BRPI0817105B1 - Dispositivo microfluido para determinar o tempo de coagulação em um meio fluido, tal como sangue ou plasma, método para determinar o tempo de coagulação em um meio fluido, dispositivo coagulômetro, e método para a fabricação de um dispositivo microfluido - Google Patents

Description

(54) Título: DISPOSITIVO MICROFLUIDO PARA DETERMINAR O TEMPO DE COAGULAÇÃO EM UM MEIO FLUIDO, TAL COMO SANGUE OU PLASMA, MÉTODO PARA DETERMINAR O TEMPO DE COAGULAÇÃO EM UM MEIO FLUIDO, DISPOSITIVO COAGULÔMETRO, E MÉTODO PARA A FABRICAÇÃO DE UM DISPOSITIVO MICROFLUIDO (73) Titular: ILINE MICROSYSTEMS, S.L.. Endereço: Parque Tecnológico Miramón, Paseo Mikeletegi, 56-ED.B8 l^aPL„ Donostia, ESPANHA(ES), E-20009 (72) Inventor: INAKI SÁDABA CHAMPETIER DE RIBES; JUAN ANTONIO PEÓN EGUIGUREN

Prazo de Validade: 20 (vinte) anos contados a partir de 22/09/2008, observadas as condições legais

Expedida em: 03/04/2018

Assinado digitalmente por:

Júlio César Castelo Branco Reis Moreira

Diretor de Patente

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DISPOSITIVO MICROFLUIDO PARA DETERMINAR O TEMPO DE

COAGULAÇÃO EM UM MEIO FLUIDO, TAL COMO SANGUE OU PLASMA, MÉTODO PARA DETERMINAR O TEMPO DE COAGULAÇÃO EM UM MEIO FLUIDO, DISPOSITIVO COAGULÔMETRO, E MÉTODO PARA A FABRICAÇÃO DE UM DISPOSITIVO MICROFLUIDO

DESCRIÇÃO

Campo da Invenção

A invenção se refere a um dispositivo do tipo laboratório em uma placa (ou chip) (lab-on-a-chip, é um dispositivo integrado que reúne, sobre um substrato muito pequeno, uma ou várias funções de laboratório) , e a um método para se determinar o tempo de coagulação de um meio fluido, e, em particular, para se determinar o tempo de coagulação do sangue. A invenção se refere igualmente a um dispositivo de medição, tal como um coagulômetro, para ser usado em combinação com o laboratório em uma placa da invenção.

Fundamentos da invenção

Em indivíduos saudáveis, a viscosidade e a espessura do sangue são reguladas por um processo conhecido como hemostase. Este mecanismo impede a perda de sangue a partir do sistema vascular.

A coagulação do sangue é regulada por um processo complexo para impedir que ocorra qualquer sangramento no corpo. Coágulos adequados são formados através da interação de fatores de proteínas de coagulação, vasos sanguíneos e plaquetas. O processo

2/46 monitoramento terapêutico.

continua depois da cura, quando o coágulo sanguíneo é dissolvido.

Durante as primeiras etapas de formação do coágulo, as plaquetas se agregam, ao mesmo tempo em que é ativado um fenômeno conhecido como cascata do sangue. Neste processo, o fibrinogênio, uma proteína solúvel do plasma, é convertido para uma malha de fibrina ou coágulo do sangue insolúvel. Esta conversão é catalisada pela trombina, uma enzima de uma maneira geral presente no sangue na sua forma inativa, protrombina.

Os distúrbios do sangue decorrem de desequilíbrios na hemostase. Estes podem ser de uma origem genética, tal como na hemofilia ou doença de Von Willebrand; provocada por outras condições, tais como a síndrome de anticorpos antifosfolipídeos, a síndrome do intestino irritável ou câncer; ou adquiridos através de fatores extrínsecos: pacientes tomando anticoagulantes orais como tratamento ou profilaxia de distúrbios trombóticos, enfermidades cardíacas ou vasculares.

A terapia anticoagulante oral, tal como a warfarina, é amplamente usada e necessita frequente por causa do seu estreito índice A dosagem deverá ser ajustada periodicamente, a fim de evitar trombose ou risco de sangramento.

Para estes e outros pacientes com condições de predisposição conhecidas, tais como imobilidade,

3/46 obesidade, mediação, ou submetidos à cirurgia ou tratamento dentário, a disponibilidade de testes de confiança que lhes permitam monitorar regularmente a coagulação em suas casas representaria uma alternativa conveniente, rápida e econômica para os testes de coagulação clínicos atualmente disponíveis. Tais testes também podem ser empregados como um auxiliar preliminar no diagnóstico de distúrbios hemostáticos.

A análise de coagulação mais comumente empregada no Mundo é a chamada Relação Normalizada Internacional (INR). Esta relação é calculada através do Tempo de Protrombina (PT), que é o tempo decorrido desde a ativação pelo agente de coagulação até o início da coagulação do sangue. O agente de ativação é um fator de tecido ou tromboplastina e este mecanismo é chamado o caminho extrínseco. Por causa das diferenças entre diferentes lotes fator de tecido (ele é um biologicamente) , idealizou-se a INR para padronizar os resultados. A INR é a relação do tempo de protrombina de um paciente para o tempo médio de protrombina médio (MNPT) de pelo menos 20 pessoas normais saudáveis, elevado à potência do valor do índice de Sensibilidade internacional (ISI) para a amostra de controle usada. Cada fabricante dá um ISI para qualquer fator de tecido comercializado, indicando como a batelada particular de fator de tecido se compara a uma amostra padronizada de forma internacional.

e fabricantes do produto obtido

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Existe um segundo tipo de análise, porém usado menos comumente, que consiste de um mecanismo de coagulação análogo, através do caminho intrínseco, e é chamado o Tempo de Protrombina Parcial Ativado (APTT). Estas duas análises são referidas como os tempos de coagulação na presente invenção.

Tradicionalmente, na Europa, estas análises foram realizadas em laboratórios, onde é usualmente requerida a preparação da amostra de sangue antes da determinação do PT. Nos últimos anos vem ocorrendo uma tendência geral emergente no sentido de empregar dispositivos de Ponto de Cuidado (POC), ou similarmente denominados Teste Perto do Paciente (NPT), para serem usados diretamente pela enfermeira ou médico, ou de forma autônoma pelo paciente, e vem substituindo amplamente os métodos tradicionais.

Os métodos que foram desenvolvidos inicialmente e conhecidos na técnica requeriam a extração de volumes grandes ou exatos de sangue por flebotomia, tratamento subsequente do sangue antes da realização do teste e pessoal experiente para realizar o processo e interpretar os resultados. Em contraste, os coagulômetros de Ponto de Cuidado, também conhecidos como coagulômetros portáteis, requerem uma gota de sangue total extraída por perfuração do dedo e proporcionam resultados de INR imediatos.

pedido de patente WO 92/21028 descreve um método de detecção baseado em ferro magnetismo. O

5/46 dispositivo contém uma câmara de coagulação e uma câmara de controle, cada uma das quais é equipada com uma palheta de agitação, a qual gira em um campo magnético oscilatório. A rotação da palheta na câmara de coagulação retarda o início da coagulação do sangue e exerce resistência contra seu movimento. O tempo de coagulação é medido como o tempo em que o movimento relativo das palhetas de agitação nas câmaras é alterado.

Outros dispositivos, tais como aqueles descritos na patente US 5.110.727, contêm uma amostra de sangue com partículas metálicas dispersas pelo mesmo. Quando é aplicado um campo magnético oscilatório, é induzido um movimento para frente e para trás das partículas, que diminui quando o sangue é coagulado. A diminuição na velocidade é relacionada com o aumento de viscosidade da amostra de sangue ou pelo início da coagulação.

Os pedidos de patente WO 00/06761 e WO 02/48707

A2, ambos, descrevem um dispositivo equipado com eletrodos em contacto com uma amostra de sangue estacionária e medem, respectivamente, a variação na condutividade e corrente elétrica quando a viscosidade do sangue aumenta.

O pedido de patente WO 2004/059316 Al descreve um dispositivo descartável, de baixo custo, para determinar o tempo de coagulação do sangue. O dispositivo é equipado com um micro sensor, pelo menos

6/46 parcialmente em contacto com o fluido e mede a impedância e capacitância do sangue no canal quando o sangue é coagulado e pára de escoar.

Não obstante, altos custos de produção associados com estes dispositivos restringem o seu uso como unidades descartáveis.

Consequentemente, permanece uma necessidade quanto a chips de precisão descartáveis, de baixo custo, e métodos de detecção para determinação de tempo de coagulação POC e/ou NPT.

Houve um desenvolvimento no sentido de testes de detecção de menor dimensão, que requerem amostras de sangue total menores e não medidas, na escala do microlitro, devido aos avanços na ciência de materiais e nos métodos eletrônicos e óticos.

pedido de patente WO 2007/025559 Al expõe um dispositivo de várias camadas para a determinação de coagulação em uma amostra de plasma ou de sangue total, que compreende uma ou mais áreas de detecção, todas elas providas de pelo menos um reagente estimulador de coagulação.

pedido de patente US2007/0122849A1 expõe uma estrutura de ensaio de amostra em uma microplaqueta microfluida para análise quantitativa e detecção de analitos.

A patente EP 0394070 Bl descreve um dispositivo microfluido de um canal capilar, otimizado para determinação do APTT em uma amostra de sangue total, de

7/46 μΐ de volume e tempo de permanência de 200 s. O dispositivo usa como reagente uma mistura de um agente ativado para medições de tempo de tromboplastina parcial ativada e uma mistura de fosfolipídios. O método de detecção empregado através do trajeto capilar é visual ou ótico, tal como um LED, e determina o APTT quando o fluxo de sangue pára ao longo do dispositivo.

A US 6.900.021 descreve um dispositivo microfluido para conduzir estudos in vitro na reação e efeitos dos vários compostos nas células. O fluxo de fluido é controlado utilizando-se bombas, diferenças de pressão ou campos elétricos, e não por capilaridade no canal microfluido. Existem dois caminhos de fluxo de entrada que se cruzam e fundem com um caminho de fluxo principal para permitir que ocorra a reação. Portanto, o caminho de fluxo principal não compreende uma área que contém um reagente. Além disso, os reagentes não estão presentes na microplaqueta, mas são adicionados em diferentes pontos e tempos, com isto permitindo que a microplaqueta seja usada para diferentes ensaios de reação com diferentes reagentes.

Apesar destes desenvolvimentos, os coagulômetros de ponto de cuidado que são usados atualmente ainda apresentam importantes inconvenientes: - Muito embora a maior parte das microplaquetas ou tiras de teste usadas sejam descartáveis, elas incluem diversos componentes tais como meios para coletar a amostra de sangue, meios para medirem a

8/46 mudança na condutividade ou meios para medirem a mudança na viscosidade. A presença de componentes ativos tais como contactos eletroquímicos ou partículas oscilatórias na tira torna a produção da microplaqueta descartável complexa e dispendiosa. Além disso, a dimensão não pode ser reduzida sem comprometer a qualidade da tira.

- Muito embora tenham sido realizados avanços concernentes à quantidade da amostra de sangue necessária para o teste, o volume situa-se ainda na faixa de 10 μΐ no melhor dos casos, que é ainda inconveniente para o paciente. Isto contrasta desfavoravelmente, por exemplo, com a quantidade usada para outros testes, tais como medição de glicose, que pode ser realizada com precisão com uma amostra de sangue de 1 μΐ ou menos.

- As aparelhagens de detecção e medição que são usadas com as microplaquetas ou tiras de teste conhecidas são ainda muito complexas. Em alguns casos elas necessitam de meios adicionais para transportar ou movimentar a amostra de sangue, tais como campos magnéticos ou bombas. Em outros, o dispositivo necessita de vários meios de detecção: meios eletroquímicos ou magnéticos para medirem algumas mudanças de propriedades na amostra que requerem microplaquetas de calibragem, e meios de detecção adicionais para promoverem leitura de sistemas de controle de qualidade em

9/46 painel adicionais. Isto aumenta a complexidade e, portanto, o custo do dispositivo portátil.

Em vista destes inconvenientes, constitui um objetivo da presente invenção proporcionar um dispositivo microfluido aperfeiçoado e método para determinar o tempo de coagulação em um meio fluido, tal como sangue ou plasma, que envolve somente etapas mínimas, tem um baixo custo, e pode ser usado desta forma de uma maneira autônoma pelo paciente. Constitui um outro objetivo proporcionar um dispositivo de medição para ser usado com o dispositivo microfluido, tal como um coagulômetro, a fim de detectar e monitorar o tempo de coagulação da amostra e os controles de qualidade presentes no dispositivo microfluido, que é simples de manufaturar, é compacto e pode ser usado de forma autônoma pelo paciente.

Sumário da invenção

Em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um dispositivo microfluido de baixo custo para determinar o tempo de coagulação em um meio fluido tal como sangue ou plasma, de acordo com a reivindicação independente 1.

Em um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um dispositivo coagulômetro que compreende uma fenda para introduzir o dispositivo microfluido, meios para detectarem e/ou monitorarem pelo menos uma propriedade de um meio fluido e meios para processarem os dados distribuídos pelos ditos meios de detecção

10/46 e/ou monitoramento para a determinação do tempo de coagulação do dito fluido, de acordo com a reivindicação independente 19.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção proporciona um método para determinar o tempo de coagulação em um meio fluido, de acordo com a reivindicação independente 25.

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para manufaturar um dispositivo microfluido para determinar o tempo de coagulação em um meio fluido, de acordo com a reivindicação independente

26.

Concretizações favoráveis da invenção encontram-se definidas nas reivindicações dependentes.

Desta forma, a presente invenção proporciona dispositivo passivo microfluido aperfeiçoado de baixo custo de produção e de uso simples, o qual pode ser, portanto, descartável, para determinar o tempo de coagulação de um fluido. Além disso, o dispositivo microfluido (tira de teste), dispositivo de medição (coagulômetro) e método de acordo com a invenção, proporcionam meios precisos para determinarem o Tempo de Protrombina com uma amostra de sangue mínima, e desta maneira pode ser usado facilmente e de maneira autônoma por parte do paciente sem requerer flebotomia.

Estes e outros aspectos da invenção serão evidenciados e elucidados com referência às concretizações que se encontram descritas doravante.

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Descrição breve dos desenhos

A invenção será mais bem compreendida e seus numerosos objetivos e vantagens serão mais facilmente evidentes para aqueles versados na técnica pela referência aos desenhos anexos, em conjunto com o relatório anexo, nos quais:

A Figura 1 mostra uma vista em perspectiva explodida de uma concretização do dispositivo da presente invenção, mostrando as duas camadas separadamente.

A Figura 2 mostra uma vista de topo (parte esquerda da figura) e vista lateral (parte direita da figura) do dispositivo de acordo com a concretização da Figura 1.

A Figura 2A mostra uma vista de topo de outra concretização do dispositivo microfluido.

A Figura 3 mostra uma representação gráfica da superposição das posições de frente de fluxo nos canais de coagulação e controle.

A Figura 4 mostra uma representação gráfica da superposição das velocidades de frente de fluxo nos canais de coagulação e controle.

A Figura 5 mostra as posições de frente de fluxo esquemática antes da coagulação em uma concretização de acordo com a Figura 1.

A Figura 6 mostra as posições de frente de fluxo esquemáticas depois da coagulação concretização de acordo com a Figura 1.

em uma

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A Figura 7 mostra o coeficiente de absorção de sangue versus comprimento de onda.

A Figura 8 mostra o espectro de emissão de um

LED.

A Figura 9 mostra a curva de resposta de um fotodiodo otimizado para detectar os comprimentos de onda esverdeados.

A Figura 10 mostra a intensidade de corrente detectada versus tempo em duas microplaquetas de dimensões diferentes para os canais de coagulação e controle.

Figura 11 mostra as derivadas das curvas de intensidade de corrente da Figura 10.

A Figura 12 mostra a superposição de uma serpentina de uma concretização de acordo com a Figura 1 e um arranjo de CCD com dimensões de pixel 19xl9pm.

As Figuras 13 - 16 mostram gráficos das equações usadas para determinar o tempo de coagulação através de curvas teóricas.

A Figura 17 mostra dados típicos na etapa 3 a partir de testes de coagulação e tempos de coagulação reais conforme determinados seguindo-se o método teórico 1 ou 2.

Nas figuras, números de referência iguais referem-se a elementos assemelhados.

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção proporciona um dispositivo na forma de uma microplaqueta ou tira de teste

13/46 descartável, para determinar o tempo de coagulação de um fluido, tal como sangue e plasma, uma aparelhagem de medição para ser usada como um coagulômetro portátil com a tira de teste da invenção, e um método de determinação do tempo de coagulação utilizando-se o dispositivo microfluido da invenção.

Um coagulômetro portátil, na forma de um dispositivo de Ponto de Cuidado, consiste em uma tecnologia que segue quatro linhas principais de aperfeiçoamentos: redução de custo, redução de amostra de sangue, controle de qualidade e portabilidade aumentada. Todos estes quatro aspectos são especialmente importantes para propagar de forma econômica e segura o autoteste do paciente.

A presente invenção tem vantagens significativas com relação às tiras de teste portáteis

e coagulômetros de	acordo	com o estado	da técnica
atual:
Redução de	custo: a	microplaqueta	microfluida
descartável	é um	componente	extremamente

simples (passivo), manufaturado com tecnologias de produção e materiais de alto volume e baixo custo.

Redução de amostra de sangue: amostras de sangue bem abaixo de 5μ1 podem ser testadas através da tecnologia de microplaqueta microfluida com os necessários controles de qualidade e precisão

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Controle de qualidade: Um número de controles de qualidade na placa distintos pode ser integrado no dispositivo descartável da invenção e lido por um único meio de detecção. Além disso, o dispositivo permite o uso de plasmas calibrados como controle de qualidade externo.

Portabilidade aumentada: os sistemas de detecção são extremamente compactos, de baixo custo e podem ser embutidos em dispositivos portáteis finos.

A invenção é baseada no fato de que um canal microfluido apropriado permite o fluxo capilar da amostra fluida, tal como sangue ou plasma, permitindo que a posição ou a velocidade da frente de fluido seja monitorada com precisão com meios simples, de uma maneira passiva, sem contacto com o fluido de amostra. Alterações reológicas do fluido de amostra na iniciação da cascata de coagulação (quando a amostra faz contacto com o reagente de coagulação), e em particular alterações de viscosidade aparente no ponto final de coagulação, têm um efeito significativo nos parâmetros dinâmicos monitorados.

Estes parâmetros podem ser monitorados com os mesmos meios de detecção simples, e comparados seja com uma amostra de controle que não contém um reagente de coagulação, ou contém um reagente de controle diferente, ou alternativamente com um valor teórico

15/46 prognosticado.

Sem com isso se pretender ficar limitado pela teoria, os inventores acreditam que o sistema microfluido da invenção imita, de alguma maneira, a estrutura microcapilar dos vasos sanguíneos e a dinâmica do fluxo sanguíneo. Devido à complexidade e alta sensibilidade dos estágios de coagulação do sangue (iniciação, amplificação, propagação e formação do coágulo) é altamente favorável reproduzir tanto quanto possível o ambiente de hemostase in vivo. De acordo com um relatório publicado pela University of Chicago [Kastrup, C. J. Runyon, Μ. K. Shen, F. Ismagilov, R. F. Modular Chemical mechanism predicts spatiotemporal dynamics of initiation in the complex network of hemostasis, Department of Chemistry and Institute for Biophysical Dynamics, University of Chicago, Edited by George M. Whitesides, Harvard University.], um ambiente microfluido in vitro pode imitar o comportamento da coagulação do sangue verdadeira nos capilares humanos, que eles comprovam ser da maior importância para a determinação do tempo de coagulação.

Além disso, esta invenção permite a monitoramento contínua da dinâmica de fluxo de forma que alterações moleculares hemostáticas podem ser detectadas, proporcionando alta precisão e capacidade de reprodução. Em particular, a formação das primeiras fibrinas insolúveis tem um efeito mensurável nas propriedades reológicas devido à dimensão da estrutura

16/46 microcapilar.

Tal como ilustrado na Figura 1, de acordo com uma concretização o dispositivo microfluido da invenção é constituído por um conjunto de duas camadas que compreende um substrato plano inferior e uma camada de encontra-se cobertura

padronizado	um	sistema de
resultando	em	uma	série
conectados	por	uma	extremi'

No substrato inferior distribuição de canais ou condutos, ade por meios apropriados para uma área de introdução de amostra.

Os canais induzem o fluxo através de capilaridade. Aquele versado na técnica será capaz de ajustar a dimensão e forma do canal padronizado no substrato inferior para obter uma posição ou velocidade de fluxo que possa ser monitorada com exatidão. Para criar o fluxo capilar da amostra de fluido, é necessária no canal uma superfície hidrofílica, de maneira tal que seja induzida pressão negativa suficiente. Esta superfície hidrofílica pode estar presente no substrato inferior ou na camada de cobertura.

De acordo com uma concretização, o substrato inferior é feito de plástico. Se o plástico for hidrofóbico, a condição hidrofílica no canal tem de ser induzida por meios conhecidos daqueles versados na técnica, tais como tratamento químico, revestimento químico ou tratamento por plasma, para se obter a energia de superfície ou ângulo de contacto desejado.

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Em uma concretização preferida, a superfície hidrofílica é proporcionada pela camada de tampa que veda os canais microfluidos padronizados na camada inferior. De acordo com esta concretização, ou um material hidrofílico é selecionado como camada de tampa, ou então é um material que é submetido a um tratamento hidrofóbico tal como descrito anteriormente.

Alternativamente, em uma concretização preferida, as propriedades hidrofílicas são proporcionadas para a camada de topo pelo adesivo usado para ligar as duas camadas que formam a microplaqueta. Em tal caso, é importante que o revestimento adesivo selecionado não reaja com a amostra fluida ou interfira com a reação de coagulação.

Portanto, a camada de tampa pode consistir de películas de polímero adesivo de vários tipos, tais como vedações a quente e adesivos sensíveis à pressão. Podem ser empregadas formulações hidrofílicas com tensoativos adicionados dentro do adesivo. Preferem-se os adesivos duros para prevenir o bloqueio dos canais decorrente do escoamento de adesivo durante a etapa de vedação ou em decorrência de deslizamento.

As Figuras 2 e 2A mostram uma vista de topo de diferentes concretizações do dispositivo microfluido da invenção, sendo que o dito dispositivo compreende os componentes descritos em seguida.

Meios (1) para introdução de uma amostra de meio fluido, consistindo principalmente de um orifício

18/46 de entrada. Este orifício de entrada é acoplado a um canal capilar de distribuição (2) , seguido por uma bifurcação de canais (3) que divide o canal de distribuição (2) em uma primeira (6a) e uma segunda região (6b), que permitem que o meio fluído escoe ao longo de um comprimento das ditas regiões. Opcionalmente, o canal de distribuição contém um filtro de células (ilustrado somente na Figura 1).

Em uma concretização preferida, as ditas primeira (6a) e segunda (6b) regiões são dotadas de estruturas idênticas.

Cada uma das ditas regiões (6a, e 6b) compreende, na ordem a partir do canal de distribuição, primeiro uma área (5a, 5b) e pelo menos um canal microfluido, o qual será referido como a área de varredura (8) neste caso. A primeira área (5a) contém um primeiro reagente capaz de reagir com o dito meio fluido, e faz o canal microfluido na região (6a) funcionar como um canal de reação, enquanto a segunda área (5b) se encontra ou vazia ou contém um reagente diferente, de maneira que o canal microfluido na região (6b) funciona como um canal de controle. Preferencialmente, o dito primeiro reagente é capaz de iniciar a coagulação do dito meio fluido.

De acordo com outra concretização, mais de duas regiões encontram-se presentes na microplaqueta. Uma das regiões funciona como o canal de reação como explicado anteriormente, e as outras duas ou mais

19/46 constituem canais de controle.

Para controle de qualidade na placa, a amostra de sangue pode ser movida por ação capilar ao longo dos canais de controle onde as câmaras de reação têm compostos específicos que proporcionam tempos de coagulação conhecidos e fixos (ou faixa estreita). Por exemplo, dois tipos de tais controles podem ser incorporados, controle normalizado e controle anormal, para proporcionar referências inferiores e superiores para os tempos de coagulação.

Os canais de controle têm uma composição de reagente diferente do reagente que se encontra presente no canal de reação.

Portanto, de acordo com uma concretização, existe um canal de controle normalizado, o reagente presente no mesmo pode ser, por exemplo, pelo menos um fator de coagulação dependente de Vitamina K. Esses fatores de coagulação podem ser provenientes de um grupo de plasmas secos ou liofilizados de pacientes normais.

Em outra concretização, existe um canal de controle anormal, que compreende um inibidor de fator de coagulação tal como, heparinas, citratos, oxalatos, EDTA e assemelhados. Além disso, ele pode compreender os mesmos fatores de coagulação dependentes de Vitamina

K como no canal de controle normalizado.

que se segue são ilustrações de concretizações preferidas que descrevem o número de

20/46 regiões e a sua funcionalidade:

regiões: Um canal de reação para determinação de tempo de coagulação de amostra de sangue com relação a um canal de controle sem qualquer agente coagulante ou com um agente inibidor de coagulação.

regiões: Um canal de reação para determinação de tempo de coagulação de amostra de sangue através de curvas teóricas e um canal de controle que proporciona tempos de coagulação normalizados.

regiões: Um canal de reação para determinação de tempo de coagulação de amostra de sangue com relação a um canal de controle sem qualquer agente coagulante ou com um agente inibidor de coagulação. Além disso, outro canal de controle que proporciona tempos de coagulação normalizados.

regiões: Um canal de reação para determinação de tempo de coagulação de amostra de sangue através da comparação de curvas teóricas. Além disso, um canal de controle que proporciona tempos de coagulação normalizados e outro canal de controle que proporciona tempos de coagulação conhecidos anormalmente altos.

Todas estas concretizações e outras variantes que serão evidentes para a pessoa versada na técnica são abrangidas pela presente invenção.

No dispositivo da invenção, o fluxo é impulsionado somente pelas forças capilares e, assim, a

21/46 microplaqueta ou tira de teste constitui um dispositivo passivo sem qualquer necessidade de forças externas. As superfícies de canal hidrofílicas permitem que os meniscos de umedecimento se movimentem ao longo dos canais no sentido da pressão capilar negativa, enquanto o menisco de desumedecimento permanece no orifício de entrada. O fluxo é sustado nas válvulas de parada pela indução de uma superfície hidrofóbica ou pela delineação de uma abertura de canal adequada. Em uma concretização preferida, cada região (6a, 6b) contém meios (7) para ventilação, com maior preferência um orifício de ventilação, que também funciona como uma válvula de fechamento de fluxo. Muito embora ilustrados na extremidade de canal na Figura 2, os orifícios de ventilação (7) podem ficar localizados em outras posições ao longo dos canais microfluidos. Por exemplo, orifícios de ventilação de conexão (7) com obturadores de fluxo na saída das câmaras de reação permitem que velocidades de fluxo capilar até este ponto sejam maximizadas, conforme ilustrado na Figura 2A. Em outras concretizações, cada canal tem mais do que um orifício de ventilação (7), os orifícios de ventilação (7) permitem controlar e modular a velocidade e as propriedades de escoamento do fluido.

Pelo menos uma propriedade do meio fluido, preferencialmente a posição ou a velocidade frontal de fluido, é monitorada como as áreas de exploração de trânsito de meio fluido (8) da primeira (6a), segunda

22/46 (6b) e opcional terceira regiões. A comparação entre as ditas propriedades nas ditas diferentes regiões permite a detecção do momento em que ocorreu a reação na primeira região (6a) e a determinação do tempo de coagulação para a amostra de fluido. As regiões são preferencialmente canais capilares.

Os princípios operacionais deste dispositivo baseiam-se em microfluidos, para o que os princípios reguladores diferem radicaimente da teoria de fluxo convencional, devido ao escalonamento descendente do sistema.

Princípios Reguladores

O enchimento dinâmico sob comportamento Newtoniano de um conduto capilar de seção transversal constante pode ser determinado através da taxa de fluxo volumétrico Q, que depende da viscosidade η, da resistência de fluxo total R_fr, e da diferença de pressão ΔΡ, entre o menisco de umedecimento (frontal) e o menisco de desumedecimento (traseiro):

⁽

R-FR

Para um canal de comprimento L e de seção retangular A, largura a e profundidade b, a resistência ao

fluxo Rfr pode	ser expressa como:
	Ί < | _12^ 6b) L	-1 (2
Onde Rh é R - ab	o raio	hidráulico	e é definido como
2(a + b) ’

23/46

Para se determinar L=L(t), isto é, a posição frontal de fluxo contra tempo, é requerida a integração da equação (1) com tempo. Assim, L e a velocidade, calculada como a derivada de L com tempo, são expressas como:

2ΔΡ

7(0 = (3) dL

ΔΡ

5a

6b

Rí dt

2η t

Estas são as equações reguladoras de fluxo antes da coagulação, já que se supôs a viscosidade como sendo constante. Quando a coagulação é iniciada, a viscosidade é uma função de tempo, com um aumento exponencial, de forma tal que, de acordo com a equação (1), a relação de fluxo, que é linearmente inversa à viscosidade, sofrerá uma diminuição repentina. As curvas L(t) e os derivados ilustrados em outras seções foram determinados numericamente para viscosidade variável.

Com as equações (1) até (3), é possível produzir uma concepção preliminar dos comprimentos de canais necessários para permitir o fluxo permanente até aos tempos de coagulação mais altos. O volume constante V de um conduto de seção constante pode ser estimado como sendo:

V = a b L (t) (4)

Desta forma, o dispositivo deve ser projetado e

24/46 a dimensão dos canais selecionada de acordo com a relação (4) existente entre os parâmetros geométricos dos canais, a, b e L, do volume de amostra requerido e do tempo de coagulação máximo.

Determinação do tempo de coagulação através de curvas teóricas

De acordo com uma concretização da invenção, tirando-se vantagem da monitoramento continua de dinâmica de fluxo, o tempo de coagulação pode ser determinado ou controlado através de comparação da propriedade medida da amostra com o valor teórico prognosticado.

Uma vez que o comportamento dinâmico é perfeitamente prognosticado antes da coagulação, o tempo de coagulação pode ser determinado como o instante quando a curva de coagulação monitorada se desvia além de um limite particular em relação às curvas teóricas provenientes das equações (3). Umas poucas operações matemáticas podem ser aplicadas de forma que tal divergência dependa somente do comportamento dinâmico de fluxo qualitativo e não do quantitativo. Descrevem-se duas abordagens diferentes, porém análogas, como se seguem:

Método 1:

Etapa 1:

De acordo com equação (3) , para o comprimento capilar sob o comportamento Newtoniano, L(t) é uma função de tempo de potência. Partindo-se dos valores

25/46

L(t) e t extraídos do sistema de detecção, pode-se construir a seguinte curva:

L(t) = Kt°'⁵ (5)

A curva monitorada (canal de coagulação) e curva teórica são marcadas no gráfico ilustrado na Figura 13.

Etapa 2:

Aplicando-se logaritmos nos dois lados da expressão mencionada, obtém-se uma curva linear com inclinação de 0,5 (vide igualmente o gráfico da Figura 14) :

Log- L(t) = log K + 0,5 log t (6)

O termo quantitativo é log K e o qualitativo é 0,5 log

t.

Etapa 3:

Pela alteração da variável (u=log t) uma nova função Y=Y(u) pode ser definida, e a diferenciando da mesma com relação a u (vide igualmente o gráfico da Figura 15):

Y (u) = log K + 0,5 u (7) dY _ = 0,5 (8) du

Etapa 4:

Realiza-se a segunda diferenciação de Y com relação a u (Figura 16):

(9)

26/46

O decaimento do valor constante além de um limite predefinido em qualquer das curvas de velocidade dY d²Y (—) ou de aceleração (—-) determina o tempo de du du coagulação. As operações mencionadas anteriormente são a base matemática de um algoritmo que permite a determinação do tempo de coagulação através de apenas um canal de coagulação independente.

A microplaqueta microfluida da presente invenção é projetada de forma que o fluxo sanguíneo tenha um comportamento Newtoniano predominante antes da coagulação. O desvio em relação a este comportamento é somente devido ao efeito pseudoplástico, que pode aparecer nas taxas de fluxo baixas. Se isto ocorrer, o método ainda se aplica e funciona razoavelmente bem, porque esse efeito pseudoplástico é muito mais fraco do que o efeito de coagulação, e pode ser diferenciado nas curvas de aceleração.

Método 2:

Uma segunda abordagem matemática análoga para a determinação teórica do tempo de coagulação pode ser descrita sucintamente como se segue. Partindo-se dos mesmos dados brutos, dos valores L(t) e t obtidos na etapa 1, pode-se traçar a seguinte curva:

77a — (10)

Esta curva é proporcional à viscosidade (77) , tal como pode ser derivada da equação (3) . As etapas seguintes (2, 3 e 4) são aplicadas identicamente como

27/46 anteriormente (isto é, aplicação logarítmica, primeira derivada e segunda derivada), de forma que as curvas de velocidade e aceleração são traçadas.

Com base em dados de teste reais, os dois métodos aproximadamente dão o mesmo tempo de coagulação (PT). Um resultado surpreendente encontrado em praticamente todas as curvas monitoradas, tais como aquelas ilustradas no gráfico da Figura 17, foi um comportamento inicialmente inesperado que é contrário ao efeito de coagulação, vide as áreas realçadas nas duas curvas sob o termo inversão. Este efeito é na realidade uma diminuição de viscosidade transitória de cerca de 1 ou 2 segundos de duração que é sempre observado precisamente antes do tempo de coagulação. Este comportamento proporciona uma identificação mais fácil do tempo de coagulação quando o instante PT torna-se deste modo um ponto de inflexão evidente, seja um máximo no método 1 ou um mínimo no método 2. Muito embora a razão para este comportamento inesperado seja desconhecida, algumas evidências sugerem que isto possa ser devido à formação dos monômeros insolúveis de fibrina acoplados com o efeito de Fahraeus-Lindqvist, que reduz a viscosidade aparente antes da formação dos polímeros de fibrina.

Além da determinação do tempo de coagulação, a abordagem teórica descrita anteriormente também pode ser empregada para controle de qualidade pela correlação das curvas de teste com os prognósticos

28/46 teóricos. Sob um operador normal (isto é, nenhum uso impróprio do paciente) e condições corretas do dispositivo, o fluxo de amostra de sangue antes da coagulação deverá estar próximo do comportamento linear mencionado. Qualquer desvio significativo em relação a esse comportamento pode ser detectado e processado pelo sistema e processador de monitoramento de fluxo, proporcionando uma ordem de cancelamento de teste.

De acordo com uma concretização preferida o meio fluido é sangue, preferencialmente sangue total capilar proveniente de picada no dedo do paciente, e plasma calibrado com tempos de coagulação conhecidos pode ser usado para controle de qualidade externo. O reagente capaz de reagir com o dito meio fluido é um reagente de coagulação, com maior preferência um fator de tecido ou tromboplastina.

Neste caso, o dispositivo e método de acordo com a invenção são particularmente adequados para determinar o Tempo de Protrombina, ou seja, o tempo decorrido entre a ativação de coagulação e o início da coagulação.

O dispositivo pode ser projetado de acordo com valores de INR padrão; a faixa de INR mais alta recomendada é cerca de 8, o que também significa PT de cerca de 100 segundos. As dimensões requeridas para alcançar tal INR máximo estão ilustradas na Tabela 1. Tal como mencionado anteriormente, as dimensões requeridas e volumes totais V_t dos diferentes

29/46 traçados de condutos são regulados pela equação (3).

	a (mm)	b (mm)	L (mm)	Vt (pL)
Traçado microfluido	0,08	0,08	150	1,0
Traçado microfluido	0, 125	0, 125	250	3,9
Traçado intermediário	0,5	0,5	500	125
Traçado convencional	1	1	700	700

Tabela 1. Comprimentos e volumes totais Vt requeridos de diferentes traçados de condutos para alcançarem essa faixa de INR máxima (100 segundos).

Esta tabela demonstra que, simplesmente pela diminuição em escala do traçado fluido para a micro escala, a faixa de INR padrão pode ser alcançada somente com uma gota de sangue.

A forma e as dimensões dos canais de acordo com a presente invenção permitem a determinação do tempo de coagulação de uma amostra de sangue de não mais que 15 μΐ, e o volume total alocado quando todos os circuitos estão preenchidos é menor do que 10 μΐ, permitindo um volume remanescente dentro do orifício de entrada, necessário para fixar o menisco de desumedecimento no orifício de entrada. Os canais microfluidos permitem um fluxo contínuo, durável desde alguns segundos até mais de uma centena de segundos, permitindo a determinação de PT em torno de um longo período de tempo. Desta forma, a microplaqueta e método da invenção permitem a medição de tempos de coagulação e determinação de INR precisas, com pequenas quantidades de amostra de sangue, preferencialmente inferiores a 10 μΐ, com maior

30/46 preferência inferiores a 5 μΐ, e com maior preferência com cerca de 1 μΐ ou menos. Isto é muito importante para a conveniência do paciente.

O comprimento dos canais capilares (6a, 6b) deverá ser suficientemente longo para permitir a reação do reagente com o fluido a ser completado antes de o fluido frontal alcançar a extremidade do canal. De acordo com uma concretização preferida, os canais capilares (6a, 6b) encontram-se em uma configuração encurvada, com maior preferência tendo um percurso em forma de serpentina, a fim de reduzir ao mínimo a área do dispositivo, ao mesmo tempo em que se mantém o comprimento dos canais.

A seção transversal preferida dos canais é retangular devido a limitações de manufatura, permitindo uma geometria 2D pura, o que simplifica os processos de fabricação por molde. As dimensões específicas têm de ser calculadas cuidadosamente, uma vez que a dinâmica de fluxo e volume total empregado é muito sensível às dimensões de canais. Tal como ilustrado neste contexto, valores de dimensão bem acima de 100 pm requerem comprimentos de canal muito longos para permitir durações de fluxo até os tempos de coagulação mais altos, e são requeridos volumes de amostra de sangue mais altos. Com um traçado microfluido, ou em outras palavras, dimensões seccionais de canais de cerca de 100 pm ou menos, os comprimentos de canais podem ser reduzidos com

31/46 a dimensão

utilização de pouco	sangue.	. Adicionalmente, a dimensão
da microplaqueta e	o seu	custo também	são reduzidos
consideravelmente.
Preferencialmente,	os canais	de reação e

controle têm uma seção onde a=b. Neste caso, a e b estão preferencialmente entre 30 e 125 pm, com maior preferência entre 50 e 100 pm, e ainda com maior preferência de cerca de 80pm.

Também as dimensões da área que contém o reagente, preferencialmente uma célula de reação, devem ser apropriadas para permitir volume suficiente para distribuir o reagente em estado liquido. Além disso, o traçado tem de ser definido de forma que o tempo de difusão permita alcançar concentração de reagente suficiente a fim de elevar ao máximo o volume de sangue ativado. Isto pode ser alcançado maximizando a relação de superfície para volume dentro da câmara de reação. Preferencialmente, o traçado de câmara da pegada deverá ser circular para adaptação à forma distribuída da gota, com dimensões situadas entre 1 e 4 mm de diâmetro e altura entre 40 e 150 pm. Com maior preferência o diâmetro tem cerca de 1,5 mm e a altura tem cerca de 80 pm.

A dimensão de altura do canal de distribuição situa-se preferencialmente entre 150 pm e 350 pm, com maior preferência cerca de 250 pm.

O orifício de entrada de sangue é preferencialmente o intervalo ou espaço deixado entre

32/46 os substratos de tampa e de base na borda da microplaqueta, no canal de distribuição, e portanto pode ter a altura do dito canal de distribuição. O volume alocado ao canal de distribuição deverá ser ligeiramente maior do que o volume alocado na estrutura capilar subsequente, de forma tal que uma vez completamente preenchido o canal de distribuição com fluido ele não possa nunca ser esvaziado. Este volume define o requisito de volume de amostra de teste mínimo.

A fim de preencher os requisitos de construção e sujeições dimensionais, a taxa de fluxo Q pode ser modificada através da introdução de válvulas de controle de fluxo passivo pela modificação da seção dos canais microfluidos, por exemplo, pelo estreitamento de segmentos dos canais microfluidos ou pela introdução de canais microfluidos afilados.

Operação do dispositivo microfluido

A presente invenção requer a aplicação de uma amostra de sangue ou de plasma ao orifício de entrada, através do qual o sangue ou plasma entra no canal de distribuição de amostra, ao longo do qual a mesma amostra de sangue ou plasma é dividida em um canal de reação /coagulação e um ou mais canais de controle.

Em um tempo t_m antes da coagulação do sangue as posições frontais de fluxo nos canais podem ser representadas como se segue,

33/46

L'=L'(t_m) (11)

Em que L e L' são, respectivamente, as posições de coagulação e de controle. O tempo t = 0 é o instante em que o fluxo sai da célula de reação do canal de coagulação, uma vez que ele é o momento em que o fator de tecido ou tromboplastina foi solubilizado e os mecanismos de reação são iniciados.

Os fluxos divididos têm dinâmicas de movimento aproximadamente idênticas até a coagulação ser iniciada no canal de coagulação. Este instante, quando ocorre a primeira coagulação do sangue, é identificado como o Tempo de Protrombina, e induz um aumento repentino na viscosidade. Neste instante, a dinâmica de fluxo ao longo do canal de coagulação é desacelerada com relação ao(s) canal(is) de controle. Pela monitoramento continua (8) da posição frontal de fluxo como uma função de tempo, a derivada da posição com tempo, que pode ser referida como a velocidade frontal de fluxo, pode ser calculada.

Na Figura 3, está ilustrado como as posições frontais de fluxo nos dois canais e o Tempo de Protrombina podem ser identificados. Estas curvas foram calculadas numericamente com as seguintes suposições, onde as variáveis a, b, η e PT têm o significado indicado previamente neste contexto, e γ é a tensão de superfície do sangue:

34/46

Y (N/m)	0,05589	Ângulo de contacto	35
a (m)	0,000125	η (Pa.s)	0, 003
b (m)	0,000125	PT (s)	25

Tabela 2. Suposições para os cálculos numéricos.

Antes do PT a diferença entre os canais deverá ser mínima, somente afetada pelas condições ambientais não uniformes, tolerâncias de manufatura e ruído de detecção. O derivativo com curvas de tempo é preferido uma vez que ele é mais sensível às mudanças de viscosidade, que podem ser referidas como as velocidades frontais de fluxo. De uma maneira análoga em um tempo t_m antes do PT, as velocidades são monitoradas para coagulação (V) e o controle (V') será:

V = V(t_m)

V'=V'(t_m) (12)

Estas curvas estão ilustradas na Figura 4.

O PT pode ser determinado pela definição de um limite Δ adequado para a diferença entre as velocidades V(t_m)-V'(t_m) . Antes do PT, a viscosidade é constante e as posições e velocidades de frentes de fluxo têm diferenças mínimas conforme ilustrado esquematicamente na Figura 5.

Em um tempo t_p a diferença de velocidades acabou de ultrapassar o limite (vide Figura 6) e este instante é PT.

Meios de detecção

Para uma detecção ou monitoramento contínua do

35/46 movimento frontal de fluxo L=L(t) ou v=v(t) podem utilizar-se diferentes técnicas de detecção:

• Detecção através de fotodiodo • Detecção através de sensores óticos, tais como Charged-Coupled-Device Complementary Metal Oxide (CMOS).

(CCD) ou

Semiconductor

O coeficiente de absorção de sangue está marcado na Figura 7. Pode-se observar que ele absorve especialmente sob 4 00 nm, e também em torno do verde (530 nm).

Detecção através de fotodiodo

A serpentina é iluminada com um LED e a luz transmitida é detectada com o fotodiodo. À frente de fluxo em movimento aumenta linearmente a absorção e deste modo a intensidade detectada é correspondentemente reduzida. Com um amplificador de sinal é possível monitorar incrementos diminutos de posição de fluxo.

Em seguida, realizaram-se alguns cálculos para avaliar a viabilidade de tal esquema de monitoramento, utilizando-se componentes padrão de baixo custo.

Selecionaram-se um LED e um fotodiodo, ambos de baixo custo, a partir de distribuidores facilmente disponíveis.

O LED tem dimensão de 3 mm e emite dentro de um ângulo de 20°. A intensidade é de 15.000 mcd (dicroísmo circular magnético) = 0,0309 Watts/str (string), de

36/46 forma que, tomando-se o total de ângulo sólido de 20° (0,095 str) , a potência de emissão total alcança 0,00294.

O espectro de emissão do LED e a curva de resposta do fotodiodo, que é um de silício padrão, mas também otimizado para detector os comprimentos de onda verdes, pode ser ilustrado nas Figuras 8 e 9.

Sob estas suposições e ainda pela aquisição da área de varredura (8), dimensões de canais e a curva e L(t) efetiva a partir da Figura 3, pode-se obter o sinal de intensidade detectado pelo fotodiodo. Por razões de simplicidade, também se supôs que a microplaqueta é perfeitamente transparente e que não ocorrem quaisquer reflexos de Fresnel. 0 sinal de intensidade, marcado na Figura 10, também contém uma simulação de ruído aleatório de corrente escura de 20picoA, conforme especificado pelo fabricante. Esta curva corresponde a uma seção de canal de 250x250 pm.

Pelo cálculo da derivada do sinal de intensidade com tempo, pode obter-se um sinal proporcional à velocidade de fluxo, tal como ilustrado na Figura 11.

Com as duas marcações ilustradas (Figuras 10 and 11) demonstra-se que a monitoramento frontal de fluxo é viável, com uma sensibilidade suficientemente alta, tal como pode ser deduzido a partir do ruído insignificante que afeta as curvas. Além disso, a resposta de tempo do fotodiodo é muito alta, o que permite amostragem de frequência tão alta quanto 10MHz

37/4 6 e o próprio amplificador é limitado a lOKhz. Estes valores são ordens de grandeza além da frequência necessária para monitoramento de precisão, cerca de

20Hz.

Detecção através de sensores óticos

Com este esquema de detecção, o sistema emprega uma configuração assemelhada, mas com substituição do dispositivo de detecção. Neste caso empregam-se sensores CCD ou CMOS, de forma que a posição frontal de fluxo é obtida por processamento dos dados adquiridos depois do mapeamento de alta frequência da superfície de varredura.

O sistema de LED pode ser semelhante àquele definido no caso anterior. Sob um aspecto interessante, neste caso nenhuma sensibilidade elevada é requerida, uma vez que cada célula ou pixel dentro da CCD destina-se a detector a presença ou ausência de fluxo nesta posição. Tal como ilustrado na Figura 12, pela superposição da área efetiva de CCD de um padrão com a serpentina, a imagem mapeada permitirá a identificação da posição frontal de fluxo, com resolução e tempo de resposta suficientes (>lKHz).

Esta técnica requer processamento de dados de imagem, de forma que a partir de uma imagem borrada a posição de menisco pode ser identificada. Isto aumenta a complexidade do sistema de monitoramento. Entretanto, e em contraste com o esquema de detecção de fotodiodo, a sensibilidade de cada célula ou pixel é

38/46 menos rigorosa, o que neste sentido favorecerá o esquema de detecção de CCD.

A fim de aperfeiçoar a qualidade do sinal de detecção, meios óticos, tais como uma lente, podem ser integrados. Blocos rígidos comerciais, lente de integração e sensor encontram-se atualmente disponíveis sob custo muito baixo, tais como as câmaras em miniatura que são fornecidas à indústria móvel. Estes blocos medem apenas uns poucos milímetros e deste modo permitem a integração muito compacta e fina em sistemas portáteis, tais como o coagulômetro portátil.

O sinal detectado é processado pelo microprocessador com software embutido. Geram-se curvas de dados de fluxo dinâmico e os algoritmos são empregados para determinação de tempo de coagulação e também para vários controles de qualidade.

Tal como exposto anteriormente, a microplaqueta (tira de teste) e método da invenção têm outra vantagem significativa, em que os mesmos meios de detecção podem ser usados para monitorar fluxo de fluido de amostra e para preencher várias tarefas de controle de qualidade.

Quando o meio de detecção é proporcionado através de sistema de visão artificial, tal como sensor CCD/CMOS ou micro câmara, três controles de qualidade principais, usuais em tiras de coagulômetros, podem ser realizados processamento de imagem do campo de visão de tal sistema de visão:

teste para através do

39/46

Indicadores de condição de ambiente na placa para monitoramento de estabilidade: condições ambiente tais como temperatura e umidade podem ser monitoradas através de compostos sensíveis a cor para esses fatores. Os compostos selecionados sofrem uma mudança de cor irreversível quando submetidos a limites de temperatura e umidade, sinalizando uma microplaqueta deficiente. Eles podem ser adicionados diretamente nas câmaras de reação, no substrato de base ou na superfície de tampa, sob o campo de visão do detector. Para esta finalidade poderá ser usada uma combinação de diferentes compostos sensíveis. Exemplos de tais compostos como compostos sensíveis a temperatura: corantes Leuco, Oxazinas, lactona violeta cristal, fenolftaleína e assemelhados. Sais metálicos como compostos sensíveis à umidade: cloreto de cobalto, sulfato de cálcio e assemelhados. Compostos de N-óxido ou Nitroso como compostos sensíveis à temperatura e umidade.

Isto permitirá que o dispositivo de medição (tal como o coagulômetro portátil) informe ao paciente que a tira de teste não passou no controle de qualidade e deverá ser descartada.

Controle de qualidade externo: plasmas calibrados com tempos de coagulação conhecidos, disponíveis comercialmente para executarem calibragens de teste de INR e PT, podem ser usados como controle de qualidade externo, de forma que todo o sistema

40/46 coagulômetro portátil pode ser avaliado. Nesta concretização, o sistema de visão artificial é ajustado para permitir a detecção dos plasmas capazes de fluir. Muito embora o plasma seja um fluido aproximadamente transparente, alguma ajustagem do sistema de led de iluminação e processamento de imagem é requerida para rastrear efetivamente o fluxo de plasma, uma vez que o plasma em movimento é reconhecido como uma sombra cinza que avança ao longo de canais brilhantes.

Código de barras impresso: código impresso carregando entre outros dados de calibragem de informação relevantes, dados de rastreamento e dados de expiração. Códigos de matriz de dados padrão de dimensões de uns poucos milímetros usados nesta espécie de tiras de teste podem ser impressos na camada de tampa da microplaqueta ou sobre um rótulo transparente.

Os meios de detecção e/ou monitoramento adequados descritos anteriormente estão compreendidos em um dispositivo externo (coagulômetro) que compreende uma ranhura para receber o dispositivo microfluido da invenção e é projetado para cooperar com o dito dispositivo microfluido.

Adicionalmente, compreende meios para o dispositivo externo processamento dos dados distribuídos pelos meios de detecção e/ou monitoramento e produz uma saída de sinal em um meio de visualização.

Fabricação presente dispositivo microfluido pode ser

41/46 natureza hidrofóbica.

material fortemente facilmente manufaturado com tecnologias de replicação plástica e técnicas de montagem atuais. A montagem é formada por dois componentes vedados: o substrato inferior, onde as microestruturas são padronizadas e o substrato de topo ou tampa de cobertura, como ilustrada na Figura 1.

Os materiais adequados para o substrato inferior e para a camada de tampa do dispositivo são compreendidos por uma gama de materiais poliméricos, de termofixação e/ou termoplásticos que sejam dotados de boas propriedades óticas e boa estabilidade dimensional. Por exemplo, podem ser usados COC, PMMA, PC, PSU, SAN, PETG, PS e PP.

A maior parte dos materiais poliméricos são de Portanto, se for escolhido um hidrofóbico como substrato padronizado, será necessária uma etapa de produção subsequente para tornar algumas superfícies hidrofílicas, tal como explicado anteriormente. Por esta razão, são recomendados plásticos hidrofílicos ou pelo menos não hidrofóbicos (ângulo de contacto < 90°). Este é o caso para PMMA, Acetato de Celulose, PC, COC e PS, entre outros materiais bem conhecidos. Um material que é particularmente preferido é o PMMA, em vista do seu bom ângulo de contacto, propriedades óticas e estabilidade dimensional.

O substrato inferior pode ser facilmente replicado com uma gama de tecnologias atualmente

42/46 disponíveis, e com precisões muito altas, possibilitando tolerâncias baixas de micro execução. As técnicas atuais mais relevantes para a dita etapa de padronização são moldagem por micro injeção, gravação em relevo a quente e impressão por litografia maleável.

A etapa de vedação pode ser realizada com um número de técnicas amplamente conhecidas tais como ligação por compressão térmica, ligação adesiva, ligação ativada por plasma, ligação ultra-sônica, soldagem a laser e outras.

A tampa é preferencialmente uma película hidrofílica. Ela é preferencialmente transparente, para permitir monitoramento precisa do fluxo de fluido. Tal como exposto anteriormente, as películas hidrofílicas proporcionam meios de custo muito efetivo que possibilitam vedação e hidrofilização de canais, evitando a etapa de tratamento de superfície. Neste caso, a técnica de produção consiste de processos de laminação padrão, que podem requerer controle de pressão e temperatura. Outras técnicas de produção compreendem os processos de gravação em relevo ou prensagem.

Tal como descrito anteriormente, as câmaras de reação podem alocar um número de compostos de reagentes secos para vários propósitos. O composto principal é tromboplastina para iniciar a cascata de coagulação. Em decorrência das dimensões diminutas da câmara de reação, compostos de alto desempenho podem ser

43/46 adicionado sem aumentar de forma significativa o custo da produção.

Os recombinantes de tromboplastina humana têm propriedades extremamente úteis em termos de solubilização e sensibilização devido à sua pureza química. A propriedade precedente foi tradicionalmente aumentada pelo uso de aditivos específicos. Sob a concepção da presente invenção, uma fração de um microlitro de fator recombinante humano pode ser distribuída, mostrando excelentes resultados em termos de solubilização e de sensibilidade.

Um número de agentes adicionais desempenha uma função no funcionamento apropriado do reagente seco. Eles podem ser empregados não somente para solubilização rápida, mas também para parâmetros de difusão de controle, aperfeiçoamento de etapas de fabricação e estabilidade de reagente, ou para tratar com as seguintes questões:

a) Apreensão modulada do líquido dentro do reagente seco: polímeros simples, tais como hidróxipropil-celulose, poli(álcool vinílico), polietileno glicol e assemelhados.

b) Solubilização rápida, estabilizadores e redutores do processo de secagem: albumina, glutamato, sacarídeos, (tais como glicose, sacarose, trealose, e outros), e assemelhados.

c) Umectabilidade controlada: Triton, Macol, Tetronic, Silwet, Zonyl, Pluronic, e assemelhados.

44/46

d) Indicador de cor para monitorar estabilidade e para distribuir controle: corantes Leuco como compostos sensíveis à temperatura (Oxazinas, lactona violeta cristal, fenolftaleína e assemelhados). Sais metálicos como compostos sensíveis à umidade tais como cloreto de cobalto, sulfato de cálcio e assemelhados. Compostos de N-óxido ou Nitroso como compostos sensíveis à temperatura e umidade.

e) Intensificação de estabilidade de condições ambiente: Compostos de organomercúrio tais como Thimerosal e assemelhados.

f) Outros compostos para várias funcionalidades: Polibreno (agente anti-heparina) e tampões.

Os reagentes secos podem ser aplicados na câmara de reação ou alternativamente no substrato de cobertura, através de um número de técnicas amplamente conhecidas: distribuição de gotas líquidas, distribuição de gel, distribuição de jato, impressão

por tela,	revestimento	por	espátula,	pulverização
seletiva e	revestimento	por	película.	A etapa	de
distribuição	é seguida por	uma	etapa de secagem.
Preferencialmente,	o	reagente	seco	é

distribuído em um estado líquido na câmara de reação que forma uma gota que ocupa a maior parte da câmara que na secagem se torna uma camada fina de reagente seco.

Vantajosamente, tanto o método de manufatura quanto a microplaqueta (tira de teste) assim fabricada

45/46 são extremamente simples, não são necessários componentes embutidos, tais como eletrodos ou qualquer forma de estruturas de várias camadas. Naturalmente, as técnicas de manufatura apresentadas permitem produção de baixo custo, de maneira tal que podem produzir-se dispositivos descartáveis baratos.

A presente invenção, através de seu desenho microfluido, proporciona meios muito sensíveis e precisos para determinação de tempo de coagulação. O tempo de coagulação (tal como, o Tempo de Protrombina) se refere ao momento quando as moléculas de fibrina insolúveis começam a polimerizar-se, para mais tarde produzirem uma malha que forma o coágulo. A formação de polímeros de fibrina, tipicamente da ordem de uns poucos micrômetros, conduz a um aumento repentino na viscosidade aparente do sangue fluente, especialmente quando a seção transversal do canal se torna tão diminuta quanto o desenho microfluido atual. Em termos de precisão e sensibilidade, este dispositivo oferece as vantagens anteriormente mencionadas com relação aos dispositivos anteriores para determinação do tempo de coagulação.

Além disso, a combinação da microplaqueta com o dispositivo de medição da invenção proporciona vantagens combinadas. O uso de meios de detecção óticos permite combinar simultaneamente a detecção de mudanças de fluxo de fluido e diferentes controles de qualidade. Isto significa que o dispositivo de medição

46/46 portátil será menos complexo e mais compacto, utilizando-se componentes padrão. Com efeito, o dispositivo de medição pode ter a dimensão de um telefone móvel. Existe também um melhoramento significativo na precisão e sensibilidade em relação aos dispositivos anteriores, especialmente aqueles que são baseados no fluxo de sangue, já que a monitoramento de fluxo é realizada continuamente com uma amostragem de alta frequência. Desta maneira, o exato momento em que a formação de coágulo tem o primeiro efeito de desaceleração no fluxo sanguíneo pode ser determinado com precisão.

Como será reconhecido por aqueles versados na técnica, os conceitos inovadores descritos na presente invenção podem ser modificados e variados sobre uma ampla gama de aplicações.

Consequentemente, o escopo da matéria suscetível de ser patenteada não deverá ser limitado a qualquer um dos ensinamentos exemplificativos específicos discutidos, mas é, em vez disso, definido pelas reivindicações em anexo. Quaisquer símbolos de referência constantes das reivindicações não deverão ser considerados como limitativos do seu escopo.

1/8

Claims (29)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Dispositivo microfluido para determinar o tempo de coagulação em um meio fluido, tal como sangue ou plasma, o dito dispositivo compreendendo:

   - meios (1) para introduzirem uma amostra do dito meio fluido; acoplados a um canal capilar de distribuição (2);

   - uma primeira região (6a), acoplada com os ditos meios (1) para introduzir uma amostra, para permitir que o dito meio fluido escoe ao longo de uma extensão da dita primeira região;

   - uma primeira área (5a) no início da dita primeira região que contém um reagente capaz de reagir com o dito meio fluido;

   - uma segunda região (6b), também acoplada aos ditos meios (1) para introduzir uma amostra, para permitir que o dito meio fluido escoe ao longo de uma extensão da dita segunda região;

   - sendo que a dita segunda região (6b) não contém um reagente capaz de reagir com o dito meio fluido ou - sendo que existe uma segunda área (5b), no início da dita segunda região (6b), que contém um

   reagente capaz de reagir com o dito meio fluido, que é diferente do reagente da primeira área (5a);

   caracterizado pelo fato de que cada uma das ditas regiões (6a) e (6b) compreende, na ordem a partir do canal de distribuição (2), primeiramente, as áreas
2. 2/8 (5a) e (5b) e pelo menos um canal microfluido que constitui a área de varredura (8).

   2. Dispositivo microfluido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada uma das ditas regiões (6a, 6b) consiste em pelo menos um canal microfluido.
3. 3. Dispositivo microfluido de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os canais microfluidos (6a, 6b) são canais capilares, em que as superfícies dos ditos canais são hidrófilas e a capilaridade atua como a única força para movimentar o meio fluido.
4. 4. Dispositivo microfluido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que cada uma das ditas regiões contém meios (7) para ventilação.
5. 5. Dispositivo microfluido de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os ditos meios de ventilação consistem em um orifício de ventilação (7) que funciona como uma válvula de parada de fluxo.
6. 6. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a dita primeira área da dita primeira região consiste em uma célula de reação (5a) que contém um reagente capaz de iniciar a coagulação do dito meio fluido.
7. 7. Dispositivo microfluido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado

   3/8 pelo fato de que a dita segunda área da dita segunda região consiste em uma célula de reação (5b) que contém um reagente capaz de inibir a coagulação do dito meio fluido.
8. 8. Dispositivo microfluido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o dito dispositivo compreende ainda uma terceira região, também acoplada aos ditos meios (1) para introduzir uma amostra, para permitir ao dito meio fluido escoar ao longo de uma extensão da dita terceira região, em que no início da dita terceira região existe uma terceira área que contém um reagente capaz de reagir com o dito meio fluido que é diferente do reagente da primeira (5a) ou segunda (5b) áreas.
9. 9. Dispositivo microfluido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que os ditos meios para introduzirem uma amostra consistem em um orifício de entrada (1) acoplado às ditas primeira e segunda regiões (6a, 6b), e à dita terceira região, se presente, por meio de um canal de distribuição (2) seguido por uma bifurcação de canal (3) que divide (4) nas ditas primeira, segunda e, opcionalmente, terceira regiões.
10. 10. Dispositivo microfluido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que as ditas primeira, segunda e, opcionalmente, terceira regiões têm uma configuração encurvada.

    4/8
11. 11. Dispositivo microfluido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que as ditas primeira, segunda e, opcionalmente, terceira regiões (6a, 6b) consistem em canais dotados de um percurso em forma de serpentina.
12. 12. Dispositivo microfluido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que os canais têm uma seção transversal retangular.
13. 13. Dispositivo microfluido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que os canais consistem em uma combinação de segmentos de diferentes seções transversais.
14. 14. Dispositivo microfluido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o dito reagente na área (5a) ser a tromboplastina e o dito tempo de coagulação representa o tempo de protrombina.
15. 15. Dispositivo microfluido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a dita primeira região funciona como um canal de coagulação (6a) e a dita segunda região funciona como um canal de controle (6b) e sendo que cada uma das duas regiões tem estrutura idêntica.
16. 16. Dispositivo microfluido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a dita primeira região funciona como um canal de coagulação (6a) e as ditas segunda e

    5/8 terceira regiões funcionam como canais de controle, e sendo que cada uma das três regiões tem estrutura idêntica.
17. 17. Dispositivo microfluido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende ainda recursos óticos para controle de qualidade.
18. 18. Dispositivo coagulômetro, caracterizado por compreender:

    - uma ranhura para introduzir um dispositivo microfluido definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17;

    - meios óticos para detectarem e/ou monitorarem continuamente a posição da frente do dito meio fluido em cada uma das ditas regiões e/ou a sua velocidade; e

    - meios para processarem os dados liberados pelos ditos meios de detecção e/ou monitoramento e para determinarem o tempo de coagulação do dito meio fluido, sendo que os meios óticos também medem ou lêem os recursos de controle de qualidade no dispositivo microfluido.
19. 19. Dispositivo coagulômetro de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que os ditos meios de processamento incluem meios para comparar a dita propriedade ou propriedades em cada uma das duas ou três regiões.
20. 20. Dispositivo coagulômetro de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que

    6/8 os ditos meios de processamento incluem meios para detectarem o momento temporal em que a diferença entre a dita propriedade ou as ditas propriedades no primeiro canal (6a) e a dita propriedade ou as propriedades no segundo canal (6b) e/ou terceiro canal alcança um limite pré-estabelecido.
21. 21. Dispositivo coagulômetro de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pelo fato de que os ditos meios de detecção e/ou monitoramento incluem meios para iluminar cada uma das ditas regiões e meios para analisarem a luz transmitida ou refletida por cada uma das ditas regiões.
22. 22. Dispositivo coagulômetro de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que os ditos meios de iluminação compreendem pelo menos um LED e os ditos meios de análise compreendem pelo menos um sensor ótico.
23. 23. Dispositivo coagulômetro de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que os ditos meios de análise incluem pelo menos uma lente.
24. 24. Método para determinar o tempo de coaguiação em um meio fluido, como o sangue ou o plasma, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

    - introduzir uma amostra do dito meio fluido em um dispositivo microfluido, conforme definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, que tem uma primeira e uma segunda regiões (6a, 6b), onde ele é

    7/8 deixado escoar ao longo de uma extensão;

    - fornecer no início da dita primeira região (6a) na área (5a) um primeiro reagente (5a) capaz de reagir com o dito meio fluido;

    - fornecer na dita segunda região (6b) na área (5b), ou nenhum reagente, ou um segundo reagente (5b) diferente do primeiro reagente (5a) da dita primeira região (6a),

    - monitorar continuamente com meios óticos pelo menos uma propriedade do dito meio fluido na dita primeira região (6a) e na dita segunda região (6b); e

    - comparar pelo menos uma propriedade do dito meio fluido na dita primeira região (6a) com pelo menos a mesma propriedade do dito meio fluido na dita segunda região (6b) ou contra um valor teórico desta propriedade.
25. 25. Método para determinar o tempo de coagulação em um meio fluido, como o sangue ou o plasma, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a comparação de pelo menos a dita propriedade do dito meio fluido na dita primeira região é realizada contra pelo menos uma propriedade do dito meio fluido na dita segunda região (6b).
26. 26. Método para determinar o tempo de coagulação em um meio fluido, como o sangue ou o plasma, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a comparação de pelo menos a dita propriedade do dito meio fluido na dita primeira região

    8/8 é realizada contra um valor teórico para a dita propriedade.
27. 27. Método para determinar o tempo de coagulação em um meio fluido, como o sangue ou o plasma, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que inclui uma etapa de controle de qualidade que compreende correlacionar as ditas propriedades monitoradas com as curvas teóricas.
28. 28. Método para a fabricação de um dispositivo microfluido, definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, para determinar o tempo de coagulação em um meio fluido, como o sangue ou o plasma, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

    - fornecer um primeiro substrato;

    - padronizar no dito primeiro substrato uma microestrutura correspondente a um dispositivo microfluido, definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17;

    - fornecer um segundo substrato; e

    - vedar o dito segundo substrato no topo do dito primeiro substrato padronizado, de tal maneira que o dito segundo substrato funcione como uma tampa de cobertura.
29. 29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o dito segundo substrato é uma película hidrófila.

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