CH587865A5 - Reagent for radio-immunoassay of testosterone - by reacting testerone-oxime with tyrosine ester - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Testosteron-3-(O-carboxymethyl)oximtyro- sinmethylester. Immunologische Hormonversuchsmethoden beruhen auf der Fähigkeit eines gegebenen Hormons, bei einer gegebenen immunologischen Reaktion als Antigen zu wirken. Gestützt auf dieses Prinzip sind in letzter Zeit Radioimmunversuchsmethoden entwickelt worden, bei denen eine unbekannte Menge des zu bestimmenden unmarkierten (kalten) Hormons in Gegenwart einer bekannten Menge desselben markierten Hormons mit einer geeigneten Menge eines spezifischen Antiserums geimpft wird. So kann eine unbekannte Hormonmenge leicht aus der Radioaktivitätsbestimmung des Antigen-Antikörperkomplexes durch Vergleich mit einer vorgängig aufgenommenen Eichkurve ermittelt werden. Eine solche Eichkurve wird unter Verwendung von spezifischem Antiserum, kaltem Hormon und markiertem Hormon in bekannten Mengen aufgenommen, wobei kaltes und markiertes Hormon proportional zu ihren Mengen an der Bildung des genannten Antigen-Antikörperkomplexes beteiligt sind. Offensichtlich ist die Radioaktivitätszählung des genannten Antigen-Antikörperkomplexes umgekehrt proportional zur eingesetzten Menge an kaltem Hormon, wenn die Menge an Antiserum und markiertem Hormon gleich bleibt. Eine Radioimmunversuchsmethode zur Messung von Steroid-Hormonen, welche auf der Verwendung von 125J markierten Steroid-Tyrosinmethylester-Konjugaten beruht, ist von Oliver et al., in J. Clin. Investig. 47, 1035 (1968) vorgeschlagen und in bezug auf ihre Anwendung auf die Messung pharmakologischer Digitoxinkonzentrationen im menschlichen Blutserum spezifisch beschrieben worden. Bei der Anwendung auf den Radioimmunversuch von Testosteron bedingt diese Methode die Synthese des konjugaten Testosteron-3-(O-carboxymethyl)oximtyrosinmethylesters (im folgenden T-3-TME genannt), dessen Markierung mit 125J und Verwendung als radioaktives Hapten bei der radioimmunologischen Reaktion. Midgley et al. haben in Recent Progress in Hormone Research, 27, 236 (1971) festgestellt, dass die relative molare Aktivität von T-3-TME beim Testosteron-3-Radioimmunversuch dem 0,7-fachen des Wertes von Testosteron entspricht. Dies bedeutet, dass z'var ein konjugates Steroid wie beispielsweise T-3-TME nicht exakt im selben Verhältnis wie das entsprechende native Steroid an den Antikörper gebunden sein kann, dass jedoch die Differenz klein ist, sofern überhaupt eine solche vorliegt. Aus den obigen Ausführungen geht die Brauchbarkeit des T3-TME-Konjugates beim Radioimmunversuch von Testosteron klar hervor. Die Synthese von T-3-TME ist nicht speziell beschrieben worden, Die einzige vorgeschlagene Methode ist die Isobutylchlorformiat (gemischtes Anhydrid) Synthesemethode, welche von Oliver et al. am Beispiel der Synthese vom 3 -O-succinyldigitoxigenintyrosinmethylester-Konjugat beschrieben worden ist. Wenn jedoch die gemischte Anhydrid Methode zur Synthese von T-3-TME gebraucht wird, kann keine feststellbare Ausbeute an gewünschtem Produkt erzielt werden. Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Testosteron-3-(O-carboxymethyl)oximtyrosinmethylester ist dadurch gekennzeichnet, dass Testosteron-3-(O-carboxymethyl)oxim in Gegenwart von N,N-Dicyclohexylcarbodiimid mit Tyrosinmethylester in einem apolaren Lösungsmittel bei einer Temperatur von 0-25 C umgesetzt wird, das Lösungsmittel abgedampft und der rohe Rückstand kristallisiert wird. Bevorzugte Verfahrensbedingungen sind die folgenden: Äquimolare Mengen der Reagenzien bei leichtem molarem Überschuss an N,N-Dicyclohexylcarbodiimid; apolare Lösungsmittel wie z.B. Methylenchlorid, N,N-Dimethylformamid und Chloroform; Reaktionstemperaturen von 0 bis 25ob, vorzugsweise etwa 10ob. Das folgende Beispiel soll das erfindungsgemässe Verfahren noch besser veranschaulichen: Beispiel Unter Rühren wurden zu einer Suspension von 2,31 g Tyrosinmethylesterhydrochlorid in 80 ml Methylenchlorid 1,4 ml Triäthylamin und, 30 Minuten später, 3,61 g Testosteron-3 (O-carboxymethyl)oxim zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde auf -10"C gekühlt, mit 2,47 g N,N-dicyclohexylcarbodiimid versetzt, wieder auf + 10oC gebracht und 24 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Nach dem Abfiltrieren und Eindampfen im Vakuum bis zur Trockenheit wurde der halbfeste Rückstand in 50 ml 50%igem Äthanol gelöst und die Lösung filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft, wodurch ein öliger Rückstand erhalten wurde. Dieser wurde durch Zugabe von etwa 20 ml dest. Wasser zu einer Lösung des Rückstandes in 10 ml 95 %-igem Äthanol in Form eines kristallinen Festkörpers ausgefällt. Die Ausbeute an kristallinem Testosteron-3-(O-carboxymethyl)oxim-TME betrug 2,15 g (40%). Nach Umkristallisierung aus wässrigem Äthanol betrug der Schmelzpunkt 94-95"C. Elementaranalyse für C31H4206N2: C H N Berechnet 69,12% 7,86% 5,20% Gefunden 68,95 % 8,36% 5,06% Die UV- und IR-Spektren stimmten völlig mit der erwarteten Struktur von T-3-TME überein. Das so erhaltene Produkt wurde nach Greenwood et al., Biochem. J. 89, 114 (1963) mit 125J markiert, wodurch ein, für den Radioimmunversuch von Testosteron-3 geeignetes Reagenz von hoher spezifischer Wirksamkeit erhalten wurde. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Testosteron-3-(O-carboxymethyl)oximtyrosinmethylester, dadurch gekennzeichnet, dass Testosteron-3-(O-carboxymethyl)oxim in Gegenwart von N,N-Dicyclohexylcarbodiimid mit Tyrosinmethylester in einem apolaren Lösungsmittel bei einer Temperatur von 0-25oC umgesetzt wird, das Lösungsmittel abgedampft und der rohe Rückstand kristallisiert wird. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als apolares Lösungsmittel Methylenchlorid, N,N-Dimethylformamid oder Chloroform verwendet wird. 2. Verfahren nach Patentanspruch oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass äquimolare Mengen Testosteron-3-(O-carboxymethyl)oxim und Tyrosinmethylester in Gegenwart eines geringen molaren Überschusses an N,N-Dicyclohexylcarbodiimid miteinander umgesetzt werden. 3. Verfahren nach Patentanspruch oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der rohe Rückstand aus wässrigem Äthanol umkristallisiert wird. **WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.
Claims (1)
- **WARNUNG** Anfang CLMS Feld konnte Ende DESC uberlappen **.Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Testosteron-3-(O-carboxymethyl)oximtyro- sinmethylester.Immunologische Hormonversuchsmethoden beruhen auf der Fähigkeit eines gegebenen Hormons, bei einer gegebenen immunologischen Reaktion als Antigen zu wirken.Gestützt auf dieses Prinzip sind in letzter Zeit Radioimmunversuchsmethoden entwickelt worden, bei denen eine unbekannte Menge des zu bestimmenden unmarkierten (kalten) Hormons in Gegenwart einer bekannten Menge desselben markierten Hormons mit einer geeigneten Menge eines spezifischen Antiserums geimpft wird. So kann eine unbekannte Hormonmenge leicht aus der Radioaktivitätsbestimmung des Antigen-Antikörperkomplexes durch Vergleich mit einer vorgängig aufgenommenen Eichkurve ermittelt werden. Eine solche Eichkurve wird unter Verwendung von spezifischem Antiserum, kaltem Hormon und markiertem Hormon in bekannten Mengen aufgenommen, wobei kaltes und markiertes Hormon proportional zu ihren Mengen an der Bildung des genannten Antigen-Antikörperkomplexes beteiligt sind.Offensichtlich ist die Radioaktivitätszählung des genannten Antigen-Antikörperkomplexes umgekehrt proportional zur eingesetzten Menge an kaltem Hormon, wenn die Menge an Antiserum und markiertem Hormon gleich bleibt.Eine Radioimmunversuchsmethode zur Messung von Steroid-Hormonen, welche auf der Verwendung von 125J markierten Steroid-Tyrosinmethylester-Konjugaten beruht, ist von Oliver et al., in J. Clin. Investig. 47, 1035 (1968) vorgeschlagen und in bezug auf ihre Anwendung auf die Messung pharmakologischer Digitoxinkonzentrationen im menschlichen Blutserum spezifisch beschrieben worden.Bei der Anwendung auf den Radioimmunversuch von Testosteron bedingt diese Methode die Synthese des konjugaten Testosteron-3-(O-carboxymethyl)oximtyrosinmethylesters (im folgenden T-3-TME genannt), dessen Markierung mit 125J und Verwendung als radioaktives Hapten bei der radioimmunologischen Reaktion.Midgley et al. haben in Recent Progress in Hormone Research, 27, 236 (1971) festgestellt, dass die relative molare Aktivität von T-3-TME beim Testosteron-3-Radioimmunversuch dem 0,7-fachen des Wertes von Testosteron entspricht.Dies bedeutet, dass z'var ein konjugates Steroid wie beispielsweise T-3-TME nicht exakt im selben Verhältnis wie das entsprechende native Steroid an den Antikörper gebunden sein kann, dass jedoch die Differenz klein ist, sofern überhaupt eine solche vorliegt.Aus den obigen Ausführungen geht die Brauchbarkeit des T3-TME-Konjugates beim Radioimmunversuch von Testosteron klar hervor.Die Synthese von T-3-TME ist nicht speziell beschrieben worden, Die einzige vorgeschlagene Methode ist die Isobutylchlorformiat (gemischtes Anhydrid) Synthesemethode, welche von Oliver et al. am Beispiel der Synthese vom 3 -O-succinyldigitoxigenintyrosinmethylester-Konjugat beschrieben worden ist. 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Dieser wurde durch Zugabe von etwa 20 ml dest.Wasser zu einer Lösung des Rückstandes in 10 ml 95 %-igem Äthanol in Form eines kristallinen Festkörpers ausgefällt.Die Ausbeute an kristallinem Testosteron-3-(O-carboxymethyl)oxim-TME betrug 2,15 g (40%).Nach Umkristallisierung aus wässrigem Äthanol betrug der Schmelzpunkt 94-95"C.Elementaranalyse für C31H4206N2: C H N Berechnet 69,12% 7,86% 5,20% Gefunden 68,95 % 8,36% 5,06% Die UV- und IR-Spektren stimmten völlig mit der erwarteten Struktur von T-3-TME überein.Das so erhaltene Produkt wurde nach Greenwood et al., Biochem. J. 89, 114 (1963) mit 125J markiert, wodurch ein, für den Radioimmunversuch von Testosteron-3 geeignetes Reagenz von hoher spezifischer Wirksamkeit erhalten wurde.PATENTANSPRUCHVerfahren zur Herstellung von Testosteron-3-(O-carboxymethyl)oximtyrosinmethylester, dadurch gekennzeichnet, dass Testosteron-3-(O-carboxymethyl)oxim in Gegenwart von N,N-Dicyclohexylcarbodiimid mit Tyrosinmethylester in einem apolaren Lösungsmittel bei einer Temperatur von 0-25oC umgesetzt wird, das Lösungsmittel abgedampft und der rohe Rückstand kristallisiert wird.UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als apolares Lösungsmittel Methylenchlorid, N,N-Dimethylformamid oder Chloroform verwendet wird.2. Verfahren nach Patentanspruch oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass äquimolare Mengen Testosteron-3-(O-carboxymethyl)oxim und Tyrosinmethylester in Gegenwart eines geringen molaren Überschusses an N,N-Dicyclohexylcarbodiimid miteinander umgesetzt werden.3. 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| PL | Patent ceased | ||
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