DE102006006461A1

DE102006006461A1 - Hautmodell mit dendritischen Zellen

Info

Publication number: DE102006006461A1
Application number: DE200610006461
Authority: DE
Inventors: Dietmar Dr. Eschrich; Rüdiger Dr. Graf; Karsten Rüdiger Dr. Mewes; Martina Raus
Original assignee: Phenion GmbH and Co KG
Current assignee: Phenion GmbH and Co KG
Priority date: 2006-02-10
Filing date: 2006-02-10
Publication date: 2007-08-23
Also published as: WO2007090575A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Hautmodell, insbesondere ein Dermisäquivalent, ein Epidermisäquivalent und ein Ganzhautäquivalent, umfassend eine Kollagenmatrix sowie dendritische Zellen, Verfahren zur Herstellung des Dermis-, Epidermis- bzw. Hautäquivalentes sowie deren Verwendung zur Testung von Substanzen, insbesondere in Bezug auf eine potentielle sensibilisierende Wirkung, bevorzugt auf die Haut.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Hautmodell, insbesondere ein Dermisäquivalent, ein Epidermisäquivalent und ein Ganzhautäquivalent umfassend eine Kollagenmatrix sowie dendritische Zellen, Verfahren zur Herstellung des Dermis-, Epidermis- bzw. Hautäquivalentes sowie deren Verwendung zur Testung von Substanzen, insbesondere in Bezug auf eine potentiell sensibilisierende Wirkung, bevorzugt auf die Haut.
Hauttypische Vollhautmodelle, die auch als in vitro-Hautäquivalente bezeichnet werden, können insbesondere in der Dermatologie als Testhaut verwendet werden, um Substanzen, beispielsweise potentielle Arzneimittel oder Kosmetika, oder Agenzien, wie Licht und Wärme, auf ihre pharmakologischen oder kosmetischen Wirkungen, insbesondere Reiz-, Toxizitäts- und Entzündungswirkungen, und auf ihre Verträglichkeit zu untersuchen. Ein solches System kann darüber hinaus für vielfältige immunologische, histologische und molekularbiologische Fragestellungen eingesetzt werden. Dazu zählen zum Beispiel Studien zur Wundheilung und zur Penetration und Resorption von Substanzen. Die Untersuchungen beziehungsweise Tests von Substanzen an solchen Vollhautmodellen bieten gegenüber Tierversuchen und Versuchen mit menschlichen Probanden wesentliche Vorteile, da die damit erzielten Ergebnisse reproduzierbarer sind und die Untersuchungen kostengünstiger und schneller durchgeführt werden können.
Zur Prüfung von Rohstoffen und Produkten sind in den letzten Jahren zumeist humane Zellkulturen als in vitro-Systeme verwendet worden. Eine Weiterentwicklung der Zellkulturtechnik stellen organähnliche humane Gewebe oder bioartifizielle Konstrukte und Cokultursysteme dar. Die damit gewonnenen Ergebnisse lassen sich noch besser auf den Menschen übertragen als die an Einzelzellkulturen gewonnenen Ergebnisse.
Die EP 0 197 090 B1 offenbart ein Verfahren zur Bildung eines Hautäquivalents, wobei durch Mischen einer sauren Kollagenlösung mit kontraktilen Zellen, beispielsweise Fibroblasten, ein hydratisiertes Kollagengitter hergestellt wird. Nach Neutralisierung des pH-Wertes werden in dem Kollagengitter Kollagenfibrillen ausgefällt. Die kontraktilen Zellen lagern sich an das Kollagengitter an und bewirken dessen Kontraktion, wobei sich ein Dermisäquivalent bildet. Durch das Einbringen von Haut-Stanzbiopsien in das Kollagengitter können Keratinozyten aus den Stanzbiopsien auf der Oberfläche des Dermisäquivalentes wachsen, wobei sich ein Hautäquivalent bildet.
In der EP 0 285 474 B1 wird ein Hautäquivalent offenbart, das ein aus Kollagen und Fibroblasten erhaltenes Dermisäquivalent und ein mehrschichtiges Epidermisäquivalent umfaßt. Dabei wird das Dermisäquivalent mit einem menschlichen oder tierischen Explantat, beispielsweise einem Haarfollikel, beimpft, um das Epidermisäquivalent zu erhalten.
Die EP 0 020 753 B1 beschreibt ein Verfahren zur Bildung von Gewebe, insbesondere Hautgewebe, wobei ebenfalls Fibroblasten in ein hydratisiertes Kollagengitter eingebracht werden und sich nach Kontraktion des Kollagengitters ein Gewebe bildet. Auf dieses Gewebe können zuvor in vitro kultivierte Keratinocyten oder aus Vorhaut isolierte Keratinozyten aufgebracht werden, wobei sich ein Hautersatz bildet.
Aus der EP 0 418 035 B1 ist ein Gewebeäquivalent bekannt, das ein hydratisiertes Kollagengitter, welches mittels eines kontraktilen Agens wie Fibroblasten kontrahiert wird, und ein Kollagengel, welches mit einem permeablen Element in Kontakt steht, umfasst. Dabei wird das Gemisch aus Kollagen und kontraktilem Agens auf das Kollagengel aufgetragen, wobei durch den Kontakt zwischen Kollagengel und permeablem Element, beispielsweise einer Polycarbonatmembran, die radiale oder laterale Kontraktion des Kollagengitters unterbunden wird, so dass das Gitter nur bezüglich seiner Dicke kontrahiert. Nach Bildung des Dermisäquivalents können dann Keratinozyten ausgesät werden, wobei sich ein Hautäquivalent bildet.
Das US-Patent Nr. 4,963,489 beschreibt ein in vitro hergestelltes Stroma-Gewebe, wobei die Stromazellen, beispielsweise Fibroblasten, ein Grundgerüst umhüllen, das aus einem biologisch verträglichen Material, beispielsweise Cellulose, besteht. Das beschriebene System lässt sich unter anderem zur Herstellung eines dreidimensionalen Hautkultursystems verwenden, wobei Keratinozyten und Melanocyten auf dem Dermisäquivalent, das heißt der dreidimensionalen Stroma-Trägermatrix, ausgebracht werden.
Das US-Patent Nr. 5,755,814 beschreibt ein Hautmodellsystem, das sich sowohl als in vitro-Testsystem als auch für therapeutische Zwecke einsetzen lässt. Das System umfasst eine dreidimensionale vernetzte Matrix von unlöslichem Kollagen mit darin enthaltenen Fibroblasten und stratifizierte Schichten differenzierter Epidermiszellen, wobei eine Epidermiszell-Schicht in direktem Kontakt zu der Oberfläche der Kollagen-Matrix steht. Die Vernetzung der Matrix kann sowohl mittels thermischer Behandlung unter Wasserentzug als auch durch chemische Mittel, beispielsweise Carbodiimid, erfolgen.
In dem US-Patent Nr. 5,882,248 ist ein Verfahren zur Bestimmung der Wirkung chemischer Substanzen oder Agenzien auf ein menschliches Hautmodellsystem gemäß US-Patent Nr. 5,755,814 beschrieben. Die Wechselwirkung zwischen dem Hautmodellsystem und den zu testenden Substanzen wird anhand der Freisetzung von Stoffen durch Zellen des Hautmodellsystems sowie der Wirkungen auf Stoffwechsel, Proliferation, Differenzierung und Reorganisation dieser Zellen bestimmt.
In der WO 95/10600 ist darüber hinaus ein Verfahren beschrieben, mit dem ein Epidermisäquivalent gewonnen werden kann. Dieses Epidermisäquivalent kann für pharmazeutische und/oder kosmetische Sonnenbräunungs-Tests verwendet werden.
Die internationale Patentanmeldung WO 01/092477 offenbart ein Verfahren zur Differenzierung und/oder Vermehrung isolierter dermaler Fibroblasten, wobei die Fibroblasten in einer dreidimensionalen gelartigen Matrix kultiviert werden und sich dort vermehren können. Diese Matrix enthält neben den zu kultivierenden Fibroblasten ein aus einer Kollagenlösung konstituiertes Gerüst aus menschlichem oder tierischem Kollagen, also gewebetypische Matrixproteine. Durch das Verfahren soll ein organoides in vitro-Hautmodell erhalten werden, das aus zwei gewebetypischen Schichten, nämlich einem Dermisäquivalent und einem Epidermisäquivalent, aufgebaut ist. Das organotypische Hautmodell soll sowohl histologisch als auch funktionell weitgehend der nativen Haut entsprechen.
Bei den bekannten Hautmodellen wirkt sich nachteilig aus, dass diese zumeist nur aus einer oder mehreren epidermalen Schicht(en) aus Keratinozyten bestehen. In den Fällen, in denen eine stratifizierte Epidermis erhalten wird, werden häufig Gewebe-Explantate eingesetzt, die die Gefahr einer Kontamination mit Erregern in sich bergen, was bei einer späteren Verwendung des Hautäquivalents als Testhaut zu Ergebnisverfälschungen führen kann. Sofern die beschriebenen Hautmodelle einen Dermalteil besitzen, besteht dieser häufig aus spongiösem, quervernetztem Material, das neben Kollagen außerdem noch andere nichthauttypische Materialien enthalten kann. Sofern bei den im Stand der Technik beschriebenen Hautäquivalenten der Dermalteil nur aus Kollagen und Fibroblasten besteht, ist er einem undefinierten Schrumpfungsprozess unterworfen, der auf eine starke Schrumpfung des Kollagengels und einen Flüssigkeitsaustritt daraus zurückzuführen ist. Dies führt dazu, dass die im Stand der Technik beschriebenen Hautäquivalente sich nur in beschränktem Maße als Testhaut definierter Größe eignen und die damit erhaltenen Ergebnisse sich nur bedingt auf native menschliche Haut übertragen lassen. Herkömmliche Hautägivalente mit einem Dermalteil aus Kollagen und Fibroblasten sind zudem aufwendig in der Herstellung, da ein Kollagengel eingesetzt wird, das sich nur schwer verarbeiten läßt. Die Gellösung muß nämlich in der Kälte, also am besten auf Eis, angerührt werden und auch kalt pipettiert werden, da sie nur so flüssig bleibt. Anschließend wird die Gellösung erwärmt, z.B. auf 37° im Brutschrank. Nur nter diesen Bedingungen und dem richtig eingestellten pH-Wert kommt es zur Gelierung. Je wärmer die Gellösung wird, umso schwerer lässt sie sich verarbeiten. Wird das Gel zu stark erwärmt, besteht zudem die Gefahr, dass das Kollagen denaturiert und das Gel somit unbrauchbar wird.
Schließlich bleibt noch festzustellen, dass die aus dem Stand der Technik bekannten Hautmodelle hinsichtlich ihrer Hautähnlichkeit suboptimal sind. Insbesondere die Expression des bedeutsamen dermalen Differenzierungsmarkers Elastin ist in den bekannten Hautmodellen – im Gegensatz zu natürlicher Dermis – nicht zu beobachten.
Allergische Reaktionen werden über dendritische Zellen vermittelt. Die dendritischen Zellen der Haut sind die Langerhanszellen. Sie sind die wesentlichen antigenpräsentierenden Zellen der Haut und nehmen in der Epidermis Antigene auf, wandern zu den regionären Lymphknoten und präsentieren die durch Haut- und Schleimhäute eingedrungenen Antigene den T-Lymphozyten.
Die Isolierung und insbesondere die Kultivierung von adulten Langerhanszellen ist schwierig. Eine längere Kultivierung ist nicht möglich, da diese Zellen innerhalb von 1–2 Tagen in einer Kultur absterben. Es können daher keine Hautmodelle als Testsysteme für sensibilisierende Substanzen durch die Kokultivierung mit adulten Langerhanszellen erzeugt werden.
Sensibilisierende Substanzen (Rohstoffe oder Wirkstoffe) können, wenn sie in Berührung mit der Haut oder der Schleimhaut kommen, eine allergische Reaktion (Kontaktallergie) hervorrufen.
Bekannte Beispiele sensibilisierender Stoffe sind beispielsweise Nickel-, Zink- und Kobaltionen, Chromat-Ionen, Duft- und Aromastoffe in Parfüms, Latex, Konservierungsmittel (Thiomersal, Parabene, Formalin), Kolophonium, TNBF (2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure), DNCB (Dinitrochlorbenzol), TNCB (Trinitrochlorbenzol), DNFB (2,4-Dinitrodifluorobenzol), MBT (2-Mercaptobenzothiazol), MCI/MI (Methylchloroisothiazolinone/Methylisothiazolinone), Neomycinsulfat und andere externe Antibiotika und Gummihilfsstoffe (Akzeleratoren, Antioxidantien, Vulkanisierungstoffe, Stabilisatoren der Gummiherstellung). Andere Auslöser sind Epoxidharze (Harze, Lösungsmittel und Härter; meist nur die kleineren Monomere und Dimere, nicht aber die Polymere), Arzneimittel und Pflanzen.
Solche Substanzen dringen bei der Sensibilisierung in die vitalen Zellschichten der Epidermis ein. Zumeist handelt es sich dabei um kleine Moleküle, die selber keine Immunreaktion auslösen können. In der Haut verbinden sich diese Moleküle mit hauteigenen Proteinen und bilden einen Hapten-Protein-Komplex, der nun vom Immunsystem erkannt werden kann. Im Fall der Kontaktallergie wird der Protein-Hapten-Komplex von den dendritischen Zellen (den Langerhanszellen) aufgenommen und verarbeitet. Kleine Moleküle, die per se nicht sensibilisierend wirken, können zu einem sensibilisierenden Agens (Hapten) werden, wenn sie durch hauteigene Enzyme verändert werden. In diesem Fall entsteht aus einem Prohapten durch die biochemische Umsetzung erst das eigentliche Hapten, das dann mit Proteinen einen immunogen wirkenden Hapten-Protein-Komplex bildet.
Eine Möglichkeit zur Bestimmung des sensibilisierenden Potentials eines Agens ist ein Tierversuch mit Mäusen (murine lymph node essay), denen die Prüfsubstanz in die Haut gespritzt wird, um das Immunsystem der Tiere zu stimulieren. Es wird dann bestimmt, ob die Testsubstanz bei nochmaligem Kontakt allergische Reaktionen auslöst.
Tierversuchfreie Tests, ob bestimmte neue Substanzen sensibilisierend wirken können, werden bisher an zweidimensionalen Zellkulturen (Monolayer) unterschiedlicher Zelltypen (z.B. monocytäre dendritische Zellen) durchgeführt. Nachteilig ist dabei, dass in solchen einfachen Modellen die komplexen Interaktionen, die in der Haut bei Kontakt mit einem sensibilisierenden Agens stattfinden, nicht beobachtet werden können. Darüber hinaus können in solche Zellkulturen nur wasserlösliche Roh- bzw. Wirkstoffe eingebracht und getestet werden.
Es besteht nun Bedarf, ohne Rückgriff auf Tierversuche, ein Testsystem bereitzustellen, welches die Nachteile des Standes der Technik überwindet und eine Vorhersage des sensibilisierenden Potentials von Substanzen, die mit der Haut bzw. den Schleimhäuten in Kontakt kommen, ermöglicht.
Das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende technische Problem besteht also darin, ein Hautmodell, welches möglichst weitgehend nativer menschlicher Haut entspricht, ein Dermisäquivalent, ein Epidermisäquivalent und besonders bevorzugt ein humanes in vitro-Vollhautmodell, sowie Verfahren und Mittel zu deren Herstellung bereit zu stellen, das die oben genannten Nachteile des Standes der Technik überwindet und sich als Testhaut beispielsweise zur Untersuchung pharmakologischer und kosmetischer Wirkungen sowie zur Hautverträglichkeitsprüfung, insbesondere zur Testung des allergenen bzw. sensibilisierenden Potentials von Wirkstoffen, einsetzen lässt.
Das Problem wird gelöst durch ein Hautmodell, umfassend eine Kollagenmatrix und dendritische Zellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Hautmodell, insbesondere ein Dermisäquivalent, ein Epidermisäquivalent und ein Ganzhautäquivalent umfassend eine Kollagenmatrix sowie dendritische Zellen, Verfahren zur Herstellung des Dermis-, Epidermis- bzw. Hautäquivalentes sowie deren Verwendung zur Testung von Substanzen, insbesondere in Bezug auf eine potentiell sensibilisierende Wirkung, bevorzugt die Wirkung auf die Haut.
Unter Hautmodell im Sinne der vorliegenden Erfindung sind neben Vollhautäquivalenten (auch Ganzhautmodelle genannt) auch Dermis- und Epidermisäquivalente zu verstehen.
Unter dendritischen Zellen sind erfindungsgemäß solche Zellen sowie ihre Vorläufer zu verstehen, die entweder basal oder aufgrund von Stimulation einen der Oberflächenmarker CD86 (B7.2) oder CD 54 (ICAM) exprimieren oder regulieren können. Dabei kann die Stimulation bevorzugt durch dem Fachmann bekannte Faktoren, insbesondere Chemokine und/oder Cytokine, oder durch den Kontakt der Zellen mit einem sensibilisierenden Agens erfolgen.
Bevorzugt sind solche Zellen, die entweder basal oder aufgrund von Stimulation den Sensibilisierungsmarker CD86 (B7.2) exprimieren oder regulieren können.
Besonders bevorzugt sind solche Zellen, die entweder basal oder aufgrund von Stimmulation sowohl den Marker CD86 als auch den Marker CD54 exprimieren oder regulieren können.
Insbesondere sind unter dendritischen Zellen sowohl induzierte oder nicht induzierte monocytäre dendritische Zellen oder induzierte oder nicht induzierte dendritische Zellen, die aus lymphoiden, myeloischen, histiocytären oder monocytischen Zelllinien gewonnen wurden, zu verstehen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäßen dendritischen Zellen ausgewählt aus Zellen oder Zelllinien gewonnen aus Tumoren des blutbildenden und/oder immunologischen Systems.
Die Zellen bzw. Zelllinien aus Tumoren des blutbildenden und/oder immunologischen Systems werden bevorzugt eingesetzt. Insbesondere können sie nach einer Stimulierung mit geeigneten Faktoren, insbesondere mit Chemokinen oder Cytokinen eingesetzt werden, da sie bevorzugt nach der Stimulation die Marker CD86 und/oder CD54 exprimieren oder regulieren, und aus Zelllinien erhältlich sind.
Im Gegensatz zu Langerhanszellen und deren Vorläufern sowie Zellen, die aus Blut gewonnen werden, sind diese Zelllinien als Zellkulturen verfügbar und können beliebig oft geteilt und weiter kultiviert werden. Die Qualität des resultierenden Hautmodells ist daher viel weniger abhängig von der Qualität der einzelnen Zellpräparationen.
Die Hautmodelle, die mit den genannten Zelllinien hergestellt werden bzw. diese enthalten, weisen vorteilhafter Weise eine besonders hohen Stabilität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse auf. Die aus sogenannten immortalen Zelllinien abgeleiteten Hautmodelle liefern insbesondere bei mehreren Testreihen besonders gut vergleichbare Werte.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Tumoren ausgewählt aus myeloiden oder lymphoiden Tumoren.
Bevorzugt sind die myeloiden Tumoren ausgewählt aus human acute myeloid leukemia, human multiple myeloma, human acute myeloid (eosinophilic) leukemia, human multiple myeloma, human acute myeloid leukemia, myelomonocytic leukemia, human chronic myeloid leukemia in blast crisis, human multiple myeloma, human acute monocytic leukemia, human acute myelogenous leukemia, human histocytic lymphoma und human monocytic leukemia. Es wurde hierbei die Bezeichnung der beim DSMZ „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" veröffentlichten Tumoren verwendet.
Aus diesen myeloiden Tumoren können Zelllinien gewonnen werden, die besonders gut kultivierbar sind.
Insbesondere ist es bevorzugt, dass die erfindungsgemäß einzusetzenden Zellen aus myeloiden Tumoren ausgewählt sind aus Zellen der humanen Zelllinien KG-1 (DSMZ no. ACC 14), U937 (DSMZ no. ACC 5) und THP-1 (DSMZ no. ACC 16).
Diese Zelllinien sind besonders geeignet, da sie sowohl den Oberflächenmarker CD86 (B7.2) als den Marker CD 54 (ICAM) basal oder nach Stimulation exprimieren oder regulieren können.
Die in Klammern angegebenen Nummern kennzeichnen die Zelllinien. Auf der Homepage des DSMZ (www.dsmz.de) sind die genannten Zelllinien mit ihren Ursprüngen sowie ihren Merkmalen beschrieben. Die angegebenen Informationen beziehen sich auf den Katalog vom November 2005.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäß einzusetzenden Zellen aus lymphoiden Tumoren ausgewählt, aus human plasma cell leukemia, human T cell leukemia, human T cell lymphoma, human B cell precursor leukemia, human B cell lymphoma, human chronic B cell leukemia, human T cell acute lymphoblastic leukemia, human histiocytic lymphoma und human Hodgkin lymphoma. Es wurde hierbei die Bezeichnung der beim DSMZ „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" veröffentlichten Tumoren verwendet.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäß einzusetzenden Zellen ausgewählt aus monocyte derived dendritic cells (MoDC), Zellen aus Zelllinien, gewonnen aus Tumoren ausgewählt aus human acute myelogenous leukemia, human histocytic lymphoma, human monocytic leukemia, insbesondere den humanen Zelllinien KG-1 (DSMZ no. ACC 14), U937 (DSMZ no. ACC 5), THP-1 (DSMZ no. ACC 16) Mono Mac 6 (DSMZ no. ACC 124) oder Mono Mac 1 ((DSMZ no. ACC 252) oder MUTZ-3 (DSMZ no. ACC 295).
Ganz besonders bevorzugt ist es, dass die erfindungsgemäß einzusetzenden Zellen ausgewählt sind aus Monocyte derived dendritic Cells (MoDC) sowie insbesondere den humanen Zelllinien KG-1 (DSMZ no. ACC 14), U937 (DSMZ no. ACC 5) und THP-1 (DSMZ no. ACC 16).
Diese Zellkulturlinien sind besonders gut, insbesondere im Hinblick auf ihre Reaktionen bei Sensilibisierungsuntersuchungen, charakterisiert.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Hautmodells werden die erfindungsgemäß geeigneten Zellen vor, während oder nach der Kokultivierung mit dem Hautmodell mit geeigneten Faktoren, insbesondere Chemokine oder Cytokinen, behandelt. Die geeigneten Faktoren können jedem der geeigneten Kulturmedien zugesetzt werden.
Bevorzugt geeignete Cytokine sind ausgewählt aus GM-CSF (Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor), SCF (Stem Cell Factor), IL-4 (Interleukin 4), IL-13 (Interleukin 13), TGFβ (Transforming Growth Factor beta), insbesondere TGFβ1, oder TNF-α (Tumor Necrosis Factor alpha) und deren Mischungen, besonders bevorzugt aus IL-4 und GM-CSF sowie deren Mischungen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt die Kollagenmatrix vernetzt vor.
Die erhöhte Stabilität der vernetzten Kollagenmatrix (die, wie weiter unten beschrieben, hergestellt werden kann) führt wiederum zu einer verbesserten Handhabbarkeit der Hautmodelle und einer höheren Reproduzierbarkeit der zu erhaltenden Testergebnisse.
Insbesondere kann die Vernetzung der Kollagenmatrix durch Vernetzungsreagentien, wie beispielhaft für das Herstellungsverfahren (Schritt d) beschrieben, besonders bevorzugt durch Glutaraldehyd, erzeugt werden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Kollagenmatrix Fibroblasten und/oder Keratinozyten.
Wie weiter unten beschrieben können durch die Einsaat verschiedener Zellen unterschiedliche Testsysteme der realen Haut nachgebildet werden.
Werden nur Keratinozyten eingesät, resultiert ein Epidermismodell, während die Einsaat von Fibroblasten ohne Keratinozyten zu einem Dermismodell führt.
Besonders bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Hautmodell sowohl Fibroblasten als auch Keratinozyten, die nacheinander (insbesondere wie weiter unten genauer beschrieben), auf die Kollagenmatrix, die bevorzugterweise vernetzt ist, aufgebracht werden. Dort werden die Zellen wachsen gelassen und ggf. an der Air-Liquid-Interface in ein fertiges Hautmodell umgewandelt.
Durch die Anwesenheit von Keratinozyten und Fibroblasten im Hautmodell ist es möglich, ein Testsystem zur Verfügung zu stellen, das der in vivo Situation besonders gut und realistisch nachgebildet ist.
Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Hautmodells, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man

a) aus kollagenhaltigem Gewebe schwer lösliches Kollagen gewinnt,
b) das schwer lösliche Kollagen mittels einer Mischvorrichtung in eine homogene Kollagensuspension überführt,
c) die Kollagensuspension lyophilisiert und so eine erste Matrix A erzeugt,
d) die erste Matrix A einer Vernetzung unterzieht und so eine zweite, mechanisch stabilisierte Matrix B erzeugt,
e) Fibroblasten und/oder Keratinozyten (optional nacheinander) auf die zweite Matrix B einsät und wachsen lässt,
f) die in und auf der Matrix B wachsenden Zellen bis zur vollständigen Ausbildung des Hautmodells weiter kultiviert,

Vorteilhafterweise können im Gegensatz zu den bisher eingesetzten zweidimensionalen Testkulturen (Monolayern) bei einem dreidimensionalen Hautmodell die zu testenden Substanzen topisch auf die Oberfläche der Hautmodelle appliziert werden. Es können daher auch Formulierungen, z.B. Salben, Cremes, Gele und Schäume, und nicht nur wasserlösliche Roh-/Wirkstoffe z.B. oben auf die Epidermis aufgetragen und somit getestet werden.
Ein weiterer Vorteil ist darin zu sehen, dass die auf das erfindungsgemäße Hautmodell aufgetragenen Substanzen durch das Stratum corneum, also die Barriereschicht der Haut, penetrieren. Die Penetrationsrate hängt dabei maßgeblich von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Stoffe ab, z.B. Lipophilie, Molekulargröße, Reaktivität, die auch in vivo entscheidenden Einfluss auf den Effekt einer potentiell sensibilisierenden Substanz haben. Nach Auftragung der Testsubstanz auf das Modell bildet sich ein Verteilungsmuster der Substanzen aus, aus dem sich die Bioverfügbarkeit der Substanz ableiten lässt. Dieser Effekt kann nicht an Monolayer-Kulturen simuliert werden.
Weiterhin kann die zu testende Substanz während der Passage durch die Zellschichten des Hautmodells durch gewebeeigene Enzyme bzw. Enzymsysteme metabolisiert werden. Im Falle einer Substanz, die als Prohapten durch eine solche Metabolisierung erst als sensiblisierendes Agens (Hapten) aktiviert wird, ist ein Nachweis in Monolayer-Kulturen nicht möglich. Beispielsweise ist es möglich, dass sich erst nach der Metabolisierung stabile Hapten-Protein-Komplexe bilden, die erst die Sensibilisierungsreaktion auslösen.
Auch eine umgekehrte Wirkungsweise, die Inaktivierung einer sensibilisierenden Substanz durch Metabolisierung in der Haut, kann durch das erfindungsgemäße Modell, im Gegensatz zu zweidimensionalen Zellkultur-Testsystemen erfasst werden.
Vorteilhafterweise lässt sich die in Schritt b) erhaltene Kollagensuspension – ganz im Gegensatz zu den im Stand der Technik eingesetzten Kollagengelen – bei Raumtemperatur problemlos gießen und pipettieren.
Das erfindungsgemäße Hautmodell lässt sich im Vergleich zu Modellen aus dem Stand der Technik gut handhaben, da es besonders robust ist. Außerdem haftet das erfindungsgemäß erhältliche Ganzhautmodell gut am Boden der Kulturgefäße, so dass es nicht zur vorzeitigen Ablösung des noch nicht vollständig ausgebildeten Hautmodells kommt, wodurch das Modell unbrauchbar würde.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "Kultivieren" ein, vorzugsweise in vitro stattfindendes, Aufrechterhalten der Lebensfunktionen von Zellen, beispielsweise Fibroblasten oder Keratinozyten, in einer geeigneten Umgebung, beispielsweise unter Zu- und Abfuhr von Stoffwechseledukten und -produkten, insbesondere auch eine Vermehrung der Zellen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Fibroblasten natürlicherweise vorkommende, insbesondere in der Dermis vorkommende Fibroblasten, gentechnisch veränderte Fibroblasten oder aber aus Spontanmutationen hervorgegangene Fibroblasten oder deren Vorläufer verstanden. Die Fibroblasten können tierischer oder menschlicher Herkunft sein.
Unter „schwer löslichem Kollagen" wird erfindungsgemäß grobfaseriges Kollagen verstanden, das im wässrigen Medium über mehrere Stunden hinweg keine sichtbare oder nur geringe Quellung bzw. keine oder nur geringe Gelbildung, insbesondere keine Gelbildung, zeigt. Schwer lösliches Kollagen wird vorzugsweise aus den Sehnen von Tieren, insbesondere von Säugetieren, bevorzugt von Pferden, Schweinen oder Rindern, ganz besonders bevorzugt aus den Achillessehnen oder der Haut von Rindern, insbesondere aus den Achillessehnen von Rindern, gewonnen.
Die Überführung in eine homogene Kollagensuspension kann mit oder in jeder aus fachmännischer Sicht geeigneten Mischapparatur erfolgen, vorzugsweise in einem statischen Mischer oder mit einem Ultra Turrax.
Die Kollagensuspension wird nun in Behältnisse gegeben, deren Dimensionen denen der gewünschten Matrices entsprechen, z. B. in die Kavitäten einer Mikrotiterplatte.
Vor dem Befüllen der Behältnisse, z. B. der Kavitäten einer Mikrotiterplatte mit der Kollagensuspension können die Gefäße mit verschiedenen Agenzien beschichtet werden, um im folgenden die Haftung der lyophilisierten Kollagenmatrix an die Gefäßwand zu verbessern. Geeignete Agenzien sind beispielsweise Kollagen, Gelatine, Polylysin, Fibrin bzw. Fibrinogen/Thrombin oder Fibronectin. Hierbei benetzt man zunächst die inneren Gefäßwandungen mit Lösungen oder Suspensionen der Agenzien, trocknet die Gefäße, so dass sich eine Schicht der Agenzien auf der inneren Gefäßfläche bildet und füllt dann erst die Kollagensuspension ein.
Die Lyophilisierung (Gefriertrocknung) in Schritt c) erfolgt in diesen Behältnissen. Wenn das Einfrieren mit geringer Abkühlgeschwindigkeit erfolgt, so werden große Eiskristalle erhalten, die Konzentrationsunterschiede und Entmischung im Produkt bewirken. Durch ein langsames, ausgeprägtes Eiskristallwachstum entstehen besonders große Eiskristalle, die, wenn ein Temperaturgradient beim Einfrieren vorgelegen hat, in Richtung des Gradienten ausgerichtet sind. In diesem Fall werden Produkte erhalten, die von einer großlumigen Säulen- bzw. Kaminstruktur durchzogen sind. Allerdings ist bei diesen groß gewachsenen Strukturen die spezifische Oberfläche verkleinert, so dass das Rekonstitutionsverhalten negativ beeinflußt sein kann.
Aus diesem Grunde wird üblicherweise bei der Gefriertrocknung biologischen Materials darauf geachtet, eine möglichst schnelle Abkühlung zu bewirken.
Überraschenderweise hat die Anmelderin jedoch festgestellt, dass eine langsame Abkühlung der Kollagensuspension während des Lyophilisierungsprozesses vorteilhafte Auswirkungen auf die Beschaffenheit der Matrices A und B hat. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine Abkühlrate von bis zu 50°C pro Stunde, insbesondere 5°C bis 40°C pro Stunde, vorzugsweise 10°C bis 30°C pro Stunde, besonders bevorzugt 15°C bis 25°C pro Stunde, ganz besonders bevorzugt von 18°C bis 23°C und noch stärker bevorzugt von 20°C bis 22°C.
Solche bevorzugt erhältlichen Lyophilisate weisen ein Häutchen an der Produktoberfläche auf.
Vorteilhafterweise bildet dieses Häutchen an der Oberfläche der lyophilisierten Matrix Poren aus, die für die nachfolgende Besiedelung mit Fibroblasten besonders gute Bedingungen bieten, da sie ein langsames Einwandern der Fibroblasten in die Matrix fördern. Schnellere Abkühlungsraten während des Lyophilisationsprozesses führen hingegen häufig zu einer offenporigen Matrix mit „Kratern" in der Oberfläche, die die Fibroblasten in der gegebenen Kultivierungszeit nicht komplett mit neusynthetisierter extrazellulärer Matrix ausfüllen können. Ausgesäte Keratinozyten können in diese Krater hineinfallen, in ihnen aggregieren und ausdifferenzieren, wodurch die Schichtung und damit die Differenzierung des Hautmodells empfindlich gestört werden kann.
Die Vernetzung in Schritt d) kann mit Hilfe jedes dem Fachmann geeignet scheinenden physikalischen oder chemischen Vernetzungsverfahrens erfolgen. Überraschenderweise hat die Anmelderin gefunden, dass sich Glutaraldehyd trotz seiner cytotoxischen und apoptotischen Eigenschaften bevorzugt als Vernetzer für das erfindungsgemäße Verfahren eignet. Die Vernetzung kann jedoch auch durch physikalische Verfahren wie UV-Bestrahlung und dehydrothermale Vernetzung (DHT) erfolgen.
Als chemische Vernetzungsreagenzien sind erfindungsgemäß bifunktionale Substanzen geeignet, deren Gruppen mit den Aminogruppen der Lysin- und Hydroxylysinresten auf verschiedenen Polypeptidketten der Kollagenfasern reagieren. Weiterhin kann auch die Aktivierung der Carboxylgruppen der freien Glutamin- und Asparginsäurereste, gefolgt von einer Reaktion mit den Aminogruppen einer anderen Polypeptidkette, zu einer erfindungsgemäßen Vernetzung der Kollagenfasern führen.
Eine Vernetzung zwischen zwei Kollagenfasern kann erfindungsgemäß auch durch eine Reaktion der Aminogruppen mit Diisocyanaten oder durch die Ausbildung von Acylaziden erfolgen.
Gängig und im Sinne der vorliegenden Erfindung einsetzbar ist auch die Vernetzung mit Carbodiimiden wie z.B. EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)-carbodiimid) unter Beteiligung von N-Hydroxysuccinimid.
Erfindungsgemäß sind auch Vernetzungsreaktionen mit homo-bifunktionalen Vernetzungsreagenzien, die mit Aminogruppen reagieren möglich, beispielsweise mit p-Benzochinon, Dimethyladipimidat, Dimethylpimelinidat, Dimethylsuberimidat, 1,4-Phenylendiisothiocyanat, Polyoxyethylen-bis (imidazolyl carbonyl), bis[Polyoxyethylen-bis(imidazolyl-carbonyl)] und Suberinsäure-bis(N-hydroxysuccinimidester); ebenso wie der Einsatz eines biologischen Vernetzungsagens, insbesondere mit Enzymen, bevorzugt Transglutaminase, das Peptidketten miteinander verknüpfen kann, oder Lysyl-Oxidasen (EC 1.4.3.13). Weitere Vernetzungsmöglichkeiten sind beispielsweise in der EP-A2-0898973 aufgeführt, auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Die Gewinnung und Kultivierung der Fibroblasten und Keratinozyten erfolgt nach der Fachwelt bekannten Verfahren, die gemäß den gewünschten Eigenschaften des herzustellenden Hautmodells angepasst werden können.
Erfindungsgemäß ist darüber hinaus in einer bevorzugten Ausführung vorgesehen, dass vor, während oder nach der Aussaat der Keratinozyten in Schritt f) zusätzlich zu den erfindungsgemäß eingesetzten Zellen auch andere Zelltypen und/oder andere Zellen anderer Gewebetypen humanen als auch tierischen Ursprungs, z.B. von Säugetieren, und/oder deren Vorläuferzellen auf der Matrix ausgesät werden können, zum Beispiel Melanocyten, Macrophagen, Monocyten, Leukocyten, Plasmazellen, neuronale Zellen, Adipocyten, induzierte und nicht induzierte Vorläuferzellen von Langerhans-Zellen, Langerhans-Zellen sowie andere Immunzellen, Endothelzellen, Zellen aus Tumoren der Haut bzw. hautassoziierter Zellen, insbesondere Sebocyten bzw. Talgdrüsengewebe oder Talgdrüsenexplantate, Zellen der Schweißdrüsen bzw. Schweißdrüsengewebe oder Schweißdrüsenexplantate, Haarfollikelzellen oder Haarfollikelexplantate; sowie Zellen aus Tumoren anderer Organe bzw. aus Metastasen. Es können auch Stammzellen unterschiedlicher Herkunft, gewebespezifische Stammzellen, embryonale und/oder adulte Stammzellen, in das Hautmodell eingebaut werden. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird somit ein organoides in vitro-Hautmodell erhalten, das aus zwei gewebetypischen Schichten, nämlich einem Dermisäquivalent und einem Epidermisäquivalent, aufgebaut ist. Das organotypische Hautmodell entspricht sowohl histologisch als auch funktionell weitgehend der nativen Haut.
Durch die Vernetzung der Matrix A wird erreicht, dass das auf und in der Matrix B heranwachsende Dermisäquivalent im Verlauf der Kultivierungsdauer keinem oder nur einem sehr geringen Schrumpfungsprozess unterworfen ist. Dadurch werden Hautäquivalente mit definiertem Durchmesser, einheitlicher Oberfläche und einem definierten Abschluss zum Rand des Kulturgefäßes erhalten. Durch die einheitliche Größe und einheitliche Beschaffenheit des als Testoberfläche verwendeten Vollhautmodells (Ganzhautmodells) wird erreicht, dass bei Tests von Substanzen auf pharmakologische und/oder kosmetische Effekte die Qualität der Ergebnisse gesteigert wird und die Testergebnisse reproduzierbarer werden.
Die zur Kultivierung der Fibroblasten vorgesehene vernetzte Matrix B enthält also die zu kultivierenden Fibroblasten und ein aus einer, vorzugsweise frischen, Kollagensuspension menschlichen oder tierischen Ursprungs neu konstituiertes Kollagengerüst mit einer Konzentration von etwa 5 bis 50 mg Kollagen pro ml Matrix, entspr. 0,5 % bis 5 % Kollagen. Bevorzugt ist der Bereich von 8 bis 25, entsprechend 0,8 % bis 2,5 % Kollagen, insbesondere von 8 bis 12 mg Kollagen pro ml Matrix, entsprechend 0,8 % bis 1,2 % Kollagen.
Das Kollagengerüst wird aus einer, vorzugsweise zellfreien, sauren Suspension von schwer löslichem Kollagen gewonnen, wobei die Proteinkonzentration der Suspension vorzugsweise 5 bis 15 mg/ml, entsprechend 0,5 bis 1,5 Gew.-%, beträgt. Der pH-Wert der Kollagenlösung beträgt 0,1 bis 6,9, vorzugsweise 2,0 bis 5,0, bevorzugt 3,0 bis 4,5 und insbesondere 3,5 bis 4,0.
Zur Kultivierung der Fibroblasten-haltigen Matrix wird die Matrix B mit einer Lösung, enthaltend ein Zellkulturmedium (vorzugsweise DMEM-Zellkulturmedium), Puffer (beispielsweise Hepes-Puffer), Serum (vorzugsweise fötales Kälberserum (FCS), normales Kälberserum (NCS), normales Lammserum (NLS), definiertes Serum oder Serumersatzprodukte) und vorzugsweise 1–6 × 10⁵/Matrix Fibroblasten, insbesondere vorkultivierten Fibroblasten, versetzt.
Zur weiteren Stabilisierung der Matrix B kann Fibronectin und/oder Laminin, vorzugsweise humanes Fibronectin und/oder Laminin, auf die Matrix bzw. in das Kulturmedium gegeben werden. Bei Fibronectinen handelt es sich um in Fibroblasten produzierte Struktur- beziehungsweise Adhäsionsproteine, deren Funktion in vivo in der Bindung an andere Makromoleküle, beispielsweise Kollagen, und in der Anheftung von Zellen an Nachbarzellen besteht. Laminin ist ein Protein der Basalmembran, an das Zellen adhärieren können. Durch die Zugabe von Fibronektinen und/oder Laminin zur Fibroblasten-Kollagenmatrix wird also die Bindung der Fibroblasten sowohl an Kollagen als auch untereinander begünstigt. Beide Proteine können entweder direkt in die Matrix eingearbeitet werden bei deren Herstellung oder nach dem Vernetzungsschritt der Matrix in gelöster Form, z.B. in Kulturmedium gelöst, zugegeben werden. Dies kann vor oder parallel zur Zellaussaat erfolgen.
Die anschließende Kultivierung der Fibroblasten in der Kollagenmatrix erfolgt vorzugsweise in Submers-Kultur. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Submers-Kultivierung" oder einer „Submers-Kultur" ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen verstanden, wobei die Zellen mit einer Nährlösung bedeckt sind. Die Fibroblasten enthaltende Matrix B wird also bevorzugtermaßen mit Zellkulturmedium überschichtet und im Temperaturbereich von etwa 30°C bis etwa 40°C inkubiert.
Zusätzlich zu der beschriebenen Methode zur Kultivierung eines erfindungsgemäß erhaltenen Vollhautmodells kann das Modell durch Veränderungen der Kultivierungsbedingungen, z.B. durch Mediumkomponenten dahingehend optimiert werden, dass es eine bessere Barrierefunktion erhält, die der in vivo-Situation noch näher kommt. Diese ist wichtig z.B. für die Durchführung von Penetrationsstudien, aber auch für Herstellung von Produkten, die die Barrierefunktion der Haut verbessern. Darüber hinaus gibt es medizinisch relevante Störungen der Barrierefunktion, sei es durch Umweltfaktoren (Kontakt mit Detergenzien) oder genetisch bedingt. Hautmodelle mit optimierter Barrierefunktion wären hier wichtig.
Die Verbesserung der Barrierefunktion kann durch veränderte Kulturbedingungen (z.B. Luftfeuchte, Temperatur), durch chemische Komponenten im Medium (Ceramide, Vitamin C) oder durch genetisch veränderte Keratinozyten erreicht werden.
Die Veränderung der Barrierefunktion kann durch die Messung der elektrischen Kapazität der Oberfläche (surface electrical capacitance) gemessen werden. Ausführliche Angaben zur Verbesserung der Barrierefunktion finden sich beispielsweise in der US-A1-20020168768, auf deren Offenbarung hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Zur Verbesserung des Fibroblastenwachstums im Dermisäquivalent bzw. im Ganzhautmodell können dem Kulturmedium Faktoren zugefügt werden, die im Falle einer Kokultivierung von Fibroblasten und Keratinozyten von den Keratinozyten freigesetzt werden. Beispielsweise kann der konditionierte Kulturüberstand (d.h. der Mediumüberstand von kultivierten Keratinozyten und/oder Kokulturen von Keratinozyten mit anderen Zelltypen, wie z.B. Endothelzellen, Immunzellen oder Fibroblasten) verwendet werden.
Die erfindungsgemäße Kokultivierung von dendritischen Zellen mit dem erfindungsgemäßen Hautmodell kann auf verschiedene Weise erfolgen:
Die Kokultivierung kann bevorzugt durch Einsaat der dendritischen Zellen vor, während oder nach Schritt e) des Herstellungsverfahrens für die Hautmodelle (bevorzugt Ganz- bzw. Vollhautmodell, Dermisäquivalent, Epidermisäquivalent) erfolgen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Hautmodelle, insbesondere des Epidermis- und des Vollhautäquivalents, erfolgt die Einsaat der Zellen gemeinsam mit den Keratinozyten in Schritt e. Im Herstellungsverfahren erfolgt dann die Isolierung, Anzucht und Differenzierung der dendritischen Zellen parallel zur Anzucht der Keratinocyten. Nach der Ernte der beiden Zelltypen können diese miteinander gemischt werden. Bevorzugt erfolgt die Mischung beider Zelltypen in einem Verhältnis von 10:1 bis 1:1 (Keratinozyten zu dendritischen Zellen.
Die Zellmischung kann nun gemeinsam auf der zweiten Matrix, die im Falle des Ganzhautmodells vorzugsweise mit Fibroblasten vorkultiviert wurde, in Keratinocytenmedium erfolgen. Danach wird die submerse Kultivierung bevorzugterweise fortgesetzt, besonders bevorzugt über 2–7 Tage. Danach wird das Modell vorzugsweise in die Air-Liquid-Interface zur weiteren Differenzierung der Epidermis überführt. Die weitere Kultivierung kann 7–21 Tage betragen.
Die dendritischen Zellen in der Haut kommen überwiegend in der Epidermis vor. Daher ist es vorteilhaft, die Zellen nach (oder gleichzeitig mit) der Aussaat der Keratinozyten in das Hautmodell, insbesondere das Epidermisäquivalent bzw. das Ganzhautmodell, einzusäen.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Einsaat der dendritischen Zellen in das Hautmodell, insbesondere das Epidermisäquivalent bzw. das Ganzhautmodell, nach der Aussaat der Keratinocyten in Keratinocytenmedium auf die zweite Matrix (B). Die Kultivierung der Keratinozyten kann dann weiterhin submers verlaufen.
Die dendritischen Zellen können sowohl während der submersen Kulturphase, die bevorzugter Weise 3 bis 7 Tage dauern kann, als auch nach der Überführung in die Air-Liquid Interface stattfinden.
Besonders bevorzugt werden die Zellen nach der Überführung des Modells in die Air-Liquid-Interface auf die zweite Matrix (B) gesät. Ganz besonders bevorzugt ist es, wenn die Aussaat der erfindungsgemäß einzusetzenden Zellen, nach 1 bis 3 Tagen nach Überführung des Modells in die Air-Liquid-Interface auf das Modell ausgesät werden.
Eine weitere Möglichkeit zur Kokultivierung des Hautmodells und der dendritischen Zellen besteht darin, dass man das Hautmodell nach den Schritten a bis f herstellt und an der Air-Liquid-Interface weiterkultiviert. Dieses fertige Hautmodell kann nun mit einer Kultur von dendritischen Zellen über ein geeignetes Medium in Kontakt gebracht werden.
Besonders bevorzugt ist es dabei, das Hautmodell, insbesondere das fertig entwickelte Hautmodell, vorzugsweise auf einem geeigneten Träger, in eine mit passendem Zellnährmedium überschichtete Kultur von dendritischen Zellen so einzuführen, das der untere Teil des Hautmodells, bei Ganzhautmodellen insbesondere die Dermis, über die Seite, insbesondere aber nur über den Boden, der bevorzugt über eine Membran in Kontakt mit dem Medium steht, mit den Zellen in Kontakt kommt.
Die dendritischen Zellen können dabei auch statt in einer normalen Zellkultur in einem Gel vorliegen. Bevorzugt werden Kollagen-, Agarose- oder Fibringele verwendet, besonders bevorzugt Kollagengele.
Dabei werden die Zellen in eine noch nicht oder nicht vollständig gelierte Gellösung eingerührt. Das Gel wird in eine Form gegossen und gelieren gelassen. Kollagengelen gelieren beispielsweise durch Erwärmen auf etwa 37°C (z.B. im Brutschrank).
Das die Zellen enthaltene Gel wird bevorzugt in einem Kokulturinsert auf eine Membran, die bevorzugt porös ist und/oder aus polymerem Material hergestellt wird, hineingegossen oder hineingesetzt. Auf das Gel kann nun das Hautmodell direkt platziert werden. Das Kokulturinsert wird in ein Kulturgefäß mit Kulturmedium eingesetzt. Die Zellen im Gel haben dabei keinen direkten Kontakt mit den Zellen im Hautmodell, können aber Botenstoffe und andere Substanzen austauschen.
Vorteilhafterweise können die dendritischen Zellen bei dieser Methode nach Abschluss des Experimentes einfacher geerntet und für weitere Analysen aufbereitet werden.
Das so erhaltene Hautmodell kann für Screening- und Diagnoseverfahren verwendet werden, insbesondere zur Untersuchung der Wirkungen chemischer Substanzen, Pflanzenextrakten und Metallen, beispielsweise potentieller Arzneimittel oder Bestandteile von Kosmetika, oder anderer Agenzien (physikalische Größen), wie Licht oder Wärme, Radioaktivität, Schall, elektomagnetische Strahlung, elektrische Felder und auch zur Untersuchung der Phototoxizität, also der schädigenden Wirkung von Licht unterschiedlicher Wellenlänge, auf Zellstrukturen. Das erfindungsgemäß hergestellte Dermisäquivalent kann auch zur Untersuchung der Wundheilung eingesetzt werden. Es eignet sich auch zur Untersuchung der Wirkung von Gasen, Aerosolen, Rauch, Stäuben auf die Zellstrukturen bzw. den Stoffwechsel oder die Genexpression.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff „Agens" oder „Agenzien" insbesondere auf die Haut oder Hautzellen wirkende physikalische Mittel wie Licht, Wärme, oder ähnliches, verstanden. Die Erfindung betrifft daher auch Screening- und Diagnoseverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Hautmodellen.
Eine bevorzugte Ausführung der Erfindung umfasst die Behandlung des Hautmodellen in An- und Abwesenheit der zu untersuchenden Substanz und/oder des zu untersuchenden Agens und den Vergleich der beobachteten Auswirkungen auf die Zellen oder Zellbestandteile des Dermisäquivalents.
Eine weitere bevorzugte Ausführung der Erfindung umfasst ein Verfahren zur Untersuchung der Penetration von Substanzen unter Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten Hautmodellen, insbesondere und unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Ganzhautmodells, das aus einem Dermisäquivalent und einem Epidermisäquivalent besteht.
Insbesondere eignet sich die erfindungsgemäße Hautmodell, bevorzugt das erfindungsgemäße Ganzhautmodell, zur Untersuchung solcher Substanzen, für die ein Verdacht auf eine sensibilisierende bzw. allergieauslösende Wirkung besteht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Dermisäquivalentes verwendet.
Dabei werden die Fibroblasten in der Matrix B so kultiviert, dass anschließend ein Dermisäquivalent gewonnen werden. Dies geschieht vorzugsweise durch ein Verfahren zur Herstellung eines Dermisäquivalentes, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man

a. aus kollagenhaltigem Gewebe schwer lösliches Kollagen gewinnt,
b. das schwer lösliche Kollagen mittels einer Mischvorrichtung in eine homogene Kollagensuspension überführt,
c. die Kollagensuspension lyophilisiert und so eine erste Matrix A erzeugt,
d. die erste Matrix A einer Vernetzung unterzieht und so eine zweite, mechanisch stabilisierte Matrix B erzeugt,
e. Fibroblasten auf die zweite Matrix B einsät und wachsen lässt und schließlich
f. die in und auf der Matrix B wachsenden Fibroblasten bis zur vollständigen Ausbildung des Dermisäquivalentes weiter kultiviert, wobei man vor, während oder nach der Einsaat der Zellen in Schritt e. dendritische Zellen mit dem Dermisäquivalent kokultiviert.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Dermisäquivalent" eine Bindegewebe-artige Schicht aus Kollagen und Fibroblasten verstanden, die weitgehend der nativen Dermis entspricht.
Besonders geeignet zur Herstellung eines Ganzhautmodells ist ein Verfahren einzusetzen, in dem man

a) aus kollagenhaltigem Gewebe schwer lösliches Kollagen gewinnt,
b) das schwer lösliche Kollagen mittels einer Mischvorrichtung in eine homogene Kollagensuspension überführt,
c) die Kollagensuspension lyophilisiert und so eine erste Matrix A erzeugt,
d) die erste Matrix A einer Vernetzung unterzieht und so eine zweite, mechanisch stabilisierte Matrix B erzeugt,
e) Fibroblasten auf die zweite Matrix B einsät und wachsen lässt,
f) Keratinozyten auf die zweite Matrix B einsät und wachsen lässt und schließlich
g) die in und auf der Matrix B wachsenden Zellen bis zur vollständigen Ausbildung des dermalen und des epidermalen Teils des Ganzhautmodells weiter kultiviert,

Besonders bevorzugt ist es, die Einsaat der dendritischen Zellen vor, während oder nach der Einsaat der Keratinozyten in Schritt f vorzunehmen.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft auch ein vorgenanntes Verfahren zur Kultivierung dermaler Fibroblasten und epidermaler Keratinozyten in einer Matrix zur Herstellung eines aus Dermisäquivalent und Epidermisäquivalent bestehenden Ganzhautäquivalentes. Dabei werden ein bis drei Wochen, vorzugsweise 10 bis 14 Tage, nach der vorstehend beschriebenen Herstellung und Inkubation der Fibroblasten enthaltenden Kollagen-Matrix Keratinozyten auf die Matrix ausgesät.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter „Keratinozyten" Zellen der Epidermis, die verhornendes Plattenepithel bilden, gentechnisch veränderte Keratinozyten oder aus Spontanmutationen hervorgegangene Keratinozyten oder deren Vorläufer verstanden, die tierischer oder menschlicher Herkunft sein können. Da die Ausbildung einer gut differenzierten Epidermis mit intakter Verhornung in starkem Maße vom Anteil basaler Stammzellen in den verwendeten Keratinozyten abhängt, kann es sich bei den gemäß Schritt f) des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Matrix ausgesäten Keratinozyten um weitgehend undifferenzierte Keratinozyten-Stammzellen aus humanem Biopsiegewebe handeln. Es ist aber auch möglich, Zelllinien oder bestimmte differenzierte Zellen einzusetzen. Alternativ zu den normalen Haut-Keratinozyten können auch Schleimhautkeratinocyten oder Darmepithelzellen auf die Matrix aufgebracht werden:
Vorzugsweise handelt es sich dabei um vorkultivierte Zellen, besonders bevorzugt um Keratinozyten in der ersten oder in der zweiten Zellpassage, es ist aber auch der Einsatz von Zellen aus höheren Passagen möglich.
Die Aussaat der Keratinozyten auf die Matrix erfolgt vorzugsweise in einem Zellkulturmedium, besonders bevorzugt in DMEM/F12-Medium das etwa 1 bis 30 % fötales Kälberserum, NCS, definiertes Serum oder Serumersatzprodukte und verschiedene Additive in wechselnden Konzentrationen enthält, die die Proliferation und Differenzierung der Zellen fördern. Anschließend wird die Matrix bevorzugtermaßen mit DMEM-Medium, enthaltend insbesondere EGF aus der Maus oder auch vergleichbare Präparate aus anderen Tieren, epidermalen Wachstumsfaktor (hEGF) (z.B. in einer Konzentration von 0,2 μg/l Medium), und beispielsweise 0,8 mM CaCl₂, überschichtet und einer vorzugsweise 1- bis 10-tägigen, vorzugsweise 3- bis 7-tägigen Submers-Kultivierung unterworfen.
Eine vollständige Differenzierung der Keratinozytenschichten wird beispielsweise durch eine Airlift-Kultur (Air-liquid-Interface-Kultur) in DMEM ohne hEGF und BPE (bovine pituitary extract) erreicht. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Airlift-Kultur" eine Kultur verstanden, wobei die Höhe des Nährmedienspiegels genau auf die Höhe der Matrix abgestimmt ist, während die Keratinozyten oder durch die Keratinozyten gebildeten Zellschichten über dem Nährmedienspiegel liegen und vom Nährmedium nicht bedeckt werden, das heisst die Kultivierung erfolgt an der Grenzschicht Luft-Nährmedium, wobei die Versorgung der Kulturen von unten her erfolgt. Dazu werden z.B. die Hautmodelle aus einer Mikrotiterplatte gehoben und auf Filterpapiere gesetzt, die auf metallenen Abstandshaltern in Kulturgefäßen ruhen. Das Medium wird in den Kulturgefäßn so hoch eingefüllt, dass es das Filterpapier nicht vollständig bedeckt, dass aber ein Flüssigkeitskragen um die Basis der Hautmodelle vorhanden ist (Air-Liquid-Interface). Der Zeitraum der Airlift-Kultur kann durch den Fachmann in gewünschter Weise variiert werden. Typischerweise beträgt er etwa 1 bis 4 Wochen. Während dieses Zeitraumes entwickelt sich ein hauttypisches, aus Dermisäquivalent und Epidermisäquivalent bestehendes in vitro-Vollhautmodell.
Das erfindungsgemaße Verfahren zur Herstellung eines in vitro-Ganzhautmodells kann vorteilhafterweise so modifiziert werden, dass vor, während oder nach der Aussaat von Keratinozyten weitere Zelltypen, wie Melanocyten, Macrophagen, Monocyten, Leukocyten, Plasmazellen, neuronale Zellen, Adipocyten, induzierte und nicht induzierte Vorläuferzellen von Langerhans-Zellen, Langerhans-Zellen andere Immunzellen, Endothelzellen sowie Zellen aus Tumoren der Haut bzw. hautassoziierter Zellen auf der Matrix ausgesät und weiter kultiviert werden können. Die genannten Zellen können sowohl humanen als auch tierischen Ursprungs sein.
Die Erfindung betrifft daher auch ein hauttypisches in vitro-Vollhautmodell (Ganzhautmodell), insbesondere ein humanes in vitro-Vollhautmodell, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und einem gegebenenfalls anschließenden und/oder vorausgehenden Kultivierungsverfahren herkömmlicher Art hergestellt wurde und das im epidermalen Anteil mindestens eine proliferative Zellschicht, einige differenzierende Zellschichten und mindestens eine verhornte Zellschicht umfasst, wobei das Epidermisäquivalent Stratum basale, Stratum spinosum, Stratum granulosum und Stratum corneum umfasst und wobei zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent eine Basalmembran, bestehend aus den charakteristischen BM-Proteinen wie beispielsweise Laminin und Kollagen IV enthalten ist und wobei darüber hinaus hauttypische Proteine wie Transglutaminase, Involucrin, Kollagen IV, Laminin, Filaggrin, Fibronectin, Ki-67, Cytokeratin 10 und insbesondere Elastin exprimiert werden.
Der Stressmarker Cytokeratin 6 wird hierbei jedoch nur in geringem Umfang exprimiert, was darauf hindeutet, das sich die Zellen in dem erfindungsgemäßen in vitro-Vollhautmodell in einem relativ stressarmen Zustand befinden. Starke CK6- Expression findet man in der Haut z.B. während der Wundheilung bzw. Regeneration.
Das proliferative Verhalten sowie die Differenzierung der dermalen und epidermalen Zellen kann durch das Anlegen von elektrischen bzw. elektromagnetischen Feldern an das Dermismodell oder Vollhautmodell während der Kultivierungsphase modifiziert werden.
Aufgrund der Komplexität des hergestellten Hautmodells kann dieses gezielt für verschiedene Fragestellungen der chemisch-pharmazeutischen Industrie und der kosmetischen Industrie verwendet werden. Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäß hergestellte Hautäquivalent zur Produktprüfung, beispielsweise im Hinblick auf Wirksamkeit, unerwünschte Nebenwirkungen, beispielsweise Reiz-, Toxizitäts- und Entzündungswirkungen oder allergieauslösende Wirkungen, oder Verträglichkeit von Substanzen. Dabei kann es sich um Substanzen handeln, die potentielle Verwendung als Arzneimittel, insbesondere als Dermatika, finden sollen, oder um Substanzen, die Bestandteil von Kosmetika sind, oder auch um Konsumgüter, die mit der Haut in Berührung kommen, wie z.B. Waschmittel etc.
Das erfindungsgemäß hergestellte Hautäquivalent kann beispielsweise auch für Studien zur Resorption, zum Transport und/oder zur Penetration von Substanzen verwendet werden. Darüber hinaus eignet es sich auch zur Untersuchung anderer Agenzien (physikalische Größen), wie Licht oder Wärme, Radioaktivität, Schall, elektromagnetische Strahlung, elektrische Felder beispielsweise zur Untersuchung der Phototoxizität, also der schädigenden Wirkung von Licht unterschiedlicher Wellenlänge, auf Zellstrukturen. Das erfindungsgemäß hergestellte Hautäquivalent kann auch zur Untersuchung der Wundheilung eingesetzt werden. Es eignet sich auch zur Untersuchung der Wirkung von Gasen, Aerosolen, Rauch, Stäuben auf die Zellstrukturen bzw. den Stoffwechsel oder die Genexpression.
Die Wirkungen von Substanzen oder Agenzien auf menschliche Haut lassen sich beispielsweise anhand der Freisetzung von Stoffen, beispielsweise Cytokinen oder Mediatoren, durch Zellen des humanen oder tierischen Hautmodellsystems, sowie der Wirkungen auf Genexpression, Stoffwechsel, Proliferation, Differenzierung und Reorganisation dieser Zellen ermitteln. Unter Verwendung von Verfahren zur Quantifizierung der Zellschädigung, insbesondere unter Verwendung eines Vitalfarbstoffes, wie eines Tetrazoliumderivates, können beispielsweise cytotoxische Wirkungen auf Hautzellen nachgewiesen werden. Die Tests von Substanzen oder Agenzien an dem erfindungsgemäßen humanen Hautäquivalent können sowohl histologische Verfahren als auch immunologische und/oder molekularbiologische Verfahren umfassen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst daher Verfahren zur Untersuchung der Wirkung, insbesondere der pharmakologischen Wirkungen, von Substanzen oder Agenzien auf menschliche Haut unter Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten humanen Hautmodells, insbesondere eines Ganzhautmodells. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird dabei ein XTT-Tetrazoliumreduktionstest (EZ4U-Test) oder Alamar Blue (Resazurinreduktionstest, Fa. Promega) durchgeführt. EZ4U ist ein nicht-toxisches wasserlösliches gelbes Tetrazoliumsalz, das von lebenden Zellen zu intensiv gefärbten Formazanen reduziert werden kann. Die Reduktion erfordert intakte Mitochondrien und der Test kann daher zum Nachweis der Vitalität von Zellen eingesetzt werden. Erfindungsgemäß einsetzbare Vitalitätsassays, die auch auf der Basis von Tetrazoliumverbindungen ruhen, sind z.B. der MTT-, MTS- bzw. der WST-1-Test. Diese werden als Testkits u. a. von der Firma Roche angeboten. Der Nachweis der Vitalität der Zellen kann auch über die Freisetzung der Lactatdehydrogenase (LDH) aus Zellen mit geschädigter Zellmembran erfolgen. Mit Trypanblau können Zellen mit geschädigter Zellmembran selektiv angefärbt werden.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst ein Verfahren zur Untersuchung der Penetration von Substanzen, wobei sowohl ein erfindungsgemäß hergestelltes Dermisäquivalent als auch ein erfindungsgemäß hergestelltes Hautäquivalent mit den zu untersuchenden Substanzen behandelt werden und die bei beiden Systemen erhaltenen Ergebnisse miteinander verglichen werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Wirkungen chemischer Substanzen oder anderer Agenzien auf spezielle Hauttypen untersucht. Dabei werden Zellen definierter Hauttypen, beispielsweise Hauttypen mit wenig Pigmenten und/oder Hauttypen mit vielen Pigmenten, zur Etablierung erfindungsgemäßer Hautäquivalente eingesetzt und diese werden im Hinblick auf die Wirkung von Substanzen oder Agenzien getestet.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das erfindungsgemäß hergestellte Hautäquivalent als Modellsystem zu Untersuchungen von Hautkrankheiten und zur Entwicklung neuer Behandlungsmöglichkeiten für Hautleiden verwendet. Beispielsweise können Zellen von Patienten mit einer bestimmten genetisch bedingten oder erworbenen Hautkrankheit verwendet werden, um daraus patientenspezifische Hautmodellsysteme zu etablieren und daran die Wirksamkeit bestimmter Therapien und/oder Medikamente zu untersuchen und zu beurteilen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäß hergestellte Hautäquivalent mit Mikroorganismen, insbesondere pathogenen Mikroorganismen besiedelt werden. Insbesondere bevorzugt ist eine Besiedelung mit pathogenen oder parasitären, insbesondere auch humanpathogenen Mikroorganismen. Unter Mikroorganismen sind im erfindungsgemäßen Sinne insbesondere Pilze, Bakterien und Viren zu verstehen.
Bevorzugt sind die Mikroorganismen dabei ausgewählt aus Pilzen oder pathogenen und/oder parasitären Bakterien. Insbesondere bevorzugt sind als Pilze die Spezies der Gattung Candida, Malassezia und Trichophyton, insbesondere bevorzugt Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes und Malassezia furfur. Als pathogene und/oder parasitäre Bakterien sind insbesondere Staphylococcus aureus bevorzugt.
Mit einem solchermaßen besiedelten Hautäquivalent kann sowohl der Prozess der Besiedelung, insbesondere der Infektionsprozess, durch den Mikroorganismus selbst als auch die Antwort der Haut auf diese Besiedelung untersucht werden.
Weiterhin ist es mit einem solchen Hautäquivalent möglich, die Wirkung von vor, während oder nach der Besiedelung aufgebrachten Substanzen auf die Besiedelung selbst oder auf die Auswirkungen der Besiedelung auf das Hautäquivalent zu untersuchen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Epidermisäquivalentes verwendet. Dies gelingt, in dem man

a) aus kollagenhaltigem Gewebe schwer lösliches Kollagen gewinnt,
b) das schwer lösliche Kollagen mittels einer Mischvorrichtung in eine homogene Kollagensuspension überführt,
c) die Kollagensuspension lyophilisiert und so eine erste Matrix A erzeugt,
d) die erste Matrix A einer Vernetzung unterzieht und so eine zweite, mechanisch stabilisierte Matrix B erzeugt,
e) Keratinozyten auf die zweite Matrix B einsät und wachsen lässt und schließlich
f) die in und auf der Matrix B wachsenden Keratinozyten bis zur vollständigen Ausbildung des Epidermisäquivalentes weiter kultiviert,

In diesem Fall werden – anders als bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung des Ganzhautmodells – nur Keratinozyten auf die Matrix ausgesät, die als Gerüst bzw. Träger für das Epidermismodell fungiert, und unter solchen Bedingungen kultiviert, dass die Keratinozyten zunächst proliferieren und sich dann so differenzieren, dass eine aus allen 4 Schichten bestehende Epidermis gebildet wird. Die Matrix wird vorzugsweise mit Proteinen der extrazellulären Matrix bzw. der Basalmembran vorbehandelt, um eine bessere Adhäsion der Keratincoyten an das Matrixmaterial zu erreichen und um den Zellen die durch diese Proteine vermittelten Signale zu bieten. Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Proteine sind Kollagen IV bzw. Kollagene anderer Typen, Fibronectin und Laminin. Das so gebildete Epidermismodell ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung und kann wie das Vollhautmodell auch für vielseitige Tests eingesetzt werden.
Bevorzugte Zellkulturmedien sind DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), RPMI 1640, M199 und Ham's F12-Medium. Jedoch kann auch jedes andere beliebige Zellkulturmedium verwendet werden, welches die Kultivierung von Fibroblasten ermöglicht. Als Serum wird vorzugsweise fötales Kälberserum (FCS), aber auch NCS sowie Serumersatzprodukte verwendet und als Puffer zum Beispiel Hepes-Puffer. Der pH-Wert der Lösung aus Zellkulturmedium, Puffer und Serum beträgt in bevorzugter Ausführung 6,0 bis 8,0, beispielsweise 6,5 bis 7,5, insbesondere 7,0
Erfindungsgemäß kann das Medium weitere Faktoren, beispielsweise Hormone, Wachstumsfaktoren, Adhäsionsmittel, Antibiotika, Selektionsmittel, Enzyme und Enzyminhibitoren und ähnliche enthalten.
Zur Verbesserung des Keratinozytenwachstums im Epidermisäquivalent können dem Kulturmedium Faktoren zugefügt werden, die im Falle einer Kokultivierung von Fibroblasten und Keratinozyten von den Fibroblasten freigesetzt werden. Beispielsweise kann der konditionierte Kulturüberstand (d.h. der Mediumüberstand von kultivierten Fibroblasten und/oder Kokulturen von Fibroblasten mit anderen Zelltypen, wie z.B. Endothelzellen, Immunzellen oder Keratinozyten) verwendet werden.
Das Hautmodell kann genutzt werden, indem insbesondere zu testende Substanzen topisch auf die Oberfläche des HM appliziert werden. Die Expression von Oberflächenmarkern in den dendritischen Zellen kann dazu genutzt werden, die sensibilisierenden bzw. allergieauslösenden Eigenschaften der aufgetragenen Substanzen zu evaluieren.
Um die dendritischen Zellen zu untersuchen und ggf. eine Stimulierung, also den Kontakt mit einer sensibilisierenden Substanz, nachweisen zu können, werden die Zellen bevorzugt aus dem Hautmodell herausgelöst.
Für die Analyse der Epidermis von Vollhautmodellen und Epidermisäquivalenten inkubiert man diese bevorzugt mit Thermolysin, bis sich die Epidermis von der Dermis bzw. Matrix löst. Anschließend dissoziiert man die Epidermis durch mit Enzymen, bevorzugt proteolytischen Enzymen, z.B. Trypsin, bis der Gewebeverband in einzelne Zellen zerfällt.
Für die Analyse des Dermisäquivalents bzw. der Dermis des Vollhautmodells ist es bevorzugt, die Dermis mittels proteolytischer Enzyme aufzulösen, bevorzugt mit Kollagenasen, welche aus unterschiedlichsten Quellen gewonnen werden können. Danach können die Zellen einfach isoliert werden.
Die so gewonnenen Zellen können mit Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, nachgewiesen und untersucht werden.
Bevorzugt können sie spezifisch markiert und in einem Cell Sorter analysiert werden, z.B. mit der FACS Methode (fluorescence-activated cell sorting).
Mit den Zellen können weiterhin auch Genexpressionsanalysen mittels dem Fachmann bekannten PCR-Verfahren (z.B. auch Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) bzw. Real-time-RT-PCR) durchgeführt werden.
Die Zellen können weiterhin auch im intakten Hautmodell untersucht werden. Dazu kann beispielsweise die Anwesenheit der Zellen bzw. deren Differenzierungszustand beispielsweise mittels immunhistochemischer Verfahren, mikroskopischer, insbesondere elektronen- oder lichtmikroskopischer Verfahren, oder über in-situ- bzw. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmethoden nachgewiesen werden.
Insbesondere können Endpunkte dendritischer Zellen untersucht werden, die nach einer Aktivierung durch Kontakt mit sensibilisierenden Substanzen auftreten bzw. deren Expression reguliert, insbesondere stark reguliert.
Besonders bevorzugt werden folgenden Endpunkte, die nach Kontakt mit sensibilisierenden Substanzen auftreten untersucht: CD86 (B7.2), CD83 (HB15), CD54 (ICAM-1), DC-SIGN, Moleküle der MHC-Klassen 1 und/oder 2, HLA-DR; IL-1 beta und IL-8 Genexpression
Lösliche Stoffe, beispielsweise Chemo- oder Cytokine, insbesondere Interleukine, die durch den Kontakt mit sensibilisierenden Substanzen sezerniert werden, können darüber hinaus auch im umgebenden Kulturmedium durch dem Fachmann bekannte Methoden nachgewiesen werden, beispielsweise geeignet sind ELISA, RIA (radioactive immuno assay) oder EIA (enzyme immuno assay), HPLC, FPLC, GC-MS oder MALDI-TOF.
In den Vollhaut- bzw. Epidermisäquivalenten, insbesondere im Vollhautmodell, kann weiterhin untersucht werden, ob eine Migration der dendritischen Zellen aus der Epidermis heraus in die Dermis bzw. die Matrix oder in das umgebende Medium stattfindet (Migrationsassay) und insbesondere eine Reifung dieser Zellen beobachtbar ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Ablösung der Epidermis von einem Hautmodell, bevorzugt einem Epidermisäquivalent, besonders bevorzugt einem Ganzhautmodell, dadurch gekennzeichnet, dass die Epidermis des Hautmodells mit proteolytischen Enzymen, bevorzugt Thermolysin behandelt wird.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:
Beispiel 1:
Herstellung der Matrix A:
In ein 1000 ml Becherglas werden 700 ml vollentsalztes Wasser gegeben, das mit 875 μl konzentrierter Essigsäure (Eisessig) angesäuert wird. Mit Hilfe eines handelsüblichen Magnetrührers mit Rührfisch wird die Lösung gerührt. In die rotierende Wassersäule hinein werden 7,0 g Rindersehnenkollagen auf einmal eingerührt. Anschließend wird das Gemisch vom Rührer genommen und für 4 Stunden ohne Rühren bei Raumtemperatur belassen. Alle 30 Minuten wird der pH-Wert des Gemisches kontrolliert. Der pH sollte in einem Bereich zwischen pH 3,5 und 4 liegen. Ebenfalls alle 30 Minuten wird die Suspension für 1 Minute mit hoher Geschwindigkeit gerührt. Es muss darauf geachtet werden, dass dabei die Temperatur der Suspension nicht ansteigt. Schließlich wird die Suspension für 3 Minuten mit hoher Geschwindigkeit gerührt und hierdurch homogenisiert. Um eine Erwärmung durch den Homogenisationsprozess zu vermeiden, wird die Suspension auf Raumtemperatur gehalten. Man erhält eine milchig-trübe Kollagensuspension. Um evtl. vorhandene Luftblasen aus der Suspension zu entfernen, kann sie bei 400 UpM (= 24,73 g) für 1 Minute bei 20°C zentrifugiert werden (Hettich Universal 16 R, Rotordurchmesser 138 mm). Die Blasen entweichen dann ohne Schaumbildung.
Mit einem Dispenser wird die Suspension in die Vertiefungen einer Zellkulturplatte mit 24 Vertiefungen pipettiert. Die gefüllte Platte wird anschließend in die Hand genommen, leicht gekippt und nach allen Seiten gedreht, damit die Gellösung die Wand der Vertiefungen auch oberhalb der Matrixoberfläche benetzt. Durch diese Verfahrensweise wird die Haftung der Matrices in den Vertiefungen verbessert. Die so behandelten gefüllten Platten werden direkt in den Lyophilisator gestellt und im Gerät eingefroren.
Die in die Zellkulturplatten mit 24 Vertiefungen eingefüllte Kollagensuspension wird in einem Lyophilisator mit temperierbaren Stellflächen eingefroren und anschließend bei Unterdruck getrocknet.
Ausgehend von einer Temperatur der Gellösung von 20°C beträgt die Einfrierrate 18°C bis 23°C pro Stunde. Der gesamte Gefriertrocknungsprozess dauert ca. 20–27 Stunden.
Beispiel 2:
Vernetzung der Matrix A zur Herstellung der Matrix B
Um eine möglichst große und ebene Oberfläche der Hautmodelle zu erhalten, werden die Kollagenmatrices vor der Einsaat der Fibroblasten chemisch fixiert. Als Fixiermittel wird Glutaraldehyd (GA) eingesetzt: C₅H₈O₂, MG = 100,12.
Auf jede Matrix von 24 Matrices A in einer Zellkulturplatte mit 24 Kavitäten wird mit einer Pipette vorsichtig Glutaraldehydlösung gegeben. Die Lösung wird langsam am inneren Rand der Vertiefung herunterlaufen gelassen, um die Matrixoberfläche nicht zu beschädigen. Die Glutaraldehydlösung benötigt mehrere Minuten, um in das Innere der Kollagenschwämme einzudringen. Die zunehmende Durchtränkung macht sich in einer Farbänderung der Matrices von rein weiß zu grau bis fahlgelb bemerkbar. Anschließend wird der Deckel auf die Zellkulturplatten gesetzt und der Rand mit Parafilm luftdicht verschlossen, um eine Verdunstung der Lösung zu vermeiden. Die behandelten Platten werden lichtgeschützt bei Raumtemperatur für 24 Stunden gelagert.
Die Vernetzung der Matrices einschließlich Waschen und Äquilibrieren kann in einem Zeitraum von vorzugsweise 5 Tagen, jedoch mindestens 4 Tagen, durchgeführt werden.
Beispiel 3:
Isolierung von MoDC:
Monocytäre dendritische Zellen werden durch Kultivierung von PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) gewonnen. Ausgangsmaterial für die Isolierung von Monocyten ist ein Lymphozytenkonzentrat (Buffy Coat), welches man nach dem Abzentrifugieren von Vollblut erhält. Aus dem Lymphozytenkonzentrat lassen sich mittels Dichtegradienten-Zentrifugation oder CCE (countercurrent centrifugal elutriation) die monocytären Zellen des peripheren Blutes isolieren.
Die weitere Isolierung erfolgte nach der Methode aus Berger et al. (Journal of Immunological Methods, 298, 2005, S. 61–72). Eine alternative, ebenfalls anwendbare Methode ist in Nutt et al., Journal of Immunological Methods, 293, 2004, S. 215–218 beschrieben. Die Identität der Monocyten wird in einer FACS-Analyse überprüft.
Kultivierung von MoDC
Die isolierten Monocyten werden in RPMI 1640 mit 25 mM HEPES (Zusammensetzung: siehe Tabelle) bei 37°C in eine CO₂-Inkubator kultiviert. Die Differenzierung zu unreifen monocytären dendritischen Zellen erfolgt durch Zugabe von rekombinatem humanem GM-CSF und rekombinantem humanem IL-4 zum Kulturmedium. Kulturdauer 2–7 Tage.
Beispiel 4:
Differenzierung der Zellen
Nach Kultivierung in cytokin-supplementiertem Medium (s. Tabelle 8) kann der Oberflächenmarker CD86 (B7.2) mittels eines spezifischen Antikörpers über Durchflusszytometrie (Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS-Analyse) nachgewiesen werden.
Beispiel 5:
Herstellung eines Dermisäquivalents
Vor der Aussaat auf die vernetzten Collagen-Matrices werden Fibroblasten einer geeigneten Passage in Zellkulturflaschen mit Fibroblastenmedium vorkultiviert. Nach Erreichen der gewünschten Zelldichte wird das Kulturmedium abgesaugt. Die Zellen werden durch Zugabe einer Trypsinlösung in die Kulturflaschen vom Gefäßboden abgelöst, mit Kulturmedium gewaschen und abzentrifugiert. Nach Bestimmung der Zellzahl wird die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 – 6 × 10⁵ Fibroblasten/ml eingestellt.
Aus den Vertiefungen der Mikrotiterplatte, die die mit Fibroblastenmedium äquilibrierten Matrices enthalten, wird das Medium so weit abgesaugt, das die Matrices feucht bleiben. Auf die Oberfläche der Matrices wird jeweils 1 ml Fibroblastenmedium, enthaltend jeweils 1 – 6 × 10⁵ Fibroblasten, pipettiert, ohne die Oberfläche dabei zu verletzen. Nach Beendigung der Einsaat wird der Plattendeckel aufgesetzt und die Platte waagerecht in den Inkubator gestellt. Die Kultivierung der Fibroblasten auf der Matrix erfolgt bei 37° und 5 % v/v CO₂. Das Kulturmedium wird in regelmäßigen Intervallen gewechselt. Nach 2–4 Wochen ist das Dermismodell fertig entwickelt.
Beispiel 6:
Herstellung eines Vollhautmodells
Vor der Aussaat auf die vernetzten Collagen-Matrices werden Fibroblasten einer geeigneten Passage in Zellkulturflaschen mit Fibroblastenmedium vorkultiviert. Nach Erreichen der gewünschten Zelldichte wird das Kulturmedium abgesaugt. Die Zellen werden durch Zugabe einer Trypsinlösung (oder einer anderen zur Ablösung adhärenter Zellen geeigneten Lösung) in die Kulturflaschen vom Gefäßboden abgelöst, mit Fibroblastenmedium gewaschen und abzentrifugiert. Nach Bestimmung der Zellzahl wird die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 – 6 × 10⁵ Fibroblasten/ml eingestellt.
Aus den Vertiefungen der Mikrotiterplatte, die die mit Kulturmedium äquilibrierten Matrices enthalten, wird das Medium so weit abgesaugt, dass die Oberfläche der Matrices feucht bleibt. Auf die Oberfläche der Matrices wird jeweils 1 ml Fibroblastenmedium, enthaltend jeweils 1 – 6 × 10⁵ Fibroblasten, pipettiert, ohne die Oberfläche dabei zu verletzen. Nach Beendigung der Einsaat wird der Plattendeckel aufgesetzt und die Platte waagerecht in den Inkubator gestellt. Die Kultivierung der Fibroblasten auf der Matrix erfolgt bei 37° und 5 % CO₂. Das Kulturmedium wird in regelmäßigen Intervallen gewechselt.
Nach einer Kultivierungszeit der Fibroblasten von 2–4 Wochen werden die Keratinozyten auf das Dermismodell ausgesät. Dazu werden Keratinozyten einer geeigneten Passage in Zellkulturflaschen mit Keratinozytenmedium vorkultiviert. Nach Erreichen der gewünschten Zelldichte wird das Kulturmedium abgesaugt. Die Zellen werden durch Zugabe einer Trypsinlösung in die Kulturflaschen vom Gefäßboden abgelöst, mit Kulturmedium (Keratinozytenmedium) gewaschen und abzentrifugiert. Nach Bestimmung der Zellzahl wird die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 – 6 × 10⁵ Keratinozyten/ml eingestellt. Aus den Vertiefungen der Mikrotiterplatte, die die Dermisäquivalente enthalten, wird das Medium so weit abgesaugt, dass die Oberfläche der Dermisäquivalente feucht bleibt. Auf die Oberfläche der Dermismodelle wird jeweils 1 ml Keratinozytenmedium, enthaltend jeweils 1 – 6 × 10⁵ Keratinozyten, pipettiert, ohne die Oberfläche dabei zu verletzen. Nach Beendigung der Einsaat wird der Plattendeckel aufgesetzt und die Platte waagerecht in den Inkubator gestellt (Submerskultur). Die Kultivierung der Fibroblasten und Keratinozyten auf der Matrix erfolgt 3–7 Tage bei 37° und 5 % CO₂. Das Kulturmedium wird in regelmäßigen Intervallen gewechselt.
Nach Ablauf der 3–7-tägigen Submerskultur wird das Keratinozytenmedium aus den Vertiefungen abgesaugt. Die noch unfertigen Vollhautmodelle werden aus den Vertiefungen herausgeholt und auf Filterpapiere gesetzt. Die Filterpapiere liegen auf metallenen Abstandhaltern jeweils in einer Kulturgefäß. Nachdem die unfertigen Vollhautmodelle auf dem Filterpapier platziert sind, wird das Kulturgefäß mit Kulturmedium (Airlift-Medium; Air-Liquid-Interface-Medium; ALI-Medium) so weit gefüllt, dass das Medium den oberen Rand des Filterpapiers erreicht und sich um die Basis der Hautmodelle verteilt. Die Oberfläche der Hautmodelle wird nicht von Kulturmedium bedeckt (Airlift-Kultur oder Air-Liquid-Interface). In Abhängigkeit vom gewünschten Differenzierungsgrad werden die Hautmodelle 1–4 Wochen in der Air-Liquid-Interface belassen. Das Kulturmedium wird in regelmäßigen Intervallen gewechselt.
Beispiel 7:
Herstellung eines Hautmodells mit dendritischen Zellen:

Kokultivierung der dendritischen Zellen in das Vollhautmodell gemäß Beispiel 6:

a) Einsaat zusammen mit den Keratinocyten
Die THP-1-Zellsuspension wird zentrifugiert, das Pellet anschließend in Keratinocytenmedium resuspendiert. Die Zellzahl wird in einer Neubauer-Zählkammer nach Inkubation der Zellen mit TrypanBlau bestimmt. Die THP1-Zellen werden im Verhältnis 1:2 bis 1:10 mit den Keratinocyten gemischt. Bei einer Einsaat von 4·10⁵ Keratinocyten pro Hautmodell entspricht dies einer THP1-Zellzahl von 40.000 – 400.000 pro Hautmodell. Die Hautmodelle werden anschließend 2–7 Tage in Keratinocytenmedium submers kultiviert. Danach werden sie in die ALI-Phase (Air-Liquid-Interface-Phase) überführt und in ALI-Medium 7–21 Tage kultiviert.
b) Einsaat während der ALI-Phase
Die Keratinocyten (4·10⁵ Zellen pro Hautmodell) werden zunächst 2–7 Tage in Keratinocytenmedium submers kultiviert und anschließend in die ALI-Phase überführt. Nach 2 Tagen (1–5 Tage) werden die THP-1-Zellen im Verhältnis 1:2 bis 1:10 zu den Keratinocyten auf jene ausgesät. Die Weiterkultivierung erfolgt für 7–21 Tage in ALI-Medium.
c) Kokultivierung durch Mediumkontakt einer Kultur dendritischer Zellen mit dem Hautmodell
Es wird ein Vollhautmodell gemäß Beispiel 6 hergestellt. Das Vollhautmodell wird an der Air-Liquid-Interface, wie oben beschrieben, auf einem auf einem Kokulturinsert bzw. Abstandhalter auf einer porendurchsetzten Polymermembran kultiviert und mit dem darunter befindlichen Medium in Kontakt gebracht. In dem Kulturgefäß (insbesondere auf dem Boden der Kulturgefäß) befindet sich neben geeignetem Zellnährmedium (insbesondere nach Tabellen 3 oder 4) eine Kultur von THP-1 Zellen, die über das Medium in Kontakt mit dem Hautmodell stehen.
Auf die Oberfläche des Hautmodells, die nicht mit dem Medium in Kontakt kommt, können nun Substanzen aufgetragen werden, die auf eine sensibilisierende Wirkung getestet werden sollen. Durch die Penetration durch das Hautmodell werden die Substanzen analog dem natürlichen Vorgang ggf. modifiziert, bevor sie eine detektierbare Reaktion im Hautmodell und in der Kultur der dendritischen Zellen zeigen.
Auf die vorher beschriebenen Weisen a) bis c) erfolgt auch die Einsaat der MoDC, KG-1- und U937-Zellen auf die Hautmodelle. Die Anzuchtphase der einzelnen Zelllinien wird unter Verwendung des dafür besonders geeigneten Mediums (vgl. Tabelle 5 bis 8) durchgeführt.
Die Zellen der Zelllinien THP-1, KG-1 und U937 können sowohl im naiven wie auch im aktivierten Zustand in das Hautmodell eingebracht werden. Dazu wird jeweils das geeignete Medium für die Anzucht in Kulturflaschen (ohne bzw. mit Cytokinen, beispielsweise Tabellen 3 bis 7) ausgewählt.
Analog kann auch die Einsaat der dendritischen Zellen in das Dermisäquivalent gemäß Beispiel 5 und des analog zu Beispiel 5 mit Keratinozyten hergestellte Epidermisäquivalent erfolgen.
Beispiel 8:
Herstellung eines Epidermismodells mit dendritischen Zellen:

Kokultivierung der dendritischen Zellen in das Epidermismodell gemäß Beispiel 6:

d) Einsaat zusammen mit den Keratinocyten
Die KG-1-Zellsuspension wird zentrifugiert, das Pellet anschließend in Keratinocytenmedium resuspendiert. Die Zellzahl wird in einer Neubauer-Zählkammer nach Inkubation der Zellen mit TnpanBlau bestimmt. Die KG-1-Zellen werden im Verhältnis 1:2 bis 1:10 mit den Keratinocyten gemischt. Bei einer Einsaat von 4·10⁵ Keratinocyten pro Epidermismodell entspricht dies einer KG-1-Zellzahl von 40.000 – 400.000 pro Epidermismodell. Die Epidermismodelle werden anschließend 2–7 Tage in Keratinocytenmedium submers kultiviert.
Danach werden sie in die ALI-Phase (Air-Liquid-Interface-Phase) überführt und in ALI-Medium 7–21 Tage kultiviert.
e) Einsaat während der ALI-Phase
Die Keratinocyten (4·10⁵ Zellen pro Epidermismodell) werden zunächst 2–7 Tage in Keratinocytenmedium submers kultiviert und anschließend in die ALI-Phase überführt. Nach 2 Tagen (1–5 Tage) werden die KG-1-Zellen im Verhältnis 1:2 bis 1:10 zu den Keratinocyten auf jene ausgesät. Die Weiterkultivierung erfolgt für 7–21 Tage in ALI-Medium.
f) Kokultivierung durch Mediumkontakt einer Kultur dendritischer Zellen mit dem Epidermismodell
Es wird ein Epidermismodell gemäß Beispiel 6 hergestellt. Das Epidermismodell wird an der Air-Liquid-Interface, wie oben beschrieben, in einem Kokulturinsert auf einer porösen polymeren Membran mit dem darunter befindlichen Medium in Kontakt gebracht. In dem Kulturgefäß (insbesondere auf dem Boden des Kulturgefäßes) befindet sich neben geeignetem Zellnährmedium (insbesondere nach Tabellen 5 und 6 bzw. das für die jeweiligen Zellen geeignete Zellmedium nach Tabellen 3,4, 7 oder 8) eine Kultur von KG-1-Zellen, die über das Medium in Kontakt mit dem Hautmodell stehen.
Auf die Oberfläche des Epidermismodells, die nicht mit dem Medium in Kontakt kommt, können nun Substanzen aufgetragen werden, die auf eine sensibilisierende Wirkung getestet werden sollen. Durch die Penetration durch das Epidermismodell werden die Substanzen analog dem natürlichen Vorgang ggf. modifiziert, bevor sie eine detektierbare Reaktion im Epidermismodell und in der Kultur der dendritischen Zellen.
Auf die vorher beschriebenen Weisen a) bis c) erfolgt auch die Einsaat der MoDC, THP-1- und U937-Zellen auf die Epidermismodelle. Die Anzuchtphase der einzelnen Zelllinien wird unter Verwendung des dafür besonders geeigneten Mediums (vgl. Tabelle 3, 4, 7 bzw. 8) durchgeführt.
Die Zellen der Zelllinien THP-1, KG-1 und können sowohl im naiven wie auch im aktivierten Zustand in das Epidermismodell eingebracht werden. Dazu wird jeweils das geeignete Medium für die Anzucht in Kulturflaschen (ohne bzw. mit Cytokinen, beispielsweise Tabellen 3 bis 7) ausgewählt.
Beispiel 9:
Herstellung eines Dermismodells mit dendritischen Zellen:

Kokultivierung der dendritischen Zellen in das Dermismodell gemäß Beispiel 6:

g) Einsaat zusammen mit den Fibroblasten
Die U937-Zellsuspension wird zentrifugiert, das Pellet anschließend in Fibroblastenmedium resuspendiert. Die Zellzahl wird in einer Neubauer-Zählkammer nach Inkubation der Zellen mit TnpanBlau bestimmt. Die U937-Zellen werden im Verhältnis 1:2 bis 1:10 mit den Fibroblasten gemischt. Bei einer Einsaat von 4·10⁵ Fibroblasten pro Dermismodell entspricht dies einer U937-Zellzahl von 40.000 – 400.000 pro Dermismodell. Die Dermismodelle werden anschließend 7–28 Tage in Fibroblastenmedium submers kultiviert.
h) Einsaat während der Fibroblastenkultur
Die Fibroblasten (4·10⁵ Zellen pro Dermismodell) werden zunächst 2–7 Tage in Fibroblastenmedium submers kultiviert. Nach 2–7 Tagen werden die U937-Zellen im Verhältnis 1:2 bis 1:10 zu den Fibroblasten auf jene ausgesät. Die Weiterkultivierung erfolgt für 7–21 Tage Fibroblastenmedium.
i) Kokultivierung durch Mediumkontakt einer Kultur dendritischer Zellen mit dem Dermismodell
Es wird ein Dermismodell gemäß Beispiel 6 hergestellt. Das Dermismodell wird in einem Co-Kultur-Insert mit poröser polymerer Membran kultiviert und mit dem darunter befindlichen Medium in Kontakt gebracht. In der Multiwellschale (insbesondere auf dem Boden der Multiwellschale) befindet sich neben geeignetem Zellnährmedium (insbesondere nach Tabelle 8 oder das für die jeweiligen Zellen geeignete Zellmedium nach Tabellen 3 bis 7) eine Kultur von U937-Zellen, die über das Medium in Kontakt mit dem Dermismodell stehen.
Auf die Oberfläche des Dermismodells, die nicht mit dem Medium in Kontakt kommt, können nun Substanzen aufgetragen werden, die auf eine sensibilisierende Wirkung getestet werden sollen. Durch die Penetration durch das Dermismodell werden die Substanzen analog dem natürlichen Vorgang ggf. modifiziert, bevor sie eine detektierbare Reaktion im Dermismodell und in der Kultur der dendritischen Zellen zeigen.
Auf die vorher beschriebenen Weisen a) bis c) erfolgt auch die Einsaat der MoDC, THP-1- und KG-1-Zellen auf die Dermismodelle. Die Anzuchtphase der einzelnen Zelllinien wird unter Verwendung des dafür besonders geeigneten Mediums (vgl. Tabelle 3 bis 6, 8) durchgeführt.
Die Zellen der Zelllinien THP-1, KG-1 und U937 können sowohl im naiven wie auch im aktivierten Zustand in das Dermismodell eingebracht werden. Dazu wird jeweils das geeignete Medium für die Anzucht in Kulturflaschen (ohne bzw. mit Cytokinen, beispielsweise Tabellen 3 bis 7) ausgewählt.
Die Zusammensetzung der unterschiedlichen Kulturmedien finden sich in den folgenden Tabellen: Tabelle 1: Fibroblasten-Medium:
Tabelle 2: Keratinozyten-Medium:
Kultivierung von THP-1-Zellen: Tabelle 3: Kulturmedium THP-1 I ohne Cytokine:
Tabelle 4: Kulturmedium THP-1 II mit Cytokinen:
Kultivierung von KG-1-Zellen: Tabelle 5: Kulturmedium KG-1 I ohne Cytokine:
Tabelle 6: Kulturmedium KG-1 II mit Cytokinen:
Tabelle 7: Kulturmedium U937 I ohne Cytokine:
Tabelle 8: Kulturmedium von MoDC-Zellen:
Tabelle 9: Air-Liquid-Interface-Medium:
Beispiel 8:
Nachweis von Elastin im Vollhautmodell
Fertig ausdifferenzierte Vollhautmodelle mit dendritischen Zellen gemäß Beispiel 7 werden direkt aus der Air-Liquid-Interface entnommen, im Kryostaten eingefroren und geschnitten (Schnittdicke 7–9 μm). Die Schnitte werden für 10 Minuten in – 20°C kalten Aceton fixiert und anschließen mit TBS (TRIS-buffered saline) mehrmals gewaschen. Der anti-Elastin-Antikörper (rabbit; Fa. Novotec) wird 1:40 mit TBS verdünnt, auf die Schnitte aufgetropft und für 60 Minuten auf diesen belassen. Anschließend werden die Schnitte dreimal für jeweils 5 Minuten in TBS gewaschen. Als sekundärer Antikörper wird ein goat-anti-rabbit-Antikörper mit Alexa-Konjugat (Fa. Molecular Probes) in einer 1:20-Verdünnung eingesetzt. Um die hohe Eigenfluoreszenz der Collagenmatrix zu blockieren, wird die Verdünnung des sekundären Antikörpers in einer 0,1 % Evans Blue-Lösung angesetzt. Der sekundäre Antikörper wird auf die Schnitte aufgetropft und auf diesen für 60 Minuten belassen. Danach werden die Schnitte dreimal für jeweils 5 Minuten mit TBS gewaschen. Zum Schluss werden die antikörper-markierten Schnitte in DAKO Faramount Einbettmedium eingedeckelt. Als Negativ-Kontrolle werden Schnitte ohne den ersten Antikörper inkubiert.

Claims

Hautmodell, umfassend eine Kollagenmatrix und dendritischen Zellen.
Hautmodell gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kollagenmatrix vernetzt ist.
Hautmodell gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die dendritischen Zellen ausgewählt sind aus Zellen oder Zelllinien, gewonnen aus Tumoren des blutbildenden und/oder immunologischen Systems.
Hautmodell gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumoren ausgewählt sind aus myeloiden oder lymphoiden Tumoren.
Hautmodell gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die myeloiden Tumoren ausgewählt sind aus Tumoren mit der Bezeichnung human acute myeloid leukemia, human multiple myeloma, human acute myeloid (eosinophilic) leukemia, human multiple myeloma, human acute myeloid leukemia, myelomonocytic leukemia, human chronic myeloid leukemia in blast crisis, human multiple myeloma, human acute monocytic leukemia, human acute myelogenous leukemia, human histocytic lymphoma und human monocytic leukemia.
Hautmodell gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen aus myeloiden Tumoren ausgewählt sind aus Zellen der humanen Zelllinien KG-1 (DSMZ no. ACC 14), U937 (DSMZ no. ACC 5) und THP-1 (DSMZ no. ACC 16).
Hautmodell gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen aus lymphoiden Tumoren ausgewählt sind mit der Bezeichnung human plasma cell leukemia, human T cell leukemia, human T cell lymphoma, human B cell precursor leukemia, human B cell lymphoma, human chronic B cell leukemia, human T cell acute lymphoblastic leukemia, human histiocytic lymphoma und human Hodgkin lymphoma.
Hautmodell gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen ausgewählt sind aus monocyte derived dendritic cells (MoDC), Zellen aus Zelllinien, gewonnen aus Tumoren, bevorzugt ausgewählt aus Tumoren mit der Bezeichnung human acute myelogenous leukemia, human histocytic lymphoma, human monocytic leukemia, insbesondere den humanen Zelllinien KG-1 (DSMZ no. ACC 14), U937 (DSMZ no. ACC 5), THP-1 (DSMZ no. ACC 16) Mono Mac 6 (DSMZ no. ACC 124) oder Mono Mac 1 ((DSMZ no. ACC 252) oder MUTZ-3 (DSMZ no. ACC 295).
Hautmodell gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Monocyte derived dendritic Cells (MoDC) sowie insbesondere den humanen Zelllinien KG-1 (DSMZ no. ACC 14), U937 (DSMZ no. ACC 5) und THP-1 (DSMZ no. ACC 16).
Hautmodell gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen vor, während oder nach der Kokultivierung mit dem Hautmodell mit Chemokinen und/oder Cytokinen behandelt werden.
Hautmodell gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen vor, während oder nach der Kokultivierung mit dem Hautmodell mit Cytokinen behandelt werden, die ausgewählt sind aus GM-CSF (Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor), SCF (Stem Cell Factor), IL-4 (Interleukin 4), IL-13 (Interleukin 13), TGFβ (Transforming Growth Factor beta), insbesondere TGFβ1, oder TNF-α (Tumor Necrosis Factor alpha) und deren Mischungen, besonders bevorzugt aus IL-4 und GM-CSF sowie deren Mischungen.
Hautmodell gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kollagenmatrix Fibroblasten und/oder Keratinozyten enthält.
Hautmodell gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Vollhautäquivalent ist, bei dem Fibroblasten in der Matrix und Keratinozyten auf der Matrix enthalten sind.
Hautmodell gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Dermisäquivalent ist, bei dem Fibroblasten in der Matrix enthalten sind.
Hautmodell gemäß einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Epidermisäquivalent ist, bei dem Keratinozyten auf der Matrix enthalten sind.
Hautmodell nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es mit Mikroorganismen, insbesondere pathogenen Mikroorganismen besiedelt wird.
Hautmodell nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind aus Staphylococcus aureus sowie Spezies der Gattung Candida, Malassezia und Trichophyton.
Verfahren zur Herstellung eines Hautmodells, dadurch gekennzeichnet, dass man a. aus kollagenhaltigem Gewebe schwer lösliches Kollagen gewinnt, b. das schwer lösliche Kollagen mittels einer Mischvorrichtung in eine homogene Kollagensuspension überführt, c. die Kollagensuspension lyophilisiert und so eine erste Matrix A erzeugt, d. die erste Matrix A einer Vernetzung unterzieht und so eine zweite, mechanisch stabilisierte Matrix B erzeugt, e. Fibroblasten und/oder Keratinozyten (optional nacheinander) auf die zweite Matrix B einsät und wachsen lässt, f. die in und auf der Matrix B wachsenden Zellen bis zur vollständigen Ausbildung des dermalen und des epidermalen Teils des Ganzhautmodells weiter kultiviert, wobei man vor, während oder nach der Einsaat der Zellen in Schritt e. dendritische Zellen mit dem Hautmodell kokultiviert.
Verfahren nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Dermisäquivalentes, dadurch gekennzeichnet, dass man a. aus kollagenhaltigem Gewebe schwer lösliches Kollagen gewinnt, b. das schwer lösliche Kollagen mittels einer Mischvorrichtung in eine homogene Kollagensuspension überführt, c. die Kollagensuspension lyophilisiert und so eine erste Matrix A erzeugt, d. die erste Matrix A einer Vernetzung unterzieht und so eine zweite, mechanisch stabilisierte Matrix B erzeugt, e. Fibroblasten auf die zweite Matrix B einsät und wachsen lässt und schließlich f. die in und auf der Matrix B wachsenden Fibroblasten bis zur vollständigen Ausbildung des Dermisäquivalentes weiter kultiviert, wobei man vor, während oder nach der Einsaat der Zellen in Schritt e. dendritische Zellen mit dem Dermisäquivalent kokultiviert.
Verfahren nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Epidermisäquivalentes, dadurch gekennzeichnet, dass man a. aus kollagenhaltigem Gewebe schwer lösliches Kollagen gewinnt, b. das schwer lösliche Kollagen mittels einer Mischvorrichtung in eine homogene Kollagensuspension überführt, c. die Kollagensuspension lyophilisiert und so eine erste Matrix A erzeugt, d. die erste Matrix A einer Vernetzung unterzieht und so eine zweite, mechanisch stabilisierte Matrix B erzeugt, e. Keratinozyten auf die zweite Matrix B einsät und wachsen lässt und schließlich f. die in und auf der Matrix B wachsenden Keratinozyten bis zur vollständigen Ausbildung des Epidermisäquivalentes weiter kultiviert, wobei man vor, während oder nach der Einsaat der Keratinozyten in Schritt e dendritische Zellen mit dem Epidermisäquivalent kokultiviert.
Verfahren nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Ganzhautmodells, dadurch gekennzeichnet, dass man a. aus kollagenhaltigem Gewebe schwer lösliches Kollagen gewinnt, b. das schwer lösliche Kollagen mittels einer Mischvorrichtung in eine homogene Kollagensuspension überführt, c. die Kollagensuspension lyophilisiert und so eine erste Matrix A erzeugt, d. die erste Matrix A einer Vernetzung unterzieht und so eine zweite, mechanisch stabilisierte Matrix B erzeugt, e. Fibroblasten auf die zweite Matrix B einsät und wachsen lässt, f. Keratinozyten auf die zweite Matrix B einsät und wachsen lässt und schließlich g. die in und auf der Matrix B wachsenden Zellen bis zur vollständigen Ausbildung des dermalen und des epidermalen Teils des Ganzhautmodells weiter kultiviert, wobei man vor, während oder nach Einsaat der Zellen in Schritt e oder Schritt f dendritische Zellen mit dem Hautmodell kokultiviert.
Verfahren zur Herstellung eines Ganzhautmodells nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die dendritischen Zellen vor, während oder nach Einsaat der Keratinozyten in Schritt f mit dem Hautmodell kokultiviert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem schwer löslichen Kollagen um ein grobfaseriges Kollagen handelt, das im wässrigen Medium über mehrere Stunden hinweg keine sichtbare oder nur geringe Quellung oder Gelbildung zeigt, vorzugsweise um schwer lösliches Kollagen aus den Sehnen von Tieren, insbesondere von Säugetieren, bevorzugt von Pferden, Schweinen oder Rindern, ganz besonders bevorzugt aus den Achillessehnen von Rindern.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Lyophilisierungsprozeß in Schritt c) mit einer Abkühlrate von bis zu 50°C pro Stunde, insbesondere 5°C bis 40°C pro Stunde, vorzugsweise 10°C bis 30°C pro Stunde, besonders bevorzugt 15°C bis 25°C pro Stunde, ganz besonders bevorzugt von 18°C bis 23°C und noch stärker bevorzugt von 20°C bis 22°C pro Stunde durchgeführt wird.
Ganzhautmodell, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 24.
Ganzhautmodell nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass hauttypische Proteine, insbesondere Elastin, exprimiert werden.
Dermisäquivalent, erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 19.
Epidermisäquivalent, erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 20.
Verwendung eines Hautmodells gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, eines Ganzhautmodells gemäß den Ansprüchen 25 oder 26, eines Dermisäquivalentes gemäß 27 oder eines Epidermisäquivalentes gemäß Anspruch 28 zur Produktprüfung, insbesondere im Hinblick auf Wirksamkeit, unerwünschte Nebenwirkungen, Reiz-, Toxizitäts- und Entzündungswirkungen oder sensibilisierende bzw. allergieauslösende Wirkungen, oder Verträglichkeit von Substanzen.
Verfahren zur Ablösung der Epidermis von einem Hautmodell, bevorzugt einem Epidermisäquivalent, besonders bevorzugt einem Ganzhautmodell, dadurch gekennzeichnet, dass die Epidermis des Hautmodells mit proteolytischen Enzymen, bevorzugt Thermolysin, behandelt wird.