吸收、分配、新陈代谢或排泄的任何手术或医学症状(即，受损的肝脏或肾功能、糖尿病、心血管异常、胰腺疾病、严重便秘或腹泻慢性症状、或其它与胃肠道相关的急性症状，仅允许阑尾切除术或疝切开术)；

·B或C型肝炎病史及/或出现急性或慢性B或C型肝炎的肝炎血清呈阳性结果(接种疫苗者除外)；

·HIV血清呈阳性结果；

·吸烟；

·对任何药物有临床相关过敏或严重有害反应的病历；

·筛选检查前3个月内曾参与另一临床研究；

·第一次摄取药物前两周曾经或并行接受任何医药疗法(处方或OTC)；

·研究前3个月内曾流失250ml或更多血液；

·筛选前4星期内曾出现临床相关病症(例如，急性细菌、病毒、或真菌感染)。

并行疗法、饮食方面、酒精、吸烟、身体活动

除非该处理法出现不良反应，否则不允许进行并行疗法。

受试者在研究第1及10天时，于摄取药物前10小时至摄取药物后4小时期间禁食。研究期间，受试者接受以下标准食物：

·在第-1天及第2至第11天进食早餐(第1及第10天无早餐)；

·在第-1天、第1及第10天约中午或摄取药物后约4小时进食中餐；

·在第-1天、第1及第10天给药约8小时后吃点心；及

·在第-1天、第1及第10天约19:00点或给药后约11小时进食晚餐。

不同剂量组的受试者在分别研究期间均接受相同食物。第1天与第10天的食物相同。可随意摄取水。

从筛选至研究结束，受试者避免强烈体能活动及剧烈体育运动(耐力运动)及不饮用任何含酒精的饮料、葡萄柚或葡萄柚汁。在诊所中亦不允许饮用包含黄嘌呤的饮料。

实验步骤

在临床实验中使用游离碱形式的丙基氨基磺酸[5-(4-溴-苯基)-6-[2-(5-溴-嘧啶-2-基氧基)-乙氧基]-嘧啶-4-基]-酰胺(见WO 02/053557或WO 2007/031933；以下命为″参考化合物″)，为硬凝胶胶囊用于口服，调配浓度1及10mg。对应的安慰剂胶囊包含相同赋形剂，但无参考化合物。

参考化合物以1、3、10及30mg上升多剂量给药(分别以1个1mg胶囊、3个1mg胶囊、1个10mg胶囊及3个10mg胶囊)。处理受试者10天。基于匿名的义务，以识别号码及密码分配用于受试者。仅以受试者号码及出生日期识别受试者。

以双盲形式进行实验。每剂量组包含的6位受试者随机分配，接受参考化合物处理及分配2位受试者接受安慰剂处理。

早上给予站立姿势受试者服用药物与150ml水，在第1天及第10天时，均在至少禁食10小时后服用。其它研究日期的试验药物是在摄取早餐前30分钟给药。对于每个受试者，每次药物摄取间隔24±0.5小时，但通常在7:00至9:00之间摄取药物。

所有药物均在直接医药监督下给予。每次药物给予后，立刻检查口腔。在分析期间，测量参考化合物及/或其代谢物(即式I化合物)的血浆含量，进一步核查其一致性。

利用LC-MS测定参考化合物及其代谢物(即式I化合物)在血浆及尿中的含量。两者分析定量极限估计为1ng/ml。

结果：

研究第10天时，在人体中式I化合物及参考化合物在每次不同日给药剂量(分别为1、3、10及30mg)下测量的表观消除半衰期(t_1/2)可见下表4(数据为几何平均值)。

表4

本发明化合物药理学性质总结

可以看出，式I化合物为一种内皮素受体拮抗剂(参见″对内皮素与携载人类ET受体的CHO细胞的膜的结合的抑制作用″，表1及″对内皮素所诱发已分离的大鼠主动脉环(ET_A受体)及大鼠气管环(ET_B受体)收缩的抑制性″，表2)，具有比WO02/053557参考化合物更长半衰期(大鼠及人)及更低清除率(大鼠)(参见″大鼠口服单一剂量后的药物动力学″，表3及″人体口服多剂量后的药物动力学″表4)。

Claims

1.一种式I的化合物或其盐

2.一种医药组合物，该医药组合物包含作为活性成分的根据权利要求1的式I化合物或其医药上可接受的盐，及至少一种无治疗活性的赋形剂。

3.一种根据权利要求1的式I化合物或其医药上可接受的盐在制备药物中的用途，该药物用于治疗高血压。

4.根据权利要求3的用途，其中制备的药物用于治疗肺高血压。

5.根据权利要求4的用途，其中制备的药物用于治疗肺动脉高血压。

6.一种制备根据权利要求1的式I化合物的方法，该方法包括以下步骤：

a)在强碱存在下，使式I-2_B化合物与式I-3化合物反应

其中式I-3化合物中G₁代表氯或溴原子或甲磺酰基或乙磺酰基；及

b)脱除步骤a)中的得到的式I-1_B化合物的苯甲基

其中，使用BC1₃或BBr₃脱除。