DE3025226C2

DE3025226C2 - Pterinderivate und ihre Verwendung zur radioimmunologischen Bestimmung von Pterinen

Info

Publication number: DE3025226C2
Application number: DE3025226A
Authority: DE
Inventors: Miki Musashino Tokyo Akino; Takeshi Yokohama Kanagawa Kato; Sadao Nagoya Aichi Matsuura; Toshiharu Nagatsu; Takashi Chiryu Aichi Sugimoto; Tokio Hachioji Tokyo Yamaguchi
Original assignee: Fujifilm RI Pharma Co Ltd
Current assignee: Fujifilm RI Pharma Co Ltd
Priority date: 1979-07-04
Filing date: 1980-07-03
Publication date: 1982-07-22
Also published as: AU6010680A; FR2460952B1; FR2460952A1; US4371514A; NL8003854A; SE8004933L; DE3025226A1; GB2056459A; CA1150243A; SE441529B; AU526214B2; GB2056459B

Description

R₆ und R₇

Es ist bekannt, daß Pterine, wie Folsäure, beim Aminosäurestoffwechsel als Coenzym eine Rolle spielen. Diese Erkenntnis führte zu dem Gedanken, daß die Feststellung quantitativer Veränderungen an Pterinen in einem Lebewesen zur Diagnose von verschiedenen Enzymmangelerscbeinungcn hilfreich sein könnte. Vor kurzem wurde über den Zuaammenhang von Phetoylketonurie und Biopterin in Annals of Neurology, Band 3, Seiten 224-230 (1978), The New England Journal of Medicine, Band 299, Seiten 673-679 (1978) und Clinica Chimiea Aeta, Band 93, Seitim 251-262 (1979) berichtet. So besteht großes Interesse an der quantitativen Bestimmung von Pterinen (:2-Amino-4-hydroxypteridin-Derivaten) im menschlichen Körper.

Es ist ein Bioassay-Verfahren zur Bestimmung von Biopterin (d. h. 2-Απιίηο-4-Ι^Γθχν-6-^βΓγΐ1ιΐΌ-1,2-άί· hydroxypropyl)-pteridin) bekannt, und in Methods in

Enzymology, Band 18 B, Seite 618 (1971) beschrieben. Dieses Verfahren ist jedoch nicht zur praktischen Anwendung geeignet, da es relativ lange dauert, bis man das Ergebnis erhält. Ein Verfahren zur Bestimmung von Neopterin (d. h. 2-Amino-4-hydroxy-6-{L- oder D-erythro-l,2,3-trihydroxypropy|)-pteridin) wurde noch nicht vorgeschlagen, kann jedoch in Zukunft notwendig werden.

Die Erfindung betrifft somit die Schaffung von Pterin-Derivaten der allgemeinen Formel I:

Hydroxyphenyl, radiojodiertes Hydroxyphenyl, Tyraminocarbonyl, radiojotliertes Tyraminocarbonyl, eine Protemocarbonylgruppe oder Carboxyl; eine geradkettige oder verzweigte Alkylengruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; und

jeweils Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, oder eine Hydroxalkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten.

2. Im Phenylrest radiojodiertes 4-Hydroxy-2-[2-(4-hydroxyphenyl)-äthyl]-amino-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropylj-^teridin nach Anspruch 1.

3. Im Phenylrest rariiojodk-tes 2-[5-(Tyraminocarbonyl)-pentylamino]-<f -hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-pteridin nach / "ispruch 1.

4. 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-l,2-dihydroxypropyl)-pteridin nach Anspruch 1.

5. Verwendung der Pterinderivate der in Anspruch 1 angegebenen allgemeinen Formel I, worin R eine radiojodierte Hydroxyphenylgruppe oder eine radiojodierte Tyraminocarbonylgruppe bedeutet, und Q, R₆ und R? die dort angegebene Bedeutung besitzen, zur radioimmunologischen Bestimmung von Pterinen.

OH

Q-R

worm R

eine Hydroxyphenylgruppe, eine radiojodierte Hydroxyphenylgruppe, eine Tyrarninocarbonylgruppe, eine radiojodierte Tyraminocarijonylgruppe, eine Proteinocarbonylgruppe oder eine Carboxylgruppe; eine geradkettige oder verzweigte Alkylengruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; und R₆ und R₇ jeweils ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Hydroxylalkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen radiojodierten Pterinderivate als Tracer in Radioimmunoassay-(RAI)-Verfahren. F i g. 1 und 2 zeigen Standardkurven für Biopterin, worin »B« für die Radioaktivität sieht (Counts pro Minute, nachstehend »cpm« genannt), »Bo« für die Radioaktivität (cpm) in Abwesenheit der zu bestimmenden Verbindung (Biopterin), und »N« für die Radioaktivität nicht-spezifischer Bindungen (cpm) in Abwesen heit des Antiserums und der zu bestimmenden Verbindung (Biopterin) stehen.

Für den Radioimmunoassay von Pterinen wurden zwei Arten von Tracern synthetisiert Einmal radiojodierte 4-Hydroxy-2·tyΓaminocarbonylalkylaminopteΓi- din-Derivate und zum anderen radiojodierte 4-Hydroxy-2-(hydroxyphenylalkyl)-aminopteridin-Derivate, wobei die ersteren eine radiojodierte Tyraminocarbonylgruppe und die letzteren eine radiojodierte Hydroxyphenylgruppe für R in der allgemeinen Formel I aufweisen. Repräsentative Beispiele für solche Tracer sind radiojodiertes 2-[5-(Tyraminocarbonyl)-pentylamino]-4-hydroxy-6-(L-erythro-l,2-dihydroxypropyl)-pteridin und radiojodiertes 4-Hydroxy-2-[2-(4-Hydw>xyphenyl)-äthyl]-amino-6-(L-erythro- 1,2-dihydroxypropyl)- pteridin.

Darüber hinaus werden erfindungsgemäß neue Proteinocarbonylalkylpterine, wie Biopterinylcaproylprotein, die zur Antikörpererzeugung verwendet werden, bereitgestellt

Die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen ist in dem nachfolgenden Schema dargestellt In diesem Schema werden Biopterin, Rinderserumalbumin (BSA)

3 4

ind Pentylen als Beispiele for Pterin, das Protein bzw. die Alkylengruppe der Formel I verwendet

OH

NO

CH₃S

' N

(VII)

(Π)

OH

NH,

CH₃S ^N NH₂ (ΠΙ)

B ί

OH

CH₃S

λ N N

OHOH

I I

CHCHCH₃

(IVa)

OHOH

OH I

NV

CHCHCH₃

A k ΗΝ^{Χ Ν Ν}

CH₂CH₂-(Va)

-OH

OH

HN

OHOH CHCHCH₃

*I

CH_:CH₂

OH

(II) C

HN

NO

NH₃

I)

wobei "I für radioaktive* Jod steht.

OH

NH,

N ^Ν HN NH,

(CII.1,COOH (VIII)

OH

OHOII

CHC IK Il

OH

OHOH

CHCHCH,

HN

N N

(CU ι ( OMK H C Il

<\.ιι

N N

(CH,hCOOil
(I.V.·.)

OHOH

( IK IK H

'C H ι CONHCHCH -

— OH HN

DII

OHOH

CHCHC H,

N N

(CH;)_;COBSA
(XIIa)

In dem obigen Schema werden Reaktionen, welche mit dem gleichen Großbuchstaben neben dem Pfeil gekennzeichnet sind, unter im wesentlichen den gleichen Reaktionsbedingungen durchgeführt.

In den Reaktionsschema wird 4-Amino-6-hydroxy-2-methylthio-5-nitrosopyrimidin (II) mit Epsilon-Capronsäure (einer Aminosäure) in Wasser erhitzt, wobei man 4-Amino-2-(2-carboxypentylamino)-6-hydroxy-5-nitrosopyrimidin (VII) erhält Wenn es sich bei der Aminosäure um eine «-Aminosäure handelt wird die Reaktion bevorzugt unter alkalischen Bedingungen, «ι z. B. in einer 0,25M wäßrigen Natriumhydroxidlösung durchgeführt Wird die Verbindung der Formel (II) oder (VII) katalytisch reduziert, wird die 5-Nitrosogruppe in eine Aminogruppe umgewandelt wobei man dann die Verbindungen der Formel (III) bzw. (VIII) erhält Für die katalytische Reduktion kann Palladium-Kohlenstoff als Katalysator verwendet werden. Dann werden die Verbindungen der Formel (III) oder (VIII), nachdem sie gegebenenfalls gereinigt wurden, mit 5-Deoxyarabino-

se-phenylhydrazon in einem Lösungsmittel erhitzt, wobei sich durch Ringschlußkondensation ein Pteridinring bildet und man eine Verbindung der Formel (IVa) oder (IXa) erhält. Beispiele für Lösungsmittel sind wäßrige Alkohole und die Reaktion wird bevorzugt ; unter einem Inertgasstrom, wie Stickstoff, durchgeführt. Behandelt man die Verbindung der Formel (IVa) mit Tyramin auf ähnliche Weise wie oben für die Umsi'-iung der Verbindung (II) und der Aminosäure beschriüben, so erhält man 4-Hydroxy-6-(l,2-dihydroxy- in

propyl)-2-[2-(4-hydroxyphenyl)-äthylamino]-pteridin
der Formel (Va), welches dann, wie nachstehend beschrieben, mit radioaktivem Jod markiert werden kann, und die sich daraus ergebende radiojodierte Verbindung der Formel (VIa) wird dann als Tracer < ·, verwendet.

Die wie vorstehend beschrieben hergestellte Verbindung der Formel (IXa) kann dann mit Tyramin oder einem Protein, wie Rinderserumalbumin (BSA), Kaninchenserumalbumin oder menschlichem Serumalbumin >» konjugiert werden, wobei mittels eines aus dem Stand der Technik bekannten Verfahrens eine Säure-Amid-Bindung gebildet wird. Ein Beispiel für dieses Verfahren ist das Verfahren unter Verwendung eines gemischten Säureanhydrids, bei dem eine Säure [wie die Verbindung y, (IXa)] in Gegenwart eines tertiären Amins mit Chlorameisensäure-ester behandelt wird, wobei man ein gemischtes Anhydrid erhält, welches dann mit Tyramin oder einem Protein umgesetzt wird.

Verbindungen, welche einen Phenylrest in ihrer Struktur aufweisen, wie die Verbindungen (Va) oder (Xa) werden mit radioaktivem Jod markiert, um nach irgendeinem der bekannten Verfahren, vorzugsweise unter Anwendung einer Abwandlung des Chloramin T (Natrium-p-toluolsulfonchloramid) Verfahrens, welches a nach dem Stand der Technik gut bekannt ist, einen Tracer herzustellen.

Beim Chloramin-T-Verfahren läßt man im allgemeinen die Umsetzung des Tyraminkonjugats mit dem radioaktiven Natriumjodid in Gegenwart von Chloramin T während einer Zeitdauer von etwa 30 Sekunden bis etwa 5 Minuten ablaufen und stoppt durch Zusetzen von Natrium-meta-bisulfit. Unter dem Gesichtspunkt der Verfügbarkeit, der Halbwertszeit und der spezifischen Aktivität werden ¹²⁵I und ¹³¹I bevorzugt, wobei 4; jedoch ¹²⁵I am meisten bevorzugt wird.

Zur Herstellung des Tracers kann auch eine andere Verfahrensweise angewandt werden. Bei diesem Alternativverfahren wird Tyramin zuerst, wie oben beschrieben, mit Jod markiert und anschließend mit einem Pteridinderivat konjugiert wobei man die gleichen Reaktionen wie oben beschrieben anwendet

Beispielsweise kann bei der Herstellung einer Neopterinverbindung D- oder L-Arabinose-phenylhydrazon für den RingschluB in Stufe B verwendet werden. Weitere Beispiele für Reaktionsteilnehmer, welche in dieser Stufe verwendet werden können, sind Diacetyl und Glyoxal.

Zur Herstellung eines Antiserums gegen das zu bestimmende Pterin können bekannte Immunisationsverfahren angewandt werden. Beispielsweise werden Säugetiere durch Injektion eines mit Protein konjugierten Pterins (Haptenproteinkonjugat) in Form einer Emulsion mit vollständigem Freudschem Medium immunisiert Von den Säugetieren können vorteilhaft Kaninchen, Ziegen, Schafe, Meerschweinchen und dergleichen verwendet werden. r-4ach mehreren Auffrischungsimpfungen wird Blut gesammelt und anschlie-

so

55 ßend werden die Blutkörperchen entfernt. Das Antiserum kann so wie es ist für Versuchszwecke verwendet werden, es können aber auch Reinigungsverfahren, wie Aussalzen oder Affinitätschromatographie vorher durchgeführt werden.

Falls nötig kann vor dem RIA eine Urinprobe für das RIA-Verfahren vorbehandelt werden. Beispielsweise kann bei der Bestimmung von Biopterin im Urin, das reduzierte Biopterin, d. h. Dihydrobiopterin und Tetrahydrobiopterin unter Verwendung eines geeigneten Oxydationsmittels, wie Jod, oxydiert werden.

Der RIA zur Bestimmung von Pterinen kann nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden. Nach einer Ausführungslorm wird beispielsweise das Antiserum mit einem Puffer auf eine geeignete Konzentration verdünnt und mit einer Probeoder einer Vergleichslösung inkubiert. Die¹ erhaltene Mischung wird dann mit einem Tracer, der nach dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, bei einer geeigneten Temperatur, z. B. bei Raumtemperatur, inkubiert, anschließend erfolgt eine geeignete Abtrennung der gebundenen und der freien Antikörper. Beispiele für solche Verfahren sind die Doppd-Antikörper-Methode, die Dextran-Aktivkohle-Methode, die Festphasenmethode, welche alle an sich bekannt sind. Die Radioaktivität jeder der abgetrennten Substanzen wird mit einem Scintillations-Zähler gezählt und man stellt eine Vergleichskurve auf, die auf dem für die Vergleichslösungen erhaltenen Wert basiert und bestimmt dann den Urinspiegel anhand der Vergleichskurve.

Es wurde gefunden, daß die Cross-Reaktivität des Biopterinantiserums mit Tetrahydrobiopterin, Dihydrobiopterin, Neopterin, 6,7-Dimethylpterin, F'terin oder Folsäure vernachlässigbar gering ist. Der Antikörper auf Neopterin oder Dimethylpterin hat auch eine hohe Selektivität und zeigt geringe Cross-Reaktivität mit anderen Pterinen.

Das RIA-Verfahren, das den Tracer und das Pterinylprotein gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, ist äußerst genau und dauert weniger lang als beispielsweise das Bioassay-Verfahren, welches in Methods in Enzymology, Band 18 B, S. 618 (1971) beschrieben ist. Die Verwendung von z. B. radiojodiertem 2-[2-(4-Hydroxyphenyl)-äthyl]-aminopteridin-Derivat als Tracer ergibt besonders bezüglich der Empfindlichkeit bessere Ergebnisse als die Verwendung eines der radiojodierten 2-(Tyraminocarbonylalkylamino)-pteridine, weil das erstere eine andere Brücke als das Antigen (Proteinkonjugat) hat

Das mit den erfindungsgemäßen Proteinocarbonylalkylpterinen erhaltene Antiserum enthält sowohl einen Antikörper auf das Brückenglied als auch den Antikörper auf das Hapten. Unter diesen Umständen wird angenommen, daß bei Verwendung eines markierten Haptens (Tracer), das die gleiche Brücke hat wie diejenige, die im Haptenkonjugat vorhanden ist das Assaysystem eine Tendenz zu relativ hohen nicht-spezifischen Bindungen und relativ geringer Sensitivität hat

Wenn der Tracer und das Antigen die gleiche Brücke, z. B. Caproyi, PropionyL Butyryl· aufweisen, wird eine Verfahrensstufe zur Abtrennung des Antiserums zur Brücke notwendig.

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen noch detaillierter erläutert

Wenn nicht anders angegeben sind alle Teile, Prozcntangabcn und Verhäiüiiszah'en auf das Gewicht bezogen.

Beispiel 1-1

In 500 ml einer 0,5M wäßrigen Kaliumhydroxidlösung löst man 18 g 4-Amino-6-hydroxy-2-methylthio-5-nitrosopyrimidin (II). Man gibt 10 g 5%iges Palladium auf Aktivkohle zu der Lösung und reduziert bei Raumtemperatur unter rormalem Atmosphärendruck bis die theoretische Menge Wasserstoff verbraucht ist. Nach Entfernen des Katalysators durch Abfiltrieren wird das Filtrat unter Verwendung von Ameisensäure auf einen pH-Wert von 3 bis 4 eingestellt, wobei 4,5-Diamino-6-hydroxy-2-methylthiopyrimidin (III) in Form von farblosen Nadeln ausgefällt wird. Ohne zu isolieren gibt man die Kristalle zu einer Mischung von 32 g 5-Deoxy-L-arabinose-Phenylhydrazon und 400 ml Methanol, und rührt die erhaltene Mischung bei 25°C 90 Minuten lang unter Stickstoffgas und weitere 30 Minuten am Rückfluß. Man kühlt die erhaltene Mischung in einem Eisbad und gibt 100 g Kalium-hexa-

Berechnet:
gefunden:

C 39,46, H 5,31,
C 40,2:, H 4.45,

N 18,41%, N 18,65%.

Berechnet:

gefunden für D-Form: gefunden für L-Form:

C 39,72, H 4,68, N 1*54%, C 39,63, H 4,68, N 18,03%, C 39,75, H 4,63, N 18,17%.

Beispiel 1-2 Man erhitzt eine Mischung von 1,0 g 4-Hydroxy-6-{L-

erythro-1 ^-dihydroxypropyI)-2-aiethylthiopteridin

(IVa), 3,0 g Tyramin, 03 g Essigsäure und 50%iger wäßriger Lösung von 2-Methoxyäthanol 6 Stunden lang auf eine Temperatur im Bereich von 100 bis 105° C Man

(5 g/500 ml) zu. Man rührt die Mischung bei einem pH-Wert von 3 bis 4 20 Stunden lang bei 25⁰C, wobei man Sauerstoff zuführt, engt die Reaktionsmischung im Vakuum auf ein Volumen von 500 ml ein und stellt mit Ammoniak auf einen pH von 9 bis 10 ein. Nicht-fluoreszierender Feststoff wird durch Filtrieren entfernt und das Filtrat wird über eine Florisil-Säule (5 χ 60 cm) gegeben und mit Wasser eluiert. Man erhält zwei Fraktionen mit blauer Fluoreszenz. Die Hauptfraktion wird auf 150 ml eingeengt und erneut mit einer Florisil-Säule behandelt und eluiert. Das Eluat engt man im Vakuum zur Trockene ein und extrahiert den Rückstand mit 500 ml heißem Methanol. Man engt den Extrakt auf ein Volumen von 50 ml ein, woraus man nach Abkühlen 5,5 g farbloser Nadeln von 4-Hydroxy-6-(L-erythro-t,2-dihydroxypropyl)-2-methylthiopteridin (IVa) erhält. Dieses Produkt zersetzt sich bei einer Temperatur oberhalb 210°C (umkristallisiert aus Wasser).

Analyse C₁₀H₁₂N₄O₃S · 2 H₂O:

stellt den pH der Reaktionsmischung mit Chlorwasserstoffsäure auf 1 bis 2 ein und gibt die Mischung über eine Florisil-Säule (J,5 χ 40 cm). Nicht umgesetztes Ausgangsmaterial wird entfernt, indem man die Säule mit 500 ml einer 2ivl wäßrigen Ameisensäurelösung und anschließend mit 500 ml Wasser wäscht und das Produkt dann allmählich mit 1000 ml wäßrigen ammoniakalischen Lösungen, welche einen Ammoniakgehalt von 0 bis 2% haben, eluiert. Man engt die Eljate auf ein Volumen von 150 ml ein und behandelt dann erneut, wie vorstehend beschrieben, mit einer Florisil-Säule. Das Eluat wird zur Trockne eingeengt, mit 200 ml einer wäßrigen ammoniakaüschen Lösung extrahiert und der Extrakt wird auf ein Volumen von 100 ml eingeengt. Man stellt den pH der Mischung mit Ameisensäure auf 3 bis 4 ein und kühlt die Mischung, wobei man 4-Hydroxy-2-[2-(4-hydroxyphenyl)-äthyl]-amino-6-(l_- erythro-l,2-dihydroxypropyl)-pteridin (Va) in Form von gelben Nadeln erhält, welche sich nach Kristallisation auc Wasser hpi I fi.ST! 7pr<;pt7pn

Auf die gleiche Weise wie oben beschrieben, jedoch unter Verwendung von D- oder L-Arabinose-phenylhydrazon anstelle von 5-Deoxy-L-arabinose-phenylhydrazon xypropyl)-2-methylthiopteridin (IV) bzw. die entsprechende L-Form (IVc). Der Zersetzungspunkt beider Isomeren nach Kristallisation aus Wasser beträgt 158" C.

Analyse C₁₀H₁₂N₄O₄S · 2 H₂C:

Analyse CuH	[i»N	₅O₄ · H₂O:	H 5,64,	N	18,66%,
Berechnet:		C 54,39,	H 5.62,	N	18,38%.
gefunden:		C 54.56,

Beispiel 1-3 Markieren mit radioaktivem Jod

Zu 20 μΙ einer 0.05M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) gibt man 10 μ! Dimethylformamid, welches 10 μg der wie in Beispiel 1-2 beschriebenen erhaltenen Verbindung (Va) enthält, setzt 10 μΙ (1,2 mCi) Na ¹³⁵I zu und gibt dann 20 μg Chloramin T, gelöst in 10 μΙ des gleichen Puffers zu. Die erhaltene Mischung läßt man 30 Sekunden bei 25°C reagieren. Man stoppt die Reaktion durch Zugabe von 40 μg Natrium-meta-bisulfit, gelöst in 10 μΐ des gleichen Puffers. Die erhaltene Reaktionsmischung wird mittels Elektrophorese an Celluloseacetat gereinigt, mit einem 0.05M Phosphatpuffcr (pH 7,6) abgetrennt und mit einem Phosphatpuffer, der 5% BSA enthält extrahiert, wobei man ^l25I-markiertes 4-Hydroxy-2-[2-(4-hydroxyphenyl)-äthyl]-amino-6-(L-erythrol,2-dihydroxypropyl)-pteridin (VIa) erhält, rf 0.48 [SiIicagel-Dünnschicht; Äthylacetat-Methanol-5%ige wäßrige Ammoniaklösung (1 :1 :0,2) Volumenteile].

Beispiel 2-1

10 g ^Amino-e-hydroxy^-methylthio-S-nitrosopyrimidin (II) und 20 g Epsilon-aminocapronsäure gibt man zu 400 ml Wasser und erhitzt die Mischung 1 Stunde am Rückfluß. Die unter Verwendung von Ameisensäure auf pH 2 bis 3 eingestellte Reaktionsmischung kühlt man und sammelt den Niederschlag durch Filtrieren, wobei man 8,5 g 4-Amino-2-(5-carboxvpentyIamino)-6-hydroxy-5-nitrosopvrimidin (VlI) erhält Löst man dieses Produkt in heißer verdünnter wäßriger Ammoniaklösung und säuert mit Ameisensäure an, so erhält man rot-orangefarbene Nadeln.

Die Verbindungen der Formel (VII), weiche ähnlich wie oben beschrieben erhalten wurden, sowie deren Schmelzpunkte und die Ausgangsmaterialien sind in Tabelle I aufgeführt

Tabelle I

OH

It

NO

Q- R

Γρ. (

Λ u s e;t η c s mil 1 c π .11

Cl I,COOl I
(C 11.,),COOI I
(CH-I₁COOIl
(CH, IXOOII
CIlIfH.IfOOII(I S)
CH(CH₁)COOH(I R)

300. wird bei 2Sf) ( schwarz

300

240-241 </ers.)

232.5-233.5 (/.ers.i

iflO Srhw;ir/I;irhiiiiii bfi }4> 300

Glycin
/(-Alanin

(■-Aniino'niitlcrsaurc
ί-Aminocapronsäure

I -Al;min

D-Alanin

Beispiel 2-2

Man gibt 4,3 g 4-Amino-2-(5-carboxypentylamino)-6-hydroxy-5-nitrosopyrimidin (VII) zu 60 ml einer 2M Natriumhydroxidlösung und reduziert katalytisch mit Wasserstoff in Gegenwart von ?. g Palladium-Aktivkohle. Wenn die Wasserstoffabsorption beendet ist gibt man 20 ml konz. Chlorwasserstoffsäure zur Reaktionsmischung und entfernt den Katalysator durch Abfiltrieren. Man engt das Filtrat ein und trocknet die erhaltenen Kristalle unter Verwendung von Phosphorpentoxid als Trockenmittel, wobei man 9,5 g 4,5-Diamino-2-(5-carboxypentylamino^ö-hydroxy-pyrimidin-dihydrochloridmonohydrat (VIII) erhält. 5,0 g des so erhaltenen Produkts und 3,7 g 5-Deoxy-L-arabinose-phenylhydrazon gibt man zu 400 ml 50%igem (Volumenteile) Methanol und erhitzt die Mischung unter einem Stickstoffstrom 20 Minuten am Rückfluß. Man stellt den pH der Reaktionsmischung auf 5 ein und führt 6 Stunden lang Luft in die Mischung ein. Man engt die Reaktionsmischung zur Trockne ein, setzt 100 ml Wasser zu und stellt den pH mit Ameisensäure auf 2,0 ein. Man gibt die Mischung über eine Florisil-Säule (400 ml), wäscht mit 0,25M Ameisensäure und eluiert mit Wasser. Das Eluat wird zur Trockne eingeengt, mit 250 ml Methanol extrahiert und der Rückstand wird zur Trockne eingeengt Man kristallisiert den Rückstand aus 10 ml Äthanol, wobei man 465 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro~ 1,2-dihydroxypropyl)-pteridin (IXa) erhält

Analyse Ci_SH₂iN_sO₅ · H₂O:

Berechnet:- C 48,77, H 6,28, N 18,96%, gefunden: C 48,55, H 6.25, N 18,55%.

B e i s ρ i e 1 2-3

43 g 44-Diamino-2-(5-carboxypentylainino)-6-hydroxypyrimidin-dihydrochJorid-monohydrat und 2^> g Diacetyl löst man in 100 ml Wasser und nachdem man den pH auf 2 bis 3 eingestellt hat erhitzt man die Lösung 1 Stunde am Rückfluß. Nach dem Abkühlen kristallisiert man den Niederschlag aus 5O°/oigem (Volumenteil) Methanol und erhält 3.1 g 2(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6,7-dimethylpteridin in Form von gelben Nadeln mit einem Fp. .215 — 219'C(Zers.).

Beispiel 2-4

74 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(I.· erythro-l.2-dihydroxypropyl)-pteridin und 126 μΐ Triäthylamin gibt man zu 2 ml Dimethylformamid (DMF). Man setzt der Mischung 65 μΙ Äthylchlorformiat zu. wobei man auf -5°C kühlt und rührt die Mischung 15 Minuten lang. Nach Zusetzen von 2 ml einer DMF-Losung, welche 52 mg Tyramin enthält, rührt man die Mischung 30 Minuten lang bei einer Temperatur von -5°C und dann 1 Stunde bei 0"C. Man engt die Reaktionsmischung im Vakuum ein. gibt 3 ml 1M Natriumhydroxid zum Rückstand und läßt die Mischung 30 Minuten bei 3O⁰C stehen. Man säuert die Reaktionsmischung mit Ameisensäure an, reinigt durch Flonsil-Säulenchromatographie (Kolonne 100 ml, eluic.-t mit Äthanol-Wasser) und kristallisiert das Produk' ilann aus Wasser, wobei man 66 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-l,2-dihydroxypropyI)-pteridin-tyramin-Konjugat (Biopterinylcaproyltyramin) (Xa) in Form von farblosen Nadeln mit einem Fp. 169— 171 'C (Zers.) erhält.

Analyse CjsH*^	^i₆O; ■ H₂O:	H 6,60,	N	17,20%,
Berechnet:	C 56,54,	H 6,48,	N	1734%.
gefunden:	C 56,65,

Beispiel 2-5
Markieren mit radioaktivem Jod

10 μΐ DMF, welches 10 μg Biopterinyl-caproyl-tyramin-Konjugat enthält, gibt man zu 20 μΐ eines 0.05M Phosphatpuffers (pH 7,4) und gibt dann zu der Mischung 10 μΐ (1,2 mCi) Na¹²³I und anschließend 20 μg Chloramin T, gelöst in 10 μΐ des gleichen Puffers. Man läßt die Mischung 30 Sekunden bei 25° C reagieren und stoppt dann die Reaktion durch Zugabe von 40 μ§ Natriummeta-bisulfit eelöst in 1OuJ des deichen

Pulfers. Das Produkt wird durch Elektrophorese an Celluloseacetat gereinigt, mit einem 0.05M Phosphatpuffer (pH 7,6) abgetrennt und mit einem Phosphatpuffer, der 0,5% BSA enthält, extrahiert, wobei man ^I25I-markiertes 2-(5-Carboxy-pentylamino)-4-hydroxy-

6-{L-erythro-1 ^-dihydroxypropylj-pteridin-tyramin-Konjugat erhält Rf 0,50 [Silicagel Dünnschichtchromatographie; Äthylacetat-Methanol-5%ige wäßrige Ammoniaklösung (1 : 1 :0,2) Volumenteile].

Beispiel 3

184 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-lZ3-trihydroxypropyl)-pteridin und 400 μΐ Triäthylamin löst man in 2 ml DMF und gibt dann bei einer Temperatur von —5° C 200 μΐ Äthylchlorformiat zu. Man rührt die Mischung 15 Minuten bei —5° C und gibt dann 2 ml einer DMF-Lösung von 137 mg Tyramin zu. Die erhaltene Mischung rührt man 30 Minuten bei -5⁰C, 1 Stunde bei 0⁰C und 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Man engt die Reaktionsmischung im Vakuum ein und setzt 2 ml IM Natriumhydroxid zu. Nachdem man bei Raumtemperatur 30 Minuten stehengelassen hat, säuert man die Mischung mit Ameisensäure an und reinigt durch Florisil-Säulenchromatographie (Kolonne 100 ml), wobei man mit Äthanol-Wasser eluiert wobei man 101 mg2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-lA3-trihydroxypropyl)-pteridin-tyramin-Konjugat (ein Neopterinylcaproyltyramin) erhält. Fp. 192—196°C (Zers.) (kristallisiert aus wäßrigem Äthanol).

Analyse CuH₃₀N₆O₆ · H₂O:

Berechnet: C 54,75, H 63, N 16,66°/o, gefunden: C 5434, H 6,40, N1633%.

Beispiel 4

249 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6,7-dimethylpteridin und 200 μΙ Triäthylamin gibt man zu 4 ml DMF und fügt dann 100 μΐ Äthylchlorformiat bei einer Temperatur von -5° C zu. Man läßt die Mischung 15 Minuten bei -5° C reagieren. Nach Zusetzen von 2 ml einer DMF-Lösung, die 205 mg Tyramin enthält, wird die Reaktion unter Rühren während 30 Minuten bei -5° C und I Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Man engt die Reaktionsmischung im Vakuum ein und löst den Rückstand in Wasser. Nach Ansäuern mit Ameisensäure reinigt man die Mischung durch Florisil-Säulenchromatographie, eluiert allmählich unter Verwendung von 1 I Wasser und 11 einer wäßrigen Lösung, welche 200 ml Aceton und 4 g Ammoniak enthält, wobei man 209 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6,7-dimethylpteridin-tyramin-Konjugat erhält. Fp. 200⁰C (Zers.) (umkristallisiert aus 50% [Volumenteile] Äthanol).

Äthylchlorformiat bei einer Temperatur von —5°C zu. Man rührt die Mischung 15 Minuten und gibt sie dann zu einer Mischung von 114 mg Rinderserumalbumin (BSA), 2 ml Wasser und 200 μΐ einer IM Natriumhydroxidlösung. Die erhaltene Lösung rührt man dann 30 Minuten bei — 5⁰C, wobei man den pH auf 9 einstellt, 1 Stunde bei 0⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach Zugabe von 5 ml IM Natriumhydroxidlösung läßt man die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen

ίο und dialysiert dann unter Verwendung eines Cellophanschlauches gegen fließendes Wasser. Den Cellophanschlauch gibt man in ein Becherglas, welches eine Mischung von 1 g Natriumacetat und 300 ml Wasser enthält, stellt auf pH 4,5 ein und dialysiert 6 Stunden. Die innere Lösung wird dann zentrifugiert und der Niederschlag wird Iyophilisiert, wobei man 95 mg 2-(5-Carboxy-pentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-pteridin-BSA-Konjugat (Biopterinylcaproyl-BSA) erhält

B e i s η i e I 5-2

73,4 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L- erythro-l,2,3-trihydroxypropyl)-pteridin und 168 μ Triäthylamin gibt man zu 1 ml DMF und setzt dann 87 μ Äthylchlorformiat bei einer Temperatur von —5° C zu wonach man die Mischung 15 Minuten rührt Man gibl die Reaktionslösung zu einer Mischung von 114 mg BSA, 2 ml Wasser und 200 ml 1M Natriumhydroxid unc rührt die erhaltene Mischung dann bei —5° C währenc man den pH auf 9 einstellt, 30 Minuten lang, dann 1 Stunde bei 0⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach Zusetzen von IM Natriumhydroxid läßt man die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Di« Reaktionsmischung dialysiert man wie in Beispiel 5-1 beschrieben, zentrifugiert und Iyophilisiert den Nieder schlag, wobei man 100 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4 hydroxy-6-(L-erythro-1 Ä3-trihydroxypropyl)-pteridin-

BSA-Konjugat (ein Neopterinylcaproyl-BSA) erhält

Nach einem ähnlichen Verfahren wie oben beschrie ben, werden die folgenden BSA-Konjugate erhalten.

Berechnet: gefunden:

H₂O:

C 59,71, H 6,83, C 59,77, H 735,

N 1839%, N 18,76%.

Konjugation mit BSA Beispiel 5-1

74 mg Biopterinylcaproyltyramin und 168 μΙ Triäthylamin gibt man zu 1 ml DMF und setzt dann 87 μΙ

Beispiel 5-3

2-(5-Carboxypentyl)-amino-4-hydroxy-6,7-dimethyl-

pteridin-BSA-Konjugat (83 mg) aus 61 mg 2-(5-Carb

oxypentyIamino)-4-hydroxy-6,7-dimethylpteridin. Sub

so stitution des Pterins: 82% [berechnet von Aem (pt 7,0I)J

B e i s ρ i e I 5-4

2-Carboxymethylamino-4-hydroxy-6-(ti~erythrol,2,3-trihydroxypropyl)-pteridin-BSA-Konjugat (44 mg aus 31 mg der entsprechenden 2-Carboxymethylamino Verbindung.

B e i s ρ i e I 5-5

2-Cäfböxjmiethylämino-4-hydroxy-6,7-dimethyl-pte ridin-BSA-Konjugat (32 mg) aus 25 mg der entspre chenden2-Girboxymethylaminoverbindung. Weitere nach den Beispielen 1-2 bis 5-5 nach einer ähnlichen Verfahren erhaltenen Verbindungen sind i der folgenden Tabelle H in Zusammenhang mit de obenstehenden Formel (!) aufgeführt.

16

Tabelle II

Q-R

R₇

Fp. ("C) oder Rf

CH₂CH₂

desgl.
desgl.

CH₂CH

OH

° ^H

DHP

THP(D) THP

DHP

CH₂COOH	Me
(CHj)₂COOH	Me
(CH₂^COOH	Me
(CH^COOH	Me
CH(CH₃)COOH (IS)	Me
(CHJjCOOH	DHP
CH₂COOH	THP
(CH^COOH	THP
(CH^CO-tyramin	CH₃
desgl.	THP
desgl.	DHP
(CH^CO-BSA	Me
desgl.	THP
desgl.	DHP
CH₂CO-BSA	Me
desgl.	THP
(CHJsCO-tyramin-¹²⁵!	Me
desgl.	THP
desgl.	DHP

DHP: L-Erythro-1,2-dihydroxypropyl THP: L-Erythro-1,2,3-trihydroxypropyl THP (D): D-Erythro-1,2,3-trihydroxypropyl

H
H

Me

CH₃

Me

165 (d)

180-182 (d) 182-184 (d)

Rf 0,48

206-210 (Zers.) 275 (Schwarzfarbung) 238-240 (Zers.) 215-219 (Zers.) 193-194 (Zers.) 216-218 (Zers.) 177-180 (Zers.) 186-190 (Zers.) 200 (Zers.) 192-196 (Zers.) 169-171 (Zers.)

Rf 0,58
Rf 0,36
Rf 0,50

RF-Wert auf Silicagel-Dlinnschicht, entwickelt mit Äthylacetat-Methanol-5% wäßrige Ammoniaklösung (1:1:0,2; Volumenteile).

t7

Versuchsbeispiel 1 Herstellung des Antikörpers

2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erytnrol,2-dinydroxypropyl)-pteridin-BSA-Konjugat mit komplettem Freudschem Adjuvans injiziert man intradermal New Zealand weißen Kaninchen (1 mg pro Kaninchen). Nach einem Monat erfolgt eine zusätzliche Immunisierung (0,4 mg pro Kaninchen) auf die gleiche Weise, und insgesamt vier solcher zusätzlichen Immunisationen werden in wöchentlichen Abständen vorgenommen. 10 Tage nach der endgültigen Immuniserung wird von den Kaninchen Blut gesammelt, woraus dann Antiserum erhalten wird.

Versuchsbeispiel 2-1 (a) Vorbehandlung von Urinproben

Zu 5,0 ml frischem menschlichem Urin gibt man 500 μΐ 5M Chlorwasserstoffsäure und 1 ml einer 0,2%igen I₂-0,4%igen KI-Lösung und läßt die erhaltene Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen. Dann wiederholt man die gleiche Behandlung, nur verwendet man 0,5M Natriumhydroxid anstelle der Chlorwasserstoffsäure. Man stoppt die Oxidationsreaktion durch Zugabe von 0,5 ml 2%iger Ascorbinsäure und zentrifugiert die Reaktionsmischung 15 Minuten lang bei 7000 rpm. Die überstehende Flüssigkeit wird einer Säulenchromatographie mit Dowex-50(H⁺) (0,9 χ 2 cm) unterworfen. Nach Waschen der Säule mit 20 ml Wasser wird Biopterin mit 5 ml einer IM wäßrigen Ammoniaklösung eluiert Man stellt das Eluat auf pH 7 ein und auf ein Volumen von 6,0 ml mit 250 μΐ einer 0,5M Phosphatpufferlösung (pH 7,0j and 5M Chlorwasserstoffsäure, und verwendet es» dpjin für den Assay.

(b) RIA von Biopterin

Bei dem Test verwendet man einen 0.0175M Phosphatpuffer, welcher 0,1% BSA enthält

Um den Capronsäurerest-Antikörper zu entfernen werden zwei Reihen der Mischung von 10 μg 2-(5-CarboxypentyIamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydro-

§j xypropylf pteridin und 100 μΙ eines 80Ofach verdünnten

§ Antiserums 30 Minuten bei 37° C inkubiert Zu einer

Reihe der sich ergebenden Lösung gibt man 100 μΐ des '- Puffers zu, der Standard-Biopterin (0 bis 71OpMoI) : enthält und zu der anderen Reihe der Lösung gibt man

I_I 100 μΐ der verdünnten Urinprobe (4-, 8-, 16- und 32fache || Verdünnung), und inkubiert die Mischung 30 Minuten 'i bei 37° C. Zu jeder setzt man dann 10 μΙ radiojodiertes ί| (¹²⁵I) 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-ery-S thro-l,2-dihydroxy-propyl)pteridin-tyramin-Konjugat T;! (20 000 cpm) zu und läßt die Mischung 30 Minuten bei

' Raumtemperatur stehen. Dann gibt man 100 μΙ Anti-

Kaninchen IgG als zweiten Antikörper zu und läßt 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen.

:', Nach Zugabe von 500 μΐ 4%igem Dextran rührt man

die Mischung heftig und zentrifugiert 15 Minuten lang mit 2000 rpm bei 4° C. Dann wird die Radioaktivität

j. eines jeden Niederschlages gezahlt Bs wird eine

ti Standard-Kurve (Fig. 1) gezeichnet, indem man die

Ί Werte (B-N/Bo-N), die bei Standardlösungen erhal-

ten wurden, aufträgt, dann werden die Biopterinspiegel in den Urinproben, basierend auf der Kurve, bestimmt, welche in Tabelle III im Vergleich zu dem vorher angegebenen bekannten Bioassay erhalten wurden.

35

40

45

50

55

60

Tabelle III	Biopterin (n Mol/ml	Urin)
Nr. der Probe	RIA	Bioassay
	5,75	5,4
1	15,1	16,0
2	8,0	7,2
3	10,7	8,9
4	9,7	8,9
5

10

15 Versuchsbeispiel 2-2 (a) Vorbehandlung von Urinproben

Zu 500 μΐ frischem menschlichem Urin gibt man 50 μΐ einer 2M Chlorwasserstoffsäure und 50 μΐ einer 2%-h— 4%-KI-Lösung und läßt die Mischung bei Raumtemperatur 1 Stunde in der Dunkelheit stehen. Dann stoppt man die Oxidation durch Zugabe von 50 μΐ einer 2%igen AscorbinsäiuvJösung zu der Mischung. Man Iyophilisiert die Reaktionsmischung, um die Chlorwasserstoffsäure zu entfernen und löst den Rückstand in 0.02M Phosphatpuffer (pH 7,5), welcher 03% BSA enthält, und verwendet sie so für den Assay.

(b) RIA von Biopterin

Bei dem Assay verwendet man 0,02M Phosphatpuffer (pH 7,4), der 0,1 % BSA enthält

Zu einer Mischung von 100 μΐ des Puffers und 100 μΐ Antiserum (etwa 4000- bis 5000fache Verdünnung), gibt man 100 μΐ Standard-Biopterin (0—300 pmol) in Pufferlösung oder 100 μΐ Urinprobe (50—10Ofache Verdünnung). Man inkubiert die Mischung 30 Minuten bei 37° C. Zu jeder gibt man dann 100 μΐ radiojodiertes (¹²⁵I) 4-Hydroxy-2-[2-(4-hydroxyphenyl)-äthyl]-amino-6-(L-erythro-l,2-dihydroxypropyl)-pteridin (10 000—

20 000 cpm) und läßt die erhaltene Mischung 1 bis 2 Stunden bei 4° C stehen.

Zu der Reaktionsmischung gibt man als den zweiten Antikörper 100 μΐ Anti-Kaninchen IgG. Man läßt die Mischung 10 Minuten bsi Raumtemperatur stehen und setzt dann 100 μΐ 4%iges Dextran zu. Man rührt die Mischung heftig und zentrifugiert 15 Minuten bei 2500 rpm bei 4° C Dann wird die Radioaktivität des Niederschlags gezählt

Durch Auftragen der so erhaltenen Werte (B-N/ B₀-N) erhält man die in F i g. 2 gezeigte Kurve (A) im Vergleich zur Kurve (B)₁ welche unter Verwendung des gleichen Tracers wie in Beispiel 2-1 erhalten wurde.

Wie aus der Figur hervorgeht, zeigen die Kurven ein scharfes Dosis-Ansprechen, wie es für den RIA geeignet ist, und insbesondere die Empfindlichkeit unter Verwendung des Tracers, der eine Brücke hat, die von der des Antigens verschieden int, ist höher al« im Falle der Verwendung der gleichen Brücke.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche: 1, Pterinderivate der allgemeinen Formel I:

HN

Q-R

worin R