Facultad de Ciencias Farmacuticas y Bioqumica Curso: FARMACOGNOSIA Profesor: HERRERA HERNANDEZ, NORA Tema:

Horario: G1 -- Martes de 11:20am a 1:00pm

Integrantes: MALPARTIDA OR, KELLY PIZARRO VENTOCILLA, DAMARIS AROSTEGUI BACA, MARINA

-2011-

INTRODUCCIN Este trabajo se realiz esencialmente para reconocer los diferentes

metabolitos secundarios, de diversas plantas mediante pruebas qumicas. En cada una de las muestras se realizaron diferentes pruebas de acuerdo al metabolito que contenan. Para saber que reactivo especfico se debe usar en cada tipo de metabolito para su reconocimiento, se tuvo un conocimiento previo de la estructura molecular de cada metabolito diferente que contena la muestra, y tambin de la planta que lo contiene. Teniendo en cuenta todos estos datos se concluy satisfactoriamente la prctica. Para esta prueba tambin se tuvo mtodos de extraccin, para cada muestra diferente, ya que sin este procedimiento necesario no se podra identificar ningn metabolito.

OBJETIVO Identificar y clasificar los diferentes metabolitos secundarios presentes en el tejido vegetal de diferentes especies vegetales, por medio de pruebas

qumicas de coloracin y precipitacin.

MARCO TEORICO

Desde la antigedad se usan a las plantas por la actividad teraputica que poseen, sin embargo no se sabia las causas de ese efecto. Ahora en la actualidad con el avance cientfico, estos se conocen tanto por su actividad y estructura. En Estados Unidos por ejemplo el 25% de las recetas medicas, contienen medicamentos cuyos principios activos son derivados de plantas. 1 Un gran porcentaje de principios activos estn comprendidos dentro de los llamados metabolitos secundarios, estos son sintetizados en la planta, y tienen una estructura molecular compleja.1Estos metabolitos secundarios cumplen una funcin especfica en la planta as como: la funcin de la clorofila sirve para la captacin de luz y los aceites esenciales para la polinizacin y control de plagas.2 Los metabolitos secundarios se originan luego de las rutas metablicas de los

bsicas, Las propiedades qumicas de los diferentes compuestos

metabolitos secundarios se basan esencialmente en su estructura qumica y grupo funcional que poseen dichos compuestos. As los terpenos pueden presentarse como alcoholes (mentol), teres (cineol), cetona (carvona), etc., y estos a su vez tienen propiedades qumicas similares a los terpenoides.5 Alcaloides: Son sustancias orgnicas, que proceden principalmente del metabolismo secundario. Se forman a partir de los aminocidos. Los principales productores de alcaloides son las plantas, las principales familias que lo contienen son:

Solanceas, Papaverceas, Rubiceas, Apocinceas. Tambin se pueden encontrar en bacterias e insectos.5 La deteccin de alcaloides se clasifica en 3:4 1. Reacciones de precipitacin: Combinacin de alcaloides con metales

pesados en medio acido. cidos de elevado peso molecular: Ac. Fosfowolfrmico, ac.

Silicowolfrmico, ac. Fosfomolibdnico. Reactivos yodados: reactivo de Valser y Meyers, reactivo de Wagner, reactivo de Dragendorff y otros. 2. Reacciones de cristalizacin: acido pcrico, cloruro cloruro de mercurio. 3. Reacciones coloreadas: reacciones de deshidratacin con H2SO4, oxidacin con HNO3, KMnO4. Reactivo de Vitali Morn: Detecta alcaloides tropnicos y produce una coloracin violeta. Reactivo de Van Urk: p-dimetilaminobenzaldehido. Detecta alcaloides con el ncleo de ergolina. Produce coloracin azul. Raactivo de Oberlin Zeisel: Detecta protolonas. y bromuro rico y

Flavonoides: Los Flavonoides son grupos relacionados a los antocianos, catequinas y

leucontocianidinas.4Se conocen diez clases de Flavonoides y todos tienen un ncleo bsico formado por quince carbonos, son estructuras del tipo C 6-C3-C6 con dos anillos aromticos.1 Este compuesto se identifica generalmente por cromatografa de capa fina (CCF) y revelado UV.4 Saponinas: Son compuestos tensoactivos naturales. Para identificarlas solo se agita la solucin acuosa y se observa la formacin de espuma. Las saponinas se clasifican de acuerdo a la naturaleza del aglicn:

Las que tienen aglicn triterpenico se denominan saponinas triterpnicas y las que lo tienen esterodica.4 Cumarinas: Son metabolitos secundarios ampliamente difundido en el reino vegetal. Las familias que poseen gran cantidad de Cumarinas son las Fabceas, con estructura esterodica se denominan saponinas

Rubiceas, Rutceas, Asterceas, umbelferas, Apocinceas y compuestos. Tambin se encuentran en ciertos hongos del genero Aspergillus.4 Para su identificacin; Estas producen embargo hay falsos positivos como (cardiotnicos, terpenlactonas).2 Taninos: Los taninos estn constituidos por un amplio hidrosolubles grupo de compuestos fluorescencia bajo la luz UV. Sin son los compuestos lactnicos

con estructura polifenlica, capaces de precipitar ciertas

macromolculas (protenas, alcaloides, celulosa, gelatina).4 Su identificacin consiste, en una solucin acuo-alcohlica al aadir cloruro frrico producen diferentes coloraciones y precipitan las protenas.

Antocianina: Las antocianinas son compuestos fenlicos que se encuentran principalmente en frutos, flores y hojas de las plantas, y son las responsables de conferir los colores rojos, azul, violeta. Se sintetizan a partir de la conversin de los

precursores fenilalanina y acetato, va el metabolismo del fenil propanoide , y se acumulan en las vacuolas de las clulas hipodermales. Su estructura

corresponde a heterociclos formados por la combinacin de una aglicona o un azcar.6

MTODO EXPERIMENTAL Equipos: Centrfuga Balanza digital Reactivo Kedde, soluciones AyB ETOH Diclorometano Benceno Anhidrido actico cido sulfrico concentrado cido clorhdrico concentrado

Materiales: Papel de filtro Matraz erlenmeyer Cuchillo Probeta x 100 mL Pipeta x 5 mL Mortero Tubos de ensayos

Muestras biolgicas: Llanten --Plantago major Uvas --Vitis vinifera Hojas de tabaco --Nicotiana tabacum Soja-- Glycine max Petalos de rosas --Rosa gallica Sabila --Aloe vera Manzanilla Matricaria recutita

Reactivos: HCl al 5% Urea 10 M FeCl3 al 10% cido sulfrico al 50% Solucin de NaOH al 5% con amonaco al 2% Reactivo de Dragendorff, Mayer y Wagner Reactivo gelatina sal

PROCEDIMIENTO: EXPERIENCIA 1: IDENTIFICACIN DE ALCALOIDES Muestra: Nicotiana tabacum

Desmenuzar en un mortero x gr de la muestra fresca y colocarlos en un matraz erlenmeyer. Lo mismo realizar con la muestra seca.

- Adicionar un volumen suficiente de HCL al 5%, para que toda la muestra este en contacto con la solucin cida. (Ambas muestras).

Calentar con agitacin en bao mara por 5 minutos, enfriar y filtrar. (Ambas muestras).

Colocar 1ml de la solucin en 3 tubos de ensayo y aadir 2 gotas de reactivo:

Dragendorff

Mayer

Wagner

EXPERIENCIA2: IDENTIFICACIN DE FLAVONOIDES Y ANTOCIANIDINAS Muestra: Vitis vinifera

- Colocar x gr de la muestra desmenuzada en un matraz erlenmeyer.

- Aadir un volumen suficiente de etanol que cubra toda la muestre y le de fluidez.

- Calentar en bao mara durante 5 minutos luego enfriar y filtrar.

ENSAYO FLAVONOIDES - Colocar 1 limadura de magnesio en un tubo de ensayo y 2 ml del filtrado, dejar caer varias gotas de HCL concentrado en zona. ENSAYO PARA LEUCOANTOCIANIDINAS -Colocar en un tubo de ensayos 2 mL del filtrado ms 1 mL de HCl concentrado, calentar en bao de agua hirviendo durante 15 minutos. La aparicin de coloraciones rojas es prueba positiva de la existencia de leucoantocianidinas en la muestra.

EXPERIENCIA3: IDENTIFICACIN DE SAPONINAS Muestra: Aloe vera

- En un mortero desmenuzamos 10g de muestra fresca con unos ml de agua. Filtramos,

MUESTRA

(ALOE VERA)

MOLER LA MUESTRA

FILTRAR En un tubo de ensayo tapado, agitamos 4 ml del filtrado acuoso durante 1min. EXPERIENCIA 4: IDENTIFICACIN DE TANINOS Muestra: Plantago major

- E n un mortero desmenuzarmos 10g de la muestra fresca con unos ml de agua.

Filtramos y colocamos en un tubo de ensayo 1ml del filtrado y un 1 ml de reactivo gelatina- salluego aadimos 2 a 3 gotas de solucin de FeCl3 al10 %.

EXPERIENCIA 5: IDENTIFICACIN DE ESTEROIDES Y/O TRITERPENOSIDES Muestra: Glycine max

- En un mortero trituamos la muestra vegetal seca.

Agregamos volumen suficiente de diclorometano y extrajimos por agitacin. Filtramos, luego se seca por un minuto con sulfato de sodio.

En un tubo de ensayo limpio y seco colocamos 1 ml del filtrado orgnico y 1 ml de anhdrido actico. Por la pared del tubo dejamos resbalar cuidadosamente 1 a 2 gotas de acido sulfrico concentrado, tal como vemos en la imagen

EXPERIENCIA 6: IDENTIFICACIN DE QUINONAS Muestra: Aloe vera

- En el reflujo colocamos 5 g de muestra fresca (o un g de muestra seca) con unos 25ml de HCl al 5% reflujamos por 5 minutos, filtramos cuando se enfri. Colocamos en un tubo de ensayo 5 ml del filtrado acuoso mas 1 ml perxido de hidrogeno al 20% y 1 ml de acido sulfrico al 50%. Calentamos la mezcla en bao de agua hirviendo durante 15 minutos. Enfriar, agregar 5 ml de tolueno, agitamos sin emulsionar. Recuperamos la fase toluenica y trasvasamos 2 ml a un tubo de ensayo, agregamos 1 ml de solucin de NaOH al 5% con amoniaco al 2%, agitamos sin emulsionar.

EXPERIENCIA 7: IDENTIFICACIN DE ANTOCIANOS Muestra: Vitis vinifera

- En un matraz erlenmeyer colocamos la muestra fresca finalmente desmenuzada y 200 ml de agua, calentamos a ebullicin durante 5 minutos y filtrar. En un tubo de ensayo colocamos 2 ml del filtrado y 1 ml de NaOH diluido, en otro tubo de ensayo colocamos 2 ml de filtrado y 6 gotas de un acido mineral diluido.

EXPERIENCIA 8: IDENTIFICACIN DE CUMARINAS Muestra: Matricaria recutita

En un tubo de ensayo agregamos un 1 g de la planta fresca con la cantidad suficiente de etanol comercial cubrimos la boca del tubo con un papel de filtro blanco humedecido en NaOH y sujetado con una pita. Calentamos el tubo hasta ebullicin durante 5 minutos, enfriamos y retiramos el papel de filtro.

RESULTADOS Experiencia 1: Los resultados se muestran en el siguiente cuadro: N de tubo Reactivo Dragendorff Presenta precipitado Resultado de prueba un positiva de Imagen del resulado

color anaranjado. Meyers Solucin de color positiva blanco-crema turbio Wagner precipitado marrn color positiva

Experiencia 2: Los resultados se observan en el siguiente cuadro: FLAVONOIDES LEUCOANTOCIANIDINAS rojo de la

Anillo de color rosado en Coloracin Formacin la superficie solucin

Resultado del ensayo

Positivo

Positivo

Imagen del resultado

Experiencia 3: Identificacin de saponinas:

Luego de la agitacin por un minuto, se observ la formacin de espuma persistente.

Experiencia 4: Identificacin de taninos

Al agregar gelatina se observ la presencia de un pequeo precipitado, y luego al final del procedimiento al agregar FeCl3 se observ la formacin de un color verde amarronado.

Experiencia 5: Identificacin triterpenoides y/o esteroides

Al agregar el acido sulfrico a la solucin preparada se observo la formacin de un color rojo anaranjado que se a medida pasaba el tiempo se fue haciendo ms intenso.

Experiencia 6: Identificacin de quinonas

Luego de realizar el procedimiento previamente, se agreg al final una solucin de NaOH al 5% con amonaco al 2% y el extracto se coloreo de color rosado.

Experiencia 7: Identificacin de antocianinas.

Los resultados se observan en el siguiente cuadro:

MEDIO CIDO PRUEBA COLOR Positiva Rosado

MEDIO BSICO Positiva Incoloro

IMAGEN

Experiencia 8: Identificacin de cumarinas En el papel filtro se observ traslucidez,se observa en la imagen, sin embargo no se lleg a concluir esta prueba por la falta de equipo.

DISCUSIN Experiencia 1: Identificacin de alcaloides

Las tcnicas de reconocimiento de alcaloides estan basadas en la capacidad que tienen los alcaloides en estado de sal (extractos cidos), de combinarse con el yodo y metales pesados como bismuto, mercurio, tungsteno formando precipitados coloreados. Por ejemplo nosotros, al agregar a la solucin que contena alcaloides, previa extraccin, el reactivo de Dragendorff form junto con la solucin un precipitado de color naranja, este precipitado es el -tetra yodo bismutato de potasio- , mientras que en la molcula de alcaloide el hidrogeno es reemplazado por I- . Esta reaccin se encuentra en el anexo1.

Experiencia 2: Identificacin de Flavonoides y leucoantocianidinas

El procedimiento realizado tambin es llamado el ensayo de shinoda. La muestra con la que trabajamos contiene flavonoides, el color rojo de los petalos se debe a los Flavonoides. Los flavonoides con el ncleo benzopirona (p. ej. flavonas, flavonoles, flavanonas, etc.) producen coloraciones de rosado a rojizo. Se desconoce el mecanismo de reaccin.

La identificacin de leucoantocianidinas se concluy satisfactoriamente, sin embargo la solucin se coloreo de rojo sin necesidad de calentarlo. El ensayo de Rosenheim (para leucoantocianidinas) es igual hasta la mitad al procedimiento que se llevo a cabo, el ensayo de Rosenheim consiste en agregar HCl() al filtrado y luego agregar alcohol amlico, agitar y observar las fases, y por ultimo llevar a calentamiento hasta que el alcohol amilico se coloree a color carmes.

Experiencia 3: Identificacin de saponinas: Las saponinas son un conjunto de glucsidos que se disuelven en agua y disminuyen la tensin superficial de esta, por lo tanto, al sacudir una solucin que contiene saponinas y agua, se forma espuma abundante y relativamente estable. Por hidrlisis de las saponinas se obtienen carbohidratos y esteroide, es decir tiene un elemento soluble en lpidos (esteroide), y soluble en agua

(azcar), es por esa razn que presencia de espuma.

observamos en nuestro tubo de ensayo

Experiencia 4: Identificacin de taninos La determinacin de taninos con gelatina, fue propuesto por Lowental, este mtodo sirve para la eliminacin de taninos por precipitacin de una muestra. La formacin de precipitado con gelatina es una importante reaccin de reconocimiento del carcter curtiente de una combinacin de los polifenoles implicados. El color verde- marrn que nos dio como resultado la solucin que contena taninos, se debe a que el grupo R-OH del compuesto, tiende a colorearse con soluciones frricas, en este caso se us el FeCl3. Experiencia 5: Identificacin triterpenoides y/o esteroides El procedimiento realizado es llamado La reaccin de Liebermen Burchard. Para esta reaccin nosotros previamente extrajimos el lipido con

diclorometano. Esta reaccin se lleva a cabo en una medio acido fuerte, en nuestro caso lo constituyo el anhdrido actico y el acido sulfrico concentrado. En la reaccin el esteroide sufre oxidacin, formndose un compuesto con doble enlace adicional del cual deriva. La coloracin se debe al que el grupo OH del compuesto se protona y este luego de protonarse forma agua, y por ello da un color anaranjado rojizo.

Experiencia 6: Identificacin de quinonas

La identificacin de quinonas se llev a cabo satisfactriamente, el reflujo de la muestra por 5 minutos junto con el FeCl3 en medio cido, tiene como fin romper las uniones C-glicsido y ayudar a la oxidacin de las formas reducidas hasta quinonas. En otras palabras al usar nosotros el acido clorhdrico hidrolizamos todos los glicosidos de la muestra para asi dejar libres la moleculas de quinonas. Luego de este procedimiento se hace la particin con un solvente orgnico. La fase orgnica (en nuestro caso el tolueno) se pone en contacto

con una solucin de NaOH al 5% con amonaco al 2% y este nos da como resultado una coloracin roja.

Experiencia 7: Identificacin de antocianinas Esta prueba esencialmente esta basada en el efecto de pH. Las antocianinas son ms estables en un medio cido que en un medio neutro o alcalino. Nosotros tuvimos dos tubos de prueba el cual contena el filtrado de la misma muestra (extracto de uvas sin ollejo), sin embargo a uno se le acidul con H2SO4() y al otro se le agrego NaOH. En medio cido la forma predominante es la del in flavilio, el cual nos dio el color rosado, cuanto la muestra fue sometida a pH bsico o alcalino, el in flavilio es susceptible al ataque nucleoflico por parte del agua, producindose la pseudobase carbinol y/o chalcona, estas dos formas son incoloras, por ello al agregar el NaOH la solucin no cambi de color. Las dos reaccione acido / base se observan en el anexo 3.

Experiencia 8: Identificacin de cumarinas

Esta practica no se concluy, ya que a universidad no cuenta con el equipo para determinar la coloracin.

CONCLUSIONES

La identificacin de metabolitos es muy importante, ya que as podemos reconocer los diferentes metabolitos que tiene una planta de composicin qumica desconocida.

El reconocimiento de los metabolitos tambin sirve para verificar lo extrado, ya que muchas veces se realizan extracciones de metabolitos secundarios de una especie, y se desconoce si la extraccin fue buena, as que se pueden verificar por medio de reacciones qumicas, la presencia de estos, con reactivos especficos para cada metabolito.

Los metabolitos secundarios son muchos y diferentes, e cuanto a su estructura, propiedades, grupo funcional, etc. Por lo tanto es necesario usar diferentes ensayos de reconocimiento, en otras palabras usando reactivos y tcnicas especialmente diseadas para cada metabolito.

BIBLIOGRAFIA 1. Lock de Ugaz. Anlisis fotoqumico y metabolitos secundarios [citada el 16 de setiembre del 2011]; [24 pginas].Disponible en:

http://www.bvsde.paho.org/texcom/manualesMEC/fitoterapia/cap4.pdf

2. Martnez M. Ensayos de Reconocimiento de Metabolitos Secundarios de Inters Farmacutico. [citada el 16 de setiembre del 2011]; [14 pginas]. Disponible en: http://farmacia.udea.edu.co/~ff/ensayos2os.pdf

3. Claus E., Varru E. Farmacognosia. El Ateneo. Argentina. 1965. (533 pginas)

4. Kuklinski, C. Farmacognosia- Estudio de las drogas y sustancias medicamentosas de origen natural. Omega.Espaa.2003. (515 pginas) 5. Trease y Evans. Farmacognosia. Nueva editorial interamericano.Mexico.1991. (1054 pginas)

6. Del Valle Leguizamn, et, Antocianinas en la uvay su relacin con el color [citada el 02de octubre del 2011]; [11 pginas].Disponible en: http://redalyc.uaemex.mx/pdf/610/61028408.pdf

ANEXO