JP5219827B2 - ｉｎｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗ヒトＤｌｋ−１抗体 - Google Patents

Description

本発明は、抗腫瘍活性を有する抗ヒトＤｌｋ−１抗体、特にｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗ヒトＤｌｋ−１抗体に関する。また本発明は、当該抗体を産生するハイブリドーマ、及び当該抗体の用途に関する。

ヒトＤｌｋ−１（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ １ ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）；以下「ｈＤｌｋ−１」ということがある。）は、全長３８３アミノ酸残基の１回膜貫通型の１型膜タンパク質であり、細胞外領域に６つのＥＧＦ様モチーフを有する。その細胞外領域は、Ｎｏｔｃｈ／Ｄｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅファミリーと相同性を示す。ｈＤｌｋ−１遺伝子は、ＧＲＰ（ｇａｓｔｒｉｎ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）応答性の肺小細胞癌由来細胞株で発現する分子（非特許文献１）あるいは前脂肪細胞の分化を抑制する因子としてクローニングされた（非特許文献２）。ｈＤｌｋ−１は、細胞分化制御因子であるＮｏｔｃｈレセプターのリガンドであるＤｅｌｔａとのアミノ酸配列の相同性から、ＤＬＫ１という遺伝子シンボルで称されるのが一般的であり、その他に、Ｐｒｅｆ−１（非特許文献２）、ｐＧ２（非特許文献３）、ＳＣＰ−１（非特許文献４）及びＺＯＧ（非特許文献５）といった複数の遺伝子シンボルを持つが、これらは基本的に同一分子である。
また、ｈＤｌｋ−１は、細胞外領域の細胞膜近傍が未同定のプロテアーゼにより切断され、血液中に分泌される。遊離ｈＤｌｋ−１（ｈＤｌｋ−１細胞外領域）は、２２５〜２６２アミノ酸残基のＦＡ−１（Ｆｅｔａｌ ａｎｔｉｇｅｎ−１）（非特許文献６）と呼ばれる糖タンパク質と同一の分子である。
ｈＤｌｋ−１遺伝子及びその遺伝子産物は、未分化で増殖能の高い胎児細胞で高発現を示す。特に、胎児肝臓、胎児腎臓、胎児骨格筋、胎児脳などで高い発現を示すが、出生後はほとんどの組織で発現が認められなくなり、正常な成体組織においては副腎、胎盤、下垂体に限局している（特許文献１、非特許文献２）。
さらに、成体組織においても、未分化な幹細胞や前駆細胞と考えられている細胞には、ｈＤｌｋ−１の発現が認められる。例えば、成体肝臓における未分化で多分化能を有する肝オーバル細胞（非特許文献７、８）や、骨／軟骨／脂肪細胞の幹細胞である間葉系幹細胞（非特許文献９）で、ｈＤｌｋ−１の発現が報告されており、これら組織幹細胞の性質、例えば未分化能の維持等、に関与していることが示唆される。
このような、胎児期の細胞や幹細胞に限局しているｈＤｌｋ−１の発現様式や、ＥＧＦ様モチーフを有する遺伝子／遺伝子産物のファミリー（Ｎｏｔｃｈ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｎｏｔｃｈ ｌｉｇａｎｄ（Ｄｅｌｔａ，Ｊａｇｇｅｄ，ｓｅｒｒａｔｅ）など）は、一般にＥＧＦ様モチーフを介する細胞間相互作用により、細胞の増殖や分化を制御することから、ｈＤｌｋ−１もそのような機能を有することが示唆されている。事実、脂肪前駆細胞の分化にともない、発現が低下し、また脂肪前駆細胞にｈＤｌｋ−１遺伝子を強制発現させると脂肪分化が抑制されることがよく知られている（非特許文献２）。しかしながら、現時点において、ｈＤｌｋ−１と相互作用する分子（リガンド）についての詳細は不明である。
一方、ｈＤｌｋ−１遺伝子及びその遺伝子産物は、様々な癌や腫瘍でも高頻度で発現していることが報告されている。現在までに、その発現が確認されている癌の種類としては、固形癌では、神経内分泌腫瘍、神経芽細胞腫、神経膠腫、１型神経線維腫症、小細胞肺癌、肝臓癌、腎臓癌及び卵巣癌が知られており（特許文献１、２、及び、非特許文献１、３、１０、１１、１２、１３、１４）、血液癌では、骨髄異形成症候群（特許文献３、及び、非特許文献１５、１６）及び急性骨髄性白血病（非特許文献１６）が知られている。赤白血病細胞株（ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ）であるＫ５６２細胞にｈＤｌｋ−１遺伝子を導入すると細胞増殖が亢進されること（非特許文献１６）、同様に、グリア芽種細胞にｈＤｌｋ−１遺伝子を導入すると、細胞増殖の亢進に加えて、細胞の接触阻止が失われ、足場非依存的な細胞増殖能を獲得することが報告されており、ｈＤｌｋ−１と発癌との関連性が示唆されている（非特許文献１７）。
＜特許文献＞
ＷＯ ２００５／０５２１５６ ＷＯ ０２／０８１６２５ 特開２００１−２６９１７４号

＜非特許文献＞
Ｌａｂｏｒｄａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２６８（６），ｐ．３８１７−３８２０（１９９３） Ｓｍａｓ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ，７３（４），ｐ．７２５−７３４（１９９３） Ｈｅｌｍａｎ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８４，ｐ．２３３６−２３３９（１９８７） Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ，Ｇｅｎｅｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｄ１６８４７（１９９３） Ｈａｌｄｅｒ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１３９，ｐ．３３１６−３３２８（１９９８） Ｆａｙ，Ｔ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２９，ｐ．７３−８５（１９８８） Ｔａｎｉｍｉｚｕ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｔｅｒｎｓ，ｖｏｌ．５，ｐ．２０９−２１８（２００４） Ｊｅｎｓｅｎ，ＣＨ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，ｖｏｌ．１６４（４），ｐ．１３４７−１３５９（２００４） Ａｂｄａｌｌａｈ，Ｂ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１９（５），ｐ．８４１−８５２（２００４） Ｊｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，ｖｏｌ．１４０（６），ｐ．１０５４−１０５９（１９９９） Ｊｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２０（５），ｐ．２５６−２６２（１９９９） Ｙｉｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，ｖｏｌ．２４（４），ｐ．１０１１−１０１５（２００４） Ｙｉｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２５（１３），ｐ．１８５２−１８６１（２００６） Ｆｕｋｕｚａｗａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，ｖｏｌ．５８，ｐ．１４５−１５０（２００６） Ｍｉｙａｚａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．９８，ｐ．４２２−４２７（２００１） Ｓａｋａｊｉｒｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，ｖｏｌ．１９（８），ｐ．１４０４−１４１０（２００５） Ｙｉｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２５（１３），ｐ．１８５２−１８６１（２００６）

上述したように、ｈＤｌｋ−１の発現は正常組織では胎児期の細胞や幹細胞に限局しているが癌組織では種々の腫瘍で高頻度に発現していること、及びｈＤｌｋ−１が細胞膜タンパク／分泌タンパクであることから、ｈＤｌｋ−１は、各種腫瘍の治療等において良い標的になると考えられる。そして、このｈＤｌｋ−１を標的とする場合、抗ｈＤｌｋ−１抗体が有用であると考えられる。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、抗腫瘍活性を有する抗ヒトＤｌｋ−１抗体、特にｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗ヒトＤｌｋ−１モノクローナル抗体を提供することにある。さらに、当該抗体を産生するハイブリドーマ、当該抗体と薬剤との複合体、腫瘍の診断用又は治療用医薬組成物、腫瘍の検出方法、腫瘍の検出用又は診断用キットを提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、ヒトＤｌｋ−１と特異的に反応する抗体（特に抗ヒトＤｌｋ−１モノクローナル抗体）であって抗腫瘍活性を有する抗体、さらには当該抗体と各種薬剤との複合体（イムノコンジュゲート）を見出し、これらがｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗腫瘍活性を有することを確認した。また、これら抗体及び複合体が、腫瘍の治療、診断及び検出に有用であることも見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する、ヒトＤｌｋ−１に対する抗体。
上記腫瘍としては、例えばヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
上記（１）の抗体において、抗腫瘍活性は、例えば腫瘍血管新生阻害活性が挙げられる。
上記（１）記載の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体であるものが挙げられる。
上記（１）記載の抗体は、例えば、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号３０〜３２で示されるアミノ酸配列であるもの、及び／又は、Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号３３〜３５で示されるアミノ酸配列であるものが挙げられる。
本発明の抗体としては、ハイブリドーマが産生する抗体、遺伝子組換え抗体などが挙げられる。
ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、ミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる所望の抗原特異性を有する抗体を生産する細胞をいう。
遺伝子組換え抗体としては、キメラ抗体（ヒト型キメラ抗体）、ヒト化抗体、ヒト抗体またはそれらの抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。ここで、キメラ抗体としては、例えば、Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるものが挙げられる。
（２）受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７０７であるハイブリドーマにより産生される、ヒトＤｌｋ−１に対するモノクローナル抗体。
（３）受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０８９９であるハイブリドーマにより産生される、ヒトＤｌｋ−１に対するモノクローナル抗体。
（４）受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０９００であるハイブリドーマにより産生される、ヒトＤｌｋ−１に対するモノクローナル抗体。
上記（１）〜（４）に記載の抗体は、例えば、配列番号２に示されるヒトＤｌｋ−１のアミノ酸配列中の、第２６番目〜第８５番目のアミノ酸からなる領域、第９２番目〜第１６７番目のアミノ酸からなる領域、又は第１３１番目〜第２４４番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部と結合する（当該一部を認識する）ものが挙げられる。
（５）上記（１）〜（４）に記載の抗体としては、例えば、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７０７、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８９９、又はＦＥＲＭ ＢＰ−１０９００であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が結合（認識）する部位（例えばエピトープ）に結合する抗体が挙げられる。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体に由来する抗体断片。
上記（６）記載の抗体断片は、例えば、配列番号３０〜３２で示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられ、具体的には、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
上記（６）記載の抗体断片は、例えば、配列番号３３〜３５で示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられ、具体的には、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
（７）上記（１）記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
（８）受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７０７である、ヒトＤｌｋ−１に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（９）受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０８９９である、ヒトＤｌｋ−１に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（１０）受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０９００である、ヒトＤｌｋ−１に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（１１）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物とを含む、抗体−薬剤複合体。
（１２）上記（６）記載の抗体断片と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物とを含む、抗体断片−薬剤複合体。
上記（１１）及び（１２）記載の複合体において、腫瘍としては、例えばヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
上記（１１）及び（１２）記載の複合体において、抗腫瘍活性は、例えば腫瘍血管新生阻害活性が挙げられる。
（１３）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体、上記（６）記載の抗体断片、及び上記（１１）又は（１２）記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、医薬組成物。
上記（１３）記載の組成物は、例えば、腫瘍の治療に用いるものが挙げられ、腫瘍の治療としては、例えば、腫瘍血管新生を阻害することが挙げられる。また、当該組成物は、例えば、体重減少の副作用を有しないものが挙げられる。
上記（１３）記載の組成物は、例えば、腫瘍の診断に用いるものが挙げられる。
上記（１３）記載の組成物において、腫瘍としては、例えばヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
（１４）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体、上記（６）記載の抗体断片、及び上記（１１）又は（１２）記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍治療剤。
上記（１４）記載の治療剤は、例えば、体重減少の副作用を有しないものが挙げられる。
上記（１４）記載の治療剤において、腫瘍としては、例えば、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
（１５）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体、上記（６）記載の抗体断片、及び上記（１１）又は（１２）記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍血管新生阻害剤。
上記（１５）記載の阻害剤は、例えば、体重減少の副作用を有しないものが挙げられる。
上記（１５）記載の阻害剤において、腫瘍としては、例えば、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
（１６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体、上記（６）記載の抗体断片、及び上記（１１）又は（１２）記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍診断剤。
上記（１６）記載の診断剤において、腫瘍としては、例えば、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
（１７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体、上記（６）記載の抗体断片、及び上記（１１）又は（１２）記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種と、生体から採取された試料とを反応させ、反応した抗体のシグナルを検出することを特徴とする、腫瘍の検出方法。
上記腫瘍としては、例えばヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
（１８）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体、上記（６）記載の抗体断片、及び上記（１１）又は（１２）記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種、あるいは上記（１３）の医薬組成物を患者に投与することを含む、腫瘍の診断及び／又は治療方法。
上記腫瘍としては、例えばヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
上記（１８）の方法としては、例えば、腫瘍の血管新生を阻害又は抑制することによる腫瘍の治療方法が挙げられる。
（１９）腫瘍の診断用及び／又は治療用の、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体、上記（６）記載の抗体断片、又は上記（１１）若しくは（１２）記載の複合体。
上記腫瘍としては、例えばヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
（２０）腫瘍を診断及び／又は治療するための医薬の製造のための、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体、上記（６）記載の抗体断片、又は上記（１１）若しくは（１２）記載の複合体の使用。
上記腫瘍としては、例えばヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
（２１）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体、上記（６）記載の抗体断片、及び上記（１１）又は（１２）記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍の検出用、診断用又は治療用キット。
上記腫瘍としては、例えばヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。

図１は、ｈＤｌｋ−１発現肝癌細胞株（Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ ｃｅｌｌ）を用いたＸｅｎｏｇｒａｆｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいて、公知の（ＷＯ ２００５／０５２１５６）抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体３クローン（１Ｃ１，４Ｃ４，３１Ｃ４）を投与した場合の結果を表す図である。各抗体は、１日目（Ｄａｙ １）、４日目（Ｄａｙ ４）、７日目（Ｄａｙ ７）及び１０日目（Ｄａｙ １０）の計４回（矢印）腹腔内投与を行った。
Ａ： ラットＩｇＧ（コントロール群）（●），１Ｃ１（○）
Ｂ： ラットＩｇＧ（コントロール群）（●），４Ｃ４（○）
Ｃ： ラットＩｇＧ（コントロール群）（●），３１Ｃ４（○）
Ａ〜Ｃのそれぞれにおいて、各群の個体数はＮで示し、各測定値（腫瘍体積）は平均値±標準誤差で表した。これらの実験は、少なくとも３回の独立した実験を行った。いずれの場合もヌードマウス皮下で確立した肝癌に対する抗腫瘍活性は認められなかった。
図２は、Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ ｃｅｌｌを用いたＸｅｎｏｇｒａｆｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいて、新規な抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体クローンＤＩ−２−１４（マウスＩｇＧ１）の抗腫瘍活性を評価した図である。
Ａ： コントロール群（マウスＩｇＧ）とＤＩ−２−１４投与群の腫瘍成長を経時的に表した（平均値±標準誤差）。矢印は抗体投与（２０ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内投与）を表す。^＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ： Ａの試験において、１４日目（Ｄａｙ１４）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。各プロット上に示す数値は、平均値±標準誤差。^＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｃ： ＤＩ−２−１４の抗腫瘍活性を独立した別の実験で評価した結果を表す。^＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ−ｔｅｓｔ）
図３は、Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ ｃｅｌｌを用いたＸｅｎｏｇｒａｆｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいて、Ａ：クローン２−１３（ラットＩｇＧ２ｂ）、Ｂ：クローンＢＡ−１−３Ｄ（マウスＩｇＧ２ａ）、Ｃ：クローンＤＩ−６（マウスＩｇＧ１）、Ｄ：クローンＭ３−１（マウスＩｇＧ１）の抗腫瘍活性を評価した図である。腫瘍体積は平均値±標準誤差で表し、アスタリスクは、有意差検定（^＊Ｐ＜０．０１，^＊＊Ｐ＜０．０５ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ−ｔｅｓｔ）の結果を示す。
図４は、抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体（クローン２−１３）のｈＤｌｋ−１発現大腸癌細胞株（ＳＷ４８０−ｈＤｌｋ細胞）を用いたＸｅｎｏｇｒａｆｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルでの抗腫瘍活性を示した図である。ＳＷ４８０−ｈＤｌｋ細胞をヌードマウス皮下に移植し、大腸癌組織を確立させた。矢印で示す時点で抗体（２０ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与した。腫瘍体積は平均値±標準誤差で示した（^＊Ｐ＜０．０１，^＊＊Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ−ｔｅｓｔ）。
図５は、ＨＥＫ２９３−ｈＤｌｋ細胞を用いた抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体のフローサイトメトリーによる反応性を示す図である。各ヒストグラムの上に示す番号は、クローン番号を示す。黒塗りがアイソタイプコントロール抗体。黒線が抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体である。
図６は、Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ細胞を用いた抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体のフローサイトメトリーによる反応性を示す図である。各ヒストグラムの上に示す番号は、クローン番号を示す。黒塗りがアイソタイプコントロール抗体。黒線が抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体である。
図７は、抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体が認識するエピトープを解析するために作製した、各ＥＧＦ様モチーフを欠失させた変異体の模式図である。
図８は、クローンＤＩ−２−１４のエピトープ解析の結果を示す図である。
Ａ： 記載してあるｈＤｌｋ−１遺伝子の変異体を、ＣＯＳ−７細胞にリポフェクションにより一過性に遺伝子導入し２４〜７２時間後にＦＡＣＳ解析した図である（左：マウスＩｇＧ１、右：ＤＩ−２−１４）。ゲートをかけている部分が、クローンＤＩ−２−１４が認識している各変異体発現細胞を示す。
Ｂ： ＥＧＦ（１−２）を発現させたＣＯＳ−７細胞の塗沫標本を、陽性コントロール（抗ｈＤｌｋ−１ポリクローナル抗体）とクローンＤＩ−２−１４とで免疫染色した写真である。茶褐色に染色されている部分がＥＧＦ（１−２）の発現を示す。
図９は、クローンＤＩ−６、ＢＡ−１−３Ｄ及び２−１３のエピトープ解析の結果を示す図である。
Ａ： 記載してあるｈＤｌｋ−１遺伝子の変異体を、ＣＯＳ−７細胞にリポフェクションにより一過性に遺伝子導入し２４〜７２時間後にＦＡＣＳ解析した図である。ゲートをかけている部分が、各クローンが認識している各変異体発現細胞を示す。
Ｂ： ＥＧＦ（１−２）を発現させたＣＯＳ−７細胞の塗沫標本を、クローンＤＩ−６、ＢＡ−１−３Ｄ及び２−１３で免疫染色した写真である。矢印で示す茶褐色に染色されている部分がＥＧＦ（１−２）の発現を示す。
図１０は、クローンＭ３−１のＦＡＣＳによるエピトープ解析の結果を示す図である。
記載してあるｈＤｌｋ−１遺伝子の変異体を、ＣＯＳ−７細胞にリポフェクションにより一過性に遺伝子導入し２４〜７２時間後にＦＡＣＳ解析した図である。ゲートをかけている部分が、ＤＩ−２−１４が認識している各変異体発現細胞を示す。
図１１は、抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体の抗原結合後のインターナリゼーション活性の分析結果を示す図である。
Ａ： ＨＥＫ２９３−ｈＤｌｋ細胞を抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体（クローンＭ３−１、Ｍ１−２９０及びＭ３−４）と反応させ（４℃、２０分）、ＰＢＳで２回洗浄した後、３７℃で、記載している時間インキュベートした。その後、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧと反応させ、ＦＡＣＳ解析を行った。値は、インキュベート無し（０分）における、平均蛍光強度を１００％とした場合の相対値として表した。
Ｂ： ＦＩＴＣ標識したクローンＭ３−１（ＦＩＴＣ−Ｍ３−１）をＨＥＫ２９３−ｈＤｌｋ細胞と反応させ（４℃、２０分）、ＰＢＳで２回洗浄した後、３７℃で１２０分インキュベートした時の平均蛍光強度の変化を表した図である。黒カラムは、Ａと同様に未標識Ｍ３−１と細胞を反応後、３７℃で１２０分インキュベートし、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧと反応させた場合の平均蛍光強度の変化を示した。
図１２は、ローダミン標識した抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体の抗原結合後のインターナリゼーション活性の分析結果を示す図である。
Ａ： ＨＥＫ−２９３−ｈＤｌｋ細胞を、ローダミン標識−Ｍ３−１（Ｒｈｏ−Ｍ３−１）と反応させ（４℃，２０分）、ＰＢＳで２回洗浄後、ただちに塗沫標本を作製し、蛍光顕微鏡でＲｈｏ−Ｍ３−１の局在を観察した写真である。オレンジ色で示される部分がＲｈｏ−Ｍ３−１の局在を示し、細胞膜へ局在が観察された。
Ｂ〜Ｅ： Ｒｈｏ−Ｍ３−１（Ｂ）、Ｒｈｏ−ＤＩ−１（Ｃ）、Ｒｈｏ−Ｍ１−２９０（Ｄ）及びＲｈｏ−Ｍ３−４（Ｅ）をＨＥＫ２９３−ｈＤｌｋ細胞と反応させ、ＰＢＳで２回洗浄後、３７℃で１５分インキュベートした後、塗沫標本を作製し、蛍光顕微鏡で各クローンの局在を観察した写真である。同じエピトープ（ＥＧＦ４−６）を認識するＲｈｏ−Ｍ３−１及びＲｈｏ−ＤＩ−１は、いずれも細胞内に取り込まれ、ドット状に局在している様子が観察された。
図１３は、サポリンを結合させた抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体の、Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ細胞及びＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞に対する細胞障害活性を示した図である。
Ａ：Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ細胞に対する、コントロール（マウスＩｇＧ−サポリン（ＩｇＧ−ＳＡＰ））及びＭ３−１−ＳＡＰの効果を示した図である。縦軸は未添加の場合の細胞の生存率を１００％としたときの相対値（Ｎ＝３，平均値±標準偏差）で表した。
Ｂ：ＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞に対する、コントロール（ＩｇＧ−ＳＡＰ）、Ｍ３−１−ＳＡＰ及びＭ１−２９０−ＳＡＰの効果を示した図である。
図１４は、Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ細胞のＸｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいて、マウスＩｇＧ（２０ｍｇ／ｋｇ体重）、Ｍ３−１−ＳＡＰ（５ｍｇ／ｋｇ体重）、及びＭ１−２９０−ＳＡＰ（５ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した場合の、Ａ：投与後の各マウスの体重変化、Ｂ：マウス生存率を示した図である。値は平均値±標準偏差で表した。矢印は、抗体投与時を示す。
図１５は、Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ細胞のＸｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいて、マウスＩｇＧ（●；Ｎ＝８）、及びＭ３−１−ＳＡＰ（○：Ｎ＝８）を腹腔内投与した場合の腫瘍成長阻害効果を示した図である。矢印は、抗体投与時を示す。値は平均値±標準偏差で表した（^＊Ｐ＜０．０１，^＊＊Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）。
図１６は、Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ細胞のＸｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいて、Ａ，Ｂ：マウスＩｇＧ（●：Ｎ＝５）とＭ３−１−ＳＰ（○：Ｎ＝５）を腫瘍内投与（４０μｇ）した場合の腫瘍成長阻害効果（Ａ）及び体重変化（Ｂ）を示した図、並びに、Ｃ，Ｄ：ＰＢＳ（●：Ｎ＝４）とシスプラチン（○：Ｎ＝４）を腹腔内投与（５ｍｇ／ｋｇ体重）した場合の腫瘍成長阻害効果（Ｃ）及び体重変化（Ｄ）を示した図である。いずれの図においても、矢印は抗体投与時を示し、値は平均値±標準偏差で表した（^＊Ｐ＜０．０１，^＊＊Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）。
図１７は、ヒト大腸癌組織アレイ（Ｃｙｂｒｄｉ社製、ＣＣ０５−０１−００１）を抗ｈＤｌｋ−１抗体で免疫染色した場合の代表例を示す写真。茶褐色の部分が、抗ｈＤｌｋ−１抗体で染色された癌組織を示す。ｈＤｌｋ−１陰性は、Ｎｏ．４８の切片（６９才男性、腺癌、Ｇｒａｄｅ ＩＩＩ）に示すように、全く染色された領域が観察されなかった切片を指す。Ｎｏ．１９（５５才女性、腺癌、Ｇｒａｄｅ ＩＩ）は、非常に強い染色性を示し、Ｎｏ．１９と同等の染色性を示した切片をｈＤｌｋ−１強陽性とした。また、Ｎｏ．２５（７５才男性、腺癌、Ｇｒａｄｅ ＩＩ）のように、明らかにｈＤｌｋ−１陽性であることが確認され、染色性が弱い切片をｈＤｌｋ−１弱陽性とした。
図１８は、ヒト乳癌組織アレイ（Ｃｙｂｒｄｉ社製、ＣＣ０８−０２−００２）を抗ｈＤｌｋ−１抗体で免疫染色した場合の代表例を示す写真。茶褐色の部分が、抗ｈＤｌｋ−１抗体で染色された癌組織を示す。
写真上段は、組織アレイ中に含まれる正常乳腺組織を抗ｈＤｌｋ−１抗体で染色した場合の写真である。左：Ｎｏ．０７（６８才女性、正常乳管；ｈＤｌｋ−１陰性）、右：Ｎｏ．０１（４３才女性、正常乳腺小葉；ｈＤｌｋ−１弱陽性）。矢印は、ｈＤｌｋ−１弱陽性の部位を示した。
写真下段は、浸潤性乳管癌患者の写真を示す。左：Ｎｏ．０８（４５才女性、Ｇｒａｄｅ ＩＩ；ｈＤｌｋ−１陰性）、中央：Ｎｏ．５６（２８才女性，Ｇｒａｄｅ ＩＩ；ｈＤｌｋ−１弱陽性）、右：Ｎｏ．２０（５９才女性、Ｇｒａｄｅ ＩＩ；ｈＤｌｋ−１強陽性）。
図１９は、Ｈｕｈ−７−ｄｌｋ細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｏｄｅｌにおけるクローンＤＩ−２−１４の用量依存的な抗腫瘍活性を示す図である。
図２０は、ＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｏｄｅｌにおけるクローンＤＩ−２−１４の用量依存的な抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ： 抗体投与開始以後の腫瘍成長を示す。腫瘍体積は平均値±標準誤差で表した（^＊Ｐ＜０．０１，^＊＊Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）。
Ｂ： 抗体投与後２３日目（Ｄａｙ ２３）において、摘出した癌組織の重量を示すグラフである。
図２１は、クローンＤＩ−２−１４Ｈ鎖（重鎖）可変領域（ＶＨ）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号２２）と推定アミノ酸配列（配列番号２３）を示す図である。シグナルペプチドはイタリックで表している。二重下線を引いたグルタミン酸（Ｅ）は、成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＣＤＲ配列（下線）は、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，Ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従った。クローンＤＩ−２−１４ＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号３０〜３２に示す。
図２２は、クローンＤＩ−２−１４Ｌ鎖（軽鎖）可変領域（ＶＬ）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号２４）と推定アミノ酸配列（配列番号２５）を示す図である。シグナルペプチドはイタリックで表している。二重下線を引いたアスパラギン酸（Ｄ）は、成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＣＤＲ配列（下線）は、Ｋａｂａｔら（１９９１；前掲）の定義に従った。クローンＤＩ−２−１４ＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号３３〜３５に示す。
図２３は、クローンＤＩ−２−１４ＶＨ遺伝子の塩基配列（配列番号２６）及びアミノ酸配列（配列番号２７）を示す図である。５’末端にＳｐｅＩ部位、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加してある（それぞれ下線を付した。）。イタリック文字で示した塩基配列は、イントロンに相当する配列を示す。
図２４は、クローンＤＩ−２−１４ＶＬ遺伝子の塩基配列（配列番号２８）及びアミノ酸配列（配列番号２９）を示す図である。５’末端にＮｈｅＩ部位、３’末端にＥｃｏＲＩ部位を付加してある（それぞれ下線を付した。）。イタリック文字で示した塩基配列は、イントロンに相当する配列を示す。
図２５は、キメラＤＩ−２−１４遺伝子発現ベクター（ｐＣｈＤＩ−２−１４）の概略図である。当該ベクターは、ＳａｌＩサイトから時計回りに、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要最初期プロモーター（ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）ｍａｊｏｒｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）と抗体重鎖遺伝子の転写開始のためのエンハンサーとで始まる重鎖翻訳ユニットを含む。ＣＭＶ領域は、その後、ＶＨエキソン、ヒトγ１重鎖定常領域（イントロンを介在しＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３のエキソンを含む）の遺伝子配列、並びにＣＨ３に続くｍＲＮＡプロセッシングのためのポリＡ部位へと続いている。重鎖遺伝子配列の後は、ＣＭＶプロモーター及びエンハンサーで始まる軽鎖翻訳ユニットがあり、その後、ＶＬエキソン及び上流にイントロン部分を有するヒトκ鎖定常領域のエキソン（ＣＬ）、並びにκ遺伝子のポリＡシグナルへと続いている。当該軽鎖遺伝子は、その後、ＳＶ４０初期プロモーター、大腸菌由来キサンチングアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子（ｔｈｅ Ｅ．ｃｏｌｉ ｘａｎｔｈｉｎｅ ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｇｐｔ）ｇｅｎｅ）、及びＳＶ４０のポリＡ部位を含むセグメントへと続いている。最後に、当該プラスミドは、バクテリアの複製起点及びβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むｐＵＣ１９プラスミドの一部を有している。
図２６は、マウスＤＩ−２−１４及びキメラＤＩ−２−１４（ＣｈＤＩ−２−１４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの展開後、ＣＢＢ染色した図である。ＭＷはサイズマーカーを示し、矢印はそれぞれのバンドの分子量（ｋＤ）を示す。
図２７は、精製ＦＡ−１（ｈＤｌｋ−１細胞外領域）固相ＥＬＩＳＡによる、ＤＩ−２−１４及びＣｈＤＩ−２−１４の抗原結合活性を示す図である。○は、マウスＩｇＧ１抗体（クローンＤＩ−２−１４）、●は、キメラ抗体（ＣｈＤＩ−２−１４）を表す。
図２８は、ＨＥＫ２９３−ｈＤｌｋ細胞を用いたＤＩ−２−１４及びＣｈＤＩ−２−１４のフローサイトメトリーによる反応性を示す図である。黒塗りのヒストグラムが、アイソタイプコントロール抗体であり、黒線（白抜き）のヒストグラムが、それぞれＤＩ−２−１４およびＣｈＤＩ−２−１４である。
図２９は、ヒト肝癌細胞株における細胞表面Ｄｌｋ−１の発現をフローサイトメトリーで解析した図である。青のラインはマウスＩｇＧ１、赤のラインは抗ヒトＤｌｋ−１抗体であり、それぞれの細胞を染色した場合のヒストグラムを示す。
図３０は、ヒト乳癌細胞株における細胞表面Ｄｌｋ−１の発現をフローサイトメトリーで解析した図である。青のラインはマウスＩｇＧ１、赤のラインは抗ヒトＤｌｋ−１抗体であり、それぞれの細胞を染色した場合のヒストグラムを示す。
図３１は、ヒト白血病細胞株における細胞表面Ｄｌｋ−１の発現をフローサイトメトリーで解析した図である。青のラインはマウスＩｇＧ１、赤のラインは抗ヒトＤｌｋ−１抗体であり、それぞれの細胞を染色した場合のヒストグラムを示す。
図３２は、Ｈｕｈ−７−ｄｌｋ細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｏｄｅｌにおける摘出した癌組織におけるＦｌｋ−１／ＶＥＧＦ−Ｒ２の免疫組織染色を示す図である。
Ａ： マウスＩｇＧ投与群（コントロール群）及びクローンＤＩ−２−１４投与群から採取（摘出）した癌組織の新鮮凍結切片を、それぞれ抗マウスＦｌｋ−１／ＶＥＧＦ−Ｒ２抗体で免疫染色した写真である（対物２００倍）。写真中、矢頭状の印（▲）で示した箇所は、Ｆｌｋ−１／ＶＥＧＦ−Ｒ２陽性の腫瘍血管内皮細胞を示す。
Ｂ： ＩｇＧ投与群（２個体）及びＤＩ−２−１４投与群（４個体）からそれぞれ採取した新鮮凍結切片を、抗マウスＦｌｋ−１／ＶＥＧＦ−Ｒ２抗体で免疫染色し、それぞれの切片において、対物２００倍下で８〜１３視野（ＩｇＧ投与群：全２１視野、ＤＩ−２−１４投与群：全３５視野）について、Ｆｌｋ−１／ＶＥＧＦ−Ｒ２陽性の腫瘍血管内皮細胞数をカウントし、１視野あたりの細胞数を示したグラフである（^＊Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）。
図３３は、Ｈｕｈ−７−ｄｌｋ細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｏｄｅｌにおける摘出した癌組織におけるＦｌｋ−１／ＶＥＧＦ−Ｒ２の遺伝子発現を示した図である。
Ａ： ＩｇＧ投与群（Ｎ＝７）及びＤＩ−２−１４投与群（Ｎ＝７）から、それぞれ腫瘍を摘出した後、Ｔｒｉｚｏｌ試薬でＲＮＡを抽出し、次いで１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成し、それぞれの１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲ法（３０サイクル）によりマウスＦｌｋ−１／ＶＥＧＦ−Ｒ２（ｍＦｌｋ−１）及びマウス／ヒトＧＡＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）の遺伝子発現を確認した電気泳動像を示す図である。下のグラフは、ｍＦｌｋ−１及びＧＡＰＤＨのＰＣＲによる増幅産物のバンドをＮＩＨ ｉｍａｇｅで定量し、Ｒａｔｉｏ（ｍＦｌｋ−１／ＧＡＰＤＨ）として示したグラフである。
Ｂ： ＰＣＲ法による増幅反応を３５サイクル行った以外は、Ａと同様にした場合の図である。

以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００６−３０５３５５号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
ヒトＤｌｋ−１（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ １ ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）；ｈＤｌｋ−１）は、前述したように、全長３８３アミノ酸残基の１回膜貫通型の１型膜タンパク質であり、細胞外領域に６つのＥＧＦ様モチーフを有する。そして、ｈＤｌｋ−１遺伝子及びその遺伝子産物は、種々の癌や腫瘍細胞において高頻度で発現していることが知られている。一般的に、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を示す抗体を作製し取得することは困難であるため、抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体を作製したとしても、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは抗腫瘍活性を有するがｉｎ ｖｉｖｏでは同活性を示さないことが多い。また、ｈＤｌｋ−１の癌細胞の増殖などに対する機能的ドメインや、ｈＤｌｋ−１のリガンド（または受容体）及び細胞内シグナル伝達経路などは明らかではないため、ターゲットを絞って効率的に抗体作製を行うことも実質的に不可能である。このような状況の下、本発明においては、多数のクローンからスクリーニングを行うことによって、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有するクローンを取得することに成功した。
まず、本発明者は、公知の抗ｈＤｌｋ−１抗体を用いた免疫組織化学により、これまでｈＤｌｋ−１の発現が確認されていた前述の癌や腫瘍細胞以外に、新たに大腸癌及び乳癌においてもｈＤｌｋ−１が発現していることを見出した。
次いで、本発明者は、個体レベルでｈＤｌｋ−１発現癌細胞を死滅させ得る又は腫瘍成長を阻害し得る抗ｈＤｌｋ−１抗体、すなわちｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗腫瘍活性を有する抗ｈＤｌｋ−１抗体を作製することを目的として、新たに抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体を約１００クローン作製した。そして、これらクローンにつき、各種癌細胞株をヌードマウス皮下に移植し確立した担癌マウスを用いてｉｎ ｖｉｖｏにおける薬効（抗腫瘍作用）の評価を行った。その結果、顕著な腫瘍成長阻害活性を示すクローンを複数得ることに成功した（クローン名：ＤＩ−２−１４，２−１３，ＢＡ−１−３Ｄ，ＤＩ−６，Ｍ３−１）。
また本発明者は、上述した抗ｈＤｌｋ−１抗体の中でも、ｈＤｌｋ−１を発現する細胞内への移動能（インターナリゼーション活性）に優れた抗体を見出し、このような抗体と、抗腫瘍活性や殺細胞活性を有する化合物とを含む、抗体−薬剤複合体を作製した。この複合体は、いわゆるイムノコンジュゲートとして、目的とする腫瘍細胞内への薬剤送達能に優れたものである。
本発明者は、上述した抗腫瘍活性を有する抗ｈＤｌｋ−１抗体や抗体−薬剤複合体を用いると、各種腫瘍の治療、あるいは腫瘍の診断及び検出に有用であることを見出した。
２．抗ｈＤｌｋ−１抗体の作製
（１）抗原の調製
ｈＤｌｋ−１のアミノ酸配列（配列番号２）の情報は、例えばＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に「Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ＿００３８２７」として公表されている。なお、ｈＤｌｋ−１のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号１）の情報は、同ウェブサイトに「Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００３８３６」として公表されている。
抗原としては、ｈＤｌｋ−１のアミノ酸配列の少なくとも一部（全部又は一部）を含むポリペプチド又はペプチド（単にペプチドともいう）を使用することができ、好ましくは、ｈＤｌｋ−１の細胞外領域（ＦＡ−１）のアミノ酸配列の少なくとも一部（全部又は一部）を含むペプチドを使用することができる。ｈＤｌｋ−１の細胞外領域は、前述したように６つのＥＧＦ様モチーフ（ＥＧＦ−１〜ＥＧＦ−６）を含む領域を言い、配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちの第２６番目〜第２４４番目のアミノ酸を含む領域、好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちの「第２４番目」から「第２４８〜２８５番目」までのアミノ酸からなる領域（およそ２２５〜２６２アミノ酸残基）のことを言う。
ここで、抗原に用いるペプチドにつき、上記「アミノ酸配列の少なくとも一部」とは、長さが特に限定されるわけではなく、例えば、６つのＥＧＦ様モチーフのうちの１つ又は２つ以上を含む領域が好ましい。より好ましくは、例えば、ＥＧＦ−１及びＥＧＦ−２を含む領域（すなわち配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちの第２６番目〜第８５番目のアミノ酸からなる領域）、ＥＧＦ−３及びＥＧＦ−４を含む領域（すなわち配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちの第９２番目〜第１６７番目のアミノ酸からなる領域）、並びに、ＥＧＦ−４、ＥＧＦ−５及びＥＧＦ−６を含む領域（すなわち配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちの第１３１番目〜第２４４番目のアミノ酸からなる領域）である。
抗原とするペプチドの作製方法は、化学合成でも、大腸菌などを用いる遺伝子工学的手法による合成でもよく、当業者に周知の方法を用いることができる。
ペプチドの化学合成を行う場合は、ペプチドの合成の周知方法によって合成することができる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置（例えば、島津製作所製：ＰＳＳＭ−８など）を使用してもよい。
ペプチドを遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該ペプチドをコードするＤＮＡを設計し合成する。当該設計及び合成は、例えば、全長ｈＤｌｋ−１遺伝子を含むベクター等を鋳型とし、所望のＤＮＡ領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行うことができる。そして、上記ＤＮＡを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）。
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。組換えベクターの作製は、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。ヤギ等の哺乳動物を宿主として使用することも可能である。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である。
そして、前記形質転換体を培養し、その培養物から抗原として使用されるペプチドを採取する。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
培養後、目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりペプチドを抽出する。また、目的ペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、ペプチドの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
本発明においては、無細胞合成系を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳により抗原となるペプチドを得ることもできる。この場合は、ＲＮＡを鋳型にする方法とＤＮＡを鋳型にする方法（転写／翻訳）の２通りの方法を用いることができる。無細胞合成系としては、市販のシステム、例えばＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ^ＴＭシステム（インビトロジェン社）、ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標；ポストゲノム研究所）、ＴＮＴシステム（登録商標；プロメガ社）等を用いることができる。
上記のごとく得られたペプチドは、適当なキャリアタンパク質、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒトチログロブリン、ニワトリガンマグロブリン等に結合することも可能である。
また抗原は、ｈＤｌｋ−１のアミノ酸配列（配列番号２）又は前述したその部分配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。例えば、ｈＤｌｋ−１のアミノ酸配列又はその部分配列のうち１又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））のアミノ酸が欠失しており、１又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されており、あるいは、１又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを使用することもできる。
本発明において、細胞等に導入するための遺伝子としては、ｈＤｌｋ−１タンパク質若しくはその部分断片又はこれらの変異型のタンパク質又は断片をコードする遺伝子が挙げられる。そのような遺伝子としては、例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその部分配列を有するものを使用することができる。
また、細胞等に導入するための遺伝子としては、配列番号１に示される塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つｈＤｌｋ−１活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、又はその部分配列を使用することも可能である。
「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイズさせた後の洗浄時の条件であって、バッファーの塩（ナトリウム）濃度が１０〜５００ｍＭであり、温度が４２℃〜７２℃、好ましくは、上記塩濃度が５０〜３００ｍＭであり、温度が５５〜６８℃での条件をいう。
遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ^ＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ等：タカラバイオ社製）を用いて行うことができる。
（２）ポリクローナル抗体の作製
調製した抗原を、免疫のため哺乳動物に投与する。哺乳動物は特に限定はされず、例えばラット、マウス及びウサギなどを挙げることができ、なかでもマウスが好ましい。
抗原の動物一匹あたりの投与量は、アジュバントの有無により適宜設定することができる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、足蹠、皮下、腹腔内等に注入することにより行うことができる。また、免疫の間隔については、特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは１週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜３回免疫を行う。そして、最終の免疫日から３〜７日後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡ）や放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、所望の抗体価を示した日に採血して、抗血清を得ることができる。上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
（３）モノクローナル抗体の作製
（３−１）抗体産生細胞の採取
本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体は、限定はされないが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
調製した抗原を、免疫のため哺乳動物、例えばラット、マウス及びウサギなどに投与する。抗原の動物一匹あたりの投与量は、アジュバントの有無により適宜設定することができる。アジュバントとしては上記と同様である。免疫手法も前記と同様である。そして、最終の免疫日から１〜６０日後、好ましくは１〜１４日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞及び末梢血細胞などが挙げられるが、なかでもリンパ節細胞及び脾臓細胞が好ましい。
（３−２）細胞融合
ハイブリドーマ（抗体産生細胞株）を得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を用いることができる。用いる細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。
ミエローマ細胞としては、例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ１）及びＳｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。ミエローマ細胞の選択は、抗体産生細胞との適合性を適宜考慮して行うことができる。
次いで、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ及びＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞用培地中で、１ｘ１０^６〜１ｘ１０^７個／ｍＬの抗体産生細胞と２ｘ１０^５〜２ｘ１０^６個／ｍＬのミエローマ細胞とを混合する。抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比（抗体産生細胞；ミエローマ細胞）は、限定はされないが、通常、１：１〜１０：１とすることが好ましく、より好ましくは３：１である。次に、細胞融合促進剤の存在下で融合反応を行う。細胞融合促進剤として、例えば、平均分子量１，０００〜６，０００ダルトン（Ｄ）のポリエチレングリコールなどを使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
（３−３）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などに適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に播き、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリーマとして得ることができる。
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、ｈＤｌｋ−１に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定はされない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採取し、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ及びＲＩＡなどによってスクリーニングすることができる。
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行うことができる。ｈＤｌｋ−１に強い反応性を示す抗体をフローサイトメトリー等により判定し、これを産生するハイブリドーマを選択し、クローンとして樹立する。
（３−４）モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマを培養し、得られる培養物からモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法、又は腹水形成法等を採用することができる。「培養」とは、ハイブリドーマを培養皿又は培養ボトル中で生育させること、あるいはハイブリドーマを下記のように動物の腹腔内で増殖させることを意味する。
細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ_２濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得することができる。
腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１ｘ１０^７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、２〜３週間後に腹水を採取することが好ましい。
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
（３−５）抗腫瘍活性を有するクローンの選別
本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗体である。
ここで、「抗腫瘍活性」とは、腫瘍細胞（癌細胞）を死滅させる活性又は腫瘍成長を阻害する活性を意味する。本発明において、抗腫瘍活性としては、例えば、腫瘍血管新生阻害活性が好ましく挙げられる。また、本発明の抗体が抗腫瘍活性を発揮しうるヒト腫瘍（腫瘍細胞）の種類としては、ｈＤｌｋ−１の発現が確認されている前述した公知のヒト腫瘍（具体的には、固形癌では、神経内分泌腫瘍、神経芽細胞腫、神経膠腫、１型神経線維腫症、小細胞肺癌、肝臓癌、腎臓癌及び卵巣癌など、血液癌では、骨髄異形成症候群及び急性骨髄性白血病など。）ならびに本発明者が新たにｈＤｌｋ−１の発現を確認したヒト大腸癌及びヒト乳癌が挙げられる。なかでも特に、大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌及びヒト神経芽細胞腫のうちの１種又は２種以上が好ましく挙げられる。
ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性の確認は、例えば、所望の腫瘍細胞をマウスの皮下に移植した担癌マウスを用い、このマウスに前記のとおり得られた抗体を投与することにより行うことができる。この場合、抗体の投与は、腫瘍細胞の移植直後から行ってもよいし（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデル）、移植に腫瘍が所定の体積になったのを確認してから行ってもよい（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデル）。投与方法は、限定はされないが、例えば、３日に１回、２０ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内投与とすることができる。Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルの場合は、腫瘍形成頻度と腫瘍体積により抗腫瘍活性の有無及びレベルを評価することができる。Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルの場合は、腫瘍体積により抗腫瘍活性の有無及びレベルを評価することができる。
本発明において、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗ｈＤｌｋ−１抗体としては、例えば、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７０７であるハイブリドーマにより産生される抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体（クローン名：Ｍ３−１）、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０８９９であるハイブリドーマにより産生される抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体（クローン名：ＤＩ−２−１４）、及び受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０９００であるハイブリドーマにより産生される抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体（クローン名：ＤＩ−６）などが好ましく挙げられる。また、クローン名：ＤＩ−２−１４の抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体もｉｎ ｖｉｖｏでの高い抗腫瘍活性を有する抗体として好ましい。
ここで、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７０７であるハイブリドーマは、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ｍ３−１」と称し２００６年１０月１８日付で、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０８９９であるハイブリドーマは、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＤＩ−２−１４」と称し２００７年８月２１日付で、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０９００であるハイブリドーマは、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＤＩ−６」と称し２００７年８月２１日付で、いずれも独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に寄託されたものである。
また、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体としては、例えば、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号３０〜３２で示されるアミノ酸配列であるもの、及び／又は、Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号３３〜３５で示されるアミノ酸配列であるものが、好ましく挙げられる。上記Ｈ鎖Ｖ領域としては、例えば、配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましく、上記Ｌ鎖Ｖ領域としては、例えば、配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。
さらに、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体としては、例えば、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７０７、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８９９、又はＦＥＲＭ ＢＰ−１０９００であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が結合（認識）する部位（例えばエピトープ）に結合する抗ｈＤｌｋ−１抗体も好ましく挙げられる。
（３−６）抗ｈＤｌｋ−１抗体のエピトープ
本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体のエピトープ（抗原決定基）は、抗原であるｈＤｌｋ−１の少なくとも一部であればよく限定はされないが、例えば、配列番号１に示されるｈＤｌｋ−１のアミノ酸配列中の、第２６番目〜第８５番目のアミノ酸からなる領域（ｈＤｌｋ−１のＥＧＦ−１〜ＥＧＦ−２を含む領域）、第９２番目〜第１６７番目のアミノ酸からなる領域（ｈＤｌｋ−１のＥＧＦ−３〜ＥＧＦ−４を含む領域）、若しくは第１３１番目〜第２４４番目のアミノ酸からなる領域（ｈＤｌｋ−１のＥＧＦ−４〜ＥＧＦ−６を含む領域）の少なくとも一部であることが好ましい。なかでも、ｈＤｌｋ−１のＥＧＦ−４〜ＥＧＦ−６を含む領域及びＥＧＦ−４〜ＥＧＦ−６を含む領域がより好ましく、特に好ましくは、第９２番目〜第１２０番目のアミノ酸からなる領域（ｈＤｌｋ−１のＥＧＦ−３を含む領域）である。当該領域を認識する（当該領域と結合する）抗ｈＤｌｋ−１抗体は、例えば、腫瘍細胞内へのインターナリゼーション活性が高く、後述するイムノコンジュゲート等の用途に極めて有用なものである。
（４）遺伝子組換え抗体、及び抗体断片
（４−１）遺伝子組換え抗体
本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト抗体等が挙げられる。
キメラ抗体（すなわちヒト型キメラ抗体）は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結（接合）した抗体であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，６８５１−６８５５，（１９８４）等を参照）、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。ここで、マウス由来抗体の可変領域としては、Ｈ鎖Ｖ領域は、例えば、配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましく、Ｌ鎖Ｖ領域は、例えば、配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。
ヒト型化抗体を作製する場合は、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（ＦＲ）はヒト由来のものでＣＤＲはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する（いわゆるＣＤＲグラフティング（ＣＤＲ移植））。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７）；Ｑｕｅｅｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３３（１９８９）；特表平４−５０２４０８号公報（特許第２８２８３４０号公報；クイーンら）等を参照）。ここで、本発明のヒト型化抗ｈＤｌｋ−１抗体に用いることができるマウス由来のＣＤＲ配列としては、限定はされないが、例えば、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３として（それぞれ順に）配列番号３０〜３２に示されるアミノ酸配列が、Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３として（それぞれ順に）配列番号３３〜３５に示されるアミノ酸配列が、好ましく挙げられる。
ヒト抗体（完全ヒト抗体）は、一般にＶ領域の抗原結合部位である超過変領域（Ｈｙｐｅｒ Ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）、Ｖ領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。但し、超可変部位は他の動物由来であってもよい。ヒト抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９７７）１６，１３３−１４３；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，（１９９８）２６，３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐｅｃｔｓ，（１９９９）１０，６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２０００）９７，７２２−７２７等を参照）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．，（２００２）４３（７），２３０１−８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，（２００２）１（２），１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，（２００２）１０９（３），４２７−４３１等を参照）により取得することができる。
上記キメラ抗体、ヒト型抗体及びヒト抗体は、抗体Ｆｃ領域におけるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であるものが好ましく、詳しくは、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖を抗体分子のＦｃ領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる抗体が挙げられる。このような抗体であれば、ＡＤＣＣ活性を飛躍的に向上させることができる。なお、この点（抗体Ｆｃ領域におけるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の特徴）は、前述したポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体についても同様に好ましい。
（４−２）抗体断片
本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体の断片も、本発明の抗体に含まれるものとする。ここで、本発明の抗体断片は、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体と同様に、ｈＤｌｋ−１に対する結合活性を有するものであってｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有するものである。
当該抗体の断片としては、抗ｈＤｌｋ−１ポリクローナル抗体又は抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体の一部分の領域（すなわち、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体に由来する抗体断片）を意味し、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、一本鎖抗体（Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｈ鎖Ｖ領域、及びＬ鎖Ｖ領域等）、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｓｃＦｖ二量体）、ｄｓＦｖ（ジスルフィド安定化Ｖ領域）、並びに、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。
Ｆａｂは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを、原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することもできる。
Ｆ（ａｂ’）_２は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、後述するＦａｂをチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させて、作製することもできる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを、原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することもできる。
ｓｃＦｖは、１本のＨ鎖Ｖ領域（ＶＨ）と１本のＬ鎖Ｖ領域（ＶＬ）とを適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。ｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築して、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。ｄｉａｂｏｄｙは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＰのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築して、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、Ｒｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。ｄｓＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築して、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３）の少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。ＣＤＲを含むペプチドは、抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
本発明の抗体断片としては、そのままの形状でＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体Ｆｃ領域の一部または全部を含む抗体断片でもよく、また、上述した抗体断片とＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体Ｆｃ領域の一部または全部との融合タンパク質であってもよい。このような抗体断片であれば、ＡＤＣＣ活性を飛躍的に向上させることができるため、好ましい。
本発明の抗体断片の具体例としては、限定はされないが、例えば、配列番号３０〜３２で示されるアミノ酸配列（Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３）を少なくとも一部に含むものが挙げられ、具体的には、配列番号２３で示されるアミノ酸配列（Ｈ鎖Ｖ領域）を含むものが挙げられる。また、当該抗体断片としては、配列番号３３〜３５（Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３）で示されるアミノ酸配列を少なくとも一部に含むものが挙げられ、具体的には、配列番号２５で示されるアミノ酸配列（Ｌ鎖Ｖ領域）を含むものが挙げられる。
以下、本明細書中の説明においては、上述した抗体断片も、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体に含まれるものとする。
３．抗体−薬剤複合体の作製
上記本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体を用いたイムノコンジュゲート等として、当該抗体と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物とを含む、抗体−薬剤複合体を提供することができる。なお、予め、当該抗体分子と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物とを、それぞれ調製したのち、これらを複合化させて得られたものは、一般に、イムノコンジュゲートと称される。また、遺伝子組換え技術を用い、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物としてのタンパク質トキシンを、遺伝子上で抗体遺伝子と連結させて、１つのタンパク質（融合タンパク質）として発現させて得られたものは、一般に、イムノトキシンと称される。
抗腫瘍活性を有する化合物としては、例えば、ドキソルビシン、カリケアマイシン、マイトマイシンＣ、Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅなどが挙げられる。
殺細胞活性を有する化合物としては、例えば、サポリン、リシン、緑膿菌外毒素、ジフテリアトキシン等が挙げられ、なかでもサポリン及び緑膿菌外毒素が好ましく用いられる。
抗体−薬剤複合体の作製方法としては、限定はされないが、例えば、ジスルフィド結合やヒドラゾン結合によって抗体と薬剤とをカップリングする方法などが挙げられる。
上記本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体は、ｈＤｌｋ−１を発現する標的腫瘍細胞内へのインターナリゼーション活性に優れたものである。そのため、予め、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物を複合化させておくことにより、これら化合物を腫瘍細胞に直接かつ高選択的に作用させることができる。本発明の抗体−薬剤複合体は、標的腫瘍細胞への薬剤送達能に極めて優れたものである。
なお、細胞内へのインターナリゼーション活性は、抗体をローダミン等により蛍光標識し、細胞内への移行挙動及び抗体の局在性について蛍光顕微鏡等を用いて観察することにより評価することができる。
また本発明においては、抗体−薬剤複合体において、抗体の代わりに前述の抗体断片を用いた抗体断片−薬剤複合体を提供することもできる。抗体断片−薬剤複合体の詳細については、上述の抗体−薬剤複合体の説明を適宜適用することができる。
以下、本明細書中の説明においては、抗体断片−薬剤複合体も、本発明の抗体−薬剤複合体に含まれるものとする。
４．医薬組成物
本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び抗体−薬剤複合体は、医薬組成物に含まれる有効成分として有用である。
当該医薬組成物は、腫瘍の治療用及び／又は診断用の医薬組成物として有用である。特に、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体、及び該抗体を含む抗体−薬剤複合体は、抗腫瘍活性として、腫瘍血管新生阻害活性を有するものであるため、腫瘍の治療用に使用されることが好ましい。すなわち、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び抗体−薬剤複合体は、腫瘍治療剤、腫瘍血管新生阻害剤及び腫瘍診断剤に含まれる有効成分として有用なものである。
本発明の医薬組成物は、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び／又は抗体−薬剤複合体を有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。
本発明の医薬組成物の適用の対象となる疾患（腫瘍）としては、ｈＤｌｋ−１の発現が確認されている前述した公知のヒト腫瘍ならびに本発明者が新たにｈＤｌｋ−１の発現を確認したヒト大腸癌及びヒト乳癌が挙げられる。なかでも特に、大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌及びヒト神経細胞腫のうちの１種又は２種以上が好ましく挙げられる。これらの疾患は単独であってもよく、２つ以上が併発してもよい。
「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、１つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。
特に、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体由来の抗体断片（中でも低分子のもの）を生体内に投与する場合は、上記に加えて、コロイド分散系を用いることができる。コロイド分散系は化合物（抗体断片）の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであればよく限定はされないが、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げることができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Ｍａｎｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，６８２；Ｂｌｕｍｅ ａｎｄ Ｃｅｖｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，１９９４，２３，１１９；Ｃｈｏｎｎ ａｎｄ Ｃｕｌｌｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐ．Ｂｌｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，６９８）。
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び抗体−薬剤複合体の種類などにより異なる。通常、成人一人あたり、一回につき６００μｇから６０００ｍｇの範囲で投与することができるが、この範囲に限定されるものではない。
例えば注射剤により投与する場合は、ヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１００μｇ〜１００ｍｇの量を、１日平均あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。すなわち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
なお、本発明は、腫瘍を治療及び／又は診断する医薬（薬剤）を製造するための、前記本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び／又は抗体−薬剤複合体の使用を提供するものでもある。また、本発明は、腫瘍を治療用及び／又は診断用の、前記本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び／又は抗体−薬剤複合体を提供するものでもある。
さらに、本発明は、前記本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び／又は抗体−薬剤複合体を用いる（すなわち患者に投与する）ことを特徴とする腫瘍の治療及び／又は診断方法を提供するものであり、また、腫瘍を治療及び／又は診断するための、前記本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び／又は抗体−薬剤複合体の使用を提供するものでもある。
５．腫瘍の検出方法
本発明の腫瘍の検出方法は、前記本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体と、生体から採取された試料（以下、生体試料）とを反応させ、反応した抗体のシグナルを検出することを特徴とする方法である。
前述したように、ｈＤｌｋ−１は各種腫瘍細胞において特異的に発現することが確認されているため、ｈＤｌｋ−１、特に遊離ｈＤｌｋ−１（ｈＤｌｋ−１の細胞外領域部分）は、各種腫瘍マーカーとして利用することが可能である。なかでも、ヒト大腸癌、ヒト乳癌及びヒト肝癌のマーカーとして利用することが好ましい。
そこで、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体を生体試料と反応させ、反応した抗体のシグナルを検出することにより、腫瘍を検出することができる。得られた抗体のシグナルは、生体試料中の抗原量（すなわちｈＤｌｋ−１量又は遊離ｈＤｌｋ−１量）の指標となる。本発明の抗体を用いた腫瘍の検出は、まず、検体として被験者から採取した生体試料、例えば検査対象とする組織片又は血液等と、本発明の抗体とを、抗原抗体反応によって結合させる。次いで、結合した抗体量の測定結果に基づいて、生体試料中の目的とする抗原量を測定することにより行う。当該測定は、公知の免疫学的測定法に従って行えばよく、例えば、免疫沈降法、免疫凝集法、標識免疫測定法、免疫比懸濁法、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー法などを用いることができる。標識免疫測定法では、抗体のシグナルは、標識抗体を用いて直接検出した標識量で表すほか、既知濃度あるいは既知抗体価の抗体を標準液として相対的に表してもよい。すなわち、標準液と検体を測定計により測定し、標準液の値を基準にして生体試料中の抗体シグナルを相対的に表すことができる。標識免疫測定法としては、例えばＥＬＩＳＡ法、ＥＩ法、ＲＩＡ法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）等が挙げられる。なかでも特に、ＥＬＩＳＡ法が、簡便かつ高感度という点で好ましい。
本発明においては、上記検出方法により得られた検出結果を指標として腫瘍の状態を評価又は診断することができる。例えば、検出結果が所定の基準値を超えるものを腫瘍陽性、所定の基準値以下のものを腫瘍陰性とし、陽性の場合には、いずれかの腫瘍を発症している可能性があると判断し、腫瘍の状態を評価することができる。ここで、腫瘍の状態とは、腫瘍の罹患の有無又はその進行度を意味し、腫瘍の発症の有無、進行度、悪性度、転移の有無及び再発の有無等が挙げられる。
上記評価にあたり、腫瘍の状態としては１つを選択してもよいし、複数個を組み合わせて選択してもよい。腫瘍の有無の評価は、得られた検出結果に基づいて、所定の基準値を境界として腫瘍に罹患しているか否かを判断することにより行うことができる。腫瘍の悪性度は、癌がどの程度進行しているのかを示す指標となるものであり、検出結果に基づいて、病期（Ｓｔａｇｅ）を分類して評価したり、あるいは早期癌や進行癌を分類して評価したりすることも可能である。例えば、検出結果を指標として早期癌又は進行癌であると評価することもできる。腫瘍の転移は、検出結果を指標として、原発巣の位置から離れた部位に新生物が出現しているか否かにより評価することができる。再発は、間欠期又は寛解の後に検出結果が再び所定の基準値を超えたか否かにより評価することができる。
６．腫瘍の検出用又は診断用キット
本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体は、腫瘍の検出用又は診断用キットの形態で提供することができる。本発明のキットは抗体を含むが、その他に、標識物質、あるいは抗体又はその標識物を固定した固相化試薬などを含めることができる。抗体の標識物質とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等によって標識されたものを意味する。本発明のキットは、上記の構成要素のほか、本発明の検出を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素基質（発色性基質等）、酵素基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。また、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器（エッペンドルフチューブ等）、ブロッキング剤（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ），Ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ，Ｇｏａｔ血清等の血清成分）、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び実験操作マニュアル（説明書）等を含んでいてもよい。
本発明のキットは、上記本発明の検出方法を行うために有効に用いることができ、極めて有用性が高いものである。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜材料及び方法＞
１．細胞株
ＨＥＫ−２９３−ｈＤｌｋ細胞、７Ｅ２−Ｃ−ｈＤｌｋ細胞、及びＨｕｈ−７−ｈＤｌｋ細胞は、ＷＯ ２００５／０５２１５６に記載の通り作製した細胞株を用いた。また、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；カタログＮｏ．ＣＲＬ２１４２）から入手した。
ＳＷ４８０−ｈＤｌｋ細胞については、ヒト大腸癌由来細胞株ＳＷ４８０（入手元：東京大学分子細胞生物学研究所機能形成）に、全長ｈＤｌｋ−１遺伝子を含む発現ベクターｐｃＤＮＡ−ｈｄｌｋ−Ｆｌａｇ（ＷＯ ２００５／０５２１５６参照）を遺伝子導入し、抗生物質Ｇ４１８（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）による選択を行った後、ｈＤｌｋ−１を安定して発現している細胞株を樹立することにより得た。
２．抗ｈＤｌｋ−１ポリクローナル抗体の作製
ｈＤｌｋ−１の細胞外領域（ＦＡ−１）発現ベクターを構築するにあたり、以下のプライマーを設計し、合成した。
この際、ＲプライマーにはＸｈｏＩによる制限酵素消化配列を付加した。これらのプライマーを用い、ｈＤｌｋ−１のｃＤＮＡを鋳型として、以下の反応液組成及び反応条件で、ＰＣＲ反応を行った。
≪反応液組成≫
鋳型ＤＮＡ： １μＬ
１０×ＰＣＲバッファー： ５μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ： ４μＬ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ： ０．５μＬ
Ｆプライマー（１０μＭ）： １μＬ
Ｒプライマー（１０μＭ）： １μＬ
滅菌水： ３７．５μＬ
合計： ５０μＬ
≪反応条件≫
「熱変性・解離：９５℃（６０ｓｅｃ）→アニーリング：５５℃（６０ｓｅｃ）→合成・伸長：７２℃（６０ｓｅｃ）」を１サイクルとして、計３５サイクル。
得られたｈＤｌｋ−１の細胞外領域（ヒトＦＡ１）のｃＤＮＡを、ｐＣＲＩＩベクター（インビトロジェン）にクローニングした（ｐＣＲＩＩ−ｈＦＡ１）。クローニングしたヒトＦＡ１のｃＤＮＡは、シークエンサーにより確認した。
ｐＣＲＩＩ−ｈＦＡ１からヒトＦＡ１ ｃＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片を切り出し、ｐｃＤＮＡ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター（インビトロジェン）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した（ｐｃＤＮＡ４−ｈＦＡ１）。この発現ベクターにはＣ末端側にＭｙｃタグ及びＨｉｓタグ配列が付加されており、ヒトＦＡ１はＭｙｃタグ及びＨｉｓタグとの融合タンパク質として発現する。融合タンパク質を抗原として、常法により、ウサギに免疫を行い、抗ｈＤｌｋ−１ポリクローナル抗体を作製した。
３．ｈＤｌｋ−１遺伝子のＥＧＦ様モチーフ欠失変異体の作製
抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体のエピトープ解析に用いるため、以下の通り、ｈＤｌｋ−１遺伝子のＥＧＦ様モチーフ欠失変異体を作製した。
まず、該当する領域をＰＣＲ法で増幅するためのプライマーを作製した。作製した各プライマー配列を、下記表１に示す。この時、ＦプライマーにはＮｏｔＩによる制限酵素消化配列を付加し、ＲプライマーにはＸｂａＩによる制限酵素消化配列を付加した。ただし、ＥＧＦ（４−６）及びＥＧＦ（５−６）の領域を増幅するためのＲプライマーには、ＸｂａＩによる制限酵素消化配列は付加していない。なお、表１中のコンストラクト欄につき、例えば「ＥＧＦ（１−４）」との表記は、ｈＤｌｋ−１のＦＡ−１領域に存在する６つのＥＧＦ様モチーフ（ＥＧＦ−１〜ＥＧＦ−６）のうち、ＥＧＦ−１からＥＧＦ−４までの連続した領域を意味する。
上記各プライマーを用いたＰＣＲは、以下の反応液組成及び反応条件で行った。
≪反応液組成≫
鋳型ＤＮＡ： １μＬ
１０×ＰＣＲバッファー： ５μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ： ４μＬ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ： ０．５μＬ
Ｆプライマー（１０μＭ）： １μＬ
Ｒプライマー（１０μＭ）： １μＬ
滅菌水： ３７．５μＬ
合計： ５０μＬ
≪反応条件≫
「熱変性・解離：９５℃（６０ｓｅｃ）→アニーリング：５５℃（６０ｓｅｃ）→合成・伸長：７２℃（６０ｓｅｃ）」を１サイクルとして、計３５サイクル。
ＰＣＲ法で増幅した各断片はＴＡクローニングキット（インビトロジェン）を用いてｐＣＲ ＩＩベクター（インビトロジェン）にクローニングし、塩基配列を確認した。その後、Ｎｏｔ Ｉ／Ｘｂａ Ｉで切断した断片を得、当該断片をｐＭＥ１８Ｓ−ＣＦＨＸ−ＦＸＹＤ ＴＭのＮｏｔ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ部位へ、サブクローニングした。なお、ｐＭＥ１８Ｓ−ＣＦＨＸ−ＦＸＹＤ ＴＭは、発現させた目的タンパク質がＮ末端にヒトＣＤ８ａ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１７６８）のシグナル配列及びＨｉｓタグ配列を有するものとなるように設計された発現ベクターである（入手元：東京大学分子細胞生物学研究所機能形成）。
４．抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体の作製
（１）細胞免疫，タンパク抗原免疫
ｈＤｌｋ−１発現細胞株（ＨＥＫ−２９３−ｈＤｌｋ細胞，７Ｅ２−Ｃ−ｈＤｌｋ細胞）、及び上記方法で調製したｈＤｌｋ−１のＦＡ−１領域（以下、ｈＦＡ−１）を抗原とした。ｈＤｌｋ−１発現細胞株は、１ｘ１０^７ｃｅｌｌ，ｈＦＡ−１タンパクは２０μｇを免疫補助剤（完全フロイントアジュバンド：和光純薬工業）、またはＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（フナコシ株式会社）と、１：１で混合してエマルジョンを調製し、６週齢のラット（Ｗｉｓｔｅｒ）、マウス（Ｃ５７／ＢＬ６，Ｂａｌｂ／ｃ）の両足蹠に注射した（初回免疫）。初回免疫から３日後及び１０日後に追加免疫を行い、最終免疫の翌日に、両膝膏リンパ節を採取し、リンパ球を調製した。追加免疫は、細胞免疫では５×１０^６ｃｅｌｌのＰＢＳによる細胞懸濁液を用い、タンパク質抗原の場合は、５μｇのＰＢＳ溶液を用いた。最終免疫の翌日に、両膝膏リンパ節を採取し、リンパ球を調製した。なお、追加免疫時には、ＰＢＳによる細胞懸濁液を抗原とした。調製したリンパ球とマウスミエローマ細胞株（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）とを、３：１の割合で混合し、ポリエチレングリコール法で細胞融合を行った。９６穴平底プレートでＨＡＴ（アミノプテリン、ヒポキサンチン、チミジン）を含む選択培地を用い、５％ ＣＯ_２インキュベーターで培養した。１０日〜１４日培養し、増殖してきたハイブリドーマの培養上清を、Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ（後述）による一次スクリーニング、ＨＥＫ−２９３細胞を用いたＦＡＣＳ解析で２次スクリーニングを行った。その後、限界希釈法で抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローン作製した。
（２）ＤＮＡ免疫
同様に、抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体を作製する目的で、ＤＮＡ免疫法という方法を用いることにより、ｈＤｌｋ−１の立体構造を認識し、その生物生理活性を阻害する特異的モノクローナルを作製した。ＤＮＡ免疫法は、マウス体内において、導入した発現ベクターに組み込まれたｈＤｌｋ−１遺伝子が発現されるため、本来の立体構造や翻訳後の各種修飾（例えば糖鎖修飾及びジスルフィド架橋等）を維持した形で、抗原を提示することが可能なため、従来の変性タンパク質や合成ペプチドを免疫源とした場合には困難な、本来のｈＤｌｋ−１の立体構造を認識し、その生物生理活性を阻害する特異的モノクローナルの作製を試みた。
ｈＤｌｋ−１の全長ｃＤＮＡをタグ付の哺乳動物発現ベクターに組み込む。構築した遺伝子コンストラクトが設計した通りに細胞表面に発現されるかどうかについて、免疫実施前に哺乳細胞を用いて検証した。すなわち、構築した遺伝子コンストラクトを哺乳細胞に一過性発現導入した。導入した哺乳細胞をＣＯ_２インキュベーターにて２４時間培養し、ＦＣＭ解析に用いた。ＦＣＭ解析する際、上記の導入遺伝子に付加しているタグに対する抗体を、遺伝子導入した培養細胞が入っている培養溶液に加え、３０分間静置した。その後、タグを特異的に認識する蛍光標識した二次抗体を溶液に添加し、３０分間静置してからＦＣＭ解析に使用した。本発明で構築した遺伝子コンストラクトが細胞表面に発現していることを証明した。
ｈＤｌｋ−１の立体構造を認識し且つその生物生理活性を阻害する抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体の開発するため、前記の通り構築した各種遺伝子コンストラクトを、単独で又は混合して、様々な遺伝子導入法（筋肉注射、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ、遺伝子銃）により免疫動物に導入した（約２〜３ヶ月間実施）。免疫した動物より採取した血清解析には、上記ＨＥＫ２９３−ｈＤｌｋ細胞を用いた。上記の導入遺伝子で免疫動物より採取した血清をＨＥＫ２９３−ｈＤｌｋ細胞が入っている培養溶液に加え、３０分間静置した。その後、免疫動物の免疫グロブリンを特異的に認識する蛍光標識した二次抗体を溶液に添加し、３０分間静置してからＦＣＭ解析に使用した。ＨＥＫ２９３−ｈＤｌｋ細胞を認識する強い特異抗体を産生している動物を解剖し、常法に従い、Ｂ細胞を単離して抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体作製した。
５．抗体精製
上記方法で作製したハイブリドーマのクローンを、予め（７日前）２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（プリスタン）を投与されたＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの腹腔内に３×１０^６個投与し、２週間後の腹水を採取した。さらに、この腹水から、カプリル酸沈澱、プロテインＧカラム（ＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いてアフィニティー精製を行うことで、各ハイブリドーマクローンが産生する抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体を得た。以後の解析は、この精製した抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体を用いて、実施した。
６．抗体の標識
作製した抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体のエピトープによる分類、又はインターナリゼーション活性の評価を行うために、抗体の標識を行った。当該抗体のビオチン標識は、ＥＣＬ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス、ＲＰＮ２２０２）を用いて行った。ローダミン標識は、ＥＺ−Ｌａｂｅｌ^ＴＭ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ピアス，５３００２）を用いて、ＦＩＴＣ標識は、ＥＺ−Ｌａｂｅｌ^ＴＭ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ピアス、５３００４）を用いて、各キットに添付のマニュアルに従って行った。
７．Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ
ゼラチンでコートした９６穴培養プレート（コーニング）に、上記７Ｅ２−Ｃ（ｈｄｌｋ）株を７．５×１０^３細胞／ウェルで播種し、３７℃で２日間培養した。氷冷ＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（商品名）溶液で処理し、ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ用プレートとした。以後、常法に従い、ＥＬＩＳＡ法を行った。具体的には以下の通りである。
まず、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液によるブロッキングを室温で２時間行った。次に、ハイブリドーマ上清を加え、室温で１時間反応させた後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）−ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。二次抗体としてビオチン化抗ラットＩｇＧ（ベクターラボラトリー）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ溶液で１００倍希釈して使用した。室温で１時間反応させた後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。さらに０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ溶液で１０００倍希釈したｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＨＲＰ；ベクターラボラトリー）を室温で１時間反応させ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ：ＳＩＧＭＡ）基質溶液を添加して発色反応を行い、１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させた。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ Ｍｏｄｅｌ ５５０（バイオ・ラッド）を用いて、吸光度を測定した。
８．ＦＡＣＳ解析
細胞はトリプシン処理によって培養皿から剥がし、細胞懸濁液（細胞密度５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を調製した。抗ヒトＤｌｋモノクローナル抗体０．５μｇと細胞懸濁液１００μＬとを、４℃で３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧまたはＰＥ標識抗ラットＩｇＧ（いずれもＢＤファーミンゲン）（０．５μｇ）と反応（４℃、３０分）させた後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン）により解析した。
９．ＥＬＩＳＡ法による解離定数（Ｋｄ値）の算出
作製した抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体の抗原親和性（Ｋｄ値）は、ＥＬＩＳＡを用いた方法で算出した（Ｄｊａｖａｄｉ−Ｏｈａｎｉａｎｃｅ Ｌ．ｅｔ ａｌ（１９９６），Ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈａｐｔｅｒ ４，ｐｐ７７−９７．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。
具体的には、９６穴培養プレート（コーニング）に、精製したリコンビナントｈＦＡ−１タンパク（１μｇ／ｍＬ）を添加して抗原を固相化した（室温，１時間）。次に、ＰＢＳで３回洗浄し、２％スキムミルク（ＰＢＳ溶液）を加えてブロッキングを行った（室温、１時間）。ＰＢＳで２回洗浄後、予め抗原溶液（精製ｈＦＡ−１タンパク；５０，２５，１２．５，６．２５，３．１２５ｎＭ）と抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体の各クローン（０．５ｎＭ）とを混合し平衡化させておいた抗原−抗体複合体を、上記ＥＬＩＳＡプレートに添加して反応させた（室温、１時間）。ＰＢＳで３回洗浄した後、ブロッキング液で希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（最終濃度１μｇ／ｍＬ）またはＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ（最終濃度１μｇ／ｍＬ）（いずれもＧＥヘルスケアバイオサイエンス）と反応させた（室温、１時間）。
１０．抗ヒトＤｌｋ−１モノクローナル抗体のエピトープ解析
作製した約１００種類の抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体を認識するエピトープによる分類を行った。前記発現ベクターｈｄｌｋ−ＥＧＦ（１−３）／ｐＭＥ１８Ｓ−ＣＦＨＸ，ｈｄｌｋ−ＥＧＦ（３−４）／ｐＭＥ１８Ｓ−ＣＦＨＸ，ｈｄｌｋ−ＥＧＦ（４−６）／ｐＭＥ１８Ｓ−ＣＦＨＸをそれぞれＣＯＳ−７細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入してから２４〜７２時間後に、細胞をトリプシン処理によって培養皿から剥がし、ＦＡＣＳ解析によって、各抗体クローンがｈＤｌｋ−１のどのＥＧＦ様モチーフを認識するものであるかについて検討した。
１１．免疫組織染色法
ヒト癌組織アレイ（Ｃｙｂｒｄｉ社、大腸癌組織アレイＬｏｔ：ＣＣ０５−０１−００１，乳癌組織アレイＬｏｔ：ＣＣ０８−０２−００２）は、脱パラフィン処理後、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、オートクレーブ（１２１℃，５分）を用いて抗原賦活化処理を施し、抗ｈＤｌｋ−１ポリクローナル抗体を用いた染色に使用した。ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンチジン）を基質とて発色反応を行った後、対比染色としてヘマトキシリンによる核染色を行った。具体的には、以下のようにして行なった。
中性ホルマリンによる固定及びパラフィン包埋された切片を、脱パラフィン処理後、１０ｍＭクエン酸ナトリウム溶液中でオートクレーブ（１２１℃，５分）を用いて抗原賦活化処理を施した。次に、メタノールに終濃度０．３％となるように過酸化水素水を加えた溶液によって、室温で２０分間処理し内因性のペルオキシダーゼ活性を除いた。ＰＢＳで室温５分間の洗いを２回行い、ブロックエース試薬（大日本製薬株式会社）を用いて３０分間ブロッキングを行い、組織中の非特異的結合部位をふさぐ操作を行った。次に、１／１０に希釈したブロックエース試薬により希釈した抗ｈＤｌｋ−１ポリクローナル抗体（終濃度０．５μｇ／ｍＬ）を室温で１時間反応させ、ＰＢＳで５分の洗浄を３回行い、続いて、１／１０に希釈したブロックエース試薬によって１００倍に希釈したビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体を室温で１時間反応させた。ＰＢＳによる５分間の洗浄を３回行った後、ＡＢＣキットの試薬を説明書通りに混ぜてＡＢＣコンプレックスを作り、これを室温で３０分反応させた。ＰＢＳで５分間の洗浄を３回行った後、ペルオキシダーゼ基質（０．０２％ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンチジン）、０．０３％過酸化水素水、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）によって発色を行った。発色を確認した後、水で１０分間洗浄し、マイヤーヘマトキシリン溶液（和光純薬工業）によって核を染色し、その後アルコールで脱水し、キシレンで透徹して、エンテランニュー（メルク・ジャパン）で封入した。
１２．担癌マウスの作製、及び抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体の薬効評価
（１）Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデル
ｈＤｌｋ−１を発現する肝癌細胞株（Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ）をトリプシン処理で剥がし、ＰＢＳで６×１０^７ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞懸濁液を調整し、氷上にて等量のマトリゲル（ＢＤファーミンゲン）と混合した。６週齢の雌のヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）の右脇腹の皮下に２６Ｇのシリンジを用いて１００μＬ（３ｘ１０^６ｃｅｌｌ）注射した。癌細胞移植当日に、マウスを群分し、抗体の投与（２０ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内投与）を開始した。以降は、３日に１回の間隔で同様の投与を行った。抗腫瘍活性は、腫瘍形成頻度及び腫瘍体積により評価した。腫瘍体積の計測は、以下の計算式を用いた。
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝（短径）^２×（長径）× π／６
（２）Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデル
ｈＤｌｋ−１を発現する肝癌細胞株（Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ）及びｈＤｌｋ−１を発現する大腸癌細胞株（ＳＷ４８０−ｈＤｌｋ）をトリプシン処理で剥がし、ＰＢＳで６×１０^７〜１０×１０^７ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞懸濁液を調整し、氷上にて等量のマトリゲル（ＢＤファーミンゲン）と混合した。６週齢の雌のヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）の右脇腹の皮下に２６Ｇのシリンジを用いて１００μＬ（３×１０^６〜５×１０^６ｃｅｌｌ）注射した。癌細胞移植から１０〜１４日後、腫瘍体積が５０〜１５０ｍｍ^３（平均値で約１００ｍｍ^３）に成長したマウスを群分し、群分した当日を１日目（Ｄａｙ １）として、抗体投与を開始した。抗体は３日に１回の間隔で腹腔内投与を行った（２０ｍｇ／ｋｇ体重）。抗腫瘍活性は、腫瘍体積を計測することによって評価した。有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ−ｔｅｓｔ）で行い、Ｐ＜０．０５以下を統計的に有意と判定した。
１３．抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体のインターナリゼーション活性の評価
ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体が抗原に結合した後、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれるインターナリゼーション活性は、抗体が認識するエピトープに依存する。そこで、作製した抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体のインターナリゼーション活性の評価を行った。ＦＡＣＳ解析による評価方法は、ＦＡＣＳ解析と蛍光顕微鏡による観察により評価した。
ＦＡＣＳ解析によるインターナリゼーション活性の評価は以下の方法で行った。抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体（０．５μｇ）をＨＥＫ−２９３−ｈｄｌｋ細胞（２×１０^５ｃｅｌｌ）に添加して反応させ（４℃、２０分）、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＭＥＭ培地に懸濁し、３７℃でインキュベート（６０分、９０分、１２０分，２４０分）し、細胞表面上に抗原−抗体複合体のインターナリゼーションを促進させた。その後、遠心（１，０００ｒｐｍ、５分）して細胞を回収後、ＰＥ標識抗マウス（又はラットＩｇＧ）（０．５μｇ）と反応（４℃、２０分）させた後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン）により解析した。
また、ＦＩＴＣ標識した抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体を、同様な方法でＨＥＫ−２９３−ｈｄｌｋ細胞と反応させ、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＭＥＭ培地に懸濁し、３７℃でインキュベート（１２０分）した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン）により解析した。
次に、ローダミン標識した抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体（０．５μｇ）をＨＥＫ−２９３−ｈｄｌｋ細胞（２×１０^５ｃｅｌｌ）に添加して反応させ（４℃、２０分）、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＭＥＭ培地に懸濁し、３７℃でインキュベート（１５分、３０分、６０分、１２０分）した後、サイトスピン（シャンドン）で塗沫標本を作製し（８００ｒｐｍ、３分）、マウンティング溶液で封入後（ベクターラボラトリー）、蛍光顕微鏡（ニコン；エクリプスＥ８００）で、抗原−抗体複合体の局在を観察した。
１４．抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体を用いたイムノコンジュゲートの作製
抗原結合後のインターナリゼーション活性の高い抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体クローンＭ３−１（マウスＩｇＧ１）、及び比較対照としてのクローンＭ１−２９０（マウスＩｇＧ２ｂ）と、植物性タンパク毒素であるサポリンとのイムノコンジュゲートを作製した（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ社、サンディエゴ）。
１５．抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体を用いたイムノコンジュゲートの薬効評価
細胞は、トリプシン処理によって培養皿から剥がし、１０％ ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ培地に１ｘ１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞懸濁液を調整した。コラーゲンコートした９６穴平底プレートに１ｘ１０^４／ｗｅｌｌで播いて、２〜３時間培養し細胞を接着させた。次に、各種イムノコンジュゲート、すなわちマウスＩｇＧ−サポリン（ＩｇＧ−ＳＡＰ）、Ｍ３−１−サポリン（Ｍ３−１−ＳＡＰ）、及びＭ１−２９０−サポリン（Ｍ１−２９０−ＳＡＰ）を添加した。それぞれ、０．１，１，１０，１００，１，０００ｎｇ／ｍＬで添加した。４８〜７２時間培養後、ＭＴＴ法により吸光度を測定した。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性の評価は、上記Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ細胞を用いた担癌マウスで評価した。
１６．ＭＴＴ法
９６穴プレートで培養した細胞にテトラカラーワン（生化学工業）を添加し、５％ ＣＯ_２インキュベーターで３〜４時間反応させた。反応後の９６穴プレートを、そのままマイクロプレートリーダーを用いて波長４９０ｎｍ（対照波長：６５５ｎｍ）の吸光度を測定した。
＜結果＞
１．ヒト肝癌細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデル）における公知の抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体（１Ｃ１，４Ｃ４，３１Ｃ４）の腫瘍成長阻害活性の検討
ｈＤｌｋ−１は、種々の癌細胞の細胞表面に発現し、またヒト肝癌細胞株にｈＤｌｋ−１遺伝子を安定的に発現させると、ヌードマウス皮下に移植した場合、腫瘍成長速度が著しく促進されることから（ＷＯ ２００５／０５２１５６参照）、抗ｈＤｌｋ−１抗体は、癌治療用薬剤として有用であると考えられる。ｈＤｌｋ−１自体は遺伝子配列／アミノ酸配列が公知であるので、原理的には合成ペプチドや精製タンパクを免疫源として、公知の方法によりｈＤｌｋ−１に対するモノクローナル抗体を得ることは可能である。しかしながら、実際に、癌治療薬として活性を示す、すなわち個体レベル（ｉｎ ｖｉｖｏ）で抗腫瘍活性を示す抗体が作製できるか否かは、一般に、抗原の種類、発現量、タンパク構造などからは不明なことが多い。数万種類とも言われるモノクローナル抗体の中で、腫瘍（癌）を代表とする疾患の治療薬として上市されているものは、わずか２０種類程度ということからも分かるように、大部分の抗体は、個体レベルで薬効を示さない。
公知の抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体（クローン１Ｃ１，４Ｃ４，３１Ｃ４）は、少なくとも補体存在下においてヒト肝癌細胞を死滅させることが公知である（ＷＯ ２００５／０５２１５６参照）。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬効については不明であった。
まず、公知の３クローンのｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性を、ｈＤｌｋ−１を発現する肝癌細胞株（Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ）をヌードマウス皮下に移植し、移植と同時に抗体投与を開始し、腫瘍細胞のヌードマウス皮下への生着と腫瘍成長への効果を検討した。
下記表２に示した通り、細胞移植と同時に抗体投与を開始し、１４日目（Ｄａｙ １４）において、コントロール群（ラットＩｇＧ投与）では、１０匹中全ての個体で腫瘍が形成された（平均腫瘍体積：３８２．０±７４．８ｍｍ^３）。一方、抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体投与群の腫瘍形成率は、１Ｃ１投与群で４０％、４Ｃ４投与群及び３１Ｃ４投与群で３０％と、著しく腫瘍形成率が低かった。２１日目（Ｄａｙ ２１）においても、１Ｃ１投与群で７０％、４Ｃ４投与群及び３１Ｃ４投与群で５０％と、いずれも抗体投与によって腫瘍形成が阻害された。形成された腫瘍の体積は、平均値では抗体投与群はコントロール群よりも低い値を示したが、統計的な有意差が認められなかった。
２．ヒト肝癌細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデル）における公知の抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体（１Ｃ１，４Ｃ４，３１Ｃ４）の腫瘍成長阻害活性の検討
抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体が、癌治療抗体として薬効を発揮するためには、確立した腫瘍組織に対して、抗腫瘍活性を発揮することが非常に重要である。また、上記Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルでは、腫瘍形成率を比較することによって、抗体の抗腫瘍活性をある程度推測することは可能であるが、個体間のばらつきが大きく、抗腫瘍活性を正確に評価することはできない。
そこで、次にＨｕｈ−７−ｈＤｌｋ細胞をヌードマウス皮下に移植し、平均腫瘍体積が１００ｍｍ^３に成長した段階で抗体投与を開始するＴｒｅａｔｍｅｎｔモデルで薬効評価した。
図１に示すように、Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルでは、１Ｃ１（ラットＩｇＧ１）（図１Ａ）、４Ｃ４（ラットＩｇＧ２ａ）（図１Ｂ）及び３１Ｃ４（ラットＩｇＧ２ａ）（図１Ｃ）を、それぞれ２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で３日に１回腹腔内投与を行い、腫瘍成長に対する効果を検討した。しかし、いずれのクローンも有意な腫瘍成長阻害活性を示さなかった。
３．ヒト肝癌細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデル）における新規な抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性の検討
ｈＤｌｋ−１を標的とした癌治療用抗体は、Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいて、ｈＤｌｋ−１を発現する腫瘍組織を特異的に死滅させるか、腫瘍の成長を阻害する活性を示すことが必須である。
本願発明において新たに作製した抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体（約１００クローン）を、同様にＨｕｈ−７−ｈＤｌｋ細胞のＸｅｎｏｇｒａｆｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルで評価した。新規に作製した約１００クローンのうち、大部分のクローンは公知の３クローンと同様に、Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルでは薬効を示さなかったが、その中でも顕著な腫瘍成長阻害活性を示す以下のクローン、すなわちクローンＤＩ−２−１４、２−１３、ＢＡ−１−３Ｄ、ＤＩ−６及びＭ３−１が得られた。
クローンＤＩ−２−１４（マウスＩｇＧ１）投与群では、抗体投与後、全ての個体で（Ｎ＝８）腫瘍成長が阻害され、投与開始後１４日目（Ｄａｙ １４）において、コントロール群（Ｎ＝８）の腫瘍体積が９０７．７±１４２．８ｍｍ^３に対し、クローンＤＩ−２−１４投与群では１７５．５±４６．５ｍｍ^３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図２Ａ）。抗体投与開始時点での腫瘍体積を１．０としたときの、１４日目（Ｄａｙ １４）における腫瘍体積は、コントロール群が９．２４であるのに対し、クローンＤＩ−２−１４投与群では１．８５であった。摘出した腫瘍重量も、コントロール群が０．５８±０．０７（ｇ）であったのに対し、クローンＤＩ−２−１４投与群では０．１５±０．０４（ｇ）（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図２Ｂ）。
図２Ｃに示すように、クローンＤＩ−２−１４の投与による抗腫瘍活性は、独立した別の試験においても再現され、同様に腫瘍体積の平均値が１００ｍｍ^３（コントロール群：１０３．８±１１ｍｍ^３（Ｎ＝７）、ＤＩ−２−１４投与群：１０１．４±９．５ｍｍ^３（Ｎ＝８））に達した段階で、抗体投与を開始した。投与開始後１４日目（Ｄａｙ １４）において、コントロール群の腫瘍体積が７３３．３７±２４４．８６ｍｍ^３であったのに対し、クローンＤＩ−２−１４投与群では１４８．８３±３２．６５ｍｍ^３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であった。
クローン２−１３（ラットＩｇＧ２ｂ）投与群（Ｎ＝１０）では、完全ではないが、腫瘍成長速度が統計的に有意に阻害され、投与開始後１４日目（Ｄａｙ １４）において、コントロール群（Ｎ＝１０）の腫瘍体積が１５８０．２±１７９．４ｍｍ^３であったのに対し、クローン２−１３投与群では８３２．９±１３１．８ｍｍ^３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であり、約５０％の阻害を示した（図３Ａ）。
同様に、クローンＢＡ−１−３Ｄ（マウスＩｇＧ２ａ）投与群（Ｎ＝８）及びクローンＤＩ−６（マウスＩｇＧ１）投与群（Ｎ＝８）では、コントロール群（Ｎ＝８）の腫瘍体積が９０７．７±１４２．８ｍｍ^３であったのに対し、それぞれ、３８０．８±５４．４ｍｍ^３（図３Ｂ）及び３２１．０±５９．６ｍｍ^３（図３Ｃ）であり、いずれも有意に腫瘍成長が阻害された（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）。
また、クローンＭ３−１（マウスＩｇＧ１）投与群（Ｎ＝８）でも、腫瘍成長速度が有意に阻害され、投与開始後１４日目（Ｄａｙ １４）におけるコントロール群（Ｎ＝７）の腫瘍体積が１１２３．８±２４９．１ｍｍ^３であったのに対し、クローンＭ３−１投与群では４５７．０±１２３．７５ｍｍ^３であった（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）（図３Ｄ、表３参照）。
なお、上記クローンのうち、クローンＭ３−１を産生するハイブリドーマは、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ｍ３−１」と称して、２００６年１０月１８日付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７０７）。
同様に、クローンＤＩ−２−１４を産生するハイブリドーマは、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ｍ３−１」と称して、２００７年８月２１日付で、同センターに寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８９９）。
クローンＤＩ−６を産生するハイブリドーマは、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ｍ３−１」と称して、２００７年８月２１日付で、同センターに寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９００）。
４．ヒト大腸癌細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデル）における抗腫瘍活性の検討
上記のヒト肝癌細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルを用いた場合と同様に、ヒト大腸癌細胞株（ＳＷ４８０−ｈＤｌｋ）のＸｅｎｏｇｒａｆｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルでの抗腫瘍活性を、クローン２−１３について検討した（図４）。
クローン２−１３投与群では、コントロール群（ラットＩｇＧ投与群）と比較して、腫瘍成長が有意に阻害され、１６日目（Ｄａｙ １６）において、ラットＩｇＧ投与群（Ｎ＝７）の腫瘍体積が８７７．２７±１７６．８２ｍｍ^３（投与開始日を１．０とした場合、５．０１）であったのに対し、クローン２−１３投与群（Ｎ＝８）では４５２．７１±５４．９７ｍｍ^３（投与開始日を１．０とした場合、２．８７）であった（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）（図４）
以上の結果より、抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体は、肝癌細胞のみならず、大腸癌細胞に対しても、ｉｎ ｖｉｖｏでの有意な腫瘍成長阻害活性を示すことが明らかとなった。
５．抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体（クローンＤＩ−２−１４、２−１３、ＢＡ−１−３Ｄ、ＤＩ−６及びＭ３−１）の抗原結合活性（ＨＥＫ−２９３−ｈＤｌｋ細胞を用いたＦＡＣＳ解析、及びＥＬＩＳＡによる解離定数の算出）
ヒト癌細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルで顕著な抗腫瘍活性を示した抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体について、抗原であるｈＤｌｋ−１との親和性を、ＨＥＫ−２９３−ｈＤｌｋ細胞（図５）及びＨｕｈ−７−ｈＤｌｋ細胞（図６）を用いてＦＡＣＳ解析したところ、いずれのクローンも全ての細胞株を認識し、ｈＤｌｋ−１の立体構造を認識することが示された。データは示していないが、いずれのクローンも、ｈＤｌｋ−１を発現していないＨＥＫ２９３細胞及びＨｕｈ−７細胞については全く認識しなかった。
次に、これらクローンの抗原との親和性（解離定数）を上記ＥＬＩＳＡ法により算出した。その結果、それぞれのクローンのＫｄ値は、クローンＤＩ−２−１４は９．２６×１０^−９（Ｍ）、クローンＭ３−１は６．２８×１０^−９（Ｍ）、クローンＢＡ−１−３Ｄは３２．２×１０^−９（Ｍ）、クローンＤＩ−６は１０．１×１０^−９（Ｍ）であった。クローン２−１３については、精製したリコンビナントｈＦＡ−１との親和性が高くなく、上記方法によりＫｄ値を算出することができなかった。
６．抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体のエピトープ解析
次に、抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体のエピトープの解析を行った。
ｈＤｌｋ（ＥＧＦ １−２）−ｐＭＥ−ＣＨＦＸ、ｈＤｌｋ（ＥＧＦ １−３）−ｐＭＥ−ＣＨＦＸ、ｈＤｌｋ（ＥＧＦ ３−４）−ｐＭＥ−ＣＨＦＸ、ｈＤｌｋ（ＥＧＦ ４−６）−ｐＭＥ１８−ＣＨＦＸ、及びｈＤｌｋ（ＥＧＦ ５−６）−ｐＭＥ１８−ＣＨＦＸのそれぞれの発現ベクター（図７）を、ＣＯＳ−７細胞に導入し、ＦＡＣＳ解析及びサイトスピン標本の免疫染色により、各抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体が、ｈＤｌｋ−１のＦＡ−１領域（細胞外領域）に存在する６つのＥＧＦ様モチーフを含む領域のうち、どのあたりの部位を認識しているかについて検討した。
クローンＤＩ−２−１４は、ＦＡＣＳ解析と免疫染色により、ＥＧＦ（１−３）及びＥＧＦ（３−４）を認識し、ＥＧＦ（１−２）、ＥＧＦ（４−６）及びＥＧＦ（５−６）は全く認識しなかった（図８）。クローンＤＩ−２−１４が認識するエピトープは、ｈＤｌｋ−１の３番目のＥＧＦ様モチーフ（ＥＧＦ−３）から４番目のＥＧＦ様モチーフ（ＥＧＦ−４）を含む領域（ｈＤｌｋ−１の第９２番目〜第１６７番目のアミノ酸からなる領域）、おそらくＥＧＦ−３（ｈＤｌｋ−１の第９２番目〜第１２０番目のアミノ酸からなる領域）であることが示された。マウスにおいては、ＩｇＧのアイソタイプのうち、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）は、ＩｇＧ２ａとＩｇＧ２ｂとが強く、ＩｇＧ１は活性が低いことが報告されている（Ｋｉｐｐｓ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９８５参照）。クローンＤＩ−２−１４のアイソタイプはマウスＩｇＧ１であることから、クローンＤＩ−２−１４の非常に強い腫瘍成長阻害活性は、ＡＤＣＣ活性などのエフェクター細胞を介した癌細胞障害活性よりも、ｈＤｌｋ−１の機能を阻害することにより抗腫瘍活性を発揮していることが示され、ｈＤｌｋ−１のＥＧＦ−３及びＥＧＦ−４を含む領域、特にＥＧＦ−３は、ｈＤｌｋ−１の機能において特に重要なドメインであることが示された。
また、クローン２−１３、ＤＩ−６及びＢＡ−１−３Ｄは、ＥＧＦ（１−２）及びＥＧＦ（１−３）を認識し、ＥＧＦ（３−４）及びＥＧＦ（４−６）は全く認識しなかった（図９）。これら３クローンが認識するエピトープは、ｈＤｌｋ−１の１番目のＥＧＦ様モチーフ（ＥＧＦ−１）から２番目のＥＧＦ様モチーフ（ＥＧＦ−２）を含む領域（ｈＤｌｋ−１の第２６番目〜第８５番目のアミノ酸からなる領域）であることが示され、ｈＤｌｋ−１のＥＧＦ−１及びＥＧＦ−２を含む領域は、ｈＤｌｋ−１の機能において特に重要なドメインであることが示された。
さらに、クローンＭ３−１は、ＥＧＦ（１−４）及びＥＧＦ（４−６）を認識したが、ＥＧＦ（１−２）、ＥＧＦ（１−３）及びＥＧＦ（３−４）は認識しなかった（図１０）。クローンＭ３−１が認識するエピトープは、ｈＤｌｋ−１の４番目のＥＧＦ様モチーフ（ＥＧＦ−４）から６番目のＥＧＦ様モチーフ（ＥＧＦ−６）を含む領域（ｈＤｌｋ−１の第１３１番目〜第２４４番目のアミノ酸からなる領域）であることが示され、ｈＤｌｋ−１のＥＧＦ−４、ＥＧＦ−５及びＥＧＦ−６を含む領域は、ｈＤｌｋ−１の機能において特に重要なドメインであることが示された。
７．抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体のインターナリゼーション活性
作製した抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体の各クローンを、認識するエピトープによって分類し、分類された各グループに属するクローンについて、抗原認識後のインターナリゼーション活性を調べた。
ＥＧＦ（１−２）を認識するクローンＭ１−２９０、ＥＧＦ（４−６）を認識するＭ３−１、及びＥＧＦ（５−６）を認識するクローンＭ３−４について、各抗体をＨＥＫ２９３−ｈＤｌｋ細胞と反応後、３７℃でインキュベートし、その後、ＰＥ標識抗マウス抗体と反応させた。図１１Ａに示すように、インキュベートをしなかった場合の蛍光強度を１００％とした場合、クローンＭ３−１は他のクローンと比べて著しく早い速度で、インキュベート時間に依存して蛍光強度が減少した。この結果により、抗原−抗体反応後、時間依存的に細胞内に取り込まれることによって、細胞表面上の抗原−抗体複合体が減少するためであることが示された。なお、各インキュベート時間後の蛍光強度は以下の通りであった。
６０分； Ｍ３−１：３８．７％，Ｍ１−２９０：５２．１％，Ｍ３−４：７４．１％
９０分； Ｍ３−１：３６．９％，Ｍ１−２９０：４７．１％，Ｍ３−４：７１．１５％
１２０分；Ｍ３−１：２８．１％，Ｍ１−２９０：３６．３％，Ｍ３−４：５７．３％
２４０分；Ｍ３−１：１２．２％，Ｍ１−２９０：３１．２％，Ｍ３−４：４１．４％
インキュベートした場合の平均蛍光強度の減少の要因が、インキュベート間に抗原と結合した抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体が当該抗原から剥がれたことではないことを確認した。クローンＭ３−１を直接ＦＩＴＣで標識し、同様にＨＥＫ２９３−ｈＤｌｋ細胞と反応させ、ＰＢＳで洗浄後、３７℃で１２０分インキュベートし、その後、ＦＡＣＳ解析を行い、反応直後とインキュベート１２０分後の蛍光強度を比較した。その結果、両者で有意差はなかった（インキュベート無し：１００％，インキュベート１２０分後：１１０．９％）（図１１Ｂ）。
次に、ローダミン標識した抗体をＨＥＫ２９３−ｈＤｌｋ細胞と反応させ、ＰＢＳ洗浄後、同様に３７℃でインキュベートした。その後、サイトスピンを用いて塗沫標本を作製し、蛍光顕微鏡で蛍光標識抗体の局在を観察した。その結果、図１２に示すように、インキュベート無しでは、細胞膜への局在が観察された。しかし、３７℃でインキュベートすることによって、ＥＧＦ（４−６）を認識するクローンＭ３−１及びＤＩ−１では、わずか１５分のインキュベートで、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ、ベシクルに取り込まれ、ドット状の細胞内局在が観察された。一方、クローンＭ１−２９０及びＭ３−４では、ドット状の局在が観察されるものの、大部分は細胞膜に局在していた（図１２）。
以上の結果から、クローンＭ３−１などのＥＧＦ（４−６）を認識する抗体は、他のドメインを認識する抗体と比較して、抗原認識後のインターナリゼーション活性が著しく高かった。従って、クローンＭ３−１などの抗ｈＤｌｋ−１抗体を、抗癌剤や細胞毒素と結合させて複合体化したイムノコンジュゲートは、すばやく標的細胞内に取り込まれるため、抗癌剤や細胞毒素の薬理効果が高く、しかも副作用が少ないことが考えられた。
８．抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体イムノコンジュゲートの細胞障害活性
抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体のイムノコンジュゲートを用いたミサイル療法の有用性を、インターナリゼーション活性の高いクローンＭ３−１と、比較対照としてのクローンＭ１−２９０に、それぞれサポリンを結合させたイムノコンジュゲート（Ｍ３−１−ＳＡＰ，Ｍ１−２９０−ＳＡＰ）を作製し、薬効評価をおこなった。Ｍ３−１−ＳＡＰ及びＭ１−２９０−ＳＡＰのいずれも、ｈＤｌｋ−１を発現していないＨＥＫ２９３細胞には、全く毒性を示さなかった。
次に、ｈＤｌｋ−１を発現しているＨｕｈ７−ｈＤｌｋ細胞及びＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞（内在性ｈＤｌｋ−１発現神経芽細胞腫）に添加して培養したところ、コントロール（マウスＩｇＧ−ＳＡＰ）では、いずれの細胞でもほとんど細胞障害性を示さなかった。しかし、Ｍ３−１−ＳＡＰを培養液に添加して培養したところ、濃度依存的に細胞が障害され、１μｇ／ｍＬの濃度であると、Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ細胞では生存率２３．３±１．３５％（Ｎ＝３）、ＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞では生存率９．３８±２．１％（Ｎ＝３）であり、強い細胞障害活性を示した（図１３）。
ＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞（内在性ｈＤｌｋ−１発現神経芽細胞腫）に対する、Ｍ３−１−ＳＡＰとＭ１−２９０−ＳＡＰとの細胞障害活性を比較したところ、図１３Ｂに示すように、両者の活性はほぼ同等であった（図１３Ｂ）。
９．抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体イムノコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍成長阻害活性
Ｍ３−１−ＳＡＰのイムノコンジュゲートとしての有用性、すなわちマウス個体に投与した場合の、抗腫瘍活性及び副作用について、Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ ｃｅｌｌのＸｅｎｏｇｒａｆｔモデルで評価した。比較対照としてＭ１−２９０−ＳＡＰを用いた。抗腫瘍活性の評価は、前記と同様に腫瘍体積で行い、副作用の検討は投与後の体重変化及び致死率で行った。
マウスＩｇＧ投与群（Ｎ＝８）では、試験期間（１４日間）を通して、体重の増減は認められなかったが、Ｍ３−１−ＳＡＰ（５ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内投与）投与群（Ｎ＝８）及びＭ１−２９０−ＳＡＰ（５ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内投与）投与群（Ｎ＝８）では、イムノコンジュゲート投与開始後４日目（Ｄａｙ ４）において、体重の減少が観察された（「Ｍ３−１−ＳＡＰ」は、Ｄａｙ １：２１．２±１．３６（ｇ），Ｄａｙ ４：１８．５±１．４４（ｇ）；「Ｍ１−２９０−ＳＡＰ」は、Ｄａｙ １：２１．１３±０．８１（ｇ），Ｄａｙ ４：１７．９±０．８５（ｇ））。特に、インターナリゼーション活性の高くないＭ１−２９０−ＳＡＰの毒性は強く、８個体のうち、４日目（Ｄａｙ ４）で２個体が死亡し、５日目（Ｄａｙ ５）で残り６個体が死亡したため、結果として投与開始から５日間で全ての個体が死亡した（図１４Ｂ）。
一方、Ｍ３−１−ＳＡＰ投与群では全個体が生存し、体重も８日目（Ｄａｙ ８）以降回復が見られた。
腫瘍成長についても、図１５に示すように、Ｍ３−１−ＳＡＰ投与群では強く阻害され、１４日目（Ｄａｙ １４）における腫瘍体積は（投与はＤａｙ １及びＤａｙ ４の２回）、コントロール群が１１２３．８±２４５．６５ｍｍ^３であったのに対し、Ｍ３−１−ＳＡＰ投与群では４１５．８±１０５．１ｍｍ^３（Ｐ＜０．０５ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であった。
さらに、Ｍ３−１−ＳＡＰの抗腫瘍活性を確認するために、Ｍ３−１−ＳＡＰを腫瘍部位に局所投与（１ｍｇ／ｍＬ Ｍ３−１−ＳＡＰ，４０μＬ／腫瘍）した。Ｍ３−１−ＳＡＰ及びコントロールＩｇＧの投与は、所定の平均腫瘍体積（コントロール群：１４４．９８±６．１ｍｍ^３（Ｎ＝５）、Ｍ３−１−ＳＡＰ群：１４５．８７±２１．２６ｍｍ^３（Ｎ＝５））となった時点と、投与開始後４日目（Ｄａｙ ４）との２回行い、腫瘍体積の成長を観察した。
その結果、図１７Ａに示すように、Ｍ３−１−ＳＡＰ投与群では７日目（Ｄａｙ ７）までほぼ完全に腫瘍の成長が阻害され（コントロール群：５８４．０２±１３７．０７ｍｍ^３、Ｍ３−１−ＳＡＰ群：１４８．６７±３８．０ｍｍ^３、Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）、１４日目（Ｄａｙ １４）においても、コントロール群が２０３８．６６±３３３．１７ｍｍ^３であったのに対し、Ｍ３−１−ＳＡＰ投与群は５７５．７５±２１６．６１ｍｍ^３（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であり、非常に強い抗腫瘍活性を示した。
図１６Ｂに示すように、Ｍ３−１−ＳＡＰの腫瘍内投与の場合においても、４日目（Ｄａｙ ４）における２回目の投与以後、若下の体重減少が認められたが、全個体生存しており、９日目（Ｄａｙ ９）以後は体重も次第に回復し、１０日目（Ｄａｙ １０）では完全に投与前の状態にまで回復した。
一方、図１６Ｃに示すように、既存の抗癌剤であるシスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）（抗悪性腫瘍剤ランダ注；日本化薬株式会社）を投与した場合、５ｍｇ／ｋｇの投与量で、腫瘍成長はほぼ完全に阻害されたものの（１６日目でコントロール群（ＰＢＳ群）：１０８５．３６±２８６．３０ｍｍ^３，Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ群：７７．２８±１５．２０ｍｍ^３，Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）、図１６Ｄに示すように、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ投与群では、経時的な体重の著しい減少が観察され、１６日目（Ｄａｙ １６）におけるコントロール群の体重が、２０．５８±０．５３ｇであったのに対し、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ投与群では１３．２４±１．８３ｇ（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であり、非常に強い副作用（体重減少）が観察された。
以上の結果から、インターナリゼーション活性の高いクローンＭ３−１（ＥＧＦ（４−６）の認識抗体）は、イムノコンジュゲートとして使用した場合、他のクローンと比べて、副作用が少なく、かつ抗腫瘍活性が高いことが示された。
１０．ヒト大腸癌組織、乳癌組織におけるｈＤｌｋ−１の発現
ｈＤｌｋ−１は、従来、固形癌では、神経内分泌腫瘍、神経芽細胞腫、神経膠腫、１型神経線維腫症、小細胞肺癌、肝臓癌、腎臓癌及び卵巣癌において発現していることが報告され、血液癌では、骨髄異形成症候群及び急性骨髄性白血病において発現していることが報告されている。
上記以外の癌種でのｈＤｌｋ−１の発現を調べるため、市販のヒト癌組織アレイを抗ｈＤｌｋ−１抗体で免疫染色し検討した。大腸癌におけるｈＤｌｋ−１の陽性率は、大腸癌組織アレイ（Ｃｙｂｒｄｉ社、ｌｏｔ Ｎｏ．ＣＣ０５−０１−００１）を用いた。図１７に、代表的な染色写真を示したが、７０検体の大腸癌組織を検討したところ、Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（腺癌）では４３検体中１２検体（２７．９％）が強陽性、１９検体（４４．２％）が弱陽性を示し、腺癌全体では４３検体中３１検体（７２．１％）でｈＤｌｋ−１陽性であった（表４参照）。
また、同じ組織アレイ中のＰａｐｉｌｌｌａｒｙ Ａｄｅｎｏｃａｒｉｃｉｎｏｍａ（乳頭状腺癌）の１１検体については、６検体（５４．５％）でｈＤｌｋ−１強陽性を示した（表４参照）。
乳癌におけるｈＤｌｋ−１の陽性率は、乳癌組織アレイ（Ｃｙｂｒｄｉ社、ｌｏｔ Ｎｏ．ＣＣ０８−０２−００２）を用いた。本組織アレイは、５３検体から採取した計６３切片から構成され、このうち、１７検体（１７切片）がＩｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｄｕｃｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（浸潤性乳管癌）、２検体（２切片）がＩｎｔｒａｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（乳管内癌）、３４検体（４４切片）が正常組織やコラーゲンファイバーなどの非癌組織からなる。ｈＤｌｋ−１は正常な乳腺組織でも弱陽性を示す検体もあったが（図１８）、染色性は非常に弱く、一方、Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｄｕｃｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａでは１７検体中５検体（２９％）で強陽性を示した。（図１８、表５参照）。
従来公知のｈＤｌｋ−１発現癌種に加え、大腸癌及び乳癌でも、両者ともに約３０％でｈＤｌｋ−１が強発現していることが明らかとなった。抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体は、上記実施例で示したとおり、肝癌細胞のＸｅｎｏｇｒａｆｔに加えて、大腸癌細胞のＸｅｎｏｇｒａｆｔモデルでも抗腫瘍活性を示したことから、肝癌に加えて、大腸癌に対しても有効な治療薬となる。同様に乳癌やその他のｈＤｌｋ−１発現癌細胞を標的とした有効な治療薬となる。

１．マウス抗ヒトＤｌｋ−１抗体（クローンＤＩ−２−１４）の、ヒトＤｌｋ−１発現肝癌細胞株（Ｈｕｈ−７−Ｄｌｋ細胞）Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける用量依存的な抗腫瘍活性
＜目的＞
抗ヒトＤｌｋ−１モノクローナル抗体であるクローンＤＩ−２−１４（マウスＩｇＧ１）は、実施例１に記載の通り、ヒト肝癌細胞株（Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ細胞）のＸｅｎｏｇｒａｆｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいて、２０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で、非常に高い抗腫瘍活性を示した。そこで、クローンＤＩ−２−１４の抗腫瘍活性を更に検証するために、用量依存的な抗腫瘍活性の評価を行った。
＜方法＞
抗体の投与量を変えた以外は、実施例１と同様にして抗腫瘍活性の評価を行った。
＜結果＞
図１９に示したとおり、腫瘍の成長はクローンＤＩ−２−１４の投与によって用量依存的に阻害され、抗体投与後８日目（Ｄａｙ ８）において、コントロール群（Ｎ＝９）の腫瘍体積が７８２．１±１２４．４ｍｍ^３であったのに対し、ＤＩ−２−１４（１ｍｇ／ｋｇ）投与群（Ｎ＝９）が５２２．７６±１０７．９ｍｍ^３、ＤＩ−２−１４（２ｍｇ／ｋｇ）投与群（Ｎ＝９）が３０９．２±５８．９ｍｍ^３、ＤＩ−２−１４（５ｍｇ／ｋｇ）投与群（Ｎ＝９）が２８５．８±３８．２ｍｍ^３であった。
２．マウス抗ヒトＤｌｋ−１抗体（クローンＤＩ−２−１４）のヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける抗腫瘍活性
＜目的＞
実施例１に記載の通り、ヒト肝癌細胞株（Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ細胞）のＸｅｎｏｇｒａｆｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいて、抗腫瘍活性を示した５種類の抗ヒトＤｌｋ−１モノクローナル抗体の中でも、特に強い抗腫瘍活性を示したクローンＤＩ−２−１４（マウスＩｇＧ１）について、ヒト神経芽細胞腫（ＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞）のＸｅｎｏｇｒａｆｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける抗腫瘍活性の評価を行った。Ｈｕｈ−７−ｈＤｌｋ細胞は、Ｈｕｈ−７細胞に外来性にヒトＤｌｋ−１遺伝子を安定的に発現させた細胞株であるのに対して、ＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞は、内在的にＤｌｋ−１を細胞表面に発現している細胞株である。そのため、ＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞株でのＸｅｎｏｇｒａｆｔ ＴｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおいてクローンＤＩ−２−１４の投与による抗腫瘍活性を示すことは、ヒト神経芽細胞腫に対して抗ヒトＤｌｋ−１モノクローナル抗体が薬効を示すことであり、同時に、細胞表面にＤｌｋ−１を発現している各種癌細胞に対して抗ヒトＤｌｋ−１モノクローナル抗体（特にクローンＤＩ−２−１４）が有効である（薬効を示す）ことであると言える。
＜方法＞
内在的にｈＤｌｋ−１を細胞表面に発現するヒト神経芽細胞腫（ＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞、ＡＴＣＣ：カタログＮｏ．ＣＲＬ２１４２）をトリプシン処理で剥し、ＰＢＳで６ｘ１０^７ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞懸濁液を調製し、氷上にて等量のマトリゲル（ＢＤファーミンゲン）と混合した。６週齢の雌の重症複合免疫不全マウス（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ）の右脇腹の皮下に２６Ｇのシリンジを用いて１００μＬ（３ｘ１０^６ｃｅｌｌ）注射した。癌細胞移植から１０〜１４日後、腫瘍体積が５０〜１５０ｍｍ^３（平均：約１００ｍｍ^３）に成長したマウスを群分し、群分した当日を１日目（Ｄａｙ １）として、抗体（クローンＤＩ−２−１４）の投与を開始した。抗体は、３日に１回の間隔で腹腔内投与により投与した（５ｍｇ／ｋｇ体重、２０ｍｇ／ｋｇ体重）。抗腫瘍活性は、実施例１と同様にして腫瘍体積を計測することにより評価した。また、実験最終日に、剖検により腫瘍を摘出し、腫瘍重量を計測して評価した。有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔで行い、Ｐ＜０．０５以下を統計的に有意であると判定した。
＜結果＞
図２０Ａに示すように、クローンＤＩ−２−１４（マウスＩｇＧ１）投与群では、コントロール群（Ｎ＝７）と比較して、５ｍｇ／ｋｇ投与群（Ｎ＝８）及び２０ｍｇ／ｋｇ投与群（Ｎ＝７）のいずれにおいても腫瘍成長が顕著に阻害され、特に２０ｍｇ／ｋｇ投与群（Ｎ＝７）では、投与開始後の翌日から実験終了時である２３日目（Ｄａｙ ２３）まで、同日基準の腫瘍体積が統計的に有意に小さかった（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）。
投与開始後２３日目（Ｄａｙ ２３）においては、コントロール群の腫瘍体積が５２７．８±４８．９ｍｍ^３であったのに対して、クローンＤＩ−２−１４（５ｍｇ／ｋｇ体重）投与群では３３３．８±６．８ｍｍ^３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）、クローンＤＩ−２−１４（２０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群では２３３．０±１６．４ｍｍ^３（Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であり、クローンＤＩ−２−１４の用量依存的な抗腫瘍活性が確認された（ＤＩ−２−１４（５ｍｇ／ｋｇ）ｖｓ ＤＩ−２−１４（２０ｍｇ／ｋｇ），Ｄａｙ ２３，Ｐ＜０．０１ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）。
摘出した腫瘍重量も、コントロール群が０．０７±０．０４（ｇ）であったのに対して、クローンＤＩ−２−１４（５ｍｇ／ｋｇ体重）投与群では０．０３±０．００９（ｇ）（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）、クローンＤＩ−２−１４（２０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群では０．０２±０．００５（ｇ）（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であった。腫瘍体積と同様に、クローンＤＩ−２−１４の５ｍｇ／ｋｇ投与群と２０ｍｇ／ｋｇ投与群との腫瘍重量の差も有意（Ｐ＜０．０５ ｂｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）であり、用量依存的な抗腫瘍活性が確認された（図２０Ｂ）。
３．マウス抗ヒトＤｌｋ−１抗体（クローンＤＩ−２−１４）の抗体遺伝子の可変領域配列の決定と、キメラＤＩ−２−１４発現ベクターの構築
マウス抗ヒトＤｌｋ−１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で、３７℃、７．５％ ＣＯ_２インキュベーターで培養した。３ｘ１０^６個のハイブリドーマより、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、全ＲＮＡを抽出したのち、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、キット添付の方法に従い、オリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。クローンＤＩ−２−１４（マウスＩｇＧ１）のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域（ＶＨ，ＶＬ）をコードする遺伝子は、上記合成後のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてクローニングした。この際、５’−プライマーはＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔに添付されているものを使用した。−方、３’−プライマーは、ＶＨ増幅用３’−プライマーとしてはマウス_Ｙ１定常領域に相補的な配列を有するものを使用し、ＶＬ増幅用３’−プライマーとしてはマウス_Ｋ定常領域に相補的な配列を有するものを使用した。
上記各プライマーを用いたＰＣＲは、以下の反応液組成及び反応条件で行った。
≪反応液組成≫
鋳型ｃＤＮＡ： １．５μＬ
１０×ＴｈｅｒｍａｌＡｃｅ ＰＣＲバッファー： ５μＬ
２ｍＭ ｄＮＴＰ： ５μＬ
ＴｈｅｒｍａｌＡｃｅ ポリメラーゼ： ０．５μＬ
Ｆプライマー（１０μＭ）： ３μＬ
Ｒプライマー（１０μＭ）： １．５μＬ
滅菌水： ３３．５μＬ
合計： ５０μＬ
≪反応条件≫
「熱変性・解離：９４℃（１０ｓｅｃ）→アニーリング：５５℃（１０ｓｅｃ）→合成・伸長：７２℃（６０ｓｅｃ）」を１サイクルとして、計３５サイクル。
合成したＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングして、塩基配列を決定した。複数のＶＨクローン及びＶＬクローンの塩基配列を解読し、マウスＨ鎖及びＬ鎖の可変領域に典型的な塩基配列を同定した。図２１及び図２２に、ＤＩ−２−１４のＶＨ及びＶＬのコンセンサスｃＤＮＡ塩基配列、ならびに推定アミノ酸配列を示した。
次に、ＶＨ及びＶＬのコード領域に、それぞれ対応するマウス生殖細胞系列ＪＨ及びＪ_Ｋ配列由来のスプライシング供与シグナルを付加し、さらに両端に動物細胞発現ベクターに挿入するために適切な制限酵素部位を付加した。このようにして作製された、エキソンとしての機能を持つＶＨ（図２３）及びＶＬ（図２４）遺伝子を、ヒト_Ｙ１鎖及び_Ｋ鎖の定常領域を含む動物細胞発現ベクター（図２５）に挿入し、マウス−ヒトキメラ抗体（ＤＩ−２−１４ ＩｇＧ１／_Ｋ）発現ベクター（ｐＣｈＤＩ−２−１４）を作製した。
４．ＣｈＤＩ−２−１４抗体タンパクの精製
樹立したＣｈＤＩ−２−１４の抗体産生安定ＮＳ０細胞株を、無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に順化した後、無血清培地で培養した培養液を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥヘルスケア）を用いて、常法に従い、抗体精製を行った。
図２６に、マウスＤＩ−２−１４抗体、及び精製したＣｈＤＩ−２−１４抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開後、ＣＢＢ染色した図を示した。還元条件下で、いずれも約５０ｋＤのＨ鎖と約２５ｋＤのＬ鎖が検出され、ＣｈＤＩ−２−１４抗体タンパクの産生が確認された。
５．キメラＤＩ−２−１４抗体（ＣｈＤＩ−２−１４）の抗原親和性
精製したＣｈＤＩ−２−１４タンパクの抗原親和性を、ＥＬＩＳＡを用いた方法で検討した。
ＥＬＩＳＡは、実施例１と同様に、精製リコンビナントｈＦＡ−１タンパク（０．５〜１μｇ／ｍＬ）を固相化したＥＬＩＳＡプレートを使用して行った。具体的には、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄バッファーで３回洗浄後、ブロッキング液により室温で１時間（または４℃で一晩）ブロッキングを行い、洗浄バッファーで２回洗浄後、ＥＬＩＳＡバッファーで希釈系列を作成したマウスＤＩ−２−１４抗体及びＣｈＤＩ−２−１４抗体を添加して反応させた（４℃，一晩）。洗浄バッファーで３回洗浄した後、ブロッキング液で希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（最終濃度１μｇ／ｍＬ）またはＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（最終濃度１μｇ／ｍＬ）（いずれもＧＥヘルスケアバイオサイエンス）と反応させた。その結果、マウスＤＩ−２−１４及びＣｈＤＩ−２−１４の反応曲線はほぼ重なり、ＥＣ５０はいずれも１０ｎｇ／ｍＬ以下であった（図２７）。
また、生細胞の細胞表面に発現しているＤｌｋ−１タンパクに対する結合活性をＨＥＫ２９３−ｈＤｌｋ細胞を用いたフローサイトメトリーで解析した結果、ＥＬＩＳＡの結果と同様に、ＣｈＤＩ−２−１４は、マウスＤＩ−２−１４と同等の抗原結合能を示した（図２８）。
以上の結果から、キメラＤＩ−２−１４抗体（ＣｈＤＩ−２−１４）は、マウスＤＩ−２−１４抗体とほぼ同等の抗原親和性を維持していることから、作製したキメラＤＩ−２−１４抗体は、マウスＤＩ−２−１４抗体が有するｉｎ ｖｉｖｏにおける強い抗腫瘍活性を保持するものであり、細胞表面にＤｌｋ−１を発現する癌に対して有効な治療用抗体、あるいは診断用又は検出用抗体となることが示された。
６．ヒト肝癌、乳がん及び白血病細胞株での細胞表面Ｄｌｋ−１の発現（ＦＡＣＳ）
Ｄｌｋ−１のヒト癌細胞での発現を更に詳細に調べるために、肝癌細胞株（７細胞株）、乳がん細胞株（１０細胞株）及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞株（７細胞株）について、抗ヒトＤｌｋ−１抗体を用いたフローサイトメトリーによる解析を行った。
使用した細胞株は、以下に列挙する通り、ヒューマンサイエンス振興事業団、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）より入手したものを使用した。
ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ）、ＮＢ−４（ＤＳＭＺ）、ＭＶ−４−１１（ＡＴＣＣ）、ＫＧ−１（ＡＴＣＣ）、ＫＧ−１ａ（ＡＴＣＣ）、ＴＦ−１（ＡＴＣＣ）、ＣＭＫ−１１−５（ヒューマンサイエンス振興事業団）、ＨｅｐＧ２（ヒューマンサイエンス振興事業団）、Ｃ３Ａ／ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ）、Ｈｕｈ−７（ヒューマンサイエンス振興事業団）、ＯＣＵＧ−１（ヒューマンサイエンス振興事業団）、ＨＬＥ（ヒューマンサイエンス振興事業団）、ＨＬＦ（ヒューマンサイエンス振興事業団）、ＳＫ−ＨＥＰ−１（ＡＴＣＣ）、ＨＣＣ１１４３（ＡＴＣＣ）、ＪＩＭＴ−１（ＤＳＭＺ）、ＺＲ−７５−１（ＡＴＣＣ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４１５（ＡＴＣＣ）、ＢＴ５４９（ＡＴＣＣ）、ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ）、ＤＵ４４７５（ＡＴＣＣ）、Ｔ４７Ｄ（ＡＴＣＣ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣ）
肝癌細胞株では、使用した７種類の細胞株全てにおいて、細胞表面Ｄｌｋ−１の発現が確認された（図２９）。乳がん細胞株では、使用した１０種類の細胞株のうち、ＨＣＣ１１４３細胞及びＪＩＭＴ−１細胞で強い発現が確認され（図３０）、その他の８種類の細胞株においても弱いながらも細胞表面Ｄｌｋ−１の発現が確認された（図３０）。ＡＭＬ細胞株では、７種類の細胞株のうち、ＣＭＫ−１１−５細胞、ＴＦ−１細胞、ＭＶ−４−１１細胞及びＮＢ−４細胞の４種類の細胞株で、細胞表面Ｄｌｋ−１の発現が確認された（図３１）。

ＤＩ−２−１４抗体（マウス抗ヒトＤｌｋ−１モノクローナル抗体、クローンＤＩ−２−１４）のｉｎ ｖｉｖｏにおける血管新生阻害効果
＜方法＞
（１）免疫組織染色
Ｈｕｈ−７−ｈｄｌｋ細胞の担癌マウスにおいて、マウスＩｇＧ投与群（コントロール群：２個体）、ＤＩ−２−１４投与群のマウス（４個体）から、それぞれ癌組織を摘出し、Ｏ．Ｃ．Ｔコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）で包埋後、新鮮凍結切片（７μｍ）を作製し、２．５％グルタルアルデヒド／ＰＢＳで１５分、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳで３分室温にて固定し、ＰＢＳで室温５分間の洗いを３回行った。次に、メタノールに終濃度０．３％となるように過酸化水素水を加えた溶液によって、室温で５分間処理し内因性のペルオキシダーゼ活性を除いた。次いで、ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳの順番で、それぞれ室温で５分間ずつ洗い、Ｍ．Ｏ．Ｍ．^ＴＭ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ）のプロトコールに従いＭ．Ｏ．Ｍ．^ＴＭ ｍｏｕｓｅ Ｉｇ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔで組織中の非特異的結合部位を塞ぐブロッキング操作を行い、ＰＢＳで室温２分間の洗いを２回行った。Ｍ．Ｏ．Ｍ．^ＴＭ Ｄｉｌｕｅｎｔで室温５分間反応させた。形成したＨｕｈ−７−ｈｄｌｋ細胞由来の腫瘍内の腫瘍血管は、マウスの血管内皮細胞に由来するため、次いで、Ｍ．Ｏ．Ｍ．^ＴＭ ｍｏｕｓｅ Ｉｇ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔでで希釈した抗マウスＦｌｋ−１／ＶＥＧＦ−Ｒ２抗体（終濃度２μｇ／ｍｌ）を室温で３０分反応させ、ＰＢＳで室温２分間の洗いを２回行い、続いて、Ｍ．Ｏ．Ｍ．^ＴＭ Ｄｉｌｕｅｎｔによって１００倍に希釈したビオチン化抗ラットＩｇＧ抗体を室温で１０分反応させた。ＰＢＳによる２分間の洗浄を２回行った後は、１１．免疫組織染色法に従って行った。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ
本実施例で言うＲＴ−ＰＣＲは、抽出ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成と、該ｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲとを別々に行った反応を意味する。
Ｈｕｈ−７−ｈｄｌｋ細胞の担癌マウスにおいて、マウスＩｇＧ投与群（コントロール群：７個体）、ＤＩ−２−１４投与群のマウス（７個体）から、それぞれ癌組織を摘出し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＲＮＡを抽出した。ついで１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｓｎｔｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）を用い、該ｋｉｔ添付のプロトコールに従い、１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。
合成した１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型として、マウスＩｇＧ投与群（コントロール群：７個体）、ＤＩ−２−１４投与群のマウス（７個体）の摘出癌組織について、腫瘍血管内皮細胞マーカーであるマウスＦｌｋ−１／ＶＥＧＦ−Ｒ２（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ７０８４２）の遺伝子発現を、ＰＣＲ法により解析した。
ＰＣＲプライマーは下記のものを使用した（ＰＣＲ増幅産物は３３６ｂｐ）。
上記プライマーを用いたＰＣＲは、以下の反応液組成及び反応条件で行った。
≪反応液組成≫
鋳型ＤＮＡ： １μＬ
１０×ＰＣＲバッファー： ５μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ： ４μＬ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ： ０．５μＬ
Ｆプライマー（２５１０μＭ）： １μＬ
Ｒプライマー（２５１０μＭ）： １μＬ
滅菌水： ３７．５μＬ
合計： ５０μＬ
≪反応条件≫
９５℃（３分間）の変性後に、「熱変性・解離：９５℃（６０ｓｅｃ）→アニーリング：５５℃（６０ｓｅｃ）→合成・伸長：７２℃（６０ｓｅｃ）」を１サイクルとして、計３０サイクルの反応と計３５サイクル。
なお、内部コントロールとしてはＧＡＰＤＨ（ヒトＧＡＰＤＨ：ＮＭ＿００２０４６；マウスＧＡＰＤＨ：ＮＭ＿００８０８４，ＮＭ＿００１００１３０３，ＸＭ＿００１００３３１４，ＸＭ＿９８８８５３，ＸＭ＿９９０２３８）を用いた。ＧＡＰＤＨを増幅するＰＣＲプライマーは下記のものを使用した（ＰＣＲ増幅産物は４５２ｂｐ）。これらのプライマーは、ヒトＧＡＰＤＨ及びマウスＧＡＰＤＨのいずれを鋳型とした場合も増幅可能なものである。
なお、ＰＣＲの反応液組成及び反応条件は、上述したＦｌｋ−１／ＶＥＧＦ−Ｒ２を増幅する場合と同様にした。
ＰＣＲ産物の定量は、まず、１．２％アガロースゲル電気泳動で展開した後、エチジウムブロマイドで染色した。次いで、撮影した電気泳動像をスキャナーで取り込み、ＮＩＨ ＩｍａｇｅでＰＣＲ産物の定量を行い、Ｆｌｋ−１／ＧＡＰＤＨのＲａｔｉｏでグラフを作成した。
＜結果＞
図３２に示す通り、ＩｇＧ投与群（２０ｍｇ／ｋｇ体重）（２個体）とＤＩ−２−１４投与群（２０ｍｇ／ｋｇ体重）（４個体）につき、それぞれ８〜１３視野（対物ｘ２００）について、ヘマトキシリンによる核染色で核が確認され、かつＦｌｋ−１／ＶＥＧＦ−Ｒ２陽性である腫瘍血管内皮細胞数をカウントし（ＩｇＧ投与群：全２５視野、ＤＩ−２−１４投与群：全３５視野）、１視野当たりの腫瘍血管細胞数を計測したところ、ＩｇＧ投与群では１１２．０±６３．６（Ｆｌｋ−１陽性細胞数／視野）であったのに対して、ＤＩ−２−１４投与群では３６．３±２．２（Ｆｌｋ−１陽性細胞数／視野）であり、有意に腫瘍血管細胞数が少なかったため（Ｐ＜０．０１）、ＤＩ−２−１４投与により腫瘍血管新生が阻害されていることが示された。
また、別の実験において、同じくＨｕｈ−７−ｈＤｌｋ−１細胞の担癌マウスで、ＩｇＧ投与群（２０ｍｇ／ｋｇ体重、Ｎ＝７）及びＤＩ−２−１４投与群（２０ｍｇ／ｋｇ体重、Ｎ＝７）のマウスから、それぞれ形成された腫瘍における腫瘍血管内皮細胞の特異的なマーカー遺伝子であるＦｌｋ−１／ＶＥＧＦ−Ｒ２の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲで半定量的に解析したところ、図３３に示す通り、ＤＩ−２−１４投与群の腫瘍ではＦｌｋ−１／ＶＥＧＦ−Ｒ２の遺伝子発現が低下しており、この結果はＤＩ−２−１４投与によって腫瘍血管新生が阻害されていることが示された。
＜考察＞
癌の形成において、腫瘍血管の新生は必須であることが知られており、腫瘍血管新生阻害を主な作用機所としている癌治療抗体として抗ＶＥＧＦ抗体（アバスチン）が知られている。これまでに、Ｄｌｋ−１及び抗Ｄｌｋ−１抗体に関して、血管新生や血管新生阻害活性について示された公知情報は無かった。またＤｌｋ−１の機能に関しては、これまでに、脂肪細胞の分化制御やＤｌｋ−１遺伝子の安定的導入によるグリオーマ細胞や白血病細胞での増殖亢進についての報告はあるが、先行公知情報に基づいて抗Ｄｌｋ−１抗体（ＤＩ−２−１４）が腫瘍血管新生阻害活性を有することは予見不可能であった。本実施例により、ＤＩ−２−１４抗体の、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性の少なくとも１つの作用機序が示された。

本発明によれば、抗腫瘍活性を有する抗ヒトＤｌｋ−１抗体、特にｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗腫瘍活性を有する抗ヒトＤｌｋ−１モノクローナル抗体を提供することができる。さらに本発明は、当該抗体を産生するハイブリドーマ、当該抗体と各種薬剤との複合体、腫瘍の診断用又は治療用医薬組成物、腫瘍の検出方法、腫瘍の検出用又は診断用を提供することができる。

配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２０：合成ＤＮＡ
配列番号２１：合成ＤＮＡ
配列番号２６：組換えＤＮＡ
配列番号２７：合成コンストラクト（組換えタンパク質）
配列番号２８：組換えＤＮＡ
配列番号２９：合成コンストラクト（組換えタンパク質）
［配列表］

Claims (25)

1. in vivoで抗腫瘍活性を有する、ヒトDlk-1に対する抗体又は該抗体に由来する抗体断片であって、
   該抗体は、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号３０〜３２で示されるアミノ酸配列であり、かつ、Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号３３〜３５で示されるアミノ酸配列である抗体であり、
   該抗体断片は、配列番号３０〜３２で示されるアミノ酸配列及び配列番号３３〜３５で示されるアミノ酸配列を含む抗体断片である、
   前記抗体又は抗体断片。
2. 抗腫瘍活性が腫瘍血管新生阻害活性である、請求項１記載の抗体又は抗体断片。
3. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項１又は２記載の抗体又は抗体断片。
4. 腫瘍が、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片。
5. 抗体が遺伝子組換え抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片。
6. 遺伝子組換え抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト抗体である、請求項５記載の抗体又は抗体断片。
7. キメラ抗体は、Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２３で示されるアミノ酸配列の第２０番目〜第１３７番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むものであり、Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２５で示されるアミノ酸配列の第２１番目〜第１３２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むものである、請求項６記載の抗体又は抗体断片。
8. 配列番号２に示されるヒトDlk-1のアミノ酸配列中の、第９２番目〜第１６７番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部と結合するものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片。
9. 受託番号がFERM BP-10707、FERM BP-10899若しくはFERM BP-10900であるハイブリドーマにより産生される、ヒトDlk-1に対するモノクローナル抗体又は該抗体に由来する抗体断片。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
11. 受託番号がFERM BP-10707、FERM BP-10899又はFERM BP-10900であり、ヒトDlk-1に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
12. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物とを含む、抗体−薬剤複合体又は抗体断片−薬剤複合体。
13. 抗腫瘍活性が腫瘍血管新生阻害活性である、請求項１２記載の複合体。
14. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片、及び請求項１２又は１３記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、医薬組成物。
15. 腫瘍の治療に用いるものである、請求項１４記載の組成物。
16. 腫瘍の治療が腫瘍血管新生を阻害することである、請求項１５記載の組成物。
17. 体重減少の副作用を有しないものである、請求項１５又は１６記載の組成物。
18. 腫瘍の診断に用いるものである、請求項１４記載の組成物。
19. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片、及び請求項１２又は１３記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍治療剤。
20. 体重減少の副作用を有しないものである、請求項１９記載の治療剤。
21. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片、及び請求項１２又は１３記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍血管新生阻害剤。
22. 体重減少の副作用を有しないものである、請求項２１記載の阻害剤。
23. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片、及び請求項１２又は１３記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍診断剤。
24. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片、及び請求項１２又は１３記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種と、生体から採取された試料とを反応させ、反応した抗体及び／又は抗体断片のシグナルを検出することを特徴とする、腫瘍の検出を補助する方法。
25. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片、及び請求項１２又は１３記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍の治療用、診断用又は検出用キット。