BR112014030835B1 - Composição contendo ácido nicotínico e/ou nicotinamida e/ou triptofano, e uso da mesma - Google Patents

Abstract

composição farmacêutica contendo ácido nicotínico e/ou nicotinamida e/ou triptofano, e seu uso. a presente invenção refere-se a uma nova composição farmacêutica que contém ácido nicotínico, nicotinamida, triptofano ou compostos relacionados para influenciar positivamente a microbiota intestinal. em certas modalidades, a composição farmacêutica é parcialmente ou totalmente liberada para o intestino delgado ou intestino grosso.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a uma nova composiçãofarmacêutica que contém ácido nicotínico e/ou nicotinamida e/ou tripto- fano para influenciar positivamente a microbiota intestinal, em que a composição farmacêutica é especificamente liberada (por exemplo, liberada seletivamente) no intestino delgado e/ou no intestino grosso. ANTECEDENTES

[002] Muitas doenças inflamatórias da parede intestinal são provocadas ou influenciadas por alterações na microbiota intestinal e/ou uma interação diminuída entre a microbiota intestinal e os intestinos. Tais inflamações intestinais ocorrem nos seres humanos, por exemplo, doenças inflamatórias do intestino (IBD), tal como a doença de Crohn ou colite ulcerosa, mas também em outros mamíferos (por exemplo, colite idiopática crônica em cães). Estas doenças são baseadas em processos imunológicos complexos que não são totalmente compreendidos. No entanto, alterações na, e interações prejudicadas da, microbiota intestinal também podem ser fatores causadores em uma série de outras doenças. Exemplos incluem doenças atópicas, como eczema atópico, condições alérgicas ou asma (ver, por exemplo, Bis- gaard et al. 2011, J. Allergy Clin. Immunol. 128:646; Iebba et a.l 2011, Dig. Dis. 29:531; Abrahamsson et al. 2012, J. Allergy Clin. Immunol. 129:434; Candela et al. 2012, BMC Microbiol. 12:95; Olszak et al. 2012, Science 336:489), bem como doenças metabólicas, com um componente inflamatório, como arteriosclerose com doenças cardíacas coronárias resultantes, obesidade ou diabetes (Ott et al. 2006, Circulation 113:929; Koren et al. 2011, PNAS 108 Suppl 1: 4592; para comentários ver César et al. 2010, J. Intern. Med. 268: 320; e Vrise et al. 2010, Diabetologia 53:606).

[003] Embora a relação entre a microbiota intestinal e várias doenças seja conhecida, não tem sido compreendido como influenciar a microbiota de uma maneira que tenha um impacto positivo em doenças associadas.

[004] O ácido nicotínico (niacina, vitamina B3), nicotinamida(amida do ácido nicotinico) e/ou L-triptofano foram usados para a terapia de doenças de deficiência a niacina (por exemplo, pelagra) ao longo de décadas. Sabe-se que a pelagra pode ser acompanhada por inflamação intestinal, que é melhorada após a administração de niaci- na, em que o princípio terapêutico é a eliminação da deficiência de vitamina causadora da inflamação intestinal (Segal et al. 1986, Int J. Colorectal Dis. 1: 238; e Clayton et al. 1991, Eur J. Pediatr. 150: 498).

[005] Sabe-se também que o ácido nicotínico tem um efeito depromoção da saúde em lipoproteínas de colesterol no sangue (relação de HDL/LDL e tamanho das vesículas de LDL; Wahlberg et al. 1990, J. Intern. Med. 228:151; Semente et al. 1993, Atherosclerosis 101:61; Elam et al. 2000, JAMA 284:1263; McKenney et al. 2001, Am J. Cardiol. 88: 270).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] O objetivo da presente invenção consiste em proporcionarnovas formas de tratamentos para a terapia e/ou a profilaxia de doenças em seres humanos e animais associadas com alterações na microbiota intestinal e/ou uma interação prejudicada entre a microbiota intestinal e os intestinos.

[007] De acordo com a invenção, o problema acima é resolvidopor uma composição farmacêutica que contém ácido nicotínico, a nico- tinamida, o triptofano ou outro composto descrito aqui, que se acredita influenciar positivamente a microbiota intestinal. Em modalidades preferidas, o ácido nicotínico e/ou a nicotinamida e/ou o triptofano são administrados para influenciar localmente a mucosa intestinal e a microbiota intestinal. Por exemplo, a substância ativa é formulada para ser administrada seletivamente no íleo terminal ou no cólon onde a microbiota intestinal a ser modificada está localizada. Outras substâncias ativas que podem ser convertidas em ácido nicotínico e/ou nicoti- namida e/ou triptofano em um organismo animal (por exemplo, um corpo humano) são também contempladas pela presente invenção.

[008] Por conseguinte, as composições farmacêuticas são fornecidas contendo ácido nicotínico (niacina, vitamina B3) e/ou nicotinami- da e/ou triptofano. Estas três substâncias atuam individualmente ou em combinação (combinação de duas ou três) umas com as outras de uma forma anti-inflamatória e/ou benéfica sobre a microbiota no intestino delgado e/ou no intestino grosso. A composição é adequada para administração oral com liberação controlada e/ou lenta do ingrediente ativo durante para eficácia local ou tópica específica no íleo terminal e/ou cólon. Exemplos de condições tratadas incluem a terapia ou a profilaxia de doenças inflamatórias do intestino delgado, doenças inflamatórias do intestino grosso, profilaxia de carcinoma do cólon, e terapia ou profilaxia de outras doenças que resultam de alterações na microbiota intestinal e/ou uma interação prejudicada entre a microbiota intestinal e os intestinos. A composição também é adequada para a administração (neo)retal no cólon ou bolsa para a terapia local e/ou tópica de doenças inflamatórias do intestino grosso ou bolsite.

[009] A invenção também inclui métodos de tratamento de umaou mais das doenças e condições descritas aqui com uma composição farmacêutica descrita aqui. Além disso, a invenção proporciona a utilização de uma composição farmacêutica descrita aqui na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma ou mais das doenças e condições descritas aqui.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0010] A Figura 1 mostra a prevenção da intensificação da coliteDSS em camundongos deficientes ACE-2 por nicotinamida ou triptofa- no. Coluna de cima: histopatologia do cólon (hematoxilina eosina colorida no dia 10 após a administração DSS; bar: 100 μm (a)), perda de peso em percentagem (b) e escore de diarreia (c) de camundongos ACE2-normais desafiados com DSS (ACE2+/y) e camundongos deficiente ACE2 (ACE2/y) que receberam veículo ou nicotinamida (NAM) na água de beber. A administração de NAM começou três dias antes da administração de DSS. Coluna inferior: histopatologia do cólon (hema- toxilina eosina no dia 7 após o desafio com DSS; bar: 100 μm (d)), perda de peso em percentagem (e) e danos das criptas do cólon (f) em camundongos ACE2-normais desafiados com DSS (ACE2+/y) e camundongos deficientes ACE2 (ACE2/y) que receberam dieta normal (controle) ou uma dieta de triptofano-dipeptídeo (Trp+).

[0011] Todos os valores são valores médios com o erro padrão de3-10 camundongos por grupo.*: P <0,05; ** Ou ##: P <0,01.

[0012] A Figura 2 mostra o desenvolvimento do índice de atividade da doença de Crohn (CDAI) em três pacientes da semana (sem) 0 a semana 4, enquanto administrando a nicotinamida (2 x 600 mg por dia).

[0013] A Figura 3 mostra os escores histológicos da mucosa docólon de camundongos desafiados com colite induzida por sulfato de sódio de dextrano (DSS) e tratados com nicotinamida (NAM) por gavage em água ou uma formulação de mini-comprimido de liberação controlada de NAM misturada na dieta ou ácido 5-aminosalicílico por gavagem como uma suspensão em metilcelulose a 0,5%.

[0014] A Figura 4 mostra os dados do índice de atividade da doença (DAI) de camundongos desafiados com colite induzida por sulfato de sódio de dextrano (DSS) e tratados com (1) nicotinamida (NAM) por gavagem em água, ou (2) grânulos de controle misturados na dieta, ou (3) uma formulação de grânulos de liberação controlada de NAM misturado na dieta em três doses, ou (4) uma formulação de grânulos de liberação controlada de ácido 5-aminossalicílico (grânulos 5-ASA) misturada na dieta. *, P <0,05 vs. grânulos de controle; **, P <0,01 versus grânulos de controle; *** P <0,001 vs grânulos de controle; ###, P <0,001 vs mesma dose de NAM em água.

[0015] A Figura 5 mostra o conteúdo da mieloperoxidase (MPO)de homogeneizados de tecido do cólon de camundongos desafiados com colite induzida por sulfato de sódio de dextrano (DSS) e tratados com (1) nicotinamida (NAM) por gavage em água, ou (2) grânulos de controle misturados na dieta, ou (3) uma formulação de grânulos de liberação controlada de NAM misturada na dieta em três doses, ou (4) uma formulação de grânulos de liberação controlada de ácido 5- aminossalicílico (grânulos 5-ASA) misturado na dieta. *, P <0,05 vs. grânulos de controle; ***, P <0.001 vs. grânulos de controle.

[0016] A Figura 6 mostra a abundância relativa dos principais filosbacterianos Bacteroides e Firmicutes em amostras de fezes de 5 a 8 camundongos por grupo, antes e depois de 12 dias de uma dieta deficiente de triptofano, ácido nicotínico ou nicotinamida (dieta livre de Trp/Nia/NAM). A dieta livre de Trp/Nia/NAM continha (1) grânulos de controle sem NAM ou ácido 5-aminossalicílico (5-ASA), (2) uma formulação de grânulos de liberação controlada de NAM misturada na dieta em três doses, ou (3) uma formulação de grânulos de liberação controlada de ácido 5-aminossalicílico (grânulos 5-ASA) misturada na dieta.

[0017] A Figura 7 mostra as análises percentuais de similaridade(SIMPER) da composição da microbiota em amostras de fezes de 5 a 8 camundongos por grupo, antes e depois de 12 dias de uma dieta deficiente de triptofano, ácido nicotínico ou nicotinamida (dieta livre de Trp/Nia/NAM). A dieta livre de Trp/Nia/NAM continha (1) grânulos de controle sem NAM ou ácido 5-aminossalicílico (5-ASA), ou (2) uma formulação de grânulos de liberação controlada de NAM misturada na dieta em três doses, ou (3) uma formulação de grânulos de liberação controlada de ácido 5-aminossalicílico (grânulos 5-ASA) misturada na dieta. A expansão de Bacteroidales não classificados e Bacteroidales do gênero Paraprevotella é visualizada pelas porções tracejadas das colunas.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0018] O núcleo da presente invenção é uma composição farmacêutica que compreende uma, duas ou mais substância(s) ativa(s) se-lecionadas de ácido nicotínico; nicotinamida; triptofano; um composto que se converte no corpo de um animal (por exemplo, um corpo humano) em ácido nicotínico, nicotinamida ou triptofano; nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD); nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP); um intermediário na biossíntese de NAD ou NADP; e um dipeptídeo de triptofano, para influenciar positivamente a microbiota intestinal, em que a composição farmacêutica é concebida para uma liberação lenta de modo que ela se libere (por exemplo, parcialmente liberar, liberar seletivamente) no intestino delgado inferior, no cólon, ou em ambos.

[0019] Os inventores constataram que o ácido nicotínico e/ou anicotinamida e/ou o triptofano tem um efeito anti-inflamatório por influenciar a microbiota intestinal (a totalidade de todos os microrganismos nos intestinos, em particular as bactérias), em que eles alteram o padrão de secreção de peptídeos antimicrobianos nos intestinos. A microbiota intestinal alterada após a administração de uma composição farmacêutica de acordo com a invenção tem um efeito de promoção da inflamação menor ou é anti-inflamatório, causando, assim, e/ou suportando uma clara redução nos sintomas de IBD, tais como a doença de Crohn ou colite ulcerativa, em seres humanos ou em outros mamíferos (por exemplo, colite idiopática crônica em cães). Além disso, foi demonstrado pela primeira vez aqui que as composições farmacêuticas que liberam, pelo menos, parte da sua substância ativa na área afetada do trato gastrointestinal tem melhor eficácia significativamente do que uma composição farmacêutica que é largamente absorvida antes de alcançar a área afetada.

[0020] Assim, tal como utilizado aqui, "influenciando positivamentea microbiota intestinal" se refere a provocar uma alteração na microbiota intestinal que tem um impacto positivo sobre a saúde, especialmente em uma ou mais das doenças e condições descritas aqui. Por exemplo, os impactos positivos estão associados com a redução do número de bactérias patogênicas, reduzindo a proporção de bactérias patogênicas às bactérias benéficas, aumentando a diversidade da microbiota, reduzindo a quantidade de inflamação que a microbiota induz nos intestinos, e, em parte ou completamente, revertendo alterações patológicas no enterotipo da microbiota (por exemplo, enterotipos associado com Bacteroides, Prevotella e Ruminococcus). As bactérias geralmente consideradas como patogênicas em doenças inflamatórias do intestino incluem, por exemplo, Enterobacteriaceae (por exemplo, Escherichia coli) com propriedades invasivas ou fatores de virulência, Desulfovibrio spp. e Fusobacterium spp produzindo sulfureto com propriedades invasivas. As bactérias geralmente consideradas como be-néficas incluem espécies dos gêneros Lactobacillus, Bifidobacterium e Faecalibacterium, como L. casei, L. plantarum e F. prausnitzii. Para uma visão mais recente da microbiota intestinal em doenças inflamatórias intestinais, ver Manichanh et al. 2012, Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9: 599.

[0021] Hashimoto et al. (Nature 2012, 487: 477), publicado depoisda data de prioridade deste pedido e cujos conteúdos são incorporados aqui por referência, proporcionam evidências adicionais em rela- ção à invenção descrita aqui. Hashimoto et al. demonstraram que a má absorção do triptofano em camundongos leva a um aumento significativo da severidade da colite induzida pelo sulfato de sódio dextrano (DSS) irritante. A suplementação dietética do triptofano ou nicotinami- da impediu esse aumento na colite. Hashimoto et al. demonstraram que o aumento da susceptibilidade à colite severa foi devido a uma microbiota intestinal alterada, que, quando transplantada para outros camundongos também aumentou a gravidade da colite nos receptores. A alteração prejudicial na microbiota intestinal foi devido a quantidades fortemente reduzidas de determinados peptídeos antimicrobianos (AMPs), especialmente alfa-defensinas, cuja expressão em células epiteliais do íleo terminal foi amplamente controlada por sinalização mTOR induzida por triptofano ou nicotinamida.

[0022] Porque a inflamação intestinal crônica aumenta fortementeo risco de desenvolvimento de carcinoma de cólon (para uma revisão ver, por exemplo, Ullman & Itzkowitz 2011, Gastroenterology 140: 1807), um uso de composição de acordo com a invenção é também a profilaxia de carcinoma do cólon no caso de uma inflamação intestinal crônica ou recorrente.

[0023] A intervenção terapêutica por estabelecimento ou restabelecimento de uma microbiota intestinal normal ou por suplementação de bactérias benéficas tem sido eficaz em diversos modelos de doenças e nas respectivas doenças humanas. Por exemplo, Olszak et al. (Science 2012, 336: 489) demonstraram recentemente que a acumulação patológica de células T assassinas naturais invariantes em órgãos doentes em modelos murinos livres de germes de IBD ou asma pode ser prevenida pela colonização de camundongos recém-nascidos com microbiota normal. Em diferentes doenças, estudos têm demonstrado efeitos benéficos de certos pré, pró ou simbióticos. Por exemplo, os lactobacilos podem reduzir os níveis de colesterol no sangue na obesidade, mas o mecanismo ainda não é totalmente claro (revisado por César et al. 2010, J. Intern. Med. 268:320). Nas doenças inflamatórias do intestino, alguns probióticos como VSL # 3 (uma mistura de Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus para- casei, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus e Streptococcus thermophilus) têm sido utilizados com sucesso em um número limitado de estudos clínicos. Parece que a suplementação de, pelo menos várias cepas de bactérias, é geralmente necessária para fornecer um benefício terapêutico significativo. Um exemplo recente de eficácia espetacular de uma intervenção bacteriana complexa é o sucesso do uso de transplantes de fezes contra Clostridium difficile (van Nood et al. 2013, New Engl. J. Med 368:407).

[0024] Como as alterações patológicas na microbiota intestinal podem também desempenhar um papel causal em inúmeras outras doenças provenientes de distúrbios atópicos, assim como em doenças metabólicas com um componente inflamatório, a terapia e/ou a profilaxia de tais doenças também está dentro do âmbito da invenção. Em particular, as seguintes doenças são exemplos de tais indicações:

[0025] - Pele: alergia, eczema atópico, psoríase;

[0026] - Pulmão: fibrose cística, asma, COPD;

[0027] - Vasos: doença cardíaca coronariana, arteriosclerose, ate-rosclerose;

[0028] - Sistema endócrino: diabetes, adiposidade.

[0029] O uso inventivo, específico, tópico de ácido nicotínico e/ounicotinamida e/ou triptofano (e substâncias ativas relacionadas) para influenciar localmente a mucosa intestinal e a microbiota intestinal, in-flamações intestinais, e a terapia direta da mucosa intestinal resultam das percepções descritas aqui para o papel anteriormente desconhecido e inesperado destes compostos. Este uso difere significativamen- te de usos convencionais das substâncias ativas, onde essas substâncias são absorvidas e supostamente agem sistemicamente. Em razão do seu novo efeito anti-inflamatório e/ou do seu efeito modificando a microbiota intestinal, o ácido nicotínico e/ou a nicotinamida e/ou o trip- tofano (e os outros compostos descritos aqui) são, portanto, adequados como substâncias ativas para o tratamento de doenças inflamatórias do intestino delgado e/ou do intestino grosso. Condições particulares incluem o tratamento de inflamações intestinais, a profilaxia do carcinoma do cólon, e a terapia ou a profilaxia de outras doenças que resultam de mudanças na microbiota intestinal e/ou uma interação prejudicada entre a microbiota intestinal e os intestinos. De preferência, estas substâncias ativas são utilizadas em uma formulação farmacológica que protege a maior quantidade possível da substância ativa de ser absorvida pelo organismo no intestino delgado superior e, em vez disso efetua uma liberação (por exemplo, liberação controlada e/ou liberação lenta) para o terminal íleo ou cólon em que a microbiota intestinal para ser modificada está localizada (por exemplo, a substância ativa é liberada seletivamente no íleo terminal e/ou no cólon).

[0030] Em particular, as substâncias ativas descritas aqui são, portanto, adequadas para serem utilizadas em medicamentos com liberação tópica (por exemplo, controlada e/ou de liberação lenta) para a terapia da doença de Crohn, colite ulcerativa, bolsite, outras doenças crônicas do intestino grosso ou inflamações do intestino grosso, colite de derivação fecal, enterite infecciosa, diarreia associada a antibióticos, tais como a diarreia associada a C. difficile, colite infecciosa, di- verticulite e inflamações que são formadas por irradiação, pelos antibióticos, pelos agentes quimioterapêuticos, por produtos farmacêuticos ou por produtos químicos, bem como para a profilaxia do carcinoma do cólon e para a terapia ou a profilaxia de outras doenças que resultam de alterações na microbiota intestinal e/ou interação prejudicada entre uma microbiota intestinal e os intestinos.

[0031] As substâncias reivindicadas são igualmente utilizáveis para a terapia ou a profilaxia de doenças com origem semelhante em ambos seres humanos e outros mamíferos, em particular em animais domésticos e úteis. Exemplos de tais animais são cães, gatos, cavalos, camelos ou vacas sem restrição objetiva.

[0032] As substâncias ativas, isto é, ácido nicotínico e/ou nicoti-namida e/ou triptofano, podem ser utilizadas em qualquer forma disponível no mercado, por exemplo, produzidas pela Merck KgaA. O tripto- fano pode ser usado como um único aminoácido ou dipeptídeo, por exemplo, como um dipeptídeo Gli-Trp.

[0033] Além do ácido nicotínico, da nicotinamida e do triptofano,outros compostos relacionados podem ser utilizados na invenção descrita aqui como substâncias ativas. Por exemplo, os compostos que se convertem em um destes agentes (por exemplo, por hidrólise, metabolismo) no organismo humano ou animal são adequados, tais como os ésteres do ácido nicotínico. Em adição, os intermediários na síntese de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) ou NAD fosfato (NADP), tal como N-formilquinurenina, L-quinurenina, 3-hidroxi-L-quinurenina, 3- hidroxiantranilato, 2-amino-3-carboximuconato semialdeído, quinolina- to e D-ribonucleotídeo beta-nicotinato, podem ser utilizados. Outros exemplos incluem NAD e NADP.

[0034] As composições farmacêuticas que contêm ácido nicotínicoe/ou nicotinamida e/ou triptofano (ou uma das outras substâncias descritas acima) podem ser administradas por via oral com uma liberação da substância ativa lenta ou também através de um modo retal de aplicação (por exemplo, enemas ou supositórios). O local de entrega da substância ativa é, de preferência, as porções inferiores do intestino delgado e/ou do cólon para inibir processos inflamatórios, e assim distingue-se fundamentalmente de modos de aplicações que - por exem- plo, para a terapia da pelagra - buscam a absorção máxima e o metabolismo no organismo e, assim, um efeito sistêmico. Além disso, o modo de administração de acordo com a invenção e a dose de acordo com a invenção minimizam a probabilidade da ocorrência de efeitos secundários, por exemplo, como descrito em ligação com a administração sistêmica do ácido nicotínico.

[0035] Tal como utilizado aqui, o "intestino delgado inferior" é asegunda metade do intestino delgado e o "íleo terminal" é a segunda metade do íleo.

[0036] A este respeito, a presente invenção também compreendepreparações de combinações, tais como as combinações de ácido ni- cotínico e/ou nicotinamida com ácido acetilsalicílico e/ou antagonistas D2da prostaglandina, tais como laropiprant, que reduzem os efeitos colaterais típicos do ácido nicotínico. A composição e a dosagem de tais combinações são conhecidas por um especialista na técnica. Além disso, a utilização de nicotinamida em vez de ácido nicotínico, que é o preferido de acordo com a invenção, minimiza a probabilidade da ocorrência de efeitos colaterais.

[0037] Para produzir formulações administradas por via oral deuma substância ativa que tem um efeito anti-inflamatório e/ou de modificação na microbiota intestinal no íleo terminal e/ou no cólon é, assim, vantajoso e inovador usar modos controlados e/ou lentos de liberação. Em contraste com modos convencionais (em alguns casos também lentos) de liberação para a suplementação ótima, por exemplo, no caso da pelagra, certas modalidades da presente invenção, parcialmente ou substancialmente, evitam uma absorção no estômago e nas porções superiores do intestino delgado.

[0038] A fim de tratar a doença de Crohn ou a colite ulcerativa,modos oral e/ou retal (por exemplo, enema) de aplicação são adequados. A fim de tratar a bolsite, no caso da colite ulcerativa, a aplicação retal (por exemplo, com enema) é a preferida. Ela também pode ser suportada por uma administração oral das formulações orais descritas acima, por exemplo, preparações de liberação lenta. Para a terapia sintomática de qualquer outra forma de colite, ambas as aplicações orais e retais podem ser escolhidas para a modificação terapêutica da microbiota intestinal. A aplicação oral é a preferida para a profilaxia do carcinoma do cólon, em particular no caso da colite ulcerativa, e para a terapia e/ou profilaxia de outras doenças que parcialmente ou substancialmente resultam de alterações na microbiota intestinal e/ou uma interação prejudicada entre a microbiota intestinal e os intestinos.

[0039] Para administração oral, as formas de dosagem particulares que controlam e/ou retardam a liberação da substância ativa devido aos galênicos especiais (chamada de formas de liberação controlada, liberação lenta ou liberação lenta) são particularmente adequados. Tais formas de dosagem podem ser comprimidos simples e também comprimidos revestidos, por exemplo, comprimidos de filme ou drá- geas. Os comprimidos são geralmente redondos ou biconvexos. As formas de comprimido oblongas, que permitem que o comprimido seja separado, também são possíveis. Além disso, grânulos, esferoides, pelotas ou microcápsulas são possíveis, que são enchidos em sachês ou cápsulas, se for o caso.

[0040] O termo "liberação lenta" se refere de preferência a umaformulação farmacêutica que libera os ingredientes ativos após um período de retardo. Em certas modalidades, o retardo é suficiente para pelo menos uma porção das substâncias ativas em uma formulação para liberação no intestino delgado inferior (por exemplo, o íleo terminal) e/ou cólon.

[0041] O termo "liberação controlada" se refere de preferência auma formulação farmacêutica ou ao seu componente que libera, ou entrega, um ou mais ingredientes ativos ao longo de um período de tempo prolongado. Em certas modalidades, o período de tempo é suficiente para pelo menos uma porção das substâncias ativas em uma formulação para liberação no intestino delgado inferior (por exemplo, o íleo terminal) e/ou cólon.

[0042] O retardo é vantajosamente conseguido, por exemplo, porrevestimentos que são resistentes ao suco gástrico e se dissolvem em função do pH, por meio de microcelulose e/ou de tecnologias multima- triz (MMX), utilizando diferentes matrizes de veículos, ou uma combinação destas técnicas. Exemplos incluem revestimentos de película que contêm polímeros acrílicos e/ou de metacrilatos em várias misturas de liberação controlada e/ou lenta. Por exemplo, a(s) substância(s) ativa(s) pode(m) estar contida(s) em uma matriz convencional de celulose ou gelatina microcristalina, ou com tecnologia MMX, que é revestida com um material, o qual proporciona a liberação lenta da(s) subs- tância(s) ativa(s). Prefere-se introduzir uma substância ativa em cápsulas de grande volume (por exemplo, gelatina com um conteúdo de 0,68 mL) que são revestidos por meio de métodos conhecidos. Agentes de revestimento adequados são ceras e polímeros insolúveis em água, tais como os polimetacrilatos (por exemplo, a carteira de produtos com o nome comercial de Eudragit®, em particular, Eudragit® S e Eudragit® L, Evonik Industries AG, Essen, Alemanha) e celuloses insolúveis em água (por exemplo, metilcelulose, etilcelulose). Se for o caso, os polímeros solúveis em água (por exemplo, polivinilpirrolido- na), celuloses solúveis em água (por exemplo, hidroxipropilmetil- celulose ou hidroxipropil-celulose), polissorbato 80, polietileno glicol (PEG), lactose ou manitol também podem estar contidos no material de revestimento.

[0043] Por exemplo, uma combinação de compostos de Eudragit®S e L (por exemplo, Eudragit® L/S 100) efetua uma liberação controlada das substâncias ativas de acordo com a invenção a um pH> 6,4, o que ocorre no íleo terminal. Outros usos de preparações e misturas de Eudragit® (compostos L, S, e R) também são concebíveis para o em- balamento de uma substância ativa, e, por conseguinte, uma utilização tópica em porções selecionadas de todo o trato gastrointestinal pode ser alcançada pela liberação controlada em certos valores de pH.

[0044] A composição farmacêutica também pode conter outrassubstâncias excipientes farmacêuticas, tais como aglutinantes, enchimentos, deslizantes, lubrificantes e agentes reguladores de fluxo. Os compostos de acordo com a invenção podem ser formulados, se for o caso, com as substâncias mais ativas e com excipientes convencionais em composições farmacêuticas, por exemplo, talco, goma arábica, lactose, amido, estearato de magnésio, manteiga de cacau, carre- adores aquosos e não aquosos, componentes lipídicos de origem animal ou vegetal, derivados de parafina, glicóis (em particular, polietileno glicol), vários plastificantes, dispersantes, emulsionantes e/ou conservantes.

[0045] A fim de produzir os enemas ou supositórios para aplicaçãoretal, as preparações de uma substância ativa podem ser dissolvidas em um solvente adequado e ser subsequentemente processadas em enemas ou supositórios de acordo com os métodos farmacêuticos conhecidos.

[0046] O teor de substância ativa na forma de dosagem finalizadavai de 1 a 3000 mg, de preferência 100 a 1000 mg, no caso da administração por via oral; os enemas e/ou supositórios podem conter uma quantidade de 10 mg a 5000 mg da substância ativa. Dependendo da intensidade e da gravidade da doença inflamatória, as formas de dosagem são administradas uma vez ou várias vezes ao dia ou em outro regime de dosagem para ser escolhido por um médico.

[0047] Tal como utilizados aqui, os termos "tratamento", "tratar" e"tratando" se referem a reverter, aliviar, retardar o surgimento de, ou inibição do progresso de uma doença ou desordem, ou um ou mais dos seus sintomas, como descrito aqui. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser administrado depois de um ou mais sintomas se desenvolveram. Em outras modalidades, o tratamento pode ser administrado na ausência de sintomas. Por exemplo, o tratamento pode ser administrado a um indivíduo susceptível antes do início dos sintomas (por exemplo, em função de uma história de sintomas e/ou em função de fatores genéticos ou outras susceptibilidades). O tratamento também pode ser continuado após o desaparecimento dos sintomas, por exemplo, para prevenir ou retardar a sua recorrência.

[0048] Tal como utilizados aqui, os termos "profilaxia" e "prevenir"se referem a retardar o surgimento de uma doença ou reduzir a probabilidade de desenvolver uma doença ou desordem ou de um ou mais dos seus sintomas, em comparação com uma população de controle não tratada.

[0049] Outro aspecto da invenção descrito aqui é a utilização eficaz dos medicamentos reivindicados na base de dados genéticos e/ou microbiológicos e as necessidades específicas de cada indivíduo a ser tratado. Novos insights sobre a predisposição genética dos indivíduos para todos os tipos de doenças (em particular também doenças onde a interação entre a microbiota intestinal e os intestinos é prejudicada) e na farmacogenética indicam que uma medicina personalizada baseada em evidências, incluindo análises genéticas de genes de risco relevantes e também de genes que codificam, por exemplo, os receptores da superfície celular, as proteínas de transporte, as enzimas do metabolismo ou as proteínas de transdução de sinal, as quais interagem com o medicamento e/ou seus metabolitos e/ou seus efetores a jusante, podem contribuir com informação e melhorias no que diz respeito ao tipo de utilização, o modo de aplicação, o(s) tempo(s) de utilização, a dose e/ou o regime de dosagem dos medicamentos descritos aqui. Os indivíduos que podem se beneficiar deste tratamento personalizado incluem aqueles com triptofano sérico reduzido, expressão alterada de B0AT1 (por exemplo, em células epiteliais do intestino) e polimorfismos B0AT1. Isto se aplica analogamente à análise da microbiota intestinal, particularmente quando uma amostra de fezes indica uma mudança na microbiota. A presente invenção também compreende, portanto, a utilização de métodos de ensaio genético e/ou microbiológico adequados para identificar indivíduos particularmente sensíveis aos medicamentos de acordo com a invenção e/ou adaptar o uso de medicamentos de acordo com a invenção para as circunstâncias individuais. Isto também compreende expressar a utilização de diferentes substâncias (ácido nicotínico e/ou nicotinamida e/ou triptofano) em diferentes modos de administração dependendo das propriedades microbiológicas e genéticas do indivíduo. Para estes fins, é possível a utilização de testes de laboratório e/ou kits de teste adequados e também métodos de medição, dispositivos e/ou kits a serem empregados por um médico, usuário e/ou paciente, por exemplo, para tirar amostras de fezes ou analisar parâmetros adequados no sangue, na urina ou em outros fluidos corporais.

EXEMPLOS

[0050] Existem possibilidades variáveis para desenvolver vantajosamente, e desenvolver ainda mais, o ensino da presente invenção. Para este propósito, é feita referência aos exemplos abaixo que descrevem a invenção de uma forma representativa.

Exemplo 1:

[0051] Novidades e achados não publicados no momento que opedido de prioridade foi depositado, uma vez publicado como Hashimoto et al. (Nature 2012, 487: 477), suportam os ensinamentos da presente invenção e são brevemente descritos aqui com o propósito de ilustração: sabe-se que a expressão do transportador de aminoáci- dos neutros B0AT1 (que transportam o triptofano) sobre a superfície de células epiteliais do intestino está ligada à presença da enzima conversora da angiotensina 2 (ACE2) (Kowalczuk et al. 2008, FASEB J. 22:2880; Camargo et al. 2009, Gastroenterology 136:872.). Os resultados defeituosos da ACE2 em uma doença de deficiência de aminoá- cidos (a chamada doença de Hartnup), cujo padrão de doença é semelhante à pelagra e que pode ser tratada por um aumento do fornecimento de triptofano e nicotinamida. Um modelo de camundongo já mostrou que camundongos sem o funcionamento do ACE2 (genótipo: Ace2-/y) sofriam de inflamações intestinais induzidas artificialmente substancialmente mais forte do que os camundongos com genótipo normal (Ace2 +/y), quando eles receberam a substância sulfato de sódio dextrano (DSS). Curiosamente, foi possível reduzir este efeito pela administração profilática e permanente de nicotinamida (NAM) ou por dipeptídeos de triptofano alimentados (que são absorvidos através de um transportador que não o B0AT1, que não está disponível no presente documento) para o valor de camundongos geneticamente normais. Os dados de acompanhamento são resumidos na Figura 1 e suportam, no que diz respeito ao conteúdo, os resultados e as reivindicações da presente invenção para uso em homens e animais a partir da perspectiva de um modelo de camundongo.

Exemplo 2:

[0052] A fim de analisar a mudança na microbiota intestinal quando a nicotinamida é dada, o DNA genômico é isolado a partir de amostras de fezes de acordo com a técnica anterior e quantificados, e a região variável do gene 16-S-rRNA bacteriano é amplificado, em que os amplicons são fornecidos com marcas adequadas para a finalidade de identificação. Seguindo o pirosequenciamento de processamento elevado dos amplicons, todas as sequências obtidas são submetidas a um controle de qualidade e são analisadas por comparação de se- quência em várias fases com os bancos de dados curados de sequências de DNA bacterianas. Diferenças das seções transversais representativas obtidas da microbiota intestinal nas amostras de fezes de indivíduos tratados e não tratados são correlacionadas e avaliadas com os sintomas da doença observados e medidos e os fatores genéticos relevantes dos indivíduos.

[0053] A Figura 2 mostra o desenvolvimento do índice atividadeda doença de Crohn (CDAI), isto é, a atividade da doença calculada de acordo com um padrão reconhecido a partir de diferentes parâmetros de doença de três pacientes que sofriam de doença de Crohn e foram tratados com nicotinamida em doses elevadas convencionalmente formulada para 4 semanas (2 x 600 mg por dia). Um valor de CDAI <150 é equivalente a remissão. Todos os três pacientes que sofrem de doença de Crohn mostraram uma clara resposta à administração de nicotinamida, dois deles conseguiram a remissão dentro do período de terapia.

[0054] O mecanismo subjacente e os efeitos benéficos da nicoti-namida descritos por Hashimoto et al. 2012 (Nature 487: 477) para o modelo de colite murina (ver Exemplo 1) combinam com a melhora clínica dos pacientes com doença de Crohn humanos em resposta à suplementação com nicotinamida visto neste exemplo.

Exemplo 3:

[0055] Constatou-se surpreendentemente que embora a expressão de ACE2 na mucosa intestinal de pacientes que sofrem de doença de Crohn e colite ulcerativa não diferiu significativamente dos valores em indivíduos saudáveis (dados não mostrados), a expressão de B0AT1 em porções inflamadas da mucosa foi reduzida muito fortemente e de uma forma estatisticamente significativa (valor de P <0,05) (ver tabela 1). Além disso, as amostras de controle de doentes que sofrem de inflamações intestinais de gênesis diferentes (denominados contro- les de especificidade da doença) não mostraram desvio significativo de pessoas normais hospitalizadas (HN). Isto argumenta contra uma doença de deficiência geral não específica ou deficiência de aminoáci- dos, e para os efeitos específicos de ácido nicotínico, nicotinamida e/ou triptofano (e compostos relacionados) no tratamento da IBD, cujos efeitos foram recentemente observados na presente invenção. Tabela 1: Expressão de RNAm de B0AT1 em relação ao valor de base (a partir de amostras de controles normais hos-pitalizados, HN, ou seja, pacientes sem inflamação intestinal)

[0056] A deficiência de transportador de triptofano observada empacientes com IBD observados neste exemplo corresponde à situação em camundongos com colite exacerbada devido à deficiência de transportador de triptofano (Hashimoto et al. 2012, Nature 487:477; ver Exemplo 1).

Exemplo 4:

[0057] A fim de caracterizar a vantagem das formulações de liberação controlada para entrega direcionada de nicotinamida para o epi- télio intestinal, um estudo de prova de conceito foi conduzido em modelo de colite de sulfato de sódio de dextrano (DSS) em camundongos. Colite DSS é um modelo de colite padronizado para avaliação da eficácia do fármaco candidato para doenças inflamatórias intestinais humanas. Como um controle no tratamento normalmente eficaz em colite DSS, foi utilizado ácido 5-aminossalicílico (5-ASA). O 5-ASA é quase insolúvel a um pH fisiológico e, portanto, foi administrado como uma suspensão em metilcelulose a 0,5%.

[0058] Devido a diferenças específicas da espécie no trato gastrointestinal, em termos de comprimento, tempo de passagem e meio de pH, as formulações de liberação controlada foram adaptadas ao organismo que foi tratado. Com base nos parâmetros do trato gastro- nintestinal murino (Koopman et al. 1978, Lab Anim 12:223; McConnell et al. 2008, J. Pharm Pharmacol 60:63), uma formulação específica de murino foi produzida para o estudo de prova-de-conceito em camun-dongos.

[0059] Mini comprimidos de liberação controlada foram produzidoscom um pó misturado de 99% NAM e 1% de estearato de magnésio (ambos da Caelo, Hilden, Alemanha) como lubrificante. Após a mistura, o pó foi caracterizado em termos de fluxo de pó (ângulo de repouso; <35°) e distribuição de tamanho (difração de laser; fração de partícula principal: 100-200 μm) para assegurar um bom fluxo do pó. Mini- comprimidos foram então produzidos em uma prensa rotativa e revestidos por um filme de polímero insolúvel em água Kollidon SR 30 D (BASF, Ludwigshafen, Alemanha) para controlar a liberação de NAM por difusão de NAM através do filme. A formulação de revestimento foi a seguinte: Kollicoat SR 20 D (49,9%), monoestearato de glicerol 60 (0,743%), propileno glicol (0,743%), óxido de ferro vermelho (0,4%), polisorbato 80 (0,314%) e água ad 100 %.

[0060] O monoestearato de glicerol 60 (Caelo) foi aquecido commetade da água a 80° C e emulsionado com um Ultraturrax (IKA, Stau- fen, Alemanha). Subsequentemente, o óxido de ferro vermelho (Caelo) foi adicionado e dispersado por mais 5 minutos (primeiro compartimento). O polissorbato 80 (Caelo), o propilenoglicol (Caelo) e as dispersões de polímero foram combinados em um segundo compartimento e agitados com um agitador magnético. A emulsão fria (<30° C) do primeiro compartimento foi combinada com a dispersão de polímero do segundo compartimento, e a água restante foi adicionada. A dispersão foi agitada durante 1 h antes da filtração (<500 μm). Os mini- comprimidos foram revestidos em um aparelho de leito fluidizado (Mycrolab, Hüttlin, Schopfheim, Alemanha) com um tamanho de lote de 50 g com uma taxa de alimentação de líquido de cerca de 1 mL/min e uma pressão de nebulização de 0,7 bar. Antes da pulverização, os comprimidos foram pré-aquecidos por um fluxo de volume de 8 m3 a 45° C. Durante a pulverização, o fluxo de volume foi aumentado para 16 m3 a 45° C. Uma temperatura de produto de cerca de 38° C foi observada. Depois da pulverização, os comprimidos foram fluidizados com 16 m3 por mais 10 min a 45° C durante a cura. Na etapa final do processo, o aquecimento foi desligado e o leito de comprimidos foi arrefecido a <30° C para evitar a aderência. Os comprimidos foram revestidos com 6,2 ± 0,04 mg/cm2. A liberação de fármaco foi determinada em um aparelho de pás (DT6, Erweka, Heusenstamm, Alemanha) de acordo com a Ph. Eur. a 50 rpm. Tampão de fosfato (pH 4) foi utilizado como meio de dissolução porque um fluido gastrointestinal ligeiramente ácido de cerca deste pH é esperado em camundongos (McConnell et al. 2008, J. Pharm. Pharmacol. 60:63-70). A concentração de fármaco foi determinada pela absorção de UV a 262 nm. Os comprimidos não revestidos mostraram uma liberação do fármaco instantânea devido ao tamanho minúsculo dos comprimidos e a alta solubilidade em água de nicotinamida. Usando o revestimento Kollidon SR, a liberação do fármaco foi optimizada para cobrir as áreas de alvo no intestino delgado dos camundongos (tempo de atraso de, pelo menos, 15 min, a liberação do fármaco constante ao longo de 3 h). Os mini- comprimidos foram misturados de forma homogênea com o pó de dieta livre de triptofano/niacina, pastilhas de aproximadamente 2 cm de comprimento e 1 cm de diâmetro foram formadas com uma quantidade mínima de água estéril, congeladas em alíquotas de uso único a -20° C para armazenamento e recém descongeladas diariamente para alimentar os camundongos.

[0061] Camundongos machos C57BL/6J (livre de patógeno específico; Taconic Europa, Ry, Dinamarca) foram incluídos no local do ensaio com 6-7 semanas de idade e aclimatizados durante 2 semanas. A dieta durante a fase de aclimatação foi Altromin 1324, produzido por Altromin (Lage, Alemanha). Após 2 semanas de aclimatação, a dieta foi alterada para uma dieta feita sob medida, sem triptofano ou ácido nicotínico ou nicotinamida (dieta livre de Trp/Nia/NAM), que foi fabricado pela Ssniff (Soest, Alemanha). No dia da mudança de dieta, o regime de tratamento começou como especificado abaixo. Tanto a dieta livre de Trp/Nia/NAM quanto o tratamento foram administrados até o sacrifíco dos camundongos. Após 12 dias de dieta livre de Trp/Nia/ NAM, os camundongos foram desafiados com 1,5% DSS (MP Biomedicals, Illkirch, França) na água de beber, durante 4 dias e, em segui- da, sacrificados.

[0062] O regime de tratamento foi realizado com quatro grupos de10 camundongos cada um, que foram tratados como se segue:

[0063] Grupo 1: gavagem oral diária de 0,25 mL de veículo (águaestéril).

[0064] Grupo 2: gavagem oral diária de 0,25 mL de nicotinamida(Cat No. 4488 Caelo.) solução em água estéril (6 mg/mL; dose final: cerca de 60 mg/kg de peso corporal).

[0065] Grupo 3: minicomprimidos de NAM de liberação controladahomogeneamente dispersos na dieta (dose final: cerca de 60 mg/kg de peso corporal, com base em uma ingestão de alimentos de 2,5 g por camundongo por dia).

[0066] Grupo 4: gavagem oral diária de 0,25 mL de ácido 5-aminossalicílico (5-ASA; Cat No. A3537, Sigma-Aldrich, Brondby, Di-namarca) suspensa em metilcelulose a 0,5% (Cat. N° M7140, Sigma- Aldrich) a uma concentração de 15 mg/mL (dose final: cerca de 150 mg/kg de peso corporal).

[0067] Soluções de dose foram preparadas na hora a partir dasmesmas soluções de estoque todos os dias imediatamente antes da administração.

[0068] Imediatamente antes de alterar a dieta, antes da indução dacolite DSS e antes do sacrifício, as amostras de fezes frescas equiva-lentes a duas pelotas fecais foram coletadas de cada animal para análises de microbioma. As amostras de fezes foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80° C. O congelamento imediato foi realizado para manter as relações entre diferentes bactérias com diferentes características de crescimento, sob condições ambientais.

[0069] Imediatamente após o sacrifício dos animais, o cólon foilavado com solução salina a 0,9% e amostras do tipo "rocambole" fo- ram preparadas (Moolenbeek e Ruitenberg 1981: Lab. Anim. 15:57). Resumindo, o cólon limpo foi aberto longitudinalmente, embrulhado com as vilosidades viradas para fora, e o rolo resultante foi fixado em formaldeído e embebido em parafina de acordo com procedimentos padrão. A preparação "rocambole" permite a avaliação histológica lon-gitudinal e quantitativa da mucosa do cólon completo no slide de mesmo corte. Os cortes foram corados com hematoxilina-eosina de acordo com procedimentos padrão. As amostras foram avaliadas por dois investigadores independentes e cegos e pontuadas de acordo com o seguinte sistema baseado em três parâmetros:

[0070] Gravidade da inflamação: 0, células inflamatórias raras nalâmina; 1, aumento do número de granulócitos na lâmina própria, edema submucoso; 2, confluência de células inflamatórias que se estendem para a submucosa; 3, extensão transmural do infiltrado inflamatório.

[0071] Danos da cripta: 0, criptas intactas; 1, perda de um terçobasal; 2, perda de dois terços basais; 3, perda de toda cripta; 4, mudança de superfície epitelial com a erosão; 5, erosão confluente.

[0072] Ulceração: 0, ausência de úlceras; 1, 1 ou 2 focos de ulcerações; 2, 3 ou 4 focos de ulcerações; 3, ulceração confluente ou ex-tensiva.

[0073] O escore máximo histológico foi de 3 + 5 + 3 = 11.

[0074] A avaliação histológica cega da mucosa do cólon completofoi escolhida como um parâmetro difícil para um efeito terapêutico das formulações de NAM reivindicadas.

[0075] Os escores dos quatro grupos são mostrados na Figura 3,expressadas como médias e desvios-padrão. Apenas amostras de cólon otimamente conservadas e preparadas e seções foram utilizadas (número de animais representados entre parênteses no texto a seguir). Os escores foram os seguintes:

[0076] Grupo 1 (controle de água): 6,25 ± 1,39 (n = 8);

[0077] Grupo 2 (NAM em água): 5,14 ± 1,07 (n = 7);

[0078] Grupo 3 (comprimidos de liberação controlada de NAM):3,38 ± 0,92 (n = 8);

[0079] Grupo 4 (5-ASA): 6,50 ± 1,60 (n = 8).

[0080] Considerando que a NAM na água de beber induziu apenasuma diminuição tendencial no escore de inflamação histológica em relação ao controle da água (p = 0,1), uma diferença altamente significativa foi observada tanto entre comprimidos de liberação controlada de NAM e o grupo de controle de água (p <0,001) e, importante, também entre NAM em água e liberação controlada de NAM (p <0,01). Curiosamente, o tratamento de controle 5-ASA (que melhora a colite DSS normal e é amplamente utilizado para a terapia de doenças inflamatórias do intestino nos seres humanos) não foi capaz de melhorar a colite DSS na ausência de triptofano ou niacina (Figura 3). Estes resultados suportam o conceito da presente invenção de que os efeitos benéficos sobre a NAM na microbiota intestinal e na colite não são aproveitados otimamente por distribuição sistêmica por meio de gavagem oral, mas sim por formulações de liberação controlada no intestino, e que o efeito primário de NAM é no ambiente local no intestino.

Exemplo 5:

[0081] Para caracterizar ainda mais as formulações de liberaçãocontrolada para entrega direcionada de nicotinamida no epitélio intestinal, um segundo estudo de prova de conceito foi conduzido em modelo de colite de sulfato de sódio de dextrano (DSS) em camundongos. Neste segundo e maior estudo de prova de conceito, uma formulação de grânulos de liberação controlada para NAM foi testada em três doses diferentes. Como um controle de tratamento normalmente eficaz na colite DSS, foram utilizados grânulos de liberação controlada contendo o ácido 5-amino-salicílico (grânulos de 5-ASA; PENTASA, Ferring Pharmaceuticals, Saint-Prex, Suíça).

[0082] A formulação de liberação controlada para a NAM é umgranulado de 25% nicotinamida, 70% fosfato de cálcio dibásico e 5% Povidona K30. O tamanho médio de partícula foi de 234 μm. O granulado foi subsequentemente revestido por uma película com etilcelulose 7 para atingir um ganho de peso de 30% e um tamanho médio de partícula de 640 μm. A filtragem removeu as partículas com um tamanho inferior a 355 μm. Grânulos de controle substituíram a NAM com uma quantidade equivalente de fosfato de cálcio dibásico.

[0083] Camundongos machos C57BL/6J (livre de patógeno específico; Charles River Laboratories, Saint-Germain-sur-l'Arbresle, França) foram incluídos no local do ensaio com > 12 semanas de idade e aclimatados para 1,5 meses, a fim de enriquecer e estabilizar a sua microbiota. A dieta durante a fase de aclimatação foi dieta A4, produzida pela SAFE (Scientific animal Food and Engineering, Augy, França). Após a aclimatação, a dieta foi alterada para uma dieta feita sob medida, sem triptofano ou ácido nicotínico ou nicotinamida (dieta livre de Trp/Nia/NAM), que foi fabricada pela Ssniff (Soest, Alemanha). A dieta livre de Trp/Nia/NAM foi fornecida como um pó, que foi utilizado para preparar pastilhas alimentares sem grânulos, grânulos de controle sem NAM ou 5-ASA, granulados de NAM ou grânulos de 5-ASA. Os grânulos foram dispersos homogeneamente na dieta. Pastilhas alimentares de cerca de 2 cm de comprimento e 1 cm de diâmetro foram formadas com uma quantidade mínima de água estéril, congeladas em alíquotas de uso único a -20° C para armazenamento e descongeladas diariamente para alimentar os camundongos. O teor dos grânulos das pastilhas de alimento foi definido como segue com uma base de cálculo de 30 g de peso corporal e uma ingestão diária de alimentos de 3 g.

[0084] Grânulos de 5-ASA (dose alvo de 5-ASA: 150 mg/kg de peso corporal; teor de 5-ASA: 52%): 4,5 mg de 5-ASA necessários em 3 g de alimento; 8,65 mg de grânulos necessários em 3 g de alimento; 2,88 g de grânulos adicionados por kg de alimento. As doses fixas para os outros grânulos foram calculadas de um modo análogo.

[0085] Grânulos de NAM (doses alvo de NAM: 30, 60 ou 120mg/kg de peso corporal; teor de NAM: 19,1%): para 30 mg/kg de NAM, 1,57 g de grânulos por kg de alimentos; para 60 mg/kg de NAM, 3,14 g de grânulos por kg de alimento; para 120 mg/kg de NAM, 6,28 g de grânulos por kg de alimento.

[0086] Os grânulos de controle foram adicionados aos alimentosna mesma proporção que os grânulos da NAM de grupo de dose de 120 mg/kg, ou seja, 6,28 g de grânulos por kg de alimento.

[0087] No dia em que a dieta foi mudada para dieta livre de Trp/Nia/NAM com ou sem grânulos, o regime de tratamento de gavagem oral foi iniciado para os grupos 1 e 2, conforme especificado abaixo. Tanto a dieta livre de Trp/Nia/NAM com ou sem grânulos e o tratamento foram administrados por gavagem até o sacrifício dos camundongos. Após 12 dias de dieta livre de Trp/Nia/NAM, os camundongos foram desafiados com 1,5% de DSS (TDB Consultancy, Uppsala, Suécia) na água de beber por cinco dias e sacrificados após mais dois dias, durante os quais foram fornecidos com água de beber normal.

[0088] O regime de tratamento foi realizado com sete grupos de 10camundongos cada, que foram tratados como se segue:

[0089] Grupo 1: gavagem oral diária de 0,1 mL de veículo (águaestéril).

[0090] Grupo 2: gavagem oral diária de 0,1 mL de solução de NAM(Sigma-Aldrich, Brondby, Dinamarca) em água estéril (18 mg/mL; dose final: cerca de 60 mg/kg de peso corporal).

[0091] Grupo 3: grânulos de controle da dieta (teor do grânulo correspondente ao grupo 6).

[0092] Grupo 4: grânulos de NAM na dieta (dose final: 30 mg/kg de peso corporal).

[0093] Grupo 5: grânulos de NAM na dieta (dose final: 60 mg/kg depeso corporal).

[0094] Grupo 6: grânulos de NAM na dieta (dose final: 120 mg/kgde peso corporal).

[0095] Grupo 7: grânulos de 5-ASA na dieta (dose final: 150 mg/kgde peso corporal).

[0096] As soluções da dose foram preparadas na hora a partir dasmesmas soluções de estoque todos os dias imediatamente antes da administração.

[0097] Imediatamente antes de alterar a dieta, antes da indução dacolite DSS e antes do sacrifício, as amostras de fezes frescas equiva-lentes a duas pelotas fecais foram coletadas de cada animal para análises de microbioma. As amostras de fezes foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80° C. O congelamento imediato foi realizado para manter as proporções entre diferentes bactérias com diferentes características de crescimento, sob condições ambientais.

[0098] Desde o início do desafio com DSS, os camundongos foram monitorizados diariamente para o seu estado geral de saúde e os parâmetros relevantes para o índice de atividade da doença (DAI), ou seja, diarreia e sangue fecal visível. Após o sacrifício, uma classificação macroscópica da inflamação do cólon foi realizada. O DAI foi calculado de acordo com Melgar et al. 2005 (Am J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288:G1328), que tem um máximo teórico de 9. Os dados de DAI resumidos na Tabela 2 e Figura 4, mostram que, semelhante aos dados do Exemplo 4, a NAM em água mostrou apenas uma tendência não significativa para a melhoria nesta configuração experimental, enquanto que a formulação de liberação controlada de NAM (grânulos de NAM) causou uma redução altamente significativa e depen- dente da dose de DAI. É importante notar que o grupo de grânulo de NAM recebendo 60 mg/kg de NAM teve um DAI significativamente mais baixo do que o grupo que recebeu 60 mg/kg de NAM na água (Tabela 2). Os grânulos de 5-ASA exibiram uma tendência não significativa para a eficácia terapêutica.Tabela 2: Dados do índice de atividade da doença (DAI) e sua avaliação estatística.

[0099] A quantidade de mieloperoxidase (MPO), uma enzima contida em grânulos de granulócitos, neutrófilos e polimorfonucleares, é um marcador para de tecido quantitativo para o recrutamento de neu- trófilos e permite indiretamente quantificar a inflamação do cólon aguda mediada por neutrófilos em colite DSS.

[00100] Para ensaiar o teor de MPO do tecido do cólon murino, amostras de tecido do cólon representativas foram analisadas com o kit ELISA para camundongos MPO Hycult (No. HK210; Hycult Biotech; CliniSciences, Nanterre, França), de acordo com as recomendações do fabricante.

[00101] Enquanto o NAM em água mostrou apenas uma tendência não significativa para a redução de MPO, uma diminuição significativa dos níveis de MPO foi observada nos grupos de camundongos que receberam grânulos de NAM em doses de 60 e 120 mg/kg, o que indica novamente um efeito terapêutico significativo de NAM apenas quando administrado como uma formulação de liberação controlada (Tabela 3, Figura 5).Tabela 3: Quantificação e análise estatística de níveis de mieloperoxi- dase (MPO) no cólon.

Exemplo 6:

[00102] Como os resultados dos dois estudos com animais descritos nos Exemplos 4 e 5 sugeriram um efeito terapêutico significativo de formulações de liberação controlada de NAM, a microbiota intestinal de camundongos a partir do estudo descrito no Exemplo 5 foi analisado com exatamente a mesma metodologia e maquinaria (filogenias 16SrDNA e sequenciamento de marcador 454) como descrito por Hashimoto et al. 2012 (Nature 487:477). Dos cinco grupos que receberam grânulos de liberação controlada (grupos 3-7), oito animais tinham sido selecionados de um modo cego, antes de analisar os parâmetros de doença descritos no Exemplo 5. As amostras de fezes de todos estes camundongos antes da intervenção nutricional (flora normal, não colitogênica como um ponto de referência) e após 12 dias de dieta livre de Trp/Nia/NAM (imediatamente antes do desafio com DSS, ver Exemplo 5) foram comparadas.

[00103] A Figura 6 mostra que 12 dias de dieta livre de Trp/Nia/NAM levou a uma dramática troca do filo dominante de Bacte- roidetes para Firmicutes. Isso poderia, em parte, e de forma dose- dependente ser prevenido por grânulos de NAM de liberação controlada. Os grânulos de 5-ASA de liberação controlada mostraram uma tendência no mesmo sentido (Figura 6). Além disso, as análises percentuais de similaridade mais detalhadas (SIMPER) dos grupos de bactérias mostraram que liberação controlada de NAM induziu uma expansão de Bacteroidales não classificadas e Bacteroidales do gênero Paraprevotella (Figura 7; porções tracejadas das colunas).

[00104] Simbiontes benéficos da ordem Bacteroidales pertencem aos gêneros predominantemente representados no intestino de mamíferos e são importantes para o processamento de nutrientes, porque eles hidrolisam polissacarídeos dietéticos e os convertem em ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs), que podem ser utilizados pelo hospedeiro. Os genomas mais homólogos aos encontrados no grupo Bac- teroidales expandindos sob tratamento com grânulos de NAM de liberação controlada pertenciam a esses produtores de SCFA. De particular relevância, a prevalência destes simbiontes benéficos e os níveis resultantes de SCFAs intestinais são reduzidos em doenças inflamatórias intestinais humanas (Frank et al. 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 104:13780). A expansão de tal microbiota por pré- ou probióticos, bem como os seus produtos de SCFA mostraram ser terapeuticamente efi-cazes na colite DSS de roedores (Osman et al. 2006, BMC Gastroen terol 28; 6:31; Maslowski et al. 2009, Nature 461:1282). Além disso, os Bacteroidales mostraram secretar estruturas imunomoduladoras de carboidrato (polissacarídeo A) que possam suprimir a resposta infla-matória (Mazmanian et al. 2008, Nature 453:620).

[00105] Em resumo, a liberação controlada de NAM no intestino leva a um aumento dose-dependente na microbiota benéfica e reduz a colite.

[00106] Os exemplos acima servem para explicar a invenção, mas não têm a intenção de limitar o escopo.

Claims (13)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma substância ativa selecionada dentre ácido nicotínico, ésteres de ácido nicotínico, nicotinamida, triptofano, um dipeptídeo de triptofano ou uma combinação dos mesmos, em que a composição é formulada para administração oral com liberação lenta e/ou controlada, e em que a referida composição libera a substância ativa para eficácia tópica no íleo terminal, no cólon ou em ambos, onde a microbiota intestinal a ser modificada está localizada.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é formulada para administração oral, com liberação lenta do(s) ingrediente(s) ativo(s) para a eficácia local específica no íleo terminal e/ou no cólon.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é formulada para administração oral com liberação controlada do(s) ingrediente(s) ativo(s) para a eficácia local específica no íleo terminal e/ou no cólon.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende nicotinamida.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que é formulada para a administração oral com liberação lenta ou controlada da substância ativa- para uso na terapia ou profilaxia de doenças inflamatórias do intestino delgado e/ou doenças do intestino grosso e/ou na profilaxia de carcinoma do cólon e/ou para uso na terapia ou profilaxia de doenças pela alteração da microbiota intestinal para ter menos efeito promotor de inflamação ou para ser anti-inflamatório, e/ou para uso no tratamento e/ou profilaxia de alterações patológicas na microbiota intestinal;- para uso na causa de uma alteração na microbiota intesti nal que apresenta um impacto positivo sobre a saúde pela redução do número de bactérias patogênicas, e/ou redução da proporção de bactérias patogênicas para bactérias benéficas, e/ou aumento da diversidade da microbiota, e/ou redução da quantidade de inflamação que a microbiota induz nos intestinos, e/ou reversão parcial ou completa de alterações patológicas no enterotipo da microbiota.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que é formulada para liberação seletiva da substância ativa para eficácia tópica no íleo terminal, cólon ou ambos, onde a microbiota a ser modificada está localizada.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é formulada para aplicação oral com um teor de substância ativa de 1 a 3000 mg por forma de dosagem finalizada.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o ácido acetilsalicílico e/ou antagonistas da prostaglandina D2 estão contidos em adição ao ácido nicotínico e/ou à nicotinamida.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que é(a) para uso na terapia ou profilaxia de doença inflamatória do intestino,(b) para uso na terapia ou profilaxia de carcinoma do cólon, ou(c) para uso na terapia ou profilaxia de doenças originadas de distúrbios atópicos e/ou doenças metabólicas com um componente inflamatório, e/ou selecionados a partir do grupo que consiste em alergia cutânea, eczema atópico, psoríase, fibrose cística, asma, DPOC, doença cardíaca coronariana, arteriosclerose, aterosclerose, diabetes e adiposidade.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que é para uso na terapia ou profilaxia de doença inflamatória do intestino.

11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que compreende o dipeptí- deo de triptofano.

12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que é para uso na causa de uma alteração na microbiota intestinal que apresenta um impacto positivo sobre a saúde pela redução do número de bactérias patogênicas, e/ou redução da proporção de bactérias patogênicas para bactérias benéficas, e/ou aumento da diversidade da microbiota, e/ou redução da quantidade de inflamação que a microbiota induz nos intestinos, e/ou reversão parcial ou completa de alterações patológicas no entero- tipo da microbiota; e/ou para uso na terapia ou profilaxia de doenças pela alteração da microbiota intestinal para ter menos efeito promotor de inflamação ou ser anti-inflamatório; e/ou para uso no tratamento e/ou profilaxia de alterações patológicas na microbiota intestinal.

13. Uso da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para tratar uma ou mais doenças e condições selecionadas dentre doenças inflamatórias do intestino delgado, doenças inflamatórias do intestino grosso, carcinoma do cólon, doenças que apresentam microbiota intestinal com efeito promotor de inflamação, e alterações patológicas na microbiota intestinal.

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