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WO2005052156A1 - 肝癌の検出方法及び肝癌診断薬並びに癌治療薬 - Google Patents

肝癌の検出方法及び肝癌診断薬並びに癌治療薬 Download PDF

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WO2005052156A1
WO2005052156A1 PCT/JP2004/017499 JP2004017499W WO2005052156A1 WO 2005052156 A1 WO2005052156 A1 WO 2005052156A1 JP 2004017499 W JP2004017499 W JP 2004017499W WO 2005052156 A1 WO2005052156 A1 WO 2005052156A1
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WO
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dlk
antibody
human
cells
cancer
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/017499
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English (en)
French (fr)
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Koji Nakamura
Hiroko Anzai
Hiroyuki Yanai
Atsushi Miyajima
Original Assignee
Kanagawa Academy Of Science And Technology
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Publication date
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    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/9121—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases

Definitions

  • liver cancer detection method liver cancer diagnostic agent and cancer therapeutic agent
  • the present invention relates to a method for detecting liver cancer, a diagnostic agent for liver cancer, and a therapeutic agent for cancer.
  • Hepatocellular carcinoma is one of the most common carcinomas in the world, and it is particularly common in Southeast Asia, China, and sub-Saharan Africa. The incidence and prevalence in Japan are also high. The number of deaths from liver cancer in Japan is over 30,000 annually and is still increasing. Most hepatocellular carcinomas are hepatocellular carcinomas, whose origin is due to hepatitis virus infection. However, the mechanism by which cancer progresses from viral hepatitis to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma is still unknown. Therefore, the currently used diagnostic methods (ultrasound diagnosis, imaging diagnosis using CT, blood diagnosis using tumor markers such as ⁇ -fetoprotein (AFP)) target cancer tissues that have already formed.
  • AFP ⁇ -fetoprotein
  • Hematological diagnosis using AFP as a tumor marker is simple but not highly specific for liver cancer, and is known to show high values in cirrhosis and hepatitis.
  • liver cancer The death toll from liver cancer is more than 35,000 a year, making it the third-largest cancer death. In the future, the incidence of liver cancer is expected to increase further unless innovative diagnostic and therapeutic agents are developed.
  • local therapy such as surgical hepatectomy, percutaneous ethanol injection therapy, and hepatic artery embolization therapy and systemic therapy such as systemic administration of anticancer drugs and immunotherapy are used.
  • the mainstream of treatment is local treatment, which has the best hepatectomy S compared to percutaneous ethanol injection and hepatic artery embolization in terms of the degree of healing.
  • surgery is often not indicated, depending on the degree of impairment of liver function and the extent of tumor occupancy.
  • Non-Patent Document 1 With regard to systemic treatment, standard chemotherapy has not been established, and only cisplatin showed an efficacy rate of 10% or more in single-agent treatment, and The law has not been established (Non-Patent Document 1).
  • the immunostimulant Picibanil (OK-432) (Chugai Pharmaceutical) is effective against liver cancer. Even with these treatments, it is difficult to completely cure liver cancer due to multicentric carcinogenesis and recurrence. It is important to develop molecularly targeted drugs (therapeutic antibodies) that specifically attack liver cancer. It is considered to be.
  • Cancer cells are killed by in vivo immune mechanisms such as complement-dependent cytotoxicity (CDC) activity. Although few cancer-specific targeted drugs are currently being promoted, the development of a drug with high specificity for such cancers will increase the cure rate of cancer, including liver cancer. There is expected.
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • Dlkl / Pref-1 is a membrane protein having an EGF-like motif, and its extracellular region shows homology to the Notch / Delta / Serrate family.
  • Dlkl / Pref-1 has been cloned as a molecule that is expressed in a GRP (gastrin releasing peptide) -responsive cell line derived from small cell lung cancer (Non-Patent Document 1) or as a factor that suppresses preadipocyte cell division ( Non-patent document 2). Its expression is found in multiple tissues and organs during the fetal period, but is lost in most tissues after birth (Non-Patent Documents 2 and 3).
  • Non-patent Documents 4 and 5 Regarding the function of DM / Pref-1, in addition to the suppression of preadipocyte cell division, its involvement in hematopoiesis has recently been suggested (Non-Patent Document 6). However, the expression pattern and the like suggest that it may be involved in the undifferentiated state maintenance mechanism in undifferentiated cells.
  • a signal trap method that selectively isolates offspring, that is, genes encoding cell surface antigens and secretory proteins, a gene dlk highly expressed in the liver of mouse embryonic day 14.5 was identified.
  • Non-Patent Documents 7, 13 Dlk expression during mouse liver development was already seen before embryonic day 10 and was strongly expressed up to around embryonic day 16, but decreased rapidly around the time of birth and was not expressed in adult liver. Powerful (Non-Patent Documents 7, 13). Further, they have found that hepatic stem cells can be purified from fetal liver in one step with high purity using an anti-Dlk monoclonal antibody (Non-Patent Document 7, Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 Laborda, J., et al (1993) J. Biol. Chem. 268 (6): 3817-20
  • Non-Patent Document 2 Smas, CM., Et al (1993) Cell. 73 (4): 725-34
  • Non-Patent Document 3 Floridon, C, et al (2000) Differentiation 66 (1): 49-59
  • Non-Patent Document 4 Harken, J.C., et al (1999) Tumour Biol. 20 (5): 256-62
  • Non-Patent Document 5 Jensen, CH, et al (1999) Br. J. Dermatol. 140 (6): 1054-9
  • Non-Patent Document 6 Ohno, N., et al (2001) Stem Cells 19 (1): 71— 9
  • Non-Patent Document 7 Tanimizu, N "et al (2003) J. Cell Sci. 116 (Pt 9): 1775-86
  • Non-Patent Document 8 Onishi, M., et al (1996) Exp.Hematol. 24; 324-329
  • Non-Patent Document 9 Sell, S. (1993) Int.J. Dev. Biol. 37: 189-201
  • Non-Patent Document 10 Jensen, C.H. et al (1994) Eur.J. Biochem. 225: 83-92
  • Non-patent literature l l Kaneta, M. et al. (2000) J. Immunol. 164: 256-264
  • Non-Patent Document 12 Okada, S., et al (1993) Oncology. 50 (1): 22-26.
  • Non-Patent Document 13 Kitajima, T., et al (1999) Nat. Biotechnol. 17 (5): 487-490.
  • Non-Patent Document 14 Jensen, C. H "et al (1999) Br. J. Dermatol. 140 (6): 1054-1059.
  • Non-Patent Document 15 Russell, W. C, et al (1977) J. Gen . Virol. 36: 59-72.
  • Non-Patent Document 16 Kipps, T. J "et al (1985) J. Exp. Med. 161: 1-17.
  • Patent Document 1 International Publication WO 02/103033
  • the present inventors have conducted extensive studies and found that dlk was expressed on the surface of adult hepatoma cells, and demonstrated that the dlk could be used as a tumor marker to detect hepatoma cells. I confirmed it properly. Furthermore, we succeeded in producing an anti-human dlk monoclonal antibody that reacts antigen-antibody with the extracellular region of dlk expressed on the cell surface. Furthermore, it was confirmed that the anti-human dlk monoclonal antibody also had an antigen-antibody reaction with FA1, which is extracellular of dlk released into the blood.
  • the inventors of the present application have thought that there is a possibility that the anti-human Dlk monoclonal antibody will become a therapeutic antibody targeting cancer cells expressing Dlk.
  • the anti-human Dlk monoclonal antibodies produced we examined the antitumor activity that specifically kills cancer cell lines that expressed Dlk in an in vitro experimental system, and examined the anti-human Dlk monoclonal antibody.
  • the present inventors have completed the present invention after confirming the anticancer activity of the antibody.
  • the present invention provides a method for detecting liver cancer cells in a sample, using the expression of the dlk gene as an index. Further, the present invention provides a method for detecting liver cancer, comprising measuring the extracellular region of dlk present in blood or urine collected from a living body. Furthermore, the present invention provides a diagnostic agent for liver cancer, which comprises an antibody or an antigen-binding fragment thereof that reacts with the extracellular region of dlk as an antigen-antibody.
  • the present invention provides a nucleic acid for detecting liver cancer, which hybridizes with mRNA or cDNA of dlk gene and has a nucleic acid power which can be used as a primer or probe for measuring mRNA or cDNA of dlk gene. Further, the present invention provides the use of an antibody or an antigen-binding fragment thereof, which reacts with the extracellular region of dlk as an antigen-antibody, for the production of a diagnostic agent for liver cancer. Further, the present invention relates to a cancer therapeutic agent which is an antibody that reacts antigen-antibody with Dlk expressed on the surface of a cancer cell and which contains an antibody that exerts an anticancer effect on the cancer cell as an active ingredient. provide.
  • the present invention provides an effective amount of an antibody that is expressed on the surface of a cancer cell and reacts with Dlk as an antigen-antibody, and that exerts an anticancer effect on the cancer cell.
  • a method of treating cancer comprising administering.
  • the present invention relates to an antibody for performing an antigen-antibody reaction with Dlk expressed on the surface of a cancer cell, wherein the antibody exerts an anticancer effect on the cancer cell. The use of provide.
  • the present invention provides a method for detecting liver cancer using a novel liver cancer marker.
  • dlk in an adult is not detected in an organ other than the placenta and is not detected in a mouse acute liver injury model, it is possible to detect liver cancer with high specificity by the method of the present invention. Furthermore, dlk is also expressed in highly proliferative fetal hepatocytes and opal cells that appear during adult liver regeneration, and is considered to be expressed in proliferating liver cancer cells. It is considered that the liver cancer can be detected.
  • an anti-dlk monoclonal antibody it is possible to detect the extracellular region of dlk, FA1, which is released in blood or urine.The extracellular region of dlk was used as a tumor marker. It is possible to easily detect liver cancer by a blood test or urine test. Further, the present invention provides a novel therapeutic agent for cancer that exhibits a high anticancer effect.
  • the cancer therapeutic agent of the present invention is particularly effective for treating liver cancer.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of Northern blot showing Dlk gene expression in human fetuses and adult tissues.
  • A Dlk gene expression in fetal liver from 6 to 12 weeks of gestation
  • B Gene expression of Dlk in fetal tissues
  • C Gene expression of Dlk in adult tissues.
  • FIG. 2 shows the results of Dlk expression analysis in a human liver cancer-derived cell line, (A) FACS analysis, (B) immunofluorescent staining, and (C) RT-PCR analysis.
  • FIG. 3 is a photograph showing the expression of Dlk in human liver cancer tissue, showing the results for (A) hepatocellular carcinoma tissue and (B) cholangiocellular carcinoma tissue.
  • FIG. 4 shows the detection of human FA1 using an anti-human Dlk monoclonal antibody, and shows the results of detection and confirmation by ELISA.
  • B shows the detection of purified human FA1 using an anti-human Dlk monoclonal antibody. The results of detection and confirmation by ELISA using a luminescent substrate (QuantaBlu (trade name) Fluorogenic Peroxidase Substrates: PIERCE) are shown. Show.
  • FIG. 5 shows the results of immunostaining of human Dlk in tissues (64 years) based on Dlk staining.
  • the arrow indicates the Dlk-positive site as a reference.
  • FIG. 6 shows a stained image of hepatocellular carcinoma.
  • HE Hematoxylin'eosin staining Center: Human Dlk-positive immunostaining
  • Gradel Human immunostaining Gradel: HE, Dlk-positive (48-year-old male), Dlk-negative (39-year-old male)
  • Gradell HE, Dlk-positive ( 68-year-old man), Dlk-negative (36-year-old man)
  • Gradelll HE, Dlk-positive (63-year-old man), Dlk-negative (43-year-old man)
  • FIG. 7 is a view showing the expression of Dlk by FACS analysis of HEK293 cells and HEK293 (hdlk) cells.
  • Dotted line control IgG antibody
  • solid line anti-human Dlk monoclonal antibody.
  • FIG. 8 is a diagram showing CDC activity using an anti-human Dlk monoclonal antibody.
  • FIG. 9 is a graph showing ADCC activity using an anti-human Dlk monoclonal antibody.
  • HEK293 cells and HEK293 (hdlk) cells were cultured with 5 g / ml of antibody and healthy human peripheral blood mononuclear cells for 3 days. Then, ADCC activity was measured by MTT assay, and the result was shown by a standard error of the mean. The cells were cultured at a 1: 1 target ratio of 10: 1.
  • FIG. 10 shows the expression of Dlk in Huh-7 EGFP and Huh-7 (hdlk) cells (clone PC14, PC16) by FACS analysis.
  • Dotted line control IgG antibody
  • solid line anti-human Dlk monoclonal antibody
  • FIG. 11 is a view showing CDC activity using an anti-human Dlk monoclonal antibody.
  • B Antibody 0, 0.3, 1, 3, 5 to Huh-7 EGFP cells and Huh-7 (hdlk) cells (clone PC14, PC16)
  • the normal rat complement serum was added at 25% at a concentration of 10 ⁇ g / ml and cultured for 3 days. CDC activity was measured by MTT assay, and the mean value was indicated by standard error.
  • FIG. 12 is a view showing the effect of promoting tumorigenicity by human Dlk gene expression.
  • Huh-7 Tumor formation of EGFP and Huh-7 (hdlk) cells (clone PC14) subcutaneously in nude mice. The tumor volume (mm 3 ) up to 19 days after transplantation is shown.
  • B Tumor formation of Huh-7 EGFP and Huh-7 (hdlk) cells (clone PC16) subcutaneously in nude mice. No tumor volume (mm ') up to 21 days after transplantation.
  • dlk is expressed on adult liver cancer cells with high V and specificity, and that dlk antigen on the cell surface is expressed in tumors. It was found that liver cancer cells could be detected by using them as an indicator or by measuring the mRNA of the dlk gene. The present invention is based on this finding.
  • “measurement” includes detection, quantification, and semi-quantification.
  • dlk itself is known, the cDNA encoding dlk is cloned, and its nucleotide sequence and the amino acid sequence encoded by it are also known.
  • human dlk is shown in GenBank accession numbers U15979 and NM-003836.
  • Rat dlk is shown in GenBank accession numbers AB046763 and D84336 and the like.
  • the dlk of the network is shown in GenBank accession number AB009278.
  • the cDNA sequence of human dlk represented by GenBank accession number U15979 and the amino acid sequence encoded thereby are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing, respectively.
  • the extracellular region is a region of 24aa-304aa.
  • liver cancer cells can be detected by using this as a tumor marker antigen.
  • Hepatocellular carcinoma cells include hepatocellular carcinoma cells and cholangiocellular carcinoma cells, and as described in the examples below, it was confirmed that dlk was expressed on any of these surfaces.
  • the method itself for measuring a tumor marker antigen on a cell surface is well known, and can be performed by various methods utilizing an antigen-antibody reaction between the tumor marker antigen and an antibody that reacts with the antigen.
  • As the antibody to be used a monoclonal antibody having high and uniform specificity is preferable. Anti Mouse dlk monoclonal antibody is known (Non-Patent Document 11).
  • human dlk cDNA is incorporated into an expression vector for mammalian cells, this recombinant vector is introduced into a cell line to create a cell line that expresses dlk on the cell surface, and this is used as an immunogen in a conventional manner.
  • a hybridoma producing an anti-human dlk monoclonal antibody can be established.
  • the extracellular region of dlk or a part thereof can be easily prepared by genetic engineering techniques or peptide synthesis methods. Can be prepared. The prepared extracellular region of dlk or a part thereof can be used as it is, or can be conjugated to a keyhole limpet to a carrier such as mosyanin (KLH) or serum albumin (BSA) as an immunogen. It is possible to produce anti-dlk monoclonal antibodies. It also has antigen-binding properties, such as antibody Fab fragments and F (ab ') fragments.
  • KLH mosyanin
  • BSA serum albumin
  • the anti-dlk antibody Liver cancer cells in a sample can be measured based on a well-known technique using Examples of the measuring method include a sandwich method such as immunostaining and ELISA, an agglutination method such as a latex agglutination method, and a competitive method. These are all well known, and can be easily carried out by a conventional method once the antibody to be used is obtained.
  • a preferred method for efficiently detecting the liver cancer cells of the present invention is a method using a magnetic cell sorter (MACS) or a flow cytometer, particularly a method using a fluorescence activated cell sorter (FACS).
  • MACS is a system in which cells are labeled with ultrafine magnetic beads in which antibodies against cell surface antigens have been immobilized, and this is passed through a column set in a strong magnetic field to separate target cells. Cells can be obtained, large amounts of cells can be efficiently separated, and separation can be performed while maintaining cell function and proliferation ability.
  • FACS also labels cells with fluorescently labeled antibodies, irradiates the nozzle with a laser beam to the injected cell stream, analyzes the scattered light and fluorescence generated, and charges water droplets containing one cell each. , It is a device that separates by high electric field. FACS is also preferred for the method of the present invention for the same reasons as MACS. Both MACS and FACS are well known in the art, and devices for them are commercially available. Therefore, once the antibody to be used is obtained, it can be easily performed using these commercially available products.
  • the sample subjected to the method for detecting dlk antigen on the cell surface is a sample that may contain liver cancer cells, and is usually a liver biopsy sample.
  • the biopsy sample may be a tissue section (in the case of immunostaining) or a cell suspension obtained by treating liver tissue with a protease such as collagenase or trypsin.
  • Non-Patent Document 10 Non-Patent Document 10
  • the anti-human dlk monoclonal antibody produced by the present inventors has an antigen-antibody reaction with FA1. Therefore, diagnosing liver cancer using a blood sample (serum, plasma, whole blood, etc.) or urine sample by immunoassaying FA1 in blood using an anti-dlk antibody, preferably an anti-dlk monoclonal antibody. It is possible.
  • the immunoassay itself can be easily performed by the usual method as described above.
  • an anti-Dlk antibody or an antigen-binding fragment thereof is immobilized on a solid phase as a first antibody, reacted with a sample, washed, and then washed with a second antibody that reacts with Dlk as an antigen antibody. After washing, the second antibody bound to the solid phase is measured.
  • the second antibody bound to the solid phase is measured.
  • the second antibody bound to the solid phase can be measured. Measurement was performed on a plurality of standard samples with known concentrations by the above method, and a calibration curve was created based on the relationship between the measured amount of label and the amount of FA1 in the standard sample.
  • an anti-dlk antibody preferably an anti-dlk monoclonal antibody can be used for detecting liver cancer, and thus has use as a diagnostic agent for liver cancer.
  • Expression of the dlk gene can also be examined by measuring dlk mRNA in cells.
  • the measurement of mRNA in cells can be performed by a conventional method. That is, for example, as described in the following examples, the electrophoretic band can be further analyzed by Northern blotting, or by performing reverse transcription PCR (RT-PCR) and electrophoresing the PCR product, thereby further analyzing the electrophoretic band. It can be done by applying the law. Alternatively, by performing RT-PCR by real-time detection PCR (RTD-PCR), the amount of type III cDNA, and thus the amount of mRNA, can be accurately quantified.
  • RT-PCR real-time detection PCR
  • mRNA can be directly amplified by the NASBA method or the like, and measured by electrophoresis, or by Northern plot after electrophoresis. These methods are all ordinary methods, and necessary reagent kits and devices are commercially available.
  • probe primers required for these methods can be easily designed, and these examples are also specifically described in Examples below. Therefore, measurement of mRNA encoding Dlk protein can be easily performed by those skilled in the art.
  • Probes and primers used for detecting and amplifying Dlk mRNA (or cDNA obtained by using mRNA as type II) have a sequence complementary to! Or any strand of Dlk mRNA or cDNA.
  • the size of the probe or primer (the size of the region that hybridizes with Dlk mRNA or cDNA) is not particularly limited, but is 15 bases or more, preferably 20 bases or more, as in the conventional method. There is no particular limitation, but in the case of a primer, the length is usually 50 bases or less, preferably 40 bases or less. In the case of a probe, the total length is appropriate.
  • a non-complementary sequence may be added to one end of the nucleic acid fragment as long as it contains the nucleic acid region hybridizing with the Dlk mRNA or cDNA region to be measured and can be used as a primer or probe. . Such a sequence can be used for binding to a tag or another nucleic acid in some cases.
  • the present invention also provides nucleic acids for detecting liver cancer, such as these probes and primers, which hybridize with Dlk mRNA or cDNA.
  • the cancer therapeutic agent of the present invention contains, as an active ingredient, an antibody that reacts with Dlk expressed on the surface of a cancer cell as an antigen-antibody.
  • an antibody that reacts with Dlk as an antigen-antibody the above-mentioned anti-Dlk antibody, which expresses Dlk on the cell surface and exerts an anticancer effect on cancer cells, can be used.
  • Monoclonal antibodies with high and uniform specificity are preferred.
  • An anti-dlk monoclonal antibody that expresses Dlk on the cell surface and exerts an anticancer effect on cancer cells is screened by an MTT assay using a Dlk-expressing cell line, as specifically described in the Examples below. be able to.
  • two of the three obtained anti-human Dlk monoclonal antibodies exerted an anticancer effect by MTT assay, so that screening by MTT assay reproducibly immobilized Dlk on the cell surface.
  • An anti-dlk monoclonal antibody that exerts an anticancer effect on expressed cancer cells can be obtained.
  • the antibody may be an antibody derived from an animal species different from the animal species to which the therapeutic agent is administered, but at least the constant region is a constant region (Fc) of an antibody of the same species as the animal species to be administered. Preferably it is.
  • a chimeric antibody or a humanized antibody in which at least the constant region is a human-derived antibody can be preferably used.
  • the antigenicity of the antibody can be reduced, and an antigen-antibody reaction occurs when the antibody is administered.
  • ADCC activity is increased by making the constant part of the antibody human-derived.
  • a humanized antibody is an antibody obtained by transplanting only the gene sequence of the antigen-binding site (CDR, complementarity determining region) of a mouse antibody into a human antibody gene, and has a smaller mouse-derived portion than a chimeric antibody. is there.
  • CDR antigen-binding site
  • Humanized antibodies and methods for preparing them are well known, and in recent years, many humanized antibodies are commercially available.
  • an anti-Dlk antibody exerts an anticancer effect at least in the presence of complement. Because complement is contained in the patient's blood, the anti-Dlk antibody functions as a cancer treatment as it is.
  • the ADCC activity of the anti-human Dlk monoclonal antibody against the human liver cancer cell line was not observed.This was considered to be due to the Fc cut of the antibody, and the CDC activity was observed. Therefore, if Fc is changed from human, ADCC will also be exerted.
  • the anti-Dlk antibody can be used as it is, but by binding a toxin such as ricin or another anticancer agent to the antibody, so-called missile therapy is also possible.
  • the cancer treated by the cancer therapeutic agent of the present invention is a cancer in which Dlk is expressed on the surface of cancer cells, such as hepatocellular carcinoma, cholangiocellular carcinoma, small cell lung cancer, and type 1 cancer.
  • cancer cells such as hepatocellular carcinoma, cholangiocellular carcinoma, small cell lung cancer, and type 1 cancer.
  • Neurofibromatosis can be mentioned.
  • liver cancer such as hepatocellular carcinoma and cholangiocellular carcinoma is particularly preferred.
  • the route of administration of the cancer therapeutic agent of the present invention is preferably parenteral administration, such as injection into the affected area, intravenous injection, intramuscular injection, and the like.
  • the dose is appropriately selected depending on the condition of the patient, the degree of progression of the cancer, etc.
  • the antibody amount is about 0.001 to 100 mg / kg body weight, preferably about 0.01 to 50 mg / kg, and more preferably about 0.01 to 50 mg / day. Preferably, it is about 0.1-5 mg.
  • the preparation may be a solution obtained by simply dissolving the antibody in a physiological buffer, and is commonly used in the field of pharmaceutical preparations by adding one or more additives thereto. Well.
  • PCR primers were designed based on the gene sequence information of human Dlk (Genbank accession No. U15979). The sequences of the prepared primers are as follows.
  • a Flag tag is added to the C-terminus of human Dlk.
  • Oligonucleotide encoding Flag tag sequence at Hindlll / Sall site of pbluescript II SK (+) vector (STRATAGENE) (Sequence: forward side
  • the expression vector has Myc tag and His tag sequences attached to the C-terminal side, and human FA1 is expressed as a fusion protein with Myc tag and His tag.
  • the human liver cancer-derived cell lines are JHH-6, HLF, JHH-5 and Huh-6, all of which were purchased from the Human Science Promotion Foundation.
  • the primers used are as follows.
  • RNA Fetal tissue total RNA (TAKARA) and total RNA extracted using Cellulase Trizol reagent (Futan Gene), 10 g each, were electrophoresed on formaldehyde denaturing gel. After transfer to a nylon membrane, hybridization was carried out using a DIG-labeled cDNA probe. Probe detection was performed by chemiluminescence using CDP-star as a substrate.
  • the retroviral vector (pMIG-hdlk-Flag) incorporating the human dlk gene was packaged into BOSC23 cells (Pear, W.S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the expression vector pcDNA-hdlk-Flag was introduced into HEK293 cells (obtained from the Institute for Molecular and Cellular Biology, The University of Tokyo), and selection was performed using the antibiotic G418 (geneticin, GIBCO BRL). Later, a human cell line HEK293 (hdlk) was established, which stably expressed human Dlk.
  • Rats were immunized using the above two cell lines as antigens, and hybridoma clones producing anti-human Dlk monoclonal antibodies were prepared by a conventional method. These clones previously (7 days) 2,6, 10, 14-tetramethyl pentadecane 3xl0 to six administered intraperitoneally administered BALB / c nude mouse (the pristane), ascitic fluid is taken after 2 weeks did. Furthermore, anti-human Dlk monoclonal antibodies produced by each of the hybridoma clones were obtained by subjecting the ascites to force purilic acid precipitation and protein G column purification.
  • the 7E2-C (hdlk) strain 96-well culture plate coated (Corning) gelatin were seeded with 7.5Xl0 3 cells / Ueru, and cultured for 2 days at 37 ° C. After washing with ice-cold PBS, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde solution and treated with 0.2% Triton-X-100 (trade name) solution to prepare a plate for cell ELISA. Thereafter, ELISA was performed according to a standard method. Specifically, the ELISA was performed as follows. First, blocking with a 1% BSA-PBS solution was performed at room temperature for 2 hours.
  • Paraffin sections of normal human tissues and liver cancer tissues (Bio Chain, Hepatocellular carcinoma; catalog No .: T2235149-4, lot No .: A607070, Cholangiocellular carcinoma; catalog No.:T2235149-2, lot No .: A603549) was subjected to deparaffinization treatment, followed by heat treatment in a 10 mM sodium citrate solution for 10 minutes, and used for staining with an anti-human Dlk monoclonal antibody. After a color reaction was performed using DAB (3,3′-diaminopenbenzidine) as a substrate, nuclear staining with hematoxylin was performed as a counterstain. More specifically, these operations were performed as follows.
  • the sections fixed with 4% paraformaldehyde and embedded in paraffin were deparaffinized, and then heat-treated in a 10 mM sodium citrate solution for 10 minutes.
  • the mixture was treated at room temperature for 20 minutes with a solution prepared by adding hydrogen peroxide to a final concentration of 0.3% in methanol to remove endogenous peroxidase activity. Washing twice with PBS at room temperature for 5 minutes was performed twice, blocking was performed for 30 minutes using a Block Ace reagent (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), and an operation of closing a nonspecific binding site in the tissue was performed.
  • anti-human dlk monoclonal antibody clone 1C1 (final concentration 0.25 g / ml) diluted with Proc Ace reagent diluted in 1Z10 was reacted at room temperature for 1 hour, washed 5 times with PBS three times, and then washed with lZlO.
  • a 100-fold dilution of the anti-HotG antibody against Piotin-dani was reacted with the diluted Block Ace reagent for 1 hour at room temperature.
  • the ABC kit reagents were mixed as described to form an ABC complex, which was reacted at room temperature for 30 minutes.
  • paraffin sections of human hepatocellular carcinoma (Cybrdi, Hepatocellular carcinoma; catalog No .: CS03-01, lot No .: CS03- 01-001-012 (23 patients, 63 sections), CS03-01-002 (63 The patient, 63 sections >> was deparaffinized, hydrophilized, and autoclaved (121 ° C, 5 minutes) with 10 mM citrate buffer (pH 6.0). The mixture was treated with a solution of hydrogen peroxide in water for 5 minutes at room temperature to remove endogenous peroxidase activity, and washed with PBS three times for 5 minutes each to give 1.5% goat serum PBS.
  • the cells were blocked for 30 minutes with the solution, and then the anti-human dlk monoclonal antibody clonelCl (concentration: 0.25 g / ml) diluted with 1.5% goat serum PBS solution was added.
  • the anti-human dlk monoclonal antibody clonelCl concentration: 0.25 g / ml
  • the mixture was reacted at C ° C, washed three times for 5 minutes with PBS, and reacted with a biotinylated rat IgG antibody (Vector) diluted 100-fold with a 1.5% goat serum PBS solution at room temperature for 2 hours. Washing with PBS was performed three times for 5 minutes, and the ABC complex was reacted at room temperature for 30 minutes.
  • Cells peeled from the culture dish by trypsinization prepared a cell suspension (cell density 5xl0 6 cells / ml). 0.5 ⁇ g of the anti-human Dlk monoclonal antibody and 100 ⁇ L of the cell suspension were reacted at 4 ° C. for 30 minutes. After washing with PBS, it was reacted with a biotinylated anti-HgG Vector O / zg) (4 ° C, 30 minutes) and washed again with PBS. After reacting with streptavidin-FITC (Pharmingen) or streptavidin-PE (Pharmingen) (0.5 ⁇ g) (4 ° C., 30 minutes), analysis was performed by FACSCalibur (BECTON DICKINSON).
  • the human FA1 expression vector was introduced into 7E2-C cells, and the culture supernatant after 3 days, or hFAl purified from the culture supernatant using the His Trap HP Kit (Amersham Bioscience) (hFAl concentration: 30 ⁇ g / ml) was used as a detection sample.
  • hFAl concentration: 30 ⁇ g / ml was used as a detection sample.
  • a sandwich ELISA method using clone 31C4 as a capture antibody and clone 4C4 that had been biotinylated as a detection antibody was used.
  • the detection antibody, Pyotin-Dani is performed using the ECL Protein Biotinylation Module (Amersham Bioscience).
  • the sandwich ELISA was specifically performed as follows.
  • the capture antibody clone31C4 was diluted to 10 ⁇ g / ml with PBS, and added to a 96-well plate at 100 ⁇ l / well. After standing at room temperature, the plate was washed three times with PBS, and blocked with a 2% skim milk-PBS solution (hereinafter referred to as 2% MPBS) at room temperature for 2 hours. Next, the culture supernatant containing hFAl or hFAl diluted to each concentration with 2% MPBS was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • 2% MPBS 2% skim milk-PBS solution
  • clone 4C4 which was a biotinylated antibody for detection, was diluted to 1 ⁇ g / ml with 2% MPBS and added. After reacting at room temperature for 1 hour, the plate was washed three times with a 0.1% Tween20 (trade name) -PBS solution. Piotinylated anti-Lag HgG (Vector) diluted 100 times with 2% MPBS solution for use as secondary antibody did. After reacting at room temperature for 1 hour, the plate was washed three times with a 0.1% Tween 20-PBS solution.
  • horseradish veroxidase streptavidin (manufactured by Vector) diluted 1000-fold with a 2% MPBS solution was reacted at room temperature for 1 hour, and washed three times with a 0.1% Tween20_PBS solution.
  • the color reaction was performed by adding ⁇ (3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine: SIGMA) as a substrate solution, and the reaction was stopped by adding 1 M sulfuric acid. Absorbance was measured using Microplate reader Mode 50 (BIO-RAD).
  • the fluorescence reaction was performed using QuantaBlu (trade name) Fluorogenic Peroxidase Substrates (manufactured by PIERCE) and fluoroscan ascent (Thermo
  • the present inventors have previously shown that Dlk is highly expressed in embryonic hepatocytes in mice, but not expressed in adult hepatocytes, and that anti-mouse Dlk monoclonal antibody
  • the present inventors first prepared an anti-human Dlk monoclonal antibody (Lag HgG). Two types of human Dlk-expressing cells were established as antigens, and rats were immunized using the cells as antigens. The hybridoma was prepared according to a standard method and then used as an antigen. Positive clones were selected by FACS analysis using 7E2-C (hdlk) strain and cell ELISA. Cloning was further performed to establish three stable clones (clone 1C1, 4C4 and 31C4). FACS analysis was performed using the culture supernatants of the clones finally established, and it was confirmed that monoclonal antibodies specifically reactive with human Dlk were produced in these culture supernatants. .
  • human Dlk is absent in immature hepatocytes of the fetus, similar to the results in mice, but not in adult hepatocytes.
  • the present inventors examined the possibility of expression of human Dlk in human liver cancer.
  • four human liver cancer cell lines JHH-6, HLF, JHH-5, Huh-6) were examined by FACS analysis, immunostaining and RT-PCR.
  • FACS analysis using the anti-human Dlk monoclonal antibody clone 4C4 showed no shift in the undifferentiated cell line 0HH-6, HLF).
  • Huh-6) showed a shift indicating the expression of human Dlk (Fig. 2 ⁇ ).
  • a stained image was confirmed in the differentiated cell line (Fig. 2 (1)).
  • human Dlk may be expressed in liver cancer tissues. Therefore, the expression of human Dlk in human liver cancer tissues was examined by immunohistochemical staining using an anti-human Dlk monoclonal antibody clone 1C1. As a result, it became clear that hepatocellular carcinoma and cholangiocellular carcinoma tissues were strongly stained at the cancer site (Fig. 3). At this time, normal tissue adjacent to the cancer site was vigorously stained. This suggests that Dlk is expressed not only in embryonic hepatocytes but also in adult hepatocytes, suggesting that Dlk may be a tumor marker in liver cancer.
  • Dlk positive rate in hepatocellular carcinoma was 82% (9/11), Grade I-II was 100% (3/3), Grade II was 61% (33/54), and Grade III was 40% (20Z50).
  • Yes (Table 1), it was found that all hepatocellular carcinomas ranging from poorly differentiated to highly differentiated were Dlk-positive. However, Dlk expression is frequently observed in hepatocellular carcinomas with low grade I and II, and as described above, Dlk is a highly proliferative fetal hepatocyte.
  • hepatocellular carcinoma Grade I This suggests that it may be a tumor marker for hepatocellular carcinoma.
  • Fig. 6 shows examples of positive and negative histological images of hematoxylin and eosin (HE) staining and Dlk staining of each grade observed.
  • HE hematoxylin and eosin
  • Dlk has been shown to be truncated in its extracellular region to produce a soluble molecule known as FA1. Since the anti-human Dlk monoclonal antibody we created recognizes the extracellular region of Dlk, it was thought that this antibody could be used to recognize and detect human FA1. Therefore, an ELISA method was used to examine the culture supernatant in which human FA1 was transiently expressed in 7E2-C cells. As a result, it was confirmed that a signal was not detected in the culture supernatant into which the control vector was introduced, but a signal was detected in the culture supernatant containing human FA1 (FIG. 4). From the above, it was clarified that the anti-human Dlk monoclonal antibody we created can detect human FA1.
  • a cell suspension of 7E2-C (hdlk) and HEK293 (hdlk) was mixed with an adjuvant (complete Freund's adjuvant: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in a 1: 1 mixture.
  • the emulsion was applied to both feet of 6-week-old Wistar rats. Immunization was performed by injecting 1 ⁇ 10 7 cells each. After two boosters, lymph nodes were collected from both feet, lymphocytes were prepared, and cell fusion was performed with the mouse myeloma cell line (P3X) by the polyethylene glycol method.
  • the cells were cultured in a medium containing HAT (aminopterin, hypoxanthine, thymidine) in a 96-well flat bottom plate in a 5% C02 incubator. After culturing, the culture supernatant of the grown hybridoma was screened by FACS analysis using 7E2-C (hdlk) strain and Cell ELISA to select positive clones. This clone was further cloned to establish three types of hybridoma strains (clone 1C1, 4C4, 31C4). Each of these hybridoma strains was suspended in RPMI medium at a concentration of 1.5 ⁇ 10 7 cells / ml.
  • Heparin was collected from healthy human venous blood, diluted 2-fold with PBS, layered on Lymphoprep (Daiichi Pure Chemicals), and centrifuged at 800 g for 20 minutes at 20 ° C. After centrifugation, the mononuclear cells in the intermediate layer fraction were collected, washed three times with PBS, and suspended in DMEM medium supplemented with 10% FCS, and used as effector cells.
  • the venous blood of healthy subjects was collected without anticoagulant, transferred to a 15 ml tube, and left in an incubator at 37 ° C for 60 minutes. After left at room temperature for 60 minutes, the clot was peeled off from the tube wall and centrifuged at 2500 rpm for 15 minutes at 20 ° C. After centrifugation, the serum of the supernatant was recovered and used as complement serum. Serum in which complement was inactivated (inactivated) by heating at 56 ° C for 30 minutes was used as a control.
  • Tetracolor one (Seikagaku Corporation) was added to the cells cultured in the 96-well plate according to the attached protocol, added to each culture well, and reacted in a 5% CO incubator for 3-4 hours.
  • the absorbance at 490 nm (control wavelength: 655 nm) of the 96-well plate was measured using a microplate reader as it was.
  • HEK293 and HEK293 (hdlk) cells were detached from plates by trypsinization, it was used as target cells were suspended in DMEM medium example mosquitoes ⁇ with 10% FCS at a concentration of lxl0 5 / ml.
  • DMEM medium example mosquitoes ⁇ with 10% FCS at a concentration of lxl0 5 / ml.
  • anti-human Dlk antibody 4C4, 31C4 Contact and rats HGG (respectively 0.2, 1.0, 5 g / ml ) were incubated for 30 minutes in the presence of.
  • human serum used as complement was added to 25% of the culture solution, and the cells were cultured for 72 hours. After the culture, the absorbance was measured by the MTT method.
  • the absorbance value indicating the number of viable cells in the CDC activity was calculated by subtracting the average value of the wells prepared as a control and supplemented with complement serum to the medium. The significance test was performed by Student's t test.
  • Huh-7EGFP and Huh-7 (hdlk) cells were detached from the plate by trypsinization,
  • HEK293 and HEK293 (hdlk) cells were detached from plates by trypsinization, in DMEM medium example mosquitoes ⁇ with 10% FCS suspended at a concentration of 2xl0 5 / ml, it was used as target cells.
  • DMEM medium example mosquitoes ⁇ with 10% FCS suspended at a concentration of 2xl0 5 / ml, it was used as target cells.
  • the effector cells can be added to the target cells at an effector: target ratio (20: 1, 10: 1, 5: 1) in addition to 5% CO ink.
  • the cells were cultured in two incubators for 72 hours. After the culture, the absorbance was measured by the MTT method. The absorbance value indicating the number of viable cells in the ADCC activity was calculated by subtracting the average value of the wells of the medium prepared as a control only.
  • the expression vector (pcDNA-hdlk-Flag) incorporating the full-length human Dlk cDNA described in “1.
  • Genes were introduced into the derived cell line Huh-7 (obtained from the Institute for Molecular and Cellular Biology, The University of Tokyo), and after selection by G418 (geneticin, GIBCO BRL), two types of human Dlk were stably expressed.
  • Huh-7 hDlk
  • clone PC14, PC16 was established.
  • an expression vector (PEGFP) incorporating full-length EGFP cDNA as a control cell was introduced into Huh_7 cells, and after selection with G418, a cell line Huh-7 EGFP stably expressing EGFP was established. .
  • control cells were transplanted to the left subcutaneous and right subcutaneous backs of one nude mouse, and clone PC14 or PC16 cells were transplanted to the other in the same nude mouse.
  • Tumor volume was measured using a vernier caliper according to a standard method.
  • Tumor volume (mm 3 ) ⁇ / 6 X major axis X (minor axis) 2
  • Dlk is expressed in human cancer cell lines and cancer tissues means that Dlk can be a tumor marker and can express anti-human Dlk monoclonal antibody Dlk to become a therapeutic antibody targeting cancer cells. It suggests. Therefore, the cytotoxicity of antibodies and complement, that is, CDC activity, was measured first (Fig. 8, Tables 3.1 and 3.2). Seed HEK293 or HEK293 (hdlk) cells as target cells in a 96-well plate, and add anti-human Dlk antibody (clone 4C4, 31C4 at 5 ⁇ g / ml). The cells were cultured with complement serum. After 3 days of culture, target cell damage was measured by MTT assay.
  • HEK293 (hdlk) cells when Dlk antibody was added at 5 / zg / ml was higher than that of the system without antibody addition or control IgG antibody added to anti-human Dlk antibody (clone 4C4, 31C4 ) And complement serum, the absorbance decreased and the viable cell count decreased by 70-90%.
  • the system containing 5 / zg / ml anti-human Dlk antibody (clone 31C4) was used as the system without antibody supplemented and the control antibody supplemented. There was no difference in absorbance and the number of viable cells was the same ( Figure 8A, Table 3.1).
  • Dlk was expressed, none of the antibodies against HEK293 cells showed any cytotoxic activity.
  • HEK293 (hdlk) cells Observation of HEK293 (hdlk) cells under a microscope revealed that the cell dysfunction was higher in a system in which control IgG antibody was added to complement serum and in a system in which anti-human Dlk antibody (clone 31C4) was added to inactivated complement serum. Although S colonies were formed and proliferated, morphology was observed.However, in the system in which complement serum was supplemented with anti-human Dlk antibody (Clone 31C4), most cells appeared to be scattered and dead. Was seen. On the other hand, in HEK293 cells that do not express Dlk, no damaged cells were confirmed even in a system supplemented with anti-human Dlk antibody and complement serum.
  • HEK293 (hdlk) cells The CDC activity of HEK293 (hdlk) cells was examined (Fig. 8B, Table 3.2). When the CDC activity after 3 days of culture was measured by MTT assay, the viable cell number of HEK293 (hdlk) cells decreased depending on the concentration of anti-human Dlk antibody, indicating that 31C4 had a stronger activity than 4C4. confirmed. These results indicate that the prepared anti-human Dlk antibody has CDC activity against cells expressing the Dlk antigen.
  • the ADCC activity of the prepared anti-human Dlk monoclonal antibody was measured using HEK293 (hdlk) expressing human Dlk as a target cell and healthy human peripheral blood mononuclear cells as effector cells.
  • HEK293 or HEK293 (hdlk) cells were cultured with anti-human Dlk monoclonal antibodies (clone 1C1, 4C4, 31C4) and human peripheral blood mononuclear cells. The damage to the target cells of the wells was measured. At this time, the cells were cultured at an efetater: target ratio of 20: 1, 10: 1, and 5: 1, respectively. When the effector: target ratio is 10: 1, HEK293 (hdlk) cells show the same activity regardless of which anti-human Dlk antibody is added, as well as the system without the antibody or the control antibody. HEK293 cells had similar activity ( Figure 9, Table 4).
  • Huh-7EGFP cells were obtained using Huh-7EGFP cells and Huh-7 (hdlk) cells (clone PC14, PC16).
  • Complement cytotoxicity that is, CDC activity was measured (FIG. 11, Table 5).
  • Cells were seeded on a 96-well plate, and cultured with anti-human Dlk antibody (clone 4C4, 31C4 added at 5 / zg / ml) and complement serum. After 3 days of culture, target cell damage was measured by MTT assay.
  • the damage of Huh-7 (hdlk) cells when Dlk antibody was added was compared with that of control IgG antibody-added cells, and anti-human Dlk antibodies (clone 4C4, 31C4) and complement serum were added. Absorbance values were reduced in the cultivated system, and live cells were reduced by 24-94%. In contrast, against Huh-7EGFP cells that did not express Dlk, the outlying antibody showed no cytotoxic activity (FIG. 11A, Table 5
  • Huh-7 (hdlk) cells when anti-human Dlk antibody (clone 4C4, 31C4) was added at 0.3, 1, 3, 5, 10 g / ml was examined (Fig. 11B, Table 5B).
  • Huh-7 (hdlk) cells were killed in both clones 4C4 and 31C4 in a concentration-dependent manner.
  • Anti-human Dlk monoclonal antibody kills human liver cancer cell line Huh-7 cells in a complement-dependent manner Showed activity. Since Dlk expression is observed in the cancerous part of human hepatoma cells, the prepared monoclonal antibody is effective as a therapeutic antibody that expresses Dlk and kills hepatoma cells. At this time, neither CDC activity nor ADCC activity of the anti-human Dlk monoclonal antibody clone 1C1 has been observed, but it is described in Example 1, ⁇ 2.Results (4) Expression of human Dlk in human liver cancer tissue ''.
  • Dlk antigen is strongly recognized in human liver cancer-derived cell lines and liver cancer pathological sections.As described above, ADCC activity and CDC activity both depend on the constant region (Fc) of the antibody.
  • Fc constant region
  • an anti-dlk monoclonal antibody exhibiting an anticancer effect can be prepared.
  • Huh-7EGFP cells and Huh-7 (hdlk) cells were prepared using the prepared anti-human Dlk monoclonal antibody according to the method described in “1. FACS analysis of PC 16) was performed. It was confirmed that human Dlk was not expressed at all in Huh-7EGFP cells, but was strongly expressed in Huh-7 (hdlk) cells (FIG. 10).
  • the method for detecting liver cancer and the diagnostic agent for liver cancer of the present invention are useful for diagnosis of liver cancer.
  • the therapeutic agent for cancer of the present invention is useful for treating cancer such as liver cancer.

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Abstract

高い特異性をもって肝癌を検出することができる肝癌の検出方法及びそのための診断薬並びに優れた抗癌効果を有する新規な癌治療薬が開示されている。試料中の肝癌細胞の検出方法は、dlk遺伝子の発現を指標とする。dlk遺伝子の発現は、抗dlk抗体を用いた免疫測定やdlk遺伝子のmRNAを測定することにより測定可能である。癌治療薬は、癌細胞表面上に発現しているDlkと抗原抗体反応する抗体であって、該癌細胞に対して抗癌作用を発揮する抗体を有効成分として含有する。

Description

明 細 書
肝癌の検出方法及び肝癌診断薬並びに癌治療薬
技術分野
[0001] 本発明は、肝癌の検出方法及び肝癌診断薬並びに癌治療薬に関する。
背景技術
[0002] 肝細胞癌は世界中の癌腫の中で最も多いものの一つであり、東南アジア、中国、サ ハラ砂漠以南のアフリカでの発症が特に多い。また、日本での発症率 ·有病率も高い 。 日本における肝癌による死者は年間三万人以上にのぼっており、依然として増加 傾向にある。肝癌のほとんどは肝細胞癌であり、その発生母地は肝炎ウィルス感染に 起因する。し力しながら、ウィルス肝炎から肝硬変、肝細胞癌へと移行する癌化メカ- ズムは未だ不明である。それゆえ現在用いられている診断方法 (超音波診断、 CTに よる画像診断、 α—フエトプロテイン (AFP)などの腫瘍マーカーを用いた血液診断）は 、すでに形成された癌組織を対象にした方法であり、ある程度進行した癌を検出する ことはできても、非常に初期段階にある癌細胞、もしくは前癌細胞の存在を検出する には至っていない。また、 AFPを腫瘍マーカーとする血液診断は、簡便であるが、肝 癌に対する特異性は高いとは言えず、肝硬変、肝炎などでも高い値を示すことが知 られている。
[0003] また、日本の癌による死亡率は 1980年頃力 増加し、死因の第一位となっている。
なかでも肝癌による死者は年間 35,000人以上に上り、癌死全体の第三位である。今 後、画期的な診断薬、治療薬が開発されない限り、肝癌の発症数はさらに増加すると 考えられている。肝癌の治療には、外科的肝切除や経皮的エタノール注入療法、肝 動脈塞栓療法などの局所療法と抗癌剤の全身投与や免疫療法などの全身的治療 法が行われている。治療の主流を占めるのは局所的治療法であり、治癒度の点から みて経皮的エタノール注入療法や肝動脈塞栓療法に比べ肝切除力 Sもっとも優れて いる。しかし、肝機能の障害の程度や腫瘍の占有範囲によっては手術適応とならな いことも多い。全身的治療法では、標準的化学療法は確立されておらず、単剤で行 つた治療成績で 10%以上の有効率を示したのはシスブラチンだけであり、多剤併用療 法についても確立されていない (非特許文献 1)。また、免疫治療では免疫賦活薬で ある「ピシバニール (OK-432)」（中外製薬)が肝癌に対して有効性があると報告され ている。このような治療法を用いても、肝癌は多中心性発癌および再発の面から、完 治が難しいのが現状であり、肝癌を特異的に攻撃する分子標的医薬品 (治療抗体） の開発が重要であると考えられる。
[0004] ここ数年、癌細胞を特異的に攻撃する分子標的医薬品の上巿、開発が活発になつ てきている。これらの医薬品はある特定の癌に特異的に発現している標的遺伝子を 狙っているため、従来の抗癌剤よりも効果が高ぐかつ副作用が少ないという利点が あり、今後の抗癌剤開発の主流になっていくと考えられる。癌治療抗体としては、 Her2過剰発現が確認された転移性乳癌の治療薬「ハーセプチン (抗 Her2ヒトイ匕モノ クローナル抗体製剤）」（中外製薬)と、 CD20陽性の B細胞性非ホジキンリンパ腫の治 療薬「リツキサン (抗 CD20キメラモノクローナル抗体製剤)」（中外製薬、全薬工業)が 製品化されている。これらの治療抗体は、抗体依存性細胞傷害 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)活性、補体依存性細胞傷害（
complement-dependent cytotoxicity, CDC)活'性といった生体内の免疫機構によって 、癌細胞を殺傷する。癌特異的な分子標的医薬品は、現在、上巿されているものは 少ないが、このような癌に特異性が高い製剤が開発されれば、肝癌を含めた癌の治 癒率が上昇することが期待される。
[0005] 一方、 Dlkl/Pref-1は EGF様モチーフを持つ膜タンパク質で、その細胞外領域は Notch/Delta/Serrateファミリーと相同性を示す。 Dlkl/Pref- 1は、 GRP(gastrin releasing peptide)応答性の肺小細胞癌由来細胞株で発現する分子 (非特許文献 1) あるいは前脂肪細胞の分ィ匕を抑制する因子としてクローニングされた (非特許文献 2 )。その発現は、胎生期には複数の組織、臓器に見られるが、出生後はほとんどの組 織で発現が見られなくなる (非特許文献 2、 3)。また、肺小細胞癌や 1型神経線維腫 症など、一部の癌組織でも発現が認められる（非特許文献 4、 5)。 DM/Pref-1の機能 については前脂肪細胞の分ィ匕抑制以外に、最近造血への関与も示唆されている（非 特許文献 6)。しかし、発現パターンなどから未分化細胞における未分化状態維持機 構に関与している可能性も示唆されている。我々は、以前シグナル配列を持った分 子、すなわち細胞表面抗原や分泌性タンパク質をコードする遺伝子を、選択的に単 離するシグナルトラップ法を用いて、マウス胎性 14.5日の肝臓に高発現する遺伝子 dlkを同定した。マウス肝臓の発生過程における Dlkの発現は、胎生 10日以前にすで に見られ、胎生 16日付近までは強く発現しているが、出生前後にかけて急激に減少 し、成熟肝臓では発現していな力つた (非特許文献 7、 13)。さらに抗 Dlkモノクローナ ル抗体を用いて、胎児肝臓より 1ステップで肝幹細胞を高純度精製できることを見 ヽ 出した (非特許文献 7、特許文献 1)。
[0006] 非特許文献 1 : Laborda, J., et al (1993) J. Biol .Chem. 268(6):3817- 20
非特許文献 2 : Smas, CM., et al (1993) Cell. 73(4):725-34
非特許文献 3 : Floridon, C, et al (2000) Differentiation 66(1):49- 59
非特許文献 4 : Harken, J.C., et al (1999) Tumour Biol. 20(5):256- 62
非特許文献 5 : Jensen, C.H., et al (1999) Br. J. Dermatol. 140(6): 1054-9 非特許文献 6 : Ohno, N.， et al (2001) Stem Cells 19(1):71— 9
非特許文献 7 : Tanimizu, N" et al (2003) J. Cell Sci. 116(Pt 9): 1775-86
非特許文献 8 : Onishi, M., et al (1996) Exp. Hematol. 24;324-329
非特許文献 9 : Sell, S. (1993) Int. J. Dev. Biol. 37:189-201
非特許文献 10 : Jensen, C.H. et al (1994) Eur. J. Biochem. 225:83-92
非特許文献 l l : Kaneta, M. et al. (2000) J. Immunol. 164:256-264
非特許文献 12 : Okada, S.， et al (1993) Oncology. 50 (1): 22-26.
非特許文献 13 : Kitajima, T.， et al (1999) Nat. Biotechnol. 17 (5): 487-490.
非特許文献 14 : Jensen, C. H" et al (1999) Br. J. Dermatol. 140 (6): 1054-1059. 非特許文献 15 : Russell, W. C, et al (1977) J. Gen. Virol. 36: 59-72.
非特許文献 16 : Kipps, T. J" et al (1985) J. Exp. Med. 161: 1-17.
特許文献 1：国際公開公報 WO 02/103033
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の目的は、高い特異性をもって肝癌を検出することができる肝癌の検出方 法及びそのための診断薬を提供することである。また、本発明の目的は、優れた抗癌 効果を有する新規な癌治療薬を提供することである。
課題を解決するための手段
[0008] 本願発明者らは、鋭意研究の結果、成体の肝癌細胞表面上に dlkが発現して 、るこ とを見出し、この dlkを腫瘍マーカーとして肝癌細胞の検出が可能であることを実験的 に確認した。さらに、細胞表面上に発現する dlkの細胞外領域と抗原抗体反応する抗 ヒト dlkモノクローナル抗体の作出に成功した。さらに、この抗ヒト dlkモノクローナル抗 体力 血液中に遊離される dlkの細胞外である FA1とも抗原抗体反応することを確認 した。
[0009] さらに、本願発明者らは、この抗ヒト Dlkモノクローナル抗体力 Dlkを発現している 癌細胞を標的とした治療抗体になる可能性があることに想到した。そこで、作製した 3 種類の抗ヒト Dlkモノクローナル抗体を用いて、 in vitroの実験系で Dlkを発現した癌細 胞株を特異的に死滅させる抗腫瘍活性にっ ヽて検討し、抗ヒト Dlkモノクローナル抗 体の抗癌活性を確認し、本発明を完成した。
[0010] すなわち、本発明は、 dlk遺伝子の発現を指標とする、試料中の肝癌細胞の検出方 法を提供する。また、本発明は、生体から採取された血液中又は尿中に存在する、 dlkの細胞外領域を測定することを含む肝癌の検出方法を提供する。さらに、本発明 は、 dlkの細胞外領域と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む、肝 癌診断薬を提供する。さら〖こ、本発明は、 dlk遺伝子の mRNA又は cDNAとハイプリ ダイズし、 dlk遺伝子の mRNA又は cDNAを測定するためのプライマー又はプローブ として利用できる核酸力も成る、肝癌検出用核酸を提供する。さらに、本発明は、 dlk の細胞外領域と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片の、肝癌診断薬の 製造のための使用を提供する。さらに、本発明は、癌細胞表面上に発現している Dlk と抗原抗体反応する抗体であって、該癌細胞に対して抗癌作用を発揮する抗体を有 効成分として含有する癌治療薬を提供する。さらに、本発明は、癌細胞表面上に発 現して!/ヽる Dlkと抗原抗体反応する抗体であって、該癌細胞に対して抗癌作用を発 揮する抗体の有効量を癌患者に投与することを含む、癌の治療方法を提供する。さ らに、本発明は、癌細胞表面上に発現している Dlkと抗原抗体反応する抗体であって 、該癌細胞に対して抗癌作用を発揮する抗体の、癌治療薬の製造のための使用を 提供する。
発明の効果
[0011] 本願発明により、新規な肝癌マーカーを利用した、肝癌の検出方法が提供された。
成体における dlkは、胎盤以外の臓器では検出されず、また、マウス急性肝障害モデ ルにおいても検出されないことから、本発明の方法により高い特異性で肝癌を検出 することが可能である。さらに、 dlkは、増殖性の高い胎児期の肝細胞や、成体におけ る肝再生時に出現するオーパル細胞においても発現することから、増殖する肝癌細 胞において発現していると考えられるので、初期の肝癌を検出できると考えられる。ま た、抗 dlkモノクローナル抗体を用いることにより、血液中又は尿中に遊離した、 dlkの 細胞外領域である FA1を検出することが可能であることから、 dlkの細胞外領域を腫瘍 マーカーとした血液検査又は尿検査により簡便に肝癌を検出することが可能である。 また、本発明により、高い抗癌作用を発揮する新規な癌治療薬が提供された。本発 明の癌治療薬は、特に肝癌の治療に有効である。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]ヒト胎児および成体組織における Dlkの遺伝子発現を示すノーザンブロットの結 果を示す写真であり、 (A)妊娠 6週目から 12週目の胎児肝臓における Dlkの遺伝子 発現、 （B)胎児組織における Dlkの遺伝子発現、 （C)成体組織における Dlkの遺伝 子発現を示す。
[図 2]ヒト肝癌由来細胞株における Dlkの発現解析の結果を示す図であり、 (A) FACS 解析 （B)免疫蛍光染色 （C) RT- PCR解析の結果を示す図である。
[図 3]ヒト肝癌組織における Dlkの発現を示す写真であり、 （A)肝細胞癌組織 （B)胆 管細胞癌組織にっ 、ての結果を示す。
[図 4](A)は、抗ヒト Dlkモノクローナル抗体を用いたヒト FA1の検出を示す図であり、 ELISA法により検出、確認した結果を示す。（B)は、抗ヒト Dlkモノクローナル抗体を用 いた精製ヒト FA1の検出を示す図であり、発光基質 (QuantaBlu (商品名） Fluorogenic Peroxidase Substrates:PIERCE)を用いた ELISA法により検出、確認した結果を示す。
[図 5]Dlkの染色性を基準にした組織 (64歳）のヒト Dlkの免疫染色の結果を示す図で ある。矢印は基準にした Dlk陽性部位を示す。 [図 6]肝細胞癌の染色像を示す。左：へマトキシリン 'ェォジン（HE)染色中央:ヒト Dlk陽性の免疫染色右：ヒトの免疫染色 Gradel： HE、 Dlk陽性 (48歳男性）、 Dlk陰性 ( 39歳男性) Gradell： HE、 Dlk陽性 (68歳男性）、 Dlk陰性 (36歳男性) Gradelll： HE、 Dlk 陽性 (63歳男性)、 Dlk陰性 (43歳男性）
[図 7]HEK293細胞と HEK293(hdlk)細胞の FACS解析による Dlkの発現を示す図であり 、点線:コントロール IgG抗体、実線:抗ヒト Dlkモノクローナル抗体、を示す。
[図 8]抗ヒト Dlkモノクローナル抗体を用いた CDC活性を示す図であり、 (A) HEK293細 胞および HEK293(hdlk)細胞に、抗体 5 μ g/ml、正常ヒト血清 25%を添加して 3日間培 養し、 MTTアツセィにより CDC活性を測定し、平均値士標準誤差で示した。吸光度の 値は抗体非添カ卩の系に比べ有意差を認めた (*: p<0.01, n=3, Student's t test)。 (B) HEK293(hdlk)細胞に抗体、ヒト補体血清 25%を添カ卩して 3日間培養し、 MTTアツセィ により CDC活性を測定し、平均値士標準誤差で示した。吸光度の値は抗体非添加の 系に比べ有意差を認めた (*: p<0.01, n=3, Student's t test)。
[図 9]抗ヒト Dlkモノクローナル抗体を用いた ADCC活性を示す図であり、 HEK293細胞 および HEK293(hdlk)細胞に、抗体 5 g/mlと健常人末梢血単核球をカ卩ぇ 3日間培養 し、 MTTアツセィにより ADCC活性を測定し、平均値士標準誤差で示した。ェフエクタ 一：ターゲット比は 10:1で培養した。
[図 10]Huh- 7 EGFPと Huh- 7 (hdlk)細胞（クローン PC14, PC16)の FACS解析による Dlkの発現を示す図である。点線:コントロール IgG抗体、実線:抗ヒト Dlkモノクローナ ル抗体
[図 11]抗ヒト Dlkモノクローナル抗体を用いた CDC活性を示す図である。 (A) Huh- 7 EGFP細胞および Huh-7 (hdlk)細胞（クローン PC14, PC 16)に抗体 5Dg/ml、正常ラ ット補体血清 25%で添加して 3日間培養し、 MTTアツセィにより CDC活性を測定し、平 均値士標準誤差で示した。（*: p<0.01, n=3, Student's t test) (B) Huh-7 EGFP細胞 および Huh- 7 (hdlk)細胞（クローン PC14, PC 16)に抗体を 0, 0.3, 1, 3, 5, 10 μ g/ml の濃度、正常ラット補体血清を 25%で添加して 3日間培養し、 MTTアツセィにより CDC 活性を測定し、平均値士標準誤差で示した。
[図 12]ヒト Dlk遺伝子発現による腫瘍形成能の促進効果を示す図である。 (A) Huh-7 EGFPと Huh-7 (hdlk)細胞（クローン PC14)のヌードマウス皮下における腫瘍形成。移 植後 19日目までの腫瘍体積 (mm3)を示す。 (B) Huh-7 EGFPと Huh- 7 (hdlk)細胞（クロ ーン PC16)のヌードマウス皮下における腫瘍形成。移植後 21日目までの腫瘍体積 (mm ')を不す。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 下記実施例に具体的に記載するように、本願発明者らは、 dlkが成体において、高 V、特異性をもって肝癌細胞表面上に発現しており、細胞表面上の dlk抗原を腫瘍マ 一力一として用いたり、 dlk遺伝子の mRNAを測定することにより、肝癌細胞の検出が 可能であることを見出した。本願発明は、この知見を基礎とするものである。なお、本 明細書及び請求の範囲において、「測定」には、検出、定量及び半定量が包含され る。
[0014] dlk自体は公知であり、 dlkをコードする cDNAはクローユングされており、その塩基 配列及びそれがコードするアミノ酸配列も公知である。例えば、ヒト dlkは、 GenBank accession番号 U15979および NM— 003836等に示されている。ラット dlkは、 GenBank accession番号 AB046763および D84336等に示されている。ゥシの dlkは、 GenBank accession番号 AB009278に示されている。これらのうち、 GenBank accession番号 U15979に示されるヒト dlkの cDNA配列及びそれがコードするアミノ酸配列をそれぞ れ配列表の配列番号 1及び 2に示す。また、 GenBank accession番号 NM_003836に記 載されている通り、 dlkcDNAには、 SNPを有する複数のバリアントが知られており、こ のようなノリアントも dlkに包含されることは言うまでもない。なお、配列番号 2に示すヒ ト dlkのアミノ酸配列のうち、細胞外領域は、 24aa— 304aaの領域である。
[0015] dlkは、肝癌細胞表面上に発現して 、るので、これを腫瘍マーカー抗原として利用 することにより肝癌細胞を検出することができる。なお、肝癌細胞には、肝細胞癌細 胞及び胆管細胞癌細胞が包含され、下記実施例において具体的に記載されるよう に、これらのいずれの表面にも dlkが発現していることが確認された。細胞表面上の腫 瘍マーカー抗原を測定する方法自体は周知であり、該腫瘍マーカー抗原と抗原抗 体反応する抗体との抗原抗体反応を利用した種々の方法により行うことができる。用 いる抗体としては、高くて均一な特異性を有するモノクローナル抗体が好ましい。抗 マウス dlkモノクローナル抗体は公知である（非特許文献 11)。また、下記実施例に具 体的に記載するように、本願発明者らは、抗ヒト dlkモノクローナル抗体の作出に成功 した。すなわち、ヒト dlkcDNAを哺乳動物細胞用の発現ベクターに組み込み、この組 換えベクターを細胞株に導入して dlkを細胞表面上に発現する細胞株を作出し、これ を免疫原として用いて常法である Kohlerと Milsteinの方法により抗ヒト dlkモノクローナ ル抗体を産生するハイプリドーマを榭立することができる。あるいは、上記のように、 dlkの細胞が領域のアミノ酸配列及びそれをコードする cDNA配列は公知であるので 、 dlkの細胞外領域又はその一部分は、遺伝子工学的手法又はペプチド合成法によ り容易に調製可能である。調製した dlkの細胞外領域又はその一部分をそのまま、又 はキーホールリンペットへモシァニン (KLH)ゃゥシ血清アルブミン (BSA)等の担体に結 合させたものを免疫原として用いる常法によっても抗 dlkモノクローナル抗体を作出す ることが可能である。また、抗体の Fab断片や、 F(ab')断片のような、抗原結合性を有
2
する抗体断片を用いることも可能である。
細胞表面上に発現する抗原 (本願発明の場合は dlk)に対する抗体又はその抗原 結合性断片を用いた、該抗原を細胞表面上に発現する細胞の測定方法自体は周知 であるので、抗 dlk抗体を用いた周知の手法に基づき、試料中の肝癌細胞を測定す ることができる。測定方法としては、免疫染色、 ELISA等のサンドイッチ法、ラテックス 凝集法などの凝集法、競合法等を挙げることができる。これらはいずれも周知であり、 用いる抗体さえ入手すれば常法により容易に行うことができる。さらに、本発明の肝 癌細胞の検出を効率的に実施できる好まし 、方法として、マグネティックセルソータ 一 (MACS)又はフローサイトメーター、とりわけ蛍光活性化セルソーター (FACS)を用い る方法を挙げることができる。 MACSは、細胞表面抗原に対する抗体を不動化した超 微粒子磁性ビーズで細胞を標識し、これを強力磁場にセットしたカラムに通して目的 の細胞を分離するシステムであり、回収率が高く高純度な細胞を得ることができ、大 量の細胞も効率的に分離することができ、さらに、細胞の機能や増殖能を保ったまま 分離できるので、検出した肝癌細胞の性質をさらに調べる場合等に好ましい。また、 FACSは、蛍光標識した抗体で細胞を標識し、ノズル力も噴射された細胞流にレーザ 一を当て、発生する分散光と蛍光を分析して、各 1個の細胞を含む水滴を荷電させ、 高電界で分離する装置である。 FACSも MACSと同様な理由により、本発明の方法に 好ましい。 MACS及び FACSはいずれもこの分野において周知であり、そのための装 置が市販されているので、用いる抗体さえ入手すればこれらの市販品を用いて容易 に行うことができる。
[0017] 細胞表面上の dlk抗原を検出する方法に供される試料としては、肝癌細胞を含んで いるカゝもしれない試料であり、通常、肝臓の生検試料である。生検試料は、組織切片 (免疫染色の場合)でもよ 、し、肝臓組織をコラゲナーゼやトリプシン等のプロテア一 ゼで処理して得られる細胞浮遊液であってもよい。
[0018] 一方、膜タンパク質である Dlkはその細胞外領域が切断され、 FA1として知られる可 溶性分子を生成することが明力となっている（非特許文献 10)。そして、下記実施例 に記載したとおり、本願発明者らが作出した抗ヒト dlkモノクローナル抗体は、 FA1とも 抗原抗体反応をする。したがって、抗 dlk抗体、好ましくは抗 dlkモノクローナル抗体を 用いて血液中の FA1を免疫測定することにより、血液試料 (血清、血漿、全血等）、あ るいは尿試料を用い肝癌の診断を行なうことが可能である。免疫測定自体は、上記 のような常法により容易に行うことができる。例えば、サンドイッチ ELISAにより免疫測 定を行う場合、抗 Dlk抗体又はその抗原結合性断片を第 1抗体として固相に不動化 し、検体と反応させ、洗浄後、 Dlkと抗原抗体反応する第 2抗体を反応させ、洗浄後、 固相に結合した第 2抗体を測定する。第 2抗体を酵素、蛍光物質、放射性物質、ピオ チン等で標識しておくことにより固相に結合した第 2抗体を測定することができる。濃 度既知の複数の標準試料中について上記方法により測定し、測定された標識量と標 準試料中の FA1量の関係に基づき検量線を作成し、未知濃度の被検試料にっ 、て の測定結果をこの検量線に当てはめることにより、被検試料中の FA1を定量すること 力 Sできる。下記実施例に具体的に記載されるように、 ELISAにおける酵素基質として 発光基質（fluorogenic peroxidase substrate: PIERCE)を用い、蛍光を測定することに より、検出感度を Ing/mL以下の高感度を達成することが可能である。また、凝集法で は、ラテックス等の粒子に抗 Dlk抗体又はその抗原結合性断片を不動化し、検体と反 応させて吸光度を測定する。濃度既知の複数の標準試料中について上記方法によ り測定し、測定された標識量と標準試料中の FA1量の関係に基づき検量線を作成し 、未知濃度の被検試料についての測定結果をこの検量線に当てはめることにより、 被検試料中の FA1を定量することができる。
[0019] 上記した抗原抗体反応を利用した細胞表面上の dlk抗原を測定する方法にぉ ヽて 、ヒトの細胞上の dlk抗原を測定する場合には、抗ヒト dlkモノクローナル抗体又はその 抗原結合性断片を用いることが好まし ヽことは言うまでもな 、。
[0020] 上記のように、抗 dlk抗体、好ましくは抗 dlkモノクローナル抗体は、肝癌の検出に用 V、ることができるので、肝癌診断薬としての用途を有する。
[0021] また、細胞中の、 dlk mRNAを測定することによつても、 dlk遺伝子の発現を調べる ことができる。細胞中の mRNAの測定は、常法により行うことができる。すなわち、例 えば、下記実施例に記載の通り、ノーザンプロット法により行うこともできるし、逆転写 PCR(RT-PCR)を行い、 PCR産物を電気泳動することにより、さらに電気泳動バンド をサザンブロット法にかけることにより行うことができる。あるいは、 RT-PCRをリアルタ ィム検出 PCR(RTD-PCR)法により行うことにより、铸型となる cDNA量、ひいては mR NA量を正確に定量することができる。あるいは、 NASBA法等により、 mRNAを直接 増幅し、電気泳動さらには電気泳動後のノーザンプロットにより測定することも可能で ある。これらの方法自体は、いずれも常法であり、必要な試薬キット及び装置は巿販 されている。また、 Dlkの cDNA配列が公知であるので、これらの方法に必要なプロ一 ブゃプライマーは容易に設計することができるし、下記実施例にも具体的にこれらの 例が記載されている。したがって、 Dlkタンパクをコードする mRNAの測定は、当業者 が容易に行うことができる。なお、 Dlkの mRNA (又は mRNAを铸型として得られた c DNA)の検出や増幅に用いられるプローブやプライマーは、 Dlkの mRNA又は cDN Aの!、ずれかの鎖に相補的な配列を有するものが好まし!/、が、プローブやプライマ 一のサイズの 10%以下、好ましくは 5%以下の塩基のミスマッチを有するものを用い ることも可能である。このようなミスマッチを有するプライマーを用いることにより、増幅 産物に所望の制限酵素部位を付与することができる。このような制限酵素部位は、増 幅産物をベクターへ組み込む際に便利な場合がある。また、プローブやプライマーの サイズ（Dlkの mRNA又は cDNAとハイブリダィズする領域のサイズ）は、特に限定さ れないが、常法と同様、 15塩基以上、好ましくは 20塩基以上であり、サイズの上限は 特にないが、プライマーの場合には、通常、 50塩基以下、好ましくは 40塩基以下で あり、プローブの場合には全長以下が適当である。なお、測定すべき Dlkの mRNA又 は cDNAの領域とハイブリダィズする上記核酸領域を含み、プライマー又はプローブ として利用可能であれば、核酸断片の一端に非相補的な配列が付加されていてもよ い。このような付カ卩的な配列は、タグや他の核酸との結合のために利用することが可 能な場合がある。本発明は、 Dlkの mRNA又は cDNAとハイブリダィズする、これらの プローブ及びプライマーのような、肝癌検出用核酸をも提供する。
[0022] 上記の通り、本発明の癌治療薬は、癌細胞表面上に発現している Dlkと抗原抗体 反応する抗体を有効成分として含有する。 Dlkと抗原抗体反応する抗体としては、上 記した抗 Dlk抗体であって、細胞表面上に Dlkを発現して 、る癌細胞に対して抗癌作 用を発揮するものを用いることができ、高くて均一な特異性を有するモノクローナル 抗体が好ま 、。細胞表面上に Dlkを発現して 、る癌細胞に対して抗癌作用を発揮 する抗 dlkモノクローナル抗体は、下記実施例に具体的に記載する、 Dlk発現細胞株 を用いた MTTアツセィによりスクリーニングすることができる。下記実施例では、得ら れた 3種の抗ヒト Dlkモノクローナル抗体のうち 2種が MTTアツセィにより抗癌作用を発 揮したので、 MTTアツセィによるスクリーニングにより、再現性をもって、細胞表面上 に Dlkを発現している癌細胞に対して抗癌作用を発揮する抗 dlkモノクローナル抗体 を得ることができる。
[0023] 抗体は、治療薬の投与対象の動物種と異なる動物種由来の抗体であってもよいが 、少なくとも定常部が、投与対象の動物種と同一種の抗体の定常部 (Fc)であることが 好ましい。例えば、ヒトに投与する治療薬の場合、少なくとも定常部がヒト由来の抗体 である、キメラ抗体やヒト化抗体を好ましく用いることができる。キメラ抗体やヒト化抗体 を用いることにより、抗体の抗原性を減じることができ、抗体を投与した際の抗原抗体 反応が起きに《なる。のみならず、ヒトに投与する場合に抗体の定常部分をヒト由来 とすることにより、 ADCC活性が高くなると考えられる。すなわち、 ADCCが起きるため には、エフェクター細胞の Fc受容体に抗体の Fcが結合することが必要であるので、 Fcはその動物種のエフェクター細胞の Fc受容体にフィットするものが有利であるから である。キメラ抗体は、抗原をマウスに免疫し、得られるマウスモノクローナル抗体の 遺伝子から抗原と結合する抗体可変部 (V領域)を切り出し、ヒト骨髄腫由来の抗体 定常部（C領域)遺伝子と結合してキメラ遺伝子を作成し、このキメラ遺伝子を宿主細 胞で発現させることにより得られる抗体である。その調製方法は周知であり、市販のキ メラ抗体も多数存在する。また、ヒト化抗体は、マウス抗体の抗原結合部位 (CDR,相 補性決定領域)の遺伝子配列だけをヒト抗体遺伝子に移植した抗体であり、キメラ抗 体よりもさらにマウス由来部分が少ない抗体である。ヒト化抗体及びその調製方法も 周知であり、近年、多くのヒト化抗体が市販されている。
[0024] 抗 Dlk抗体は、下記実施例に具体的に記載するように、少なくとも補体の存在下で 抗癌作用を発揮する。補体は、患者の血液内に含まれているので、抗 Dlk抗体は、そ のままで癌治療薬として機能する。なお、下記実施例では、抗ヒト Dlkモノクローナル 抗体のヒト肝癌細胞株に対する ADCC活性は認められな力つた力 これは、抗体の Fc カ^ット由来であるためと考えられ、 CDC活性が認められているので、 Fcをヒト由来に 変えれば ADCCも発揮されると考えられる。抗 Dlk抗体はそのままでも用いることがで きるが、抗体にリシン等の毒素や他の抗癌剤を結合させることにより、いわゆるミサイ ル療法も可能になる。
[0025] 本発明の癌治療薬により治療される癌としては、 Dlkが癌細胞表面上に発現される 癌であり、肝細胞癌ゃ胆管細胞癌のような肝癌、肺小細胞癌や 1型神経線維腫症を 挙げることができる。これらのうち、肝細胞癌ゃ胆管細胞癌のような肝癌が特に好まし い。
[0026] 本発明の癌治療薬の投与経路は、患部への注射、静脈内注射、筋肉内注射等の 非経口投与が好ましい。投与量は、患者の状態や癌の進行度等に応じて適宜選択 される力 通常、成人患者 1日 1回、体重 lkg当たり、抗体量で 0.001— lOOmg程度、 好ましくは 0.01— 50mg程度、さらに好ましくは 0.1— 5mg程度である。製剤は、単に抗 体を生理緩衝液中に溶解したものであってもよ ヽし、医薬製剤の分野にお 、て一般 に用いられて 、る 1又は 2以上の添加剤を添カロしてもよ 、。
[0027] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実 施例に限定されるものではない。
実施例 [0028] 実施例 1 肝癌の検出
1. 材料と方法
(1) ヒト dlk全長 cDNAの単離と発現ベクターの構築
ヒト Dlk(Genbank accession No. U15979)の遺伝子配列情報より PCRプライマーを設 計した。作成したプライマーの配列は以下の通りである。
フォヮ 1 ~~ド側フフィマ' ~~： 5 - cgcgtccgcaaccagaagccc- 3
リノ、1 ~~ス側フフイマ1 ~~： 0 - aagcttgatctcctcgtcgccggcc- この時、リバース側プライマーには Hindlllによる制限酵素消化配列を付加した。これ らのプライマーと胎生 10週のヒト肝臓より調整した全 RNA (TAKARA)カゝら合成した cDNAを铸型として PCR反応を行った。その後、ァガロースゲル電気泳動による展開、 目的のバンドの抽出を行い、 pCRIIベクター (Invitrogen)にクローユングした
(pCRII- hdlk)。クローユングしたヒト Dlkの cDNAはシークェンスにより確認した。
[0029] 発現ベクターの構築にあたり、ヒト Dlkの C末端に Flagタグを付加するため、まず
pbluescript II SK(+)ベクター (STRATAGENE)の Hindlll/Sall部位に Flagタグ配列をコ ードするオリゴヌクレオチド (配列：フォワード側
5 -agcttgactacaaggacgacgatgacaagtgag-3 、 リノ、1 ~~ス側
5— tcgactcacttgtcatcgtcgtccttgtagtca— 3，)を挣入した (pBS— Flag)。次に pCRII— hdlk力 らヒト dlk遺伝子を含む EcoRI/Hindlll断片を切り出し、 pBS-Flagベクターの
EcoRI/Hindlll部位に挿入した (pBS- hdlk- Flag)。さらに pBS- hdlk- Flagから EcoRI/Sall 断片を切り出し、 pcDNA3.1ベクター (Invitrogen)および pMIGベクター 8)の EcoRI/XhoI 部位に挿入した (それぞれ pcDNA- hdlk- Flag、 pMIG- hdlk- Flag)。
[0030] ヒト FA1発現ベクターを構築するにあたり、以下のプライマーを設計し、合成した。
フォヮ 1 ~~ド側フフィマ' ~~： 5 -cgcgtccgcaaccagaagccc- 3
ジノヽ1 ~~スィ則フフィマ' ~~： 0— ctcgaggtgctccggctgctgcaccggc— 3'
この時リバース側プライマーには Xholによる制限酵素消化配列を付加した。これらの プライマーとヒト dlkの cDNAを铸型として PCR反応を行い、得られたヒト FA1 cDNAを pCRIIベクター (Invitrogen)にクローユングした (pCRII-hFAl)。クローユングしたヒト FA1 の cDNAはシークェンスにより確認した。 [0031] pCRII- hFAlからヒト FA1 cDNAを含む EcoRI/XhoI断片を切り出し、 pcDNA4/Myc- Hisベクター (Invitrogen)の EcoRI/XhoI部位に挿入した
(pcDNA4-hFAl)。この発現ベクターには C末端側に Mycタグ及び Hisタグ配列が付カロ されており、ヒト FA1は Mycタグ及び Hisタグとの融合タンパク質として発現する。
[0032] (2) ヒト肝癌由来細胞株
ヒト肝癌由来細胞株は、 JHH-6、 HLF、 JHH-5及び Huh-6であり、いずれも（財)ヒュ 一マンサイエンス振興財団より分譲を受けた。
[0033] (3) 培養細胞への遺伝子導入
培養細胞への遺伝子導入は、 LipofectAMINE-plus試薬 (GIBCO BRL)を用い、添 付のプロトコルに従 、行った。
[0034] (4) RT-PCR
ヒト肝癌由来細胞株カゝら Trizol試薬 (二ツボンジーン)を用いて RNAを抽出した。 First-strand cDNA synthesis kit(Amersnam Pharmacia Biotecnノ 用 ヽて抽出した RNAから cDNAを合成した後、 PCR法によりヒト Dlkの発現を解析した。使用したプライ マーは以下の通りである。
フォヮ 1 ~~ド側フフイマ1 ~~：。 - agagctcaacaagaaaacc- 3
リノ ~~スィ則プフイマ ~~： 0 -gcgtatagtaagctctgagg-3 '
[0035] (5) ノーザンブロット解析
胎児組織全 RNA(TAKARA)および細胞カゝら Trizol試薬 (二ツボンジーン）を用いて抽 出した全 RNA、各 10 gをホルムアルデヒド変性ゲルにて電気泳動した。ナイロン膜 に転写した後、 DIGラベルした cDNAプローブを用いてハイブリダィズした。プローブ の検出は、 CDP-starを基質とした化学発光により行った。
[0036] (6) 抗ヒト Dlkモノクローナル抗体の作製
ヒト dlk遺伝子を組み込んだ、上記レトロウイルスベクター (pMIG-hdlk- Flag)をパッケ 一ジング細胞である BOSC23細胞（Pear, W.S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90, 8392-8396)に導入し、ヒト dlk遺伝子を持つレトロウイルスを産生した。我々 が以前、温度感受'性 SV40 large T antigenのトランスジエニックマウス（Yanai,N. et al.
(1991) Exp. Cell Res. 197, 50-56)の胎児肝臓から榭立した細胞株 7E2-Cに産生し たレトロウイルスを感染させ、恒常的にヒト Dlkを発現する細胞株 7E2-C(hdlk)を得た。
[0037] さらに、 HEK293細胞 (入手先:東京大学分子細胞生物学研究所機能形成）に上記 発現ベクター pcDNA- hdlk- Flagを導入し、抗生物質 G418(geneticin, GIBCO BRL)に よる選択を行った後、ヒト Dlkを安定して発現して 、る細胞株 HEK293(hdlk)を榭立した
[0038] 上記 2種の細胞株をそれぞれ抗原としてラットを免疫し、常法により抗ヒト Dlkモノクロ ーナル抗体を産生するノ、イブリドーマクローン作製した。これらのクローンを、予め（7 日前） 2,6, 10, 14-テトラメチルペンタデカン（プリスタン）を投与された BALB/cヌードマ ウスの腹腔内に 3xl06個投与し、 2週間後の腹水を採取した。さらに、この腹水から力 プリル酸沈澱、プロテイン Gカラム精製を行うことで、各ハイプリドーマクローンが産生 する抗ヒト Dlkモノクローナル抗体を得た。
[0039] (7) cell ELISA法
ゼラチンでコートした 96穴培養プレート (Corning)に上記 7E2-C(hdlk)株を 7.5xl03細 胞 /ゥエルで播種し、 37°Cで 2日間培養した。氷冷 PBSで洗浄後、 4%パラホルムアル デヒド溶液で固定、 0.2% Triton-X- 100 (商品名）溶液で処理し、 cell ELISA用プレート とした。以後、定法に従い ELISA法を行った。具体的には、 ELISAは次のようにして行 なった。まず 1%BSA-PBS溶液によるブロッキングを室温で 2時間行った。次に、ハイブ リドーマ上清をカ卩え、室温で 1時間反応させた後、 0.1%Tween20 (商品名） -PBS溶液 で 3回洗浄した。二次抗体としてピオチンィ匕抗ラッ HgG(VeCtor社製)を
0.1%Tween20- PBS溶液で 100倍希釈して使用した。室温で 1時間反応させた後、 0.1%Tween20-PBS溶液で 3回洗浄した。さらに 0.1%Tween20-PBS溶液で 1000倍希釈 したセィヨウヮサビペルォキシダーゼ ストレプトアビジン（Vector社製)を室温で 1時 間反応させ、 0.1%Tween20_PBS溶液で 3回洗浄した。 ΤΜΒ(3,3',5,5'-テトラメチルべ ンチジン： SIGMA社製)基質溶液を添加し発色反応を行い、 1M硫酸を加え反応を停 止させた。 Microplate reader Model 550(BIO- RAD)を用い吸光度を測定した。
[0040] (8) 免疫組織染色法
ヒト正常組織、肝癌組織のパラフィン切片 (Bio Chain, Hepatocellular carcinoma; catalog No.:T2235149-4, lot No.:A607070, Cholangiocellular carcinoma; catalog No.:T2235149-2, lot No.:A603549)は、脱パラフィン処理後、 10mMクェン酸ナトリウム 溶液中で 10分間加熱処理し、抗ヒト Dlkモノクローナル抗体を用いた染色に使用した 。 DAB(3,3'-ジァミノベンチジン)を基質とて発色反応を行った後、対比染色としてへ マトキシリンによる核染色を行った。これらの操作はより具体的には次のようにして行 なった。 4%パラホルムアルデヒドによる固定及びパラフィン包埋された切片を、脱パ ラフィン処理後、 10mMクェン酸ナトリウム溶液中で 10分間加熱処理した。次にメタノ 一ルに終濃度 0. 3%となるように過酸ィ匕水素水をカ卩えた溶液によって、室温で 20分 間処理し内因性のペルォキシダーゼ活性を除 、た。 PBSで室温 5分間の洗 、を 2回 行 、、ブロックエース試薬 (大日本製薬株式会社)を用いて 30分間ブロッキングを行 い、組織中の非特異的結合部位をふさぐ操作を行った。次に 1Z10に希釈したプロ ックエース試薬により希釈した抗ヒト dlkモノクローナル抗体 clone 1C1 (終濃度 0.25 g/ml)を室温で 1時間反応させ、 PBSで 5分の洗いを 3回行い、続いて lZlOに希釈 したブロックエース試薬によって 100倍に希釈したピオチンィ匕抗ラッ HgG抗体を室温 で 1時間反応させた。 PBSによる 5分間の洗いを 3回行った後、 ABCキットの試薬を説 明書通りに混ぜて ABCコンプレックスを作り、これを室温で 30分反応させた。 PBSで 5分間 3回の洗いの後、ペルォキシダーゼ基質（0. 02%DAB、 0. 03%過酸化水素 水、 50mM Tris-HCl pH 7.5)によって発色を行った。発色を確認した後、水で 10分 間洗い、マイヤーへマトキシリン溶液 (和光）によって核を染色し、その後アルコール で脱水し、キシレンで透徹して、ェンテラン-ユー (メルク'ジャパン株式会社)で封入 した。
また、ヒト肝細胞癌のパラフィン切片（Cybrdi社， Hepatocellular carcinoma; catalog No.: CS03-01, lot No.: CS03- 01- 001- 012 (23患者、 63切片)， CS03- 01- 002 (63患 者、 63切片》は、脱パラフィン処理後、親水化し、 10mMクェン酸緩衝液（pH6.0)で、 オートクレープ処理（121°C、 5分)した。次にメタノールに最終濃度 0.3%となるように過 酸ィ匕水素水をカ卩えた溶液によって、室温で 5分間処理し、内因性のペルォキシダー ゼ活性を除いた。 PBSで 5分間の洗いを 3回行い、 1.5%ャギ血清 PBS溶液で 30分間ブ ロッキングを行い、組織中の非特異的結合部位をふさぐ操作を行った。次に 1.5%ャギ 血清 PBS溶液で希釈した抗ヒト dlkモノクローナル抗体 clonelCl (濃度 0.25 g/ml)を 4 °Cでー晚反応させ、 PBSで 5分間の洗浄を 3回行い、 1.5%ャギ血清 PBS溶液で 100倍 に希釈したピオチンィ匕抗ラット IgG抗体 (Vector)を室温で 2時間反応させた。 PBSで 5 分間の洗浄を 3回行い、 ABCコンプレックスを室温で 30分反応させた。 PBSで 5分間 ずつ 3回洗った後、ペルォキシダーゼ基質 (0.02%DAB、 0.03%過酸化水素水、 50mM Tris-HCl pH7.5)により発色を行った。発色後、精製水で 10分間洗い、マイヤーへマ トキシリン (和光）によって核を染色し、エタノールによる脱水、キシレンでの透徹の後 、ェンテラン-ユー (メルク'ジャパン)で封入した。
[0042] (9) FACS解析
細胞はトリプシン処理によって培養皿より剥がし、細胞懸濁液 (細胞密度 5xl06 cells/ml)を調製した。抗ヒト Dlkモノクローナル抗体 0.5 μ gと細胞懸濁液 100 μ Lを 4°C 、 30分間反応させた。 PBSで洗浄後、ピオチン化抗ラッ HgG Vector O /z g)と反応（ 4°C、 30分）させ、再び PBSで洗浄した。ストレプトアビジン- FITC(Pharmingen)またはス トレプトアビジン- PE(Pharmingen) (0.5 μ g)と反応 (4°C、 30分)させた後、 FACSCalibur (BECTON DICKINSON)にて解析した。
[0043] (10) 抗ヒト dlkモノクローナル抗体によるヒト FA1の検出
ヒト FA1発現ベクターを 7E2-C細胞に導入し、 3日後の培養上清、又は培養上清か ら His Trap HP Kit (Amersham Bioscience)を用いて精製 (hFAl濃度: 30 μ g/ml)した hFAlを検出試料とした。検出には、捕獲抗体として clone 31C4、検出抗体としてピオ チン化した clone 4C4を用いたサンドイッチ ELISA法を用いた。検出抗体のピオチン ィ匕は ECL Protein Biotinylation Module(Amersham Bioscience)を用いて行つ 7こ。な お、このサンドイッチ ELISAは具体的に次のようにして行なった。まず捕獲抗体 clone31C4を PBSで 10 μ g/mlに希釈し、 96穴プレートに 100 μ 1/wellで添カ卩した。室温 でー晚静置した後、 PBSで 3回洗浄し、 2%スキムミルク- PBS溶液（以降 2%MPBSとす る）によるブロッキングを室温で 2時間行った。次に、 hFAlを含む培養上清または 2%MPBSで各濃度に希釈した hFAlを加え室温で 1時間静置した。 PBSで 3回洗浄した 後、検出用抗体のピオチン化した clone4C4を 2%MPBSで 1 μ g/mlに希釈し添カ卩した 。室温で 1時間反応させた後、 0.1%Tween20 (商品名） -PBS溶液で 3回洗浄した。二次 抗体としてピオチン化抗ラッ HgG(Vector社製)を 2%MPBS溶液で 100倍希釈して使用 した。室温で 1時間反応させた後、 0.1%Tween20- PBS溶液で 3回洗浄した。さらに 2%MPBS溶液で 1000倍希釈したセィヨウヮサビベルォキシダーゼ ストレプトアビジン (Vector社製)を室温で 1時間反応させ、 0.1%Tween20_PBS溶液で 3回洗浄した。発色 反応は ΤΜΒ(3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン： SIGMA社製)を基質溶液として添加し て行い、 1M硫酸を加え反応を停止させた。 Microplate reader Mode 50(BIO- RAD) を用い吸光度を測定した。蛍光反応は QuantaBlu (商品名） Fluorogenic Peroxidase Substrates(PIERCE社製)と測定機器としてフルォロスキャンアセント (Thermo
Labsystems社製)を用いて測定した。
[0044] 2. 結果
(1) ヒト正常肝臓におけるヒト Dlkの発現
本願発明者らは、以前、マウスにおいて Dlkが胎生肝細胞に高発現しており、成体 肝細胞には発現が見られないこと、抗マウス Dlkモノクローナル抗体と
MACS(Magnetic beads cell sorting)を組み合わせて用いることで、胎児肝臓から肝細 胞のみを高純度で回収することができることを見い出している（非特許文献 7、特許文 献 1)。そこで、まずヒトにおいても同様な発現パターンを示すの力検討した。ヒト胎児 肝臓全 RNAサンプル (TAKARA)を用いてノーザンブロット解析を行った結果、妊娠 6 週目から 12週目の胎児肝臓においてヒト Dlkの発現が認められた (図 1A)。また妊娠 12 週目における各臓器でのヒト Dlkの発現を調べた結果、肝臓以外に腎臓、骨格筋でも 発現していた (図 1B)。これに対し成体組織での発現は、以前の報告にあるように、胎 盤以外では検出できな力つた (図 1C) (非特許文献 1)。し力しながら最近の報告では 、 FA1が下垂体（Larsen, J.B. et al. (1996) Lancet. 347, 191)、副腎（Jensen, C.H. et al. (1993) Hum. Reprod. 8, 635-641)などにも発現していることが明らかにされてい る。このことから、ヒトでもマウスと同様に、肝臓での Dlkの発現は胎児で見られるもの の、成体肝臓では発現して 、な 、ことがわ力つた。
[0045] (2) 抗ヒト Dlkモノクローナル抗体
上記の結果を更に確認するため、本願発明者らはまず、抗ヒト Dlkモノクローナル抗 体 (ラッ HgG)を作製した。抗原として 2種類のヒト Dlk発現細胞を榭立し、これを抗原と してラットを免疫した。ハイプリドーマを定法に従い調整し、その後、抗原として用いた 7E2-C(hdlk)株を用いた FACS解析、および cell ELISA法により陽性クローンを選択し た。さらにクロー-ングを行い、 3種類（clone 1C1、 4C4、 31C4)の安定したクローンを 確立した。最終的に確立したクローンの培養上清を用いて FACS解析を行った結果、 確かにこれらの培養上清中にヒト Dlkと特異的に反応するモノクローナル抗体が産生 されて 、ることが確認された。
[0046] これらのクローンを、予め（7日前） 2,6, 10, 14-テトラメチルペンタデカン（プリスタン） を投与された BALB/cヌードマウスの腹腔内に 3xl06個投与し、 2週間後の腹水を採取 した。さらに、この腹水力も力プリル酸沈澱、プロテイン Gカラム精製を行うことで、各 ハイプリドーマクローンが産生する抗ヒト Dlkモノクローナル抗体を得た。得られた精製 モノクローナル抗体は、対応する各培養上清と FACS解析にぉ ヽて同等の活性を示 した。
[0047] 得られた抗ヒト Dlkモノクローナル抗体 clone 1C1を用いて、ヒト胎児組織の免疫組織 染色を行った。ノーザンプロットの結果に一致して、肝臓、腎臓、骨格筋で染色像が 見られた。また、胎盤組織でも同様に染色を行った結果、絨毛の合胞体性栄養細胞 にお 、て強 、染色が見られた。
[0048] (3) ヒト肝癌由来細胞株におけるヒト Dlkの発現
ヒト Dlkの発現は、マウスでの結果と同様、胎児の未熟な肝細胞では見られる力 成 体の肝細胞では発現が認められない。本願発明者らは、ヒト肝癌におけるヒト Dlkの発 現の可能性を検討した。まず 4種類のヒト肝癌由来細胞株 (JHH-6、 HLF、 JHH-5、 Huh-6)について、 FACS解析、免疫染色および RT-PCR法によって検討した。抗ヒト Dlkモノクローナル抗体 clone 4C4を用いて FACS解析を行った結果、未分化型の細 胞株 0HH- 6、 HLF)ではシフトは認められな力つた力 分ィ匕型の細胞株 (JHH-5、 Huh-6)ではヒト Dlkの発現を示すシフトが見られた (図 2Α)。また免疫染色法の結果も 同様に、分化型の細胞株では染色像が確認された (図 2Β)。
[0049] 次に RT-PCR法による解析を行った。それぞれの細胞株力も抽出した全 RNAから cDNAを合成し、これを铸型として PCR反応を行った。その結果、 FACS解析、免疫染 色の結果と同様に、分ィ匕型の細胞株ではヒト Dlkの発現が見られた。しかしながら RT-PCR法では、 FACS解析、免疫染色では発現の見られなカゝつた未分ィ匕型の細胞 株でも、弱いながらヒト Dlkの発現が認められた (図 2C)。未分化型の細胞株における 結果の相違は、ヒト Dlkの検出感度の差であると考えられる。
[0050] (4) ヒト肝癌組織におけるヒト Dlkの発現
ヒト肝癌由来細胞株におけるヒト Dlkの発現解析の結果は、ヒト Dlkが肝癌組織にお Vヽても発現して 、る可能性を示唆して 、る。そこでヒト肝癌組織でのヒト Dlkの発現を、 抗ヒト Dlkモノクローナル抗体 clone 1C1を用いて免疫組織染色法により検討した。そ の結果、肝細胞癌および胆管細胞癌の組織において癌部で強く染色されることが明 力となった (図 3)。この時、癌部に隣接する正常組織では全く染色されな力つた。この ことは Dlkが胎生肝細胞のみならず、成体肝細胞の癌化によっても発現することを示 しており、肝癌における腫瘍マーカーになりうることが示唆された。
[0051] さらに、肝細胞癌における Dlkの陽性率を、正確に調べる為に、多数の肝細胞患者 由来の病理切片を抗 Dlk抗体を用いて免疫染色を行 ヽ検討した。ヒト組織アレイを用 いた肝細胞癌でのヒト Dlkの発現は、 lot No.: CS03- 01- 001- 012の No. 51切片を基準 にし、 Dlk陽性染色部位と同等以上の染色性のものを Dlk陽性とし、それ以下のもの を陰性として測定した（図 5)。 80患者、 118切片の肝細胞癌組織を検討したところ、全 体では 118病理切片中 65切片において Dlk陽性（55%)であり、更に、各グレード (Grade)ごとに検討したところ， Grade Iの肝細胞癌での Dlk陽性率は 82 % (9/11), Grade I一 IIが 100% (3/3), Grade IIが 61 % (33/54), Grade IIIで 40% (20Z50)で あり（表 1)、低分化型から高分化型に至るすべての肝細胞癌において広く Dlk陽性で あることが判明した。し力しながら、特に Grade I, IIの分ィ匕度の低い肝細胞癌におい て、高頻度で Dlkの発現が認められ、また上記したように、 Dlkは増殖性の高い胎児期 の肝細胞や、成体における肝再生時に出現し、前癌細胞である可能性が指摘されて いるオーパル細胞においても発現することから、肝細胞癌 Grade Iでの高い Dlkの発 現率は、 Dlkが初期の肝細胞癌の腫瘍マーカーである可能性を示唆している。観察 した各 Gradeのへマトキシリン'ェォジン（HE)染色、 Dlk染色の陽性および陰性組織 像の例は図 6に示した。
[0052] なお、図 2B、図 3、図 4、図 5及び図 6の原図はカラー写真であり、添付の図面（白 黒グレースケール)では結果は明瞭ではないかもしれないが、原図では、上記結果 が明瞭に示されている。
[0053] [表 1] urade 合計 Dlk陽性 （％) Dili陰性
Ϊ 1 1 9 (82) 2 (1 8)
I〜ϋ 3 3 ( 1 00) 0 (0)
Π 54 33 (61 ) 21 (39)
ffl 50 20 (40) 30 (60)
[0054] (5) 抗ヒト dlkモノクローナル抗体によるヒト FA1の検出
Dlkは、その細胞外領域が切断され、 FA1として知られる可溶性分子を産生すること が明かとなっている。我々が作出した抗ヒト Dlkモノクローナル抗体は、 Dlkの細胞外 領域を認識することから、この抗体を用いてヒト FA1を認識、検出できる可能性が考え られた。そこで、 7E2-C細胞にヒト FA1を一過性に発現させた培養上清を用いて ELISA法により検討した。その結果、確かにコントロールベクターを導入した培養上清 ではシグナルが検出されな 、が、ヒト FA1を含む培養上清ではシグナルが検出される ことが確認された（図 4)。以上のことから我々の作出した抗ヒト Dlkモノクローナル抗体 は、ヒト FA1を検出できることが明かとなった。
[0055] (6) 抗ヒト dlkモノクローナル抗体によるヒト FA1の検出法の感度検定
さらに、上記の「1.材料と方法」の「(10) 抗ヒト dlkモノクローナル抗体によるヒト FA1 の検出」に記載したように、精製ヒト FA1タンパク質を用いて、 ELISA法の感度検定を ?Tつた結果、 5§光基質 (QuantaBlu (商品名ノ Fluorogenic Peroxidase
Substrates:PIERCE)と測定機器としてフルォロスキャンアセント (Thermo Labsystems) を用いることで、 lng/mlのヒト FA1が検出可能であった（図 4B、表 2)。
[0056] [表 2] FA— 1 (ng/mL) 螢光強度値
0 179.85
1 221.55
3 277.1
10 537.9
30 1331.0
100 3685.0
[0057] 実施例 2 抗 Dlk抗体の抗癌活性
1. 材料及び方法
「(1) ヒト dlk全長 cDNAの単離と発現ベクターの構築」、「(2) ヒト肝癌由来細胞株」 、 「(3) 培養細胞への遺伝子導入」、「(4) RT- PCR」、 「(5) ノーザンプロット解析」は 実施例 1記載の通りに行った。
[0058] (6) 抗ヒト Dlkモノクローナル抗体の作製
2種類の Dlk発現細胞株 7E2-C(hdlk)と HEK293(hdlk)の榭立までは実施例 1記載の 通りに行った。
[0059] 抗ヒト Dlkモノクローナル抗体を作製するために、 2種類の Dlk発現細胞株
7E2- C(hdlk)と HEK293(hdlk)の細胞懸濁液を、免疫補助剤（完全フロイントアジュバン ド:和光純薬工業）と 1： 1で混合したェマルジヨンを 6週齢のウィスターラットの両足に 1X107細胞ずつ注射し、免疫を行った。追加免疫を 2回行った後に両足のリンパ節を 採取し、リンパ球を調製し、マウスのミエローマ細胞株（P3X)とポリエチレングリコール 法で細胞融合を行った。 96穴平底プレートで HAT (アミノプテリン、ヒポキサンチン、チ ミジン）を含む培地で、 5% C02インキュベーターで培養した。培養後、増殖したハイ ブリドーマの培養上清を 7E2- C(hdlk)株を用いた FACS解析および Cell ELISA法によ りスクリーニングし、陽性クローンを選択した。このクローンをさらにクローユングし、 3 種類のハイプリドーマ株（クローン 1C1, 4C4, 31C4)を榭立した。これらのハイプリドー マ株は、それぞれ 1.5X107個/ mlの濃度で RPMI培地に懸濁した。細胞懸濁液を予め 7日前に 2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン (プリスタン)を投与したヌードマウス（ Balb/c-nu/nuSlc)の腹腔内に 200 L(3X106個)投与した。 2週間後に腹水を採取し、 力プリル酸沈殿、プロテイン Gカラムを用いて、各抗体をァフィユティー精製した。得ら れた精製モノクローナル抗体は、対応する各培養上清と FACS解析にぉ ヽて同等の 活性を示した。
[0060] Γ(7) cell ELISA法」、「(8) 免疫組織染色法」、「(9) FACS解析」は実施例 1記載の 通りに行った。
[0061] (10) ヒト末梢血単核細胞の分離
健常人静脈血をへパリン採血し、 PBSで 2倍に希釈後、 Lymphoprep (第一化学薬 品)上に重層し 20°Cで 800g、 20分間遠心した。遠心後、中間層分画にある単核細胞 を回収し、 PBSで 3回洗浄後、 10% FCSをカ卩えた DMEM培地に浮遊させエフェクター 細胞として用いた。
[0062] (11)ヒト補体血清の分離
健常人静脈血は抗凝固剤をカ卩えずに採血し、 15mlチューブに移して 37°Cの孵卵 器内に 60分間放置した。さらに室温に 60分間放置し、血餅をチューブの壁から剥が した後に 20°Cで 2500rpm、 15分間遠心した。遠心後、上清の血清を回収し、補体血 清として用いた。 56°C、 30分間の加温により補体を不活性化 (非働化)した血清は、コ ントロールとして使用した。
[0063] (12) MTT法
96穴プレートで培養した細胞にテトラカラーワン (生化学工業)を、添付のプロトコ一 ルに従い、各培養ゥエルに添カ卩し、 5% COインキュベーターで 3-4時間反応させた。
2
反応後 96穴プレートをそのままマイクロプレートリーダーを用いて 490nm (対照波長： 655nm)の吸光度を測定した。
[0064] (13)補体依存性細胞傷害活性
HEK293と HEK293(hdlk)細胞はトリプシン処理によってプレートから剥離し、 10% FCSをカ卩えた DMEM培地に lxl05/mlの濃度で浮遊させターゲット細胞として用いた。 ゼラチンコートした 96穴平底プレートに lxl04/wellで播き、抗ヒト Dlk抗体 4C4、 31C4お よびラッ HgG (それぞれ 0.2、 1.0、 5 g/ml)の存在下で 30分培養した。さらに補体とし て使用するヒト血清を培養液の 25%になるように加え、 72時間培養した。培養後、 MTT 法により吸光度を測定した。 CDC活性における生細胞数を示す吸光度の値は、対照 として作製した、培地に補体血清を添加したゥエルの平均値を差し引いて算出した。 有意差検定は Student's t testにより行った。
[0065] Huh-7EGFPと Huh-7(hdlk)細胞はトリプシン処理によってプレートから剥がし、
DMEM培地で 2xl05/mlの濃度で浮遊させ、ターゲット細胞として用いた。 96穴プレー トに lxl04/wellで播き、抗ヒト Dlk抗体 4C4、 31C4およびラット IgG (それぞれ 0.3、 1、 3、 5、 10 g/ml)の存在下で 30分培養した。さらに補体として使用するラット血清を培養 液の 25%になるように加え、 72時間培養した。培養後、 MTT法により吸光度を測定し た。 CDC活性における生細胞数を示す吸光度の値は、対照として作製した、培地に 補体血清を添加したゥエルの平均値を差し引いて算出した。有意差検定は Student's t testにより行った。
[0066] (14)抗体依存性細胞傷害活性
HEK293と HEK293(hdlk)細胞はトリプシン処理によってプレートから剥離し、 10% FCSをカ卩えた DMEM培地に 2xl05/mlの濃度で浮遊させ、ターゲット細胞として用いた 。ゼラチンコートした 96穴平底プレートに lxl04/wellで播き、抗ヒト Dlk抗体 1C1、 4C4、 31C4およびラッ HgG (5 /z g/ml)の存在下で 30分培養した。さらにエフェクター細胞は 、エフェクター：ターゲット比（20:1、 10:1、 5:1)でターゲット細胞に加え 5% COインキ
2 ュベータ一で 72時間培養した。培養後 MTT法により吸光度を測定した。 ADCC活性 における生細胞数を示す吸光度の値は、対照として作製した培地だけのゥエルの平 均値を差し引いて算出した。
[0067] (15) ヒト Dlkを発現するヒト肝癌由来細胞株 Huh-7の榭立
実施例 1の「1.材料と方法（1) ヒト dlk全長 cDNAの単離と発現ベクターの構築」に 記載したヒト Dlkの全長 cDNAを組み込んだ発現ベクター（pcDNA-hdlk-Flag)をヒト肝 癌由来細胞株 Huh-7 (入手先：東京大学分子細胞生物学研究所機能形成）に遺伝 子導入し、 G418 (geneticin, GIBCO BRL)による選択後、ヒト Dlkを安定に発現してい る 2種の細胞株 Huh- 7(hDlk) (クローン PC 14, PC16)を榭立した。また、コントロール細 胞として EGFPの全長 cDNAを組み込んだ発現ベクター（PEGFP)を Huh_7細胞に導 入し、 G418による選択後、 EGFPを安定に発現している細胞株 Huh-7 EGFPを榭立し た。
[0068] (16) 補体血清の分離 Std: Wister/STラット、 8週齢、雄の静脈血を抗凝固剤を加えずに採血し、実施例 2 の「1.材料と方法 (11)ヒト補体血清の分離」記載の方法で、補体血清を分離した。
[0069] (17) ヒト Dlk遺伝子の腫瘍形成促進活性の検討
ヒト Dlkを安定に発現して!/、る 2種の細胞株 Huh-7(hDlk) (クローン PC14, PC 16)およ びコントロール細胞（EGFPを安定に発現している細胞株 Huh-7 EGFP)を 3X106 cell / 100 L (PBS: EHS- gel=l:l)ずつ、 6週齢のヌードマウス（Balb/c; nu/nuゝ雌、 日本 エスエルシー）の皮下に移植した。ヒト Dlk遺伝子の腫瘍形成に与える影響を検討す る為に、ヌードマウス同一個体において、背中の左側皮下と右側皮下において、片 方にコントロール細胞を、もう一方にクローン PC14,あるいは PC16細胞を移植し、移 植後 3週間にわたり、それぞれの移植肝癌細胞の腫瘍形成を観察した。腫瘍体積の 測定はノギスを用いて、常法に従い、
腫瘍体積 (mm3)= π /6 X長径 X (短径) 2
の計算式で算出した。
[0070] 2. 結果
「(1) ヒト正常肝臓におけるヒト Dlkの発現」、 Γ(2) 抗ヒト Dlkモノクローナル抗体」、「 (3) ヒト肝癌由来細胞株におけるヒト Dlkの発現」、「(4) ヒト肝癌組織におけるヒト Dlk の発現」の結果は実施例 1に記載したとおりである。
[0071] (5)抗ヒト Dlkモノクローナル抗体を用いた 293 (hdlk)細胞の FACS解析（Dlk発現量の 確認）
作製した抗ヒト Dlkモノクローナル抗体（クローン 4C4)を用いて、 HEK293細胞と HEK293 (hdlk)細胞の FACS解析を行った。ヒト Dlkは HEK293細胞では全く発現して いなかつたが、 HEK293 (hdlk)細胞では強く発現していることが確認された（図 7)。
[0072] (6)抗ヒト Dlkモノクローナル抗体を用いた CDC活性
Dlkがヒト癌細胞株や癌組織で発現していることは、 Dlkが腫瘍マーカーになり、抗ヒ ト Dlkモノクローナル抗体力 Dlkを発現して 、る癌細胞を標的とした治療抗体になる 可能性を示唆している。そこで、まず、抗体と補体による細胞傷害、すなわち CDC活 性を測定した（図 8、表 3.1,3.2)。 96穴プレートにターゲット細胞として、 HEK293また は HEK293(hdlk)細胞を播き、抗ヒト Dlk抗体（クローン 4C4, 31C4を 5 μ g/mlで添加）と 補体血清を加えて培養した。培養 3日後、 MTTアツセィによりターゲット細胞の傷害を 測定した。 Dlk抗体を 5 /z g/mlで添カ卩したときの HEK293(hdlk)細胞の傷害は、抗体非 添加やコントロール IgG抗体を添カ卩した系に比較し、抗ヒト Dlk抗体（クローン 4C4, 31C4)と補体血清を添加した系で吸光度の値が低下し、生細胞数が 70-90%減少して いた。また、非働化した補体血清を添加して培養した場合、 5 /z g/mlの抗ヒト Dlk抗体 (クローン 31C4)を添加した系は、抗体非添カ卩およびコントロール抗体を添カ卩した系と 吸光度に違いはみられず、生細胞数は同等であった（図 8A、表 3.1)。また、 Dlkを発 現して 、な 、HEK293細胞に対しては、 、ずれの抗体も細胞傷害活性を示さなかつ た。
[0073] HEK293(hdlk)細胞を顕微鏡下で観察すると、補体血清にコントロール IgG抗体を添 加した系、非働化補体血清に抗ヒト Dlk抗体 (クローン 31C4)を添加した系では、細胞 力 Sコロニーを作って増殖して 、る形態が観察されたが、補体血清に抗ヒト Dlk抗体 (ク ローン 31C4)を添カ卩した系では、ほとんどの細胞が散在し、死滅している様に見られ た。一方、 Dlkを発現していない HEK293細胞では、抗ヒト Dlk抗体と補体血清を添カロ した系でも傷害を受けた細胞は確認されなカゝつた。
[0074] さらに、抗ヒト Dlk抗体（クローン 4C4、 31C4)を 0.2、 1.0、 5 μ g/mlで添加した時の
HEK293(hdlk)細胞の CDC活性を検討した（図 8B、表 3.2)。培養 3日後の CDC活性を MTTアツセィによって測定すると、 HEK293(hdlk)細胞の生細胞数は抗ヒト Dlk抗体濃 度に依存して減少し、 4C4と比較して 31C4に強い活性が見られることが確認された。 これらの結果は作製した抗ヒト Dlk抗体力 Dlk抗原を発現する細胞に対して CDC活 性を有することを示して 、る。
[0075] [表 3.1] 吸光度 ±SE
m 非働化血清 セルライン なし 4C4 31C4 ラット IgG なし 31C4 ラ' y HgG
HEK293 1.12±0.06 1.13±0.04 1.03+0.05 1.11 ±0.11 1,24±0.05 1.13±0.05 1 ,12±0.05
HEK293fhdlk] 0.43±0 2 0.12±0.01 0.04±0.00 0.43±0.01 0.89±0.05 0.95±0,02 0,75±0.03 [0076] [表 3.2] 吸光度 ± SE
抗体濃度（ji/ g/ml)
抗 DIK抗体 なし 0.2 1.0 5.0
4C4 0,43±0.02 0,49±0,00 0.52±0.04 0.12±0,01 31 C4 0.43±0.02* 0.48±0.02 0.33±0.0Cf 0.04±0.00* ラット IqG 0,43±0.02 0.43±0.01 0.42±0.02 0.43±0.01
[0077] (7)抗ヒト Dlkモノクローナル抗体を用いた ADCC活性
次に、ヒト Dlkを発現している HEK293(hdlk)をターゲット細胞、健常人末梢血単核球 をエフェクター細胞として、作製した抗ヒト Dlkモノクローナル抗体の ADCC活性を測 疋した。
[0078] 96穴プレートを使い、 HEK293または HEK293(hdlk)細胞と抗ヒト Dlkモノクローナル 抗体（クローン 1C1, 4C4, 31C4)およびヒト末梢血単核球を合わせて培養し、 3日後に MTTアツセィによって各ゥエルのターゲット細胞の傷害を測定した。この時、エフエタ ター：ターゲット比はそれぞれ 20:1、 10: 1、 5:1として培養した。エフェクター：ターゲット 比が、 10:1の時、 HEK293(hdlk)細胞は、いずれの抗ヒト Dlk抗体を添カ卩しても、抗体 非添加やコントロール抗体を添加した系と同様な活性を示し、 HEK293細胞とも同様 な活性だった（図 9、表 4)。また、エフェクター：ターゲット比がそれぞれ 20:1、 5:1の時 でも、抗ヒト Dlk抗体を添カ卩した系でターゲット細胞は死滅しな力つた。 HEK293(hdlk) 細胞の抗ヒト Dlkモノクローナル抗体を介した、エフェクター細胞による傷害活性は観 察されなかった。
[0079] [表 4] エフェクター： ターゲット比 =10
セルライン なし 1C1 4C4 31 C4 ッ卜 IgG
HEK293 0.64+0.02 0.78±0.01 0.67÷0.04 0.58±0.02 0.76±0.05 HE 293[hdlk] 0.45±0.01 0.60±0.04 0.50±0.01 0.52±0.01 0.62±0.03
[0080] さらに、 Huh-7EGFP細胞とHuh-7(hdlk)細胞（クローンPC14, PC16)を用いて抗体と 補体による細胞傷害、すなわち CDC活性を測定した（図 11、表 5)。 96穴プレートに 細胞を播き、抗ヒト Dlk抗体（クローン 4C4, 31C4を 5 /z g/mlで添加）と補体血清を加え て培養した。培養 3日後、 MTTアツセィによりターゲット細胞の傷害を測定した。 Dlk抗 体を添カ卩したときの Huh-7(hdlk)細胞の傷害は、コントロール IgG抗体を添カ卩した系に 比較し、抗ヒト Dlk抗体 (クローン 4C4, 31C4)と補体血清を添カ卩した系で吸光度の値 が低下し、生細胞が 24-94%減少していた。し力し、 Dlkを発現していない Huh- 7EGFP 細胞に対しては 、ずれの抗体も細胞傷害活性は示さな力つた（図 11A、表 5A)。
[0081] さらに、抗ヒト Dlk抗体（クローン 4C4, 31C4)を 0.3, 1, 3, 5, 10 g/mlで添カ卩した時の Huh- 7(hdlk)細胞の CDC活性を検討した（図 11B、表 5B)。培養 3日後の CDC活性を MTTアツセィによって測定すると、クローン 4C4と 31C4のいずれにおいても、濃度依 存的に Huh-7(hdlk)細胞を死滅させた。
[0082] [表 5]
吸光度 ±SE
セルライン ラッ卜 IgG 4C4 31C4
Huh- 7 EGFP ί.91 ±0.04 1.64 ±0.03 80 ±0.04
Huh-7 PC 14 1.77 ±0.14* 0.67士 0.04* 0.1 i ±0.00*
Huh 7 PC 16 に 57 +0.05* 1.19 ±0.15 0.56 ±0.08*
B 吸光度土 SE
抗体濃度 (^g/ml)
セルライン 抗 Dlk抗体 なし 03 !.0 3.0 5,0 10.0
EOFP £(Ί 1 9 ±004 7 0.Ο7 I.S7 ±0.06 1 S7 +004 1.91 丄 0.04 1.86 ÷ 0.0S
4 4 1.89 +0.04 1.74 ±0.12 176 -.0.03 1.64 ^0.03 7S 0,07
31C LS9 0.04 ！ 47 ±0.07 .74 ± 0.Ο4 !.32 - 0.06 I.SO -:0.04 1.74 ±008
PC14 IgG 169 χθ.10 I 71 ±0.tO 1.75 "10.03 1.92 +0.07 1.77 O.H 1.90 ±0.03
4C4 1·69 ±0Ί0» 140 0.1 U ±0.07 1.12 ± 0.04* 0.67 :+ 0.05* 0.22 ±002»
3IC4 OJO* i.69±0,10 i.681:0,07 0.30 ±0.04» 01Ϊ ±0.03* 0.06 ±0·0
PC 16 5 gG 1,70 ±0.03 1.75 ±0.10 I 62 +0,06 !.70 0.09 1 57 ±0,05 1.62 ±0.05
4C4 l^O O.O:;* L6510.06 i 83 ±0.08 !.57 0.02 I 19 ±015 Ο·5ΰ ±0·03*
3 C 1,70 003* 0.04 67 ±0.08 1.00 0,07* 056 ±0.08* 026 0.01» 抗ヒト Dlkモノクローナル抗体は、ヒト肝癌由来の細胞株 Huh-7細胞を補体依存的に 死滅させる細胞傷害活性を示した。ヒト肝癌細胞の癌部に Dlkの発現が認められるこ とから、作製したモノクローナル抗体は Dlkを発現して 、る肝癌細胞を殺傷する治療 抗体として有効である。また、抗ヒト Dlkモノクローナル抗体クローン 1C1は、現時点で は、 CDC活性、 ADCC活性のいずれも認められていないが、実施例 1の「2.結果 (4) ヒト肝癌組織におけるヒト Dlkの発現」に示したとおり、ヒト肝癌由来細胞株、および肝 癌病理切片において Dlk抗原を強く認識すること、上記のとおり、 ADCC活性、 CDC 活性はいずれも抗体の定常部 (Fc)に依存することから、少なくとも定常部がヒト Fc由 来の抗体である、キメラ抗体やヒト化抗体を作成することにより、抗癌作用を発揮する 抗 dlkモノクローナル抗体作成することができる。 [0084] (8) 抗ヒトモノクローナル抗体を用いた Huh-7(hdlk)細胞の FACS解析（Dlk発現量の 確認）
実施例 1の「1.材料と方法 (9)FACS解析」に示した方法で、作製した抗ヒト Dlkモノク ローナル抗体を用いて、 Huh- 7EGFP細胞と Huh- 7(hdlk)細胞（クローン PC14, PC 16) の FACS解析を行った。ヒト Dlkは Huh-7EGFP細胞では全く発現して!/、なかったが、 Huh-7(hdlk)細胞では強く発現して!/、ることが確認された（図 10)。
[0085] (9) ヒト Dlk遺伝子発現による腫瘍形成能の促進
Dlkは、ヒト肝癌細胞株や肝癌組織で発現していることが明らカゝとなった力 Dlkの肝 癌腫瘍形成における機能については不明であった。榭立したヒト Dlkを安定に発現し ているヒト肝癌由来細胞株 Huh-7(hDlk)クローン PC14細胞のヌードマウス皮下におけ る腫瘍形成をコントロール細胞（Huh-7 EGFP)と比較したところ、移植した 5匹全ての 個体において、クローン PC14細胞の著しい腫瘍の成長が観察された（図 12A)。移植 19日目のコントロール細胞由来の癌組織の体積は 1271土 427.5 (mm3)に対して、ク ローン PC14細胞由来の癌組織の体積は 4319.4土 378.5 (mm3)であった。クローン PC16細胞細胞についても同様に実験を行ったところ、やはりコントロール細胞と比較 して、著しい腫瘍の成長が再現された（図 12B)。以上の結果は、 Dlkが肝癌の腫瘍形 成を著しく促進させる機能を持っていることを示唆しており、 Dlkが肝癌治療の標的と して優れて!/、ることを示して 、る。
産業上の利用可能性
[0086] 本発明の肝癌の検出方法及び肝癌診断薬は、肝癌の診断に有用である。本発明 の癌治療薬は、肝癌等の癌の治療に有用である。

Claims

請求の範囲
[1] dlk遺伝子の発現を指標とする、試料中の肝癌細胞の検出方法。
[2] 細胞表面上に発現する dlkを測定することを含む請求項 1記載の方法。
[3] 細胞表面上に発現する dlkと、抗 dlk抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反 応を利用する請求項 2記載の方法。
[4] 前記抗 dlk抗体が、モノクローナル抗体である請求項 3記載の方法。
[5] FACS又は MACSにより行なう請求項 2ないし 4のいずれ力 1項に記載の方法。
[6] dlk遺伝子の mRNAを測定することにより行なう請求項 1記載の方法。
[7] mRNA又はそれに由来する cDNAを核酸増幅法により増幅することを含む請求項
6記載の方法。
[8] RT-PCRを行なうことを含む請求項 7記載の方法。
[9] 前記肝癌細胞が、肝細胞癌細胞又は胆管細胞癌細胞である請求項 1な 、し 8の ヽ ずれか 1項に記載の方法。
[10] 前記肝癌細胞がヒト肝癌細胞である請求項 1な 、し 9の 、ずれか 1項に記載の方法
[11] 前記肝癌細胞がヒト肝癌細胞であり、前記モノクローナル抗体が抗ヒト dlkモノクロ一 ナル抗体である請求項 4記載の方法。
[12] 生体から採取された血液中又は尿中に存在する、 dlkの細胞外領域を測定すること を含む肝癌の検出方法。
[13] 血液中に存在する dlkの細胞外領域と、抗 dlk抗体又はその抗原結合性断片との抗 原抗体反応を利用する請求項 12記載の方法。
[14] 前記抗 dlk抗体力 モノクローナル抗体である請求項 13記載の方法。
[15] 前記血液又は尿がヒト血液又はヒト尿であり、前記モノクローナル抗体が抗ヒト dlkモ ノクローナル抗体である請求項 14記載の方法。
[16] dlkの細胞外領域と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む、肝癌
[17] 前記抗体が抗ヒト dlkモノクローナル抗体である請求項 16記載の診断薬。
[18] dlk遺伝子の mRNA又は cDNAとハイブリダィズし、 dlk遺伝子の mRNA又は cDN Aを測定するためのプライマー又はプローブとして利用できる核酸力も成る、肝癌検 出用核酸。
[19] dlk遺伝子の mRNA又は cDNAの一部領域と相補的な塩基配列又は該塩基配列 と 90%以上の同一性を有する塩基配列であって 15塩基以上のサイズの領域を含む 請求項 18記載の核酸。
[20] dlk遺伝子の mRNA又は cDNAの一部領域と相補的な塩基配列であって 15塩基 以上のサイズの領域を含む請求項 19記載の核酸。
[21] dlkの細胞外領域と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片の、肝癌診断 薬の製造のための使用。
[22] 前記抗体が抗ヒト dlkモノクローナル抗体である請求項 21記載の使用。
[23] dlk遺伝子の mRNA又は cDNAとハイブリダィズし、 dlk遺伝子の mRNA又は cDN
Aを測定するためのプライマー又はプローブとして利用できる核酸の、肝癌検出用試 薬の製造のための使用。
[24] dlk遺伝子の mRNA又は cDNAの一部領域と相補的な塩基配列又は該塩基配列 と 90%以上の同一性を有する塩基配列であって 15塩基以上のサイズの領域を含む 請求項 23記載の使用。
[25] dlk遺伝子の mRNA又は cDNAの一部領域と相補的な塩基配列であって 15塩基 以上のサイズの領域を含む請求項 24記載の使用。
[26] 癌細胞表面上に発現している Dlkと抗原抗体反応する抗体であって、該癌細胞に 対して抗癌作用を発揮する抗体を有効成分として含有する癌治療薬。
[27] 前記癌細胞が、肝癌細胞である請求項 26記載の癌治療薬。
[28] 前記肝癌細胞が、肝細胞癌細胞又は胆管細胞癌細胞である請求項 26又は 27記 載の癌治療薬。
[29] 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項 26な 、し 28の 、ずれか 1項に記載の 癌治療薬。
[30] 前記癌細胞がヒト細胞であり、前記抗体が抗ヒト Dlk抗体である請求項 26ないし 29 の！、ずれ力 1項に記載の癌治療薬。
[31] 前記抗体は、補体の存在下において抗癌作用を発揮するものである請求項 26な V、し 30の 、ずれか 1項に記載の癌治療薬。
[32] 癌細胞表面上に発現している Dlkと抗原抗体反応する抗体であって、該癌細胞に 対して抗癌作用を発揮する抗体の有効量を癌患者に投与することを含む、癌の治療 方法。
[33] 前記癌細胞が、肝癌細胞である請求項 32記載の方法。
[34] 前記肝癌細胞が、肝細胞癌細胞又は胆管細胞癌細胞である請求項 32又は 33記 載の方法。
[35] 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項 32な 、し 34の 、ずれか 1項に記載の 方法。
[36] 前記癌細胞がヒト細胞であり、前記抗体が抗ヒト Dlk抗体である請求項 32ないし 35 の!、ずれか 1項に記載の方法。
[37] 前記抗体は、補体の存在下において抗癌作用を発揮するものである請求項 32な
Vヽし 36の!、ずれか 1項に記載の方法。
[38] 癌細胞表面上に発現している Dlkと抗原抗体反応する抗体であって、該癌細胞に 対して抗癌作用を発揮する抗体の、癌治療薬の製造のための使用。
[39] 前記癌細胞が、肝癌細胞である請求項 38記載の使用。
[40] 前記肝癌細胞が、肝細胞癌細胞又は胆管細胞癌細胞である請求項 38又は 39記 載の使用。
[41] 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項 38な 、し 40の 、ずれか 1項に記載の 使用。
[42] 前記癌細胞がヒト細胞であり、前記抗体が抗ヒト Dlk抗体である請求項 38ないし 41 の！ヽずれか 1項に記載の使用。
[43] 前記抗体は、補体の存在下において抗癌作用を発揮するものである請求項 38な
Vヽし 42の 、ずれか 1項に記載の使用。
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