TW202308605A

TW202308605A - 用於炎症性腸疾病之預防或改善之組合物、以及用於腸內細菌叢調節之組合物

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Publication number: TW202308605A
Application number: TW111126624A
Authority: TW
Inventors: 金倫基
Original assignee: 日商明治控股股份有限公司; 學校法人慶應義塾
Priority date: 2021-07-19
Filing date: 2022-07-15
Publication date: 2023-03-01
Also published as: JPWO2023002939A1; WO2023002939A1

Abstract

本發明係一種用於炎症性腸疾病之預防或改善之組合物，其含有D-色胺酸作為有效成分。

Description

用於炎症性腸疾病之預防或改善之組合物、以及用於腸內細菌叢調節之組合物

本發明係關於一種用於炎症性腸疾病之預防或改善之組合物、以及用於腸內細菌叢調節之組合物。

炎症性腸疾病(IBD：inflammatory bowel disease)係引起大腸及小腸之黏膜產生慢性炎症或潰瘍之疾病之總稱，其代表性疾病有潰瘍性結腸炎、克隆氏病等。炎症性腸疾病之患者人數呈逐年增加之傾向，存在因慢性腹瀉、便秘、血便、腹痛、體重減輕、嘔吐、噁心、狹窄、穿孔等症狀而影響患者之社會生活之問題。認為於炎症性腸疾病中，因自體免疫異常或腸內細菌叢等而喪失腸道之免疫功能或屏障功能，導致腸炎發展並持續存在。然而，其病因尚未完全解明，目前未發現能根治之療法。

因此，正在積極開發炎症性腸疾病之新穎療法，例如，日本專利特開2012-201625號公報(專利文獻1)中記載了一種包含組胺酸或異白胺酸等人體必需胺基酸之炎症性疾病用營養組合物。又，例如，日本專利特表2018-504404號公報(專利文獻2)、日本專利特表2018-504405號公報(專利文獻3)、及日本專利特表2018-504406號公報(專利文獻4)中分別記載了使用脯胺酸、絲胺酸、及蘇胺酸之促進腸道黏膜治癒之方法、對治療炎症性疾病患者有用之營養組合物、及用於治療炎症之方法。然而，即便利用該等先前之組合物或方法，對炎症性腸疾病之預防或改善作用仍不足，期待進一步開發用於炎症性腸疾病之預防或改善之組合物或方法。

又，如上所述，認為腸內細菌叢會引起炎症性腸疾病之發病或有助於該疾病之治癒，除此以外，認為其還具有預防、改善便秘等腸道調理、助消化、調節免疫反應、抗炎症等多種作用。因此，亦期待進一步開發用於腸內細菌叢調節之組合物或方法。 [先前技術文獻] [專利文獻]

專利文獻1：日本專利特開2012-201625號公報專利文獻2：日本專利特表2018-504404號公報專利文獻3：日本專利特表2018-504405號公報專利文獻4：日本專利特表2018-504406號公報

[發明所欲解決之問題]

本發明係鑒於上述先前技術所具有之課題而完成者，其目的在於提供一種具有炎症性腸疾病之預防或改善作用之新穎組合物、及具有腸內細菌叢調節作用之新穎組合物。 [解決問題之技術手段]

本發明人等為達成上述目的而反覆銳意研究，使用藉由投予葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulfate Sodium Salt，DSS)而於大腸內誘發了腸炎之小鼠(DSS結腸炎模型小鼠)來探索對炎症性腸疾病之預防或改善有效之成分，結果發現，已知藉由向上述小鼠投予D-色胺酸，而與投予L-色胺酸之情形或未投予該等之情形相比，會於葡聚糖硫酸鈉誘發性之腸炎發病中縮短的大腸之長度顯著變長，且作為大腸黏膜肥厚之指標之每1 cm大腸之重量顯著減少。又，本發明人等發現，於上述投予D-色胺酸之小鼠中，表示大腸之炎症程度之組織學評分(Histological score)亦顯著降低，進而，炎症性細胞激素(TNFα、IL-1β、IL-6)基因之表現量亦顯著減少，藉由投予D-色胺酸，可抑制上述腸炎之發病。

進而，本發明人等還發現，於上述投予D-色胺酸之小鼠中，腸內細菌叢中之擬桿菌科(Bacteroidaceae)及乳桿菌科(Lactobacillaceae)之佔有率顯著增加，但毛螺菌科(Lachnospiraceae)或普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)等之佔有率降低，藉由投予D-色胺酸，確認到腸內細菌叢發生變化。

因此，可知藉由投予或攝取以D-色胺酸為有效成分之組合物，可預防或改善炎症性腸疾病、或可調節腸內細菌叢，從而完成了本發明。基於該見解獲得之本發明之態樣如下。 [1] 一種用於炎症性腸疾病之預防或改善之組合物，其含有D-色胺酸作為有效成分。 [2] 如[1]之組合物，其為經口用組合物或經腸用組合物。 [3] 如[1]或[2]之組合物，其為飲食組合物、醫藥組合物、或準醫藥組合物。 [4] 如[1]至[3]中任一項之組合物，其中上述炎症性腸疾病為選自由克隆氏病、潰瘍性結腸炎、及壞死性腸炎所組成之群之至少一種。 [5] 如[1]至[4]中任一項之組合物，其中對人類之每天投予量以D-色胺酸之游離體換算量計為0.01～1000 mg/kg。 [6] 一種用於腸內細菌叢調節之組合物，其含有D-色胺酸作為有效成分。 [7] 如[6]之組合物，其為經口用組合物或經腸用組合物。 [8] 如[6]或[7]之組合物，其為飲食組合物、醫藥組合物、或準醫藥組合物。 [9] 如[6]至[8]中任一項之組合物，其中對人類之每天投予量以D-色胺酸之游離體換算量計為0.001～50 mg/kg。 [10] 一種炎症性腸疾病之預防或改善方法，其將D-色胺酸投予至對象。 [11] 如[10]之方法，其中上述炎症性腸疾病為選自由克隆氏病、潰瘍性結腸炎、及壞死性腸炎所組成之群之至少一種。 [12] 如[10]或[11]之方法，其中以D-色胺酸之游離體換算量計，對人類每天投予0.01～1000 mg/kg。 [13] 一種D-色胺酸之用途，其用於炎症性腸疾病之預防或改善。 [14] 如[13]之用途，其中上述炎症性腸疾病為選自由克隆氏病、潰瘍性結腸炎、及壞死性腸炎所組成之群之至少一種。 [15] 如[13]或[14]之用途，其中以D-色胺酸之游離體換算量計，對人類每天投予0.01～1000 mg/kg。 [16] 一種D-色胺酸之用途，其用於製備炎症性腸疾病之預防或改善用組合物。 [17] 如[16]之用途，其中上述炎症性腸疾病為選自由克隆氏病、潰瘍性結腸炎、及壞死性腸炎所組成之群之至少一種。 [18] 一種腸內細菌叢調節方法，其將D-色胺酸投予至對象。 [19] 如[18]之方法，其中以D-色胺酸之游離體換算量計，對人類每天投予0.001～50 mg/kg。 [20] 一種D-色胺酸之用途，其用於腸內細菌叢之調節。 [21] 如[20]之用途，其中以D-色胺酸之游離體換算量計，對人類每天投予0.001～50 mg/kg。 [22] 一種D-色胺酸之用途，其用於製備腸內細菌叢調節用組合物。 [發明之效果]

根據本發明，可提供一種具有炎症性腸疾病之預防或改善作用之新穎組合物、及具有腸內細菌叢調節作用之新穎組合物。又，本發明之組合物亦可作為飲食組合物提供，故而易攝取，又，易習慣性地攝取。

以下，對本發明藉由其較佳實施方式詳細進行說明。

＜炎症性腸疾病之預防或改善用組合物、腸內細菌叢調節用組合物＞本發明提供一種含有D-色胺酸作為有效成分之用於炎症性腸疾病之預防或改善之組合物(以下，有時稱為｢炎症性腸疾病之預防或改善用組合物｣)、以及含有D-色胺酸作為有效成分之用於腸內細菌叢調節之組合物(以下，有時稱為｢腸內細菌叢調節用組合物｣)。

本發明之炎症性腸疾病之預防或改善用組合物、及腸內細菌叢調節用組合物(以下，有時將該等統稱為｢本發明之組合物｣)中含有之有效成分為D-色胺酸。本發明人等發現，於胺基酸中，色胺酸、其中尤其D體亦會發揮優異之炎症性腸疾病之預防或改善作用、及腸內細菌叢調節作用。

色胺酸(Tryptophan)為人體必需胺基酸之一，雖存在作為光學異構體之L體及D體，但自然界中存在之大部分色胺酸為L體。本發明之D-色胺酸為D體之色胺酸，其Cas No.為153-94-6，有時亦被稱為(R)-(＋)-2-胺基-3-(3-吲哚基)丙酸。又，有時使用｢Trp｣或｢W｣作為色胺酸之簡稱。

作為本發明之D-色胺酸，可為游離之形態(游離體)，亦可為水合物或鹽之形態，本說明書中，於簡稱為｢D-色胺酸｣之情形時包含該等中之任一者。作為上述鹽，只要不阻礙本發明之效果則無特別限定，可例舉食品或醫藥品上可容許之鹽，更具體而言，例如可例舉與有機酸(例如乙酸、酒石酸、脂肪酸等)、無機酸(例如鹽酸、氫溴酸、硝酸、硫酸、過氯酸等)、無機鹼(例如鉀、鈉、鋅等)等之鹽，可為該等鹽中之一種，亦可為兩種以上之組合。本發明之D-色胺酸之形態可根據組合物之形態、投予或攝取之方法等適當選擇。

本發明之D-色胺酸之來源並無特別限定，可例如使用榨汁、濃縮、純化、結晶、及提取等先前公知之方法或基於其之方法自素材或食品(肉類、乳、蛋、大豆、甲殼類(蝦、蟹)、貝類)等中分別單獨獲得。用於上述提取之溶劑並無特別限定，例如可例舉水、醇類、烴類、有機酸、有機鹼、無機酸、無機鹼、超臨界流體等通常用於提取之溶劑，可單獨使用該等中之一種，亦可組合兩種以上使用。又，作為本發明之D-色胺酸，可為乳酸菌(乳桿菌屬、雙叉桿菌屬等)之醱酵物等使用微生物生產者、或化學合成者等。進而，可適當購買市售品。

於本發明之組合物中，D-色胺酸之含量(以游離體換算，下同)根據組合物之形態、投予量或攝取量、投予或攝取之目的及方法等適當調整，故無特別限定，相對於組合物之總質量可為0.01～100質量%，例如於本發明之組合物為飲食組合物之情形時，較佳為0.1～10質量%，更佳為1～5質量%，於醫藥組合物之情形時，較佳為1～100質量%，更佳為1～80質量%，於準醫藥組合物之情形時，較佳為1～100質量%，更佳為1～90質量%。

本發明之組合物之投予量或攝取量(以下，有時稱為｢用量｣)可考慮組合物之形態；投予或攝取之目的及方法；對象之物種、年齡、體重、性別、疾病、症狀之程度等，視各自之情形來適當決定。因此，並無特別限定，例如，於以炎症性腸疾病之治療或改善為目的之情形時，作為對人類(較佳為成人)之用量，以D-色胺酸之量(以游離體換算，下同)計，每1 kg對象每天較佳為0.01～5000 mg，例如更佳為0.01～1000 mg、0.1～500 mg、1～200 mg，進而較佳為10～100 mg。又，例如於以炎症性腸疾病之預防為目的之情形時，作為對人類(較佳為成人)之用量，以D-色胺酸之量計，每1 kg對象每天較佳為0.001～1000 mg，更佳為0.01～1000 mg，進而較佳為0.01～100 mg，進而更佳為0.1～50 mg。進而，例如於以腸內細菌叢調節為目的之情形時，作為對人類(較佳為成人)之用量，以D-色胺酸之量計，每1 kg對象每天較佳為0.001～50 mg，更佳為0.01～10 mg，進而較佳為0.1～5 mg。

關於本發明之組合物，只要不阻礙本發明之效果，則除D-色胺酸以外，還可含有食品或醫藥品上可容許之其他成分。上述其他成分並無特別限定，例如可例舉：水、脂質、糖類、糖醇類、礦物質類、維生素類、蛋白質、肽、除D-色胺酸以外之胺基酸類、有機酸、乳酸菌(乳桿菌屬、雙叉桿菌屬等)、上述乳酸菌處理物(破碎處理物、加熱處理物等)、上述乳酸菌之醱酵物、製劑助劑、除D-色胺酸以外之其他有效成分。

上述脂質並無特別限定，更具體而言，例如可例舉：大豆油、玉米油、棕櫚油、紫蘇油、芥花籽油(canola oil)、紅花油(safflower oil)、葵花籽油、芝麻油、米糠油、葡萄籽油、魚油、紅花油、菜籽油、及花生油等天然油脂；碳數約6～12之中長鏈三酸甘油酯(Medium-Chain Triglyceride，MCT)等合成油脂。

上述糖類並無特別限定，更具體而言，例如可例舉：澱粉、糊精、麥芽糊精、低聚果醣、半乳寡醣、低聚乳果糖、乳酮糖、菊糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、及環糊精。

上述糖醇類並無特別限定，更具體而言，例如可例舉：山梨糖醇、甘露醇、麥芽糖醇、赤藻糖醇、還原飴糖、異麥芽酮糖醇等甜味料。

上述礦物質類並無特別限定，更具體而言，可例舉：鈣、鎂、鈉、鉀、磷、鐵、錳、銅、鋅、碘、鋅、硒、鉻、及鉬。

上述維生素類並無特別限定，可例舉維生素A、B1、B2、B6、B12、C、D、E、K。

上述製劑助劑並無特別限定，更具體而言，例如可例舉：溶劑、分散劑、乳化劑、增黏劑、增黏穩定劑(羧甲基纖維素等)、膠化劑、界面活性劑、緩衝劑、穩定劑、賦形劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、矯味劑、助溶劑、懸浮劑、包衣劑、載體(固體載體、水等液體載體)、保存劑、香料、著色劑、pH調整劑。

上述除D-色胺酸以外之其他有效成分並無特別限定，更具體而言，例如可例舉：膳食纖維(難消化性糊精等)、水果/蔬菜及其加工品、動植物生藥萃取物、天然來源高分子(膠原蛋白、玻尿酸、軟骨素等)等。

上述其他成分可單獨含有一種，亦可含兩種以上。又，於含有上述其他成分之情形時，該其他成分之含量並無特別限定，可根據組合物之形態、用量、投予或攝取之目的及方法等適當調整。

本發明之組合物較佳為以經口或經腸之方式進行投予或攝取，可根據其方法製成經口用組合物或經腸用組合物。又，本發明之組合物根據投予或攝取組合物之目的、對象、方法、用量等，例如可製成醫藥組合物、準醫藥組合物、飲食組合物、或飼料組合物。

作為本發明之醫藥組合物及準醫藥組合物，例如可製成製劑，其形態並無特別限定，例如可例舉：錠劑、丸劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等固體劑；一般液劑、懸浮劑、乳劑、糖漿劑等液劑；凝膠劑；經腸投予劑；栓劑等。關於上述製劑，例如可向D-色胺酸中加入上述製劑助劑中之一種或兩種以上，進而視需要加入上述其他成分中之一種或兩種以上，藉由公知之方法或基於其之方法來製造。

本發明之飲食組合物之形態並無特別限定，例如可例舉：如棒狀之固體狀、如飲料或流質食品般之液狀、糊狀、半液體狀、凝膠狀(果凍狀)、凝膠狀油脂(半固體狀油脂)、粉末狀等形態。又，上述飲食組合物亦可製成流質食品、粉末流質食品、營養糊劑、經口/經管灌營養劑、飲料、凝膠狀食品等，以用於經口/經腸營養患者或高齡者、嬰幼兒等之營養管理。

本發明之飲食組合物之例並無特別限定，例如可例舉：飲料(茶類、碳酸飲料、可可、咖啡、乳酸菌飲料、豆乳飲料、果汁/蔬菜汁飲料、清涼飲料、營養飲料、酒精飲料等)、加工食品(巧克力、口香糖、軟糖、果凍、烘焙點心(麵包、蛋糕、曲奇、餅乾等)、糖果等)、乳製品(調製乳粉(奶粉)、調製乳、乳飲料、醱酵乳、酸乳酪、冰淇淋、乾酪、奶油、乳酪、人造奶油、煉乳等)、調味料(沙司、湯汁、調味醬、蛋黃醬、蛋黃醬型調味料、奶油等)、補充品、食用油、功能性食用油脂。此種飲食組合物例如可藉由將本發明之D-色胺酸調配至既有飲食品或其原料或者製造過程中之中間產物中之方法等來製造。此時所調配之D-色胺酸可為上述醫藥組合物或準醫藥組合物之形態。

又，作為本發明之飲食組合物，例如，可製成一般食品、保健食品、功能性食品、保健功能食品(例如特定保健用食品、營養功能食品、營養輔助食品、功能性標示食品等)、特殊用途食品(例如幼兒用食品、孕產婦用食品、病患用食品等)、醫藥食品(由美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)及罕見病藥物法定義且於醫師之監管下配製之食品)、治療食品(以治療為目的，基於營養師等按照醫師開出之膳食處方製作之菜單所烹調出之食品)、飲食療法食品，對於上述飲食組合物亦可標示出本發明之D-色胺酸於其製品中帶來之作用和功效(例如，炎症性腸疾病之預防或改善)。

作為本發明之飼料組合物，可例舉根據投予或攝取飼料組合物之目的、對象、方法、用量等適當改變上述飲食組合物而得者。

作為本發明之組合物，較佳為於自製造後至投予或攝取期間包裝(較佳為封入)於包裝容器內。上述包裝容器並無特別限定，例如可例舉包裝紙、包裝袋、軟袋、管、鋁箔袋、紙容器、罐、瓶子、膠囊。

本發明之組合物藉由含有上述D-色胺酸作為有效成分，可用於預防或改善炎症性腸疾病。因此，本發明亦提供用於炎症性腸疾病之預防或改善之D-色胺酸之用途、以及用於製造炎症性腸疾病之預防或改善用組合物之D-色胺酸之用途。

於本發明中，作為上述炎症性腸疾病，可例舉克隆氏病、潰瘍性結腸炎、壞死性腸炎等。又，於本發明中，上述炎症性腸疾病之｢改善｣包括治癒或緩解炎症性腸疾病、抑制或改善由炎症性腸疾病引起之腸(大腸、小腸)中之炎症、抑制上述炎症之惡化。

本發明之組合物可用於預防或改善與上述炎症性腸疾病相關之疾病、即過敏性疾病或過敏性腸疾病。進而，可用於預防、治療或改善、或者緩解由上述炎症性腸疾病引起之症狀(例如，大腸之縮短、腸內細菌叢之變化、腹瀉、便秘、血便、腹痛、體重減輕、嘔吐、噁心、狹窄、穿孔等)。

於本發明中，改善或預防上述炎症性腸疾病除臨床上改善了上述症狀或抑制了發病以外，例如還可藉由如下等情況來確認：已知以未投予組合物之群或投予前為基準，於葡聚糖硫酸鈉誘發性之腸炎發病中縮短之大腸之長度較長；作為大腸黏膜肥厚之指標之每1 cm大腸之重量減少；利用Wirtz等人之方法(S.Wirtz, et al., Nat. Protoc., 2, 2007, p.541-546)算出之表示大腸之炎症程度之病理組織學活動性評分(Histological score(組織學評分))降低；腸中之炎症性細胞激素(TNFα、IL-1β、IL-6等)基因之表現量減少。

又，本發明之組合物藉由含有上述D-色胺酸作為有效成分而可用於腸內細菌叢調節。因此，本發明亦提供一種用於腸內細菌叢調節之D-色胺酸之用途、以及用於製造腸內細菌叢調節用組合物之D-色胺酸之用途。

於本發明中，上述腸內細菌叢調節表示使腸內之細菌叢變化。作為此種變化，更具體而言，例如可例舉：以未投予組合物之群或投予前為基準，選自由擬桿菌科(Bacteroidaceae)及乳桿菌科(Lactobacillaceae)所組成之群之至少一種於腸內之佔有率增加；選自由普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)及毛螺菌科(Lachnospiraceae)所組成之群之至少一種於腸內之佔有率減少；腸內之細菌之種類數減少等。

該腸內細菌叢調節作用認為係發揮上述炎症性腸疾病之預防或改善作用之原因之一。又，本發明之組合物除該炎症性腸疾病之預防或改善之用途以外，亦可用於藉由該腸內細菌叢調節作用來調理腸道，或用於腸內細菌叢調節起到效果之對便秘、腹瀉、腹痛、血便等之預防、治療或改善、或者緩解。

進而，本發明之組合物藉由含有上述D-色胺酸作為有效成分而亦可用於減少炎症性細胞激素基因於腸內之表現量。作為上述炎症性細胞激素，可例舉TNFα、IL-1β、IL-6。該炎症性細胞激素基因之表現量減少作用認為係發揮上述炎症性腸疾病之預防或改善作用之原因之一。又，本發明之組合物除該炎症性腸疾病之預防或改善之用途以外，亦可用於藉由該炎症性細胞激素基因之表現量減少作用來調理腸道，或用於炎症性細胞激素基因之表現量減少起到效果之對便秘、腹瀉、腹痛、血便等之預防、治療或改善、或者緩解。

＜炎症性腸疾病之預防或改善方法、腸內細菌叢調節方法＞藉由將上述D-色胺酸投予至對象，可預防或改善該對象之炎症性腸疾病，又，可調節腸內細菌叢。因此，本發明亦提供一種將D-色胺酸投予至對象之炎症性腸疾病之預防或改善方法、以及將D-色胺酸投予至對象之腸內細菌叢調節方法(以下，有時統稱為｢本發明之方法｣)。

進而，如上所述，亦可預防或改善與上述炎症性腸疾病或腸內細菌叢相關之各疾病或症狀，故而本發明之方法亦可為：預防或改善過敏性疾病或過敏性腸疾病之方法；預防、治療或改善、或者緩解由炎症性腸疾病引起之各症狀之方法；減少炎症性細胞激素基因於腸內之表現量之方法；腸道調理方法；腸內細菌叢調節或炎症性細胞激素基因之表現量減少起到效果之對各症狀之預防、治療或改善、或者緩解之方法。

本發明之方法包括將本發明之D-色胺酸之有效量投予至對象之步驟。作為本發明之對象，可例舉人類或非人動物，較佳為哺乳動物。作為上述哺乳動物，除人類以外，還可例舉羊、牛、豬、馬、猴等。作為上述對象，可為已罹患炎症性腸疾病者，亦可為以預防罹患該疾病或調節腸內細菌叢等為目的者。

於本發明之方法中，D-色胺酸較佳為直接經口或經腸投予至上述對象，更佳為以本發明之組合物之形式經口或經腸投予至上述對象。再者，於本發明中，經口投予亦包括攝取上述飲食組合物或上述飼料組合物等。

於本發明之方法中，作為D-色胺酸之有效量，考慮投予之目的及方法；對象之物種、年齡、體重、性別、疾病、症狀之程度等，根據各自之情形而適當決定，故無特別限定，與上述本發明之組合物之用量相同，例如，針對於人類(較佳為成人)，於以炎症性腸疾病之治療或改善為目的之情形時，以D-色胺酸之量(以游離體換算，下同)計，每1 kg對象每天較佳為0.01～5000 mg，例如更佳為0.01～1000 mg、0.1～500 mg、1～200 mg，進而較佳為10～100 mg。又，例如於以炎症性腸疾病之預防為目的之情形時，較佳為0.001～1000 mg，更佳為0.01～1000 mg，進而較佳為0.01～100 mg，進而更佳為0.1～50 mg。進而，例如於以腸內細菌叢調節為目的之情形時，較佳為0.001～50 mg，更佳為0.01～10 mg，進而較佳為0.1～5 mg。又，於本發明之方法中，投予次數可1天1次～分為適當之次數。 [實施例]

以下，基於實施例及比較例更具體地說明本發明，但本發明並不限定於以下實施例。再者，於各實施例及比較例中，若無特別記載，則表示濃度之｢%｣表示重量/體積(w/v：g/mL)百分比。

＜試驗例1＞ (實施例1、比較例1) 使用6週齡之雌性C57BL/6J小鼠(Sankyo Labo Service股份有限公司製造)作為實驗動物。所有實驗動物均於光亮期：8點～20點、暗期：20點～8點、室溫：25±2℃、濕度：50±5%之環境下飼養，經過一週以上之適應期後供於下述試驗。

對照群(比較例1，Cont，24個體)中，以每天1 mL/隻經口投予0.5%羧甲基纖維素水溶液三週。D-色胺酸群(實施例1，D-Trp，24個體)中，以每天1 mL/隻經口投予含有5% D-色胺酸(D-色胺酸，東京化成工業股份有限公司製造)之0.5%羧甲基纖維素水溶液三週。在此期間，兩個群均自由飲水，其中，自各經口投予開始日(第-7天(Day：-7))起一週後(第0天(Day：0))，將自由飲用之水替換為2%葡聚糖硫酸鈉(質量36-50 kDa，MP Biomedicals公司製造)水溶液，以自由飲用5天之方式投予至所有個體，自第5天(Day：5)起恢復成水。

對於各群中之各12個體，自試驗開始日(第-7天(Day：-7))至第21天(第14天(Day：14))進行狀態觀察。將2%葡聚糖硫酸鈉水溶液之投予開始日(第0天(Day：0))之各個體之體重設為100%時，對照群(Cont，n＝12)及D-色胺酸群(D-Trp，n＝12)於該投予開始日(第0天(Day：0))至第14天(第14天(Day：14))之每天(Days after DSS treatment，DSS處理後天數)之各體重之比率之平均值(體重推移，Body weight change(%))示於圖1中。如圖1所示，對照群中，藉由投予2%葡聚糖硫酸鈉水溶液，可確認到自其投予開始至第6天(Day：6)以後體重顯著減輕。另一方面，D-色胺酸群中，與對照群相比，第6天以後之體重顯示出顯著較高之值(基於雙向ANOVA和Sidak之多重比較檢驗(two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test)之P值：0.001以下)，體重減輕得到抑制。

又，對於上述各群中各自其餘之12個體，將試驗開始日(Day：-7)至第16天(Day：9)之大腸長度(Colon length(cm))之測定結果示於圖2中，將大腸重量(Colon weight(g))之測定結果示於圖3中，進而，將根據該等對每1 cm大腸之重量(Colon weight(g/cm))進行計算所得之結果示於圖4中。已知，於葡聚糖硫酸鈉誘發性之腸炎發病中大腸之長度會縮短，但如圖2所示，與對照群(Cont)相比，大腸長度於D-色胺酸群(D-Trp)中顯示出顯著較高之值(基於Welch T檢驗(Welch's t-test)之P值：0.001以下)。又，如圖4所示，與對照群相比，作為大腸黏膜肥厚之指標之每1 cm大腸之重量於D-色胺酸群中顯示出顯著較低之值(基於Welch T檢驗(Welch's t-test)之P值：0.001以下)。

進而，將對供於上述大腸測定之大腸之組織切片進行蘇木精-伊紅(HE)染色後之顯微鏡照片示於圖5中。如圖5所示，對照群(Cont)中，確認到來自黏膜固有層之黏膜下組織之細胞浸潤或腺管結構之紊亂，但D-色胺酸群(D-Trp)中未確認到該等變化。又，將基於Wirtz等之方法(S.Wirtz, et al., Nat. Protoc., 2, 2007, p.541-546)對大腸之炎症程度進行評分所得之結果(組織學評分)示於圖6中。如圖6所示，D-色胺酸群與對照群相比顯示出顯著較低之評分(基於Welch T檢驗(Welch's t-test)之P值：0.01以下)。

根據上述結果確認到，對照群中因葡聚糖硫酸鈉之投予而於大腸中誘發了腸炎，與此相對，D-色胺酸群中其得以抑制。

＜試驗例2＞ (實施例2、比較例2～3) 使用6週齡之雌性C57BL/6J小鼠(Sankyo Labo Service股份有限公司製造)作為實驗動物。所有實驗動物均於光亮期：8點～20點、暗期：20點～8點、室溫：25±2℃、濕度：50±5%之環境下進行飼養，經過一週以上之適應期後供於下述試驗。

對照群(比較例2，Cont，n＝12)中，作為標準飼料，餵食投予CE-2(CLEA Japan公司製造)兩週至試驗結束，L-色胺酸群(比較例3，L-Trp，n＝11)中，餵食投予以含量成為5%之方式添加有L-色胺酸(Nacalai Tesque股份有限公司製造)之CE-2兩週至試驗結束，D-色胺酸群(實施例2，D-Trp，n＝12)中，餵食投予以含量成為5%之方式添加有D-色胺酸(東京化成工業股份有限公司製造)之CE-2兩週至試驗結束。收集投予開始日(第0天(Day：0))及自該投予開始兩週後(第14天(Day：14))之糞便，進行腸內細菌叢之16S宏基因組分析。

使用E.Z.N.A ^(R)Stool DNA kit(OMEGA公司製造)自各糞便中提取DNA。使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix(日本Genetics公司製造)對自所提取之DNA中之16SrRNA之可變V3-V4區進行擴增。上述擴增中使用V3-V4-正向引子(將核苷酸序列示於序列編號：1)及V3-V4-反向引子(將核苷酸序列示於序列編號：2)。

擴增產物係使用AMPure XP(Beckman coulter公司製造)進行純化及尺寸選擇。又，使用Nextera XT index kit(Illumina公司製造)之引子進行PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)，併合並對每個樣品附加有不同索引之基因庫DNA。使用Miseq Reagent Kit V3(Illumina公司製造)及Miseq sequencer(Illumina公司製造)對合併後之基因庫DNA實施序列解析。

利用QIIME(v.1.9.1)軟體及RDP v.10.27 and CORE update 2 September 2012，對上述解析所得之序列資料進行解析，藉由主成分分析(PCA：Principal Coordinate Analysis)對各群(Cont、L-Trp、D-Trp)於第0天(Day：0)及第14天(Day：14)之腸內細菌叢進行繪圖，將所得之結果示於圖7。如圖7所示，第14天(Day：14)之D-色胺酸群(D-Trp)之叢集與對照群(Cont)及L-色胺酸群(L-Trp)之叢集明顯分離。

又，利用QIIME(v.1.9.1)軟體及RDP v.10.27 and CORE update 2 September 2012對上述解析所得之序列資料進行解析，算出對照群(Cont)及D-色胺酸群(D-Trp)於第0天(Day：0)及第14天(Day：14)之糞便中之各細菌群相對於總細菌群之佔有率。將結果以合計100%之累積圖表方式示於圖8中。進而，利用QIIME(v.1.9.1)軟體及RDP v.10.27 and CORE update 2 September 2012對上述所得之序列資料進行解析，藉由線性判別分析(LDA：Linear Discriminant Analysis)於第14天(Day：14)之對照群(Cont)與D-色胺酸群(D-Trp)之間進行群間比較分析，將所得之結果示於圖9中。如圖8及圖9所示，於第14天(Day：14)之腸內細菌叢之構成中，D-色胺酸群中擬桿菌科及乳桿菌科之佔有率顯著增加，另一方面，優桿菌科(Eubacteriaceae)或理研菌科(Rikenellaceae)、普雷沃氏菌科、毛螺菌科、未鑑定之梭菌目(UndClostridiales)或未鑑定之擬桿菌目(UndBacteroidales)之佔有率降低。

根據上述結果確認，於D-色胺酸群中腸內細菌叢變化，尤其是擬桿菌科及乳桿菌科之佔有率增加，並且細菌之種數減少。

＜試驗例3＞ (實施例3、比較例4～5) 研究D-色胺酸對炎症模型動物之腸內細菌叢構成與生長之影響。使用市售套組(美天旎生物技術股份有限公司製造)，自野生型雌性C57BL/6J小鼠之脾臟中分離出CD4 ^＋CD25 ^-調節性T細胞，將該等5×10 ⁵cells腹腔內投予至Rag1 ^-/ ^-小鼠，使用製得之慢性炎症模型動物作為實驗動物。所有實驗動物均於光亮期：8點～20點、暗期：20點～8點、室溫：25±2℃、濕度：50±5%之環境下飼養，經過一週以上之適應期後供於下述試驗。

對照群(比較例4，Cont，n＝6)中，作為標準飼料，餵食投予CE-2(CLEA Japan公司製造)三週至試驗結束，L-色胺酸群(比較例5，L-Trp，n＝6)中，餵食投予以含量成為5%之方式添加有L-色胺酸(L-色胺酸，Nacalai Tesque股份有限公司製造)之CE-2三週至試驗結束，D-色胺酸群(實施例3，D-Trp，n＝6)中，餵食投予以含量成為5%之方式添加有D-色胺酸(D-色胺酸，東京化成工業股份有限公司製造)之CE-2三週至試驗結束。

對於各餵食投予三週後之各個體，將大腸長度(Colon length(cm))之測定結果示於圖10中，將大腸重量(Colon weight(g))之測定結果示於圖11中，進而，將根據該等對每1 cm大腸之重量(Colon weight(g/cm))進行計算所得之結果示於圖12中。

如圖10所示，與對照群(Cont)相比，大腸長度於D-色胺酸群(D-Trp)中顯示出顯著較高之值(基於單向ANOVA和Dunnett之多重比較檢驗(one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison test)之P值：0.05以下)，但於對照群與L-色胺酸群(L-Trp)之間未確認到群間差異。又，如圖12所示，與對照群相比，作為大腸黏膜肥厚之指標之每1 cm大腸之重量於D-色胺酸群中顯示出顯著較低之值(基於單向ANOVA和Dunnett之多重比較檢驗之P值：0.001以下)，但於對照群與L-色胺酸群之間未確認到群間差異。

進而，將對供於上述大腸測定之大腸之組織切片進行蘇木精-伊紅(HE)染色後之顯微鏡照片示於圖13中。如圖13所示，對照群(Cont)及L-色胺酸群(L-Trp)中，確認到來自黏膜固有層之黏膜下組織之細胞浸潤或腺管結構之紊亂，但D-色胺酸群(D-Trp)中未確認到該等變化。又，將基於上述Wirtz等人之方法對大腸之炎症程度進行評分所得之結果(組織學評分)示於圖14中。如圖14所示，D-色胺酸群與對照群相比顯示出顯著較低之評分(基於單向ANOVA和Dunnett之多重比較檢驗之P值：0.001以下)，但於對照群與L-色胺酸群之間未觀察到群間差異。

進而，藉由PureLink RNA Mini Kit(Thermo Fisher Scientific，USA)自供於上述大腸之測定的大腸中提取RNA，藉由ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(TOYOBO，Japan)對其進行反轉錄，將所得之cDNA作為模板DNA，進行將炎症性細胞激素(TNFα、IL-1β、IL-6)基因設為靶之q-PCR(quantitative Polymerase Chain Reaction，定量聚合酶鏈反應)，以解析各基因之表現量。引子分別使用下述表1中記載之序列編號所示之核苷酸序列之引子組。又，作為對照，使用與下述表1中記載之16S RNA基因(total 16s)共通之引子組同樣地進行q-PCR。

[表1]

基因	引子	序列編號
TNF α(Tnf)	Tnfa-正向引子	3
Tnfa-反向引子	4
IL-1β (Il1b)	IL 1b-正向引子	5
IL 1b-反向引子	6
IL-6(Il6)	IL6-正向引子	7
IL6-反向引子	8
Total 16S	16S-正向引子	9
16S-反向引子	10

將各群(Cont、L-Trp、D-Trp)中之TNFα基因之表現量(TNFα基因之mRNA量/對照之mRNA量，相對表現量(Relative expression))示於圖15中，將IL-1β基因之表現量(IL-1β基因之mRNA量/對照之mRNA量，相對表現量(Relative expression))示於圖16中，將IL-6基因之表現量(IL-6基因之mRNA量/對照之mRNA量，相對表現量(Relative expression))示於圖17中。如圖15～圖17所示，與對照群(Cont)相比，各炎症性細胞激素基因之表現量於D-色胺酸群(D-Trp)中顯示出顯著較低之值(基於單向ANOVA和Dunnett之多重比較檢驗之P值：0.05以下(圖15)、0.05以下(圖16)、0.001以下(圖17))，但於對照群與L-色胺酸群(L-Trp)之間未確認到群間差異。

＜試驗例4＞ (實施例4、比較例6) 使用6週齡之雌性C57BL/6J小鼠(Sankyo Labo Service股份有限公司製造)作為實驗動物。所有實驗動物均於光亮期：8點～20點、暗期：20點～8點、室溫：25±2℃、濕度：50±5%之環境下飼養，經過一週以上之適應期後供於下述試驗。

自試驗開始日(第0天(Day：0))起，以自由飲用5天之方式向所有個體投予2%葡聚糖硫酸鈉(質量36-50 kDa，MP Biomedicals公司製造)水溶液，自第5天(Day：5)起替換為水。又，自試驗開始日(第0天(Day：0))後第6天(Day：6)起，於對照群(比較例6，Cont，24個體)中以每天1 mL/隻經口投予0.5%羧甲基纖維素水溶液兩週，於D-色胺酸群(實施例4，D-Trp，24個體)中以每天1 mL/隻經口投予含有5% D-色胺酸(D-色胺酸，東京化成工業股份有限公司製造)之0.5%羧甲基纖維素水溶液兩週。

對於各群中之各12個體，自試驗開始日(第0天(Day：0))至第14天(第14天(Day：14))進行狀態觀察。將試驗開始日(第0天(Day：0))之各個體之體重設為100%時，對照群(Cont，n＝12)及D-色胺酸群(D-Trp，n＝12)自試驗開始日(第0天(Day：0))至第14天(第14天(Day：14))之每天(Days after DSS treatment，DSS處理後天數)之各體重之比率之平均值(體重推移，Body weight change(%))示於圖18中。如圖18所示，於試驗開始後第7天(Day：7)～第11天(Day：11)，與對照群相比，於D-色胺酸群中體重顯示出顯著較高之值(基於單向ANOVA和Sidak之多重比較檢驗之P值：均為0.05以下)，體重減輕得到抑制。

又，對於上述各群中各自其餘之12個體，將試驗開始日(第0天(Day：0))至第9天(Day：9)之大腸長度(Colon length(cm))之測定結果示於圖19中。如圖19所示，與對照群(Cont)相比，大腸長度於D-色胺酸群(D-Trp)中顯示出顯著較高之值(基於單向ANOVA和Dunnett之多重比較檢驗之P值：0.001以下)。

根據上述結果，確認到D-色胺酸有預防或改善用作炎症性腸疾病之代表性模型之葡聚糖硫酸鈉誘發性腸炎(DSS結腸炎)發病的作用，又，亦確認到調節腸內細菌叢之作用。進而，確認到色胺酸對葡聚糖硫酸鈉誘發性腸炎之作用係D型色胺酸具有之特異性作用。 [產業上之可利用性]

如上所述，根據本發明，可提供一種具有炎症性腸疾病之預防或改善作用之新穎組合物、及具有腸內細菌叢調節作用之新穎組合物。本發明之用於炎症性腸疾病之預防或改善之組合物、及用於腸內細菌叢調節之組合物可用作用於預防或改善炎症性腸疾病、例如克隆氏病、潰瘍性結腸炎、及壞死性腸炎之組合物、或用於腸道調理之組合物，或者亦可用作飲食組合物。 [序列表非關鍵詞文字]

序列編號：1 ＜223＞V3-V4-正向引子＜223＞n為a、c、g、或t 序列編號：2 ＜223＞V3-V4-反向引子＜223＞n為a、c、g、或t 序列編號：3 ＜223＞Tnfa-正向引子序列編號：4 ＜223＞Tnfa-反向引子序列編號：5 ＜223＞IL1b-正向引子序列編號：6 ＜223＞IL1b-反向引子序列編號：7 ＜223＞IL6-正向引子序列編號：8 ＜223＞IL6-反向引子序列編號：9 ＜223＞16S-正向引子序列編號：10 ＜223＞16S-反向引子

圖1係表示試驗例1中之對照群(Cont)及D-色胺酸群(D-Trp)之體重推移之圖表。圖2係表示試驗例1中之對照群(Cont)及D-色胺酸群(D-Trp)之大腸長度(Colon length(cm))之測定結果之圖表。圖3係表示試驗例1中之對照群(Cont)及D-色胺酸群(D-Trp)之大腸重量(Colon weight(g))之測定結果之圖表。圖4係表示對試驗例1中之對照群(Cont)及D-色胺酸群(D-Trp)之每1 cm大腸之重量(Colon weight(g/cm))進行計算所得之結果之圖表。圖5係對試驗例1之對照群(Cont)及D-色胺酸群(D-Trp)中之大腸之組織切片進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色後之顯微鏡照片。圖6係表示對試驗例1中之對照群(Cont)及D-色胺酸群(D-Trp)之大腸之炎症程度進行評分所得之結果(組織學評分)之圖表。圖7係表示藉由主成分分析(PCA)對試驗例2之各群(Cont、L-Trp、D-Trp)於第0天(Day：0)及第14天(Day：14)之腸內細菌叢進行繪圖所得之結果之圖表。圖8係表示試驗例2之對照群(Cont)及D-色胺酸群(D-Trp)於第0天(Day：0)及第14天(Day：14)之糞便中之各細菌群相對於總細菌群之佔有率之圖表。圖9係表示藉由線性判別分析(LDA)於試驗例2之第14天(Day：14)之對照群(Cont)與D-色胺酸群(D-Trp)之間進行群間比較分析所得之結果之圖表。圖10係表示試驗例3中之各群(Cont、L-Trp、D-Trp)之大腸長度(Colon length(cm))之測定結果之圖表。圖11係表示試驗例3中之各群(Cont、L-Trp、D-Trp)之大腸重量(Colon weight(g))之測定結果之圖表。圖12係表示對試驗例3中之各群(Cont、L-Trp、D-Trp)之每1 cm大腸之重量(Colon weight(g/cm))進行計算所得之結果之圖表。圖13係對試驗例3之各群(Cont、L-Trp、D-Trp)中之大腸之組織切片進行蘇木精-伊紅(HE)染色後之顯微鏡照片。圖14係表示對試驗例3中之各群(Cont、L-Trp、D-Trp)之大腸之炎症程度進行評分所得之結果(組織學評分)之圖表。圖15係表示試驗例3之各群(Cont、L-Trp、D-Trp)中之TNFα基因之表現量(相對表現量(Relative expression))之圖表。圖16係表示試驗例3之各群(Cont、L-Trp、D-Trp)中之IL-1β基因之表現量(相對表現量)之圖表。圖17係表示試驗例3之各群(Cont、L-Trp、D-Trp)中之IL-6基因之表現量(相對表現量)之圖表。圖18係表示試驗例4中之對照群(Cont)及D-色胺酸群(D-Trp)之體重推移之圖表。圖19係表示試驗例4中之對照群(Cont)及D-色胺酸群(D-Trp)之大腸長度(Colon length(cm))之測定結果之圖表。

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Claims

一種用於炎症性腸疾病之預防或改善之組合物，其含有D-色胺酸作為有效成分。
如請求項1之組合物，其為經口用組合物或經腸用組合物。
如請求項1之組合物，其為飲食組合物、醫藥組合物、或準醫藥組合物。
如請求項1之組合物，其中上述炎症性腸疾病為選自由克隆氏病、潰瘍性結腸炎、及壞死性腸炎所組成之群之至少一種。
如請求項1之組合物，其中對人類之每天投予量以D-色胺酸之游離體換算量計為0.01～1000 mg/kg。
一種用於腸內細菌叢調節之組合物，其含有D-色胺酸作為有效成分。
如請求項6之組合物，其為經口用組合物或經腸用組合物。
如請求項6之組合物，其為飲食組合物、醫藥組合物、或準醫藥組合物。
如請求項6之組合物，其中對人類之每天投予量以D-色胺酸之游離體換算量計為0.001～50 mg/kg。