KR20150060761A - in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 Dlk-1 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 hDlk-1 과 특이적으로 반응하여 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항체 (항 hDlk-1 항체, 특히 인간형화 항체), 당해 항체의 단편, 당해 항체를 산생하는 하이브리도마, 당해 항체 또는 항체 단편과 약제의 복합체, 당해 항체 등을 포함하는 의약 조성물, 종양 치료제, 종양 진단제, 종양 세포의 아포토시스 유도제, 종양의 치료 방법, 종양의 검출 방법, 종양 세포의 아포토시스 유도 방법, 종양의 검출용 및/또는 진단용 키트, 그리고 종양 세포의 아포토시스 유도용 키트 등을 제공한다.

Description

in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 Dlk-1 항체 {ANTI-HUMAN DLK-1 ANTIBODY HAVING ANTI-TUMOR ACTIVITY IN VIVO}

본 발명은 항종양 활성을 갖는 항인간 Dlk-1 항체, 특히 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항인간 Dlk-1 항체에 관한 것이다. 또 본 발명은 당해 항체를 산생하는 하이브리도마, 및 당해 항체의 용도에 관한 것이다.

인간 Dlk-1 (delta-like 1 homolog (Drosophila) ； 이하 「hDlk-1」 이라고 하는 경우가 있다.) 은 전체 길이 383 아미노산 잔기의 1 회 막관통형의 1 형막 단백질로, 세포 외 영역에 6 개의 EGF 형 모티프를 갖는다. 그 세포 외 영역은 Notch/Delta/Serrate 패밀리와 상동성을 나타낸다. hDlk-1 유전자는 GRP (gastrin releasing peptide) 응답성의 폐소세포암 유래 세포주에서 발현하는 분자 (비특허문헌 1) 혹은 전지방 세포의 분화를 억제하는 인자로서 클로닝되었다 (비특허문헌 2). hDlk-1 은, 세포 분화 제어 인자인 Notch 리셉터의 리간드인 Delta 와의 아미노산 배열의 상동성에서, DLK1 이라는 유전자 심볼로 칭해지는 것이 일반적이고, 그 외에, Pref-1 (비특허문헌 2), pG2 (비특허문헌 3), SCP-1 (비특허문헌 4) 및 ZOG (비특허문헌 5) 와 같은 복수의 유전자 심볼을 가지지만, 이들은 기본적으로 동일 분자이다.

또, hDlk-1 은 세포 외 영역의 세포막 근방이 미동정의 프로테아제에 의해 절단되어, 혈액 중에 분비된다. 유리 hDlk-1 (hDlk-1 세포 외 영역) 은 225 ∼ 262 아미노산 잔기의 FA-1 (Fetal antigen-1) (비특허문헌 6) 로 불리는 당단백질과 동일한 분자이다.

hDlk-1 유전자 및 그 유전자 산물은 미분화로 증식능이 높은 태아 세포에서 고발현을 나타낸다. 특히, 태아 간장, 태아 신장, 태아 골격근, 태아 뇌 등에서 높은 발현을 나타내지만, 출생 후는 대부분의 조직에서 발현이 확인되지 않게 되어, 정상적인 성체 조직에 있어서는 부신, 태반, 하수체에 국한되어 있다 (특허문헌 1, 비특허문헌 2).

또한, 성체 조직에 있어서도, 미분화인 간세포나 전구 세포라고 생각되고 있는 세포에는, hDlk-1 의 발현이 확인된다. 예를 들어, 성체 간장에 있어서의 미분화로 다분화능을 갖는 간 오발 세포 (비특허문헌 7, 8), 뼈/연골/지방 세포의 간세포인 간엽계 간세포 (비특허문헌 9), 및 전립선의 기저 세포층의 전립선 상피 전구 세포 (비특허문헌 18) 에 있어서, hDlk-1 의 발현이 보고되고 있다. 또, 마우스의 간엽계 간세포에 있어서는, 유리 Dlk-1 (마우스 Dlk-1 세포 외 영역) 이 ERK/MAP 키나아제를 활성화하여, Sox-9 의 발현을 유도함으로써, 지방 세포로의 분화를 억제하고, 동시에 연골 세포로의 분화를 유도하지만, 골아 세포로의 분화와 연골 세포의 성숙에 대해서는 그들을 억제하는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 19, 20). 이들의 점에서, hDlk-1 은 조직 간세포의 성질, 예를 들어 미분화능의 유지 등에 관여하고 있는 것이 시사된다.

이와 같은, 태아기의 세포나 간세포에 국한되어 있는 hDlk-1 의 발현 양식이나, EGF 형 모티프를 갖는 유전자/유전자 산물의 패밀리 (Notch-receptor, Notch ligand (Delta, Jagged, serrate) 등) 는, 일반적으로 EGF 형 모티프를 개재하는 세포간 상호 작용에 의해, 세포의 증식이나 분화를 제어하는 점에서, hDlk-1 도 그러한 기능을 갖는 것이 시사되고 있다. 사실, 지방 전구 세포의 분화에 따라, 발현이 저하되고, 또 지방 전구 세포에 hDlk-1 유전자를 강제 발현시키면 지방 분화가 억제되는 것이 잘 알려져 있다 (비특허문헌 2). 그러나, 현시점에 있어서, hDlk-1 과 상호 작용하는 분자 (리간드) 에 대한 자세한 것은 불분명하다.

한편, hDlk-1 유전자 및 그 유전자 산물은 여러 가지 암이나 종양에서도 고빈도로 발현하고 있는 것이 보고되고 있다. 현재까지, 그 발현이 확인되고 있는 암의 종류로서는, 고형암에서는, 신경 내분비 종양, 신경아세포종, 신경교종, 1 형 신경 섬유종증, 소세포 폐암, 간암, 신장암, 난소암, 대장암, 유방암 및 췌장암이 알려져 있고 (특허문헌 1, 2, 4, 5, 및, 비특허문헌 1, 3, 10, 11, 12, 13, 14, 21), 혈액암에서는, 골수 이형성 증후군 (특허문헌 3, 및, 비특허문헌 15, 16) 및 급성 골수성 백혈병 (비특허문헌 16) 이 알려져 있다. 적백혈병 세포주 (erythroleukemia) 인 K562 세포에 hDlk-1 유전자를 도입하면 세포 증식이 항진되는 것 (비특허문헌 16), 마찬가지로, 글리오 아종 세포에 hDlk-1 유전자를 도입하면, 세포 증식의 항진에 더하여, 세포의 접촉 저지가 상실되고, 족장 비의존적인 세포 증식능을 획득하는 것이 보고되어 있고, hDlk-1 과 발암의 관련성이 시사되어 있다 (비특허문헌 17).

종래, 인간의 간암 세포에 대해, in vitro 에 있어서 보체 존재하에서 세포 상해 활성을 나타내는 항 hDlk-1 모노클로날 항체로서는, 래트 항 hDlk-1 모노클로날 항체인 1C1, 4C4 및 31C4 (클론명) 가 알려져 있지만 (특허문헌 1), 한편, 이들 클론 항체는 in vivo (인간 암 세포 담암 마우스에 있어서의 치료 모델) 에 있어서의 항종양 활성 (종양 성장 저해 활성) 을 나타내지 않는 것도 알려져 있다 (특허문헌 4, 5).

WO 2005/052156 WO 02/081625 일본 공개특허공보2001-269174호 WO 2008/056833 WO 2009/116670

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상기 서술한 바와 같이, hDlk-1 의 발현은 정상 조직에서는 태아기의 세포나 간세포에 국한되어 있지만 암조직에서는 여러 가지의 종양으로 고빈도로 발현하고 있는 것, 및 hDlk-1 이 세포막 단백/분비 단백인 점에서, hDlk-1 은 각종 종양의 치료 등에 있어서 좋은 표적이 된다고 생각된다. 그리고, 이 hDlk-1 을 표적으로 하는 경우, 항 hDlk-1 항체가 유용하다고 생각된다. 또, 예를 들어 암치료용 항체로서 사용하기 위해서는, 인간 암 세포를 사용한 담암 마우스 치료 모델에 있어서 항체 단독 투여에서 현저한 항종양 활성을 나타내는 것에 더하여, 액제 처방 중 및 인간 또는 원숭이의 혈중에 있어서 안정적인 항원 결합 활성의 유지능을 갖는 것이 보다 바람직하다.

그래서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 항종양 활성을 갖는 항 hDlk-1 항체, 구체적으로는 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항 hDlk-1 모노클로날 항체, 특히 당해 항체로서 인간형화 항체인 것을 제공하는 것에 있다. 또, 당해 항체를 산생하는 하이브리도마, 당해 항체와 약제의 복합체 등을 제공하는 것에 있다. 또한, 상기 항체나 상기 복합체 등을 사용하는, 종양의 진단용 또는 치료용 의약 조성물, 종양 세포의 아포토시스 유도용 의약 조성물, 종양 치료제, 종양 진단제, 종양 세포의 아포토시스 유도제, 종양의 치료 방법, 종양의 검출 방법, 종양 세포의 아포토시스 유도 방법, 종양의 검출용 또는 진단용 키트, 그리고 종양 세포의 아포토시스 유도용 키트 등을 제공하는 것에 있다.

본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 실시했다. 그 결과, hDlk-1 과 특이적으로 반응하는 항체 (특히 항 hDlk-1 모노클로날 항체) 로서 항종양 활성을 갖는 항체 (특히, 인간형화 항체) 를 알아내고, 이들이 in vivo 에 있어서 항종양 활성을 갖는 것을 확인했다. 또, 이와 같은 항체로서 인간형화 항체의 제작에도 성공했다. 또한, 이들 항체 및 복합체가 종양의 치료, 진단 및 검출, 그리고 종양 세포의 아포토시스 유도에 유용한 것도 알아내어, 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 35, 40, 69, 73, 77, 81, 85 및 89 중 어느 하나에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지고, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 45 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 인간 Dlk-1 에 대한 항체.

상기 (1) 의 항체는, 예를 들어, in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 것을 들 수 있다. 여기서, 종양으로서는, 예를 들어, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암, 인간 췌장암, 인간 소세포 폐암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.

상기 (1) 의 항체는, 예를 들어, 인간형화 항체인 것을 들 수 있다.

상기 (1) 의 항체는, 예를 들어, 모노클로날 항체인 것을 들 수 있다.

상기 (1) 의 항체는, 예를 들어, 배열 번호 2 에 나타나는 인간 Dlk-1 의 아미노산 배열 중의, 제 24 번째 ∼ 제 91 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역의 적어도 일부와 결합하는 것을 들 수 있다.

(2) 상기 (1) 의 항체에서 유래하는 항체 단편.

상기 (2) 의 항체 단편은, 예를 들어, 배열 번호 35, 40, 69, 73, 77, 81, 85 및 89 중 어느 하나에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 것, 및, 배열 번호 45 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 것, 그리고, 배열 번호 35, 40, 69, 73, 77, 81, 85 및 89 중 어느 하나에 나타나는 아미노산 배열과 배열 번호 45 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 것을 들 수 있다.

(3) 상기 (1) 의 항체와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물을 포함하는 항체-약제 복합체.

(4) 상기 (2) 의 항체 단편과, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물을 포함하는 항체 단편-약제 복합체.

(5) 상기 (1) 의 항체, 상기 (2) 의 항체 단편, 및 상기 (3) 또는 (4) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 의약 조성물.

상기 (5) 의 의약 조성물은, 예를 들어, 종양의 치료에 사용하는 것을 들 수 있고, 특히, 체중 감소의 부작용을 갖지 않는 것을 들 수 있다. 또, 상기 (5) 의 의약 조성물은, 예를 들어, 종양의 진단에 사용하는 것을 들 수 있다. 또한, 상기 (5) 의 의약 조성물은, 예를 들어, 종양 세포의 아포토시스 유도에 사용하는 것을 들 수 있다.

(6) 상기 (1) 의 항체, 상기 (2) 의 항체 단편, 및 상기 (3) 또는 (4) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 치료제.

상기 (6) 의 종양 치료제는, 예를 들어, 체중 감소의 부작용을 갖지 않는 것을 들 수 있다.

(7) 상기 (1) 의 항체, 상기 (2) 의 항체 단편, 및 상기 (3) 또는 (4) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 세포의 아포토시스 유도제.

여기서, 상기 (5) 의 의약 조성물, 상기 (6) 의 종양 치료제, 및 상기 (7) 의 아포토시스 유도제에 있어서, 종양으로서는, 예를 들어, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암, 인간 췌장암, 인간 소세포 폐암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.

(8) 상기 (1) 의 항체, 상기 (2) 의 항체 단편, 및 상기 (3) 또는 (4) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 종양의 치료 방법.

상기 (8) 의 치료 방법은, 예를 들어, 환자에게 있어서 체중 감소의 부작용을 갖지 않는 것을 들 수 있다.

(9) 상기 (1) 의 항체, 상기 (2) 의 항체 단편, 및 상기 (3) 또는 (4) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종과, 생체로부터 채취된 시료를 반응시키고, 반응한 항체 및/또는 항체 단편의 시그널을 검출하는 것을 포함하는 종양의 검출 방법.

(10) 상기 (1) 의 항체, 상기 (2) 의 항체 단편, 및 상기 (3) 또는 (4) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종과, 생체로부터 채취된 시료를 반응시키고, 반응한 항체 및/또는 항체 단편의 시그널을 검출하는 것을 포함하는 종양 세포의 아포토시스 유도 방법.

여기서, 상기 (8) 의 치료 방법, 상기 (9) 의 검출 방법, 및 상기 (10) 의 아포토시스 유도 방법에 있어서, 종양으로서는, 예를 들어, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암, 인간 췌장암, 인간 소세포 폐암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.

(11) 상기 (1) 의 항체, 상기 (2) 의 항체 단편, 및 상기 (3) 또는 (4) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양의 치료용, 진단용 또는 검출용 키트.

(12) 상기 (1) 의 항체, 상기 (2) 의 항체 단편, 및 상기 (3) 또는 (4) 의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 세포의 아포토시스 유도용 키트.

여기서, 상기 (11) 및 (12) 의 키트에 있어서, 종양으로서는, 예를 들어, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암, 인간 췌장암, 인간 소세포 폐암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 들 수 있다.

도 1 은 마우스 항 hDlk-1 모노클로날 항체 클론 BA-1-3D 의 H 사슬 (중사슬) 가변 영역 (VH) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 12) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 13) 을 나타내는 도면이다. 아미노산 잔기는 일 문자 표기로 나타내고, 시그널 펩티드 (당해 추정 아미노산 배열의 N 말단으로부터 19 아미노산으로 이루어지는 펩티드) 는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 글루타민 (Q) 은 BA-1-3D VH 의 성숙 펩티드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. BA-1-3D VH 의 성숙 펩티드의 cDNA 염기 배열은 배열 번호 14 에 나타내고, 그 추정 아미노산 배열은 배열 번호 15 에 나타낸다.
CDR 배열 (밑줄친 배열) 은 Kabat 들 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U. S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따랐다. BA-1-3D VH 의 CDR1 (DYAMH), CDR2 (VISTYYGNTNYNQKFKG) 및 CDR3 (GGLREYYYAMDY) 의 아미노산 배열은, 각각 순서대로, 배열 번호 16 ∼ 18 에 나타낸다.
도 2 는 마우스 항 hDlk-1 모노클로날 항체 클론 BA-1-3D 의 L 사슬 (경사슬) 가변 영역 (VL) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 19) 과 추정 아미노산 배열 (배열 번호 20) 을 나타내는 도면이다. 아미노산 잔기는 일 문자 표기로 나타내고, 시그널 펩티드 (당해 추정 아미노산 배열의 N 말단으로부터 20 아미노산으로 이루어지는 펩티드) 는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 아스파르트산 (D) 은 BA-1-3D VL 의 성숙 펩티드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. BA-1-3D VL 의 성숙 펩티드의 cDNA 염기 배열은 배열 번호 21 에 나타내고, 그 추정 아미노산 배열은 배열 번호 22 에 나타낸다. CDR 배열 (밑줄친 배열) 은 Kabat 들 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U. S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따랐다. BA-1-3D VL 의 CDR1 (KSSQSLLNSSNQKNYLA), CDR2 (FASTRES) 및 CDR3 (QQHYSTPPT) 의 아미노산 배열은, 각각 순서대로, 배열 번호 23 ∼ 25 에 나타낸다.
도 3 은 SpeI 사이트 (ACTAGT ； 밑줄) 와 HindIII 사이트 (AAGCTT ； 밑줄) 로 끼워지는 형태로 디자인된 BA-1-3D VH 유전자의 염기 배열 (배열 번호 26) 과 아미노산 배열을 나타낸다. 염기 배열의 이탤릭체로 나타낸 배열 (HindIII 사이트를 포함하는 3' 말단측의 22 염기) 은 인트론 배열을 나타낸다. 그 이외는 도 1 의 설명과 동일하다.
도 4 는 NheI 사이트 (GCTAGC ； 밑줄) 와 EcoRI 사이트 (GAATTC ； 밑줄) 로 끼워지는 형태로 디자인된 BA-1-3D VL 유전자의 염기 배열 (배열 번호 27) 과 아미노산 배열을 나타낸다. 염기 배열의 이탤릭체로 나타낸 배열 (EcoRI 사이트를 포함하는 3' 말단측의 22 염기) 은 인트론 배열을 나타낸다. 그 이외는 도 2 의 설명과 동일하다.
도 5 는 키메라 및 인간형화 BA-1-3D IgGa/κ 항체의 발현 벡터의 구조를 나타내는 모식도이다. 발현 벡터는, SalI 에 의한 제한 효소 부위를 선두로, 시계 방향으로 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 주요 최초기 프로모터/인핸서 (CMV 프로모터) 에 의해 항체의 H 사슬의 전사를 개시하는 전사 유닛을 포함한다. CMV 프로모터에 이어, VH 액슨, CH1, 힌지, CH2, CH3 액슨, 및 그들 액슨 간에 개재되는 인트론의 순서로 늘어서고, CH3 액슨의 뒤에 폴리아데닐레이션 배열을 연결했다. H 사슬 유전자 배열에 이어서, L 사슬의 전사 유닛으로서 CMV 프로모터, VL 액슨, 인트론 배열의 일부에 이어 인간 κ 사슬 정상 영역의 액슨 (CL), 폴리아데닐레이션 배열을 연결했다. L 사슬 유전자에 이어 SV40 어얼리 프로모터 (SV40 프로모터), 대장균의 xanthine guanine phosphoribosyl transferase 유전자 (gpt), SV40 폴리아데닐레이션 부위 (SV40 poly (A) site) 를 포함하는 세그먼트를 연결하고, 최종적으로 대장균의 복제 기점 (pUC ori) 과 β 락타마제 유전자 (beta lactamase) 를 포함한 pUC19 플라스미드의 배열의 일부를 연결했다.
도 6 은 BA-1-3D VH, 2 종류의 인간형화 BA-1-3D VH (HuBA-1-3D VH1 및 HuBA-1-3D VH2), 그리고 억셉터인 U00503 VH 의 아미노산 배열의 얼라이먼트를 나타낸다. 아미노산은 일 문자 표기로 나타내고, 배열의 상부에 나타내는 아미노산 번호는 Kabat 들 (1991) 의 정의에 따랐다. BA-1-3D VH 의 아미노산 배열 중의 밑줄은 Kabat 들 (1991) 의 정의에 의한 CDR 배열을 나타낸다 (DYAMH, VISTYYGNTNYNQKFKG, GGLREYYYAMDY). HuBA-1-3D VH1 과 HuBA-1-3D VH2 의 아미노산 배열 중의 밑줄은 대응하는 마우스 BA-1-3D VH 의 아미노산 배열 중의 아미노산을 유지한 아미노산 잔기로서, CDR 의 구조의 형성에 중요하다고 추찰되는 아미노산 잔기를 나타낸다. U00503 VH 의 CDR 배열의 표기는 생략되어 있다.
또한, 도면 중의 BA-1-3D VH 의 아미노산 배열은 배열 번호 15 에 나타내고 (그것을 코드하는 염기 배열은 배열 번호 14), HuBA-1-3D VH1 의 아미노산 배열은 배열 번호 35 에 나타내고 (그것을 코드하는 염기 배열은 배열 번호 34), HuBA-1-3D VH2 의 아미노산 배열은 배열 번호 40 에 나타내고 (그것을 코드하는 염기 배열은 배열 번호 39), U00503 VH 의 아미노산 배열은 배열 번호 29 에 나타내고 (그것을 코드하는 염기 배열은 배열 번호 28) 에 나타낸다.
도 7 은 BA-1-3D VL, 인간형화 BA-1-3D VL (HuBA-1-3D VL), 및 억셉터인 Z46622 VL 의 아미노산 배열의 얼라이먼트를 나타낸다. 아미노산은 일 문자 표기로 나타내고, 배열의 상부에 나타내는 아미노산 번호는 Kabat 들 (1991) 의 정의에 따랐다. BA-1-3D VL 의 아미노산 배열 중의 밑줄은 Kabat 들 (1991) 의 정의에 의한 CDR 배열을 나타낸다 (KSSQSLLNSSNQKNYLA, FASTRES, QQHYSTPPT). HuBA-1-3D VL 의 아미노산 배열 중의 밑줄은 대응하는 마우스 BA-1-3D VL 의 아미노산 배열 중의 아미노산을 유지한 아미노산 잔기로서, CDR 의 구조의 형성에 중요하다고 추찰되는 아미노산 잔기를 나타낸다. Z46622 VL 의 CDR 배열의 표기는 생략되어 있다.
또한, 도면 중의 BA-1-3D VL 의 아미노산 배열은 배열 번호 22 에 나타내고 (그것을 코드하는 염기 배열은 배열 번호 21), HuBA-1-3D VL 의 아미노산 배열은 배열 번호 45 에 나타내고 (그것을 코드하는 염기 배열은 배열 번호 44), Z46622 VL 의 아미노산 배열은 배열 번호 31 에 나타내고 (그것을 코드하는 염기 배열은 배열 번호 30) 에 나타낸다.
도 8 은 SpeI 사이트 (ACTAGT ； 밑줄) 와 HindIII 사이트 (AAGCTT ； 밑줄) 로 끼워지는 형태로 디자인된 HuBA-1-3D VH1 유전자의 염기 배열 (배열 번호 36) 과 아미노산 배열을 나타낸다. 염기 배열의 이탤릭체로 나타낸 배열 (HindIII 사이트를 포함하는 3' 말단측의 23 염기) 은 인트론 배열을 나타낸다.
HuBA-1-3D VH1 의 cDNA 염기 배열은 배열 번호 32 에 나타내고, 그 추정 아미노산 배열은 배열 번호 33 에 나타낸다. 아미노산 잔기는 일 문자 표기로 나타내고, 시그널 펩티드 (당해 추정 아미노산 배열의 N 말단으로부터 19 아미노산으로 이루어지는 펩티드) 는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 글루타민 (Q) 은 HuBA-1-3D VH1 의 성숙 펩티드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. HuBA-1-3D VH1 의 성숙 펩티드의 cDNA 염기 배열은 배열 번호 34 에 나타내고, 그 추정 아미노산 배열은 배열 번호 35 에 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 그은 배열) 은 Kabat 들 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U. S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따랐다. HuBA-1-3D VH1 의 CDR1 (DYAMH), CDR2 (VISTYYGNTNYNQKFKG) 및 CDR3 (GGLREYYYAMDY) 의 아미노산 배열은, 각각 순서대로, 배열 번호 16 ∼ 18 에 나타낸다.
도 9 는 SpeI 사이트 (ACTAGT ； 밑줄) 와 HindIII 사이트 (AAGCTT ； 밑줄) 로 끼워지는 형태로 디자인된 HuBA-1-3D VH2 유전자의 염기 배열 (배열 번호 41) 과 아미노산 배열을 나타낸다. 염기 배열의 이탤릭체로 나타낸 배열 (HindIII 사이트를 포함하는 3' 말단측의 23 염기) 은 인트론 배열을 나타낸다.
HuBA-1-3D VH2 의 cDNA 염기 배열은 배열 번호 37 에 나타내고, 그 추정 아미노산 배열은 배열 번호 38 에 나타낸다. 아미노산 잔기는 일 문자 표기로 나타내고, 시그널 펩티드 (당해 추정 아미노산 배열의 N 말단으로부터 19 아미노산으로 이루어지는 펩티드) 는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 글루타민 (Q) 은 HuBA-1-3D VH2 의 성숙 펩티드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. HuBA-1-3D VH2 의 성숙 펩티드의 cDNA 염기 배열은 배열 번호 39 에 나타내고, 그 추정 아미노산 배열은 배열 번호 40 에 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 그은 배열) 은 Kabat 들 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U. S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따랐다. HuBA-1-3D VH2 의 CDR1 (DYAMH), CDR2 (VISTYYGNTNYNQKFKG) 및 CDR3 (GGLREYYYAMDY) 의 아미노산 배열은, 각각 순서대로, 배열 번호 16 ∼ 18 에 나타낸다.
도 10 은 NheI 사이트 (GCTAGC ； 밑줄) 와 EcoRI 사이트 (GAATTC ； 밑줄) 로 끼워지는 형태로 디자인된 HuBA-1-3D VL 유전자의 염기 배열 (배열 번호 46) 과 아미노산 배열을 나타낸다. 염기 배열의 이탤릭체로 나타낸 배열 (EcoRI 사이트를 포함하는 3' 말단측의 23 염기) 은 인트론 배열을 나타낸다.
HuBA-1-3D VL 의 cDNA 염기 배열은 배열 번호 42 에 나타내고, 그 추정 아미노산 배열은 배열 번호 43 에 나타낸다. 아미노산 잔기는 일 문자 표기로 나타내고, 시그널 펩티드 (당해 추정 아미노산 배열의 N 말단으로부터 20 아미노산으로 이루어지는 펩티드) 는 이탤릭으로 나타내고 있다. 이중 밑줄을 그은 아스파르트산 (D) 은 HuBA-1-3D VL 의 성숙 펩티드의 N 말단 아미노산 잔기를 나타낸다. HuBA-1-3D VL 의 성숙 펩티드의 cDNA 염기 배열은 배열 번호 44 에 나타내고, 그 추정 아미노산 배열은 배열 번호 45 에 나타낸다. CDR 배열 (밑줄 그은 배열) 은 Kabat 들 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U. S. Department of Health and Human Services, 1991) 의 정의에 따랐다. HuBA-1-3D VL 의 CDR1 (KSSQSLLNSSNQKNYLA), CDR2 (FASTRES) 및 CDR3 (QQHYSTPPT) 의 아미노산 배열은, 각각 순서대로, 배열 번호 23 ∼ 25 에 나타낸다.
도 11 은 본원 실시예 4 에 있어서의, H 사슬 및 L 사슬의 cDNA 의 PCR 증폭, 그리고 시퀀스 반응에 사용한 올리고 뉴클레오티드 프라이머 (CMV2, JNT026, JNT082, JNT097 및 JNT098) 의 염기 배열을 나타낸다. CMV2, JNT026, JNT082, JNT097 및 JNT098 의 염기 배열은, 각각 순서대로, 배열 번호 47 ∼ 51 에 나타낸다.
도 12 는 pChBA-1-3D 벡터의 H 사슬 (γ1 사슬) 의 코딩 영역의 염기 배열 (배열 번호 52) 과 아미노산 배열 (배열 번호 53) 을 나타낸다. 아미노산은 일 문자 표기로 나타내고, 터미네이션 코돈의 위치는 “ㆍ” 로 나타내고 있다.
도 13 은 pChBA-1-3D 벡터의 L 사슬 (κ 사슬) 의 코딩 영역의 염기 배열 (배열 번호 54) 과 아미노산 배열 (배열 번호 55) 을 나타낸다. 아미노산은 일 문자 표기로 나타내고, 터미네이션 코돈의 위치는 “ㆍ” 로 나타내고 있다.
도 14 는 pHuBA-1-3D-1 벡터의 H 사슬 (γ1 사슬) 의 코딩 영역의 염기 배열 (배열 번호 56) 과 아미노산 배열 (배열 번호 57) 을 나타낸다. 아미노산은 일 문자 표기로 나타내고, 터미네이션 코돈의 위치는 “ㆍ” 로 나타내고 있다.
도 15 는 pHuBA-1-3D-2 벡터의 H 사슬 (γ1 사슬) 의 코딩 영역의 염기 배열 (배열 번호 58) 과 아미노산 배열 (배열 번호 59) 을 나타낸다. 아미노산은 일 문자 표기로 나타내고, 터미네이션 코돈의 위치는 “ㆍ” 로 나타내고 있다.
도 16 은 pHuBA-1-3D-1 벡터, pHuBA-1-3D-2 벡터, pHuBA-1-3D-1-T73K 벡터, 및 pHuBA-1-3D-1-A24G/T73K 벡터의, L 사슬 (κ 사슬) 의 코딩 영역의 염기 배열 (배열 번호 60) 과 아미노산 배열 (배열 번호 61) 을 나타낸다. 요컨대, HuBA-1-3D-1, HuBA-1-3D-2, HuBA-1-3D-1-T73K 및 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 각 항체의 L 사슬 (κ 사슬) 은 모두 동일한 염기 배열 및 아미노산 배열이다. 도면 중, 아미노산은 일 문자 표기로 나타내고, 터미네이션 코돈의 위치는 “ㆍ” 로 나타내고 있다.
도 17 은 정제한 각 항체의 SDS-PAGE 의 도면이다 (레인 1 : 분자량 마커 (SeeBluePlus2 Prestained Standard (Invitrogen)), 레인 2 : ChBA-1-3D, 레인 3 : HuBA-1-3D-1, 레인 4 : HuBA-1-3D-2, 레인 5 : HuBA-1-3D-1-T73K, 레인 6 : HuBA-1-3D-1-A24G/T73K). 각 항체 7.5 ㎍ 을 MES-SDS Running buffer (Invitrogen) 를 이용하여, 환원 조건하에서 NuPAGE Bis-Tris 4-20 ％ 겔로 전개한 결과이다. 도면의 좌측의 수치는 분자량을 나타낸다.
도 18 은 hDlk-1 세포 외 영역의 리콤비넌트 단백질 (hDlk-1-His) 의 ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 에 대한 결합 활성을 나타내는 ELISA 의 결과이다. ELISA 플레이트를 1 ㎍/㎖ 의 ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 로 코팅하고, hDlk-1-His 는 1 ㎍/㎖ 로부터 2 배씩 희석 계열을 제작하여 반응시켰다. hDlk-1-His 의 결합은 HRP 표식의 항 His 태그 항체로 검출했다.
도 19 는 ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 의 hDlk-1-His 에 대한 결합 활성을 나타내는 ELISA 의 결과이다. ELISA 플레이트를 0.5 ㎍/㎖ 의 hDlk-1-His 로 코팅하고, 피검항체 (ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2) 는 5 ㎍/㎖ 로부터 2 배씩 희석 계열을 제작하여 반응시켰다. 도면 중에 ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 의 EC₅₀ 값을 나타냈다.
도 20 은 ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 의 hDlk-1-His 에 대한 결합 활성을 나타내는 ELISA 의 결과이다. ELISA 플레이트를 0.05 ㎍/㎖ 의 hDlk-1-His 로 코팅하고, 피검항체 (ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2) 는 5 ㎍/㎖ 로부터 2 배씩 희석 계열을 제작하여 반응시켰다.
도 21 은 ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-2, HuVH/MuVL (HuBA-1-3D-2 의 VL (HuBA-1-3D VL) 을 마우스 BA-1-3D 의 VL 로 치환한 것) 및 MuVH/HuVL (HuBA-1-3D-2 의 VH (HuBA-1-3D VH2) 을 마우스 BA-1-3D 의 VH 로 치환한 것) 의 hDlk-1-His 에 대한 결합 활성을 나타내는 ELISA 의 결과이다. ELISA 플레이트를 0.05 ㎍/㎖ 의 hDlk-1-His 로 코팅하고, 피검항체 (ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-2, HuVH/MuVL 및 MuVH/HuVL) 를 각각 일과성 발현시킨 세포의 배양 상청의 2 배 희석 계열을 제작하여 반응시켰다.
도 22 는 HuBA-1-3D VH1, 및 그 아미노산 치환 변이체 (V5Q ∼ T73K/T75S) 의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다. 아미노산은 일 문자 표기로 나타냈다. 각 아미노산 치환 변이체에서는, HuBA-1-3D VH1 의 아미노산과 동일한 아미노산에 대해서는 “－” 로 나타내고, 치환한 아미노산에 대해서만 일 문자 표기로 나타냈다. 배열 상부의 숫자는 아미노산 번호를 나타낸다 (Kabat 들, 1991).
도 23 은 ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1, HuBA-1-3D-1-A24G, HuBA-1-3D-1-T73K 및 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 hDlk-1-His 에 대한 결합 활성을 나타내는 ELISA 의 결과이다. ELISA 플레이트를 0.05 ㎍/㎖ 의 hDlk-1-His 로 코팅하고, 피검항체 (ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1, HuBA-1-3D-1-A24G, HuBA-1-3D-1-T73K 및 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K) 를 각각 일과성 발현시킨 세포의 배양 상청의 2 배 희석 계열을 제작하여 반응시켰다.
도 24 는 pHuBA-1-3D-1-T73K 의 H 사슬 (γ1 사슬) 의 코딩 영역의 염기 배열 (배열 번호 62) 과 아미노산 배열 (배열 번호 63) 을 나타낸다. 아미노산은 일 문자 표기로 나타내고, 터미네이션 코돈의 위치는 “ㆍ” 로 나타내고 있다.
여기서, HuBA-1-3D-1-T73K 의 H 사슬 가변 영역 (VH) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 70) 은 배열 번호 62 에 나타내는 염기 배열의 제 1 번째 ∼ 제 420 번째의 염기로 이루어지는 배열이며, HuBA-1-3D-1-T73K 의 VH 의 추정 아미노산 배열 (배열 번호 71) 은 배열 번호 63 에 나타내는 아미노산 배열의 제 1 번째 ∼ 제 140 번째의 아미노산으로 이루어지는 배열이다. 상기 HuBA-1-3D-1-T73K 의 VH 의 추정 아미노산 배열 (배열 번호 71) 중, N 말단으로부터 19 아미노산으로 이루어지는 펩티드는 시그널 펩티드이다. HuBA-1-3D-1-T73K 의 VH 의 성숙 펩티드의 cDNA 염기 배열은 배열 번호 72 에 나타내고, 그 추정 아미노산 배열은 배열 번호 73 에 나타낸다.
도 25 는 pHuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 H 사슬 (γ1 사슬) 의 코딩 영역의 염기 배열 (배열 번호 64) 과 아미노산 배열 (배열 번호 65) 을 나타낸다. 아미노산은 일 문자 표기로 나타내고, 터미네이션 코돈의 위치는 “ㆍ” 로 나타내고 있다.
여기서, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 H 사슬 가변 영역 (VH) 의 cDNA 염기 배열 (배열 번호 74) 은 배열 번호 64 에 나타내는 염기 배열의 제 1 번째 ∼ 제 420 번째의 염기로 이루어지는 배열이며, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 VH 의 추정 아미노산 배열 (배열 번호 75) 은 배열 번호 65 에 나타내는 아미노산 배열의 제 1 번째 ∼ 제 140 번째의 아미노산으로 이루어지는 배열이다. 상기 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 VH 의 추정 아미노산 배열 (배열 번호 75) 중, N 말단으로부터 19 아미노산으로 이루어지는 펩티드는 시그널 펩티드이다. HuBA-1-3D-1- A24G/T73K 의 VH 의 성숙 펩티드의 cDNA 염기 배열은 배열 번호 76 에 나타내고, 그 추정 아미노산 배열은 배열 번호 77 에 나타낸다.
도 26 은 ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1, HuBA-1-3D-1-T73K 및 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 hDlk-1-His 에 대한 결합 활성을 나타내는 ELISA 의 결과이다. ELISA 플레이트를 0.05 ㎍/㎖ 의 hDlk-1-His 로 코팅하고, 피검항체는 5 ㎍/㎖ 로부터 2 배 희석 계열을 제작하여 반응시켰다.
도 27 은 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 액제 중에서의 항원 결합 활성의 안정성을 나타내는 도면이다. HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 를 각 pH 의 액제 중에서 40 ℃, 1 개월 보존한 후, 결합 활성을 플로우 사이트 미터 및 항원 고상화 ELISA 를 이용하여 검증했다. 각 pH 의 액제 중에서 -80 ℃ 보존한 항체를 활성 표준품으로서 사용했다.
(A) hDlk-1 을 항상적으로 발현하는 293 세포를 사용하여 플로우 사이트 미터에 의한 항원 결합 활성의 측정을 실시했다. 세로축은 형광 강도의 평균치 (MFI : mean fluoro-intensity) 를 나타내고, 가로축은 항체 농도를 나타낸다.
(B) hDlk-1-His 를 코팅한 항원 고상화 ELISA 를 사용하여 항원 결합 활성의 검토를 실시했다. 세로축은 흡광도를 나타내고, 가로축은 항체 농도를 나타낸다.
도 28 은 필리핀 원숭이 혈장 중에서의 항원 결합 활성의 안정성의 해석 결과를 나타내는 도면이다. HuBA-1-3-D1-A24G/T73K 를 필리핀 원숭이 혈장 중에서, 도면 중에 나타낸 기간, 37 ℃ 에서 보존한 후, hDlk-1-His 를 코팅한 항원 고상화 ELISA 를 사용하여 항원 결합 활성의 검토를 실시했다. 세로축은 0 h 를 100 ％ 로 한 경우의 각 보존 기간 후의 항원 결합 활성 (Absorbance 값) 의 비율을 나타내고, 가로축은 보존 기간을 나타낸다.
도 29 는 인간 간세포 암 세포주 HepG2 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서의, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A ： 컨트롤군 (● ： PBS) 과 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군 (○ ： 1 mg/kg, △ ： 5 mg/kg, □ ： 10 mg/kg) 의 종양 형성을 시간 경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 가로축 상의 시두는 항체 투여 시를 나타낸다. 모든 항체 투여군에 있어서, 13 일째 (Day 13) 이후, 대조군과 비교해서 유의한 항종양 효과 (P < 0.01 (by Student's t-test)) 가 확인된다.
B ： A 의 실험에 있어서, 23 일째 (Day 23) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. **P < 0.01 (by Student's t-test)
도 30 은, 인간 신경아세포종 세포주 SK-N-F1 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서의, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A ： 컨트롤군 (● ： PBS) 과 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군 (○ ： 1 mg/kg, △ ： 5 mg/kg, □ ： 10 mg/kg) 의 종양 형성을 시간 경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 가로축 상의 시두는 항체 투여 시를 나타낸다. *P < 0.05, **P < 0.01 (by Student's t-test)
B ： A 의 실험에 있어서, 34 일째 (Day 34) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. **P < 0.01 (by Student's t-test)
도 31 은, 인간 간세포 암 세포주 HepG2 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서의, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 와 넥사바르의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A ： 컨트롤군 (● ： PBS) 과 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군 (○ ： 0.1 mg/kg, △ ： 0.5 mg/kg, □ ： 1 mg/kg) 의 종양 체적을 시간 경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 가로축 상의 시두는 항체 투여를 나타낸다. **P < 0.01 (by Student's t-test)
B : 컨트롤군 (● ： PBS) 과 넥사바르 투여군 (○ ： 40 mg/kg, △ ： 80 mg/kg) 의 종양 체적을 시간 경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 가로축 상의 시두는 항체 투여 시를 나타낸다. *P < 0.05 (by Student's t-test)
C : A 및 B 의 실험에 있어서, 마우스의 체중 변화를 시간 경과적으로 나타낸 도면이다. 각 군에 있어서의 군분류 시 (Day 10) 의 마우스의 체중을 100 ％ 로 한 경우의 각 측정일에 있어서의 체중의 비율로서 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). *P < 0.05, **P < 0.01 (by Student's t-test)
도 32 는, 인간 간세포 암 세포주 HepG2/C3A 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서의, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 컨트롤군 (● ： PBS) 과 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군 (○ ： 0.1 mg/kg, △ ： 0.5 mg/kg, □ ： 1 mg/kg, ◇ ： 5 mg/kg) 의 종양 체적을 시간 경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 가로축 상의 시두는 항체 투여를 나타낸다. **P < 0.01 (by Student's t-test)
B ： A 의 실험에 있어서, 26 일째 (Day 26) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. **P < 0.01 (by Student's t-test)
도 33 은, 인간 소세포 폐암 세포주 Lu-135 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서의, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 항종양 활성을 나타내는 도면이다.
A : 컨트롤군 (● ： PBS) 과 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군 (○ ： 1 mg/kg, △ ： 10 mg/kg) 의 종양 체적을 시간 경과적으로 나타냈다 (평균치 ± 표준 편차). 가로축 상의 시두는 항체 투여를 나타낸다. *P < 0.05 (by Student's t-test)
B ： A 의 실험에 있어서, 34 일째 (Day 34) (실험 최종일) 의 시점에서의 각 마우스에 있어서의 종양 중량을 플롯한 도면이다. *P < 0.05 (by Student's t-test)
도 34 는, 인간 간세포 암 세포주 HepG2 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델에 있어서의 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여 후의 Xenograft 종양의 동결 절편에 있어서, 아포토시스에 의한 세포사를 검출한 사진이다.
A : TUNEL 염색에 의해, 아포토시스에 의한 세포사를 검출한 사진이다. 좌로부터 PBS 투여 48 시간 후, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 mg/kg) 투여 24 시간 후, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 mg/kg) 투여 48 시간 후의 염색 이미지를 나타낸다. 다갈색의 핵염색이 보여지는 암 세포가 TUNEL 양성의 아포토시스 세포를 나타낸다 (현미경의 대물 렌즈 ： 400 배).
B : 항 Cleaved Caspase-3 항체를 사용한 면역 조직화학에 의해, 아포토시스 에 의한 세포사를 검출한 사진이다. 좌로부터 PBS 투여 48 시간 후, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 mg/kg) 투여 24 시간 후, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 mg/kg) 투여 48 시간 후의 염색 이미지를 나타낸다. 세포질이 다갈색으로 염색되어 있는 암 세포가 활성형 카스파제 3 양성의 아포토시스 세포를 나타낸다 (현미경의 대물 렌즈 ： 400 배).

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 범위는 이들의 설명에 구속되는 경우는 없고, 이하의 예시 이외에 대해서도, 본 발명의 취지를 저해하지 않는 범위에서 적절히 변경하여 실시할 수 있다.

또한, 본 명세서는 본원 우선권 주장의 기초가 되는 미국 가출원 61/709, 282호 명세서 (2012 년 10 월 3 일 출원) 의 전체를 포함한다. 또, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 간행물, 예를 들어 선행 기술 문헌, 및 공개 공보, 특허 공보 그 밖의 특허문헌은 참조로서 본 명세서에 포함된다.

1. 본 발명의 개요

인간 Dlk-1 (delta-like 1 homolog (Drosophila) ； hDlk-1) 은, 전술한 바와 같이, 전체 길이 383 아미노산 잔기의 1 회 막관통형의 1 형 막단백질이며, 세포 외 영역에 6 개의 EGF 형 모티프를 갖는다. 그리고, hDlk-1 유전자 및 그 유전자 산물은 여러 가지의 암이나 종양 세포에 있어서 고빈도로 발현하고 있는 것이 알려져 있다. 일반적으로, in vivo 에서 항종양 활성을 나타내는 항체를 제작하여 취득하는 것은 곤란하기 때문에, 항 hDlk-1 모노클로날 항체를 제작했다고 해도, in vitro 에서는 항종양 활성을 갖지만 in vivo 에서는 동활성을 나타내지 않는 경우가 많다. 또, hDlk-1 의 암 세포의 증식 등에 대한 기능적 도메인이나, hDlk-1 의 리간드 (또는 수용체) 및 세포 내 시그널 전달 경로 등은 분명하지 않기 때문에, 타겟을 짜서 효율적으로 항체 제작을 실시하는 것도 실질적으로 불가능하다. 이와 같은 상황하, 본 발명에 있어서는, 다수의 클론으로부터 스크리닝을 실시함으로써, in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 클론을 취득하는 것에 성공했다.

먼저, 본 발명자는, 공지된 항 hDlk-1 항체를 사용한 면역 조직화학에 의해, 지금까지 hDlk-1 의 발현이 확인되고 있던 전술한 암이나 종양 세포 이외에, 새롭게 대장암, 유방암 및 췌장암에 있어서도 hDlk-1 이 발현하고 있는 것을 알아냈다.

이어서, 본 발명자는, 개체 레벨에서 hDlk-1 발현 암 세포를 사멸시킬 수 있거나 또는 종양 성장을 저해할 수 있는 항 hDlk-1 항체, 즉 in vivo 에 있어서 항종양 활성을 갖는 항 hDlk-1 항체를 제작하는 것을 목적으로 하여, 새롭게 항 hDlk-1 모노클로날 항체를 약 100 클론 제작했다. 그리고, 이들 클론에 대해, 각종 암 세포주를 누드 마우스 피하에 이식하여 확립한 담암 마우스를 사용하여 in vivo 에 있어서의 약효 (항종양 작용) 의 평가를 실시했다. 그 결과, 현저한 종양 성장 저해 활성을 나타내는 클론을 복수 얻는 것에 성공했다 (클론명 ： BA-1-3D, DI-2-14, 2-13, DI-6, M3-1).

또 본 발명자는, 상기 서술한 항 hDlk-1 항체 중에서도, 암 치료용 항체로서 개발을 실시하는데 있어서 중요해지는, 인간 암 세포를 사용한 담암 마우스 치료 모델에 있어서 항체 단독 투여에서 현저한 항종양 활성을 나타내는 항체를 알아내어, 그 인간형화 항체도 개발했다. 또한 본 발명자는, 이 인간형화 항 hDlk-1 항체에 특정 개변 (아미노산 치환 변이) 을 추가함으로써, 보다 한층 아비디티 (Avidity ； 항원 결합 활성) 를 높인, 친항체 (마우스 BA-1-3D) 와 동등 정도의 아비디티를 갖는 개변 인간형화 항 hDlk-1 항체도 알아내고, 또, 이 개변 인간형화 항 hDlk-1 항체가 액제 처방 중 및 원숭이나 인간의 혈중 (혈장 중) 등에 있어서 장기 안정적인 항원 결합 활성을 유지하는 것을 나타냈다.

2. 항 hDlk-1 항체의 제작

(1) 항원의 조제

hDlk-1 의 아미노산 배열 (배열 번호 2) 의 정보는, 예를 들어, NCBI (GenBank) 의 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 에 「Accession number ： NP_003827」 로서 공표되어 있다. 또한, hDlk-1 의 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열 (배열 번호 1) 의 정보는 동웹 사이트에 「Accession number ： NM_ 003836」 으로서 공표되어 있다.

항원으로서는, hDlk-1 의 아미노산 배열의 적어도 일부 (전부 또는 일부) 를 포함하는 폴리펩티드 또는 펩티드 (간단히 펩티드라고도 한다) 를 사용할 수 있고, 바람직하게는, hDlk-1 의 세포 외 영역 (FA-1) 의 아미노산 배열의 적어도 일부 (전부 또는 일부) 를 포함하는 펩티드를 사용할 수 있다. hDlk-1 의 세포 외 영역은 전술한 바와 같이 6 개의 EGF 형 모티프 (EGF-1 ∼ EGF-6) 를 포함하는 영역을 말하고, 배열 번호 2 에 나타나는 아미노산 배열 중 제 24 번째 ∼ 제 244 번째의 아미노산을 포함하는 영역, 바람직하게는, 배열 번호 2 에 나타나는 아미노산 배열 중 「제 24 번째」 부터 「제 248 ∼ 285 번째」 까지의 아미노산으로 이루어지는 영역 (대략 225 ∼ 262 아미노산 잔기) 을 말한다.

여기서, 항원에 사용하는 펩티드에 대해, 상기 「아미노산 배열의 적어도 일부」 란, 길이가 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어, 6 개의 EGF 형 모티프 중 하나 또는 2 개 이상을 포함하는 영역이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 예를 들어, EGF-1 및 EGF-2 를 포함하는 영역 (즉 배열 번호 2 에 나타나는 아미노산 배열 중 제 24 번째 ∼ 제 91 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역), EGF-3 및 EGF-4 를 포함하는 영역 (즉 배열 번호 2 에 나타나는 아미노산 배열 중 제 92 번째 ∼ 제 167 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역), 그리고, EGF-4, EGF-5 및 EGF-6 을 포함하는 영역 (즉 배열 번호 2 에 나타나는 아미노산 배열 중 제 131 번째 ∼ 제 244 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역) 이다.

항원으로 하는 펩티드의 제작 방법은 화학 합성이거나, 대장균 등을 사용하는 유전자 공학적 수법에 의한 합성이어도 되고, 당업자에게 주지의 방법을 이용할 수 있다.

펩티드의 화학 합성을 실시하는 경우에는, 펩티드의 합성의 주지 방법에 의해 합성할 수 있다. 또, 그 합성은 고상 합성법 및 액상 합성법 중 어느 것이나 적용할 수 있다. 시판되는 펩티드 합성 장치 (예를 들어, 시마즈 제작소 제조 ： PSSM-8 등) 를 사용해도 된다.

펩티드를 유전자 공학적으로 합성하는 경우에는, 먼저, 당해 펩티드를 코드하는 DNA 를 설계하여 합성한다. 당해 설계 및 합성은, 예를 들어, 전체 길이 hDlk-1 유전자를 포함하는 벡터 등을 주형으로 하고, 원하는 DNA 영역을 합성할 수 있도록 설계한 프라이머를 사용하여, PCR 법에 의해 실시할 수 있다. 그리고, 상기 DNA 를 적당한 벡터에 연결함으로써 단백질 발현용 재조합 벡터를 얻고, 이 재조합 벡터를 목적 유전자가 발현할 수 있도록 숙주 중에 도입함으로써 형질 전환체를 얻는다 (Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3 rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).

벡터에는, 숙주 미생물에서 자율적으로 증식할 수 있는 파지 또는 플라스미드가 사용된다. 또한, 동물 바이러스, 곤충 바이러스 벡터를 사용할 수도 있다. 재조합 벡터의 제작은 정제된 DNA 를 적당한 제한 효소로 절단하고, 적당한 벡터 DNA 의 제한 효소 부위 등에 삽입하여 벡터에 연결하면 된다. 형질 전환에 사용하는 숙주로서는, 목적의 유전자를 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 세균 (대장균, 고초균 등), 효모, 동물 세포 (COS 세포, CHO 세포 등), 곤충 세포 또는 곤충을 들 수 있다. 염소 등의 포유 동물을 숙주로서 사용하는 것도 가능하다. 숙주에의 재조합 벡터의 도입 방법은 공지이다.

그리고, 상기 형질 전환체를 배양하고, 그 배양물로부터 항원으로서 사용되는 펩티드를 채취한다. 「배양물」 이란, (a) 배양 상청, (b) 배양 세포 혹은 배양균체 또는 그 파쇄물 모두를 의미하는 것이다.

배양 후, 목적 펩티드가 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우에는, 균체 또는 세포를 파쇄함으로써 펩티드를 추출한다. 또, 목적 펩티드가 균체 외 또는 세포 외에 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나, 원심 분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 펩티드의 단리 정제에 사용되는 일반적인 생화학적 방법, 예를 들어 황산암모늄 침전, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용함으로써, 목적의 펩티드를 단리 정제할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 무세포 합성계를 사용한 in vitro 번역에 의해 항원이 되는 펩티드를 얻을 수도 있다. 이 경우에는, RNA 를 주형으로 하는 방법과 DNA 를 주형으로 하는 방법 (전사/번역) 의 2 가지 방법을 사용할 수 있다. 무세포 합성계로서는, 시판되는 시스템, 예를 들어 Expressway^TM 시스템 (인비트로젠사), PURESYSTEM (등록상표 ； 포스트게놈 연구소), TNT 시스템 (등록상표 ； 프로메가사) 등을 사용할 수 있다.

상기와 같이 얻어진 펩티드는 적당한 캐리어 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민 (BSA), 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 인간 티로글로불린, 닭 감마글로불린 등에 결합하는 것도 가능하다.

또, 항원은 hDlk-1 의 아미노산 배열 (배열 번호 2) 또는 전술한 그 부분 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드여도 된다. 예를 들어, hDlk-1 의 아미노산 배열 또는 그 부분 배열 중 1 또는 복수개 (바람직하게는 1 개 또는 수 개 (예를 들어 1 개 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 개 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 결실되어 있고, 1 또는 복수개 (바람직하게는 1 개 또는 수 개 (예를 들어 1 개 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 개 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있고, 혹은, 1 또는 복수개 (바람직하게는 1 개 또는 수 개 (예를 들어 1 개 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 개 ∼ 5 개)) 의 다른 아미노산이 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드를 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 세포 등에 도입하기 위한 유전자로서는, hDlk-1 단백질 혹은 그 부분 단편 또는 이들의 변이형의 단백질 또는 단편을 코드하는 유전자를 들 수 있다. 그러한 유전자로서는, 예를 들어, 배열 번호 1 에 나타나는 염기 배열 또는 그 부분 배열을 갖는 것을 사용할 수 있다.

또, 세포 등에 도입하기 위한 유전자로서는, 배열 번호 1 에 나타나는 염기 배열에 상보적인 배열과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고 또한 hDlk-1 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 배열, 또는 그 부분 배열을 사용하는 것도 가능하다.

「스트린젠트한 조건」 이란, 하이브리다이즈시킨 후의 세정 시의 조건으로서, 버퍼의 염 (나트륨) 농도가 10 ∼ 500 mM 이며, 온도가 42 ℃ ∼ 72 ℃, 바람직하게는, 상기 염 농도가 50 ∼ 300 mM 이며, 온도가 55 ∼ 68 ℃ 에서의 조건을 말한다.

유전자에 변이를 도입하려면, Kunkel 법이나 Gapped duplex 법 등의 공지 수법에 의해, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예를 들어 GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System (인비트로젠사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Prime STAR (등록상표) Mutagenesis Basal kit, Mutan (등록상표)-Super Express Km 등 ： 다카라 바이오사 제조) 을 사용하여 실시할 수 있다.

(2) 폴리클로날 항체의 제작

조제한 항원을 면역을 위해 포유 동물에 투여한다. 포유 동물은 특별히 한정은 되지 않고, 예를 들어 래트, 마우스 및 토끼 등을 들 수 있고, 그 중에서도 마우스가 바람직하다.

항원의 동물 한마리당 투여량은 아쥬반트의 유무에 따라 적절히 설정할 수 있다. 아쥬반트로서는, 프로인트 완전 아쥬반트 (FCA), 프로인트 불완전 아쥬반트 (FIA), 수산화알루미늄아쥬반트 등을 들 수 있다. 면역은 주로 정맥 내, 족척, 피하, 복강 내 등에 주입함으로써 실시할 수 있다. 또, 면역의 간격에 대해서는, 특별히 한정되지 않고, 수 일부터 수 주일 간격, 바람직하게는 1 주일 간격으로, 1 ∼ 10 회, 바람직하게는 2 ∼ 3 회 면역을 실시한다. 그리고, 최종 면역일부터 3 ∼ 7 일 후에, 효소 면역 측정법 (ELISA 또는 EIA) 이나 방사성 면역 측정법 (RIA) 등으로 항체가를 측정하고, 원하는 항체가를 나타낸 날에 채혈하여, 항혈청을 얻을 수 있다. 상기 항체의 채취 방법에 있어서, 항체의 정제가 필요하게 되는 경우에는, 유안 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 적절히 선택하고, 또는 이들을 조합시킴으로써, 정제할 수 있다. 그 후는 항혈청 중의 폴리클로날 항체의 반응성을 ELISA 법 등으로 측정한다.

(3) 모노클로날 항체의 제작

(3-1) 항체 산생 세포의 채취

본 발명의 항 hDlk-1 항체는 한정은 되지 않지만, 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.

조제한 항원을 면역을 위해 포유 동물, 예를 들어 래트, 마우스 및 토끼 등에 투여한다. 항원의 동물 한마리당 투여량은 아쥬반트의 유무에 따라 적절히 설정할 수 있다. 아쥬반트로서는 상기와 동일하다. 면역 수법도 상기와 동일하다. 그리고, 최종 면역일부터 1 ∼ 60 일 후, 바람직하게는 1 ∼ 14 일 후에, 항체 산생 세포를 채취한다. 항체 산생 세포로서는, 비장 세포, 림프절 세포 및 말초혈 세포 등을 들 수 있지만, 그 중에서도 림프절 세포 및 비장 세포가 바람직하다.

(3-2) 세포 융합

하이브리도마 (항체 산생 세포주) 를 얻기 위해, 항체 산생 세포와 미엘로마 세포의 세포 융합을 실시한다. 항체 산생 세포와 융합시키는 미엘로마 세포로서, 마우스 등의 동물의 일반적으로 입수 가능한 주화 세포를 사용할 수 있다. 사용하는 세포주로서는, 약제 선택성을 가지며, 미융합 상태에서는 HAT 선택 배지 (히폭산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함한다) 에서 생존할 수 없고, 항체 산생 세포와 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 성질을 갖는 것이 바람직하다.

미엘로마 세포로서는, 예를 들어, P3-X63-Ag8.653, P3-X63-Ag8 (X63), P3-X63-Ag8.U1 (P3U1), P3/NS I/1-Ag4-1(NS1) 및 Sp2/0-Ag14 (Sp2/0) 등의 마우스 미엘로마 세포주를 들 수 있다. 미엘로마 세포의 선택은 항체 산생 세포와의 적합성을 적절히 고려하여 실시할 수 있다.

이어서, 미엘로마 세포와 항체 산생 세포를 세포 융합시킨다. 세포 융합은, 혈청을 포함하지 않는 DMEM 및 RPMI-1640 배지 등의 동물 세포용 배지 중에서, 1 × 10⁶ ∼ 1 × 10⁷ 개/㎖ 의 항체 산생 세포와 2 × 10⁵ ∼ 2 × 10⁶ 개/㎖ 의 미엘로마 세포를 혼합한다. 항체 산생 세포와 미엘로마 세포의 세포비 (항체 산생 세포 ： 미엘로마 세포) 는 한정은 되지 않지만, 통상적으로, 1 ： 1 ∼ 10 ： 1 로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 3 ： 1 이다. 다음으로, 세포 융합 촉진제의 존재하에서 융합 반응을 실시한다. 세포 융합 촉진제로서 예를 들어, 평균 분자량 1,000 ∼ 6,000 달톤 (D) 의 폴리에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있다. 또, 전기 자극 (예를 들어 일렉트로포레이션) 을 이용한 시판되는 세포 융합 장치를 사용하여, 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시킬 수도 있다.

(3-3) 하이브리도마의 선별 및 클로닝

세포 융합 처리 후의 세포로부터 목적으로 하는 하이브리도마를 선별한다. 그 방법으로서, 세포 현탁액을, 예를 들어 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지 등에 적당하게 희석 후, 마이크로타이터 플레이트 상에 뿌리고, 각 웰에 선택 배지를 추가하고, 이후 적당하게 선택 배지를 교환하여 배양을 실시한다. 그 결과, 선택 배지에서 배양 개시 후, 14 일 전후부터 생육해 오는 세포를 하이브리마로서 얻을 수 있다.

다음으로, 증식해 온 하이브리도마의 배양 상청 중에, hDlk-1 에 반응하는 항체가 존재하는지의 여부를 스크리닝한다. 하이브리도마의 스크리닝은 통상적인 방법에 따르면 되고, 특별히 한정은 되지 않는다. 예를 들어, 하이브리도마로서 생육한 웰에 포함되는 배양 상청의 일부를 채취하고, ELISA, EIA 및 RIA 등에 의해 스크리닝할 수 있다.

융합 세포의 클로닝은 한계 희석법 등에 의해 실시할 수 있다. hDlk-1 에 강한 반응성을 나타내는 항체를 플로사이트메트리 등에 의해 판정하고, 이것을 산생하는 하이브리도마를 선택하여, 클론으로서 수립한다.

(3-4) 모노클로날 항체의 채취

수립한 하이브리도마를 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 모노클로날 항체를 채취하는 방법으로서 통상적인 세포 배양법, 또는 복수 형성법 등을 채용할 수 있다. 「배양」 이란, 하이브리도마를 배양 접시 또는 배양 보틀 중에서 생육시키는 것, 혹은 하이브리도마를 하기와 같이 동물의 복강 내에서 증식시키는 것을 의미한다.

세포 배양법에 있어서는, 하이브리도마를 10 ％ 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지, MEM 배지 또는 무혈청 배지 등의 동물 세포 배양 배지 중에서, 통상적인 배양 조건 (예를 들어 37 ℃, 5 ％ CO₂ 농도) 에서 7 ∼ 14 일간 배양하고, 그 배양 상청으로부터 항체를 취득할 수 있다.

복수 형성법의 경우에는, 미엘로마 세포 유래의 포유 동물과 동종계 동물의 복강 내에 하이브리도마를 약 1 × 10⁷ 개 투여하여, 하이브리도마를 대량으로 증식 시킨다. 그리고, 2 ∼ 3 주일 후에 복수를 채취하는 것이 바람직하다.

상기 항체의 채취 방법에 있어서, 항체의 정제가 필요하게 되는 경우에는, 유안 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 어피니티 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 적절히 선택하거나, 또는 이들을 조합시킴으로써 정제할 수 있다.

(3-5) 항종양 활성을 갖는 클론의 선별

본 발명의 항 hDlk-1 항체는 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항체이다.

여기서, 「항종양 활성」 이란, 종양 세포 (암 세포) 를 사멸시키는 활성 또는 종양 성장을 저해하는 활성을 의미한다. 본 발명에 있어서, 항종양 활성으로서는, 예를 들어, 종양 혈관 신생 저해 활성을 바람직하게 들 수 있다. 또, 본 발명의 항체가 항종양 활성을 발휘할 수 있는 인간 종양 (종양 세포) 의 종류로서는, hDlk-1 의 발현이 확인되고 있는 전술한 공지된 인간 종양 (구체적으로는, 고형암에서는, 신경 내분비 종양, 신경아세포종, 신경교종, 1 형 신경 섬유종증, 소세포 폐암, 간암, 신장암 및 난소암 등, 혈액암에서는, 골수 이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병 등.) 그리고 본 발명자가 새롭게 hDlk-1 의 발현을 확인한 인간 대장암, 인간 유방암 및 인간 췌장암을 들 수 있다. 그 중에서도 특히, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 췌장암, 인간 간암, 인간 소세포 폐암 및 인간 신경아세포종 중 1 종 또는 2 종 이상을 바람직하게 들 수 있다.

in vivo 에서의 항종양 활성의 확인은, 예를 들어, 원하는 종양 세포를 마우스의 피하에 이식한 담암 마우스를 사용하여, 이 마우스에 상기와 같이 얻어진 항체를 투여함으로써 실시할 수 있다. 이 경우, 항체의 투여는 종양 세포의 이식 직후부터 실시해도 되고 (Prevention 모델), 이식에 종양이 소정의 체적이 된 것을 확인하고 나서 실시해도 된다 (Treatment 모델). 투여 방법은 전혀 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 3 일에 1 회, 20 mg/kg 체중, 복강 내 투여로 해도 된다. Prevention 모델의 경우에는, 종양 형성 빈도와 종양 체적에 의해 항종양 활성의 유무 및 레벨을 평가할 수 있다. Treatment 모델의 경우에는, 종양 체적 및 종양 중량에 의해 항종양 활성의 유무 및 레벨을 평가할 수 있다.

본 발명에 있어서, in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 항 hDlk-1 항체로서는, 예를 들어, 수탁 번호가 FERM BP-11337 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항 hDlk-1 모노클로날 항체 (클론명 ： BA-1-3D), 수탁 번호가 FERM BP-10707 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항 hDlk-1 모노클로날 항체 (클론명 ： M3-1), 수탁 번호가 FERM BP-10899 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항 hDlk-1 모노클로날 항체 (클론명 ： DI-2-14), 및 수탁 번호가 FERM BP-10900 인 하이브리도마에 의해 산생되는 항 hDlk-1 모노클로날 항체 (클론명 ： DI-6) 등을 바람직하게 들 수 있다.

여기서, 수탁 번호가 FERM BP-11337 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse hybridoma BA-1-3D」 라고 칭하고 2011 년 2 월 1 일부로, 수탁 번호가 FERM BP-10707 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse hybridoma : M3-1」 이라고 칭하고 2006 년 10 월 18 일부로, 수탁 번호가 FERM BP-10899 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse hybridoma DI-2-14」 라고 칭하고 2007 년 8 월 21 일부로, 수탁 번호가 FERM BP-10900 인 하이브리도마는 「Mouse-Mouse hybridoma DI-6」 이라고 칭하고 2007 년 8 월 21 일부로, 모두, 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물 기탁센터 ((우) 305-8566 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 중앙 제 6) 에 기탁된 것이다.

또, 본 발명의 항 hDlk-1 항체로서는, 예를 들어, H 사슬 V 영역의 CDR1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 16 ∼ 18 에 나타나는 아미노산 배열인 것, 및/또는, L 사슬 V 영역의 CDR1 ∼ 3 의 아미노산 배열이, 각각 순서대로, 배열 번호 23 ∼ 25 에 나타나는 아미노산 배열인 것을, 바람직하게 들 수 있다. 상기 H 사슬 V 영역으로서는, 예를 들어, 배열 번호 13 에 나타나는 아미노산 배열, 특히 배열 번호 15 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) 로 이루어지는 것이 바람직하고, 상기 L 사슬 V 영역으로서는, 예를 들어, 배열 번호 20 에 나타나는 아미노산 배열, 특히 배열 번호 22 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) 로 이루어지는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 항 hDlk-1 항체로서는, 예를 들어, 수탁 번호가 FERM BP-11337, FERM BP-10707, FERM BP-10899, 또는 FERM BP-10900 인 하이브리도마에 의해 산생되는 모노클로날 항체가 결합 (인식) 하는 부위 (예를 들어 에피토프) 에 결합하는 항 hDlk-1 항체도 바람직하게 들 수 있다.

(3-6) 항 hDlk-1 항체의 에피토프

본 발명의 항 hDlk-1 항체의 에피토프 (항원 결정기) 는 항원인 hDlk-1 의 적어도 일부이면 되며 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 배열 번호 2 에 나타나는 hDlk-1 의 아미노산 배열 중의, 제 24 번째 ∼ 제 91 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역 (hDlk-1 의 EGF-1 ∼ EGF-2 를 포함하는 영역), 제 92 번째 ∼ 제 167 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역 (hDlk-1 의 EGF-3 ∼ EGF-4 를 포함하는 영역), 혹은 제 131 번째 ∼ 제 244 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역 (hDlk-1 의 EGF-4 ∼ EGF-6 을 포함하는 영역) 의 적어도 일부인 것이 바람직하다. 그 중에서도, hDlk-1 의 EGF-1 ∼ EGF-2 를 포함하는 영역이 보다 바람직하다. 당해 영역을 인식하는 (당해 영역과 결합한다) 항 hDlk-1 항체는, 예를 들어, 종양 세포 내에의 인터널리제이션 활성이 높고, 후술하는 이뮤노콘쥬게이트 등의 용도에 매우 유용한 것이다.

(4) 유전자 재조합 항체, 및 항체 단편

(4-1) 유전자 재조합 항체

본 발명의 항 hDlk-1 항체의 바람직한 양태의 하나로서, 유전자 재조합 항체를 들 수 있다. 유전자 재조합 항체로서는, 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 키메라 항체, 인간형화 항체 및 인간화 항체 등을 들 수 있다.

키메라 항체 (즉 인간형 키메라 항체) 는 마우스 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 연결 (접합) 한 항체이며 (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81, 6851-6855, (1984) 등을 참조), 키메라를 제작하는 경우에는, 그와 같이 연결한 항체가 얻어지도록, 유전자 재조합 기술에 의해 용이하게 구축할 수 있다. 여기서, 마우스 유래 항체의 가변 영역으로서는, H 사슬 V 영역은, 예를 들어, 배열 번호 13 에 나타나는 아미노산 배열, 특히 배열 번호 15 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) 로 이루어지는 것이 바람직하고, L 사슬 V 영역은, 예를 들어, 배열 번호 20 에 나타나는 아미노산 배열, 특히 배열 번호 22 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) 로 이루어지는 것이 바람직하다.

인간형화 항체를 제작하는 경우에는, 마우스 항체의 가변 영역으로부터 상보성 결정 영역 (CDR) 을 인간 가변 영역에 이식하고, 프레임 워크 영역 (FR) 은 인간 유래의 것으로 CDR 은 마우스 유래의 것으로 이루어지는, 재구성한 가변 영역을 제작한다 (이른바 CDR 그라프팅 (CDR 이식)). 다음으로, 이들의 인간형화된 재구성 인간 가변 영역을 인간 정상 영역에 연결한다. 여기서, 인간형화된 재구성 인간 가변 영역으로서는, H 사슬 V 영역은, 예를 들어, 배열 번호 33 에 나타나는 아미노산 배열, 특히 배열 번호 35 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) 로 이루어지는 것, 또는 배열 번호 38 에 나타나는 아미노산 배열, 특히 배열 번호 40 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) 로 이루어지는 것이 바람직하고, L 사슬 V 영역은, 예를 들어, 배열 번호 43 에 나타나는 아미노산 배열, 특히 배열 번호 45 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) 로 이루어지는 것이 바람직하다. 이들 인간형화 항체의 제작법은, 예를 들어, Nature, 321, 522-525 (1986) ； J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987) ； Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 : 10029-10033 (1989) ； 일본 공표특허공보 평4-502408호 (특허공보 제2828340호 ； 퀸 들) 등을 참조할 수 있다. 여기서, 본 발명의 인간형화 항 hDlk-1 항체에 사용할 수 있는 마우스 유래의 CDR 배열로서는, 한정은 되지 않지만, 예를 들어, H 사슬 V 영역의 CDR1 ∼ 3 으로서 (각각 순서대로) 배열 번호 16 ∼ 18 에 나타나는 아미노산 배열이 L 사슬 V 영역의 CDR1 ∼ 3 으로서 (각각 순서대로) 배열 번호 23 ∼ 25 에 나타나는 아미노산 배열을 바람직하게 들 수 있다.

또한 본 발명에 있어서는, 상기 인간형화 항체의 H 사슬 또는 L 사슬의 V 영역의 일부 (CDR 배열을 제외한다) 의 아미노산 (바람직하게는 1 ∼ 수 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 2 개의 아미노산) 을 다른 아미노산 치환한, 개변형의 아미노산도 포함된다.

개변형의 아미노산으로서는, 예를 들어, 상기 인간형화 항체의 H 사슬 V 영역 (CDR 배열을 제외한다) 의 1 또는 2 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것이 바람직하다. 이와 같이 치환된 아미노산으로서는, 예를 들어, H 사슬 V 영역이,

(1-1) 배열 번호 67 에 나타나는 아미노산 배열 (염기 배열은 배열 번호 66), 특히 배열 번호 69 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) (염기 배열은 배열 번호 68) 로 이루어지는 것,

(1-2) 배열 번호 71 에 나타나는 아미노산 배열 (염기 배열은 배열 번호 70), 특히 배열 번호 73 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) (염기 배열은 배열 번호 72) 로 이루어지는 것,

(1-3) 배열 번호 75 에 나타나는 아미노산 배열 (염기 배열은 배열 번호 74), 특히 배열 번호 77 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) (염기 배열은 배열 번호 76) 로 이루어지는 것,

(2-1) 배열 번호 79 에 나타나는 아미노산 배열 (염기 배열은 배열 번호 78), 특히 배열 번호 81 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) (염기 배열은 배열 번호 80) 로 이루어지는 것,

(2-2) 배열 번호 83 에 나타나는 아미노산 배열 (염기 배열은 배열 번호 82), 특히 배열 번호 85 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) (염기 배열은 배열 번호 84) 로 이루어지는 것,

(2-3) 배열 번호 87 에 나타나는 아미노산 배열 (염기 배열은 배열 번호 86), 특히 배열 번호 89 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) (염기 배열은 배열 번호 88) 로 이루어지는 것 등을 바람직하게 들 수 있고, 보다 바람직하게는 (1-3) 및 (2-3) 의 아미노산 배열이다. 이와 같이 H 사슬 V 영역이 상기 (1-1) ∼ (2-3) 중 어느 것의 아미노산 배열로 개편되고, 또한 L 사슬 V 영역이 전술한 배열 번호 43 에 나타나는 아미노산 배열, 특히 배열 번호 45 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) 로 이루어지는 개변 인간형화 항 hDlk-1 항체는 보다 한층 아비디티 (Avidity ； 항원 결합 활성) 가 높은 인간형화 항체이며, 예를 들어, 세포 표면에 있어서의 항원의 발현량이 적은 암 세포와의 결합 활성의 유지를 가능하게 하는 것이다. 또, 당해 개변 인간형화 항 hDlk-1 항체는 액제 처방 중 및 원숭이나 인간의 혈중 (혈장 중) 등에 있어서 장기 안정적인 항원 결합 활성을 유지할 수 있는 것이다.

여기서, 상기 (1-1) 의 배열 번호 67 에 나타나는 아미노산 배열은 배열 번호 33 에 나타나는 아미노산 배열의 제 43 번째의 알라닌 (A) 이 글리신 (G) 으로 치환된 것이며, 배열 번호 69 에 나타나는 아미노산 배열은 배열 번호 35 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) 의 제 24 번째의 알라닌 (A) 이 글리신 (G) 으로 치환된 것이다.

또, 상기 (1-2) 의 배열 번호 71 에 나타나는 아미노산 배열은 배열 번호 33 에 나타나는 아미노산 배열의 제 93 번째의 트레오닌 (T) 이 리신 (K) 으로 치환된 것이며, 배열 번호 73 에 나타나는 아미노산 배열은 배열 번호 35 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) 의 제 74 번째의 트레오닌 (T) 이 리신 (K) 으로 치환된 것이다.

또, 상기 (1-3) 의 배열 번호 75 에 나타나는 아미노산 배열은 배열 번호 33 에 나타나는 아미노산 배열의 제 43 번째의 알라닌 (A) 이 글리신 (G) 으로 치환되고, 또한, 제 93 번째의 트레오닌 (T) 이 리신 (K) 으로 치환된 것이며, 배열 번호 77 에 나타나는 아미노산 배열은 배열 번호 35 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) 의 제 24 번째의 알라닌 (A) 이 글리신 (G) 으로 치환되고, 또한, 제 74 번째의 트레오닌 (T) 이 리신 (K) 으로 치환된 것이다.

또한, 상기 (2-1) 의 배열 번호 79 에 나타나는 아미노산 배열은 배열 번호 38 에 나타나는 아미노산 배열의 제 43 번째의 알라닌 (A) 이 글리신 (G) 으로 치환된 것이며, 배열 번호 81 에 나타나는 아미노산 배열은 배열 번호 40 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) 의 제 24 번째의 알라닌 (A) 이 글리신 (G) 으로 치환된 것이다.

또, 상기 (2-2) 의 배열 번호 83 에 나타나는 아미노산 배열은 배열 번호 38 에 나타나는 아미노산 배열의 제 93 번째의 트레오닌 (T) 이 리신 (K) 으로 치환된 것이며, 배열 번호 85 에 나타나는 아미노산 배열은 배열 번호 40 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) 의 제 74 번째의 트레오닌 (T) 이 리신 (K) 으로 치환된 것이다.

또, 상기 (2-3) 의 배열 번호 87 에 나타나는 아미노산 배열은 배열 번호 38 에 나타나는 아미노산 배열의 제 43 번째의 알라닌 (A) 이 글리신 (G) 으로 치환되고, 또한, 제 93 번째의 트레오닌 (T) 이 리신 (K) 으로 치환된 것이며, 배열 번호 89 에 나타나는 아미노산 배열은 배열 번호 40 에 나타나는 아미노산 배열 (성숙 펩티드) 의 제 24 번째의 알라닌 (A) 이 글리신 (G) 으로 치환되고, 또한, 제 74 번째의 트레오닌 (T) 이 리신 (K) 으로 치환된 것이다.

인간화 항체 (완전 인간 항체) 는 일반적으로 V 영역의 항원 결합 부위인 초과변 영역 (Hyper Variable region), V 영역의 그 밖의 부분 및 정상 영역의 구조가 인간의 항체와 동일한 구조를 갖는 것이다. 단, 초가변 부위는 다른 동물 유래여도 된다. 인간화 항체를 제작하는 기술도 공지이며, 인간에 공통의 유전자 배열에 대해서는 유전자 공학적 수법에 의해 제작하는 방법이 확립되어 있다. 인간화 항체는, 예를 들어, 인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 산생 마우스를 사용한 방법 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics, (1977) 16, 133-143 ; Kuroiwa, Y. et. al., Nuc. Acids Res., (1998) 26, 3447-3448 ; Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology : Basic and Applied Aspects, (1999) 10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers ; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000) 97, 722-727 등을 참조) 이나, 인간 항체 라이브러리에서 선별한 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002) 43 (7), 2301-8 ; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics, (2002) 1 (2), 189-203 ; Siriwardena, D. et. al., Opthalmology, (2002) 109 (3), 427-431 등을 참조) 에 의해 취득할 수 있다.

상기 키메라 항체, 인간형 항체 및 인간화 항체는, 예를 들어, 항체 Fc 영역에 있어서의 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 그 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있지 않은 당사슬인 것이 바람직하고, 상세하게는, 그 푸코오스의 1 위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 α 결합되어 있지 않은 당사슬을 항체 분자의 Fc 영역에 갖는 유전자 재조합 항체 분자로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 이와 같은 항체이면, ADCC 활성을 비약적으로 향상시킬 수 있다. 또한, 이 점 (항체 Fc 영역에 있어서의 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬의 특징) 은 전술한 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체에 대해서도 마찬가지로 바람직하다.

(4-2) 항체 단편

본 발명의 항 hDlk-1 항체의 단편도 본 발명의 항체에 포함되는 것으로 한다. 여기서, 본 발명의 항체 단편은, 본 발명의 항 hDlk-1 항체 (마우스 항체 이외의 인간형화 항체 등을 포함한다) 와 마찬가지로, hDlk-1 에 대한 결합 활성을 갖는 것으로서 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 것이다.

당해 항체의 단편으로서는, 항 hDlk-1 폴리클로날 항체 또는 항 hDlk-1 모노클로날 항체의 일부분의 영역 (즉, 본 발명의 항 hDlk-1 항체에서 유래하는 항체 단편) 을 의미하고, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv (variable fragment of antibody), 한 개 사슬 항체 (H 사슬, L 사슬, H 사슬 V 영역, 및 L 사슬 V 영역 등), scFv, diabody (scFv 2 량체), dsFv (디술파이드 안정화 V 영역), 그리고, 상보성 결정 영역 (complementarity determining region ： CDR) 을 적어도 일부에 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.

Fab 는, 항체 분자를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편 중, H 사슬의 N 말단측 약 반과 L 사슬 전체가 디술파이드 결합으로 결합된, 분자량 약 5 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 또, 항체의 Fab 를 코드하는 DNA 를, 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, Fab 를 제조할 수도 있다.

F(ab')₂ 는, 항체 분자를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중, Fab 가 힌지 영역의 디술파이드 결합을 개재하여 결합된 것보다 약간 큰, 분자량 약 10 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 또, 후술하는 Fab 를 티오에테르 결합 혹은 디술파이드 결합시켜, 제작할 수도 있다.

Fab' 는 상기 F(ab')₂ 의 힌지 영역의 디술파이드 결합을 절단한, 분자량 약 5 만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 또, 항체의 Fab' 단편을 코드하는 DNA 를, 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, Fab' 를 제조할 수도 있다.

scFv 는 1 개의 H 사슬 V 영역 (VH) 과 1 개의 L 사슬 V 영역 (VL) 을 적당한 펩티드 링커 (P) 를 사용하여 연결한, VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩티드에서, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. scFv 는, 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, scFv 를 코드하는 DNA 를 구축하고, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.

diabody 는 scFv 가 2 량체화한 항체 단편으로, 2 가의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2 가의 항원 결합 활성은 동일할 수도 있고, 일방을 상이한 항원 결합 활성으로 할 수도 있다. diabody 는, 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, scFv 를 코드하는 DNA 를 P 의 아미노산 배열의 길이가 8 잔기 이하가 되도록 구축하고, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.

dsFv 는, VH 및 VL 중의 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를, 그 시스테인 잔기간의 디술파이드 결합을 개재하여 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환하는 아미노산 잔기는, Reiter 들에 의해 나타낸 방법 (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994) 에 따라, 항체의 입체 구조 예측에 기초하여 선택할 수 있다. dsFv 는, 항체의 VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, dsFv 를 코드하는 DNA 를 구축하고, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.

CDR 을 포함하는 펩티드는 VH 또는 VL 의 CDR (CDR1 ∼ 3) 의 적어도 1 영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수의 CDR 을 포함하는 펩티드는 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 개재하여 결합시킬 수 있다. CDR 을 포함하는 펩티드는, 항체의 VH 및 VL 의 CDR 을 코드하는 DNA 를 구축하고, 그 DNA 를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다. 또, CDR 을 포함하는 펩티드는 Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법) 및 tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.

본 발명의 항체 단편으로서는, 그대로의 형상으로 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 그 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있지 않은 당사슬인 항체 Fc 영역의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이어도 되고, 또, 상기 서술한 항체 단편과 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 그 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있지 않은 당사슬인 항체 Fc 영역의 일부 또는 전부와의 융합 단백질이어도 된다. 이와 같은 항체 단편이면, ADCC 활성을 비약적으로 향상시킬 수 있기 때문에 바람직하다.

본 발명의 항체 단편의 구체예로서는, 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 배열 번호 16 ∼ 18 에 나타나는 아미노산 배열 (H 사슬 V 영역의 CDR1 ∼ 3) 을 적어도 일부에 포함하는 것을 들 수 있고, 구체적으로는, 배열 번호 13 (특히 배열 번호 15), 배열 번호 33 (특히 배열 번호 35), 배열 번호 38 (특히 배열 번호 40), 배열 번호 67 (특히 배열 번호 69), 배열 번호 71 (특히 배열 번호 73), 및 배열 번호 75 (특히 배열 번호 77), 배열 번호 79 (특히 배열 번호 81), 배열 번호 83 (특히 배열 번호 85), 배열 번호 87 (특히 배열 번호 89) 에 나타나는 아미노산 배열 (H 사슬 V 영역) 을 포함하는 것을 들 수 있다. 또, 당해 항체 단편의 다른 구체예로서는, 예를 들어, 배열 번호 23 ∼ 25 (L 사슬 V 영역의 CDR1 ∼ 3) 에 나타나는 아미노산 배열을 적어도 일부에 포함하는 것을 들 수 있고, 구체적으로는, 배열 번호 20 (특히 배열 번호 22) 및 배열 번호 43 (특히 배열 번호 45) 에 나타나는 아미노산 배열 (L 사슬 V 영역) 을 포함하는 것을 들 수 있다.

이하, 본 명세서 중의 설명에 있어서는, 상기 서술한 항체 단편도 본 발명의 항 hDlk-1 항체에 포함되는 것으로 한다.

3. 항체-약제 복합체의 제작

상기 본 발명의 항 hDlk-1 항체를 사용한 이뮤노콘쥬게이트 등으로서, 당해 항체와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물을 포함하는 항체-약제 복합체를 제공할 수 있다. 또한, 미리, 당해 항체 분자와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물을, 각각 조제한 후, 이들을 복합화시켜 얻어진 것은, 일반적으로, 이뮤노콘쥬게이트라고 칭해진다. 또, 유전자 재조합 기술을 이용하여, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물로서의 단백질 톡신을, 유전자 상에서 항체 유전자와 연결시켜, 1 개의 단백질 (융합 단백질) 로서 발현시켜 얻어진 것은, 일반적으로, 이뮤노톡신이라고 칭해진다.

항종양 활성을 갖는 화합물로서는, 예를 들어, 독소르비신, 칼리케어마이신, 마이토마이신 C, Auristatin E 등을 들 수 있다.

살세포 활성을 갖는 화합물로서는, 예를 들어, 사포린, 리신, 녹농균 외 독소, 디프테리아톡신 등을 들 수 있고, 그 중에서도 사포린 및 녹농균 외 독소가 바람직하게 사용된다.

항체-약제 복합체의 제작 방법으로서는, 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 디술파이드 결합이나 히드라존 결합에 의해 항체와 약제를 커플링하는 방법 등을 들 수 있다.

상기 본 발명의 항 hDlk-1 항체는 hDlk-1 을 발현하는 표적 종양 세포 내에의 인터널리제이션 활성이 우수한 것이다. 그 때문에, 미리, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물을 복합화시켜 둠으로써, 이들 화합물을 종양 세포에 직접 또한 고선택적으로 작용시킬 수 있다. 본 발명의 항체-약제 복합체는 표적 종양 세포로의 약제 송달능이 매우 우수한 것이다.

또한, 세포 내에의 인터널리제이션 활성은 항체를 로다민 등에 의해 형광 표식하고, 세포 내로의 이행 거동 및 항체의 국재성에 대해 형광 현미경 등을 사용하여 관찰함으로써 평가할 수 있다.

또 본 발명에 있어서는, 항체-약제 복합체에 있어서, 항체 대신에 전술한 항체 단편을 사용한 항체 단편-약제 복합체를 제공할 수도 있다. 항체 단편-약제 복합체의 상세한 것에 대해서는, 상기 서술한 항체-약제 복합체의 설명을 적절히 적용할 수 있다.

이하, 본 명세서 중의 설명에 있어서는, 항체 단편-약제 복합체도 본 발명의 항체-약제 복합체에 포함되는 것으로 한다.

4. 의약 조성물

본 발명의 항 hDlk-1 항체 및 항체-약제 복합체는 의약 조성물에 포함되는 유효 성분으로서 유용하다.

당해 의약 조성물은 종양의 치료용 및/또는 진단용의 의약 조성물로서 유용하다. 즉, 본 발명의 항 hDlk-1 항체 및 항체-약제 복합체는 종양 치료제나 종양 진단제에 포함되는 유효 성분으로서 유용한 것이다. 여기서, 종양의 치료로서는, 종양 혈관 신생 저해도 포함된다 (이하, 본 명세서에 있어서 동일).

본 발명의 항 hDlk-1 항체 및 항체-약제 복합체는, 종양의 치료에 사용한 경우에, 체중 감소 등의 부작용을 갖지 않는 점에서, 바람직한 것이다.

또, 당해 의약 조성물은 종양 세포의 아포토시스 유도용의 의약 조성물로서 유용하다. 즉, 본 발명의 항 hDlk-1 항체 및 항체-약제 복합체는 종양 세포의 아포토시스 유도제에 포함되는 유효 성분으로서 유용한 것이다.

본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 항 hDlk-1 항체 및/또는 항체-약제 복합체를 유효 성분으로서 포함하고, 또한 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물의 형태로 제공하는 것이 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물의 적용의 대상이 되는 질환 (종양) 으로서는, hDlk-1 의 발현이 확인되고 있는 전술한 공지된 인간 종양 (구체적으로는, 고형암에서는, 신경 내분비 종양, 신경아세포종, 신경교종, 1 형 신경 섬유종증, 소세포 폐암, 간암, 신장암 및 난소암 등, 혈액암에서는, 골수 이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병 등.) 그리고 본 발명자가 새롭게 hDlk-1 의 발현을 확인한 인간 대장암, 인간 유방암 및 인간 췌장암을 들 수 있다. 그 중에서도 특히, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암, 인간 췌장암, 인간 소세포 폐암 및 인간 신경세포종 중 1 종 또는 2 종 이상을 바람직하게 들 수 있다. 이들의 질환은 단독이어도 되고, 2 개 이상이 병발해도 된다.

「약학적으로 허용될 수 있는 담체」 란, 부형제, 희석제, 증량제, 붕괴제, 안정제, 보존제, 완충제, 유화제, 방향제, 착색제, 감미제, 점조제, 교미제, 용해 보조제 혹은 그 밖의 첨가제 등을 들 수 있다. 그러한 담체의 1 종 이상을 사용함으로써, 주사제, 액제, 캡슐제, 현탁제, 유제 혹은 시럽제 등의 형태의 의약 조성물을 조제할 수 있다. 이들의 의약 조성물은 경구 혹은 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구 투여를 위한 그 밖의 형태로서는, 1 개 이상의 활성 물질을 포함하고, 통상적인 방법에 의해 처방되는 주사제 등이 포함된다. 주사제의 경우에는, 생리 식염수 또는 시판되는 주사용 증류수 등의 약학적으로 허용되는 담체 중에 용해 또는 현탁함으로써 제조할 수 있다.

특히, 본 발명의 항 hDlk-1 항체 유래의 항체 단편 (그 중에서도 저분자인 것) 을 생체 내에 투여하는 경우에는, 상기에 더하여, 콜로이드 분산계를 사용할 수 있다. 콜로이드 분산계는 화합물 (항체 단편) 의 생체 내의 안정성을 높이는 효과나, 특정의 장기, 조직 또는 세포에 화합물을 효율적으로 수송하는 효과가 기대된다. 콜로이드 분산계는 통상적으로 사용되는 것이면 되고 한정은 되지 않지만, 폴리에틸렌글리콜, 고분자 복합체, 고분자 응집체, 나노 캡슐, 미크로스페어, 비즈, 및 수중유계의 유화제, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함하는 지질을 베이스로 하는 분산계를 들 수 있고, 바람직하게는, 특정의 장기, 조직 또는 세포에 화합물을 효율적으로 수송하는 효과가 있는, 복수의 리포솜, 인공막의 소포이다 (Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682 ; Blume and Cevc, Biochem. et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91 ; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119 ; Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698).

본 발명의 의약 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 체중 및 증상, 치료 효과, 투여 방법, 처리 시간, 혹은 의약 조성물에 함유되는 본 발명의 항 hDlk-1 항체 및 항체-약제 복합체의 종류 등에 따라 상이하다. 통상적으로, 성인 1 인당, 1 회당 600 ㎍ 내지 6000 mg 의 범위로 투여할 수 있지만, 이 범위로 한정되는 것은 아니다.

예를 들어 주사제에 의해 투여하는 경우에는, 인간 환자에 대해, 1 회의 투여에 있어서 1 kg 체중당, 10 ㎍ ∼ 100 mg, 또는 30 ㎍ ∼ 100 mg, 또는 50 ㎍ ∼ 100 mg, 또는 100 ㎍ ∼ 100 mg 의 양, 또는 200 ㎍ ∼ 100 mg, 또는 300 ㎍ ∼ 100 mg, 또는 500 ㎍ ∼ 100 mg 의 용량, 혹은 이들 용량 범위의 하한을 적절히 조합한 범위의 용량 (예를 들어, 30 ㎍ ∼ 200 ㎍ 이나 100 ㎍ ∼ 500 ㎍) 을 1 일 평균당 1 회 ∼ 수 회 투여할 수 있다. 투여의 형태로서는, 정맥내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 근육내 주사 혹은 복강내 주사 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 정맥내 주사이다. 또, 주사제는, 경우에 따라, 비수성의 희석제 (예를 들어 폴리에틸렌글리콜, 올리브유 등의 식물유, 에탄올 등의 알코올류 등), 현탁제 혹은 유탁제로서 조제할 수도 있다. 그러한 주사제의 무균화는 필터에 의한 여과 멸균, 살균제의 배합 등에 의해 실시할 수 있다. 주사제는 용시 조제의 형태로서 제조할 수 있다. 즉, 동결 건조법 등에 의해 무균의 고체 조성물로 하고, 사용 전에 무균의 주사용 증류수 또는 다른 용매에 용해하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은, 종양을 치료하고, 종양을 진단하고, 및/또는 종양 세포의 아포토시스를 유도하는 의약 (약제) 을 제조하기 위한, 상기 본 발명의 항 hDlk-1 항체 및/또는 항체-약제 복합체의 사용을 제공하는 것이기도 하다. 또, 본 발명은 종양의 치료용, 종양의 진단용, 및/또는 종양 세포의 아포토시스 유도용의, 상기 본 발명의 항 hDlk-1 항체 및/또는 항체-약제 복합체를 제공하는 것이기도 하다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 항 hDlk-1 항체 및/또는 항체-약제 복합체를 사용하는 (즉 환자에게 투여한다) 것을 특징으로 하는, 종양의 치료 방법, 종양의 진단 방법, 및/또는 종양 세포의 아포토시스 유도 방법을 제공하는 것이며, 또, 종양을 치료하고, 종양을 진단하고, 및/또는 종양 세포의 아포토시스를 유도하기 위한, 상기 본 발명의 항 hDlk-1 항체 및/또는 항체-약제 복합체의 사용을 제공하는 것이기도 하다.

5. 종양의 검출 방법

본 발명의 종양의 검출 방법 (종양의 진단 방법이어도 된다) 은 상기 본 발명의 항 hDlk-1 항체와, 생체로부터 채취된 시료 (이하, 생체 시료) 를 반응시키고, 반응한 항체의 시그널을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법이다.

전술한 바와 같이, hDlk-1 은 각종 종양 세포에 있어서 특이적으로 발현하는 것이 확인되고 있기 때문에, hDlk-1, 특히 유리 hDlk-1 (hDlk-1 의 세포 외 영역 부분) 은 각종 종양 마커로서 이용하는 것이 가능하다. 그 중에서도, 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암 및 인간 췌장암의 마커로서 이용하는 것이 바람직하다.

그래서, 본 발명의 항 hDlk-1 항체를 생체 시료와 반응시키고, 반응한 항체의 시그널을 검출함으로써, 종양을 검출할 수 있다. 얻어진 항체의 시그널은 생체 시료 중의 항원량 (즉 hDlk-1 량 또는 유리 hDlk-1 량) 의 지표가 된다. 본 발명의 항체를 사용한 종양의 검출은, 먼저, 검체로서 피험자로부터 채취한 생체 시료, 예를 들어 검사 대상으로 하는 조직편 또는 혈액 등과, 본 발명의 항체를, 항원 항체 반응에 의해 결합시킨다. 이어서, 결합한 항체량의 측정 결과에 기초하여, 생체 시료 중의 목적으로 하는 항원량을 측정함으로써 실시한다. 당해 측정은 공지된 면역학적 측정법에 따라 실시하면 되고, 예를 들어, 면역 침강법, 면역 응집법, 표식 면역 측정법, 면역비 현탁법, 웨스턴 블롯법, 플로사이트메트리법 등을 사용할 수 있다. 표식 면역 측정법에서는, 항체의 시그널은, 표식 항체를 사용하여 직접 검출한 표식량으로 나타내는 것 외에, 이미 알려진 농도 혹은 이미 알려진 항체가의 항체를 표준액으로서 상대적으로 나타내도 된다. 즉, 표준액과 검체를 측정계에 의해 측정하고, 표준액의 값을 기준으로 하여 생체 시료 중의 항체 시그널을 상대적으로 나타낼 수 있다. 표식 면역 측정법으로서는, 예를 들어 ELISA 법, EI 법, RIA 법, 형광 면역 측정법 (FIA), 화학 발광 면역 측정법 (Luminescence immunoassay) 등을 들 수 있다. 그 중에서도 특히, ELISA 법이 간편하고 고감도라는 점에서 바람직하다.

본 발명에 있어서는, 상기 검출 방법에 의해 얻어진 검출 결과를 지표로 하여 종양의 상태를 평가 또는 진단할 수 있다. 예를 들어, 검출 결과가 소정의 기준치를 초과하는 것을 종양 양성, 소정의 기준치 이하의 것을 종양 음성으로 하고, 양성의 경우에는, 어느 것의 종양을 발증하고 있을 가능성이 있다고 판단하여, 종양의 상태를 평가할 수 있다. 여기서, 종양의 상태란, 종양의 이환의 유무 또는 그 진행도를 의미하고, 종양의 발증의 유무, 진행도, 악성도, 전이의 유무 및 재발의 유무 등을 들 수 있다.

상기 평가에 있어서, 종양의 상태로서는 1 개를 선택해도 되고, 복수개를 조합하여 선택해도 된다. 종양의 유무의 평가는, 얻어진 검출 결과에 기초하여, 소정의 기준치를 경계로 하여 종양에 이환하고 있는지의 여부를 판단함으로써 실시할 수 있다. 종양의 악성도는 암이 어느 정도 진행되고 있는지를 나타내는 지표가 되는 것이며, 검출 결과에 기초하여, 병기 (Stage) 를 분류하여 평가하거나 혹은 조기암이나 진행암을 분류하여 평가하거나 하는 것도 가능하다. 예를 들어, 검출 결과를 지표로 하여 조기암 또는 진행암이라고 평가할 수도 있다. 종양의 전이는, 검출 결과를 지표로 하여, 원발소의 위치에서 떨어진 부위에 신생물이 출현하고 있는지의 여부에 의해 평가할 수 있다. 재발은 간헐기 또는 관해 후에 검출 결과가 다시 소정의 기준치를 초과하였는지의 여부에 의해 평가할 수 있다.

6. 종양의 검출용 또는 진단용 키트, 및 종양의 치료용 또는 종양 세포의 아포토시스 유도용 키트

본 발명의 항 hDlk-1 항체는 종양의 검출용 키트 또는 종양의 진단용 키트의 형태로 제공할 수 있다. 또, 본 발명의 항 hDlk-1 항체 및 항체-약제 복합체는 종양의 치료용 키트 또는 종양 세포의 아포토시스 유도용 키트의 형태로 제공할 수 있다.

본 발명의 키트는 항체를 포함하지만, 그 외에, 표식 물질, 혹은 항체 또는 그 표식물을 고정한 고상화 시약 등을 포함할 수 있다. 항체의 표식 물질이란, 효소, 방사성 동위체, 형광 화합물 및 화학 발광 화합물 등에 의해 표식된 것을 의미한다. 본 발명의 키트는, 상기의 구성 요소 외에, 본 발명의 검출을 실시하기 위한 다른 시약, 예를 들어 표식물이 효소 표식물의 경우에는, 효소 기질 (발색성 기질 등), 효소 기질 용해액, 효소 반응 정지액, 혹은 검체용 희석액 등을 포함하고 있어도 된다. 또, 각종 버퍼, 멸균수, 각종 세포 배양 용기, 각종 반응 용기 (엡펜도르프 튜브 등), 블로킹제 (Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk, 염소 혈청 등의 혈청 성분), 세정제, 계면 활성제, 각종 플레이트, 아지화나트륨 등의 방부제, 및 실험 조작 매뉴얼 (설명서) 등을 포함하고 있어도 된다.

본 발명의 키트는 전술한 본 발명에 관련된 종양의 검출 방법, 혹은, 본 발명에 관련된 종양의 치료 방법 또는 종양 세포의 아포토시스 유도 방법 등을 실시하기 위해서 유효하게 사용할 수 있어, 매우 유용성이 높은 것이다.

이하에, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.

〔실시예 1〕

마우스 항인간 Dlk-1 모노클로날 항체 (클론 BA-1-3D) 의 항체 유전자의 클로닝과 가변 영역 배열의 결정

마우스 항인간 Dlk-1 모노클로날 항체로서, WO 2008/056833 (전게 특허문헌 4) 및 WO 2009/116670 (전게 특허문헌 5) 에 있어서, 현저한 종양 생장 저해 활성이 나타난 클론 BA-1-3D (마우스 IgG2a) (이하, 마우스 BA-1-3D) 를 사용했다. 마우스 BA-1-3D 를 산생하는 하이브리도마는 「Mouse-Mouse hybridoma BA-1-3D」 라고 칭하고, 2011 년 2 월 1 일부로, 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 ((우) 305-8566 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 중앙 제 6) 에 기탁했다 (수탁 번호 ： FERM BP-11337).

상기 마우스 BA-1-3D 산생 하이브리도마는 20 ％ 소 태아 혈청 (FBS ; HyClone), 1 mM 피루브산나트륨, 100 units/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 및 1x Hybridoma Fusion and Cloning Supplement (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) 를 포함하는 RPMI-1640 배지에서, 37 ℃, 7.5 ％ CO₂ 인큐베이터에서 배양했다. 10⁷ 개의 하이브리도마로부터, TRIzol 시약 (Invitrogen) 을 사용하여 전체 RNA 를 추출한 후, SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, Mountain View, CA) 를 사용하여, 그 키트 첨부의 방법에 따라, 올리고 dT 프라이머를 사용하여 cDNA 를 합성했다. 마우스 BA-1-3D 의 H 사슬 가변 영역 (VH) 및 L 사슬 가변 영역 (VL) 을 코드하는 유전자는 상기 합성 후의 cDNA 를 주형으로 하여, Phusion DNA polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA) 를 사용하여, PCR 법에 의해 클로닝했다. 이 때, 5'-프라이머로서는, 키트에 첨부되어 있는 Universal Primer A Mix (UPM) 또는 Nested Universal Primer A (NUP) 를 사용했다. 또, VH 증폭용 3'-프라이머로서는, 마우스 γ2a 정상 영역에 상보적인 배열을 갖는 것을 사용하고, VL 증폭용 3'-프라이머로서는, 마우스 κ 정상 영역에 상보적인 배열을 갖는 것을 사용했다.

5'-프라이머 (F 프라이머 ； Universal Primer A Mix (UPM)) ：

Long ：

5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' (배열 번호 3)

Short ：

5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (배열 번호 4)

5'-프라이머 (F 프라이머 ； Nested Universal Primer A (NUP)) ：

5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' (배열 번호 5)

3'-프라이머 (R 프라이머) ：

VH ： 5'-GCCAGTGGATAGACCGATGG-3' (배열 번호 6)

VL ： 5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3' (배열 번호 7)

상기 각 프라이머를 사용한 PCR 은 이하의 반응액 조성 및 반응 조건에서 실시했다.

＜반응액 조성＞

주형 cDNA : 2.5 ㎕

5 × PrimeSTAR 버퍼 (Mg²⁺ plus) : 10 ㎕

2.5 mM dNTP : 4 ㎕

Phusion DNA polymerase (2.0 U/㎕) : 0.5 ㎕

10 × UPM or NUP : 5 ㎕

R 프라이머 (10 μM) : 1 ㎕

멸균수 ： 27 ㎕

합계 ： 50 ㎕

＜반응 조건＞

94 ℃ (10 sec) 반응시킨 후, 「열변성·해리 ： 98 ℃ (10 sec) → 어닐링 ： 60 ℃ (5 sec) → 합성·신장 ： 72 ℃ (60 sec)」 를 1 사이클로 하여 합계 30 사이클 반응시킨 후, 마지막으로 72 ℃ (3 min) 반응시켰다.

합성한 마우스 BA-1-3D 의 VH 및 VL (BA-1-3D VH, BA-1-3D VL) 의 cDNA 를, pCR-BluntII-TOPO 벡터 (Invitrogen) 에 서브 클로닝하여, 염기 배열을 결정했다. 복수의 VH 클론 및 VL 클론의 염기 배열을 해독하여, 마우스 H 사슬 및 L 사슬의 가변 영역에 전형적인 염기 배열을 동정했다. 도 1 및 도 2 에, BA-1-3D VH 및 BA-1-3D VL 의 콘센서스 cDNA 염기 배열, 그리고 추정 아미노산 배열을 나타냈다.

〔실시예 2〕

마우스 - 인간 키메라 BA-1-3D IgG1/κ 발현 벡터의 구축

BA-1-3D VH 를 코드하는 유전자 (BA-1-3D VH 유전자) 는 마우스 생식 세포 계열 JH4 배열 유래의 스프라이스 공여 시그널과, 양단에 적절한 제한 효소 부위를 부가한 액슨으로서 제작했다. 구체적으로는, BA-1-3D VH 유전자의 cDNA 를 주형으로 하여 PCR 법을 사용하여 합성했다. 이 때, 5'-프라이머는 동물 세포 발현 벡터에 삽입하기 위한 제한 효소 부위로서 SpeI 사이트를 부가한 것을 사용하고, 3'-프라이머에는 동 HindIII 사이트를 부가한 것을 사용했다.

5'-프라이머 (F 프라이머) ：

5'-GCAACTAGTACCACCATGGGTTGGAGCTGTATC-3'(배열 번호 8)

(밑줄 ： SpeI 사이트)

3'-프라이머 (R 프라이머) ：

5'-GGGAAGCTTGAGAGGCCATTCTTACCTGAGGAGACGGTGACTGAGGT-3'(배열 번호 9)

(밑줄 ： HindIII 사이트)

상기 각 프라이머 (배열 번호 8, 9) 를 사용한 PCR 은 이하의 반응액 조성 및 반응 조건에서 실시했다.

＜반응액 조성＞

주형 cDNA ： 1.0 ㎕

5 × PrimeSTAR 버퍼 (Mg²⁺ plus) ： 10 ㎕

2.5 mM dNTP ： 4 ㎕

Phusion DNA polymerase (2.0 U/㎕) ： 0.5 ㎕

F 프라이머 (10 μM) ： 3 ㎕

R 프라이머 (10 μM) ： 1.0 ㎕

멸균수 ： 30.5 ㎕

합계 ： 50 ㎕

＜반응 조건＞

「열변성·해리 ： 98 ℃ (10 sec) → 어닐링 ： 57 ℃ (10 sec) → 합성·신장 ： 72 ℃ (60 sec)」 를 1 사이클로 하여 합계 35 사이클.

동일하게, BA-1-3D VL 을 코드하는 유전자 (BA-1-3D VL 유전자) 는 마우스 생식 세포 계열 Jκ5 배열 유래의 스프라이스 공여 시그널과, 양단에 적절한 제한 효소 부위를 부가한 액슨으로서 제작했다. 구체적으로는, BA-1-3D VL 유전자의 cDNA 를 주형으로 하여 PCR 법을 사용하여 합성했다. 이 때, 5'-프라이머는 동물 세포 발현 벡터에 삽입하기 위한 제한 효소 부위로서 NheI 사이트를 부가한 것을 사용하고, 3'-프라이머에는 동 EcoRI 사이트를 부가한 것을 사용했다.

5'-프라이머 (F 프라이머) ：

5'-GCTGCTAGCACCACCATGGAATCACAGACCCAG-3'(배열 번호 10)

(밑줄 ： NheI 사이트)

3'-프라이머 (R 프라이머) ：

5'-GCAGAATTCAGAAAAGTGTACTTACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCC-3'(배열 번호 11)

(밑줄 ： EcoRI 사이트)

상기 각 프라이머 (배열 번호 10, 11) 를 사용한 PCR 은 이하의 반응액 조성 및 반응 조건에서 실시했다.

＜반응액 조성＞

주형 cDNA ： 1.0 ㎕

5 × PrimeSTAR 버퍼 (Mg²⁺ plus) ： 10 ㎕

2.5 mM dNTP ： 4 ㎕

Phusion DNA polymerase (2.0 U/㎕) ： 0.5 ㎕

F 프라이머 (10 μM) ： 3 ㎕

R 프라이머 (10 μM) ： 1.0 ㎕

멸균수 ： 30.5 ㎕

합계 ： 50 ㎕

＜반응 조건＞

「열변성·해리 ： 98 ℃ (10 sec) → 어닐링 ： 57 ℃ (10 sec) → 합성·신장 ： 72 ℃ (60 sec)」 를 1 사이클로 하여 합계 35 사이클.

이상과 같이 하여 제작된, 액슨으로서의 기능을 가지는 BA-1-3D VH 유전자 및 BA-1-3D VL 유전자를 각각 도 3 및 도 4 에 나타냈다.

제작한 상기 BA-1-3D VH 유전자 및 BA-1-3D VL 유전자를 pCR-BluntII-TOPO 벡터 (Invitrogen) 에 서브 클로닝하여, 배열의 확인을 실시한 후, BA-1-3D VH 유전자의 삽입에는 SpeI/HindIII 부위를 사용하고, BA-1-3D VL 유전자의 삽입은 NheI/EcoRI 부위를 사용하여, 인간 γ1 사슬 및 κ 사슬의 정상 영역을 포함하는 동물 세포 발현 벡터 (도 5) 에 삽입하고, 마우스-인간 키메라 BA-1-3D IgG1/κ 항체 (ChBA-1-3D) 발현 벡터 (pChBA-1-3D) 를 제작했다.

〔실시예 3〕

인간형화 BA-1-3D VH 및 VL 유전자의 제작

BA-1-3D VH 및 BA-1-3D VL 의 인간형의 디자인은 Queen 들의 방법에 따라 이하와 같이 실시했다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 10029-10033, 1989). 먼저, BA-1-3D 항체의 가변 영역의 입체 구조의 분자 모델링을 컴퓨터로 실시하여, CDR 구조의 형성에 중요한 프레임 워크 배열 중의 아미노산을 동정했다. 병행하여 인간 항체 유전자의 가변 영역 배열과의 호몰로지 검색에 의해, BA-1-3D VH 의 인간형화에 필요한 프레임 워크 (FR) 배열을 제공하는 억셉터로서, GenBank accession number ： U00503 의 cDNA (U00503 VH) (Huang and Stollar, J. Immunol. 151 : 5290, 1993) 를 선택했다. 동일하게, BA-1-3D VL 의 인간형화에 필요한 프레임 워크 (FR) 배열을 제공하는 억셉터로서, GenBank accession number ： Z46622 의 cDNA (Z46622 VL) (Giachino et al., J. Exp. Med. 181 : 1245, 1995) 를 선택했다.

BA-1-3D VH 의 인간형화에서는, 먼저 BA-1-3D VH 의 CDR 배열을 억셉터인 U00503 VH 의 대응하는 위치에 이식했다. 다음으로, 마우스 BA-1-3D 의 가변 영역의 컴퓨터 모델링에 의한 입체 구조 해석에 의해, BA-1-3D VH 의 CDR 에 인접하고, 그 구조 유지에 중요한 역할을 다하고 있다고 생각되는 FR 배열 중의 아미노산 잔기 (48 번째의 이소류신 (I), 66 번째의 리신 (K), 67 번째의 알라닌 (A), 71 번째의 발린 (V)) 에 대해서는 BA-1-3D VH 의 것을 유지하고, 그 이외의 FR 영역을 억셉터 배열로 치환했다. VH 의 아미노산 잔기 위치 번호는 Kabat 들의 정의 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U. S. Department of Health and Human Services, 1991) 에 준거했다. 이와 같이 하여 제작된 인간형화 BA-1-3D 의 VH 를 HuBA-1-3D VH1 로 했다.

BA-1-3D VH 에 있어서의 66 번째의 리신 (K) 은 CDR 배열에 인접하고 있지만, 더욱 자세한 BA-1-3D 가변 영역의 컴퓨터 모델링에 의한 해석의 결과, HuBA-1-3D VH1 에 있어서의 66 번째의 리신 (K) 은, U00503 VH 의 대응하는 위치의 아르기닌 (R) 에, 항원과의 친화성을 저해하는 일 없이 치환 가능한 것이 시사되었다. 그래서, 항원성 (potential immunogenicity) 을 경감하는 목적으로, HuBA-1-3D VH1 의 66 번째의 리신 (K) 을 아르기닌 (R) 으로 치환한 인간형화 BA-1-3D 의 VH 도 아울러 제작했다. 당해 치환 후의 인간형화 BA-1-3D 의 VH 를 HuBA-1-3D VH2 로 했다.

BA-1-3D VH, HuBA-1-3D VH1, HuBA-1-3D VH2 및 U00503 VH 의 아미노산 배열 얼라이먼트를 도 6 에 나타냈다.

BA-1-3D VL 의 인간형화에 대해서도 동일하게, BA-1-3D VL 의 CDR 배열을 억셉터인 Z46622 VL 의 대응하는 위치에 이식했다. 다음으로, 마우스 BA-1-3D 의 가변 영역의 컴퓨터 모델링에 의한 입체 구조 해석에 의해, BA-1-3D VL 의 CDR 에 인접하고, 그 구조 유지에 중요한 역할을 다하고 있다고 생각되는 FR 배열 중의 아미노산 잔기 (48 번째의 발린 (V)) 는 BA-1-3D VL 의 것을 유지하고, 그 이외의 FR 영역을 억셉터 배열로 치환했다. VL 의 아미노산 잔기 위치 번호는 Kabat 들의 정의 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U. S. Department of Health and Human Services, 1991) 에 준거했다. 이와 같이 하여 제작된 인간형화 BA-1-3D 의 VL 을 HuBA-1-3D VL 로 했다.

BA-1-3D VL, HuBA-1-3D VL 및 Z46622 VL 의 아미노산 배열 얼라이먼트를 도 7 에 나타냈다.

HuBA-1-3D VH1 및 HuBA-1-3D VH2 를 코드하는 유전자는 각각 마우스 BA-1-3D VH 의 시그널 펩티드, 인간 생식 세포 계열 JH3 배열 유래의 스프라이스 공여 시그널을 포함하고, 또 동물 세포 유전자 발현 벡터에 삽입하기 위한 적절한 제한 효소 부위를 양단에 부가한 (5' 말단측에 SpeI, 3' 말단측에 HindIII) 액슨으로서 유전자 합성 (GenScript USA , Piscataway, NJ) 에 의해 제작했다. 이와 같이 제작한 HuBA-1-3D VH1 유전자 및 HuBA-1-3D VH2 유전자의 유전자 배열, 그리고, HuBA-1-3D VH1 및 HuBA-1-3D VH2 의 아미노산 배열을 각각 도 8 및 도 9 에 나타냈다.

마찬가지로, HuBA-1-3D VL 을 코드하는 유전자는 마우스 BA-1-3D VL 의 시그널 펩티드, 인간 생식 세포 계열 Jκ2 배열 유래의 스프라이스 공여 시그널을 포함하고, 또 동물 세포 유전자 발현 벡터에 삽입하기 위한 적절한 제한 효소 부위를 양단에 부가한 (5' 말단측에 NheI, 3' 말단측에 EcoRI) 액슨으로서 유전자 합성 (GenScript USA , Piscataway, NJ) 에 의해 제작했다. 이와 같이 제작한 HuBA-1-3D VL 유전자의 유전자 배열, 및, HuBA-1-3D VL 의 아미노산 배열을 도 10 에 나타냈다.

다음으로, HuBA-1-3D VH1 및 VH2 유전자의 삽입에는 SpeI/HindIII 부위를 사용하고, HuBA-1-3D VL 유전자의 삽입에는 NheI/EcoRI 부위를 사용하여, 각각, 인간 γ1 사슬 및 κ 사슬의 정상 영역을 포함하는 동물 세포 발현 벡터 (도 5) 에 삽입했다. 구체적으로는, HuBA-1-3D VH1 유전자와 HuBA-1-3D VL 유전자의 조합, 및, HuBA-1-3D VH2 유전자와 HuBA-1-3D VL 유전자의 조합으로, 각각 상기 발현 벡터에 삽입했다. 이와 같이 하여, HuBA-1-3D VH1 및 HuBA-1-3D VL 로 구성되는 인간형화 BA-1-3D IgG1/κ 항체 (HuBA-1-3D-1) 를 발현하는 발현 벡터 (pHuBA-1-3D-1), 그리고, HuBA-1-3D VH2 및 HuBA-1-3D VL 로 구성되는 인간형화 BA-1-3D IgG1/κ 항체 (HuBA-1-3D-2) 를 발현하는 발현 벡터 (pHuBA-1-3D-2) 를 제작했다.

〔실시예 4〕

마우스-인간 키메라 BA-1-3D 항체 (ChBA-1-3D), 및, 인간형화 BA-1-3D 항체 (HuBA-1-3D-1, HuBA-1-3D-2) 의 안정 산생 NS0 세포주의 제작

마우스 미엘로마 세포주 NS0 (European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UK) 는 10 ％ 소 태아 혈청을 포함하는 DME 배지에서 37 ℃, 7.5 ％ CO₂ 인큐베이터에서 배양했다. ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 를 안정적으로 산생하는 세포주를 제작하기 위해서, 각각의 항체 유전자 발현 벡터 (pChBA-1-3D, pHuBA-1-3D-1 및 pHuBA-1-3D-2) 20 ㎍ (사전에 제한 효소 FspI 로 리니어라이즈한 것) 을 약 10⁷ 개의 NS0 세포에, Bebbington 들의 방법 (Bio/Technology 10 : 169-175, 1992) 에 따라, 일렉트로포레이션법으로 유전자 도입했다. 48 시간 후, 선택 배지 (10 ％ FBS 함유 DME medium, HT media supplement (Sigma, St. Louis, MO), 0.25 mg/㎖ 크산틴, 및 1 ㎍/㎖ 미코페놀산) 로 교환하고, 약 10 일 후에 배양 상청 중의 항체 산생의 유무를 해석했다.

배양 상청 중의 ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 는 샌드위치 ELISA 법에 의해 검출 및 측정했다. 구체적으로는, 96 구멍 플레이트를 PBS 로 1/2,000 으로 희석한 goat anti-human IgG Fcγ-chain-specific polyclonal antibody (Sigma) 를 각 웰에 100 ㎕ 씩 첨가하여 4 ℃ 에서 하룻밤 코팅한 후, 세정 버퍼 (0.05 ％ Tween 20 을 포함하는 PBS) 로 세정했다. 다음으로, 블로킹 버퍼 (2 ％ 스킴 밀크와 0.05 ％ Tween 20 을 포함하는 PBS) 를 각 웰에 300 ㎕ 씩 첨가하여 30 분간, 실온에서 블로킹을 실시했다. 세정 버퍼로 세정한 후, 각 웰에 100 ㎕ 씩, ELISA 버퍼 (PBS containing 1 ％ Skim Milk and 0.025 ％ Tween 20) 로 적당한 희석 배율로 희석한 배양 상청을 첨가하여, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 표준품으로서는, 인간 또는 인간형화 IgG1/κ 항체를 사용했다. 세정 버퍼로 세정한 후, 검출용 항체로서, 각 웰에 100 ㎕ 씩, ELISA 버퍼로 1/2,000 으로 희석한 HRP-conjugated goat anti-human kappa chain polyclonal antibody (SouthernBiotech) 를 첨가하고, 실온에서 30 분간 반응시켰다. 세정 버퍼로 세정한 후, 각 웰에 100 ㎕ 씩 ABTS 기질을 첨가하여 발색 반응을 실시하고, 각 웰에 100 ㎕ 씩 2 ％ oxalic acid 를 첨가하여 반응을 정지한 후, 405 nm 의 흡광도를 측정했다.

ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 항체를 안정적으로 산생하는 NS0 세포주로서, 각각 NS0-ChBA-1-3D 2A4, NS0-HuBA-1-3D-1 2D2 및 NS0-HuBA-1-3D-2 3F7 을 수립하여, 무혈청 배지 (Hybridoma-SFM (Invitrogen)) 로 순화했다.

당해 NS0-ChBA-1-3D 2A4, NS0-HuBA-1-3D-1 2D2 및 NS0-HuBA-1-3D-2 3F7 의 각 NS0 세포주가 산생하는 항체의 H 사슬과 L 사슬의 배열은 cDNA 시퀀스에 의해 확인했다. 구체적으로는, 먼저, TRIzol 시약 (Invitrogen) 을 사용하여 각 세포주로부터 전체 RNA 를 추출하고, SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) 을 사용하여, 키트 첨부의 방법에 따라, 올리고 dT 프라이머를 사용하여 cDNA 를 합성했다. 이어서, 인간 γ1 사슬의 코딩 영역은, CMV2 와 JNT098 을 프라이머로서 PCR 로 증폭한 후, CMV2, JNT082, JNT097 및 JNT098 을 프라이머로서 시퀀스를 실시했다. 마찬가지로, 인간 κ 사슬의 코딩 영역은, CMV2 와 JNT026 을 프라이머로서 PCR 로 증폭한 후, CMV2 와 JNT026 을 프라이머로서 시퀀스를 실시했다. 또한, 상기 각 프라이머 (CMV2, JNT026, JNT082, JNT097 및 JNT098) 는 도 11 에 나타낸 염기 배열로 이루어지는 것이다.

그 결과, 상기 각 NS0 세포주가 산생하는 ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 의 H 사슬 및 L 사슬의 cDNA 배열은 pChBA-1-3D, pHuBA-1-3D-1 및 pHuBA-1-3D-2 의 각 벡터의 대응하는 cDNA 배열 (도 12 ∼ 16) 과 완전히 일치했다.

〔실시예 5〕

ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 의 정제

NS0-ChBA-1-3D 2A4, NS0-HuBA-1-3D-1 2D2 및 NS0-HuBA-1-3D-2 3F7 의 각 NS0 세포주를 롤러 보틀을 사용하여 배양했다. 배지는 Hybridoma-SFM (Invitrogen) 을 사용하여, 약 1 × 10⁶ cells/㎖ 의 세포 밀도에 도달한 단계에서, 1/10 양인 60 mg/㎖ Ultrafiltered Soy Hydrolysate (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) (SFM4MAb media (HyClone) 에 용해한 것) 를 첨가하여, 생세포가 50 ％ 이하가 될 때까지 배양을 실시했다. 배양 상청을 원심과 필트레이션으로 회수한 후, Protein-A Sepharose 칼럼 (HiTrap MABSelect SuRe, GE Healthcare, Piscataway, NJ) 에 배양 상청을 로드하고, PBS 로 칼럼을 세정한 후, 0.1 M 의 Glycine-HCl (pH3.0) 로 용출했다. 1 M Tris-HCl (pH8.0) 로 중화한 후, 투석에 의해 PBS 로 버퍼 치환을 실시했다. 항체의 농도는 280 nm 의 흡광도 측정에 의해 결정했다 (1 mg/㎖ = 1.4 OD). 각 NS0 세포주 500 ㎖ 의 배양에서의 항체의 수량은 ChBA-1-3D 가 6.1 mg, HuBA-1-3D-1 이 5.0 mg, HuBA-1-3D-2 가 3.8 mg 이었다.

정제한 ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 의 각 항체를 통상적인 방법에 따라, 환원하에서 SDS-PAGE 를 실시한 결과, 어느 항체에 대해서도, 약 50 kDa 의 H 사슬과 약 25 kDa 의 L 사슬의 밴드가 확인되었다 (도 17). 또, 어느 항체도, 정제 후의 순도는 95 ％ 이상이었다.

〔실시예 6〕

ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 의 캐릭터리제이션

ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 의 항원 (인간 Dlk-1) 과의 결합 활성에 대해, 3 종류의 상이한 포맷의 ELISA 를 사용하여 해석을 실시했다.

최초의 포맷의 ELISA 로서, 1 가의 항원 항체 반응을 해석하는 ELISA 를 실시했다. 96 구멍 플레이트에, PBS 로 1 ㎍/㎖ 로 희석한 ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 항체를 각각 100 ㎕/웰로 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 코팅을 실시했다. 세정 버퍼로 플레이트를 세정 후, 블로킹 버퍼로 블로킹한 후, 재차 세정 버퍼로 플레이트를 세정 후, hDlk-1 세포 외 영역의 리콤비넌트 단백질 (hDlk-1-His) (Nakamura and Tajima, US2009/0326205 A1) 을 1 ㎍/㎖ 의 농도로부터 2 배씩 희석의 희석 계열을 ELISA 버퍼로 제작하고, 100 ㎕/웰로 첨가하여 실온에서 1 시간 반응시켰다. 이어서, 세정 버퍼로 세정 후, ELISA 버퍼로 1/2,000 으로 희석한 HRP-conjugated mouse anti-His tag antibody (Hypromatrix, Worcester, MA) 를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 30 분간 반응시켰다. 세정 버퍼로 세정 후, 각 웰에 100 ㎕ 씩 ABTS 기질을 첨가하여 발색 반응을 실시하고, 각 웰에 100 ㎕ 씩 2 ％ oxalic acid 를 첨가하여 반응을 정지한 후, 405 nm 의 흡광도를 측정했다. 그 결과, hDlk-1-His 의 ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 와의 결합 커브는 완전히 겹치고 (도 18), HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 의 항원 친화성 (어피니티) 은 ChBA-1-3D 의 항원 친화성을 유지하고 있는 것이 나타나, BA-1-3D 의 인간형화가 성공한 것이 나타났다.

2 번째의 포맷의 ELISA 로서, 96 구멍 플레이트에, PBS 로 0.5 ㎍/㎖ 의 농도로 희석한 hDlk-1-His 를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 코팅하여, 세정 버퍼로 플레이트를 세정 후, 블로킹 버퍼로 블로킹한 후, 재차 세정 버퍼로 플레이트를 세정했다. ELISA 버퍼로 5 ㎍/㎖ 의 농도로부터 2 배 희석 계열을 제작한, ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 세정 버퍼로 세정한 후, ELISA 버퍼로 1/2,000 으로 희석한 HRP-conjugated goat anti-human kappa chain polyclonal antibody 를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 30 분간 반응시킨 후, 상기와 동일한 방법으로 발색 반응을 실시했다. 그 결과, ChBA-1-3D 의 EC₅₀ 값은 116 ng/㎖, HuBA-1-3D-1 의 EC₅₀ 값은 148 ng/㎖, HuBA-1-3D-2 의 EC₅₀ 값은 154 ng/㎖ 이며 (도 19), HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 의 어느 인간형화 항체도 ChBA-1-3D 와 동등한 항원 친화성 (어피니티) 을 나타냈다.

3 번째의 포맷의 ELISA 로서, 96 구멍 플레이트를 코팅하는 hDlk-1-His 의 농도를 1/10 으로 희석하고, 0.05 ㎍/㎖ 의 hDlk-1-His 를 100 ㎕/웰로 첨가하여 4 ℃ 에서 하룻밤 코팅하고, 저농도의 hDlk-1-His 로 코팅한 ELISA 플레이트를 제작했다. 그 이외는, 전술한 2 번째의 포맷의 ELISA 와 동일하게, ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 의 hDlk-1-His 와의 결합을 측정했다. 그 결과, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 의 결합 활성은, ChBA-1-3D 와 비교해서, 예기치 않게 저하되어 있었다 (도 20).

최초의 포맷의 ELISA 에서 나타낸 바와 같이, ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 의 hDlk-1-His 와의 1 가의 결합에는 서로 실질적인 상이가 없고 (도 18), 2 번째의 포맷의 ELISA 에서 나타낸 바와 같이, 고농도의 hDlk-1-His 를 코팅한 ELISA 에 있어서도 ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 의 hDlk-1-His 단백과의 결합에는 서로 실질적인 상이가 확인되지 않은 점에서 (도 18), 3 번째의 포맷의 ELISA 에서 나타낸 저농도의 hDlk-1-His 에 대한 HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 의 결합이 ChBA-1-3D 와 비교해서 저하된 결과 (도 20) 의 원인으로서는, 인간형화 항체에서는 항원과의 2 개의 결합 아암의 운동능에 관한 플렉시빌리티가 저하되고 있는 것에 의한, 아비디티 (Avidity ； 항원 결합 활성) 의 저하가 생각되었다. 2 번째의 포맷의 ELISA 의 경우와 같이, 항원의 밀도가 높은 경우에는, ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 는 모두 항원에 대해 2 가의 결합이 가능하기 때문에, 이들의 결합 활성은 동등하게 검출되지만 (도 19), 3 번째의 포맷의 ELISA 와 같이 항원 밀도가 낮은 경우에는, ChBA-1-3D 는 2 가의 항원 결합이 가능하지만, HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 는 아비디티가 저하되고 있기 때문에, 1 가에서의 항원 결합밖에 할 수 없고, 그 때문에 ChBA-1-3D 와 비교해서, 낮은 항원 결합을 나타냈다고 생각되었다.

〔실시예 7〕

인간형화 BA-1-3D 항체의 변이체의 제작과 캐릭터리제이션

HuBA-1-3D-1 및 HuBA-1-3D-2 의 아비디티의 저하가 VH 와 VL 중 어느 쪽에 원인이 있는지를 이하의 실험에서 검토했다. 먼저, pHuBA-1-3D-2 벡터의 NheI 와 EcoRI 의 제한 효소 부위에 끼워진 HuBA-1-3D VL 유전자의 단편 (도 10) 을 마우스 BA-1-3D VL 의 NheI-EcoRI 단편 (도 4) 으로 치환하고, HuBA-1-3D VH2 와 마우스 BA-1-3D VL 로 구성되는, 즉 인간형화 VH 와 마우스 VL (HuVH/MuVL) 로 구성되는 발현 벡터 (pHuVH2/MuVL) 를 제작했다. 다음으로, pHuBA-1-3D-2 벡터의 SpeI 와 HindIII 의 제한 효소 부위에 끼워진 HuBA-1-3D VH2 유전자의 단편 (도 9) 을 마우스 BA-1-3D VH 의 SpeI-HindIII 단편 (도 3) 으로 치환하고, 마우스 BA-1-3D VH 와 HuBA-1-3D VL 로 구성되는, 즉 마우스 VH 와 인간형화 VL (MuVH/HuVL) 로 구성되는 발현 벡터 (pMuVH/HuVL) 를 제작했다.

다음으로, pChBA-1-3D, pHuBA-1-3D-2, pHuVH2/MuVL 및 pMuVH/HuVL 의 각 발현 벡터를, 각각 Lipofectamine 2000 시약 (Invitrogen) 을 사용하여, 첨부 방법에 따라, HEK293 세포에 트랜스펙션을 실시하고, 10 ％ 소 태아 혈청을 포함하는 DME 배지에서 37 ℃, 7.5 ％ CO₂ 인큐베이터에서 수 일간 배양을 실시한 후, 배양 상청을 회수했다. 배양 상청 중의 항체 농도는 전술한 샌드위치 ELISA 로 측정했다. ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-2, HuVH2/MuVL 및 MuVH/HuVL 각각의 hDlk-1 과의 결합은 전술한 3 번째의 포맷의 ELISA (즉 0.05 ㎍/㎖ 의 농도로 hDlk-1-His 를 코팅한 ELISA) 로 측정했다. 그 결과, HuVH2/MuVL 및 HuBA-1-3D-2 의 hDlk-1-His 에 대한 결합은 약한데 대해, MuVH/HuVL 의 hDlk-1-His 에 대한 결합은 ChBA-1-3D 와 동일한 정도의 결합을 나타내고 (도 21), HuBA-1-3D VL 은 아비디티의 저하에는 기여하고 있지 않고, HuBA-1-3D VH 에 아비디티의 저하의 원인이 있는 것이 나타났다.

저하된 아비디티를 회복시키기 위해서, HuBA-1-3D VH1 의 아미노산의 치환을 실시했다. 도 6 에 나타낸 바와 같이, HuBA-1-3D VH1 과 마우스 BA-1-3D VH 의 아미노산 배열의 얼라이먼트에 있어서는, 아미노산 번호 (Kabat 들의 정의 (1991) 에 따라 부여) 가 5, 9, 11, 12, 13, 16, 20, 24, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 73, 75, 82a, 82b, 83, 85, 87, 89 및 108 번째의 합계 23 개의 아미노산이 양자간에 상이하다. 그래서, HuBA-1-3D VH1 중의 이들 아미노산 번호의 아미노산을 각각 대응하는 마우스 BA-1-3D VH 의 아미노산으로 치환한 변이체의 발현 벡터 (pHuBA1-3D-1 변이체) 를 제작했다.

또한, 도 6 의 얼라이먼트에 있어서의 아미노산 번호에서는, 예를 들어, 52 와 52a, 82 와 82a, 82b, 82c 와 같이, 동 52 나 82 에서도 구별되는 번호 (52a 나 82a 등) 도 부여되어 있다 (이 점은 도 22 에 있어서도 동일하다.). 따라서, 도 6 (및 도 22) 에 있어서의 아미노산 번호와, 각 도면 중의 VH 의 성숙 펩티드의 아미노산 배열 (배열 번호 15, 35, 40, 67, 73) 에 있어서의 아미노산 번호에는, 차이가 생긴다. 본원 명세서 및 도면에 있어서는, 치환한 아미노산의 번호는 도 6 (및 도 22) 에 있어서의 아미노산 번호의 기재에 기초하여 표기하기 때문에 (T73K 등), 예를 들어, 도 6 (및 도 22) 에 있어서의 73 번째의 아미노산은 도 1, 8 및 9 의 VH 의 성숙 펩티드의 아미노산 배열 (배열 번호 15, 35 및 40) 에 있어서는 74 번째의 아미노산에 대응한다 (다른 아미노산 번호의 아미노산이나, VL 의 아미노산 번호에 대해서도 동일).

여기서, 각 아미노산 치환 변이체는, 유전자 재조합 기술에 관한 당업자의 기술 상식에 기초하여, 그것을 코드하는 DNA 에 의해 조제할 수 있다. 각 치환 변이체를 조제하기 위해서 DNA 에 변이를 도입하려면, Kunkel 법이나 Gapped duplex 법 등의 공지 수법에 의해, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예를 들어 GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System (인비트로젠사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Prime STAR (등록상표) Mutagenesis Basal kit, Mutan (등록상표)-Super Express Km 등 ： 다카라 바이오사 제조) 을 사용하여 실시할 수 있다. 각 치환 변이체의 발현 벡터는, 예를 들어, pHuBA1-3D-1 벡터 중의 HuBA-1-3D VH1 을 코드하는 DNA 에 변이 도입함으로써 조제할 수 있다.

도 22 에, 제작한 23 종류의 HuBA-1-3D VH1 변이체의 각각의 명칭 (V5Q ∼ T73K/T75S) 과 아미노산 배열 (HuBA-1-3D VH1 의 아미노산 배열과 상이한 아미노산만 표시) 을 나타냈다.

각 pHuBA-1-3D-1 변이체의 발현 벡터를, 각각 HEK293 세포에 트랜스펙션하고, 배양 상청을 사용하여, 각 아미노산 치환 항체의 hDlk-1 과의 결합 활성을, 3 번째의 포맷의 ELISA (즉 저농도 (0.05 ㎍/㎖) 의 hDlk-1-His 를 코팅한 ELISA) 로 측정했다. 23 종류의 HuBA-1-3D VH1 변이체 중, 아미노산 번호가 73 번째의 트레오닌 (T) 을 리신 (K) 으로 치환한 T73K 변이체 (HuBA-1-3D-1-T73K) 가 부분적이지만, 분명한 항원 결합 활성의 회복이 확인되고, 또, 아미노산 번호가 24 번째의 알라닌 (A) 을 글리신 (G) 으로 치환한 A24G 변이체 (HuBA-1-3D-1-A24G) 에서도 항원 결합 활성의 회복이 확인되었다 (도 23). 그 밖의 21 종류의 변이체에서는, HuBA-1-3D-1 과 비교해서, 항원 결합의 회복은 확인되지 않거나, 극히 조금 확인되는 정도였다.

또한, HuBA-1-3D-1 에서 저하되어 있던 아비디티를 회복시키기 위해서, A24G 와 T73K 의 아미노산 치환을 조합한 2 아미노산 치환 (A24G/T73K) 을 실시한 변이체를 제작했다 (도 22). 또, 5 번째의 아미노산 (V) 과 75 번째의 아미노산 (T) 은, 가변 영역의 삼차원 구조에 있어서, 73 번째의 아미노산에 근접하여 위치하고 있고, 또 11 번째의 아미노산 (V) 은 γ 사슬의 VH 와 CH 사이의 ball-and-socket joint 에 포함되는 것이 이전에 보고되었기 때문에 (Landolfi et al. J. Immunol. 166 : 1748, 2001), T73K 와 조합하여 5 번째, 11 번째, 75 번째의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한 변이체 (V5Q/T73K, V11L/T73K 및 T73K/T75S) 도 아울러 제작했다 (도 22). 또한, 이들 각 아미노산 치환 변이체, 및 그들의 발현 벡터의 조제는 전술한 23 종의 각 아미노산 치환 변이체 등의 조제와 동일한 방법으로 실시했다.

상기 4 종류의 2 아미노산 치환 변이체 (HuBA-1-3D-1-A24G/T73K, HuBA-1-3D-1-V5Q/T73K, HuBA-1-3D-1-V11L/T73K 및 HuBA-1-3D-1-T73K/T75S) 의 발현 벡터 (pHuBA-1-3D-1-A24G/T73K, pHuBA-1-3D-1-V5Q/T73K, pHuBA-1-3D-1-V11L/T73K 및 pHuBA-1-3D-1-T73K/T75S) 와, pChBA-1-3D 및 pHuBA-1-3D-1 의 발현 벡터를 각각 HEK293 세포에 트랜스펙션하고, 배양 상청을 사용하여, 각 아미노산 치환 항체의 hDlk-1 과의 결합 활성을 3 번째의 포맷의 ELISA (즉 저농도 (0.05 ㎍/㎖) 의 hDlk-1-His 를 코팅한 ELISA) 로 측정했다. 그 결과, 상기 4 종류의 변이체 중, A24G/T73K 변이체 (HuBA-1-3D-1-A24G/T73K) 가, ChBA-1-3D 와 동등한, 강한 hDlk-1-His 와의 결합을 나타내고 (도 23), 다른 3 종류의 변이체는 1 아미노산 치환의 변이체인 T73K 변이체 (HuBA-1-3D-1-T73K) 와 비교해서 거의 개선은 확인되지 않았다.

〔실시예 8〕

HuBA-1-3D-1-T73K 및 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 발현, 정제 그리고 캐릭터리제이션

변이형 항체인 HuBA-1-3D-1-T73K 및 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 발현 벡터 (pHuBA-1-3D-1-T73K 및 pHuBA-1-3D-1-A24G/T73K) 를, 실시예 4 에서 기술한 방법과 동일한 방법으로 NS0 세포에 트랜스펙션하고, 안정적으로, HuBA-1-3D-1-T73K 를 산생하는 NS0 세포주 (NS0-HuBA-1-3D-1-T73K 3E12) 와, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 를 산생하는 NS0 세포주 (NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 2G3, NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 5C7 및 NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 5F9) 를 수립하여, 무혈청 배지 (Hybridoma-SFM (Invitrogen)) 로 순화했다.

이들 NS0-HuBA-1-3D-1-T73K 3E12, NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 2G3, NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 5C7 및 NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 5F9 의 각 NS0 세포주가 산생하는 항체의 H 사슬과 L 사슬은 실시예 4 에서 기술한 방법과 동일한 방법으로 cDNA 시퀀스에 의해 배열을 확인했다. 상기 각 NS0 세포주가 산생하는 HuBA-1-3D-1-T73K 및 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 H 사슬 및 L 사슬의 cDNA 배열은, 각각, pHuBA-1-3D-1-T73K 벡터 및 pHuBA-1-3D-1-A24G/T73K 벡터의 대응하는 cDNA 배열 (도 16, 24, 25) 과 완전히 일치했다.

NS0-HuBA-1-3D-1-T73K 3E12 세포와 NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 2G3 세포를, Hybridoma SFM 배지에서, 실시예 5 에서 기술한 방법과 동일한 방법으로 배양하고, 배양 상청으로부터 Protein A 칼럼을 사용하여, HuBA-1-3D-1-T73K 와 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 를 정제했다. 정제한 HuBA-1-3D-1-T73K 와 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 를 비환원 조건으로 SDS-PAGE 로 전개한 결과, 약 50 kDa 의 H 사슬과 약 25 kDa 의 L 사슬이 확인되고 (도 17), 각각의 항체의 순도는 95 ％ 이상이었다.

다음으로, 정제한 ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1, HuBA-1-3D-1-T73K 및 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 항원과의 아비디티 (Avidity ； 항원 결합 활성) 를, hDlk-1-His 를 0.05 ㎍/㎖ 의 저농도로 96 구멍 플레이트에 코팅한 상기 3 번째의 포맷의 ELISA 에 의해 해석을 실시했다. 그 결과, HuBA-1-3D-1-T73K 의 항원 결합 활성은 HuBA-1-3D-1 보다 활성이 강하지만, ChBA-1-3D 항체보다는 약했다. 한편, HuBA-1-3D-A24G/T73K 에서는, EC₅₀ 값은 35.5 ng/㎖ 로, ChBA-1-3D 의 EC₅₀ 값인 25.4 ng/㎖ 와 가까운 값을 나타낸 점에서, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 에서는, HuBA-1-3D-1 에서 저하되어 있던 아비디티가 개선되어, ChBA-1-3D 와 동등한 항원 결합 활성을 획득한 것이 나타났다 (도 26).

〔실시예 9〕

HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 고산생 NS0 세포주의 제작

pHuBA-1-3D-1-A24G/T73K 벡터의 NS0 세포에의 트랜스펙션과 안정 세포주의 구축, 무혈청 배지 (Hybridoma SFM) 로의 순화는 실시예 4 및 실시예 8 과 마찬가지로 실시했다. 수립한 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 항체 고산생 NS0 세포의 하나인 NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 8A3 을, 250 ㎖ 의 플라스틱 삼각 플라스크를 사용하여, 2 mM L-글루타민, 0.1 ％ pluronic F-68 용액 (Sigma) 을 포함하는 Hybridoma SFM 배지 40 ㎖ 에서, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 인큐베이터 내에서 회전수 100 rpm 의 로터리 쉐이커에 의해 배양을 실시했다.

세포 밀도가 약 2 x 10⁶/㎖ 에 도달한 시점에서 1/10 양인 35 mg/㎖ Cell Boost 4 (HyClone) 와 0.1 ％ pluronic F-68 용액을 배지에 첨가했다. 게다가 2 일 후, 1/10 양의 SFM4MAb 배지 (HyClone) 로 희석한 60 mg/㎖ Ultrafiltered Soy Hydrolysate (Irvine Scientific) 와 0.1 ％ pluronic F-68 용액을 배지에 첨가하고, 생세포율이 50 ％ 이하가 될 때까지 배양을 실시했다. 배양 상청 중의 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 농도는 73 ㎍/㎖ 였다.

NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 8A3 세포가 산생하는 항체의 H 사슬 및 L 사슬은 실시예 4 에서 기술한 방법과 동일한 방법으로 cDNA 시퀀스에 의해 배열을 확인하고, pHuBA-1-3D-1-A24G/T73K 벡터의 대응하는 cDNA 배열 (도 16, 25) 과 완전히 일치했다.

〔실시예 10〕

HuBA-1-3-D-1-A24G/T73K 의 항원 결합 안정성의 검토

변이형 항체인 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 항원 결합 안정성에 대해, 액제 중에서의 가속 시험, 및 필리핀 원숭이 혈장 중에서의 보존 시험에 의해 검토했다.

먼저, 액제 중에서의 가속 시험은 이하와 같이 실시했다. HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 를 pH 가 상이한 3 종류의 버퍼 중에서 40 ℃, 1 개월간 보존했다. 사용한 버퍼는 10 mM 글루탐산나트륨 (Wako), 262 mM D-소르비톨 (Wako), 0.05 mg/㎖ 폴리소르베이트 80 (Wako) 을 포함하는 용액으로, pH 를 4.0, 5.5 및 7.0 의 3 종류로 조제했다. 각 pH 의 버퍼에 있어서의 항체 농도는 0.977 mg/㎖ (pH4.0), 0.996 mg/㎖ (pH5.5) 및 0.959 mg/㎖ (pH 7.0) 로 40 ℃ 보존을 개시했다. 보존 종료 후, 각 샘플은 항원 결합 활성 측정까지 -80 ℃ 에서 보존했다. 또, 활성 표준품은 40 ℃, 1 개월 보존 전의 항체 용액을 -80 ℃ 에서 보존하고 있던 샘플을 사용했다. 항원 결합 활성의 측정은 FACS 해석 및 항원 고상화 ELISA 법에 의해 실시했다. FACS 해석은 HEK293 세포에 인간 전체 길이 Dlk-1 유전자를 안정적으로 발현시킨 HEK293-hDlk-1 세포를 사용하여 실시했다 (Nakamura and Tajima, US2009/0326205 A1). 트립신 처리에 의해 배양 접시로부터 벗기고, 5 x 10⁵ cells 의 세포 현탁액에 대해, 1 차 항체로서, 가속 시험 샘플 및 활성 표준품을 10 ％ FCS 를 포함하는 배지에서 10, 3, 1, 0.3 및 0.1 ㎍/㎖ 로 희석한 항체 용액 100 ㎕ 를 첨가하고, 4 ℃ 에서 20 분간 인큐베이션했다. 그 후, 1 ㎖ 의 10 ％ FCS 를 포함하는 배지로 세정하고, 비오틴 표식 항인간 IgG Fc 항체 (Rockland) 를 2,000 배 희석하고 또한 스트렙트아비딘 표식 PE (BD Pharmingen) 를 500 배 희석한 2 차 항체 용액 100 ㎕ 를 첨가했다. 4 ℃ 에서 20 분간 인큐베이션한 후, 다시 1 ㎖ 의 10 ％ FCS 를 포함하는 배지로 세정했다. 그 후, 표식 세포를 포함하는 샘플은 1 ㎖ 의 1 ％ FCS, 2 mM EDTA 를 포함하는 PBS 에 현탁하고, FACSCalibur (Becton Dickinson) 를 사용하여 해석했다. 그 결과, 40 ℃, 1 개월간의 가속 시험 샘플은 검토한 3 종류의 pH 에 있어서 -80 ℃ 보존의 활성 표준품과 동등한 항원 결합 활성을 나타냈다 (도 27A).

또한, 항원 고상화 ELISA 법에 의한 항원 결합 활성의 측정을 실시했다. 항원 고상화 ELISA 는 이하와 같이 실시했다. 96 구멍 플레이트 (BD FALCON) 를, PBS 로 3 ㎍/㎖ 로 희석한 hDlk-1 세포 외 영역의 리콤비넌트 단백질 (hDlk-1 His) 에 의해 50 ㎕/well 로 코팅했다 (4 ℃, 하룻밤). 세정 버퍼 (0.01 ％ Tween 20 을 포함하는 PBS) 로 세정 후, 블로킹 버퍼 (2 ％ 스킴 밀크, 0.05 ％ Tween 20 을 포함하는 PBS) 를 200 ㎕/well 로 첨가하여 블로킹을 실시했다 (실온, 1 시간). 세정 버퍼로 세정한 후, 시험 항체를 ELISA 버퍼 (1 ％ 스킴 밀크, 0.025 ％ Tween 20 을 포함하는 PBS) 로 1, 0.1, 0.03, 0.01 및 0.001 ㎍/㎖ 로 희석하여, 각각 50 ㎕/well 로 첨가했다 (실온, 2 시간). 세정 버퍼로 세정한 후, 검출용 항체로서 ELISA 버퍼로 2,000 배 희석한 HRP 표식 염소 항인간 κ 사슬 항체 (Southern Biotech) 를 50 ㎕/well 로 첨가했다 (실온, 1 시간). 세정 버퍼로 세정 후, TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 ； SIGMA) 를 기질 용액으로서 50 ㎕/well 로 첨가하여, 발색 반응을 실시했다. 1 M 황산을 25 ㎕/well 로 첨가하여 반응을 정지시킨 후, iMark Microplate reader (Bio Rad) 를 사용하여, 655 nm 의 흡광도를 레퍼런스로 하여 450 nm 의 흡광도를 측정했다. 그 결과, FACS 해석의 결과와 마찬가지로, 3 종류의 pH 의 버퍼에 있어서의 40 ℃, 1 개월간의 보존에 의한 활성의 저하는 확인되지 않았다 (도 27 B).

이들의 결과로부터, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 가 액제 중에서는 안정적인 항원 결합 활성을 유지하는 것이 분명해졌다.

다음으로, 필리핀 원숭이 혈장 중에서의 항원 결합 활성에 대해, 항원 고상화 ELISA 법에 의해 검토했다. 필리핀 원숭이 혈장은 헤파린 처리한 풀 혈장으로, 닛폰 에스엘시 주식회사로부터 입수하여, 사용까지 -80 ℃ 에서 보존했다. 사용 시에, 해동한 필리핀 원숭이 혈장은 소형 원심기 (Beckman) 로 12,000 rpm 으로 5 분간 원심하고, 그 상청을 사용했다. 항원 고상화 ELISA에 사용하는 샘플은 이하와 같이 조제했다. HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 를 필리핀 원숭이 혈장으로 10 ㎍/㎖ 로 조제하고, 37 ℃ 에서 1, 6, 24, 48 시간 및 7 일간 보온했다. 각 시간 보온한 샘플은 측정까지 -80 ℃ 에서 보존했다. 활성 표준품으로서 필리핀 원숭이 혈장으로 10 ㎍/㎖ 로 조제한 직후의 샘플을 사용했다. 항원 결합 활성의 측정시에, 해동한 측정 샘플은 소형 원심기 (Beckman) 로 12,000 rpm 으로 5 분간 원심하고, 그 상청을 사용했다. 항원 고상화 ELISA 는 이하와 같이 실시했다. 96 구멍 플레이트 (BD FALCON) 를 PBS 로 3 ㎍/㎖ 로 희석한 hDlk-1 세포 외 영역의 리콤비넌트 단백질 (hDlk-1 His) 을 50 ㎕/well 로 코팅했다 (4 ℃, 하룻밤). 세정 버퍼 (0.05 ％ Tween 20 을 포함하는 PBS) 로 세정 후, 블로킹 버퍼 (1 ％ 카세인을 포함하는 PBS) 를 200 ㎕/well 로 첨가하여 블로킹을 실시했다 (실온, 1 시간). 세정 버퍼로 세정한 후, 측정 샘플을 블로킹 버퍼로 0.1 ㎍/㎖ 로 희석하고, 각 50 ㎕/well 로 첨가했다 (실온, 1 시간). 세정 버퍼로 세정한 후, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 검출에는 블로킹 버퍼로 2,000 배 희석한 HRP 표식 염소 항인간 κ 사슬 항체 (Southern Biotech) 를 50 ㎕/well 로 첨가했다 (실온, 1 시간). 세정 버퍼에 의한 세정 후, TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 ； SIGMA) 를 기질 용액으로서 50 ㎕/well 로 첨가하고, 발색 반응을 실시했다. 1 M 황산을 25 ㎕/well 로 첨가하여 반응을 정지시킨 후, iMark Microplate reader 혹은 Microplate reader Model 550 (Bio Rad) 을 사용하여, 655 nm 의 흡광도를 레퍼런스로 하여 450 nm 의 흡광도를 측정했다. 그 결과, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 는 7 일간의 인큐베이션에서도 현저한 항원 결합 활성의 저하는 보이지 않았다 (도 28). 따라서, 필리핀 원숭이 혈장 중에 있어서, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 는 안정적인 항원 결합 활성을 유지할 수 있는 것이 나타났다. 이 결과로부터, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 는 인간의 혈장 중 (혈중) 에 있어서도 동일하게 안정적인 항원 결합 활성을 유지할 수 있는 것이 시사되었다.

〔실시예 11〕

인간형화 항인간 Dlk-1 항체 (HuBA-1-3D-1-A24G/T73K) 의 in vivo 에 있어서의 항종양 활성 (이하, 실시예 11 ∼ 16 에 있어서 동일)

＜인간 간세포 암 세포주 HepG2 세포 Xenograft Treatment 모델에 있어서의 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 항종양 활성＞

HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 in vivo 에 있어서의 항종양 활성을, 내재적으로 hDlk-1 을 세포 표면에 발현하는 인간 간세포 암 세포주 HepG2 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델로 검토했다.

5 × 10⁶ cells 의 HepG2 세포를 7 주령 암컷의 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식 (Day 0) 하고, 이식으로부터 9 일 후 (Day 9) 에 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 정도에 도달한 단계에서, 컨트롤군 (PBS 투여군, N = 8, 96.6 ± 11.0 ㎣), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (1 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 96.2 ± 8.5 ㎣), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 96.3 ± 8.6 ㎣), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (10 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 96.2 ± 8.5 ㎣) 으로 군분류를 실시하고, 동일로부터 3 일에 1 회의 투여 간격으로, 항체의 복강내 투여를 실시했다.

그 결과, 암 세포 이식으로부터 23 일째 (Day 23) 에 있어서의 종양 체적에 대해서는, 컨트롤군이 900.1 ± 248.6 ㎣ 였던 것에 대해, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군에서는 어느 용량의 투여군에 있어서도 매우 높은 항종양 활성 (종양 형성 저해 활성) 이 관찰되고, 1 mg/kg 체중 투여군에서는, 93.4 ± 47.3 ㎣ (저해율 89.6 ％, P < 0.01 by Student's t-test), 5 mg/kg 체중 투여군에서는, 102.6 ± 39.7 ㎣ (저해율 88.6 ％, P < 0.01 by Student's t-test), 10 mg/kg 체중 투여군에서는, 140.6 ± 55.0 ㎣ (저해율 84.4 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 였다(도 29A).

마찬가지로, 암 세포 이식으로부터 23 일째 (Day 23) 에 있어서의 종양 중량에 대해서도, 컨트롤군이 0.440 ± 0.105 g 이었던 것에 대해, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군에서는 어느 용량의 투여군에 있어서도 매우 높은 항종양 활성 (종양 형성 저해 활성) 이 관찰되고, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (1 mg/kg 체중) 투여군에서는, 0.030 ± 0.026 g (저해율 93.2 ％, P < 0.01 by Student's t-test), 5 mg/kg 체중 투여군에서는, 0.042 ± 0.026 g (저해율 90.5 ％, P < 0.01 by Student's t-test), 10 mg/kg 체중 투여군에서는, 0.065 ± 0.039 g (저해율 85.1 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 이었다 (도 29B).

〔실시예 12〕

＜인간 신경아세포종 세포주 SK-N-F1 세포 Xenograft Treatment 모델에 있어서의 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 항체의 항종양 활성＞

HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 in vivo 에 있어서의 항종양 활성을, 내재적으로 hDlk-1 을 세포 표면에 발현하는 인간 신경아세포종 세포주 SK-N-F1 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델로 검토했다.

약 5 × 10⁶ cells 의 SK-N-F1 세포를 7 주령 암컷의 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식 (Day 0) 하고, 이식으로부터 13 일 후 (Day 13) 에 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 정도에 도달한 단계에서, 컨트롤군 (PBS 투여군, N = 8, 91.7 ± 18.3 ㎣), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (1 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 91.9 ± 16.9 ㎣), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 91.5 ± 16.5 ㎣), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (10 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 90.2 ± 11.7 ㎣) 으로 군분류를 실시하고, 동일로부터 3 일에 1 회의 투여 간격으로, 항체의 복강내 투여를 실시했다.

그 결과, 암 세포 이식으로부터 34 일째 (Day 34) 에 있어서의 종양 체적에 대해서는, 컨트롤군이 1231.6 ± 411.1 ㎣ 였던 것에 대해, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군에서는 용량 의존적인 항종양 활성 (종양 형성 저해 활성) 이 관찰되고, 1 mg/kg 체중 투여군에서는, 713.6 ± 343.8 ㎣ (저해율 42.1 ％, P < 0.05 by Student's t-test), 5 mg/kg 체중 투여군에서는, 317.0 ± 160.6 ㎣ (저해율 74.3 ％, P < 0.01 by Student's t-test), 10 mg/kg 체중 투여군에서는, 189.0 ± 104.0 ㎣ (저해율 84.7 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 였다 (도 30A).

마찬가지로, 암 세포 이식으로부터 34 일째 (Day 34) 에 있어서의 종양 중량에 대해서도, 컨트롤군이 0.584 ± 0.213 g 이었던 것에 대해, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군에서는 용량 의존적인 항종양 활성 (종양 형성 저해 활성) 이 관찰되고, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (1 mg/kg 체중) 투여군에서는, 0.379 ± 0.183 g (저해율 64.8 ％), 5 mg/kg 체중 투여군에서는, 0.165 ± 0.115 g (저해율 71.8 ％, P < 0.01 by Student's t-test), 10 mg/kg 체중 투여군에서는, 0.093 ± 0.059 g (저해율 84.1 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 이었다 (도 30B).

〔실시예 13〕

＜인간 간암 세포주 HepG2 세포 Xenograft Treatment 모델에 있어서의, 저용량의 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 약효 평가 및 기존의 항암제와의 약효 비교＞

HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 in vivo 에 있어서의 항종양 활성을, 내재적으로 hDlk-1 을 세포 표면에 발현하는 인간 간세포 암 세포주 HepG2 세포를 사용한 Xenograft Treatment 모델로 검토했다. 동시에, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 와, 기존의 간암 치료약으로서 승인되어 있는 「넥사바르」 (소라페니브토실산염정, Bayer) 의 항종양 활성의 비교를 실시했다.

5 × 10⁶ cells 의 HepG2 세포를 7 주령 암컷의 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식 (Day 0) 하고, 이식으로부터 10 일 후 (Day 10) 에 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 정도에 도달한 단계에서, 컨트롤군 (PBS 투여군, N = 8, 107.0 ± 16.8 ㎣), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (0.1 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 108.0 ± 13.9 ㎣), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (0.5 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 107.9 ± 10.5 ㎣), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (1 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 107.9 ± 10.0 ㎣) 으로 군분류를 실시하고, 동일로부터 3 일에 1 회의 투여 간격으로, 항체의 복강내 투여를 실시했다. 또, 넥사바르 (40 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 107.7 ± 9.7 ㎣), 넥사바르 (80 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 107.9 ± 9.6 ㎣) 에 대해서도, 동일로부터 주 5 일 투여, 2 일간 휴약의 사이클로 경구 투여를 실시했다.

그 결과, 암 세포 이식으로부터 28 일째 (Day 28) 에 있어서의 종양 체적은, 컨트롤군이 945.2 ± 562.1 ㎣ 였던 것에 대해, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 0.5 mg/kg 투여군 및 1 mg/kg 투여군의 종양 체적은 각각 219.4 ± 182.8 ㎣ (저해율 76.8 ％, P < 0.01 by Student's t-test), 116.5 ± 69.2 ㎣ (저해율 87.7 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 가 되고 (도 31A), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군에 있어서는, 0.5 mg/kg 의 저용량에 있어서도 매우 강한 항종양 활성이 확인되었다. 넥사바르 투여군에 있어서의 항종양 활성은 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군과 비교해서 약하고, 40 mg/kg 투여군에서는 컨트롤과 비교해서 유의한 항종양 활성은 확인되지 않고 (588.0 ± 314.0 ㎣), 80 mg/kg 투여군에 있어서도 384.1 ± 190.4 ㎣ (저해율 59.4 ％, P < 0.05 by Student's t-test) 였다 (도 31B).

부작용의 하나의 지표로서, 암 세포 이식으로부터의 마우스의 체중 변화에 대해, 군분류 시 (Day 10) 의 각 군의 마우스의 체중의 평균치를 100 ％ 로 하고, 28 일째 (Day 28) 까지의 각 군의 마우스의 체중의 증가율을 시간 경과적으로 조사했다. 컨트롤군에서는, 종양의 성장에 수반하여 마우스의 체중의 감소가 관찰되었지만 (93.0 ± 8.5 ％, N = 8, Day 28), 항종양 효과를 나타낸 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군에서는 마우스의 체중 감소는 관찰되지 않았다 (0.5 mg/kg 투여군 ： 99.0 ± 10.0 ％, 1 mg/kg 투여군 ： 100.0 ± 4.2 ％). 넥사바르 투여군에서는, 시간 경과적인 체중 감소가 관찰되고, Day 28 에 있어서의 체중 감소율은 넥사바르 40 mg/kg 투여군에서 83.0 ± 5.2 ％ (N = 8, P < 0.01 by Student's t-test), 80 mg/kg 투여군에서 80.0 ± 7.7 ％ (N = 7, P < 0.05 by Student's t-test) 였다 (도 31C). 이상의 결과로부터, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 항체는, 0.5 mg/kg 체중의 저용량에 있어서도, 거의 완전하게 종양의 성장을 저해하는 활성을 갖는 것이 분명해졌다. 또 기존의 간암 치료약인 넥사바르와 비교해서 강한 항종양 활성을 나타내고, 부작용은 나타내지 않는 것이 분명해졌다.

〔실시예 14〕

＜인간 간암 세포주 HepG2/C3A 세포 Xenograft Treatment 모델에 있어서의 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 약효 평가＞

간암에서의 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 항종양 활성에 대해, 인간 간암 세포주 HepG2/C3A 세포 (ATCC, Cat#CRL-10741) 를 사용한 Xenograft Treatment 모델로 검토했다.

5 × 10⁶ cells 의 HepG2/C3A 세포를 7 주령 암컷의 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식 (Day 0) 하고, 이식으로부터 10 일 후 (Day 10) 에 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 이상에 도달한 단계에서, 컨트롤군 (PBS 투여군, N = 8, 120.8 ± 22.6 ㎣), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (0.1 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 120.4 ± 18.4 ㎣), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (0.5 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 120.1 ± 18.8 ㎣), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (1 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 120.3 ± 18.8 ㎣), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 120.6 ± 21.0 ㎣) 으로 군분류를 실시하고, 동일로부터 3 일에 1 회의 투여 간격으로, 항체의 복강내 투여를 실시했다.

그 결과, 암 세포 이식으로부터 26 일째 (Day 26) 에 있어서의 종양 체적은, 컨트롤군이 637.6 ± 353.9 ㎣ (N = 8) 였던 것에 대해, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군에서는 1 mg/kg 체중 투여군과 5 mg/kg 체중 투여군에서 통계적으로 유의한 항종양 활성이 관찰되었다. 1 mg/kg 체중 투여군의 종양 체적은 132.9 ± 266.1 ㎣ (저해율 79.2 ％, N = 8, P < 0.01 by Student's t-test), 5 mg/kg 체중 투여군에서는, 128.0 ± 75.6 ㎣ (저해율 79.9 ％, N = 8, P < 0.01 by Student's t-test) 였다 (도 32A).

마찬가지로, 암 세포 이식으로부터 26 일째 (Day 26) 에 있어서의 종양 중량에 대해서도, 컨트롤군이 0.624 ± 0.381 g 이었던 것에 대해, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군에서는, 1 mg/kg 체중 투여군에서 0.107 ± 0.117 g (저해율 82.9 ％, P < 0.01 by Student's t-test), 5 mg/kg 체중 투여군에서 0.079 ± 0.056 g (저해율 87.3 ％, P < 0.01 by Student's t-test) 이 되어, 매우 강한 항종양 활성이 확인되었다 (도 32B).

〔실시예 15〕

＜인간 소세포 폐암 세포주 Lu-135 세포 Xenograft Treatment 모델에 있어서의 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 약효 평가＞

HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 소세포 폐암에 있어서의 항종양 활성을, 내재적으로 hDlk-1 을 세포 표면에 발현하는 인간 소세포 폐암 세포주 Lu-135 세포 (휴먼 사이언스 진흥 재단 연구 자원 뱅크에서 구입, Cat#JCRB0170) 를 사용한 Xenograft Treatment 모델로 검토했다.

5 × 10⁶ cells 의 Lu-135 세포를 7 주령 암컷의 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식 (Day 0) 하고, 이식으로부터 10 일 후 (Day 10) 에 평균의 종양 체적이 100 ㎣ 정도에 도달한 단계에서, 컨트롤군 (PBS 투여군, N = 8, 100.9 ± 12.7 ㎣), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (1 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 100.6 ± 8.1 ㎣), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (10 mg/kg 체중) 투여군 (N = 8, 102.9 ± 12.0 ㎣) 으로 군분류를 실시하고, 동일로부터 3 일에 1 회의 투여 간격으로, 항체의 복강내 투여를 실시했다. 그 결과, 암 세포 이식으로부터 34 일째 (Day 34) 에 있어서의 종양 체적은, 컨트롤군이 972.7 ± 266.8 ㎣ 였던 것에 대해, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군에서는, 1 mg/kg 체중 투여군에서 631.9 ± 218.9 ㎣ (저해율 35.0 ％, P < 0.05 by Student's t-test), 10 mg/kg 체중 투여군에서 582.3 ± 220.4 ㎣ (저해율 40.1 ％, P < 0.05 by Student's t-test) 가 되어, 통계적으로 유의한 항종양 활성이 확인되었다 (도 33A).

마찬가지로, 암 세포 이식으로부터 34 일째 (Day 34) 에 있어서의 종양 중량에 대해서도, 컨트롤군이 0.632 ± 0.177 g 이었던 것에 대해, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군에서는, 1 mg/kg 체중 투여군에서 0.429 ± 0.161 g (저해율 32.1 ％, P < 0.05 by Student's t-test), 10 mg/kg 체중 투여군에서 0.420 ± 0.178 g (저해율 33.5 ％, P < 0.05 by Student's t-test) 이 되어, 통계적으로 유의한 항종양 활성이 확인되었다 (도 33B).

〔실시예 16〕

＜인간 간암 세포주 HepG2 세포 Xenograft Treatment 모델에 있어서의, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여에 의한 암 세포의 아포토시스 유도＞

다음으로, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 가 나타내는 항종양 활성의 작용 기서에 대해, 항체 투여 후의 Xenograft 종양에 있어서의 암 세포의 아포토시스를, TUNEL 법, 및 항 Cleaved Caspase-3 항체를 사용한 면역 조직 염색법에 의해 검토했다.

5 × 10⁶ cells 의 HepG2 세포를 7 주령 암컷의 NOD-scid 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 이식하고, 평균의 종양 체적이 200 ㎣ 이상에 도달한 단계에서, 컨트롤군 (PBS 투여군), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군 (5 mg/kg 체중) 으로 군분류를 실시했다. 컨트롤군은 PBS 투여 48 시간 후 (N = 3), HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 투여군은 항체 투여 24 시간 후, 48 시간 후 (각 N = 3) 에, Xenograft 종양을 회수하고, O. C. T. 콤파운드 (티슈·텍 O. C. T. 콤파운드, 후나코시) 로 포매한 후, 액체 질소하에서 동결 블록을 제작했다. 크리오스탓트에서 Xenograft 종양의 동결 절편을 제작하고, TUNEL 법에 의한 아포토시스의 검출을, TumorTACS^TM In Situ Apoptosis Detection Kit (Trevigen, 4815-30-K) 에 기재된 방법에 따라 실시했다.

제작한 동결 절편은, 실온에서 충분히 풍건시킨 후, 에탄올 계열로 재수화를 실시하고, 3.7 ％ 의 포름알데히드 (Wako, 064-00406) 를 포함하는 PBS 로 고정했다. PBS 로 실온하 5 분간의 세정을 2 회 실시한 후, Cytonin (Trevigen, 4876-05-01) 에 의한 투과 처리를 실시하고, 증류수로 실온 2 분간 2 회의 세정 후, 메탄올에 종농도 3 ％ 가 되도록 과산화수소수 (Wako, 081-04215) 를 첨가한 용액으로 실온하 5 분간의 처리를 하고, 내인성 퍼옥시다아제 활성을 제거했다. 그 후, PBS 로 실온하 1 분간의 세정, 및 10 × TdT Labeling Buffer (Trevigen, 4810-30-02) 를 증류수로 10 배로 희석한 용액 (이하, 1 × TdT Labeling Buffer) 으로의 전처리를 실시하고, TdT dNTP Mix (Trevigen, 4810-30-04), 50 × Mn²⁺ (Trevigen, 4810-30-14), TdT Enzyme (Trevigen, 4810-30-05), 1 × TdT Labeling Buffer 를 TumorTACS^TM In Situ Apoptosis Detection Kit 의 설명서에 따라 혼합하여 제작한 Labeling Reaction Mix 를 37 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, 비오틴 표식 dNTP 를 단편화 DNA 에 부가시켰다. 10 × Stop Buffer (Trevigen, 4810-30-03) 를 증류수로 10 배로 희석한 용액을 실온에서 5 분간 반응시켜, Labeling 반응을 정지시킨 후, PBS 로 실온하 2 분간의 세정을 2 회 실시하고, Strep-HRP (Trevigen, 4800-30-06) 를 PBS 로 50 배로 희석한 용액을 실온하에서 10 분간 반응시켜, ABC 복합체를 형성시켰다. PBS 로 실온하 2 분간의 세정을 2 회 실시한 후, PBS, DAB (Trevigen, 4800-30-09), 30 ％ 과산화수소수를 TumorTACS^TM In Situ Apoptosis Detection Kit 의 설명서에 따라 혼합하여 제작한 DAB solution 에 의해 발색을 실시했다. 발색을 확인한 후, 탈이온수로 2 분간 4 회의 세정을 실시하고, 1 ％ Methyl Green (Trevigen, 4800-30-18) 에 의해 핵을 염색하고, 그 후 에탄올로 탈수, 자일렌으로 투철하여 엔테란뉴 (MERCK, 1079610100) 로 봉입한 후, 현미경하에서 관찰했다. 조직 절편 중의 전체 암 세포 중, 10 ％ 이상의 암 세포가 염색되는 조직 절편을 양성으로 했다.

그 결과, 컨트롤군 (PBS 투여군, N = 3) 의 Xenograft 종양에 있어서는 TUNEL 양성의 아포토시스를 일으킨 암 세포는 관찰되지 않은 것에 대해, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 5 mg/kg 체중 투여군에서는, 투여 24 시간 후에 TUNEL 양성의 아포토시스가 유도된 암 세포가 관찰되고, 투여 48 시간 후에는, 3 예 전례에서 30 ％ 이상의 암 세포에 있어서 아포토시스가 관찰되었다 (도 34A).

마찬가지로, Xenograft 종양에 있어서의 암 세포의 아포토시스를, 활성형 카스파제 3 의 면역 염색으로 검토했다. 동결 절편은 4 ％ Paraformaldehyde (Wako, 160-16061) 를 포함하는 PBS 로 4 ℃ 에서 15 분간 처리하여 고정했다. PBS 로 실온하 5 분간의 세정을 2 회 실시한 후, 메탄올에 종농도 3 ％ 가 되도록 과산화수소수 (Wako, 081-04215) 를 첨가한 용액으로 실온하 10 분간 처리하여, 내인성 퍼옥시다아제 활성을 제거했다. PBS 로 실온하 5 분간의 세정을 2 회 실시한 후, 1.5 ％ 의 정상 염소 혈청 (Vector, S-1000) 을 포함하는 PBS 로 블로킹을 실시했다 (실온하에서 1 시간).

다음으로, 블로킹 버퍼로 600 배로 희석한 항 Cleaved Caspase-3 항체 (Cell Signaling Technology, cat# 9661) 를 4 ℃ 에서 하룻밤 반응시킨 후, ChemMate EnVision 폴리머 시약 (DAKO, K5027) 을 실온하에서 30 분간 반응시켰다. PBS 로 실온하 5 분간의 세정을 3 회 실시한 후, 히스토파인 퍼옥시다아제 기질 심플 스테인 DAB 용액 (Nichirei Bioscience, 415171) 에 의해 발색을 실시했다. 탈이온수로 5 분간 세정하고, 마이어 헤마톡실린 용액 (Wako, 131-09665) 에 의해 핵을 염색하고, 그 후 에탄올로 탈수, 자일렌으로 투철하여 엔테란뉴 (MERCK, 1079610100) 로 봉입한 후, 현미경하에서 관찰했다. 조직 절편 중의 전체 암 세포 중, 10 ％ 이상의 암 세포가 염색되는 조직 절편을 양성으로 했다.

그 결과, 컨트롤군 (PBS 투여군, N = 3) 의 Xenograft 종양에서는 활성형 카스파제 3 은 검출되지 않은 것에 대해, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 mg/kg 체중) 투여군에서는, 투여 24 시간 후에는 3 예 중 2 예, 투여 48 시간 후에는 3 예 전례에서 활성형 카스파제 3 양성의 아포토시스가 유도된 암 세포가 관찰되고, 특히 투여 48 시간 후의 Xenograft 종양에서는 전체의 80 ％ 이상의 암 세포에서 활성형 카스파제 3 양성의 아포토시스에 의한 세포사가 관찰되었다 (도 34B).

이상의 결과로부터, HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 는 간암 세포주 HepG2 세포에 대해 아포토시스에 의한 세포사를 유도하는 것이 분명해져, 적어도 HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 의 항종양 활성의 작용 기서의 하나인 것이 나타났다.

산업상 이용가능성

본 발명에 의하면, 항종양 활성을 갖는 항 hDlk-1 항체, 구체적으로는 in vivo 에 있어서 항체 단독 투여에서도 현저한 항종양 활성을 갖는 항 hDlk-1 모노클로날 항체, 특히 인간형화 항체를 제공할 수 있다. 또한, 당해 인간형화 항체 중에서도, 보다 한층 아비디티 (Avidity ； 항원 결합 활성) 가 높아지도록 개변된, 아미노산 치환 변이형의 인간형화 항 hDlk-1 모노클로날 항체를 제공할 수 있다.

또 본 발명은 당해 항체를 산생하는 하이브리도마, 당해 항체와 각종 약제의 복합체를 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 항체나 상기 복합체 등을 사용하는, 종양의 진단용 또는 치료용 의약 조성물, 종양 세포의 아포토시스 유도용 의약 조성물, 종양 치료제, 종양 진단제, 종양 세포의 아포토시스 유도제, 종양의 치료 방법, 종양의 검출 방법, 종양의 검출용 또는 진단용 키트, 그리고 종양 세포의 아포토시스 유도용 키트 등을 제공할 수 있다.

배열표 프리 텍스트

배열 번호 3 ∼ 11 ： 합성 DNA

배열 번호 26 ： 재조합 DNA

배열 번호 27 ： 재조합 DNA

배열 번호 32 ： 재조합 DNA

배열 번호 33 ： 재조합 단백질

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배열 번호 47 ∼ 51 ： 합성 DNA

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독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물 기탁센터 FERMBP-11337 20110201 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물 기탁센터 FERMBP-10707 20061018 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물 기탁센터 FERMBP-10899 20070821 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물 기탁센터 FERMBP-10900 20070821

SEQUENCE LISTING <110> LivTech, Inc. <120> ANTI-HDLK-1 ANTIBODY HAVING AN ANTITUMOR ACTIVITY IN VIVO <130> PCT13-0032 <150> US61/709,282 <151> 2012-10-03 <160> 89 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1532 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (154)..(1305) <400> 1 gagagcgcag cgcgcagccc ggtgcagccc tggctttccc ctcgctgcgc gcccgcgccc 60 cctttcgcgt ccgcaaccag aagcccagtg cggcgccagg agccggaccc gcgcccgcac 120 cgctcccggg accgcgaccc cggccgccca gag atg acc gcg acc gaa gcc ctc 174 Met Thr Ala Thr Glu Ala Leu 1 5 ctg cgc gtc ctc ttg ctc ctg ctg gct ttc ggc cac agc acc tat ggg 222 Leu Arg Val Leu Leu Leu Leu Leu Ala Phe Gly His Ser Thr Tyr Gly 10 15 20 gct gaa tgc ttc ccg gcc tgc aac ccc caa aat gga ttc tgc gag gat 270 Ala Glu Cys Phe Pro Ala Cys Asn Pro Gln Asn Gly Phe Cys Glu Asp 25 30 35 gac aat gtt tgc agg tgc cag cct ggc tgg cag ggt ccc ctt tgt gac 318 Asp Asn Val Cys Arg Cys Gln Pro Gly Trp Gln Gly Pro Leu Cys Asp 40 45 50 55 cag tgc gtg acc tct ccc ggc tgc ctt cac gga ctc tgt 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gag aac gac ggc 702 Glu Ile Val Ala Asn Ser Cys Thr Pro Asn Pro Cys Glu Asn Asp Gly 170 175 180 gtc tgc act gac att ggg ggc gac ttc cgc tgc cgg tgc cca gcc ggc 750 Val Cys Thr Asp Ile Gly Gly Asp Phe Arg Cys Arg Cys Pro Ala Gly 185 190 195 ttc atc gac aag acc tgc agc cgc ccg gtg acc aac tgc gcc agc agc 798 Phe Ile Asp Lys Thr Cys Ser Arg Pro Val Thr Asn Cys Ala Ser Ser 200 205 210 215 ccg tgc cag aac ggg ggc acc tgc ctg cag cac acc cag gtg agc tac 846 Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Leu Gln His Thr Gln Val Ser Tyr 220 225 230 gag tgt ctg tgc aag ccc gag ttc aca ggt ctc acc tgt gtc aag aag 894 Glu Cys Leu Cys Lys Pro Glu Phe Thr Gly Leu Thr Cys Val Lys Lys 235 240 245 cgc gcg ctg agc ccc cag cag gtc acc cgt ctg ccc agc ggc tat ggg 942 Arg Ala Leu Ser Pro Gln Gln Val Thr Arg Leu Pro Ser Gly Tyr Gly 250 255 260 ctg gcc tac cgc ctg acc cct ggg gtg cac gag ctg ccg gtg cag cag 990 Leu Ala Tyr Arg Leu Thr Pro Gly Val His Glu Leu Pro Val Gln Gln 265 270 275 ccg gag cac cgc atc ctg aag gtg tcc atg aaa gag ctc aac aag aaa 1038 Pro Glu His Arg Ile Leu Lys Val Ser Met Lys Glu Leu Asn Lys Lys 280 285 290 295 acc cct ctc ctc acc gag ggc cag gcc atc tgc ttc acc atc ctg ggc 1086 Thr Pro Leu Leu Thr Glu Gly Gln Ala Ile Cys Phe Thr Ile Leu Gly 300 305 310 gtg ctc acc agc ctg gtg gtg ctg ggc act gtg ggt atc gtc ttc ctc 1134 Val Leu Thr Ser Leu Val Val Leu Gly Thr Val Gly Ile Val Phe Leu 315 320 325 aac aag tgc gag acc tgg gtg tcc aac ctg cgc tac aac cac atg ctg 1182 Asn Lys Cys Glu Thr Trp Val Ser Asn Leu Arg Tyr Asn His Met Leu 330 335 340 cgg aag aag aag aac ctg ctg ctt cag tac aac agc ggg gag gac ctg 1230 Arg Lys Lys Lys Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Asn Ser Gly Glu Asp Leu 345 350 355 gcc gtc aac atc atc ttc ccc gag aag atc gac atg acc acc ttc agc 1278 Ala Val Asn Ile Ile Phe Pro Glu Lys Ile Asp Met Thr Thr Phe Ser 360 365 370 375 aag gag gcc ggc gac gag gag atc taa gcagcgttcc cacagccccc 1325 Lys Glu Ala Gly Asp Glu Glu Ile 380 tctagattct tggagttccg cagagcttac tatacgcggt ctgtcctaat 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gca cag aag ctc 192 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 cag ggc aga gtc acc atg acc aca gac aca tcc acg agc aca gcc tac 240 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg agg agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga tat att gcc tat gat gct ttt gat atc tgg ggc caa ggg aca 336 Ala Arg Tyr Ile Ala Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 atg gtc acc gtc tct tca 354 Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 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gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cag caa 288 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 tat tat agt act cct tcg tac act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag 336 Tyr Tyr Ser Thr Pro Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110 atc aaa cga 345 Ile Lys Arg 115 <210> 31 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110 Ile Lys Arg 115 <210> 32 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(420) <400> 32 atg ggt tgg agc tgt atc atc ttc ttt ctg gta gca aca gct aca ggc 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtg cac tcc caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aaa gtc tcc tgc aag gct tcc ggc tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act gat tat gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg 192 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttt aag ggc aag gcc aca atg act gtc gac aca tcc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 aca gcc tat atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 tac tgg ggt caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 33 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 33 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 34 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 34 caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aaa gtc tcc tgc aag gct tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca atg act gtc gac aca tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 35 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <400> 36 actagtacca ccatgggttg gagctgtatc atcttctttc tggtagcaac agctacaggc 60 gtgcactccc aagtccagct ggtgcagtct ggggctgaag tgaagaagcc tggggcctca 120 gtgaaagtct cctgcaaggc ttccggctac acattcactg attatgctat gcactgggtg 180 cgacaggccc ctggacaagg cctggagtgg attggagtta ttagtactta ctatggtaat 240 acaaactaca accagaagtt taagggcaag gccacaatga ctgtcgacac atccaccagc 300 acagcctata tggaacttag gagcttgaga tctgacgata ctgccgtgta ttactgtgca 360 agaggaggat tgcgagagta ttactatgct atggactact ggggtcaagg aaccatggtc 420 accgtctcct caggtaagat gggctttcct aagctt 456 <210> 37 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(420) <400> 37 atg ggt tgg agc tgt atc atc ttc ttt ctg gta gca aca gct aca ggc 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtg cac tcc caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aaa gtc tcc tgc aag gct tcc ggc tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act gat tat gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg 192 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttt aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aca tcc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 aca gcc tat atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 tac tgg ggt caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 38 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 38 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 39 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 39 caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aaa gtc tcc tgc aag gct tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aca tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 40 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 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agaggaggat tgcgagagta ttactatgct atggactact ggggtcaagg aaccatggtc 420 accgtctcct caggtaagat gggctttcct aagctt 456 <210> 42 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(399) <400> 42 atg gaa tca cag acc cag gtc ctc atg ttt ctt ctg ctc tgg gta tct 48 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 ggt gcc tgt gca gac att gtc atg aca cag tct cca gac tcc ctg gct 96 Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 gtg tca ctg gga gag agg gcc act atc aac tgc aag tcc agt cag agc 144 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 ctt ctg aat agt agc aat caa aag aac tat ttg gcc tgg tac cag cag 192 Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 aaa cca gga cag cct cct aaa ctt ctg gtc tac ttt gca tcc act agg 240 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 gaa tct ggg gtc cct gat cgc ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat 288 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 ttc act ctt acc atc agc agt ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tac 336 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 100 105 110 tac tgt cag caa cat tat agc act cct ccc aca ttc ggt cag ggg acc 384 Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 aag ctg gag atc aaa 399 Lys Leu Glu Ile Lys 130 <210> 43 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 43 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Lys 130 <210> 44 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400> 44 gac att gtc atg aca cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tca ctg gga 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gag agg gcc act atc aac tgc aag tcc agt cag agc ctt ctg aat agt 96 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 agc aat caa aag aac tat ttg gcc tgg tac cag cag aaa cca gga cag 144 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 cct cct aaa ctt ctg gtc tac ttt gca tcc act agg gaa tct ggg gtc 192 Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 cct gat cgc ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctt acc 240 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 atc agc agt ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tac tac tgt cag caa 288 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 cat tat agc act cct ccc aca ttc ggt cag ggg acc aag ctg gag atc 336 His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 aaa 339 Lys <210> 45 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 45 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 46 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <400> 46 gctagcacca ccatggaatc acagacccag gtcctcatgt ttcttctgct ctgggtatct 60 ggtgcctgtg cagacattgt catgacacag tctccagact ccctggctgt gtcactggga 120 gagagggcca ctatcaactg caagtccagt cagagccttc tgaatagtag caatcaaaag 180 aactatttgg cctggtacca gcagaaacca ggacagcctc ctaaacttct ggtctacttt 240 gcatccacta gggaatctgg ggtccctgat cgcttcagtg gcagtggatc tgggacagat 300 ttcactctta ccatcagcag tctgcaggct gaagatgtgg cagtttacta ctgtcagcaa 360 cattatagca ctcctcccac attcggtcag gggaccaagc tggagatcaa acgtaagtac 420 ttttttttcg aattc 435 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 47 gaaccgtcag atcgcctgga gacg 24 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 48 tgaaagatga gctggaggac 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 49 ctttcttgtc caccttggtg 20 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 50 gctgtcctac agtcctcag 19 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 51 acgtgccaag catcctcg 18 <210> 52 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 52 atg ggt tgg agc tgt atc atc ttc ttt ctg gta gca aca gct aca ggt 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtg cac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct ggg cct gag ctg gtg agg 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg 20 25 30 cct ggg gtc tca gtg aag att tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc 144 Pro Gly Val Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act gat tat gct atg cac tgg gtg aag cag agt cat gca aag agt cta 192 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu 50 55 60 gag tgg att gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttt aag ggc aag gcc aca atg act gta gac aaa tcc tcc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tat atg gaa ctt gcc aga ttg aca tct gag gat tct gcc atc 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile 100 105 110 tat tac tgt gca aga gga gga tta cga gag tat tac tat gct atg gac 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag 432 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg 480 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg 528 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc 576 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg 624 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 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Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc 1344 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445 tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc 1392 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 450 455 460 tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1413 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 53 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 53 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Val Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser 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gcc tgt gca gac att gtg atg aca cag tct cca tcc tcc ctg gct 96 Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 atg tca gta gga cag aag gtc act atg agc tgc aag tcc agt cag agc 144 Met Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 ctt tta aat agt agc aat caa aag aac tat ttg gcc tgg tac cag cag 192 Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 aaa cca gga cag tct cct aaa ctt ctg gta tac ttt gca tcc act agg 240 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 gaa tct ggg gtc cct gat cgc ttc ata ggc agt gga tct ggg aca gat 288 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 ttc act ctt acc atc agc agt gtg cag gct gaa gac ctg gca gat tac 336 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr 100 105 110 ttc tgt cag caa cat tat agc act cct ccc acg ttc ggt gct ggg acc 384 Phe Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr 115 120 125 aag ctg 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agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc 1248 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag 1296 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc 1344 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445 tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc 1392 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 450 455 460 tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1413 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 57 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 57 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala 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agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg 1008 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 325 330 335 ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 1056 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350 gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa 1104 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 355 360 365 cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac 1152 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 370 375 380 cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc 1200 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400 gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc 1248 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag 1296 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc 1344 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445 tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc 1392 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 450 455 460 tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1413 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 59 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 59 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg 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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 210 215 220 gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc 720 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 225 230 235 240 aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa 768 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 250 255 ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 816 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 864 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285 gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 912 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300 gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac 960 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 305 310 315 320 agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg 1008 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 325 330 335 ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 1056 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350 gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa 1104 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 355 360 365 cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac 1152 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 370 375 380 cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc 1200 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400 gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc 1248 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag 1296 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc 1344 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445 tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc 1392 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 450 455 460 tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1413 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 65 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 65 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 210 215 220 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 225 230 235 240 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 250 255 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 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Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aaa gtc tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act gat tat gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg 192 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttt aag ggc aag gcc aca atg act gtc gac aca tcc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 aca gcc tat atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 tac tgg ggt caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 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Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aaa gtc tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca atg act gtc gac aca tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 69 <211> 121 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Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aaa gtc tcc tgc aag gct tcc ggc tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act gat tat gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg 192 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttt aag ggc aag gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 aca gcc tat atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 tac tgg ggt caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 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Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aaa gtc tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act gat tat gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg 192 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttt aag ggc aag gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 aca gcc tat atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 tac tgg ggt caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 75 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 75 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 76 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 76 caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 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Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aaa gtc tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act gat tat gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg 192 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttt aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aca tcc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 aca gcc tat atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 tac tgg ggt caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 79 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 79 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 80 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 80 caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aaa gtc tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aca tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 81 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 81 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 82 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(420) <400> 82 atg ggt tgg agc tgt atc atc ttc ttt ctg gta gca aca gct aca ggc 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtg cac tcc caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aaa gtc tcc tgc aag gct tcc ggc tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act gat tat gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg 192 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttt aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 aca gcc tat atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 tac tgg ggt caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 83 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 83 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 84 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 84 caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aaa gtc tcc tgc aag gct tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 85 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 85 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 86 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(420) <400> 86 atg ggt tgg agc tgt atc atc ttc ttt ctg gta gca aca gct aca ggc 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtg cac tcc caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aaa gtc tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act gat tat gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg 192 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg att gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttt aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 aca gcc tat atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 tac tgg ggt caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 87 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 87 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 88 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 88 caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aaa gtc tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc aca gcc tat 240 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 89 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct (Recombinant Protein) <400> 89 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (31)

1. H 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 35, 40, 69, 73, 77, 81, 85 및 89 중 어느 하나에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지고, L 사슬 V 영역의 아미노산 배열이 배열 번호 45 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 인간 Dlk-1 에 대한 항체.
2. 제 1 항에 있어서,
   항체가 in vivo 에서 항종양 활성을 갖는 것인 항체.
3. 제 2 항에 있어서,
   종양이 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암, 인간 췌장암, 인간 소세포 폐암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 항체.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   항체가 인간형화 항체인 항체.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   항체가 모노클로날 항체인 항체.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   배열 번호 2 에 나타나는 인간 Dlk-1 의 아미노산 배열 중의, 제 24 번째 ∼ 제 91 번째의 아미노산으로 이루어지는 영역의 적어도 일부와 결합하는 것인 항체.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 항체에서 유래하는 항체 단편.
8. 제 7 항에 있어서,
   배열 번호 35, 40, 69, 73, 77, 81, 85 및 89 중 어느 하나에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 것인 항체 단편.
9. 제 7 항에 있어서,
   배열 번호 45 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 것인 항체 단편.
10. 제 7 항에 있어서,
    배열 번호 35, 40, 69, 73, 77, 81, 85 및 89 중 어느 하나에 나타나는 아미노산 배열과, 배열 번호 45 에 나타나는 아미노산 배열을 포함하는 것인 항체 단편.
11. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 항체와, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물을 포함하는 항체-약제 복합체.
12. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 단편과, 항종양 활성 및/또는 살세포 활성을 갖는 화합물을 포함하는 항체 단편-약제 복합체.
13. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 단편, 및 제 11 항 또는 제 12 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 의약 조성물.
14. 제 13 항에 있어서,
    종양의 치료에 사용하는 것인 조성물.
15. 제 14 항에 있어서,
    체중 감소의 부작용을 갖지 않는 것인 조성물.
16. 제 13 항에 있어서,
    종양의 진단에 사용하는 것인 조성물.
17. 제 13 항에 있어서,
    종양 세포의 아포토시스 유도에 사용하는 것인 조성물.
18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암, 인간 췌장암, 인간 소세포 폐암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 조성물.
19. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 단편, 및 제 11 항 또는 제 12 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 치료제.
20. 제 19 항에 있어서,
    체중 감소의 부작용을 갖지 않는 것인 치료제.
21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,
    종양이 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암, 인간 췌장암, 인간 소세포 폐암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 치료제.
22. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 단편, 및 제 11 항 또는 제 12 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 세포의 아포토시스 유도제.
23. 제 22 항에 있어서,
    종양이 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암, 인간 췌장암, 인간 소세포 폐암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 아포토시스 유도제.
24. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 단편, 및 제 11 항 또는 제 12 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 종양의 치료 방법.
25. 제 24 항에 있어서,
    환자에게 있어서 체중 감소의 부작용을 갖지 않는 것인 방법.
26. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 단편, 및 제 11 항 또는 제 12 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종과, 생체로부터 채취된 시료를 반응시키고, 반응한 항체 및/또는 항체 단편의 시그널을 검출하는 것을 포함하는 종양의 검출 방법.
27. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 단편, 및 제 11 항 또는 제 12 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 종양 세포의 아포토시스 유도 방법.
28. 제 24 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암, 인간 췌장암, 인간 소세포 폐암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 방법.
29. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 단편, 및 제 11 항 또는 제 12 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양의 치료용, 진단용 또는 검출용 키트.
30. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 단편, 및 제 11 항 또는 제 12 항에 기재된 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 종양 세포의 아포토시스 유도용 키트.
31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
    종양이 인간 대장암, 인간 유방암, 인간 간암, 인간 췌장암, 인간 소세포 폐암 및 인간 신경아세포종으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인 키트.

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