DE2924332C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft neue markierte Konjugate zur Verwendung in spezifischen Bindungs-Untersuchungsverfahren für Liganden oder deren Bindungspartner in einem flüssigen Medium. Die Erfindung betrifft insbesondere Flavin-adenin- dinukleotid (FAD)-markierte Konjugate zur Verwendung in solchen Untersuchungen, insbesondere zum Nachweis von Jodothyronin, wie Thyroxin, im Serum. Beschrieben werden auch Zwischenprodukte, die bei der Synthese der neuen markierten Konjugate gebildet werden.

Die Jodothyronine haben die folgende allgemeine Formel

worin β ¹ und β ² unabhängig voneinander Wasserstoff oder Jod bedeuten. Die hauptsächlichsten Jodothyronine von klinischem Interesse werden in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Die quantitative Bestimmung der Konzentration von verschiedenen Jodothyroninen, insbesondere der Hormone T-3 und T-4 in Serum und der Sättigungsgrad der Jodothyronin- Bindungsstellen an dem Trägerprotein-Thyroid-bindendem Globulin (TBG) sind wertvolle Hilfen bei der Diagnose von Thyroid-Störungen. Ebenso ist die Bestimmung anderer Komponenten von Körperflüssigkeiten, einschließlich Serum, brauchbar zur Beurteilung des Gesundheitszustandes von Individuen. Beispiele für andere Substanzen von klinischem Interesse gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor.

Spezifische Bindungs-Bestimmungsmethoden haben eine technische Weiterentwicklung erfahren von der ursprünglichen kompetitiven Bindungsradioimmunoassay (RIA), bei welcher ein Radioisotop-markiertes Antigen Kompetitiv zu einem Antigen aus einer Versuchsprobe zum Binden des spezifischen Antikörpers gemacht wird. Bei der RIA-Technik wird eine Antigenprobe quantitativ bestimmt durch Messung des Anteils der Radioaktivität, die mit dem Antikörper assoziiert wird, indem man die Bindung des radiomarkierten Antigens (die gebundene Spezies des markierten Antigens) zu der Radioaktivität, die mit dem Antikörper (der freien Spezies) unassoziiert verbleibt, mißt und dann das Verhältnis mit einer Standardkurve vergleicht. Ein umfassender Überblick über die RIA-Technik wird in Skelly et al., Clih. Chem., 19, 146 (1973), gegeben. Während RIA definitionsgemäß auf der Bindung des spezifischen Antikörpers mit einem Antigen oder Hapten basiert, wurden radiomarkierte Bindungsversuche entwickelt, die auf anderen spezifischen Bindungsreaktionen beruhen, wie zwischen Hormonen und deren Bindungsproteinen.

Aus den radiomarkierten Bindungsuntersuchungsmethoden haben sich nicht-radioisiotopische Bindungsuntersuchungsmethoden entwickelt, bei denen markierte Substanzen, wie Enzyme, verwendet werden (siehe US-PS 36 54 090 und 38 17 837). Kürzlich sind weitere verbesserte, nicht-radioisotopische Bindungsversuche entwickelt worden, die in den DE-OS 26 18 419 und 26 18 511 beschrieben werden und bei denen spezielle einzigartige Markierungssubstanzen, einschließlich Coenzyme, zyklische Reaktanten, spaltbare Fluoreszenzenzymsubstrate und Chemilumineszenmoleküle verwendet werden. Flavin-adenin-dinukleotid wird als geeignet zur Coenzymmarkierung erwähnt, weil FAD als Coenzym in geeigneten Überwachungsreaktionen fungiert. In der deutschen Offenlegungsschrift 29 24 249 A1 der Anmelderin wird FAD als geeignet beschrieben, spezifische Bindungs-Untersuchungsverfahren zu verbessern unter Anwendung einer prostetischen Gruppe als Markierung, weil FAD auch als prostetische Gruppe in ausgewählten biochemischen Systemen wirkt. Es gibt verschiedene Methoden zur Bestimmung von Jodothyronin- Konzentrationen im Serum. Ein beachtlicher Fortschritt in der Jodothyronin-Bestimmung wurde durch die Entwicklung der kompetitiven Protein-Bindungsuntersuchungsmethode von Murphy und Pattee, J. Clin. Endocrinol. Metab., 24, 187 (1964), gezeigt, bei dem radiomarkiertes Jodothyronin mit Serumjodothyronin kompetitiv bei der Bindung von TBG sind. Die Entwicklung eines spezifischen Antiserums für verschiedene Jodothyronine ermöglichte die Entwicklung von Radioimmunoassays, bei denen radiomarkiertes und Serum-jodothyronin kompetitiv an Antikörper anstelle von TBG gebunden werden. In diesen beiden kompetitiven Protein-Bindungsuntersuchungsmethoden und der Radioimmunoassay für Jodothyronin besteht das radiomarkierte Material aus nativem Jodothyronin, bei dem ein oder mehrere Jodatome durch radioaktives Jodisotop, im allgemeinen ¹²⁵J, ersetzt wird. Die vorerwähnte nicht-radioisiotopische Bindungs-Untersuchungsmethode hat weitere vorteilhafte Verfahren zur Bestimmung von Jodothyronin ermöglicht, insbesondere solche, wie sie in den US-PS 40 43 872 und 40 40 907 und insbesondere in den DE-OS 26 18 419 und 26 18 511 sowie in der DE-OS 29 24 249 beschrieben werden.

Es wurden nun neue Flavin-adenin-dinukleotid (FAD)-markierte Konjugate entwickelt für die Verwendung in Bindungsuntersuchungen, zur Bestimmung von Liganden oder Bindungspartner davon, für die ein analytisches Interesse besteht, wie Jodothyroninen, und insbesondere für die Anwendung in der hier erwähnten Untersuchungsmethode unter Verwendung einer Markierung prostetischer Gruppen. Die FAD-markierten Konjugate haben die folgende allgemeine Formel

worin Riboflavin-(Phos)₂-Ribose den Riboflavin-pyrophosphat- ribose-Rest in FAD darstellt, n=2 bis 6 und vorzugsweise 2 oder 6 bedeutet und ein spezifisch bindungsfähiger Ligand ist oder ein spezifisches Bindungsanalog davon und vorzugsweise ein Jodothyronin darstellt, wie Thyroxin, das über eine Amidbindung gebunden ist.

Der spezifisch bindungsfähige Ligand oder dessen Analog bei den vorliegenden markierten Konjugaten ist hinsichtlich seiner chemischen Natur im allgemeinen ein Protein, Polypeptid, Peptid, Kohlenwasserstoff, Glycoprotein, Steroid oder ein anderes organisches Molekül, für welches ein spezifischer Bindungspartner erhältlich ist. Funktionell ausgedrückt ist der Ligand im allgemeinen ein Antigen oder ein Antikörper dazu, ein Hapten oder ein Antikörper dazu, oder ein Hormon, Vitamin oder ein Arzneimittel oder ein Rezeptor oder eine Bindungssubstanz dafür. Im allgemeinen ist der Ligand ein immunologisch aktives Polypeptid oder Protein mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4 000 000, wie ein antigenisches Polypeptid oder Protein oder ein Antikörper, oder er ist ein Hapten mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1500.

FAD-markierte Konjugate, bei denen der Ligand ein Jodothyronin ist, sind besonders bei der Verwendung in spezifischen Bindungsuntersuchungsmethoden geeignet für die Bestimmung von Jodothyronin in flüssigen Medien, wie Serum, und haben vorzugsweise die allgemeine Formel

worin Riboflavin-(Phos)₂-Ribose den Riboflavin-pyrophosphat-ribose- Rest in Flavin-adenin-dinukleotid darstellt, n=2 bis 6 bedeutet, β ¹ und β ² unabhängig voneinander Wasserstoff oder Jod bedeuten.

Die FAD-markierten Konjugate werden in Bindungsversuchen für Liganden oder für spezifische Bindungspartner davon verwendet und werden bestimmt, d. h. überwacht, für die Zwecke dieser Untersuchungsmethode durch Messung der FAD- Aktivität, z. B. der Coenzym- oder prostetischen Gruppenaktivität, die bei der Kombination eines solchen Konjugats mit einem Apoenzym erzeugt wird, welches FAD veranlaßt, seine katalytische Funktion auszuüben. Dies wird ausführlich in der vorerwähnten DE-OS 29 24 249 beschrieben.

Die vorliegenden FAD-markierten Konjugate können auf verschiedene Weise hergestellt werden. Beispielsweise besteht eine Syntheseroute in der folgenden allgemeinen Reaktion:

Bei der Umsetzung von 6-Chlor-9-(2′,3′-O-isopropyliden-β- D-ribofuranosyl)-purin (1) (Hampton et al., J. Am. Chem. Soc., 83, 150 [1961]) mit einem α,ω-Diaminoalkan, ausgewählt aus der in Tabelle 2 gezeigten Aufstellung

n
α,ω-Diaminoalkan
2
1,2-Diaminoethan
3	1,3-Diaminopropan
4	1,4-Diaminobutan
5	1,5-Diaminopentan
6	1,6-Diaminohexan

erhält man das Zwischenprodukt 6-(ω-Aminoalkyl)-9-(2′,3′- O-isopropyliden-β-D-ribofuranosyl)-purin (2)

Das Aminopurin-Zwischenprodukt (2) wird dann durch Bildung einer Peptid- oder Amidbindung mit entweder dem Liganden, sofern dieser eine Carbonsäurefunktion aufweist, oder einem Bindungsanalog des Liganden (z. B. einem Derivat des Liganden), wobei der Analog die gewünschte Carbonsäurefunktion aufweist, verbunden unter Bildung des Liganden- oder Analog- substituierten Adenosin-Zwischenproduktes (3)

worin der Ligand oder dessen Analog, gebunden über eine Amidbindung, darstellt. Solche Kondensationsreaktionen können durchgeführt werden, indem man das Aminopurin-Zwischenprodukt (2) direkt mit dem Carbonsäure enthaltenden Liganden oder dem Ligandenanalogen unter Anwendung üblicher Peptidkondensationsreaktionen umsetzt, z. B. der Carbodiimidreaktion (Science, 144, 1344 [1964]), der Mischanhydridreaktion (Erlanger et al., Methods in Immunology and Immunochemistry, herausgegeben von Williams and Chase, Academic Press [New York, 1967], S. 149) und der Säureazid- und Aktivesterreaktionen (Kopple, Peptides and Amino Acids, W. A. Benjamin, Inc. [New York, 1966]). Ein allgemeiner Überblick wird in Clin. Chem., 22, 726 (1976), gegeben.

Es ist natürlich ersichtlich, daß andere gut bekannte Verfahren zum Kuppeln des Liganden oder eines Derivates davon an das Aminopurin-Zwischenprodukt (2) möglich sind. Insbesondere können übliche bifunktionelle Kupplungsmittel zum Kuppeln eines Liganden oder dessen Derivat, enthaltend eine Carbonsäure- oder Aminogruppe, an das Aminopurin- Zwischenprodukt (2) verwendet werden. Zum Beispiel können Amin-Amin-Kupplungsmittel, wie Bis-isocyanate, Bis-imidoester und Glutaraldehyd (Immunochem., 6, 53 [1969]) zum Kuppeln eines Liganden oder dessen Derivats, enthaltend eine Aminogruppe, an das Aminopurin-Zwischenprodukt (2) verwendet werden. Es sind weiterhin auch geeignete Kupplungsreaktionen zum Einführen einer Brückengruppe beim Kuppeln eines Amins bekannt (z. B. des Aminopurin-Zwischenproduktes) an eine Carbonsäure (z. B. den Liganden oder ein Derivat davon) bekannt. Kupplungsreaktionen dieser Art werden genau, z. B. in der vorerwähnten Monografie von Kopple und in Lowe & Dean, Affinity Chromatography, John Wiley & Sons (New York, 1974) beschrieben.

Solche Kupplungsverfahren können als Äquivalente für die vorher erwähnten Peptid-Kondensationsreaktionen für die Herstellung von brauchbaren markierten Konjugaten angesehen werden. Die Wahl der Kupplungstechnik hängt von den in dem Liganden oder dessen Analog für die Kupplung an das Aminopurin-Zwischenprodukt (2) zur Verfügung stehenden Funktionalitäten und der Länge der gewünschten Brückengruppe ab. In allen Fällen umfaßt bei der vorliegenden Erfindung das entstandene Kondensationsprodukt das Aminopurinderivat, das dann schließlich in FAD umgewandelt wird, gebunden an den restlichen Teil des Produktes, oder gebunden an den restlichen Teil des FAD-markierten Konjugats, und zwar über eine Amidbindung. Ein solcher Restteil des Kondensationsproduktes oder Konjugats wird als Rest eines Bindungsanalogs des Liganden angesehen, sofern der Ligand nicht selbst direkt an das Aminopurin-Zwischenprodukt (2) gekuppelt ist. In der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen bedeutet die Abkürzung den Liganden oder dessen Bindungsanalog, gekuppelt über eine Amidbindung, wobei das Analog ein Derivat des Liganden, gekuppelt durch Peptidkondensation, sein kann oder den Liganden oder dessen Derivat darstellt, gekuppelt über eine Brückengruppe, die eingesetzt wurde durch Kupplung des Liganden oder dessen Derivats mit einem bifunktionellen Kupplungsmittel.

Es liegt auf der Hand, daß beim Kuppeln des Liganden oder dessen Derivats an das Aminopurin-Zwischenprodukt (2) es wünschenswert sein kann, gewisse reaktive Gruppen in einem solchen Liganden, um Nebenreaktionen während der Kupplungsreaktion zu vermeiden, zu schützen.

Der Schutz der reaktiven Gruppen kann auch wünschenswert sein, um störende Reaktionen während der Synthesestufen, die nachfolgend für die Herstellung der Zubereitungen von FAD- markierten Konjugaten beschrieben werden, zu vermeiden. Abhängig von dem spezifischen Liganden oder dessen Derivaten, das bei der gewählten Kupplungsmethode angewendet wird, kann die Zugabe von Schutzgruppen an den reaktiven Stellen in dem Liganden oder dessen Derivat vor oder nach der Kupplung an das Aminopurin-Zwischenprodukt (2) erfolgen. Der Fachmann hat hier eine große Auswahl an üblichen Blockierungsreaktionen zur Verfügung, mit denen er den gewünschten Schutz der reaktiven Gruppen vornehmen kann, wobei die zugeführte Blockierungsgruppe auch wieder einfach in einer nachfolgenden Synthesestufe entfernt werden kann, um den ursprünglichen Liganden oder dessen Derivat, gekuppelt an FAD, zu erhalten.

Ist z. B. der Ligand ein Jodothyronin, so wird bevorzugt, die Aminogruppe vor der Kondensation oder Bindung mit dem Aminopurin-Zwischenprodukt zu schützen. Das Amino-geschützte Jodothyronin-Zwischenprodukt hat die Formel

β ¹, β ²=H oder J,
worin Y eine Aminoschutzgruppe bedeutet. Es ist ersichtlich, daß der Schutz der Aminogruppe ein übliches Verfahren ist und daß man die Aminoschutzgruppe aus einer Vielzahl von Gruppen auswählen kann, einschließlich der Trifluoracetylgruppe, die bevorzugt wird, und dergleichen und auch anderen Gruppen vom Acyltyp (z. B. Formyl, Benzoyl, Phthalyl, p-Tosyl, Aryl- und Alkylphosphoryl, Phenyl- und Benzylsulfonyl, Tritylsulfenyl, o-Nitrophenyl-sulfenyl und o-Nitrophenoxyacetyl), solchen vom Alkyltyp (z. B. Trityl, Benzyl und Alkyliden) und solchen vom Urethantyp (z. B. Carbobenzoxy, p-Brom-, p-Chlor- und p-Methoxycarbobenzoxy, Tosyloxyalkyloxy-, Cyclopentyloxy-, Cyclohexyloxy-, t-Butyloxy-, 1,1-Dimethylpropyloxy-, 2-(p-Biphenyl)-2-propyloxy- und Benzylthiocarbonyl.

Die substituierten Adenosin-Zwischenprodukte, die durch Kondensation bzw. Bindung zwischen dem Aminopurin-Zwischenprodukt (2) und dem Amino-geschützten Jotothyronin-Zwischenprodukt (4) erfolgt, haben die Formel (3), worin

β ¹, β ²=H oder J,
worin Y eine der vorerwähnten Aminoschutzgruppen ist.

Die Behandlung des Zwischenproduktes (3) mit Phosphoroxychlorid ergibt das mit dem phosphorylierten Liganden oder dessen Analog substituierte Adenosin-Zwischenprodukt (6)

welches bei der Hydrolyse das durch den Liganden oder dessen Analog substituierte 5′-Adenylsäure-Zwischenprodukt (7)

ergibt.

Die Kondensation von Riboflavin-5′-monophosphat mit dem Zwischenprodukt (7), aktiviert zu einem Phosphorimidazolidat durch Behandlung mit N,N′-Carbonyldiimidazol, ergibt FAD-markierte Konjugate (8)

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform, bei der der Ligand Jodothyronin ist und somit durch die Formel (5) dargestellt wird, hat das entstehende FAD-Jodothyroninkonjugat die Formel (9)

β¹, β²=H oder J,
worin Y eine Aminoschutzgruppe ist oder nach üblicher Behandlung zur Entfernung einer solchen Schutzgruppe Y Wasserstoff darstellt.

Wie vorher dargestellt, haben die neuen Zwischenprodukte (2), (3), (6) und (7), die im Laufe der Synthese der FAD- markierten Konjugate gebildet werden, die folgenden allgemeinen Formeln (das Aminopurin-Zwischenprodukt (2) entspricht der Formel A, und die Zwischenprodukte (3), (6) und (7) entsprechen der Formel B,

Formel A

worin n=2 bis 6 ist; und

Formel B

worin ein spezifisch bindungsfähiger Ligand ist oder ein Bindungsanalog dazu und vorzugsweise die Formel (5) hat, gebunden über eine Amidbindung; n=2 bis 6 und β ¹ und β ² unabhängig voneinander Wasserstoff oder Jod bedeuten und

bedeutet, wenn R² und R³ zusammen die Gruppe

bedeutet, und

bedeutet, wenn R² und R³ OH bedeuten.

Wie bereits dargelegt, ist der Ligand in dem markierten Konjugat oder dessen Bindungsanalog in den meisten Fällen ein immunologisch aktives Polypeptid oder Protein mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4 000 000, wie ein antigenisches Polypeptid oder Protein oder ein Antikörper oder ein Hapten mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1500. Verschiedene Verfahren zum Kuppeln solcher Liganden oder Analogen davon an das Aminopurin-Zwischenprodukt (2) über eine Amidbindung bei der Synthese der vorliegenden FAD-markierten Konjugate werden nachfolgend gezeigt.

Polypeptide und Proteine

Typische und spezifische bindungsfähige Proteinliganden sind im allgemeinen Antikörper, insbesondere solche der IgG-, IgE-, IgM- und IgA-Klasse, z. B. Hepatitis B-Antikörper, und antigenische Proteine, wie Insulin, chorionisches Gonadotropin (z. B. HCG), carcinoembrionisches Antigen (CEA), Myoglobin, Hämoglobin, follikelstimulierendes Hormon, humanes Wachstumshormon, thyroidstimulierendes Hormon (TSH), humanes Placentalactogen, Thyroxinbindungsglobulin (TSG), instrinsischer Faktor, Transcobalamin, Enzyme, wie alkalische Phosphatase und Milchsäuredehydrogenase, und hepatitisassoziierte Antigene, wie Hepatitis B- Oberflächenantigen (HB_sAg), Hepatitis e-Antigen (HB_eAg) und Hepatitis-Kernantigen (HB_vAg). Typische Polypeptid-Liganden sind Angiotensin I und II, C-Peptid, Oxytocin, Vasopressin, Neurophysin. Gastrin, Secretin und Glucagon.

Da Liganden dieser allgemeinen Kategorie als Peptide zahlreiche verfügbare Carbonsäure- und Aminogruppen aufweisen, kann die Kupplung des Aminopurin-Zwischenproduktes (2) nach üblichen Peptid-Kondensationsreaktionen durchgeführt werden, wie durch eine Carbodiimidreaktion, der Mischanhydridreaktion und dergleichen, wie sie bereits vorher erwähnt wurden, oder unter Verwendung von üblichen bifunktionellen Reagentien, die in der Lage sind, eine Kupplung von Carbonsäure- oder Aminofunktionen in der Aminogruppe des Aminopurin-Zwischenproduktes (2), wie vorher beschrieben, zu bewirken. Allgemeine Hinweise bezüglich der Kupplung von Proteinen an primäre Amine oder Carbonsäuren wurden bereits vorher gegeben.

Haptene

Haptene stellen eine große Klasse organischer Substanzen dar, die eine immunochemische Reaktion in einem Gasttier nur dann entwickeln, wenn sie in Form eines immunogenen Konjugates aus dem Hapten, gekuppelt an ein Trägermolekül, und zwar in den meisten Fällen einem Protein, wie Albumin, injiziert werden. Die Kupplungsreaktionen zur Bildung der immunogenen Konjugate sind aus dem Stand der Technik bekannt und bestehen im allgemeinen aus der Kupplung eines Carbonsäure-Liganden oder eines Carbonsäurederivates des Liganden an eine verfügbare Aminogruppe des Proteinträgers unter Bildung einer Amidbindung. Solche bekannten Kupplungsreaktionen sind direkte Analoge zu der vorliegenden Bildung von markierten Konjugaten durch Kupplung von Carbonsäureliganden oder deren Bindungsanalogen an das Aminopurin-Zwischenprodukt (2).

Hapten-Liganden, die selbst Carbonsäurefunktionen aufweisen, mittels derer sie direkt an das Aminopurin-Zwischenprodukt (2) gekuppelt werden können, sind z. B. Jodthyroninhormone, wie Thyroxin und Liothyronin, und auch andere Stoffe, wie Biotin, Valpronsäure, Folsäure und gewisse Prostaglandine. Es folgen typische Synthesewege zur Herstellung von Carbonsäure-Bindungsanalogen von Hapten-Liganden, die selbst keine verfügbaren Carbonsäurefunktionen enthalten, wodurch solche Analoge an das Aminopurin-Zwischenprodukt (2) durch die vorerwähnte Peptid-Kondensationsreaktion oder eine bifunktionelle Kupplungsmittelreaktion gekuppelt werden kann (in der nachfolgenden Strukturformel bedeutet n eine ganze Zahl, gewöhnlich 1 bis 6, und Me bedeutet Methyl).

Carbamazepin

Dibenz[b,f]azepin wird nacheinander mit Phosgen, einem ω-Aminoalkanol, und Jones-Reagens (Chromtrioxid in Schwefelsäure) nach dem Verfahren von Singh, gemäß US-PS 40 58 511 behandelt, wobei man die folgende Reihe von Carbonsäuren erhält:

Chinidin

Arbeitet man nach dem Verfahren von Cook et al., Pharmacologist, 17, 219 (1975), so wird Chinidin demethyliert und dann mit 5-Bromvalerat behandelt und anschließend sauer hydrolysiert unter Bildung eines geeigneten Carbonsäurederivates.

Digoxin und Digitoxin

Das Aglycon des Herzglycosids wird mit Bernsteinsäureanhydrid und Pyridin nach dem Verfahren von Oliver et al., J. Clin. Invest., 47, 1035 (1968), behandelt, wobei man folgende Verbindung erhält

Theophyllin

Nach dem Verfahren von Cook et al., Res. Comm. Chem. Path. Pharm., 13, 497 (1976), wird 4,5-Diamino-1,3-dimethylpyrimidin- 2,6-dion mit Glutarsäureanhydrid erhitzt, wobei man

erhält.

Phenobarbital und Primidon

Natriumphenobarbital wird mit Methyl-5-bromovalerat erhitzt, und das Produkt wird zu dem entsprechenden Säurederivat von Phenobarbital hydrolysiert (Cook et al., Qantitative Analytic Studies in Epilepsy, herausgegeben von Kelleway und Peterson, Raven Press [New York, 1976], S. 39-58):

Um das Säurederivat von Primidon zu erhalten unter Verwendung der gleichen Methode von Cook et al. wird 2-Thiophenbarbital analysiert, hydrolysiert und das Produkt mit Raney-Nickel behandelt, wobei man

erhält.

Diphenylhydantoin

Nach dem Verfahren von Cook et al., Res. Comm. Chem. Path. Pharm., 5, 767 (1973), wird Natriumdiphenylhydatoin mit Methyl-5-bromovalerat umgesetzt und anschließend sauer hydrolysiert, wobei man

erhält.

Morphin

Freie Morphinbase wird mit Natrium-β-chloracetat nach dem Verfahren von Spector et al., Science, 168, 1347 (1970), behandelt, wobei man ein geeignetes Carbonsäurederivat erhält.

Nikotin

Nach dem Verfahren von Langone et al., Biochem., 12 (24), 5025 (1973), werden trans-Hydroxymethylnikotin und Bernsteinsäureanhydrid umgesetzt, wobei man

erhält.

Androgene

Geeignete Carbonsäurederivate von Testosteron und Androstendion, die über einer der 1- oder 7-Stellungen des Steroidkerns verknüpft sind, erhält man nach dem Verfahren von Bauminger et al., J. Steroid Biochem. 5, 739 (1974). Typische Testosteronderivat sind

Östrogene

Geeignete Carbonsäurederivate von Östrogenen, z. B. Östron, Östradiol und Östriol, erhält man nach dem Verfahren von Bauminger et al. Ein typisches Östronderivat ist

Progesterone

Geeignete Carbonsäurederivate von Progesteron und dessen Metaboliten, die über eine der 3-, 6- oder 7-Stellungen im Steroidkern verknüpft sind, erhält man nach dem Verfahren von Bauminger et al. Ein typisches Beispiel hierfür sind

Die vorerwähnten Verfahren sind lediglich Beispiele für die vielen geeigneten Verfahren zur Herstellung von Carbonsäurederivaten von Haptenen, von analytischem Interesse. Die grundsätzlichen Verfahren zur Herstellung von Derivaten sind in Clin. Chem., 22, 726 (1976), beschrieben und schließlich die Veresterung eines primären Alkohols mit Bernsteinsäureanhydrid (Abraham und Grover, Principles of Competitive Protein-Binding Assays, herausgegeben von Odell und Daughaday, J. B. Lippincott Co. [Philadelphia, 1971], S. 140-157), die Bildung eines Oxims aus der Umsetzung einer Ketongruppe mit einem Carboxymethylhydroxylamin (J. Biol. Chem., 234, 1090 (1959), die Einführung einer Carbonsäuregruppe in einen Phenolrest unter Verwendung von Chloracetat (Science, 1968, 1347 [1970]) und das Kuppeln an diazotierte p-Aminobenzoesäure in der in J. Biol. Chem., 235, 1051 (1960), beschriebenen Verfahrensweise ein.

Das allgemeine Reaktionsschema, wie vorher beschrieben, wird durch die folgende Beschreibung für die Synthese von Ethyl-(n=2)- und Hexyl-(n=6)-analogen der FAD- markierten Konjugate in Beispielen gezeigt, bei denen der Ligand das Jodothyroninthyroxin ist (d. h. hat die Formel (5), worin β ¹ und b ² beide Jod bedeuten). In der Beschreibung sind auch Untersuchungsmethoden und die erzielten Ergebnisse gezeigt, die erhalten wurden unter Anwendung der in den Beispielen beschriebenen Analogen von markierten Konjugaten in spezifischen Bindungs-Untersuchungen für Thyroxin.

1. Ethylanalog 1-I. Herstellung des markierten Konjugats 6-(2-Aminoethyl)-amino-9-(2′,3′-O-isopropyliden-β-D-ribofuranosyl)- purin (2)

13,56 g (41,5 mmol) 6-Chlor-9-(2′,3′-O-isopropyliden-β-D-ribofuranosyl)- purin (1) (Hampton et al., J. Am. Chem. Soc., 83, 150 [1961]) wurden während 15 Minuten unter Rühren zu einem kalten Überschuß an 1,2-Diaminoäthan (75 ml) gegeben. Die erhaltene Lösung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wurde im Vakuum eingedampft und das erhaltene gelbe Öl wurde mit 50 ml kaltem, gesättigtem Natriumbicarbonat gerührt. Die Mischung wurde im Vakuum eingedampft, und der erhaltene Rückstand wurde wiederholt im Vakuum eingedampft, zuerst aus Wasser (dreimal aus 50 ml) und daß aus 2-Propanol (viermal aus 50 ml), wobei man ein gelbes, glasartiges Produkt (15 g) erhielt. Ein Teil (3 g) des glasartigen Produktes wurde in einer geringen Menge Wasser gelöst und auf die Spitze einer 25×55 cm mit Dowex® 50W-X2-Kationenaustauscherharz in der Ammoniumform gefüllte Kolonne gegeben.

Die Kolonne wurde mit einem linearen Gradienten mit 2 l von jeweils Wasser und 0,5 mol/l Ammoniumbicarbonat eluiert. Die Eluierung wurde vervollständigt unter Verwendung eines Lineargradienten der erzeugt wurde mit 2 l von jeweils 0,5 mol/l und 1 mol/l. Ammoniumbicarbonat. Der Abfluß aus dieser Säule wurde in 19-ml-Fraktionen gesammelt und durch Eluieren über Platten aus Kieselgel dünnschichtchromatografisch mit einer Mischung von 9 : 1 (V/V) aus Äthanol und Ammoniumhydroxid behandelt. Die entwickelten TLC-Platten (Dünnschichtchromatografieplatten) wurden unter ultraviolettem Licht untersucht und mit Ninhydrinreagenz besprüht (Randerath, Thin Layer Chromatography, Academic Press [1966]). Die Fraktionen 250 bis 350 aus der Säulenchromatografie wurden vereint und im Vakuum eingedampft, wobei man das gewünschte Purin (2) als schwarzgelbes amorphes Glas (1,5 g) erhielt.

Analyse für C₁₅H₂₂N₆O₄:
Berechnet: C 51,42, H 6,33, N 23,99;
gefunden: C 50,92, H 6,54, N 23,01.

NMR (60 MHz, CDCl₃):
δ 1,32 (s, 3 H, Isopropyliden), 1,63 (s, 3 H, Isopropyliden), 5,92 (d, 1 H, 1′-Ribose), 7,90 (s, 1 H, Purin), 8,26 (s, 1 H, Purin).

Optische Drehung [α] =-74,85° (c 1,0, CH₃OH).

Das zurückbleibende Rohprodukt (12 g) wurde chromatografisch über Dowex® 50W-X2, wie vorher beschrieben, gereinigt. Die Gesamtausbeute betrug 8 g (55%).

α-(N-Trifluoracetyl)-amino-b-[3,5-dÿodo-4-(3′,5′-dÿodo-4′- hydroxyphenoxy)-phenyl]-propansäure (4)

Diese Verbindung wurde nach dem Verfahren von Blank, J. Pharm. Sci., 53, 1333 (1964), hergestellt. Zu einer gekühlten (0°C) und gerührten Suspension von 5 g (6,4 mmol) L-Thyroxin in 60 ml trockenem Ethylacetat wurden 11,5 ml Trifluoressigsäure und 1,9 ml Trifluoressigsäureanhydrid gegeben. Nach 30 Minuten wurden die erhaltenen klaren Lösungen dreimal mit 30 ml Wasser, einmal mit 30 ml einer 5%igen Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit 50 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die vereinten wäßrigen Waschungen wurden zweimal mit 20 ml Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschichten wurden kombiniert und mit 30 ml Wasser gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Die getrocknete Ethylacetatlösung wurde im Vakuum eingedampft, wobei ein weißer Feststoff zurückblieb. Beim Umkristallisieren aus einer Mischung aus Ethylether und Petrolether erhielt man einen weiß-rosa Feststoff (3,95 g, 70,5%) mit dem Schmelzpunkt 228 bis 230°C (Zersetzung).

Analyse für C₁₇H₁₀F₃J₄NO₅:
Berechnet: C 23,39, H 1,15, N 1,60;
gefunden: C 23,00, H 1,05, N 1,65.

NMR [60 MHz, DCON(CD₃)₂]:
δ 7,28 (s, 2 H, aromatisch), 8,03 (s, 2 H, aromatisch), 9,7 (m, 1 H, Amido).

IR (KCl): 1700 (<C=0).

Optische Drehung [α] =-14,97° (c 1,0 Dimethylsulfoxid).

Bei einer zweiten Umkristallisation wurde ein zweiter Niederschlag (0,95 g), F 224 bis 228°C (Zersetzung) erhalten. Die Gesamtausbeute betrug 87,5%.

N-{2-[N-(Trifluoracetyl)-3,3′,5,5′-tetrajodothyronyl]- aminoethyl}-2′,3′-O-isopropyliden-adenosin (3)

Eine Lösung aus 8,72 g (10,0 mmol) α-(N-Trifluoracetyl)- amino-β-[3,5-dÿodo-4-(3′,5′-dÿodo-4′-hydroxyphenoxy)- phenyl]-propansäure (4) und 3,6 g (11,0 mmol) 6-(2-Aminoethyl)- amino-9-(2′,3′-O-isopropyliden-β-D-ribofuranosyl)- purin (2) in 50 ml trockenem Dimethylacetamid wurde bei -20°C unter einer trockenen Argonatmosphäre hergestellt. Zu dieser kalt gerührten Lösung wurde eine Lösung aus 3,04 g (11,0 mmol) Diphenylphosphorylacid in 10 ml trockenem Dimethylacetamid gegeben, und anschließend wurden 1,6 ml (11,0 mmol) trockenes Triethylamin zugegeben. Die Lösung wurde 22 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Zu der Lösung wurden dann bei 0°C 300 ml Wasser unter Rühren zugegeben. Der erhaltene weiße Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt und im Vakuum (56°C) getrocknet, wobei man 13,0 g eines hellen cremefarbenen Feststoffes erhielt. Der Feststoff wurde in 500 ml Aceton gelöst, und die Lösung wurde durch Sieden konzentriert. Der aus der siedenden Acetonlösung ausfallende weiße Feststoff wurde noch in der Hitze filtriert. Weiteres Sieden des Filtrats ergab zwei weitere Ausfällungen. Die drei Ausfällungen wurden vereint, wobei man 8 g (66,6%) eines weißen Feststoffes, F 198 bis 200°C (Zersetzung) erhielt.

Analyse für C₃₂H₃₀F₃J₄N₇O₈:
Berechnet: C 31,89, H 2,51, N 8,14;
gefunden: C 31,95, H 2,60, N 7,86.

NMR [220 MHz, (CD₃)₂SO]:
δ 1,32 (s, 3 H, Isopropyliden), 1,55 (s, 3 H, Isopropyliden), 6,14 (d, 1 H, 1′-Ribose), 7,02 (s, 2 H, Thyroxin), 7,82 (s, 2 H, Thyroxin), 8,25 (s, 1 H, Purin), 8,36 (s, 1 H, Purin), 8,41 (t, 1 H, J=6, Amido), 9,64 (d, 1 H, J=8, Trifluoracetamido).

Optische Drehung [α] =-11,82° (c 1,0, Pyridin).

N-{2-[N-(Trifluoracetyl)-3,3′,5,5′-tetrajodothyronyl]- aminoethyl}-2′,3′-O-isopropyliden-5′-adenylsäure-monotriäthylaminsalzmonohydrat-  (6)

Eine Lösung aus 1,2 g (1,0 mmol) N-{2-[N-Trifluoracetyl)- 3,3′,5,5′-tetrajodothyronyl]-aminoethyl}-2′,3′-O-isopropliden- adenosin (3) in 10 ml trockenem Triethylphosphat wurde bei 0°C unter einer trockenen Argonatmosphäre hergestellt. Zu der kalten gerührten Lösung wurden 0,45 ml (5 mmol) Phosphoroxychlorid gegeben. Die erhaltene Lösung wurde 24 Stunden bei 0°C gehalten und dann tropfenweise unter Rühren zu 1 l Eiswasser gegeben. Der ausgefallene Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt und im Vakuum getrocknet, wobei man 1,23 g eines weißen Feststoffs erhielt. Der Feststoff wurde in Aceton gelöst, und 0,32 ml (2,2 mmol) Triethanolamin wurden zugegeben. Es bildete sich ein Niederschlag. Die Mischung wurde im Vakuum eingedampft und mit trockenem Aceton ausgelaugt und dann aus einer Mischung aus trockenem Methylalkohol und trockenem Ethylether umkristallisiert, wobei man 390 mg (27,8% Ausbeute) eines weißen Feststoffes, F 173 bis 183°C (Zersetzung) erhielt.

Analyse für C₃₈H₄₈F₃J₄N₈O₁₂P:
Berechnet: C 32,50, H 3,45, N 7,98;
gefunden: C 32,24, H 3,08, N 7,58.

NMR [60 MHz, (CD₃)₂SO]:
δ 1,53 (s, 3 H, Isopropyliden), 6,2 (d, 1 H, 1′ H-Ribose), 7,1 (s, 2 H, Thyroxin aromatisch), 7,87 (s, 2 H, Thyroxin aromatisch), 8,27 (s, 1 H, Purin), 8,52 (s, 1 H, Purin).

Optische Drehung [α] =-17,50° (c 1,0, CH₃OH).

N-{2-[N-(Trifluoracetyl)-3,3′,5,5′-tetrajodothyronyl]-aminoethyl}- 5′-adenylsäure (7)

200 mg (0,14 mmol) N-{2-[N-(Trifluoracetyl)-3,3′,5,5′-tetrajodothyronyl]- aminoethyl}-2′,3′-O-isopropyliden-5′-adenylsäure- monotriethylaminsalz-monohydrat (6) wurden in 1 ml Wasser (0°C) suspendiert, und unter Rühren wurden tropfenweise 9 ml Trifluoressigsäure zugegeben. Nach 30 Minuten erhielt man eine klare Lösung. Die Lösung wurde kalt (0°C) weitere 15 Stunden gehalten und dann im Vakuum (30°C) eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde viermal im Vakuum (25°C) aus 20 ml Volumina wasserfreiem Ethylalkohol eingedampft und dann im Vakuum (25°C) getrocknet, wobei ein weißer Feststoff zurückblieb.

Der Feststoff wurde 30 Minuten mit 10 ml kaltem Methylalkohol gerührt, dann durch Filtrieren gesammelt und im Vakuum (25°C) getrocknet, wobei man einen weißen Feststoff (135 mg, 76% Ausbeute) erhielt, der langsam unter Zersetzung oberhalb 188°C schmolz.

Analyse für C₂₉H₂₇F₃J₄O₁₁P:
Berechnet: C 27,97, H 2,19, N 7,87;
gefunden: C 28,11, H 2,31, N 7,65.

NMR [220 MHz, (CD₃)₂SO]:
δ 5,95 (d, 1 H, 1′-Ribose), 7,04 (s, 2 H, Thyroxin aromatisch), 7,84 (s, 2 H, Thyroxin aromatisch), 8,25 (s, 1 H, Purin), 8,36 (s, 1 H, Purin), 8,43 (m, 1 H, Amido), 9,66 (d, 1 H, Trifluoracetamido).

Optische Drehung [α] =-2,72° (c 1,0, Pyridin).

Flavin-adenin-dinukleotid-thyroxin-Konjugat (8)

498 mg (0,4 mmol) N-{2-[N-(Trifluoracetyl)-3,3′,5,5′- tetrajodothyronyl]-aminoethyl}-5′-adenylsäure (7) wurden in 10 ml trockenem Dimethylformamid gelöst, und Tri-n- butylamin (96 µl, 0,4 mmol) wurden hinzugegeben und anschließend 1,1′-Carbonyldiimidazol (320 mg, 2,0 mmol). Nach 18stündigem Rühren bei Raumtemperatur in Abwesenheit von Feuchtigkeit wurde Wasser (280 µl) zugegeben und das Lösungsmittel im Vakuum eingedampft.

Das erhaltene Öl wurde wiederholt im Vakuum aus trockenem Dimethylformamid (4× aus 10 ml) getrocknet. Das entstandene Phosphorimidazolidat wurde wiederum in 10 ml trockenem Dimethylformamid aufgelöst und tropfenweise zu einer 0,4-mmol-Lösung von Tri-n-octylaminsalz von Riboflavin-5′- monophosphat in 10 ml trockenem Dimethylformamid gegeben. Das Salz wurde hergestellt indem man eine Lösung des Ammoniumsalzes von Riboflavin-5′-monophosphat (192 mg, 0,4 mmol) in 10 ml Wasser zu einer gerührten Lösung aus Tri-n-octylamin (176 µl, 0,4 mmol) in 100 ml Aceton gab. Nach 30 Minuten wurde die erhaltene Mischung im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde durch wiederholtes Verdampfen im Vakuum aus trockenem Dimethylformamid getrocknet, wobei das Salz als organgefarbener Feststoff zurückblieb.

Die obige Lösung, enthaltend das Phosphorimidazolidat von (7) und das Riboflavin-5′-monophosphatsalz wurden nach 24 Stunden in zwei aliquote Teile geteilt, und ein Aliquot wurde im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde über einer Säule (2,5×78 cm) von 100 g Sephadex® LH-20, der bereits angequollen war (18 Stunden) in einer 19 : 1-(V/V)-Mischung von Dimethylformamid und Triethylammoniumbicarbonat ( mol/l, pH 7,5) chromatografiert.

Die Lösung wurde mit der obigen 19 : 1-(V/V)-Mischung eluiert, und 10-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Der Ausfluß aus der Säule wurde durch Eluierung über Kieselgel 60 silanisierten RP-2®TLC-Platten (E. Merck, Darmstadt) kontrolliert.

Die TLC-Platten wurden entwickelt unter Verwendung einer 40 : 40 : 25 : 1-(V/V)-Mischung aus Aceton, Chloroform, Methylalkohol, Wasser und Triethylamin. Die Fraktionen 11 bis 17 aus der vorerwähnten Säulenchromatografie wurden vereint und im Vakumm eingedampft. Der Rückstand wurde über einer Säule (2,5×75 cm), hergestellt aus 125 g Sephadex® LH-20, die 18 Stunden in 0,3 mol/l Ammoniumbicarbonat vorgequollen worden war, chromatografiert. Die Säule wurde mit 0,3 mol/l Ammoniumbicarbonat eluiert, und 10-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Der Abfluß wurde durch Absorption von ultraviolettem Licht bei 254 nm überwacht. Das Volumen der Fraktionen wurde auf 20 ml, beginnend mit der Fraktion Nr. 150, erhöht. Die Salzkonzentration aus dem Abfluß wurde stufenweise wie folgt vermindert: 0,15 mol/l Ammoniumbicarbonat bei Fraktion Nr. 295, 0,075 mol/l Ammoniumnat bei Fraktion Nr. 376 und Wasser bei Fraktion Nr. 430. Insgesamt wurden 480 Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 200 und 235 wurden vereint und im Vakuum eingedampft, wobei das markierte Konjugat (8) als gelb-oranger Rückstand zurückblieb. Eine alkalische wäßrige Lösung dieses Rückstandes zeigte Ultraviolett-Absorptionsmaxima bei den folgenden Wellenlängen: 266 nm, 350 nm, 373 nm und 450 nm. Die Ausbeute, berechnet für die Absorption bei 450, betrug etwa 5%.

Eine Phosphodiesterase-Zubereitung, isoliert aus Schlangengift (Crotalus Adamanteus), hydrolysierte das obige Produkt zu Riboflavin-5′-monophosphat und der Thyroxin-substituierten 5′-Adenylsäure (7), von welcher die Trifluoracetyl-Blockierungsgruppe entfernt worden war.

1-II. Bindungsversuch für Thyroxin

Das wie oben zubereitete markierte Konjugat wurde in einer prostetische-Gruppen-markierten-spezifischen-Bindungsversuchsanordnu-ng in folgender Weise verwendet (nähere Einzelheiten über diese Versuchsmethode finden sich in der DE-OS 29 24 249 A1):

(A) Herstellung von Apoglucose-oxidase

Gereinigte Glucoseoxidase mit niedriger Katalaseaktivität wurde zweimal 12 Stunden gegen 0,5% (W/V) Mannit (30 Volumeneinheiten jeweils) dialysiert. Aliquote der Dialysate, enthaltend 100 mg Glucoseoxidase, wurden jeweils lyophilisiert und bei -20°C aufbewahrt.

Rinderserumalbumin (200 mg) wurde in 12 ml Wasser, eingestellt auf pH 1,6 mit konzentrierter Schwefelsäure, gelöst und mit 150 mg Aktivkohle (RIA-Grad) vermischt und dann auf 0°C gekühlt. Lyophilisierte Glucoseoxidase (100 mg) wurde wieder aufgelöst in 3,1 ml Wasser, und 3 ml wurden zu der gerührten Albumin-Aktivkohle-Suspension zugegeben, und das Rühren wurde 3 Minuten fortgesetzt. Die Suspension wurde dann durch ein 0,8 µm, 25 mm Durchmesser, Filter, befestigt in einer Filterapparatur, in eine 50-ml-Plastikabsaugflasche filtriert. Das Filtrat wurde schnell auf pH 7,0 neutralisiert durch Zugabe von 2 ml 0,4 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,6) und anschließend 5 n Natriumhydroxid. Trockene Aktivkohle (150 mg) wurde dann zugegeben und das Ganze 1 Stunde bei 0°C gerührt. Die erhaltene Suspension wurde zunächst durch ein 0,8-µm- Filter filtriert und dann durch ein 0,22-µm- Filter. Zu dem Filtrat wurde Glyzerin bis zu einem Gehalt von 25% (V : V) zugegeben, und die stabilisierte Apoglucose-Oxidase-Zubereitung wurde bei 4°C gelagert.

(B) Versuchsreagentien

(1) Markiertes Konjugat: Das ethylanaloge, markierte Konjugat, hergestellt wie in Abschnitt 1-I, wurde in 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7) auf eine Konzentration von 1 mmol/l verdünnt.

(2) Apoenzym: Apoglucoseoxidase wurde mit 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7) auf eine Konzentration von 0,6 µmol/l FAD-Bindungsstellen verdünnt. Die FAD-Bindungsstellenkonzentration in der Apoenzymzubereitung wurde experimentell durch Messung der Minimummenge an FAD, die erforderlich ist, um eine maximale Glucoseoxidaseaktivität beim Inkubieren mit dem Apoenzym zu ergeben, bestimmt.

(3) Unlöslichgemachter Antikörper: Ein gewaschener, feuchter Kuchen von Sepharose® 4B-Gel (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schwefen), aktiviert mittels Cyanbromid nach dem Verfahren von March et al., Anal. Biochem., 60, 119 (1974), wurde zu einer Lösung auf 85 mg Antikörper (isoliert aus Antiserum gegen ein Thyroxin-Rinderserumalbumin- Konjugat) in 20 ml 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,0) gegeben und langsam 36 Stunden bei 4°C gerührt. Nach Beendigung der Kupplungsreaktion wurde 1 ml 1 mol/l Alanin zugegeben und 4 Stunden zum Blockieren von nichtreagierten Stellen geschüttelt. Der erhaltene sepharosegebundene Antikörper wurde auf einem Trichter mit 400 ml von jeweils 50 mmol/l Natriumacetat - 500 mmol/l Natriumchlorid (pH 5) und 50 mmol/l Phosphatpuffer sowie 500 mmol/l Natriumchlorid (pH 7,0) und 800 ml 100 mmol/l Phosphatpuffer (pH 7) gewaschen. Der feuchte Filterkuchen wurde dann in 100 mmol/l Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 0,01% Natriumazid, suspendiert, wobei man 22 ml einer etwa 50%igen Suspension erhielt.

(4) Standard: Eine 1,15-mmol/l-Vorratslösung von Thyroxin in 5 mmol/l Natriumhydroxid wurde auf 2 µmol in 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7) verdünnt.

Nachweisreagenz: Ein Glucoseoxidasereagenz für den Versuch wurde hergestellt unter Ausbildung einer Mischung, die pro 130 µl folgende Bestandteile enthielt: 25 µl 1,2 mg/ml Peroxidase in 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7), 5 µl 10 mmol/l 4-Aminoantipyrin in Wasser, 20 µl 25 mmol/l 3,5-Dochlor-2- hydroxybenzolsulfonat in 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7), 30 µl 16,5%iges Rinderserumalbumin in 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7) und 50 µl 1 mol/l Glucose in wäßriger gesättigter Benzoesäurelösung.

(C) Versuchsdurchführung

Bindungsreaktionsmischungen wurden hergestellt durch Vermischen von 150 µl der unlöslichgemachten Antikörpersuspension, 80 µl der Lösung des markierten Konjugats, unterschiedliche Mengen der Standardthyroxinlösung unter Ausbildung von unterschiedlichen Konzentrationen an Thyroxin in den Reaktionsmischungen und einem ausreichenden Volumen an 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7), um das Gesamtvolumen auf 500 µl einzustellen. Die Reaktionsmischungen wurden unter Schütteln 2 Stunden bei 25°C inkubiert. Jede Reaktionsmischung wurde dann durch eine mit Glaswolle verschlossene trockene Pasteuer-Pipette, die zuvor hintereinander mit Perjodat- und Ethylenglykollösungen zum Eleminieren einer möglichen FAD-Verunreinigung behandelt worden war, filtriert. Zu einem 300-µl-Aliquot eines jeden Filtrats wurden 130 µl des Nachweisreagenz und 50 µl der Apoenzymlösung zugegeben. Nach 1 Stunde wurde die Absorption bei jeder Reaktionsmischung bei 520 nm gemessen.

Ergebnisse

In der nachfolgenden Tabelle 3 werden die Ergebnisse der Versuchsdurchführung beim Messen von Thyroxin gezeigt. Die Absorptionsergebnisse sind Durchschnittswerte von doppelten Ansätzen, korrigiert hinsichtlich der Restenzymaktivität der Apoenzymlösung (Absorption von 0,522) und für endogenes FAD in der Antikörpersuspension (Absorption von 0,142).

Volumen an zugegebenen Thyroxinstandard (µl)
Absorption (520 nm)
0
0,223
25	0,221
75	0,281
250	0,286

Die Ergebnisse zeigen, daß die vorliegenden markierten Konjugate geeignet sind für spezifische Bindungsversuchsverfahren zum Bestimmen eines Liganden in einem flüssigen Medium.

2. Hexylanalog 2-I. Herstellung des markierten Konjugats 6-(6-Aminohexyl)-amino-9-(2′,3′-O-isopropyliden-β-D-ribofuranosyl)- purin (2)

16,0 g (50 mmol) 6-Chlor-9-(2′,3′-O-isoproyliden-β-D- ribofuranosyl)-purin (1) (Hampton et al., J. Am. Chem. Soc., 83, 1501 [1961]) wurde unter Rühren zu einer geschmolzenen Probe (70°C) von frisch destilliertem 1,6-Diaminohexan (58 g, 500 mmol) gegeben. Die erhaltene Mischung wurde unter Argon bei 40°C 18 Stunden gerührt. Das überschüssige Diamin wurde durch Destillation unter vermindertem Druck (60°C, 0,013 mbar) abdestilliert. Der zurückbleibende schwach-gelbe Rückstand wurde auf 150 g Kieselgel absorbiert und zu einer chromatografischen 9 : 1-(V : V)-Mischung aus absolutem Ethylalkohol und Triethylaminobicarbonat (pH 7,5, 1 mol/l) gegeben. Die Säule wurde mit der obigen 9 : 1-(V : V)-Lösungsmittelmischung eluiert, und es wurden 920 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatografie (TLC) über Kieselgel durch Eluieren mit einer 7 : 3-(V :V)-Mischung aus absolutem Ethylalkohol und Diethylaluminiumbicarbonat (pH 7,5, 1 mol/l) eluiert. Die Fraktionen Nr. 391 bis 900 aus der Säulenchromatografie wurden vereint und im Vakuum eingedampft, wobei 15,0 g eines glasartigen Rückstandes (74%ige Ausbeute) zurückblieben. Eine 1-g-Probe dieses glasartigen Rückstandes wurde in einem kleinen Volumen an Methylalkohol gelöst und auf eine Säule aus 80 g Sephadex® LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden), vorgequollen in Methylalkohol, gegeben. Die Säule wurde mit Methylalkohol eluiert. Insgesamt wurden 90 8-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen wurden durch TLC über Kieselgel unter Eluierung mit einer 7 : 3-(V : V)-Mischung aus absolutem Ethylalkohol und Triethylammoniumbicarbonat (pH 7,5, 1 mol/l). Die Fraktionen 19 bis 27 aus der Säulenchromatografie wurden vereint und im Vakuum eingedampft, wobei 910 mg (91% Rückgewinnung) eines weißen, glasartigen Stoffes zurückblieben.

Analyse für C₁₉H₃₀N₆O₄:
Berechnet: C 56,14, H 7,44, N 20,68;
gefunden: C 53,91, H 7,33, N 19,18.

NMR (60 MHz, CDCl₃):
δ 1,40 (s, 3 H, Isopropyliden), 1,63 (s, 3 H, Isopropyliden), 5,98 (d, 1 H, 1′-Ribose), 7,92 (s, 1 H, Purin), 8,36 (s, 1 H, Purin).

Optische Drehung [α] =-50,11° (c 1,0, Methylalkohol).

N-{6-[N-(Trifluoracetyl)-3,3′,5,5′-tetrajodothyronyl]- aminohexyl}-2′,3′-O-isopropyliden-adenosin (3)

Eine Lösung aus 4,36 g (5,0 mmol) α-(N-Trifluoracetyl)- amino-β-[3,5-dÿodo-4-(3′,5′-dÿodo-4′-hydroxyphenoxy)- phenyl]-propansäure (4), hergestellt gemäß Abschnitt 1-I, und 2,24 g (5,5 mmol) 6-(6-Aminohexyl)-amino-9-(2′,3′-O- isopropyliden-β-D-ribofuranosyl)-purin (2) in 100 ml trockenem Dimethylformamid wurde unter einer trockenen Argonatmosphäre bei -20°C hergestellt. Zu dieser kalt gerührten Lösung wurde eine Lösung aus 1,52 g (5,5 mmol) Diphenylphosphorylazid in 50 ml trockenem Dimethylformamid gegeben, und anschließend wurden 0,8 ml (5,5 mmol/l) trockenes Triethylamin zugegeben. Die Lösung wurde 22 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wurde die Lösung tropfenweise zu 600 ml kaltem (0°C) Wasser unter Rühren gegeben. Der erhaltene weiße Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt und im Vakuum (60°C) getrocknet, wobei man 4,90 g (78%ige Ausbeute) eines weißen Feststoffs erhielt. Eine Probe dieses Feststoffes wurde aus einer Mischung aus Aceton und Wasser umkristallisiert und ergab einen weißen Feststoff, F 205 bis 207°C (Zersetzung).

Analyse für C₃₆H₃₈F₃J₄N₇O₈:
Berechnet: C 34,28, H 3,04, N 7,77;
gefunden: C 34,22, H 2,99, N 7,41.

Massenspektrum (20 ma) m/e : 1262 [MH⁺], 1164 [M⁺ minus COCF₃].

Optische Drehung [α] =-21,89° (c 1,0, Pyridin).

N-{6-[N-(Trifluoracetyl)-3,3′,5,5′-tetrajodothyronyl]-aminohexyl}- 2′,3′-O-isopropyliden-5′-adenylsäure-monotriethylaminsalz- monohydrat (6)

Eine Lösung aus 1,89 g (1,5 mmol) N-{6-Trifluoracetyl)- 3,3′,5,5′-tetrajodothyronyl]-aminohexyl}-2′,3′-O-isopropylidenadenosin (3) in 15 ml trockenem Tirethylphosphat wurde in einer trockenen Argonatmosphäre bei -10°C hergestellt. Zu der kalt gerührten Lösung wurden 0,68 ml (7,5 mmol) Phosphoroxychlorid gegeben. Die erhaltene Lösung wurde 18 Stunden bei -15°C gehalten und dann tropfenweise unter Rühren zu 1,5 l Eiswasser gegeben. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt und im Vakuum getrocknet, wobei man 1,9 g (87%ige Ausbeute) eines weißen Feststoffs erhielt. Der Feststoff wurde in 10 ml Methylalkohol gelöst, und dazu wurden 0,38 ml (2,6 mmol) Triethylamin gegeben. Diese Lösung wurde im Vakuum eingedampft, und der erhaltene Rückstand wurde aus einer Mischung aus Methylalkohol und Ethylether umkristallisiert, wobei man 720 mg (33%ige Ausbeute) eines weißen Feststoffs, F 151 bis 154°C (Zersetzung) erhielt.

Analyse für C₄₂H₅₆F₃J₄N₈O₁₂P:
Berechnet: C 34,54, H 3,86, N 7,67;
gefunden: C 35,24, H 3,88, N 7,75.

Massenspektrum (20 ma) m/e : 1342 [MH⁺], 1244 [M⁺ minus COCF₃].

Optische Drehung [α] =-17,20° (c 1,0, CH₃OH).

N-{6-[N-(Trifluoracetyl)-3,3′,5,5′-tetrajodothyronyl]-aminohexyl}- 5′-adenylsäure (7)

600 mg (0,41 mmol) N-{6-[N-Trifluoracetyl)-3,3′,5,5′- tetrajodothyronyl]-aminohexyl}-2′,3′-O-isopropyliden-5′- adenylsäure-monotriethylaminsalz-monohydrat (6) wurden in 0,6 ml Wasser (0°C) suspendiert, und dazu wurden 6 ml Trifluoressigsäure tropfenweise unter Rühren zugegeben. Nach 50 min erhielt man eine klare Lösung. Die Lösung wurde bei 0°C weitere 15 h gehalten und dann im Vakuum bei 30°C eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde im Vakuum fünfmal aus 20 ml Volumina an wasserfreiem Methylalkohol eingedampft und dann mit 30 ml Wasser trituriert und mit einem geringen Volumen Methylalkohol gewaschen. Der erhaltene weiße Feststoff (430 mg) wurde aus Methylalkohol umkristallisiert, wobei man 290 mg (54,6%ige Ausbeute) als weißen Feststoff, F 180 bis 183°C (Zersetzung) erhielt.

Analyse für C₃₃H₃₅F₃J₄N₇O₁₁P:
Berechnet: C 30,46, H 2,71, N 7,54;
gefunden: C 30,77, H 2,55, N 7,29.

Massenspektrum (20 ma) m/e : 1302 [MH⁺), 1204 [M minus COCF₃].

Flavin-adenin-dinukleotid-Thyroxin-Konjugat (8)

130,13 mg (0,1 mmol) N-{6-[N-(Trifluoracetyl)-3,3′,5,5′- tetrajodothyronyl]-aminohexyl}-5′-adenylsäure (7) wurden in eine Argonatmosphäre gebracht. Zu dieser Probe wurde eine Lösung aus 14 µl (0,1 mmol) Triethylamin in 1 ml trockenem Dimethylformamid gegeben, und anschließend wurde eine Lösung aus 16,2 mg (0,1 mmol) 1,1′-Carbonyldiimidazol in 1 ml trockenem Dimethylformamid gegeben. Nach 24 Stunden wurde ein zweites Äquivalent an 1,1′-Carbonyldiimidazol (16,2 mg) in 1 ml trockenem Dimethylformamid zugegeben. Diese Reaktionsmischung ließ man insgesamt 48 Stunden unter Ausschluß von Feuchtigkeit bei Raumtemperatur reagieren. Eine Probe aus 47,3 mg (0,1 mmol) des Ammoniumsalzes von Riboflavin-5′-monophosphat wurde wie in Abschnitt 1-T zuvor beschrieben in das entsprechende Tri-n-octylaminsalz überführt. Dieses Salz wurde in 3 ml trockenem Dimethylformamid gelöst und der obigen Lösung, enthaltend das Phosphorimidazolidat des Adenylsäure-Zwischenproduktes (7), gegeben.

Die erhaltene Lösung ließ man in der Dunkelheit bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Feuchtigkeit 24 h stehen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft, und der erhaltene Rückstand wurde über einer Säule (2,5×78 cm), hergestellt aus 100 g Sephadex® LH-20, das zuvor 18 h vorgequollen worden war, in einer 19 : 1-(V : V)-Mischung aus Dimethylformamid und Trimethylammoniumbicarbonat (1 mol/l, pH 7,5) chromatografiert. Die Säule wurde mit der obigen 19 : 1-(V : V)-Mischung eluiert, und es wurden 5 ml Fraktionen gesammelt. Der Abfluß aus der Säule wurde überwacht durch Elution über Kieselgel 60-silanisierten RP-2®- TLC-Platten (E. Merck, Darmstadt). Die TLC-Platten wurden entwickelt unter Verwendung einer 40 : 40 : 25 : 1 : 1- (V : V)-Mischung aus Aceton, Choroform, Methylalkohol, Wasser und Triethylamin.

Die Fraktionen 24 bis 38 aus der Säulenchormatografie wurden vereint und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde über einer Säule (2,5×85 cm), hergestellt aus 125 g Sephadex LH-20, die zuvor 18 Stunden in 0,1 mol/l Ammoniumcarbonat vorgequollen worden war, chromatografiert. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten, erzeugt aus 2 l 0,1 mol/l Ammoniumbicarbonat und 2 l Wasser, eluiert, und es wurden 23 ml Fraktionen gesammelt. Der Abfluß wurde durch Ultraviolettabsorption (244 nm) überwacht. Die Elution wurde fortgesetzt mit 2 l 0,2 mol/l Ammoniumbicarbonat, und es wurden insgesamt 23 ml Fraktionen gesammelt. Insgesamt wurden 257 Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 70 bis 110 wurden vereint und im Vakuum eingedampft, wobei man das markierte Konjugat (8) als gelb-orangen Rückstand erhielt. Eine alkalische wäßrige Lösung aus diesem Rückstand zeigte Ultraviolettabsorptionsmaxima bei den folgenden Wellenlängen: 270 nm, 345 nm und 450 nm. Die Ausbeute, geschätzt für die Absorption bei 450 nm, betrug etwa 5%.

Eine Phosphordiesterase-Zubereitung, isoliert aus Schlangengift (Crotalus Adamanteus), hydrolysierte das obige Produkt zu Riboflavin-5′-monophosphat und die Thyroxin-substituierte 5′-Adenylsäure (7), in welcher die Trifluoracetylblockierungsgruppe entfernt worden war.

2-II. Bindungsversuch für Thyroxin

Das wie oben hergestellt markierte Konjugat wurde in einem prostetischen Gruppen-markiertem-spezifischen Bindungsversuch in folgender Weise verwendet (nähere Einzelheiten über die Versuchsmethoden finden sich in der DE-OS 29 24 249 A1).

(A) Herstellung von Apoglucoseoxidase

Das Apoenzym wurde nach dem Verfahren gemäß 1-II, Teil A, hergestellt.

(B) Versuchsreagentien

(1) Markiertes Konjugat: Das hexylanaloge, markierte Konjugat, hergestellt wie in Abschnitt 2-I, wurde in 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7) auf eine Konzentration von 100 nm verdünnt.

(2) Apoenzym: Dieses Reagenz war das gleiche wie das in Abschnitt 1-II, Teil B (2), beschriebene.

(3) Unlöslichgemachte Antikörper: Dieses Reagenz war das gleiche wie das in 1-II, Teil B (3), beschriebene.

(4) Standard: Eine 1,15 mmol/l Vorratslösung in Thyroxin von 5 mmol/l Natriumhydroxid wurde auf 1 µl in 0,1 mmol/l Phosphatpuffer (pH 7) verdünnt.

(5) Überwachungsreagenz: Ein Glucoseoxidasereagenz wurde hergestellt, so daß es folgende Mischung pro 117 µl enthielt: 25 µl 1,2 mg/ml Peroxidase in 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7), 5 µl 10 mol/l 4-Amminoantipyrin in Wasser, 20 µl 25 mmol/l 3,5-Dichlor-2- hydroxybenzolsulfonat in 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7), 17 µl 30%iges Rinderserumalbumin in 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7) und 50 µl 1 mol/l Glucose in einer wäßrigen gesättigten Benzoesäurelösung.

(C) Versuchsdurchführung

Bindungsreaktionsmischungen wurde hergestellt durch Vermischen von 30 ml der Suspension des unlöslichgemachten Antikörpers, 100 µl der Lösung des markierten Konjugats und entweder 100 µl oder gar keine Menge der Standardhydroxinlösung, sowie einem ausreichenden Volumen an 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7), bis zu einem Gesamtvolumen von 500 µl. Die Reaktionsmischungen wurden unter Schütteln 2 h bei 25°C inkubiert. Jede Reaktionsmischung wurde dann im Vakuum durch mit Glaswolle verschlossenen trockenen Pasteur-Pipetten, die zuvor hintereinander mit Perjodat- und Ethylenglykollösungen behandelt worden waren, um eine mögliche FAD- Verschmutzung auszuschließend, im Vakuum filtriert. Zu einem 350-µl-Aliquot eines jeden Filtrats wurden 117 µl des Überwachungsreagenz und 50 µl der Apoenzymlösung gegeben. Nach 1 h wurde die Absorption einer jeden Reaktionsmischung bei 520 nm gemessen.

(D) Ergebnisse

In der folgenden Tabelle 4 werden die Ergebnisse der Versuchsdurchführung zur Messung von Thyroxin gezeigt. Die Absorptionsergebnisse werden, ausgedrückt als Durchschnitt von Doppelversuchen, korrigiert, um die Restenzymaktivität in der Apoenzymlösung (Absorption von 0,467) und für endogenes FAD in der Antikörpersuspension (Absorption von 0,041).

Volumen an zugegebenem Thyroxinstandard (µl)
Absorption (520 nm)
0
0,231
100	0,295

Diese Ergebnisse zeigen, daß die vorliegenden markierten Konjugate geeignet sind, in spezifischen Bindungsversuchsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium.

Claims (7)

1. Ein Flavin-adenin-dinukleotid-markiertes Konjugat der allgemeinen Formel worin Riboflavin-(Phos)₂-Ribose den Riboflavin-pyrophosphat- ribose-Rest in Flavin-adenin-dinukleotid, n=2 bis 6 und ein Hapten mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1500, ein antigenes Polypeptid oder Protein, ein Antikörper, ein Hormon oder ein Rezeptor für ein Hormon, gebunden über eine Amidbindung, bedeutet.

2. Markiertes Konjugat gemäß Anspruch 1 der Formel worin Riboflavin-(Phos)₂-Ribose den Riboflavin-pyrophosphat- ribose-Rest in Flavin-adenin-dinukleotid, n=2 bis 6, Y eine Aminschutzgruppe oder Wasserstoff und β ¹ und β ² unabhängig voneinander Wasserstoff oder Jod bedeuten.

3. Verbindung der allgemeinen Formel worin bedeuten:
ein Hapten mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1500, ein antigenes Polypeptid oder Protein oder ein Antikörper, ein Hormon oder ein Rezeptor für ein Hormon, gebunden über eine Amidbindung,
n=2 bis 6, wenn R² und R³ zusammen die Gruppe wenn R² und R³ -OH bedeuten.

4. Verbindung gemäß Anspruch 3, worin ist, worin Y eine Aminoschutzgruppe und β ¹ und β ² unabhängig voneinander Jod oder Wasserstoff bedeuten.

5. Verbindung gemäß Anspruch 4, worin Y Trifluoracetyl ist.

6. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats der allgemeinen Formel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise folgende Stufen durchführt:

• (a) Umsetzen von 6-Chlor-9-(2′,3′-O-isopropyliden- β-D-ribofuranosyl)-purin mit einem α,ω-Diaminoalkan, ausgewählt aus 1,2-Diaminoäthan, 1,3-Diaminopropan, 1,4-Diaminobutan, 1,5-Diaminopentan und 1,6- Diaminohexan, unter Bildung eines 6-(ω-Aminoalkyl)- 9-(2′,3′-O-isopropyliden-β-D-ribofuranosyl)-purins;
• (b) Kuppeln des Haptens mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1500, des antigenen Polypeptides oder Proteins, des Antikörpers oder des Hormons oder Rezeptors für das Hormon an die primäre Aminogruppe des 6-(ω-Aminoalkyl)- 9-(2′,3′-O-isopropyliden-β-D-ribofuranosyl)-purins unter Bildung einer Amidbindung, wobei man ein substituiertes Adenosin-Zwischenprodukt erhält;
• (c) Behandeln des substituierten Adenosin-Zwischenproduktes mit Phosphoroxychlorid unter Bildung eines phosphorylierten Zwischenproduktes;
• (d) Hydrolysieren des phosphorylierten Zwischenproduktes unter Entfernung der Isopropylidengruppe unter Bildung eines 5′-Adenylsäure-Zwischenproduktes und
• (e) Kondensieren von Riboflavin-5′-monophosphat mit dem Phosphorimidazolidat, das gebildet wurde durch die Behandlung des 5′-Adenylsäure-Zwischenproduktes mit N,N′-Carbonyldiimidazol unter Ausbildung des gewünschten Flavin-adenin-dinukleotid-markierten Konjugats.

7. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 in einem spezifischen Bindungs-Untersuchungsverfahren zum Nachweis eines Haptens mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1500, eines antigenen Polypeptides oder Proteins oder eines Antikörpers in einem flüssigen Medium.