KR100972618B1

KR100972618B1 - 허셉틴을 이용한 유방암 진단 키트, 조성물 및 이들을이용하여 허셉틴 민감성 ｈｅｒ２ 과발현 세포를 검출하는방법

Info

Publication number: KR100972618B1
Application number: KR1020070105736A
Authority: KR
Inventors: 이은숙; 강건욱; 유병철; 이호영; 공선영; 강세훈; 백남석; 권부미; 권영미
Original assignee: 국립암센터
Priority date: 2007-10-19
Filing date: 2007-10-19
Publication date: 2010-07-27
Anticipated expiration: 2027-10-19
Also published as: KR20090040118A; WO2009051427A3; US20100316635A1; WO2009051427A2

Abstract

본 발명은 HER2에 특이적으로 결합하는 항체인 허셉틴을 포함하는, 허셉틴에 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포를 검출하는 암 진단 키트, 암 진단용 조성물 및 이를 이용하여 허셉틴 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포를 검출하는 방법에 관한 것이다.

허셉틴(Herceptin), HER2, 유방암, 진단 키트, 면역조직화학염색법(IHC; Immunohistochemistry)

Description

허셉틴을 이용한 유방암 진단 키트, 조성물 및 이들을 이용하여 허셉틴 민감성 ＨＥＲ２ 과발현 세포를 검출하는 방법 {A Kit for Diagnosis of Breast Cancer Using Herceptin, a Composition Comprising Herceptin and a Method for Detecting Herceptin-sensitive HER2 over Expressed Cell Using the Same}

본 발명은 HER2에 특이적으로 결합하는 항체인 허셉틴을 포함하는, 허셉틴에 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포를 검출하는 암 진단 키트, 암 진단용 조성물 및 이를 이용하여 허셉틴에 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포를 검출하는 방법에 관한 것이다.

HER2는 유방암 세포의 증식과 생존에 관계하는 중요한 신호전달 체계 중의 하나인 상피세포 성장인자 수용체 (epidermal growth factor receptor; EGFR) 패밀리이다. EGFR 패밀리의 티로신 인산화효소 수용체 (receptor tyrosine kinases) 는 erb1, erb2/HER2, erb3, erb4의 4개로 되어 있으며 세포 증식(proliferation)과 생존(survival) 외에도 세포의 부착(adhesion), 이동(migration) 및 분 화(differentiation)를 조절하는데 관여하는 것으로 알려져 있다. 4개의 erb family 중 erb2/HER2가 결합하는 리간드는 없지만 유방암에서 가장 강력한 암유전자(oncoprotein)로 알려져 있다. HER2가 정상적인 수준인 경우에는 정상적인 유선조직의 성장과 발달에 관여하지만, 비정상적으로 HER2가 과발현하거나 증폭되면 정상세포 조절이 붕괴되어 유선조직에서는 공격적인 암세포가 형성되게 된다. 이 과정은 HER2가 다른 EGFR family member와 올리고머화(oligomerization)되어 활성화되면 많은 하부 분자(downstream molecules)를 인산화하여 차례로 여러 가지 신호전달계(signaling cascades)를 활성화시킨다. 이 중 세포증식(cell proliferation)에 관여하는 SOS-Ras-Raf-MEK-MAPK 경로와 세포사멸(apoptosis)를 억제하는 PI-3K/Akt 경로가 암 증식에 관여하는 대표적인 기전이다. 전임상과 임상실험 결과 HER2 과발현은 암발생 단계의 초기부터 나타나는 중요한 현상이며, 이는 암의 성장과 진행에 중요한 역할을 하고 있다. HER2 과발현은 침윤성 유방암의 약 20-30%에서 나타나고 있으며 과발현은 악성도가 보다 높은 공격적인 암으로 유방암의 불량한 예후와도 관계가 있는 것으로 알려지고 있다.

허셉틴(Herceptin)은 HER2의 세포외 도메인을 타겟으로 하는 재조합 인간화 단일클론 항체이다. 허셉틴이 HER2의 세포외 도메인에 결합하면 HER2 신호에 중요한 EGFR 패밀리 일부와의 이형이합체(heterodimerization) 형성이 억제되어 신호전달계(signaling cascades)의 활성화를 억제한다. 이러한 결과로 세포증식의 억제, 세포사멸의 촉진 및 혈관형성의 억제라는 효과가 나타나게 된다. 이러한 허셉틴을 이용하여 암환자를 치료하기 위해서는 유방암에서 HER2 과발현을 반드시 확인하여 치료대상을 선별하여야 한다.

유방암 연구에 있어서 HER2에 대한 관심이 큰 이유는 HER2 증폭 또는 과발현 여부가 유방암 환자에서 예후적 지표와 치료에 대한 반응의 예측 지표로서의 가치를 가지고 있기 때문이다. 예후인자로서의 가치는 논란이 있으나, HER2 유전자의 증폭 또는 그 결과로 나타나는 단백의 과발현이 관찰되는 경우 예후가 나쁘고, 생존기간이 유의하게 짧아진다는 보고들이 여러 학회를 통해 발표되고 있다. 특히, 전이성 혹은 원발성 유방암 환자에서 HER2/neu에 대한 단클론항체 치료제제인 허셉틴을 사용하여 암환자를 치료하기 위해서는 HER2의 증폭 또는 과발현 여부가 결정적인 지표가 된다. HER2의 이와 같은 가치가 인정되어 2000년도에 ASCO (American Society of Clinical Oncology)에서 제시하는 유방암의 종양표지자에 HER2가 포함되었으며, 대부분의 치료 가이드라인에서 모든 원발성 유방암 환자에 대해서 HER2 검사를 시행하도록 하였다. 따라서, 유방암 조직에서 HER2에 대한 표준화된 평가가 요구되고 있는 실정이다.

HER2 증폭 혹은 과발현을 검사하는 방법에는 HER2 유전자 증폭 (gene amplication)을 알아보는 형광제자리부합법 (Fluorescence in situ hybridization ;FISH), 염색체제자리부합화 (chromogenic in situ hybridization ;CISH), 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction ;PCR)이 있 고, 증가된 HER2 mRNA 전사체를 알아보는 실시간 중합효소연쇄반응 (reverse transcription-Polymerase chain reaction ;RT-PCR)이 있으며, HER2 단백질 과발현 (protein over-expression)을 알아볼 수 있는 면역조직화학염색법 (Immuno-histochemistry ;IHC)이 있다. 이 중 현재 임상적으로 널리 이용되는 방법은 FISH와 IHC이다.

IHC 방법은 병리검사실에서 익숙하게 사용하는 방법으로서, 추가적인 장비가 필요 없고, 검사에 소요되는 시간이 약 3시간으로 짧고, 기술적인 어려움이 없으며, 비용이 비교적 저렴하다는 장점 있으나, IHC의 단점은 검출 민감도가 다른 분자유전학적인 방법에 비해서 낮은 한계를 가지고 있고, 사용하는 항체의 종류, 항원 복구(antigen retrieval)의 방법, 판독 기준에 따라 결과가 다를 수 있으며, 판독자의 주관적인 판독이 결정적이기 때문에 같은 검체, 같은 항체 등 동일한 기술적인 방법을 사용하더라도 판독자에 따라 결과가 다를 수 있다는 단점이 있다. 예를 들어서 많은 연구에서 적용하고 있는 FDA에서 공인한 IHC 상업용 키트인 HercepTest^® (Dako)의 경우 1차 항체로써 토끼 유래의 항-HER2 다클론항체(rabbit antibody to human HER2 protein)를, 2차 항체로써 염소 유래의 항-토끼 항체(goat anti-rabbit immunoglobulin)을 사용하는데, 그 판독기준을 살펴보면, 10% 이상의 종양세포에서 강하게 세포막염색이 되는 경우 3+, 중등도로 막염색이 되는 경우 2+로 하며, 염색 정도가 강함 또는 중증도임을 결정하는 것은 지극히 주관적인 판단으로서 객관성이 떨어진다. 실제 동일 검체를 가지고 시행한 병리의사의 판독 일치 율을 보면 2+ 판독의 일치율은 59%에 불과하였다. 또한 HercepTest^®의 경우 2+ 이상을 HER2/neu 과발현으로 정의하고 있으나, 실제 2+ 검체 중 HER2/neu 유전자의 증폭을 보이는 경우는 약 25%에 불과하며, 이와 같이 유전자의 증폭을 동반하지 않는 IHC 2+ 환자의 경우 Herceptin 치료에 대한 반응이 좋지 않았다.

FISH 방법은 현재까지 알려진 HER2/neu 판정 방법 중 가장 정확한 방법으로서, 검출 민감도가 가장 높으며, 위음성이 거의 없다는 장점이 있으나, 고가의 형광현미경이 필요하고, IHC에 비해서 검사에 소요되는 시간이 약 2일로서 상대적으로 길고, 형광소식자의 비용이 IHC에 사용하는 항체에 비해 약 10배 비싸며, 암세포를 직접 확인할 수 없는 단점을 가지고 있다. 따라서, 임상에서는 IHC 방법으로 1차 선별검사를 하고, IHC 2+의 경우에 한하여 FISH 방법으로 확인하는 방법을 흔히 쓰고 있다. 이러한 권고는 여러 가지 연구를 통하여 IHC 3+와 FISH positive인 경우 서로의 감작의 일치율은 95%이며, 허셉틴 치료시 IHC 3+와 FISH positive의 반응률이 각각 49%로 동일한 것으로 보고되고 있다. 주로 임상에서는 IHC를 먼저 실시하여 IHC 3+인 경우에는 치료 대상군으로, IHC 0, 1+는 대상군에서 제외하고, IHC 2+인 경우에는 FISH 검사를 통하여 HER2 증폭을 한 번 더 확인한다.

그러나 IHC나 FISH를 통하여 치료 대상자를 가장 적절하게 선택하여도 허셉틴에 대한 치료 반응율은 50% 미만에 불과한바, 이는 기존의 HER2 테스트는 허셉틴 민감세포주와 허셉틴 내성세포주 모두에서 HER2의 증폭 및 과발현을 검출하여 실제로 허셉틴으로 치료할 대상을 선별하는데 어려움이 있기 때문이다. 따라서, 더 적절하게 허셉틴 치료 대상군을 선택할 수 있는 테스트가 개발된다면, 불필요한 낭비와 부작용을 줄일 수 있을 것이며, 현재 HER2 검색방법을 표준화하고 기술적으로 타당한 방법을 개발하기 위한 연구에 관심이 모아지고 있다.

이에, 본 발명자들은 기존의 HER2 테스트의 한계점을 보완하기 위해 연구한 결과, 진단용 항체로써 허셉틴을 이용하면 단순히 HER2가 과발현된 세포가 아닌, 허셉틴에 민감성이 있어 허셉틴에 대한 치료 효과를 가지는 HER2 과발현 세포만을 효율적으로 검출할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, HER2에 특이적인 허셉틴을 포함하며 항원-항체 결합반응을 통해 검체 시료 중 HER2의 발현 정도를 측정하는, 허셉틴에 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포 검출용 암 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 진단 키트를 이용하여 허셉틴에 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 허셉틴을 포함하는, 허셉틴에 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포 검출용 암 진단 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 HER2에 특이적인 허셉틴을 포함하며 항원-항체 결합반응을 통해 검체 시료 중 HER2의 발현 정도를 측정하는, 허셉틴에 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포 검출용 암 진단 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트에서 사용되는 "허셉틴"은 Genentech(San Francisco, CA, USA) 사에서 개발되어 상용화된 유방암 치료용 인간화 단일클론항체로서, Genentech 사로부터 구입하거나 공지된 방법에 의하여 제조하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 허셉틴뿐만 아니라 허셉틴의 항체 단편 또는 이들의 변이체를 사용할 수 있다. 본 발명에서 용어, "항체 단편"이란 바람직하게는 항원 결합영역 또는 그의 가변영역을 포함하는, 항체의 일부를 의미한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 scFv 단편 등이 있다. 항체를 파파인 (papain)으로 절단하면 Fab 단편으로 불리는 두 개의 동일한 항원-결합 단편 (각각 단일한 항원 결합부위를 가짐)과 나머지 Fc 단편이 생성된다. 반면, 항체에 펩신 (pepsin)을 처리하면 이가 항원-결합부위를 가지며 항원과 여전히 가교결합을 형성할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성시킨다. Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함하는 것이고, Fab' 단편은 Fab 단편과 달리 항체 힌지 (hinge) 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 수 개의 잔기가 부가되어 있다. 본 발명에서 용어, "변이체"란 본 발명에 따르는 항체 분자인 허셉틴과 실질적으로 유사한 생물학적 활성(작용성 또는 구조적), 즉 실질적으로 유사한 기질 특이성 또는 기질 절단성을 보유하고 있는 항체 분자를 의미한다. 예를 들어, 1개 또는 수 개의 점 돌연변이물, 1개 또는 수 개의 핵산 교환물, 결실물 또는 삽입물, 또는 1개 또는 수 개의 아미노산 교환물, 결실물 또는 삽입물을 수반할 수 있다. 상기 변이체는 여전히 항체 결합 활성과 같은 이의 생물학적 활성을 보유하고 있는데, 적어도 부분적으로 또는 심지어 이보다 개선된 생물학적 활성을 동반하기도 한다.

본 발명에서 검체 시료 중 HER2의 발현 정도를 측정하기 위한 "항원-항체 결합반응"은, 본 발명의 항체에 대한 항원의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며, 바람직하게는 면역조직화학법(immunohistochemistry), 면역블롯법(immunoblot), 면역침강법(immunoprecipitation), 효소결합 면역흡착분석법(ELISA; enzyme linked immunosorbent assay), 응집법(agglutination) 및 방사능 면역시험법(radio-immuno assay)로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 특히 바람직하게는 면역조직화학법(immunohistochemical techniques)을 사용할 수 있다.

본 발명에서 "허셉틴에 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포"란, 세포막에서 HER2를 정상의 세포에 비해 과발현하는 세포 중, 허셉틴에 의한 치료효과를 가지는 세포를 의미한다. HER2는 17번 염색체의 장완(17q21)에 존재하는 종양유전자(proto-oncogene)에 의해 암호화되는 185kD의 세포막 당단백으로서, p185의 세포 내 성분은 티로신 인산화효소(tyrosine kinase)의 활성을 가지고 있기 때문에 세포내 성분의 40% 및 세포외 성분의 85%에서 표피성장인자 수용체와 구조적 상동성을 가지며, 유방암, 폐암, 난소암 및 위암 등에서 발현이 관찰된다. 현재까지 확보된 다양한 유방암 세포주 중 허셉틴에 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포에는 AU565, SK-BR-3, SK-BR-3 및 HCC1569 등이 있다. 본 발명에 따른 키트는 JIMT-1 세포와 같이 HER2가 과발현되기는 하나 허셉틴에 대하여 치료 효과가 없는, 허셉틴 저항성 세포는 검출하지 않고, 상기와 같은 허셉틴 민감성 세포만을 검출하는 효과가 있다.

본 발명은 암 진단 키트로서, HER2가 과발현되어 발생하는 암을 검출할 수 있다. HER2가 과발현되는 암에는 유방암, 폐암, 난소암 및 위암 등이 있으나 이에 제한되지 아니하고, 특히 바람직하게는 유방암을 검출하는데 유용하다.

본 발명의 진단 키트는 기질과의 반응에 의하여 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체접합체, 상기 표지체와 발색 반응하는 발색 기질 용액 및 각 반응단계에 사용할 세척액을 추가로 포함할 수 있다.

상기 2차 항체접합체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, Q dot(Quantum dot), HRP(Horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose Oxidase), 루시퍼라아제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(MDH: malate dehydrogenase), 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase) 콜로이드 금(Coloid gold), 형광물질(Fluorescein), 방사성 물질 및 색소(Dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다. 형광물질로는 플루오르신이소티옥시아네이트(fluoresceine isothiocyanate), 피코빌리프로테인(phycobili proteins) 등을 사용할 수 있고, 발광물질로는 이소루시놀(isolucinol), 루시제닌(lucigenin) 등을, 방사성 물질로는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴C, ³H 등을 사용할 수 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있으며, 특히 바람직하게는, 실시예 3에서 보는 바와 같이 Q-dot을 사용했을 때 발색 정도를 보다 명확하게 확인할 수 있다. 본 발명에서는, 염소 유래의 항-인간 IgG-HRP 접합체 (goat anti-human IgG-HRP conjugate, Zymed) 및 Q-dot-항체접합체를 사용하였다.

상기 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, DAB (diaminobenzidine), AEC (3-amino-9-ethylcarbasole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD (o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 HCCR-1 단백질 항원의 존재 유무를 검출한다. 본 발명에서는, HRP (Horseradish Peroxidase)를 부착시킨 검출계 (detection system)를 사용하고 발색 기질로서 DAB (diaminobenzidine)를 사용하였다.

상기 세척액은 단계에 따라 증류수, TBS(Tris buffered saline) 트윈 완충용액, PBS( Phosphate buffer saline) , PSS인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20등을 사용할 수 있다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 반응기에 넣어 3 내지 6회 세척한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기의 진단 키트를 이용하여 허셉틴에 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포를 검출하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 1) 피험체로부터 표본을 제공받는 단계; 2) 단백질 분해효소를 처리하는 단계 및 ;3) 상기 표본에 허셉틴을 처리하여 항원-항체 반응시키는 단계를 포함하는, 허셉틴에 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에서 피험체로부터 제공받는 표본이란, HER2가 과발현되어 발생하는 암을 가지고 있거나 발병 위험이 있는지 여부를 판단하기 위하여 사람의 인체로부터 분리된 세포 또는 생검조직으로서, 암을 가진 피험체로부터 준비된 표본 또는 정상인으로부터 준비된 표본(예컨대, 유방암 조직 표본)일 수 있다. 피험자로부터 제공된 표본은 파라핀 포매 조직절편(Paraffin Embedded Tissues), 냉동조직절편(Frozen Tissues, Formalin Fixed Tissues) 및 Cell Smear 등으로 처리할 수 있으며, 이 중에서 파라핀 절편이 가장 많이 이용되고 있다. 세포나 조직의 형태학적 관찰을 원활하게 하기 위해서는 검체의 고정 과정이 제일 중요하다. 고정이 잘된 조직은 세포의 소기관이 잘 유지되지만, 고정이 부족하면 형태학적 구조가 불완전하게 되고, 고정이 너무 지나치면 항원의 소실과 비특이적인 반응이 나타날 수 있다. 조직 고정제는 응고형 고정제와 비응고형(변성형) 고정제로 구분되며 통상적으로 가장 많이 사용되고 있는 포르말린은 비응고형 고정제에 해당된다. 포르말린은 1시간에 1 mm 정도 조직에 침투하면서 고정이 이루어지는데, 항원결정부위(epitope)의 파괴가 적고 단백질과 펩타이드를 교차결합시키므로 세포의 형태가 잘 유지된다.

또한, 본 발명은 단계 1)을 시행한 후 단계 3)를 시행하기 전 단계에서, 단계 1)에서 제공받은 표본에 대하여 항원성을 복원시키기 위하여 단백질 분해효소를 전처리하는 단계를 포함한다.

본 발명에서, 항원성의 복원이란 포르말린에 고정한 후 제작한 파라핀 절편에서는 항원결정부위와 다른 단백질 사이에 교차결합(cross-link)을 원상태로 되돌림으로써, 항원이 잘 검출될 수 있도록 하는 것을 말한다. 최근에는 포르말린에 고정한 후 제작한 파라핀 절편에서 통상적인 염색방법으로 항원의 검출이 어려운 경우에는 전자렌지(Microwave), 고압 멸균기(Autoclave) 및 압력솥(Pressure Cooker) 등을 이용한 항원성 복원계(antigen retrieval system)를 이용하고 있다. 또한, 단백질 분해효소인 펩신(pepsin), 렌닌(rennin), 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 카텝신(cathepsin), 파파인(papain), 피신(ficin), 트롬빈(thrombin), 레닌(renin), 콜라게나제(collagenase), 브로멜라인(bromelain) and bacterioproteinase, 펩티다아제(peptidase), 프로테이나제 A(proteinase A), 프로테이나제 K (proteinase K) 등을 사용하여 포르말린 고정에 의하여 형성된 교차결합을 원상태로 되돌릴 수도 있다. 특히 바람직하게는, 프로테이나제 K 또는 펩신을 사용하는 것이 좋다.

바람직한 양태로서, 본 발명에서는 항원성 복원을 위하여 파라핀 포매 조직절편의 슬라이드를 프로테이나제 K(0.02㎎/㎖)에 넣어서 37℃에서 3분간 전처리하여 우수한 효과를 얻었다. 프로테이나제 K(Tritirachium alkaline proteinase)는 트리티라키움 알붐 림버(Tritirachium album Limber)에서 분리한 효소로서, 세린 엔도펩티다아제(Serine Endopeptidase)의 일종으로 단백질들을 빠르게 가수분해하고 요소(urea) 및 소디움 도데실 설페이트(SDS; sodium dodecyl sulfate)와 같은 계면활성제(detergent)에서도 활성을 잃지 않는다. 또한 프로테이나제 K는 케라틴을 구성하는 펩티드 결합까지도 가수분해시켜 줌으로써 세포에서는 DNA나 RNA를 분리 정제할 때 사용되기도 한다. 프로테이나제 K는 수용액 또는 현탁액 내에서 또는 동결건조된 분말로써 상업적으로 구입 가능하다(예를 들어, Invitrogen사 등에서 구입).

본 발명에서 허셉틴을 처리하여 항원-항체 결합반응을 시키는 단계는 생체 외에서 이루어지며, 검체 시료 중 HER2의 발현 정도를 측정하기 위한 항원-항체 결합반응은 면역조직화학법(immunohistochemistry), 면역블롯법(immunoblot), 면역침강법(immunoprecipitation), 효소결합 면역흡착분석법(ELISA; enzyme linked immunosorbent assay), 응집법(agglutination) 및 방사능 면역시험법(radio-immuno assay)로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 특히 바람직하게는 면역조직화학법(immunohistochemical techniques)을 사용할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.

또한, 본 발명은 단계 2)를 통해 생성된 항원항체 반응물을 표지체가 접합된 2차 항체 접합체 (Conjugate) 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계를 추가 로 포함할 수 있다.

본 발명의 진단 방법에서 사용할 수 있는 표지체, 2차 항체접합체 및 발색기질 용액의 상세 사항은, 상기 진단 키트를 구성하는 것과 동일한 구성을 가질 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 허셉틴을 포함하는, 허셉틴에 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포 검출하기 위한 암 진단용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "약학적 조성물"은 유효성분으로서 허셉틴을 포함하는 조성물로서, 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제 등의 다른 화학적 성분을 추가로 포함할 수 있다. 약학적 조성물의 목적은 생물체에 화합물의 투여를 용이하게 하는데 있다. 여기서, 용어 "유효성분"은 생물학적 효과의 원인이 될 수 있는 펩타이드 또는 항체 제제를 말한다. 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 이러한 용어에는 보조제가 포함된다. 적합한 담체로는 이에 한정되지는 않으나 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액들 중 어느 한 가지(예를 들어, 인산완충액) 또는 불용성 담체, 예컨대 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다. 용어 "부형제"는 활성 성분의 투여를 더욱 용이하게 하기 위하여 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물 질을 말한다. 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 전분의 여러가지 당류, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 기름 및 폴리에틸렌 글리콜 등이 있다.

기존의 HER2 검사 Kit (DAKO사)는 JIMT-1 과 같이 허셉틴에 내성(resistance)을 가지는 HER2 과발현 세포주에서도 강하게 염색됨으로써 허셉틴의 치료대상을 정확히 분류하지 못하는 문제가 있었는데 반하여(도 1 및 도 3), 본 발명은 Q dot-Trastuzumab을 사용할 경우 실제로 허셉틴에 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포주만을 판독함으로써 허셉틴의 치료대상을 정확하게 분류할 수 있다(도 1 내지 도 4).

본 발명은 허셉틴을 HER 과발현에 의한 암 진단용 항체로 이용하여 기존의 진단용 키트가 판독할 수 없는 영역, 즉 HER2가 과발현되기는 하나 허셉틴에 민감성을 가지고 있는지 여부를 판독함으로써 허셉틴의 치료대상을 정확하게 분류할 수 있는 유용성이 있다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. DAKO 사의 HER2 진단 키트에 따른 면역조직화학 염색반응 확인

현재까지 확보된 다양한 유방암 세포주 중 HER2/neu cell line인 AU565(HER2+;over), SK-BR-3(ATCC-HER2+;over), SK-BR-3(KCLB-HER2+;over), HCC1569(HER2+;over), JIMT-1(HER2+;over, Herceptin-resistance), HCC70(HER2-) 및 MCF7(HER2-) 을 준비하고, 각각의 세포주를 75㎠ 플라스크에 90% viability 로 하여 SK-BR-3 및 JIMT-1는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco), 10% 열불활성화된 (heat-inactivated) FBS (Gibco), 100μunit/100㎍ 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco)에서, AU565, HCC 1569, MCF 7 및 HCC 70 세포주는 RPMI 1640 (Ginco), 10% 열불활성화된 FBS (Gibco), 100μunit/100㎍ 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco)에서 37℃, 5% CO₂ 인 환경에서 5일 동안 배양하였다.

상기 배양한 세포주를 각각 파라핀에 포매한 세포블록 및 유방암 환자로부터 적출하여 파라핀에 포매한 조직블록을 4㎛ 절편으로 만들어 슬라이드에 부착한 후 크실렌(xylene)에 5분 동안 담가 파라핀을 제거하고(2회), 100% 에탄올에 3분(2회), 95% 에탄올에 1분(3회) 처리하여 재수화시킨 후, 증류수에 1분간(5회) 세척하였다. 항원성을 복원시키기 위하여 구연산 완충액 (citrate buffer pH6.0)에 슬라이드를 넣어서 마이크로웨이브에서 20분간 처리하였다. 내인성 퍼옥시다제 활성(endogenous peroxidase activity)을 제거하기 위하여 hydrogen peroxide blocking 용액(Labvision)에 10분간 방치한 후 4분간 TBS 트윈 버퍼로 세척하고, 다시 Cap-Plus^TM 진단 키트(Zymed, San Francisco Ca USA)에 들어있는 차단(blocking) 용액으로 10분간 처리하였다. 1차 항체로는 1:500으로 희석한 다중클론항체(polyclonal rabbit anti-human c-erbB-2, Dako)를 처리하고 90분 동안 보관한 후 4분간 TBS tween buffer로 세척하였다. 이후 2차항체(biotinylated secondary Antibody)를 처리하여 20분 동안 보관한 후 TBS tween buffer로 세척하였고, streptavidin-HRP로 실온에서 처리한 후 DAB(diaminobenzidine)을 사용하여 현미경 하에서 발색하였다. 메이어 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin)으로 대조 염색하고 봉입제(Mounting)로 봉입하여 광학 현미경 하에서 판독하였다.

그 결과, HER2가 과발현된 세포인 AU565, SK-BR-3, SK-BR-3, HCC1569 및 JIMT-1 모두에서 중증도의 세포막 염색을 관찰할 수 있었고, HER2가 발현되지 않은 세포인 HCC70 및 MCF7에서는 세포막 염색을 관찰할 수 없었다(도 1).

실시예 2. 허셉틴의 면역조직화학 염색반응 확인

현재까지 확보된 다양한 유방암 세포주 중 HER2/neu cell line인 AU565(HER2+;over), SK-BR-3(ATCC-HER2+;over), SK-BR-3(KCLB-HER2+;over), HCC1569(HER2+;over), JIMT-1(HER2+;over, Herceptin-resistance), HCC70(HER2-) 및 MCF7(HER2-) 을 준비하고, 각각의 세포주를 75㎠ 플라스크에 90% viability 로 하여 SK-BR-3 및 JIMT-1는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco), 10% 열불활성화된 (heat-inactivated) FBS (Gibco), 100μunit/100㎍ 페니실린/스 트렙토마이신 (Gibco)에서, AU565, HCC 1569, MCF 7 및 HCC 70 세포주는 RPMI 1640 (Ginco), 10% 열불활성화된 FBS (Gibco), 100μunit/100㎍ 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco)에서 37℃, 5% CO₂ 인 환경에서 5일 동안 배양하였다.

상기 배양한 세포주를 각각 파라핀에 포매한 세포블록 및 유방암 환자로부터 적출하여 파라핀에 포매한 조직블록을 4㎛ 절편으로 만들어 슬라이드에 부착한 후 크실렌(xylene)에 5분 동안 담가 파라핀을 제거하고(2회), 100% 에탄올에 3분(2회), 95% 에탄올에 1분(3회) 처리하여 재수화시킨 후, 증류수에 1분간(5회) 세척하였다. 항원성 복원을 위하여 세포블록 슬라이드는 프로테이나제 K(0.02㎎/㎖)에 넣어서 37℃에서 4분간 처리하고, 조직블록 슬라이드는 프로테이나제 K(0.02㎎/㎖)에 넣어서 37℃에서 30분간 처리하였다. 내인성 과산화수소 활성(endogenous peroxidase activity)을 제거하기 위하여 hydrogen peroxide blocking 용액(Dako)에 10분간 방치한 후 4분간 TBS 트윈 버퍼로 세척하고, 비특이적 면역반응을 제거하기 위한 차단 항체(Blocking antibody)로 Super block(Scytek, Logan, Utah, USA)으로 5분간 반응시킨 후 TBS 트윈 버퍼로 세척하였다. human-to-human block(Scytek)을 60분간 처리한 후 TBS 트윈 버퍼로 세척하고, 1차 항체로는 허셉틴 10㎍/㎖(Genentech, San Francisco, CA)를 처리하고 90분 동안 보관한 후 TBS tween buffer로 세척하였다. 이후 2차 항체(HRP-Goat Anti-Human IgG conjugate, Zymed)를 처리하여 20분 동안 보관한 후 TBS로 세척하였고, DAB(diaminobenzidine)을 사용하여 현미경 하에서 발색하였다. 메이어 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin) 으로 대조 염색하고 봉입제(Mounting)로 봉입하여 광학 현미경 하에서 판독하였다.

그 결과, HER2가 과발현된 세포 중 허셉틴에 민감성을 가지는 세포인 AU565, SK-BR-3, SK-BR-3 및 HCC1569에서는 중증도의 세포막 염색을 관찰할 수 있었으나, HER2가 과발현된 세포 중 허셉틴에 저항성을 가지는 세포인 JIMT-1, HER2가 발현되지 않은 세포인 HCC70 및 MCF7에서는 세포막 염색을 관찰할 수 없었다(도 1). 또한, 유방암 환자의 조직 또는 정상인의 조직에 있어서, DAKO사의 HER2 진단 키트에 따른 면역조직화학 염색반응의 경우 FISH에 의해 정상으로 판독된 경우에도 중증도의 막염색을 나타내서 두 방법에 의한 감작의 불일치가 나타났으나, 허셉틴을 일차 항체로 사용한 면역조직화학 염색반응의 경우 FISH에 의한 판독 결과와 정확한 일치를 보였다(도 2).

즉, 기존의 DAKO사의 HER2 테스트는 허셉틴에 대한 민감성 여부와 상관없이 HER2가 과발현된 세포에서는 모두 막염색을 보이지만, 허셉틴을 진단용 항체로 사용한 경우에는 HER2가 과발현된 세포 중에서도 허셉틴에 민감성을 가지는 세포만을 판독할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 3. 허셉틴 및 Q- dot 을 이용한 면역조직화학 염색반응 확인

현재까지 확보된 다양한 유방암 세포주 중 HER2/neu cell line인 AU565(HER2+;over), SK-BR-3(ATCC-HER2+;over), SK-BR-3(KCLB-HER2+;over), HCC1569(HER2+;over), JIMT-1(HER2+;over, Herceptin-resistance), HCC70(HER2-) 및 MCF7(HER2-) 을 준비하고, 각각의 세포주를 75㎠ 플라스크에 90% viability 로 하여 SK-BR-3 및 JIMT-1는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco), 10% 열불활성화된 (heat-inactivated) FBS (Gibco), 100μunit/100㎍ 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco)에서, AU565, HCC 1569, MCF 7 및 HCC 70 세포주는 RPMI 1640 (Ginco), 10% 열불활성화된 FBS (Gibco), 100μunit/100㎍ 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco)에서 37℃, 5% CO₂인 환경에서 5일 동안 배양하였다.

상기 배양한 세포주를 각각 파라핀에 포매한 세포블록 및 유방암 환자로부터 적출하여 파라핀에 포매한 조직블록을 4㎛ 절편으로 만들어 슬라이드에 부착한 후 크실렌(xylene)에 5분 동안 담가 파라핀을 제거하고(2회), 100% 에탄올에 3분(2회), 95% 에탄올에 1분(3회) 처리하여 재수화시킨 후, 증류수에 1분간(5회) 세척하였다. 항원성 복원을 위하여 세포블록 슬라이드는 프로테이나제 K(0.02㎎/㎖)에 넣어서 37℃에서 4분간 처리하고, 조직블록 슬라이드는 프로테이나제 K(0.02㎎/㎖)에 넣어서 37℃에서 30분간 처리하였다. 내인성 과산화수소 활성(endogenous peroxidase activity)을 제거하기 위하여 hydrogen peroxide blocking 용액(Dako)에 10분간 방치한 후 4분간 TBS 트윈 버퍼로 세척하고, 비특이적 면역반응을 제거하기 위한 차단 항체(Blocking antibody)로 Super block(Scytek, Logan, Utah, USA)으로 5분간 반응시킨 후 TBS 트윈 버퍼로 세척하였다. human-to-human block(Scytek)을 60분간 처리한 후 TBS 트윈 버퍼로 세척하고, 1차 항체로는 허셉틴 10㎍/㎖(Genentech, San Francisco, CA)를 처리하고 60분 동안 보관한 후 TBS tween buffer로 세척하였다. 이후 Q-dot을 접합시킨 2차 항체(Q-dot 605 goat Anti-Human IgG conjugate, Invitrogen)를 처리하여 30분 동안 보관한 후 TBS로 세척한 후 형광현미경 하에서 판독하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 기존의 DAKO사의 HER2 진단 키트에 사용된 항체에 표지체로서 Q-dot을 사용하여 면역조직화학 염색반응을 시킨 경우 HER2가 과발현된 세포인 AU565, SK-BR-3 (ATCC), SK-BR-3 (KCLB), HCC1569 및 JIMT-1 모두에서 발색을 관찰할 수 있었으나, 허셉틴에 Q-dot을 표지하여 면역조직화학 염색반응을 시킨 경우 HER2가 과발현된 세포 중 허셉틴에 민감성을 가지는 세포인 AU565, SK-BR-3 (ATCC), SK-BR-3 (KCLB) 및 HCC1569에서는 발색을 관찰할 수 있었으나, HER2가 과발현된 세포 중 허셉틴에 저항성을 가지는 세포인 JIMT-1, HER2가 발현되지 않은 세포인 HCC70 및 MCF7에서는 발색을 관찰할 수 없었다(도 3). 즉, 허셉틴을 진단용 항체로 사용한 경우에는 HER2가 과발현된 세포 중에서도 허셉틴에 민감성을 가지는 세포만을 판독할 수 있음을 다시 한 번 확인할 수 있었으며, 표지체로서 Q-dot을 사용한 경우 도 1 또는 도 2의 경우보다 정확하게 판독할 수 있었다.

실시예 4. 프로테이나제 K 및 펩신을 이용한 면역조직화학 염색반응 확인

HER2/neu 세포주인 AU565(HER2+;과발현), SK-BR-3(ATCC-HER2+;과발현), SK-BR-3(KCLB-HER2+;과발현), HCC1569(HER2+;과발현), JIMT-1(HER2+;과발현, 허셉틴-저항성 세포주), HCC70(HER2-) 및 MCF7(HER2-)의 세포블록을 파라핀에 포매하여 4㎛ 절편으로 만들어 2개의 슬라이드에 각각 부착한 후 크실렌(xylene)에 5분 동안 담가 파라핀을 제거하고(2회), 100% 에탄올에 3분(2회), 95% 에탄올에 1분, 80% 에탄올에 1분 및 70% 에탄올에 1분씩 처리하여 재수화시킨 후, 증류수에 1분간(5회) 세척하였다. 항원성 복원을 위하여 슬라이드 하나는 프로테이나제 K(0.02㎎/㎖)에 넣어서 37℃에서 4분간 처리하고, 나머지 하나는 펩신(pepsin)을 상온에서 4분간 처리하였다. 2% BSA/PBS에 20분간 처리한 후 PBS로 세척하고, 비특이적 면역반응을 제거하기 위한 Blocking antibody로 Super block(Scytek, Logan, Utah, USA)으로 5분간 반응시킨 후 PBS로 세척하였다. human-to-human block(Scytek)을 60분간 처리한 후 PBS로 세척하고, 1차 항체로는 허셉틴 10㎍/㎖(Genentech, San Francisco, CA)를 각각 처리하고 면역조직화학염색을 위해서는 90분 동안, Q-dot을 이용하는 면역조직화학염색을 위해서는 60분 동안 실온에서 보관한 후 PBS로 세척하였다.

일반 면역조직화학염색은 이후 2차 항체(HRP-Goat Anti-Human IgG conjugate, Zymed)를 각각 처리하여 30분 동안 실온에서 보관한 후 PBS로 세척하였고, DAB(diaminobenzidine)을 사용하여 현미경 하에서 발색하였다. Mayer's hematoxylin으로 대조 염색하고 봉입제(Mounting)로 봉입하여 광학 현미경 하에서 판독하였다.

Q-dot을 이용한 면역조직화학염색은 Q-dot을 접합시킨 2차 항체(Q-dot 605 goat Anti-Human IgG conjugate, Invitrogen)를 처리하여 30분 동안 보관한 후 TBS로 세척한 후 형광현미경 하에서 판독하였다.

그 결과, 프로테이나제 K로 전처리한 것과 펩신으로 전처리한 것 모두, 허셉틴에 Q-dot을 표지하여 면역조직화학 염색반응을 시킨 경우 HER2가 과발현된 세포 중 허셉틴에 민감성을 가지는 세포인 AU565, SK-BR-3 (ATCC), SK-BR-3 (KCLB) 및 HCC1569에서는 발색을 관찰할 수 있었으나, HER2가 과발현된 세포 중 허셉틴에 저항성을 가지는 세포인 JIMT-1, HER2가 발현되지 않은 세포인 HCC70 및 MCF7에서는 발색을 관찰할 수 없었다(도 4 및 도 5). 즉, 프로테이나제 K로 전처리한 것과 펩신으로 전처리한 경우 모두 허셉틴에 민감성을 가지는 세포를 잘 판독할 수 있었으며, 허셉틴을 진단용 항체로 사용한 경우에는 HER2가 과발현된 세포 중에서도 허셉틴에 민감성을 가지는 세포만을 판독할 수 있음을 다시 한 번 확인할 수 있었다.

도 1은 HER2/neu 세포주인 AU565(HER2+;과발현), SK-BR-3(ATCC-HER2+;과발현), SK-BR-3(KCLB-HER2+;과발현), HCC1569(HER2+;과발현), JIMT-1(HER2+;과발현, 허셉틴-저항성 세포주), HCC70(HER2-) 및 MCF7(HER2-)에 있어서, DAKO사의 HER2 진단 키트에 따른 면역조직화학 염색반응 및 허셉틴을 일차 항체로 사용한 경우의 면역조직화학 염색반응 결과를 비교한 것이다.

도 2는 DAKO사의 HER2 진단 키트 및 FISH에 의해 판독된 유방암 환자의 조직 또는 정상인의 조직에 있어서, 실제로 DAKO사의 HER2 진단 키트에 따른 면역조직화학 염색반응 및 허셉틴을 일차 항체로 사용한 경우의 면역조직화학 염색반응 결과를 비교한 것이다.

도 3은 HER2/neu 세포주인 AU565(HER2+;과발현), SK-BR-3(ATCC-HER2+;과발현), SK-BR-3(KCLB-HER2+;과발현), HCC1569(HER2+;과발현), JIMT-1(HER2+;과발현, 허셉틴-저항성 세포주), HCC70(HER2-) 및 MCF7(HER2-)에 있어서, 살아있는 세포에서 DAKO사의 HER2 진단 키트에 표지체로서 Q-dot을 사용한 경우의 면역조직화학 염색반응 및 허셉틴에 Q-dot을 표지하여 사용한 경우의 면역조직화학 염색반응 결과를 비교한 것이다.

도 4는 HER2/neu 세포주인 AU565(HER2+;과발현), SK-BR-3(ATCC-HER2+;과발현), SK-BR-3(KCLB-HER2+;과발현), HCC1569(HER2+;과발현), JIMT-1(HER2+;과발현, 허셉틴-저항성 세포주), HCC70(HER2-) 및 MCF7(HER2-)에 있어서, 허셉틴을 1차 항체로 이용하고 2차 항체로 Q-dot을 표지한 항 인간 이뮤노글로불린 G(anti human immunoglobulin G)를 이용하고, 프로테이나제 K를 전처리 하였을 때 세포블록에 면역조직화학 염색반응 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 펩신(Pepsin)을 전처리한 경우의 면역조직화학 염색반응 결과를 나타낸 것이다.

Claims

HER2에 특이적인 허셉틴을 포함하며 항원-항체 결합반응을 통해 검체 시료 중 HER2의 발현 정도를 측정하는, 허셉틴에 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포 검출용 암 진단 키트.
제 1항에 있어서, 상기 암은 유방암인 진단 키트.
제 1항에 있어서, 상기 항원-항체 결합반응이 면역조직화학법(immunohistochemical techniques), 면역블롯법(immunoblot), 면역침강법(immunoprecipitation), 효소결합 면역흡착분석법(ELISA; enzyme linked immunosorbent assay), 응집법(agglutination) 및 방사능 면역시험법(radio-immuno assay)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 1항에 있어서, 상기 항원-항체 결합반응이 면역조직화학법(immunohistochemical techniques)인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 1항에 있어서, 기질과의 반응에 의하여 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체접합체, 상기 표지체와 발색 반응하는 발색 기질 용액 및 각 반응단계에 사용할 세척액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 5항에 있어서, 2차 항체 접합체의 표지체가 Q dot(Quantum dot), HRP(Horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose Oxidase), 루시퍼라아제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(MDH: malate dehydrogenase), 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase) 콜로이드 금(Coloid gold), 형광물질(Fluorescein), 방사성 물질 및 색소(Dye) 로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 5항에 있어서, 2차 항체 접합체의 표지체가 Q dot(Quantum dot)인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 5항에 있어서, 발색기질이 DAB (diaminobenzidine), AEC(3-amino-9- ethylcarbasole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD (o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
1) 인체로부터 분리된 세포 또는 조직 표본에 단백질 분해효소를 처리하는 단계; 및 2) 상기 세포 또는 조직 표본에 허셉틴을 처리하여 항원-항체 반응시키는 단계를 포함하는, 허셉틴에 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포의 검출방법.
제 9항에 있어서, 상기 표본이 유방암 환자의 조직 표본인 방법.
제 9항에 있어서, 상기 단백질 분해효소가 프로테이나제 K(proteinase K) 또는 펩신(pepsin)인 방법.
제 9항에 있어서, 상기 항원-항체 결합반응이 면역조직화학법(immunohistochemical techniques), 면역블롯법(immunoblot), 면역침강법(immunoprecipitation), 효소결합 면역흡착분석법(ELISA; enzyme linked immunosorbent assay), 응집법(agglutination) 및 방사능 면역시험법(radio-immuno assay)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 항원-항체 결합반응이 면역조직화학법(immunohistochemical techniques)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 단계 2)를 통해 생성된 항원항체 반응물을 2차 항체 접합체 (Conjugate) 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 14항에 있어서, 2차 항체 접합체의 표지체가 Q dot(Quantum dot), HRP(Horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose Oxidase), 루시퍼라아제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(MDH: malate dehydrogenase), 아세 틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase) 콜로이드 금(Coloid gold), 형광물질(Fluorescein), 방사성 물질 및 색소(Dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 2차 항체 접합체의 표지체가 Q dot(Quantum dot)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 발색기질이 DAB (diaminobenzidine), AEC(3-amino-9-ethylcarbasole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD (o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
허셉틴을 포함하는, 허셉틴에 민감성을 가지는 HER2 과발현 세포 검출하기 위한 암 진단용 약학적 조성물.
제 18항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가적으로 포함하는 조성물.