BRPI1106859A2 - Matrizes de colágeno estabilizadas contra degradação, biocompatíveis - Google Patents

Abstract

Matrizes de colágeno estabilizadas contra degradação, biocompatíveis. A presente invenção refere-se a matrizes de colágeno estabilizadas contra degradação, biocompatíveis que são distinguidas em particular pelo fato de que elas contêm constituintes de peptídeo e colágeno solúvel, a processos para a preparação de tais matrizes de colágeno, processos esses que incluem em particular reticulação química com um agente de reticulação de epóxi-funcional, e ao uso das matrizes de colágeno de acordo com a invenção como um agente farmacêutico ou cosmético, em particular para o uso tópico, e como um agente de tratamento de ferimento, como um implante ou como um agente hemostático em seres humanos ou animais, e como uma armação para a população de células na biotecnologia, pesquisa básica e nó campo de engenheiramento de tecido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MATRIZES DE COLÁGENO ESTABILIZADAS CONTRA DEGRADAÇÃO, BIOCOMPA-TÍVEIS".

Descrição Introdução e Técnica Anterior A presente invenção refere-se a matrizes de colágeno biocom-patíveis, estabilizadas por degradação que são distinguidos em particular pelo fato de que além de fibras de colágenos insolúveis elas contêm constituintes de peptídeo e colágeno solúvel, um processo para a preparação de tais matrizes de colágeno, processos esses que incluem em particular reticu-lação química com um agente de reticulação de epóxi-funcional, e ao uso das matrizes de colágeno de acordo com a invenção como um agente farmacêutico ou cosmético, em particular para o uso tópico, e também como um agente de tratamento de ferimento, como um implante ou como um a-gente hemostático em seres humanos ou animais, e como uma armação para a população de células na biotecnologia, pesquisa básica e no campo de engenheiramento de tecido.

No campo de materiais de colágeno, a provisão de materiais e armações que são mecanicamente estáveis, flexíveis e mostram estabilidade adequada contra degradação biológica desempenha um papel importante. Tais exigências de produto estão se tornando crescentemente importantes em particular no campo de tratamento de ferimento, implantes biológicos e no campo de engenheiramento de tecido e população de células de armações, mas também no campo de materiais altamente solvíveis no campo de cura de ferimento e hemóstase. No campo de cosmético, é adicionalmente desejável em particular para materiais ter uma sensação e aparência agradável enquanto ao mesmo tempo sendo bem tolerado pela pele. Além do mais, a provisão de ingredientes ativos via tais materiais de base ou suporte estabilizado pela degradação, que adicionalmente têm estabilidade mecânica, é um importante aspecto tanto nas aplicações cosméticas quanto farmacêuticas e no engenheiramento de tecido. A combinação, por exemplo, de armações de engenheiramento de tecido com ingredientes ativos é uma es- tratégia que é refletida em um número grande de publicações. Ingredientes ativos que desenvolvem sua atividade biológica durante um período prolongado por sendo adsorvivelmente ou covalentemente ligados à armação ou continuamente liberados a partir de um depósito que pertencem a técnica anterior. Liberação contínua a partir de um depósito de ingrediente ativo correspondente abre intervenções direcionadas na cura de ferimento em particular no caso de ingredientes ativos que têm uma semi-vida biologicamente curta. Por exemplo, muitos fenômenos críticos, por exemplo, diferenciação celular, proliferação e agregação celular, são influenciados por proteínas de sinal via expressão de gene. A disponibilidade e diferenciação, a regeneração ou a substituição de células individuais, regulação e divisão celular são as principais questões da pesquisa (Rui Miguel Paz, Dissertation RWTH Aa-chen 2004). Equipamento de biomateriais com substâncias biologicamente ativas a fim de aperfeiçoar sua funcionalidade ilustra o desenvolvimento do material de implante puramente passivo em um implante ativo que entra na interação vantajosa com o tecido envolvente ou o tecido de fluido. Combinações de substâncias biologicamente ativas com biomateriais são difundidos na medicina e desempenham um papel crescente, por exemplo, na prevenção de infecções relacionadas com implante. Por exemplo, no campo de curativos de ferimento, um papel crescentemente mais importante por um ambiente de ferimento melhorado, a redução de infecções e o estímulo de crescimento celular por adição de ingredientes ativos mas também por influência proposital de diferenciação celular e o padrão de expressão das células por ajuste das propriedades físicas do material, tal como em particular a rigidez do material de matriz, de um modo controlável. Assim chamado exsudato de ferimento management, que no caso de ferimentos crônicos em particular refere-se à influência e interação especialmente na exsudação, isto é, gote-jamento, ferimentos tanto no nível físico, via funções puramente adsolvíveis, administração do exsudato de ferimento, etc., quanto em nível farmacológi-co, liberação de ingredientes ativos, também se tornou mais importante em anos recentes. O carregamento das matrizes de colágeno com ingredientes ati- vos de proteína, tais como fatores de crescimento, era conhecido por um tempo longo e é descrito, por exemplo, na WO 85/04413 ou na patente de U.S. no. 5219576 (EP 0428541 B1).

No entanto, a fim de também ser capaz de alcançar as exigências de produto de alta estabilidade mecânica dos materiais de suporte, e também de alcançar uma redução na degradação biológica excessivamente rápida, que é indesejável, por exemplo, em um ferimento ou em implantes no corpo, o método de reticulação, em particular reticulação com agentes de reticulação química, é conhecido e é difundido. Em particular, é também conhecido como realizando reticulação química de colágeno com agentes de reticulação epóxi-funcionais.

Nesse aspecto são processos predominantemente conhecidos em que reticulação com o reticulador de epóxi é realizado em material de colágeno sólido, seco, em geral seco por congelamento. DE 69533285, por exemplo, descreve próteses de menisco das fibras de biopolímero que podem ser quimicamente reticuladas ou parcialmente reticuladas, a reticulação ocorrendo já nas fibras de colágeno secas por congelamento. WO 2003/053490 A1 (EP 1455855 A1) também provê materiais de colágeno secos por congelamento que podem ser quimicamente reticula-dos. A reticulação química de materiais de colágeno-elastina secos por congelamento é também descrita aqui, glutaraldeído sendo usado como o agente de reticulação químico e epóxidos sendo mencionados apenas em geral como agentes de reticulação. DE 102006006461 A1 e DE 102004039537 A1 proveem matrizes de colágeno povoadas com células de pele (modelo de pele total), em que os materiais de colágeno povoados são submetidos a reticulação química com glutaraldeído. Um grande número de outros agentes de reticulação químicos são listados em geral apenas. Aqui também, apenas reticulação dos já materiais secos por congelamento é descrita.

Reticulação química nesses processos é convencionalmente realizada por imersão dos materiais de colágeno sólidos, em particular aqueles na forma de folhas ou camadas, em uma solução contendo o agente de reti- culação. Os materiais de colágeno sólido de tipo folha (camada) são em geral primeiramente obtidos por secagem de (por exemplo, secagem por congelamento) materiais de colágeno por processos convencionais e, depois de serem imersos em uma solução contendo o agente de reticulação, são submetidos a uma outra etapa de secagem (por exemplo, outra secagem por congelamento). Em uma etapa adicional, depois que a reação de reticulação ocorreu, agente de reticulação em excesso que não foi acoplado é em geral removido por lavagem do material por enxague intenso, que é necessário em virtude da bicompatibiiidade do material reticulado ou a redução em sua toxicidade causada por resíduos de agente de reticulação.

Um processo correspondente é descrito em "Cross-linking of Collagen-based materiais" (dissertation R. Zeeman, 1998) e por Zeeman e outros in J Biomed Mater Res, 46, 424-433, 1999, em J Biomed Mater Res, 47, 270-277, 1999, em Biomaterials, 20, 921-931, 1999, e em J Biomed Mater Res, 51, 541-548, 2000. Naquele processo, por exemplo, colágeno de dérmico de carneiro em camadas (camada de DSC) obtido por secagem por congelamento é imerso em pH alcalino ou ácido em uma solução de um a-gente de reticulação de epóxi-funcional tal como éter de 1,4-butanodiol digli-cidila (BDDGE) e é reticulado durante um período de vários dias a temperatura ambiente (20-30°C). As camadas de colágeno totalmente reticuladas são então lavadas e são secas por congelamento novamente a fim de se obter os materiais de colágeno reticulados por epóxi. Naquelas publicações, é descrito que o valor de pH usado para a reticulação tem uma influência significativa na flexibilidade e elasticidade do material reticulado, materiais reticulados em um valor de pH ácido < 6 (pH 4-6) tendo uma flexibilidade e elasticidade mais alta quando comparadas com materiais reticulados em um valor de pH alcalino. EP 0898973 B1 também descreve um processo para a reticulação química de colágeno. Uma suspensão de colágeno é também mencionada em princípio aqui como um possível material de partida para a reticulação química. No entanto, o processo de reticulação descrito consiste substancialmente de pelo menos duas etapas de reticulação e é em geral reali- zada em valores de pH de 4-9. O único exemplo de implementação concreto, em que reticulação é realizada com reticuladores de epóxido tal como BDDGE, refere-se a colágeno dérmico de carneiro em forma de folha (DSC) como descrito acima, que é imerso em uma solução contendo BDDGE e, depois de um tempo de reação de 7 dias, é lavado e então novamente é seco por congelamento.

Desvantagens de tais processos, em que reticulação é realizada por imersão de um material de colágeno sólido, seco (seco por congelamento) e então secagem dele novamente, são por outro lado a necessidade de realizar várias etapas de secagem, que é desvantajosa em particular por razões de economia de processo, e por outro lado o alto gasto em termos de tempo associado em particular à tempos de reticulação, que se prolongam durante vários dias. Verificou-se também que, quando um material já seco por congelamento, reticulado é novamente seco por congelamento, uma mudança indesejável no material, em particular na forma de redução do material em camadas, pode ser observada. Efeitos desvantajosos sobe a estrutura do material de colágeno, por exemplo, desnaturação aumentada ou outras mudanças estruturais na estrutura de peptídeo de colágeno, em particular nos materiais de colágeno em que o colágeno está presente como a proteína estrutural biológica, nativa, são adicionalmente sendo esperados devido ao esforço térmico aumentado sobre o material de colágeno que é inevitavelmente causado pelo segundo processo de secagem adicional.

Em contraste com isso, é conhecido da EP 0793511 A1, por e-xemplo, um processo para a produção de espumas de biopolímero de com-pósito, compreendendo interalia também misturas de polímeros de colágeno e elastina, em que o agente de reticulação é adicionado a uma suspensão de polímero e só então é uma etapa de secagem simples, em particular secagem por congelamento, é realizada. Reticulação de tais misturas de polímeros com reticuladores epóxi-funcionais não é descrita, no entanto. EP 0680990 A1 também descreve a adição do agente de reticulação a uma suspensão de polímero, misturas de polímeros de colágeno e um polímero hidrofílico sintético tal como em particular um polímero hidrofíli- co sintético funcionalmente ativado tal como, por exemplo, um glicol, de preferência um polietileno glicol difuncionalmente ativado (PEG), sendo submetido à reação de reticulação. Epóxido como agente de reticulação é listrado apenas em ge4ral como um de muitos possíveis agentes de reticulação. A patente de U.S. no. 4.883.864 descreve composições de colá-geno quimicamente modificadas (reticuladas), em que o colágeno é solubili-zado por meio de pepsina e é então reticulado pela adição do agente de reticulação. Epóxido é do mesmo modo mencionado nessa publicação meramente em geral como um possível agente de reticulação. Exemplo 18 menciona que os materiais de colágeno de acordo com a invenção pode ser seco por congelamento e usado como material de esponja cirúrgica. O uso de colágeno nativo insolúvel ou o uso concreto de epóxido, em particular em ligação com a etapa de secagem por congelamento, não é também descrita aqui.

Materiais de colágeno quimicamente reticulados, em particular daquele colágeno nativo insolúvel em ácido, já são conhecidos da DE 10350654 A1, um pedido de patente mais velho do requerente. Naquela a-plicação, suspensões de colágeno aquosas tendo um valor de pH de 2-4 são de preferência usadas. Além disso, a possibilidade de adição de agentes de reticulação a tais suspensões de colágeno aquosas e subsequente secagem por congelamento é mencionada. É ulteriormente mencionado aqui, em particular quando do uso de agentes de reticulação que reagem em um meio ácido, o tratamento de reticulação pode ocorrer antes da secagem por congelamento. Vários grupos de agentes de reticulação polifuncionais são listados como possíveis agentes de reticulação, essa lista geral também incluindo diepóxidos tal como éter de 1,4-butanodiol diglicidila (BDDGE). Uma reticulação desidrotérmica é de preferência realizada, no entanto. Para materiais reticulados por meio de EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida), o aperfeiçoamento surpreendente nas propriedades angiogenéticas do material de colágeno é também mencionado. Em ligação com a reticulação desidrotérmica que distinguida ali como sendo preferida, temperaturas de secagem por congelamento de pelo menos 50 a 180°C são mencionadas, tempe- raturas mais altas acima de 80°C sendo distinguidas quando preferidas para a reticulação desidrotérmica. Uma escolha concreta de epóxidos como agentes de reticulação, em particular em combinação com um procedimento concreto que leva em conta de, por exemplo, um valor de pH concreto < 4 e uma faixa de temperatura de secagem por congelamento escolhida, não é evidente a partir do mesmo. Além do mais, esse documento descreve o processamento e preparação de uma suspensão de colágeno de fibra, colágeno insolúvel nativo. Há, no entanto, nenhuma referência à preservação de constituintes de peptídeo liberáveis em ácido e de colágeno solúveis, que são presumivelmente formados dentro do contexto desse processamento, no material de colágeno. Em particular em ligação com reticulação química, que é mencionada apenas em geral, nem a necessidade de preservação de tais constituintes solúveis nem uma possibilidade portanto é mencionada. Por contraste com isso, esse documento refere-se explicitamente ao uso desejado material de colágeno insolúvel em ácido, e colágeno solúvel em ácido é mencionado explicitamente como sendo desvantajoso. A introdução de, por exemplo, ingredientes ativos proteinogênicos (fatores de crescimento etc.) é alcançada aqui por encapsulação e incorporação de microesferas.

Colágeno insolúvel em ácido nativo convencionalmente refere-se à fração de uma suspensão de colágeno que é insolúvel na solução de ácido, pode ser precipitada por centrifugação e contém fibras visíveis por microscópio eletrônico; dentro do escopo da presente invenção, colágeno insolúvel em ácido nativo inclui em particular a fração de uma suspensão de colágeno pura que é insolúvel em uma solução ácida de pH < 4, pode ser precipitada por centrifugação a 16.000 g e contém fibras que são visíveis sob um microscópio eletrônico (espessura de fibra de 0,2 pm e acima).

Colágeno, solúvel em ácido, ou solúvel nativo, por outro lado, significa a fração de colágeno que forma uma solução clara em solução áci-da a pH < 4 e não contém quaisquer estruturas de fibra que são visíveis sob microscópio eletrônico.

Colágeno, solúvel em ácido ou, solúvel nativo pode ser separado por meio de fracionação, por exemplo, por meio de processos conhecidos de SEC (cromatografia de exclusão por tamanho), em moléculas de colágeno completas, nativas de peso molecular mais alto tendo um peso molecular > 250 kDa e peptídeos de baixo peso molecular tendo um peso molecular < 250 kDa. Os peptídeos de colágeno de baixo peso molecular podem desse modo não ser atribuídos a uma molécula de colágeno completa.

Em princípio, a presença de moléculas de colágeno completas solúveis bem como de constituintes de peptídeo de baixo peso molecular podem ser detectados qualitativamente por análise dos constituintes solúveis por meio de métodos conhecidos, por exemplo, SDS-PAGE (eletroforese de gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sódio), como descritos nos seguintes exemplos.

Os constituintes de peptídeos de colágeno e de colágeno solúveis em ácido têm várias características vantajosas. Por exemplo, eles têm propriedades formadoras de película e, quando aplicadas topicamente ou liberadas a partir de um material de veículo sobre a pele, elas podem aperfeiçoar a capacidade de retenção de água da pele, e correspondentemente reduzem a perda de água transdérmica, via aquela formação de película. Além do mais, fragmentos de colágeno solúveis são mensageiros de sinal importantes e constituintes de matriz que realizam propriedades positivas no tratamento de ferimentos e na capacidade de controlar população de célu-las/reação de célula, que é vantajosa e desejável em particular no campo de engenheiramento de tecido com relação ao perfil de expressão assim chamado da população de células. Um aspecto importante da presente invenção é, portanto, para preservar tais peptídeos e constituintes de colágeno solúvel em ácido bem como outros constituintes de peptídeo de baixo peso molecular na matriz de colágeno estabilizado por degradação, seco por congelamento (quimicamente reticulada) de modo que, quando usado eles são liberados a partir da matriz e são capazes de alcançar sua ação vantajosa no sítio de aplicação.

Os materiais de colágeno quimicamente reticulados e desse modo estabilizados por degradação conhecidos da técnica anterior não mais contêm os fragmentos, outros constituintes de peptídeo e frações de coláge- no solúveis em ácido, ou por causa da natureza fundamental do material, por exemplo no caso de colágeno de ruptura de pele ou as camadas de coláge-no dérmico de carneiro acima descrito (DSC), ou por causa do processo de reticulação de epóxido que é realizado e as condições de reticulação aplicadas ali. Os processos de reticulação de epóxi descritos na técnica anterior são realizados usando-se um excesso marcado de agente de reticulação em uma alta quantidade por volume de solvente durante um período longo de pelo menos 72 horas. As frações solúveis que podem estar presentes na matéria prima são desse modo liberadas pela grande quantidade de solvente, diluídas e correspondentemente removidas por lavagem. Como um resultados de alto efeito de diluição, frações de colágeno e peptídeo solúvel estão ainda presentes no material em apenas quantidades pequenas. Os constituintes de colágeno e peptídeo solúvel ainda presentes para graus pequenos são reticulados com os fios de colágeno pelas altas concentrações de agente de reticulação e os longos tempos de reticulação e são correspondentemente inseparavelmente ligados no material reticulado. Uma vez que os processos descritos adicionalmente incluem como uma etapa necessária a remoção por lavagem do agente de reticulação do material reticulado, quaisquer frações de colágeno solúveis não ligadas ou fragmentos de colágeno solúveis ou constituintes de peptídeo solúveis de baixo peso molecular são removidos por lavagem do material reticulado pelo fato de que a etapa de lavagem no fim. Correspondentemente, a técnica anterior não provê materiais de colágeno quimicamente reticulados que, bem como tendo alta estabilidade de degradação e resistência mecânica como um resultado da reticulação química, ao mesmo tempo têm alta biocompatibilidade (baixa toxicidade) e outros constituintes de peptídeos e/ou fragmentos, frações de colágeno solúvel em ácido que podem ser liberados a partir do material reticulado. Objetivo O objetivo da presente invenção era, portanto, prover matrizes de colágeno secas por congelamento que têm tanto alta estabilidade de degradação biológica (estabilidade hidrolítica) quanto uma resistência a rasgo mecânico adequado para as aplicações cosméticas e médicas, em particular no estado hidratado (resistência a rasgo por via úmida). Além disso, as matrizes de colágeno devem ter alta biocompatibilidade, caracterizadas pela baixa toxicidade, e devem permitir a liberação de constituintes de peptídeo e colágeno solúvel da matriz reticulada no uso. Além disso, as matrizes de colágeno reticuladas devem ter uma alta capacidade de absorção e taxa de hidratação de líquido, e as matrizes de colágeno devem ter lata flexibilidade e elasticidade bem como sendo agradável para tocar e tendo propriedades óptica s atraentes (por exemplo, alta densidade óptica ), a fim de ser adequados em particular como agentes cosméticos ou farmacêuticos, especialmente para o uso como máscaras ou materiais de tratamento cosméticos e como agentes de tratamento de ferimento, implantes ou agentes hemostáti-cos e também como armações para a população de células/cultivo de células no engenheiramento de tecido. Em um outro aspecto, matrizes de colágeno devem ser providas que, como um resultado de adaptação controlada de uma rigidez, permitem diferenciação celular e o padrão de expressão das células devem ser influenciadas propositadamente na biotecnologia, pesquisa básica e campo de engenheiramento de tecido. Uma armação que é estável e é otimizada com relação à influência do padrão de expressão de células, e alta biocompatibilidade do material de colágeno, são exigências para a incorporação facilitada de novas células e seu desempenho, por exemplo, quando usadas como um implante e quando usadas como uma armação de célula no engenheiramento de tecido.

Por último mas não menos importante, o processo deve ser superior à técnica anterior a partir de um ponto de vista econômico.

Descrição da Invenção Os inventores verificaram que tal material de colágeno aperfeiçoado, específico pode ser obtido por adição de, em um valor de pH < 4, um agente de reticulação de epóxi-funcional a uma solução aquosa de colágeno compreendendo, além de colágeno nativo insolúvel em ácido, fibroso, também frações de peptídeos de colágeno e colágeno solúvel nativo (solúvel em ácido), como definido aqui mais acima, e/ou agentes de formação de estrutura e ingredientes ativos do grupo das proteínas de matriz, constituintes de matriz extracelulares, ingredientes ativos proteinogênicos e constituintes de peptídeo ou proteína solúveis, e então congelamento dessa mistura e secagem por congelamento dela em uma temperatura < 100°C. Em particular foi mostrado, surpreendentemente, que esse novo processo permitiu que o teor de agente de reticulação de epóxido seja drasticamente reduzido quando comparado com os teores de reticulador conhecidos da técnica anterior sem obter perda em termos de grau de reticulação. Um baixo valor de pH < 4 bem como teores de agente de reticulação são vantajosos em particular em relação à atividade de epóxido residual depois da secagem por congelamento e em relação à preservação constituintes de peptídeo e colágeno solúvel não reticulado que podem ser liberados no uso, e correspondentemente em relação a toxicidade e biocompatibilidade do material de colágeno reticulado. Temperaturas de secagem por congelamento mais baixas do que aquelas convencionalmente aplicadas na reticulação desidrotérmica podem ser vantajosas a partir do ponto de vista econômico, mas elas são conhecidas em particular como sendo essenciais para o leve processamento e proteção de ingredientes sensíveis a temperatura (por exemplo, ingredientes ativos instáveis). Uma outra vantagem do processo de acordo com a invenção é o uso de um processo de um pote assim chamado por adição do reticulador à suspensão de colágeno e então realização da secagem por congelamento diretamente para dar o produto final reticulado com um tempo curto de repouso (tempo de pote) da mistura de colágeno/reticulador de preferência não mais do que 24 horas antes da conclusão da secagem por congelamento. Um procedimento marcadamente mais econômico é desse modo totalmente possível.

Correspondentemente, era possível alcançar o objetivo acima em particular por provisão de um processo para a preparação de matrizes de colágeno reticulado com epóxi biocompatíveis, estabilizados por degradação e mecanicamente estáveis contendo constituintes de peptídeo e colágeno solúvel não reticulados que podem ser liberados no uso, o processo compreendendo as seguintes etapas: a) preparação de uma suspensão de colágeno aquosa, b) ajuste do valor de pH da suspensão de colágeno da etapa a) para pH < 4, c) adição opcional de outros agentes formadores de estrutura, ingredientes ativos e/ou substâncias auxiliares, d) adição de um agente de reticulação de epóxi-funcional, a ordem das etapas c) e d) sendo variáveis, e) congelamento da mistura de colágeno obtenível da etapa d) , f) secagem por congelamento da mistura congelada da etapa e) a temperatura de secagem por congelamento < 100°C, g) ajuste opcional do material de colágeno reticulado seco por congelamento assim obtenível para um teor de umidade de < 25% em peso, com base no material de colágeno seco por congelamento, e h) conversão opcional dos materiais obteníveis da etapa g) na forma desejada, esterilização e/ou processamento. A presente invenção ulteriormente provê as matrizes de colágeno biocompatíveis, reticuladas, estabilizadas por degradação e mecanicamente estáveis contendo constituintes de peptídeo e colágeno solúvel não reticulado que podem ser liberados no uso, obteníveis por esse processo. O colágeno usado de acordo com a invenção para preparar as matrizes de colágeno reticuladas é em particular de origem bovina, suína, equina ou de ser humano ou é colágeno produzido por engenharia genética. Particularmente de preferência, ele é colágeno de origem bovina. A preparação de um colágeno particularmente preferido é descrita na DE 4048622 A1 e na DE 10350654 A1 do requerente. O processo descrito ali para a preparação de esponjas de colágeno compreende: submissão de uma matéria prima de colágeno a tratamento alcalino, lavagem do material de colágeno resultante, submissão do colágeno resultante a tratamento com ácido, lavagem do material de colágeno resultante, e moagem do material de colágeno resultante, em particular usando-se um moinho coloidal, em que cada uma das etapas mencionadas podem opcionalmente ser repetidas várias vezes. É desse modo obtida uma suspensão de colágeno aquosa do assim chamado colágeno insolúvel em ácido nativo na forma de fibras e fibri-las, que adicionalmente compreende quantidades mensuráveis de constituintes de colágeno solúvel em ácido e de peptídeo solúvel em ácido. A detecção qualitativa de frações solúveis em ácido pode ser realizada, por exemplo, por meio de SDS-PAGE, como descrito aqui. Essa suspensão de colágeno pode então ser processada por meio do processo de acordo com a invenção por ajuste do valor de pH para pH < 4, adição opcional de outros agentes formadores de estrutura, ingredientes ativos cosméticos ou farmacêuticos e substâncias auxiliares e adição subsequente do agente de reticu-lação de epóxi-funcional, por secagem por congelamento a temperatura de secagem por congelamento < 100°C, para dar o produto de acordo com a invenção. O uso de um único material de colágeno solúvel em ácido, como descrito muitas vezes na técnica anterior (vide, por exemplo, a patente de U.S. no. 4.883.864), é desvantajoso sobre as suspensões de colágeno usadas no processo de acordo com a invenção contendo predominantemente colágeno insolúvel em ácido na forma de fibras e fibrilas porque, a fim de alcançar um grau adequado de reticulação, quantidades marcadamente mais altas de agente de reticulação são necessárias, por comparação, no caso de unicamente colágeno solúvel em ácido. É conhecido que materiais preparados a partir de colágeno puramente solúvel em ácido têm per se, no estado úmido, resistência mecânica inadequada (resistência a rasgo por via úmida) e baixa estabilidade de degradação quando comparados com materiais obteníveis a partir de colágeno insolúvel em ácido. Isso é substancialmente atribuível pelo fato de que colágeno solúvel em ácido consiste de moléculas de colágeno individuais, enquanto que cofágeno insolúvel em ácido consiste substancialmente de fibrilas de colágeno, que são compostos de moléculas de colágeno lateralmente dispostas que são já naturalmente reti-culadas entre si. Essas fibrilas são por sua vez ligadas lateralmente por reti-culação natural para formar agregados maiores, as fibras de colágeno. Degradação tanto de fibras de colágeno que já estão naturalmente reticuladas e de fibras de colágeno quimicamente reticuladas ocorre marcadamente mais lentamente devido à área de superfície relativa menor e a acessabili-dade reduzida de cadeias de proteína individuais, que estão incluídas no compósito da fibra. O material de colágeno de acordo com a invenção é substancialmente colágeno de tipo I, III e V, principalmente I. A suspensão de colágeno usada no processo de acordo com a invenção, que é obtenível, por e-xemplo, pelos processos conhecidos da DE 3203957 A1, contém o material de colágeno pré-tratado e purificado na forma pré-moída, homogeneizada e desfibrada e está presente como uma dispersão aquosa que representa o material de partida para a preparação das matrizes de colágeno reticuladas de acordo com a invenção. O peso seco da dispersão seria aproximadamente de 1 a 4% em peso, de preferência de 1,5 a 2,5% em peso. O valor de pH da dispersão aquosa seria < 4, de outro modo o valor de pH deve ser ajustado para pH < 4. Ajuste do valor de pH é de preferência realizado com ácido clorídrico diluído. De preferência, o valor de pH da suspensão de colágeno aquosa é ajustado para pH de 2,5 a 3,5, mais de preferência para pH de 2,7 a 3,3, mais particularmente de preferência para pH 3.

Devido à preparação acima descrita, em particular devido à etapa de moagem, a suspensão de colágeno assim obtenível usualmente contém, além do colágeno insolúvel em ácido nativo, fibroso de preferência também constituintes de peptídeo e colágeno solúvel em ácido que foram liberados pela moagem de coloide e são desejáveis de acordo com a invenção. A quantidade de tais constituintes solúveis em ácido pode ser controlada pelo processo e ajustada pela quantidade desejada. Preferência é dada para uma quantidade de constituintes de peptídeo e colágeno solúvel em ácido na suspensão de colágeno de até 7% em peso, com base na massa seca da suspensão de colágeno, determinada pela quantidade em peso dos constituintes solúveis obtidos depois da centrifugação a 16.000 g e então secos por congelamento. A adição de outros agentes de formação de estrutura que podem estar presentes ou opcionalmente de ingredientes ativos cosméticos ou farmacêuticos e opcionalmente de substâncias auxiliares como descritas abaixo da composição de colágeno de acordo com a invenção podem ser realizadas nesse ponto por adição à suspensão de colágeno aquosa. por adição de outros agentes de formação de estrutura ou ingredientes ativos do grupo das proteínas de matriz, constituintes de matriz extracelulares, ingredientes ativos proteinogênicos e constituintes de peptídeo ou proteína solúveis, etc., a quantidade dos constituintes de peptídeo e colágeno solúvel como acima mencionados na suspensão de colágeno pode naturalmente ser aumentada, em particular é desse modo também possível alcançar marcadamente teores mais altos de > 7% em peso (massa seca). Se uma suspensão de colágeno for usado que contém a mesma apenas pequenas quantidades de peptídeos e colágenos solúvel em ácido, tais constituintes podem de preferência ser misturados na suspensão na quantidade desejada nesse ponto. A adição do agente de reticulação de epóxido à suspensão de colágeno é então realizada. It is, no entanto, igualmente possível misturar no agente de reticulação de epóxido antes da adição de quaisquer outros agentes formadores de estrutura, ingredientes ativos ou substâncias auxiliares que possam estar presentes. Essas etapas são correspondentemente variáveis na sequência de processo e são em princípio intercambeáveis. O agente de reticulação de epóxi-funcional é selecionado do grupo dos compostos de epóxido (epóxidos) compreendendo em particular diepóxidos bem como compostos de poliepóxi tais como éteres de poliglice-rol poliglicidila tendo um grau de polimerização de desde 1 a 3, éteres poliol poliglicidila, éteres de glicol diglicidila, éteres de glicerol diglicidila, éteres de glicerol triglicidila, éteres de diglicerol tetraglicidila, éteres de glicidila de eti-leno glicol, éteres de butanodiol diglicidila, tais como em particular éter de 1,4-butanodiol diglicidila, ésteres de diglicidila de ácido dicarboxílico, etc. Os agentes de reticulação epóxi-funcionais podem ser selecionados em particular do grupo dos éteres de diglicidila de polietileno glicol de acordo com a fórmula geral ' » ou do grupo das moléculas de éter-funcional poliglicidila de polietileno glicol, polipropileno glicol e polietileno propileno glicol, em que o derivado de éter de diglicidila é representado pela fórmula geral em que x + z = 0-70ey = 0-90. O grupo dos diepóxidos inclui em particular aqueles que correspondem à fórmula geral em que R pode ser qualquer substituinte que nao interfere com o processo de reticulação e/ou reduz a solubilidade de água da substância de reticulação em uma solução aquosa e em que n = 1-6, de preferência n = 1-4.

Em princípio, as propriedades essenciais das matrizes de colágeno de acordo com a invenção podem ser controladas pela escolha do agente de reticulação de epóxido adequado, por exemplo, em relação a sua bifuncionalidade, comprimento de cadeia, etc.

Agentes de reticulação de epóxido solúvel em água são preferido; o agente de reticulação de epóxido é particularmente de preferência selecionado do grupo dos diepóxidos, éter de 1,4-butanodiol diglicidila (BDD-GE) sendo mais particularmente preferido. Sob condições adequadas, os compostos de epóxido podem sofrer tanto reações catalisadas por ácido e catalisadas por base com um grande número de grupos funcionais, incluindo grupos carboxila e amina. N técnica anterior (por exemplo, Zeeman e outros), é descrito aqui, na reticulação na faixa de pH ácido (pH 4-6), principalmente a reticulação dos grupos carboxila ocorre, enquanto que no caso de reticulação alcalina (pH 9), reticulação ocorre principalmente nos grupos amida.

Para a incorporação do agente de reticulação e se possível outros ingredientes do grupo da proteína solúvel e constituintes de peptídeo, bem como de ingredientes ativos e/ou substâncias auxiliares, a suspensão de colágeno é de preferência resfriada para temperaturas abaixo da temperatura ambiente (23°C). Em particular, a misturação ocorre em uma temperatura < 20°C, de preferência em uma temperatura < 10°C, particularmente de preferência a < 5°C, a temperatura da suspensão/mistura de colágeno naturalmente não ainda sendo diminuída para o congelamento da massa nesse ponto na sequência de processo. A suspensão de colágeno aquosa descrita acima assim obtida, que contém o agente de reticulação bem como opcionalmente outros agentes formadores de estrutura, ingredientes ativos e/ou substâncias auxiliares (mistura de colágeno) e tem um valor de pH < 4, é então congelado, de preferência dentro de um período de 24 horas, de modo que o tempo de repouso (tempo de pote) da mistura de colágeno aquosa não excede 24 horas se possível. A temperatura preferida da mistura de colágeno aquosa durante esses tempos de repouso (tempo de potes) corresponde às temperaturas reduzidas definidas acima da operação de misturação, e a mistura de colágeno é correspondentemente mantida em uma temperatura < 20°C, de preferência < 10°C, particularmente de preferência < 5°C, sem congelar mistura de colágeno, durante quaisquer tempos de repouso.

As temperaturas reduzidas durante a misturação em e o tempos de repouso da mistura de colágeno antes do congelamento surpreendentemente têm um efeito vantajoso na estabilidade mecânica (resistência a rasgo por via úmida) das matrizes de colágeno secas por congelamento de acordo com a invenção. Por exemplo, foi mostrado, surpreendentemente, que um aperfeiçoamento na resistência a rasgo por via úmida mecânica pode ser alcançada por diminuição da temperatura durante o tempo de repouso.

De preferência, subsequente congelamento ocorre durante um período de desde 0,5 a 4 horas, de preferência de 1 a 3 horas, em uma temperatura de desde -10 a -60°C.

Surpreendentemente, verificou-se que tempos de repouso mais longos de vários dias, como são descritos na técnica anterior, são claramente não absolutamente necessários de alcançar reticulação completa e satisfatória. Por contraste com isso, foi mostrado, surpreendentemente, que tempos de repouso mais longos antes do congelamento têm um efeito adverso no processo de acordo com a invenção no grau de reticulação e correspondentemente na resistência a rasgo (resistência a rasgo por via úmida) e a taxa de degradação. Nesse aspecto, demonstrou ser vantajoso para congelar a mistura de colágeno aquosa no processo de acordo com a invenção imediatamente depois de sua preparação, dentro de um período não excedendo 24 horas, mais de preferência dentro de um período não excedendo 18 horas, particularmente de preferência dentro de um período de menos do que 12 horas. Além dos efeitos vantajosos com relação às propriedades de material, tempos de repouso curtos são também preferidos por razões da economia de processo. É admitida que reação de reticulação entre as moléculas de pep-tídeo e o agente de reticulação na mistura aquosa é suprimida pelo congelamento imediato da suspensão aquosa, que é vantajosa devido à teoria com relação ao mecanismo de reação procedente, como explicado abaixo: Na adição do agente de reticulação de epóxi-funcional à suspensão de colágeno aquosa, uma reação de competição em princípio ocorre entre a hidrólise de epóxido (epóxido t> H20) por um lado e reação de reticulação entre epóxido e proteína (epóxido tf proteína) por outro lado. Congelamento imediato leva os constituintes de reação a serem imobilizados e as reações a serem como eram "congeladas". Além disso, a água desse modo congela em forma altamente pura e exibe os constituintes dissolvidos (epó- xido) na periferia de cristal de H2O, pelo que o epóxido está localizado em forma concentrada relativamente próximo às proteínas a serem reticuladas. Devido à proximidade relativa resultante e concentração aumentada do epóxido em relação às proteínas, uma cinética de reação vantajosa com o colá-geno fibras é presumidamente obtida, e a reação de competição é deslocada na direção "epóxido U proteína". É ulteriormente admitido que, com o início do processo de secagem por congelamento, via a entrada de energia que ocorre desse modo, pelo que as moléculas de água congeladas são imediatamente convertidas no estado gasoso por sublimação, a energia de ativação para a reação epóxido ±5 proteína, pelo que reação é ajustada no movimento, também se tomou disponível. Além do mais, uma vez que água não mais passa no estado intermediário da fase líquida, devido à sublimação, a reação de hidrólise de reação epóxido ^ H20 é adicionalmente suprimida.

Correspondentemente, é particularmente preferido de acordo com a invenção manter os tempos de reação na suspensão aquosa tão curtos quanto possíveis e para converter suspensão em uma forma congelada tão rapidamente quanto possível.

Com base nas afirmações acima, é em particular também possível usar quantidades extremamente pequenas do reticulador de epóxi no processo de acordo com a invenção. De acordo com a invenção são de preferência usadas concentrações de epóxi de até um máximo de 50% em peso, de preferência até 20% em peso, mais de preferência até 10% em peso, particularmente de preferência até 7% em peso, em cada caso com base na massa seca da suspensão de colágeno, ou até um máximo de 1% em peso, de preferência até 0,4% em peso, mais de preferência até 0,2% em peso, particularmente de preferência até 0,14% em peso, em cada caso com base na suspensão de colágeno aquosa (que opcionalmente também compreende outros agentes formadores de estrutura, ingredientes ativos e substâncias auxiliares). A fim de alcançar um grau satisfatório de reticulação (resistência a rasgo por via úmida/taxa de degradação/estabilidade hidrolítica), o agente de reticulação é de preferência usado em uma quantidade de pelo menos 0,5% em peso, mais de preferência pelo menos 1% em peso, ainda mais de preferência pelo menos 3% em peso, em cada caso com base na massa seca da suspensão de colágeno aquosa, ou de pelo menos 0,01% em peso, de preferência pelo menos 0,02% em peso, mais de preferência pelo menos 0,06% em peso, em cada caso com base na suspensão de colágeno aquosa (que opcionalmente também compreende outros agentes formadores de estrutura, ingredientes ativos e substâncias auxiliares). A escolha da concentração de agente de reticulação adequada é dependente a um grau significativo das propriedades de material desejado e do campo particular de aplicação.

Por contraste com isso, as concentrações de epóxido usadas na técnica anterior são muitas vezes mais altas. O uso de tais baixas concentrações de epóxido tem um efeito vantajoso a particular em particular na bio-compatibilidade, que corresponde à atividade residual do agente de reticulação de epóxido (e correspondentemente baixo toxicidade) no produto final, e adicionalmente permite a preservação desejada dos constituintes de peptí-deo e colágeno solúvel em ácido liberáveis no uso do produto final.

Por causa do potencial tóxico associado, a atividade de epóxido residual representa uma medição da biocompatibilidade das matrizes reticu-ladas. Determinação da atividade de epóxi residual pode ser realizada por meio de um ensaio de NBP modificado (ensaio de nitrobenzil-piridina) com base em "Detecção de Epoxides with 4-(p-nitrobenzylpiridina)" por Agarwal e outros (1979) Bull. Environm. Contam. Toxicol. 23, p. 825-829, modified de acordo com Zocher e outros (2000) " Epoxide hydrolase activity of Strep-tomyces tensãos" J. Biotechnol. 17 de Fev 17; 77(2-3), p. 287-292, como descxritos em detalhes aqui. A baixa atividade de epóxi residual, e correspondentemente alta biocompatibilidade, das matrizes de colágeno de acordo com a invenção é presumidamente também atribuível ao baixo valor de pH < 4 que é preferido para o processo, uma vez que baixos valores de pH no produto final efetuam rápida hidrólise de epóxido residual restante e correspondentemente aceleram sua degradabilidade no produto final. Esse efeito é também significati- vamente influenciado pelo teor de umidade das matrizes de colágeno reticu-ladas (no produto final), como explicado ulteriormente aqui mais abaixo.

Ulteriormente verificou-se, surpreendentemente, que baixas concentrações de epóxido que são preferidas de acordo com a invenção têm uma influência significativa na resistência a rasgo, a estabilidade hidrolítica e na degradação enzimática (por exemplo, degradação de colagenase). Ótimos resultados foram alcançados aqui nas faixas preferidas definidas acima. A suspensão obtenível pelas etapas descritas acima é de preferência congelada na forma de folhas, mas quaisquer configurações adaptadas a partir de outras formas geométricas concebíveis, formas naturais ou formas fisiológicas são também possíveis. A espessura das folhas resultantes podem ser de 0,5 a 5,0 cm, de preferência de 1,0 a 3,0 cm, particularmente de preferência de 1,5 a 2,0 cm.

As matrizes de colágeno obtenível pelos processos de acordo com a invenção são materiais de colágeno porosos, que em particular é também a razão para sua alta capacidade de adsorção ou capacidade de absorção de umidade e taxa de hidratação. A porosidade das matrizes de colágeno de acordo com a invenção também representa uma propriedade significativa para sua estabilidade as armações para a população de células / cultivo de células no engenheiramento de tecido. O grau de porosidade dos materiais de colágeno de acordo com a invenção é substancialmente uma função de dois parâmetros, a densidade de material e o tamanho de cristal de gelo. Altos teores de sólidos na suspensão aquosa aumentam a densidade de material no produto final seco por congelamento e reduzem o agente de reidratação/ interface sólida. Altos gradientes de congelamento levaram a pequenos cristais de gelo, que levaram a grandes superfícies de material internas, que por sua vez auxilia reidratação. Baixos gradientes de congelamento, por outro lado, causam cristais de gelo grandes, que por sua vez resulta em uma estrutura de material de poro grande no produto final. O tamanho de poro das matrizes de colágeno de acordo com a invenção pode correspondentemente ser propositada-mente influenciado por controle da velocidade de congelamento. Além do mais, é possível adicionalmente influenciar o tamanho de poro por adição de substâncias de ação superficial, embora isso seja preferido.

As folhas obtidas podem opcionalmente ser imediatamente armazenadas de -3°C a -35°C. De preferência, as folhas congeladas são armazenadas por pelo menos 24 horas.

Depois do congelamento e armazenagem de intermediário opcional, as folhas são submetidas a secagem por congelamento.

Surpreendentemente, foi mostrado que, no processo de acordo com a invenção, a temperatura de secagem por congelamento não excedería 100°C a fim de se obter matrizes de colágeno reticuladas tendo as ótimas propriedades desejadas em relação a resistência a rasgo mecânico, estabilidade hidrolítica, biocompatibilidade correspondente a baixa atividade de e-póxi residual, e a preservação de constituintes de peptídeo e colágeno solúvel liberáveis ou agentes de formação de estrutura liberáveis ou ingredientes ativos do grupo das proteínas de matriz, constituintes de matriz extracelula-res, ingredientes ativos proteinogênicos e constituintes de peptídeo ou proteína solúveis, etc. no produto final, e os aspectos relacionados com toque na forma de flexibilidade, elasticidade e maciez do material. É conhecido da técnica anterior para aplicar temperaturas de secagem por congelamento relativamente altas de desde 50 a 180°C e temperaturas preferidas > 80°C a fim de alcançar reticulação desidrotérmica de matrizes de colágeno. É ulteriormente conhecido que o grau de reticulação, e correspondentemente a resistência a rasgo, aumenta com a temperatura de secagem por congelamento. Particularmente altos graus de reticulação são alcançados de acordo com a técnica anterior, por exemplo, com temperaturas de secagem por congelamento entre 80 e 150°C ou temperaturas acima de 110 a 150°C. Admita-se correspondentemente que temperaturas secagem por congelamento mais altas também levariam a resultados melhores em relação ao grau de reticulação e correspondentemente a resistência a rasgo em ligação com o uso de agentes de reticulação. Ao contrário disso, verificou-se, no entanto, que no processo de reticulação de epóxido de acordo com a invenção, temperaturas de secagem por congelamento mais altas levam a resultados mais pobres em relação à resistência a rasgo (resistência a rasgo por via úmida). Em particular, também verificou-se que uma pós-reticulação desidrotérmico nas temperaturas > 100°C tem um efeito adverso na resistência a rasgo por via úmida. Esse efeito era surpreendente pelo fato de que a pessoa versada na técnica esperaria um efeito aditivo da reticula-ção química e da reticulação desidrotérmica. É admitido que a vantagem das temperaturas de secagem por congelamento de < 100°C de acordo com a invenção é determinada pelo comprimento associado do processo de sublimação. Devido às temperaturas de secagem por congelamento comparativamente mais baixas, um processo de sublimação prolongado para completar secagem do material se necessário, como um resultado do qual um período de tempo prolongado para a reação completa do agente de reticulação e as moléculas de peptídeo está disponível. Correspondentemente, conclusão da reação de reticulação é possível durante aquele processo de sublimação prolongado, que leva a graus mais altos de reticulação, enquanto que altas temperaturas de secagem por congelamento levam a uma reação de reticulação acelerada que então ocorre homogeneamente e desigualmente, resultando nos produtos finais e baixa resistência a rasgo. Correspondentemente, o processo de acordo com a invenção é realizada com a temperatura de secagem por congelamento < 100°C, a temperatura de secagem por congelamento < 85°C sendo mais preferido e < 80°C sendo ainda mais preferido.

Como já afirmado acima, temperaturas de secagem por congelamento > 100°C, como são vantajosas a fim de alcançar reticulação desidrotérmica satisfatória, são desvantajosas em termos da preservação de constituintes de peptídeo e colágeno solúvel liberáveis e/ou agentes de formação de estrutura ou ingredientes ativos do grupo das proteínas de matriz, constituintes de matriz extracelulares, ingredientes ativos proteinogênicos e constituintes de peptídeo ou proteína solúveis, por um lado porque aqueles componentes são reticulados ao mesmo tempo e correspondentemente in-separavelmente ligados no material, e por outro lado por que uma desnatu-ração indesejável - pelo menos parcial - térmica daqueles constituintes pro- teinogênicos podem ocorrer na temperaturas que são demasiadamente altas.

De acordo com os processos de reticulação descritos na técnica anterior, em que temperaturas de secagem por congelamento na faixa de 20 a 30°C são usadas, tempos de reticulação comparativamente longos, até 44 horas, isto é vários dias (até 7 dias), são necessários antes da secagem por congelamento. No processo de acordo com a invenção, por outro lado, nenhum tempo de reticulação adicional é exigido antes da secagem por congelamento, o tempo de repouso da suspensão de colágeno antes que a secagem por congelamento seja realizada é não mais do que 24 horas, e a reticulação então ocorre substancialmente no curso dos processos de secagem por congelamento. Em particular, verificou-se que a temperatura de secagem por congelamento > 40°C, de preferência > 50°C, mais de preferência > 60°C, é vantajosa para um ótimo processo. Uma vez que a reação de reticulação no processo de acordo com a invenção ocorre substancialmente durante a secagem por congelamento, temperaturas de reticulação mais altas, como definidas acima, permitem particularmente tempos de secagem por congelamento curtos e correspondentemente particularmente tempos de reticulação curtos sem adversamente afetar o grau de reticulação e correspondentemente a estabilidade de material resultante. Além do mais, a vantagem de tempo é também obtida a partir da realização da reação de reticulação e da secagem por congelamento em uma única etapa.

No processo de acordo com a invenção, o teor de umidade do material de colágeno resultante reticulado seco por congelamento é então opcionalmente ajustado para um teor de umidade de até um máximo de 25% em peso, com base no material de colágeno seco por congelamento (reidra-tação). Mais de preferência, um ajuste é feito para um teor de umidade de até 20% em peso, ainda mais de preferência até 15% em peso, em cada caso com base no material de colágeno seco por congelamento. De preferência, reidratação ou ajuste do teor de umidade é realizado para pelo menos 3% em peso, mais de preferência para pelo menos 5% em peso, ainda mais de preferência para pelo menos 7% em peso, em cada caso com base no material de colágeno seco por congelamento. Em particular, é vantajoso se ajustar o teor de umidade para um teor de desde 3 to 25% em peso, mais de preferência de 5 a 20% em peso, ainda mais de preferência de 7 a 15% em peso, em cada caso com base no material de colágeno seco por congelamento. a reidratação ou ajuste do teor de umidade pode em princípio ser realizado por processos conhecidos para climatização ou ajuste de umidade. Por exemplo, os materiais de colágeno secos por congelamento de acordo com a invenção pode ser correspondentemente ajustados ou condicionados pela armazenagem sob condições ambientais controlados pelo clima, adequadas, por exemplo, em uma temperatura de desde 10 a 25°C, uma umidade relativa de desde 40 to 95%, mais de preferência de 50 a 75%, por um período de tempo adequado, por exemplo, de 5 a 120 horas, mais de preferência de 12 a 80 horas. Em princípio, uma pessoa versada na técnica é capaz de adequadamente combinar parâmetros mencionados, temperatura, umidade e tempo de armazenagem a fim de alcançar os melhores resultados em relação ao ajuste de umidade desejado.

Surpreendentemente, verificou-se que tal ajuste do teor de umidade dos materiais de colágeno secos por congelamento é vantajoso em relação à atividade residual do agente de reticulação de epóxido no material seco por congelamento. Em particular, foi possível mostrar, por meio do método de determinação definido aqui, que a redução da atividade de epóxi a um nível não mais detectável podería ser marcadamente acelerado por escolha adequada das condições de reidratação (teor de umidade, tempo de armazenagem). Em particular, é correspondentemente possível, por escolha dos parâmetros de reidratação, propositadamente para controlar a depleção da atividade de epóxi residual e correspondentemente influenciam o processo de um modo enconomicamente vantajoso.

As matrizes de colágeno secas por congelamento reticuladas por epóxi resultantes de acordo com a invenção são de preferência artigos de forma de tipo esponja, porosos que podem opcionalmente ser cortados em uma forma adequada, esterilizada e processada. A conversão dos materiais de colágeno na forma desejada de acordo com a etapa h) é vantajosamente realizada por corte. Em princípio, eles podem ser cortados em qualquer forma ou espessura geométrica desejada usando-se processos conhecidos, convencionais.

Esterilização das matrizes de colágeno de acordo com a invenção é importante para as aplicações terapêuticas em particular, referência sendo feita a processos convencionais aqui também. Esterilização por meio de radiação gama/radiação X é preferida.

Processamento inclui opcionalmente impressão, modelagem, cunhagem, perforação e/ou laminação bem como opcionalmente gravação a laser (mudança da estrutura de superfície) das matrizes de colágeno de a-cordo com a invenção, bem como embalagem.

As matrizes de colágeno porosas de acordo com a invenção são de preferência providas na forma de um material em camadas que tem uma espessura (dimensão que tem a extensão longitudinal menor) de preferência aproximadamente de 0,1 a 30 mm, de preferência de 0,5 a 20 mm, ainda mais de preferência de 1 a 10 mm.

As matrizes de colágeno reticuladas de acordo com a invenção podem conter, além do colágeno, opcionalmente pelo menos um outro constituinte que é selecionado do grupo que consiste de outros agentes formadores de estrutura, ingredientes ativos cosméticos ou farmacêuticos e/ou substâncias auxiliares.

Do grupo de outros agentes formadores de estrutura, alginatos, elastina, ácido hiaiurônico são de preferência escolhidos.

Ingredientes ativos cosméticos dentro do escopo da invenção incluem em particular aqueles ingredientes ativos que são destinados a serem aplicados externamente a seres humanos para a finalidade de limpeza, cuidado ou para influenciar a aparência ou odor do corpo ou para diminuir impressões de odor, a não se que eles destinam-se que principalmente a aliviar ou eliminar doenças, aflições, lesões físicas ou doenças patológicas. Dentro desse contexto, os materiais de acordo com a invenção para o uso cosmético são, por exemplo, preparações de banho, lavagem de pele e agentes de limpeza, agentes de cuidado de pele, em particular agentes de cuidado de pele facial, cosméticos para os olhos, agentes de cuidado de lábio, agentes de cuidado de unha, agentes de cuidado de pé, agentes de cuidado de cabelo, em particular xampus de cabelo, condicionadores de cabelo, amaci-antes de cabelo, etc., agentes de proteção, agentes de clareamento e bronzeamento de pele, agentes de despigmentação, desodorantes, anti-hidróticos, agentes depilatórios, repelentes de insetos, etc. ou tais agentes em combinação. Uso como uma máscara ou material de tratamento cosmético é preferido.

Exemplos de compostos tendo cosmético, opcionalmente também, por exemplo, atividade terapêutica, dermatológica, incluem: agentes anti-acne, agentes antimicrobianos, antiperspirantes, adstringentes, agentes desodorantes, depilatórios, agentes de condicionamento para a pele, agentes de amaciamento de pele, agentes para aumento de hidratação de pele tal como, por exemplo, dexpantenol (pantenol, pantotenol), glicerol ou ureia bem como outros NMFs (fatores de umidificação natural) tais como, por e-xemplo, ácido pirrolidonacarboxílico, ácido láctico e aminoácidos, protetores solar, ceratolíticos, aceitantes de radical para radicais livres, antioxidantes, antisseborrêicos, agentes anti-caspa, ingredientes ativos antissépticos, ingredientes ativos para o tratamento de sinais de envelhecimento de pele e/ou agentes que modulam diferenciação e/ou proliferação e/ou pigmentação de pele, inibidores de protease, por exemplo, inibidores de MMP (meta-loproteinase de matriz), inibidores de glicação para a redução da formação de substâncias de AGE (produto final de glicação avançado), vitaminas tais como vitamina C (ácido ascórbico) e seus derivados, tais como, por exemplo, glicosídeos tal como ascorbil glicosídeo, ou ésteres de ácido ascórbico tais como fosfato ou ascorbil palmitato de sódio ou magnésio e estearato, ésteres de fosfato de ácido L-ascórbico, sais de metal alcalino, tais como sais de potássio e de sódio, de ésteres de fosfato de ácido L-ascórbico; sais de metal alcalino-terroso, tais como sais de cálcio e de magnésio, de ésteres de fosfato de ácido L-ascórbico; sais de metal trivalente, tais como sais de alumínio, de ésteres de fosfato de ácido L-ascórbico; sais de metal alcalino de ésteres de sulfato de ácido L- ascórbico, tais como sais de sódio e de potássio de ésteres de sulfato de ácido L-ascórbico; sais de metal alcalino-terroso, tais como sais de magnésio ou de cálcio, de ésteres de sulfato de ácido L-ascórbico; sais de metal trivalente, tais como sais de alumínio, de ésteres de sulfato de ácido L-ascórbico; sais de metal alcalino, tais como sais de sódio e de potássio, de ésteres de ácido L-ascórbico; sais de metal alcalino-terroso, tais como sais de magnésio ou de cálcio, de ésteres de ácido L-ascórbico; e sais de metal trivalente, tais como sais de alumínio, de ésteres de ácido L-ascórbico, quaisquer peptídeos naturais, naturais idênticos e artificiais tais como, por exemplo, neuropeptídeos, peptídeos e matricinas e peptídeos antimicrobianos com e sem modificação por ligação covalente a uma esterificação ou ácido graxo.

Ingredientes ativos tendo um efeito colateral irritante, tais como ácidos alfa-hidróxi, ácidos β-hidróxi, ácido alfa-ceto, ácido β-ceto, retinóides (retinol, retinal, ácido retínico), antralinas (dioxiantranol), antranóides, peró-xidos (em particular benzoil peróxido), minoxidila, sais de lítio, antimetabóli-tos, vitamina D e seus derivados; catecóis, flavonóides, ceramidas, ácidos graxos polinsaturados, ácidos graxos essenciais (por exemplo, ácido gama-linoléico), ingredientes ativos tendo estruturas lipossomais, sistemas de veículo, enzimas, coenzimas, inibidores de enzima, agentes de hidratação, a-gente calmante de pele, detergentes ou agentes formadores de espuma, e materiais de enchimento “mattifying" inorgânicos ou sintéticos, ou substâncias decorativas tais como pigmentos ou colorações e partículas de coloração para bases, formulações de maquiagem, e outros agentes para a coloração e embelezamento estético dos olhos, lábios, face, etc., bem como a-gentes abrasivos.

Menção pode ulteriormente ser feita de extratos de ingrediente ativo de planta ou extratos ou substância simples obtidos da mesma. O extrato de ingrediente ativo de planta é em gerai selecionado do grupo que consiste de extratos de planta sólidos, extratos de planta líquidos, extratos de planta hidrofóbicos, extratos de planta lipofílicos, ingredientes de planta simples; bem como suas misturas, tais como flavonóides e seus agiica: ruti-na, quercetina, diosmina, hiperosídeo, (neo)hesperidina, hesperitina, gingko biloba (por exemplo, gingko flavona glicosídeos), extrato de crataegus (por exemplo, procianidinas oligoméricas), trigo sarraceno (por exemplo, rutina), Sophora japonica (por exemplo, rutina), folhas de vidoeiro (por exemplo, quercetina glicosídeos, hiperosídeo e rutina), “elderflowers" (por exemplo, rutina), flor da árvore de limão-galeo (por exemplo, óleo etéreo com quercetina e farnesol), óleo de Wort de St. John ou extrato de Wort de St. John, óleo de prímula (por exemplo, extrato de óleo de oliva), calêndula, arnica (por exemplo, extratos oleosos da flor com óleo etereal, extratos polares com flavonóides), melissa (por exemplo, flavonas, etéreo); estimulantes imunes: Echinacea purpureia (por exemplo, extratos alcoólicos, suco de planta fresca, suco prensado), Eleutherococcus senticosus; alcalóides: cafeína, theine, chá preto ou extrato de chá preto, teobromina, capsaícina, ajmalina (por e-xemplo, prajmalina), evergreen (por exemplo, vincamina); outros fitofarma-cêuticos: aloe, castanha cavalo (por exemplo, aescine), alho (por exemplo, óleo de alho), abacaxi (por exemplo, bromelina), ginseng (por exemplo, gin-senosídeos), fruta de cardo de leite (por exemplo, extrato de silimarina padronizado), raiz de vassoura de açougueiro (por exemplo, ruscogenina), va-leriana (por exemplo, valepotriates, tct. valerianae), kava-kava (por exemplo, cavalactonas), flores de lúpulo (por exemplo, subsância armarga do lúpulo), extr. passiflora, enzian (por exemplo, extrato de etanol), extratos de fármaco contendo antraquinona, por exemplo, suco de aloe vera contendo aloína, extrato de pólen, extratos de algas, extratos de raiz de alcaçuz, extrato de palma, galphimia (por exemplo, tintura-mãe), mistletoe (por exemplo, extrato de etanol aquoso), fitoesteróis (por exemplo, beta-sitosterol), flores de ver-basco (por exemplo, extrato de álcool aquoso), drosera (por exemplo, extrato de licor de vinho), fruto do espinheiro marinho (por exemplo, suco obtido de mesmo ou óleo de espinheiro marinho), raiz de marshmallow, extrato de raiz de prímula, extratos de planta frescas oriundas de malva-rosa, comfrey, hera, cavalinha, milefólio, ribwort (por exemplo, suco prensado), urtiga, celidô-nia, salsa; extratos de planta oriundos de Norolaena lobata, Tagetes lúcida, Teeoma siems, Momordica charantia, e extratos de aloe vera, Tintura-mãe de Cardiospermum, extrato de dulcamara, bem como agentes de bronzea- mento e tanino.

Ao contrário dos ingredientes ativos descritos acima, que são usados substancialmente em cosméticos, os ingredientes ativos terapêuticos (medicamentos) são aqueles que, dentro do significado da lei farmacêutica, destinam-se inter alia para a cura, alívio ou prevenção de doenças, doenças, lesões físicas ou doenças patológicas. Adequados de acordo com a invenção são em particular aqueles agentes e ingredientes ativos que destinam-se a aplicação externa ou transdérmica, em particular no campo de tratamento e cura de ferimento e no campo do tratamento de queimaduras, em particular para primeiro socorro para queimaduras.

Ingredientes ativos para a aplicação dérmica ou transdérmica são em particular ingredientes ativos para pele mas também transdérmicos. Eles incluem, por exemplo: agentes para o tratamento de queimaduras, a-gentes para o tratamento de doenças de pele, analgésicos para a aplicação externa, por exemplo, dextropropoxifeno, pentazocina, petidina, buprenorfi-na; antirreumáticos/antiflogísticos (anti-inflamatórios) (NSARs), por exemplo incenso ou extrato de incenso, indometacina, diclofenaco, naproxeno, ceto-profeno, ibuprofeno, flurbiprofeno, ácido salicílico e seus derivados, tail como ácido acetilsalicílico, oxicamas; hormônios esteróides, por exemplo, corticói-des, glicocorticóides tais como hidrocortisona, cortisol, acetato de cortisona, cloprednol, prednisona, prednisolona, deflazacort, fluocortolona, triamcinolo-na, betametasona, betametasona valerato, mometasona furoato, dexameta-sona, metilprednisolona, etiniloestradiol, medroergotamina, di-hidroergo-toxina; agentes antigotosos, por exemplo benzbromarona, alopurinol; agentes dérmicos externos, anti-istaminas tais como bromfeniramina, bamipina; antibióticos tais como eritromicina, clindamicína, tetraciclina, incluindo agentes antibacterianos tais como, por exemplo, sais de prata e prata coloidal tal como cloreto de prata, nitrato de prata, iodeto de prata ou outros agentes de tratamento de ferimento contendo prata conhecidos da técnica anterior; an-timicóticos, medicamentos de peptídeo, ingredientes ativos antivirais, anti-ingredientes ativos inflamatórios, ingredientes ativos antipruríticos tais como ingredientes ativos anestesiantes, por exemplo, anti-histaminas, benzocaína, polidocanol ou corticóides e glicocorticóides; agentes anti-acne; ingredientes ativos antiparasíticos; hormônios para aplicação externa; terapêutica de veia; supressores imunes tais como inibidores de calcineurina tais como tacroli-mus e pimecrolimus, substâncias minerais e elementos em traço, tais como, por exemplo, compostos de selênio inorgânicos ou orgânicos, zinco e sais de zinco, etc., a totalidade para a aplicação dérmica ou transdérmica. A título de clarificação é observado que a classificação dos ingredientes ativos no grupo dos ingredientes ativos cosméticos ou terapêuticos dentro do contexto da presente invenção não representa uma classificação conclusiva. Em particular, a classificação produzida aqui não exclui a possibilidade de que os ingredientes ativos correspondentes são usados tanto quanto ingredientes ativos cosméticos quanto também terapêuticos.

Ingredientes ativos preferidos para a aplicação dérmica e transdérmica são selecionados do grupo que consiste de contendo: agentes para o tratamento de doenças de pele tais como neurodermatite, dermatite atópi-ca, psoríase, rosacea, etc, ingredientes ativos anti-inflamatórios, ingredientes ativos antipruríticos, agentes de bronzeamento, analgésicos tópicos, anestésicos e ingredientes ativos antibacterianos.

Particularmente de preferência, pelo menos um ingrediente ativo é selecionado do grupo do lipídios como pele, compreendendo, por exemplo, fosfolipídios, lipídios neutros e esfingolipídios bem como componentes do fator de umidificação natural (NMF) da pele, compreendendo, por exemplo, ureia, aminoácidos e ácidos carboxílicos, ácido pirrolidonacarboxíiico, sódio, potássio, cálcio, magnésio, lactato (ácido láctico), citrato, cloreto, fosfato, etc., ácido úrico e outros ácidos orgânicos.

Preferência particular é ulteriormente dada por aqueles ingredientes ativos que são usados no campo de tratamento de ferimento, em particular para o tratamento de ferimentos crônicos, decubitus, Ulcus cruris, sín-drome de pé diabético, etc., tais como, por exemplo, analgésicos, por exemplo, supressores imunes, hormônios, ingredientes anestésicos ativos, ingredientes ativos antiparasítico, fúngico ou antimicótico e antibacteriano tais como em particular ingredientes ativos contendo prata tais como, por exem- pio, nitrato de prata, cloreto de prata, iodeto de prata,partículas de prata de tamanho micro ou outro substâncias de tratamento de ferimento contendo prata conhecidas da técnica anterior, ingredientes ativos para o suporte e regulação do ambiente do ferimento tais como em particular eletrólitos, síli-ca, substâncias minerais e elementos em traço tais como, por exemplo, potássio, magnésio, cálcio, selênio, iodeto, etc., ingredientes ativos para o alcance de um desbridamento do ferimento tais como, por exemplo, colagena-ses ou outras enzimas proteolíticas adequadas conhecidas na técnica anterior, bem como ingredientes ativos para o auxílio da cura de ferimento tais como, por exemplo, fatores de crescimento, inibidores de enzima, proteínas de matriz ou constituintes de matriz extracelulares ou proteína solúvel (baixo peso molecular) constituintes de peptídeo, colágenos tipos outros que não do tipo I, III e V já contido em uma suspensão de colágeno usada de acordo com a invenção.

Ingredientes ativos particularmente preferidos a partir do campo dos agentes de tratamento de ferimento são selecionados de ingredientes ativos contendo prata tais como em particular nitrato de prata, cloreto de prata, partículas de prata de tamanho micro, tacrolimus, pimecrolimus, anti-histaminas, polidocanol, incenso/extrato de incenso, capsaicina, tanina, óleo de Wort de St. John/ extrato de Wort de St. John, óleo de prímula, dexpante-nol bem como compostos de selênio inorgânicos ou orgânicos, zinco e sais de zinco.

Outros ingredientes ativos preferidos são aqueles do grupo dos ingredientes ativos proteinogênicos, de preferência compreendendo fatores de crescimento, hormônios proteinogênicos, enzimas, coenzimas, glicoprote-ínas, fatores de coagulamento de sangue, outras citocinas e variantes dos ingredientes ativos mencionados acima preparados por técnicas recombi-nantes.

Fatores de crescimento que podem ser usados de acordo com a invenção são de preferência selecionados do grupo que consiste de VEGF (fator de crescimento endotelial vascular), bFGF (fator de crescimento de fibroblasto básico), FGF-1 (fator de crescimento de fibroblasto ácido), TGF-β, TGF-α (fator de crescimento de transformação β ou a), EGF (fator de crescimento endotelial), FIGF (fator de crescimento de hepatócito), TNF-α (fator de necrose de tumor a), IGF I e II (fator de crescimento de tipo insulina/ fator de crescimento de ligação de insulina I e II), fator de crescimento de ligação de heparina I e II, PDGF (fator de crescimento derivado de plaqueta), PD-ECGF (fator celular de crescimento endotelial derivado de plaqueta), BMP (fator de crescimento morfogenético de osso), GHRP (fator de liberação de hormônio de crescimento), fator de indução de cartilagem A e B, fatores de crescimento de osso, interleucina δ, angiopoietina, angiogenina, apro-tinina, e vWF (fator de von Willebrand).

Glicoproteínas como ingredientes ativos incluem, por exemplo, immunoglobulinas e anticorpos.

Outras citocinas como ingredientes ativos incluem, por exemplo, interleucinas e interferon.

Outros ingredientes ativos preferidos são aqueles que têm uma ação hemostático, tais como fatores de coagulação de sangue tal como, por exemplo, trombina, fibrinogênio ou sulfato de colesterila (por exemplo, sulfato de colesterila de sódio), ou ingredientes ativos tendo uma ação de ativação nos fatores e substâncias da cascata de coagulação extrínsica e/ou in-trínsica, tais como, por exemplo, fosfolipídios, caulim, aprotinina, concentrados de fator ou fatores, fator de tecido ou íons de cálcio. É ulteriormente concebível administrar outros ingredientes ativos tais como terapêutica brônquicos tais como anti-asmáticos, antitussivos, mu-colíticos, etc., antidiabéticos tais como, por exemplo, glibenclamida, hormônios, hormônios esteróides tal como dexametasona, glicosídeos cardíacos tal como digitoxina, terapêutica circulatória e cardíaca tal como, por exemplo, beta bloqueadores, antiarrítmicos, anti-hipertensivos, antagonistas de cálcio, etc., psicofarmacêuticos e antidepressores tais como, por exemplo, antide-pressores tricíclicos (NSMRI), inibidores de recaptação de serotonina (SS-Rl), inibidores de recaptação de noradrenalina (NRI), inibidores de recaptação de serotonina-noradrenalina (SNRI), inibidores de monoamino-oxidase (inibidores de MAO), etc., neurolépticos, anticonvulsivos ou antiepiféticos, hipnóticos, sedativos, anestésico, gástrico, terapêutica intestinal, agentes de diminuição de lipídio, analgésicos tais como, por exemplo, agentes anti-enxaqueca, paracetamol, ácido salicílico e seus derivados tais como ácido acetil salicílico, diclofenaco, ibuprofeno, cetoprofeno, naproxeno, etc., anti-inflamatórios, vasodilatadores, diuréticos, agentes antigotosos, citoestáticos, relaxante muscular, contraceptivos, por exemplo na forma de emplastros de hormônio, agentes anti-vício na forma de, por exemplo, emplastros de nicotina, extratos de planta, provitaminas tais como, por exemplo, beta-caroteno, vitaminas tais como, por exemplo, vitamina C, A, B, E, etc., por administração transdérmica em uma composição de acordo com a invenção, por e-xemplo na forma de um emplastro de ingrediente ativo transdérmico. É mais particularmente preferido de acordo com a invenção adicionar como outros agentes de formação de estrutura ou ingredientes ativos substâncias essas que são selecionadas do grupo das proteínas de matriz, constituintes de matriz extracelulares ou constituintes de peptídeo e proteína baixo peso molecular) solúveis, de preferência do grupo que compreende elastina, hidrolisados de elastina, glicosaminoglicanos, tais como sulfato de heparan, sulfato de condroitina, sulfato de dermatan, sulfato de ceratan, he-parina e ácido hialurônico, proteoglicanos, tais como agrecan, fibromodulin, decorin, biglican, versican, perlecan, proteoglican de membrana basal de alta densidade, sindecan e serglicina, fibrina, fibronectina, glucanos, tal como paramilon, etc. Mais particularmente preferidos constituintes de matriz extracelulares e agentes de formação de estrutura daquele tipos são elastina e hidrolisados de elastina, ácido hialurônico e fibronectina. O material de colágeno per se pode também ter certas ações terapêuticas, tal como em particular uma ação hemoestática ou um efeito de auxílio positivo na cura de ferimento. Não é, no entanto, um ingrediente ativo dentro do significado da invenção.

Os ingredientes ativos acima mencionados estão presentes nas matrizes de colágeno reticuladas sozinho ou em uma combinação de uma pluralidade de ingredientes ativos, de preferência em uma quantidade vantajosa até 40% em peso, de preferência até 60% em peso, mais de preferência até 80% em peso, com base no produto final seco por congelamento.

Nas matrizes de colágeno secas por congelamento, agentes de formação de estrutura ou ingredientes ativos do grupo das proteínas de matriz, constituintes de matriz extracelulares, ingredientes ativos proteinogêni-cos e constituintes de peptídeo ou proteína solúveis, juntamente com quaisquer constituintes de peptídeo e colágeno solúveis em ácido do processamento da suspensão de colágeno usado, pode de preferência contar no total para até 10% em peso, mais de preferência até 20% em peso, com base na massa seca do produto final seco por congelamento, medido pelo método de determinação (BCA) definido aqui.

As matrizes de colágeno de acordo com a invenção podem opcionalmente conter pelo menos uma substância auxiliar.

Substâncias auxiliares incluem: agentes para o ajuste do pH, tais como tampões, ácidos ou bases inorgânicos e orgânicos; substâncias graxas, tais como óleos minerais tais como óleos de parafina ou óleo de vasili-na, óleos de silicone, óleos vegetais tais como óleo de coco, óleo de amêndoa dose, óleo de damasco, óleo de milho, óleo de jojoba, óleo de oliva, óleo de abacate, óleo de gergelim, óleo de palma, óleo de eucalipto, óleo de alecrim, óleo de lavanda, óleo de pinho, óleo de tomilho, óleo de hortelã, óleo de cardamomo, óleo de flor de laranja, óleo de soja, óleo de farelo, óleo de arroz, óleo de colza e óleo de rícino, óleo de germe de trigo e vitamina E isolados dos mesmos, óleo de prímula, lecitinas de planta (por exemplo, lecitina de soja), efingolipídios/ceramidas isolados de plantas, óleos ou gorduras de animal, tais como sebo, lanolina, óleo de manteiga, óleo neutro, esqualeno, ésteres de ácido graxo de alcoóis graxos tais como triglicerídeos, e ceras tendo um ponto de fusão que corresponde à temperatura da pele (ceras de animal, tais como cera de abelha, cera de carnaúba e cera de candelila, ceras minerais, tais como ceras microcristalinas, e ceras sintéticas, tais como ceras de polietileno ou de silicone), bem como todos os óleos adequados para as finalidades cosméticas (assim chamados óleos cosméticos), como mencionado, por exemplo, no papel de CTFA, Cosmetic Ingredient Handbo-ok, 1st Edition, 1988, The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, agentes tensoativos além dos tensoativos de lavagem mencionados acima, tais como agentes de dispersão, umectantes, emulsificadores, etc.; materiais de enchimento; estabilizadores; cossolventes; colorações ou pigmentos farmaceuticamente e cosmeticamente convencionais ou outras coloração ou pigmentos, em particular aqueles que são usados principalmente para a coloração do composto de hidrogel e não para a aplicação a e coloração do corpo humano, tais como aqueles pigmentos e colorações como os colorantes decorativos listados sob o grupo dos ingredientes ativos; preservativos; emolientes; lubrificantes e agentes de deslizamento, etc.

Substâncias auxiliares preferidos de acordo com a invenção são gorduras e óleos. Preferência é dada em particular a óleos cosméticos como listados acima, em particular triglicerídeos, particularmente de preferência triglicerídeos de ácido caprílico/caproico, óleo de jojoba ou esqualeno bem como óleo de prímula.

As substâncias auxiliares mencionadas acima estão presentes nas matrizes de colágeno reticuladas sozinho ou em uma combinação de uma pluralidade de substâncias auxiliares, de preferência em uma quantidade vantajosamente de até 80% em peso, de preferência até 60% em peso, mais de preferência até 40% em peso, com base no produto final seco por congelamento.

Em geral, a classificação das substâncias mencionadas acima na categoria das substâncias auxiliares dentro do contexto da presente invenção não desvia a possibilidade de que essas substâncias auxiliares podem também ter certas ações cosméticas/terapêuticas, que é verdadeira em particular para os óleos cosméticos mencionados que são de preferência usados.

Se os materiais de colágeno de acordo com a invenção contiver uma combinação de ingredientes adicionais de pelo menos dois grupos mencionados, agentes de formação de estrutura, ingredientes ativos e/ou substâncias auxiliares, então a quantidade total desses ingredientes adicionais na matriz de veículo de colágeno porosa total é até 40% em peso, de preferência até 60% em peso, mais de preferência até 80% em peso, em cada caso com base no material de colágeno seco por congelamento. A quantidade de tais agentes de formação de estrutura, ingredientes ativos e/ou substâncias auxiliares, ou sozinhos ou em uma combinação de pelo menos dois dos grupos mencionados, é de preferência não menos do que 0,1% em peso, mais de preferência não menos do que 1% em peso.

Como já afirmado, uma outra vantagem do processo de acordo com a invenção e que, por causa do procedimento especial, em particular também a baixa atividade de epóxido residual devido ao processo e a possibilidade de inativação de quaisquer atividades residuais por ajuste do teor de umidade depois da secagem por congelamento, não é necessário remover por lavagem do epóxido reticulador, como é conhecido, por exemplo, dos processos da técnica anterior (por exemplo, grupo Zeeman). Isso é importante não apenas a fim de preservar os constituintes de peptídeo e colágeno solúvel em ácido da suspensão de colágeno usada liberavelmente, no material reticulado, seco por congelamento mas também para outros agentes de formação de estrutura ou ingredientes ativos do grupo das proteínas de matriz, constituintes de matriz extracelulares, ingredientes ativos proteinogêni-cos e constituintes de peptídeo ou proteína solúveis, como definidos aqui, por exemplo elastina, etc., que são opcionalmente adicionados a uma suspensão de colágeno. Na ordem para tais constituintes serem capazes de desenvolver sua ação positivo no uso, eles devem ser liberáveis a partir de matriz de colágeno reticulada, que age quase como um material de veículo, no uso. É imperativo para o mesmo que tais ingredientes ativos proteinogê-nicos e constituintes permaneçam predominantemente não reticulados no material e não são reticulados no material de colágeno, por exemplo pela adição de epóxi, e desse modo inseparavelmente ligados. Por meio do processo de acordo com a invenção é possível introduzir esses constituintes de proteína de matriz solúveis na forma não reticulada transformam no material de colágeno e para preservá-los predominantemente não reticulados ali, in-ter alia também porque uma quantidade extremamente pequena de agente de reticulação de epóxido está presente no processo de acordo com a in- venção. Como um resultado dessa pequena quantidade de agente de reticu-lação, reação de reticulação ocorre principalmente entre as quantidades pequenas do agente de reticulação de epóxido e os polipeptídeos de colágeno presentes em excesso como padrões de reação, como substituto com as moléculas de matriz proteinogênicas de baixo peso molecular.

Além de tudo, a quantidade de tais constituintes proteinogênicos, não reticulados, solúveis que podem ser liberados no uso nas matrizes de colágeno de acordo com a invenção é pelo menos de 0,1% em peso, de preferência pelo menos 2% em peso, particularmente de preferência > 5% em peso, em cada caso com base na massa seca do material seco por congelamento de colágeno. A quantidade de tais constituintes solúveis liberáveis, compreendendo constituintes de peptídeo e colágeno solúvel em ácido e/ou agentes de formação de estruturador ingredientes ativos do grupo das proteínas de matriz, constituintes de matriz extracelulares, ingredientes ativos proteinogênicos e constituintes de peptídeo ou proteína solúveis, é vantajosamente um máximo de até 20% em peso. A quantidade quantitativa de tais constituintes de peptídeo e colágeno liberáveis solúveis pode ser determinada, por exemplo, por meio de ensaio de BCA (ensaio de ácido biquinoico ) em comparação com albumina de soro bovino como padrão no sobrenadante depois da extração em 0,9% de NaCI durante um período de 24 horas a 37°C, como descrito em detalhes aqui.

Nos processos de acordo com a técnica anterior, tais constituintes proteinogênicos solúveis também seriam reticulados por causa da grande quantidade de agente de reticulação e correspondentemente inesperadamente estariam ligados ao material de veículo. Quaisquer resíduos não reticulados adicionalmente seriam removidos por lavagem do material no outro processo pela remoção por lavagem necessária do reticulado de epóxido residual a fim de reduzir a atividade de epóxi residual.

Em uma concretização particularmente preferida do processo, nenhum polímero hidrofílico sintético, em particular nenhum polímero hidrofí-lico sintético funcionalmente ativado, tal como, por exemplo, um glicol, tal como em particular um polietileno glicol difuncionalmente ativado, é adicionado a uma suspensão de colágeno antes da adição do agente de reticula-ção. Correspondentemente, concretização particularmente preferidas das matrizes de colágeno reticuladas de acordo com a invenção são aquelas que não compreendem um conjugado de um colágeno com um polímero sintético.

Como afirmado acima, as matrizes de colágeno reticuladas por epóxi secas por congelamento de acordo com a invenção não mais exibem reatividade de epóxi residual detectável, medida pelo método descrito aqui, no último depois da etapa de ajuste de umidade.

Além disso, foi também mostrado que os materiais de colágeno obteníveis pelo processo de acordo com a invenção não exibem qualquer toxicidade em processos padrão in vitro para a determinação de toxicidade (teste de XTT), que é outra evidência da alta biocompatibilidade de tais materiais de colágeno reticulados.

As matrizes de colágeno reticuladas por epóxi secas por congelamento de acordo com a invenção são adicionalmente distinguidas por estabilidade de degradação aperfeiçoada, que correspondem a uma taxa de degradação reduzida (degradação reduzida/digestão de colagenase), estabilidade hidrolítica aperfeiçoada e estabilidade mecânica aumentada no sentido de resistência a rasgo por via úmida aumentada, em cada caso como definido e descrito aqui mais abaixo.

Uma vez que a velocidade de degradação, ou taxa de degradação, reflete a estabilidade de matrizes de colágeno para degradação enzímá-tica, em particular para digestão de colagenase, pode ser determinada, por exemplo, por meio do teste de digestão de colagenase. Nesse teste, degradação das fibras e fibrilas de colágeno pela enzima colagenase (colagenase oriunda de Clostridium histolyticum (tipo 1) em tampão de PBS (solução salina tamponada por fosfato)) é propositadamente realizada sob condições controladas e, depois de um tempo de reação definido, a quantidade de produtos de composição é determinada por meio de medição de UVA/IS em um fotômetro de espectro, como descrito em detalhes nos seguintes exemplos.

As matrizes de colágeno estabilizadas por degradação de acordo com a invenção são distinguidas por uma redução na taxa de degradação, no sentido de uma redução na quantidade de produtos de composição solúveis, quando comparados com colágeno seco por congelamento não reticulado ou apenas desidrotermicamente reticulado, que pode ser determinado por meio do teste de digestão de colagenase como descrito aqui. A taxa de degradação é por um lado dependente da quantidade de agente de reticulação usada, mas por outro lado é também dependente da quantidade de quaisquer constituintes de proteína solúveis (proteínas de matriz, etc.) adicionada. Devido aos parâmetros de processo usados, as propriedades de degradação podem ser controladas na dependência do campo desejado da aplicação.

As matrizes de colágeno de acordo com a invenção de preferência têm a taxa de degradação, medida no tempo de reação de 6 horas depois da adição da colagenase, de não mais do que 85%, de preferência não mais do que 70%, mais de preferência não mais do que 50%, quando comparada com colágeno seco por congelamento desidrotermicamente reticulado (taxa de degradação 100%). Isso significa um aperfeiçoamento na estabilidade de degradação de pelo menos 15%, de preferência pelo menos 30%, particularmente de preferência pelo menos 50%, quando comparada com colágeno não reticulado ou apenas desidrotermicamente reticulado.

Em um outro método para a determinação da taxa de degradação da matriz de colágeno, a velocidade de degradação da matriz de colágeno é determinada por determinação do peso de uma amostra antes ou depois da degradação enzimática por colagenase oriunda de Clostrídium histolyticum (tipo I, Worthington Biochemicals). Para aquela finalidade, pedaços definidos das matrizes de colágeno são imersas em uma solução que contém unidades definidas de colagenase em 1 ml de PBS (pH 7,2) e são incubados por 2 horas a 37°C como leve agitação. A degradação é parada por adição de 0,2 ml de uma solução de EDTA a 0,25 M, e resfriamento sobre gelo é realizado por 10 minutos. A amostra é então lavada com 5 ml de tampão de PBS (pH 7,2) três vezes por 15 minutos e com 5 ml de água desmineralizada três vezes por 15 minutos, é congelada de um dia para o outro a -80°C e então seca por congelamento. Depois da secagem por congelamento, o peso da amostra de veículo de colágeno parcialmente degradada é determinada e a velocidade de degradação é determinada como se segue: Velocidade de degradação (%) = 100 x (peso original — peso depois da degradação)/peso original As matrizes de colágeno de acordo com a invenção são distin-guidas pela velocidade de degradação de não mais do que cerca de 60%, mais de preferência não mais do que cerca de 50%, ainda mais de preferência não mais do que cerca de 40%, e a velocidade de degradação é de preferência pelo menos cerca de 2%, mais de preferência pelo menos cerca de 4%, ainda mais de preferência pelo menos cerca de 8%, ainda mais de preferência pelo menos cerca de 10%.

Dependendo do grau de reticulação, as matrizes de colágeno re-ticuladas de acordo com a invenção são materiais que são ressolvíveis mais ou menos rapidamente. Isto é, um material tendo um baixo grau de reticulação é degradado enzimaticamente sob as condições prevalentes no organismo depois da administração subcutânea ou intramuscular, por exemplo. Depois de ser posto em contato com o ferimento, o material pode correspondentemente permanecer sobre o mesmo ou ali e auxiliar na cura do ferimento. Remoção do material não é vantajosamente necessária. Tal aplicação é vantajosa em particular quando usada como um agente de tratamento de ferimento. Se tais agentes de tratamento de ferimento destinassem a permanecer no ferimento, eles também são chamados de implantes degra-dáveis.

Bem como tendo estabilidade mecânica aumentada (resistência a rasgo), um material de colágeno reticulado aumentou estabilidade a biode-gradabilidade (por exemplo degradação enzimática) e é adequado em particular como um implante semipermanente para reconstrução de tecido ou para enchimento de defeito ou como uma armação para a população de células, por exemplo no campo de engenheiramento de tecido.

Uma baixa velocidade de degradação, e alta estabilidade de degradação correspondente, das matrizes de colágeno é vantajosa em particular também para o uso como um tratamento cosmético, armação de população de células ou para o uso como um material de esponja para a absorção de exsudato de ferimento, por exemplo em uma terapia de um tratamento de ferimento auxiliado por vácuo.

Por outro lado, no entanto, a taxa de degradação demasiadamente baixa da matriz para o uso como um agente de tratamento de ferimento e como um implante de tratamento de ferimento degradável é indesejável por que ele pode levar a encapsulação do material incompletamente degradado no ferimento ou no corpo e correspondentemente à ocorrência de dureza indesejável do tecido. É portanto particularmente importante de acordo com a invenção ajustar a taxa/velocidade de degradação otimamente para a aplicação desejada. As propriedades de degradação do material de colágeno são influenciadas tanto pela natureza do material obtido como descrito acima quanto pelas condições de reticulação ou secagem aplicadas ao mesmo durante a preparação das matrizes de colágeno de acordo com a invenção. De acordo com a invenção, propriedades de degradação particularmente vantajosas podem ser alcançadas com o material de colágeno preparado como descrito acima, em particular em combinação com as condições de preparação preferidas para a matriz de colágeno que são descritas aqui mais abaixo, na dependência do campo desejado de aplicação.

Em particular materiais de colágeno para o uso como um tratamento cosmético, como uma armação para a população de células no enge-nheiramento de tecido e como um material de tratamento para o uso em uma terapia de tratamento de ferimento auxiliada a vácuo têm uma taxa de degradação mais baixa de não mais do que 50%, que corresponde a um aperfeiçoamento na estabilidade de degradação de pelo menos 50%, quando comparada com colágeno não reticulado ou apenas desidrotermicamente reticulado. Por outro lado, materiais de colágeno para o uso como um agente de tratamento de ferimento ou como um agente de tratamento de ferimento degradável que é para permanecer no ferimento (implante degradável) ou como um implante para reconstrução de tecido bem como para o revestimento de defeitos de pele profundos têm uma taxa de degradação mais baixa de não mais do que de 85 a 70%, que corresponde a um aperfeiçoamento na estabilidade de degradação de pelo menos de 15 a 30%, quando comparada com colágeno não reticulado ou apenas desidrotermicamente reticu-lado.

Dentro do escopo da presente invenção, efeito de reticulação ou grau de reticulação significa por um lado a redução na taxa de degradação, ou um aumento na estabilidade de degradação da matriz de colágeno, que pode ser alcançada pela reticulação e, por outro lado, o aperfeiçoamento na estabilidade mecânica pelo aumento na resistência a rasgo (resistência a rasgo por via úmida), que pode em princípio ser determinada por métodos de determinação convencionais, em particular pelos métodos descritos aqui, e, além disso, o aumento na rigidez do material, que é quantificável por medição do módulo de elasticidade.

Por exemplo, a resistência de uma estrutura de colágeno a cola-genase pode ser determinada, por exemplo, pelo método descrito aqui (digestão de colagenase), que é uma medição da reticulação, material não reticulado sendo enzimaticamente degradado consideravelmente mais rápido do que o caso com material reticulado. A estabilidade hidrolítica é também uma medida da reticulação de uma matriz de colágeno e pode ser demonstrada, por exemplo, por colocação de uma quantidade definida de material de colágeno em uma solução aquosa e determinação da mudança nas propriedades de material durante um tempo. Enquanto materiais de colágeno não reticulados ou desidrotermicamente reticulado exibia hidrólise completa (dissolução estrutural da estrutura de matriz) depois de < 18 dias sob as condições escolhidas (solução aquosa a 50°C), nenhuma mudança estrutural na matriz foi observada no caso dos materiais de colágeno reticulados de acordo com a invenção sob as mesmas condições.

A resistência a rasgo por via úmida das matrizes de colágeno de acordo com a invenção pode ser determinada de acordo com DIN EN ISO 3376 e é de preferência > 50 cN/mm de espessura de camada, mais de preferência >100 cN/mm, ainda mais de preferência > 300 cN/mm.

De preferência, no entanto, a resistência a rasgo por via úmida é determinada usando-se um método de medição interna (UV8801) como descrito nos seguintes exemplos. Resistências a rasgo por via úmida preferidas das matrizes de colágeno reticuladas de acordo com a invenção, determinadas por esse método interno (UV 8801), são > 200 cN/mm de espessura de camada, mais de preferência > 400 cN/mm, ainda mais de preferência > 500 cN/mm.

As matrizes de colágeno reticuladas por epóxi secas por congelamento de acordo com a invenção adicionalmente exibem uma absorção marcadamente aperfeiçoada, absorção líquida e capacidade de amarzena-gem bem como uma umidificação aumentada ou taxa de hidratação quando comparada com não reticulada matrizes de colágeno, e quando comparada com matrizes de colágeno que eram apenas reticuladas por meio de reticu-lação desidrotérmica ou por meio de outros agentes de reticulação química conhecidos. A absorção líquida ou capacidade de amarzenagem das matrizes de colágeno de acordo com a invenção significa a capacidade de absorver quantidades de líquido em particular em combinação com a capacidade de armazenar e reter tais quantidades absorvidas de líquido. De acordo com a invenção, preferência é dada para aquelas matrizes de colágeno reticuladas que são capazes de absorver e armazenar quantidades de líquido de desde 1 a 200 vezes, de preferência de 10 a 100 vezes de seu próprio peso.

Uma medição da quantidade de líquido que pode ser absorvida pelo material é significado pelo grau de massa de inchamento (Qm): Onde Qm significa a razão de massa do material inchado (mGei) para a massa de material seco antes do inchamento (mtr.pr.)· A fim de medir o grau de massa de inchamento, o material seco por congelamento é correspondentemente introduzido e então colocado do- sadamente em um prato contendo um excesso de água destilada a uma temperatura de desde 15 a 25°C, sobre a superfície da água, e deixado para inchar por 10 minutos. A água em excesso é despejada longe sem ação mecânica. Depois da medição do peso da composição inchada novamente, o grau de massa de inchamento é calculado de acordo com a fórmula acima.

As composições secas por congelamento de acordo com a invenção de preferência têm um grau de massa de inchamento de desde 15 a 100. É adicionalmente possível indicar a capacidade de retenção líquida com base no peso da composição. Para aquela finalidade, o aumento no peso das amostras de material inchadas calculado na disposição do teste descrito acima é convertido, depois que o líquido em excesso foi despejado, no volume de líquido que corresponde àquele aumento de peso e que o volume absorvido de líquido é indicado, com base em 1 g da composto usada.

As matrizes de colágeno de acordo com a invenção são também distinguidas por uma densidade óptica mais alta quando comparada com matrizes de colágeno não reticuladas ou apenas desidrotermicamente reticu-ladas.

Densidade óptica aqui significa a densidade óptica unitária quantitativa, medida como o logaritmo comum do quociente de intensidade de luz transmitida para a intensidade de luz irradiada, calculada usando-se um densitômetro de Heiland SW TD 03 sobre matrizes de colágeno em camadas tendo a espessura de camada de 1 m. As matrizes de colágeno da presente invenção de preferência têm uma densidade óptica de > 0,02, mais de preferência > 0,03, ainda mais de preferência > 0,05, por mm de espessura de camada.

Além das vantagens acima mencionadas das matrizes de colágeno de acordo com a invenção, que são o resultado substancialmente do processo de acordo com a invenção, o material de colágeno reticulado por epóxido de acordo com a invenção tem em particular as seguintes propriedades vantajosas sobre material de colágeno não reticulado ou apenas desidrotermicamente reticulado e sobre materiais de colágeno reticulados por meio de outros agentes de reticulação química conhecidos: Sensação melhor: O material é mais aveludado, mais macio, sensações mais cheio e mais volumoso do que, por exemplo, não reticula-do/-desidrotermicamente material reticulado com uma espessura de camada idêntica. Isso é vantajoso no campo de cosmético em particular.

Densidade óptica mais alta: vantajosa no campo da aplicação cosmética e para as concretizações que devem ser avaliadas por impressões de cor.

Força de retorno mais alta: o material reticulado não colapsa no estado por via úmido na resposta a ações mecânicas tão facilmente quanto, por exemplo, material não reticulado/desidrotermicamente reticulado e assume seu volume original novamente mais facilmente, similarmente a uma esponja.

Capacidade de absorção de água aperfeiçoada Taxa de hidratação aperfeiçoada Elasticidade e flexibilidade alta População de células controláveis/reação de célula (resposta da célula ao material) Em ligação com a população de células controlável/reação de célula deve ser observado que, por meio do processo de acordo com a invenção, uma possibilidade foi encontrada do controle proposital das propriedades de material em relação a rigidez e flexibilidade, degradabilidade enzi-mática (taxa de degradação) e a provisão de constituintes de peptídeo e co-lágeno solúveis liberáveis ou de outras proteínas de matriz e constituintes de peptídeo solúveis, etc., como listados acima.

Em relação ao controle de uma rigidez e flexibilidade devem ser observadas que é conhecida que uma rigidez/flexibilidade de matrizes adequada para a população celular tem uma influência significativa nas propriedades das células que aderem à mesma. A influência do ambiente celular no desenvolvimento do fenótipo de célula e seu padrão de expressão, comportamento de migração e proliferação em anos recentes foram empurrados crescentemente para a linha de frente da pesquisa básica no campo de en- genheiramento de tecido. Apesar de sua composição, a rigidez (dureza ou rigidez) e elasticidade da matriz extracelular (ECM) é um aspecto principal do ambiente de célula particular. A rigidez da matriz extracelular é um sinal de regulação para o comportamento de células. Por exemplo, a diferenciação de células tronco é diretamente dependente da rigidez do substrato; do mesmo modo, o comportamento de miofibroblastos, por exemplo, é com base em uma rigidez particular do ambiente celular. As células reagem diretamente para dar feed-back mecânico do ECM que as envolvem (sensação mecano-química). A fim de estudar a ligação entre a rigidez do material que envolve as células e a resposta de célula com no mesmo, o uso de géis de rigidez diferente e composição é conhecida na técnica anterior (Mih e outros in PLoS ONE 6 (5): e19929; 2011). Exemplos de substratos sintéticos são hi-drogéis de poliacrilamida de diferentes graus de polimerização bem como múltiplas camadas de polieletrólito (PEM); géis à base de proteína são do mesmo modo usados, tais como, por exemplo, géis de colágeno (por exemplo, de acordo com Yang e outros in Biophysical Journal Vol. 97, 2051-2060; 2009). A rigidez do gel de colágeno de colágeno solúvel é diretamente dependente da concentração da proteína de formação de gel e pode ser ulteri-ormente modificada pela reticulação adicional, por exemplo com glutaraldeí-do ou também genipin. A elasticidade do material em questão é quantificada por meio do módulo assim chamado de elasticidade (também: módulo de Young), E. Isso é definido como se segue: O módulo de elasticidade (também: módulo de Young, da physi-cist Thomas Young) é um material constante oriundo do engenheiramento do material que descreve a relação entre esforço e tensão na deformação de um corpo sólido com comportamento elástico linear. O módulo de elasticidade é abreviado com o símbolo E. O valor do módulo de elasticidade é mais alto, a maior resistência de um material a deformação. A material tendo um alto módulo de elasticidade é portanto rígido, um material com um baixo módulo de elasticidade é flexível. É conhecido que a rigidez de ECM no tecido saudável e doente ou danificado tem uma ampla distribuição.

Por exemplo, a rigidez de tecido nervoso (cérebro) é E = cerca de 2,.5 kPa, aquele de tecido de músculo é E = 12 kPa e aquele de ossos é E = 18 GPa. Para o tecido de granulação, quando está presente na cura de ferimento, uma rigidez inicial de de desde 0.1 a 1 kPa e de 18 kPa depois de 7 dias é descrito (Krishnan e outros in Cell Adhesion & Migration 2:2, 83-94; 2008). É de interesse prover armações para o cultivo de 3D na biotecnologia, pesquisa básica e engenheiramento de tecido de campo que, bem como tendo alta biocompatibilidade e estabilidade de degradação correspondente, também têm uma rigidez que é específica ao tecido em questão e pode propositadamente ser ajustada a fim de ser capaz de prover o ótimo ambiente celular para as células que devem ser cultivadas.

As matrizes de colágeno de acordo com a invenção têm uma rigidez, ajustável por meio do processo de acordo com a invenção, na faixa de 0,01 a 100 kPa, de preferência na faixa de 0,1 a 60 kPa, particularmente de preferência na faixa de 2 a 40 kPa. É correspondentemente possível, por meio do presente processo para a reticulação de matrizes de colágeno, propositadamente se adaptar as propriedades de material para as exigências de ótimo crescimento celular (população), diferenciação celular, em particular para o perfil de expressão assim chamado das células que estão em contato direto com a matriz. Perfil de expressão significa, por exemplo, a expressão de proteínas de matriz particulares, proteínas de citoesqueleto (actinas), citocinas, proteases, etc. Tal controle de diferenciação celular ou do perfil de expressão de matrizes povoadas é vantajosa em particular no campo de engenheiramento de tecido e bioimplantes, mas também no estabelecimento dos sistemas de modelo na pesquisa básica, diagnósticos e análise.

Por causa das propriedades vantajosas acima mencionadas das matrizes de colágeno reticuladas de acordo com a invenção, elas são parti- cularmente adequadas para o uso cosmético e médico, farmacêutico ou bio-tecnológico.

Correspondentemente, a invenção também provê o uso cosmético das matrizes de colágeno de acordo com a invenção como um agente cosmético, em particular como um tratamento cosmético ou máscara. O uso da matriz de colágeno reticulada com epóxi seca por congelamento de acordo com a invenção como um tratamento cosmético ou máscara é de preferência realizado ou por aplicação do tratamento ou máscara no estado seco à parte do corpo a ser tratada e então hidratação dela com água ou uma solução aquosa de um ou mais ingredientes ativos e/ou opcionalmente substâncias auxiliares, ou por encharcamento da matriz de colágeno na forma de um tratamento ou máscara cosmética com uma solução aquosa de um ou mais ingredientes ativos e/ou opcionalmente substâncias auxiliares antes deles serem aplicados à parte do corpo a ser tratada.

Uma aplicação pré-umidificada ou seca pode também ser realizada quando do uso das matrizes de colágeno de acordo com a invenção como um agente para o tratamento de ferimento. A presente invenção refere-se ulteriormente às matrizes de colágeno reticuladas por epóxi secas por congelamento de acordo com a invenção para o uso como um agente farmacêutico (incluindo também dispositivos médicos), em particular para a aplicação tópica ou dérmica ou para a implantação em seres humanos ou animais.

Preferência particular é dada ao uso das matrizes de colágeno de acordo com a invenção como um implante, como um tratamento de pele dérmico ou transdérmico e/ou como um agente hemostático e como uma armação para o cultivo de células no campo de engenheiramento de tecido. A presente invenção refere-se ulteriormente às matrizes de colágeno de acordo com a invenção para o uso em pelo menos uma indicação ou aplicação selecionada do seguinte grupo, que consiste de: tratamento de ferimentos crônicos ou agudos, aperfeiçoamento de cura de ferimento, equa-lisação de defeitos de tecido, revestimento de defeitos de pele profundos enquanto formando volume, auxílio de regeneração de tecido, regeneração da derme, tratamento de queimaduras, uso na cirurgia plástica, uso depois de excisão de cicatriz, terapia de combinação com transplantes de pele cortada em partes, auxílio da formação de tecido de granulação, auxílio de an-giogênese, assegurando melhor qualidade de cicatriz, tratamento de ferimentos crônicos tais como Úlcera cruris, decúbito e pé diabético, tratamento de ferimentos abertos, tratamento de desordens para cura de ferimento, tratamento de doenças com defeitos de pele profundos, produção de um implante de mandíbula, produção de um implante ósseo, produção de um implante de cartilagem, produção de um implante de tecido, produção de um implante de pele, produção de um curativo médico, produção de um curativo transdérmico, produção de um emplastro de ferimento, produção de um material de bandagem de ferimento, produção de um curativo de ferimento e produção de uma matriz de cultura de célula para multiplicação celular para a implantação de unidades de matriz celular, e em biotecnologia na produção dos sistemas de modelo para a reprodução in vitro de sistemas de tecido (por exemplo, modelo de pele) para pesquisa básica, diagnóstico e análise.

Além do mais, as matrizes de colágeno de acordo com a invenção podem também ser usados em terapia de tratamento de ferimento auxiliado com vácuo, como é conhecido em princípio a partir da técnica anterior e como descrito, por exemplo, na patente de U.S. no. 2007/0027414. Por causa de sua alta flexibilidade, as matrizes de colágeno de acordo com a invenção podem ser introduzidas com sucesso no leito do ferimento em tal tratamento a vácuo, onde eles positivamente auxiliam a remoção de excesso de fluidos de ferimento devido a suas boas propriedades de absorção e hi-dratação. Transporte do exsudato já é alcançado por um lado pelo material de matriz colágeno poroso, permeável devido a sua fundamentalmente alta hidrofiiicidade e inchabilidade. Além disso, as matrizes de colágeno de acordo com a invenção têm alta porosidade, como um resultado do processo de secagem por congelamento, que adicionalmente facilita a passagem de líquidos. É uma vantagem adicional que as matrizes de colágeno de acordo com a invenção per se já têm uma influência positiva no processo de cura de ferimento, em particular também por causa do peptídeo, constituintes de proteína, peptídeo e colágeno solúveis liberáveis contidos ali.

As matrizes de colágeno de acordo com a invenção são particularmente adequados para as aplicações acima em particular também por causa de sua alta biocompatibilidade, que correspondem a uma baixa atividade de epóxi residual, e os constituintes de proteína, peptídeo e colágeno solúveis liberáveis que elas contêm.

Para os campos preferidos descritos acima de aplicação das matrizes de colágeno reticuladas de acordo com a invenção, elas são de preferência na forma em camadas de máscaras, folhas, matrizes, curativos, almofadas, camadas ou formas planas similares. Tais formas em camadas são particularmente adequadas para o tratamento externo e plano também de região afetadas maiores da pele.

Em uma outra concretização possível, tais matrizes de colágeno em camadas podem também ser totalmente ou parcialmente laminadas, isto é presente na forma de camadas de múltiplas camadas mutuamente ligadas (camada de sanduíche). Pode ser usado como materiais convencionais laminados conhecidos da técnica anterior, tais como, por exemplo, fibras, não tecidos, redes, películas ou folhas de materiais adequados tal como, por e-xemplo, rayon, celulose, polietileno (PE) ou poliuretano (PU) ou outros polí-meros/copolímeros sintéticos ou semissintéticos, que podem firmemente estar ligados ao materiais de veículo dentro do escopo da presente invenção por métodos convencionais, por exemplo, por ligação adesiva, laminação a quente, reticulação, etc. Tal laminação é particularmente adequada para o aumento adicional da estabilidade mecânica dos materiais de colágeno em camadas de acordo com a invenção, bem como para o aperfeiçoamento da sua manipulação durante a aplicação, em particular no estado umidecido. Uma laminação preferida compreende uma laminação com uma camada autoadesiva ou um material de emplastro em camadas, que é de preferência aplicado aos materiais de colágeno em camadas de tal modo que a camada laminada autoadesiva projeta totalmente ou parcialmente além do material de colágeno nas extremidades, de modo que os materiais de colágeno lami- nados, similarmente a uma disposição de emplastro convencional, pode ser prontamente fixado à área da pele a ser tratada por meio da laminação au-toadesiva que projeta nas extremidades. No caso de tais materiais de colá-geno laminados autoadesivos, particular preferência é dada por aqueles revestimentos laminados autoadesivos que são particularmente bem tolerados pela pele, têm uma baixa tendência a causar irritação e alergias e são fáceis de se remover, a fim de não causar dano adicional na remoção da camada adesiva à áreas de pele que pode já ser danificada ou irritada. Dependendo do campo desejado de uso, tais laminações podem ser oclusivas, auto-oclusivas ou hidrofílicas e não oclusivas, preferência sendo dada a laminações hidrofílicas, não oclusivas ou no máximo (no sentido de "no máximo ainda") semioclusivas, a fim de permitir hidratação dos materiais de coláge-no laminados para o uso. Além do mais, quando da escolha de tais revestimentos de laminação autoadesiva deve ser assegurada que a camada adesiva não é solúvel em água, de modo que o adesivo não pode ser dissolvido quando do umidecimento do material e a ação adesiva ou de fixação é assim não perdida.

Correspondentemente, a presente invenção também compreende em particular materiais de colágeno reticulados em camadas que são providos totalmente ou parcialmente com uma outra camada selecionada de fibras, não tecidas, redes, películas ou folhas ou uma camada autoadesiva, que é aplicada ao material de colágeno em camadas de tal modo que finaliza com o mesmo nas extremidades ou projeta totalmente ou parcialmente além do material de colágeno nas extremidades.

Como afirmado acima, as matrizes de colágeno de acordo com a invenção podem ser pré-encharcadas, isto é totalmente reidratadas, tanto antes do uso cosmético quanto depois do uso médico. Tal encharcamento ou reidratação é de preferência realizado com uma solução aquosa selecionada do grupo que compreende água e opcionalmente água desmineraliza-da ou assim chamada água térmica, soluções fisiológicas e soluções aquo-sas que contêm pelo menos um ingrediente ativo e/ou substância auxiliar. As soluções aquosas usadas para o encharcamento ou reidratação são também chamadas de soluções ativadoras.

Tais soluções ativadoras podem ser, por exemplo, soluções de ingredientes ativos e/ou substâncias auxiliares prontamente voláteis que, por causa do processo de preparação, por exemplo, a secagem por congelamento, não seriam ou não poderíam ser introduzidas para dentro de um material seco por congelamento, tais como, por exemplo, certas frações de ó-leos eterais, perfumes, etc. Também pode estar presentes ingredientes ativos e/ou substâncias auxiliares que alcançam uma ação de hidratação adicional e que, por causa dessa ação de hidratação ou por causa da tendências higroscópicas, não podem ser incorporadas nas matrizes de colágeno secas por congelamento de acordo com a invenção, ou podem ser incorporadas em apenas quantidades pequenas, uma vez que a estabilidade do próprio material seco por congelamento de colágeno, ou a estabilidade de quaisquer ingredientes ativos instáveis úmidos que estão presentes, podem não mais serem mantidos.

Em princípio, um ou mais dos ingredientes ativos e/ou substâncias auxiliares mencionados aqui mais acima podem estar presentes nas soluções ativadoras. Em particular, soluções de ingrediente ativo que contêm um ou mais dos ingredientes ativos ou substâncias auxiliares preferidos aqui mais acima mencionados são particularmente adequados para o uso terapêutico nas indicações que são preferidas de acordo com a invenção.

Em uma concretização particularmente preferida, uma solução ativadora aquosa que está substancialmente livre de preservativos e/ou substâncias auxiliares do grupo dos poliéteres, polietileno glicóis (PEGs), polipropileno glicóis (PPGs) e poliglicóis (PGs) é usado.

Em uma outra concretização preferida da invenção, o material de colágeno reticulado com epóxi de acordo com a invenção está presente com a solução ativadora em uma disposição espacial associada preparação de combinação, kit de aplicação, conjunto, kit de partes, etc.). Tais preparações de combinação ou disposições de kit de partes de preferência compreendem pelo menos uma das matrizes de colágeno de acordo com a invenção, de preferência aqueles na forma em camadas de curativos, almofadas ou máscaras, bem como pelo menos uma solução aquosa que pode conter um ou mais ingredientes ativos e/ou pelo menos uma ou mais substâncias auxiliares (solução ativadora). A configuração de tais preparações de combinação ou combinações de kit de partes de material de colágeno de acordo com a invenção por um lado e solução ativadora por outro lado pode prover os dois componentes a serem removidos a partir da disposição de kit de partes separadamente e combinados para outro uso do lado de fora. É, no entanto, também concebível para os componentes serem combinados dentro da própria embalagem de kit de partes, por exemplo, em câmaras providas para o mesmo, e a composição de reidratação então a ser realizada diretamente a partir da mesma para continuar o uso externo ou transdérmico. Isso pode de preferência ser realizado diretamente pelo usuário final. A invenção é explicada em maiores detalhes pelos seguintes exemplos. EXEMPLOS Exemplo 1: Preparação exemplo 1a Matriz de colágeno puro com reticulação de epóxido (5% de agente de reticulação de epóxido/massa seca) Exemplo para a preparação de uma biomatriz de colágeno reti-culada por epóxi de acordo com a invenção sem adição de outros constituintes de peptídeo ou proteína solúveis, ingredientes ativos e/ou substâncias auxiliares, usando-se uma quantidade de agente de reticulação de epóxido de 5%, com base na massa seca da suspensão de colágeno. a) Provisão de 3000 g de uma suspensão de colágeno (colágeno de teor seco: 1,6%, teor de colágeno: 48 g), preparados pelo processo de acordo com DE 4048622 A1 e em particular DE 10350654 A1. b) Ajuste do valor de pH de uma suspensão de colágeno para pH 3,3. c) (omitido) d) A uma temperatura abaixo de 10°C, 2,4 g de éter de 1,4- butanodiol diglicidila (BDDGE, Sigma-Aldrich) são adicionados gota a gota a uma suspensão de colágeno dentro de um período de 5 minutos, enquanto se agitando com um agitador de pá (eurostar, IKA) a 600 rps. A massa resultante é desgaseificada em um misturador a vácuo (Smartmix, A-mann/Girrbach) em porções de cerca de 750 g. e) No período de 2 horas de misturação no agente de reticula-ção, a suspensão desgaseificada é despejada nas folhas e é congelada, a suspensão de colágeno sendo mantida a uma temperatura < 18°C até o congelamento. f) A massa congelada é então armazenada por 24 horas a -20°C e então é submetida a secagem por congelamento, a secagem por temperatura de congelamento sendo mantida abaixo de 100°C. g) A matriz de colágeno liofilizada é reidratada para um teor de umidade de até 25%, com base na matriz de colágeno seca, a uma umidade de60-70% de umidade relativa durante um período de 24-48 horas. h) A matriz de colágeno assim obtida é separadas em camadas de 1-2 mm, é processadas e opcionalmente é submetida a esterilização gama (20 kGy).

Preparação exemplo 1 b Matriz de colágeno puro com reticulação de epóxido (10% de agente de reticulação de epóxido/massa seca) Exemplo para a preparação de uma biomatriz de colágeno reti-culada por epóxi de acordo com a invenção sem adição de outros constituintes de peptídeo ou proteína solúveis, ingredientes ativos e/ou substâncias auxiliares, usando-se uma quantidade de agente de reticulação de epóxido de 10%, com base na massa seca da suspensão de colágeno. A preparação é realizada analogamente a Preparação exemplo 1a, em que na etapa d) 4,8 g de éter de 1,4-butanodiol diglicidila (BDDGE, Sigma-Aldrich) são adicionados e na etapa g) a reidratação é realizada por até 96 horas.

Exemplo 2: Preparação exemplo 2a Matriz de colágeno reticulada com epóxido com constituintes de proteína solúveis adicionais do grupo das proteínas de matriz (hidrolisado de elastina) (5% agente de reticulação de epóxido/massa seca) Exemplo para a preparação de uma biomatriz de colágeno reticulada por epóxi de acordo com a invenção com adição de outros constituintes de proteína/peptídeo solúveis (proteínas de matriz: elastina) usando-se uma quantidade de agente de reticulação de epóxido de 5%, com base na massa seca da suspensão de colágeno aquosa. a) Provisão de 3000 g de uma suspensão de colágeno (colágeno de teor seco: 1,6%, teor de colágeno: 48 g), preparados pelo processo de acordo com DE 4048622 A1 e em particular DE 10350654 A1.

b) Ajuste do valor de pH da suspensão de colágeno para pH 3,3. c) A uma temperatura abaixo de 10°C, 2,4 g de éter de 1,4-butanodiol diglicidila (BDDGE, Sigma-Aldrich) são adicionados gota a gota à suspensão de colágeno dentro de um período de 5 minutos, enquanto se agitando com um agitador de pá (eurostar, IKA) a 550 rps. d) Então adição de 30 g de hidrolisado de elastina (Elastin spezial B1N, GfN, Herstellung von Naturextrakten GmbH) sob as mesmas condições. A massa resultante (mistura de colágeno aquosa) é desgaseifi-cada por 2x5 minutos em um misturador a vácuo (Smartmix, A-mann/Girrbach) em porções de cerca de 750 g. e) No período de 2 horas de misturação no agente de reticulação e o hidrolisado de elastina, a mistura de colágeno desgaseificada é despejada nas folhas e é congelada, a mistura de colágeno sendo mantida a uma temperatura < 10°C até o congelamento. f) A massa congelada é então armazenada por 24 horas a -20°C e então é submetida a secagem por congelamento, a secagem por temperatura de congelamento sendo mantida abaixo de 100°C. g) A matriz de colágeno liofilizada é reidratada para um teor de umidade de até 25%, com base na matriz de colágeno seca, a uma umidade de 60-70% de umidade relativa durante um período de 24-48 horas. h) A matriz de colágeno assim obtida é separadas em camadas de 1-2 mm, é processada e opcionalmente é submetida a esterilização gama (20 kGy).

Preparação exemplo 2b Matriz de colágeno reticulada com epóxido com constituintes de proteína solúveis adicionais do grupo das proteínas de matriz (hidrolisado de elastina) (10% de agente de reticulação de epóxido/massa seca) Exemplo para a preparação de uma biomatriz de colágeno reticulada por epóxi de acordo com a invenção com adição de outros constituintes proteína/peptídeo solúveis (proteínas de matriz; elastina), usando-se uma quantidade de agente de reticulação de epóxido de 10%, com base na massa seca da suspensão de colágeno aquosa. A preparação é realizada analogamente a Preparação exemplo 2a, em que na etapa c) 4,8 g de éter de 1,4-butanodiol diglicidila (BDDGE, Sigma-Aldrich) são adicionados e na etapa g) a reidratação é realizada for até 96 horas.

Exemplo 3: Preparação exemplo 3 Matriz de colágeno reticulada com epóxido com ingredientes ativos/ substâncias auxiliares adicionais do grupo das gorduras e óleos cosméticos (triglicerídeos/óleo neutro) (4,8% de agente de reticulação de epóxido/massa seca) Exemplo para a preparação de uma biomatriz de colágeno reticulada por epóxi de acordo com a invenção com adição de outros ingredientes ativos/substâncias auxiliares do grupo das gorduras e óleos (triglicerídeos/óleo neutro), usando-se uma quantidade de agente de reticulação de epóxido de 4,8%, com base na massa seca da suspensão de colágeno a-quosa. a) Provisão de 3900 g de uma suspensão de colágeno (colágeno de teor seco: 1,6%, teor de colágeno: 62,4 g), preparados pelo proces- so de acordo com DE 4048622 A1 e em particular DE 10350654 A1.

b) Ajuste do valor de pH da suspensão de colágeno para pH 3.3. c) A uma temperatura abaixo de 10°C, 2.95 g de éter de 1,4-butanodiol diglicidila (BDDGE, Sigma-Aldrich) são adicionados gota a gota à suspensão de colágeno dentro de um período de 5 minutos, enquanto se agitando com um agitador de pá (eurostar, IKA) a 550 rps. d) Então a adição de 3,8 g de óleo neutro sob as mesmas condições. A massa resultante (mistura de colágeno aquosa) é desgaseificada por 2x 5 min em um misturador a vácuo (Smartmix, Amann/Girrbach) em porções de cerca de 750 g. e) No período de 2 horas de misturação no agente de reticula-ção e o óleo neutro, a mistura de colágeno desgaseificada é despejada nas folhas e é congelada, a mistura de colágeno sendo mantida a uma temperatura < 10°C até o congelamento. f) A massa congelada é então armazenada por 24 horas a -20°C e então é submetida a secagem por congelamento, a secagem por temperatura de congelamento sendo mantida abaixo de 100°C. g) A matriz de colágeno liofilizada é reidratada para um teor de umidade de até 25%, com base na matriz de colágeno seca, a uma umidade de 60-70% de umidade relativa durante um período de 24-48 horas. h) A matriz de colágeno assim obtida é separadas em camadas de 1-2 mm, é processada e opcionalmente é submetida a esterilização gama (20 kGy).

Exemplo 4: Determinação qualitativa de proteínas solúveis por meio de SDS-PAGE

Breve explicação: SDS-PAGE SDS = dodecil sulfato de sódio, detergente, sal de sódio de uma cadeia de ácido graxo longa PAGE = eletroforese de gel de poliacrilamida, eletroforese em um gel de polímero de acrilamida Eletroforese: Separação de partículas carregadas em uma substância de veículo por aplicação de uma voltagem elétrica, que resulta na migração das partículas.

Breve descrição: Por adição de detergentes iônicos a pH > 7 proteínas não carregadas são convertidas em partículas carregadas, que separam em um gel por aplicação de uma voltagem elétrica no campo elétrico resultante com base em seu tamanho e forma ao longo da distância de migração. Proteínas de baixa massa migram mais rapidamente do que proteínas maiores de massa mais alta. Proteínas esféricas migram mais rapidamente do que se alongam, proteínas de tipo fio. Os grupos de proteínas separam de acordo com tamanho e formam tiras estreitas (chamadas tiras) no gel, que podem ser visualizados com corantes específicos. O tamanho de proteínas ou fragmentos de proteína é avaliado visualmente com base em sua distância de migração quando comparada com substâncias de referência (padrão de peso molecular = proteínas de tamanho conhecido).

Sistemas de teste adequados são sistemas de teste padrão comercialmente disponíveis convencionais tal como, por exemplo, o sistema de critério oriundo de Biorad: Critério de XT Precast Gel 4-12% de acrilamida, Sistema de tampão: Bis-Tris, 12+2 Well Comb, 45 pl por cavidade Espessura de Gel: 1 mm, catálogo 345-0123 Bio Rad Tampão B: Critério XT Mes (tampão, 20x) Controle 210007145 Tampão de amostra: Tampão de amostra de XT; 4x, 10 ml de Controle 310008088 Manchamento dos géis de proteína finalizado é alcançado por reagente pronto para o uso GelCode Blue Safe Stain (Thermo Scientific), que é com base no corante sensível a proteína Coomassie Blue.

Exemplo 5: Determinação quantitativa de constituintes de proteína solúveis por meio do método de BCA A detecção de constituintes de proteína e proteína solúvel por meio do teste de BCA é com base no fato de que proteínas formam um complexo com íons de Cu2+ em solução alcalina (reação de biureto). Os íons de Cu2+ desse complexo são reduzidos a íons de Cu+, que formam um complexo de cor violeta com ácido bicinquinônico (BCA). A absorção desse complexo de cor é medida por espectrometria a 562 nm. A redução é realizada pelas cadeias laterais de cisteína, tirosina, triptofano e a ligação de peptídeo, a intensidade da formação de cor (o comportamento de redox dos grupos envolvidos) sendo dependente inter alia da temperatura, de modo que a sensibilidade do teste pode ser modificada por sua variação.

Sistemas de teste adequados são sistemas de teste padrão comercialmente disponíveis convencionais tal como, por exemplo, o kit de ensaio de proteína de Pierce BCA (Thermo Scientific). A determinação é feita em comparação com uma solução padrão de BSA (albumina de soro bovino).

Condições de reação para o desenvolvimento de cor: 60°C, 1 hora de tempo de reação.

Resultado de teste: Figura 1 mostra a percentagem de constituintes de proteína solúveis em uma matriz de colágeno reticulada com epóxi com proteínas de matriz solúveis adicionais (hidrolisado de elastina), que correspondem à composição de acordo com Exemplos de preparação 2a e 2b, que foram reticulados com concentrações de epóxido de 5% e 10%, em cada caso com base na massa seca da suspensão de colágeno, em comparação com uma matriz de colágeno unicamente desidrotermicamente reticulada com hidrolisado de elastina (100%). (Na figura, "uma matriz não reticulada" significa colágeno desidrotermicamente reticulado (isto é, quimicamente reticulada).) A figura claramente mostra que, apesar da reticulação química, uma alta porção de constituintes de proteína solúveis e proteínas de matriz é retido no material. A medição adicionalmente mostrou as seguintes quantidades por peso de constituintes de proteína solúveis, em cada caso com base no produto final seco por congelamento, para os materiais testados: Matriz de colágeno desidrotermicamente reticulada com elastina ("não reticulado"): > 15% em peso Preparação exemplo 2a com 5% de epóxido: > 10% em peso Preparação exemplo 2b com 10% epóxido: > 4% em peso.

Exemplo 6: Determinação da taxa de degradação Digestão de teste de colagenase A determinação da estabilidade enzimática (estabilidade de degradação) de matrizes de colágeno é realizada por meio de um método que é com base no degradação das fibras de colágeno pela enzima colagenase. Nesse método, a degradação das fibras e fibrilas de colágeno pela enzima colagenase (colagenase oriunda de Clostridium histolyticum (tipo 1) em tampão de PBS (solução salina tamponada por fosfato)) é efetuada proposita-damente sob condições controladas, e a quantidade de produtos de decomposição é determinada por meio de medição de UV/VIS em um espectrofo-tômetro depois de um tempo de reação definido.

Produtos químicos usados: solução de tampão de TRIS: base de TRIZMA (Fluka Art No. 93350 LOT 450756/1), CaCI2*6H20 (Riedel de Haen Art No. 12074 LOT 12610), - HCI de 25% (Merck Art No. 1.00316.1000 LOT Z730816335) solução de EDTA: di-hidrato de sal de dissódio de ácido eti-lenodiamina-tetraacético 0,2 mol/l (Fluka Art No. 03679 LOT 1104109 10505293) colagenase: Sigma C 688T LOT 122k8607, 700 U/mg matrizes de colágeno: por exemplo, de acordo com Exemplos de preparação de 1 a 3 Preparação dos reagentes: Solução de tampão de TRIS de CaCI2 a 0,1 M/25 mM: 1,21 g de base de TRIZMA são dissolvidos juntamente com 0,55 g de CaCI2*6H20 em 80 ml de água de RO e são ajustados para um valor de pH 7,4 com cerca de 1 ml de 25% de HCI. A solução é então transferida para um frasco de medição de 100 ml e é perfeito com água de RO.

Solução de EDTA de 0,2 mol/l: 3,7224 g de dl-hidrato de sal de dissódio de ácido etilenodiami-na-tetra acético são dissolvidos em 50 ml de água de RO (usando-se um agitador magnético cerca de 30 minutos).

Solução de enzima: 5 mg da enzima são dissolvidos em 1 ml de solução de tampão de TRIS. Para os testes individuais, alíquotas de 50 ou 100 U (volume dependente de carga, aqui = 35 e 70 μΙ) são adicionados ao sistema de teste. Ácido Acético a 0,95%: 0,95 ml de ácido acético glacial é perfeito a 1000 ml com água de RO.

Procedimento: Pedaços tendo um raio de 10 mm (peso seco cerca de 15 mg) são cortados de 2 mm de espessura de folhas de colágeno e são secos por 12 horas em um dessecador. As amostras são introduzidas pesadamente em 2 ml de vasos de Eppendorf (Safe Lock Tubes 0030.120.094), e 1,5 ml da solução de tampão de TRIS são adicionados. Assim que 35 μΙ de solução de enzima foram adicionados, as amostras são temperadas a 37°C em um bloco térmico (aquecedor por blocos de Stuart Scientific).

Depois do tempo de digestão correspondente (1,5 horas, 3 horas, 6 horas e 23 horas), 200 μΙ de solução de EDTA são adicionados aos vasos de Eppendorf e centrifugação é realizada na capacidade máxima por 40 minutos a 18°C. Para a diluição com 7,5 ml de ácido acético glacial a 0,95%, alíquotas de 800 μΙ são transferidos para tubos de teste da região padrão 10 ml, são selados com uma tampa e são movidos levemente de um lado para o outro para as finalidades de homogeneização.

Medição fotométrica: Medição é realizada em um espectrofotômetro de UVA/IS em um comprimento de onda de 234 nm. 10 mm de cubetas de quartzo são usados. 7,5 ml de ácido acético com 800 μΙ de solução de tampão de TRIS são medidos como o valor em branco. Antes que as amostras são medidas, uma solução de enzima correspondente (aqui: 35 μΙ de solução de enzima em 1,5 ml de tampão de TRIS em um vaso de Eppendorf, cujos 800 μΙ em 7,5 ml de ácido acético) seria medida como o valor zero, cuja absorção é ajustada como o valor de zero no diagrama (absorção cerca de 0,0166).

Para a determinação dos valores absolutos, uma solução de ca-libração é também preparada e é medida de acordo com o procedimento acima.

Preparação da solução de calibração: 0,1006 g de colágeno foi degradado totalmente de um dia para o outro a 37°C em 8 ml de tampão de TRIS com 233 μΙ de solução de colage-nase (que correspondem a 600 U). No dia seguinte, 1333 μΙ de solução de EDTA foram adicionados à solução, e foi perfeito a 10 ml com tampão de TRIS no frasco de medição. Volumes correspondentes dessa solução, de acordo com a seguinte tabela, foram diluídos a 10 ml com 0,95% de ácido acético e a absorção dessa solução foi medida a 234 nm. A curva de calibração correspondente tem a equação linear A (234 nm) = 0,0011c-0,0407 (R2 = 0,9983).

Resultados de teste: Figura 2a mostra as taxas de degradação relativas (%) de uma matriz de colágeno reticulada com epóxi sem ingredientes adicionais de a-cordo com a Preparação exemplo 1a e de uma matriz de colágeno reticulada com epóxi com proteínas de matriz solúveis adicionais (hidrolisado de elasti-na) de acordo com a Preparação exemplo 2a (concentração de epóxido a 5% em cada caso) em comparação com a matriz de colágeno unicamente desidrotermicamente reticulada com hidrolisado de elastina. (Na figura, "não reticulado" significa uma matriz de colágeno desidrotermicamente reticulada (isto é, não quimicamente reticulada)). A figura claramente mostra a aperfeiçoamento na degradação como uma redução na taxa de degradação (redução na degradação enzimá-tica) dos materiais de colágeno reticulados com epóxido de acordo com a invenção. A matriz dissolvida totalmente depois de 6 horas foi ajustada como 100% aqui. Os valores de absorção foram normalizados para 10 mg de matriz.

Por determinação da curva de calibração, os valores absolutos das quantidades dissolvidas podem ser calculadas a partir dos valores de absorção: Figura 2b mostra as concentrações absolutas correspondentes da matriz dissolvida normalizada para dar 10 mg de matrix usada durante um período de até 23 horas.

Figura 2b adicionalmente mostra o desenvolvimento da degradação durante um período de até 23 horas como uma percentagem da degradação. As matrizes de colágeno reticuladas de acordo com a invenção correspondentemente exibem marcadamente melhor estabilidade de degradação do que uma matriz quimicamente reticulada mesmo depois de 23 horas de digestão de colagenase.

Exemplo 7: Determinação de a estabilidade hidrolítica A estabilidade hidrolítica de matrizes de colágeno é estudada por colocação de um material de colágeno definido em uma solução aquosa e armazenagem dele a 50°C e determinação da mudança nas propriedades de material durante um tempo.

Um exemplo de uma solução aquosa para o estudo da estabilidade hidrolítica tem a seguinte composição: Preparação: 1) Dissolver glicerol, pentanodiol e Rokonsal MEP em um proveta de vidro usando-se um agitador magnético 2) Perfazer a cerca de 98% da quantidade final com água ul-trapura (SHC 101), com agitação 3) Adicionar NaCI e dissolver usando-se um agitador magnético 4) Ajustar valor de pH para pH 5,0 com 1% de solução de ácido cítrico 5) Perfazer à quantidade final com água ultrapura (SHC 101) 6) Checar valor de pH e ajustar para pH 5,0 novamente se necessário A estabilidade hidrolítica pode ser determinada por um lado por medição da redução na área de superfície, causada pela redução das matrizes. A estabilidade hidrolítica pode adicionalmente ser determinada por meio da diminuição na massa, determinada de acordo com Estabilidade hidrolítica (%) =Mtx x 100 / Mto onde M(* = massa do material de matriz intacta/ligada seco Mto = massa do material de matriz seco antes do início do teste Resultados de teste: A estabilidade hidrolítica foi estudada sob as condições descritas acima por determinação da redução na área de superfície de a) matriz de colágeno desidrotermicamente reticulado ("não reti-culado") contendo triglicerídeos/óleo neutro, que foi seca por congelamento a temperatura de secagem por congelamento > 120°C, b) matriz de colágeno reticulada com epóxi de acordo com a invenção do exemplo da preparação 3 (contendo triglicerídeos/óleo neutro), e c) matriz de colágeno reticulada com epóxi (5% de epóxido/DM) que correspondem à composição de acordo com a Preparação exemplo 3 (contendo triglicerídeos/óleo neutro), que foi seco por congelamento a temperatura de secagem por congelamento > 120°C.

Figura 3 mostra que materiais de colágeno meramente desi-drotermicamente reticulados ("não reticulado") de acordo com a) exibem hi-drólise completa (dissolução estrutural da estrutura de matriz) depois de a-penas 5 dias sob as condições de teste escolhida, enquanto que no caso dos materiais de colágeno reticulados por epóxi de acordo com a invenção de acordo com b), nenhuma mudança estrutural na matriz é observada ainda depois de 18 dias sob as mesmas condições. No mesmo ponto de tempo, materiais de colágeno reticulados com epóxi secos a temperaturas de secagem por congelamento > 100°C de acordo com c) exibem o início de hidróli-se (redução da área de superfície) quando comparada com os materiais de acordo com a invenção de acordo com b). Depois de cerca de 4 semanas, a matriz de acordo com a invenção de acordo com b) também exibe o começo da hidrólise, os materiais de acordo com c) seco em uma temperatura mais alta que exibem uma estabilidade hidrolítica marcadamente mais pobre naquele tempo. Os resultados correspondentemente refletem o fato de que a secagem por temperatura de congelamento também tem uma influência na estabilidade hidrolítica. Correspondentemente, matrizes expostas à secagem por temperatura de congelamento > 100°C exibem estabilidade hidrolítica mais pobre quando comparados com os materiais produzidos de acordo com a invenção (secagem por temperatura de congelamento < 100°C). A título de exemplo, Figura 4 mostra o grau de hidrólise de uma matriz desidrotermicamente reticulada de acordo com a) quando comparada com a matriz de acordo com a invenção de acordo com b) depois da armazenagem de 18 dias sob condições de teste descritas aqui mais acima. Exemplo 8: Determinação de método interno de resistência a rasgo por via úmida (UV8801) No método para a determinação da resistência a rasgo por meio de uma matriz (método de medição interna UV8801), uma matriz de metal tendo uma cabeça esférica (25 mm de diâmetro) é pressionada sobre uma modalidade em camadas das matrizes de colágeno de acordo com a invenção com o auxílio de um dispositivo de teste mecânico (dispositivo de teste de material de Zwick B Z 2.5 / TN 1S), e trajeto e força que a matriz avança e exerce e são registrados.

Para a determinação, uma matriz de colágeno em camadas tendo uma espessura de 1,5 mm é cortada em um tamanho de 8 x 8 cm e é introduzida para dentro do recipiente da amostra do dispositivo e totalmente é molhado ali. A medição é então iniciada e a matriz esférica é pressionada sobre a amostra até que o material se rasgue. A força em que o material rasga é registrada por meio de gravação de dados eletrônica, é calculada e é exibida.

Resultados de teste: A título de exemplo, Figura 5 mostra a aperfeiçoamento na resistência a rasgo por via úmida (de acordo com método interno UV8801) de matrizes de colágeno reticuladas por epóxi tendo a composição de acordo com a Preparação exemplo 1a quando comparadas com matrizes de colágeno meramente desidrotermicamente reticuladas (não reticulada, secagem 100°C, "não reticulado" significando unicamente desidrotermicamente reticu-lado (isto é, não quimicamente reticulado)).

Figura 5 também mostra a influência da secagem por temperatura de congelamento na resistência a rasgo por via úmida. De acordo com a figura, matrizes expostas à secagem por temperatura de congelamento > 100°C ou a pós-secagem a > 100°C exibem resistências a rasgo por via ú-mida mais pobres do que os materiais preparados de acordo com a invenção.

Além do mais, Figura 6 adicionalmente mostra a influência do agente de reticulação de concentração de epóxido na resistência a rasgo por via úmida. É mostrado que, quando a concentração de epóxido aumenta > 5% (em DM da mistura/suspensão de colágeno aquosa), a resistência a rasgo por via úmida diminui. Ótimas resistências a rasgo por via úmida são al- cançadas sob as condições de processo dadas com concentrações de epó-xido de desde 5% a 10% (DM). A figura adicionalmente mostra, como esperado, o aumento na resistência a rasgo por via úmida de materiais de colá-geno meramente desidrotermicamente reticulados quando a secagem por temperatura de congelamento aumenta.

Figura 7 mostra a influência na resistência a rasgo por via úmida dos tempos de repouso e da temperatura da suspensão/mistura de colágeno aquosa mantidas desse modo antes do congelamento. Está claro a partir do que tantos tempos de repouso mais longos quanto temperaturas mais altas adversamente afetam a resistência a rasgo por via úmida dos materiais de colágeno.

Todos os materiais de matriz reticulados com epóxi testados e-xibiam resistências a rasgo por via úmida de > 400 cN/mm de espessura de camada. O material desidrotermicamente reticulado exibia uma resistência a rasgo por via úmida de < 200 cN/mm de espessura de camada.

Exemplo 9: Detecção de compostos de epóxi reativos Determinação da atividade de epóxi residual (ensaio de NBP) A atividade de epóxi residual pode ser determinada por meio de um ensaio de NBP modificado (ensaio de nitrobenzil-piridina) com base em "Detecção de Epóxidos com 4-(p-nitrobenzilpiridina" por Agarwal e outros (1979) Bull. Environm. Contam. Toxicol. 23, p. 825-829, modificado de acordo com Zocher e outros (2000) "Atividade de hidrolase de epóxido de cepas de Streptomyces " J. Biotechnol. Feb 17; 77(2-3), p. 287-292. 1. Princípio O processo de teste é usado para a determinação quantitativa de compostos de epóxi reativos, solúveis no produto final seco por congelamento no caso de biomatrizes estabilizadas com epóxidos. p-Nitrobenzilpiridina reagem com compostos de alquilação (incluindo epóxidos) para dar um sal moderadamente solúvel, incolor que, na reação com uma base, é desprotonada em um corante moderadamente solúvel, azul. A intensidade de cor pode ser detectada por espectrometria em um comprimento de onda de 570 nm. 2. Reaaentes/produtos químicos para-Nitrobenzilpiridina (NBP) (Merck, para síntese) Etileno glicol (Fluka, purum) Acetona (Fluka, para espectroscopia de UV) Trietilamina (Fluka, purum) Éter de 1,4-butanodiol diglicidila ou BDDG ou Epóxido (Sigma Aldrich, purum) Água de RO

Preparado a partir dos mesmos: Solução de substrato: Dissolver 1 g de NBP em 5 ml de etileno glicol e 1,25 ml de acetona a 50°C (suficiente para 10 amostras) Solução base: 50% de trietilamina em acetona (v/v) (suficiente para 10 amostras) 3. Dispositivos O tubo de teste com vidro fosco, rolha fosca, grampos de vidro fosco ou 50 ml de frasco de laboratório com topo de rosca Gabinete quente e blocos de aquecimento (50°C) 2 ml recipientes de reação com fecho seguro ou fecho de rosa Micropipetas para 200 μΙ e 1000 μΙ (Eppendorf), satisfazendo extremidades de pipeta Espectrômetro de UV (570 nm) 1,5 ml de cubetas de plástico descartáveis (Plastikbrand, No. 7591 50) 4. Amostras Corte (12 mm) do material de colágeno a ser testado, por amostra (em triplicata) 1-3 matrizes Amostra de comparação: biomatriz seco por congelamento sem reticulador químico (por exemplo, matriz de colágeno meramente desidro- termicamente reticulado) 5. Procedimento Solução de substrato: Para em cada caso 10 amostras, 1 g de NBP é introduzido pe-sadamente para dentro de um tubo de teste com vidro fosco e é misturado com 5 ml de etileno glicol e 1,25 ml de acetona. Para um número maior de amostras, multiplicar a quantidade correspondentemente e usar um frasco com topo de rosca.

Depois de cuidadosamente fechar o recipiente (tampa de vidro fosco/grampo de vidro fosco ou topo de rosca), a mistura de substrato é a-quecida em um gabinete quente a cerca de 50°C enquanto ocasionalmente sendo movido de um lado para o outro, até que o sólido se dissolvesse totalmente (1/2 - 1 hora). A solução de substrato é então resfriada para a temperatura ambiente. O sal permanece dissolvido.

Solução base: Selar 3 ml de trietilamina e 3 ml de acetona no tubo de teste com vidro fosco e misturar.

Preparação das amostras padrão para curva de calibração: Pré-diluição: 1 g de epóxido, exato para 0,001 g, é introduzido pesadamente para dentro de um frasco de medição de 100 ml por meio de uma pipeta de Pasteur (vidro), perfeito a 100 ml com água de RO e é totalmente misturado (1:100).

Exatamente 1000 μΙ da pré-diluição são transferidos por meio da pipeta de 1000 μΙ para um frasco de medição de 100 ml, são perfeitos a 100 ml e totalmente misturados. Isso é a diluição de epóxido (1:10,000) para a geração dos valores medidos padrão (curva de calibração).

Valores medidos padrão: Adicionar quantidades iguais de pedaços de 12 mm do material de comparação (sem reticulador) a 2 ml de recipientes de reação, marcar os recipientes de reação. Usando-se a pipeta de 200 μΙ, adicionar diferentes volumes de água de RO ao não tecido (para volumes vide fileira A, Tabela 1), então adicionar 600 μΙ de solução de substrato.

Tabela 1 - Valores medidos padrão Finalmente - apenas depois das amostras de teste foram completadas - adicionar a diluição de epóxido 1:10.000 (para volumes vide fileira B, Tabela 1) à série padrão no recipiente de reação. Resumidamente se mover novamente de um lado para o outro.

Material de teste: 1-3 Pedaços de 12 mm do material a serem testados são introduzidos pesadamente, exatos, para 0,1 mg, para dentro de 2 ml recipientes de reação, em triplicata, e são encharcados com 200 μΙ de água de RO. Então 600 μΙ de solução de substrato são adicionados aos pedaços encharcados.

Dar pancadinha leve nos recipientes de reação até que a suspensão, que estiver inicialmente turva, se tornar clara. Se a solução de reação estiver abaixo do topo, se mover o líquido de volta para dentro do fundo por breve centrifugação. Incubar todas as amostras, cuidadosamente seladas, por 1 hora a 50°C no gabinete quente nos blocos de aquecimento.

Resfriar para a temperatura ambiente, então adicionar 600 μΙ da solução de base e se agitar levemente.

Medição da absorção deve ser realizada no período de 10 minutos.

Remover a totalidade do sobrenadante dos pedaços de coláge-no usando-se a pipeta de 1000 μΙ e transferir para uma cubeta de plástico de 1,5 ml.

Medir a absorção a 570 nm no período de 10 minutos depois da adição da solução de base.

Programa de medição: Métodos/Concentração/ENBP

Ponto de calibração: valor medido padrão 50 (= 25 nmols de e- póxido) Haste paralela e branca: cubeta de plástico vazia 6. Avaliação A quantidade de epóxido reativo é determinada por meio de curva de calibraçãos (relação concentração/absorção). O resultado da medição está relacionado com a quantidade pesada original do material de matriz testado e dá: Teor de epóxido: ng/mg de colágeno Resultados de teste: A título de exemplo, Figura 8 mostra a atividade de epóxido residual dos materiais de colágeno preparada de acordo com a invenção com base na matriz de acordo com a Preparação exemplo 1a e a sua diminuição exponencial durante um tempo depois de secagem por congelamento (curva de degradação). As matrizes testadas ali foram secas a temperatura de secagem por congelamento não excedendo 60°C. A figura adicionalmente mostra em particular a influência de condições de reidratação na redução na atividade de epóxido residual. Para o teste, os materiais de colágeno foram submetidos a reidratação sob condições climáticas controladas, imediatamente depois da secagem por congelamento. A redução na atividade residual de materiais com um período de reidratação de a) 24 horas, b) 48 horas, c) 72 horas e d) 96 horas foi comparada. A determinação era em cada caso realizada imediatamente depois da conclusão da reidratação. Apenas a amostra a) foi armazenada por 24 horas sob condições ambientais normais antes da primeira medição ter sido realizada. É assim obtido os pontos de medição indicados depois de 48 horas (2 dias) para as amostras a) e b), 72 horas (3 dias) para as amostras a), b) e c), depois de 96 horas (4 dias) para as amostras a), b), c) e d) e depois de 168 horas (7 dias) e depois de 336 horas (14 dias) para a totalidade das amostras a) a d).

Está claro que a atividade de epóxido residual pode ser depleta-da marcadamente mais rapidamente e reduzida a um nível que não é mais detectável quando o período de reidratação aumenta.

Exemplo 10: Teste de citotoxicidade in vitro (teste de XTT) no material de colágeno reticulado com epóxi de acordo com a Preparação exemplo 3 1. Equipamento e Método 1.1 Material de teste: Material de colágeno reticulado seco por congelamento de acordo com a Preparação exemplo 3. 1.2. Preparação dos Extratos A partir do material de teste, pedaços do tamanho idênticos (9,6 cm2) foram cortados de 3 folhas de colágeno diferentes. Os pedaços cortados foram extraídos por 24 horas a 37±1,5°C, com agitação, em 9,6 ml de meio de cultura de célula (meio de RPM! 1640) suplementados com 10% de FCS (Gibco, Invitrogen, Ref. No. 10270-106), piruvato de sódio a 1 mM, L-glutamina a 4 mN e 100 pg/ml de penicilina/estreptomicina (meio completo). Controles positivos e negativos foram extraídos do mesmo modo.

Os materiais de teste foram extraídos de acordo com ISO 10993-12 em uma razão de área de superfície/ de volume de 3 cm2/ml. 1.3. Controles Quantidades maiores dos extratos dos controles negativos e positivos foram preparadas anteriormente e foram armazenadas a -20°C. 100% de extratos foram descongelados e foram diluídos imediatamente depois do tratamento. Os controles negativos e positivos foram extraídos no meio completo de acordo com ISO 10993-12 em uma razão de área de superfí-cie/volume de 6 cm2/ml. 1.3.1 Controle Negativo RM-C (polietileno de alta densidade) Fabricante: Hatano Pesquisa Institute, Hatano/Japão Lot: C - 042 1.3.2 Controle Positivo Nome. Látex Fornecedor: VWR International GmbH (64295 Darmstadt, Alemanha) Lot: 03200694110385 1.4 Sistema de Teste 1.4.1 Critério para Seleção de Linha de Célula L929 A linha de célula de 929 de clone de ATCC, CCL 1 NCTC (clone de cepa L, tecido conectivo de camundongo) foi usado com sucesso por muitos anos em experiências in vitro. Em particular a alta taxa de proliferação (tempo de duplicação: 16 horas, medido em 22 de outubro de 1992) e a boa viabilidade de células não tratadas (em geral mais do que 70%), ambas as quais são necessárias para execução adequada do estudo, eram os aspectos em favor da escolha dessa linha de célula. 1.4.2 Culturas de Células Grandes quantidades da linha de célula L929 (fornecida pela LMP, Technische Universitãt Darmstadt, D-64287 Darmstadt) foram armazenadas em nitrogênio líquidos no banco de céllulas GmbH de Harlan Cytotest Cell Research, que permite o uso repetico da mesma carga de cultura de célula nas experiências. Como um resultado, devido às características reproduzíveis das células, é assegurado que parâmetros constantes são mantidos nas experiências.

Culturas de células tronco descongeladas foram multiplicadas a 37 ± 1,5°C em garrafas plásticas (Greiner, D-72634 Frickenhausen), cultivo foi realizado com cerca de 2 x 105 células/garrafa de cultura em 6 ml de meio completo. As células foram subcultivadas duas vezes semanalmente. As culturas de células foram incubadas a 37 ± 1,5°C e em uma atmosfera de 5,0 ± 0,5% de dióxido de carbono. 1.5 Grupos de Teste 1.5.1 controle de meio: meio completo 1.5.2. Controle negativo: RM-C extraído com meio completo por 24 horas, 100% de extrato 1.5.3. Controle positivo: Látex extraído com meio completo por 24 horas; 3% de extrato, 10% de extrato, 30% de extrato, 70% de extrato, 100% de extrato 1.5.4. Material de teste: Matriz de colágeno de acordo com a Preparação exemplo 3 extraído com meio completo por 24 horas; 3% de extrato, 10% de extrato, 30% de extrato, 100% de extrato 1.6 Procedimento de Teste 1.6.1. Cultivo de Células Culturas troncos de desenvolvimento exponenciais, mais do que 50% de confluente, foram enxaguadas com solução de sal livre de Ca-Mg e foram tratadas com tripsina a 37 ± 1°C por 5 minutos (Gibco BRL tripsi-na/solução de EDTA 10x Cat. No. 35400-019). Então a dissolução enzimáti-ca foi parada pela adição do meio completo em uma suspensão de célula simples foi preparada. A solução de sal livre de Ca-Mg tinha a seguinte composição (por litro): NaCI 8000 mg KCI 400 mg Glicose 1000 mg NaHCC>3 350 mg 0,1 ml de meio contendo cerca de 15.000 células foi adicionado a cavidades individuais de uma placa de microtítulo de cultura de célula de 96 cavidades (Greiner). O meio estava completo.

As placas foram incubadas por 24 horas a fim de permitir adesão celular. 1.6.2 1.6.2 Tratamento O meio foi então removido, e 0,1 molar de meio de tratamento foi adicionado às células, o meio de tratamento contendo diferentes concentraçãos dos extratos dos materiais de teste, dos extratos de controle negativos e controle positivos ou de controle de meio.

Todas as incubações foram realizadas 37 ± 1,5°C em uma atmosfera úmida em atmosfera de 5,0 + 0,5% de CO2.

1.6.3 Medição e Marcação de XTT

Depois do tempo de incubação de 24 horas, 50 μΙ da mistura de marcação de XTT foram adicionados. A mistura contém o reagente de marcação de XTT e um reagente de acoplamento de elétron (razão de volume de 1:100). As células foram incubadas por cerca de 1 hora 35 minutos e então foram transferidas para a leitora de microplaca (dispositivos moleculares Versamax®, D-85737 Ismaning) equipada com um filtro de 450 nm for a medição da absorção (comprimento de onda de referência 690 nm). 1.7 Gravação de Dados Os dados gerados foram gravados como dados brutos. Os resultados são mostrados na forma da tabelas contendo os grupos de teste com os materiais de teste, meio negativo e grupo de controle. 1.8 Avaliação dos Resultados Uma diminuição no número de células vivas resulta em uma diminuição da atividade total da desidrogenase mitocondrial nas amostras. Essa diminuição se correlaciona diretamente com a quantidade de formaza-no laranja formada, medida pela absorção. Os resultados para a resposta de citotoxicidade dependente de dose podem ser mostrados como o desvio padrão ± médio aritmético. A fim de calcular a concentração do material tóxico que é necessário para reduzir a absorção por 50% em relação ao controle de meio (XTT50), a seguinte fórmula foi usada: a) Cone. > 50 = concentração medida max com % do controle de meio > 50% b) Cone. < 50 = concentração medida min. com % do controle de meio < 50% c) % > 50 = absorção relativa em a) em % d) % < 50 = absorção relativa em b) em % Quanto menor o valor de XTT50, mais alto o potencial citotóxico do material de teste.

Uma redução na viabilidade para < 70% e > 50% do controle de meio significa baixo citotoxicidade. No caso de uma redução na viabilidade para < 50% do controle de meio, potencial citotóxico está presente. 2. Resultados 2.1. Tabela dos Resultados Resultados depois de 24 horas da extração no meio completo Absorções indicadas mostram valores arredondados. Absorções relativas foram calculadas os valores de absorção corretos.

Grupos de teste tonalizados representam concentrações de material de teste em que investigações microscópicas depois do tratamento mostram mudanças morfológicas nas células devido à ocorrência de citotoxicidade. * absorção média (absoluto) de 7 cavidades ** absorção relativa [valores arredondados]: Valores de XTT50 dos materiais de teste não poderíam ser calculados porque a viabilidade das células não foi reduzida de um modo relevante. Valores de XTT5odo controle positivo: 16.3% (v/v) 3. Discussão Esse estudo in vitro foi realizado a fim de investigar o potencial citotóxico de material de colágeno reticulado com epóxi seco por congela- mento de acordo com a Preparação exemplo 3 por meio do teste de XTT usando-se a linha de célula de camundongo L929.

Pedaços de teste idênticos (9,6 cm2) foram cortados dos três materiais de teste, e os pedaços cortados foram extraídos como descritos aqui mais acima.

As seguintes concentrações dos extratos de teste foram estudados: 3%, 10%, 30% e 100% (v/v) das seguintes concentrações dos extratos (controle positivo) foram testadas: 3%, 10%, 30%, 70% e 100 % (v/v) Nenhuma diferença relevante poderia ser observada entre o controle de meio (meio completo) e o controle negativo (controle negativo extraído RM-C). O controle positivo (látex) exibia uma redução dependente de dose marcada na viabilidade de célula e proliferação celular. Com o extrato padrão de referência não diluído (100%), uma redução na viabilidade de célula e/ou proliferação celular nas cavidades respectivas cerca de 1,81% foram encontrados. O valor calculado de XTT50 é de 16,3% (v/v).

Efeitos citotóxicos depois da incubação não poderiam ser observados em qualquer um dos extratos testados do material de colágeno de acordo com o Preparação exemplo 3. O valor de XTT50 não poderiam ser calculados porque a viabilidade das células não foi reduzida de um modo relevante. 4. Resultados Em resumo, dentro do contexto desse teste sob as condições experimentais descritas, extratos do material de teste de acordo com a Preparação exemplo 3 não demonstraram qualquer potencial citotóxico na totalidade até da concentração de teste mais alta.

Exemplo 11: Medição da rigidez/módulo de elasticidade E (de acordo com Stok e outros; J Biomed Mater Res; 2009) de material de colágeno reticulado com epóxi de acordo com Exemplos de preparação 2a e 2b (5% e 10% de agente de reticulação de epóxido/massa seca) A rigidez foi medida de acordo com Stok e outros 2009 por testes de compressão usando-se uma máquina de testagem de material (Zwick/Roell 1456, Ulm) com um sensor de força de 5 N. Um tamanho adequado para a matriz de teste foi calculado de acordo com Spilker e outros; Journal of Biomechanical Engineering, série 114, H. 2, p. 191-201; 1992; o diâmetro era de 1,38 mm. A amostra foi localizada em um suporte em uma tabela de micro-coordenada (vide fig.), onde ela foi coberta com uma camada de PBS. Uma cobertura de vidro de plástico preveniu que a amostra se dobre para cima. A matriz foi movida para dentro da amostra por etapas para uma profundidade de 5%, 15% e 25% da espessura da amostra e é mantida até que os sistema tivesse relaxado. O módulo de elasticidade foi determinado da médio dos últimos dez valores da fase de equilíbrio de três etapas de impressão: Módulo de elasticidade [kPa] é o gradiente da tensão (x) e esforço (y) Tensão = profundidade de penetração [mm]/espessura da amostra [mm] Esforço = força [mN]/área de superfície da matriz [mm2] A amostra foi imersa em PBS por pelo menos 15 minutos, foi colocada para dentro do suporte e foi deixado lá, foi coberta com uma camada de PBS, por pelo menos 5 minutos. A superfície da amostra foi definida como a posição em que o sensor detectou a resistência a 0,1 mN. Determinação dos valores de E foi realizada por medição em triplicata (n = 3). A disposição de teste é mostrada a título de exemplo na Figura 9.

Resultado: Matrizes de colágeno de acordo com a Preparação exemplo 2a (5% epóxido) exibem uma rigidez de 9 kPa.

Matrizes de colágeno de acordo com a Preparação exemplo 2b (10% epóxido) exibem uma rigidez de 22 kPa.

Uma matriz de colágeno-elastina não reticulada (desidrotermicamente reticulada) exibia uma rigidez de apenas 6 kPa.

Exemplo 12: Uso das matrizes de colágeno reticuladas Os materiais de acordo com a invenção do exemplo de preparações de 1 a 3 são particularmente adequadas para o uso como um agente cosmético ou farmacêutico.

Exemplo de aplicacão 12a Uso como uma máscara cosmética Para o tratamento, os materiais de acordo com a invenção do exemplo de preparações de 1 a 3 são cortadas no tamanho e na forma desejada da área de pele a ser tratada e ou a) colocadas no estado seco sobre a pele a ser tratada e rei-dratada por molhação com água ou uma solução ativadora até que se tornasse saturada, ou b) molhada com água ou uma solução ativadora até que se tornasse saturada antes de ser colocada sobre a pele, e então colocada no estado reidratado na área de pele a ser tratada.

Os curativos de colágeno reidratados foi deixados sobre as á-reas tratadas da pele durante um período de aproximadamente de 20 a 30 minutos.

Durante esse tratamento lá era um revestimento marcado da e-xistência de vermelhidão e irritação, bem como de existência de coceira, uma aparência mais fresca, maior elasticidade da pele e hidratação da pele aperfeiçoada.

Exemplo de aplicacão 12b Uso como um implante subcutâneo Os materiais de acordo com a invenção do exemplo de preparações 1 e 2 podem ser usados como um implante subcutâneo no campo da cirurgia plástica ou reconstrutora com o objetivo de formação de volume re- construtora, por exemplo, em casos de perda de volume de pele secundária a várias causas na região média da face, para procedimentos de rinoplastia bem como para operações estéticas reconstrutoras, por exemplo, depois de cirurgia de tumor ou depois de trauma independente da parte do corpo envolvida.

Antes do implante, o material, no estado seco, pode ser cortado e correspondentemente adaptado para a área de pele subjacente.

Antes que a matriz seja introduzida para dentro da bolsa de pele preparada, deve ser reidratada em grandes quantidades de solução salina fisiológica ou solução de Ringer. Inserção da matriz para dentro da bolsa de pele subdérmica preparada é realizada rapidamente imediatamente depois da reidratação da matriz em solução salina fisiológica estéril ou solução de Ringer é contemplada. Fechamento do ferimento deve ser adaptado de a-cordo com o procedimento operatório e deve ser decidido pelo médico que faz o tratamento.

Acão da matriz: No implante, a matriz age como uma armação e permite o crescimento das células que estão envolvidas na formação de tecido de pele.

As estruturas de tecido autólogas de síntese de células migradas durante o processo de cura e assim proveem o aumento desejado no volume na região do implante inserido.

Como progressos de neogênese, a estrutura da matriz pode ser totalmente ressorvida e remodelada. O modelo de colágeno estruturalmente intacto nativo é otimamente adequado para a promoção do crescimento de células e vasos; isso consequentemente suporta a regeneração de tecido. O uso da matriz colocado entre duas camadas diferentes de tecido age profilaticamente contra formação de adesão e contraturas secundárias.

Exemplo de aplicação 12c Uso como substituição da derme (implante) (ferimentos crônicos e agudos) Os materiais de acordo com a invenção do exemplo de prepara- ções 1 e 2 podem ser usados para construção da derme em combinação com transplantes de pele cortada em partes no caso de defeitos dérmicos profundos e ferimentos de pele de espessura completa em cirurgias de queimaduras, em cirurgia de reconstrutora plástica e no tratamento de pobremente cura de ferimentos (por exemplo, ferimentos crônicos) exigindo um transplante.

Aplicação: O pedaço correspondente de material é removido estéril a partir da embalagem e grosseiramente é cortado para ajustar o defeito de pele. O material seco é então colocado sobre o ferimento e primeiramente é pressionado na área do ferimento por meio de um pano no abdô-menabdômen. O material encharcado com fluidos do ferimento adere a base do ferimento sem o risco de formação de bolsas de ar. As extremidades são cortadas em um círculo deixando uma sobreposição estreita de cerca de 2 mm.

Se o material for assentado adequadamente na área de ferimento, solução salina é cuidadosamente aplicada por meio de uma seringa; alternativamente, um pano no abdômen muito úmido encharcado com solução salina pode ser aplicado e deixado por alguns minutos. Depois desse tempo, o material é totalmente reidratado e é colocado exatamente no leito do ferimento de acordo com a colocação anterior.

Transplante da pele cortada em partes na área do ferimento é realizada diretamente no material. Proteção adicional do material juntamente com a pele cortada em partes é alcançada por sutura ou grampos. Se a matriz não for coberta com o transplante de pele cortada em partes até um tempo mais tarde, seria permitido que não ressecasse. Uma gaze não aderente, estéril encharcada com solução salina fisiológica é adequada para essa finalidade.

Para a cobertura do ferimento, é recomendado usar uma folha de silicone não oclusiva ou várias camadas de gazes graxa livre de ingrediente ativo a fim de assegurar um ambiente de ferimento úmido. Até aqui, demonstrou ser vantajoso na prática usar uma bandagem firme de uma combinação de 5-6 camadas de gaze graxa e 3-4 camadas de bandagem de gaze. A técnica de bandagem seria projetada para permitir bom contato entre a pele cortada em partes, a base do ferimento e matriz e para absorver forças de cisalhamento. A aplicação de uma bandagem a vácuo a ferimentos tratados é governada pela decisão do médico em cada caso particular. Em muitos casos, bons resultados foram alcançados com essa técnica de bandagem. A questão do tratado é para formar uma neoderma, a fim de a-perfeiçoar a qualidade da pele restaurada. Cicatriz deve ser reduzida e contração do ferimento deve ser evitada.

Exemplo de aplicação 12d Uso como um agente hemostático (ferimentos agudos e cirúrgicos) Os materiais de acordo com a invenção do exemplo de preparações 1 e 2 podem ser usados como um agente hemostático para a administração local, de preferência no caso de operações com sangramento venoso e difuso, por exemplo, na cirurgia visceral, cirurgia vascular cardiotorácica, neurocirurgia, cirurgia do maxilar e estomologia geral, ENT, urologia e ginecologia. O material é de preferência colocado no estado seco sobre o ferimento pincelado e levemente modelado ao mesmo, mas pode também ser molhado antes do uso. No caso de sangramento mais severo, tampo-namento pode ser realizado com uma compressa úmida. Áreas de ferimento maiores são providas com vários pedaços; para pequenas áreas, o material pode ser apropriadamente cortado com tesouras.

Modo de Acão: O material absorve várias vezes seu próprio peso de líquido. Os trombócitos se agregam na superfície interna larga e contribuem para he-móstase local por liberação do fator de coagulação. A fibrina que forma âncoras a matriz de colágeno para a base de ferimento e assim forma um fechamento do ferimento estável.

Hemoestase rápida pode ser alcançada por esse tratamento. Exemplo de aplicação 12e Use como um curativo de ferimento dérmico/transdérmico para exudação de ferimentos (ferimentos crônicos) Os materiais de acordo com a invenção do exemplo de preparações 1 e 2 podem ser usados como um curativo de ferimento para o tratamento de ferimento interativo local. Para ótima ação, o material seria aplicado diretamente ao leito de ferimento total. Nos ferimentos com nenhuma ou |eve exudação, o material pode ser reidratado com solução salina ou solução de Ringer. O curativo de ferimento deve ser coberto com uma bandagem secundária adequada a fim de manter uma umidade no ambiente de cura de ferimento. Depois da primeira aplicação application, os ferimentos seriam tratados com o material novamente em intervalos de até 72 horas, dependendo da extensão do exsudato. Qualquer matriz não ressorvida pode permanecer no ferimento.

Modo de Acão: O material é capaz de absorver várias vezes seu próprio peso no líquido e é portanto de modo excelente adequado para a administração do líquido no ferimento. Com a absorção da secreção necroses, bactérias e coberturas de fibrina do ferimento ejetadas pelo ferimento podem também ser absorvidas, como um resultado do qual a formação do tecido de granulação pode ser auxiliada e acelerada. Ambos os efeitos contribuem em direção a aceleração de cura de ferimento.

Exemplo de aplicação 12f Uso na terapia de tratamento de ferimento auxiliada por vácuo (ferimentos crônicos) Para o uso, os materiais de acordo com a invenção do exemplo de preparações 1 e 2 são aplicados no estado seco às partes do corpo a ser tratadas ou ao ferimento, o material sendo cortado para a forma do ferimento se necessário. O material é então totalmente encharcado e é reidratado ou pelos fluidos de ferimento ou com água ou uma solução aquosa ou solução salina fisiológica. É adicionalmente possível molhar os materiais de acordo com a invenção antes que eles sejam aplicado à parte do corpo a ser tratada. O ferimento é então fechado de um modo hermético com uma folha de cobertura com um comprimido a vácuo convencional. Depois da aplicação de um vácuo adequado, o líquido de ferimento é retirado por processos de terapia a vácuo convencionais por meio de dispositivos convencionais para o transporte para longe o fluido de ferimento (unidade de drenagem).

Por meio desse tratamento é possível alcançar uma redução na área de superfície de ferimento, uma contração das extremidades do ferimento, um melhoramento da formação de tecido de granulação e, além disso, uma aceleração da cura de ferimento.

Explicações das figuras: Fig. 1: Método de BCA: Determinação dos constituintes de proteína solúveis [%] em uma matriz de colágeno reticulada com epóxi com proteínas de matriz solúveis adicionais (hidrolisado de elastina) de acordo com a preparação exemplo 2 em comparação com a matriz de colágeno unicamente desidrotermicamente reticulada com hidrolisado de elastina ("não reticulado").

Fig. 2a: Digestão de teste de colagenase: Determinação da taxa de degradação [%] de matrizes de colágeno reticuladas com epóxi de acordo com a invenção do exemplo de preparações 1a e 2a em comparação com a matriz de colágeno unicamente desidrotermicamente reticulada com hidrolisado de elastina ("não reticulado"); dentro de um período de 6 horas.

Fig. 2b: Digestão de teste de colagenase: Determinação da quantidade absoluta da porção dissolvida das matrizes de colágeno reticuladas com epóxi de acordo com a invenção (normalizadas para 10 mg) do exemplo de preparações 1a e 2a em comparação com a matriz de colágeno unicamente desidrotermicamente reticulada com hidrolisado de elastina ("não reticulado"); dentro de um período de 23 horas.

Fig. 3: Estabilidade hidrolítica: a) matriz de colágeno desidro- termicamente reticulada ("não reticulado") com triglicerídeos/óleo neutro (secagem por temperatura de congelamento > 120°C); b) matriz de colágeno reticulada com epóxi de acordo com a invenção do exemplo de preparação 3 (5% de epóxido/DM; com triglicerídeos/óleo neutro; secagem por temperatura de congelamento < 100°C); c) matriz de colágeno reticulada com epóxi que corresponde à composição de acordo com a preparação exemplo 3 (5% de epóxido/DM; com triglicerídeos/óleo neutro; secagem por temperatura de congelamento > 120°C).

Fig. 4: Grau de hidrólise depois de 18 dias a) de uma matriz de colágeno desidrotermicamente reticulada em comparação com b) a matriz de colágeno de acordo com a invenção do exemplo de preparação 3.

Fig. 5: Influência da secagem por temperatura de congela- mento sobre a resistência a rasgo por via úmida (método interno UV8801).

Fig. 6: Influência da secagem por temperatura de congela- mento e da concentração de reticulador de epóxido sobre a resistência a rasgo por via úmida (método interno UV8801).

Fig. 7; Influência do tempo de repouso e da temperatura durante o tempo de repouso da mistura/suspensão de colágeno aquosa antes do congelamento sobre a resistência a rasgo por via úmida (método interno UV8801).

Fig. 8: Atividade de epóxido residual e influência de remo- Ihamento sobre a redução na atividade de epóxido residual da matriz de colágeno de acordo com a invenção do exemplo de preparação 1.

Fig. 9: Disposição de teste para a medição da rigidez/módulo de elasticidade E.

Claims (15)

1. Processo para a preparação de matrizes de colágeno reticu-ladas, compreendendo as etapas: a) preparação de uma suspensão de colágeno aquosa, b) ajuste do valor de pH da suspensão de colágeno da etapa a) para pH < 4, c) adição opcional de outros agentes formadores de estrutura, ingredientes ativos e/ou substâncias auxiliares, d) adição de um agente de reticulação de epóxi-funcional, a ordem das etapas c) e d) sendo variável, e) congelamento da mistura de colágeno obtenível da etapa d) , f) secagem por congelamento da mistura congelada da etapa e) a temperatura de secagem por congelamento < 100°C, g) ajuste opcional do material de colágeno reticulado seco por congelamento assim obtenível para um teor de umidade de até 25% em peso, com base no produto final, e h) conversão opcional dos materiais obtenível da etapa g) na forma desejada, esterilização e/ou processamento.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a suspensão de colágeno da etapa a) compreende colágeno insolúvel em ácido nativo na forma de fibras e fibrilas.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a suspensão de colágeno compreende constituintes de peptídeo e colágeno solúvel em ácido e/ou em que na etapa c) agentes de formação de estrutura ou ingredientes ativos do grupo das proteínas de matriz, constituintes de matriz extracelulares, ingredientes ativos proteínogênicos e constituintes de peptídeo ou proteína solúveis são adicionados.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, em que o agente de reticulação de epóxi-funcional é selecionado dos diepóxidos tal como em particular éter de 1,4-butanodiol diglicidila (BDDGE).

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o agente de reticulação de epóxi-funcional é adicionado em uma quantidade de não mais do que 50% em peso, com base na massa seca da suspensão de colágeno da etapa a).

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o congelamento de acordo com a etapa e) é realizada no período de 24 horas da preparação da mistura de colágeno da etapa d).

7. Matriz de colágeno reticulada obtenível pelo processo de a-cordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Matriz de colágeno reticulada com epóxi seca por congelamento contendo não reticulado colágeno solúvel em ácido e/ou constituintes de peptídeo e/ou agentes de formação de estrutura ou ingredientes ativos do grupo das proteínas de matriz, constituintes de matriz extrace-lulares, ingredientes ativos proteinogênicos e constituintes de peptídeo ou proteína solúveis, que são liberáveis no uso e são detectáveis por meio do método de BCA, de preferência em uma quantidade no total de pelo menos 0,1%, com base no matriz de colágeno seca por congelamento, medida de acordo com o método de BCA.

9. Matriz de colágeno reticulada com epóxi seca por congelamento de acordo com ou a reivindicação 7 ou reivindicação 8 ou a matriz de colágeno obtenível pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, tendo a resistência a rasgo por via úmida > 50 cN/mm de espessura de camada, medida por meio de DIN EN ISO 3376, ou > 200 cN/mm de espessura de camada, medida por meio do método de UV8801.

10. Matriz de colágeno reticulada com epóxi seca por congelamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, ou a matriz de colágeno obtenível pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, que contém pelo menos um outro agente de formação de estrutura, pelo menos um ingrediente ativo farmacêutico ou cosmético e/ou pelo menos uma substância auxiliar.

11. Matriz de colágeno reticulada com epóxi seca por congelamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, ou a matriz de colágeno obtenível pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, que está na forma em camadas de curativos, folhas, almofadas ou máscaras que podem opcionalmente ser providas, totalmente ou parcialmente, com uma outra camada selecionada das fibras, não tecidos, redes, películas ou folhas ou uma camada autoadesiva que é aplicada ao material de colágeno em camadas de tal modo que ela finalize com o mesmo nas extremidades ou projete totalmente ou parcialmente além do material de colágeno nas extremidades.

12. Matriz de colágeno reticulada com epóxi seca por congelamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, ou a matriz de colágeno obtenível pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, contendo pelo menos um ingrediente ativo selecionado do grupo dos ingredientes ativos dérmico e transdérmico para o tratamento da pele, para o tratamento de doenças de pele, para o tratamento de ferimento ou para hemóstase, em particular aqueles ingredientes ativos que são selecionados do grupo que compreende: proteínas de matriz, constituintes de peptídeo solúveis tais como em particular elastina e/ou fatores de crescimento, agentes de tratamento de ferimento antibacterianos tais como em particular ingredientes ativos contendo prata, em particular nitrato de prata, e/ou pelo menos uma substância auxiliar selecionada do grupo dos óleos e gorduras de cosméticos, tal como em particular triglicerídeos ou óleo neutro.

13. Matriz de colágeno reticulada com epóxi seca por congelamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, ou a matriz de colágeno obtenível pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, para o uso como um agente farmacêutico, em particular para o uso como um agente para o tratamento de ferimentos crônicos e/ou agudos, como um implante, como um agente de tratamento de pele dérmico ou transdérmico, como um agente hemostático e/ou para o uso em uma terapia de tratamento de ferimento auxiliado a vácuo.

14. Uso da matriz de colágeno reticulada com epóxi seca por congelamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, ou da matriz de colágeno obtenível pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, como um agente cosmético, como um tratamento cosmético ou de máscara ou como uma armação para a população de células.

15. Preparação de combinação contendo pelo menos uma matriz de colágeno reticulada com epóxi seca por congelamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, ou a matriz de colágeno obtenível pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, bem como pelo menos uma solução aquosa que contém um ou mais ingredientes ativos e/ou opcionalmente uma ou mais substâncias auxiliares, em uma disposição espacial, associada como um conjunto ou combinação de kit de partes.