UVM MÉXICO Escuela de Ciencias de la Salud
Universidad del Valle de México
Practica Número 12: Espectro fotometría de absorción visible: Preparación de un
espectro de absorción y una curva estándar.
Anette Ayelén Bandera Pérez, David López Barragán, Kauris Aranza Ovando
Ascencio, Perla Zafiro Solís Rodríguez, Yuliana Zapata Reyes.
Asignatura: Física Aplicada a las Ciencias Farmacéuticas.
Licenciatura: QFBT
Periodo 2022-2
Fecha de entrega: 09 de enero del 2023.
Docente: M.C José de Jesús Fernández Jiménez
RESUMEN
En esta práctica se llevó a cabo la preparación de seis soluciones con colorante rojo,
de la cual la primera fue la solución madre y de esta salieron las otras cinco, después
de realizar estas soluciones procedimos a la realización del espectro de absorción
donde ocupamos un espectrofotómetro y realizamos aproximadamente un poco más
de 30 lecturas.
Palabras clave: Absorbancia, espectrofotómetro, longitud de onda, concentración, rojo.
Introducción
seleccionar la longitud de onda de la luz
La espectrofotometría UV-visible es una que pasa por una solución y medir la
técnica analítica que permite determinar cantidad de luz absorbida por la misma.
la concentración de un compuesto en
El estudio a nivel bioquímico de
solución. Se basa en que las moléculas
cualquier biomolécula requiere la
absorben las radiaciones
utilización de técnicas analíticas que
electromagnéticas y a su vez que la
permitan su determinación cualitativa y
cantidad de luz absorbida depende de
cuantitativa, así como su caracterización
forma lineal de la concentración. Para
fisicoquímica y biológica. Uno de los
hacer este tipo de medidas se emplea un
métodos más sencillos, accesibles, útiles
espectrofotómetro, en el que se puede
y utilizados es la espectroscopía, en
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general, y la espectroscopía ultravioleta- dobles enlaces aislados, triples enlaces,
visible, en particular. Se pueden enlaces peptídicos, sistemas aromáticos,
identificar y cuantificar biomoléculas en grupos carbonilos y otros heteroátomos
solución y en muestras biológicas, con el tienen su máxima absorbancia en la
empleo de reactivos específicos que región UV, por lo que ésta es muy
reaccionan con el compuesto a analizar importante para la determinación
y forman un producto coloreado que cualitativa y cuantitativa de compuestos
permite detectarlo en muestras orgánicos. Diversos factores -como pH,
complejas. concentración de sal y el disolvente- que
alteran la carga de las moléculas,
El fundamento de la espectroscopía se
provocan desplazamientos de los
debe a la capacidad de las moléculas
espectros UV.
para absorber radiaciones, entre ellas las
radiaciones dentro del espectro UV
visible. Las longitudes de onda de las En la región visible apreciamos el color
radiaciones que una molécula puede visible de una solución y que
absorber y la eficiencia con la que se corresponde a las longitudes de onda de
absorben dependen de la estructura luz que transmite, no que absorbe. El
atómica y de las condiciones del medio color que absorbe es el complementario
(pH, temperatura, fuerza iónica, del color que transmite.
constante dieléctrica), por lo que dicha
técnica constituye un valioso Por tanto, para realizar mediciones de
instrumento para la determinación y absorción es necesario utilizar la
caracterización de biomoléculas. longitud de onda en la que absorbe luz
la solución coloreada.
En espectroscopía el término luz no sólo
se aplica a la forma visible de radiación
Transmitancia y Absorbancia
electromagnética, sino también a las
formas UV e IR, que son invisibles. En
espectrofotometría de absorbancia se La transmitancia (T) de una sustancia en
utilizan las regiones del ultravioleta (UV solución es la relación entre la cantidad
cercano, de 195-400 nm) y el visible de luz transmitida que llega al detector
(400-780 nm). una vez que ha atravesado la muestra, It,
y la cantidad de luz que incidió sobre
ella, Io, y se representa normalmente en
tanto por ciento: % T = It/Io x 100
La transmitancia nos da una medida
Figura 1. Espectro electromagnético. física de la relación de intensidad
incidente y transmitida al pasar por la
La región UV se define como el rango de muestra. La relación entre %T y la
longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es concentración no es lineal, pero asume
una región de energía muy alta. Provoca una relación logarítmica inversa.
daño al ojo humano, así como
quemadura común. Los compuestos con
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La absorbancia (A) es un concepto más Objetivos:
relacionado con la muestra puesto que
nos indica la cantidad de luz absorbida • Aprender el uso del
por la misma, y se define como el espectrofotómetro
logaritmo de 1/T, en consecuencia: A = • Aprender a preparar un espectro
log 1/T = -log T = -log It/ Io. de absorción
• Graficar una curva estándar
Cuando la intensidad incidente y
transmitida son iguales (Io = It), la Hipótesis:
transmitancia es del 100% e indica que
la muestra no absorbe a una A través de investigaciones y previa
determinada longitud de onda, y explicación del docente se utilizará el
entonces A vale log 1 = 0. equipo de espectrofotometría para medir
la absorbancia de las soluciones.
Planteamiento del problema:
Metodología:
La espectrofotometría es una técnica
analítica utilizada para medir cuánta luz 1.Consulte el manual de operación del
absorbe una sustancia considerando la espectrofotómetro y ajústelo de acuerdo
intensidad de luz inicial y la intensidad con lo establecido en él. 2.Prepare las
de luz al pasar por dicha sustancia. En la siguientes soluciones del colorante para
presente práctica seremos capaces de todo el grupo (cada uno de los equipos
comprender el funcionamiento de un deberá preparar 1 solución), utilizando
espectrofotómetro, la preparación de agua:
muestras y la interpretación de
resultados. Sol.N°1. -Concentración= 1000 ppm;
prepare 100ml.
Justificación:
Sol.N°2.-Concentración= 10 ppm;
La realización de la presente práctica es prepare 100 ml (a partir de la solución
N°1)
de importancia ya que gracias a la
espectrofotometría es posible identificar
compuestos por su espectro de absorción Sol.N°3.-Concentración= 2 ppm;
prepare 100 ml (a partir de la solución
y conocer la concentración de un
N°1)
material o sustancia, esto nos permite
conocer la concentración de
compuestos; tiene aplicaciones en Sol.N°4.-Concentración= 4 ppm;
prepare 100ml (a partir de la solución
muchas áreas de la ciencia, incluidas la
N°1)
microbiología, la bioquímica, la física,
entre otras.
Sol.N°5.-Concentración= 6 ppm;
prepare 100 ml (a partir de la solución
N°1)
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Sol.N°6.-Concentración=8 ppm; cuál sería la longitud de onda esperada
prepare 100 ml (a partir de la solución para la misma sustancia problema.
N°1)
Evidencia fotográfica:
3. Espectro de absorción. Utilice la
solución número 2 y lea en un rango de
longitud de onda de 380-740nm, a
intervalos de 36nm. Determine la
absorbancia. Recuerde que el
espectrofotómetro se debe ajustar a cero
con el solvente (BLANCO-agua
destilada), previo alas determinación es
de la absorbancia.
4.Curva estándar. Habiendo fijado la
longitud de onda elegida, determiné la Imagen 1.0. se pesó el colorante a 0.10g
absorbancia de las siguientes soluciones,
número 3, 4, 5, 6 y 2, en este orden.
Utilice agua destilada como BLANCO.
Complete la siguiente tabla:
1.1. Se aforó el colorante con agua destilada
y se pipeteó para hacer las otras
soluciones.
5.Construya el gráfico de absorbancia
contra longitud de onda. Elija la
longitud de onda más adecuada para la
realización de la curva estándar.
6.Determine por correlación lineal,
cuadrática o polinomial u otras (ve a el
comportamiento de su curva) la
ecuación que expresa el
comportamiento de la absorbancia vs
concentración. Identifique la pendiente
de la línea, así como su punto de corte 1.2. soluciones aforadas y listas
en el eje Y.
7.Apartir de la ecuación anterior,
determine para una solución a 14 ppm
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Resultados:
-Previamente a la práctica, recibimos
por parte del docente una capacitación
acerca del correcto uso y precauciones
del Espectrofotómetro además de
una explicación sobre el manejo de las
celdas, para así reducir la probabilidad
de provocar un accidente o un resultado
erróneo.
1.3. celda cubeta para espectrofotómetro -Iniciamos preparando 100 ml de una
“Solución madre” de colorante y agua
con una concentración de 1000 ppm.
-Proseguimos preparando 5 soluciones
utilizando la “Solución madre” pero a
diferentes concentraciones, se preparó
Solución Solvente una solución a 10 ppm, a 2 ppm, a 4
blanco ppm, a 6 ppm y a 8 ppm las cuales fueron
aforadas en matraces aforados de 100
ml.
-Una vez que las soluciones estaban
listas, comenzamos a calibrar las celdas
que se usarían para el espectrógrafo,
preparamos una celda la cual llenamos
con una muestra de agua destilada pura
1.4. celdas con soluciones y listas para ir al
espectrofotómetro
la cual llamamos “Blanco” y otra celda
que llenábamos con las muestras de las
soluciones de distintas concentraciones.
-En el espectrógrafo se colocaban las
celdas con su lado liso apuntando hacia
donde estaba el láser y se iniciaba
calibrando el espectrógrafo utilizando el
“Blanco” para reiniciar el contador y se
colocaba en su lugar la celda con la
solución y se daba iniciar para conocer
el espectro de absorción, en cada
muestra se calibró el espectrógrafo con
rangos de 380 hasta 740 nm cambiando
intervalos de 36 nm sobre cada muestra.
1.5. espectrofotómetro, primero se coloca
el solvente blanco y luego la solución
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Gráfica de resultados de acuerdo con los Longitud de onda: 488nm
valores de absorbancia obtenidos
Longitud de onda: 380nm
Longitud de onda: 524nm
Longitud de onda: 416nm
Longitud de onda: 560nm
Longitud de onda: 452nm
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Longitud de onda:596nm Longitud de onda: 704nm
Longitud de onda: 632nm Longitud de onda: 740nm
Longitud de onda: 668nm Análisis de resultados:
El índice de absorción se conoce como
la fracción de radiación que un material
puede absorber cuando una frecuencia
impacta sobre este. La celda con
“Blanco” da un resultado de 0 debido a
que al ser una sustancia pura la
frecuencia que emite el rayo pasa sin
problema por la celda, mientras que la
solución con colorante esta alterada con
el color rojo, recordando que los colores
tienen frecuencias que los caracterizan al
momento de poner la celda de la
solución el índice de absorción
registrado es que rango de frecuencias
entre el rango de frecuencia de la luz roja
es absorbida durante el proceso.
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Conclusiones: David López: El utilizar los equipos del
laboratorio me agrada mucho y me
Perla Solís: Esta práctica fue muy emociona bastante debido a que cada
diferente a las anteriores ya que el maquina es capaz de realizar un trabajo
equipo de espectrofotometría era que sin su utilización sería imposible, El
completamente desconocido para mí, utilizar el espectrógrafo me pareció
este equipo es muy utilizado en los bastante tardado debido a que debíamos
laboratorios, presenta una precisión y de alternar entre la muestra de “Blanco”
exactitud adecuada por lo cual si lo y la muestra de solución para poder
sabemos utilizar tendremos resultados calibrarlo, El trabajo en equipo durante
confiables, el conocer el adecuado uso esta práctica fue necesario debido a que
del espectrofotómetro me permitió solo contábamos con 2 espectrógrafos
realizar esta práctica, con el fin de para 4 equipos pero el resultado y la
conocer la intensidad de absorbancia finalización de la práctica fue optimo.
que tenían mis muestras.
Referencias:
Kauris Ovando: Fue una práctica muy
interesante y bastante tardada, tomo su • Díaz, N. A., Antonio Bárcena
tiempo hacerlo ya que fueron muchas Ruiz, J., Reyes, E. F., Cejudo, A.
lecturas tomadas, en esta práctica pude
G., Novo, J. J., Peinado, J. P.,
trabajar con un espectrofotómetro y
Meléndez-Valdés, F. T., & Fiñana,
aprender sobre este.
I. T. (s/f). 8. Espectrofometría:
Yuliana Zapata: Esta práctica se llegó a Espectros de absorción y
la conclusión de como utilizó el cuantificación colorimétrica de
espectrofotómetro ya que uno de los biomoléculas. Uco.es. Recuperado
objetivos de la practica era aprender el el 9 de enero de 2023, de
uso de ese equipo, también se vieron los https://www.uco.es/dptos/bioqui
cálculos para una solución madre y se mica-biol-
llevó a cabo el uso de un espectro de
mol/pdfs/08_ESPECTROFOTO
absorción y por supuesto se cumplió con
METRIA.pdf#:~:text=En%20espe
la hipótesis y el planteamiento del
problema correctamente. ctroscop%C3%ADa%20el%20t%C
3%A9rmino%20luz%20no%20s%
Anette Bandera: Durante el desarrollo C3%B3lo%20se,de%20195-
de la práctica preparamos muestras con 400%20nm%29%20y%20el%20visi
distintas concentraciones a partir de una ble%20%28400-780%20nm%29.
solución madre, posterior a eso
• Experimental, L. D. Q. (2023, 9
trabajamos con el espectrofotómetro el
enero). Práctica 22.
cual nos dio los valores de absorbancia y
Espectrofotometría de absorción
transmitancia de las distintas soluciones
con diferentes concentraciones y a partir visible.
de los datos obtenidos, establecer una https://practicaslaboratorio08.blo
relación longitud de onda vs gspot.com/2013/04/practica-22-
absorbancia. espectrofotometria-de.html
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