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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Verbindungen der allgemeinen Formel
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in der R 1 einen Digoxin- oder Digitoxin-Rest, R : ein mit Jod markierbares Amin oder ein immuno- logisch oder enzymatisch aktives Protein und n eine ganze Zahl von 2 bis 5 bedeutet, zum Nach- weis von Herzglykosiden (Digitalisglykosiden).
Bei den Methoden zur Untersuchung von Digitalisglykosiden, insbesondere zur Messung des pharmakologischen Spiegels an solchen Glykosiden, handelt es sich um immunologische Tests in wässeriger oder physiologischer Lösung, z. B. im Plasma, Serum und Urin. Solche Immuntests für die Bestimmung von Digitoxin und Digoxin sind bekannt. So wird nach dem aus G. C. Oliver, B. M. Parker, D. L. Brasfield und C. W. Parker, "The Measurement of Digitoxin in Human Serum by Radioimmunoassay", J. Clin.
Investig. 47, 1035 [1968], bekannten Verfahren eine bestimmte Menge eines mittels immunologischer Standardverfahren hergestellten Antidigitoxinserums mit einer wässe- rigen oder physiologischen Lösung, deren Digitoxingehalt bestimmt werden soll, also z. B. mit Test- plasma, -serum oder -urin, oder mit einer Standarddigitoxinlösung jeweils zusammen mit einer konstanten Menge Digitoxigenin umgesetzt, das entweder radioaktiv markiert oder an ein Enzym gebunden ist, u. zw. jeweils so, dass die antigenen Eigenschaften unverändert erhalten bleiben.
Nach der Inkubation des Gemisches wird das mit dem Antikörper verbundene Digitoxin bzw.
Digitoxigenin von freiem Digitoxin bzw. Digitoxigenin abgetrennt und die Radioaktivität oder die
Enzymaktivität gemessen. Das Reagens, also das radioaktiv markierte oder an ein Enzym gebundene
Digitoxigenin, ist ein mit einem Peptid, einer Aminosäure oder einem Aminosäureester kondensier- tes 3-0-Succinyl-digitoxigenin, das durch Umsetzung von Digitoxigenin mit Bernsteinsäureanhydrid hergestellt wird.
Aus der DE-OS 2142422 ist ein analoges, ebenfalls auf Immuntests beruhendes Verfahren zur
Bestimmung von Digoxin bekannt, bei dem das entsprechende Reagens aus Digoxigenin, dem 12-Hydroxydigitoxigenin, ebenfalls durch Succinylierung, bei der die OH-Gruppe in 12-Stellung geschützt werden muss, und anschliessende Kondensation mit einem Peptid, einer Aminosäure oder einem Aminosäureester hergestellt wird. Es ist auch bekannt, das succinylierte Genin zur Antikörperherstellung als Antigen an ein Protein, z. B. an Rinderserumalbumin (RSA), zu binden.
Da der Komplex des Antikörpers mit dem Genin weniger stabil als der entsprechende Komplex mit dem vollständigen Herzglykosid ist. wurde ebenfalls bereits vorgeschlagen, das Herzglykosid über den endständigen Zuckerrest mit einer Aminosäure oder einem Protein zu kondensieren. So ist es aus V. P. Butler und 3. P. Chen, Proc. Nat. Acad. Sci. U. S., 57, 71 [19661, bekannt, den endständigen Digitoxose-Rest mittels Perjodat zu oxydieren und anschliessend mit einem Protein, wie RSA, zum Immunogen zu kondensieren. Aus der DE-OS 2331922 ist dasselbe Verfahren, jedoch zur Herstellung jodierbarer Digoxin-Aminosäure- und -Peptidderivate, bekannt.
Da Digoxin gegenüber Säuren und Laugen ausserordentlich empfindlich ist, entsteht das Digoxin-Aminosäure-Derivat unter den drastischen Bedingungen des zuletzt genannten Verfahrens nur in einer Ausbeute von 10% d. Th. Derselbe Nachteil einer geringen Ausbeute entsteht auch bei der Umsetzung mit einem Protein, wobei jedoch noch hinzu kommt, dass eine Reinigung des Digoxin-Protein-Derivates nicht mehr, wie im Falle des niedermolekularen Aminosäure-Derivates, möglich ist, so dass das auf diese Weise erhaltene Immunogen noch Nebenprodukte, wie z. B. isomerisiertes Digoxin, enthält. Ein weiterer Nachteil dieses bekannten Verfahrens zur Herstellung eines Digoxin-Reagenses ist die irreversible Veränderung des endständigen Zuckerrestes im Digoxinmolekül sowie dessen direkte Verknüpfung mit dem Protein oder der Aminosäure.
Hiedurch werden die sterischen Verhältnisse - innerhalb des Digoxinmoleküls verändert, das wieder die Genauigkeit des mit diesem Molekül als Reagens durchgeführten Tests beeinflusst, bei dem ja letzten Endes der Antikörperkomplex dieses Moleküls mit dem Antikörperkomplex des freien Digoxins verglichen wird.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese Nachteile zu vermeiden und ein Verfahren zu schaffen, welches es ermöglicht, Digitalisglykoside, wie z. B. Digoxin oder Digitoxin, ohne deren molekulare Struktur zu verändern, über eine "Brücke" mit mindestens eine Aminogruppe enthaltenden Verbindungen, z. B. Aminen, Aminosäure-Derivaten oder Proteinen, zu kondensieren, also Verbindungen zu schaffen, die zur Herstellung von Reagentien zur Untersuchung von Herzglykosiden geeignet sind.
Diese Aufgabe wird gemäss der Erfindung durch ein Verfahren zur Herstellung von neuen Verbindungen der eingangs genannten Art gelöst, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel
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in der R, und n die obige Bedeutung zukommt und X den Cyanomethyloxy-, Succinimid-N-oxy-, N-Methyl pyridiniumoxy-, 2, 4-Dini trophenoxy-, den 2, 4. 5-Trichlorphenoxy-, Pentachlorphenoxy-, Phenylthio-, p-Nitrophenoxy-, p-Nitrophenylthio-, den Piperidyl-N-oxy-, Phthalimid-N-oxy- oder den Benztriazol-N-oxy-Rest bedeutet, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel R,-NH,. (III) in der R die obige Bedeutung aufweist, umgesetzt wird.
Jede dieser Verbindungen (II) kann entweder mit einem mit Jod markierbaren, z. B. mit einem mit"'3 jodierbaren Amin. wie Tyramin, Histidin, Tyrosin und Tyrosinäthylester oder einem tyrosinhaltigen Peptid, umgesetzt werden, wobei man einen Tracer erhält, oder mit einem biologisch aktiven Protein zur Herstellung von Antikörpern, z. B. mit Rinderserumalbumin umgesetzt werden, und jede der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen kann schliesslich auch mit einem enzymatisch aktiven Protein zu einem Reagens für den ELISA-Test kondensiert werden.
Mit der Erfindung werden also Verbindungen zur Verfügung gestellt, die zur Herstellung von in ihrem chemischen Aufbau gleichartigen Reagenzien geeignet sind, wobei jedoch mit diesen Reagenzien die Messung ganz verschiedener Grössen, nämlich der Antikörperaktivität, der Enzymaktivität und der Radioaktivität, ermöglicht wird.
Ein Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass die Hydrophile der verwendeten Verbindung der allgemeinen Formel dem jeweiligen Verwendungszweck durch die Wahl des to'-Esters, also durch die Wahl zwischen Dicarbonsäureestern der angegebenen allgemeinen Formel, in der X entweder einen Cyanomethyl-, oder den Succinimid-N-oxy-, den N-Methylpyridiniumoxy-, den 2, 4-Dinitrophenoxy-, den 2, 4, 5-Trichlorphenoxy-, den Pentachlorphenoxy-, den Phenylthio-, den p-Nitrophenoxy-, den p-Nitrophenylthio-, den Piperidyl-N-oxy-, den PhthalimidN-oxy-oder den Benztriazol-N-oxy-rest bedeutet, angepasst werden kann, wobei z. B. die Cyanomethylester-derivate meist hydrophiler als die entsprechenden Hydroxysuccinimidester-derivate sind.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die Reagenzien an Trägersubstanzen, z. B. an Molekularsieben, aber auch auf Polystyrol, fixiert und im Rahmen der Affinitätschromatographie eingesetzt werden können, vor allem an hydrophilen aminogruppenhaltigen Gelen, Molekularsieben od. dgl. Diese gelgebundenen Substanzen dienen als Immunadsorbentien, also zur Reinigung von Antikörpern.
Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beispielsbeschreibung und den Ansprüchen.
Die Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) ist in der AT-PS Nr. 350040 näher beschrieben.
Beispiel 1 :
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orthotrimethylesters mit Chloracetonitril und einer katalytischen Menge eines Kronenäthers oder eines Kryptates versetzt und 8 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Von
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ausgefallenem Natriumchlorid wird abgetrennt und die Lösung wird mit Natriumdicarbonat ausgeschüttelt, getrocknet und eingeengt. Der Cyanomethylester bleibt als farbloses Öl zurück.
B) Glutarsäure-w-orthotrimethylester-wl*-hydroxysuccinimidester
Es wird, wie unter A angegeben, verfahren, statt mit Chloracetonitril aber mit dem Methyl- sulfonat oder dem p-Toluolsulfonat des Hydroxysuccinimids umgesetzt.
C) Digoxin-4'1'-glutaryl-cyanomethylester
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20 ml absol. THF(Zersetzung).
Analyse :
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berechnet : 61,5 7,4 1,5 gefunden : 61, 46 7,79 1, 17 D) Digoxin-4"'-glutaryl-hydroxysuccinimidester
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ben, und es wird, wie unter Beispiel 3 angegeben, verfahren. Fp. : 125 bis 140 C (Zersetzung). Analyse :
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berechnet : 60,5 7. 35 1, 4 gefunden : 59, 89 7, 51 1, 24
Mit den im folgenden beschriebenen Reaktionen soll-in nur beispielhafter Weise - die vorteilhafte Verwendung der erfindungsgemässen Verbindungen zur Herstellung von Reagentien zur Untersuchung von Digitalisglykosiden näher erläutert werden.
E) Digoxin-4"'-glutaryl-tyramid
0, 5 g eines gemäss C oder D hergestellten aktiven Dicarbonsäureesters, 0, 082 g Tyramin und 0, 082 ml Triäthylamin werden 4 Tage lang bei Raumtemperatur in 20 ml absol. THF ge- rührt. Das THF wird abgezogen, der Rückstand in Methylenchlorid aufgenommen und zwei- mal mit 0, 1 n Hel und einmal mit H 20 ausgeschüttelt. Die organische Phase wird getrock- net, eingeengt, in Essigester aufgenommen und mit Petroläther gefällt. Das so erhaltene kristalline Produkt wird in Essigester gelöst und an einer Silikagel-Säule chromat- graphiert. Hiebei läuft eine Verunreinigung durch, das reine Produkt wird mit THF eluiert, das Eluat eingeengt und mit Essigester versetzt.
Durch Zugabe von Petroläther kristallisiert reines Digoxin-4"'-glutaryl-tyramid aus [Fp. : 120 bis 160 C (Z.)], das nach radioaktiver Markierung ein ausgezeichnetes Reagens zur Bestimmung von Digoxin in wässeriger oder physiologischer Lösung darstellt.
Beispiel Z : Digoxin-Rinderserumalbumin-Konjugat.
Zu einer 5% igen Lösung von Rinderserumalbumin in einer wässerigen K 2 CO 3-Lösung pH=8, 5) wird eine äthanolische Lösung eines nach Beispiel IC oder 1D hergestellten aktiven Dicarbonsäureesters zugetropft. Nach mehrtägigem Rühren bei Raumtemperatur fällt ein weisser Niederschlag aus, der abzentrifugiert und mit Essigester gewaschen wird. Sowohl das Zentrifugat als auch der Rückstand, der in Wasser dispergiert wird, werden 1 Tag lang gegen fliessendes Wasser dialysiert. Die Lösung des Rückstandes wird sofort gefriergetrocknet. Die Lösung des Zentrifugats wird mit 0, 1 n HCl auf PH=7 gebracht und eingeengt und anschliessend in Äthanol aufgenommen und auf PH=4, 5 gebracht, Dabei fällt ein weiterer Teil des Konjugates aus.
Dieses wird in
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10 ml 0, 15 n NaHCOg-Lösung aufgenommen und 3 Tage lang gegen fliessendes Wasser dialysiert und schliesslich gefriergetrocknet.
Analog hiezu werden Edestin- und Polylysin-Digoxin-Konjugate aus den gemäss Beispiel IC oder 1D hergestellten aktiven Dicarbonsäureestern. hergestellt, die wie das Digoxin-Rinderserumalbumin-Konjugat, hervorragende Immunogene darstellen.
Beispiel 3 : Die Herstellung eines Peroxydase-Digoxin-Konjugates erfolgt. analog zu der des Digoxin-Rinderserumalbumin-Konjugats nach Beispiel 2, wobei bei einem Äthanolgehalt der Reak-
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dialysiert wird. Das POD-Digoxin-Derivat stellt ein hervorragendes Enzymtest-Reagens zur Bestimmung von Digoxin dar. Die Kondensation an Aminohexyl-Sepharose erfolgt nach analogen Verfahren.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von neuen Verbindungen der allgemeinen Formel
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in der R 1 einen Digoxin- oder Digitoxin-Rest, R ein mit Jod markierbares Amin oder ein immunologisch oder enzymatisch aktives Protein und n eine Zahl von 2 bis 5 bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel
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Benztriazol-N-oxy-Rest bedeutet, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel R-NH. (III) in der R die obige Bedeutung aufweist, umgesetzt wird.