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CN119343152A - 抗体药物缀合物 - Google Patents

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CN119343152A
CN119343152A CN202380045025.0A CN202380045025A CN119343152A CN 119343152 A CN119343152 A CN 119343152A CN 202380045025 A CN202380045025 A CN 202380045025A CN 119343152 A CN119343152 A CN 119343152A
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CN
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陈卓亮
J·A·达莱西奥
G·J·霍林沃思
C·J·克林特
J-B·朗格卢瓦
E·麦克尼尔
C·A·蒙特
中岛胜正
K·马多琳
余冰
Q·张
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Novartis AG
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Abstract

本披露涉及抗体‑药物缀合物(ADC)，其包含通过双接头共价连接至两种药学活性药物的抗体或其抗原结合片段。还披露了包含该双接头和这些药学活性药物的接头‑药物缀合物。此类接头是递送连接至单一抗体的两(例如，两不同的或两相同的)药物的便利方式。此类接头可特别用于改善包含一种或多种疏水性药物化合物的抗体药物缀合物(ADC)的溶解性。

Description

抗体药物缀合物
技术领域
本披露涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其包含通过双接头共价连接至两种药学活性药物的抗体或其抗原结合片段。还披露了包含该双接头和这些药学活性药物的接头-药物缀合物。此类接头是递送连接至单一抗体的两(例如，两不同的或两相同的)药物的便利方式。此类接头可特别用于改善包含一种或多种疏水性药物化合物的抗体药物缀合物(ADC)的溶解性。
背景技术
抗体药物缀合物(ADC)设计的一个方面是化学接头的设计，其将药物部分连接至靶向部分。典型地，ADC使用疏水性药物部分，但是当此类药物部分与相对疏水性接头组合使用时，会出现溶解性问题，这会影响ADC的生物相容性和药物功效。
据报道，有接头策略试图克服这些挑战，特别是包含聚乙二醇的亲水性接头(参见R.P.Lyon,T.D.Bovee,S.O.Doronina,P.J.Burke,J.H.Hunter,H.D.Neff-LaFord,M.Jonas,M.E.Anderson,J.R.Setter,P.D.Senter,Nat.Biotechnol.[自然生物技术],2015,33,733-735和WO 2015057699)、包含磺酸根的接头(R.Y.Zhao,S.D.Wilhelm,C.Audette,G.Jones,B.A.Leece,A.C.Lazar,V.S.Goldmacher,R.Singh,Y.Kovtun,W.C.Widdison,J.M.Lambert,R.V.J.Chari,J.Med.Chem.[药物化学杂志],2011,54,3606-3623)和具有碳水化合物骨架的接头(F.S.Ekholm,H.A.Vilkman,V.J.Helin,J.Saarinen,T.Satomaa,ChemMedChem.[化学药物化学],2016,11(22):2501-2505)的设计。
仍然需要允许靶向递送药学活性药物，特别是具有改善的药代动力学和药效动力学性质的疏水性药物的抗体药物缀合物形式，特别是在需要经由双接头递送两种药学活性药物的情况下。
发明内容
本发明提供了化合物和缀合物，由此实现经由双接头递送两种药学活性药物，同时实现高水平的溶解性。如果需要，使用此类接头不仅允许通过单个单克隆抗体递送两种不同的药物分子，而且与本领域已知的抗体-药物缀合物相比，还允许递送与相同抗体附接的两倍数量的药物部分(其可以递送每个单克隆抗体2、4、6或8种药物，具体取决于所使用的特定缀合技术)。本文所述的化合物和缀合物允许递送每个单克隆抗体4、8、12或16个药物分子。
本文描述了本发明的各种实施例。
根据本发明的第一方面，在此提供了一种具有式(A-1)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥联间隔子；
W是支化部分；
L2'和L3'各自独立地是接头；并且
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物。
根据本发明的第二方面，在此提供了一种具有式(B-1)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是酶切割元件或亲水性部分(例如E1和E2各自是酶切割元件)；
V1和V2各自独立地是i)自脱落基团(self-immolative group)，或ii)酶切割元件(例如V1和V2各自独立地是自脱落基团)；并且
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物。
根据本发明的第三方面，在此提供了一种具有式(C-1)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是包含1至6个氨基酸的肽基团，其中所述肽基团任选地被亲水性基团取代；
A1和A2各自独立地是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A1或A2的*表示与D1或D2的附接点；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物；
L4和L5各自独立地是间隔子部分；
R2和R3各自独立地是亲水性基团或酶切割元件(例如R2和R3各自是亲水性基团)；并且
m和n各自独立地是0或1。
根据本发明的第四方面，在此提供了一种缀合物。在此方面的一个实施例中，缀合物包含通过双接头共价连接至两种药学活性药物的抗体或其抗原结合片段，并且其中双接头具有连接至抗体的一个附接点和连接至两种药学活性药物的两个附接点，条件是两种药学活性药物都不是BH3模拟物。
在此方面的另一个实施例中，在此提供了一种具有式(A-2)的缀合物：
其中：
Ab是抗体或其片段；
R100是偶联基团；
L1是桥联间隔子；
W是支化部分；
L2'和L3'各自独立地是接头；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物；并且
a是1至16的整数。
根据本发明的第五方面，在此提供了一种具有式(B-2)的缀合物：
其中：
Ab是抗体或其片段；
R100是偶联基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是酶切割元件或亲水性部分(例如E1和E2各自是酶切割元件)；
V1和V2各自独立地是i)自脱落基团，或ii)酶切割元件(例如V1和V2各自独立地是自脱落基团)；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物；并且
a是1至16的整数。
根据本发明的第六方面，在此提供了一种具有式(C-2)的缀合物：
其中：
Ab是抗体或其抗原结合片段；
R100是偶联基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是包含1至6个氨基酸的肽基团，其中所述肽基团任选地被亲水性基团取代；
a是1至16的整数；
A1和A2各自独立地是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A1或A2的*表示与D1或D2的附接点；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物；
L4和L5各自独立地是间隔子部分；
R2和R3各自独立地是亲水性基团或酶切割元件(例如R2和R3各自是亲水性基团)；并且
m和n各自独立地是0或1。
根据本发明的第七方面，在此提供了一种药物组合物，其包含本发明的第四、第五或第六方面的缀合物以及药学上可接受的载剂。
根据本发明的第八方面，在此提供了一种治疗患有或疑似患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的第四、第五或第六方面的缀合物或本发明的第七方面的药物组合物的药物组合物。
根据本发明的第九方面，在此提供了一种减少或抑制受试者中肿瘤的生长的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的第四、第五或第六方面的缀合物或本发明的第七方面的药物组合物的药物组合物。
根据本发明的第十方面，在此提供了一种减少或抑制受试者的血液癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的第四、第五或第六方面的缀合物或本发明的第七方面的药物组合物的药物组合物。
根据本发明的第十一方面，在此提供了一种减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的第四、第五或第六方面的缀合物或本发明的第七方面的药物组合物的药物组合物。
根据本发明的第十二方面，在此提供了本发明的第四、第五或第六方面的缀合物或本发明的第七方面的药物组合物在制备药物中的用途，该药物用于(i)治疗患有或疑似患有癌症的受试者，(ii)减少或抑制受试者中肿瘤的生长，(iii)减少或抑制受试者的血液癌症，或(iv)减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增。
根据本发明的第十三方面，在此提供了本发明的第四、第五或第六方面的抗体-药物缀合物或本发明的第七方面的药物组合物，其用于(i)治疗患有或疑似患有癌症的受试者，(ii)减少或抑制受试者中肿瘤的生长，(iii)减少或抑制受试者的血液癌症，或(iv)减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增。
附图说明
图1.曲妥珠单抗(Trastuzumab)-实例8和曲妥珠单抗-实例7针对代表性癌细胞系的剂量反应曲线。
图2.曲妥珠单抗-实例5针对代表性癌细胞系的剂量反应曲线。
图3.曲妥珠单抗-实例6针对代表性癌细胞系的剂量反应曲线。
具体实施方式
通过结合附图，参考以下详细描述可以更容易地理解所披露的组合物和方法，这些附图形成本披露的一部分。
在本文通篇，描述涉及组合物及使用这些组合物的方法。在本披露描述或声明与组合物相关的特征或实施例的情况下，这种特征或实施例同等适用于使用该组合物的方法。同样地，在本披露描述或声明与使用组合物的方法相关的特征或实施例的情况下，这种特征或实施例同等适用于该组合物。
当表达数值范围时，其包括使用该范围内的任何特定值的实施例。进一步地，对范围中陈述的值的提及包括该范围内的每个值。所有范围均包括其端点并且是可组合的。当值是通过使用先行词“约”表达为近似值时，应当理解，该特定值形成了另一个实施例。除非上下文另外明确地指示，否则对特定数值的提及至少包括该特定值。除非另外指示其具体使用情形，否则“或”的使用将意指“和/或”。出于任何目的，本文引用的所有参考文献均通过援引并入。在参考文献与说明书发生冲突的情况下，以说明书为准。
除非说明书的上下文另有指示，否则，例如，在不存在表示特定连接点的符号的情况下，当绘制结构或结构的片段时，其可以单独使用或附接至ADC的其他组分，并且其可以以任何取向附接，例如，其中抗体在任何合适的附接点附接至化学部分，诸如接头-药物。然而，在有指示的情况下，ADC的组分以给定式中所示的取向附接。例如，如果式(1)被描述为并且基团被描述为，则式(1)的详细结构是。其既不是，也不是。
应当理解，出于清楚的目的本文描述于单独实施例的上下文中的披露的组合物和方法的某些特征还可以按组合形式提供于单个实施例中。相反地，出于简洁的目的描述于单个实施例的上下文中的披露的组合物和方法的不同特征还可以分开地或以任何子组合形式提供。
如贯穿本申请所使用的，抗体药物缀合物可以使用“靶抗原/抗体-有效载荷-双接头-有效载荷”的通用形式的命名约定来鉴定。仅举例来说，如果抗体药物缀合物被称为“靶X-P1-L1-P2”，则此类缀合物将包含结合靶标X的抗体、被指定为L1的双接头以及分别被指定为P1和P2的两个有效载荷。替代性地，如果抗体药物缀合物被称为“抗靶X-P1-L1-P2”，则此类缀合物将包含结合靶标X的抗体、被指定为L1的双接头以及分别被指定为P1和P2的两个有效载荷。在另一个替代方案中，如果抗体药物缀合物被称为“AbX-P1-L1-P2”，则此类缀合物将包含被指定为AbX的抗体、被指定为L1的双接头以及分别被指定为P1和P2的两个有效载荷。包含非特异性同种型对照抗体的对照抗体药物缀合物可被称为“同种型对照IgG1-P1-L1-P2”或“IgG1-P1-L1-P2”。
本文给出的任何式还旨在表示化合物的未标记的形式以及同位素标记的形式。同位素标记的化合物具有由本文给出的式描绘的结构，除了一个或多个原子被具有所选原子质量或质量数的原子替代。可以掺入本发明的化合物中的同位素包括例如氢、碳、氮、氧、氟、碘和氯的同位素，诸如3H、11C、13C、14C、15N、18F和36Cl。因此，应理解，本披露包括掺入任何前述同位素(包括例如放射性同位素(诸如3H和14C))中一种或多种的化合物或其中存在非放射性同位素(诸如2H和13C)的那些。这样的同位素标记的化合物可用于代谢研究(用14C)、反应动力学研究(例如用2H或3H)、检测或成像技术(诸如正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)，包括药物或底物组织分布测定)，或用于患者的放射治疗。特别地，18F或标记的化合物对于PET或SPECT研究可能是特别期望的。同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术，例如使用适当的同位素标记的试剂代替先前采用的未标记的试剂来制备。
根据本发明的一个方面，在此披露了一种具有式(A-1)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥联间隔子；
W是支化部分；
L2'和L3'各自独立地是接头；并且
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物。
在实施例中，L2'和L3'中的每一者包含可切割基团，任选地至少一个可切割基团包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团、肽基团和/或自脱落基团(例如肽基团和自脱落基团)。
在实施例中，L2'和L3'中的每一者包含肽基团和自脱落基团。
在实施例中，L2'和L3'中的每一者包含可切割基团，任选地至少一个可切割基团包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团、糖(例如葡糖醛酰胺)基团、肽基团和/或自脱落基团(例如肽基团和自脱落基团)。
在实施例中，化合物是具有式(B-1)的化合物：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是包含1至6个氨基酸的肽基团，其中所述肽基团任选地被亲水性部分取代；
V1和V2独立地包含i)自脱落基团，ii)酶切割元件(例如V1和V2各自独立地是自脱落基团)或iiii)自脱落基团和酶切割元件；并且
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物；
或其药学上可接受的盐。在实施例中，化合物是具有式(B-1)的化合物：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是包含1至6个氨基酸的肽基团，其中所述肽基团任选地被亲水性部分取代；
V1和V2各自独立地是i)自脱落基团，或ii)酶切割元件(例如V1和V2各自独立地是自脱落基团)；并且
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物；
或其药学上可接受的盐。
在实施例中，W是N或CH。
在实施例中，E1和E2各自是酶切割元件。
在实施例中，V1和V2各自独立地是自脱落基团。
在实施例中，(i)可切割接头包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团和/或自脱落基团；(ii)可切割接头包含自脱落基团；(iii)可切割接头包含自脱落基团，该自脱落基团包括-O-CH2-、-NH-CH2-、-OC(＝O)-、对氨基苄基-氨基甲酸酯、对氨基苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(烷氧基-PEG-烷基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-氨基甲酸酯或对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-铵；或(iv)V1和/或V2各自独立地包含含有对氨基苄基-磷酸酯或对氨基苄基-焦磷酸酯的基团。
在实施例中，(i)可切割接头包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团和/或自脱落基团；(ii)可切割接头包含自脱落基团；或(iii)可切割接头包含自脱落基团，该自脱落基团包括-O-CH2-、-NH-CH2-、OC(＝O)-、对氨基苄基-氨基甲酸酯、对氨基苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(烷氧基-PEG-烷基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-氨基甲酸酯或对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-铵。
在实施例中，化合物是具有式(C-1)的化合物：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是包含1至6个氨基酸的肽基团，其中所述肽基团任选地被亲水性基团取代；
A1和A2各自独立地是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A1或A2的*表示与D1或D2的附接点；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物；
L4和L5各自独立地是间隔子部分；
R2和R3各自独立地是亲水性基团或酶切割元件(例如R2和R3各自是亲水性基团)；并且
m和n各自独立地是0或1；
或其药学上可接受的盐。
在实施例中，W是N或CH。
在实施例中，R2和R3各自是亲水性基团。
在实施例中，化合物是具有式(D1-1)、(D2-1)或(D3-1)的化合物：
或其药学上可接受的盐。
在实施例中，式(D1-1)，R2和R3各自独立地是亲水性基团，其中对于式(D2-1)，R2和R3各自独立地是酶切割元件；并且对于式(D3-1)，R2是亲水性基团并且R3是酶切割元件；或其药学上可接受的盐。
在实施例中，R1选自由以下组成的组：
-ONH2、-NH2、 -N3、-SH、-SR11、-SSR12、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHS(＝O)2(CH＝CH2)、-NR11C(＝O)CH2Br例如-NHC(＝O)CH2Br、-NR11C(＝O)CH2I例如-NHC(＝O)CH2I、-C(O)NHNH2、
其中：
每个R11独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R12是2-吡啶基或4-吡啶基；
每个R13独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl和-OH；
每个R14独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；并且
每个R15独立地选自H、C1-C6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-C4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-C4烷基。
在实施例中，R1选自由以下组成的组：
-ONH2、NHC(＝O)CH2Br和-NHC(＝O)CH2I。
在实施例中，R1是
在实施例中，(1)L1包含：
或*-CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)-**，
其中每个n是1至12的整数，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(2)L1是并且n是1至12的整数或n是1或n是12，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(3)L1是并且n是1至12的整数，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(4)L1包含其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；或者
(5)L1是桥联间隔子，其包含：
*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)O(CH2)mSSC(RL1)2(CH2)mC(＝O)NRL1(CH2)mNRL1C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(RL1)2-**或*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
X1是并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；并且
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；并且
每个RL1独立地选自H和C1-C6烷基。
在实施例中，L1包含由以下表示的部分：
其中n是1至12的整数(例如4至8，例如4或8)，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接附接点。
在实施例中，n是4至8的整数。
在实施例中，n是4或8。
在实施例中，L1由下式表示：
其中
n是1至12的整数(例如4至8，例如4或8)；
x是0至6的整数(例如0至4，例如0至2，例如0或2)；
y是0或1；
z是0至6的整数(例如0至4，例如0至2，例如0或2)；
u是0或1；并且
其中L1的*表示与W的直接附接点，并且L1的**表示与R1的直接附接点。
在实施例中，n是4至8的整数。
在实施例中，n是4或8。
在实施例中，x是0至2的整数。
在实施例中，x是0或2。
在实施例中，z是0至2的整数。
在实施例中，z是0或2。
在实施例中，L1选自由以下组成的组：
在实施例中，L2和L3各自独立地是连接间隔子，该连接间隔子包含由以下表示的部分：
其中
k是0至6的整数；
r是0或1；
o是0至12的整数；
p是0至6的整数；并且
其中L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接或间接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接或间接附接点。
在实施例中，L2和L3各自独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
以及
其中
k在每次出现时独立地是0至4的整数；
r在每次出现时独立地是0或1；
o在每次出现时独立地是0至10的整数；
p在每次出现时独立地是0至4的整数；
RL23是氢或C1-C6烷基；
RL是氢或-C(O)-RH；
RH是亲水性基团；并且
L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接附接点；
条件是当W是N时，L2和L3不是(L2c)、(L2d)、(L2f)或(L2k)。
在实施例中，L2和L3各自独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
以及
其中
k在每次出现时独立地是1至3的整数；
o在每次出现时独立地是1至9的整数；
p在每次出现时独立地是1至3的整数；
RL23是氢或C1-C3烷基；
RL是氢或-C(O)-RH；
RH是亲水性基团；并且
L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接附接点；条件是当W是N时，L2和L3不是(L2FF)、(L2MM)、(L2NN)、(L2OO)或(L2PP)。
在实施例中，L2和L3独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
其中L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，L2或L3的##表示与W的直接附接点；RL是氢或-C(O)-RH；并且
RH是并且d是20至30的整数(例如25)。
在实施例中，d是25。
在实施例中，每个肽基团独立地包含1至4、1至3或1至2个氨基酸残基。
在实施例中，每个肽基团独立地包含2个氨基酸残基。
在实施例中，每个氨基酸残基独立地选自甘氨酸(Gly)、L-缬氨酸(Val)、L-瓜氨酸(Cit)、L-半胱氨酸(磺基-Ala)、L-赖氨酸(Lys)、L-异亮氨酸(Ile)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-甲硫氨酸(Met)、L-天冬酰胺(Asn)、L-脯氨酸(Pro)、L-丙氨酸(Ala)、L-亮氨酸(Leu)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)和β-丙氨酸(β-Ala)。
在实施例中，每个肽基团独立地选自Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Leu-Cit、Cit-(β-Ala)、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly和磺基-Ala-Val-Ala。
在实施例中，E1和/或E2各自独立地是选自由以下组成的组的肽基团：
其中E1-1或E1-2的^表示与式(B)中的V1或V2的直接附接点或与式(C)和(D)中的-NH-基团的直接附接点；并且E1-1或E1-2的^^分别表示与L2或L3的直接附接点(例如，其中E1和E2各自是独立地选自(E1-1)和(E1-2)的肽基团)。
在实施例中，E1和E2各自是独立地选自(E1-1)和(E1-2)的肽基团。
在实施例中，E1和/或E2各自独立地是由以下表示的肽基团：
其中RE是亲水性基团RH。
在实施例中，(E1-3)中的亲水性基团RH是其中e是介于20与30之间的整数(例如25)。
在实施例中，e是25。
在实施例中，E1和E2各自是
在实施例中，A1和A2独立地选自键和-OC(＝O)-*，其中*表示分别与D1或D2的附接点。
在实施例中，A1和A2独立地选自键、和-OC(＝O)-*，其中*表示分别与D1或D2的附接点。
在实施例中，A1和A2各自是键。
在实施例中，A1和A2都是-OC(＝O)-*。
在实施例中，A1和A2中的一者是OC(＝O)-*，并且A1和A2中的另一者是键。
在实施例中，A1和A2独立地是键或其中*表示与D1或D2的附接点。
在实施例中，A1和A2中的一者是并且A1和A2中的另一者是键。
在实施例中，A1和A2都是
在实施例中，A1和A2中的一者是并且A1和A2中的另一者是OC(＝O)-*。
在实施例中，(i)A1和A2是-OC(＝O)-*；
(ii)A1和A2是
(iii)A1是-OC(＝O)-*并且A2是键
(iv)A1是-OC(＝O)-*并且A2是
(v)A1是键并且A2是或者
(vi)A1是键并且A2是-OC(＝O)-*，
其中*表示与D1或D2的附接点。
在实施例中，i)L4和L5各自独立地是间隔子部分，该间隔子部分具有结构
其中：
Z是-O-、-CH2-、-CH2O-、-CH2N(RL45)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NH-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)-、-C(＝O)NRL45-、-C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)NRL45-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中每个RL45独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基；并且
X是键、三唑基或-CH2-三唑基-，
其中X连接至R2或R3；或者
(ii)L4和L5独立地是间隔子部分，该间隔子部分具有结构
其中：
Z是-CH2-、-CH2O-、-CH2N(RL45)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NH-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)-、-C(＝O)NRb-、-C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)NRL45-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中每个RL45独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基；并且
X是-CH2-三唑基-C1-C4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-C4-C6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-、-CH2-三唑基-C1-C4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-、-C4-C6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-，其中每个n独立地是1、2或3，
其中X连接至R2或R3。
在实施例中，Z是-O-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-或-CH2O-；X是键、三唑基或-CH2-三唑基-；并且RL45在每次出现时独立地是H或C1-C3烷基。
在实施例中，L4和L5各自独立地是选自由以下组成的组的间隔子部分：
其中L4或L5的@表示与苯基的直接附接点，并且L4或L5的@@表示与R2或R3的直接附接点。
在实施例中，由R2和R3表示的亲水性基团各自独立地包括聚乙二醇、聚亚烷基二醇、多元醇、聚肌氨酸、糖、寡糖、多肽、被1至3个 取代的C2-C6烷基、或被1至2个独立地选自-OC(＝O)NHS(O)2NHCH2CH2OCH3、-NHC(＝O)C1-C4亚烷基-P(O)(OCH2CH3)2和-COOH基团的取代基取代的C2-C6烷基。
在实施例中，R2或/和R3各自独立地选自由以下组成的组：
其中n是介于1与6之间的整数；
在实施例中，R2或/和R3独立地包含：
(i)具有以下部分的聚肌氨酸：
其中
f是介于3与25之间的整数；并且
R23是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
(ii)具有下式的聚乙二醇：其中
g和h独立地是介于2与30之间的整数；或者
(iii)由表示的部分。
在实施例中，R2或/和R3各自独立地选自由 组成的组；其中
g和h独立地是介于20与30之间的整数(例如23或24)。
在实施例中，R2或/和R3包含：
在实施例中，由R2或R3表示的亲水性基团各自独立地包含：
(i)具有以下部分的聚肌氨酸：
其中f是介于3与25之间的整数；并且R23是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；或者(ii)具有下式的聚乙二醇：其中g和h独立地是介于2与30之间的整数。
在实施例中，R2和R3各自独立地包含具有下式的聚乙二醇：其中g和h独立地是介于2与30之间的整数。
在实施例中，D1和D2是相同的。
在实施例中，D1和D2是不同的。
在实施例中，D1和D2各自独立地选自细胞毒性药物、细胞生长抑制药物和免疫抑制药物。
在实施例中，D1和D2各自独立地选自澳瑞他汀(auristatin)、喜树碱、倍癌霉素、依托泊苷、美登素(maytansine)、类美登素(maytansinoid)、紫杉烷、苯二氮类或含苯二氮类药物(例如，吡咯并[1,4]-苯二氮类(PBD)、吲哚并苯二氮类和噁唑烷并苯二氮类)和长春花生物碱。
在实施例中，D1和D2各自独立地选自由以下组成的组：
(例如)、(例如)、(例如)和(例如)，
其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。应当理解，如果其他三价化合物(诸如)中带有*的N原子附接至接头，则将产生阳离子结构(本文分子的片段未示出阳离子)。
在实施例中，i)D1是并且D2是
ii)D1是并且D2是
iii)D1是并且D2是
iv)D1是并且D2是
v)D1是并且D2是
vi)D1是并且D2是
vii)D1是并且D2是
viii)D1是并且D2是
ix)D1是并且D2是
x)D1是并且D2是
xi)D1是并且D2是
xii)D1是并且D2是
xiii)D1是并且D2是
xiv)D1是并且D2是
xv)D1是并且D2是
xvi)D1是并且D2是
xvii)D1是并且D2是
xviii)D1是并且D2是
xix)D1是并且D2是
xx)D1是并且D2是
xxi)D1是并且D2是
xxii)D1是并且D2是
xxiii)D1是并且D2是
xxiv)D1是并且D2是
xxv)D1是并且D2是
xxvi)D1是并且D2是
xxvii)D1是并且D2是
xxviii)D1是并且D2是
xxix)D1是并且D2是
xxx)D1是并且D2是
xxxi)D1是并且D2是
xxxii)D1是并且D2是
xxxiii)D1是并且D2是
xxxiv)D1是并且D2是
xxxv)D1是并且D2是
xxxvi)D1是并且D2是
xxxvii)D1是并且D2是
xxxviii)D1是并且D2是
xxxix)D1是并且D2是
xl)D1是并且D2是
xli)D1是并且D2是
xlii)D1是并且D2是
xliii)D1是并且D2是
xliv)D1是并且D2是
vl)D1是并且D2是
xlvi)D1是并且D2是
xlvii)D1是并且D2是
xlviii)D1是并且D2是
il)D1是并且D2是
l)D1是并且D2是
li)D1是并且D2是
lii)D1是并且D2是
liii)D1是并且D2是
liv)D1是并且D2是
lv)D1是并且D2是
lvi)D1是并且D2是
lvii)D1是并且D2是
lviii)D1是并且D2是
lix)D1是并且D2是
lx)D1是并且D2是
lxi)D1是并且D2是
lxii)D1是并且D2是
lxiii)D1是并且D2是，或者
lxiv)D1是并且D2是
其中*表示与分子的其余部分的连接点。
在实施例中，A1-D1和A2-D2各自独立地选自由以下组成的组：
和其中*表示与分子的其余部分的连接点。
在实施例中：
i)A1-D1是并且A2-D2是
ii)A1-D1是并且A2-D2是
iii)A1-D1是并且A2-D2是
iv)A1-D1是并且A2-D2是
v)A1-D1是并且A2-D2是
vi)A1-D1是并且A2-D2是
vii)A1-D1是并且A2-D2是
viii)A1-D1是并且A2-D2是
ix)A1-D1是并且A2-D2是
x)A1-D1是并且A2-D2是
xi)A1-D1是并且A2-D2是
xii)A1-D1是并且A2-D2是
xiii)A1-D1是并且A2-D2是
xiv)A1-D1是并且A2-D2是
xv)A1-D1是并且A2-D2是
xvi)A1-D1是并且A2-D2是
xvii)A1-D1是并且A2-D2是
xviii)A1-D1是并且A2-D2是
xix)A1-D1是并且A2-D2是
xx)A1-D1是并且A2-D2是
xxi)A1-D1是并且A2-D2是
xxii)A1-D1是并且A2-D2是
xxiii)A1-D1是并且A2-D2是
xxiv)A1-D1是并且A2-D2是
xxv)A1-D1是并且A2-D2是
xxvi)A1-D1是并且A2-D2是
xxvii)A1-D1是并且A2-D2是
xxviii)A1-D1是并且A2-D2是
xxix)A1-D1是并且A2-D2是
xxx)A1-D1是并且A2-D2是
xxxi)A1-D1是并且A2-D2是
xxxii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxiii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxiv)A1-D1是并且A2-D2是
xxxv)A1-D1是并且A2-D2是
xxxvi)A1-D1是并且A2-D2是
xxxvii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxviii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxix)A1-D1是并且A2-D2是
xl)A1-D1是并且A2-D2是
xli)A1-D1是并且A2-D2是
xlii)A1-D1是并且A2-D2是
xliii)A1-D1是并且A2-D2是
xliv)A1-D1是并且A2-D2是
xlv)A1-D1是并且A2-D2是
xlvi)A1-D1是并且A2-D2是
xlvii)A1-D1是并且A2-D2是
xlviii)A1-D1是并且A2-D2是
xlix)A1-D1是并且A2-D2是
l)A1-D1是并且A2-D2是
li)A1-D1是并且A2-D2是
lii)A1-D1是并且A2-D2是
liii)A1-D1是并且A2-D2是
liv)A1-D1是并且A2-D2是
lv)A1-D1是并且A2-D2是
lvi)A1-D1是并且A2-D2是
lvii)A1-D1是并且A2-D2是
lviii)A1-D1是并且A2-D2是
lix)A1-D1是并且A2-D2是
lx)A1-D1是并且A2-D2是
lxi)A1-D1是并且A2-D2是
lxii)A1-D1是并且A2-D2是
lxiii)A1-D1是并且A2-D2是或者
lxiv)A1-D1是并且A2-D2是
其中*表示与分子的其余部分的连接点。
在实施例中，D1和/或D2是澳瑞他汀。
在实施例中，D1和D2都是澳瑞他汀。
在实施例中，D1和/或D2是拓扑异构酶1抑制剂。
在实施例中，D1和D2都是拓扑异构酶1抑制剂。
在实施例中，D1和D2中的一者是澳瑞他汀，并且D1和D2中的另一者是拓扑异构酶1抑制剂。
在实施例中，D1是澳瑞他汀并且D2是拓扑异构酶1抑制剂。
在实施例中，D1是拓扑异构酶1抑制剂并且D2是澳瑞他汀。
在实施例中，D1和D2独立地选自由以下组成的组：
其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。
在实施例中，D1和D2独立地选自由以下组成的组：
在实施例中，D1和D2独立地选自由以下组成的组：
在实施例中，D1和D2各自独立地选自
在实施例中，D1和D2各自独立地选自抗微管蛋白剂、微管蛋白抑制剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂和/或长春花生物碱。
在实施例中，D1和D2各自独立地选自Eg5抑制剂、V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、核输出蛋白CRM1抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DHFR抑制剂或促凋亡剂，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物。
在实施例中，化合物或其药学上可接受的盐选自由以下组成的组：
P1-L1-P1、P1-L1-P2、P1-L1-P3、P1-L1-P4、P1-L1-P5、P1-L1-P6、P1-L1-P7、P1-L1-P8、P1-L2-P1、P1-L2-P2、P1-L2-P3、P1-L2-P4、P1-L2-P5、P1-L2-P6、P1-L2-P7、P1-L2-P8、P1-L3-P1、P1-L3-P2、P1-L3-P3、P1-L3-P4、P1-L3-P5、P1-L3-P6、P1-L3-P7、P1-L3-P8、P1-L4-P1、P1-L4-P2、P1-L4-P3、P1-L4-P4、P1-L4-P5、P1-L4-P6、P1-L4-P7、P1-L4-P8、P1-L5-P1、P1-L5-P2、P1-L5-P3、P1-L5-P4、P1-L5-P5、P1-L5-P6、P1-L5-P7、P1-L5-P8、P1-L6-P1、P1-L6-P2、P1-L6-P3、P1-L6-P4、P1-L6-P5、P1-L6-P6、P1-L6-P7、P1-L6-P8、P1-L7-P1、P1-L7-P2、P1-L7-P3、P1-L7-P4、P1-L7-P5、P1-L7-P6、P1-L7-P7、P1-L7-P8、P1-L8-P1、P1-L8-P2、P1-L8-P3、P1-L8-P4、P1-L8-P5、P1-L8-P6、P1-L8-P7、P1-L8-P8、P1-L9-P1、P1-L9-P2、P1-L9-P3、P1-L9-P4、P1-L9-P5、P1-L9-P6、P1-L9-P7、P1-L9-P8、P1-L10-P1、P1-L10-P2、P1-L10-P3、P1-L10-P4、P1-L10-P5、P1-L10-P6、P1-L10-P7、P1-L10-P8、P1-L11-P1、P1-L11-P2、P1-L11-P3、P1-L11-P4、P1-L11-P5、P1-L11-P6、P1-L11-P7、P1-L11-P8、P1-L12-P1、P1-L12-P2、P1-L12-P3、P1-L12-P4、P1-L12-P5、P1-L12-P6、P1-L12-P7、P1-L12-P8、P1-L13-P1、P1-L13-P2、P1-L13-P3、P1-L13-P4、P1-L13-P5、P1-L13-P6、P1-L13-P7、P1-L13-P8、P1-L14-P1、P1-L14-P2、P1-L14-P3、P1-L14-P4、P1-L14-P5、P1-L14-P6、P1-L14-P7、P1-L14-P8、P1-L15-P1、P1-L15-P2、P1-L15-P3、P1-L15-P4、P1-L15-P5、P1-L15-P6、P1-L15-P7、P1-L15-P8、P1-L16-P1、P1-L16-P2、P1-L16-P3、P1-L16-P4、P1-L16-P5、P1-L16-P6、P1-L16-P7、P1-L16-P8、P1-L17-P1、P1-L17-P2、P1-L17-P3、P1-L17-P4、P1-L17-P5、P1-L17-P6、P1-L17-P7、P1-L17-P8、P1-L18-P1、P1-L18-P2、P1-L18-P3、P1-L18-P4、P1-L18-P5、P1-L18-P6、P1-L18-P7、P1-L18-P8、P1-L19-P1、P1-L19-P2、P1-L19-P3、P1-L19-P4、P1-L19-P5、P1-L19-P6、P1-L19-P7、P1-L19-P8、P1-L20-P1、P1-L20-P2、P1-L20-P3、P1-L20-P4、P1-L20-P5、P1-L20-P6、P1-L20-P7、P1-L20-P8、P1-L21-P1、P1-L21-P2、P1-L21-P3、P1-L21-P4、P1-L21-P5、P1-L21-P6、P1-L21-P7、P1-L21-P8、P1-L22-P1、P1-L22-P2、P1-L22-P3、P1-L22-P4、P1-L22-P5、P1-L22-P6、P1-L22-P7、P1-L22-P8、P1-L23-P1、P1-L23-P2、P1-L23-P3、P1-L23-P4、P1-L23-P5、P1-L23-P6、P1-L23-P7、P1-L23-P8、P1-L24-P1、P1-L24-P2、P1-L24-P3、P1-L24-P4、P1-L24-P5、P1-L24-P6、P1-L24-P7、P1-L24-P8、P1-L25-P1、P1-L25-P2、P1-L25-P3、P1-L25-P4、P1-L25-P5、P1-L25-P6、P1-L25-P7、P1-L25-P8、P1-L26-P1、P1-L26-P2、P1-L26-P3、P1-L26-P4、P1-L26-P5、P1-L26-P6、P1-L26-P7、P1-L26-P8、P1-L27-P1、P1-L27-P2、P1-L27-P3、P1-L27-P4、P1-L27-P5、P1-L27-P6、P1-L27-P7、P1-L27-P8、P1-L28-P1、P1-L28-P2、P1-L28-P3、P1-L28-P4、P1-L28-P5、P1-L28-P6、P1-L28-P7、P1-L28-P8、P1-L29-P1、P1-L29-P2、P1-L29-P3、P1-L29-P4、P1-L29-P5、P1-L29-P6、P1-L29-P7、P1-L29-P8、P1-L30-P1、P1-L30-P2、P1-L30-P3、P1-L30-P4、P1-L30-P5、P1-L30-P6、P1-L30-P7、P1-L30-P8、P1-L31-P1、P1-L31-P2、P1-L31-P3、P1-L31-P4、P1-L31-P5、P1-L31-P6、P1-L31-P7、P1-L31-P8、P1-L32-P1、P1-L32-P2、P1-L32-P3、P1-L32-P4、P1-L32-P5、P1-L32-P6、P1-L32-P7、P1-L32-P8、P1-L33-P1、P1-L33-P2、P1-L33-P3、P1-L33-P4、P1-L33-P5、P1-L33-P6、P1-L33-P7、P1-L33-P8、P1-L34-P1、P1-L34-P2、P1-L34-P3、P1-L34-P4、P1-L34-P5、P1-L34-P6、P1-L34-P7、P1-L34-P8、P1-L35-P1、P1-L35-P2、P1-L35-P3、P1-L35-P4、P1-L35-P5、P1-L35-P6、P1-L35-P7、P1-L35-P8、P1-L36-P1、P1-L36-P2、P1-L36-P3、P1-L36-P4、P1-L36-P5、P1-L36-P6、P1-L36-P7、P1-L36-P8、P2-L1-P1、P2-L1-P2、P2-L1-P3、P2-L1-P4、P2-L1-P5、P2-L1-P6、P2-L1-P7、P2-L1-P8、P2-L2-P1、P2-L2-P2、P2-L2-P3、P2-L2-P4、P2-L2-P5、P2-L2-P6、P2-L2-P7、P2-L2-P8、P2-L3-P1、P2-L3-P2、P2-L3-P3、P2-L3-P4、P2-L3-P5、P2-L3-P6、P2-L3-P7、P2-L3-P8、P2-L4-P1、P2-L4-P2、P2-L4-P3、P2-L4-P4、P2-L4-P5、P2-L4-P6、P2-L4-P7、P2-L4-P8、P2-L5-P1、P2-L5-P2、P2-L5-P3、P2-L5-P4、P2-L5-P5、P2-L5-P6、P2-L5-P7、P2-L5-P8、P2-L6-P1、P2-L6-P2、P2-L6-P3、P2-L6-P4、P2-L6-P5、P2-L6-P6、P2-L6-P7、P2-L6-P8、P2-L7-P1、P2-L7-P2、P2-L7-P3、P2-L7-P4、P2-L7-P5、P2-L7-P6、P2-L7-P7、P2-L7-P8、P2-L8-P1、P2-L8-P2、P2-L8-P3、P2-L8-P4、P2-L8-P5、P2-L8-P6、P2-L8-P7、P2-L8-P8、P2-L9-P1、P2-L9-P2、P2-L9-P3、P2-L9-P4、P2-L9-P5、P2-L9-P6、P2-L9-P7、P2-L9-P8、P2-L10-P1、P2-L10-P2、P2-L10-P3、P2-L10-P4、P2-L10-P5、P2-L10-P6、P2-L10-P7、P2-L10-P8、P2-L11-P1、P2-L11-P2、P2-L11-P3、P2-L11-P4、P2-L11-P5、P2-L11-P6、P2-L11-P7、P2-L11-P8、P2-L12-P1、P2-L12-P2、P2-L12-P3、P2-L12-P4、P2-L12-P5、P2-L12-P6、P2-L12-P7、P2-L12-P8、P2-L13-P1、P2-L13-P2、P2-L13-P3、P2-L13-P4、P2-L13-P5、P2-L13-P6、P2-L13-P7、P2-L13-P8、P2-L14-P1、P2-L14-P2、P2-L14-P3、P2-L14-P4、P2-L14-P5、P2-L14-P6、P2-L14-P7、P2-L14-P8、P2-L15-P1、P2-L15-P2、P2-L15-P3、P2-L15-P4、P2-L15-P5、P2-L15-P6、P2-L15-P7、P2-L15-P8、P2-L16-P1、P2-L16-P2、P2-L16-P3、P2-L16-P4、P2-L16-P5、P2-L16-P6、P2-L16-P7、P2-L16-P8、P2-L17-P1、P2-L17-P2、P2-L17-P3、P2-L17-P4、P2-L17-P5、P2-L17-P6、P2-L17-P7、P2-L17-P8、P2-L18-P1、P2-L18-P2、P2-L18-P3、P2-L18-P4、P2-L18-P5、P2-L18-P6、P2-L18-P7、P2-L18-P8、P2-L19-P1、P2-L19-P2、P2-L19-P3、P2-L19-P4、P2-L19-P5、P2-L19-P6、P2-L19-P7、P2-L19-P8、P2-L20-P1、P2-L20-P2、P2-L20-P3、P2-L20-P4、P2-L20-P5、P2-L20-P6、P2-L20-P7、P2-L20-P8、P2-L21-P1、P2-L21-P2、P2-L21-P3、P2-L21-P4、P2-L21-P5、P2-L21-P6、P2-L21-P7、P2-L21-P8、P2-L22-P1、P2-L22-P2、P2-L22-P3、P2-L22-P4、P2-L22-P5、P2-L22-P6、P2-L22-P7、P2-L22-P8、P2-L23-P1、P2-L23-P2、P2-L23-P3、P2-L23-P4、P2-L23-P5、P2-L23-P6、P2-L23-P7、P2-L23-P8、P2-L24-P1、P2-L24-P2、P2-L24-P3、P2-L24-P4、P2-L24-P5、P2-L24-P6、P2-L24-P7、P2-L24-P8、P2-L25-P1、P2-L25-P2、P2-L25-P3、P2-L25-P4、P2-L25-P5、P2-L25-P6、P2-L25-P7、P2-L25-P8、P2-L26-P1、P2-L26-P2、P2-L26-P3、P2-L26-P4、P2-L26-P5、P2-L26-P6、P2-L26-P7、P2-L26-P8、P2-L27-P1、P2-L27-P2、P2-L27-P3、P2-L27-P4、P2-L27-P5、P2-L27-P6、P2-L27-P7、P2-L27-P8、P2-L28-P1、P2-L28-P2、P2-L28-P3、P2-L28-P4、P2-L28-P5、P2-L28-P6、P2-L28-P7、P2-L28-P8、P2-L29-P1、P2-L29-P2、P2-L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根据本发明的一个方面，提供了一种缀合物，其包含通过双接头共价连接至两种药学活性药物的抗体或其抗原结合片段，并且其中双接头具有连接至抗体的一个附接点和连接至两种药学活性药物的两个附接点，条件是两种药学活性药物都不是BH3模拟物。在一个实施例中，两种药学活性药物是相同或不同的。在另一个实施例中，药学活性药物选自细胞毒性药物、细胞生长抑制药物和免疫抑制药物。在又一个实施例中，药学活性药物选自澳瑞他汀、喜树碱、倍癌霉素、依托泊苷、美登素、类美登素、紫杉烷、苯二氮类或含苯二氮类药物(例如，吡咯并[1,4]-苯二氮类(PBD)、吲哚并苯二氮类和噁唑烷并苯二氮类)和长春花生物碱。在实施例中，药学活性药物是澳瑞他汀。在实施例中，药学活性药物选自抗微管蛋白剂、微管蛋白抑制剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂和/或长春花生物碱。在另一个实施例中，药学活性药物选自Eg5抑制剂、V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、核输出蛋白CRM1抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DHFR抑制剂或促凋亡剂。在另外的实施例中，药学活性药物选自拓扑异构酶1抑制剂或其对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘代衍生物和/或与药学上可接受的酸或碱的加成盐。在实施例中，药学活性药物是其中拓扑异构酶1抑制剂选自拓扑替康、依喜替康、德鲁替康和SN-38。在又一个实施例中，药学活性药物选自抗有丝分裂药物或其对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘代衍生物和/或与药学上可接受的酸或碱的加成盐。在另外的实施例中，抗有丝分裂药物是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或紫杉烷。在实施例中，紫杉烷选自多西他赛、紫杉醇或卡巴他赛。在另一个实施例中，缀合物包含本文披露的任何化合物或其药学上可接受的盐。
如上所述，根据本发明的一个方面，提供了一种具有式(A-2)的缀合物：
其中：
Ab是抗体或其片段；
R100是偶联基团；
L1是桥联间隔子；
W是支化部分；
L2'和L3'各自独立地是接头；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物；并且
a是1至16的整数。
在实施例中，L2'和L3'中的每一者包含可切割基团，任选地至少一个可切割基团包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团和/或自脱落基团(例如肽基团和自脱落基团)。
在实施例中，L2'和L3'中的每一者包含肽基团和自脱落基团。
在实施例中，L2'和L3'中的每一者包含可切割基团，任选地至少一个可切割基团包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团、糖(例如葡糖醛酰胺)基团、肽基团和/或自脱落基团(例如肽基团和自脱落基团)。
在实施例中，缀合物具有式(B-2)：
其中：
Ab是抗体或其片段；
R100是偶联基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是酶切割元件或亲水性部分(例如E1和E2各自是酶切割元件)；
V1和V2独立地包含i)自脱落基团，ii)酶切割元件(例如V1和V2各自独立地是自脱落基团)或iii)自脱落基团和酶切割元件；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，条件是D1和D2都不是BH3模拟物；并且
A是1至16的整数。
在实施例中，缀合物具有式(B-2)：
其中：
Ab是抗体或其片段；
R100是偶联基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是包含1至6个氨基酸的肽基团，其中所述肽基团任选地被亲水性部分取代；
V1和V2各自独立地是i)自脱落基团，或ii)酶切割元件(例如V1和V2各自独立地是自脱落基团)；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物；并且
a是1至16的整数。
在实施例中，W是N或CH。
在实施例中，E1和E2各自是酶切割元件。
在实施例中，V1和V2各自独立地是自脱落基团
在实施例中，a是1至8、或1至6、或1至4的整数，或者a是1或2。
在实施例中，a通过液相色谱-质谱法(LC-MS)确定。
在实施例中，(i)可切割接头包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团和/或自脱落基团；(ii)可切割接头包含自脱落基团；或(iii)可切割接头包含自脱落基团，该自脱落基团包括-CH2-O-、-NH-CH2-、-C(＝O)-、对氨基苄基-氨基甲酸酯、对氨基苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(烷氧基-PEG-烷基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-氨基甲酸酯或对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-铵。
在实施例中，W是N或CH。
在实施例中，R2和R3各自是亲水性基团。
在实施例中，缀合物具有式(C-2)：
其中：
Ab是抗体或其抗原结合片段；
R100是偶联基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是包含1至6个氨基酸的肽基团，其中所述肽基团任选地被亲水性基团取代；
A1和A2各自独立地是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A1或A2的*表示与D1或D2的附接点；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物；
L4和L5各自独立地是间隔子部分；
R2和R3各自独立地是亲水性基团或酶切割元件(例如R2和R3各自是亲水性基团)；并且
m和n各自独立地是0或1。
在实施例中，缀合物具有式(D1-2)、(D2-2)或(D3-2)：
在实施例中，缀合物具有式(D1-2)，R2和R3各自独立地是亲水性基团，其中对于式(D2-2)，R2和R3各自独立地是酶切割元件；并且对于式(D3-2)，R2是亲水性基团并且R3是酶切割元件。
在实施例中，R100选自由以下组成的组：
酰胺；
以及
二硫键，
其中：
R16是H、C1-C4烷基、苯基、嘧啶或吡啶；
R18是H、C1-C6烷基、苯基或被1至3个-OH基团取代的C1-C4烷基；
每个R15独立地选自H、C1-C6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-C4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-C4烷基；
R17独立地选自H、苯基和吡啶；
q是0、1、2或3；
R19是H或甲基；并且
R20是H、-CH3或苯基。
在实施例中，R100选自由 组成的组，其中R100的***表示与Ab的附接点。
在实施例中，R100是其中R100的***表示与Ab的附接点。
在实施例中，(1)L1包含：
或*-CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)-**，
其中每个n是1至12的整数，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(2)L1是并且n是1至12的整数或n是1或n是12，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(3)L1是并且n是1至12的整数，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(4)L1包含其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；或者
(5)L1是桥联间隔子，其包含：
*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)O(CH2)mSSC(RL1)2(CH2)mC(＝O)NRL1(CH2)mNRL1C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n NHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(RL1)2-**或*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
X1是并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；并且
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；并且
每个RL1独立地选自H和C1-C6烷基。
在实施例中，L1包含由以下表示的部分：
其中n是1至12的整数(例如4至8，例如4或8)，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接附接点。
在实施例中，n是4至8的整数。
在实施例中，n是4或8。
在实施例中，L1由下式表示：
其中
n是1至12的整数(例如4至8，例如4或8)；
x是0至6的整数(例如0至4，例如0至2，例如0或2)；
y是0或1；
z是0至6的整数(例如0至4，例如0至2，例如0或2)；
u是0或1；并且
其中L1的*表示与W的直接附接点，并且L1的**表示与R1的直接附接点。
在实施例中，n是4至8的整数。
在实施例中，n是4或8。
在实施例中，x是0至2的整数。
在实施例中，x是0或2。
在实施例中，z是0至2的整数。
在实施例中，z是0或2。
在实施例中，L1选自由以下组成的组：
在实施例中，L2和L3各自独立地是连接间隔子，该连接间隔子包含由以下表示的部分：
其中
k是0至6的整数；
r是0或1；
o是0至12的整数；
p是0至6的整数；并且
其中L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接或间接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接或间接附接点。
在实施例中，L2和L3各自独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
以及
其中
k在每次出现时独立地是0至4的整数；
r在每次出现时独立地是0或1；
o在每次出现时独立地是0至10的整数；
p在每次出现时独立地是0至4的整数；
RL23是氢或C1-C6烷基；
RL是氢或-C(O)-RH；
RH是亲水性基团；并且
L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接附接点；
条件是当W是N时，L2和L3不是(L2c)、(L2d)、(L2f)或(L2k)。
在实施例中，L2和L3各自独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
以及
其中
k在每次出现时独立地是1至3的整数；
o在每次出现时独立地是1至9的整数；
p在每次出现时独立地是1至3的整数；
RL23是氢或C1-C3烷基；
RL是氢或-C(O)-RH；
RH是亲水性基团；并且
L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接附接点；条件是当W是N时，L2和L3不是(L2FF)、(L2MM)、(L2NN)、(L2OO)或(L2PP)。
在实施例中，L2和L3独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
其中L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，L2或L3的##表示与W的直接附接点；RL是氢或-C(O)-RH；并且
RH是并且d是20至30的整数(例如25)。
在实施例中，d是25。
在实施例中，每个肽基团独立地包含1至4、1至3或1至2个氨基酸残基。
在实施例中，每个肽基团独立地包含2个氨基酸残基。
在实施例中，每个氨基酸残基独立地选自甘氨酸(Gly)、L-缬氨酸(Val)、L-瓜氨酸(Cit)、L-半胱氨酸(磺基-Ala)、L-赖氨酸(Lys)、L-异亮氨酸(Ile)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-甲硫氨酸(Met)、L-天冬酰胺(Asn)、L-脯氨酸(Pro)、L-丙氨酸(Ala)、L-亮氨酸(Leu)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)和β-丙氨酸(β-Ala)。
在实施例中，每个肽基团独立地选自Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Leu-Cit、Cit-(β-Ala)、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly和磺基-Ala-Val-Ala。
在实施例中，E1和/或E2各自独立地是选自由以下组成的组的肽基团：
其中E1-1或E1-2的^表示与式(B)中的V1或V2的直接附接点或与式(C)和(D)中的-NH-基团的直接附接点；并且E1-1或E1-2的^^分别表示与L2或L3的直接附接点(例如，其中E1和E2各自是独立地选自(E1-1)和(E1-2)的肽基团)。
在实施例中，E1和E2各自是独立地选自(E1-1)和(E1-2)的肽基团。
在实施例中，E1和/或E2各自独立地是由以下表示的肽基团：
其中RE是亲水性基团RH。
在实施例中，(E1-3)中的亲水性基团RH是其中e是介于20与30之间的整数(例如25)。
在实施例中，e是25。
在实施例中，E1和E2各自是
在实施例中，A1和A2独立地选自键和-OC(＝O)-*，其中*表示分别与D1或D2的附接点。
在实施例中，A1和A2独立地选自键、和-OC(＝O)-*，其中*表示分别与D1或D2的附接点。
在实施例中，A1和A2是键。
在实施例中，A1和A2独立地是键或其中*表示分别与D1或D2的附接点。
在实施例中，A1和A2中的一者是并且A1和A2中的另一者是键。
在实施例中，A1和A2都是
在实施例中，A1和A2中的一者是并且A1和A2中的另一者是OC(＝O)-*。
在实施例中，(i)A1和A2是-OC(＝O)-*；
(ii)A1和A2是
(iii)A1是-OC(＝O)-*并且A2是键；
(iv)A1是-OC(＝O)-*并且A2是
(v)A1是键并且A2是或者
(vi)A1是键并且A2是-OC(＝O)-*，
其中*表示与D1或D2的附接点。
在实施例中，i)L4和L5各自独立地是间隔子部分，该间隔子部分具有结构
其中：
Z是-O-、-CH2-、-CH2O-、-CH2N(RL45)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NH-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)-、-C(＝O)NR L45-、-C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-、-CH2NR L45C(＝O)NRL45-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中每个RL45独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基；并且
X是键、三唑基或-CH2-三唑基-，
其中X连接至R2或R3；或者
(ii)L4和L5独立地是间隔子部分，该间隔子部分具有结构
其中：
Z是-CH2-、-CH2O-、-CH2N(RL45)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NH-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)-、-C(＝O)NRb-、-C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)NRL45-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中每个RL45独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基；并且
X是-CH2-三唑基-C1-C4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-C4-C6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-、-CH2-三唑基-C1-C4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-、-C4-C6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-，其中每个n独立地是1、2或3，
其中X连接至R2或R3。
在实施例中，Z是-O-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-或-CH2O-；X是键、三唑基或-CH2-三唑基-；并且RL45在每次出现时独立地是H或C1-C3烷基。
在实施例中，L4和L5各自独立地是选自由以下组成的组的间隔子部分：
其中L4或L5的@表示与苯基的直接附接点，并且L4或L5的@@表示与R2或R3的直接附接点。
在实施例中，由R2和R3表示的亲水性基团各自独立地包括聚乙二醇、聚亚烷基二醇、多元醇、聚肌氨酸、糖、寡糖、多肽、被1至3个 取代的C2-C6烷基、或被1至2个独立地选自-OC(＝O)NHS(O)2NHCH2CH2OCH3、-NHC(＝O)C1-C4亚烷基-P(O)(OCH2CH3)2和-COOH基团的取代基取代的C2-C6烷基。
在实施例中，R2或/和R3各自独立地选自由以下组成的组：
其中n是介于1与6之间的整数；
在实施例中，R2或/和R3各自独立地包含：
(i)具有以下部分的聚肌氨酸：
其中
f是介于3与25之间的整数；并且
R23是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
(ii)具有下式的聚乙二醇：其中
g和h独立地是介于2与30之间的整数；或者
(iii)由表示的部分。
在实施例中，由R2或R3表示的亲水性基团各自独立地包含：
(i)具有以下部分的聚肌氨酸：
其中f是介于3与25之间的整数；并且R23是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；或者(ii)具有下式的聚乙二醇：其中g和h独立地是介于2与30之间的整数。
在实施例中，R2和R3各自独立地选自由 组成的组；其中
g和h独立地是介于20与30之间的整数(例如23或24)。
在实施例中，R2或/和R3包含：
在实施例中，R2和R3各自独立地包含具有下式的聚乙二醇：其中g和h独立地是介于2与30之间的整数。
在实施例中，D1和D2是相同的。
在实施例中，D1和D2是不同的。
在实施例中，D1和D2各自独立地选自细胞毒性药物、细胞生长抑制药物和免疫抑制药物。
在实施例中，D1和D2各自独立地选自澳瑞他汀、喜树碱、倍癌霉素、依托泊苷、美登素、类美登素、紫杉烷、苯二氮类或含苯二氮类药物(例如，吡咯并[1,4]-苯二氮类(PBD)、吲哚并苯二氮类和噁唑烷并苯二氮类)和长春花生物碱。
在实施例中，D1和D2各自独立地选自由以下组成的组：
(例如)、(例如)、(例如)和(例如)，
其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。
在实施例中，
i)D1是并且D2是
ii)D1是并且D2是
iii)D1是并且D2是
iv)D1是并且D2是
v)D1是并且D2是
vi)D1是并且D2是
vii)D1是并且D2是
viii)D1是并且D2是
ix)D1是并且D2是
x)D1是并且D2是
xi)D1是并且D2是
xii)D1是并且D2是
xiii)D1是并且D2是
xiv)D1是并且D2是
xv)D1是并且D2是
xvi)D1是并且D2是
xvii)D1是并且D2是
xviii)D1是并且D2是
xix)D1是并且D2是
xx)D1是并且D2是
xxi)D1是并且D2是
xxii)D1是并且D2是
xxiii)D1是并且D2是
xxiv)D1是并且D2是
xxv)D1是并且D2是
xxvi)D1是并且D2是
xxvii)D1是并且D2是
xxviii)D1是并且D2是
xxix)D1是并且D2是
xxx)D1是并且D2是
xxxi)D1是并且D2是
xxxii)D1是并且D2是
xxxiii)D1是并且D2是
xxxiv)D1是并且D2是
xxxv)D1是并且D2是
xxxvi)D1是并且D2是
xxxvii)D1是并且D2是
xxxviii)D1是并且D2是
xxxix)D1是并且D2是
xl)D1是并且D2是
xli)D1是并且D2是
xlii)D1是并且D2是
xliii)D1是并且D2是
xliv)D1是并且D2是
vl)D1是并且D2是
xlvi)D1是并且D2是
xlvii)D1是并且D2是
xlviii)D1是并且D2是
il)D1是并且D2是
l)D1是并且D2是
li)D1是并且D2是
lii)D1是并且D2是
liii)D1是并且D2是
liv)D1是并且D2是
lv)D1是并且D2是lvi)D1是并且D2是
lvii)D1是并且D2是
lviii)D1是并且D2是
lix)D1是并且D2是
lx)D1是并且D2是
lxi)D1是并且D2是
lxii)D1是并且D2是
lxiii)D1是并且D2是，或者
lxiv)D1是并且D2是
在实施例中：
i)A1-D1是并且A2-D2是
ii)A1-D1是并且A2-D2是
iii)A1-D1是并且A2-D2是
iv)A1-D1是并且A2-D2是
v)A1-D1是并且A2-D2是
vi)A1-D1是并且A2-D2是
vii)A1-D1是并且A2-D2是
viii)A1-D1是并且A2-D2是
ix)A1-D1是并且A2-D2是
x)A1-D1是并且A2-D2是
xi)A1-D1是并且A2-D2是
xii)A1-D1是并且A2-D2是
xiii)A1-D1是并且A2-D2是
xiv)A1-D1是并且A2-D2是
xv)A1-D1是并且A2-D2是
xvi)A1-D1是并且A2-D2是
xvii)A1-D1是并且A2-D2是
xviii)A1-D1是并且A2-D2是
xix)A1-D1是并且A2-D2是
xx)A1-D1是并且A2-D2是
xxi)A1-D1是并且A2-D2是
xxii)A1-D1是并且A2-D2是
xxiii)A1-D1是并且A2-D2是
xxiv)A1-D1是并且A2-D2是
xxv)A1-D1是并且A2-D2是
xxvi)A1-D1是并且A2-D2是
xxvii)A1-D1是并且A2-D2是
xxviii)A1-D1是并且A2-D2是
xxix)A1-D1是并且A2-D2是
xxx)A1-D1是并且A2-D2是
xxxi)A1-D1是并且A2-D2是
xxxii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxiii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxiv)A1-D1是并且A2-D2是
xxxv)A1-D1是并且A2-D2是
xxxvi)A1-D1是并且A2-D2是
xxxvii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxviii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxix)A1-D1是并且A2-D2是
xl)A1-D1是并且A2-D2是xli)A1-D1是并且A2-D2是
xlii)A1-D1是并且A2-D2是
xliii)A1-D1是并且A2-D2是
xliv)A1-D1是并且A2-D2是
xlv)A1-D1是并且A2-D2是
xlvi)A1-D1是并且A2-D2是
xlvii)A1-D1是并且A2-D2是
xlviii)A1-D1是并且A2-D2是
xlix)A1-D1是并且A2-D2是
l)A1-D1是并且A2-D2是
li)A1-D1是并且A2-D2是
lii)A1-D1是并且A2-D2是
liii)A1-D1是并且A2-D2是
liv)A1-D1是并且A2-D2是
lv)A1-D1是并且A2-D2是
lvi)A1-D1是并且A2-D2是
lvii)A1-D1是并且A2-D2是
lviii)A1-D1是并且A2-D2是
lix)A1-D1是并且A2-D2是
lx)A1-D1是并且A2-D2是
lxi)A1-D1是并且A2-D2是
lxii)A1-D1是并且A2-D2是
lxiii)A1-D1是并且A2-D2是或者
lxiv)A1-D1是并且A2-D2是
其中*表示与分子的其余部分的连接点。
在实施例中，D1和/或D2是澳瑞他汀。
在实施例中，D1和D2都是澳瑞他汀。
在实施例中，D1和/或D2是拓扑异构酶1抑制剂。
在实施例中，D1和D2都是拓扑异构酶1抑制剂。
在实施例中，D1和D2中的一者是澳瑞他汀，并且D1和D2中的另一者是拓扑异构酶1抑制剂。
在实施例中，D1是澳瑞他汀并且D2是拓扑异构酶1抑制剂。
在实施例中，D1是拓扑异构酶1抑制剂并且D2是澳瑞他汀。
在实施例中，D1和D2独立地选自由以下组成的组：
其中*表示与A1或A2的附接点。
在实施例中，D1和D2独立地选自由以下组成的组：
在实施例中，D1和D2各自独立地选自抗微管蛋白剂、微管蛋白抑制剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂和/或长春花生物碱。
在实施例中，D1和D2各自独立地选自Eg5抑制剂、V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、核输出蛋白CRM1抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DHFR抑制剂或促凋亡剂，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物。
在实施例中，抗体或抗原结合片段结合癌细胞上的靶抗原。
在实施例中，(i)靶抗原选自BCMA、CD33、HER2、CD38、CD48、CD79b、PCAD、CD74、CD138、SLAMF7、CD123、CLL1、FLT3、CD7、CKIT、CD56、SEZ6、DLL3、DLK1、B7-H3、EGFR、CD71、EphA2、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、TROP2、LIV1、CD46、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2和GPNMB；
(ii)靶抗原选自EGFR、CD7、HER2、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2和GPNMB；或者
(iii)靶抗原是PCAD、CD48、CD74、EphA2、HER2、TROP2、B7-H3或5T4。
在实施例中，靶抗原是PCAD、CD48、CD74、EphA2、HER2、TROP2、B7-H3或5T4。
在实施例中，抗体或其抗原结合片段选自表D1。
在实施例中，抗体或抗原结合片段包含i)选自表D3和D8中的抗体的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列，ii)选自表D2和D8中的抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列，和/或iii)选自表D4、D5和D7中的抗体的重链序列和轻链序列。
在实施例中，抗体或抗原结合片段是抗CD74抗体，其包含选自由以下组成的组的三个重链CDR和三个轻链CDR：
1)由SEQ ID NO:256组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:257组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:268组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:264组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:265组成的轻链CDR3(LCDR3)；
2)由SEQ ID NO:258组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:170组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:172组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:173组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)；
3)由SEQ ID NO:259组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:260组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:261组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:269组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:264组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)；
4)由SEQ ID NO:169组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:170组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:172组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:173组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)；
5)由SEQ ID NO:256组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:257组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:263组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:264组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:265组成的轻链CDR3(LCDR3)；
6)由SEQ ID NO:258组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:170组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:266组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:173组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)；
7)由SEQ ID NO:259组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:260组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:261组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:215组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:264组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
8)由SEQ ID NO:169组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:170组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:266组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:173组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在实施例中，抗体或抗原结合片段是抗CD74抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:262的氨基酸序列的轻链可变区，或(b)包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列的轻链可变区。
在实施例中，抗体或抗原结合片段是抗CD74抗体，其包含：
(a)SEQ ID NO:118的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:118至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:237的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:237至少95％相同的序列；
(b)SEQ ID NO:236的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:236至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:237的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:237至少95％相同的序列；或者
(c)SEQ ID NO:118的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:118至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:239的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:239至少95％相同的序列。
在实施例中，抗体或抗原结合片段是抗CD48抗体，其包含选自由以下组成的组的三个重链CDR和三个轻链CDR：
1)由SEQ ID NO:271组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:272组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:273组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:281组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:282组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:283组成的轻链CDR3(LCDR3)；
2)由SEQ ID NO:274组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:275组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:273组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:284组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:285组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:286组成的轻链CDR3(LCDR3)；
3)由SEQ ID NO:276组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:277组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:278组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:287组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:282组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:286组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
4)由SEQ ID NO:279组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:275组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:273组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:284组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:288组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:286组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
5)由SEQ ID NO:51组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:52组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:53组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:54组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:55组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:56组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在实施例中，抗体或抗原结合片段是抗CD48抗体，其包含a)包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列的轻链可变区；或b)包含SEQID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。
在实施例中，抗体或抗原结合片段是抗CD48抗体，其包含(a)SEQ ID NO:240的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:240至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:243的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:243至少95％相同的序列；或(b)SEQ ID NO:242的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:242至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:243的轻链氨基酸序列或与SEQ IDNO:243至少95％相同的序列；c)SEQ ID NO:240的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:240至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:69的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:70至少95％相同的序列。
在实施例中，抗体或抗原结合片段是抗Her2抗体，其包含选自由以下组成的组的三个重链CDR和三个轻链CDR：
1)由SEQ ID NO:289组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:290组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:291组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:297组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:298组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:299组成的轻链CDR3(LCDR3)；
2)由SEQ ID NO:292组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:40组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:291组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:300组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:301组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)；
3)由SEQ ID NO:293组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:294组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:295组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:302组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:298组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
4)由SEQ ID NO:39组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:40组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:291组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:300组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:301组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在实施例中，抗体或抗原结合片段是抗Her2抗体，其包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:296的氨基酸序列的轻链可变区。
在实施例中，抗体或抗原结合片段是抗Her2抗体，其包含SEQ ID NO:245的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:245至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:66至少95％相同的序列。
在实施例中，抗体或抗原结合片段是抗PCAD抗体，其包含选自由以下组成的组的三个重链CDR和三个轻链CDR：
1)由SEQ ID NO:304组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:305组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:306组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:312组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:313组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:314组成的轻链CDR3(LCDR3)；
2)由SEQ ID NO:307组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:308组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:306组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:315组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:25组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:316组成的轻链CDR3(LCDR3)；
3)由SEQ ID NO:309组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:277组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:278组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:317组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:313组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:316组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
4)由SEQ ID NO:310组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:308组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:306组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:315组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:25组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:316组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在实施例中，抗体或抗原结合片段是抗PCAD抗体，其包含含有SEQ ID NO:303的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的轻链可变区。
在实施例中，抗体或抗原结合片段是抗PCAD抗体，其包含SEQ ID NO:248的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:248至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:250的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:250至少95％相同的序列。
在实施例中，抗体或抗原结合片段是抗EphA2抗体，其包含选自由以下组成的组的三个重链CDR和三个轻链CDR：
1)由SEQ ID NO:319组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:320组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:321组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:330组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:331组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:332组成的轻链CDR3(LCDR3)；
2)由SEQ ID NO:322组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:323组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:324组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:333组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:334组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:335组成的轻链CDR3(LCDR3)；
3)由SEQ ID NO:325组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:326组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:327组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:336组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:331组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:335组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
4)由SEQ ID NO:328组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:323组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:321组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:333组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:334组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:335组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在实施例中，抗体或抗原结合片段是抗EphA2抗体，其包含含有SEQ ID NO:318的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:329的氨基酸序列的轻链可变区。
在实施例中，抗体或抗原结合片段是抗EphA2抗体，其包含SEQ ID NO:252的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:252至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:254的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:254至少95％相同的序列。
在实施例中，抗体或其抗原结合片段包含一个或多个半胱氨酸取代，该一个或多个半胱氨酸取代选自该抗体或其抗原结合片段的重链的E152C、S375C、或E152C和S375C两者，其中位置根据EU系统编号。
在实施例中，抗体或其抗原结合片段包含一个或多个Fc沉默突变。
在实施例中，组合物包含根据权利要求46至110中任一项所述的抗体-药物缀合物的多个拷贝，其中组合物中抗体-药物缀合物的平均a是约1至约8，例如约1至约6、约1至约4、或约1至约2。
在实施例中，化合物或其药学上可接受的盐由下式中的任一个表示：
其中：
A1和A2各自独立地选自键、和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点；
g在每次出现时独立地是介于20与30之间的整数；
o在每次出现时独立地是介于1与9之间的整数；并且
n是介于1与12之间的整数。
在实施例中，A1和A2各自独立地选自键和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点。
在实施例中，缀合物由下式中的任一个表示：
其中：
A1和A2各自独立地选自键、和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点；
g在每次出现时独立地是介于20与30之间的整数；
o在每次出现时独立地是介于1与9之间的整数；
n是介于1与12之间的整数；并且
＊＊-表示与Ab的附接点。
在实施例中，A1和A2各自独立地选自键和O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点。
在实施例中，化合物或其药学上可接受的盐具有式(D5a-1)：
其中：
A1和A2各自独立地选自键、和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点；
g在每次出现时独立地是介于20与30之间的整数(例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)；
o在每次出现时独立地是介于1与9之间(例如，介于1和3之间)的整数；并且
n是介于1与12之间(例如，介于5与10之间)的整数。
在实施例中，A1和A2各自独立地选自键和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点。
在实施例中，缀合物具有式(D5a-2)：
其中：
A1和A2各自独立地选自键、和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点；
g在每次出现时独立地是介于20与30之间的整数(例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)；
o在每次出现时独立地是介于1与9之间(例如，介于1和3之间)的整数；
n是介于1与12之间(例如，介于5与10之间)的整数；并且
＊＊-表示与Ab的附接点。
在实施例中，A1和A2各自独立地选自键和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点。
在实施例中，缀合物由下式中的任一个表示：
以及
其中A1和A2各自独立地选自键、和-OC(＝O)-*，其中*表示与D1或D2的附接点；＊＊-表示与Ab的附接点；并且表示与D1或D2的直接附接点。
在实施例中，A1和A2各自独立地选自键和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点。
在一些实施例中，本披露部分地提供了具有针对癌细胞的生物活性的新型抗体-药物缀合物(ADC)化合物。这些化合物可减缓、抑制和/或逆转哺乳动物中的肿瘤生长，和/或可用于治疗人类癌症患者。在一些实施例中，本披露更具体地涉及能够结合和杀伤癌细胞的ADC化合物。在一些实施例中，本文披露的ADC化合物包含将两种药学活性药物附接至全长抗体或抗原结合片段的双接头，任选地条件是两种药学活性药物都不是BH3模拟物。在一些实施例中，ADC化合物还能够在结合后内化到靶细胞中。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段结合癌细胞上的靶抗原。在一些实施例中，靶抗原是BCMA、CD33、HER2、CD38、CD48、CD79b、PCAD、CD74、CD138、SLAMF7、CD123、CLL1、FLT3、CD7、CKIT、CD56、DLL3、DLK1、B7-H3、EGFR、CD71、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、TROP2、LIV1、CD46、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2或GPNMB。在一些实施例中，靶抗原是EphA2、CD56、SEZ6、CD25、CCR8、CEACAM5、CEACAM6、4-1BB、5AC、5T4、甲胎蛋白、血管生成素2、ASLG659、TCLI、BMPRIB、短蛋白聚糖(Brevican)BCAN、BEHAB、C242抗原、C5、CA-125、CA-125(仿制品)、CA-IX(碳酸酐酶9)、CCR4、CD140a、CD152、CD19、CD20、CD200、CD21(C3DR)I)、CD22(B细胞受体CD22-B异构体)、CD221、CD23(gE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD37、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD70、CD72(Lyb-2、B细胞分化抗原CD72)、CD79a、CD80、CEA、CEA相关抗原、ch4D5、CLDN18.2、CRIPTO(CR、CRI、CRGF、TDGF1)、CTLA-4、CXCR5、DLL4、DR5、E16(LATI、SLC7A5)、EGFL7、EphB2R(DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5)、黏蛋白(Episialin)、ERBB3、ETBR(内皮素B型受体)、FCRHI(Fc受体样蛋白I)、FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAPI、SPAP IB、SPAP IC)、纤连蛋白额外结构域-B、卷曲受体、GD2、GD3神经节苷脂、GEDA、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HLA-DOB、HLA-DR、人散射因子受体激酶、IGF-I受体、IL-13、IL20R(ZCYTOR7)、IL-6、ILGF2、ILFRIR、整合素u、IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2)、Lewis-Y抗原、LY64(RP105)、MCP-I、MDP(DPEPI)、MPF、MSLN、SMR、间皮素、巨核细胞、PD-I、PDCDI、PDGF-R u、前列腺特异性膜抗原、PSCA(前列腺干细胞抗原前体)、PSCA hlg、RANKL、RON、SDCI、Sema Sb、STEAP I、STEAP2、PCANAP I、STAMP I、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因I、TAG-72、TEMI、肌腱蛋白C、TENB2(TMEFF2、脑肿瘤抑癌蛋白(tomoregulin)、TPEF、HPPI、TR)、TGF-IJ、TRAIL-E2、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、T17M4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员4)、TWEAK-R、TYRP I(糖蛋白75)、VEGF、VEGF-A、EGFR-I、VEGFR-2或波形蛋白。在一些实施例中，靶抗原是EGFR、CD7、HER2、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2或GPNMB。在一些实施例中，靶抗原是PCAD、HER2、CD48、CD74、EphA2、TROP2、B7-H3或5T4。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是在互联网go.drugbank.com/drugs/DB00002、在国际申请公开WO 2018/098306、WO 2016/179257、WO 2011/097627、WO 2017/214282、WO 2017/214301、WO 2017/214233、WO 2013/126810、WO 2008/056833、WO 2020/236817、WO 2017/214335和WO 2012147713中以及在美国专利号US 6870034 B2中披露的抗体或抗原结合片段，这些文献均通过援引以其全文并入。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是抗HER2抗体或抗原结合片段(例如，曲妥珠单抗或Ab T)。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是抗CD74抗体或抗原结合片段(例如，VHmil x VK1aNQAb或米拉组单抗(milatuzumab))。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是抗CD48抗体或抗原结合片段(例如，SGN-CD48A(MEM/MEM102或NY920)。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是抗PCAD抗体或抗原结合片段(例如，CQY679)。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是抗EphA2抗体或抗原结合片段(例如，1C1)。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是具有选自表D3和D8中的那些的CDR序列的抗体或抗原结合片段，或具有选自表D2和D8中的那些的可变区的抗体或抗原结合片段，或具有选自表D4、D5和D7中的那些的全长的抗体或抗原结合片段。
在一些实施例中，本文还提供了包含抗体-药物缀合物(例如，本文所述的任何示例性抗体-药物缀合物)的多个拷贝的组合物。在一些实施例中，组合物中抗体-药物缀合物的平均p是约2至约4。
在实施例中，抗体或其抗原结合片段与选自以下任一项的基团缀合。在实施例中，化合物或其药学上可接受的盐选自由以下组成的组：
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根据本发明的一个方面，在此提供了一种药物组合物，其包含缀合物和药学上可接受的载剂。
根据本发明的一个方面，在此提供了一种治疗患有或疑似患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的缀合物或药物组合物。
在实施例中，癌症表达靶抗原。
在实施例中，癌症是肿瘤或血液癌症，任选地，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌(gastric cancer)、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性成淋巴细胞性白血病在内的成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌(stomach cancer)、结肠癌或头颈癌。
根据本发明的一个方面，在此提供了一种减少或抑制受试者中肿瘤的生长的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的缀合物或药物组合物。
在实施例中，肿瘤表达靶抗原。
在实施例中，肿瘤是乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。
根据本发明的一个方面，在此提供了一种减少或抑制受试者的血液癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的缀合物或药物组合物。
在实施例中，血液癌症表达靶抗原。
在实施例中，血液癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性髓单核细胞性白血病(CMML)、急性单核细胞性白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或骨髓增生异常综合征(MDS)。
在实施例中，缀合物或药物组合物的施用使肿瘤或血液癌症的生长减少或抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
根据本发明的一个方面，在此提供了一种减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的缀合物或药物组合物。
在实施例中，癌细胞群表达靶抗原。
在实施例中，癌细胞群来自肿瘤或血液癌症，任选地其中癌细胞群来自乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性成淋巴细胞性白血病在内的成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。
在实施例中，缀合物或药物组合物的施用使癌细胞群减少或使癌细胞群的扩增减缓至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
在实施例中，抗体-药物缀合物作为单一疗法施用。在另一个实施例中，抗体-药物缀合物作为另一种治疗剂或放射疗法的辅助施用。在实施例中，抗体-药物缀合物以有效使肿瘤细胞对一种或多种另外的治疗剂和/或放射疗法敏感的量施用。
在实施例中，该方法进一步包括向有需要的受试者施用至少一种另外的治疗剂。
在实施例中，一种另外的治疗剂是紫杉烷、长春花生物碱、MEK抑制剂、ERK抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或RAF抑制剂。
根据本发明的一个方面，在此提供了本发明的缀合物或药物组合物在制备药物中的用途，该药物用于(i)治疗患有或疑似患有癌症的受试者，(ii)减少或抑制受试者中肿瘤的生长，(iii)减少或抑制受试者的血液癌症，或(iv)减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增。
根据本发明的一个方面，在此提供了本发明的抗体-药物缀合物或药物组合物，其用于(i)治疗患有或疑似患有癌症的受试者，(ii)减少或抑制受试者中肿瘤的生长，(iii)减少或抑制受试者的血液癌症，或(iv)减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增。
还披露了产生所述ADC化合物和组合物的方法。一个示例性实施例是通过在允许缀合的条件下使抗体或抗原结合片段与连接或共价附接至并非BH3模拟物的药学活性药物的可切割双接头反应来产生抗体-药物缀合物的方法。
因此，本发明提供以下编号的实施例。应当认识到，每个实施例中指定的特征可与其他指定特征组合以提供本发明的另外的实施例。
实施例1.一种具有式(A-1)的化合物，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥联间隔子；
W是支化部分；
L2'和L3'各自独立地是接头；并且
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物。
实施例2.根据实施例1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L2'和L3'中的每一者包含可切割基团，任选地至少一个可切割基团包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团、肽基团和/或自脱落基团(例如肽基团和自脱落基团)。
实施例2a.根据实施例2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L2'和L3'中的每一者包含肽基团和自脱落基团。
实施例2b.根据实施例1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L2'和L3'中的每一者包含可切割基团，任选地至少一个可切割基团包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团、糖(例如葡糖醛酰胺)基团、肽基团和/或自脱落基团(例如肽基团和自脱落基团)。
实施例3.根据实施例1、实施例2或实施例2a所述的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(B-1)：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是包含1至6个氨基酸的肽基团，其中所述肽基团任选地被亲水性部分取代；
V1和V2各自独立地包含i)自脱落基团，ii)酶切割元件(例如V1和V2各自独立地是自脱落基团)或iii)自脱落基团和酶切割元件；并且
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物；
或其药学上可接受的盐。
实施例3aa.根据实施例3所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中V1和V2各自独立地是i)自脱落基团或ii)酶切割元件(例如V1和V2各自独立地是自脱落基团)。
实施例3a.根据实施例3或实施例3aa所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中W是N或CH。
实施例3b.根据实施例3、实施例3aa或实施例3a所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中E1和E2各自是酶切割元件。
实施例3c.根据实施例3、实施例3aa、实施例3a或实施例3b所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中V1和V2各自独立地是自脱落基团。
实施例4.根据实施例3、实施例3aa、实施例3a、实施例3b或实施例3c所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中(i)可切割接头包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团和/或自脱落基团；(ii)可切割接头包含自脱落基团；或(iii)可切割接头包含自脱落基团，该自脱落基团包括-O-CH2-、-NH-CH2-、-OC(＝O)-、对氨基苄基-氨基甲酸酯、对氨基苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(烷氧基-PEG-烷基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-氨基甲酸酯或对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-铵；或(iv)V1和/或V2各自独立地包含含有对氨基苄基-磷酸酯或对氨基苄基-焦磷酸酯的基团。
实施例4a.根据实施例4所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中(i)可切割接头包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团和/或自脱落基团；(ii)可切割接头包含自脱落基团；或(iii)可切割接头包含自脱落基团，该自脱落基团包括-O-CH2-、-NH-CH2-、-OC(＝O)-、对氨基苄基-氨基甲酸酯、对氨基苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(烷氧基-PEG-烷基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-氨基甲酸酯或对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-铵。
实施例5.根据实施例3、实施例4或实施例4a所述的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(C-1)：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是包含1至6个氨基酸的肽基团，其中所述肽基团任选地被亲水性基团取代；
A1和A2各自独立地是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A1或A2的*表示与D1或D2的附接点；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物；
L4和L5各自独立地是间隔子部分；
R2和R3各自独立地是亲水性基团或酶切割元件(例如R2和R3各自是亲水性基团)；并且
m和n各自独立地是0或1；
或其药学上可接受的盐。
实施例5a.根据实施例5所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中W是N或CH。
实施例5b.根据实施例5或实施例5a所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2和R3各自是亲水性基团。
实施例6.根据实施例5、实施例5a或实施例5b所述的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(D1-1)、(D2-1)或(D3-1)：
或其药学上可接受的盐。
实施例7.根据实施例6所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中对于式(D1-1)，R2和R3各自独立地是亲水性基团，其中对于式(D2-1)，R2和R3各自独立地是酶切割元件；并且对于式(D3-1)，R2是亲水性基团并且R3是酶切割元件；或其药学上可接受的盐。
实施例8.根据前述实施例中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1选自由以下组成的组：
-ONH2、-NH2、 -N3、-SH、-SR11、-SSR12、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHS(＝O)2(CH＝CH2)、-NR11C(＝O)CH2Br例如-NHC(＝O)CH2Br、-NR11C(＝O)CH2I例如-NHC(＝O)CH2I、-C(O)NHNH2、
其中：
每个R11独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R12是2-吡啶基或4-吡啶基；
每个R13独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl和-OH；
每个R14独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；并且
每个R15独立地选自H、C1-C6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-C4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-C4烷基。
实施例9.根据前述实施例中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1选自由以下组成的组：
-ONH2、NHC(＝O)CH2Br和-NHC(＝O)CH2I。
实施例9a.根据前述实施例中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1选自由以下组成的组：
-ONH2、
实施例10.根据前述实施例中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是
实施例11.根据前述实施例中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
(1)L1包含：
或*-CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)-**，
其中每个n是1至12的整数，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(2)L1是并且n是1至12的整数或n是1或n是12，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(3)L1是并且n是1至12的整数，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(4)L1包含其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；或者
(5)L1是桥联间隔子，其包含：
*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)O(CH2)mSSC(RL1)2(CH2)mC(＝O)NRL1(CH2)mNRL1C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n NHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(RL1)2-**或*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
X1是并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；并且
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；并且
每个RL1独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例12.根据前述实施例中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L1包含由以下表示的部分：
其中n是1至12的整数(例如4至8，例如4或8)，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接附接点。
实施例12a.根据实施例12所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中n是4至8的整数。
实施例12b.根据实施例12a所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中n是4或8。
实施例13.根据前述实施例中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L1由下式表示：
其中
n是1至12的整数(例如4至8，例如4或8)；
x是0至6的整数(例如0至4，例如0至2，例如0或2)；
y是0或1；
z是0至6的整数(例如0至4，例如0至2，例如0或2)；
u是0或1；并且
其中L1的*表示与W的直接附接点，并且L1的**表示与R1的直接附接点。
实施例13a.根据实施例13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中n是4至8的整数。
实施例13b.根据实施例13a所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中n是4或8。
实施例13c.根据实施例13、实施例13a或实施例13b所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中x是0至2的整数。
实施例13d.根据实施例13c所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中x是0或2。
实施例13e.根据实施例13、实施例13a、实施例13b、实施例13c或实施例13d所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中z是0至2的整数。
实施例13f.根据实施例13e所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中z是0或2。
实施例14.根据前述实施例中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L1选自由以下组成的组：
实施例15.根据实施例3至14中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L2和L3各自独立地是连接间隔子，该连接间隔子包含由以下表示的部分：
其中
k是0至6的整数；
r是0或1；
o是0至12的整数；
p是0至6的整数；并且
其中L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接或间接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接或间接附接点。
实施例16.根据实施例3至15中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
L2和L3各自独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
以及
其中
k在每次出现时独立地是0至4的整数；
r在每次出现时独立地是0或1；
o在每次出现时独立地是0至10的整数；
p在每次出现时独立地是0至4的整数；
RL23是氢或C1-C6烷基；
RL是氢或-C(O)-RH；
RH是亲水性基团；并且
L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接附接点；
条件是当W是N时，L2和L3不是(L2c)、(L2d)、(L2f)或(L2k)。
实施例17.根据实施例16所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L2和L3各自独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
以及
其中
k在每次出现时独立地是1至3的整数；
o在每次出现时独立地是1至9的整数；
p在每次出现时独立地是1至3的整数；
RL23是氢或C1-C3烷基；
RL是氢或-C(O)-RH；
RH是亲水性基团；并且
L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接附接点；条件是当W是N时，L2和L3不是(L2FF)、(L2MM)、(L2NN)、(L2OO)或(L2PP)。
实施例18.根据实施例3至17中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L2和L3独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
其中L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，L2或L3的##表示与W的直接附接点；RL是氢或-C(O)-RH；并且
RH是并且d是20至30的整数(例如25)。
实施例18a.根据实施例18所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中d是25。
实施例19.根据实施例5至18a中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个肽基团独立地包含1至4、1至3或1至2个氨基酸残基。
实施例19a.根据实施例19所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个肽基团独立地包含2个氨基酸残基。
实施例20.根据实施例19或实施例19a所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个氨基酸残基独立地选自甘氨酸(Gly)、L-缬氨酸(Val)、L-瓜氨酸(Cit)、L-半胱氨酸(磺基-Ala)、L-赖氨酸(Lys)、L-异亮氨酸(Ile)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-甲硫氨酸(Met)、L-天冬酰胺(Asn)、L-脯氨酸(Pro)、L-丙氨酸(Ala)、L-亮氨酸(Leu)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)和β-丙氨酸(β-Ala)。
实施例21.根据实施例5至19和20中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中每个肽基团独立地选自Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Leu-Cit、Cit-(β-Ala)、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly和磺基-Ala-Val-Ala。
实施例22.根据实施例3至19a中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中E1和/或E2各自独立地是选自由以下组成的组的肽基团：
其中E1-1或E1-2的^表示与式(B)中的V1或V2的直接附接点或与式(C)和(D)中的-NH-基团的直接附接点；并且E1-1或E1-2的^^分别表示与L2或L3的直接附接点(例如，其中E1和E2各自是独立地选自(E1-1)和(E1-2)的肽基团)。
实施例22a.根据实施例22所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中E1和E2各自是独立地选自(E1-1)和(E1-2)的肽基团。
实施例23.根据实施例3至19a中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中E1和/或E2各自独立地是由以下表示的肽基团：
其中RE是亲水性基团RH。
实施例24.根据实施例23所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中(E1-3)中的亲水性基团RH是其中e是介于20与30之间的整数(例如25)。
实施例24a.根据实施例24所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中e是25。
实施例25.根据实施例22所述的化合物或药学上可接受的盐，其中E1和E2各自是
实施例26.根据实施例5至25中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2独立地选自键和-OC(＝O)-*，其中*表示分别与D1或D2的附接点。
实施例26a.根据实施例5至25中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2独立地选自键、和-OC(＝O)-*，其中*表示分别与D1或D2的附接点。
实施例27.根据实施例26所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2各自是键。
实施例27a.根据实施例26所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2都是-OC(＝O)-*。
实施例27b.根据实施例26所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2中的一者是OC(＝O)-*，并且A1和A2中的另一者是键。
实施例27c.根据实施例26a所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2独立地是键或其中*表示与D1或D2的附接点。
实施例27d.根据实施例27c所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2中的一者是并且A1和A2中的另一者是键。
实施例27e.根据实施例27c所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2都是
实施例27f.根据实施例26a所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2中的一者是并且A1和A2中的另一者是OC(＝O)-*。
实施例27g.根据实施例26a所述的化合物或药学上可接受的盐，其中)A1和A2是-OC(＝O)-*；
(ii)A1和A2是
(iii)A1是-OC(＝O)-*并且A2是键
(iv)A1是-OC(＝O)-*并且A2是
(v)A1是键并且A2是或者
(vi)A1是键并且A2是-OC(＝O)-*，
其中*表示与D1或D2的附接点。
实施例28.根据实施例5至27b中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中：
i)L4和L5各自独立地是间隔子部分，该间隔子部分具有结构
其中：
Z是-O-、-CH2-、-CH2O-、-CH2N(RL45)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NH-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)-、-C(＝O)NRL45-、-C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)NRL45-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中每个RL45独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基；并且
X是键、三唑基或-CH2-三唑基-，
其中X连接至R2或R3；或者
(ii)L4和L5独立地是间隔子部分，该间隔子部分具有结构
其中：
Z是-CH2-、-CH2O-、-CH2N(RL45)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NH-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)-、-C(＝O)NRb-、-C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)NRL45-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中每个RL45独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基；并且
X是-CH2-三唑基-C1-C4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-C4-C6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-、-CH2-三唑基-C1-C4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-、-C4-C6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-，其中每个n独立地是1、2或3，
其中X连接至R2或R3。
实施例29.根据实施例28所述的化合物或药学上可接受的盐，其中Z是-O-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-或-CH2O-；X是键、三唑基或-CH2-三唑基-；并且RL45在每次出现时独立地是H或C1-C3烷基。
实施例30.根据实施例5至29中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中L4和L5各自独立地是选自由以下组成的组的间隔子部分：
其中L4或L5的@表示与苯基的直接附接点，并且L4或L5的@@表示与R2或R3的直接附接点。
实施例31.根据实施例5至30中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中由R2和R3表示的亲水性基团各自独立地包括聚乙二醇、聚亚烷基二醇、多元醇、聚肌氨酸、糖、寡糖、多肽、被1至3个 取代的C2-C6烷基、或被1至2个独立地选自-OC(＝O)NHS(O)2NHCH2CH2OCH3、-NHC(＝O)C1-C4亚烷基-P(O)(OCH2CH3)2和-COOH基团的取代基取代的C2-C6烷基。
实施例32.根据实施例5至30中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2或/和R3各自独立地选自由以下组成的组：
其中n是介于1与6之间的整数；
实施例33.根据实施例5至30中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中R2或/和R3独立地包含：
(i)具有以下部分的聚肌氨酸：
其中
f是介于3与25之间的整数；并且
R23是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
(ii)具有下式的聚乙二醇：其中
g和h独立地是介于2与30之间的整数；或者
(iii)由表示的部分。
实施例33a.根据实施例5至30中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中由R2或R3表示的亲水性基团各自独立地包含：
(i)具有以下部分的聚肌氨酸：
其中f是介于3与25之间的整数；并且R23是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；或者
(ii)具有下式的聚乙二醇：其中g和h独立地是介于2与30之间的整数；或者
(iii)由表示的部分。
实施例34.根据实施例5至30中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中R2或/和R3各自独立地选自由以下组成的组：其中
g和h独立地是介于20与30之间的整数(例如23或24)。
实施例35.根据实施例34所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2或/和R3包含：
实施例35a.根据实施例34所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2和R3各自独立地包含具有下式的聚乙二醇： 其中g和h独立地是介于2与30之间的整数。
实施例36.根据前述实施例中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2是相同的。
实施例37.根据实施例1至35a中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2是不同的。
实施例38.根据前述实施例中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2各自独立地选自细胞毒性药物、细胞生长抑制药物和免疫抑制药物。
实施例39.根据实施例1至37中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2各自独立地选自澳瑞他汀、喜树碱、倍癌霉素、依托泊苷、美登素、类美登素、紫杉烷、苯二氮类或含苯二氮类药物(例如，吡咯并[1,4]-苯二氮类(PBD)、吲哚并苯二氮类和噁唑烷并苯二氮类)和长春花生物碱。
实施例39a.根据实施例1至37中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2各自独立地选自由以下组成的组：
(例如)和(例如)，
其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。
实施例39b.根据实施例39a所述的化合物或药学上可接受的盐，其中：
i)D1是并且D2是
ii)D1是并且D2是
iii)D1是并且D2是
iv)D1是并且D2是
v)D1是并且D2是
vi)D1是并且D2是
vii)D1是并且D2是
viii)D1是并且D2是
ix)D1是并且D2是
x)D1是并且D2是
xi)D1是并且D2是
xii)D1是并且D2是
xiii)D1是并且D2是
xiv)D1是并且D2是
xv)D1是并且D2是
xvi)D1是并且D2是
xvii)D1是并且D2是
xviii)D1是并且D2是
xix)D1是并且D2是
xx)D1是并且D2是
xxi)D1是并且D2是
xxii)D1是并且D2是
xxiii)D1是并且D2是
xxiv)D1是并且D2是
xxv)D1是并且D2是
xxvi)D1是并且D2是
xxvii)D1是并且D2是
xxviii)D1是并且D2是
xxix)D1是并且D2是
xxx)D1是并且D2是
xxxi)D1是并且D2是
xxxii)D1是并且D2是
xxxiii)D1是并且D2是
xxxiv)D1是并且D2是
xxxv)D1是并且D2是
xxxvi)D1是并且D2是
xxxvii)D1是并且D2是
xxxviii)D1是并且D2是
xxxix)D1是并且D2是
xl)D1是并且D2是
xli)D1是并且D2是
xlii)D1是并且D2是
xliii)D1是并且D2是
xliv)D1是并且D2是
vl)D1是并且D2是
xlvi)D1是并且D2是
xlvii)D1是并且D2是
xlviii)D1是并且D2是
il)D1是并且D2是
l)D1是并且D2是
li)D1是并且D2是
lii)D1是并且D2是
liii)D1是并且D2是
liv)D1是并且D2是
lv)D1是并且D2是
lvi)D1是并且D2是
lvii)D1是并且D2是
lviii)D1是并且D2是
lix)D1是并且D2是
lx)D1是并且D2是
lxi)D1是并且D2是
lxii)D1是并且D2是
lxiii)D1是并且D2是或者
lxiv)D1是并且D2是
其中*表示与分子的其余部分的连接点。
实施例39c.根据实施例1至37中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中：
i)A1-D1是并且A2-D2是
ii)A1-D1是并且A2-D2是
iii)A1-D1是并且A2-D2是
iv)A1-D1是并且A2-D2是
v)A1-D1是并且A2-D2是
vi)A1-D1是并且A2-D2是
vii)A1-D1是并且A2-D2是
viii)A1-D1是并且A2-D2是
ix)A1-D1是并且A2-D2是
x)A1-D1是并且A2-D2是
xi)A1-D1是并且A2-D2是
xii)A1-D1是并且A2-D2是
xiii)A1-D1是并且A2-D2是
xiv)A1-D1是并且A2-D2是
xv)A1-D1是并且A2-D2是
xvi)A1-D1是并且A2-D2是
xvii)A1-D1是并且A2-D2是
xviii)A1-D1是并且A2-D2是
xix)A1-D1是并且A2-D2是
xx)A1-D1是并且A2-D2是
xxi)A1-D1是并且A2-D2是
xxii)A1-D1是并且A2-D2是
xxiii)A1-D1是并且A2-D2是
xxiv)A1-D1是并且A2-D2是
xxv)A1-D1是并且A2-D2是
xxvi)A1-D1是并且A2-D2是
xxvii)A1-D1是并且A2-D2是
xxviii)A1-D1是并且A2-D2是
xxix)A1-D1是并且A2-D2是
xxx)A1-D1是并且A2-D2是
xxxi)A1-D1是并且A2-D2是
xxxii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxiii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxiv)A1-D1是并且A2-D2是
xxxv)A1-D1是并且A2-D2是
xxxvi)A1-D1是并且A2-D2是
xxxvii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxviii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxix)A1-D1是并且A2-D2是
xl)A1-D1是并且A2-D2是
xli)A1-D1是并且A2-D2是
xlii)A1-D1是并且A2-D2是
xliii)A1-D1是并且A2-D2是
xliv)A1-D1是并且A2-D2是
xlv)A1-D1是并且A2-D2是
xlvi)A1-D1是并且A2-D2是
xlvii)A1-D1是并且A2-D2是
xlviii)A1-D1是并且A2-D2是
xlix)A1-D1是并且A2-D2是
l)A1-D1是并且A2-D2是
li)A1-D1是并且A2-D2是
lii)A1-D1是并且A2-D2是
liii)A1-D1是并且A2-D2是
liv)A1-D1是并且A2-D2是
lv)A1-D1是并且A2-D2是
lvi)A1-D1是并且A2-D2是
lvii)A1-D1是并且A2-D2是
lviii)A1-D1是并且A2-D2是
lix)A1-D1是并且A2-D2是
lx)A1-D1是并且A2-D2是
lxi)A1-D1是并且A2-D2是
lxii)A1-D1是并且A2-D2是
lxiii)A1-D1是并且A2-D2是或者
lxiv)A1-D1是并且A2-D2是
其中*表示与分子的其余部分的连接点。
实施例40.根据实施例1至37中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和/或D2是澳瑞他汀。
实施例40a.根据实施例40所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2都是澳瑞他汀。
实施例40b.根据实施例1至37中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和/或D2是拓扑异构酶1抑制剂。
实施例40c.根据实施例40b所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2都是拓扑异构酶1抑制剂。
实施例40d.根据实施例1至37中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2是澳瑞他汀，并且D1和D2中的另一者是拓扑异构酶1抑制剂。
实施例40e.根据实施例40d所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1是澳瑞他汀并且D2是拓扑异构酶1抑制剂。
实施例40f.根据实施例40d所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1是拓扑异构酶1抑制剂并且D2是澳瑞他汀。
实施例41.根据前述实施例中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。
实施例41a.根据实施例41所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
实施例41b.根据实施例39a所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
(例如)和(例如)，
其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。
实施例41c.根据实施例39a所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。
实施例42.根据实施例1至37中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2各自独立地选自抗微管蛋白剂、微管蛋白抑制剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂和/或长春花生物碱。
实施例43.根据实施例1至37中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2各自独立地选自Eg5抑制剂、V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、核输出蛋白CRM1抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DHFR抑制剂或促凋亡剂，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物。
实施例44.根据前述实施例中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐。
实施例44a.根据前述实施例中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐。
实施例45.根据前述实施例中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的组：
，或其药学上可接受的盐。
实施例45a.根据实施例1至45中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的组：
，或其药学上可接受的盐。
实施例45b.根据实施例45a所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐。
实施例45c.根据实施例1至43中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自：
，或其药学上可接受的盐。
实施例45d.根据实施例1至43中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自：
，或其药学上可接受的盐。
实施例45e.根据实施例1至43中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自：
或其药学上可接受的盐。
实施例45f.根据实施例1至43中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自：
或其药学上可接受的盐。
实施例46.一种缀合物，其包含通过双接头共价连接至两种药学活性药物的抗体或其抗原结合片段，并且其中双接头具有连接至抗体的一个附接点和连接至两种药学活性药物的两个附接点，条件是两种药学活性药物都不是BH3模拟物。
实施例46a.根据实施例46所述的缀合物，其中两种药学活性药物是相同或不同的。
实施例46b.根据实施例46或46a所述的缀合物，其中药学活性药物选自细胞毒性药物、细胞生长抑制药物和免疫抑制药物。
实施例46c.根据实施例46至46b中任一项所述的缀合物，其中药学活性药物选自澳瑞他汀、喜树碱、倍癌霉素、依托泊苷、美登素、类美登素、紫杉烷、苯二氮类或含苯二氮类药物(例如，吡咯并[1,4]-苯二氮类(PBD)、吲哚并苯二氮类和噁唑烷并苯二氮类)和长春花生物碱。
实施例46d.根据实施例46c所述的缀合物，其中药学活性药物是澳瑞他汀。
实施例46e.根据实施例46或46a所述的缀合物，其中药学活性药物选自抗微管蛋白剂、微管蛋白抑制剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂和/或长春花生物碱。
实施例46f.根据实施例46或46a所述的缀合物，其中药学活性药物选自Eg5抑制剂、V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、核输出蛋白CRM1抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DHFR抑制剂或促凋亡剂。
实施例46g.根据实施例46或46a所述的缀合物，其中药学活性药物选自拓扑异构酶1抑制剂或其对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘代衍生物和/或与药学上可接受的酸或碱的加成盐。
实施例46h.根据实施例46g所述的缀合物，其中药学活性药物是其中拓扑异构酶1抑制剂选自拓扑替康、依喜替康、德鲁替康和SN-38。
实施例46i.根据实施例46或46a所述的缀合物，其中药学活性药物选自抗有丝分裂药物或其对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘代衍生物和/或与药学上可接受的酸或碱的加成盐。
实施例46j.根据实施例46i所述的缀合物，其中抗有丝分裂药物是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或紫杉烷。
实施例46k.根据实施例46j所述的缀合物，其中紫杉烷选自多西他赛、紫杉醇或卡巴他赛。
实施例46l.根据实施例46所述的缀合物，其中缀合物包含根据实施例1至45f中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
实施例46m.一种具有式(A-2)的缀合物：
其中：
Ab是抗体或其片段；
R100是偶联基团；
L1是桥联间隔子；
W是支化部分；
L2'和L3'各自独立地是接头；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，条件是D1和D2都不是BH3模拟物；并且
a是1至16的整数。
实施例47.根据实施例46m所述的缀合物，其中L2'和L3'中的每一者包含可切割基团，任选地至少一个可切割基团包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团和/或自脱落基团(例如肽基团和自脱落基团)。
实施例47a.根据实施例47所述的缀合物，其中L2'和L3'中的每一者包含肽基团和自脱落基团。
实施例47b.根据实施例46m所述的缀合物，其中L2'和L3'中的每一者包含可切割基团，任选地至少一个可切割基团包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团、糖(例如葡糖醛酰胺)基团、肽基团和/或自脱落基团(例如肽基团和自脱落基团)。
实施例48.根据实施例46m、实施例47或实施例47a所述的缀合物，其具有式(B-2)：
其中：
Ab是抗体或其片段；
R100是偶联基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是酶切割元件或亲水性部分(例如E1和E2各自是酶切割元件)；
V1和V2独立地包含i)自脱落基团，ii)酶切割元件(例如V1和V2各自独立地是自脱落基团)或iii)自脱落基团和酶切割元件；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，条件是D1和D2都不是BH3模拟物；并且
a是1至16的整数。
实施例48aa.根据实施例48所述的缀合物，其中V1和V2各自独立地是i)自脱落基团或ii)酶切割元件(例如V1和V2各自独立地是自脱落基团)。
实施例48a.根据实施例48或实施例48aa所述的缀合物，其中W是N或CH。
实施例48b.根据实施例48、实施例48aa或实施例48a所述的缀合物，其中E1和E2各自是酶切割元件。
实施例48c.根据实施例48、实施例48aa、实施例48a或实施例48b所述的缀合物，其中V1和V2各自独立地是自脱落基团。
实施例49.根据实施例46m至48c中任一项所述的缀合物，其中a是1至8、1至6、1至4的整数，或者a是1或2。
实施例49a.根据实施例46m至49所述的缀合物，其中a通过液相色谱-质谱法(LC-MS)确定。
实施例50.根据实施例46m至49中任一项所述的缀合物，其中(i)可切割接头包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团和/或自脱落基团；(ii)可切割接头包含自脱落基团；或(iii)可切割接头包含自脱落基团，该自脱落基团包括-CH2-O-、-NH-CH2-、-C(＝O)-、对氨基苄基-氨基甲酸酯、对氨基苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(烷氧基-PEG-烷基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-氨基甲酸酯或对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-铵。
实施例50a.根据实施例50所述的缀合物，其中W是N或CH。
实施例50b.根据实施例50或实施例50a所述的缀合物，其中R2和R3各自是亲水性基团。
实施例51.根据实施例46m至50b中任一项所述的缀合物，其具有式(C-2)：
其中：
Ab是抗体或其抗原结合片段；
R100是偶联基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是包含1至6个氨基酸的肽基团，其中所述肽基团任选地被亲水性基团取代；
A1和A2各自独立地是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A1或A2的*表示与D1或D2的附接点；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，条件是D1和D2都不是BH3模拟物；
L4和L5各自独立地是间隔子部分；
R2和R3各自独立地是亲水性基团或酶切割元件(例如R2和R3各自是亲水性基团)；并且
m和n各自独立地是0或1。
实施例52.根据实施例51所述的缀合物，其具有式(D1-2)、(D2-2)或(D3-2)：
实施例53.根据实施例52所述的缀合物，其中对于式(D1-2)，R2和R3各自独立地是亲水性基团，其中对于式(D2-2)，R2和R3各自独立地是酶切割元件；并且对于式(D3-2)，R2是亲水性基团并且R3是酶切割元件。
实施例54.根据实施例46m至53中任一项所述的缀合物，其中R100选自由以下组成的组：
酰胺；
以及
二硫键，
其中：
R16是H、C1-C4烷基、苯基、嘧啶或吡啶；
R18是H、C1-C6烷基、苯基或被1至3个-OH基团取代的C1-C4烷基；
每个R15独立地选自H、C1-C6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-C4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-C4烷基；
R17独立地选自H、苯基和吡啶；
q是0、1、2或3；
R19是H或甲基；并且
R20是H、-CH3或苯基。
实施例55.根据实施例46m至54中任一项所述的缀合物，其中R100选自由 组成的组，其中R100的***表示与Ab的附接点。
实施例56.根据实施例55所述的缀合物，其中R100是其中R100的***表示与Ab的附接点。
实施例57.根据实施例46m至56中任一项所述的缀合物，其中：
(1)L1包含：
或*-CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)-**，
其中每个n是1至12的整数，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(2)L1是并且n是1至12的整数或n是1或n是12，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(3)L1是并且n是1至12的整数，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(4)L1包含其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；或者
(5)L1是桥联间隔子，其包含：
*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)O(CH2)mSSC(RL1)2(CH2)mC(＝O)NRL1(CH2)mNRL1C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n NHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(RL1)2-**或*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
X1是并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；并且
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；并且
每个RL1独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例58.根据实施例46m至57中任一项所述的缀合物，其中L1包含由以下表示的部分：
其中n是1至12的整数(例如4至8，例如4或8)，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接附接点。
实施例58a.根据实施例58所述的缀合物，其中n是4至8的整数。
实施例58b.根据实施例58a所述的缀合物，其中n是4或8。
实施例59.根据实施例46m至58b中任一项所述的缀合物，其中L1由下式表示：
其中
n是1至12的整数(例如4至8，例如4或8)；
x是0至6的整数(例如0至4，例如0至2，例如0或2)；
y是0或1；
z是0至6的整数(例如0至4，例如0至2，例如0或2)；
u是0或1；并且
其中L1的*表示与W的直接附接点，并且L1的**表示与R1的直接附接点。
实施例59a.根据实施例59所述的缀合物，其中n是4至8的整数。
实施例59b.根据实施例59a所述的缀合物，其中n是4或8。
实施例59c.根据实施例59、实施例59a或实施例59b所述的缀合物，其中x是0至2的整数。
实施例59d.根据实施例59c所述的缀合物，其中x是0或2。
实施例59e.根据实施例59、实施例59a、实施例59b、实施例59c或实施例59d所述的缀合物，其中z是0至2的整数。
实施例59f.根据实施例59e所述的缀合物，其中z是0或2。
实施例60.根据实施例46m至59f中任一项所述的缀合物，其中L1选自由以下组成的组：
实施例61.根据实施例48至60中任一项所述的缀合物，其中L2和L3各自独立地是连接间隔子，该连接间隔子包含由以下表示的部分：
其中
k是0至6的整数；
r是0或1；
o是0至12的整数；
p是0至6的整数；并且
其中L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接或间接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接或间接附接点。
实施例62.根据实施例48至60中任一项所述的缀合物，其中L2和L3各自独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
以及
其中
k在每次出现时独立地是0至4的整数；
r在每次出现时独立地是0或1；
o在每次出现时独立地是0至10的整数；
p在每次出现时独立地是0至4的整数；
RL23是氢或C1-C6烷基；
RL是氢或-C(O)-RH；
RH是亲水性基团；并且
L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接附接点；
条件是当W是N时，L2和L3不是(L2c)、(L2d)、(L2f)或(L2k)。
实施例63.根据实施例62所述的缀合物，其中L2和L3各自独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
以及
其中
k在每次出现时独立地是1至3的整数；
o在每次出现时独立地是1至9的整数；
p在每次出现时独立地是1至3的整数；
RL23是氢或C1-C3烷基；
RL是氢或-C(O)-RH；
RH是亲水性基团；并且
L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接附接点；条件是当W是N时，L2和L3不是(L2FF)、(L2MM)、(L2NN)、(L2OO)或(L2PP)。
实施例64.根据实施例48至63中任一项所述的缀合物，其中L2和L3独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
其中L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，L2或L3的##表示与W的直接附接点；RL是氢或-C(O)-RH；并且
RH是并且d是20至30的整数(例如25)。
实施例64a.根据实施例64所述的缀合物，其中d是25。
实施例65.根据实施例51至64a中任一项所述的缀合物，其中每个肽基团独立地包含1至4、1至3或1至2个氨基酸残基。
实施例65a.根据实施例65所述的缀合物，其中每个肽基团独立地包含2个氨基酸残基。
实施例66.根据实施例65或实施例65a所述的缀合物，其中每个氨基酸残基独立地选自甘氨酸(Gly)、L-缬氨酸(Val)、L-瓜氨酸(Cit)、L-半胱氨酸(磺基-Ala)、L-赖氨酸(Lys)、L-异亮氨酸(Ile)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-甲硫氨酸(Met)、L-天冬酰胺(Asn)、L-脯氨酸(Pro)、L-丙氨酸(Ala)、L-亮氨酸(Leu)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)和β-丙氨酸(β-Ala)。
实施例67.根据实施例51至65中任一项所述的缀合物，其中每个肽基团独立地选自Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Leu-Cit、Cit-(β-Ala)、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly和磺基-Ala-Val-Ala。
实施例68.根据实施例48至65中任一项所述的缀合物，其中E1和/或E2各自独立地是选自由以下组成的组的肽基团：
其中E1-1或E1-2的^表示与式(B)中的V1或V2的直接附接点或与式(C)和(D)中的-NH-基团的直接附接点；并且E1-1或E1-2的^^分别表示与L2或L3的直接附接点(例如，其中E1和E2各自是独立地选自(E1-1)和(E1-2)的肽基团)。
实施例68a.根据实施例68所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中E1和E2各自是独立地选自(E1-1)和(E1-2)的肽基团。
实施例69.根据实施例48至65中任一项所述的缀合物，其中E1和/或E2各自独立地是由以下表示的肽基团：
其中RE是亲水性基团RH。
实施例70.根据实施例69所述的缀合物，其中(E1-3)中的亲水性基团RH是其中e是介于20与30之间的整数(例如25)。
实施例70a.根据实施例70所述的缀合物，其中e是25。
实施例71.根据实施例68所述的缀合物，其中E1和E2各自是
实施例72.根据实施例51至71中任一项所述的缀合物，其中A1和A2独立地选自键和-OC(＝O)-*，其中*表示分别与D1或D2的附接点。
实施例72a.根据实施例51至71中任一项所述的缀合物，其中A1和A2独立地选自键、和-OC(＝O)-*，其中*表示分别与D1或D2的附接点。
实施例73.根据实施例72所述的缀合物，其中A1和A2是键。
实施例73a.根据实施例72所述的缀合物，其中A1和A2都是-OC(＝O)-*。
实施例73b.根据实施例72所述的缀合物，其中A1和A2中的一者是OC(＝O)-*，并且A1和A2中的另一者是键。
实施例73c.根据实施例72a所述的缀合物，其中A1和A2独立地是键或其中*表示分别与D1或D2的附接点。
实施例73d.根据实施例72a所述的缀合物，其中A1和A2中的一者是并且A1和A2中的另一者是键。
实施例73e.根据实施例72a所述的缀合物，其中A1和A2都是
实施例73f.根据实施例72a所述的缀合物，其中A1和A2中的一者是并且A1和A2中的另一者是OC(＝O)-*。
实施例73g.根据实施例72a所述的缀合物，其中)A1和A2是-OC(＝O)-*；
(ii)A1和A2是
(iii)A1是-OC(＝O)-*并且A2是键
(iv)A1是-OC(＝O)-*并且A2是
(v)A1是键并且A2是或者
(vi)A1是键并且A2是-OC(＝O)-*，
其中*表示与D1或D2的附接点。
实施例74.根据实施例51至73b中任一项所述的缀合物，其中：
i)L4和L5各自独立地是间隔子部分，该间隔子部分具有结构
其中：
根据实施例41所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组:
X是键、三唑基或-CH2-三唑基-，
其中X连接至R2或R3；或者
(ii)L4和L5独立地是间隔子部分，该间隔子部分具有结构
其中：
Z是-CH2-、-CH2O-、-CH2N(RL45)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NH-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)-、-C(＝O)NRb-、-C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)NRL45-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中每个RL45独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基；并且
X是-CH2-三唑基-C1-C4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-C4-C6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-、-CH2-三唑基-C1-C4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-、-C4-C6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-，其中每个n独立地是1、2或3，
其中X连接至R2或R3。
实施例75.根据实施例74所述的缀合物，其中Z是-O-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-或-CH2O-；X是键、三唑基或-CH2-三唑基-；并且RL45在每次出现时独立地是H或C1-C3烷基。
实施例76.根据实施例51至75中任一项所述的缀合物，其中L4和L5各自独立地是选自由以下组成的组的间隔子部分：
其中L4或L5的@表示与苯基的直接附接点，并且L4或L5的@@表示与R2或R3的直接附接点。
实施例77.根据实施例51至76中任一项所述的缀合物，其中由R2和R3表示的亲水性基团各自独立地包括聚乙二醇、聚亚烷基二醇、多元醇、聚肌氨酸、糖、寡糖、多肽、被1至3个取代的C2-C6烷基、或被1至2个独立地选自-OC(＝O)NHS(O)2NHCH2CH2OCH3、-NHC(＝O)C1-C4亚烷基-P(O)(OCH2CH3)2和-COOH基团的取代基取代的C2-C6烷基。
实施例78.根据实施例51至76中任一项所述的缀合物，其中R2或/和R3各自独立地选自由以下组成的组：
其中n是介于1与6之间的整数；
实施例79.根据实施例51至76中任一项所述的缀合物，其中R2或/和R3各自独立地包含：
(i)具有以下部分的聚肌氨酸：
其中
f是介于3与25之间的整数；并且
R23是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
(ii)具有下式的聚乙二醇：其中
g和h独立地是介于2与30之间的整数；或者
(iii)由表示的部分。
实施例79a.根据实施例51至76中任一项所述的缀合物，其中由R2或R3表示的亲水性基团各自独立地包含：
(i)具有以下部分的聚肌氨酸：
其中f是介于3与25之间的整数；并且R23是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；或者
(ii)具有下式的聚乙二醇：其中g和h独立地是介于2与30之间的整数；
或者
(iii)由表示的部分。
实施例80.根据实施例51至76中任一项所述的缀合物，其中R2和R3各自独立地选自由以下组成的组： 其中
g和h独立地是介于20与30之间的整数(例如23或24)。
实施例81.根据实施例80所述的其缀合物，其中R2或/和R3包含：
实施例81a.根据实施例80所述的缀合物，其中R2和R3各自独立地包含具有下式的聚乙二醇：其中g和h独立地是介于2与30之间的整数。
实施例82.根据实施例46m至81a中任一项所述的缀合物，其中D1和D2是相同的。
实施例83.根据实施例46m至81a中任一项所述的缀合物，其中D1和D2是不同的。
实施例84.根据实施例46m至83中任一项所述的缀合物，其中D1和D2各自独立地选自细胞毒性药物、细胞生长抑制药物和免疫抑制药物。
实施例85.根据实施例46m至83中任一项所述的缀合物，其中D1和D2各自独立地选自澳瑞他汀、喜树碱、倍癌霉素、依托泊苷、美登素、类美登素、紫杉烷、苯二氮类或含苯二氮类药物(例如，吡咯并[1,4]-苯二氮类(PBD)、吲哚并苯二氮类和噁唑烷并苯二氮类)和长春花生物碱。
实施例85a.根据实施例85所述的缀合物，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。
实施例85b.根据实施例85a所述的缀合物，其中
i)D1是并且D2是
ii)D1是并且D2是
iii)D1是并且D2是
iv)D1是并且D2是
v)D1是并且D2是
vi)D1是并且D2是
vii)D1是并且D2是
viii)D1是并且D2是
ix)D1是并且D2是
x)D1是并且D2是
xi)D1是并且D2是
xii)D1是并且D2是
xiii)D1是并且D2是
xiv)D1是并且D2是
xv)D1是并且D2是
xvi)D1是并且D2是
xvii)D1是并且D2是
xviii)D1是并且D2是
xix)D1是并且D2是
xx)D1是并且D2是
xxi)D1是并且D2是
xxii)D1是并且D2是
xxiii)D1是并且D2是
xxiv)D1是并且D2是
xxv)D1是并且D2是
xxvi)D1是并且D2是
xxvii)D1是并且D2是
xxviii)D1是并且D2是
xxix)D1是并且D2是
xxx)D1是并且D2是
xxxi)D1是并且D2是
xxxii)D1是并且D2是
xxxiii)D1是并且D2是
xxxiv)D1是并且D2是
xxxv)D1是并且D2是
xxxvi)D1是并且D2是
xxxvii)D1是并且D2是
xxxviii)D1是并且D2是
xxxix)D1是并且D2是
xl)D1是并且D2是
xli)D1是并且D2是
xlii)D1是并且D2是
xliii)D1是并且D2是
xliv)D1是并且D2是
vl)D1是并且D2是
xlvi)D1是并且D2是
xlvii)D1是并且D2是
xlviii)D1是并且D2是
il)D1是并且D2是
l)D1是并且D2是
li)D1是并且D2是
lii)D1是并且D2是
liii)D1是并且D2是
liv)D1是并且D2是
lv)D1是并且D2是
lvi)D1是并且D2是
lvii)D1是并且D2是
lviii)D1是并且D2是
lix)D1是并且D2是
lx)D1是并且D2是
lxi)D1是并且D2是
lxii)D1是并且D2是
lxiii)D1是并且D2是或者
lxiv)D1是并且D2是
其中*表示与分子的其余部分的连接点。
实施例85c.根据实施例46至85b中任一项所述的缀合物，其中：
i)A1-D1是并且A2-D2是
ii)A1-D1是并且A2-D2是
iii)A1-D1是并且A2-D2是
iv)A1-D1是并且A2-D2是
v)A1-D1是并且A2-D2是
vi)A1-D1是并且A2-D2是
vii)A1-D1是并且A2-D2是
viii)A1-D1是并且A2-D2是
ix)A1-D1是并且A2-D2是
x)A1-D1是并且A2-D2是
xi)A1-D1是并且A2-D2是
xii)A1-D1是并且A2-D2是
xiii)A1-D1是并且A2-D2是
xiv)A1-D1是并且A2-D2是
xv)A1-D1是并且A2-D2是
xvi)A1-D1是并且A2-D2是
xvii)A1-D1是并且A2-D2是
xviii)A1-D1是并且A2-D2是
xix)A1-D1是并且A2-D2是
xx)A1-D1是并且A2-D2是
xxi)A1-D1是并且A2-D2是
xxii)A1-D1是并且A2-D2是
xxiii)A1-D1是并且A2-D2是
xxiv)A1-D1是并且A2-D2是
xxv)A1-D1是并且A2-D2是
xxvi)A1-D1是并且A2-D2是
xxvii)A1-D1是并且A2-D2是
xxviii)A1-D1是并且A2-D2是
xxix)A1-D1是并且A2-D2是
xxx)A1-D1是并且A2-D2是
xxxi)A1-D1是并且A2-D2是
xxxii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxiii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxiv)A1-D1是并且A2-D2是
xxxv)A1-D1是并且A2-D2是
xxxvi)A1-D1是并且A2-D2是
xxxvii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxviii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxix)A1-D1是并且A2-D2是
xl)A1-D1是并且A2-D2是
xli)A1-D1是并且A2-D2是
xlii)A1-D1是并且A2-D2是
xliii)A1-D1是并且A2-D2是
xliv)A1-D1是并且A2-D2是
xlv)A1-D1是并且A2-D2是
xlvi)A1-D1是并且A2-D2是
xlvii)A1-D1是并且A2-D2是
xlviii)A1-D1是并且A2-D2是
xlix)A1-D1是并且A2-D2是
l)A1-D1是并且A2-D2是
li)A1-D1是并且A2-D2是
lii)A1-D1是并且A2-D2是
liii)A1-D1是并且A2-D2是
liv)A1-D1是并且A2-D2是
lv)A1-D1是并且A2-D2是
lvi)A1-D1是并且A2-D2是
lvii)A1-D1是并且A2-D2是
lviii)A1-D1是并且A2-D2是
lix)A1-D1是并且A2-D2是
lx)A1-D1是并且A2-D2是
lxi)A1-D1是并且A2-D2是
lxii)A1-D1是并且A2-D2是
lxiii)A1-D1是并且A2-D2是或者
lxiv)A1-D1是并且A2-D2是
其中*表示与分子的其余部分的连接点。
实施例86.根据实施例46m至83中任一项所述的缀合物，其中D1和/或D2是澳瑞他汀。
实施例86a.根据实施例86所述的缀合物，其中D1和D2都是澳瑞他汀。
实施例86b.根据实施例46m至83中任一项所述的缀合物，其中D1和/或D2是拓扑异构酶1抑制剂。
实施例86c.根据实施例86b所述的缀合物，其中D1和D2都是拓扑异构酶1抑制剂。
实施例86d.根据实施例46m至83中任一项所述的缀合物，其中D1和D2中的一者是澳瑞他汀，并且D1和D2中的另一者是拓扑异构酶1抑制剂。
实施例86e.根据实施例86d所述的缀合物，其中D1是澳瑞他汀并且D2是拓扑异构酶1抑制剂。
实施例86f.根据实施例86d所述的缀合物，其中D1是拓扑异构酶1抑制剂并且D2是澳瑞他汀。
实施例87.根据实施例86所述的缀合物，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
其中*表示与A1或A2的附接点。
实施例87a.根据实施例87所述的缀合物，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
实施例87b.根据实施例85a所述的缀合物，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
(例如)和(例如)，
其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。
实施例87c.根据实施例85a所述的缀合物，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。
实施例88.根据实施例46m至83中任一项所述的缀合物，其中D1和D2各自独立地选自抗微管蛋白剂、微管蛋白抑制剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂和/或长春花生物碱。
实施例89.根据实施例46m至83中任一项所述的缀合物，其中D1和D2各自独立地选自Eg5抑制剂、V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、核输出蛋白CRM1抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DHFR抑制剂或促凋亡剂，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物。
实施例90.一种缀合物，其包含与独立地选自实施例44或实施例45的一种或多种(例如1至16种，例如1至4种)化合物结合的抗体或抗原结合片段。
实施例91.根据实施例46m至90中任一项所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段结合癌细胞上的靶抗原。
实施例92.根据实施例91所述的缀合物，其中：
(i)所述靶抗原选自BCMA、CD33、HER2、CD38、CD48、CD79b、PCAD、CD74、CD138、SLAMF7、CD123、CLL1、FLT3、CD7、CKIT、CD56、SEZ6、DLL3、DLK1、B7-H3、EGFR、CD71、EphA2、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、TROP2、LIV1、CD46、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2和GPNMB；
(ii)靶抗原选自EGFR、CD7、HER2、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2和GPNMB；或者
(iii)靶抗原选自PCAD、CD48、CD74、EphA2、TROP2、B7-H3、5T4和HER2。
实施例92a.根据实施例91或92所述的缀合物，其中抗体或其抗原结合片段选自表D1。
实施例93.根据实施例91至92a中任一项所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段包含i)选自表D3和D8的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列，ii)选自表D2和D8的重链可变区序列和轻链可变区序列，或iii)选自表D4、D5和D7的重链序列和轻链序列。
实施例94.根据实施例91所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段是抗CD74抗体，其包含选自由以下组成的组的三个重链CDR和三个轻链CDR：
1)由SEQ ID NO:256组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:257组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:268组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:264组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:265组成的轻链CDR3(LCDR3)；
2)由SEQ ID NO:258组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:170组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:172组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:173组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)；
3)由SEQ ID NO:259组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:260组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:261组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:269组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:264组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)；
4)由SEQ ID NO:169组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:170组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:172组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:173组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)；
5)由SEQ ID NO:256组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:257组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:263组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:264组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:265组成的轻链CDR3(LCDR3)；
6)由SEQ ID NO:258组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:170组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:266组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:173组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)；
7)由SEQ ID NO:259组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:260组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:261组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:215组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:264组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
8)由SEQ ID NO:169组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:170组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:266组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:173组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)。
实施例95.根据实施例91所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段是抗CD74抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:262的氨基酸序列的轻链可变区，或(b)包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO:267的氨基酸序列的轻链可变区。
实施例96.根据实施例91所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段是抗CD74抗体，其包含：
(a)SEQ ID NO:118的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:118至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:237的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:237至少95％相同的序列；
(b)SEQ ID NO:236的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:236至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:237的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:237至少95％相同的序列；或者
(c)SEQ ID NO:118的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:118至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:239的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:239至少95％相同的序列。
实施例97.根据实施例91所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段是抗CD48抗体，其包含选自由以下组成的组的三个重链CDR和三个轻链CDR：
1)由SEQ ID NO:271组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:272组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:273组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:281组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:282组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:283组成的轻链CDR3(LCDR3)；
2)由SEQ ID NO:274组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:275组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:273组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:284组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:285组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:286组成的轻链CDR3(LCDR3)；
3)由SEQ ID NO:276组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:277组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:278组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:287组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:282组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:286组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
4)由SEQ ID NO:279组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:275组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:273组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:284组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:288组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:286组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
5)由SEQ ID NO:51组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:52组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:53组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:54组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:55组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:56组成的轻链CDR3(LCDR3)。
实施例98.根据实施例91所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段是抗CD48抗体，其包含a)包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列的轻链可变区；或b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。
实施例99.根据实施例91所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段是抗CD48抗体，其包含(a)SEQ ID NO:240的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:240至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:243的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:243至少95％相同的序列；或(b)SEQID NO:242的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:242至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:243的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:243至少95％相同的序列；c)SEQ ID NO:240的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:240至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:69的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:70至少95％相同的序列。
实施例100.根据实施例91所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段是抗Her2抗体，其包含选自由以下组成的组的三个重链CDR和三个轻链CDR：
1)由SEQ ID NO:289组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:290组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:291组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:297组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:298组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:299组成的轻链CDR3(LCDR3)；
2)由SEQ ID NO:292组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:40组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:291组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:300组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:301组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)；
3)由SEQ ID NO:293组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:294组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:295组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:302组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:298组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
4)由SEQ ID NO:39组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:40组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:291组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:300组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:301组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)。
实施例101.根据实施例91所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段是抗Her2抗体，其包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:296的氨基酸序列的轻链可变区。
实施例102.根据实施例91所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段是抗Her2抗体，其包含SEQ ID NO:245的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:245至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:66至少95％相同的序列。
实施例103.根据实施例91所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段是抗PCAD抗体，其包含选自由以下组成的组的三个重链CDR和三个轻链CDR：
1)由SEQ ID NO:304组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:305组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:306组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:312组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:313组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:314组成的轻链CDR3(LCDR3)；
2)由SEQ ID NO:307组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:308组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:306组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:315组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:25组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:316组成的轻链CDR3(LCDR3)；
3)由SEQ ID NO:309组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:277组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:278组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:317组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:313组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:316组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
4)由SEQ ID NO:310组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:308组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:306组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:315组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:25组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:316组成的轻链CDR3(LCDR3)。
实施例104.根据实施例91所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段是抗PCAD抗体，其包含含有SEQ ID NO:303的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的轻链可变区。
实施例105.根据实施例91所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段是抗PCAD抗体，其包含SEQ ID NO:248的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:248至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:250的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:250至少95％相同的序列。
实施例106.根据实施例91所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段是抗EphA2抗体，其包含选自由以下组成的组的三个重链CDR和三个轻链CDR：
1)由SEQ ID NO:319组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:320组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:321组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:330组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:331组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:332组成的轻链CDR3(LCDR3)；
2)由SEQ ID NO:322组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:323组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:324组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:333组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:334组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:335组成的轻链CDR3(LCDR3)；
3)由SEQ ID NO:325组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:326组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:327组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:336组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:331组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:335组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
4)由SEQ ID NO:328组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:323组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:321组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:333组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:334组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:335组成的轻链CDR3(LCDR3)。
实施例107.根据实施例91所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段是抗EphA2抗体，其包含含有SEQ ID NO:318的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:329的氨基酸序列的轻链可变区。
实施例108.根据实施例91所述的缀合物，其中抗体或抗原结合片段是抗EphA2抗体，其包含SEQ ID NO:252的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:252至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:254的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:254至少95％相同的序列。
实施例109.根据实施例94至108中任一项所述的缀合物，其中抗体或其抗原结合片段包含一个或多个半胱氨酸取代，该一个或多个半胱氨酸取代选自该抗体或其抗原结合片段的重链的E152C、S375C、或E152C和S375C两者，其中位置根据EU系统编号。
实施例110.根据实施例94至108中任一项所述的缀合物，其中抗体或其抗原结合片段包含一个或多个Fc沉默突变。
实施例111.一种组合物，其包含根据实施例46m至110中任一项所述的缀合物的多个拷贝，其中组合物中缀合物的平均a是约1至约8，例如约1至约6、约1至约4、或约1至约2。
实施例112.根据实施例1至43中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其由下式中的任一个表示：
其中：
A1和A2各自独立地选自键、和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点；
g在每次出现时独立地是介于20与30之间的整数(例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)；
o在每次出现时独立地是介于1与9之间(例如，介于2和5之间)的整数；并且
n是介于1与12之间(例如，介于2与5之间)的整数。
实施例112a.根据实施例112所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中A1和A2各自独立地选自键和O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点。
实施例113.根据实施例46m至110中任一项所述的缀合物，其由下式中的任一个表示：
其中：
A1和A2各自独立地选自键、和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点；
g在每次出现时独立地是介于20与30之间的整数(例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)；
o在每次出现时独立地是介于1与9之间(例如，介于2和5之间)的整数；
n是介于1与12之间(例如，介于2与5之间)的整数；并且
＊＊-表示与Ab的附接点。
实施例113a.根据实施例113所述的缀合物，其中A1和A2各自独立地选自键和O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点。
实施例114.根据实施例1至43中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(D5a-1)：
其中：
A1和A2各自独立地选自键、和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点；
g在每次出现时独立地是介于20与30之间的整数(例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)；
o在每次出现时独立地是介于1与9之间(例如，介于1和3之间)的整数；并且
n是介于1与12之间(例如，介于5与10之间)的整数。
实施例114a.根据实施例114所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中A1和A2各自独立地选自键和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点。
实施例115.根据实施例46m至110中任一项所述的缀合物，其具有式(D5a-2)：
其中：
A1和A2各自独立地选自键、和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点；
g在每次出现时独立地是介于20与30之间的整数(例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)；
o在每次出现时独立地是介于1与9之间(例如，介于1和3之间)的整数；
n是介于1与12之间(例如，介于5与10之间)的整数；并且
＊＊-表示与Ab的附接点。
实施例115a.根据实施例115所述的缀合物，其中A1和A2各自独立地选自键和O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点。
实施例116.根据实施例46m至110中任一项所述的缀合物，其由下式中表示：
以及
其中A1或A2各自独立地选自键、和-OC(＝O)-*，其中*表示与D1或D2的附接点；＊＊-表示与Ab的附接点；并且表示与D1或D2的直接附接点。
实施例116a.根据实施例116所述的缀合物，其中A1和A2各自独立地选自键和O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点。
实施例117.一种药物组合物，其包含根据实施例46至110、113、115和116中任一项所述的缀合物，以及药学上可接受的载剂。
实施例118.一种治疗患有或疑似患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据实施例46至110、113、115和116中任一项所述的缀合物或根据实施例117所述的药物组合物。
实施例119.根据实施例118所述的方法，其中癌症表达靶抗原。
实施例120.根据实施例118或实施例119所述的方法，其中癌症是肿瘤或血液癌症，任选地，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性成淋巴细胞性白血病在内的成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。
实施例121.一种减少或抑制受试者中肿瘤的生长的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据实施例46至110、113、115和116中任一项所述的缀合物或根据实施例117所述的药物组合物。
实施例122.根据实施例121所述的方法，其中肿瘤表达靶抗原。
实施例123.根据实施例121或实施例122所述的方法，其中肿瘤是乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。
实施例124.一种减少或抑制受试者的血液癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据实施例46至110、113、115和116中任一项所述的缀合物或根据实施例117所述的药物组合物。
实施例125.根据实施例124所述的方法，其中血液癌症表达靶抗原。
实施例126.根据实施例124或实施例125所述的方法，其中血液癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性髓单核细胞性白血病(CMML)、急性单核细胞性白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或骨髓增生异常综合征(MDS)。
实施例127.根据实施例121至126中任一项所述的方法，其中缀合物或药物组合物的施用使肿瘤或血液癌症的生长减少或抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
实施例128.一种减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据实施例46至110、113、115和116中任一项所述的缀合物或根据实施例117所述的药物组合物。
实施例129.根据实施例128所述的方法，其中癌细胞群表达靶抗原。
实施例130.根据实施例128或实施例129所述的方法，其中癌细胞群来自肿瘤或血液癌症，任选地其中癌细胞群来自乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性成淋巴细胞性白血病在内的成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。
实施例131.根据实施例128至130中任一项所述的方法，其中缀合物或药物组合物的施用使癌细胞群减少或使癌细胞群的扩增减缓至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
实施例132.根据实施例118至131中任一项所述的方法，其中缀合物作为单一疗法施用。
实施例133.根据实施例118至131中任一项所述的方法，其中缀合物作为另一种治疗剂或放射疗法的辅助施用。
实施例134.根据实施例133所述的方法，其中缀合物以有效使肿瘤细胞对一种或多种另外的治疗剂和/或放射疗法敏感的量施用。
实施例135.根据实施例118至131中任一项所述的方法，其进一步包括向有需要的受试者施用至少一种另外的治疗剂。
实施例136.根据实施例135所述的方法，其中一种另外的治疗剂是紫杉烷、长春花生物碱、MEK抑制剂、ERK抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或RAF抑制剂。
实施例137.根据实施例46至110、113、115和116中任一项所述的缀合物或根据实施例117所述的药物组合物在制备药物中的用途，该药物用于(i)治疗患有或疑似患有癌症的受试者，(ii)减少或抑制受试者中肿瘤的生长，(iii)减少或抑制受试者的血液癌症，或(iv)减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增。
实施例138.根据实施例46至113、110、115和116中任一项所述的缀合物或根据实施例117所述的药物组合物，其用于(i)治疗患有或疑似患有癌症的受试者，(ii)减少或抑制受试者中肿瘤的生长，(iii)减少或抑制受试者的血液癌症，或(iv)减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增。
定义
在整个说明书和权利要求中使用了与描述的各方面有关的各种术语。除非另有指出，否则此类术语在本领域中具有其普通含义。其他具体定义的术语将以与本文提供的定义一致的方式进行解释。
如本文所用，单数形式“一个/种(a/an)”以及“该/所述(the)”包括复数形式，除非上下文清楚地另外指明。除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“有(being of)”(如在“有化学式”中)、“包括(including)”和“含有(containing)”应被解释为开放式术语(即，是指“包括但不限于”)。另外，每当在实施例中使用“包含”或另一个开放式术语时，应该理解，可以使用中间术语“基本上由……组成”或封闭式术语“由……组成”来更狭义地要求保护相同的实施例。
术语“约”或“大约”当在数值和范围的上下文使用时，是指大约或接近所述值或范围的值或范围，使得本实施例可以如预期进行，这对技术人员来说从本文所包含的教导中是显而易见的。在一些实施例中，约意指加上或减去数量的20％、15％、10％、5％、1％、0.5％或0.1％。在一个实施例中，术语“约”是指比指定值大或小10％的值的范围。在另一个实施例中，术语“约”是指比指定值大或小5％的值的范围。在另一个实施例中，术语“约”是指比指定值大或小1％的值的范围。
术语“抗体-药物缀合物”、“抗体缀合物”、“缀合物”、“免疫缀合物”和“ADC”可互换使用，并且是指与一种或多种抗体或抗原结合片段连接的一种或多种治疗化合物(其不是BH3-模拟物)。在一些实施例中，ADC由通式定义：其中Ab＝抗体或抗原结合片段，L＝双接头部分，D1和D2＝并非BH3-模拟物的药物部分，并且a＝每个抗体或抗原结合片段带有附接的D1和D2的双接头部分的数量。
术语“抗体”在最广泛的意义上用于指通过免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶标(诸如蛋白质、多肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或上述的组合)的免疫球蛋白分子。抗体可以是多克隆或单克隆的、多链或单链的或完整的免疫球蛋白，并且可以源自天然来源或来自重组来源。“完整”抗体是典型地包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，CL。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散步着更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。抗体可以是单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼源化(camelised)抗体或嵌合抗体。这些抗体可以具有任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。抗体可以是完整抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，本文披露的抗体或抗体片段包含经修饰或工程化的氨基酸残基，例如一个或多个半胱氨酸残基，以作为用于与药物部分缀合的位点(Junutula JR等人:Nat Biotechnol[自然生物技术]2008,26:925-932)。在一个实施例中，本披露提供了经修饰的抗体或抗体片段，该经修饰的抗体或抗体片段包含在本文所述的位置处用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代。用于半胱氨酸取代的位点是在抗体或抗体片段的恒定区中并且因此适用于多种抗体或抗体片段，并且选择位点以提供稳定且均质的缀合物。经修饰的抗体或片段可以具有一个、两个或更多个半胱氨酸取代，并且这些取代可以与如本文所述的其他修饰和缀合方法组合使用。用于将半胱氨酸插入在抗体的特定位置处的方法是本领域已知的，参见例如Lyons等人,(1990)Protein Eng.[蛋白质工程]3:703-708、WO 2011/005481、WO 2014/124316、WO 2015/138615。在某些实施例中，经修饰的抗体包含在其选自以下位置的恒定区上用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体的重链的位置117、119、121、124、139、152、153、155、157、164、169、171、174、189、191、195、197、205、207、246、258、269、274、286、288、290、292、293、320、322、326、333、334、335、337、344、355、360、375、382、390、392、398、400和422，并且其中位置根据EU系统编号。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段包含在其选自以下位置的恒定区上用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、109、114、129、142、143、145、152、154、156、159、161、165、168、169、170、182、183、197、199和203，其中位置根据EU系统编号，并且其中轻链是人κ轻链。在某些实施例中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸对两个或更多个氨基酸的取代的组合，其中组合包含在抗体重链的位置375、抗体重链的位置152、抗体重链的位置360、或抗体轻链的位置107处的取代，并且其中位置根据EU系统编号。在某些实施例中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸对一个氨基酸的取代，其中该取代是在抗体重链的位置375、抗体重链的位置152、抗体重链的位置360、抗体轻链的位置107、抗体轻链的位置165或抗体轻链的位置159，并且其中位置根据EU系统编号，并且其中轻链是κ链。在特定的实施例中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸对两个氨基酸的取代的组合，其中组合包含在抗体重链的位置375和抗体重链的位置152处的取代，其中位置根据EU系统编号。在特定的实施例中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在抗体重链的位置360处用半胱氨酸对一个氨基酸的取代，其中位置根据EU系统编号。在其他特别实施例中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在抗体轻链的位置107处用半胱氨酸对一个氨基酸的取代并且其中位置根据EU系统编号，并且其中轻链是κ链。
如本文所用，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”或“功能性抗体片段”是指抗体的至少一部分，该至少一部分保留与抗原(例如，PCAD、HER2、CD48、CD74、EphA2、TROP2、B7-H3或5T4)的表位特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)。抗原结合片段还可以保留内化到表达抗原的细胞中的能力。在一些实施例中，抗原结合片段还保留免疫效应子活性。术语抗体、抗体片段、抗原结合片段等旨在涵盖在较大的大分子(诸如ADC)的背景下使用来自抗体的结合结构域。已经显示，全长抗体的片段可以执行全长抗体的抗原结合功能。抗体片段的实例包括但不限于，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域、由抗体片段(诸如包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体、和分离的CDR或抗体的其他表位结合片段。抗原结合片段还可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、纳米抗体、细胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、双特异性或多特异性抗体构建体、ADC、v-NAR和双-scFv中(参见例如，Holliger和Hudson(2005)Nat Biotechnol.[自然生物技术]23(9):1126-36)。还可以将抗原结合片段移植到基于多肽诸如纤连蛋白III型(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。术语“scFv”是指融合蛋白，其包含至少一个包含轻链可变区的抗原结合片段和至少一个包含重链可变区的抗原结合片段，其中轻链可变区和重链可变区例如经由合成接头(例如，短的柔性多肽接头)连续地连接并且能够作为单链多肽表达，并且其中scFv保留了其源自的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则scFv可以例如相对于多肽的N末端和C末端以任何顺序具有VL和VH可变区，scFv可以包含VL-接头-VH或者可以包含VH-接头-VL。抗原结合片段是使用本领域的技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用(例如，结合亲和力、内化)来筛选结合片段。例如，抗原结合片段可以通过切割完整蛋白质(例如，通过蛋白酶或化学切割)来制备。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指赋予抗原特异性和结合亲和力的抗体可变区内的氨基酸序列。例如，通常，每个重链可变区中存在三个CDR(例如HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任何一种来确定，这些方案包括描述于以下的那些：Kabat等人(1991)“Sequences of Proteins of Immunological Interest[具有免疫学重要性的蛋白序列]”,第5版,Public Health Service[美国国立卫生研究院],NationalInstitutes of Health[公共卫生事业部],Bethesda,MD[马里兰州贝塞斯达市](“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)J Mol Biol.[分子生物学杂志]273(4):927-48(“Chothia”编号方案)；ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc(2001)Nucleic Acids Res.[核酸研究]29(1):207-9；Lefranc等人.(2003)Dev Comp Immunol.[发育与比较免疫学]27(1):55-77)(“IMGT”编号方案)；或其组合。在针对给定CDR区(例如，HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2或LC CDR3)的组合Kabat和Chothia编号方案中，在一些实施例中，这些CDR对应于被定义为Kabat CDR的一部分的氨基酸残基，以及被定义为Chothia CDR的一部分的氨基酸残基。如本文所用，根据“Chothia”编号方案定义的CDR有时也被称为“高变环”。
在一些实施例中，根据Kabat，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)(例如，在位置35后的一个或多个插入)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)(例如，在位置27后的一个或多个插入)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在一些实施例中，根据Chothia，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)(例如，在位置31后的一个或多个插入)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)(例如，在位置30后的一个或多个插入)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过结合Kabat和Chothia的CDR定义，在一些实施例中，CDR包含例如人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)或由其组成。在一些实施例中，根据IMGT，VH中的CDR氨基酸残基编号为大约26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，并且VL中的CDR氨基酸残基编号为大约27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。在一些实施例中，根据IMGT，可以使用程序IMGT/DomainGap Align来确定抗体的CDR区。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可以少量存在的可能的天然存在的突变以外，包含该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体对单个抗原表位具有高度特异性。相反，常规的(多克隆)抗体制剂典型地包括针对不同表位(或对不同表位具有特异性)的多种抗体。修饰语“单克隆”表明抗体的特性是由基本上均质的抗体群体获得，并且不应理解为需要通过任何具体方法产生抗体。例如，根据本披露使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等人(1975)Nature[自然]256:495首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)制备。例如，单克隆抗体也可以使用在Clackson等人(1991)Nature[自然]352:624-8和Marks等人(1991)JMol Biol.[分子生物学杂志]222:581-97中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。该术语还包括具有单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物展示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
本文所述的单克隆抗体可以是非人的、人的或人源化的。该术语具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们特异性结合靶抗原和/或表现出所需的生物活性即可。
如本文所用，术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。该术语包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区两者均源自人来源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也源自此类人序列，例如人种系序列，或人种系序列的突变形式或含有源自人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如，如Knappik等人((2000)J Mol Biol.[分子生物学杂志]296(1):57-86)所述。免疫球蛋白可变结构域(例如，CDR)的结构和位置可以使用熟知的编号方案(例如，Kabat编号方案、Chothia编号方案、或Kabat和Chothia的组合和/或ImMunoGenTics(IMGT)编号)来定义。本发明的人抗体可以包括不是由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机诱变或位点特异性诱变、或通过在体内体细胞突变、或保守取代来引入突变以促进稳定性或生产)。然而，如本文所用，术语“人抗体”并非旨在包含以下抗体，在这些抗体中源自另一个哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植于人类构架区序列上。
如本文所用，术语“重组人抗体”是指通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体，诸如从动物(例如，小鼠)(该动物对于人免疫球蛋白是转基因的或转染色体的)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；从转化以表达人抗体的宿主细胞中分离的抗体(例如，来自转染瘤中)；从重组，组合的人抗体文库中分离的抗体；以及通过任何其他方式(涉及将全部或部分的人免疫球蛋白基因、序列剪接到其他DNA序列)制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有可变区，其中框架区和CDR区源自人种系免疫球蛋白序列。然而，在一些实施例中，可以对此类重组人抗体进行体外诱变(或，当使用转基因人Ig序列的动物时，进行体内体细胞诱变)，并因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是源自人种系VH和VL序列的和与其相关的序列，这些序列在体内可能不天然存在于人抗体种系库中。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两个或更多个物种的抗体。在一些情况下，重链和轻链两者的可变区对应于具有所需特异性、亲和力和活性的源自一个物种的抗体的可变区，而恒定区与源自另一物种(例如，人)的抗体同源，以使后一物种中的免疫应答最小化。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指含有来自非人(例如，鼠)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。此类抗体是一种嵌合抗体，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体将包含基本上所有如下项：至少一个(典型地两个)可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，且所有或基本上所有框架(FR)区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。人源化抗体可以进一步通过在Fv框架区和/或替代的非人残基内进行残基取代来修饰，以改善和优化抗体特异性、亲和力和/或活性。
如本文所用，术语“Fc区”是指包含抗体的恒定结构域的CH3、CH2和铰链区的至少一部分的多肽。任选地，Fc区可以包括存在于一些抗体种类中的CH4结构域。Fc区可以包含抗体的恒定结构域的整个铰链区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含抗体的Fc区和CH1区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含抗体的Fc区CH3区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含来自抗体的恒定结构域的Fc区、CH1区和κ/λ区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含恒定区，例如重链恒定区和/或轻链恒定区。在一些实施例中，与野生型恒定区相比，这种恒定区是经修饰的。即，多肽可以包含对三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)中的一个或多个和/或对轻链恒定区结构域(CL)的改变或修饰。示例性修饰包括在一个或多个结构域中添加、缺失或取代一个或多个氨基酸。可以包括此类改变，以优化效应子功能、半衰期等。
如本文所用，关于抗体或抗原结合片段的“内化”是指能够在与细胞结合后被摄取穿过细胞的脂质双层膜进入内部隔室(即，“内化”)，优选进入细胞中的降解隔室的抗体或抗原结合片段。例如，内化型抗HER2抗体是能够在与细胞膜上的HER2结合后被摄取到细胞中的抗体。在一些实施例中，本文披露的ADC中使用的抗体或抗原结合片段靶向细胞表面抗原(例如，PCAD、HER2、CD48、CD74、EphA2、TROP2、B7-H3或5T4)并且是内化抗体或内化抗原结合片段(即，ADC在抗原结合后转移穿过细胞膜)。在一些实施例中，内化抗体或抗原结合片段结合细胞表面上的受体。靶向细胞膜上的受体的内化抗体或内化抗原结合片段可以诱导受体介导的内吞作用。在一些实施例中，内化抗体或内化抗原结合片段经由受体介导的内吞作用被摄取到细胞中。
如本文所用，关于抗体或抗原结合片段的“非内化”是指在与细胞结合后保留在细胞表面的抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，本文披露的ADC中使用的抗体或抗原结合片段靶向细胞表面抗原并且是非内化抗体或非内化抗原结合片段(即，ADC保留在细胞表面并且在抗原结合后不转移穿过细胞膜)。在一些实施例中，非内化抗体或抗原结合片段结合非内化受体或其他细胞表面抗原。示例性非内化细胞表面抗原包括但不限于CA125和CEA，并且结合非内化抗原靶标的抗体也是本领域已知的(参见例如Bast等人(1981)J ClinInvest.[临床研究杂志]68(5):1331-7；Scholler和Urban(2007)Biomark Med.[医学生物标志物]1(4):513-23；以及Boudousq等人(2013)PLoS One[公共科学图书馆·综合]8(7):e69613)。
如本文所用，术语“EPH受体A2”或“EphA2”是指人EphA2的任何天然形式(也称为肝配蛋白A型受体2)。该术语涵盖全长人EphA2(例如，NCBI参考序列：NP_004422.2；SEQ IDNO:337)，以及可由细胞加工产生的任何形式的人EphA2。该术语还涵盖人EphA2的功能变体或片段，包括但不限于剪接变体、等位基因变体以及保留人EphA2的一种或多种生物功能的异构体(即，涵盖变体和片段，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白)。EphA2可以从人分离，或者可以重组或通过合成方法产生。
如本文所用，术语“抗EphA2抗体”或“结合EphA2的抗体”是指结合(例如，特异性结合)EphA2的任何形式的抗体或其抗原结合片段。该术语涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和生物功能性抗原结合片段，只要它们结合(例如，特异性结合)EphA2即可。WO 2007/030642提供了示例性EphA2结合序列，包括示例性抗EphA2抗体序列，并通过援引并入本文。在一些实施例中，本文披露的ADC中使用的抗EphA2抗体是内化抗体或内化抗原结合片段。1C1(WO 2007/030642)是示例性抗EphA2抗体。
如本文所用，术语“P-钙粘蛋白”或“PCAD”是指人PCAD的任何天然形式(也称为1型钙粘蛋白3或CDH3)。该术语涵盖全长人PCAD(例如，UniProt参考序列：P22223；SEQ ID NO:74)，以及可由细胞加工产生的任何形式的人PCAD。该术语还涵盖人PCAD的功能变体或片段，包括但不限于剪接变体、等位基因变体以及保留人PCAD的一种或多种生物功能的异构体(即，涵盖变体和片段，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白)。PCAD可以从人分离，或者可以重组或通过合成方法产生。
如本文所用，术语“抗PCAD抗体”或“结合PCAD的抗体”是指结合(例如，特异性结合)PCAD的任何形式的抗体或其抗原结合片段。该术语涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和生物功能性抗原结合片段，只要它们结合(例如，特异性结合)PCAD即可。WO 2016/203432提供了示例性PCAD结合序列，包括示例性抗PCAD抗体序列，并通过援引并入本文。在一些实施例中，本文披露的ADC中使用的抗PCAD抗体是内化抗体或内化抗原结合片段。NOV169N31Q(WO 2016/203432)是示例性抗PCAD抗体。
如本文所用，术语“人表皮生长因子受体2”、“HER2”或“HER2/NEU”是指人HER2的任何天然形式。该术语涵盖全长人HER2(例如，UniProt参考序列：P04626；SEQ ID NO:75)，以及可由细胞加工产生的任何形式的人HER2。该术语还涵盖人HER2的功能变体或片段，包括但不限于剪接变体、等位基因变体以及保留人HER2的一种或多种生物功能的异构体(即，涵盖变体和片段，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白)。HER2可以从人分离，或者可以重组或通过合成方法产生。
如本文所用，术语“抗HER2抗体”或“结合HER2的抗体”是指结合(例如，特异性结合)HER2的任何形式的抗体或其抗原结合片段。该术语涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和生物功能性抗原结合片段，只要它们结合(例如，特异性结合)HER2即可。美国专利号5,821,337和6,870,034提供了示例性HER2结合序列，包括示例性抗HER2抗体序列，并通过援引并入本文。在一些实施例中，本文披露的ADC中使用的抗HER2抗体是内化抗体或内化抗原结合片段。曲妥珠单抗(美国专利号5,821,337和第6,870,034；还参见Molina等人(2001)Cancer Res.[癌症研究]61(12):4744-9)是示例性抗HER2抗体。
如本文所用，术语“分化簇48”或“CD48”是指人CD48的任何天然形式(也称为B-淋巴细胞活化标记物(BLAST-1)或信号传导淋巴细胞活化分子2(SLAMF2))。该术语涵盖全长人CD48(例如，UniProt参考序列：P09326；SEQ ID NO:77)，以及可由细胞加工产生的任何形式的人CD48。该术语还涵盖人CD48的功能变体或片段，包括但不限于剪接变体、等位基因变体以及保留人CD48的一种或多种生物功能的异构体(即，涵盖变体和片段，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白)。CD48可以从人分离，或者可以重组或通过合成方法产生。
如本文所用，术语“抗CD48抗体”或“结合CD48的抗体”是指结合(例如，特异性结合)CD48的任何形式的抗体或其抗原结合片段。该术语涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和生物功能性抗原结合片段，只要它们结合(例如，特异性结合)CD48即可。国际专利申请号PCT/IB2021/060871、PCT/US2021/060560和PCT/US2021/060620提供了示例性CD48结合序列，包括示例性抗CD48抗体序列，并通过援引并入本文。在一些实施例中，本文披露的ADC中使用的抗CD48抗体是内化抗体或内化抗原结合片段。SGN-CD48A(MEM/MEM102)和NY920是示例性抗CD48抗体。
如本文所用，术语“分化簇74”或“CD74”是指人CD74的任何天然形式(也称为HLAII类组织相容性抗原γ链或HLA-DR抗原相关不变链)。该术语涵盖全长人CD74(例如，NCBI参考序列：NP_001020330.1；SEQ ID NO:140)，以及可由细胞加工产生的任何形式的人CD74。该术语还涵盖人CD74的功能变体或片段，包括但不限于剪接变体、等位基因变体以及保留人CD74的一种或多种生物功能的异构体(即，涵盖变体和片段，除非上下文表明该术语仅用于指野生型蛋白)。CD74可以从人分离，或者可以重组或通过合成方法产生。
如本文所用，术语“抗CD74抗体”或“结合CD74的抗体”是指结合(例如，特异性结合)CD74的任何形式的抗体或其抗原结合片段。该术语涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和生物功能性抗原结合片段，只要它们结合(例如，特异性结合)CD74即可。WO2020/236817提供了示例性CD74结合序列，包括示例性抗CD74抗体序列，并通过援引并入本文。在一些实施例中，本文披露的ADC中使用的抗CD74抗体是内化抗体或内化抗原结合片段。米拉组单抗(WO 2003/074567)和VHmil x VK1aNQ(WO 2020/236817)是示例性抗CD74抗体。
如本文所用，术语“结合特异性”是指各个抗体或抗原结合片段优先与一种抗原决定簇而不是不同抗原决定簇反应的能力。特异性程度表示抗体或片段优先结合一种抗原决定簇而不是不同抗原决定簇的程度。此外，如本文所用，术语“特异性”、“特异性结合(specifically binds)”和“特异性结合(binds specifically)”是指在蛋白质和其他生物制剂的异质群体中，抗体或抗原结合片段(例如，抗HER2抗体、抗CD48抗体、抗CD74抗体、抗EphA2抗体、抗PCAD抗体)与靶抗原(例如，PCAD、HER2、CD48、CD74、EphA2、TROP2、B7-H3或5T4)之间的结合反应。通过在一组给定的条件下比较与适当抗原的结合和与无关抗原或抗原混合物的结合，可以测试抗体的结合特异性。如果抗体以不相关的抗原或抗原混合物的至少2、5、7、10或更多倍的亲和力结合适当的抗原，则认为是特异性的。“特异性抗体”或“靶标特异性抗体”是仅结合靶抗原(例如PCAD、HER2、CD48、CD74、EphA2、TROP2、B7-H3或5T4)但不结合(或表现出最小结合)其他抗原的抗体。在一些实施例中，特异性结合靶抗原(例如，PCAD、HER2、CD48、CD74、EphA2、TROP2、B7-H3或5T4)的抗体或抗原结合片段具有小于1×10-6M、小于1×10-7M、小于1×10-8M、小于1×10-9M、小于1×10-10M、小于1×10-11M、小于1×10-12M或小于1×10-13M的KD。在一些实施例中，KD是1pM至500pM。在一些实施例中，KD在500pM至1μM、1μM至100nM或100mM至10nM之间。
如本文所用，术语“亲和力”是指抗体与抗原之间在单个抗原位点处相互作用的强度。不受理论的约束，在每个抗原结合位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力在许多位点处与抗原相互作用；典型地，相互作用越多，亲和力越强。抗体的结合亲和力是在抗原决定簇与抗体的结合位点之间运行的吸引力和排斥力的总和。
术语“kon”或“ka”是指抗体与抗原缔合以形成抗体/抗原复合物的结合速率常数。该速率可以使用标准测定(诸如表面等离子体共振、生物膜干涉法或ELISA测定)来确定。
术语“koff”或“kd”是指抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。该速率可以使用标准测定(诸如表面等离子体共振、生物膜干涉法或ELISA测定)来确定。
术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。KD由ka/kd计算。该速率可以使用标准测定(诸如表面等离子体共振、生物膜干涉法或ELISA测定)来确定。
术语“表位”是指抗原中能够被抗体(或抗原结合片段)识别和特异性结合的部分。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(诸如氨基酸或碳水化合物或糖侧链)组成，并且可以具有特定的三维结构特性以及特定的电荷特性。当抗原是多肽时，表位可以由连续氨基酸或通过多肽的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。表位可以是“线性的”或“构象的”。构象表位和线性表位差别在于：在变性溶剂的存在下，对构象表位(而不是非构象表位)的结合丧失。抗体(或抗原结合片段)结合的表位可以使用本领域已知的任何表位作图技术来鉴定，包括通过抗原-抗体复合物的直接可视化来鉴定表位的X射线晶体学，以及监测抗体与抗原的片段或突变变异的结合，或监测抗体和抗原的不同部分的溶剂可及性。用于对抗体表位进行作图的示例性策略包括但不限于基于阵列的寡肽扫描、有限的蛋白水解、定点诱变、高通量诱变作图、氢-氘交换和质谱法(参见例如Gershoni等人(2007)BioDrugs[生物药物]21:145-56；以及Hager-Braun和Tomer(2005)Expert Rev Proteomics[蛋白质组学专家评论]2:745-56)。
竞争性结合和表位分箱也可用于确定共享相同或重叠表位的抗体。可以使用交叉阻断测定来评价竞争性结合，诸如“Antibodies,A Laboratory Manual[抗体，实验室手册],”Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室出版社],Harlow和Lanee(1988年第1版,2014年第2版)中描述的测定。在一些实施例中，当测试抗体或结合蛋白在交叉阻断测定中将参考抗体或结合蛋白与靶抗原诸如PCAD、HER2、CD48、CD74、EphA2、TROP2、B7-H3或5T4(例如，包含选自表3-5中鉴定的那些的CDR和/或可变结构域的结合蛋白)的结合减少至少约50％(例如，50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％或更多，或其间的任何百分比)时，鉴定竞争性结合，和/或反之亦然。在一些实施例中，竞争性结合可以是由于共享或相似(例如，部分重叠)的表位，或由于其中抗体或结合蛋白在邻近表位处结合的空间位阻所造成的(参见例如Tzartos,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法](Morris编辑(1998),第66卷,第55-66页))。在一些实施例中，竞争性结合可用于分选共享相似表位的结合蛋白组。例如，竞争结合的结合蛋白可以被“分箱”为具有重叠或邻近表位的结合蛋白组，而不竞争的结合蛋白被放置在不具有重叠或邻近表位的单独的结合蛋白组中。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，以指代氨基酸残基的聚合物。这些术语涵盖包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。这些术语包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。这些术语还包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。除非另外说明，否则特定的多肽序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体。
“重组”蛋白是指使用重组技术(例如，通过表达重组核酸)制备的蛋白(例如，抗体)。
“分离的”蛋白质是指不伴随至少一些在其天然状态下与其正常缔合的材料的蛋白质。例如，不分离存在于活生物体中的天然存在的多核苷酸或多肽，而是分离从活生物体中的一些或所有共存材料中分出的相同多核苷酸或多肽。该定义包括在本领域已知的多种生物体和/或宿主细胞中产生抗体。
如本文所用，术语“分离的抗体”是已鉴定并与其来源环境中的一种或多种(例如大部分)组分(按重量计)分开的抗体，例如与杂交瘤细胞培养物或用于其生产的不同细胞培养物的组分分开。在一些实施例中，进行分开使得其充分去除原本可能干扰抗体对所需应用(例如，针对治疗用途)的适合性的组分。用于制备分离的抗体的方法是本领域已知的，并且包括但不限于蛋白A色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、病毒保留过滤和超滤。
如本文所用，术语“变体”是指分别不同于参考核酸序列或氨基酸序列但保留参考序列的一种或多种生物学性质的核酸序列或氨基酸序列。变体可以相对于参考序列含有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入(或密码子的对应取代、缺失和/或插入)。核酸变体的变化可能不会改变由参考核酸序列编码的肽的氨基酸序列，或者可能导致氨基酸取代、添加、缺失、融合和/或截短。在一些实施例中，本文披露的核酸变体编码与由未经修饰的核酸编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或编码保留未经修饰的氨基酸序列的一种或多种功能性质的经修饰的氨基酸序列。肽变体的序列的变化典型地是有限的或保守的，使得未经修饰的肽和变体的序列总体上是非常相似的，并且在许多区是相同的。在一些实施例中，肽变体保留未经修饰的肽序列的一种或多种功能性质。变体和未经修饰的肽的氨基酸序列的不同之处可以为任何组合的一个或多个取代、添加、缺失。
核酸或肽的变体可以是天然存在的变体或未知天然存在的变体。核酸和肽的变体可以通过诱变技术、通过直接合成或通过本领域已知的其他技术制备。变体不一定需要对参考序列进行物理操作。只要序列与参考序列相比含有不同的核酸或氨基酸，无论其合成方式如何，都将其视为“变体”。在一些实施例中，与参考序列相比，变体具有高序列同一性(即，60％核酸或氨基酸序列同一性或更高)。在一些实施例中，肽变体涵盖具有氨基酸取代、缺失和/或插入的多肽，只要该多肽与参考序列或与参考序列的对应区段(例如，功能片段)具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％氨基酸序列同一性，例如，还保留参考序列的一种或多种功能的那些变体。在一些实施例中，核酸变体涵盖具有氨基酸取代、缺失和/或插入的多核苷酸，只要该多核苷酸与参考序列或与参考序列的对应区段(例如，功能片段)具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％核酸序列同一性。
术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。对于核酸序列，“经保守修饰的变体”是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置处，该密码子可以改变为任何所述的对应密码子而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰的变异中的一个种类。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员应认识到，核酸中的每个密码子(除了通常是甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常是色氨酸的唯一密码子的TGG)均可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，在每个所述序列中均隐含了编码多肽的核酸的每一种沉默变异。对于多肽序列，经保守修饰的变体包括对多肽序列的单个取代、缺失或添加，从而使某个氨基酸取代为化学上类似的氨基酸。提供在功能上相似的氨基酸的保守取代在本领域是熟知的。
如本文所用，术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变例如含有氨基酸序列的抗体或抗原结合片段的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域中已知的标准技术(诸如例如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入抗体或抗原结合片段中。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，在一些实施例中，抗体内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链的家族的其他氨基酸残基替代，并且可以使用本文描述的功能测定法测试改变的抗体。
如本文所用，术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子(诸如两个DNA分子或两个RNA分子)之间或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当这两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配位置或同源位置的数目的直接函数。例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是匹配的或同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。
可以通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性”的百分比，其中比较窗口中的氨基酸序列的片段可以包含与参考序列(其不包含添加或缺失)相比的添加或缺失(例如，空位或突出端)以使两个序列最佳比对。可以通过以下方式计算百分比：确定在这两个序列中出现相同氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并且将结果乘以100，以产生序列同一性的百分比。输出是主题序列相对于查询序列的百分比同一性。将空位的数量和每个空位的长度考虑在内，两个序列之间的同一性百分比是这些序列共有的相同位置的数量的函数，需要引入这些空位以进行两个序列的最佳比对。通常，本文披露的蛋白质及其变体(包括靶抗原(诸如PCAD、HER2、CD48、CD74、EphA2、TROP2、B7-H3或5T4)的变体和抗体可变结构域(包括单个变体CDR)的变体)之间的氨基酸同一性或同源性相对于本文描述的序列为至少80％，例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、几乎100％或100％的同一性或同源性。
两个序列之间的序列比较和百分比同一性确定可以使用数学算法来完成。在一些实施例中，使用Needleman和Wunsch((1970)J Mol Biol.[分子生物学杂志]48:444-53)算法(该算法已并入GCG软件包中的GAP程序中)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6、或4的空位权重和1、2、3、4、5、或6的长度权重来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。在一些实施例中，使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。一组示例性参数是具有空位罚分12、空位延伸罚分4、以及移码空位罚分5的Blosum 62评分矩阵。也可使用已经整合到ALIGN程序(版本2.0)中的Meyers和Miller((1989)CABIOS[生物科学中的计算机应用]4:11-17)的算法，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4确定两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性。
术语“药剂”在本文中用于指化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子、由生物材料制成的提取物或其两者或更多者的组合。术语“治疗剂”或“药物”或“药学活性药物”等是指能够调节生物过程和/或具有生物活性的药剂。“治疗剂”或“药物”或“药学活性药物”可以是化学治疗剂或抗癌剂。
如果存在所需的反应性官能团，则术语“药物部分”、“D”或“药物”进一步地是指美国官方药典(official United States Pharmacopeia)、美国官方顺势疗法药典(officialHomeopathic Pharmacopeia of the United States)、或官方国家处方集(officialNational Formulary)认定为药物的化学品或其任何补充剂。示例性药物在医师案头参考(Physician's Desk Reference，PDR)和由美国食品和药物管理局(FDA)维护的橙皮书中提供。
在一些实施例中，药物部分(D)是澳瑞他汀。举例说明的澳瑞他汀药物包括但不限于以下：
其中*表示与ADC的其余部分的附接点。
这些化合物的非共轭形式是
其他示例性澳瑞他汀药物包括但不限于以下：
在一些实施例中，药物部分(D)是拓扑异构酶1抑制剂。举例说明的拓扑异构酶1抑制剂包括但不限于以下：
然而，接头技术广泛适用于广泛的药物部分。在一个实施例中，药物部分(D)可以是细胞毒性药物、细胞生长抑制药物或免疫抑制药物。此类细胞毒性药物或免疫抑制药物包括，例如，抗微管蛋白剂、微管蛋白抑制剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢剂、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。此类细胞毒性药物的实例包括，例如，澳瑞他汀、喜树碱、倍癌霉素、依托泊苷、美登素和类美登素、紫杉烷、苯二氮类或含苯二氮类药物(例如，吡咯并[1,4]-苯二氮类(PBD)、吲哚并苯二氮类和噁唑烷并苯二氮类)和长春花生物碱。在实施例中，药物部分是靶向抗癌化合物。
在一个实施例中，药物部分(D)是Eg5抑制剂、V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、核输出蛋白CRM1抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DHFR抑制剂或促凋亡剂，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物。
在药物部分为疏水性的实施例中，本发明的效果可能更加显著。因此，本发明的药物部分优选地是疏水的，其SlogP值为1.5或更大、2.0或更大、或2.5或更大。在一些实施例中，用于本发明的药物具有(a)从约1.5、约2、或2.5至约7，(b)从约1.5、约2、或2.5至约6，(c)从约1.5、约2或约2.5至约5，(d)从约1.5、约2、或2.5至约4，或(e)从约1.5、约2或约2.5至约3的SlogP值。
疏水性可以使用SlogP来测量。SlogP定义为辛醇/水分配系数(包括隐式氢)的对数，并且可以使用来自化学计算集团的MOETM程序计算(使用Wildman,25S.A.,Crippen,G.M.；Prediction of Physiochemical Parameters by Atomic Contributions[通过原子贡献预测物理化学参数]；J.Chern.lnf Comput.Sci.[化学信息计算科学杂志]39第5期(1999)868-873计算SlogP值)。
术语“化学治疗剂”或“抗癌剂”在本文中用于指在治疗癌症方面有效的所有药剂(无论作用机制如何)。抑制转移或血管生成通常是化学治疗剂的性质。化学治疗剂包括抗体、生物分子和小分子。化学治疗剂可以是细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。术语“细胞生长抑制剂”是指抑制或阻碍细胞生长和/或细胞增殖的药剂。术语“细胞毒性剂”是指主要通过干扰细胞的表达活性和/或功能而引起细胞死亡的物质。
如本文所用，术语“BH3模拟物”是指能够破坏Bcl-2家族的促凋亡和抗凋亡成员之间的相互作用的药剂，并且是细胞凋亡的有效诱导剂。示例性BH3模拟物包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w和Mcl-1的抑制剂。
如本文所用，术语“抑制(inhibit或inhibition或inhibiting)”意指将生物活性或过程降低可测量的量，并且可以包括但不要求完全防止或抑制。
如本文所用，术语“癌症”是指存在具有致癌细胞的典型特性(诸如增殖失控、永生性、转移潜能、快速生长和增殖速率)和/或某些形态特征的细胞。通常，癌细胞可以呈肿瘤或肿块的形式，但此类细胞可以单独存在于受试者体内，或者可以作为独立细胞(诸如白血病或淋巴瘤细胞)在血流中循环。术语“癌症”包括癌症和癌症转移的所有类型，包括血液癌症、实体瘤、肉瘤、癌以及其他实体和非实体肿瘤癌症。血液癌症可以包括B细胞恶性肿瘤，血癌(白血病)、浆细胞癌(骨髓癌，例如，多发性骨髓瘤)或淋巴结癌(淋巴瘤)。示例性B细胞恶性肿瘤包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤。白血病可以包括急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性髓单核细胞性白血病(CMML)、急性单核细胞性白血病(AMoL)等。术语“急性成淋巴细胞性白血病”和“急性淋巴细胞性白血病”可互换使用来描述ALL。淋巴瘤可包括霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤等。其他血液癌症可以包括骨髓增生异常综合征(MDS)。实体瘤可以包括癌，诸如腺癌(例如乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌)、结肠癌或结肠直肠癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胆管癌、胶质瘤、黑色素瘤等。在一些实施例中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性成淋巴细胞性白血病在内的成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施例中，癌症是淋巴瘤或胃癌。
如本文所用，术语“肿瘤”是指由良性或恶性的过度细胞生长或增殖导致的任何组织块，包括癌前病变。在一些实施例中，肿瘤是乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌、头颈癌或脾癌。在一些实施例中，肿瘤症是胃癌。
术语“肿瘤细胞”和“瘤细胞”在本文中可以互换地使用并且是指源自肿瘤或癌症的单个细胞或总细胞群体，包括非致瘤细胞和癌症干细胞。术语“肿瘤细胞”和“瘤细胞”仅当指那些缺乏更新和分化能力的细胞时，将由术语“非致瘤”修饰以区分那些细胞和癌干细胞。
如本文所用，术语“靶标阴性”、“靶抗原阴性”或“抗原阴性”是指细胞或组织不存在靶抗原表达。术语“靶标阳性”、“靶抗原阳性”或“抗原阳性”是指存在靶抗原表达。例如，不表达靶抗原的细胞或细胞系可以被描述为靶标阴性，而表达靶抗原的细胞或细胞系可以被描述为靶标阳性。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，以指代需要治疗的任何人或非人动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如，哺乳动物和非哺乳动物)，诸如任何哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括人、黑猩猩、猿、猴、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔、狗、猫、大鼠、小鼠和豚鼠。非哺乳动物的非限制性实例包括鸟类和鱼类。在一些实施例中，受试者是人。
如本文所用，术语“需要治疗的受试者”是指在生物学、医学或生活质量方面将受益于治疗(例如，用本文所述的任何一种或多种示例性ADC化合物进行的治疗)的受试者。
如本文所用，术语“治疗(treat或treating或treatment)”是指疾病、障碍或病症的任何后果的任何改善，诸如延长生存期、降低发病率和/或减轻由替代性治疗方式引起的副作用。在一些实施例中，治疗包括延迟或改善疾病、障碍或病症(即，减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在一些实施例中，治疗包括延迟、缓解或改善疾病、障碍或病症的至少一个物理参数，包括患者可能无法辨别的那些。在一些实施例中，治疗包括在身体上(例如，可辨别症状的稳定)、生理上(例如，物理参数的稳定)亦或在这两个方面调节疾病、障碍或病症。在一些实施例中，治疗包括向受试者(例如，患者)施用所述ADC化合物，以获得本文枚举的治疗益处。治疗可以是治疗、治愈、缓解、延迟、预防、解除、改变、补救、减轻、缓和、改善或影响疾病、障碍或病症(例如，癌症)，疾病、障碍或病症(例如，癌症)的症状或对疾病、障碍或病症(例如，癌症)的易感性。在一些实施例中，除了治疗患有疾病、障碍或病症的受试者之外，还可以预防性地提供本文披露的组合物，以预防该疾病、障碍或病症或降低患该疾病、障碍或病症的可能性。
如本文所用，“药物组合物”是指组合物(例如ADC化合物或组合物)的制剂，以及适于施用于受试者的至少一种其他(和任选地多于一种其他)组分，诸如药学上可接受的载剂、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂。本文提供的药物组合物的形式允许施用，并随后提供活性成分的预期生物活性和/或实现治疗效果。本文提供的药物组合物优选地不含对将施用调配物的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
如本文所用，可互换使用的术语“药学上可接受的载剂”和“生理学上可接受的载剂”是指不会对受试者造成明显刺激并且不会消除所施用的ADC化合物或组合物和/或组合物中任何另外的治疗剂的生物活性和性质的载剂或稀释剂。药学上可接受的载剂可增强或稳定该组合物，或可用于促进组合物的制备。药学上可接受的载剂可以包括溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等以及它们的组合，如本领域技术人员已知的(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿制药科学],第18版,Mack Printing Company[麦克印刷公司],1990,第1289-1329页)。除了任何常规载剂与活性成分均不相容的情况外，设想其在治疗或药物组合物中的用途。可以选择载剂以使受试者中的不良副作用最小化，和/或使活性成分的降解最小化。佐剂也可以包含在任何这些调配物中。
如本文所用，术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分施用的惰性物质。用于肠胃外施用的调配物可以例如含有赋形剂，如无菌水或盐水、聚亚烷基二醇(诸如聚乙二醇)、植物油或氢化萘。其他示例性赋形剂包括但不限于碳酸氢钙，磷酸钙，各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒，以及表面活性剂，包括例如聚山梨酯20。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指不消除本发明的化合物的生物活性和性质、且对所施用的受试者不引起显著刺激的盐。此类盐的实例包括但不限于：(a)与无机酸形成的酸加成盐，无机酸例如为盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；以及与有机酸形成的盐，有机酸例如为乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、棕榈酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；和(b)由元素阴离子(诸如氯、溴和碘)形成的盐。参见例如Haynes等人,“Commentary:Occurrence of Pharmaceutically Acceptable Anions and Cationsin the Cambridge Structural Database[评论：剑桥结构数据库中药物可接受的阴离子和阳离子的出现]”,J.Pharmaceutical Sciences[制药科学杂志],第94卷,第10期(2005)，以及Berge等人,“Pharmaceutical Salts[药用盐]”,J.Pharmaceutical Sciences[制药科学杂志],第66卷,第1期(1977)，它们通过援引并入本文。
在一些实施例中，根据其电子电荷的不同，本文所述的抗体-药物缀合物(ADC)、接头、有效载荷和接头-有效载荷可以含有单价阴离子抗衡离子M1-。可以使用任何合适的阴离子抗衡离子。在某些实施例中，单价阴离子抗衡离子是药学上可接受的单价阴离子抗衡离子。在某些实施例中，单价阴离子抗衡离子M1-可选自溴、氯、碘、乙酸根、三氟乙酸根、苯甲酸根、甲磺酸根、甲苯磺酸根、三氟甲磺酸根、甲酸根等。在一些实施例中，单价阴离子抗衡离子M1-是三氟乙酸根或甲酸根。
如本文所用，术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指本文所述的化合物(例如，本文所述的ADC化合物或组合物)实现所需治疗结果(即，降低或抑制酶或蛋白质活性、改善症状、缓解症状或病症、延迟疾病进展、减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、预防转移)的量。在一些实施例中，治疗有效量不诱导或不引起不期望的副作用。在一些实施例中，治疗有效量诱导或引起副作用，但仅是由治疗临床医生就患者的病症而言可接受的那些。在一些实施例中，治疗有效量对于可检测地杀死、减少和/或抑制癌细胞的生长或扩散、肿瘤的大小或数量、和/或癌症的水平、阶段、进展和/或严重程度的其他量度是有效的。该术语还适用于将在靶细胞中诱导特定应答(例如，细胞生长的减少、减缓或抑制)的剂量。可以通过首先施用低剂量然后递增地增加该剂量直至实现所期望的效果来确定治疗有效量。治疗有效量还可以根据预期应用(体外或体内)或本领域普通技术人员可以容易地确定的被治疗的受试者和疾病病症(例如，受试者的体重和年龄、疾病病症的严重程度、施用方式等)而发生变化。具体量可以根据例如特定的药物组合物、受试者及其年龄和现有的健康状况或健康状况的风险、所遵循的给药方案、疾病的严重程度、其是否与其他药剂组合施用、施用时机、其被施用的组织以及承载其的物理递送系统而变化。在癌症的情况下，治疗有效量的ADC可以减少癌细胞的数量、减小肿瘤大小、抑制(例如，减缓或停止)肿瘤转移、抑制(例如，减缓或停止)肿瘤生长和/或缓解一种或多种症状。
如本文所用，术语“预防有效量”或“预防有效剂量”是指本文所披露的化合物(例如，本文所述的ADC化合物或组合物)在必要的剂量和时间段下有效实现所需预防结果的量。典型地，因为预防的剂量是在疾病之前或早期在受试者体内使用的，所以这种预防有效量将小于治疗有效量。在一些实施例中，预防有效量可以防止疾病症状的发作，这些疾病症状包括与癌症相关的症状。
术语“p”或“载药量”或“药物:抗体比率”或“药物与抗体比率”或“DAR”是指每个抗体或抗原结合片段的药物部分的数量，即，载药量，或具有式(1)的ADC中每个抗体或抗原结合片段(Ab)的药物部分的数量。在包含具有式(1)的ADC的多个拷贝的组合物中，“平均p”是指每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数，也称为“平均载药量”。
本披露的抗体-药物缀合物(ADC)化合物包括具有抗癌活性的那些。特别地，ADC化合物包括与药物部分缀合(即，通过接头共价连接)的抗体或抗原结合片段，其中药物部分在未与抗体或抗原结合片段缀合时具有细胞毒性或细胞生长抑制作用。不受理论的约束，通过将药物部分缀合至结合与在肿瘤细胞或癌症中表达相关的抗原的抗体，与单独施用时的药物部分相比，ADC可以提供改善的活性、更好的细胞毒性特异性和/或减少的脱靶杀伤。
因此，在一些实施例中，选择ADC的组分以(i)保留抗体和药物部分单独表现出的一种或多种治疗性质，(ii)维持抗体或抗原结合片段的特异性结合性质；(iii)优化载药量和药物与抗体比率；(iv)允许药物部分经由与抗体或抗原结合片段的稳定附接而递送，例如细胞内递送；(v)保持ADC作为完整缀合物的稳定性，直至转运或递送至靶位点；(vi)在施用之前或之后使ADC的聚集最小化；(vii)允许药物部分在细胞环境中发生切割或其他释放机制后的治疗效果，例如细胞毒性作用；(viii)表现出与单独的抗体和药物部分相当或更好的体内抗癌治疗功效；(ix)使药物部分的脱靶杀伤最小化；和/或(x)表现出期望的药代动力学和药效动力学性质、可配制性和毒理学/免疫学特征。这些性质中的每一个可以提供用于治疗用途的改善的ADC(Ab等人(2015)Mol Cancer Ther.[分子癌症治疗]14:1605-13)。
本披露的ADC化合物可以选择性地将有效剂量的细胞毒性剂或细胞生长抑制剂递送至癌细胞或肿瘤组织。在一些实施例中，ADC的细胞毒性和/或细胞生长抑制活性取决于细胞中的靶抗原表达。在一些实施例中，所披露的ADC在杀死表达靶抗原的癌细胞同时最大限度地减少脱靶杀伤方面特别有效。在一些实施例中，所披露的ADC对不表达靶抗原的癌细胞不表现出细胞毒性和/或细胞生长抑制作用。
示例性表达EphA2的癌症包括但不限于乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、胃部癌、膀胱癌和结肠癌。
示例性表达PCAD的癌症包括但不限于乳腺癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌和黑色素瘤(Vieira和Paredes(2015)Mol Cancer[分子癌症]14:178)。
示例性表达HER2的癌症包括但不限于乳腺癌、胃癌、膀胱癌、尿路上皮细胞癌、食道癌、肺癌(例如，肺腺癌)、子宫癌(例如，子宫浆液性子宫内膜癌)、唾液腺管癌、宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌(English等人(2013)Mol Diagn Ther.[分子诊断与治疗]17:85-99)。
示例性表达CD48的癌症包括但不限于乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌和脾癌。
示例性表达CD74的癌症包括但不限于乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌和脾癌。
在某些方面，本文提供了ADC化合物，其包含通过双接头(L)共价连接至两种药学活性药物(D1和D2)的抗体或其抗原结合片段(Ab)，其中双接头具有连接至抗体的一个附接点和连接至两种药学活性药物的两个附接点，并且其中两种药学活性药物可以相同或不同。在一些实施例中，对于本文提供的ADC化合物，抗体或其抗原结合片段(Ab)靶向癌细胞。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段能够例如以高特异性和高亲和力结合肿瘤相关抗原(例如，CD74、CD48、EphA2、PCAD或HER2)。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段在结合后内化到靶细胞中，例如内化到细胞中的降解隔室中。在一些实施例中，ADC在与靶细胞结合后内化，经历降解，并释放药学活性药物以杀死癌细胞。药学活性药物可以通过酶促作用、水解、氧化或任何其他机制从抗体和/或ADC的接头部分释放。
示例性ADC具有式(1)：
其中Ab＝抗体或抗原结合片段，L＝双接头部分，D1和D2＝药学活性药物，并且a＝每个抗体或抗原结合片段附接的药学活性药物(D1或D2)的数量。
具有式(1)的抗体或抗原结合片段(Ab)在其范围内包括特异性结合细胞上的靶抗原的任何抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，具有式(1)的抗体或抗原结合片段(Ab)在其范围内包括特异性结合癌细胞上的靶抗原的任何抗体或抗原结合片段。抗体或抗原结合片段可以与靶抗原结合，其中解离常数(KD)≤1mM、≤100nM或≤10nM或之间的任何量，如通过例如分析所测量的。在一些实施例中，KD是1pM至500pM。在一些实施例中，KD在500pM至1μM、1μM至100nM或100mM至10nM之间。
在一些实施例中，抗体或抗体结合片段是四链抗体(也称为免疫球蛋白或全长或完整抗体)，包含两条重链和两条轻链。在一些实施例中，抗体或抗体结合片段是免疫球蛋白抗原结合片段。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是保留与靶癌抗原结合的能力和/或提供免疫球蛋白的至少一种功能的免疫球蛋白抗原结合片段。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是内化抗体或其内化抗原结合片段。在一些实施例中，内化抗体或其内化抗原结合片段与在细胞表面表达的靶癌抗原结合且在结合后进入细胞。在一些实施例中，在ADC进入并存在于表达靶癌抗原细胞中之后(即，ADC已经被内化后)，ADC的药物部分从ADC的抗体或抗原结合片段中释放，例如，通过切割、通过降解抗体或抗原结合片段或通过任何其他合适的释放机制。
在一些实施例中，抗体包含介导降低的或没有的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的突变。在一些实施例中，这些突变被称为Fc沉默(Silencing)、Fc沉默(Silent)或Fc沉默(Silenced)突变。在一些实施例中，IgG1恒定区的氨基酸残基L234和L235被取代为A234和A235(也称为“LALA”)。在一些实施例中，IgG1恒定区的氨基酸残基N297被取代为A297(也称为“N297A”)。在一些实施例中，IgG1恒定区的氨基酸残基D265和P329被取代为A265和A329(也称为“DAPA”)。也可以使用其他抗体Fc沉默突变。在一些实施例中，组合使用Fc沉默突变，例如D265A、N297A和P329A(也称为“DANAPA”)。
如本文所述，如果对抗体进行修饰，则进一步用此修饰命名它们。例如，如果抗体中选定的氨基酸已经改变为半胱氨酸(例如根据抗体重链的EU编号的E152C、S375C以促进与接头-药物部分的缀合)，则它们被命名为“CysMab”；如果抗体已经用根据EU编号的IgG1恒定区的Fc沉默突变D265A和P329A进行修饰，则将“DAPA”添加至抗体名称中；或如果抗体已经用根据EU编号的IgG1恒定区的Fc沉默突变D265A、N297A和P329A进行修饰，则将“DANAPA”添加至抗体名称中。
除了示例性抗原靶标之外，本披露的示例性抗体的氨基酸序列示于表D1-D8中。
表D1.举例说明的抗体
表D2.mAb可变区的氨基酸序列
表D2a.对应于HER2迪西妥单抗抗体的可变结构域重链和轻链(VH和VL)氨基酸序列的核苷酸序列
表D3.mAb CDR的氨基酸序列(组合的)
表D4.全长mAb Ig链的氨基酸序列
表D5.全长mAb Ig链的氨基酸序列
表D6.示例性靶抗原氨基酸序列
表D7.示例性抗体序列
表D8.示例性抗体CDR和可变区序列
在一些实施例中，本文披露的ADC的抗体或抗原结合片段可以包含上表所列出的任一组重链和轻链可变结构域或来自上表所列出的任一组重链和轻链可变结构域的一组六个CDR。在一些实施例中，本文披露的ADC的抗体或抗原结合片段可以包含保守修饰的和/或与上表所列的序列同源的氨基酸序列，只要ADC保留与其靶癌抗原结合的能力(例如，KD小于1×10-8M)并且保留一种或多种本文披露的ADC的功能性质(例如，内化能力、与抗原靶标(例如，在肿瘤或其他瘤细胞上表达的抗原)结合的能力等)。
在一些实施例中，本文披露的ADC的抗体或抗原结合片段进一步包含人重链恒定结构域和人轻链恒定结构域或其片段。例如，所述ADC的抗体或抗原结合片段可以包含人IgG重链恒定结构域(诸如IgG1)和人κ或λ轻链恒定结构域。在一些实施例中，所述ADC的抗体或抗原结合片段包含具有人Igκ轻链恒定结构域的人免疫球蛋白G亚型1(IgG1)重链恒定结构域。
在一些实施例中，用于ADC的靶癌症抗原是PCAD。
在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:33组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:34组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:35组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:36组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:37组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:38组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:304组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:305组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:306组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:312组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:313组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:314组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:307组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:308组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:306组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:315组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:25组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:316组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:309组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:277组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:278组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:317组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:313组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:316组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:310组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:308组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:306组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:315组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:25组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:316组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:7至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:8至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:303的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:303的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:311的轻链可变区氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:303至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:311至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段是内化抗体或内化抗原结合片段。在一些实施例中，抗PCAD抗体包含人IgG1重链恒定结构域或经修饰的IgG1重链恒定结构域。在一些实施例中，IgG1重链恒定结构域在对应于根据EU编号系统编号的野生型(未经修饰的)IgG1重链恒定结构域中的152和375的氨基酸位置处包含半胱氨酸残基(C)。在一些实施例中，抗PCAD抗体包含SEQ ID NO:63的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:63至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:64的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:64至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗PCAD抗体包含SEQ ID NO:63的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:64的轻链氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗PCAD抗体具有与SEQID NO:63至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ IDNO:64至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗PCAD抗体是NOV169N31Q(WO 2016/203432)或其抗原结合片段。
在一些实施例中，抗PCAD抗体包含SEQ ID NO:248的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:248至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:250的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:250至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗PCAD抗体包含SEQ ID NO:248的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:250的轻链氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗PCAD抗体具有与SEQ ID NO:248至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:250至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段包含CQY679的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:304)、HCDR2(SEQ ID NO:305)、HCDR3(SEQID NO:306)；LCDR1(SEQ ID NO:312)、LCDR2(SEQ ID NO:313)和LCDR3(SEQ ID NO:314)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段包含CQY679的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:307)、HCDR2(SEQ ID NO:308)、HCDR3(SEQID NO:306)；LCDR1(SEQ ID NO:315)、LCDR2(SEQ ID NO:25)和LCDR3(SEQ ID NO:316)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段包含CQY679的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:309)、HCDR2(SEQ ID NO:277)、HCDR3(SEQID NO:278)；LCDR1(SEQ ID NO:317)、LCDR2(SEQ ID NO:313)和LCDR3(SEQ ID NO:316)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段包含CQY679的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:310)、HCDR2(SEQ ID NO:308)、HCDR3(SEQID NO:306)；LCDR1(SEQ ID NO:315)、LCDR2(SEQ ID NO:25)和LCDR3(SEQ ID NO:316)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗PCAD抗体或其抗原结合片段包含NOV169N31Q的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:33)、HCDR2(SEQ ID NO:34)、HCDR3(SEQ ID NO:35)；LCDR1(SEQ ID NO:36)、LCDR2(SEQ ID NO:37)和LCDR3(SEQ ID NO:38)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，用于ADC的靶癌症抗原是HER2。
在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:39组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:40组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:41组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:42组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:43组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:289组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:290组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:291组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:297组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:298组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:299组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:292组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:40组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:291组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:300组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:301组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:293组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:294组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:295组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:302组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:298组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:39组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:40组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:291组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:300组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:301组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:9的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:10的轻链可变区氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:9至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:10至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:296的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:9的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:296的轻链可变区氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:9至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:296至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段是内化抗体或内化抗原结合片段。在一些实施例中，抗HER2抗体包含人IgG1重链恒定结构域或经修饰的IgG1重链恒定结构域。在一些实施例中，IgG1重链恒定结构域在对应于野生型(未经修饰的)IgG1重链恒定结构域中的297的氨基酸位置处包含谷氨酰胺残基(Q)。在一些实施例中，IgG1重链恒定结构域在对应于野生型(未经修饰的)IgG1重链恒定结构域中的297的氨基酸位置处包含丝氨酸残基(S)。在一些实施例中，IgG1重链恒定结构域在对应于根据EU编号系统编号的野生型(未经修饰的)IgG1重链恒定结构域中的152和375的氨基酸位置处包含半胱氨酸残基(C)。在一些实施例中，抗HER2抗体包含人Igκ轻链恒定结构域或经修饰的Igκ轻链恒定结构域。
在一些实施例中，抗HER2抗体包含SEQ ID NO:65的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:65至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:66至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗HER2抗体包含SEQ ID NO:65的重链氨基酸序列和SEQID NO:66的轻链氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗HER2抗体具有与SEQ ID NO:65至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:66至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗HER2抗体是曲妥珠单抗(美国专利号5,821,337和6,870,034；还参见Molina等人(2001)Cancer Res.[癌症研究]61(12):4744-9)或其抗原结合片段。
在一些实施例中，抗HER2抗体包含SEQ ID NO:245的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:245至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:66至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗HER2抗体包含SEQ ID NO:245的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:66的轻链氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗HER2抗体具有与SEQ ID NO:245至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:66至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段包含曲妥珠单抗的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:39)、HCDR2(SEQ ID NO:40)、HCDR3(SEQ ID NO:41)；LCDR1(SEQ ID NO:42)、LCDR2(SEQ ID NO:43)和LCDR3(SEQ ID NO:44)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段包含曲妥珠单抗的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:289)、HCDR2(SEQ ID NO:290)、HCDR3(SEQ ID NO:291)；LCDR1(SEQ ID NO:297)、LCDR2(SEQ ID NO:298)和LCDR3(SEQ ID NO:299)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段包含曲妥珠单抗的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:292)、HCDR2(SEQ ID NO:40)、HCDR3(SEQ ID NO:291)；LCDR1(SEQ ID NO:300)、LCDR2(SEQ ID NO:301)和LCDR3(SEQ ID NO:44)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段包含曲妥珠单抗的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:293)、HCDR2(SEQ ID NO:294)、HCDR3(SEQ ID NO:295)；LCDR1(SEQ ID NO:302)、LCDR2(SEQ ID NO:298)和LCDR3(SEQ ID NO:44)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗HER2抗体或其抗原结合片段包含曲妥珠单抗的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:39)、HCDR2(SEQ ID NO:40)、HCDR3(SEQ ID NO:291)；LCDR1(SEQ ID NO:300)、LCDR2(SEQ ID NO:301)和LCDR3(SEQ ID NO:44)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，用于ADC的靶癌症抗原是CD48。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:51组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:52组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:53组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:54组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:55组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:56组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:271组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:272组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:273组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:281组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:282组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:283组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:274组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:275组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:273组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:284组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:285组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:286组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:276组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:277组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:278组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:287组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:282组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:286组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:279组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:275组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:273组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:284组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:288组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:286组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:13的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:14的轻链可变区氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:13至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:14至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:270的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:280的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:270的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:280的轻链可变区氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:270至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:280至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段是内化抗体或内化抗原结合片段。在一些实施例中，抗CD48抗体包含人IgG1重链恒定结构域或经修饰的IgG1重链恒定结构域。在一些实施例中，IgG1重链恒定结构域在对应于根据EU编号系统编号的野生型(未经修饰的)IgG1重链恒定结构域中的152和375的氨基酸位置处包含半胱氨酸残基(C)。
在一些实施例中，抗CD48抗体包含SEQ ID NO:69的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:69至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:70的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:70至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体包含SEQ ID NO:69的重链氨基酸序列和SEQID NO:70的轻链氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体具有与SEQ ID NO:69至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:70至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD48抗体是SGN-48A或其抗原结合片段。
在一些实施例中，抗CD48抗体包含SEQ ID NO:240的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:240至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:243的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:243至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体包含SEQ ID NO:240的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:243的轻链氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体具有与SEQ ID NO:240至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:243至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施例中，抗CD48抗体包含SEQ ID NO:242的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:242至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:243的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:243至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体包含SEQ ID NO:242的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:243的轻链氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体具有与SEQ ID NO:242至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:243至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含SGN-CD48A(MEM/MEM102)的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:51)、HCDR2(SEQ ID NO:52)、HCDR3(SEQ ID NO:53)；LCDR1(SEQ ID NO:54)、LCDR2(SEQ ID NO:55)和LCDR3(SEQ IDNO:56)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含NY920的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:271)、HCDR2(SEQ ID NO:272)、HCDR3(SEQ IDNO:273)；LCDR1(SEQ ID NO:281)、LCDR2(SEQ ID NO:282)和LCDR3(SEQ ID NO:283)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含NY920的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:274)、HCDR2(SEQ ID NO:275)、HCDR3(SEQ IDNO:273)；LCDR1(SEQ ID NO:284)、LCDR2(SEQ ID NO:285)和LCDR3(SEQ ID NO:286)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含NY920的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:276)、HCDR2(SEQ ID NO:277)、HCDR3(SEQ IDNO:278)；LCDR1(SEQ ID NO:287)、LCDR2(SEQ ID NO:282)和LCDR3(SEQ ID NO:286)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含NY920的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:279)、HCDR2(SEQ ID NO:275)、HCDR3(SEQ IDNO:273)；LCDR1(SEQ ID NO:284)、LCDR2(SEQ ID NO:288)和LCDR3(SEQ ID NO:286)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，用于ADC的靶抗原是CD74。
在一些实施例中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:118的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:118至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:119的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:119至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:118的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:119的轻链氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:118至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:119至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD74抗体是米拉组单抗或其抗原结合片段。
在一些实施例中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:118的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:118至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:237的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:237至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:118的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:237的轻链氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:119至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:234至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施例中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:236的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:236至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:237的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:237至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:236的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:237的轻链氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:236至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:237至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施例中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:118的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:118至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:239的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:239至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD74抗体包含SEQ ID NO:118的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:239的轻链氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD74抗体具有与SEQ ID NO:118至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:239至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:262的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:153的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:262的轻链可变区氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:153至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:262至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:267的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:153的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:267的轻链可变区氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:153至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:267至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:256组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:257组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:263组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:264组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:265组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:258组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:170组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:266组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:173组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:259组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:260组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:261组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:215组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:264组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:169组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:170组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:266组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:173组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:256组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:257组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:268组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:264组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:265组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:258组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:170组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:172组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:173组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:259组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:260组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:261组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:269组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:264组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:169组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:170组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:172组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:173组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含米拉组单抗的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:256)、HCDR2(SEQ ID NO:257)、HCDR3(SEQ ID NO:171)；LCDR1(SEQ ID NO:263)、LCDR2(SEQ ID NO:264)和LCDR3(SEQ ID NO:265)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含米拉组单抗的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:258)、HCDR2(SEQ ID NO:170)、HCDR3(SEQ ID NO:171)；LCDR1(SEQ ID NO:266)、LCDR2(SEQ ID NO:173)和LCDR3(SEQ ID NO:174)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含米拉组单抗的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:259)、HCDR2(SEQ ID NO:260)、HCDR3(SEQ ID NO:261)；LCDR1(SEQ ID NO:267)、LCDR2(SEQ ID NO:264)和LCDR3(SEQ ID NO:174)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含米拉组单抗的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:169)、HCDR2(SEQ ID NO:170)、HCDR3(SEQ ID NO:171)；LCDR1(SEQ ID NO:266)、LCDR2(SEQ ID NO:173)和LCDR3(SEQ ID NO:174)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含米拉组单抗的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:256)、HCDR2(SEQ ID NO:257)、HCDR3(SEQ ID NO:171)；LCDR1(SEQ ID NO:268)、LCDR2(SEQ ID NO:264)和LCDR3(SEQ ID NO:265)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含米拉组单抗的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:258)、HCDR2(SEQ ID NO:170)、HCDR3(SEQ ID NO:171)；LCDR1(SEQ ID NO:172)、LCDR2(SEQ ID NO:173)和LCDR3(SEQ ID NO:174)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含米拉组单抗的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:259)、HCDR2(SEQ ID NO:260)、HCDR3(SEQ ID NO:261)；LCDR1(SEQ ID NO:269)、LCDR2(SEQ ID NO:264)和LCDR3(SEQ ID NO:174)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗CD74抗体或其抗原结合片段包含米拉组单抗的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:169)、HCDR2(SEQ ID NO:170)、HCDR3(SEQ ID NO:171)；LCDR1(SEQ ID NO:172)、LCDR2(SEQ ID NO:173)和LCDR3(SEQ ID NO:174)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，用于ADC的靶抗原是EphA2。
在一些实施例中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:318的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:329的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:318的重链可变区氨基酸序列和SEQ IDNO:329的轻链可变区氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:318至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:329至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施例中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:252的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:252至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:254的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:254至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗EphA2抗体包含SEQ ID NO:252的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:254的轻链氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗EphA2抗体具有与SEQ ID NO:252至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:254至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施例中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:319组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:320组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:321组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:330组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:331组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:332组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:322组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:323组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:324组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:333组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:334组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:335组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:325组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:326组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:327组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:336组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:331组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:335组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:328组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:323组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:321组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:333组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:334组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:335组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR和三个轻链CDR，其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:319)、HCDR2(SEQ ID NO:320)、HCDR3(SEQ ID NO:321)；LCDR1(SEQ ID NO:330)、LCDR2(SEQ ID NO:331)和LCDR3(SEQ ID NO:332)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR和三个轻链CDR，其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:322)、HCDR2(SEQ ID NO:323)、HCDR3(SEQ ID NO:324)；LCDR1(SEQ ID NO:333)、LCDR2(SEQ ID NO:334)和LCDR3(SEQ ID NO:335)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含米拉组单抗的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:325)、HCDR2(SEQ ID NO:326)、HCDR3(SEQ ID NO:327)；LCDR1(SEQ ID NO:336)、LCDR2(SEQ ID NO:331)和LCDR3(SEQ ID NO:335)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
在一些实施例中，抗EphA2抗体或其抗原结合片段包含米拉组单抗的三个重链CDR和三个轻链CDR，或者其中CDR包含HCDR1(SEQ ID NO:328)、HCDR2(SEQ ID NO:323)、HCDR3(SEQ ID NO:321)；LCDR1(SEQ ID NO:333)、LCDR2(SEQ ID NO:334)和LCDR3(SEQ ID NO:335)的不超过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、缺失或取代。
如果在多肽结构中残基占据类似位置，则称两个或更多个多肽中的残基“对应”。可以通过基于氨基酸序列或结构相似性比对多肽序列来确定两个或更多个多肽中的类似位置。本领域技术人员理解，可能需要在任一序列中引入空位以产生令人满意的比对。
在一些实施例中，氨基酸取代是单个残基取代。插入通常将在约1至约20个氨基酸残基的数量级，但是只要保留生物学功能(例如，与靶抗原结合)，可以耐受相当大的插入。缺失的范围通常是约1至约20个氨基酸残基，但是在一些情况下缺失可以更大。可以使用取代、缺失、插入或其任何组合获得最后的衍生物或变体。通常，这些变化是在几个氨基酸上进行，以最小化分子的改变，特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性最小化。然而，在某些情况下可以耐受更大的改变。根据如表E所描绘的下图进行保守取代。
表E
在ADC中使用变体抗体序列的一些实施例中，变体典型地表现出相同的定性的生物学活性且将引起相同的免疫应答，即使也可以根据需要选择变体以修饰抗原结合蛋白的特性。替代性地，可以设计变体使得抗原结合蛋白的生物活性被改变。例如，可以改变或去除糖基化位点。
各种抗体可以与本文使用的ADC一起使用，以靶向癌细胞。如下所示，本文披露的ADC中的接头-有效载荷与不同的肿瘤抗原靶向抗体一起令人惊讶地有效。在癌细胞上表达但不在健康细胞上表达或在癌细胞上以高于在健康细胞上表达的水平表达的合适抗原是本领域已知的，针对它们的抗体也是如此。本领域技术人员可以制备针对那些抗原靶标的另外的抗体。这些抗体可以与本文披露的接头一起使用。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向PCAD，并且在一些实施例中，靶向PCAD的抗体或抗原结合片段是NOV169N31Q。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向PCAD，并且在一些实施例中，靶向PCAD的抗体或抗原结合片段是CQY679。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向EPhA2，并且在一些实施例中，靶向EphA2的抗体或抗原结合片段是EphA2 1C1。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向CD74，并且在一些实施例中，靶向CD74的抗体或抗原结合片段是米拉组单抗。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向CD74，并且在一些实施例中，靶向CD74的抗体或抗原结合片段是VHmil x VK1aNQ。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向CD48，并且在一些实施例中，靶向CD48的抗体或抗原结合片段是SGN-CD48A(MEM/MEM102)。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向CD48，并且在一些实施例中，靶向CD48的抗体或抗原结合片段是CD48NY920。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向HER2，并且在一些实施例中，靶向HER2的抗体或抗原结合片段是曲妥珠单抗，并且在一些实施例中，靶向HER2的抗体或抗原结合片段是迪西妥单抗。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向TROP2，并且在一些实施例中，靶向TROP2的抗体或抗原结合片段是德达博妥单抗。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向B7-H3，并且在一些实施例中，靶向B7-H3的抗体或抗原结合片段是ABBV-155，并且在一些实施例中，靶向B7-H3的抗体或抗原结合片段是DS-5573a。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向5T4。在一些实施例中，虽然所披露的接头与若干种不同的靶向肿瘤的抗体、靶向PCAD的抗体(诸如NOV169N31Q或CQY679)、靶向EphA2的抗体(诸如EphA2 1C1)、靶向CD48的抗体(诸如CD48 NY920或SGN-CD48A(MEM/MEM102))、靶向CD74的抗体(诸如米拉组单抗或VHmil x VK1aNQ)、靶向HER2的抗体(诸如曲妥珠单抗或迪西妥单抗)、靶向TROP2的抗体(诸如德达博妥单抗)、靶向B7-H3的抗体(诸如ABBV-155或DS-5573a)和靶向5T4的抗体一起令人惊讶地有效，但提供了特别改善的药物:抗体比率、聚集水平、稳定性(即，体外和体内稳定性)、肿瘤靶向(即，细胞毒性、效力)、最小化的脱靶杀伤和/或治疗功效。改善的治疗功效可以在体外或体内测量，并且可以包括降低的肿瘤生长速率和/或减小的肿瘤体积。
在一些实施例中，使用针对相同靶标的替代性抗体或针对不同抗原靶标的抗体，并提供上述有利的功能性质(例如，改善的稳定性、改善的肿瘤靶向性、改善的治疗功效等)中的至少一些。在一些实施例中，当所披露的接头和有效载荷与替代性的靶向HER2、CD74、CD48、EphA2或PCAD的抗体或抗原结合片段缀合时，观察到这些有利的功能性质中的一些或全部。在其他实施例中，当所披露的接头和有效载荷与替代性的靶向HER2的抗体或抗原结合片段缀合时，观察到这些有利的功能性质中的一些或全部。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向HER2。在一些实施例中，靶向HER2的抗体或抗原结合片段是曲妥珠单抗。在其他实施例中，当所披露的接头和药物与替代性的靶向CD74的抗体或抗原结合片段缀合时，观察到这些有利的功能性质中的一些或全部。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向CD74。在一些实施例中，靶向CD74的抗体或抗原结合片段是米拉组单抗。在一些实施例中，靶向CD74的抗体或抗原结合片段是VHmil x VK1aNQ。在其他实施例中，当所披露的接头和药物与替代性的靶向CD48的抗体或抗原结合片段缀合时，观察到这些有利的功能性质中的一些或全部。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向CD48。在一些实施例中，靶向CD48的抗体或抗原结合片段是CD48 NY920或SGN-CD48A(MEM/MEM102)。在其他实施例中，当所披露的接头和药物与替代性的靶向EphA2的抗体或抗原结合片段缀合时，观察到这些有利的功能性质中的一些或全部。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向EphA2。在一些实施例中，靶向EphA2的抗体或抗原结合片段是抗EphA2 1C1。在其他实施例中，当所披露的接头和药物与替代性的靶向PCAD的抗体或抗原结合片段缀合时，观察到这些有利的功能性质中的一些或全部。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向PCAD。在一些实施例中，靶向PCAD的抗体或抗原结合片段是NOV169N31Q或CQY679。在其他实施例中，当所披露的接头和药物与替代性的靶向TROP2的抗体或抗原结合片段缀合时，观察到这些有利的功能性质中的一些或全部。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向TROP2。在一些实施例中，靶向TROP2的抗体或抗原结合片段是德达博妥单抗。在其他实施例中，当所披露的接头和药物与替代性的靶向B7-H3的抗体或抗原结合片段缀合时，观察到这些有利的功能性质中的一些或全部。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向B7-H3。在一些实施例中，靶向B7-H3的抗体或抗原结合片段是ABBV-155或DS-5573a。在其他实施例中，当所披露的接头和药物与替代性的靶向5T4的抗体或抗原结合片段缀合时，观察到这些有利的功能性质中的一些或全部。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段靶向5T4。
接头
在一些实施例中，ADC中的接头以足以治疗有效的方式在细胞外稳定。在一些实施例中，接头在细胞外是稳定的，使得ADC在细胞外条件下存在时(例如，在转运或递送到细胞中之前)保持完整。在ADC的上下文中使用的术语“完整”意味着抗体或抗原结合片段保持与药物部分附接。
如本文所用，在接头或包含接头的ADC的上下文中，“稳定”意味着当ADC在细胞外条件下存在时，ADC的样品中不超过20％、不超过约15％、不超过约10％、不超过约5％、不超过约3％或不超过约1％的接头(或其间的任何百分比)被切割(或在总体ADC的情况下以其他方式不完整)。在一些实施例中，与替代性接头和/或具有替代性接头的ADC相比，本文披露的接头和/或ADC是稳定的。在一些实施例中，本文披露的ADC可以保持完整，持续超过约48小时、超过60小时、超过约72小时、超过约84小时或超过约96小时。
接头在细胞外是否稳定可以例如通过在血浆中包含ADC持续预定时间段(例如，2、4、6、8、16、24、48或72小时)，然后对血浆中存在的游离药物部分的量进行定量来确定。稳定性可以允许ADC有时间定位到靶癌细胞并防止药物部分的过早释放，过早释放可能会通过不加区分地损伤正常组织和癌症组织而降低ADC的治疗指数。在一些实施例中，接头在靶细胞外是稳定的，并且一旦进入细胞内就从ADC释放药物部分，使得药物可以与其靶标结合。因此，有效的接头将：(i)维持抗体或抗原结合片段的特异性结合性质；(ii)允许药物部分经由与抗体或抗原结合片段的稳定附接而递送，例如细胞内递送；(iii)保持稳定和完整，直至ADC已被转运或递送至其靶位点；并且(iv)允许药物部分在发生切割或替代性释放机制后的治疗效果，例如细胞毒性作用。
接头可影响ADC的物理化学性质。由于许多细胞毒性剂本质上是疏水性的，用另外的疏水性部分将它们连接至抗体可导致聚集。ADC聚集体是不溶性的，并且通常限制抗体上可实现的载药量，这可能对ADC的效力产生负面影响。通常，生物制剂的蛋白质聚集体也与增加的免疫原性有关。如下所示，本文披露的接头产生具有低聚集水平和期望的载药量水平的ADC。接头可以是“可切割的”或“不可切割的”(Ducry和Stump(2010)BioconjugateChem.[生物共轭化学]21:5-13)。可切割接头被设计成当经受某些环境因素时(例如，当内化到靶细胞中时)释放药物部分，而不可切割接头通常依赖于抗体或抗原结合片段本身的降解。
如本文所用，术语“烷基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，该基团中不存在不饱和。如本文所用，术语“C1-C6烷基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，该基团中不存在不饱和，具有从一个至六个碳原子，并且通过单键附接到分子的其余部分。“C1-C6烷基”基团的非限制性实例包括甲基(C1烷基)、乙基(C2烷基)、1-甲基乙基(C3烷基)、正丙基(C3烷基)、异丙基(C3烷基)、正丁基(C4烷基)、异丁基(C4烷基)、仲丁基(C4烷基)、叔丁基(C4烷基)、正戊基(C5烷基)、异戊基(C5烷基)、新戊基(C5烷基)和己基(C6烷基)。
如本文所用，术语“烯基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，该基团含有至少一个双键。如本文所用，术语“C2-C6烯基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，该基团含有至少一个双键，具有从两个至六个碳原子，通过单键附接到分子的其余部分。“C2-C6烯基”基团的非限制性实例包括乙烯基(C2烯基)、丙-1-烯基(C3烯基)、丁-1-烯基(C4烯基)、戊-1-烯基(C5烯基)、戊-4-烯基(C5烯基)、戊-1,4-二烯基(C5烯基)、己-1-烯基(C6烯基)、己-2-烯基(C6烯基)、己-3-烯基(C6烯基)、己-1-,4-二烯基(C6烯基)、己-1-,5-二烯基(C6烯基)和己-2-,4-二烯基(C6烯基)。如本文所用，术语“C2-C3烯基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，该基团含有至少一个双键，具有从两个至三个碳原子，通过单键附接到分子的其余部分。“C2-C3烯基”基团的非限制性实例包括乙烯基(C2烯基)和丙-1-烯基(C3烯基)。
如本文所用，术语“亚烷基”是指仅由碳和氢原子组成的二价直链或支链烃链基团，并且该基团中不存在不饱和。如本文所用，术语“C1-C6亚烷基”是指仅由碳和氢原子组成的二价直链或支链烃链基团，该基团中不存在不饱和，具有从一个至六个碳原子。“C1-C6亚烷基”基团的非限制性实例包括亚甲基(C1亚烷基)、亚乙基(C2亚烷基)、1-甲基亚乙基(C3亚烷基)、正亚丙基(C3亚烷基)、异亚丙基(C3亚烷基)、正亚丁基(C4亚烷基)、异亚丁基(C4亚烷基)、仲亚丁基(C4亚烷基)、叔亚丁基(C4亚烷基)、正亚戊基(C5亚烷基)、异亚戊基(C5亚烷基)、新亚戊基(C5亚烷基)和亚己基(C6亚烷基)。
如本文所用，术语“亚烯基”是指仅由碳和氢原子组成的二价直链或支链烃链基团，并且该基团含有至少一个双键。如本文所用，术语“C2-C6亚烯基”是指仅由碳和氢原子组成的二价直链或支链烃链基团，该基团含有至少一个双键，并且具有从两个至六个碳原子。“C2-C6亚烯基”基团的非限制性实例包括亚乙烯基(C2亚烯基)、亚丙-1-烯基(C3亚烯基)、亚丁-1-烯基(C4亚烯基)、亚戊-1-烯基(C5亚烯基)、亚戊-4-烯基(C5亚烯基)、亚戊-1,4-二烯基(C5亚烯基)、亚己-1-烯基(C6亚烯基)、亚己-2-烯基(C6亚烯基)、亚己-3-烯基(C6亚烯基)、亚己-1-,4-二烯基(C6亚烯基)、亚己-1-,5-二烯基(C6亚烯基)和亚己-2-,4-二烯基(C6亚烯基)。如本文所用，术语“C2-C6亚烯基”是指仅由碳和氢原子组成的二价直链或支链烃链基团，该基团含有至少一个双键，并且具有从两个至三个碳原子。“C2-C3亚烯基”基团的非限制性实例包括亚乙烯基(C2亚烯基)和亚丙-1-烯基(C3亚烯基)。
如本文所用，术语“芳基”是指苯基、萘基、联苯基或茚基。
如本文所用，术语“杂芳基”是指由5至10个环成员组成、具有至少一个芳香族部分并含有1至4个选自氧、硫和氮(包括季氮)的杂原子的任何单环或双环基团。
如本文所用，术语“环烷基”是指含有3至10个环成员的任何单环或双环非芳香族碳环基团，其可包括稠合、桥联或螺环体系。稠合双环或桥联环系的非限制性实例包括双环[1.1.1]戊烷、双环[2.1.1]己烷、双环[2.2.1]庚烷、双环[3.1.1]庚烷、双环[3.2.1]辛烷和双环[2.2.2]辛烷。单环C3-C8环烷基基团的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基基团。术语“杂环烷基”是指由3至10个环成员组成并含有1至3个选自氧、硫、SO、SO2和氮的杂原子的任何单环或双环非芳香族碳环基团，应理解，双环基团可以是稠合的或螺环型的。C3-C8杂环烷基是指具有3至8个环碳原子的杂环烷基。杂环烷基可具有4至10个环成员。
术语亚杂芳基、亚环烷基、亚杂环烷基意指二价杂芳基、环烷基和杂环烷基。
如本文所用，术语“卤代烷基”是指沿着烃链被一个或多个卤素基团代替氢取代的直链或支链烷基链。卤代烷基中适合于取代的卤素基团的实例包括氟、溴、氯和碘。卤代烷基可包括用多个卤素基团代替烷基链中的氢进行取代，其中所述卤素基团可附接到烷基链中的同一个碳或另一个碳上。
如本文所用，烷基、烯基、炔基、烷氧基、氨基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基可任选地被1至4个选自任选取代的直链或支链(C1-C6)烷基、任选取代的直链或支链(C2-C6)烯基、任选取代的直链或支链(C2-C6)炔基、任选取代的直链或支链(C1-C6)烷氧基、任选取代的(C1-C6)烷基-S-、羟基、氧代(或适当的N-氧化物)、硝基、氰基、-C(O)-OR0'、-O-C(O)-R0'、-C(O)-NR0'R0”、-NR0'R0”、-(C＝NR0')-OR0”、直链或支链(C1-C6)卤代烷基、三氟甲氧基或卤素的基团取代，其中R0'和R0”各自独立地是氢原子或任选取代的直链或支链(C1-C6)烷基，并且其中直链或支链(C1-C6)烷基的一个或多个碳原子任选地被氚化。
如本文所用，术语“聚氧乙烯”、“聚乙二醇”或“PEG”是指包含(OCH2CH2)基团的直链、支链或星形构象。在某些实施例中，聚乙烯或PEG基团是-(OCH2CH2)t*-，其中t是1-40或4-40，并且其中“-”表示指向自脱落间隔子的末端并且“*-”表示与终末端基团R'的附接点，其中R'是OH、OCH3或OCH2CH2C(＝O)OH。在其他实施例中，聚乙烯或PEG基团是-(CH2CH2O)t*-，其中t是1-40或4-40，并且其中“-”表示指向自脱落间隔子的末端并且“*-”表示与终末端基团R”的附接点，其中R”是H、CH3或CH2CH2C(＝O)OH。例如，如本文所用，术语“PEG12”意味着t是12。
如本文所用，术语“聚亚烷基二醇”是指包含(O(CH2)m)n基团的直链、支链或星形构象。在某些实施例中，聚乙烯或PEG基团是-(O(CH2)m)t*-，其中m是1-10，t是1-40或4-40，并且其中“-”表示指向自脱落间隔子的末端并且“*-”表示与终末端基团R'附接点，其中R'是OH、OCH3或OCH2CH2C(＝O)OH。在其他实施例中，聚乙烯或PEG基团是-((CH2)mO)t*-，其中m是1-10，t是1-40或4-40，并且其中“-”表示指向自脱落间隔子的末端并且“*-”表示与终末端基团R”的附接点，其中R”是H、CH3或CH2CH2C(＝O)OH。
如本文所用，术语“反应性基团”是能够与抗体、抗体片段或附接到抗体或抗体片段上的另一个反应性基团的官能团形成共价键的官能团。此类官能团的非限制性实例包括本文提供的表8的反应性基团。
如本文所用，术语“附接基团”或“偶联基团”是指将桥联间隔子连接至抗体或其片段的二价部分。附接或偶联基团是通过反应基团与抗体或其片段的官能团之间的反应形成的二价部分。此类二价部分的非限制性实例包括本文提供的表F和表G中给出的二价化学部分。如本文所用，术语“附接基团”或“偶联基团”是指将桥联间隔子连接至抗体或其片段的二价部分。附接或偶联基团是通过反应基团与抗体或其片段的官能团之间的反应形成的二价部分。此类二价部分的非限制性实例包括本文提供的表F和表G中给出的二价化学部分。
如本文所用，术语“附接点”是指接头上与抗体或药物连接的位置。在一些实施例中，该位置是原子，诸如碳、氮、硫或氧，其中接头通过共价键与抗体或药物连接。
如本文所用，术语“桥联间隔子”是指一个或多个接头组分，它们共价附接在一起以形成将支化部分W连接至附接基团的二价部分。桥联间隔子的非限制性实例包括本文所述的基团L1-1、L1-2、L1-3、L1-4、L1-5和L1-6。
如本文所用，术语“支化部分”是指与本披露的双接头中的三个或更多个基团连接的化学部分。在一些实施例中，支化部分是N或CRw；其中Rw是H或C1-6烷基。
如本文所用，术语“可切割基团”是指在体内可能不稳定的部分。在一些实施例中，“可切割基团”允许通过从缀合物的其余部分切割药物来活化药物有效载荷。根据操作定义，接头优选地在体内被生物环境切割。切割可以来自任何过程，但不限于，例如酶促、还原、pH等。在一个实施例中，选择可切割基团使得活化发生在期望的作用位点，该作用位点可以是靶细胞(例如，癌细胞)或组织中或附近的位点，诸如治疗作用位点或药物活性位点。此类切割可以是酶促的，并且示例性的可酶促切割基团包括天然氨基酸或以天然氨基酸为末端的肽序列，并且在其羧基末端附接至接头。在一个实施例中，可切割基团包括焦磷酸酯基团、磷酸酯基团、糖(例如葡糖苷酸)基团、肽基团和/或自脱落基团。
如本文所用，术语“酶切割元件”包括易受酶促切割影响的元件。酶促切割的非限制性实例包括肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割、糖苷酶诱导的切割、磷酸二酯酶诱导的切割、磷酸酶诱导的切割、蛋白酶诱导的切割或脂肪酶诱导的切割。在一些实施例中，本披露中的酶切割元件是指可以被肽酶切割的二肽基团。在一些实施例中，二肽基团选自由本文所述的E1-1和E1-2组成的组。在一些实施例中，本披露中的酶切割元件包含可被葡糖苷酶切割的糖部分，诸如葡糖苷酸基团。在一些实施例中，本披露中的酶切割元件包含可被磷酸酶切割的磷酸或焦磷酸部分。
在一些实施例中，酶切割元件由以下表示：
其中A1和A2如本文所定义，表示与E1或E2的附接点；并且表示与D1或D2的附接点。
如本文所用，术语“连接间隔子”是指一个或多个接头组分，它们共价附接在一起以形成将支化部分W连接至包含酶切割元件或亲水性部分的功能部分E1或E2的二价部分。连接间隔子的非限制性实例包括本文所述的基团L2-1至L2-30。
如本文所用，术语“亲水性基团”是指具有亲水性质的基团，该亲水性质增加附接至本披露的接头基团的双接头的水溶性。此类亲水性基团的实例包括但不限于聚乙二醇、聚亚烷基二醇、糖、寡糖、多肽、被1至3个基团取代的C2-C6烷基、或被1至2个独立地选自-OC(＝O)NHS(O)2NHCH2CH2OCH3、-NHC(＝O)C1-4亚烷基-P(O)(OCH2CH3)2和-COOH基团的取代基取代的C2-C6烷基。
如本文所用，术语“亲水性部分”是指包含具有与其附接的亲水性基团的官能团的部分。在一些实施例中，本文提及的官能团是指本披露中描述的二价肽间隔子。
如本文所用，术语“间隔子部分”是指一个或多个接头组分，它们共价附接在一起以形成将自脱落基团连接至亲水性部分或酶切割元件的部分。在一些实施例中，如本文所用，术语“间隔子部分”是指如本文所定义的L4或L5。如本文所用，术语“二价肽间隔子”是指包含一个或多个氨基酸残基的二价接头，该一个或多个氨基酸残基共价附接在一起以形成将桥联间隔子连接至自脱落间隔子或酶切割元件的部分。该一个或多个氨基酸残基可以是选自以下的氨基酸的残基：丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天门冬氨酸(Asp)、谷氨基酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、瓜氨酸(Cit)、戊氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、硒代半胱氨酸(Sec)、吡咯赖氨酸(Pyl)、高丝氨酸、高半胱氨酸和去甲基吡咯赖氨酸。
在某些实施例中，“二价肽间隔子”是2个至四个氨基酸残基的组合，其中每个残基独立地选自选自以下的氨基酸的残基：丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天门冬氨酸(Asp)、谷氨基酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、瓜氨酸(Cit)、戊氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、硒代半胱氨酸(Sec)、吡咯赖氨酸(Pyl)、高丝氨酸、高半胱氨酸、和去甲基吡咯赖氨酸，例如-ValCit*；-CitVal*；-AlaAla*；-AlaCit*；-CitAla*；-AsnCit*；-CitAsn*；-CitCit*；-ValGlu*；-GluVal*；-SerCit*；-CitSer*；-LysCit*；-CitLys*；-AspCit*；-CitAsp*；-AlaVal*；-ValAla*；-PheAla*；-AlaPhe*；-PheLys*；-LysPhe*；-ValLys*；-LysVal*；-AlaLys*；-LysAla*；-PheCit*；-CitPhe*；-LeuCit*；-CitLeu*；-IleCit*；-CitIle*；-PheArg*；-ArgPhe*；-CitTrp*；-TrpCit*；-PhePheLys*；-LysPhePhe*；-DPhePheLys*；-DLysPhePhe*；-GlyPheLys*；-LysPheGly*；-GlyPheLeuGly-[SEQ ID NO:145]；-GlyLeuPheGly-[SEQ ID NO:146]；-AlaLeuAlaLeu-[SEQID NO:147]，-GlyGlyGly*；-GlyGlyGlyGly-[SEQ ID NO:148]；-GlyPheValGly-[SEQ IDNO:149]；以及-GlyValPheGly-[SEQ ID NO:150]，其中“-”表示与桥联间隔子的附接点并且“*”表示与自脱落间隔子的附接点。
如本文所用，术语“接头组分”是指作为接头的一部分的化学部分。接头组分的实例包括：亚烷基基团：-(CH2)n-，其可以是线性的或支链的(其中在此情况下，n是1-18)；亚烯基基团；亚炔基基团；烯基基团；炔基基团；乙二醇单元：-OCH2CH2-或-CH2CH2O-；聚乙二醇单元：(-CH2CH2O-)x(其中在这种情况下x是2-20)；-O-；-S-；羰基：-C(＝O)；酯：C(＝O)-O或O-C(＝O)；碳酸酯：-OC(＝O)O-；胺：-NH-；叔胺；酰胺：-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-或-C(＝O)N(C1-6烷基)；氨基甲酸酯：-OC(＝O)NH-或-NHC(＝O)O；尿素：-NHC(＝O)NH；磺酰胺：-S(O)2NH-或-NHS(O)2；醚：-CH2O-或-OCH2；被一个或多个独立地选自羧基、磺酸酯、羟基、胺、氨基酸、糖、磷酸和膦酸酯的基团取代的亚烷基；被一个或多个独立地选自羧基、磺酸酯、羟基、胺、氨基酸、糖、磷酸和膦酸酯的基团取代的亚烯基；被一个或多个独立地选自羧基、磺酸酯、羟基、胺、氨基酸、糖、磷酸和膦酸酯的基团取代的亚炔基；C1-C10亚烷基，其中一个或多个亚甲基被一个或多个-S-、-NH-或-O-部分替代；具有两个可用的附接点的环系，诸如选自以下的二价环：苯基(包括1,2-、1,3-和1,4-二取代的苯基)、C5-C6杂芳基、C3-C8环烷基(包括1,1-二取代的环丙基、环丁基、环戊基或环己基，和1,4-二取代的环己基)，和C4-C8杂环烷基；选自以下氨基酸的残基：丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天门冬氨酸(Asp)、谷氨基酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、瓜氨酸(Cit)、戊氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、硒代半胱氨酸(Sec)、吡咯赖氨酸(Pyl)、高丝氨酸、高半胱氨酸和去甲基吡咯赖氨酸；2个或更多个氨基酸残基的组合，其中每个残基独立地选自选自以下的氨基酸的残基：丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天门冬氨酸(Asp)、谷氨基酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、瓜氨酸(Cit)、戊氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、硒代半胱氨酸(Sec)、吡咯赖氨酸(Pyl)、高丝氨酸、高半胱氨酸、和去甲基吡咯赖氨酸，例如Val-Cit、Cit-Val、Ala-Ala、Ala-Cit、Cit-Ala、Asn-Cit、Cit-Asn、Cit-Cit、Val-Glu、Glu-Val、Ser-Cit、Cit-Ser、Lys-Cit、Cit-Lys、Asp-Cit、Cit-Asp、Ala-Val、Val-Ala、Phe-Lys、Lys-Phe、Val-Lys、Lys-Val、Ala-Lys、Lys-Ala、Phe-Cit、Cit-Phe、Leu-Cit、Cit-Leu、Ile-Cit、Cit-Ile、Phe-Arg、Arg-Phe、Cit-Trp和Trp-Cit；以及自脱落间隔子，其中该自脱落间隔子包含一个或多个保护(触发)基团，该一个或多个保护(触发)基团易受酸诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割、糖苷酶诱导的切割、磷酸二酯酶诱导的切割、磷酸酶诱导的切割、蛋白酶诱导的切割、脂肪酶诱导的切割或二硫键切割影响。
另外，接头组分可以是易于通过两个反应性基团之间的反应形成的化学部分。此类化学部分的非限制性实例在表F中给出。
表F
其中：表F中的R32是H、C1-4烷基、苯基、嘧啶或吡啶；表F中的R35是H、C1-6烷基、苯基或被1至3个-OH基团取代的C1-4烷基；表F中的每个R7独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；表F中的R37独立地选自H、苯基和吡啶；表F中的q是0、1、2或3；表F中的R8和R13是H或甲基；并且表F中的R9和R14是H、-CH3或苯基；表F中的R是H或任何合适的取代基；并且表F中的R50是H。
此外，接头组分可以是下表G中列出的基团。
表G.
如本文所用，当示出化合物的部分结构时，波浪线表示该部分结构与分子其余部分的附接点。
如本文所用，当示出化合物的部分结构时，波浪线表示该部分结构与分子其余部分的附接点。
如本文所用，术语“自脱落间隔子”是指包含一个或多个触发基团(TG)的部分，该一个或多个触发基团通过酸诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割、糖苷酶诱导的切割、磷酸二酯酶诱导的切割、磷酸酶诱导的切割、蛋白酶诱导的切割、脂肪酶诱导的切割或二硫键切割而活化，并且在活化后，保护基团被去除，这产生一连串的分解反应，从而导致离去基团的暂时性顺序释放。此类一连串反应可以是但不限于1,2-、1,4-、1,6-或1,8-消除反应。
自脱落间隔子的非限制性实例包括：
TG-Ya-LG和TG-Xa-LG，其中此类基团可以任选地被取代，以及
其中：
TG是触发基团；
Xa是O、NH或S；
Xb是O、NH、NCH3或S；
Xc是O或NH；
Ya是CH2、CH2O或CH2NH；
Yb是CH2、O或NH；
Yc是键、CH2、O或NH，并且
LG是离去基团，诸如本发明的接头-药物基团的药物部分(D)。
自脱落间隔子的另外的非限制性实例描述于Angew.Chem.Int.Ed.[应用化学-国际版]2015,54,7492-7509中。
在某些实施例中，与药物部分连接的自脱落间隔子是具有以下结构的部分：
其中E1和/或E2是酶切割元件，并且A1、A2、D1、D2、R2、R3、L3和L4如本文所定义。
在某些实施例中，自脱落间隔子是具有以下结构的部分：
其中E1和/或E2是二价肽间隔子，R2和/或R3是酶切割元件，并且A1、A2、D1、D2、L3、L4、R2和R3如本文所定义。
如本文所用，术语“自脱落基团”是指当TG被活化和去除时，可生成导致离去基团在时间上顺序释放的一连串分解反应的基团。
在一些实施例中，自脱落基团是具有以下结构的基团：
其中A1、A2、R2、R3、L3和L4如本文所定义，表示与E1或E2的附接点；并且表示与D1或D2的附接点。
药物部分
在一些实施例中，作为接头部分的前体的中间体与药物部分(其不是BH3模拟物，诸如Mcl-1抑制剂、Bcl-2抑制剂或Bcl-xL抑制剂)在适当条件下反应。在一些实施例中，在药物和/或中间体或接头上使用反应性基团。药物与中间体或衍生型药物(药物加接头)之间的反应产物随后在促进药物与中间体或衍生型药物与抗体或抗原结合片段缀合的条件下与抗体或抗原结合片段反应。替代性地，中间体或接头可以首先与抗体或抗原结合片段或衍生型抗体或抗原结合片段反应，然后与药物或衍生型药物反应。
许多不同的反应可用于将药物部分和/或接头部分共价附接至抗体或抗原结合片段。这通常通过抗体或抗原结合片段的一个或多个氨基酸残基(包括赖氨酸的胺基、谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基、半胱氨酸的巯基和芳香族氨基酸的各种部分)的反应来实现。例如，可以使用碳二亚胺反应进行非特异性共价附接，以将药物部分上的羧基(或氨基)连接至抗体或抗原结合片段上的氨基(或羧基)。另外，也可使用双官能药剂(诸如二醛或亚胺酯)将药物部分上的氨基连接至抗体或抗原结合片段上的氨基。希夫碱反应也可用于将药物附接到结合剂上。此方法涉及含有二醇或羟基的药物的高碘酸盐氧化，从而形成醛，该醛然后与结合剂反应。经由与结合剂的氨基形成希夫碱而发生附接。异硫氰酸酯也可用作偶联剂，以用于将药物共价附接至结合剂。其他技术是本领域技术人员已知的并且在本披露的范围内。
拓扑异构酶1抑制剂
在一些实施例中，D1和D2中的一者包含拓扑异构酶1抑制剂或其对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘代衍生物和/或与药学上可接受的酸或碱的加成盐。
在一些实施例中，D1和/或D2包含连接至双接头的拓扑异构酶1抑制剂，其中拓扑异构酶1抑制剂是拓扑替康、依喜替康、德鲁替康或SN-38。在一些实施例中，D1和/或D2包含选自下表的式。
(*表示与分子的其余部分的附接点)
抗有丝分裂药物
在一些实施例中，D1和D2中的一者包含抗有丝分裂药物或其对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘代衍生物和/或与药学上可接受的酸或碱的加成盐。
在一些实施例中，D1和D2中的一者包含连接至双接头的抗有丝分裂药物，其中抗有丝分裂药物是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或紫杉烷。在一个实施例中，紫杉烷选自多西他赛、紫杉醇或卡巴他赛。
载药量
载药量由p(或在本披露的化合物和缀合物中的2a)表示，并且在本文中也称为药物与抗体比率(DAR)。载药量可以在每个抗体或抗原结合片段2至32个药物部分的范围内。在一些实施例中，a是1至16的整数。在一些实施例中，a是1至、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2的整数。在一些实施例中，a是2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3的整数。在一些实施例中，a是1至16的整数。在一些实施例中，a是1至8的整数。在一些实施例中，a是1至5的整数。在一些实施例中，a是2至4的整数。在一些实施例中，a是1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施例中，a是2。在一些实施例中，a是4。
载药量可能受到抗体或抗原结合片段上的附接位点的数量的限制。在一些实施例中，ADC的接头部分(L)通过抗体或抗原结合片段上的一个或多个氨基酸残基上的化学活性基团附接至抗体或抗原结合片段。例如，接头可以经由游离氨基、亚氨基、羟基、硫醇或羧基附接至抗体或抗原结合片段(例如，附接至N末端或C末端、附接至一个或多个赖氨酸残基的ε氨基、附接至一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的游离羧酸基团或附接至一个或多个半胱氨酸残基的巯基)。接头附接的位点可以是抗体或抗原结合片段的氨基酸序列中的天然残基，或者其可以例如通过DNA重组技术(例如，通过将半胱氨酸残基引入氨基酸序列中)或通过蛋白质生物化学(例如，通过还原、pH调节或水解)被引入抗体或抗原结合片段中。
在一些实施例中，可与抗体或抗原结合片段缀合的药物部分的数量受到游离半胱氨酸残基的数量的限制。例如，在连接是半胱氨酸硫醇基团的情况下，抗体可以仅具有一个或几个半胱氨酸硫醇基团，或者可以仅具有一个或几个反应性充分的硫醇基团，通过这些硫醇基团可以附接接头。通常，抗体不含许多可与药物部分连接的游离的和反应性半胱氨酸硫醇基团。实际上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基涉及链间或链内二硫键。因此，在一些实施例中，与半胱氨酸的缀合可能需要抗体的至少部分还原。接头-毒素与抗体的过度附接可通过减少可用于形成二硫键的半胱氨酸残基而使抗体不稳定。因此，最佳的药物:抗体比率应增加ADC的效力(通过增加每个抗体附接的药物部分的数量)而不会使抗体或抗原结合片段不稳定。在一些实施例中，最佳比率可以是2、4、6或8。在一些实施例中，最佳比率可以是2或4。
在一些实施例中，将抗体或抗原结合片段在缀合之前暴露于还原条件，以生成一个或多个游离半胱氨酸残基。在一些实施例中，可以将抗体在部分或全部还原条件下用二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)等还原剂还原，以生成反应性半胱氨酸硫醇基团。未配对的半胱氨酸可以通过用有限摩尔当量的TCEP进行部分还原而生成，该部分还原可以还原连接轻链和重链(每H-L配对一对)以及铰链区中的两条重链(在人IgG1的情况下，每H-H配对两对)的链间二硫键，同时保持链内二硫键完整(Stefano等人(2013)Methods MolBiol.[分子生物学方法]1045:145-71)。在实施例中，抗体内的二硫键被电化学还原，例如，通过采用施加交替还原和氧化电压的工作电极。此方法可以允许二硫键还原与分析装置(例如，电化学检测装置、NMR光谱仪或质谱仪)或化学分离装置(例如，液相色谱仪(例如HPLC)或电泳装置(参见例如US2014/0069822))的在线耦合。在一些实施例中，使抗体经受变性条件，以揭示氨基酸残基(诸如半胱氨酸)上的反应性亲核基团。
可以以不同方式控制ADC的载药量，例如通过：(i)限制药物-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量；(ii)限制缀合反应时间或温度；(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原条件；和/或(iv)通过重组技术对抗体的氨基酸序列进行工程化，使得半胱氨酸残基的数量和位置被改变，以控制接头-药物附接的数量和/或位置。
在一些实施例中，将游离半胱氨酸残基引入抗体或抗原结合片段的氨基酸序列中。例如，可以制备半胱氨酸工程化抗体，其中亲本抗体的一个或多个氨基酸被半胱氨酸氨基酸替代。任何形式的抗体都可以如此工程化，即突变。例如，亲本Fab抗体片段可以被工程化以形成半胱氨酸工程化的Fab，称为“ThioFab”。类似地，亲本单克隆抗体可以被工程化以形成“ThioMab”。由于IgG抗体的二聚体性质，单位点突变在ThioFab中产生单个工程化半胱氨酸残基，而单位点突变在ThioMab中产生两个工程化半胱氨酸残基。编码亲本多肽的氨基酸序列变体的DNA可以通过本领域已知的多种方法制备(参见例如WO 2006/034488中描述的方法)。这些方法包括但不限于通过定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和对早期制备的编码多肽的DNA进行盒式诱变来制备。重组抗体的变体也可以通过限制性片段操作或通过与合成寡核苷酸的重叠延伸PCR来构建。具有式(1)的ADC包括但不限于具有1、2、3或4个工程化半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon等人(2012)Methods Enzymol.[酶学方法]502:123-38)。在一些实施例中，在不使用工程化的情况下，抗体或抗原结合片段中已经存在一个或多个游离半胱氨酸残基，在这种情况下，可以使用现有的游离半胱氨酸残基将抗体或抗原结合片段缀合至药物部分。
如果多于一个亲核基团在包含抗体或抗原结合片段的多个拷贝和接头部分的反应混合物中与药物-接头中间体或接头部分试剂反应随后与药物部分试剂反应，则所得产物可以是ADC化合物的混合物，其分布为一个或多个药物部分附接至混合物中抗体或抗原结合片段的每个拷贝。在一些实施例中，由缀合反应产生的ADC的混合物中载药量的范围为每个抗体或抗原结合片段附接1至16个药物部分。每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数量(即，平均载药量或平均p)可以通过本领域已知的任何常规方法计算，例如通过质谱法(例如，液相色谱-质谱法(LC-MS))和/或高效液相色谱法(例如，HIC-HPLC)。在一些实施例中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数量通过液相色谱-质谱法(LC-MS)确定。在一些实施例中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数量是约1.5至约3.5、约2.5至约4.5、约3.5至约5.5、约4.5至约6.5、约5.5至约7.5、约6.5至约8.5或约7.5至约9.5。在一些实施例中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数量是约2至约4、约3至约5、约4至约6、约5至约7、约6至约8、约7至约9、约2至约8或约4至约8。
在一些实施例中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数量是约2。在一些实施例中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数量是约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4或约2.5。在一些实施例中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数量是2。
在一些实施例中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数量是约4。在一些实施例中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数量是约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4或约4.5。在一些实施例中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数量是4。
在一些实施例中，当关于每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数量使用时，术语“约”意指加或减20％、15％、10％、5％或1％。在一个实施例中，术语“约”是指比指定值大或小10％的值的范围。在另一个实施例中，术语“约”是指比指定值大或小5％的值的范围。在另一个实施例中，术语“约”是指比指定值大或小1％的值的范围。
可以通过质谱法在混合物中鉴定单个ADC化合物或“物种”，并通过例如UPLC或HPLC，例如疏水相互作用色谱法(HIC-HPLC)进行分离。在一些实施例中，可以例如通过电泳或色谱法从缀合混合物中分离具有单一负载值的均质或近似均质的ADC产物。
在一些实施例中，较高的载药量(例如，p>16)可能导致某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶性、毒性或细胞通透性丧失。较高的载药量也可能对某些ADC的药代动力学(例如，清除率)产生负面影响。在一些实施例中，较低的载药量(例如，p<2)可降低某些ADC针对表达靶标的细胞的效力。在一些实施例中，本披露的ADC的载药量范围是约2至约16、约2至约10、约2至约8；约2至约6；约2至约5；约3至约5；约2至约4；或约4至约8。
在一些实施例中，约2的载药量和/或平均载药量例如使用抗体或抗原结合片段上的链内二硫键的部分还原来实现，并提供有益的性质。在一些实施例中，约4或约6或约8的载药量和/或平均载药量例如使用抗体或抗原结合片段上的链内二硫键的部分还原来实现，并提供有益的性质。在一些实施例中，小于约2的载药量和/或平均载药量可导致不可接受地高水平的未缀合抗体物质，其可与ADC竞争结合靶抗原和/或导致降低的治疗功效。在一些实施例中，大于约16的载药量和/或平均载药量可导致不可接受地高水平的产物异质性和/或ADC聚集。由于稳定抗体或抗原结合片段所需的一个或多个化学键的丢失，大于约16的载药量和/或平均载药量也可能影响ADC的稳定性。
本披露包括产生所述ADC的方法。简而言之，ADC包含作为抗体或抗原结合片段的抗体或抗原结合片段、药物部分以及连接药物部分和抗体或抗原结合片段的接头。在一些实施例中，可以使用具有用于共价附接至药物部分和抗体或抗原结合片段的反应性官能团的接头来制备ADC。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段被官能化，以制备与接头或药物-接头中间体具有反应性的官能团。例如，在一些实施例中，抗体或抗原结合片段的半胱氨酸硫醇可以与接头或药物-接头中间体的反应性官能团形成键，以产生ADC。在一些实施例中，用细菌转谷氨酰胺酶(BTG)反应性谷氨酰胺制备抗体或抗原结合片段，该谷氨酰胺用含有环辛炔BCN(N-[(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基羰基]-1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷)部分的胺特异性官能化。在一些实施例中，进行接头或药物-接头中间体与抗体或抗原结合片段的BCN部分的位点特异性缀合，例如，如本文所述和举例说明的。ADC的生成可以通过本领域技术人员已知的技术来完成。
在一些实施例中，通过以下方式产生ADC：使抗体或抗原结合片段与接头和药物部分以顺序方式接触，使得抗体或抗原结合片段首先与接头共价连接，然后预先形成的抗体-接头中间体与药物部分反应。抗体-接头中间体在接触药物部分之前可以经历或可以不经历纯化步骤。在其他实施例中，通过使抗体或抗原结合片段与通过使接头与药物部分反应而预先形成的接头-药物化合物接触来产生ADC。预先形成的接头-药物化合物在接触抗体或抗原结合片段之前可以经历或可以不经历纯化步骤。在其他实施例中，抗体或抗原结合片段在一个反应混合物中接触接头和药物部分，从而允许在抗体或抗原结合片段与接头之间以及接头与药物部分之间同时形成共价键。这种产生ADC的方法可以包括反应，其中抗体或抗原结合片段在将接头添加到反应混合物之前接触抗体或抗原结合片段，反之亦然。在一些实施例中，通过使抗体或抗原结合片段与连接至药物部分的接头在允许缀合的条件下反应来产生ADC。
可以对根据上述方法制备的ADC进行纯化步骤。纯化步骤可涉及本领域已知的用于纯化蛋白质的任何生化方法，或其方法的任何组合。这些方法包括但不限于切向流过滤(TFF)、亲和色谱法、离子交换色谱法、任何基于电荷或等电点的色谱法、混合模式色谱法，例如，CHT(羟基磷灰石陶瓷)、疏水相互作用色谱法、尺寸排阻色谱法、透析、过滤、选择性沉淀或它们的任何组合。
治疗用途和组合物
本文披露了使用本文所述的组合物(例如，所披露的ADC化合物和组合物)治疗受试者的障碍(例如，癌症)的方法。组合物(例如ADC)可以单独施用或与至少一种另外的非活性剂和/或活性剂(例如，至少一种另外的治疗剂)组合施用，并且可以以任何药学上可接受的调配物、剂量和给药方案施用。可以针对毒性以及功效指标评价治疗功效，并相应地进行调整。功效量度包括但不限于在体外或体内观察到的细胞生长抑制和/或细胞毒性作用、肿瘤体积减小、肿瘤生长抑制和/或生存期延长。
确定ADC是否对细胞发挥细胞生长抑制作用和/或细胞毒性作用的方法是已知的。例如，ADC的细胞毒性或细胞生长抑制活性可以通过以下方式测量：例如，将表达ADC的靶抗原的哺乳动物细胞暴露于细胞培养基中；将细胞培养约6小时至约6天；并测量细胞活力(例如，使用(CTG)或MTT细胞活力测定)。基于细胞的体外测定也可用于测量ADC的活力(增殖)、细胞毒性和细胞凋亡诱导(胱天蛋白酶活化)。
为了确定细胞毒性，可以测量坏死或细胞凋亡(程序性细胞死亡)。坏死典型地伴有质膜通透性增加、细胞肿胀和质膜破裂。细胞凋亡可以例如通过测量DNA片段化来定量。用于DNA片段化的定量性体外确定的商业化光度测定法是可用的。此类测定法的实例(包括TUNEL(其检测标记核苷酸在片段化DNA中的掺入)和基于ELISA的测定法)在Biochemica[生物化学](1999)2:34-7(罗氏分子生物化学(Roche Molecular Biochemicals))中有所描述。
细胞凋亡也可以通过测量细胞中的形态变化来确定。例如，与坏死一样，质膜完整性的丧失可以通过测量某些染料(例如，荧光染料，诸如例如吖啶橙或溴化乙锭)的摄取来确定。Duke和Cohen,Current Protocols in Immunology[免疫学实验指南](Coligan等人编辑,(1992)第3.17.1-3.17.16页)已经描述了一种用于测量凋亡细胞数的方法。还可以用DNA染料(例如，吖啶橙、溴化乙锭或碘化丙锭)标记细胞，并且观察细胞的染色质凝聚和沿着内核膜的边缘化。在一些实施例中，还可以通过筛选胱天蛋白酶活性来确定细胞凋亡。在一些实施例中，可以使用测定来测量胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7的活性。在一些实施例中，该测定在针对胱天蛋白酶活性、荧光素酶活性和细胞裂解而优化的试剂中提供发光胱天蛋白酶-3/7底物。在一些实施例中，以“添加-混合-测量”形式添加3/7试剂可导致细胞裂解，随后胱天蛋白酶切割底物，并生成由荧光素酶产生的“辉光型”发光信号。在一些实施例中，发光可以与存在的胱天蛋白酶活性的量成比例，并且可以充当细胞凋亡的指示剂。可被测量以确定细胞凋亡的其他形态变化包括例如细胞质凝聚、膜起泡增加和细胞收缩。对癌细胞的任何这些作用的确定表明，ADC可用于治疗癌症。
可以例如通过确定细胞中染料(诸如中性红、台盼蓝、结晶紫或ALAMARTM蓝)的摄取来测量细胞活力(参见例如Page等人(1993)Intl J Oncology[国际肿瘤学杂志]3:473-6)。在这种测定法中，在含有染料的培养基中培养细胞，洗涤细胞，并通过分光光度法测量剩余染料(这反映了染料的细胞摄取)。
还可以例如通过定量ATP(一种代谢活跃的细胞的指示剂)来测量细胞活力。在一些实施例中，可以使用(CTG)细胞活力测定来评估制备的ADC的体外效力和/或细胞活力，如本文提供的实例中所述。在该测定中，在一些实施例中，将单一试剂(试剂)直接添加至在补充血清的培养基中培养的细胞。试剂的添加导致细胞裂解和与存在的ATP的量成比例的发光信号的生成。ATP的量与培养物中存在的细胞的数量成比例
也可以例如通过测量四唑盐的还原来测量细胞活力。在一些实施例中，可以使用MTT细胞活力测定来评估制备的ADC的体外效力和/或细胞活力，如本文提供的实例中所述。在该测定中，在一些实施例中，黄色四唑MTT(3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑溴化物)被代谢活跃的细胞还原(部分地是通过脱氢酶的作用)，以生成还原当量，诸如NADH和NADPH。然后可以将所得的胞内紫色甲臜(formazan)溶解，并通过分光光度法进行定量。
在某些方面，本披露的特征在于一种杀死、抑制或调节癌细胞或组织的生长的方法。在一些实施例中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性成淋巴细胞性白血病在内的成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施例中，癌症是淋巴瘤或胃癌。
在一些实施例中，所披露的ADC可以在表达PCAD的任何细胞或组织(诸如表达PCAD的癌细胞或组织)中施用。示例性实施例包括杀死表达PCAD的癌细胞或组织的方法。该方法可用于表达PCAD的任何细胞或组织，诸如癌细胞或转移性病变。表达PCAD的癌症的非限制性实例包括乳腺癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌和黑色素瘤(Vieira和Paredes(2015)Mol Cancer[分子癌症]14:178)。
在一些实施例中，所披露的ADC可以在表达CD48的任何细胞或组织(诸如表达CD48的癌细胞或组织)中施用。示例性实施例包括杀死表达CD48的癌细胞或组织的方法。该方法可用于表达CD48的任何细胞或组织，诸如癌细胞或转移性病变。表达CD48的癌症的非限制性实例包括乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T-细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。
在一些实施例中，所披露的ADC可以在表达CD74的任何细胞或组织(诸如表达CD74的癌细胞或组织)中施用。示例性实施例包括杀死表达CD74的癌细胞或组织的方法。该方法可用于表达CD74的任何细胞或组织，诸如癌细胞或转移性病变。表达CD74的癌症的非限制性实例包括乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T-细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。
在一些实施例中，所披露的ADC可以在表达HER2的任何细胞或组织(诸如表达HER2的癌细胞或组织)中施用。示例性实施例包括杀死表达HER2的癌细胞或组织的方法。该方法可用于表达HER2的任何细胞或组织，诸如癌细胞或转移性病变。表达HER2的癌症的非限制性实例包括乳腺癌、胃癌、膀胱癌、尿路上皮细胞癌、食道癌、肺癌(例如，肺腺癌)、子宫癌(例如，子宫浆液性子宫内膜癌)、唾液腺管癌、宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌(English等人(2013)Mol Diagn Ther.[分子诊断与治疗]17:85-99)。表达HER2的细胞的非限制性实例包括HCC1954和HCC2218乳腺癌细胞，以及包含编码HER2或其部分的重组核酸的细胞。
在一些实施例中，所披露的ADC可以在表达EphA2的任何细胞或组织(诸如表达EphA2的癌细胞或组织)中施用。示例性实施例包括杀死表达EphA2的癌细胞或组织的方法。该方法可用于表达EphA2的任何细胞或组织，诸如癌细胞或转移性病变。表达EphA2的癌症的非限制性实例包括乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、胃部癌、膀胱癌和结肠癌。在一些实施例中，表达EphA2的癌症是乳腺癌或非小细胞肺癌。
在一些实施例中，所披露的ADC可以在表达TROP2的任何细胞或组织(诸如表达TROP2的癌细胞或组织)中施用。示例性实施例包括杀死表达TROP2的癌细胞或组织的方法。该方法可用于表达TROP2的任何细胞或组织，诸如癌细胞或转移性病变。表达TROP2的癌症的非限制性实例包括乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、胃部癌、膀胱癌和结肠癌。在一些实施例中，表达TROP2的癌症是乳腺癌或非小细胞肺癌。
在一些实施例中，所披露的ADC可以在表达B7-H3的任何细胞或组织(诸如表达B7-H3的癌细胞或组织)中施用。示例性实施例包括杀死表达B7-H3的癌细胞或组织的方法。该方法可用于表达B7-H3的任何细胞或组织，诸如癌细胞或转移性病变。表达B7-H3的癌症的非限制性实例包括乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、胃部癌、膀胱癌和结肠癌。在一些实施例中，表达B7-H3的癌症是乳腺癌或非小细胞肺癌。
在一些实施例中，所披露的ADC可以在表达5T4的任何细胞或组织(诸如表达5T4的癌细胞或组织)中施用。示例性实施例包括杀死表达5T4的癌细胞或组织的方法。该方法可用于表达5T4的任何细胞或组织，诸如癌细胞或转移性病变。表达5T4的癌症的非限制性实例包括乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、胃部癌、膀胱癌和结肠癌。在一些实施例中，表达5T4的癌症是乳腺癌或非小细胞肺癌。
示例性方法包括使细胞与如本文所述的有效量(即，足以杀死细胞的量)的ADC接触的步骤。该方法可用于例如体外、体内、离体或原位培养的细胞。例如，表达HER2的细胞(例如，通过肿瘤或转移性病变的活检收集的细胞；来自已建立的癌细胞系的细胞；或重组细胞)可以在培养基中体外培养，并且可以通过将ADC添加到培养基中来影响接触步骤。该方法将导致杀死表达HER2的细胞，特别包括表达HER2的癌细胞。替代性地，可以通过任何合适的施用途径(例如，静脉内、皮下或与肿瘤组织直接接触)将ADC施用于受试者，以使其在体内产生作用。该方法可用于靶向其他细胞表面抗原(例如，EGFR、CD7、HER2、CD48、CD74或EphA2)的抗体。
可以在合适的动物模型中评价所披露的ADC治疗组合物的体内效果。例如，可以使用异种癌症模型，在该模型中，将癌症外植体或传代的异种移植组织引入免疫受损的动物，诸如裸鼠或SCID小鼠(Klein等人(1997)Nature Med.[自然医学]3:402-8)。可以使用测量肿瘤形成、肿瘤消退或转移等的抑制的测定来预测功效。
也可以使用评价细胞凋亡等机制对肿瘤死亡的促进的体内测定。在一些实施例中，可以检查来自用治疗组合物治疗的荷瘤小鼠的异种移植物是否存在凋亡病灶，并与未治疗的对照荷瘤小鼠进行比较。在经治疗小鼠的肿瘤中发现凋亡病灶的程度提供了对组合物治疗功效的指示。
在一些实施例中，本文进一步提供了所述ADC化合物和组合物的治疗用途，例如在治疗癌症方面的治疗用途。在一些实施例中，本披露提供了治疗癌症(例如，表达由ADC的抗体或抗原结合片段靶向的抗原(诸如PCAD、HER2、CD48、CD74、EphA2、EGFR、CD7、HER2、TROP2、B7-H3或5T4，例如MET)的癌症)的方法。在一些实施例中，本披露提供了减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增的方法。在一些实施例中，本披露提供了确定患有或疑似患有癌症的受试者是否将对本文披露的ADC化合物或组合物的治疗有响应的方法。
一个示例性实施例是一种治疗患有或疑似患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如，本文披露的任何示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物)。在一些实施例中，癌症表达靶抗原。在一些实施例中，癌症是肿瘤或血液癌症。在一些实施例中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性成淋巴细胞性白血病在内的成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施例中，癌症是淋巴瘤或胃癌。
另一个示例性实施例是一种减少或抑制受试者中肿瘤的生长的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如，本文披露的任何示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物)。在一些实施例中，肿瘤表达靶抗原。在一些实施例中，肿瘤是乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌、头颈癌或脾癌。在一些实施例中，肿瘤症是胃癌。在一些实施例中，抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物的施用使肿瘤的生长减少或抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
另一个示例性实施例是一种减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如，本文披露的任何示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物)。在一些实施例中，癌细胞群表达靶抗原。在一些实施例中，癌细胞群来自肿瘤或血液癌症。在一些实施例中，癌细胞群来自乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性成淋巴细胞性白血病在内的成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施例中，癌细胞群来自淋巴瘤或胃癌。在一些实施例中，抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物的施用使癌细胞群减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。在一些实施例中，抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物的施用使癌细胞群的扩增减缓至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
另一个示例性实施例是一种用于治疗患有或疑似患有癌症的受试者的抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如，本文披露的任何示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物)。在一些实施例中，癌症表达靶抗原。在一些实施例中，癌症是肿瘤或血液癌症。在一些实施例中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性成淋巴细胞性白血病在内的成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施例中，癌症是淋巴瘤或胃癌。
另一个示例性实施例是抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如，本文披露的任何示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物)在治疗患有或疑似患有癌症的受试者方面的用途。在一些实施例中，癌症表达靶抗原。在一些实施例中，癌症是肿瘤或血液癌症。在一些实施例中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性成淋巴细胞性白血病在内的成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施例中，癌症是淋巴瘤或胃癌。
另一个示例性实施例是抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如，本文披露的任何示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物)在制造药物的方法中的用途，该药物用于治疗患有或疑似患有癌症的受试者。在一些实施例中，癌症表达靶抗原。在一些实施例中，靶抗原是PCAD、HER2、CD48、CD74、EphA2、TROP2、B7-H3或5T4。在一些实施例中，癌症是肿瘤或血液癌症。在一些实施例中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性成淋巴细胞性白血病在内的成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施例中，癌症是淋巴瘤或胃癌。
另一个示例性实施例是一种确定患有或疑似患有癌症的受试者是否将对抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物(例如，本文披露的任何示例性抗体-药物缀合物、组合物或药物组合物)的治疗有响应的方法，该方法通过以下方式实现：提供来自受试者的生物样品；使样品与抗体-药物缀合物接触；以及检测抗体-药物缀合物与样品中的癌细胞的结合。在一些实施例中，样品中的癌细胞表达靶抗原。
在一些实施例中，癌症是肿瘤或血液癌症。在一些实施例中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性成淋巴细胞性白血病在内的成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施例中，癌症是淋巴瘤或胃癌。在一些实施例中，样品是组织活检样品、血液样品或骨髓样品。
在本披露的任何实施例中，靶抗原可以选自BCMA、CD33、HER2、CD38、CD48、CD79b、PCAD、CD74、CD138、SLAMF7、CD123、CLL1、FLT3、CD7、CKIT、CD56、DLL3、DLK1、B7-H3、EGFR、CD71、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、TROP2、LIV1、CD46、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2或GPNMB。在一些实施例中，靶抗原是EphA2、CD56、SEZ6、CD25、CCR8、CEACAM5、CEACAM6、4-1BB、5AC、5T4、甲胎蛋白、血管生成素2、ASLG659、TCLI、BMPRIB、短蛋白聚糖(Brevican)BCAN、BEHAB、C242抗原、C5、CA-125、CA-125(仿制品)、CA-IX(碳酸酐酶9)、CCR4、CD140a、CD152、CD19、CD20、CD200、CD21(C3DR)I)、CD22(B细胞受体CD22-B异构体)、CD221、CD23(gE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD37、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD70、CD72(Lyb-2、B细胞分化抗原CD72)、CD79a、CD80、CEA、CEA相关抗原、ch4D5、CLDN18.2、CRIPTO(CR、CRI、CRGF、TDGF1)、CTLA-4、CXCR5、DLL4、DR5、E16(LATI、SLC7A5)、EGFL7、EphB2R(DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5)、黏蛋白(Episialin)、ERBB3、ETBR(内皮素B型受体)、FCRHI(Fc受体样蛋白I)、FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAPI、SPAP IB、SPAP IC)、纤连蛋白额外结构域-B、卷曲受体、GD2、GD3神经节苷脂、GEDA、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HLA-DOB、HLA-DR、人散射因子受体激酶、IGF-I受体、IL-13、IL20R(ZCYTOR7)、IL-6、ILGF2、ILFRIR、整合素u、IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2)、Lewis-Y抗原、LY64(RP105)、MCP-I、MDP(DPEPI)、MPF、MSLN、SMR、间皮素、巨核细胞、PD-I、PDCDI、PDGF-R u、前列腺特异性膜抗原、PSCA(前列腺干细胞抗原前体)、PSCA hlg、RANKL、RON、SDCI、Sema Sb、STEAP I、STEAP2、PCANAP I、STAMPI、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因I、TAG-72、TEMI、肌腱蛋白C、TENB2(TMEFF2、脑肿瘤抑癌蛋白(tomoregulin)、TPEF、HPPI、TR)、TGF-IJ、TRAIL-E2、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、T17M4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员4)、TWEAK-R、TYRP I(糖蛋白75)、VEGF、VEGF-A、EGFR-I、VEGFR-2或波形蛋白。在一些实施例中，靶抗原是EGFR、CD7、HER2、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2或GPNMB。在一些实施例中，靶抗原是PCAD、HER2、CD48、CD74、EphA2、TROP2、B7-H3或5T4。
一个示例性实施例是一种治疗患有或疑似患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本文披露的组合物，例如ADC、组合物或药物组合物(例如，本文披露的任何示例性ADC、组合物或药物组合物)。在一些实施例中，癌症表达靶抗原。在一些实施例中，靶抗原是BCMA、CD33、HER2、CD38、CD48、CD79b、PCAD、CD74、CD138、SLAMF7、CD123、CLL1、FLT3、CD7、CKIT、CD56、DLL3、DLK1、B7-H3、EGFR、CD71、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、TROP2、LIV1、CD46、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2或GPNMB。在一些实施例中，靶抗原是EphA2、CD56、SEZ6、CD25、CCR8、CEACAM5、CEACAM6、4-1BB、5AC、5T4、甲胎蛋白、血管生成素2、ASLG659、TCLI、BMPRIB、短蛋白聚糖(Brevican)BCAN、BEHAB、C242抗原、C5、CA-125、CA-125(仿制品)、CA-IX(碳酸酐酶9)、CCR4、CD140a、CD152、CD19、CD20、CD200、CD21(C3DR)I)、CD22(B细胞受体CD22-B异构体)、CD221、CD23(gE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD37、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD70、CD72(Lyb-2、B细胞分化抗原CD72)、CD79a、CD80、CEA、CEA相关抗原、ch4D5、CLDN18.2、CRIPTO(CR、CRI、CRGF、TDGF1)、CTLA-4、CXCR5、DLL4、DR5、E16(LATI、SLC7A5)、EGFL7、EphB2R(DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5)、黏蛋白(Episialin)、ERBB3、ETBR(内皮素B型受体)、FCRHI(Fc受体样蛋白I)、FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAPI、SPAP IB、SPAP IC)、纤连蛋白额外结构域-B、卷曲受体、GD2、GD3神经节苷脂、GEDA、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HLA-DOB、HLA-DR、人散射因子受体激酶、IGF-I受体、IL-13、IL20R(ZCYTOR7)、IL-6、ILGF2、ILFRIR、整合素u、IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2)、Lewis-Y抗原、LY64(RP105)、MCP-I、MDP(DPEPI)、MPF、MSLN、SMR、间皮素、巨核细胞、PD-I、PDCDI、PDGF-R u、前列腺特异性膜抗原、PSCA(前列腺干细胞抗原前体)、PSCA hlg、RANKL、RON、SDCI、Sema Sb、STEAP I、STEAP2、PCANAP I、STAMP I、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因I、TAG-72、TEMI、肌腱蛋白C、TENB2(TMEFF2、脑肿瘤抑癌蛋白(tomoregulin)、TPEF、HPPI、TR)、TGF-IJ、TRAIL-E2、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、T17M4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员4)、TWEAK-R、TYRP I(糖蛋白75)、VEGF、VEGF-A、EGFR-I、VEGFR-2或波形蛋白。在一些实施例中，靶抗原是EGFR、CD7、HER2、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2或GPNMB。在一些实施例中，靶抗原是PCAD、HER2、CD48、CD74、EphA2、TROP2、B7-H3或5T4。在一些实施例中，癌症是肿瘤或血液癌症。在一些实施例中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性成淋巴细胞性白血病在内的成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施例中，癌症是淋巴瘤或胃癌。
另一个示例性实施例是一种将药物递送至表达TROP2的细胞的方法，该方法包括将药物缀合至免疫特异性结合TROP2表位的抗体并将细胞暴露于ADC。本披露的ADC所适用的表达TROP2的示例性癌细胞包括乳腺癌或非小细胞肺癌。
另一个示例性实施例是一种将药物递送至表达B7-H3的细胞的方法，该方法包括将药物缀合至免疫特异性结合B7-H3表位的抗体并将细胞暴露于ADC。本披露的ADC所适用的表达B7-H3的示例性癌细胞包括乳腺癌或非小细胞肺癌。
另一个示例性实施例是一种将药物递送至表达5T4的细胞的方法，该方法包括将药物缀合至免疫特异性结合5T4表位的抗体并将细胞暴露于ADC。本披露的ADC所适用的表达5T4的示例性癌细胞包括乳腺癌或非小细胞肺癌。在某些方面，本披露进一步提供了减少或抑制肿瘤(例如，表达CD48的肿瘤、表达CD74的肿瘤、表达PCAD的肿瘤、表达HER2的肿瘤、表达TROP2的肿瘤、表达B7-H3的肿瘤、表达5T3的肿瘤)的生长的方法，该方法包括施用治疗有效量的ADC或包含ADC的组合物。在一些实施例中，治疗足以减少或抑制患者肿瘤的生长、减少转移性病变的数量或大小、降低肿瘤负荷、降低原发性肿瘤负荷、减少侵袭性、延长生存时间和/或维持或改善生活质量。在一些实施例中，当单独施用时，肿瘤对用ADC的抗体或抗原结合片段(例如，抗CD48抗体、抗CD74抗体、抗PCAD抗体、抗EphA2抗体、抗HER2抗体、抗TROP2抗体、抗B7-H3抗体、抗5T3抗体)的治疗具有抗性或难治性。
一个示例性实施例是一种减少或抑制受试者中肿瘤的生长的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的ADC、组合物或药物组合物(例如，本文披露的任何示例性ADC、组合物或药物组合物)。在一些实施例中，肿瘤表达靶抗原。在一些实施例中，靶抗原是BCMA、CD33、HER2、CD38、CD48、CD79b、PCAD、CD74、CD138、SLAMF7、CD123、CLL1、FLT3、CD7、CKIT、CD56、DLL3、DLK1、B7-H3、EGFR、CD71、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、TROP2、LIV1、CD46、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2或GPNMB。在一些实施例中，靶抗原是EphA2、CD56、SEZ6、CD25、CCR8、CEACAM5、CEACAM6、4-1BB、5AC、5T4、甲胎蛋白、血管生成素2、ASLG659、TCLI、BMPRIB、短蛋白聚糖(Brevican)BCAN、BEHAB、C242抗原、C5、CA-125、CA-125(仿制品)、CA-IX(碳酸酐酶9)、CCR4、CD140a、CD152、CD19、CD20、CD200、CD21(C3DR)I)、CD22(B细胞受体CD22-B异构体)、CD221、CD23(gE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD37、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD70、CD72(Lyb-2、B细胞分化抗原CD72)、CD79a、CD80、CEA、CEA相关抗原、ch4D5、CLDN18.2、CRIPTO(CR、CRI、CRGF、TDGF1)、CTLA-4、CXCR5、DLL4、DR5、E16(LATI、SLC7A5)、EGFL7、EphB2R(DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5)、黏蛋白(Episialin)、ERBB3、ETBR(内皮素B型受体)、FCRHI(Fc受体样蛋白I)、FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAPI、SPAP IB、SPAPIC)、纤连蛋白额外结构域-B、卷曲受体、GD2、GD3神经节苷脂、GEDA、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HLA-DOB、HLA-DR、人散射因子受体激酶、IGF-I受体、IL-13、IL20R(ZCYTOR7)、IL-6、ILGF2、ILFRIR、整合素u、IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2)、Lewis-Y抗原、LY64(RP105)、MCP-I、MDP(DPEPI)、MPF、MSLN、SMR、间皮素、巨核细胞、PD-I、PDCDI、PDGF-R u、前列腺特异性膜抗原、PSCA(前列腺干细胞抗原前体)、PSCA hlg、RANKL、RON、SDCI、Sema Sb、STEAP I、STEAP2、PCANAP I、STAMP I、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因I、TAG-72、TEMI、肌腱蛋白C、TENB2(TMEFF2、脑肿瘤抑癌蛋白(tomoregulin)、TPEF、HPPI、TR)、TGF-IJ、TRAIL-E2、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、T17M4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员4)、TWEAK-R、TYRP I(糖蛋白75)、VEGF、VEGF-A、EGFR-I、VEGFR-2或波形蛋白。在一些实施例中，靶抗原是EGFR、CD7、HER2、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2或GPNMB。在一些实施例中，靶抗原是PCAD、HER2、CD48、CD74、EphA2、TROP2、B7-H3或5T4。在一些实施例中，肿瘤是乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌、头颈癌或脾癌。在一些实施例中，肿瘤症是胃癌。在一些实施例中，与不存在治疗时的生长相比，ADC、组合物或药物组合物的施用使肿瘤的生长减少或抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
另一个示例性实施例是一种延迟或减缓受试者中肿瘤的生长的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的ADC、组合物或药物组合物(例如，本文披露的任何示例性ADC、组合物或药物组合物)。在一些实施例中，肿瘤表达靶抗原。在一些实施例中，靶抗原是BCMA、CD33、HER2、CD38、CD48、CD79b、PCAD、CD74、CD138、SLAMF7、CD123、CLL1、FLT3、CD7、CKIT、CD56、DLL3、DLK1、B7-H3、EGFR、CD71、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、TROP2、LIV1、CD46、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2或GPNMB。在一些实施例中，靶抗原是EphA2、CD56、SEZ6、CD25、CCR8、CEACAM5、CEACAM6、4-1BB、5AC、5T4、甲胎蛋白、血管生成素2、ASLG659、TCLI、BMPRIB、短蛋白聚糖(Brevican)BCAN、BEHAB、C242抗原、C5、CA-125、CA-125(仿制品)、CA-IX(碳酸酐酶9)、CCR4、CD140a、CD152、CD19、CD20、CD200、CD21(C3DR)I)、CD22(B细胞受体CD22-B异构体)、CD221、CD23(gE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD37、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD70、CD72(Lyb-2、B细胞分化抗原CD72)、CD79a、CD80、CEA、CEA相关抗原、ch4D5、CLDN18.2、CRIPTO(CR、CRI、CRGF、TDGF1)、CTLA-4、CXCR5、DLL4、DR5、E16(LATI、SLC7A5)、EGFL7、EphB2R(DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5)、黏蛋白(Episialin)、ERBB3、ETBR(内皮素B型受体)、FCRHI(Fc受体样蛋白I)、FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAPI、SPAP IB、SPAP IC)、纤连蛋白额外结构域-B、卷曲受体、GD2、GD3神经节苷脂、GEDA、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HLA-DOB、HLA-DR、人散射因子受体激酶、IGF-I受体、IL-13、IL20R(ZCYTOR7)、IL-6、ILGF2、ILFRIR、整合素u、IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2)、Lewis-Y抗原、LY64(RP105)、MCP-I、MDP(DPEPI)、MPF、MSLN、SMR、间皮素、巨核细胞、PD-I、PDCDI、PDGF-R u、前列腺特异性膜抗原、PSCA(前列腺干细胞抗原前体)、PSCA hlg、RANKL、RON、SDCI、Sema Sb、STEAP I、STEAP2、PCANAP I、STAMP I、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因I、TAG-72、TEMI、肌腱蛋白C、TENB2(TMEFF2、脑肿瘤抑癌蛋白(tomoregulin)、TPEF、HPPI、TR)、TGF-IJ、TRAIL-E2、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、T17M4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员4)、TWEAK-R、TYRP I(糖蛋白75)、VEGF、VEGF-A、EGFR-I、VEGFR-2或波形蛋白。在一些实施例中，靶抗原是EGFR、CD7、HER2、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2或GPNMB。在一些实施例中，靶抗原是PCAD、HER2、CD48、CD74、EphA2、TROP2、B7-H3或5T4。
在一些实施例中，肿瘤是乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或脾癌。在一些实施例中，肿瘤症是胃癌。在一些实施例中，与不存在治疗时的生长相比，ADC、组合物或药物组合物的施用使肿瘤的生长延迟或减缓至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
在某些方面，本披露进一步提供了减少或减缓癌细胞群(例如，表达CD48的癌细胞群、表达CD74的癌细胞群、表达EphA2的癌细胞群、表达PCAD的癌细胞群、表达HER2的癌细胞群)的扩增的方法，该方法包括施用治疗有效量的ADC或包含ADC的组合物。
一个示例性实施例是一种减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的ADC、组合物或药物组合物(例如，本文披露的任何示例性ADC、组合物或药物组合物)。在一些实施例中，癌细胞群表达靶抗原。在一些实施例中，靶抗原是BCMA、CD33、HER2、CD38、CD48、CD79b、PCAD、CD74、CD138、SLAMF7、CD123、CLL1、FLT3、CD7、CKIT、CD56、DLL3、DLK1、B7-H3、EGFR、CD71、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、TROP2、LIV1、CD46、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2或GPNMB。在一些实施例中，靶抗原是EphA2、CD56、SEZ6、CD25、CCR8、CEACAM5、CEACAM6、4-1BB、5AC、5T4、甲胎蛋白、血管生成素2、ASLG659、TCLI、BMPRIB、短蛋白聚糖(Brevican)BCAN、BEHAB、C242抗原、C5、CA-125、CA-125(仿制品)、CA-IX(碳酸酐酶9)、CCR4、CD140a、CD152、CD19、CD20、CD200、CD21(C3DR)I)、CD22(B细胞受体CD22-B异构体)、CD221、CD23(gE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD37、CD4、CD40、CD44v6、CD51、CD52、CD70、CD72(Lyb-2、B细胞分化抗原CD72)、CD79a、CD80、CEA、CEA相关抗原、ch4D5、CLDN18.2、CRIPTO(CR、CRI、CRGF、TDGF1)、CTLA-4、CXCR5、DLL4、DR5、E16(LATI、SLC7A5)、EGFL7、EphB2R(DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5)、黏蛋白(Episialin)、ERBB3、ETBR(内皮素B型受体)、FCRHI(Fc受体样蛋白I)、FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAPI、SPAP IB、SPAP IC)、纤连蛋白额外结构域-B、卷曲受体、GD2、GD3神经节苷脂、GEDA、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HLA-DOB、HLA-DR、人散射因子受体激酶、IGF-I受体、IL-13、IL20R(ZCYTOR7)、IL-6、ILGF2、ILFRIR、整合素u、IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2)、Lewis-Y抗原、LY64(RP105)、MCP-I、MDP(DPEPI)、MPF、MSLN、SMR、间皮素、巨核细胞、PD-I、PDCDI、PDGF-R u、前列腺特异性膜抗原、PSCA(前列腺干细胞抗原前体)、PSCA hlg、RANKL、RON、SDCI、Sema Sb、STEAP I、STEAP2、PCANAP I、STAMP I、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因I、TAG-72、TEMI、肌腱蛋白C、TENB2(TMEFF2、脑肿瘤抑癌蛋白(tomoregulin)、TPEF、HPPI、TR)、TGF-IJ、TRAIL-E2、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、T17M4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员4)、TWEAK-R、TYRP I(糖蛋白75)、VEGF、VEGF-A、EGFR-I、VEGFR-2或波形蛋白。在一些实施例中，靶抗原是EGFR、CD7、HER2、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2或GPNMB。在一些实施例中，靶抗原是PCAD、HER2、CD48、CD74、EphA2、TROP2、B7-H3或5T4。在一些实施例中，癌细胞群来自肿瘤或血液癌症。在一些实施例中，癌细胞群来自乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性成淋巴细胞性白血病在内的成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。在一些实施例中，癌细胞群来自淋巴瘤或胃癌。在一些实施例中，与不存在治疗时的群体相比，ADC、组合物或药物组合物的施用使癌细胞群减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。在一些实施例中，与不存在治疗时的扩增相比，ADC、组合物或药物组合物的施用使癌细胞群的扩增减缓至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
本文还提供了确定患有或疑似患有癌症的受试者是否将对所披露的ADC和组合物的治疗有响应的方法。一个示例性实施例是一种确定患有或疑似患有癌症的受试者是否将对ADC、组合物或药物组合物(例如，本文披露的任何示例性ADC、组合物或药物组合物)的治疗有响应的方法，该方法通过以下方式实现：提供来自受试者的生物样品；使样品与ADC接触；以及检测ADC与样品中的癌细胞的结合。在一些实施例中，样品是组织活检样品、血液样品或骨髓样品。在一些实施例中，该方法包括提供来自受试者的生物样品；使样品与ADC接触；以及检测样品中癌细胞死亡的一种或多种标志物(例如，一种或多种细胞凋亡标志物的表达增加、培养物中癌细胞群体的扩增减少等)。
本文进一步提供了所披露的ADC和组合物的治疗用途。一个示例性实施例是一种用于治疗患有或疑似患有癌症(例如，表达PCAD的癌症、表达HER2的癌症、表达EphA2的癌症、表达CD48的癌症、表达CD74的癌症)的受试者的ADC、组合物或药物组合物(例如，本文披露的任何示例性ADC、组合物或药物组合物)。另一个示例性实施例是ADC、组合物或药物组合物(例如，本文披露的任何示例性ADC、组合物或药物组合物)在治疗患有或疑似患有癌症(例如，表达PCAD的癌症、表达HER2的癌症、表达EphA2的癌症、表达CD48的癌症、表达CD74的癌症)的受试者方面的用途。另一个示例性实施例是ADC、组合物或药物组合物(例如，本文披露的任何示例性ADC、组合物或药物组合物)在制造药物的方法中的用途，该药物用于治疗患有或疑似患有癌症(例如，表达PCAD的癌症、表达HER2的癌症、表达EphA2的癌症、表达CD48的癌症、表达CD74的癌症)的受试者。用于鉴定患有表达靶抗原(例如，CD48、CD74、EphA2、PCAD、HER2、TROP2、B7-H3或5T4)的癌症的受试者的方法是本领域已知的，并且可用于鉴定适于用所披露的ADC化合物或组合物治疗的患者。
此外，本披露的ADC可以出于兽医目的或作为人类疾病的动物模型施用于表达ADC能够与之结合的抗原的非人哺乳动物。关于后者，此类动物模型可用于评价所披露的ADC的治疗功效(例如，测试施用的剂量和时间进程)。
可以将用于实践前述方法的治疗组合物配制成药物组合物，这些药物组合物包含适于所需递送方法的药学上可接受的载剂。一个示例性实施例是一种药物组合物，其包含本披露的ADC和药学上可接受的载剂，例如适于所选施用方式(例如，静脉内施用)的载剂。药物组合物还可以包含一种或多种适用于治疗或预防例如癌症的另外的非活性剂和/或治疗剂(例如，标准护理剂等)。药物组合物还可以包含一种或多种载剂、赋形剂和/或稳定剂组分等。配制此类药物组合物和合适的调配物的方法是本领域中已知的(参见例如，“Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],”Mack Publishing Co.,Easton,PA[宾夕法尼亚州伊斯顿市的麦克出版公司])。
合适的载剂包含当与治疗组合物组合时保留治疗组合物的抗肿瘤功能，并且通常不与患者的免疫系统反应的任何材料。药学上可接受的载剂包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载剂的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇、甲磺酸盐等中的一者或多者，以及它们的组合。在许多情况下，组合物中包含等渗剂，例如糖，多元醇，诸如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。药学上可接受的载剂可以进一步包含少量辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增ADC的保质期或有效性。
本披露的药物组合物可通过本领域已知的各种方法施用。施用途径和/或模式可以根据期望的结果而变化。在一些实施例中，将治疗调配物溶解并经由能够将治疗组合物递送至癌症部位的任何途径施用。潜在有效的施用途径包括但不限于肠胃外(例如，静脉内、皮下)、腹膜内、肌肉内、肿瘤内、皮内、器官内、原位等。在一些实施例中，施用是静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内。药学上可接受的载剂应适合于施用途径，例如静脉内或皮下施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，一种或多种活性化合物(即，ADC和/或任何另外的治疗剂)可以包被在材料中以保护该一种或多种化合物免受酸和可能使该一种或多种化合物失活的其他自然条件的作用。施用可以是全身的或局部的。
本文披露的治疗组合物在制造和储存条件下可以是无菌和稳定的，并且可以是多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。形式取决于预期施用方式和治疗性应用。在一些实施例中，所披露的ADC可以掺入适于肠胃外施用的药物组合物中。可注射溶液可以由在燧石或琥珀小瓶、安瓿瓶或预填充注射器或其他已知的递送或储存装置中的液体或冻干剂型组成。在一些实施例中，ADC或药物组合物中的一种或多种作为干燥的无菌冻干粉剂或无水浓缩物在密闭容器中提供，并且可以重构(例如，用水或盐水)到适当的浓度以施用于受试者。
典型地，在本披露的药物组合物中采用治疗有效量或有效量的所披露的组合物，例如，所披露的ADC。可以通过本领域已知的常规方法将组合物(例如，包含ADC的组合物)配制成药学上可接受的剂型。使用前述方法治疗癌症的剂量和施用方案将随方法和目标癌症而变化，并且通常将取决于本领域所理解的许多其他因素。
可以调整本文披露的组合物(例如，包含单独的或与至少一种另外的非活性和/或活性治疗剂组合的ADC的那些组合物)的剂量方案，以提供最佳的期望应答(例如，治疗应答)。例如，如由治疗情况的紧急状态所指示的，可以一次性施用单次推注的一种或两种药剂，可以在预定的时间段内施用几个分次剂量，或可以按比例增加或减少一种或两种药剂的剂量。在一些实施例中，治疗涉及经由可接受的施用途径单次推注或重复施用ADC制剂。在一些实施例中，每天、每周、每月或其间的任何时间段向患者施用ADC。对于任何特定的受试者，可以根据个体的需要以及治疗临床医生的专业判断随时间调整特定的剂量方案。肠胃外组合物可以配制成剂量单位形式，以便于施用和实现剂量均匀性。如本文所用，单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗受试者的物理上离散的单位；每个单位含有经计算产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物以及所需药物载剂。
可以基于一种或多种活性化合物的独特特性和待实现的特定治疗效果来选择包含ADC和/或任何一种或多种另外的治疗剂的组合物的剂量值。医生或兽医可以以低于达到期望治疗效果所需的水平开始药物组合物中使用的ADC的剂量，并且逐渐增加剂量直至达到期望效果。通常，用于治疗癌症的本披露的组合物的有效剂量可以根据许多不同因素(包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是人动物、施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的)而变化。所选的剂量水平也可以取决于多种药代动力学因素，包括所用的本披露的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，正在使用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，正在治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和既往病史等因素。可以滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
本文提供的化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或动物模型中的标准药学程序来确定。例如，可以确定LD50、ED50、EC50和IC50，并且可以计算毒性与治疗效果之间的剂量比(LD50/ED50)作为治疗指数。从体外和体内测定获得的数据可用于估计或配制用于人的剂量范围。例如，本文披露的组合物和方法可以最初在异种癌症模型(例如，NCI-H929多发性骨髓瘤小鼠模型)中进行评价。
在一些实施例中，一次施用ADC或包含ADC的组合物。在其他实施例中，多次施用ADC或包含ADC的组合物。单次剂量之间的间隔可以是例如每天、每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，基于测量患者中施用的药剂(例如，ADC)的血液水平，以便维持药剂的相对一致的血浆浓度。ADC或包含ADC的组合物的施用剂量和频率也可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，可以在长时间段内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对较短的间隔给予相对较高的剂量直至疾病进展减少或终止，并且优选直至患者显示出一种或多种疾病症状的部分或完全改善。此后，可以向患者施用较低的例如预防性方案。
上述治疗方法可以与多种另外的手术、化学疗法或放射疗法方案中的任一种组合。在一些实施例中，本文披露的ADC或组合物与一种或多种另外的治疗剂(例如，一种或多种化疗剂、一种或多种用于所治疗的特定病症的标准护理剂)共同配制和/或共同施用。
还提供了用于本文所述的治疗和/或诊断应用的试剂盒。此类试剂盒可以包括被分隔开以容纳一个或多个容器(诸如小瓶、管等)的载体、包装或容器，该一个或多个容器中的每个容器包括用于本文所披露方法中的单独元件之一。标签附在该一个或多个容器上或与该一个或多个容器一起，以标明试剂盒内的ADC或组合物用于特定治疗或非治疗应用，诸如预后、预防、诊断或实验室应用。标签还可以指示体内或体外用途的指南，诸如本文所述的那些。指南和/或其他信息也可以包括在与试剂盒一起或附在试剂盒上的插页或标签中。标签可以在容器上或与容器相关联。当将形成标签的字母、数字或其他字符模制或蚀刻到容器本身中时，标签可以在容器上。当标签存在于也容纳容器的接收器或载体中(例如，作为包装插页)时，标签可以与容器相关联。标签可以标明试剂盒内的ADC或组合物用于诊断或治疗病症，诸如本文所述的癌症。
在一些实施例中，试剂盒包括ADC或包含ADC的组合物。在一些实施例中，试剂盒进一步包括一种或多种另外的组成部分，包括但不限于：使用说明书；其他试剂，例如治疗剂(例如，标准护理剂)；用于制备用于施用的ADC的装置、容器或其他材料；药学上可接受的载剂；以及用于向受试者施用ADC的装置、容器或其他材料。使用说明书可以包括对治疗应用的指导，包括例如在患有或疑似患有癌症的患者中的建议剂量和/或施用模式。在一些实施例中，试剂盒包括ADC和用于在治疗、预防和/或诊断癌症中使用ADC的说明书。
缀合方法
本发明提供了将本发明的接头-药物基团与抗体或抗体片段缀合以产生包含具有一个或多个亲水性基团的接头的抗体药物缀合物的各种方法。
用于形成具有式(A-2)的抗体药物缀合物的一般反应方案示出在以下方案1中：
方案1
其中：RG2是反应性基团，其与相容的R1基团反应以形成对应的R100基团(此类基团展示在表F和表G中)。D1、D2、R1、L1、L2’、L3’、Ab、W和R100如本文所定义。
方案2进一步说明了用于形成具有式(A-2)的抗体药物缀合物的这种一般方法，其中抗体包含与R1基团(如本文所定义)反应的反应性基团(RG2)，以经由R100基团(如本文所定义)将接头-药物基团与抗体共价附接。仅出于说明的目的，方案2示出了具有四个RG2基团的抗体。
方案2
在一个方面，接头-药物基团经由抗体中修饰的半胱氨酸残基与抗体缀合(参见例如WO 2014/124316)。方案3说明了用于形成具有式(A-2)的抗体药物缀合物的这种方法，其中由抗体中经工程化的半胱氨酸残基产生的游离硫醇基团与R1基团(其中R1是马来酰亚胺)反应，以经由R100基团(其中R100是琥珀酰亚胺环)将接头-药物基团与抗体共价附接。仅出于说明的目的，方案3示出了具有四个游离硫醇基团的抗体。
方案3
在另一方面，接头-药物基团经由抗体中的赖氨酸残基与抗体缀合。方案4说明了用于形成具有式(A-2)的抗体药物缀合物的这种方法，其中来自抗体中赖氨酸残基的游离胺基基团与R1基团(其中R1是NHS酯、五氟苯基或四氟苯基)反应，以经由R100基团(其中R100是酰胺)将接头-药物基团与抗体共价附接。仅出于说明的目的，方案4示出了具有四个胺基基团的抗体。
方案4
在另一方面，经由在抗体的天然存在的二硫桥处形成肟桥而将接头-药物基团与抗体缀合。通过首先通过还原抗体的链间二硫桥并通过使用1,3-二卤代丙酮(例如，1,3-二氯丙酮)再桥联来形成酮桥，从而形成肟桥。随后与包含羟胺的接头-药物基团反应，从而形成肟键(肟桥)，该肟键将接头-药物基团与抗体附接(参见例如WO 2014/083505)。方案5说明了用于形成具有式(A-2)的抗体药物缀合物的这种方法。
方案5
用于形成具有式(D3-2)的抗体药物缀合物的一般反应方案示出在以下方案6中：
方案6
其中：RG2是反应性基团，其与相容的R1基团反应以形成对应的R100基团(此类基团展示在表F和表G中)。D1、D2、R1、L1、W、L2、L3、E1、E2、L4、L5、A1、A2、R2、R3、Ab和R100如本文所定义。
方案7进一步说明了用于形成具有式(D3-2)的抗体药物缀合物的这种一般方法，其中抗体包含与R1基团(如本文所定义)反应的反应性基团(RG2)，以经由R100基团(如本文所定义)将接头-药物基团与抗体共价附接。仅出于说明的目的，方案7示出了具有四个RG2基团的抗体。
方案7
在一个方面，接头-药物基团经由抗体中修饰的半胱氨酸残基与抗体缀合(参见例如WO 2014/124316)。方案8说明了用于形成具有式(D3-2)的抗体药物缀合物的这种方法，其中由抗体中经工程化的半胱氨酸残基产生的游离硫醇基团与R1基团(其中R1是马来酰亚胺)反应，以经由R100基团(其中R100是琥珀酰亚胺环)将接头-药物基团与抗体共价附接。仅出于说明的目的，方案8示出了具有四个游离硫醇基团的抗体。
方案8
在另一方面，接头-药物基团经由抗体中的赖氨酸残基与抗体缀合。方案9说明了用于形成具有式(D3-2)的抗体药物缀合物的这种方法，其中来自抗体中赖氨酸残基的游离胺基基团与R1基团(其中R1是NHS酯、五氟苯基或四氟苯基)反应，以经由R100基团(其中R100是酰胺)将接头-药物基团与抗体共价附接。仅出于说明的目的，方案9示出了具有四个胺基基团的抗体。
方案9
在另一方面，经由在抗体的天然存在的二硫桥处形成肟桥而将接头-药物基团与抗体缀合。通过首先通过还原抗体的链间二硫桥并通过使用1,3-二卤代丙酮(例如，1,3-二氯丙酮)再桥联来形成酮桥，从而形成肟桥。随后与包含羟胺的接头-药物基团反应，从而形成肟键(肟桥)，该肟键将接头-药物基团与抗体附接(参见例如WO 2014/083505)。方案10说明了用于形成具有式(D3-2)的抗体药物缀合物的这种方法。
方案10
还提供了用于评价本发明抗体缀合物的分析方法学的一些方面的方案。这种分析方法学和结果可以证明缀合物具有有利的性质，例如使它们更容易制造、更容易施用至患者、对患者更有效和/或潜在更安全的性质。一个实例是通过尺寸排阻色谱法(SEC)确定分子大小，其中样品中所期望的抗体物种的量相对于样品中存在的高分子量污染物(例如，二聚体、多聚体、或聚集抗体)或低分子量污染物(例如，抗体片段、降解产物、或单独抗体链)的量来确定。通常，期望具有更高量的单体和更低量的例如聚集抗体，这是由于例如聚集体对抗体样品的其他性质的影响，这些其他性质诸如但不限于清除率、免疫原性和毒性。进一步的实例是通过疏水相互作用色谱法(HIC)确定疏水性，其中相对于一组已知性质的标准抗体来评估样品的疏水性。通常，期望具有低疏水性，这是由于疏水性对抗体样品的其他性质的影响，这些其他性质诸如但不限于聚集性、随时间的聚集性、对表面的粘附性、肝毒性、清除率和药代动力学暴露。参见Damle,N.K.,Nat Biotechnol.[自然生物技术]2008；26(8):884-885；Singh,S.K.,Pharm Res.[药物研究]2015；32(11):3541-71。当通过疏水相互作用色谱法测量时，较高的疏水性指数得分(即，更快地从HIC柱洗脱)反映了缀合物的较低的疏水性。如以下实例中所示，大多数测试的抗体缀合物显示出大于0.8的疏水性指数。在一些实施例中，提供了如通过疏水相互作用色谱法确定的具有0.8或更大的疏水性指数的抗体缀合物。
实例
以下实例提供本披露的说明性实施例。本领域普通技术人员将认识到可以在不改变本披露的精神或范围的情况下进行多种修改和变化。这样的修改和变化涵盖在本披露的范围内。提供的实例不以任何方式限制本披露。
实例A.接头、接头-有效载荷及其前体的合成和表征。
使用本实例中描述的示例性方法合成示例性接头、接头-有效载荷及其前体。本文使用的一些中间体及其合成方法描述于WO 2020/236841中。
缩写：
DCC： 二环己基碳二亚胺
DCE： 二氯乙烷
DCM 二氯甲烷
DIEA/DIPEA： N,N-二异丙基乙胺
DMTMM： 4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉氯化物
DMF： 二甲基甲酰胺
DMSO： 二甲基亚砜
EDC/EDC-HCl： 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐
HATU： 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐
HBTU： (2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HOAt： 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
MeCN： 乙腈
MeOH： 甲醇
NMP： N-甲基吡咯烷
TES： 三乙基硅烷
TBAF： 四丁基氟化铵
TBAI： 四丁基碘化铵
TBTU： [双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-苯并三唑鎓3-氧化物四氟硼酸盐
pTsOH： 对甲苯磺酸
PyBOP： 苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
TSTU： O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐
THF： 四氢呋喃
TFA： 三氟乙酸
TFE： 2,2,2-三氟乙醇
材料、方法和一般程序：
使用从商业来源获得的所有试剂而无需进一步纯化。无水溶剂从商业来源获得，并且无需进一步干燥即可使用。使用预填充硅胶柱(Macherey-Nagel Chromabond Flash)在CombiFlash Rf(Teledyne ISCO)上进行快速色谱法。用涂有Merck型60F254硅胶的5×10cm板进行薄层色谱法。在CEM仪器中进行微波加热。
在298K的温度下在Bruker Avance NMR光谱仪上获取NMR数据，该光谱仪配备有5mm BBFO冷冻探针，其中z梯度对于1H在400.13MHz的频率下操作，对于19F在376.50MHz的频率下操作，对于13C在100.61MHz的频率下操作。通过将内部四甲基硅烷(TMS)设置为0ppm来参考1H和13C光谱的化学位移。
分析方法
使用具有以下参数的仪器获取LC/MS数据：
用于生成LC/MS数据的方法如下：
2min酸性法：
2min碱性法：
5min酸性法
使用具有以下参数的仪器获取HRMS数据：
HRMS_QT01
HRMS_QT02
用于生成接头/有效载荷和合成中间体的HRMS数据的方法如下：
肽_300-4000_Da_5min QT1
制备型RP-HPLC：
使用Teledyne ISCO纯化系统使用C18或C4 RP ISCO或ISCO-金柱获取制备型HPLC(“Prep-HPLC”)数据。
使用四种Prep-HPLC方法：
a.TFA方法：溶剂：A水+0.05％ TFA，B乙腈+0.05％ TFA，梯度为5％至100％ B，在15至30CV中
b.NH4HCO3方法：溶剂：A水+0.02M NH4HCO3，B乙腈/水80/20+0.02M NH4HCO3，梯度为5％至100％ B，在15至30CV中
c.中性法：溶剂：A水，B乙腈，梯度为5％至100％ B，在15至30CV中
d.甲酸法：溶剂：A水+0.05％甲酸，B乙腈+0.05％甲酸，梯度为5％至100％ B，在15至30CV中
在适当情况下采用方法a.-d.的梯度变化。将含有纯化合物的所有级分合并并直接冷冻干燥，得到呈无定形粉末的化合物。
2-(溴甲基)-4-硝基苯甲酸的合成
在rt下向2-甲基-4-硝基苯甲酸(300g，1.5371mol)在CCl4(3000mL)中的搅拌溶液添加NBS(300.93mg，1.6908mol)和AIBN(37.86mg，0.2305mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌16h。通过TLC分析监测反应混合物。将反应混合物用饱和NaHCO3溶液(2升)稀释并用乙酸乙酯(2×2升)萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。使用2％-3％乙酸乙酯的石油醚溶液作为洗脱剂，将粗化合物纯化通过硅胶柱色谱法，并获得2-(溴甲基)-4-硝基苯甲酸(250g，59％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.35(d,J＝2.0Hz,1H),8.20(q,J＝8.8,2.4Hz,1H),8.12(d,J＝8.8Hz,1H),4.97(s,2H),4.00(s,3H)。
4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸的合成
在rt下向2-(溴甲基)-4-硝基苯甲酸(250g，0.9122mol)在ACN(5000mL)中的混合物中添加丙-2-炔-1-醇(255.68g，265.50mL，4.5609mol，d＝0.963g/mL)和Cs2CO3(743.03g，2.2805mol)。将所得混合物加热至80℃保持16h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，用乙酸乙酯(2升)洗涤。将滤液在减压下浓缩。向获得的粗化合物中添加饱和NaHCO3溶液(1升)，并使用2N HCl(2升)将水层酸化至pH 2。过滤真空干燥后，获得了4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸(130g，60.6％)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ13.61(brs,1H),8.37(d,J＝2.4Hz,1H),8.23(dd,J＝2.4,8.4Hz,1H),8.10(d,J＝8.8Hz,1H),4.95(s,2H),4.37(d,J＝2.4Hz,2H),3.52(t,J＝2.4Hz,1H)
4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸甲酯的合成
在0℃下向4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸(130g，0.5527mol)在MeOH(1300mL)中的搅拌溶液中缓慢添加SOCl2(526.08g，320.78mL，4.4219mol，d＝1.64g/mL)。将反应在70℃下搅拌4h。将反应溶剂在减压下蒸发。将获得的残余物溶解在乙酸乙酯(1000mL)中并用饱和NaHCO3(600mL)、水(500mL)和盐水溶液(500mL)洗涤。将分离的有机层经硫酸钠干燥，过滤并在减压下蒸发，产生4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸甲酯(110g，80％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.56(t,J＝0.8Hz,1H),8.18-8.09(m,2H),5.03(s,2H),4.35(d,J＝2.4Hz,2H),3.96(s,3H),2.49(t,J＝2.4Hz,1H)。
4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸甲酯的合成
在rt下向4-硝基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸甲酯(110g，0.4414mol)在EtOH(1100mL)和H2O(550mL)的混合物中的溶液中添加Fe粉(197.21g，3.5310mol)和NH4Cl(188.88g，3.5310mol)。将所得混合物在80℃下加热16h。将反应混合物冷却至rt并通过硅藻土过滤，并用乙酸乙酯(2升)洗涤。将滤液在减压下浓缩多达体积的一半。向残余物中添加乙酸乙酯(1.5升)并将两层分离，并将水层用乙酸乙酯(2升)萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩获得粗品。通过SiO2柱色谱法(15％-20％乙酸乙酯的石油醚溶液)纯化产生4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸甲酯(70g，72％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.67(d,J＝8.8Hz,1H),6.78(t,J＝1.6Hz,1H),6.48(q,J＝8.4,2.4Hz,1H),4.79(s,2H),4.25(d,J＝2.4Hz,2H),3.70(d,J＝4.0Hz,3H),3.42(t,J＝2.4Hz,1H)。
(4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)甲醇的合成
在0℃下向THF(1000mL)的搅拌溶液中缓慢添加LiAlH4(1M，在THF中)(21.23g，798.2mmol，798.2mL)。在0℃下缓慢添加4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯甲酸甲酯(70g，319.3mmol)在THF(800mL)中的溶液。将反应在rt下搅拌4h。将反应混合物冷却至0℃，然后非常缓慢地添加水(22mL)，随后添加20％ NaOH(22mL)和水(66mL)。将反应混合物在0℃下搅拌30min。添加无水硫酸钠以吸收过量的水。将混合物通过硅藻土过滤。将滤饼用乙酸乙酯(1000mL)和10％ MeOH/DCM(500mL)洗涤。将滤液在减压下浓缩。将所得粗化合物通过SiO2柱色谱法(35％-40％乙酸乙酯的石油醚溶液作为洗脱剂)纯化，得到(4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)甲醇(50.6g，83％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.98(d,J＝8.0Hz,1H),6.56(d,J＝2.4Hz,1H),6.43(dd,J＝2.4,8.0Hz,1H),4.98(s,2H),4.64(t,J＝5.2Hz,1H),4.47(s,2H),4.34(d,J＝5.6Hz,2H),4.15(d,J＝2.4Hz,2H),3.46(t,J＝2.4Hz,1H)。
(S)-(1-((4-(羟甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向(4-氨基-2-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)甲醇(1.92g，10.04mmol，1.0当量)、(S)-(1-氨基-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(3.99g，10.04mmol，1.0当量)和(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(4.20g，11.04mmol，1.1当量)在DMF(10mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(2.62mL，15.06mmol，1.5当量)。在环境温度搅拌1小时后，将混合物倒入水(200mL)中。将所得固体过滤、用水冲洗、并在真空下干燥，并且获得了(S)-(1-((4-(羟甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(6.08g，99％)。LCMS：MH+＝571.5；Rt＝0.93min(2min酸性法-方法A)。
(S)-2-氨基-N-(4-(羟甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺的合成
向(S)-(1-((4-(羟甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(6.08g，10.65mmol，1.0当量)添加二甲胺(2M，在THF中，21.31mL，42.62mmol，4当量)。在环境温度下搅拌1.5小时后，从已形成的胶样残余物中倾出上清液。用乙醚(3×50mL)研磨残余物并将所得固体过滤，用乙醚洗涤，并在真空下干燥。获得了(S)-2-氨基-N-(4-(羟甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(3.50g，10.04mmol，94％)。LCMS：MH+349.3；Rt＝0.42min(2min酸性法-方法A)。
((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
向(S)-2-氨基-N-(4-(羟甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺(3.50g，10.04mmol，1.0当量)、(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸(2.62g，12.05mmol，1.2当量)和(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(4.58g，12.05mmol，1.2当量)在DMF(10mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(3.50mL，20.08mmol，2.0当量)。在环境温度下搅拌2小时后，将混合物倒入水(200mL)中，并将所得悬浮液用EtOAc(3×100mL)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥并在真空下浓缩。通过ISCOSiO2色谱法(0％-20％甲醇/二氯甲烷)纯化后，获得了((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)-3-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(2.49g，4.55mmol，45％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.00(s,1H),7.96(d,J＝7.7Hz,1H),7.55(dq,J＝4.9,2.2Hz,2H,芳基),7.32(d,J＝8.9Hz,1H,芳基),6.76(d,J＝8.9Hz,1H),5.95(t,J＝5.8Hz,1H),5.38(s,2H),5.01(t,J＝5.5Hz,1H),4.54(s,2H),4.45(dd,J＝25.2,5.3Hz,3H),4.20(d,J＝2.4Hz,2H),3.83(dd,J＝8.9,6.7Hz,1H),3.49(t,J＝2.4Hz,1H),2.97(dh,J＝26.0,6.5Hz,2H),1.96(h,J＝6.6Hz,1H),1.74-1.50(m,2H),1.39(m,11H),0.84(dd,J＝16.2,6.7Hz,6H)。LCMS：MNa+570.5；Rt＝0.79min(2min酸性法-方法A)。
2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲酸的合成
向6-硝基异苯并呋喃-1(3H)-酮(90g，502.43mmol，1.00当量)在MeOH(1000mL)中的溶液中添加在H2O(150mL)中KOH(28.19g，502.43mmol，1.00当量)。将棕色混合物在25℃下搅拌1.5h。将棕色混合物在减压下浓缩得到残余物并溶解在DCM(2000mL)中。向混合物中添加TBDPSCl(296.91g，1.08mol，277.49mL，2.15当量)和咪唑(171.03g，2.51mol，5.00当量)，在25℃下搅拌12h。将混合物在减压下浓缩得到残余物。将残余物通过硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝1/0、1/1)纯化并获得呈白色固体的2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲酸(34g，74.16mmol，14.76％产率)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 1.13(s,9H)5.26(s,2H)7.34-7.48(m,6H)7.68(br d,J＝8Hz,4H)8.24(br d,J＝8Hz,1H)8.46(br d,J＝8Hz,1H)8.74(s,1H)
(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)甲醇的合成
向2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲酸(41g，94.14mmol，1当量)在THF(205mL)中的混合物中添加BH3.THF(1M，470.68mL，5当量)。将黄色混合物在60℃下搅拌2h。向混合物中添加MeOH(400mL)，并在减压下浓缩得到残余物，然后添加H2O(200mL)和DCM(300mL)，用DCM(3×200mL)萃取，用盐水(300mL)洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤，并在减压下浓缩得到残余物。将残余物通过硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝1/0、1/1)纯化。获得了呈白色固体的(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)甲醇(34g，80.65mmol，85.7％产率)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 1.10(s,9H)4.58(s,2H)4.89(s,2H)7.32-7.51(m,6H)7.68(dd,J＝8,1.38Hz,4H)7.76(d,J＝8Hz,1H)8.15(dd,J＝8 2.26Hz,1H)8.30(d,J＝2Hz,1H)。
2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲醛的合成
向(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)甲醇(34g，80.65mmol，1当量)在DCM(450mL)中的溶液中添加MnO2(56.09g，645.22mmol，8当量)。将黑色混合物在25℃下搅拌36h。向混合物中添加MeOH(400mL)，并在减压下浓缩得到残余物，然后添加H2O(200mL)和DCM(300mL)，用DCM(3×200mL)萃取，用盐水(300mL)洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤，并在减压下浓缩得到残余物。将残余物通过硅胶色谱法(CH2Cl2＝100％)纯化。获得了呈白色固体的2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲醛(30g，71.51mmol，88.7％产率)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.14(s,9H)5.26(s,2H)7.34-7.53(m,6H)7.60-7.73(m,4H)8.13(d,J＝8Hz,1H)8.48(dd,J＝8,2.51Hz,1H)8.67(d,J＝2Hz,1H)10.16(s,1H)。
N-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)丙-2-炔-1-胺的合成
向2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲醛(12.6g，30.03mmol，1当量)在DCM(130mL)中的溶液添加丙-2-炔-1-胺(4.14g，75.08mmol，4.81mL，2.5当量)和MgSO4(36.15g，300.33mmol，10当量)，然后将悬浮液混合物在25℃下搅拌24h。取少量反应溶液并用NaBH4处理，TLC示出形成了一个新的点。将反应混合物过滤并在减压下浓缩得到残余物。获得了呈黄色固体的(E)-N-[[2-[[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-硝基-苯基]甲基]丙-2-炔-1-亚胺(12g，粗品)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.11(s,9H)2.48(t,J＝2.38Hz,1H)4.52(t,J＝2.13Hz,2H)5.09(s,2H)7.35-7.49(m,6H)7.63-7.72(m,4H)7.79(d,J＝8.53Hz,1H)8.25(dd,J＝8.53,2.51Hz,1H)8.68(d,J＝2.26Hz,1H)8.84(t,J＝1.88Hz,1H)。
将(E)-N-[[2-[[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-硝基-苯基]甲基]丙-2-炔-1-亚胺(12g，26.28mmol，1当量)溶解在MeOH(100mL)和THF(50mL)中，然后添加NaBH4(1.49g，39.42mmol，1.5当量)并将黄色混合物在-20℃下搅拌2h。LCMS示出了检测到所期望的化合物。通过在-20℃下添加200mL MeOH将反应混合物淬灭，然后在减压下浓缩得到残余物。将残余物用EtOAc 500mL溶解，用盐水150mL洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩得到残余物。将残余物通过快速硅胶色谱法(0％-10％乙酸乙酯/石油醚梯度的洗脱剂)纯化。获得了呈淡黄色油状物的N-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)丙-2-炔-1-胺(9g，18.45mmol，70％产率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.12(s,9H)2.13(t,J＝2.38Hz,1H)3.33(d,J＝2.51Hz,2H)3.80(s,2H)4.93(s,2H)7.36-7.49(m,6H)7.69(dd,J＝7.91,1.38Hz,4H)7.77(d,J＝8.53Hz,1H)8.16(dd,J＝8.41,2.38Hz,1H)8.24(d,J＝2.26Hz,1H)。
(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向N-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)丙-2-炔-1-胺(9g，19.62mmol，1当量)和Fmoc-OSU(7.28g，21.59mmol，1.1当量)在二噁烷(90mL)中的溶液中添加饱和NaHCO3(90mL)并将白色悬浮液在20℃下搅拌12h。将反应混合物用H2O 150mL稀释并用EtOAc(每次150mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水200mL洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩得到残余物。将残余物通过快速硅胶色谱法(0％-30％乙酸乙酯/石油醚的洗脱剂)纯化。获得了呈白色固体的(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(7.7g，11.08mmol，56.48％产率，98％纯度)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.12(s,9H)2.17(br d,J＝14.31Hz,1H)3.87-4.97(m,9H)6.98-8.28(m,21H)。
(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向冰浴冷却的(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(5.0g，7.34mmol，1.0当量)在10％ AcOH/CH2Cl2(100mL)中的溶液中添加Zn(7.20g，110mmol，15当量)。去除冰浴，并将所得混合物搅拌2小时，此时通过硅藻土垫将其过滤。将挥发物在真空中去除，并将残余物溶解在EtOAc中，用NaHCO3(饱和)、NaCl(饱和)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩，并在ISCO SiO2色谱法(0％-75％EtOAc/庚烷)后，获得了(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.99g，62％)。LCMS：MH+＝651.6；Rt＝3.77min(5min酸性法-方法C)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向在CH2Cl2(40mL)中的(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.99g，4.59mmol，1.0当量)和(S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(1.72g，4.59mmol，1.0当量)中添加2-乙氧基喹啉-1(2H)-甲酸乙酯(2.27g，9.18mmol，2.0当量)。搅拌10分钟后，添加MeOH(1mL)，使溶液变得均质。搅拌反应16小时，在真空中去除挥发物，并在通过ISCO SiO2色谱法(0％-15％ MeOH/CH2Cl2)纯化后，获得了(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.78g，60％)。LCMS：MH+＝1008.8；Rt＝3.77min(5min酸性法-方法C)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯的合成
向(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(1.60g，1.588mmol，1.0当量)中添加在MeOH(30mL，60mmol，37当量)和THF(10mL)中的2M二甲胺。静置3小时后，将挥发物在真空中去除并将残余物用Et2O研磨以去除Fmoc脱保护副产物。向所得固体中添加CH2Cl2(16mL)和吡啶(4mL)，并向异质溶液中添加氯甲酸炔丙酯(155μL，1.588mmol，1.0当量)。搅拌30min后，添加另外的氯甲酸炔丙酯(155μL，1.588mmol，1.0当量)。再搅拌20分钟后，添加MeOH(1mL)以淬灭剩余的氯甲酸酯，并在真空中去除挥发物。通过ISCO SiO2色谱法(0％-15％MeOH/CH2Cl2)纯化后，获得了(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯(984mg，71％)。LCMS：MH+＝867.8；Rt＝3.40min(5min酸性法-方法C)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯的合成
向(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯(984mg，1.135mmol，1.0当量)在THF(7.5mL)中的溶液中添加在THF中的1.0M四丁基氟化铵(2.27mL，2.27mmol，2.0当量)。静置6小时后，在真空中去除挥发物，将残余物通过ISCOSiO2色谱法(0％-40％ MeOH/CH2Cl2)纯化，并获得了(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯(629mg，88％)。LCMS：MH+＝629.6；Rt＝1.74min(5min酸性法-方法C)。
2-(羟甲基)-N-甲基-5-硝基苯甲酰胺的合成
在25℃下向6-硝基异苯并呋喃-1(3H)-酮(500g，2.79mol)在MeOH(1500mL)中的搅拌悬浮液中添加MeNH2(3.00kg，29.94mol，600mL，31.0％纯度)并搅拌1h。将固体过滤并用水洗涤两次(600mL)，并在高真空下干燥获得残余物。获得了呈白色固体的产物2-(羟甲基)-N-甲基-5-硝基苯甲酰胺(560g，粗品)。LCMS：RT＝0.537min，MS m/z＝193.2。1H NMR：400MHz DMSOδ8.57(br d,J＝4.4Hz,1H),8.31(dd,J＝2.4,8.6Hz,1H),8.21(d,J＝2.4Hz,1H),7.86(d,J＝8.8Hz,1H),5.54(t,J＝5.6Hz,1H),4.72(d,J＝5.5Hz,2H),2.78(d,J＝4.4Hz,3H)。
(2-((甲基氨基)甲基)-4-硝基苯基)甲醇的合成
将2-(羟甲基)-N-甲基-5-硝基苯甲酰胺(560g，2.66mol)在THF(5000mL)中的溶液冷却至0℃，然后逐滴添加BH3-Me2S(506g，6.66mol)(2.0M，在THF中)持续60min，并将混合物加热至70℃保持5h。LCMS显示起始材料被完全消耗。完成后，在0℃下向反应混合物中添加在甲醇中的4M HCl(1200mL)，并在65℃下加热8h。将反应混合物冷却至在0℃，将固体过滤并在减压下浓缩。获得了呈白色固体的(2-((甲基氨基)甲基)-4-硝基苯基)甲醇(520g)。LCMS：RT＝0.742min，MS m/z＝197.1[M+H]+。1H NMR：400MHz DMSOδ9.25(br s,2H),8.37(d,J＝2.4Hz,1H),8.14(dd,J＝2.4,8.5Hz,1H),7.63(d,J＝8.4Hz,1H),5.72(br s,1H),4.65(s,2H),4.15(br s,2H),2.55-2.45(m,3H)
1-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)-N-甲基甲胺的合成
将(2-((甲基氨基)甲基)-4-硝基苯基)甲醇(520g，2.65mol)和咪唑(721g，10.6mol)在DCM(2600mL)中的溶液冷却至0℃，然后逐滴添加TBDPS-Cl(1.09kg，3.98mol，1.02L)，并将混合物搅拌2h。将混合物倒入冰冷的水(1000mL)中并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空下蒸发得到粗产物。将粗产物通过用乙酸乙酯:石油醚(10/1至1)洗脱的硅胶色谱法纯化，得到残余物。获得了呈黄色液体的1-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)-N-甲基甲胺(600g)。LCMS：产物：RT＝0.910min，MS m/z＝435.2[M+H]+
1H NMR：400MHz CDCl3δ8.23(d,J＝2.4Hz,1H),8.15(dd,J＝2.4,8.4Hz,1H),7.76(d,J＝8.4Hz,1H),7.71-7.66(m,4H),7.50-7.37(m,6H),4.88(s,2H),3.65(s,2H),2.39(s,3H),1.12(s,9H)
(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向1-(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯基)-N-甲基甲胺(400g，920.3mmol)在THF(4000mL)中的溶液中添加Fmoc-OSU(341.5g，1.01mol)和Et3N(186.2g，1.84mol，256.2mL)，并将混合物在25℃下搅拌1h。将混合物倒入水(1600mL)中并用乙酸乙酯(1000mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空下蒸发得到粗产物。将粗产物通过用石油醚:乙酸乙酯(1/0至1/1)洗脱的硅胶色谱法纯化，得到呈白色固体的(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(405g)。LCMS：RT＝0.931min，MS m/z＝657.2[M+H]+。
1H NMR：400MHz CDCl3δ8.21-7.96(m,1H),7.87-7.68(m,3H),7.68-7.62(m,4H),7.62-7.47(m,2H),7.47-7.28(m,9H),7.26-7.05(m,2H),4.81(br s,1H),4.62-4.37(m,4H),4.31-4.19(m,1H),4.08-3.95(m,1H),2.87(br d,J＝5.2Hz,3H),1.12(s,9H)。
(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
将(2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(3.0g，4.57mmol，1.0当量)在MeOH(90mL)和EtOAc(30mL)中的溶液脱气，并经由三通旋塞阀吹扫至N2的气球。重复脱气/N2吹扫2次后，添加10％ Pd/C deGussa型(0.486g，0.457mmol，0.1当量)。将所得混合物进行脱气，并经由三通旋塞阀吹扫至2H2的气球。在重复脱气/H2吹扫2次后，将反应在H2的气球压力下搅拌4小时。将反应脱气并吹扫至N2，通过硅藻土垫过滤，进一步用MeOH洗脱。在真空中去除挥发物并在高真空中抽吸后，获得了(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.78g，97％)。LCMS：MH+＝627.7；Rt＝1.59min(2min酸性法-方法A)。1H NMR：400MHz CDCl3δ7.80(br d,J＝7.2Hz,1H),7.74-7.67(m,5H),7.64(br d,J＝6.8Hz,1H),7.49-7.30(m,10H),7.23-7.06(m,2H),6.61-6.41(m,2H),4.66(br d,J＝7.2Hz,2H),4.55(s,2H),4.51-4.34(m,2H),4.32-4.10(m,1H),3.66(br s,2H),2.96-2.78(m,3H),,1.07(s,9H)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向2:1CH2Cl2/MeOH(60mL)中的(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.86g，4.56mmol，1.0当量)和(S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(1.71g，4.56mmol，1.0当量)中添加2-乙氧基喹啉-1(2H)-甲酸乙酯(2.256g，9.12mmol，2.0当量)。将均质溶液搅拌16小时，此时添加另外的(S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酸(0.340g，0.2当量)和2-乙氧基喹啉-1(2H)-甲酸乙酯(0.452g，0.4当量)以驱动反应完成。再搅拌5小时后，在真空中去除挥发物，并在通过ISCO SiO2色谱法(0％-5％ MeOH/CH2Cl2)纯化后，获得了(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.95g，65％)。LCMS：MH+＝984.1；Rt＝1.54min(2min酸性法-方法A)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯的合成
向THF(10mL)中的(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.05g，2.085mmol，1.0当量)中添加在MeOH(10.42mL，20.85mmol，10当量)中的2.0M二甲胺。搅拌16小时后，在真空中去除挥发物。将残余物溶解在CH2Cl2(20mL)中，并添加DIEA(0.533mL，4.17mmol，2当量)和氯甲酸炔丙酯(0.264mL，2.71mmol，1.3当量)。在rt下搅拌16小时后，将反应用CH2Cl2(20mL)稀释，用NaHCO3(饱和)、NaCl(饱和)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩，并通过ISCO SiO2色谱法(0％-15％ MeOH/CH2Cl2)纯化，产生(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯(1.04g，59％)。LCMS：MH+＝843.8；Rt＝1.35min(2min酸性法-方法A)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯的合成
向(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯(1.6g，1.90mmol，1.0当量)在THF(10.0mL)中的0℃溶液中添加在THF中的1.0M四丁基氟化铵(3.80mL，3.80mmol，2.0当量)。在加热至rt并搅拌16小时后，将挥发物在真空中去除，将残余物溶解在EtOAc中，用NaHCO3(饱和)、NaCl(饱和)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩，并将残余物通过ISCO SiO2色谱法(0％-30％MeOH/CH2Cl2)纯化，产生(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯(1.0g，87％)。LCMS：MH+＝605.7；Rt＝0.81min(2min酸性法-方法A)。
(S)-(1-((4-(羟甲基)-3-硝基苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向(4-氨基-2-硝基苯基)甲醇(10g，59.5mmol，1.0当量)、(S)-(1-氨基-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(23.64g，59.5mmol，1.0当量)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(8.50g，62.4mmol，1.05当量)在DMF(50mL)中的溶液中添加1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(11.97g，62.4mmol，1.05当量)。在环境温度搅拌16小时后，将混合物倒入水(4L)中并搅拌30分钟。将所得固体过滤、用水冲洗、并在真空下干燥。获得了(S)-(1-((4-(羟甲基)-3-硝基苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(31.49g，57.5mmol，97％)。LCMS：MH+＝548；Rt＝2.02min(5min酸性法-方法C)。
(S)-2-氨基-N-(4-(羟甲基)-3-硝基苯基)-5-脲基戊酰胺的合成
向(S)-(1-((4-(羟甲基)-3-硝基苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(31.49g，57.5mmol，1.0当量)在DMF(50mL)中的溶液中添加二甲胺(2M，在MeOH中，331mL，661mmol，11.5当量)。在环境温度下搅拌24小时后，将挥发物在真空下去除，并将所得残余物用乙醚(3×2L)研磨。将所得残余物在真空下干燥，并获得了(S)-2-氨基-N-(4-(羟甲基)-3-硝基苯基)-5-脲基戊酰胺(21.85g，57.5mmol，99％)。LCMS：MH+＝326.4；Rt＝0.35min(2min酸性法-方法A)。
((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)-3-硝基苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
向(S)-2-氨基-N-(4-(羟甲基)-3-硝基苯基)-5-脲基戊酰胺(10.89g，28.8mmol，1.0当量)、(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸(6.25g，28.8mmol，1.0当量)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(3.92g，28.8mmol，1.0当量)在DMF(40mL)中的溶液中添加1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(5.52g，28.8mmol，1.0当量)。在环境温度下搅拌24小时后，将混合物逐滴添加到水(2L)中，搅拌30分子，并冷却至4℃过夜。用NaCl使混合物饱和，并将所得固体滤出并在真空下干燥。获得了((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)-3-硝基苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(11.96g，22.8mmol，79％)。LCMS：MH+＝525.4；Rt＝0.79min(2min酸性法-方法A)。
((S)-1-(((S)-1-((4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-硝基苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
向((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)-3-硝基苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(11.96g，22.8mmol，1.0当量)和咪唑(15.52g，228mmol，10当量)在DMF(31mL)中悬浮液中添加叔丁基二甲基氯硅烷(13.68g，90.76mmol，4.0当量)。将所得混合物在环境温度下搅拌48小时，然后在45℃下加热4小时。将混合物倒入水中并用搅拌96小时。将固体过滤并用水(2×100mL)洗涤并在真空下干燥。通过SiO2 ISCO色谱法(0％-30％甲醇/二氯甲烷)纯化后，获得了((S)-1-(((S)-1-((4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-硝基苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(8.02g，12.56mmol，55％)。LCMS：MH+＝639.6；Rt＝1.22min(2min酸性法-方法A)。
((S)-1-(((S)-1-((3-氨基-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
在氮气氛围下，向((S)-1-(((S)-1-((4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-硝基苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(8.02g，12.56mmol，1.0当量)在甲醇(250mL)中的溶液中添加钯碳(10wt％，2.00g，1.884mmol，0.15当量)。将混合物置于1atm二氢下，并将其在环境温度下搅拌18小时。将混合物通过硅藻土过滤并在真空下浓缩。通过SiO2 ISCO色谱法(0％-40％甲醇/二氯甲烷)纯化后，获得了((S)-1-(((S)-1-((3-氨基-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(4.82g，7.92mmol，63％)。LCMS：MH+＝609.6；Rt＝2.65min(5min酸性法-方法C)。
((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)-3-(2-(((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
向甘氨酸(3.19g，42.5mmol，1.0当量)在2M氢氧化钠水溶液(63.3mL，127mmolNaOH，3.0当量)中的溶液中添加氯甲酸炔丙酯(5.0g，42.5mmol，1.0当量)。将所得混合物在环境温度下搅拌3小时。将混合物用乙酸乙酯(3×250mL)萃取。将合并的有机层经硫酸镁干燥，过滤并在真空下去除挥发物。干燥后，获得了((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)甘氨酸(3.97g，25.3mmol，59％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 3.48(t,J＝2.40Hz,1H)3.66(d,J＝6.19Hz,2H)4.63(d,J＝2.40Hz,2H)7.63(t,J＝6.13Hz,1H)12.57(br s,1H)。向((S)-1-(((S)-1-((3-氨基-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(2.7g，4.43mmol，1.0当量)在DMF(5mL)中的溶液中添加((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)甘氨酸(0.732g，4.66mmol，1.05当量)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(0.664g，4.88mmol，1.1当量)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.935g，4.88mmol，1.1当量)。将所得混合物在环境温度下搅拌1小时，然后滴入水(500mL)中，并再搅拌20分钟。将所得沉淀过滤，用水洗涤，并在真空下干燥。通过SiO2 ISCO色谱法(0％-50％甲醇/二氯甲烷)纯化后，获得了((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)-3-(2-(((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(LI-4)(1.52g，2.40mmol，54％)。LCMS：MH+＝634.6；Rt＝1.97min(5min酸性法-方法C)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.76-0.91(m,6H)1.30-1.47(m,11H)1.51-1.73(m,2H)1.87-2.00(m,1H)2.89-3.07(m,2H)3.50(t,J＝2.32Hz,1H)3.73-3.87(m,3H)4.37-4.47(m,3H)4.65(d,J＝2.45Hz,2H)5.30(t,J＝5.44Hz,1H)5.38(s,2H)5.96(t,J＝5.81Hz,1H)6.72(br d,J＝8.93Hz,1H)7.25(d,J＝8.44Hz,1H)7.45(dd,J＝8.25,2.02Hz,1H)7.78(br t,J＝5.87Hz,1H)7.87-8.00(m,2H)9.51(s,1H)10.04(s,1H)。向((S)-1-(((S)-1-((3-氨基-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(2.7g，4.43mmol，1.0当量)在DMF(5mL)中的溶液中添加((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)甘氨酸(0.732g，4.66mmol，1.05当量)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(0.664g，4.88mmol，1.1当量)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.935g，4.88mmol，1.1当量)。将所得混合物在环境温度下搅拌1小时，然后滴入水(500mL)中，并再搅拌20分钟。将所得沉淀过滤，用水洗涤，并在真空下干燥。通过SiO2ISCO色谱法(0％-50％甲醇/二氯甲烷)纯化后，获得了((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)-3-(2-(((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)氨基)乙酰胺基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1.52g，2.40mmol，54％)。LCMS：MH+＝634.6；Rt＝1.97min(5min酸性法-方法C)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.76-0.91(m,6H)1.30-1.47(m,11H)1.51-1.73(m,2H)1.87-2.00(m,1H)2.89-3.07(m,2H)3.50(t,J＝2.32Hz,1H)3.73-3.87(m,3H)4.37-4.47(m,3H)4.65(d,J＝2.45Hz,2H)5.30(t,J＝5.44Hz,1H)5.38(s,2H)5.96(t,J＝5.81Hz,1H)6.72(br d,J＝8.93Hz,1H)7.25(d,J＝8.44Hz,1H)7.45(dd,J＝8.25,2.02Hz,1H)7.78(br t,J＝5.87Hz,1H)7.87-8.00(m,2H)9.51(s,1H)10.04(s,1H)。
2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基-N,N-二(丙-2-炔-1-基)苯甲酰胺的合成
向2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基苯甲酸(1.00g，2.30mmol，1.0当量)和二炔丙胺(0.257g，2.76mmol，1.2当量)在二氯甲烷(6mL)中的溶液中添加(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(1.048g，2.76mmol，1.2当量)和N,N-二异丙基乙胺(0.445g，3.44mmol，1.5当量)。将所得混合物在环境温度下搅拌1小时，然后用水稀释，用乙醚(3×25mL)萃取，经硫酸钠干燥并浓缩。通过SiO2 ISCO色谱法(0％-100％乙酸乙酯/庚烷)纯化后，获得了2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基-N,N-二(丙-2-炔-1-基)苯甲酰胺(1.08g，2.115mmol，92％)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ8.35(dd,J＝8.6,2.3Hz,1H),8.20(d,J＝2.3Hz,1H),8.02-7.92(m,1H),7.71-7.62(m,4H),7.51-7.35(m,6H),4.87(s,2H),4.39(s,2H),3.80(s,2H),2.21(s,1H),2.08(d,J＝7.7Hz,1H),1.13(s,9H)。
5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-N,N-二(丙-2-炔-1-基)苯甲酰胺的合成
向2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-硝基-N,N-二(丙-2-炔-1-基)苯甲酰胺(1.08g，2.115mmol，1.0当量)在乙醇(4mL)和水(4mL)中的搅拌悬浮液中添加锌粉(0.553g，8.46mmol，4当量)和氯化铵(0.453g，8.46mmol，4当量)。将所得混合物在环境温度下搅拌24小时，然后用水稀释并且用乙酸乙酯(3×25mL)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。在真空下干燥后，获得了5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-N,N-二(丙-2-炔-1-基)苯甲酰胺(972mg，2.02mmol，96％)。LCMS：MH+＝481.4；Rt＝1.33min(2min酸性法-方法A)。
(S)-5-(2-氨基-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-N,N-二(丙-2-炔-1-基)苯甲酰胺的合成
向5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-N,N-二(丙-2-炔-1-基)苯甲酰胺(972mg，2.02mmol，1.0当量)、(S)-(1-氨基-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(804mg，2.02mmol，1.0当量)和(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(846mg，2.22mmol，1.1当量)在DMF(4mL)中的溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(0.53mL，3.03mmol，1.5当量)。将所得混合物在环境温度下搅拌18小时，然后倒入水(400mL)中并搅拌3小时。将沉淀过滤并在真空下干燥，然后溶解在2M二甲胺的四氢呋喃溶液(2.02mL，4.04mmol，2当量)中，并在环境温度下搅拌4小时。在真空下去除挥发物，并在通过SiO2 ISCO色谱法纯化后，获得了(S)-5-(2-氨基-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-N,N-二(丙-2-炔-1-基)苯甲酰胺(1.018g，1.596mmol，79％)。LCMS：MH+＝638.6；Rt＝1.22min(2min酸性法-方法A)。
((S)-1-(((S)-1-((4-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-(二(丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
向(S)-5-(2-氨基-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-N,N-二(丙-2-炔-1-基)苯甲酰胺(1.00g，1.568mmol，1.0当量)、(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸(0.341g，1.568mmol，1.0当量)和(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(0.656g，1.725mmol，1.1当量)在DMF(3mL)中的溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(0.41mL，2.352mmol，1.5当量)。在环境温度下搅拌1小时后，将混合物用水(30mL)和盐水(30mL)稀释，并用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过SiO2ISCO色谱法(0％-50％甲醇/二氯甲烷)纯化后，获得了((S)-1-(((S)-1-((4-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-(二(丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1.30g，1.553mmol，99％)。LCMS：MH+＝837.5；Rt＝1.32min(2min酸性法-方法A)。
((S)-1-(((S)-1-((3-(二(丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基)-4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
向((S)-1-(((S)-1-((4-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-(二(丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1.30g，1.553mmol，1.0当量)在四氢呋喃(5mL)中的搅拌溶液中逐滴添加1M四丁基氟化铵在四氢呋喃中的溶液(3.11mL，3.11mmol，2.0当量)。在环境温度下搅拌18小时后，将溶剂在真空下去除。通过SiO2 ISCO色谱法(0％-50％甲醇/二氯甲烷)纯化后，获得了((S)-1-(((S)-1-((3-(二(丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基)-4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.703g，1.174mmol，76％)。LCMS：MH+＝599.4；Rt＝0.76min(2min酸性法-方法A)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.71-7.59(m,2H),7.52-7.43(m,1H),4.51(d,J＝29.4Hz,4H),4.11-4.04(m,2H),3.95-3.85(m,1H),3.28-3.06(m,2H),2.76(m,2H),2.11-2.03(m,1H),1.97-1.83(m,1H),1.75(dtd,J＝14.2,9.4,5.1Hz,1H),1.70-1.51(m,3H),1.44(m,9H),1.00-0.90(m,6H)。
(S)-(5-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
将(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-脲基戊酸(17.57克，63.8mmol)、(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(40克，63.8mmol)和HOAT(1.0M，在DMA中，63.8mL，63.8mmol)在DMF(36mL)中的溶液搅拌直至均质，在0*C浴中冷却，并添加EDC(12.23克，63.8mmol)。将反应搅拌，同时使浴温热至rt过夜。16小时后，经约30分钟将反应溶液在搅拌下滴加到4L H2O中，此时将ppt过滤，用H2O(1L)冲洗，并在真空下空气干燥。将湿滤饼溶解在15％iPrOH/EtOAc(约1.8L)中并用H2O(250mL)、NaHCO3(饱和)(250mL)和NaCl(饱和)(250mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并泵送，产生(S)-(5-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(54.47克，96％产率)。LC/MS:MH+＝884.7,Rt＝3.82min(5min.酸性法)。
(S)-(5-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向(S)-(5-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(33.29克，37.7mmol)在THF(45mL)中的溶液中添加AcOH(12.93mL，226mmol)，接着添加在THF中的1.0M TBAF(56.6mL，56.6mmol)。搅拌72小时后，在真空中去除挥发物，并将残余物在15％iPrOH/EtOAc(1.5L)和H2O(300mL)之间分配，混合，分离，进一步用H2O(5×350mL)、用NaHCO3(饱和)(2×300mL)、用NaCl(饱和)(300mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩，泵送，用Et2O研磨并过滤，产生(S)-(5-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(19.17克，79％产率)。LC/MS:MH+＝646.7,Rf＝2.28min.(5min酸性法)。
(S)-(5-(2-氨基-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
将(S)-(5-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(15g，23.23mmol)溶解在DCM(30mL)中，在冰浴中冷却，并经5min缓慢添加TFA(28.5mL，372mmol)。将反应在冰浴中保持搅拌持续1hr。将反应缓慢升温至RT，并在RT下搅拌1小时。在真空中去除挥发物。将产物再溶于二氯乙烷(210mL)中。在真空中去除所得溶液。将该过程再重复2次(总共3次)获得深黄色固体。将固体悬浮在乙醚(300mL)中。将其超声处理10min，然后倾析。将该过程再重复2次。通过真空过滤来收集固体。在真空下空气干燥过夜后，将固体溶解在MeOH(100mL)中，并经约20分钟将该溶液逐滴添加到7N氨的MeOH溶液(201ml，402mmol)中。搅拌30分钟后，将挥发物在真空中去除，用Et2O研磨后，获得了(S)-(5-(2-氨基-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(15.75克)。LC/MS:MH+＝546.5,Rt＝1.43min.(5min酸性法)。将材料按原样用于下一步骤。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
将Boc-Val-OH(6.47g，29.8mmol)、EDC.HCl(5.48g，28.7mmol)和HOAT(3.89g，28.7mmol)溶解在DMF(35mL)中并在RT下搅拌10min。此时添加(S)-(5-(2-氨基-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(13g，23.83mmol)。添加DIPEA(4.15mL，23.83mmol)。搅拌30分钟后，在剧烈搅拌下将反应混合物逐滴添加到4L水中。30分钟后，通过真空过滤收集沉淀物。将滤饼用水(1200mL)洗涤。将产物在真空下空气干燥，用MTBE研磨，并在真空下干燥，产生(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(12.8g，72％产率)。LC/MS:MH+＝745.7,2.37min.(5min酸性法)。
(5-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向(S)-(5-(2-氨基-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(9.4g，14.25mmol)、HOAT(2.32g，17.1mmol)和((烯丙氧基)羰基)-L-缬氨酸(3.44g，17.10mmol)在DMF(27mL)中的溶液中添加DIEA(5.53g，42.7mmol)和EDC(3.28g，17.1mmol)。搅拌2小时后，在搅拌下将溶液滴加到3L H2O中。通过真空过滤收集形成的固体，进一步用H2O冲洗并在真空下空气干燥，产生(5-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(7.69g，74％产率)。LC/MS:MH+＝729.6,Rt＝2.27min(5min酸性法)。
(5-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
在rt下，向(5-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(4.0g，5.5mmol)和NaHCO3(2.8g，33mmol)在THF(55mL)中的异质溶液中添加亚硫酰氯(1.0mL，14mmol)。搅拌1小时后，将溶液在EtOAc和NaHCO3(饱和)之间分配，进一步用EtOAc萃取，经MgSO4干燥，过滤，浓缩，通过SiO2色谱法(0％-20％iPrOH/CH2Cl2洗脱剂)纯化。浓缩后，获得了(5-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.1g，51％产率)。LC/MS:MH+＝747.6,Rt＝2.72min(5min酸性法)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向((5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸9H-芴-9-基)甲酯(2.0g，2.685mmol)和碳酸双(4-硝基苯基)酯(1.634g，5.37mmol)在NMP(7mL)中的溶液中添加DIEA(1.4mL，8.06mmol)。搅拌2小时后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.0g，82％产率)。HRMS：MH+＝910.4000,Rt＝3.07min(5min酸性法)。
(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
在冰浴中用25％ TFA/CH2Cl2(12mL)处理(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.0克，2.68mmol)。搅拌一小时后，在真空中去除挥发物，添加二氯乙烷，并在真空中去除挥发物。将残余物溶解在MeOH(20mL)中，并将溶液逐滴添加到7M氨的MeOH溶液(7.67mL，53.7mmol)中。搅拌30分钟后，在真空中去除挥发物，将残余物溶解在MeOH中，并通过ISCO RP-HPLC(不含酸性改性剂)纯化。冻干后，获得了(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(1.162g，67％产率)。LC/MS:MH+＝645.5,Rt＝0.75min(2min酸性法)。
(5-((S)-2-((S)-2-(2-叠氮基乙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(400mg，0.620mmol)、2-叠氮基乙酸(60.4μl，0.806mmol)和HATU(307mg，0.806mmol)在DMF(5ml)中的溶液中添加DIPEA(433μl，2.481mmol)。搅拌30min后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(5-((S)-2-((S)-2-(2-叠氮基乙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(220mg，49％产率)。LC/MS:MH+＝728.4,Rt＝0.96min(2min酸性法)。
(5-((S)-2-((S)-2-(2-叠氮基乙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
在0℃下，向(5-((S)-2-((S)-2-(2-叠氮基乙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(220mg，302μmol)在CH2Cl2(15mL)中的浆液中添加亚硫酰氯(110μL，1510μmol)。搅拌2小时后，在真空中去除挥发物，并将残余物用Et2O研磨。将材料按原样用于下一步骤。LC/MS:MH+＝746.4,Rt＝1.13min(2min酸性法)。
(5-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯TFA盐(1.65g，1.89mmol)和(4-硝基苯基)碳酸2-叠氮基乙酯(1.07g，4.25mmol)在DMF(9.5mL)中的溶液中添加DIEA(986μL，5.66mmol)。搅拌2小时后，将溶液在EtOAc和NH4Cl(饱和)之间分配，用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并通过SiO2色谱法(0％-30％ MeOH/CH2Cl2洗脱剂)纯化。浓缩后，获得了(5-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(735mg，51％产率)。LC/MS:MH+＝758.7,Rt＝2.20min(5min酸性法)。
(5-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
在0℃下，向(5-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(735mg，970μmol)和NaHCO3(570mg，6790μmol)在THF(10mL)中的溶液中添加亚硫酰氯(283μL，3880μmol)。搅拌1小时后，将溶液在EtOAc和NaHCO3(饱和)之间分配，进一步用EtOAc萃取，经MgSO4干燥，过滤，浓缩，通过SiO2色谱法(0-1＝20％iPrOH/CH2Cl2洗脱剂)纯化。浓缩后，获得了(5-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(578mg，77％产率)。LC/MS:MH+＝776.6,Rt＝2.66min(5min酸性法)。
(S)-(5-(2-氨基丙酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
将Boc-Ala-OH(0.724g，3.83mmol)、EDC.HCl(0.734g，3.83mmol)和HOAT(0.521g，3.83mmol)溶解在DMF(3mL)中。将反应在RT下搅拌10min，此时添加(5-氨基-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2g，3.19mmol)。将反应在RT下搅拌10min。在剧烈搅拌下将反应混合物逐滴添加到大约250mL水中。形成了沉淀物，但它非常粘。将溶液在RT下搅拌30min并超声处理5min。通过真空过滤来收集沉淀物。将滤饼用水(100mL)洗涤。将产物在真空下空气干燥获得所需的酰胺产物(2.36克，93％产率)。将酰胺产物用25％ TFA/CH2Cl2(5.33mL)处理一小时，此时在真空中去除挥发物。为了切断已经部分形成的TFA酯，将残余物溶解在MeOH(10mL)中并逐滴滴加到7N氨的MeOH溶液(15.32mL，107mmol)中。在真空中去除挥发物，将残余物用Et2O研磨并泵送，产生(S)-(5-(2-氨基丙酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(3.08克，94％产率)。LC/MS:MH+＝460.5,Rt＝1.49min(5min酸性法)。将材料按原样用于下一步骤。
(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
将Boc-Val-OH(0.567g，2.176mmol)、EDC.HCl(0.501g，2.61mmol)和HOAT(0.355g，2.61mmol)溶解在DMF(4mL)中。将反应在RT下搅拌10min，此时添加(S)-(5-(2-氨基丙酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(1g，2.176mmol)。将反应在RT下搅拌10min。在剧烈搅拌下将反应混合物逐滴添加到大约1L水中。将溶液在RT下搅拌30min并超声处理5min。通过真空过滤来收集沉淀物。将滤饼用水(100mL)洗涤。将产物在真空下空气干燥获得所需的粗酰胺产物(1.6克)。将酰胺产物(1.06g，1.61mmol)用25％ TFA/CH2Cl2(5.33mL)处理一小时，此时在真空中去除挥发物。为了切断已经部分形成的TFA酯，将残余物溶解在MeOH(10mL)中并逐滴滴加到7N氨的MeOH溶液(15.32mL，107mmol)中。在真空中去除挥发物，将残余物溶解在DMSO中并通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯三氟乙酸盐(300mg，33％产率)。LC/MS:MH+＝559.6,Rt＝1.58min(5min酸性法)。
(5-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯三氟乙酸盐(150mg，223μmol)和(4-硝基苯基)碳酸2-叠氮基乙酯(112mg，446μmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加DIEA(1194μL，1115μmol)。搅拌1小时后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(5-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(185mg，约100％产率)。LC/MS:(M-H2O)+H+＝654.6,Rt＝2.45(5min酸性法)。
(5-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(氯甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
在冰浴中，向(5-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(185mg，235μmol)和碳酸氢钠(138mg，1648μmol)在THF(7mL)中的混合物中添加亚硫酰氯(69μL，942μmol)。搅拌30分钟后，将溶液逐滴添加到NaHCO3(饱和)(100mL)中，然后用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机物用NaCl(饱和)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并通过SiO2色谱法(0％-20％iPrOH/CH2Cl2洗脱剂)纯化，产生(5-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(氯甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(115mg，71％产率)。LC/MS:MH+＝690.6,Rt＝2.96min(5min酸性法)。
((S)-6-(((S)-1-(((S)-1-((3-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-6-氧代己烷-1,5-二基)二氨基甲酸叔丁基丙-2-炔-1-基酯的合成
向N6-(叔丁氧基羰基)-N2-((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)-L-赖氨酸(88mg，268μmol)、HOAT(36.4mg，268μmol)和EDC(51.3mg，268μmol)在DMF(2mL)中的溶液中搅拌10分钟，此时添加DIEA(117μL，669μmol)和(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯TFA盐(150mg，223μmol)。搅拌20分钟后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了((S)-6-(((S)-1-(((S)-1-((3-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-6-氧代己烷-1,5-二基)二氨基甲酸叔丁基丙-2-炔-1-基酯(162mg，74％产率)。LC/MS:MH+＝869.8,Rt＝2.66min(5min酸性法)。
((S)-6-(((S)-1-(((S)-1-((3-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-(氯甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-6-氧代己烷-1,5-二基)二氨基甲酸叔丁基丙-2-炔-1-基酯的合成
在冰浴中，向((S)-6-(((S)-1-(((S)-1-((3-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-6-氧代己烷-1,5-二基)二氨基甲酸叔丁基丙-2-炔-1-基酯(162mg，165μmol)和碳酸氢钠(97mg，1154μmol)在THF(7mL)中的混合物中添加亚硫酰氯(48μL，659μmol)。搅拌30分钟后，将溶液逐滴添加到NaHCO3(饱和)(100mL)中，然后用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机物用NaCl(饱和)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并通过SiO2色谱法(0％-20％iPrOH/CH2Cl2洗脱剂)纯化，产生((S)-6-(((S)-1-(((S)-1-((3-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-(氯甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-6-氧代己烷-1,5-二基)二氨基甲酸叔丁基丙-2-炔-1-基酯(115mg，71％产率)。LC/MS:MH+＝887.8,Rt＝3.10min(5min酸性法)。
((S)-6-(((S)-1-(((S)-1-((3-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-6-氧代己烷-1,5-二基)二氨基甲酸叔丁基丙-2-炔-1-基酯的合成
向N6-(叔丁氧基羰基)-N2-((丙-2-炔-1-基氧基)羰基)-L-赖氨酸(1.787g，5.44mmol)和HATU(1.88g，4.95mmol)在DMF(20mL)中的溶液中添加DIEA(862μL，4.95mmol)。搅拌5分钟后，添加在DMF(10mL)中的(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(3.19g，4.95mmol)。再搅拌2小时后，将溶液滴加到1L H2O中。将所得固体通过过滤收集，溶解在CH2Cl2/MeOH中并通过SiO2色谱法纯化，产生((S)-6-(((S)-1-(((S)-1-((3-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-6-氧代己烷-1,5-二基)二氨基甲酸叔丁基丙-2-炔-1-基酯(900mg，19％产率)。LC/MS:MH+＝955.9,Rt＝2.55min(5min酸性法)。
((S)-6-(((S)-1-(((S)-1-((3-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-(氯甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-6-氧代己烷-1,5-二基)二氨基甲酸叔丁基丙-2-炔-1-基酯的合成
在冰浴中，向((S)-6-(((S)-1-(((S)-1-((3-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-6-氧代己烷-1,5-二基)二氨基甲酸叔丁基丙-2-炔-1-基酯(507mg，531μmol)在MeCN(8mL)中的混合物中添加亚硫酰氯(97μL，1327μmol)。搅拌60分钟后，在真空中去除挥发物，将残余物溶解在CH2Cl2(20mL)+MeOH(1mL)中，并添加Boc2O(246mg，1062μmol)和DIEA(556μL，3180μmol)。搅拌60分钟后，在真空中去除挥发物，将残余物溶解在CH2Cl2中并通过SiO2色谱法(0％-30％ MeOH/CH2Cl2)纯化，产生((S)-6-(((S)-1-(((S)-1-((3-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-(氯甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-6-氧代己烷-1,5-二基)二氨基甲酸叔丁基丙-2-炔-1-基酯(342mg，66％产率)。LC/MS:MH+＝973.9,Rt＝1.21min(2min酸性法)。
(S)-5-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,10,13,16,19,22-六氧杂-4,7-二氮杂二十五烷-25-酸的合成
向Fmoc-Glu(OTBu)-OSu(200mg，0.383mmol)在DMF(1ml)中的溶液中添加氨基-PEG6-酸(271mg，0.765mmol)在MeOH(1ml)中的溶液，然后添加DIPEA(267μl，1.531mmol)。将所得溶液在RT下搅拌30min。将粗混合物通过C18柱(100g柱，MeCN/水，含0.05％TFA 0％-100％，经16CV)纯化，获得(S)-5-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,10,13,16,19,22-六氧杂-4,7-二氮杂二十五烷-25-酸(273mg，100％产率)。LC/MS:MH+＝717.5,Rt＝1.12min(3min酸性运行)。
(S)-21-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-20-氧代-4,7,10,13,16-五氧杂-19-氮杂二十四烷二酸的合成
在0℃下，在冰水浴中向预冷却的(S)-5-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,10,13,16,19,22-六氧杂-4,7-二氮杂二十五烷-25-酸(273mg，0.381mmol)和三乙基硅烷(0.061mL，0.381mmol)中添加预冷却的TFA(25％，在DCM中，v/v)(11.700mL，38.0mmol)。将混合物在0℃下搅拌15min，然后升至RT，并在RT下搅拌40min。将粗混合物在高真空下浓缩，然后在高真空下干燥过夜，然后通过C18柱(50g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-100％，经16CV)纯化，获得(S)-21-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-20-氧代-4,7,10,13,16-五氧杂-19-氮杂二十四烷二酸(196mg，78％产率)。LC/MS:MH+＝661.3,Rt＝0.91min(3min酸性运行)。
(S)-5-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,10,13,16,19,22,25-七氧杂-4,7-二氮杂二十八烷-28-酸的合成
向Fmoc-Glu(OTBu)-OSu(50mg，0.096mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液中添加氨基-PEG6-酸(67.6mg，0.191mmol)在MeOH(1ml)中的溶液，然后添加DIPEA(66.8μl，0.383mmol)。将所得溶液在RT下搅拌30min。将粗混合物通过C-18柱(100g柱，MeCN/水，含0.05％TFA0％-100％，经16CV)纯化，获得(S)-5-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,10,13,16,19,22,25-七氧杂-4,7-二氮杂二十八烷-28-酸(44mg，60％产率)。LC/MS:MH+＝761.5,Rt＝1.12min(3min酸性运行)。
(S)-24-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-23-氧代-4,7,10,13,16,19-六氧杂-22-氮杂二十七烷二酸的合成
在0℃下，在冰水浴中向预冷却的(S)-5-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,10,13,16,19,22,25-七氧杂-4,7-二氮杂二十八烷-28-酸(43.9mg，0.058mmol)和三乙基硅烷(9.22μl，0.058mmol)中添加预冷却的TFA(25％，在DCM中，v/v)(1778μl，5.77mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌15min，然后升至RT，并在RT下搅拌40min。将粗混合物在高真空下浓缩，然后在高真空下干燥过夜，并且通过C18柱(50g柱，MeCN/水，0％-100％，含0.05％ TFA，经16CV)纯化，获得(S)-24-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-23-氧代-4,7,10,13,16,19-六氧杂-22-氮杂二十七烷二酸(16mg，39％产率)。LC/MS:MH+＝705.4,Rt＝0.91min(3min酸性运行)。
(氮烷二基双(乙烷-2,1-二基))双(甲基氨基甲酸)二叔丁酯的合成
在配备有磁力搅拌棒的40mL玻璃小瓶中，将碳载钯(18.32mg，0.172mmol)溶解在EtOH(体积：5mL)中。添加(2-氨基乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(0.308mL，1.722mmol)和(2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.298mL，1.722mmol)。将反应气氛转换为氢气(用真空处理反应室并用氮气重新填充，重复4次。然后用真空处理反应室并用氢气重新填充，重复4次)。将反应在RT下搅拌16hr。通过LC-MS分析反应，并发现所需产物(LC-MS粗品：产物保留时间：1.45min，[M]+:332.3)。将反应气氛转换为氮气。将反应溶液通过硅藻土垫过滤。然后用EtOAc(20mL)洗涤垫。将合并的有机层在减压下去除。然后将产物在高真空下干燥30min。假设172μmol，将产物(氮烷二基双(乙烷-2,1-二基))双(甲基氨基甲酸)二叔丁酯按原样用于下一步骤。
(11-(2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酸(367mg，1.034mmol)和HATU(393mg，1.034mmol)溶解在DMF(8mL)中。添加DIPEA(0.542mL，3.10mmol)。将反应在RT下搅拌10min。将混合物添加到(氮烷二基双(乙烷-2,1-二基))双(甲基氨基甲酸)二叔丁酯(172μmol)中。搅拌30分钟后，将反应混合物倒入饱和氯化铵水溶液(100mL)中。将其用EtOAc(2×40mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4处理，过滤并在减压下去除。然后用EtOAc/正庚烷洗脱剂通过SiO2色谱法纯化产物。去除挥发物后，获得了(11-(2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯。LC/MS:MH+＝669.3,Rt＝3.03min(5min酸性运行)。
(1-(9H-芴-9-基)-11-(2-(甲基氨基)乙基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯三氟乙酸盐的合成
向(11-(2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(647mg，967μmol)在CH2Cl2(4mL)中的溶液中添加TFA(75μL，967μL)。在rt下静置14小时后，在真空中去除挥发物，将残余物溶解在DMSO中并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(1-(9H-芴-9-基)-11-(2-(甲基氨基)乙基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯三氟乙酸盐(110mg，20％)。LC/MS:MH+＝569.6,Rt＝0.89min(2min酸性运行)。
11-(2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)-1-(9H-芴-9-基)-14-甲基-3,10,15-三氧代-2,7,18,21-四氧杂-4,11,14-三氮杂二十四烷-24-酸叔丁酯的合成
将酸-PEG2-叔丁酯(106mg，0.405mmol)和HATU(147mg，0.387mmol)在DMF(2mL)中合并。添加DIPEA(0.322mL，1.841mmol)。将其在RT下放置5min。添加(1-(9H-芴-9-基)-11-(2-(甲基氨基)乙基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯TFA盐(251mg，0.368mmol)。将反应在RT下放置5min。将反应用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了11-(2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)-1-(9H-芴-9-基)-14-甲基-3,10,15-三氧代-2,7,18,21-四氧杂-4,11,14-三氮杂二十四烷-24-酸叔丁酯(199mg，67％)。LC/MS:MH+＝813.9,Rt＝1.24min(2min酸性运行)。
1-(9H-芴-9-基)-14-甲基-11-(2-(甲基氨基)乙基)-3,10,15-三氧代-2,7,18,21-四氧杂-4,11,14-三氮杂二十四烷-24-酸的合成
将(11-(2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(199mg，245μmol)用2:1CH2Cl2/TFA(3mL)处理1小时，此时在真空中去除挥发物。将残余物溶解在DMSO中并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了呈TFA盐的1-(9H-芴-9-基)-14-甲基-11-(2-(甲基氨基)乙基)-3,10,15-三氧代-2,7,18,21-四氧杂-4,11,14-三氮杂二十四烷-24-酸(166mg，88％产率)。LC/MS:MH+＝656.3,Rt＝0.76min(2min酸性运行)。
(2-(3-(双(2-(甲基氨基)乙基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯三氟乙酸盐的合成
将(11-(2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(614mg，918μmol)用25％TFA/CH2Cl2(8mL)处理一小时，此时在真空中去除挥发物。将残余物溶解在MeCN/H2O中并冻干，产生(2-(3-(双(2-(甲基氨基)乙基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯三氟乙酸盐。LC/MS:MH+＝469.1,Rt＝1.05min(5min酸性法)。
1-(9H-芴-9-基)-14-甲基-11-(2-(甲基氨基)乙基)-3,10,15-三氧代-2,7,18,21-四氧杂-4,11,14-三氮杂二十四烷-24-酸叔丁酯三氟乙酸盐的合成
向3-(2-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)丙酸(40mg，152μmol)和HATU(69.6mg，183μmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIEA(160μL，915μmol)。搅拌5分钟后，添加(2-(3-(双(2-(甲基氨基)乙基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯三氟乙酸盐(425mg，610μmol)。再搅拌30分钟后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了1-(9H-芴-9-基)-14-甲基-11-(2-(甲基氨基)乙基)-3,10,15-三氧代-2,7,18,21-四氧杂-4,11,14-三氮杂二十四烷-24-酸叔丁酯三氟乙酸盐(26.1mg，21％产率)。LC/MS:MH+＝713.6,Rt＝2.09min(5min酸性法)。
17-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-14,20-二甲基-13,21-二氧代-4,7,10,24,27-五氧杂-14,17,20-三氮杂三十烷二酸二叔丁酯的合成
向2,2-二甲基-4-氧代-3,7,10,13-四氧杂十六烷-16-酸(11.6mg，38μmol)和HATU(12mg，32μmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIEA(44μL，253μmol)。搅拌5分钟后，添加1-(9H-芴-9-基)-14-甲基-11-(2-(甲基氨基)乙基)-3,10,15-三氧代-2,7,18,21-四氧杂-4,11,14-三氮杂二十四烷-24-酸叔丁酯三氟乙酸盐(26.1mg，32μmol)。再搅拌30分钟后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了17-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-14,20-二甲基-13,21-二氧代-4,7,10,24,27-五氧杂-14,17,20-三氮杂三十烷二酸二叔丁酯(21.4mg，68％产率)。LC/MS:MH+＝1001.7,Rt＝1.95min(5min酸性法)。
17-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-14,20-二甲基-13,21-二氧代-4,7,10,24,27-五氧杂-14,17,20-三氮杂三十烷二酸的合成
将17-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-14,20-二甲基-13,21-二氧代-4,7,10,24,27-五氧杂-14,17,20-三氮杂三十烷二酸二叔丁酯(21.4mg，21μmol)用50％ TFA/CH2Cl2(2mL)处理一小时，此时在真空中去除挥发物。将残余物溶解在MeCN/H2O中并冻干，产生17-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-14,20-二甲基-13,21-二氧代-4,7,10,24,27-五氧杂-14,17,20-三氮杂三十烷二酸(20.2mg，99％产率)。LC/MS:MH+＝889.6,Rt＝1.94min(5min酸性法)。
16-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-4,7,10,13,19,22,25,28-八氧杂-16-氮杂三十一烷二酸的合成
将3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酸(30mg，0.13mmol)、HATU(42mg，0.11mmol)和DIPEA(79μL，0.46mmol)在DMF(1mL)中的混合物在RT下搅拌40min。将该溶液添加到4,7,10,13,19,22,25,28-八氧杂-16-氮杂三十一烷二酸HCl盐(得自BroadPharm)(50mg，0.091mmol)中。添加更多DIPEA(0.048mL，0.27mmol)。将混合物在RT下搅拌2.5h，用DMSO(1mL)稀释并加载到RP-C18 ISCO柱(50g，金)上。将柱用MeCN-水(0.1％ TFA改性剂)洗脱。将含有所需产物的级分合并并冻干，得到呈油状物的产物(29.7mg，45％产率)。LC/MS:MH+＝729.3,Rt＝0.77min(2min酸性法)。
(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)5-甲酯的合成
在0℃下，在冰水浴中向Boc-Glu(OMe)-OH(2.5g，9.57mmol)和HOSu(1.211g，10.53mmol)在THF(无水，25ml)中的搅拌溶液中分批添加DCC(2.073g，10.05mmol)。15min后，使反应混合物温热至室温并搅拌过夜。将固体DCU副产物滤出。将滤液浓缩。将所得粘稠油状物溶解在DCM(40ml)中，并静置1h，然后过滤以去除更多的DCU。蒸发滤液，并将所得玻璃状材料在高真空下干燥3h，获得(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)5-甲酯(3.47g固体泡沫，其不经进一步纯化进行下一反应)。LC/MS:M-Boc+1＝259.2,Rt＝0.81min(3min酸性运行)。
(S)-6-(3-甲氧基-3-氧代丙基)-2,2-二甲基-4,7-二氧代-3,11,14,17,20,23,26-七氧杂-5,8-二氮杂二十九烷-29-酸的合成
向(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)5-甲酯(117mg，0.326mmol)在DMF(1ml)中的溶液中添加氨基-PEG6-酸(231mg，0.653mmol)在MeOH(1ml)中的溶液，然后添加DIPEA(228μl，1.306mmol)。将所得溶液在Rt下搅拌30min。将粗混合物通过C18柱(50g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-100％，经16CV)纯化，获得(S)-6-(3-甲氧基-3-氧代丙基)-2,2-二甲基-4,7-二氧代-3,11,14,17,20,23,26-七氧杂-5,8-二氮杂二十九烷-29-酸(138mg，71％产率)。LC/MS:MH+＝597.5,Rt＝0.75min(3min酸性运行)。
3,8-二氧代-1-苯基-2,11,14-三氧杂-4,7-二氮杂十七烷-17-酸乙酯的合成
将3-(2-(3-乙氧基-3-氧代丙氧基)乙氧基)丙酸(2.50g，10.7mmol)、(2-氨基乙基)氨基甲酸苄酯(2.59g，11.2mmol)、HATU(4.46g，11.7mmol)和DIPEA(10mL，57mmol)在DMF(15mL)中的混合物在RT下搅拌30min。将混合物浓缩得到粗产物，将粗产物通过RP-C18ISCO柱(150g，金)通过用MeCN-水(0.1％ TFA)洗脱来纯化。含有所需产物的级分含有杂质。将级分合并并浓缩以去除大部分MeCN。通过添加固体K2CO3将水层碱化(pH 8至9)，并将产物用EtOAc萃取。将合并的EtOAc萃取物经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到呈油状物的粗产物。由于产物仍然不纯，将该粗产物在EtOAc和3M水性HCl之间分配。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到呈油状物的纯形式的标题产物(3.24g，74％产率)。LC/MS:MH+＝411.1,Rt＝0.82min(2min酸性法)。
2,2-二甲基-4,12-二氧代-3,15,18-三氧杂-5,8,11-三氮杂二十一烷-21-酸乙酯的合成
将3,8-二氧代-1-苯基-2,11,14-三氧杂-4,7-二氮杂十七烷-17-酸乙酯(3.24g，7.89mmol)、(2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯(1.257g，7.890mmol)和Pd-C(10％湿)(250mg，2.35mmol)在MeOH(20mL)中的混合物在RT下在气球压力下氢化3天。将混合物通过Celite过滤并浓缩。将残余油状物用DMSO和水稀释。通过过滤去除不溶性材料。将滤液加载到RP-C18ISCO柱(150g，金)上。将柱用MeCN-水(0.1％ TFA)洗脱。将含有所需产物的级分合并并浓缩，得到呈油状物的产物(TFA盐)(910mg，22％产率)。LC/MS:MH+＝420.5,Rt＝0.56min(2min酸性法)。
2,2-二甲基-4,12-二氧代-3,15,18-三氧杂-5,8,11-三氮杂二十一烷-21-酸的合成
将2,2-二甲基-4,12-二氧代-3,15,18-三氧杂-5,8,11-三氮杂二十一烷-21-酸乙酯(910mg，2.17mmol)和水性LiOH(1M，2.4mL，2.4mmol)在MeOH(2.4mL)和THF(2.4mL)中的混合物在50℃下加热0.5h。LCMS分析显示无反应。将混合物冷却至RT，并添加KOH(260mg，4.64mmol)在水(1mL)中的溶液。将混合物在RT下搅拌10min。将混合物浓缩，并将残余物溶于水中并加载到RP-C18 ISCO柱(50g，金)上。将柱用MeCN-水(0.1％ TFA)洗脱。将含有所需产物的级分合并并浓缩，得到呈白色固体的产物(TFA盐)(699mg，64％产率)。LC/MS:MH+＝392.5,Rt＝0.56min(2min酸性法)。
8-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-2,2-二甲基-4,12-二氧代-3,15,18-三氧杂-5,8,11-三氮杂二十一烷-21-酸的合成
将2,2-二甲基-4,12-二氧代-3,15,18-三氧杂-5,8,11-三氮杂二十一烷-21-酸(699mg，1.79mmol)、(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸(9H-芴-9-基)甲酯(783mg，2.32mmol)和DIPEA(1.00mL，5.73mmol)在DMF(10mL)中的混合物在RT下搅拌15h。添加更多的(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸(9H-芴-9-基)甲酯(800mg，2.37mmol)和DIPEA(0.50mL，2.9mmol)。将混合物在RT下搅拌1h。将混合物溶于DMSO中并加载到RP-C18 ISCO柱(150g，金)上。将柱用MeCN-水(0.1％ TFA)洗脱。将含有所需产物的级分合并并浓缩，得到呈油状物的产物(579mg)。LCMS分析显示产物的部分N-de-Boc。将混合物溶于MeCN(5mL)中并用Boc2O(250mg，1.15mmol)和DIPEA(1.00mL，5.73mmol)处理。将混合物在RT下搅拌40min并在EtOAc和0.5M水性HCl之间分配。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物(743mg)。将该产物不经纯化直接用于下一步骤。LC/MS:MH+＝614.5,Rt＝1.06min(2min酸性法)。
8-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-2,2-二甲基-4,12-二氧代-3,15,18-三氧杂-5,8,11-三氮杂二十一烷-21-酸烯丙酯的合成
将DMAP(0.012g，0.10mmol)添加到8-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-2,2-二甲基-4,12-二氧代-3,15,18-三氧杂-5,8,11-三氮杂二十一烷-21-酸(743mg)、DCC(0.250g，1.21mmol)和烯丙醇(0.200mL，2.94mmol)在THF(4mL)中的混合物中。将悬浮液在RT下搅拌30min(LCMS1)。将混合物浓缩并通过NP-ISCO(10％-100％ EtOAc/庚烷，然后5％MeOH/EtOAc)纯化。将含有所需产物的级分合并并浓缩，得到固体和油状物的混合物。将混合物用乙醚研磨，并通过过滤去除固体。将乙醚层浓缩，得到呈油状物的标题产物(400mg，34％产率，经最后2步)。LC/MS:MH+＝654.7,Rt＝1.16min(2min酸性法)。
4-(2-氨基乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,8-二氧代-2,11,14-三氧杂-4,7-二氮杂十七烷-17-酸烯丙酯的合成
将8-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-2,2-二甲基-4,12-二氧代-3,15,18-三氧杂-5,8,11-三氮杂二十一烷-21-酸烯丙酯(400mg，0.612mmol)和TFA(2mL，26.0mmol)在DCM(4mL)中的混合物在RT下搅拌20min。将混合物浓缩。将残余物溶于MeCN中并浓缩以去除尽可能多的TFA，得到粗产物，将该粗产物不经纯化用于下一步骤。LC/MS:MH+＝554.6,Rt＝0.75min(2min酸性法)。
13,21,30-三氧代-4,7,10,24,27,31-六氧杂-14,17,20-三氮杂三十四碳-33-烯酸的合成
将4-(2-氨基乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,8-二氧代-2,11,14-三氧杂-4,7-二氮杂十七烷-17-酸烯丙酯(来自前一步骤的粗品)、3-(2-(2-(3-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(0.250g，0.720mmol)和DIPEA(0.75mL，4.29mmol)在DMF(3mL)中的混合物在RT下搅拌40min。氨化完成(LC/MS MH+786.8,Rt＝0.96min，2min酸性法)。然后向其中添加在THF中的二甲胺(2M，3mL，6mmol)。将混合物在RT下搅拌30min。将混合物浓缩并将残余物用DMSO(5mL)稀释，加载到RP-C18 ISCO柱(100g，金)上，并用MeCN-水(0.1％TFA)洗脱。将含有所需产物的级分合并并浓缩，得到呈油状物的标题产物(TFA盐)(355mg，86％产率，经最后2步)。LC/MS:MH+＝564.6,Rt＝0.52min(2min酸性法)。
17-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,21,30-三氧代-4,7,10,24,27,31-六氧杂-14,17,20-三氮杂三十四碳-33-烯酸的合成
将13,21,30-三氧代-4,7,10,24,27,31-六氧杂-14,17,20-三氮杂三十四碳-33-烯酸(181mg，0.778mmol)、HATU(255mg，0.671mmol)和DIPEA(450μL，2.58mmol)在DMF(2mL)中的混合物在RT下搅拌10min。将其添加到13,21,30-三氧代-4,7,10,24,27,31-六氧杂-14,17,20-三氮杂三十四碳-33-烯酸三氟乙酸盐(350mg，516μmol)的DMF(1mL)溶液中。将混合物在RT下搅拌10min。将混合物用DMSO(3mL)稀释并加载到RP-ISCO柱(100g，金)上。将柱用MeCN-水(0.1％ TFA)洗脱。将含有所需产物的级分合并并通过ROTOVAP浓缩，得到呈油状物的产物(340mg)。由于产物含有约15％的N-de-Boc产物，因此将产物溶于MeCN(2mL)中并用Boc2O(40mg，0.184mmol)和DIPEA(100μL，0.573mmol)处理。将混合物在RT下搅拌30min，浓缩，并将残余物溶于DMSO中并通过RP-C18 ISCO柱(50g，金)(MeCN-水0.1％ TFA)纯化。将含有所需产物的级分合并并冻干，得到呈油状物的标题产物(236mg，59％产率)。LC/MS:MH+＝779.9,Rt＝0.80min(2min酸性法)。
(2-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成
在配备有磁力搅拌棒的40mL玻璃小瓶中，将碳载钯(0.067g，0.627mmol)、(2-氨基乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2g，6.27mmol)和(2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.999g，6.27mmol)溶解在EtOH(16mL)中。添加乙酸(0.036mL，0.627mmol)和DIPEA(1.096mL，6.27mmol)。将反应气氛转换为氢气(用真空处理反应室并用氮气重新填充，重复4次。然后用真空处理反应室并用氢气重新填充，重复4次)。将反应在RT下搅拌16hr。将反应溶液通过硅藻土垫过滤。然后用EtOAc(20mL)洗涤垫。将合并的有机层在减压下去除。然后将产物在高真空下干燥30min。将产物通过反相色谱法(用4mL DMSO稀释，ISCO金C18柱，150gr，水/MeCN作为洗脱剂，0.1％ TFA作为改性剂)纯化。将含有所需产物的级分合并并冻干，得到标题产物(TFA盐)(827mg，24％产率)。LC/MS:MH+＝426.4,Rt＝0.86(2min酸性法)。
(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基甲酸苄酯的合成
将(2-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(827mg，1.533mmol)溶解在DCM(12mL)中。添加氯甲酸苄酯(0.263mL，1.839mmol)和DIPEA(0.803mL，4.60mmol)。将反应在RT下搅拌1hr。将反应混合物倒入饱和氯化铵水溶液中。用EtOAc(2x)萃取水层。将合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4处理，过滤并在减压下去除。将产物通过快速色谱法(ISCO二氧化硅柱，120gr，MeOH/DCM作为洗脱剂，0％至10％)纯化，得到标题化合物(859mg，定量产率)。LC/MS:MH+(-Boc)460.5,Rt＝1.26min(2min酸性法)。(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)(2-氨基乙基)氨基甲酸苄酯的合成
在配备有磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶中，将(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基甲酸苄酯(859mg，1.535mmol)溶解于DCM(3mL)和TFA(1mL)中。将反应在RT下搅拌1hr。添加DCE(30mL)。将溶剂在减压下去除，获得标题产物(TFA盐)(986mg，93％产率)。将产物不经进一步纯化或表征直接使用。
7-((苄氧基)羰基)-1-(9H-芴-9-基)-3,11-二氧代-2,14,17-三氧杂-4,7,10-三氮杂二十烷-20-酸乙酯的合成
向3-(2-(3-乙氧基-3-氧代丙氧基)乙氧基)丙酸(230mg，0.982mmol)在DMF(1.5mL)中的溶液中添加HATU(299mg，0.785mmol)、DIPEA(0.572mL，3.27mmol)和(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)(2-氨基乙基)氨基甲酸苄酯(450mg，0.654mmol)。将混合物在RT下搅拌1h并浓缩。将残余物用DMSO(3mL)稀释并通过RP-ISCO色谱法(100G ISCO金C18柱，水/MeCN作为洗脱剂，0.1％ TFA作为改性剂)纯化。将所需产物级分合并并冻干，得到标题化合物(206mg，44.2％产率)。LC/MS:MH+＝676,Rt＝1.16min(2min酸性法)。
4-(2-氨基乙基)-3,8-二氧代-1-苯基-2,11,14-三氧杂-4,7-二氮杂十七烷-17-酸乙酯的合成
向7-((苄氧基)羰基)-1-(9H-芴-9-基)-3,11-二氧代-2,14,17-三氧杂-4,7,10-三氮杂二十烷-20-酸乙酯(395mg，0.585mmol)在EtOH(5mL)中的溶液中添加在THF中的二甲胺(1M，2.92mL，2.92mmol)。将混合物在RT下搅拌3h并浓缩。将残余物用DMSO(3mL)稀释并通过RP-ISCO色谱法(100G ISCO金C18柱，水/MeCN作为洗脱剂，0.1％ TFA作为改性剂)纯化。将所需产物级分合并并冻干，得到标题化合物(375mg)，其含有杂质。此产物无需进行进一步纯化即可用于下一步骤。LC/MS:MH+＝454.5,Rt＝0.78min(2min碱性法)。
17-((苄氧基)羰基)-4,13,21-三氧代-3,7,10,24,27,30-六氧杂-14,17,20-三氮杂三十三烷-33-酸的合成
将4-(2-氨基乙基)-3,8-二氧代-1-苯基-2,11,14-三氧杂-4,7-二氮杂十七烷-17-酸乙酯(375mg，来自前一步骤)、3-(2-(2-(3-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(210mg，0.605mmol)和DIPEA(0.840mL，4.81mmol)在DMF(4mL)中的混合物在RT下搅拌5min。将混合物用DMSO(5mL)稀释并加载到RP-C18 ISCO柱(金，150g)上。将柱用MeCN-水(0.1％ TFA)洗脱。将含有所需产物的级分合并并浓缩，得到呈油状物的标题化合物(310mg)，其含有少量杂质。这将无需进一步纯化即可使用。LC/MS:MH+＝686.6,Rt＝0.80min(2min酸性法)。
4,13,21-三氧代-3,7,10,24,27,30-六氧杂-14,17,20-三氮杂三十三烷-33-酸的合成
将17-((苄氧基)羰基)-4,13,21-三氧代-3,7,10,24,27,30-六氧杂-14,17,20-三氮杂三十三烷-33-酸(305mg，0.445mmol)和Pd-C(10％湿)(51mg，0.48mmol)在EtOAc(5mL)中的混合物在RT下在气球压力下氢化1h。将混合物用MeCN和水通过硅藻土过滤。将滤液浓缩，得到呈油状物的粗标题化合物(231mg)，其不经纯化直接用于下一步骤。LC/MS:MH+＝552.5,Rt＝0.50min(2min酸性法)。
17-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-4,13,21-三氧代-3,7,10,24,27,30-六氧杂-14,17,20-三氮杂三十三烷-33-酸的合成
将3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酸(117mg，0.503mmol)、HATU(175mg，0.461mmol)和DIPEA(0.30mL，1.7mmol)在DMF(3mL)中的混合物在RT下搅拌10min。将该溶液添加到4,13,21-三氧代-3,7,10,24,27,30-六氧杂-14,17,20-三氮杂三十三烷-33-酸(231mg，0.419mmol)的DMF(1mL)溶液中。添加DIPEA(0.2mL)。将混合物在RT下搅拌10min。将混合物用DMSO(5mL)稀释并加载到RP-C18 ISCO柱(150g，金)上。将柱用MeCN-水(0.1％TFA)洗脱。将含有所需产物的级分合并并冻干，得到呈油状物的产物(163mg)。LC/MS:MH+＝767.9,Rt＝0.77min(2min酸性法)。
2,2,5-三甲基-4-氧代-3,8,11,14-四氧杂-5-氮杂十七烷-17-酸的合成
向3-(2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(1g，3.51mmol)在THF(10mL)中的溶液中添加在H2O中的40wt％MeNH2(26.7g，344mmol)。搅拌过夜后，在真空中去除挥发物。将油状物溶解在MeOH(10mL)和THF(10mL)中，添加DIEA(0.451g，3.51mmol)，然后添加Boc2O(2.296g，10.5mmol)。2.5小时后，在真空中去除挥发物，将残余物溶解在DMSO中并通过ISCORP-HPLC纯化。冻干后，获得了2,2,5-三甲基-4-氧代-3,8,11,14-四氧杂-5-氮杂十七烷-17-酸(1.10g，94％产率)。LC/MS:MH+＝336.4,Rt＝1.57min(5min酸性运行)。
5,8,11-三氧杂-2-氮杂十四烷-14-酸2-氰基乙酯的合成
向2,2,5-三甲基-4-氧代-3,8,11,14-四氧杂-5-氮杂十七烷-17-酸(4.56克，13.6mmol)、DMAP(332mg，2.72mmol)和3-羟基丙腈(0.996mL，14.28mmol)在CH2Cl2(100mL)中的溶液中添加EDC(3.128克，16.31mmol)。搅拌16小时后，将反应物在EtOAc和H2O之间分配，混合，分离，用1M HCl、NaHCO3(饱和)、NaCl(饱和)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。将残余物用25％ TFA/CH2Cl2(24mL)处理1.5小时，此时在真空中去除挥发物并泵送，产生8.09克呈三氟乙酸盐的5,8,11-三氧杂-2-氮杂十四烷-14-酸2-氰基乙酯。基于重量，假设2.65当量的TFA并按原样使用。LC/MS:MH+＝289.2,Rt＝0.48min(5min酸性法)。
5,8,11-三氧杂-2-氮杂十四烷-14-酸烯丙酯的合成
向2,2,5-三甲基-4-氧代-3,8,11,14-四氧杂-5-氮杂十七烷-17-酸(3.026克，9.022mmol)、DMAP(331mg，2.71mmol)和烯丙醇(0.689mL，9.92mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液中添加EDC(2.08克，10.83mmol)。搅拌2小时后，将反应物在EtOAc和H2O之间分配，混合，分离，用1M HCl、NaHCO3(饱和)、NaCl(饱和)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。将残余物用二噁烷中的4M HCl(24mL，96mmol)处理。在rt下静置14小时后，将挥发物在真空中去除并溶解在MeCN/H2O中。冻干后，获得了呈HCl盐的5,8,11-三氧杂-2-氮杂十四烷-14-酸烯丙酯(2.55克，82％产率)。LC/MS:MH+＝276.3,Rt＝0.72min(5min酸性法)。
3-(叔丁氧基羰基)-6-甲基-5,18-二氧代-9,12,15,19-四氧杂-3,6-二氮杂十二碳-21-烯酸的合成
向5,8,11-三氧杂-2-氮杂十四烷-14-酸烯丙酯(1.944克，9.03mmol)和3,5-二氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯HCl盐(2.817克，9.03mmol)在DMF(5mL)中的溶液中添加DIEA(3.15mL，18.07mmol)。在rt下搅拌2小时后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-ISCO纯化。冻干后，获得了3-(叔丁氧基羰基)-6-甲基-5,18-二氧代-9,12,15,19-四氧杂-3,6-二氮杂十二碳-21-烯酸(2.62克，59％产率)。LC/MS:MH+＝491.5,Rt＝1.85min(5min酸性法)。
31-(2-氰基乙基)16-(叔丁氧基羰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸1-烯丙酯的合成
向5,8,11-三氧杂-2-氮杂十四烷-14-酸2-氰基乙酯三氟乙酸盐(2.65当量)(3.406克，5.768mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加DIEA(4.65mL，26.7mmol)。将该溶液添加到3-(叔丁氧基羰基)-6-甲基-5,18-二氧代-9,12,15,19-四氧杂-3,6-二氮杂十二碳-21-烯酸(2.620克，5.34mmol)和HOAT(873mg，6.41mmol)中，然后最后添加EDC(1.229克，6.41mmol)。在rt下搅拌5小时后，在真空中去除挥发物，将残余物溶解在DMSO中并通过RP-ISCO纯化。冻干后，获得了31-(2-氰基乙基)16-(叔丁氧基羰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸1-烯丙酯(3.57克，87％产率)。LC/MS:MH+＝761.7,Rt＝1.95min(5min酸性法)。
31-(2-氰基乙基)16-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸1-烯丙酯的合成
将31-(2-氰基乙基)16-(叔丁氧基羰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸1-烯丙酯(803mg，1.06mmol)用二噁烷中的4M HCl(5mL，40μmol)处理12小时，此时在真空中去除挥发物。将残余物溶解在NMP(3mL)中并通过添加DIEA(0.5mL，2.87mmol)进行中和。添加3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酸(320mg，1.37mmol)、HOAT(187mg，1.37mmol)和EDC(263mg，1.37mmol)，并在rt下搅拌2小时后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-ISCO纯化。冻干后，获得了31-(2-氰基乙基)16-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸1-烯丙酯(657mg，71％)。LC/MS:MH+＝876.7,Rt＝2.07min(5min酸性法)。
16-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18,31-三氧代-4,7,10,22,25,28,32-七氧杂-13,16,19-三氮杂三十五碳-34-烯酸的合成
向31-(2-氰基乙基)16-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸1-烯丙酯(375mg，428μmol)在DMSO(1mL)中的溶液中添加DBU(129μL，856μmol)。静置两小时后，将溶液通过ISCO C18 RP-HPLC用0.05％甲酸改性剂纯化。冻干后，获得了16-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18,31-三氧代-4,7,10,22,25,28,32-七氧杂-13,16,19-三氮杂三十五碳-34-烯酸(232mg，66％产率)。LC/MS:MH+＝823.7,Rt＝1.86min(5min酸性法)。
11-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-酸叔丁酯的合成
向2,2'-氮烷二基二乙酸二叔丁酯(250mg，1019μmol)和HATU(407mg，1070μmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIEA(356μL，2038μmol)。搅拌5分钟后，添加3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酸(398mg，1121μmol)。再搅拌30分钟后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了11-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-酸叔丁酯(509mg，86％产率)。LC/MS:MH+＝583.4,Rt＝3.06min(5min酸性法)。
11-(羧甲基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-酸的合成
将11-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-酸叔丁酯(509mg，874μmol)用33％TFA/CH2Cl2(3mL)处理4小时，此时在真空中去除挥发物。将残余物溶解在MeCN/H2O中，并且在冻干后，获得了11-(羧甲基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-酸(400mg，97％产率)。LC/MS:MH+＝471.0,Rt＝1.87min(5min酸性法)。
16-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸二叔丁酯的合成
向11-(羧甲基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-酸(40mg，85μmol)和HATU(71mg，187μmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIEA(74μL，74μmol)。搅拌5分钟后，添加5,8,11-三氧杂-2-氮杂十四烷-14-酸叔丁酯(74mg，255μmol)。再搅拌30分钟后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了16-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸二叔丁酯(54mg，62％产率)。LC/MS:MH+＝1017.8,Rt＝3.01min(5min酸性法)。
16-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸的合成
将16-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸二叔丁酯(54mg，53μmol)用33％ TFA/CH2Cl2(3mL)处理4小时，此时在真空中去除挥发物。将残余物溶解在MeCN/H2O中，并且在冻干后，获得了16-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸(47.4mg，99％产率)。HRMS：MH+＝905.4400,Rt＝2.04min(5min酸性法)。
16-(叔丁氧基羰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸双(2-氰基乙基)酯的合成
向在1:2NMP/CH2Cl2(15mL)中的5,8,11-三氧杂-2-氮杂十四烷-14-酸2-氰基乙酯HCl盐(3.19克，8.83mmol)和2,6-二氧代吗啉-4-甲酸叔丁酯(0.95克，4.41mmol)中添加DIEA(2.31mL，13.2mmol)、HOAT(0.661g，4.86mmol)，然后添加EDC(0.931g，4.86mmol)。搅拌2小时后，在真空中去除挥发物，添加DMSO，并将溶液通过RP-HPLC(用0.05％甲酸改性剂)纯化。冻干后，获得了16-(叔丁氧基羰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸双(2-氰基乙基)酯(2.10g，61％产率)。LC/MS:MH+＝774.6,Rt＝1.77min(5min酸性法)。
16-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸双(2-氰基乙基)酯的合成
向16-(叔丁氧基羰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸双(2-氰基乙基)酯(2.10g，2.71mmol)中添加在二噁烷中的4M HCl(10mL，40mmol)。静置一小时后，在真空中去除挥发物。将残余物溶解在CH2Cl2(10mL)中，添加DIEA(1.65mL，9.5mmol)作为溶液搅拌。向中和溶液中添加HOAT(480mg，3.5mmol)、3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酸(791mg，3.4mmol)和EDC(676mg，3.5mmol)。搅拌两小时后，在真空中去除挥发物，添加DMSO，并将溶液通过RP-HPLC(用0.05％甲酸改性剂)纯化。冻干后，获得了16-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸双(2-氰基乙基)酯(2.30g，95％产率)。LC/MS:MH+＝889.7
16-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸的合成
向DMSO(15mL)中的16-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸双(2-氰基乙基)酯(2.3g，2.587mmol)中添加DBU(1.56mL，10.35mmol)。搅拌一小时后，将溶液直接通过RP-HPLC(用0.05％甲酸改性剂)纯化。冻干后，获得了16-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸(0.771g，38％产率)。LC/MS:MH+＝783.6,Rt＝1.50min(5min酸性法)。
16-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯的合成
向NMP(2mL)中的16-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸(168mg，215μmol)中添加DIEA(94μL，537μmol)，然后添加TSTU(155mg，515μmol)。搅拌一小时后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC(用0.05％甲酸改性剂)纯化。冻干后，获得了16-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(138mg，66％产率)。LC/MS:MH+＝977.6,Rt＝1.75min(5min酸性法)。
16-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸二叔丁酯的合成
向11-(羧甲基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-酸(100mg，213μmol)和HATU(162mg，425μmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIEA(111μL，638μmol)。搅拌5分钟后，添加3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(177mg，638μmol)。再搅拌30分钟后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了16-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸二叔丁酯(185mg，88％产率)。LC/MS:MH+＝989.5300,Rt＝2.77min(5min酸性法)。
16-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸的合成
将16-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸二叔丁酯(185mg，187μmol)用50％ TFA/CH2Cl2(44mL)处理2小时，此时在真空中去除挥发物。将残余物溶解在MeCN/H2O中，并且在冻干后，获得了16-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸(146mg，89％产率)。LC/MS:MH+＝877.6,Rt＝1.91min(5min酸性法)。
(11-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
向3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酸(322mg，906μmol)和HATU(329mg，865μmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIEA(288μL，1648μmol)。搅拌5分钟后，添加(氮烷二基双(乙烷-2,1-二基))二氨基甲酸二叔丁酯(250mg，824μmol)。再搅拌30分钟后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(11-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯(528mg，85％产率)。LC/MS:MH+＝641.4,Rt＝2.82min(5min酸性法)。
(2-(3-(双(2-氨基乙基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
将(11-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸叔丁酯(450mg，702μmol)用25％ TFA/CH2Cl2(3mL)处理1小时，此时在真空中去除挥发物。将残余物溶解在MeCN/H2O中，并且在冻干后，获得了(2-(3-(双(2-氨基乙基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(480mg)。LC/MS:MH+＝441.1,Rt＝0.94min(5min酸性法)。
11-(2-氨基乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10,15-三氧代-2,7,18,21-四氧杂-4,11,14-三氮杂二十四烷-24-酸叔丁酯的合成
向3-(2-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)丙酸(30mg，114μmol)和HATU(43.5mg，114μmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIEA(120μL，686μmol)。搅拌5分钟后，添加(2-(3-(双(2-氨基乙基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯TFA盐(308mg，343μmol)。再搅拌30分钟后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了11-(2-氨基乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10,15-三氧代-2,7,18,21-四氧杂-4,11,14-三氮杂二十四烷-24-酸叔丁酯(65mg，62％产率)。LC/MS:MH+＝685.5,Rt＝2.05min(5min酸性法)。
17-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,21-二氧代-4,7,10,24,27-五氧杂-14,17,20-三氮杂三十烷二酸二叔丁酯的合成
向2,2-二甲基-4-氧代-3,7,10,13-四氧杂十六烷-16-酸(26mg，85μmol)和HATU(32.2mg，85μmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加DIEA(62μL，353μmol)。搅拌5分钟后，添加11-(2-氨基乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10,15-三氧代-2,7,18,21-四氧杂-4,11,14-三氮杂二十四烷-24-酸叔丁酯TFA盐(65mg，71μmol)。再搅拌30分钟后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了17-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,21-二氧代-4,7,10,24,27-五氧杂-14,17,20-三氮杂三十烷二酸二叔丁酯(46mg，67％产率)。LC/MS:MH+＝973.8,Rt＝2.84min(5min酸性法)。
17-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,21-二氧代-4,7,10,24,27-五氧杂-14,17,20-三氮杂三十烷二酸的合成
将17-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,21-二氧代-4,7,10,24,27-五氧杂-14,17,20-三氮杂三十烷二酸二叔丁酯(46.4mg，48μmol)用50％TFA/CH2Cl2(2mL)处理2小时，此时在真空中去除挥发物。将残余物溶解在MeCN/H2O中，并且在冻干后，获得了17-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,21-二氧代-4,7,10,24,27-五氧杂-14,17,20-三氮杂三十烷二酸(46mg，99％产率)。LC/MS:MH+＝861.4,Rt＝1.87min(5min酸性法)。
10-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-8,12-二氧代-4,16-二氧杂-7,10,13-三氮杂十一烷二酸二叔丁酯的合成
向11-(羧甲基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7-二氧杂-4,11-二氮杂十三烷-13-酸(50mg，106μmol)和HATU(81mg，213μmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIEA(93μL，531μmol)。搅拌45分钟后，添加3-(2-氨基乙氧基)丙酸叔丁酯(60.3mg，319μmol)。再搅拌60分钟后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了10-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-8,12-二氧代-4,16-二氧杂-7,10,13-三氮杂十一烷二酸二叔丁酯(44mg，51％产率)。LC/MS:MH+＝813.7,Rt＝2.95min(5min酸性法)。
10-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-8,12-二氧代-4,16-二氧杂-7,10,13-三氮杂十一烷二酸的合成
将10-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-8,12-二氧代-4,16-二氧杂-7,10,13-三氮杂十一烷二酸二叔丁酯(44mg，54μmol)用33％ TFA/CH2Cl2(3mL)处理1小时，此时在真空中去除挥发物。将残余物溶解在MeCN/H2O中，并且在冻干后，获得了10-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-8,12-二氧代-4,16-二氧杂-7,10,13-三氮杂十一烷二酸(47mg)。LC/MS:MH+＝701.4,Rt＝1.76min(5min酸性法)。
3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-5-氧代-9,12,15-三氧杂-3,6-二氮杂十八烷二酸1-(叔丁基)18-甲酯的合成
向N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)甘氨酸(1g，2.43mmol)和HATU(970mg，2.55mmol)在DMF(12mL)中的溶液中添加DIEA(1.7mL，9.7mmol)。搅拌5分钟后，添加3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸甲酯(899mg，2.67mmol)。再搅拌30分钟后，将溶液倒入NH4Cl(饱和)中，用EtOAc萃取并浓缩。通过SiO2色谱法纯化并浓缩，获得了3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-5-氧代-9,12,15-三氧杂-3,6-二氮杂十八烷二酸1-(叔丁基)18-甲酯(1.11g，73％产率)。LC/MS:MH+＝629.5和(M-tBu)+＝573.4,Rt＝2.70min(5min酸性法)。
18-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-3,16-二氧代-2,6,9,12-四氧杂-15,18-二氮杂二十烷-20-酸的合成
将3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-5-氧代-9,12,15-三氧杂-3,6-二氮杂十八烷二酸1-(叔丁基)18-甲酯(1.11g，1.77mol)用33％ TFA/CH2Cl2(6mL)处理1小时，此时添加二氯乙烷(50mL)并在真空中去除挥发物。将该材料按原样用于下一步骤。LC/MS:MH+＝573.4,Rt＝0.96min(2min酸性法)。
16-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸1-(叔丁基)31-甲酯的合成
向18-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-3,16-二氧代-2,6,9,12-四氧杂-15,18-二氮杂二十烷-20-酸(1.33g，1.66mmol)和HATU(695mg，1.83mmol)在DMF(10mL)中的溶液中添加DIEA(1.16mL，6.64mmol)。搅拌5分钟后，添加3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(599mg，2.16mmol)。再搅拌30分钟后，将溶液倒入NH4Cl(饱和)中，用EtOAc萃取并浓缩。通过SiO2色谱法纯化并浓缩，获得了16-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸1-(叔丁基)31-甲酯(1.19g，86％产率)。LC/MS:MH+＝832.6,Rt＝1.14min(2min酸性法)。
18-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-3,16,20-三氧代-2,6,9,12,24,27,30-七氧杂-15,18,21-三氮杂三十三烷-33-酸的合成
将16-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸1-(叔丁基)31-甲酯(1.19g，1.46mmol)用33％ TFA/CH2Cl2(4.5mL)处理一小时，此时在真空中去除挥发物。将残余物溶解在MeCN/H2O中，并且在冻干后，获得了18-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-3,16,20-三氧代-2,6,9,12,24,27,30-七氧杂-15,18,21-三氮杂三十三烷-33-酸。LC/MS:MH+＝776.6,Rt＝0.94min(2min酸性法
3,16,20-三氧代-2,6,9,12,24,27,30-七氧杂-15,18,21-三氮杂三十三烷-33-酸的合成
将18-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-3,16,20-三氧代-2,6,9,12,24,27,30-七氧杂-15,18,21-三氮杂三十三烷-33-酸(1.47g，1.9mmol)和2.0M二甲胺在THF(7mL)中的溶液在rt下搅拌一小时，此时在真空中去除挥发物。将残余物溶解在MeCN中并用TFA(150μL)中和。在真空中去除挥发物，将残余物溶解在DMSO中并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了3,16,20-三氧代-2,6,9,12,24,27,30-七氧杂-15,18,21-三氮杂三十三烷-33-酸(744mg，59％产率)。LC/MS:MH+＝554.5,Rt＝0.72min(5min酸性法)。
18-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-3,16,20-三氧代
-2,6,9,12,24,27,30-七氧杂-15,18,21-三氮杂三十三烷-33-酸的合成
向3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酸(470mg，2.02mmol)和HATU(613mg，1.61mmol)在DMF(6mL)中的溶液中添加DIEA(704μL，4.03mmol)。搅拌5分钟后，添加3,16,20-三氧代-2,6,9,12,24,27,30-七氧杂-15,18,21-三氮杂三十三烷-33-酸(744mg，1.34mmol)。再搅拌30分钟后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了18-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-3,16,20-三氧代-2,6,9,12,24,27,30-七氧杂-15,18,21-三氮杂三十三烷-33-酸(790mg，76％产率)。LC/MS:MH+＝769.8,Rt＝1.54min(5min酸性法)。
(3-(双(2-羟乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸(2.96g，9.51mmol，1.00当量)在二氯甲烷(50mL)中的搅拌溶液中添加3-(((乙基亚氨基)亚甲基)氨基)-N,N-二甲基丙-1-胺盐酸盐(2.006g，10.46mmol，1.10当量)。在环境温度下搅拌10分钟后，添加二乙醇胺(1.00g，9.51mmol，1.00当量)，并将所得混合物在环境温度下搅拌2小时。将反应混合物在减压下浓缩，并将所得残余物通过硅胶色谱法(0％-20％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到(3-(双(2-羟乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.25g，5.65mmol，59％产率)。LC/MS:MH+＝399.3,Rt＝0.82min(2min酸性运行)。
(3-(双(2-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向(3-(双(2-羟乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.24g，5.62mmol，1.00当量)和碳酸双(4-硝基苯基)酯(3.76g，12.37mmol，2.20当量)在二氯甲烷(50mL)中的搅拌溶液中添加N-乙基二异丙胺(1.60g，12.37mmol，2.20当量)。将所得混合物在环境温度下搅拌2小时。将反应混合物在环境温度或低于环境温度下在减压下浓缩，并将所得残余物通过硅胶色谱法(0％-100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到(3-(双(2-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.00g，2.74mmol，48％产率)。LC/MS:M+Na+＝751.3,Rt＝1.20min(2min酸性运行)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.27-8.22(m,2H),8.22-8.18(m,2H),7.74(d,J＝7.4Hz,2H),7.53(d,J＝7.4Hz,2H),7.42-7.33(m,4H),7.32-7.27(m,4H),5.51(t,J＝6.3Hz,1H),4.46(dt,J＝18.3,5.3Hz,4H),4.30(d,J＝7.2Hz,2H),3.80(dt,J＝10.2,5.4Hz,4H),3.56(d,J＝5.8Hz,2H),2.71(t,J＝5.5Hz,2H)。
(1-羟基-9-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基)-10-氧代-3,6,13-三氧杂-9-氮杂十五烷-15-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
向3,6,12,15-四氧杂-9-氮杂十七烷-1,17-二醇(116mg，0.412mmol，1.00当量)、3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酸(101mg，0.433mmol，1.05当量)和HATU(165mg，0.433mmol，1.05当量)在DMF(1mL)中的搅拌溶液中添加N-乙基二异丙胺(160mg，1.23mmol，3.00当量)。将所得混合物在环境温度下搅拌1小时，然后用DMSO(2mL)稀释并通过RP-ISCO纯化。冻干后，获得了(1-羟基-9-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基)-10-氧代-3,6,13-三氧杂-9-氮杂十五烷-15-基)氨基甲酸叔丁酯(118mg，0.238mmol，57％产率)。LC/MS:MH+＝497.4,Rt＝0.68min(2min酸性运行)。
(6-氧代-7-(2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3,10,13,16-四氧杂-7-氮杂十二碳-18-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
在0℃下向(1-羟基-9-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基)-10-氧代-3,6,13-三氧杂-9-氮杂十五烷-15-基)氨基甲酸叔丁酯(118mg，0.238mmol，1.00当量)在干燥THF(2mL)中的搅拌溶液中添加氢化钠(60％，分散在油中，20.0mg，0.499mmol，2.1当量)。在0℃下搅拌30分钟后，添加炔丙基溴(62.2mg，0.523mmol，2.2当量)，并使所得混合物经20小时在搅拌下升温至环境温度。在减压下浓缩后，将所得残余物通过硅胶色谱法(0％-20％异丙醇/二氯甲烷)纯化，得到(6-氧代-7-(2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3,10,13,16-四氧杂-7-氮杂十二碳-18-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯(12.6mg，0.022mmol，9.3％产率)。LC/MS:MH+＝573.4,Rt＝0.95min(2min酸性运行)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.19(d,J＝2.3Hz,4H),3.74(t,J＝6.4Hz,2H),3.71-3.54(m,24H),3.50(t,J＝5.1Hz,2H),3.28(d,J＝5.7Hz,2H),2.67(t,J＝6.4Hz,2H),2.44(t,J＝2.4Hz,2H),1.44(d,J＝2.9Hz,9H)。
(6-氧代-7-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)-3,10,13-三氧杂-7-氮杂十六碳-15-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
向NH-双(PEG2-炔丙基)(53mg，0.197mmol)、t-Boc-N-酰胺基-PEG1-酸(48.2mg，0.207mmol)在DMF(无水，1ml)中的溶液中添加HATU(79mg，0.207mmol)，然后添加DIPEA(103μl，0.590mmol)。将反应混合物在RT下搅拌1h。将粗品通过C-18柱(50g柱，用MeCN/水洗脱，含0.1％甲酸，0％-100％，经16CV)纯化，获得(6-氧代-7-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)-3,10,13-三氧杂-7-氮杂十六碳-15-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯(81mg，85％产率)。LC/MS:MH+＝485.4,Rt＝0.94min(3min酸性运行)。
3-(2-氨基乙氧基)-N,N-双(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)丙酰胺的合成
在0℃下在冰水浴中，向(6-氧代-7-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)-3,10,13-三氧杂-7-氮杂十六碳-15-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯(81mg，0.167mmol)中添加TFA(25％，在DCM中)(2576μl，8.36mmol)。然后将反应混合物升至RT并搅拌90min。将混合物在RT浴下在高真空下浓缩。然后将粗产物用C-18柱(50克柱，MeCN/水，含0.1％甲酸0％-100％，经16CV)分离，获得3-(2-氨基乙氧基)-N,N-双(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)丙酰胺(60mg，83％产率)。LC/MS:MH+＝385.8,Rt＝0.56min(3min酸性运行)。
(S)-(17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十碳-1,20-二炔-18-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
向N-Boc-2-炔丙基-L-甘氨酸(100mg，0.469mmol)、炔丙基-PEG4-胺(108mg，0.469mmol)和TSTU(141mg，0.469mmol)在DMF(2ml)中的混合物中添加DIPEA(246μl，1.407mmol)。将反应混合物在RT下搅拌1h。将粗混合物通过C-18柱(100g柱，0％-100％MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-100％，经16CV)，获得(S)-(17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十碳-1,20-二炔-18-基)氨基甲酸叔丁酯(101mg，51％产率)。LC/MS:MH+＝427.5,Rt＝0.83min(3min酸性运行)。
(S)-2-氨基-N-(3,6,9,12-四氧杂十五碳-14-炔-1-基)戊-4-炔酰胺的合成
在0℃下，向(S)-(17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十碳-1,20-二炔-18-基)氨基甲酸叔丁酯(101mg，0.237mmol)中添加TFA(25％，在DCM中)(1460μl，4.74mmol)，然后升至RT。将混合物在rt下搅拌1h。将混合物在高真空下浓缩，然后在高真空下干燥过夜，获得(S)-2-氨基-N-(3,6,9,12-四氧杂十五碳-14-炔-1-基)戊-4-炔酰胺(TFA盐，104mg，100％产率)。LC/MS:MH+＝327.4,Rt＝0.49min(3min酸性运行)。(6-氧代-7-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)-3,10,13-三氧杂-7-氮杂十六碳-15-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
向双(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)胺(53mg，0.197mmol)、3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酸(48.2mg，0.207mmol)在DMF(1ml)中的溶液中添加HATU(79mg，0.207mmol)，然后添加DIPEA(103μl，0.590mmol)。将反应混合物在RT下搅拌1h。将粗产物通过RP-C18 ISCO色谱法(用MeCN-水，0.1％甲酸洗脱)纯化，得到呈油状物的标题产物(81mg，85％产率)。LC/MS:MH+＝485.5,Rt＝0.92min(2min碱性法)。
3-(2-氨基乙氧基)-N,N-双(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)丙酰胺的合成
将(6-氧代-7-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)-3,10,13-三氧杂-7-氮杂十六碳-15-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯(408mg，0.842mmol)和TFA(1.62mL，21.1mmol)在DCM(4.8mL)中的混合物在RT下搅拌30min并浓缩。将粗产物通过RP-C18 ISCO色谱法(50g，金柱)纯化(用MeCN-水，0.1％ TFA洗脱)。将含有所需产物的级分合并并冻干，得到呈黄色油状物的产物(TFA盐)(148mg，35％产率)。LC/MS:MH+＝385.3,Rt＝0.55min(2min酸性法)。
4,7,13,16,19-五氧杂-10-氮杂十二碳-1-炔-22-酸的合成
在0℃下，向DCM(11.5ml)中的10-(叔丁氧基羰基)-4,7,13,16,19-五氧杂-10-氮杂十二碳-1-炔-22-酸叔丁酯(250mg，0.496mmol)和三乙基硅烷(238μl，1.489mmol)中逐滴添加TFA(3824μl，49.6mmol)(TFA/DCM 25％v/v)。将混合物在0℃下搅拌15min，然后升至RT并搅拌30min。将粗混合物在高真空下在旋转蒸发器上浓缩，然后在高真空下干燥两天，获得4,7,13,16,19-五氧杂-10-氮杂十二碳-1-炔-22-酸(231mg，作为粗品，其不经进一步纯化即用于下一反应)。LC/MS:MH+＝348.3,Rt＝0.47min(3min酸性运行)。
2,2-二甲基-4,11-二氧代-12-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)-3,8,15,18,21-五氧杂-5,12-二氮杂二十四烷-24-酸的合成
向t-Boc-N-酰胺基-PEG1-酸(139mg，0.595mmol)在DMF(无水，2ml)中的溶液中添加HATU(226mg，0.595mmol)，然后添加DIPEA(433μl，2.480mmol)。将反应混合物在RT下搅拌30min。然后将4,7,13,16,19-五氧杂-10-氮杂十二碳-1-炔-22-酸(229mg，0.496mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液添加到上述反应混合物中。将所得混合物在RT下搅拌30min。将粗品通过C-18柱(100g柱，用MeCN/水洗脱，含0.05％ TFA，0％-100％，经16CV)分离，获得2,2-二甲基-4,11-二氧代-12-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)-3,8,15,18,21-五氧杂-5,12-二氮杂二十四烷-24-酸(220mg，79％产率)。LC/MS:MH+＝563.4,Rt＝0.83min(3min酸性运行)。
(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(((烯丙氧基)羰基)氧基)-6-(2-氨基-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)苯氧基)四氢-2H-吡喃-2-甲酸烯丙酯的合成
将Zn粉末(48.7g，745mmol)分批添加到(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(((烯丙氧基)羰基)氧基)-6-(4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-2-硝基苯氧基)四氢-2H-吡喃-2-甲酸烯丙酯(Journal of Natural Products[天然产物杂志]2015,78,510)(56g，74.5mmol)、1,4-二噁烷(1.7mL)、H2O(280mL)和AcOH(42.6mL，745mmol)的混合物中。将混合物在25℃下搅拌16h。将混合物通过硅藻土过滤并用1,4-二噁烷(500mL)和DCM(500mL)洗涤。将所得滤液用饱和NaHCO3中和并用DCM萃取。将合并的有机萃取物用饱和NaHCO3和盐水洗涤。将有机层干燥并在真空中浓缩。将残余物通过NP-柱色谱法纯化，得到呈黄色油状物的标题产物(35.8g，66.7％产率)。LC/MS:MH+＝722.2.
(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(((烯丙氧基)羰基)氧基)-6-(2-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酰胺基)-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)苯氧基)四氢-2H-吡喃-2-甲酸烯丙酯的合成
将(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(((烯丙氧基)羰基)氧基)-6-(2-氨基-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)苯氧基)四氢-2H-吡喃-2-甲酸烯丙酯(3.00g，4.16mmol)、3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸(0.95g，5.02mmol)、HBTU(1.90g，5.01mmol)和DIPEA(2.22g，17.2mmol)在DMF(15mL)中的混合物在RT下搅拌30min，并在EtOAc和盐水之间分配。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，浓缩并进行色谱分析(NP-ISCO柱)，得到标题化合物(1.66g，45％产率)。LC/MS:MH+＝893.7,Rt＝1.49min(2min酸性法)。
(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(((烯丙氧基)羰基)氧基)-6-(2-(3-氨基丙酰胺基)-4-(羟甲基)苯氧基)四氢-2H-吡喃-2-甲酸烯丙酯的合成
将(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(((烯丙氧基)羰基)氧基)-6-(2-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酰胺基)-4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)苯氧基)四氢-2H-吡喃-2-甲酸烯丙酯(1.66g，1.86mmol)和pTsOH(0.036g，0.190mmol)在MeOH(10mL)中的混合物在RT下搅拌10min。将混合物浓缩，得到呈油状物的粗O-脱甲硅烷基化产物(LC/MS MH+779.6,Rt＝1.13min(2min酸性法))，将其用在DCM(4mL)中的TFA(6.0mL，78mmol)在RT下处理10min。将混合物浓缩，得到粗标题产物，将其不经纯化用于下一步骤。LC/MS:MH+＝679.6,Rt＝0.88min(2min酸性法)。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-((S)-6-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)己酰胺基)丙酰胺基)-4-(羟甲基)苯氧基)-3,4,5-三(((烯丙氧基)羰基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-甲酸烯丙酯的合成
将(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(((烯丙氧基)羰基)氧基)-6-(2-(3-氨基丙酰胺基)-4-(羟甲基)苯氧基)四氢-2H-吡喃-2-甲酸烯丙酯(在前一步骤中获得的粗品)、N6-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(1.2g，2.6mmol)、HBTU(1.00g，2.64mmol)和DIPEA(2.00mL，11.5mmol)在DMF(10mL)中的混合物在RT下搅拌10min。将混合物在EtOAc和依次在1M HCl和水性K2CO3之间分配。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥并且浓缩。将粗产物通过色谱法(NP-ISCO柱，80g金)纯化，得到呈白色固体的标题产物(1.11g，53％产率，经最后三步)。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-((S)-6-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)己酰胺基)丙酰胺基)-4-(氯甲基)苯氧基)-3,4,5-三(((烯丙氧基)羰基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-甲酸烯丙酯的合成
将(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-((S)-6-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)己酰胺基)丙酰胺基)-4-(羟甲基)苯氧基)-3,4,5-三(((烯丙氧基)羰基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-甲酸烯丙酯(1.11g，0.983mmol)、亚硫酰氯(0.180mL，2.466mmol)和碳酸氢钠(0.495g，5.90mmol)在THF(10mL)中的混合物在RT下搅拌10min。将混合物在EtOAc与水之间分配。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，浓缩并通过NP-ISCO柱进行色谱分析。将含有所需产物的级分合并并浓缩，得到呈白色固体的标题产物(0.95g，84％产率)。LC/MS:MH+＝1147.9,Rt＝1.39min(2min酸性法)。
(S)-9-氨基-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,14,17-三氧杂-4,11-二氮杂二十烷-20-酸的合成
在0℃下，向N6-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(633mg，1.350mmol)和3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(300mg，1.29mmol)在乙腈(9ml)中的澄清溶液中添加DMTMM(340mg，1.414mmol)。向浆液中添加DIPEA(0.449ml，2.57mmol)。将混合物在0℃下搅拌5min，然后在rt下搅拌1.5h。通过旋转蒸发并且在高真空下去除溶剂。在0℃下，向所得油状材料中添加CH2Cl2(9ml)、三乙基硅烷(0.205ml，1.286mmol)和TFA(4.95ml，64.3mmol)。将混合物在rt下搅拌1.5h。经由旋转蒸发然后在高真空下去除溶剂。□□将所得油状物溶解在DMSO/水中，并通过RP-HPLC(C18，ACN/水，含0.1％ TFA)纯化，在冻干后获得白色粉末，即呈TFA盐的(S)-9-氨基-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,14,17-三氧杂-4,11-二氮杂二十烷-20-酸(754mg，91％产率)。LC/MS:MH+＝528.3,rt＝0.79min(2min酸性法)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.48(t,J＝5.6Hz,1H),8.24-8.00(m,3H),7.90(d,J＝7.5Hz,2H),7.68(d,J＝7.5Hz,2H),7.47-7.37(m,2H),7.37-7.29(m,2H),7.29-7.19(m,1H),4.31(d,J＝6.8Hz,2H),4.21(t,J＝6.8Hz,1H),3.94-3.65(m,1H),3.59(dd,J＝7.5,5.2Hz,2H),3.45(dd,J＝13.3,7.7Hz,3H),3.39-3.14(m,2H),3.01-2.89(m,2H),2.44(t,J＝6.3Hz,2H),1.81-1.59(m,2H),1.46-1.15(m,4H)。
(S)-12-(4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丁基)-11,14-二氧代-4,7,17,20-四氧杂-10,13-二氮杂三碳-22-炔酸的合成
向DMF(2ml)中的3-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)丙酸(65.5mg，0.381mmol)添加DIPEA(0.240ml，1.37mmol)和HATU(150mg，0.394mmol)。将混合物在rt下搅拌15min。然后在0℃下，添加(S)-9-氨基-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,14,17-三氧杂-4,11-二氮杂二十烷-20-酸(220mg，0.343mmol)在DMF(2ml)中的TFA盐。将混合物在rt下搅拌1h，并用DMSO/水(10/4mL)稀释，并通过RP-HPLC(C18，ACN/水，含0.1％ TFA)纯化，在冻干后得到白色松软粉末，即(S)-12-(4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丁基)-11,14-二氧代-4,7,17,20-四氧杂-10,13-二氮杂三碳-22-炔酸(117mg，50％产率)。LC/MS:MH+＝682.4,Rt＝0.97min(2min酸性法)；HRMS：MH+＝682.2300,Rt＝2.16min(5min酸性法)。
(S)-9-氨基-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,14,17,20-四氧杂-4,11-二氮杂二十三烷-23-酸的合成
在0℃下，向乙腈(体积：12ml)中的N6-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(785mg，1.68mmol)和3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(540mg，1.60mmol)中添加DMTMM(422mg，1.76mmol)。向浆液中添加DIPEA(0.558ml，3.19mmol)。将混合物在0℃下搅拌5min，然后在rt下搅拌1.5h。通过旋转蒸发并且在高真空下去除溶剂。在0℃下，向所得油状材料中添加CH2Cl2(12ml)、三乙基硅烷(0.255ml，1.60mmol)和TFA(6.15ml，80mmol)。将混合物在rt下搅拌1.5h。经由旋转蒸发然后在高真空下去除溶剂。□□将所得油状物溶解在DMSO/水中，并通过RP-HPLC(C18，ACN/水，含0.1％TFA)纯化，在冻干后获得白色粉末，即呈TFA盐的(S)-9-氨基-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,14,17,20-四氧杂-4,11-二氮杂二十三烷-23-酸(933mg，85％产率)。LC/MS:MH+＝572.4,Rt＝0.79min(酸性，2min酸性法)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.54-8.45(m,1H),8.17(s,1H),8.06(s,2H),7.90(dt,J＝7.6,0.9Hz,2H),7.68(d,J＝7.5Hz,2H),7.46-7.39(m,2H),7.38-7.31(m,2H),7.30-7.18(m,1H),4.31(d,J＝6.8Hz,2H),4.21(t,J＝6.8Hz,1H),3.94-3.65(m,1H),3.59(t,J＝6.3Hz,2H),3.44(t,J＝5.5Hz,8H),3.38-3.18(m,2H),2.96(q,J＝6.6Hz,2H),2.61(s,2H),2.62-2.52(m,2H),2.51(s,2H),2.43(t,J＝6.3Hz,2H),1.82-1.61(m,2H),1.46-1.15(m,4H)。
(S)-15-(4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丁基)-14,17-二氧代-4,7,10,20,23-五氧杂-13,16-二氮杂六碳-25-炔酸的合成
向DMF(2.5ml)中的3-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)丙酸(84mg，0.49mmol)添加DIPEA(0.309ml，1.77mmol)和HATU(193mg，0.508mmol)。将混合物在rt下搅拌15min。然后在0℃下，添加(S)-9-氨基-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,14,17,20-四氧杂-4,11-二氮杂二十三烷-23-酸(303mg，0.442mmol)在DMF(2.5ml)中的TFA盐。将混合物在rt下搅拌1h，并用DMSO/水(10/4mL)稀释，并通过RP-HPLC(C18，ACN/水，含0.1％ TFA)纯化，在冻干后得到白色松软粉末，即(S)-15-(4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丁基)-14,17-二氧代-4,7,10,20,23-五氧杂-13,16-二氮杂六碳-25-炔酸(206mg，64％产率)。HRMS：MH+＝726.3700,Rt＝2.19min(5min酸性法)。
1-(9H-芴-9-基)-11-(2-羟基乙基)-3,10-二氧代-2,7,14,17,20-五氧杂-4,11-二氮杂二十三烷-23-酸叔丁酯的合成
在配备有磁力搅拌棒的10mL玻璃小瓶中，向溶解在EtOH(1mL)中的3-(2-(2-(2-(甲苯磺酰基氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(311mg，0.719mmol)中添加乙醇胺(220mg，3.60mmol)。将反应混合物在75℃下搅拌2h，冷却至RT。在减压下去除溶剂并在高真空下干燥过夜，得到粘稠油状物(515mg)。在0℃下，向该粘稠油状物(412mg)中添加在乙腈(6mL)和THF(3mL)中的3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酸(1329mg，3.74mmol)、DMTMM(1070mg，3.86mmol)和DIPEA(0.800mL，4.60mmol)。将混合物在rt下搅拌1h。过滤混浊混合物。将滤液浓缩并通过快速色谱法(0％-10％ MeOH in CH2Cl2洗脱剂)纯化两次，在浓缩适当级分后得到呈白色固体的1-(9H-芴-9-基)-11-(2-羟基乙基)-3,10-二氧代-2,7,14,17,20-五氧杂-4,11-二氮杂二十三烷-23-酸叔丁酯(194mg，51.5％产率)。LC/MS:MH+＝659.5,Rt＝1.13min(2min酸性法)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.70(d,J＝7.4Hz,2H),7.45-7.38(m,2H),7.37-7.25(m,3H),4.69(d,J＝64.3Hz,1H),4.41-4.01(m,4H),3.88(d,J＝33.5Hz,3H),3.64-3.55(m,4H),3.54-3.49(m,4H),3.46-3.28(m,10H),3.20-3.08(m,5H),2.64-2.56(m,2H),2.44-2.37(m,2H),1.39(d,J＝1.9Hz,9H)。
11-(2-(((N-(2-(2-(2-羧基乙氧基)乙氧基)乙基)氨磺酰基)氨基甲酰基)氧基)乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7,14,17,20-五氧杂-4,11-二氮杂二十三烷-23-酸的合成
在0℃下，向CH2Cl2(2.5ml)中的1-(9H-芴-9-基)-11-(2-羟基乙基)-3,10-二氧代-2,7,14,17,20-五氧杂-4,11-二氮杂二十三烷-23-酸叔丁酯(97mg，0.147mmol)添加异氰酸硫氯化物(0.013ml，0.15mmol)。将混合物在0℃搅拌30min。然后添加在CH2Cl2(1.2mL)中的TEA(0.103ml，0.736mmol)和3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(37.8mg，0.162mmol)。将混合物在0℃下搅拌1h，然后在rt下搅拌1h，并用饱和NH4Cl和1N HCl(0.9mL)淬灭。将水溶液用CH2Cl2萃取(5X)。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤，并经由旋转蒸发浓缩，得到澄清油状物。通过快速色谱法(0％-100％ EtOAc/庚烷，然后0％-15％MeOH/CH2Cl2)进行纯化，得到呈澄清油状物的标题化合物的二叔丁酯(25mg，17％产率)。LC/MS:MH+＝997.6,Rt＝1.38min.HR/MS(肽，5min)：3.01min,M+＝997.4900,100％纯。1H NMR(400MHz,二氯甲烷-d2)δ7.86-7.78(m,2H),7.69(t,J＝7.9Hz,2H),7.49-7.40(m,2H),7.40
-7.31(m,2H),6.41-6.13(m,1H),6.04-5.50(m,1H),4.50-4.21(m,5H),3.92-3.66(m,9H),3.66-3.49(m,20H),3.44-3.22(m,4H),2.55-2.45(m,4H),1.47(s,18H)。在0℃下，向CH2Cl2(1.3ml)中的二酯中添加三乙基硅烷(0.004ml，0.03mmol)和TFA(0.567ml，7.36mmol)。将混合物在rt下搅拌1h，然后经由旋转蒸发进行浓缩。将残余物在真空中干燥30min，然后冻干(水/ACN＝3/3mL)，得到呈白色固体的11-(2-(((N-(2-(2-(2-羧基乙氧基)乙氧基)乙基)氨磺酰基)氨基甲酰基)氧基)乙基)-1-(9H-芴-9-基)-3,10-二氧代-2,7,14,17,20-五氧杂-4,11-二氮杂二十三烷-23-酸(24mg)。HRMS：MH+＝885.3500,Rt＝2.05min(5min酸性法)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.12(s,2H),7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.69(d,J＝7.5Hz,2H),7.46-7.39(m,2H),7.37-7.30(m,2H),7.28(t,J＝5.2Hz,1H),4.33-4.08(m,5H),3.67-3.55(m,7H),3.55-3.41(m,20H),3.41-3.36(m,2H),3.18-2.99(m,4H),2.69-2.56(m,2H),2.47-2.39(m,5H)。
3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸苄酯的合成
向CH2Cl2(24mL)中的2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14-四氧杂-5-氮杂十七烷-17-酸苄酯(1000mg，2.430mmol)添加三乙基硅烷(0.388mL，2.43mmol)和TFA(8mL，0.1mol)。将混合物在rt下搅拌1h。经由旋转蒸发并在高真空下去除挥发物，持续15min，然后用ACN/水(5/5mL)稀释并冻干，得到呈无色油状物的TFA盐形式的3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸苄酯(1.269g)。LC/MS:MH+＝312.3,Rt＝0.61min(2min酸性法)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.74(s,3H),7.43-7.28(m,5H),5.11(s,2H),3.66(t,J＝6.2Hz,2H),3.60-3.54(m,6H),3.50(s,4H),2.97(h,J＝5.7Hz,2H),2.61(t,J＝6.2Hz,2H)。
(S)-10-氨基-2,2-二甲基-4,11-二氧代-3,15,18,21-四氧杂-5,12-二氮杂二十四烷-24-酸苄酯的合成
向作为TFA盐的3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸苄酯(707mg，1.66mmol)和Fmoc-Lys(Boc)-OSu(987mg，1.75mmol)在DMF(6mL)中的混合物中添加DIPEA(0.871mL，4.99mmol)。将混合物在rt下搅拌过夜。向混合物中添加二甲胺(2N，在THF中，4.15mL，8.31mmol)。将混合物在rt下搅拌2h，用DMSO(10mL)稀释并通过RP-HPLC(C18，ACN/水，含0.1％ TFA)纯化，在冻干适当级分后得到呈澄清粘稠油状物TFA盐形式的(S)-10-氨基-2,2-二甲基-4,11-二氧代-3,15,18,21-四氧杂-5,12-二氮杂二十四烷-24-酸苄酯(630mg，58％产率)。LC/MS:MH+＝540.5,Rt＝0.83min(2min酸性法)。HRMS：MH+＝540.3300,Rt＝1.74min(5min酸性法)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.48(t,J＝5.6Hz,1H),8.05(d,J＝4.8Hz,3H),7.43-7.26(m,5H),6.76(t,J＝5.7Hz,1H),5.11(s,2H),3.73-3.59(m,5H),3.48-3.17(m,10H),2.93-2.84(m,2H),2.61(t,J＝6.2Hz,2H),1.71-1.61(m,2H),1.37(s,11H),1.31-1.19(m,2H)。
(S)-15-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)-14,17-二氧代-4,7,10,20,23,26-六氧杂-13,16-二氮杂二十九烷二酸1-苄基29-甲酯的合成
在0℃下，向乙腈(8ml)中的TFA盐形式的(S)-10-氨基-2,2-二甲基-4,11-二氧代-3,15,18,21-四氧杂-5,12-二氮杂二十四烷-24-酸苄酯(630mg，1.17mmol)和3-氧代-2,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸(324mg，1.226mmol)中添加DMTMM(303mg，1.26mmol)和DIPEA(0.816ml，4.67mmol)。将混合物搅拌1.5h。经由旋转蒸发然后在高真空中去除挥发物，持续15min。将所得无色油状物通过快速色谱法(0％-10％MeOH/CH2Cl2)纯化，得到呈无色油状物的(S)-15-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)-14,17-二氧代-4,7,10,20,23,26-六氧杂-13,16-二氮杂二十九烷二酸1-苄基29-甲酯(551mg，61％产率)。LC/MS:MH+＝786.4,Rt＝1.02min(2min酸性法)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.94-7.85(m,2H),7.41-7.28(m,5H),6.72(t,J＝5.7Hz,1H),5.11(s,2H),4.23-4.11(m,1H),3.70-3.55(m,9H),3.48(t,J＝3.0Hz,16H),3.38(t,J＝6.0Hz,2H),3.26-3.10(m,2H),2.91-2.81(m,2H),2.58(dd,J＝26.8,6.2Hz,4H),2.45-2.29(m,2H),1.37(m,15H)。
(S)-17-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)-3,15,18-三氧代-2,6,9,12,22,25,28-七氧杂-16,19-二氮杂三十一烷-31-酸的合成
将(S)-15-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)-14,17-二氧代-4,7,10,20,23,26-六氧杂-13,16-二氮杂二十九烷二酸1-苄基29-甲酯(202mg，0.257mmol)和Pd-C(10％，在碳上，27mg，0.026mmol)在THF(10mL)中的混合物用H2吹扫三次，然后在气球氢气下剧烈搅拌3.5h。将混合物过滤并首先用CH2Cl2洗涤，然后用1:1CH2Cl2/MeOH(20mL)洗涤。将滤液经由旋转蒸发浓缩，然后在高真空下浓缩过夜，得到呈粘稠油状物的(S)-17-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)-3,15,18-三氧代-2,6,9,12,22,25,28-七氧杂-16,19-二氮杂三十一烷-31-酸(180mg，100％产率)。LC/MS:MH+＝696.3,Rt＝0.79min(2min酸性法)。LC/MS:MH+＝696.8,Rt＝1.64min(5min酸性法)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.13(s,1H),7.90(q,J＝7.0Hz,2H),6.72(d,J＝5.7Hz,1H),4.26-4.11(m,1H),3.66-3.54(m,9H),3.54-3.42(m,16H),3.39(t,J＝5.9Hz,2H),3.26-3.11(m,2H),2.91-2.81(m,2H),2.57-2.52(m,2H),2.47-2.28(m,4H),1.63-1.14(m,15H)。
3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酸苄酯的合成
向CH2Cl2(24mL)中的2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十四烷-14-酸苄酯(1110mg，3.02mmol)添加三乙基硅烷(0.483mL，3.02mmol)和TFA(8mL，0.1mol)。将混合物在rt下搅拌1h。经由旋转蒸发并在高真空下去除挥发物，持续15min，然后用ACN/水(5/5mL)稀释并冻干，得到呈浅黄色油状物的TFA盐形式的3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酸苄酯(1.132g，产率98％)。LC/MS:MH+＝268.2,Rt＝0.58min(2min酸性法)。
(S)-10-氨基-2,2-二甲基-4,11-二氧代-3,15,18-三氧杂-5,12-二氮杂二十一烷-21-酸苄酯的合成
向DMF(10mL)中的TFA盐形式的3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸苄酯(1132mg，2.97mmol)和Fmoc-Lys(Boc)-OSu(1763mg，3.12mmol)中添加DIPEA(1.56ml，8.91mmol)。将混合物在rt下搅拌过夜。向混合物中添加二甲胺(2N，在THF中，7.42ml，14.8mmol)。将混合物在rt下搅拌2h，用DMSO(15mL)稀释并通过RP-HPLC(C18，ACN/水，含0.1％ TFA)纯化，在冻干适当级分后得到呈澄清粘稠油状物TFA盐形式的(S)-10-氨基-2,2-二甲基-4,11-二氧代-3,15,18-三氧杂-5,12-二氮杂二十一烷-21-酸苄酯(947mg，产率52％)。LC/MS:MH+＝496.5,Rt＝0.81min(2min酸性法)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.48(t,J＝5.6Hz,1H),8.12-8.00(m,3H),7.41-7.29(m,5H),6.76(t,J＝5.7Hz,1H),5.11(s,2H),3.75-3.63(m,4H),3.51(s,3H),3.44(t,J＝5.6Hz,2H),3.38-3.17(m,2H),2.94-2.82(m,2H),2.61(t,J＝6.2Hz,2H),1.71-1.61(m,2H),1.37(m,13H)。
(S)-12-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)-11,14-二氧代-4,7,17,20,23,26-六氧杂-10,13-二氮杂二十九烷二酸1-苄基29-甲酯的合成
在0℃下，向乙腈(10ml)中的TFA盐形式的(S)-10-氨基-2,2-二甲基-4,11-二氧代-3,15,18-三氧杂-5,12-二氮杂二十一烷-21-酸苄酯(1043mg，1.71mmol)和3-氧代-2,6,9,12,15-五氧代十八烷-18-酸(501mg，1.624mmol)中添加DMTMM(401mg，1.67mmol)和DIPEA(1.081ml，6.19mmol)。将混合物搅拌2.5h。向混合物中添加3-氧代-2,6,9,12,15-五氧代十八烷-18-酸(150mg，0.487mmol)和DMTMM(120mg，0.501mmol)和DIPEA(0.324ml，1.86mmol)。将混合物在rt下搅拌30min。经由旋转蒸发然后在高真空中去除挥发物，持续15min。将所得无色油状物通过快速色谱法(0％-10％ MeOH/CH2Cl2)纯化，然后将其产物用EtOAc与1:1饱和NaHCO3/H2O洗涤，得到呈白色固体的(S)-12-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)-11,14-二氧代-4,7,17,20,23,26-六氧杂-10,13-二氮杂二十九烷二酸1-苄基29-甲酯(1062mg，产率79％)。LC/MS:MH+＝786.7,Rt＝1.04min(2min酸性法)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.95-7.84(m,2H),7.42-7.29(m,5H),6.72(t,J＝5.7Hz,1H),5.11(s,2H),4.25-4.14(m,1H),3.70-3.55(m,9H),3.53-3.44(m,16H),3.38(t,J＝6.0Hz,2H),3.25-3.13(m,2H),2.91-2.81(m,2H),2.58(dd,J＝26.1,6.2Hz,4H),2.45-2.29(m,2H),1.37(m,16H)。
(S)-20-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)-3,18,21-三氧代-2,6,9,12,15,25,28-七氧杂-19,22-二氮杂三十一烷-31-酸的合成
将(S)-12-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)-11,14-二氧代-4,7,17,20,23,26-六氧杂-10,13-二氮杂二十九烷二酸1-苄基29-甲酯(620mg，789μmol)和Pd-C(10％，在碳上，84mg，0.079mmol)在THF(30mL)中的混合物用H2吹扫三次，然后在气球氢气下剧烈搅拌3.5h。将混合物过滤并首先用CH2Cl2洗涤，然后用1:1CH2Cl2/MeOH(60mL)洗涤。将滤液经由旋转蒸发浓缩，然后在高真空下浓缩过夜，得到(S)-20-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)-3,18,21-三氧代-2,6,9,12,15,25,28-七氧杂-19,22-二氮杂三十一烷-31-酸(620mg，789μmol)。LC/MS:MH+＝696.7,Rt＝1.08min(2min碱性法)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.14(s,1H),7.96-7.82(m,2H),6.73(t,J＝5.6Hz,1H),4.26-4.14(m,1H),3.67-3.54(m,9H),3.52-3.44(m,15H),3.39(t,J＝6.0Hz,2H),3.27-3.10(m,2H),2.92-2.81(m,2H),2.55(d,J＝6.2Hz,3H),2.47-2.34(m,4H),1.37(m,15H)。
(2-(3-氧代-3-((2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)乙基)(2-(三苯甲基氨基)乙基)氨基)丙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成
在0℃下，经20min分5次向在CH2Cl2(600mL)中的2,2,2-三氟-N-(2-((2-(三苯甲基氨基)乙基)氨基)乙基)乙酰胺(14.061g，31.85mmol，J.Org.Chem.[有机化学杂志]2012,77,4226-4234)和3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酸(7.949g，34.08mmol)中添加EDC(7.326g，38.22mmol)。将澄清溶液在0℃下搅拌30min，然后升温至rt过夜。向混合物中添加更多的3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酸(0.556g，2.38mmol)和EDC(0.733g，3.82mmol)。将混合物在rt下搅拌4h，并浓缩至约400mL，并用1:1盐水/水(150mL)洗涤。将水溶液用CH2Cl2萃取(20mL)。将洗涤和反萃取程序再重复三次。将合并的有机相用饱和NaHCO3(50mL×2)、盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到呈白色泡沫的(2-(3-氧代-3-((2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)乙基)(2-(三苯甲基氨基)乙基)氨基)丙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(19.98g，产率90％)。LC/MS:M+Na+＝679.5,M-＝655.5,Rt＝1.18min.(2min酸性)。该产物无需纯化即直接用于下一步。
(2-(3-((2-氨基乙基)(2-(三苯甲基氨基)乙基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成
向溶解在MeOH(130mL)和水(13mL)中的(2-(3-氧代-3-((2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)乙基)(2-(三苯甲基氨基)乙基)氨基)丙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(9.210，14.02mmol)中添加K2CO3(9.69g，70.1mmol)。将浆液在rt下经周末搅拌，然后过滤并用EtOAc洗涤。将滤液浓缩。将残余物用1:1盐水/水(80mL)洗涤。将水溶液用EtOAc(3X)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。为了去除残留溶剂，将产物用CH2Cl2溶解并浓缩。在高真空下干燥后，再重复一次，得到呈白色泡沫的(2-(3-((2-氨基乙基)(2-(三苯甲基氨基)乙基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(7.26g，92％产率)。LC/MS:MH+＝561.6,Rt＝2.19min.(5min酸性法)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.45-7.35(m,6H),7.33-7.25(m,6H),7.24-7.13(m,3H),6.72(q,J＝6.3Hz,1H),3.57(m,J＝13.0,6.6Hz,2H),3.43-3.25(m,11H,overlapping with water),3.22-2.94(m,4H),2.80-2.53(m,4H),2.47-2.23(m,2H),2.18-2.02(m,2H),1.37(d,J＝1.3Hz,9H)。该产物无需纯化即直接用于下一步。
3-(2-(3-(烯丙氧基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)丙酸的合成
在0℃下，经20min向3,3'-(乙烷-1,2-二基双(氧基))二丙酸(7.720g，37.44mmol)、丙-2-烯-1-醇(2.175g，2.55mL，37.4mmol)和DMAP(457mg，3.74mmol)在CH2Cl2(66mL)和二噁烷(100.0mL)中的混合物中逐滴添加在二氯甲烷(34mL)中的二环己基甲烷二亚胺(8.112g，39.31mmol)浆液。将混合物升温至rt并搅拌过夜。将反应混合物过滤并将固体用CH2Cl2(100mL)洗涤。在减压下去除滤液中的挥发物。将所得油状物与DMSO(24mL)混合并过滤。将滤液通过RP-HPLC(C18，ACN/水，含0.1％ TFA)纯化，在冻干适当级分后得到呈无色油状物的3-(2-(3-(烯丙氧基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)丙酸(4.487g，49％产率)。LC/MS:MH+＝247.0,Rt＝0.66min(2min酸性法)1H NMR(400MHz,DMSO)δ5.97-5.84(m,1H),5.34-5.26(m,1H),5.24-5.17(m,1H),4.59-4.54(m,2H),3.67-3.56(m,4H),3.52-3.30(m,6H,overlapping with DMSO),2.57(t,J＝6.2Hz,2H),2.43(t,J＝6.4Hz,2H)。
2,2-二甲基-4,11,16-三氧代-12-(2-(三苯甲基氨基)乙基)-3,8,19,22-四氧杂-5,12,15-三氮杂二十五烷-25-酸烯丙酯的合成
在0℃下，经10min分两批向溶解在CH2Cl2(150mL)中的(2-(3-((2-氨基乙基)(2-(三苯甲基氨基)乙基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(8420mg，15.02mmol)和3-(2-(3-(烯丙氧基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)丙酸(3.957g，16.07mmol)添加EDC(3.224g，16.82mmol)。将混合物升温并在rt下搅拌过夜。向混合物中添加3-(2-(3-(烯丙氧基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)丙酸(277mg，1.12mmol)和EDC(226mg，1.18mmol)。在rt下搅拌过夜后，将混合物用CH2Cl2(200mL)稀释并用1:1盐水/水(200mL)洗涤。将水溶液用CH2Cl2萃取(20mL)。将该洗涤和萃取程序再重复三次。将合并的有机相用饱和NaHCO3(200mL×2)、盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到无色油状物。将粗产物通过快速色谱法(0％-10％ MeOH/CH2Cl2)纯化，得到呈粘稠无色油状物的2,2-二甲基-4,11,16-三氧代-12-(2-(三苯甲基氨基)乙基)-3,8,19,22-四氧杂-5,12,15-三氮杂二十五烷-25-酸烯丙酯(11.275g，95％产率)。LC/MS:MH+＝789.7,Rt＝1.05min(2min酸性法)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.98(d,J＝3.3Hz,1H),7.82(t,J＝6.0Hz,1H),7.40-7.33(m,6H),7.28(t,J＝7.5Hz,6H),7.22-7.14(m,3H),6.71(d,J＝5.8Hz,1H),5.90(dddd,J＝15.8,9.4,6.0,4.6Hz,1H),5.76(s,1H),5.33-5.25(m,1H),5.22-5.16(m,1H),4.58-4.52(m,2H),3.66-3.52(m,6H),3.49-3.35(m,6H),3.27-2.96(m,6H),2.82-2.53(m,5H),2.36-2.20(m,3H),2.15-2.01(m,2H),1.37(s,9H)。
12-(2-氨基乙基)-2,2-二甲基-4,11,16-三氧代-3,8,19,22-四氧杂-5,12,15-三氮杂二十五烷-25-酸烯丙酯的合成
向(经由超声处理)溶解在三氟乙醇(19mL)中的2,2-二甲基-4,11,16-三氧代-12-(2-(三苯甲基氨基)乙基)-3,8,19,22-四氧杂-5,12,15-三氮杂二十五烷-25-酸烯丙酯(8763mg，11.11mmol)中添加乙酸(19.07mL，333.2mmol)。将混合物在60℃下搅拌2h。将反应混合物冷却至rt，并与无水甲苯(100mL)混合，并浓缩。将与甲苯的共沸蒸馏再重复两次。向残余物中添加甲苯(8mL)，并在快速搅拌下将所得溶液逐滴添加到冰冷的1:1乙醚/庚烷(400mL)中。在0℃下继续搅拌15min。倾析澄清的顶部母液，并丢弃。将底部油性材料用新鲜的1:1乙醚/庚烷(2×50mL)洗涤并在真空中干燥，得到油状物(7.718g)，即标题化合物的HOAc盐。将该材料溶解在1/9TFE/CH2Cl2(250mL)中，并用饱和NaHCO3(2×100mL)洗涤，直至水溶液呈碱性。将合并的有机相用盐水(75mL)洗涤。将水溶液用1/9TFE/CH2Cl2(20mL)萃取两次。将合并有机相经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到无色油状物，即12-(2-氨基乙基)-2,2-二甲基-4,11,16-三氧代-3,8,19,22-四氧杂-5,12,15-三氮杂二十五烷-25-酸烯丙酯(7.962g，粗品，76.5wt％纯度，假设100％产率)，其直接用于下一步骤。LC/MS:MH+＝547.5,Rt＝0.73min(2min酸性法)。
17-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,21,30-三氧代-4,7,10,24,27,31-六氧杂-14,17,20-三氮杂三十四碳-33-烯酸的合成
向上述制备的12-(2-氨基乙基)-2,2-二甲基-4,11,16-三氧代-3,8,19,22-四氧杂-5,12,15-三氮杂二十五烷-25-酸烯丙酯(665mg，76.3wt％，928μmol)中添加溶解在乙腈(3.7mL)中的3-(2-(2-(3-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(387mg，1.11mmol)，以及DIPEA(323μL，1.86mmol)。将混合物在rt下搅拌20h，经由旋转蒸发去除挥发物。将所得油状物用DMSO(6mL)稀释并通过RP-HPLC(C18，ACN/水，含0.1％ NH4OH)纯化。将含有所需产物的级分(总计约112mL)用EtOAc(75mL)稀释并用1N HCl(3.5mL)酸化。将有机相分离。将水溶液用EtOAc(2×30mL)萃取。将合并的EtOAc萃取物与庚烷(20mL)混合，并将混合物用盐水(2×15mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，浓缩，得到无色油状物，即17-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,21,30-三氧代-4,7,10,24,27,31-六氧杂-14,17,20-三氮杂三十四碳-33-烯酸(274mg，37.8％产率)。LC/MS:MH+＝779.7,Rt＝1.72min(5min酸性法)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.06(s,1H),8.05-7.94(m,1H),7.93-7.80(m,1H),6.71(d,J＝6.0Hz,1H),5.98-5.84(m,1H),5.35-5.26(m,1H),5.24-5.16(m,1H),4.60-4.51(m,2H),3.68-3.53(m,10H),3.53-3.41(m,12H),3.40-3.24(m,8H,overlapping with DMSO),3.17(dt,J＝16.1,6.3Hz,4H),3.09-3.00(m,2H),2.61-2.53(m,4H),2.44(t,J＝6.3Hz,2H),2.33-2.24(m,4H),1.37(s,9H)。将水层进一步用1/9TFE/CH2Cl2(3×15mL)萃取，得到呈无色油状物的另外的标题化合物(122mg，16.9％产率)。
13-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-4,7,10,16,19,22-六氧杂-13-氮杂二十五烷二酸二叔丁酯的合成
向3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酸(CAS号：1654740-73-4)(87mg，0.244mmol)在DMF(0.50mL)中的溶液中添加HATU(93mg，0.244mmol)和DIPEA(0.205mL，1.172mmol)。将混合物在RT下搅拌15min，并添加到4,7,10,16,19,22-六氧杂-13-氮杂二十五烷二酸二叔丁酯(Broadpharm)(105mg，0.195mmol)在DMF(0.2mL)中的溶液中。将混合物在RT下搅拌1hr并浓缩以去除挥发物。将残余物用DMSO(2ml)稀释并通过RP-ISCO色谱法(ISCO金C18柱，100g，水/MeCN作为洗脱剂，0.1％ TFA作为改性剂)纯化，在冻干后得到13-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-4,7,10,16,19,22-六氧杂-13-氮杂二十五烷二酸二叔丁酯(135mg，79％产率)。LC/MS:MH+＝875.8,Rt＝1.33min(2min酸性法)。
13-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-4,7,10,16,19,22-六氧杂-13-氮杂二十五烷二酸的合成
将13-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-4,7,10,16,19,22-六氧杂-13-氮杂二十五烷二酸二叔丁酯(135mg，0.154mmol)和TFA(1.010mL，13.11mmol)在DCM(2mL)中的混合物在RT下搅拌2hr。添加DCE(3ml)后，将混合物在旋转蒸发器上浓缩。将残余物用DMSO(2mL)稀释并通过RP-ISCO色谱法(100G ISCO金C18柱，水/MeCN作为洗脱剂，0.1％ TFA作为改性剂)纯化，在冻干后得到13-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-4,7,10,16,19,22-六氧杂-13-氮杂二十五烷二酸(120mg，99％产率)。LC/MS:MH+＝763.5,Rt＝0.97min(2min酸性法)。
(3-(双(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯的合成
向双(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)胺(200mg，0.743mmol)、3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸(148mg，0.780mmol)在DMF(4ml)中的溶液中添加HATU(296mg，0.780mmol)，然后添加DIPEA(389μl，2.228mmol)。将反应混合物在RT下搅拌1h，并通过150gC18 RP柱(水/MeCN作为洗脱剂，0.1％ TFA作为改性剂)纯化，在冻干后得到(3-(双(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯(148mg，44％产率)。LC/MS:MH+＝441.3,Rt＝0.92min(2min酸性法)。
3-氨基-N,N-双(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)丙酰胺的合成
将TFA(0.568mL，7.38mmol)添加到(3-(双(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯(65mg，0.15mmol)在二氯甲烷(0.6mL)中的溶液中。将混合物在RT下搅拌1hr。添加DCE(3ml)后，将混合物在旋转蒸发器上浓缩。向残余物中添加2-3ml乙醚并进行超声处理，并去除乙醚，得到3-氨基-N,N-双(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)丙酰胺(66.4mg，99％产率)。LC/MS:MH+＝421.2,Rt＝0.52min(2min酸性法)。
(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯的合成
向含有Pd/C(10wt％，湿，Degussa型)(1.030g，10％ Wt，0.2当量，968.1μmol)的RB-烧瓶中缓慢添加(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯--(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯(3.000g，1当量，4.840mmol)在54ml MeOH中的溶液。在三个真空/H2循环之后，用H2气球向混合物充入H2(1atm)，并在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过硅藻土(用DCM预洗涤)通过自然重力过滤，并用DCM洗涤，然后用MeOH/DCM(1/1)洗涤。将滤液在真空中浓缩，得到呈2.337g(99％产率)粘稠油状物的所需产物，其不经进一步纯化即用于下一反应。HRMS：MH+＝486.3611,Rt＝1.52min(5min酸性法)。
(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯的合成
向(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯(2.337g，1当量，4.812mmol)、(1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酸(1.277g，1.1当量，5.293mmol)和HATU(2.013g，1.1当量，5.293mmol)在DMF(20ml)中的混合物中添加DIPEA(3.110g，4.19mL，5当量，24.06mmol)。将反应混合物在RT下搅拌3h。将粗混合物在真空下浓缩以去除DIPEA和大部分DMF，然后通过C18柱(150g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-100％，经18CV)纯化，获得(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯2.704g(79％产率)。HRMS：MH+＝709.4865,Rt＝2.98min(5min酸性法)。
(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯的合成
在0℃(冰水浴)下，向(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(2.704g，1当量，3.814mmol)在DCM(22ml)中的预冷溶液中逐滴添加预冷却的TFA(10.87g，7.346mL，25当量，95.35mmol)。将混合物在0℃下搅拌15min，然后升至RT，并在RT下搅拌2h。将粗品在高真空下浓缩，然后在高真空下干燥过夜，然后溶解在MeOH中，并通过C-18柱(150g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-55％，经18CV)纯化，获得(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯(2.73g，99％产率)。HRMS：MH+＝609.4279,Rt＝1.61min(5min酸性法)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(羟甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(500.0mg，1当量，671.2μmol)在DMF(4ml)中的溶液中添加碳酸双(4-硝基苯基)酯(408.4mg，2当量，1.342mmol)，搅拌至完全溶解；然后逐滴添加DIPEA(260.3mg，357μL，3当量，2.014mmol)。将反应混合物在RT下搅拌3h。将粗品直接注入并通过C-18柱(100g柱，MeCN/水，0％-100％，经18CV)纯化，获得(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(594mg，97％产率)。HRMS：MH+＝910.4000,Rt＝3.05min(5min酸性法)。
(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯的合成
向(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯(440mg，1当量，609μmol)在DMF(4ml)中的溶液中添加(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(609mg，1.10当量，670μmol)，然后添加DIPEA(472mg，636μL，6当量，3.65mmol)。将反应混合物在RT下搅拌2h。然后添加Me2NH(2M，在THF中)(274mg，3.04mL，2摩尔，10当量，6.09mmol)，并在RT下搅拌30min。将粗品在真空下浓缩，然后用DMSO稀释，然后用C-18柱(100g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA0％-65％，经18CV)纯化，获得(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(303mg，40％产率)。HRMS：MH+＝1157.7408,Rt＝2.10min(5min酸性法)。(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基
-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯的合成
向DMF(1ml)中的74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂七十五烷-75-酸(399.4mg，1.5当量，357.5μmol)中添加HATU(135.9mg，1.5当量，357.5μmol)，然后添加DIPEA(184.8mg，249μL，6当量，1.430mmol)。pH测试为碱性。将混合物搅拌30min。向上述混合物中添加(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(303.0mg，1当量，238.3μmol)在DMF(1ml)中的溶液。将混合物在Rt下搅拌1h。将粗品通过C18柱(100g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-70％，经18CV)纯化，获得(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(387mg，72％产率)。HRMS：MH+＝2256.3501,Rt＝2.63min(5min酸性法)。
(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)氧基)羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸的合成
向(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(1302.3mg，1当量，577.06μmol)在MeOH(8ml)、水(8ml)和THF(4ml)中的溶液中添加LiOH(414.6mg，30当量，17.312mmol)。将所得反应混合物在RT下搅拌2h。向粗混合物中缓慢添加HCl(4M，在二噁烷中，3.8ml)以中和额外的LiOH，但仍保持最终溶液pH接近中性，但不是酸性，以避免de-Boc。然后将粗品用C18柱(275g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-60％，经18CV)纯化，得到(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)氧基)羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(1.203g，92％产率)。HRMS：MH+＝2243.3601,Rt＝2.49min(5min酸性法)。
(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯的合成
向(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)氧基)羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(644.0mg，1当量，287.1μmol)在DMF(6ml)中的溶液中添加(S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙-1-胺盐酸盐(89.87mg，1.3当量，373.3μmol)，然后添加HATU(141.9mg，1.3当量，373.3μmol)和DIPEA(222.7mg，300μL，6当量，1.723mmol)。反应混合物变成浅棕色，在RT下搅拌2h。将粗混合物通过C-18柱(150g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-80％，经18CV)纯化，获得(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(667mg，95％产率)。HRMS：MH+＝2429.4099,Rt＝2.68min(5min酸性法)。
(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯的合成
向(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(667.2mg，1当量，274.7μmol)在DCM(1ml)中的溶液中添加三乙基硅烷(319.4mg，439μL，10当量，2.747mmol)。将混合物在冰水浴中冷却至0℃，然后用TFA(0.333ml)(TFA/DCM，25％v/v)预冷。将混合物在0℃下搅拌15min，然后升至RT。将混合物在RT下搅拌1h。将粗品通过C18柱(100g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA 10％-80％，经18CV)纯化，获得(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(627mg，93％产率)。HRMS：MH+＝2328.3401,Rt＝2.17min(5min酸性法)。
(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯的合成
向(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(100mg/ml，在DMF中)(214.7mg，2.15mL，1当量，87.89μmol)中添加(4-硝基苯基)碳酸2-叠氮基乙酯(100mg/ml，在DMF中)(66.49mg，665μL，3当量，263.7μmol)，然后添加DIPEA(90.87mg，122μL，8当量，703.1μmol)。pH测试为碱性。将混合物在RT下搅拌1h。将粗品通过C18柱(100g，MeCN/水，含0.05％ TFA10％-80％，经18CV)纯化，获得(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(179mg，83％产率)。HRMS：MH+＝2442.3799,Rt＝2.59min(5min酸性法)。
(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯的合成
向(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)氧基)羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(100mg/ml，在DMF中)(400.0mg，4.00mL，1当量，178.4μmol)中添加L-苯丙氨酸叔丁酯盐酸盐(59.76mg，1.3当量，231.9μmol)，然后添加HATU(88mg，1.3当量，232μmol)和DIPEA(138.3mg，186μL，6当量，1.070mmol)。反应混合物变成浅棕色，在RT下搅拌2h。将粗混合物通过C-18柱(150g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-80％，经18CV)纯化，获得(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(383mg，88％产率)。HRMS：MH+＝2445.4900,Rt＝2.92min(5min酸性法)。
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)氧基)羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸的合成
向(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(347.5mg，1当量，142.1μmol)在DCM(1.2ml)中的溶液中添加三乙基硅烷(165.2mg，227μL，10当量，1.421mmol)。将混合物在冰水浴中冷却至0C，然后用TFA(0.4ml)(TFA/DCM，25％v/v)预冷。将混合物在0℃下搅拌15min，然后升至RT。将混合物在RT下搅拌1h。将粗品在高真空下浓缩，然后通过C18柱(100g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-80％，经18CV)纯化，获得((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)氧基)羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸(330mg，96％产率)。HRMS：MH+＝2290.3799,Rt＝2.09min(5min酸性法)。
(1R,1'R,3S,3'S,4S,4'S)-双(3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸((((2S,5S,39S,42S)-22-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)-4,1-亚苯基))双(亚甲基)酯)的合成
向16-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸(25mg/ml，在DMF中)(10.00mg，0.40ml，1当量，12.77μmol)中添加HATU(100mg/ml)(11.66mg，117μL，2.4当量，30.66μmol)，然后添加DIPEA(19.81mg，26.7μL，12当量，153.3μmol)。将混合物在RT下搅拌30min。然后向上述混合物中添加(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(100mg/ml，在DMF中)(68.65mg，686μL，2.2当量，28.10μmol)。将混合物在RT下搅拌90min。将粗混合物用C4柱(50g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-80％，经18CV)纯化，获得(1R,1'R,3S,3'S,4S,4'S)-双(3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸((((2S,5S,39S,42S)-22-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)-4,1-亚苯基))双(亚甲基)酯)(32mg，47％产率)。HRMS：MH+＝5402.1401,Rt＝2.87min(5min酸性法)。
实例#1：(1R,3S,4S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酰基}-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸{4-[(2S,5S,39S,42S)-47-氨基-2-(3-氨基甲酰胺基丙基)-22-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15,22-二氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-基]-42-{[4-({[(1R,3S,4S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酰基}-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基]氧基}甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基]氨基甲酰基}-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40,47-七氧代-5,39-二(丙-2-基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41,46-八氮杂四十七烷-1-酰胺基]-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基}甲酯的合成
在0℃(冰水浴)下，向(1R,1'R,3S,3'S,4S,4'S)-双(3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸((((2S,5S,39S,42S)-22-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)-4,1-亚苯基))双(亚甲基)酯)(60.60mg，1当量，11.21μmol)在DCM(1.5ml)中的预冷溶液中添加预冷却的TFA(0.5ml)(TFA/DCM，作为25％v/v)。将混合物在0℃下搅拌15min，然后升至RT，并在RT下搅拌30min。然后将混合物在高真空下浓缩1h。向在DMF(1ml)中的所得混合物中添加1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(14.88mg，3当量，33.64μmol)，然后添加DIPEA(21.74mg，29.3μL，15当量，168.2μmol)。将反应混合物在RT下搅拌30min。将粗混合物用C4柱(非C-18)(50g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA，0％-80％，经18CV)纯化，获得(1R,3S,4S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酰基}-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸{4-[(2S,5S,39S,42S)-47-氨基-2-(3-氨基甲酰胺基丙基)-22-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15,22-二氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-基]-42-{[4-({[(1R,3S,4S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酰基}-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基]氧基}甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基]氨基甲酰基}-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40,47-七氧代-5,39-二(丙-2-基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41,46-八氮杂四十七烷-1-酰胺基]-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基}甲酯(30mg，47％产率)。HRMS：MH+＝5629.2300,Rt＝2.80min(5min酸性法)。
(1R,3S,4S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酰基}-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸{4-[(2S)-2-{(2S)-2-[({2-[4-(8-{2-[2-({1-[(6S,9S)-14-氨基-9-{[4-({[(1R,3S,4S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酰基}-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基]氧基}甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基]氨基甲酰基}-4,7,14-三氧代-6-(丙-2-基)-3-氧杂-5,8,13-三氮杂十四烷-1-基]-1H-1,2,3-三唑-4-基}甲氧基)乙氧基]乙基}-18,18-二甲基-9,16-二氧代-2,5,12,17-四氧杂-8,15-二氮杂十九烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]乙氧基}羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基}-5-氨基甲酰胺基戊酰胺基]-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基}甲酯的合成
将(6-氧代-7-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)-3,10,13-三氧杂-7-氮杂十六碳-15-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯(50mg/ml，在DMSO中)(5.0mg，0.100mL，1当量，10μmol)和(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(50mg/ml，在DMSO中)(60mg，1.2mL，2.4当量，25μmol)的混合物抽真空并用N2吹扫，重复三次。添加抗坏血酸钠(32mg/ml，在水中)(7.4mg，0.23mL，3.6当量，37μmol)，然后添加CuSO4.5H2O(16mg/ml，在水中)(3.1mg，0.19mL，1.2当量，12μmol)。将所得混合物抽真空并用N2吹扫，重复3次。然后将混合物在RT下在N2气氛下搅拌90min。将反应混合物直接上样并通过C4柱(50g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-90％，经16CV)分离，获得(1R,3S,4S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酰基}-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸{4-[(2S)-2-{(2S)-2-[({2-[4-(8-{2-[2-({1-[(6S,9S)-14-氨基-9-{[4-({[(1R,3S,4S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酰基}-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基]氧基}甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基]氨基甲酰基}-4,7,14-三氧代-6-(丙-2-基)-3-氧杂-5,8,13-三氮杂十四烷-1-基]-1H-1,2,3-三唑-4-基}甲氧基)乙氧基]乙基}-18,18-二甲基-9,16-二氧代-2,5,12,17-四氧杂-8,15-二氮杂十九烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]乙氧基}羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基}-5-氨基甲酰胺基戊酰胺基]-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基}甲酯(49mg，89％产率)。HRMS：MH+＝5365.9902,Rt＝2.87min(5min酸性法)。
实例#2：(1R,1'R,3S,3'S,4S,4'S)-双(3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸((((2S,2'S)-2,2'-(((2S,2'S)-2,2'-((((((8-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酰基)-2,5,11,14-四氧杂-8-氮杂十五烷-1,15-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(甲酰基))双(氮烷二基))双(3-甲基丁酰基))双(氮烷二基))双(5-脲基戊酰基))双(氮烷二基))双(2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)-4,1-亚苯基))双(亚甲基)酯)的合成
在0℃(冰水浴)下，向(1R,3S,4S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酰基}-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸{4-[(2S)-2-{(2S)-2-[({2-[4-(8-{2-[2-({1-[(6S,9S)-14-氨基-9-{[4-({[(1R,3S,4S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酰基}-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基]氧基}甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基]氨基甲酰基}-4,7,14-三氧代-6-(丙-2-基)-3-氧杂-5,8,13-三氮杂十四烷-1-基]-1H-1,2,3-三唑-4-基}甲氧基)乙氧基]乙基}-18,18-二甲基-9,16-二氧代-2,5,12,17-四氧杂-8,15-二氮杂十九烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]乙氧基}羰基)氨基]-3-甲基丁酰胺基}-5-氨基甲酰胺基戊酰胺基]-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基}甲酯(49.1mg，1当量，9.15μmol)在DCM(1.5ml)中的预冷溶液中添加预冷却的TFA(0.5ml)(TFA/DCM，作为25％v/v)。将混合物在0℃下搅拌15min，然后升至RT，并在RT下搅拌30min。将混合物在高真空下浓缩1h。向上述混合物和在DMF(1ml)中的1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(12.1mg，3当量，27.4μmol)中添加DIPEA(17.7mg，23.9μL，15当量，137μmol)。将反应混合物在RT下搅拌30min。将混合物用C4柱(50g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA，0％-80％，经18CV)分离，获得(1R,1'R,3S,3'S,4S,4'S)-双(3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸((((2S,2'S)-2,2'-(((2S,2'S)-2,2'-((((((8-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酰基)-2,5,11,14-四氧杂-8-氮杂十五烷-1,15-二基)双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(甲酰基))双(氮烷二基))双(3-甲基丁酰基))双(氮烷二基))双(5-脲基戊酰基))双(氮烷二基))双(2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)-4,1-亚苯基))双(亚甲基)酯)(28mg，54％产率)。HRMS：MH+＝5593.1499,Rt＝2.80min(5min酸性法)。
(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((2S,5S)-23-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-5-异丙基-4,7,19,27,36-五氧代-2-(3-脲基丙基)-10,13,16,30,33,37-六氧杂-3,6,20,23,26-五氮杂四碳-39-烯酰胺)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯的合成
向17-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,21,30-三氧代-4,7,10,24,27,31-六氧杂-14,17,20-三氮杂三十四碳-33-烯酸(25mg/ml，在DMF中)(20.00mg，0.80mL，1当量，25.68μmol)中添加HATU(100mg/ml，在DMF中)(11.72mg，117μL，1.2当量，30.81μmol)，然后添加DIPEA(19.91mg，26.8μL，6当量，154.1μmol)。将反应混合物搅拌30min。然后添加(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(100mg/ml，在DMF中)(75.27mg，753μL，1.2当量，30.81μmol)。将混合物在RT下搅拌1h。将粗品通过C18柱(100g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-80％，经18CV)纯化，获得(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((2S,5S)-23-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-5-异丙基-4,7,19,27,36-五氧代-2-(3-脲基丙基)-10,13,16,30,33,37-六氧杂-3,6,20,23,26-五氮杂四碳-39-烯酰胺)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(58mg，73％产率)。HRMS：MH+＝3088.7500,Rt＝2.64min(5min酸性法)。
(6S,9S)-1-氨基-27-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-9-异丙基-6-((4-((((1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基甲酰基)-1,8,11,23,31-五氧代-14,17,20,34,37-五氧杂-2,7,10,24,27,30-六氮杂四十烷-40-酸的合成
向(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((2S,5S)-23-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-5-异丙基-4,7,19,27,36-五氧代-2-(3-脲基丙基)-10,13,16,30,33,37-六氧杂-3,6,20,23,26-五氮杂四碳-39-烯酰胺)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(110.9mg，1当量，35.89μmol)在THF/MeOH(1ml/1ml，总计2ml)中的溶液中添加苯基硅烷(7.769mg，8.85μL，2当量，71.79μmol)。将溶液在真空下脱气，然后通过N2球囊充入N2；重复3次；然后向溶液中添加Pd(Ph3P)4(414.8μg，0.01当量，0.3589μmol)。将反应混合物在真空下脱气，然后通过N2球囊充入N2；重复3次。将反应混合物在N2下在RT下搅拌过夜。将粗品通过硅藻土过滤器过滤，然后用MeOH洗涤，在真空下浓缩以去除挥发物，并将所得粗品溶解在DMSO中，并通过C18柱(100g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-55％，经18CV)纯化，获得(6S,9S)-1-氨基-27-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-9-异丙基-6-((4-((((1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基甲酰基)-1,8,11,23,31-五氧代-14,17,20,34,37-五氧杂-2,7,10,24,27,30-六氮杂四十烷-40-酸(67mg，61％产率)。HRMS：MH+＝3048.7231,Rt＝2.50min(5min酸性法)。
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(((4-((S)-2-((S)-2-((S)-14-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-32-(((S)-1-((4-((((1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酰基)-33-甲基-10,18,30-三氧代-4,7,21,24,27-五氧杂-11,14,17,31-四氮杂三十四烷酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)氧基)羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸的合成
向(6S,9S)-1-氨基-27-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-9-异丙基-6-((4-((((1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基甲酰基)-1,8,11,23,31-五氧代-14,17,20,34,37-五氧杂-2,7,10,24,27,30-六氮杂四十烷-40-酸(67mg，22μmol)中添加TSTU(50mg/ml，在NMP中)(6.976mg，0.14mL，1.05当量，23.17μmol)，然后添加DIPEA(22.82mg，30.8μL，8当量，176.5μmol)。将混合物搅拌30min。向上述混合物中添加((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)氧基)羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸(80mg/ml，在NMP中)(95.48mg，1.2mL，1.8当量，39.72μmol)，然后添加额外的DIPEA(22.82mg，30.8μL，8当量，176.5μmol)。将混合物搅拌1h。将粗品用C4柱(50g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-90％，经18CV)纯化，获得((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(((4-((S)-2-((S)-2-((S)-14-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-32-(((S)-1-((4-((((1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酰基)-33-甲基-10,18,30-三氧代-4,7,21,24,27-五氧杂-11,14,17,31-四氮杂三十四烷酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)氧基)羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸(76mg，65％产率)。HRMS：MH+＝5319.0498,Rt＝2.76min(5min酸性法)。
实例#3：
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(((4-((S)-2-((S)-2-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-23-((S)-18-(((S)-1-((4-((((1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酰基)-19-甲基-4,16-二氧代-7,10,13-三氧杂-3,17-二氮杂二十烷基)-15,22,27-三氧代-3,6,9,12,19,30,33-五氧杂-16,23,26-三氮杂三十六烷-36-酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)氧基)羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸的合成
在0℃(冰水浴)下，向((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(((4-((S)-2-((S)-2-((S)-14-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-32-(((S)-1-((4-((((1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酰基)-33-甲基-10,18,30-三氧代-4,7,21,24,27-五氧杂-11,14,17,31-四氮杂三十四烷酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)氧基)羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸(76.50mg，1当量，14.38μmol)在DCM(1.5ml)中的预冷溶液中添加预冷却的TFA(0.5ml)(TFA/DCM，作为25％v/v)。将混合物在0℃下搅拌15min，然后升至RT，并在Rt下搅拌30min。将混合物在高真空下浓缩1h。向上述粗品和1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(19.08mg，3当量，43.13μmol)在DMF(1ml)中的混合物中添加DIPEA(27.87mg，37.6μL，15当量，215.6μmol)。将反应混合物在RT下搅拌30min。将混合物用C4柱(50g柱，MeCN/水，含0.05％TFA，0％-80％，经18CV)分离，获得((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(((4-((S)-2-((S)-2-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-23-((S)-18-(((S)-1-((4-((((1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酰基)-19-甲基-4,16-二氧代-7,10,13-三氧杂-3,17-二氮杂二十烷基)-15,22,27-三氧代-3,6,9,12,19,30,33-五氧杂-16,23,26-三氮杂三十六烷-36-酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)氧基)羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸(38mg，48％产率)。HRMS：MH+＝5546.1299,Rt＝2.71min(5min酸性法)。
12-(2-(2-((1-((6S,9S)-1-氨基-9-异丙基-6-((4-((((1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基甲酰基)-1,8,11-三氧代-12-氧杂-2,7,10-三氮杂十四烷-14-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙基)-2,2-二甲基-4,11-二氧代-3,8,15,18,21-五氧杂-5,12-二氮杂二十四烷-24-酸的合成
将4,7,13,16,19-五氧杂-10-氮杂十二烷-1-炔-22-酸、2,2-二甲基-4,11-二氧代-12-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)-3,8,15,18,21-五氧杂-5,12-二氮杂二十四烷-24-酸(25mg/ml，在DMSO中)(12.56mg，0.50mL，1当量，22.32μmol)和(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄酯(50mg/ml，在DMSO中)(59.96mg，1.2mL，1.1当量，24.55μmol)的混合物抽真空并用N2吹扫，重复三次。然后添加抗坏血酸钠(32mg/ml，在水中)(15.92mg，0.50mL，3.6当量，80.36μmol)，然后添加CuSO4.5H2O(16mg/ml，在水中)(6.688mg，0.42mL，1.2当量，26.79μmol)。将所得混合物抽真空并用N2吹扫，重复3次。然后将混合物在RT下在N2气氛下搅拌90min。将反应混合物直接上样并通过C-18柱(50gC-4，MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-90％，经16CV)分离，获得12-(2-(2-((1-((6S,9S)-1-氨基-9-异丙基-6-((4-((((1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基甲酰基)-1,8,11-三氧代-12-氧杂-2,7,10-三氮杂十四烷-14-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙基)-2,2-二甲基-4,11-二氧代-3,8,15,18,21-五氧杂-5,12-二氮杂二十四烷-24-酸(63mg，95％产率)。HRMS：MH+＝3033.7141,Rt＝2.59min(5min酸性法)。
(2S)-2-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-{[(1R,3S,4S)-2-({[4-{[(26S,29S)-12-{2-[2-({1-[(6S,9S)-14-氨基-9-{[4-({[(1R,3S,4S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酰基}-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基]氧基}甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基]氨基甲酰基}-4,7,14-三氧代-6-(丙-2-基)-3-氧杂-5,8,13-三氮杂十四烷-1-基]-1H-1,2,3-三唑-4-基}甲氧基)乙氧基]乙基}-29-(3-氨基甲酰胺基丙基)-2,2-二甲基-4,11,24,27,30-五氧代-26-(丙-2-基)-3,8,15,18,21-五氧杂-5,12,25,28-四氮杂三十烷-30-基]氨基}-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基]甲氧基}羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羰基]氨基}-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基}-3-苯基丙酸的合成
向12-(2-(2-((1-((6S,9S)-1-氨基-9-异丙基-6-((4-((((1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基甲酰基)-1,8,11-三氧代-12-氧杂-2,7,10-三氮杂十四烷-14-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙基)-2,2-二甲基-4,11-二氧代-3,8,15,18,21-五氧杂-5,12-二氮杂二十四烷-24-酸(30mg/ml，在NMP)(64mg，2.133mL，1当量，21μmol)中添加TSTU(50mg/ml，在NMP中)(6.7mg，0.13mL，1.05当量，22μmol)，然后添加DIPEA(22mg，30μL，8当量，0.17mmol)。将混合物搅拌30min。向上述混合物中添加((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)氧基)羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸(80mg/ml，在NMP中)(92mg，1.2mL，1.8当量，38μmol)，添加额外的DIPEA(22mg，30μL，8当量，0.17mmol)。将混合物在RT下搅拌2h。将粗品用C4柱(50g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA 0％-90％，经18CV)纯化，获得(2S)-2-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-{[(1R,3S,4S)-2-({[4-{[(26S,29S)-12-{2-[2-({1-[(6S,9S)-14-氨基-9-{[4-({[(1R,3S,4S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酰基}-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基]氧基}甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基]氨基甲酰基}-4,7,14-三氧代-6-(丙-2-基)-3-氧杂-5,8,13-三氮杂十四烷-1-基]-1H-1,2,3-三唑-4-基}甲氧基)乙氧基]乙基}-29-(3-氨基甲酰胺基丙基)-2,2-二甲基-4,11,24,27,30-五氧代-26-(丙-2-基)-3,8,15,18,21-五氧杂-5,12,25,28-四氮杂三十烷-30-基]氨基}-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基]甲氧基}羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羰基]氨基}-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基}-3-苯基丙酸(58.6mg，52％产率)。HRMS：MH+＝5274.0098,Rt＝2.82min(5min酸性法)。
实例#4：
(2S)-2-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-{[(1R,3S,4S)-2-({[4-{[(37S,40S)-23-{2-[2-({1-[(6S,9S)-14-氨基-9-{[4-({[(1R,3S,4S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酰基}-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基]氧基}甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基]氨基甲酰基}-4,7,14-三氧代-6-(丙-2-基)-3-氧杂-5,8,13-三氮杂十四烷-1-基]-1H-1,2,3-三唑-4-基}甲氧基)乙氧基]乙基}-40-(3-氨基甲酰胺基丙基)-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15,22,35,38,41-五氧代-37-(丙-2-基)-3,6,9,12,19,26,29,32-八氧杂-16,23,36,39-四氮杂四十一烷-41-基]氨基}-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基]甲氧基}羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羰基]氨基}-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基}-3-苯基丙酸的合成
在0℃(冰水浴)下，向(2S)-2-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-{[(1R,3S,4S)-2-({[4-{[(26S,29S)-12-{2-[2-({1-[(6S,9S)-14-氨基-9-{[4-({[(1R,3S,4S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酰基}-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基]氧基}甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基]氨基甲酰基}-4,7,14-三氧代-6-(丙-2-基)-3-氧杂-5,8,13-三氮杂十四烷-1-基]-1H-1,2,3-三唑-4-基}甲氧基)乙氧基]乙基}-29-(3-氨基甲酰胺基丙基)-2,2-二甲基-4,11,24,27,30-五氧代-26-(丙-2-基)-3,8,15,18,21-五氧杂-5,12,25,28-四氮杂三十烷-30-基]氨基}-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基]甲氧基}羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羰基]氨基}-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基}-3-苯基丙酸(58.60mg，1当量，11.11μmol)在DCM(1.5ml)中的预冷溶液中添加预冷却的TFA(0.5ml)(TFA/DCM，作为25％v/v)。将混合物在0℃下搅拌15min，然后升至RT，并在RT下搅拌30min。将混合物在高真空下浓缩1h。向上述粗品和1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(14.74mg，3当量，33.32μmol)在DMF中的混合物中添加DIPEA(21.53mg，29.0μL，15当量，166.6μmol)。将反应混合物在RT下搅拌30min。将混合物直接加载并用C4柱(50g柱，MeCN/水，含0.05％ TFA，0％-80％，经18CV)分离，获得(2S)-2-{(2R,3R)-3-[(2S)-1-{(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-{[(1R,3S,4S)-2-({[4-{[(37S,40S)-23-{2-[2-({1-[(6S,9S)-14-氨基-9-{[4-({[(1R,3S,4S)-3-{[(2S)-1-{[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基](甲基)氨基}-3-甲基-1-氧代丁-2-基]氨基甲酰基}-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基]氧基}甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基]氨基甲酰基}-4,7,14-三氧代-6-(丙-2-基)-3-氧杂-5,8,13-三氮杂十四烷-1-基]-1H-1,2,3-三唑-4-基}甲氧基)乙氧基]乙基}-40-(3-氨基甲酰胺基丙基)-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15,22,35,38,41-五氧代-37-(丙-2-基)-3,6,9,12,19,26,29,32-八氧杂-16,23,36,39-四氮杂四十一烷-41-基]氨基}-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基]甲氧基}羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羰基]氨基}-N,3-二甲基丁酰胺基]-3-甲氧基-5-甲基庚酰基}吡咯烷-2-基]-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基}-3-苯基丙酸(63mg，95％产率)。HRMS：MH+＝5501.1196,Rt＝2.72min(5min酸性法)。
(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸的合成
将氢氧化锂一水合物(0.26g，6.21mmol)在水(5mL)中的溶液逐滴添加到(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(2.20g，3.10mmol)在四氢呋喃(5mL)和甲醇(5mL)中的溶液中。添加完成后，将混合物在环境温度下搅拌18小时。然后用1M HCl水溶液(6.5mL)淬灭混合物，并在真空下去除挥发物。将所得残余物在乙酸乙酯(50mL)和盐水(100mL)之间分配。分离各层，并将水层用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩。在真空下干燥后，获得了(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(1.96g，2.82mmol，91％)。LCMS：MH+＝695.5；Rt＝0.73min(2min碱性法)。
(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯的合成
向(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(250mg，0.360mmol)、(S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙-1-胺盐酸盐(95mg，0.396mmol)和(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(150mg，0.396mmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(0.25mL，1.44mmol)。将所得混合物在环境温度下搅拌1小时。将混合物倒入盐水(50mL)中并用乙酸乙酯(3×25mL)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩。通过SiO2 ISCO色谱法(0％-20％甲醇/二氯甲烷)纯化后，获得了(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(317mg，99％产率)。LCMS：MH+＝881.5；Rt＝1.23min(2min碱性法)。
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(P1)的合成
向(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯(317mg，0.360mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中添加三氟乙酸(1mL)。将所得混合物在环境温度下搅拌1.5小时，然后在真空下去除挥发物。使残余物在乙酸乙酯(25mL)和用NaCl饱和的1M NaOH水溶液(50mL)之间分配。分离各层，并将水层用乙酸乙酯(2×25mL)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过RP-HPLC ISCO金色谱法(10％-100％MeCN/H2O，0.1％ TFA改性剂)纯化后，获得了(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(P1)(268mg，83％产率)。LCMS：MH+＝781.5；Rt＝1.11min(2min碱性法)。
(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯的合成
通过在标准酰胺键条件下偶联(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸和L-苯丙氨酸叔丁酯盐酸盐，可以制备(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯。
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸(P2)的合成
将(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯用25％ TFA/CH2C2处理一小时，在真空中去除挥发物并通过RP-HPLC纯化，可提供((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸。
(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯的合成
可以将(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸用25％TFA/CH2Cl2处理一小时，此时在真空中去除挥发物后，可以获得Boc脱保护的材料。随后在还原胺化条件下用多聚甲醛处理可提供(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯。
(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸的合成
遵循标准酯水解条件并使用(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯，可以制备(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸。
(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(P3)的合成
可在标准还原胺化条件下用多聚甲醛处理(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺，产生(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺。
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸叔丁酯的合成
遵循标准酰胺偶联条件，使用(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸和L-苯丙氨酸叔丁酯盐酸盐，可以制备((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸叔丁酯。
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸(P4)的合成
可以将((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸叔丁酯用25％ TFA/CH2Cl2处理一小时，此时在真空中去除挥发物，并通过RP-HPLC纯化，可以制备((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸(P4)。
(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
将(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯与(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯在DMSO中用添加的NaI或TBAI烷基化，然后通过用碱处理进行原位FMOC脱保护，在通过RP-HPLC纯化后，可以允许制备(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
遵循标准酰胺偶联方案并使用74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂七十五烷-75-酸和(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐，可以制备(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
遵循标准酯水解条件并使用(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-1,3-二甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐，可以制备(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
遵循标准酰胺键偶联条件并利用(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐和(S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙-1-胺盐酸盐，可以制备(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
通过将(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐用25％ TFA/CH2Cl2处理一小时，浓缩并通过RP-HPLC纯化，可以获得(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
可以向(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐(1当量)和(4-硝基苯基)碳酸2-叠氮基乙酯(2当量)在DMF(0.2M)中的溶液中添加DIEA(3当量)。搅拌2小时后，可以将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，可以获得(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
遵循标准酰胺键偶联条件并利用(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-2-羧基-1-甲氧基丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐和L-苯丙氨酸叔丁酯盐酸盐，可以制备(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
通过将(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐用25％ TFA/CH2Cl2处理一小时，浓缩并通过RP-HPLC纯化，可以制备(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
可以向(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐(1当量)和(4-硝基苯基)碳酸2-叠氮基乙酯(2当量)在DMF(0.2M)中的溶液中添加DIEA(3当量)。搅拌2小时后，可以将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，可以获得(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
将((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸叔丁酯与(5-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯在DMSO中用添加的NaI或TBAI烷基化，然后通过用碱处理进行原位FMOC脱保护，在通过RP-HPLC纯化后，可以提供(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,81,81-三甲基-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,80-二十五碳氧杂-2,4-二氮杂八十二烷基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
向碳酸双(4-硝基苯基)酯(1.1当量)、1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四碳氧杂七十五烷-75-酸叔丁酯(1.1当量)在DMF(0.1M)中的溶液中添加DIEA(4当量)。搅拌1小时后，可以将(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐(1当量)添加到溶液中。再搅拌2小时后，可以将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，可以获得(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,81,81-三甲基-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,80-二十五碳氧杂-2,4-二氮杂八十二烷基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,81,81-三甲基-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,80-二十五碳氧杂-2,4-二氮杂八十二烷基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
可以向(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,81,81-三甲基-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,80-二十五碳氧杂-2,4-二氮杂八十二烷基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐(1当量)在THF(0.1M)中的溶液中添加N,N,1,1,1-五甲基硅胺(5当量)。在脱气和吹扫至N2之后，可以添加四(三苯基膦)钯(0.15当量)，然后如上所述脱气/吹扫至N2(3次)。搅拌一小时后，在真空中去除挥发物并通过RP-HPLC纯化，可以获得(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,81,81-三甲基-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,80-二十五碳氧杂-2,4-二氮杂八十二烷基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,81,81-三甲基-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,80-二十五碳氧杂-2,4-二氮杂八十二烷基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
可以向(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,81,81-三甲基-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,80-二十五碳氧杂-2,4-二氮杂八十二烷基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐(1当量)和(4-硝基苯基)碳酸2-叠氮基乙酯(2当量)在DMF(0.2M)中的溶液中添加DIEA(3当量)。搅拌2小时后，可以将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，可以获得(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,81,81-三甲基-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,80-二十五碳氧杂-2,4-二氮杂八十二烷基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
将(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺与(5-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯在DMSO中用添加的NaI或TBAI烷基化，然后通过用碱处理进行原位FMOC脱保护，在通过RP-HPLC纯化后，可以提供(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,81,81-三甲基-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,80-二十五碳氧杂-2,4-二氮杂八十二烷基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
向碳酸双(4-硝基苯基)酯(1.1当量)、1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四碳氧杂七十五烷-75-酸叔丁酯(1.1当量)在DMF(0.1M)中的溶液中添加DIEA(4当量)。搅拌1小时后，可以将(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐(1当量)添加到溶液中。再搅拌2小时后，可以将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，可以获得(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,81,81-三甲基-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,80-二十五碳氧杂-2,4-二氮杂八十二烷基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,81,81-三甲基-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,80-二十五碳氧杂-2,4-二氮杂八十二烷基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
可以向(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,81,81-三甲基-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,80-二十五碳氧杂-2,4-二氮杂八十二烷基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐(1当量)在THF(0.1M)中的溶液中添加N,N,1,1,1-五甲基硅胺(5当量)。在脱气和吹扫至N2之后，可以添加四(三苯基膦)钯(0.15当量)，然后如上所述脱气/吹扫至N2(3次)。搅拌一小时后，在真空中去除挥发物并通过RP-HPLC纯化，可以获得(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,81,81-三甲基-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,80-二十五碳氧杂-2,4-二氮杂八十二烷基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,81,81-三甲基-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,80-二十五碳氧杂-2,4-二氮杂八十二烷基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐的合成
可以向(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,81,81-三甲基-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,80-二十五碳氧杂-2,4-二氮杂八十二烷基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐(1当量)和(4-硝基苯基)碳酸2-叠氮基乙酯(2当量)在DMF(0.2M)中的溶液中添加DIEA(3当量)。搅拌2小时后，可以将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，可以获得(1R,3S,4S)-2-(4-((S)-2-((S)-2-(((2-叠氮基乙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(2,81,81-三甲基-3,79-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,80-二十五碳氧杂-2,4-二氮杂八十二烷基)苄基)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲氧基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-鎓三氟乙酸盐。
(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-1-甲基哌啶-2-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯的合成
向在1:2MeOH/DMF(9mL)中的(S)-1-甲基哌啶-2-甲酸(585mg，4.09mmol)中添加HATU(1.553g，4.09mmol)和DIEA(2.28mL，13.07mmol)。搅拌15分钟后，添加(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-氨基-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯(CAS#1816949-65-1)(1587mg，3.27mmol)。搅拌10分钟后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了呈TFA盐的(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-1-甲基哌啶-2-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯(1995mg，84％)。HRMS：MH+＝611.4600,Rt＝1.71min(5min酸性法)。
(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-1-甲基哌啶-2-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸的合成
向在12mL 1:1:1MeOH/THF/H2O中的(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-1-甲基哌啶-2-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯TFA盐(1.0g，1.637mmol)中添加LiOH(784mg，32.74mmol)。搅拌1小时后，通过添加6N HCl(5.46mL，32.74mmol)将溶液中和，在真空中去除挥发物，将残余物溶解在DMSO中并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了呈TFA盐的(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-1-甲基哌啶-2-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(581mg，49.9％产率)。HRMS：M+Na+＝619.4231,Rt＝1.48min(5min酸性法)。
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-1-甲基哌啶-2-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸叔丁酯的合成
向在DMF(3mL)中的(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-1-甲基哌啶-2-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸TFA盐(692.4mg，1.16mmol)中添加HATU(485.3mg，1.276mmol)和DIEA(1.21mL，6.96mmol)。搅拌15分钟后，添加L-苯丙氨酸叔丁酯(308mg，1.392mmol)和另外的DIEA(1.21mL，6.96mmol)。搅拌1小时后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了呈TFA盐的((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-1-甲基哌啶-2-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸叔丁酯(741mg，70％)。HRMS：MH+＝800.5700,Rt＝2.18min(5min酸性法)。
(2S)-2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)-1-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸盐的合成
向((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-1-甲基哌啶-2-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸叔丁酯三氟乙酸盐(741.7，841.6μmol)、NaI(243.2mg，1683μmol)和(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(681.3mg，892.5μmol)在DMSO(10mL)中的溶液中添加DIEA(848μL，4.868mmol)。搅拌14小时后，添加二乙胺(1.68mL，16.23mmol)。搅拌30分钟后，将溶液通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(2S)-2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)-1-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸盐(536mg，46％产率)。HRMS：M+＝1304.8800,Rt＝2.04min(5min酸性法)。
(2S)-2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-1-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸盐的合成
向在DMF(2ml)中的2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂化七十四烷-74-酸(351.9mg，314.9μmol)中添加HATU(119.7mg，314.9μmol)，然后添加DIEA(274μL，1575mmol)。将混合物搅拌30min。向上述混合物中添加(2S)-2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄基)-1-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸盐(372.6mg，262.4μmol)在DMF(2ml)中的溶液。将混合物在Rt下搅拌2h。将溶液用DMSO稀释并通过ISCO金RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(2S)-2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-1-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸盐(570mg，90％产率)。HRMS：M+＝2403.4900,Rt＝2.43min(5min酸性法)。
(2S)-1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸盐的合成
将(2S)-2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁氧基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-1-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸盐(570mg，237μmol)用25％ TFA/CH2Cl2用1％ Et3SiH处理2小时，此时在真空中去除挥发物。将残余物溶解在DMSO中并通过ISCO金RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(2S)-1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸盐TFA盐(400mg，71％产率)。HRMS：M+＝2248.3701,Rt＝1.80min(5min酸性法)。
(2S,2'S)-1,1'-(((((2S,5S,39S,42S)-22-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)-4,1-亚苯基))双(亚甲基))双(2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓)三氟乙酸盐的合成
向(2S)-1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸盐(76.6mg，32.4μmol)和16-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(15.5mg，14.1μmol)在DMF(0.8mL)中的溶液中添加DIEA(24.6uL，141μmol)。16小时后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCORP-HPLC纯化。冻干后，获得了(2S,2'S)-1,1'-(((((2S,5S,39S,42S)-22-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)-4,1-亚苯基))双(亚甲基))双(2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓)三氟乙酸盐(48.6mg，64％产率)。HRMS：(M+2-H+)+＝5362.1899,Rt＝2.35min(5min酸性法)。
(2S,2'S)-1,1'-(((((2S,5S,39S,42S)-22-(3-(2-氨基乙氧基)丙酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)-4,1-亚苯基))双(亚甲基))双(2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓)三氟乙酸盐的合成
将在DMF中的(2S,2'S)-1,1'-(((((2S,5S,39S,42S)-22-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)-4,1-亚苯基))双(亚甲基))双(2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓)三氟乙酸盐(46.2mg，8.6μmol)用Et2NH(17.8uL，172.2μmol)处理1小时，此时将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(2S,2'S)-1,1'-(((((2S,5S,39S,42S)-22-(3-(2-氨基乙氧基)丙酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)-4,1-亚苯基))双(亚甲基))双(2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓)三氟乙酸盐(34.5mg，76％产率)。HRMS：(M+2-H+)+＝5140.1201,Rt＝2.06min(5min酸性法)。
实例#5：(2S,2'S)-1,1'-(((((2S,5S,39S,42S)-22-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)-4,1-亚苯基))双(亚甲基))双(2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓)三氟乙酸盐，P5-L5-P5的合成
向(2S,2'S)-1,1'-(((((2S,5S,39S,42S)-22-(3-(2-氨基乙氧基)丙酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)-4,1-亚苯基))双(亚甲基))双(2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓)三氟乙酸盐(41.3mg，8.0μmol)和1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(7.1mg，16.1μmol)在DMF中的溶液中添加DIEA(21μL，120.4μmol)。静置3小时后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(2S,2'S)-1,1'-(((((2S,5S,39S,42S)-22-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)-4,1-亚苯基))双(亚甲基))双(2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓)三氟乙酸盐(31mg，76％产率)。HRMS：(M+2-H+)+＝5467.2200,Rt＝2.25min(5min酸性法)。
(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
向(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮
甲磺酸盐(1.5g，2,822mmol)和(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.44g，2.68mmol)在NMP(10mL)中的溶液中添加DIEA(1133μL，7.07mmol)。静置8小时后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC用0.05％甲酸改性剂纯化。冻干后，获得了(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.197g，64％产率)。HRMS：MH+＝1206.5500,Rt＝2.87min(5min酸性法)。
(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的合成
将(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(2.197g，1.821mmol)用含有1％ Et3SiH的20mL 25％ TFA/CH2Cl2处理一小时，此时在真空中去除挥发物。将残余物用Et2O研磨并泵送，产生2.07克(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯。该材料直接按原样使用。HRMS：MH+＝1106.5000,Rt＝2.09min(5min酸性法)。
(6S,9S)-6-((3-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-1-氨基-26-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-9-异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28-五氧代-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29-六氮杂四十一烷-41-酸烯丙酯的合成
向(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯TFA盐(2.07g，1696μmol)和16-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18,31-三氧代-4,7,10,22,25,28,32-七氧杂-13,16,19-三氮杂三十五碳-34-烯酸(1.565g，1902μmol)在NMP(12mL)中的溶液中添加HOAT(346.3mg，2545μmol)、DIEA(1.33mL，7634μmol)和PyBOP(1.324g，2545μmol)。搅拌2小时后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(6S,9S)-6-((3-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-1-氨基-26-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-9-异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28-五氧代-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29-六氮杂四十一烷-41-酸烯丙酯(1.80g，55％产率)。HRMS：MH+＝1910.9200,Rt＝1.85min(5min酸性法)。
(6S,9S)-6-((3-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-1-氨基-26-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-9-异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28-五氧代-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29-六氮杂四十一烷-41-酸的合成
在N2气氛下，向(6S,9S)-6-((3-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-1-氨基-26-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-9-异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28-五氧代-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29-六氮杂四十一烷-41-酸烯丙酯(1.80g，942μmol)和苯基硅烷(152.9mg，1413μmol)在1:1CH2Cl2/MeOH(14mL)中的溶液中添加四(三苯基膦)钯(16.3mg，14.13μmol)。搅拌2小时后，在真空中去除挥发物，将残余物溶解在DMSO中并通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(6S,9S)-6-((3-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-1-氨基-26-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-9-异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28-五氧代-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29-六氮杂四十一烷-41-酸(1.65g，93.6％产率)。HRMS：MH+＝1870.8900,Rt＝2.63min(5min酸性法)。
(6S,9S)-1-氨基-26-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-6-((4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-3-((甲基氨基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28-五氧代-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29-六氮杂四十一烷-41-酸的合成
向(6S,9S)-6-((3-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(甲基)氨基)甲基)-4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-1-氨基-26-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-9-异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28-五氧代-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29-六氮杂四十一烷-41-酸(978mg，523μmol)在DMF(6mL)中的溶液中添加哌啶(258μL，2615μmol)。静置2小时后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了呈TFA盐的(6S,9S)-1-氨基-26-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-6-((4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-3-((甲基氨基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28-五氧代-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29-六氮杂四十一烷-41-酸(501mg，54％产率)。HRMS：MH+＝1648.8199,Rt＝1.92min(5min酸性法)。
(6S,9S)-1-氨基-26-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-6-((4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28-五氧代-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29-六氮杂四十一烷-41-酸的合成
向(6S,9S)-1-氨基-26-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-6-((4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-3-((甲基氨基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28-五氧代-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29-六氮杂四十一烷-41-酸TFA盐(501mg，284.2μmol)和2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂化七十四烷-74-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(483.2mg，398μmol)在NMP(4mL)中的溶液中添加DIEA(99μL，568.4μmol)。静置22小时后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(6S,9S)-1-氨基-26-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-6-((4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28-五氧代-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29-六氮杂四十一烷-41-酸(582mg，74％产率)。HRMS：MH+＝2747.4600,Rt＝2.32min(5min酸性法)。
(2S)-1-(4-((6S,9S,43S,46S)-1-氨基-26-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-6-((4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基甲酰基)-9,43-二异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28,41,44-七氧代-46-(3-脲基丙基)-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29,42,45-八氮杂四十七烷-47-酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸盐的合成
向(6S,9S)-1-氨基-26-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-6-((4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28-五氧代-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29-六氮杂四十一烷-41-酸(207mg，75.2μmol)在NMP(2mL)中的溶液中添加DIEA(46μL，263.6μmol)，然后添加TSTU(22.7mg，75.2μmol)。搅拌45分钟后，将该NHS酯活化的酸溶液添加到(2S)-1-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸盐(223.9mg，90.4μmol)与添加的DIEA(46μL，263.6μmol)的NMP溶液中。静置7小时后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(2S)-1-(4-((6S,9S,43S,46S)-1-氨基-26-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-6-((4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基甲酰基)-9,43-二异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28,41,44-七氧代-46-(3-脲基丙基)-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29,42,45-八氮杂四十七烷-47-酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸盐(250mg，55％产率)。HRMS：M+＝4975.8301,Rt＝2.37min(5min酸性法)。
实例#6：(2S)-1-(4-((6S,9S,43S,46S)-1-氨基-26-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酰基)-6-((4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基甲酰基)-9,43-二异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28,41,44-七氧代-46-(3-脲基丙基)-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29,42,45-八氮杂四十七烷-47-酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸盐，P5-L5-P7的合成
将(2S)-1-(4-((6S,9S,43S,46S)-1-氨基-26-(3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-6-((4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基甲酰基)-9,43-二异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28,41,44-七氧代-46-(3-脲基丙基)-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29,42,45-八氮杂四十七烷-47-酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸盐(78mg，15.3μmol)用含有1％ Et3SiH的6mL 25％TFA/CH2CL2处理一小时，此时在真空中去除挥发物，并将残余物用Et2O研磨。将所得残余物溶解在NMP(2mL)中，并用1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(10.2mg，23.0μmol)和DIEA(18.7μL，107.2μmol)处理。静置2小时后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(2S)-1-(4-((6S,9S,43S,46S)-1-氨基-26-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酰基)-6-((4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-3-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苯基)氨基甲酰基)-9,43-二异丙基-23,29-二甲基-1,8,11,24,28,41,44-七氧代-46-(3-脲基丙基)-14,17,20,32,35,38-六氧杂-2,7,10,23,26,29,42,45-八氮杂四十七烷-47-酰胺基)-2-(75-甲基-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四碳氧杂-75-氮杂七十六烷-76-基)苄基)-2-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-1-甲基哌啶-1-鎓三氟乙酸盐(25mg，28％产率)。HRMS：M+＝5202.9102,Rt＝2.37min(5min酸性法)。
((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄酯的合成
向(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(231mg，191.5μmol)在DMF(4mL)中的溶液中添加哌啶(189μL，1915μmol)。静置30分钟后，将溶液用DMSO稀释并通过C18 ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了呈甲酸盐的((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄酯(133mg，63％)。HRMS：MH+＝984.4800,Rt＝1.85min(5min酸性法)。
1-(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十九烷-79-酸的合成
向碳酸双(4-硝基苯基)酯(105.8mg，347.9μmol)和1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四碳氧杂七十五烷-75-酸(415.5mg，362.4μmol)在DMF(4mL)中的溶液中添加DIEA(227μL，1305μmol)。搅拌1.5小时后，添加((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酸4-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((甲基氨基)甲基)苄酯甲酸盐(318.4mg，290μmol)和DIEA(227μL，1305μmol)。再搅拌2小时后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了1-(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十九烷-79-酸(466mg，74％产率)。HRMS：(M+2Na+-H+)+＝2156.1499,Rt＝2.36min(5min酸性法)。
1-(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十九烷-79-酸的合成
将1-(5-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十九烷-79-酸(195mg，90.4μmol)用25％TFA/CH2Cl2(6mL)处理1小时，此时在真空中去除挥发物。将残余物溶解在DMSO(12mL)中并通过ISCO金RP-HPLC纯化。冻干后，获得了1-(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十九烷-79-酸TFA盐(190mg，96％产率)。HRMS：MH+＝2056.0801,Rt＝1.89min(5min酸性法)。
1,1'-((((2S,5S,39S,42S)-22-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(6-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-3,1-亚苯基))双(2-甲基-3-氧代-7',10',13',16',19',22',25',28',31',34',37',40',43',46',49',52',55',58',61',64',67',70',73',76'-二十四碳氧杂-2',4'-二氮杂七十九烷-79-酸)的合成
向1-(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十九烷-79-酸三氟乙酸盐(353mg，162.6μmol)和16-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(75.1mg，68.3μmol)在NMP(3mL)中的溶液中添加DIEA(56.7uL，353μmol)。4小时后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了1,1'-((((2S,5S,39S,42S)-22-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(6-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-3,1-亚苯基))双(2-甲基-3-氧代-7',10',13',16',19',22',25',28',31',34',37',40',43',46',49',52',55',58',61',64',67',70',73',76'-二十四碳氧杂-2',4'-二氮杂七十九烷-79-酸)(180mg，47％产率)。HRMS：MH+＝4979.5601,Rt＝2.56min(5min酸性法)。
(6S,9S)-1-氨基-26-((6S,9S)-1-氨基-6-((3-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)-4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23-甲基-1,8,11,24-四氧代-14,17,20-三氧杂-2,7,10,23-四氮杂二十五烷-25-基)-6-((3-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)-4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23-甲基-1,8,11,24,27-五氧代-14,17,20,30-四氧杂-2,7,10,23,26-五氮杂三十二烷-32-甲酸铵的合成
将1,1'-((((2S,5S,39S,42S)-22-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(6-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-3,1-亚苯基))双(2-甲基-3-氧代-7',10',13',16',19',22',25',28',31',34',37',40',43',46',49',52',55',58',61',64',67',70',73',76'-二十四碳氧杂-2',4'-二氮杂七十九烷-79-酸)(180mg，36.1μmol)在DMF中的溶液用哌啶(35.7uL，361μmol)处理1小时，在此时将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC进行纯化。冻干后，获得了(6S,9S)-1-氨基-26-((6S,9S)-1-氨基-6-((3-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)-4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23-甲基-1,8,11,24-四氧代-14,17,20-三氧杂-2,7,10,23-四氮杂二十五烷-25-基)-6-((3-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)-4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23-甲基-1,8,11,24,27-五氧代-14,17,20,30-四氧杂-2,7,10,23,26-五氮杂三十二烷-32-甲酸铵(75mg，41％产率)。HRMS：MH+＝4757.4902,Rt＝2.16min(5min酸性法)。
实例#7：1,1'-((((2S,5S,39S,42S)-22-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(6-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-3,1-亚苯基))双(2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十九烷-79-酸)，P7-L12-P7的合成
向(6S,9S)-1-氨基-26-((6S,9S)-1-氨基-6-((3-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)-4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23-甲基-1,8,11,24-四氧代-14,17,20-三氧杂-2,7,10,23-四氮杂二十五烷-25-基)-6-((3-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)-4-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23-甲基-1,8,11,24,27-五氧代-14,17,20,30-四氧杂-2,7,10,23,26-五氮杂三十二烷-32-甲酸铵(130mg，27.05μmol)、1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(19.2mg，43.3μmol)在DMF中的溶液中添加DIEA(23.6μL，135.3μmol)。静置3小时后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了1,1'-((((2S,5S,39S,42S)-22-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(6-(((((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-3,1-亚苯基))双(2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十九烷-79-酸)(42mg，29％产率)。HRMS：MH+＝5084.6401,Rt＝2.36min(5min酸性法)。
(2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙基)磷酸二叔丁酯的合成
向(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-甲磺酸胺(420mg，790.2μmol)和2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酸(530mg，1976μmol)在DMF(12mL)中的混合物中添加TSTU(594.6mg，1976μmol)和DIEA(1.39mL，7900mmol)。搅拌2小时后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了(2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙基)磷酸二叔丁酯(308.3mg，57％产率)。LC/MS:(M-tBu-tBu+H+)+＝574.4,Rt＝1.05min(2min酸性法)。
磷酸二氢2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙酯的合成
在0C下，将(2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙基)磷酸二叔丁酯(308.3mg，449.6μmol)用25％TFA/CH2Cl2(6mL)处理15分钟，然后在rt下处理30分钟，此时在真空中去除挥发物。将残余物溶解在DMSO中并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了磷酸二氢2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙酯(188mg，73％产率)。LC/MS:MH+＝574.4,Rt＝0.53min(2min酸性法)。
((2S)-1-(((2S)-1-((4-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)-3-((甲基氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸烯丙酯的合成
将磷酸二氢2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙酯(256mg，446.4μmol)在DMF(1.5mL)和N,N'-二环己基吗啉-4-甲脒(393mg，1339μmol)中的溶液搅拌15分钟，此时添加(5-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-(氯甲基)苄基)(甲基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(500mg，670μmol)。搅拌20小时后，添加Et2NH(924uL，8928μmol)。再搅拌30分钟后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCO RP-HPLC纯化。冻干后，获得了呈甲酸盐的((2S)-1-(((2S)-1-((4-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)-3-((甲基氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸烯丙酯(158mg，33％产率)。HRMS：MH+＝1062.4000,Rt＝1.75min(5min酸性法)。
1-(5-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十九烷-79-酸的合成
向碳酸双(4-硝基苯基)酯(71.6mg，235.2μmol)和1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四碳氧杂七十五烷-75-酸(269.7mg，235.2μmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加DIEA(205μL，1176μmol)。搅拌1小时后，添加在DMF(2mL)中的((2S)-1-(((2S)-1-((4-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)-3-((甲基氨基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸烯丙酯甲酸盐(208.2mg，196μmol)和DIEA(205μL，1176μmol)。再搅拌1小时后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了1-(5-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十九烷-79-酸(218.9mg，50％产率)。HRMS：MH+＝2234.0701,Rt＝2.34min(5min酸性法)。
1-(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十九烷-79-酸的合成
在N2气氛下，向1-(5-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十九烷-79-酸(233mg，104.3μmol)和苯基硅烷(33.9mg，312.9μmol)在1:1CH2Cl2/MeOH(2mL)中的溶液中添加四(三苯基膦)钯(1.2mg，1.04μmol)。搅拌2小时后，在真空中去除挥发物，将残余物溶解在DMSO中并通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了1-(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十九烷-79-酸(161mg，71％产率)。HRMS：MH+＝2150.0901,Rt＝1.81min(5min酸性法)。
(6S,9S)-1-氨基-26-((6S,9S)-1-氨基-6-((3-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)-4-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23-甲基-1,8,11,24-四氧代-14,17,20-三氧杂-2,7,10,23-四氮杂二十五烷-25-基)-6-((3-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)-4-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23-甲基-1,8,11,24,27-五氧代-14,17,20,30-四氧杂-2,7,10,23,26-五氮杂三十二烷-32-三氟乙酸铵的合成
向1-(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)-2-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十九烷-79-酸(159.6mg，74.2μmol)和16-(3-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)-13,19-二甲基-14,18-二氧代-4,7,10,22,25,28-六氧杂-13,16,19-三氮杂三十一烷二酸双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(34.0mg，30.9μmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加DIEA(53.9uL，309.3μmol)。4小时后，添加Et2NH(64uL，618.7μmol)，并且1小时后，将溶液用DMSO稀释并通过ISCORP-HPLC纯化。冻干后，获得了(6S,9S)-1-氨基-26-((6S,9S)-1-氨基-6-((3-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)-4-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23-甲基-1,8,11,24-四氧代-14,17,20-三氧杂-2,7,10,23-四氮杂二十五烷-25-基)-6-((3-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)-4-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23-甲基-1,8,11,24,27-五氧代-14,17,20,30-四氧杂-2,7,10,23,26-五氮杂三十二烷-32-三氟乙酸铵(108.6mg，70％产率)。HRMS：MH+＝4945.4399,Rt＝2.27min(5min酸性法)。
实例#8：1,1'-((((2S,5S,39S,42S)-22-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(6-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)-3,1-亚苯基))双(2-甲基-3-氧代-7',10',13',16',19',22',25',28',31',34',37',40',43',46',49',52',55',58',61',64',67',70',73',76'-二十四碳氧杂-2',4'-二氮杂七十九烷-79-酸)，EX#8，P8-L12-P8的合成
向(6S,9S)-1-氨基-26-((6S,9S)-1-氨基-6-((3-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)-4-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23-甲基-1,8,11,24-四氧代-14,17,20-三氧杂-2,7,10,23-四氮杂二十五烷-25-基)-6-((3-(78-羧基-2-甲基-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十四碳氧杂-2,4-二氮杂七十八烷基)-4-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-23-甲基-1,8,11,24,27-五氧代-14,17,20,30-四氧杂-2,7,10,23,26-五氮杂三十二烷-32-三氟乙酸铵(109mg，22μmol)和1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(19.4mg，43.9μmol)在DMF(0.6mL)中的溶液中添加DIEA(57.4μL，329.3μmol)。静置1小时后，将溶液用DMSO稀释并通过RP-HPLC纯化。冻干后，获得了1,1'-((((2S,5S,39S,42S)-22-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酰基)-5,39-二异丙基-19,25-二甲基-4,7,20,24,37,40-六氧代-2,42-双(3-脲基丙基)-10,13,16,28,31,34-六氧杂-3,6,19,22,25,38,41-七氮杂四十三烷二酰基)双(氮烷二基))双(6-((((2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)甲基)-3,1-亚苯基))双(2-甲基-3-氧代-7',10',13',16',19',22',25',28',31',34',37',40',43',46',49',52',55',58',61',64',67',70',73',76'-二十四碳氧杂-2',4'-二氮杂七十九烷-79-酸)(30.3mg，27％产率)。HRMS：MH+＝5272.5601,Rt＝2.70min(5min酸性法)。
使用实例#1-8的制备中描述的程序，可以制备以下化合物：P1-L1-P1、P1-L1-P2、P1-L1-P3、P1-L1-P4、P1-L1-P5、P1-L1-P6、P1-L1-P7、P1-L1-P8、P1-L2-P1、P1-L2-P2、P1-L2-P3、P1-L2-P4、P1-L2-P5、P1-L2-P6、P1-L2-P7、P1-L2-P8、P1-L3-P1、P1-L3-P2、P1-L3-P3、P1-L3-P4、P1-L3-P5、P1-L3-P6、P1-L3-P7、P1-L3-P8、P1-L4-P1、P1-L4-P2、P1-L4-P3、P1-L4-P4、P1-L4-P5、P1-L4-P6、P1-L4-P7、P1-L4-P8、P1-L5-P1、P1-L5-P2、P1-L5-P3、P1-L5-P4、P1-L5-P5、P1-L5-P6、P1-L5-P7、P1-L5-P8、P1-L6-P1、P1-L6-P2、P1-L6-P3、P1-L6-P4、P1-L6-P5、P1-L6-P6、P1-L6-P7、P1-L6-P8、P1-L7-P1、P1-L7-P2、P1-L7-P3、P1-L7-P4、P1-L7-P5、P1-L7-P6、P1-L7-P7、P1-L7-P8、P1-L8-P1、P1-L8-P2、P1-L8-P3、P1-L8-P4、P1-L8-P5、P1-L8-P6、P1-L8-P7、P1-L8-P8、P1-L9-P1、P1-L9-P2、P1-L9-P3、P1-L9-P4、P1-L9-P5、P1-L9-P6、P1-L9-P7、P1-L9-P8、P1-L10-P1、P1-L10-P2、P1-L10-P3、P1-L10-P4、P1-L10-P5、P1-L10-P6、P1-L10-P7、P1-L10-P8、P1-L11-P1、P1-L11-P2、P1-L11-P3、P1-L11-P4、P1-L11-P5、P1-L11-P6、P1-L11-P7、P1-L11-P8、P1-L12-P1、P1-L12-P2、P1-L12-P3、P1-L12-P4、P1-L12-P5、P1-L12-P6、P1-L12-P7、P1-L12-P8、P1-L13-P1、P1-L13-P2、P1-L13-P3、P1-L13-P4、P1-L13-P5、P1-L13-P6、P1-L13-P7、P1-L13-P8、P1-L14-P1、P1-L14-P2、P1-L14-P3、P1-L14-P4、P1-L14-P5、P1-L14-P6、P1-L14-P7、P1-L14-P8、P1-L15-P1、P1-L15-P2、P1-L15-P3、P1-L15-P4、P1-L15-P5、P1-L15-P6、P1-L15-P7、P1-L15-P8、P1-L16-P1、P1-L16-P2、P1-L16-P3、P1-L16-P4、P1-L16-P5、P1-L16-P6、P1-L16-P7、P1-L16-P8、P1-L17-P1、P1-L17-P2、P1-L17-P3、P1-L17-P4、P1-L17-P5、P1-L17-P6、P1-L17-P7、P1-L17-P8、P1-L18-P1、P1-L18-P2、P1-L18-P3、P1-L18-P4、P1-L18-P5、P1-L18-P6、P1-L18-P7、P1-L18-P8、P1-L19-P1、P1-L19-P2、P1-L19-P3、P1-L19-P4、P1-L19-P5、P1-L19-P6、P1-L19-P7、P1-L19-P8、P1-L20-P1、P1-L20-P2、P1-L20-P3、P1-L20-P4、P1-L20-P5、P1-L20-P6、P1-L20-P7、P1-L20-P8、P1-L21-P1、P1-L21-P2、P1-L21-P3、P1-L21-P4、P1-L21-P5、P1-L21-P6、P1-L21-P7、P1-L21-P8、P1-L22-P1、P1-L22-P2、P1-L22-P3、P1-L22-P4、P1-L22-P5、P1-L22-P6、P1-L22-P7、P1-L22-P8、P1-L23-P1、P1-L23-P2、P1-L23-P3、P1-L23-P4、P1-L23-P5、P1-L23-P6、P1-L23-P7、P1-L23-P8、P1-L24-P1、P1-L24-P2、P1-L24-P3、P1-L24-P4、P1-L24-P5、P1-L24-P6、P1-L24-P7、P1-L24-P8、P1-L25-P1、P1-L25-P2、P1-L25-P3、P1-L25-P4、P1-L25-P5、P1-L25-P6、P1-L25-P7、P1-L25-P8、P1-L26-P1、P1-L26-P2、P1-L26-P3、P1-L26-P4、P1-L26-P5、P1-L26-P6、P1-L26-P7、P1-L26-P8、P1-L27-P1、P1-L27-P2、P1-L27-P3、P1-L27-P4、P1-L27-P5、P1-L27-P6、P1-L27-P7、P1-L27-P8、P1-L28-P1、P1-L28-P2、P1-L28-P3、P1-L28-P4、P1-L28-P5、P1-L28-P6、P1-L28-P7、P1-L28-P8、P1-L29-P1、P1-L29-P2、P1-L29-P3、P1-L29-P4、P1-L29-P5、P1-L29-P6、P1-L29-P7、P1-L29-P8、P1-L30-P1、P1-L30-P2、P1-L30-P3、P1-L30-P4、P1-L30-P5、P1-L30-P6、P1-L30-P7、P1-L30-P8、P1-L31-P1、P1-L31-P2、P1-L31-P3、P1-L31-P4、P1-L31-P5、P1-L31-P6、P1-L31-P7、P1-L31-P8、P1-L32-P1、P1-L32-P2、P1-L32-P3、P1-L32-P4、P1-L32-P5、P1-L32-P6、P1-L32-P7、P1-L32-P8、P1-L33-P1、P1-L33-P2、P1-L33-P3、P1-L33-P4、P1-L33-P5、P1-L33-P6、P1-L33-P7、P1-L33-P8、P1-L34-P1、P1-L34-P2、P1-L34-P3、P1-L34-P4、P1-L34-P5、P1-L34-P6、P1-L34-P7、P1-L34-P8、P1-L35-P1、P1-L35-P2、P1-L35-P3、P1-L35-P4、P1-L35-P5、P1-L35-P6、P1-L35-P7、P1-L35-P8、P1-L36-P1、P1-L36-P2、P1-L36-P3、P1-L36-P4、P1-L36-P5、P1-L36-P6、P1-L36-P7、P1-L36-P8、P2-L1-P1、P2-L1-P2、P2-L1-P3、P2-L1-P4、P2-L1-P5、P2-L1-P6、P2-L1-P7、P2-L1-P8、P2-L2-P1、P2-L2-P2、P2-L2-P3、P2-L2-P4、P2-L2-P5、P2-L2-P6、P2-L2-P7、P2-L2-P8、P2-L3-P1、P2-L3-P2、P2-L3-P3、P2-L3-P4、P2-L3-P5、P2-L3-P6、P2-L3-P7、P2-L3-P8、P2-L4-P1、P2-L4-P2、P2-L4-P3、P2-L4-P4、P2-L4-P5、P2-L4-P6、P2-L4-P7、P2-L4-P8、P2-L5-P1、P2-L5-P2、P2-L5-P3、P2-L5-P4、P2-L5-P5、P2-L5-P6、P2-L5-P7、P2-L5-P8、P2-L6-P1、P2-L6-P2、P2-L6-P3、P2-L6-P4、P2-L6-P5、P2-L6-P6、P2-L6-P7、P2-L6-P8、P2-L7-P1、P2-L7-P2、P2-L7-P3、P2-L7-P4、P2-L7-P5、P2-L7-P6、P2-L7-P7、P2-L7-P8、P2-L8-P1、P2-L8-P2、P2-L8-P3、P2-L8-P4、P2-L8-P5、P2-L8-P6、P2-L8-P7、P2-L8-P8、P2-L9-P1、P2-L9-P2、P2-L9-P3、P2-L9-P4、P2-L9-P5、P2-L9-P6、P2-L9-P7、P2-L9-P8、P2-L10-P1、P2-L10-P2、P2-L10-P3、P2-L10-P4、P2-L10-P5、P2-L10-P6、P2-L10-P7、P2-L10-P8、P2-L11-P1、P2-L11-P2、P2-L11-P3、P2-L11-P4、P2-L11-P5、P2-L11-P6、P2-L11-P7、P2-L11-P8、P2-L12-P1、P2-L12-P2、P2-L12-P3、P2-L12-P4、P2-L12-P5、P2-L12-P6、P2-L12-P7、P2-L12-P8、P2-L13-P1、P2-L13-P2、P2-L13-P3、P2-L13-P4、P2-L13-P5、P2-L13-P6、P2-L13-P7、P2-L13-P8、P2-L14-P1、P2-L14-P2、P2-L14-P3、P2-L14-P4、P2-L14-P5、P2-L14-P6、P2-L14-P7、P2-L14-P8、P2-L15-P1、P2-L15-P2、P2-L15-P3、P2-L15-P4、P2-L15-P5、P2-L15-P6、P2-L15-P7、P2-L15-P8、P2-L16-P1、P2-L16-P2、P2-L16-P3、P2-L16-P4、P2-L16-P5、P2-L16-P6、P2-L16-P7、P2-L16-P8、P2-L17-P1、P2-L17-P2、P2-L17-P3、P2-L17-P4、P2-L17-P5、P2-L17-P6、P2-L17-P7、P2-L17-P8、P2-L18-P1、P2-L18-P2、P2-L18-P3、P2-L18-P4、P2-L18-P5、P2-L18-P6、P2-L18-P7、P2-L18-P8、P2-L19-P1、P2-L19-P2、P2-L19-P3、P2-L19-P4、P2-L19-P5、P2-L19-P6、P2-L19-P7、P2-L19-P8、P2-L20-P1、P2-L20-P2、P2-L20-P3、P2-L20-P4、P2-L20-P5、P2-L20-P6、P2-L20-P7、P2-L20-P8、P2-L21-P1、P2-L21-P2、P2-L21-P3、P2-L21-P4、P2-L21-P5、P2-L21-P6、P2-L21-P7、P2-L21-P8、P2-L22-P1、P2-L22-P2、P2-L22-P3、P2-L22-P4、P2-L22-P5、P2-L22-P6、P2-L22-P7、P2-L22-P8、P2-L23-P1、P2-L23-P2、P2-L23-P3、P2-L23-P4、P2-L23-P5、P2-L23-P6、P2-L23-P7、P2-L23-P8、P2-L24-P1、P2-L24-P2、P2-L24-P3、P2-L24-P4、P2-L24-P5、P2-L24-P6、P2-L24-P7、P2-L24-P8、P2-L25-P1、P2-L25-P2、P2-L25-P3、P2-L25-P4、P2-L25-P5、P2-L25-P6、P2-L25-P7、P2-L25-P8、P2-L26-P1、P2-L26-P2、P2-L26-P3、P2-L26-P4、P2-L26-P5、P2-L26-P6、P2-L26-P7、P2-L26-P8、P2-L27-P1、P2-L27-P2、P2-L27-P3、P2-L27-P4、P2-L27-P5、P2-L27-P6、P2-L27-P7、P2-L27-P8、P2-L28-P1、P2-L28-P2、P2-L28-P3、P2-L28-P4、P2-L28-P5、P2-L28-P6、P2-L28-P7、P2-L28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实例B.ADC的缀合和表征
体外Cysmab ADC制备
将抗体(典型地5-10mg)与rProtein A琼脂糖树脂(GE)以10mg Ab比1ml树脂的比率在PBS中一起孵育15分钟，同时在适当大小的一次性柱中混合。添加半胱氨酸HCl至终浓度为20mM，并在室温伴随搅动孵育30min，以使反应性半胱氨酸解粘连。将树脂在真空歧管上用50倍柱体积的PBS多次快速洗涤。然后将树脂重悬在含有250nM CuCl2的等体积PBS中。通过采取时间点来监测抗体链间二硫键的重新形成。在每个时间点，去除25μL树脂浆液，添加1μL 20mM MC-valcit-MMAE，并将管轻弹几次。旋转沉降树脂，去除上清液，然后用50μL抗体洗脱缓冲液(赛默飞世尔公司(Thermo))洗脱。沉淀树脂，并使用安捷伦PLRP-S 4000A5um，4.6×50mm柱(缓冲液A为水、0.1％ TFA，缓冲液B为乙腈、0.1％ TFA，柱保持在80℃，流速为1.5ml/min；梯度为0分钟-30％B，5分钟-45％B，6.5分钟-100％B，8分钟-100％B，10分钟-30％)通过反相色谱法分析上清液。
一旦确定抗体已重新形成其链间二硫键，则用10倍柱体积的PBS洗涤树脂，并将树脂重悬于等体积的PBS中，并添加12当量的在DMSO中的适当接头-有效载荷(20mM)，然后在室温下孵育2小时。然后用50倍柱体积的PBS洗涤树脂，以去除过量的接头-有效载荷。用抗体洗脱缓冲液从蛋白A树脂洗脱ADC。然后将ADC透析到PBS中。然后，使用离心浓缩器(使用Amicon Ultra-15，50KDa，再生纤维素)(密理博公司(Millipore)，UFC0905024)将该材料浓缩至4.5mg/ml，并通过0.22μm无菌PVDF过滤器，25mm(密理博公司(Millipore)，SLGV013SL)无菌过滤且在4℃下储存。进行了以下分析：用于确定单体百分比的分析型SEC，用于确定DAR的还原质谱，用于确定内毒素载量的LAL试验，并且蛋白浓度由A280利用消光系数和抗体分子量确定。所有体外材料均为>90％单体。如通过比较210和280nm处的高分子量峰值吸光度面积与单体ADC的峰值吸光度面积所确定的，聚集百分比。HRMS数据(蛋白方法)表示重链+2物种的主要质量，通过比较DAR1、DAR2和DAR3物种的峰的MS强度给出计算的DAR为约4.0。
一般方法：根据以下方法，通过液相色谱-质谱法(LC/MS)确定示例性ADC中药物与抗体的比率(DAR)。对于所有LC方法，流动相A为纯化的MS级水(霍尼韦尔公司(Honeywell)，LC015-1)，流动相B为MS级80％异丙醇(霍尼韦尔公司(Honeywell)LC323-1):20％乙腈(霍尼韦尔公司(Honeywell)，LC015-1)，LC323-1)，补充有1％甲酸(FA)(赛默科技公司(ThermoScientific)，85178)。将柱温设定在80℃。针对所有合成的ADC优化通用MS方法。用于分析的柱为安捷伦(Agilent)PLRP-S 4000A；2.1×150mm，8um(安捷伦公司(Agilent)，PL1912-3803)。使用的流速为0.3ml/min。在Acuity Bio H-Class Quaternary UPLC(沃特世公司(Waters))上使用的梯度为0-0.75分钟95％A，0.76-1.9分钟75％A，1.91-11.0分钟50％A，11.01-11.5010％A，11.51-13.50分钟95％A，13.51-18分钟95％A。MS系统为Xevo G2-XSQToF ESI质谱仪(沃特世公司(Waters))，从1.5-11分钟获取数据并且在15000-80000道尔顿之间分析质量。从解卷积光谱或UV色谱图通过对未缀合和缀合的给定物种(mAb或相关片段)的完整MS(总离子流)或UV(280nm)峰面积求和(通过每个面积乘以附接的药物数量加权)确定DAR。将求和且加权的面积和除以总面积的和，结果得到全部ADC的最终平均DAR值。
尺寸排阻色谱法(SEC)：纯化后进行(SEC)以确定ADC的质量和聚集百分比(％)。在分析柱Superdex 200Increase 5/150GL(GE医疗集团(GE Healthcare)，28990945)上，在等度条件100％ PBS(pH 7.2)(海克隆(Hyclone)SH30028.03)，流速0.45ml/min下进行分析，持续8分钟。基于280nm处的峰面积吸光度定量ADC样品的聚集级分％。计算是基于280nm处高分子量洗脱液除以相同波长处高分子量洗脱液和单体洗脱液的峰面积吸光度之和的比值乘以100％。在配备有Wyatt miniDAWN光散射和Treos折射率检测器的安捷伦(Agilent)Bio-Inert1260HPLC(加利福尼亚州圣巴巴拉市的怀雅特技术公司(Wyatt Technologies,Santa Barbara,CA))上获取数据。
体内Cysmab ADC制备
将抗体(25-200mg)与rProtein A琼脂糖树脂(Cytiva)以10mg Ab比1ml树脂的比率在PBS中一起孵育15分钟，同时在适当大小的一次性柱中混合。添加半胱氨酸HCl至终浓度为20mM，并在室温伴随搅动孵育30min，以使反应性半胱氨酸解粘连。将树脂在真空歧管上用50倍柱体积的磷酸盐缓冲盐水pH 7.2(PBS)多次快速洗涤。然后将树脂重悬在含有250nM CuCl2的等体积PBS中。通过采取时间点来监测抗体链间二硫键的重新形成。在每个时间点，去除25μL树脂浆液，添加1μL20mM MC-valcit-MMAE，并将管轻弹几次。旋转沉降树脂，去除上清液，然后用50μL抗体洗脱缓冲液(赛默飞世尔公司(Thermo))洗脱。沉淀树脂，并使用安捷伦PLRP-S 4000A 5um，4.6×50mm柱(缓冲液A为水、0.1％ TFA，缓冲液B为乙腈、0.1％ TFA，柱保持在80℃，流速为1.5ml/min；梯度为0分钟-30％B，5分钟-45％B，6.5分钟-100％B，8分钟-100％B，10分钟-30％)通过反相色谱法分析上清液。
一旦确定抗体已重新形成其链间二硫键，则用10倍柱体积的PBS洗涤树脂，并将树脂重悬于等体积的PBS中，并添加12当量的在DMSO中的适当接头-有效载荷(20mM)，然后在室温下孵育2小时。然后用50倍柱体积的PBS洗涤树脂，以去除过量的接头-有效载荷。用抗体洗脱缓冲液从蛋白A树脂洗脱ADC。如果需要，然后使用16/60或26/600S200increase pgSEC柱(GE)将ADC透析到PBS和制备型SEC中，其中PBS作为流动相。
然后，使用离心浓缩器(使用Amicon Ultra-15，50KDa，再生纤维素)(密理博公司(Millipore)，UFC0905024)将该材料浓缩至4.5mg/ml，并通过0.22μm无菌PVDF过滤器，25mm(密理博公司(Millipore)，SLGV013SL)无菌过滤且在4℃下储存。进行了以下分析：分析型SEC以确定单体百分比，质谱以确定DAR，LAL试验以确定内毒素载荷，以及蛋白浓度由A280利用消光系数和抗体分子量确定。所有体内材料均为>95％单体。聚集典型地<10％。如通过比较210和280nm处的高分子量峰值吸光度面积与单体ADC的峰值吸光度面积所确定的，聚集百分比。HRMS数据(蛋白方法)表示重链+2物种的主要质量，通过比较DAR1、DAR2和DAR3物种的峰的MS强度给出计算的DAR为约4.0。
一般方法：
根据以下方法，通过液相色谱-质谱法(LC/MS)确定示例性ADC中药物与抗体的比率(DAR)。对于所有LC方法，流动相A为纯化的MS级水(霍尼韦尔公司(Honeywell)，LC015-1)，流动相B为MS级80％异丙醇(霍尼韦尔公司(Honeywell)LC323-1):20％乙腈(霍尼韦尔公司(Honeywell)，LC015-1)，LC323-1)，补充有1％甲酸(FA)(赛默科技公司(ThermoScientific)，85178)。将柱温设定在80℃。针对所有合成的ADC优化通用MS方法。用于分析的柱为安捷伦(Agilent)PLRP-S 4000A；2.1×150mm，8um(安捷伦公司(Agilent)，PL1912-3803)。使用的流速为0.3ml/min。在Acuity Bio H-Class Quaternary UPLC(沃特世公司(Waters))上使用的梯度为0-0.75分钟95％A，0.76-1.9分钟75％A，1.91-11.0分钟50％A，11.01-11.50 10％A，11.51-13.50分钟95％A，13.51-18分钟95％A。MS系统为Xevo G2-XSQToF ESI质谱仪(沃特世公司(Waters))，从1.5-11分钟获取数据并且在15000-80000道尔顿之间分析质量。从解卷积光谱或UV色谱图通过对未缀合和缀合的给定物种(mAb或相关片段)的完整MS(总离子流)或UV(280nm)峰面积求和(通过每个面积乘以附接的药物数量加权)确定DAR。将求和且加权的面积和除以总面积的和，结果得到全部ADC的最终平均DAR值。
尺寸排阻色谱法(SEC)：纯化后进行(SEC)以确定ADC的质量和聚集百分比(％)。在分析柱Superdex 200Increase 5/150GL(GE医疗集团(GE Healthcare)，28990945)上，在等度条件100％ PBS(pH 7.2)(海克隆(Hyclone)SH30028.03)，流速0.45ml/min下进行分析，持续8分钟。基于280nm处的峰面积吸光度定量ADC样品的聚集级分％。计算是基于280nm处高分子量洗脱液除以相同波长处高分子量洗脱液和单体洗脱液的峰面积吸光度之和的比值乘以100％。在配备有Wyatt miniDAWN光散射和Treos折射率检测器的安捷伦(Agilent)Bio-Inert1260HPLC(加利福尼亚州圣巴巴拉市的怀雅特技术公司(Wyatt Technologies,Santa Barbara,CA))上获取数据。
实例C.EphA2双重ADC的体外评估
细胞系
针对九种内源性癌细胞系测试EphA2抗体药物缀合物。
OCUM-1：胃部癌/胃癌-JCRB编号：JCRB0192，在DMEM+0.5mM丙酮酸钠+10％ FBS中培养
EBC-1：肺癌-JCRB编号：JCRB0820，在DMEM+10％ FBS中培养
SKCO-1：结肠癌-ATCC编号：HTB-39，在Eagle最低必需培养基+10％ FBS中培养
针对九种内源性癌细胞系测试Her2抗体药物缀合物。
NCI-N87：胃部癌/胃癌-ATCC编号：CRL-5822，在RPMI-1640+10％FBS中培养
针对九种内源性癌细胞系测试PCAD抗体药物缀合物。
BICR-22：舌癌-ECACC编号：04072106，在DMEM+2mM谷氨酰胺+2％ FBS+0.4微克/毫升氢化可的松中培养
细胞增殖和存活的抑制
使用普洛麦格公司(Promega)的增殖测定评估抗体药物缀合物抑制细胞增殖和存活的能力。
将细胞系在组织培养箱中在5％ CO2、37℃下在对其生长最佳的培养基中培养。在用于增殖测定的接种之前，在测定前至少2天分开细胞，以确保最佳生长密度。接种当天，使用细胞计数器(Vi-Cell XR细胞活力分析仪，贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))确定细胞活力和细胞密度。将活力高于85％的细胞接种在白色透明底部的384孔TC处理板(康宁公司(Corning)目录号3765)中。将细胞以1,000个细胞/孔的密度接种于45μL的标准生长培养基中。将板在组织培养箱中于5％CO2、37℃孵育过夜。第二天，在标准生长培养基中以10倍制备游离澳瑞他汀有效载荷和靶向性ADC。将制备的处理物添加到细胞中，得到0.005-100nM的最终浓度和50μL/孔的最终体积。每个药物浓度一式四份地进行测试。将板在组织培养箱中在5％ CO2、37℃下孵育5天，之后通过添加25μL的CellTiter(普洛麦格公司(Promega)，目录号G7573)(一种裂解细胞并测量三磷酸腺苷(ATP)总含量的试剂)来评估细胞活力。将板在室温下孵育10分钟以稳定发光信号，然后使用发光读取器(EnVision多标记酶标仪，珀金埃尔默公司(PerkinElmer))读数。为了评价药物处理的效果，使用来自含有未处理细胞(100％活力)的孔的发光计数对处理样品进行归一化。应用可变斜率模型以使非线性回归曲线与GraphPad PRISM版本7.02软件中数据相拟合。从所得曲线外推IC50和Amax值。
用表1-4中总结的所测试细胞系的代表性IC50值计算抑制50％细胞生长或存活(IC50)所需的处理浓度。
代表性癌细胞系被证明对渗透性澳瑞他汀有效载荷敏感，IC50范围为0.23-1.38nM。靶向EphA2的ADC对代表性癌细胞系的细胞增殖具有细胞毒性作用，IC50范围为0.075-12.02nM。靶向Her2的ADC对代表性癌细胞系的细胞增殖具有细胞毒性作用，IC50范围为0.047-0.117nM。靶向PCAD的ADC对代表性癌细胞系的细胞增殖具有细胞毒性作用，IC50范围为0.495-0.970nM。这些研究表明，澳瑞他汀ADC能够抑制表达EphA2、Her2和PCAD的各种癌细胞系上的细胞增殖。
表1：EphA2 ADC细胞毒性
表2：Her2 ADC细胞毒性
表3：PCAD ADC细胞毒性
表4：未缀合药物细胞毒性
细胞系
针对三种乳腺癌体外模型测试了抗HER2 TOPOi双抗体药物缀合物曲妥珠单抗-实例8和曲妥珠单抗-实例7。
BT474：ATCC编号：HTB-20，在杜氏改良Eagle培养基+10％ FBS中培养
UACC-812：ATCC编号：CRL-1897，在RPMI-1640+20％ FBS+20ng/mL EGF中培养
ZR-75-30：ATCC编号：CRL-1504，在RPMI-1640+10％ FBS中培养
针对三种乳腺癌体外模型测试了抗体药物缀合物曲妥珠单抗-实例5和曲妥珠单抗-实例6。
BT474：ATCC编号：HTB-20，在杜氏改良Eagle培养基+10％ FBS中培养
EFM-19：RRID：CVCL_0253，在RPMI-1640+10％ FBS中培养
ZR-75-30：ATCC编号：CRL-1504，在RPMI-1640+10％ FBS中培养
细胞增殖和存活的抑制
使用普洛麦格公司的增殖测定评估曲妥珠单抗-实例8、曲妥珠单抗-实例7、曲妥珠单抗-实例5和曲妥珠单抗-实例6抑制细胞增殖和存活的能力。
将细胞系在组织培养箱中在5％ CO2和37℃下在对其生长最佳的培养基中培养。在用于增殖测定的接种之前，在测定前至少2天分开细胞，以确保最佳生长密度。在接种当天，使用胰蛋白酶-EDTA(0.05％)(赛默飞世尔公司目录号25300054)将贴壁细胞从组织培养瓶中提起。使用细胞计数器(Vi-Cell BLU细胞活力分析仪，贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter))确定细胞活力和细胞密度。将活力高于85％的细胞接种在白色透明底部的384孔TC处理板(康宁公司(Corning)目录号3765)中。将细胞以每孔1,000个细胞的密度接种在45μL标准生长培养基中，但ZR-75-30和UACC-812除外，它们以每孔2,000个细胞的密度接种在45μL标准生长培养基中。将板在组织培养箱中于5％ CO2和37℃孵育过夜。
在给药当天，在标准生长培养基中以10倍制备HER2靶向性ADC和HER2。将制备的靶向性ADC处理物添加到细胞中，得到3.81e-5nM至100nM的最终浓度和50uL/孔的最终体积。每个药物浓度一式四份地进行测试。同一天，通过添加25μL的CellTiter(普洛麦格公司目录号G7573)(一种裂解细胞并测量总三磷酸腺苷(ATP)含量的试剂)来评估给药时未处理细胞的细胞活力。将板在室温下孵育10分钟以在读数之前稳定发光信号。使用发光读取器(PHERAstar FSX酶标仪，BMG Labtech)测量所有板的发光信号。该信号表示未处理细胞在给药当天或第0天的细胞活力。
将板在组织培养箱中在5％ CO2和37℃下孵育5天，之后通过添加25μL的CellTiter(普洛麦格公司目录号G7573)来评估细胞活力。将板在室温下孵育10分钟以稳定发光信号。使用发光读取器(PHERAstar FSX酶标仪，BMG Labtech)读取所有测定板。为了评价药物处理的效果，使用第5天和第0天来自含有未处理细胞(100％活力)的孔的发光计数对处理样品进行归一化。应用可变斜率模型以使非线性回归曲线与GraphPad PRISM版本9.4.1软件中数据相拟合。从所得曲线外推IC50和Amax/Span值。
曲妥珠单抗-实例8(图1)、曲妥珠单抗-实例7(图1)、曲妥珠单抗-实例5(图12)和曲妥珠单抗-实例6(图3)针对代表性癌细胞系的剂量反应曲线如图所示。分别用表5、6和7中总结的所测试细胞系的代表性IC50值计算抑制50％细胞生长或存活(IC50)所需的处理浓度。
代表性乳腺癌细胞系被证明对双重ADC敏感，IC50值范围为0.01nM至5nM。这些研究表明，具有多种有效载荷形式的靶向HER2的双重ADC能够抑制表达HER2的各种乳腺癌细胞系上的细胞增殖。
表5：抗HER2 TOPOi双重ADC对乳腺模型的细胞毒性(IC50)
表6：抗HER2 AuriX双重ADC对乳腺模型的细胞毒性(IC50)
表7：抗HER2 AuriX/TOPOi双重ADC对乳腺模型的细胞毒性(IC50)

Claims (257)

1.一种具有式(A-1)的化合物，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥联间隔子；
W是支化部分；
L2'和L3'各自独立地是接头；并且
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L2'和L3'中的每一者包含可切割基团，任选地至少一个可切割基团包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团、肽基团和/或自脱落基团(例如肽基团和自脱落基团)。
3.根据权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L2'和L3'中的每一者包含肽基团和自脱落基团。
4.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L2'和L3'中的每一者包含可切割基团，任选地至少一个可切割基团包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团、糖(例如葡糖醛酰胺)基团、肽基团和/或自脱落基团(例如肽基团和自脱落基团)。
5.根据权利要求1、权利要求2或权利要求3所述的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(B-1)：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是包含1至6个氨基酸的肽基团，其中所述肽基团任选地被亲水性部分取代；
V1和V2各自独立地包含i)自脱落基团，ii)酶切割元件(例如V1和V2各自独立地是自脱落基团)或iii)自脱落基团和酶切割元件；并且
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物；
或其药学上可接受的盐。
6.根据权利要求5所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中V1和V2各自独立地是i)自脱落基团，或ii)酶切割元件(例如V1和V2各自独立地是自脱落基团)。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中W是N或CH。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中E1和E2各自是酶切割元件。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中V1和V2各自独立地是自脱落基团。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中(i)所述可切割接头包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团和/或自脱落基团；(ii)所述可切割接头包含自脱落基团；或(iii)所述可切割接头包含自脱落基团，所述自脱落基团包括-O-CH2-、-NH-CH2-、-OC(＝O)-、对氨基苄基-氨基甲酸酯、对氨基苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(烷氧基-PEG-烷基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-氨基甲酸酯或对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-铵；或(iv)V1和/或V2各自独立地包含含有对氨基苄基-磷酸酯或对氨基苄基-焦磷酸酯的基团。
11.根据权利要求10所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中(i)所述可切割接头包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团和/或自脱落基团；(ii)所述可切割接头包含自脱落基团；或(iii)所述可切割接头包含自脱落基团，所述自脱落基团包括-O-CH2-、-NH-CH2-、-OC(＝O)-、对氨基苄基-氨基甲酸酯、对氨基苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(烷氧基-PEG-烷基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-氨基甲酸酯或对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-铵。
12.根据权利要求5至11中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(C-1)：
其中：
R1是附接基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是包含1至6个氨基酸的肽基团，其中所述肽基团任选地被亲水性基团取代；
A1和A2各自独立地是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A1或A2的*表示与D1或D2的附接点；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物；
L4和L5各自独立地是间隔子部分；
R2和R3各自独立地是亲水性基团或酶切割元件(例如R2和R3各自是亲水性基团)；并且
m和n各自独立地是0或1；
或其药学上可接受的盐。
13.根据权利要求12所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中W是N或CH。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2和R3各自是亲水性基团。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(D1-1)、(D2-1)或(D3-1)：
或其药学上可接受的盐。
16.根据权利要求15所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中对于式(D1-1)，R2和R3各自独立地是亲水性基团，其中对于式(D2-1)，R2和R3各自独立地是酶切割元件；并且对于式(D3-1)，R2是亲水性基团并且R3是酶切割元件；或其药学上可接受的盐。
17.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1选自由以下组成的组：
-ONH2、-NH2、 -N3、-SH、-SR11、-SSR12、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-(CH2)2S(＝O)2(CH＝CH2)、-NHS(＝O)2(CH＝CH2)、-NR11C(＝O)CH2Br例如-NHC(＝O)CH2Br、-NR11C(＝O)CH2I例如-NHC(＝O)CH2I、-C(O)NHNH2、
其中：
每个R11独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R12是2-吡啶基或4-吡啶基；
每个R13独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl和-OH；
每个R14独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；并且
每个R15独立地选自H、C1-C6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-C4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-C4烷基。
18.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1选自由以下组成的组：
-ONH2、NHC(＝O)CH2Br和-NHC(＝O)CH2I。
19.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1选自由以下组成的组：
-ONH2、
20.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是
21.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
(1)L1包含：
或*-CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)-**，
其中每个n是1至12的整数，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(2)L1是并且n是1至12的整数或n是1或n是12，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(3)L1是并且n是1至12的整数，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(4)L1包含其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；或者
(5)L1是桥联间隔子，其包含：
*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)O(CH2)mSSC(RL1)2(CH2)mC(＝O)NRL1(CH2)mNRL1C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(RL1)2-**或*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
X1是并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；并且
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；并且
每个RL1独立地选自H和C1-C6烷基。
22.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L1包含由以下表示的部分：
其中n是1至12的整数(例如4至8，例如4或8)，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接附接点。
23.根据权利要求22所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中n是4至8的整数。
24.根据权利要求23所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中n是4或8。
25.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L1由下式表示：
其中
n是1至12的整数(例如4至8，例如4或8)；
x是0至6的整数(例如0至4，例如0至2，例如0或2)；
y是0或1；
z是0至6的整数(例如0至4，例如0至2，例如0或2)；
u是0或1；并且
其中L1的*表示与W的直接附接点，并且L1的**表示与R1的直接附接点。
26.根据权利要求25所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中n是4至8的整数。
27.根据权利要求26所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中n是4或8。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中x是0至2的整数。
29.根据权利要求28所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中x是0或2。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中z是0至2的整数。
31.根据权利要求30所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中z是0或2。
32.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L1选自由以下组成的组：
33.根据权利要求5至32中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L2和L3各自独立地是连接间隔子，所述连接间隔子包含由以下表示的部分：
其中
k是0至6的整数；
r是0或1；
o是0至12的整数；
p是0至6的整数；并且
其中L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接或间接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接或间接附接点。
34.根据权利要求5至33中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
L2和L3各自独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
以及
其中
k在每次出现时独立地是0至4的整数；
r在每次出现时独立地是0或1；
o在每次出现时独立地是0至10的整数；
p在每次出现时独立地是0至4的整数；
RL23是氢或C1-C6烷基；
RL是氢或-C(O)-RH；
RH是亲水性基团；并且
L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接附接点；
条件是当W是N时，L2和L3不是(L2c)、(L2d)、(L2f)或(L2k)。
35.根据权利要求34所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L2和L3各自独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
以及
其中
k在每次出现时独立地是1至3的整数；
o在每次出现时独立地是1至9的整数；
p在每次出现时独立地是1至3的整数；
RL23是氢或C1-C3烷基；
RL是氢或-C(O)-RH；
RH是亲水性基团；并且
L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接附接点；条件是当W是N时，L2和L3不是(L2FF)、(L2MM)、(L2NN)、(L2OO)或(L2PP)。
36.根据权利要求5至35中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L2和L3独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
其中L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，L2或L3的##表示与W的直接附接点；RL是氢或-C(O)-RH；并且
RH是并且d是20至30的整数(例如25)。
37.根据权利要求36所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中d是25。
38.根据权利要求12至37中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个肽基团独立地包含1至4、1至3或1至2个氨基酸残基。
39.根据权利要求38所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个肽基团独立地包含2个氨基酸残基。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个氨基酸残基独立地选自甘氨酸(Gly)、L-缬氨酸(Val)、L-瓜氨酸(Cit)、L-半胱氨酸(磺基-Ala)、L-赖氨酸(Lys)、L-异亮氨酸(Ile)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-甲硫氨酸(Met)、L-天冬酰胺(Asn)、L-脯氨酸(Pro)、L-丙氨酸(Ala)、L-亮氨酸(Leu)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)和β-丙氨酸(β-Ala)。
41.根据权利要求12至38和40中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中每个肽基团独立地选自Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Leu-Cit、Cit-(β-Ala)、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly和磺基-Ala-Val-Ala。
42.根据权利要求5至39中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中E1和/或E2各自独立地是选自由以下组成的组的肽基团：
其中E1-1或E1-2的^表示与式(B)中的V1或V2的直接附接点或与式(C)和(D)中的-NH-基团的直接附接点；并且E1-1或E1-2的^^分别表示与L2或L3的直接附接点(例如，其中E1和E2各自是独立地选自(E1-1)和(E1-2)的肽基团)。
43.根据权利要求42所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中E1和E2各自是独立地选自(E1-1)和(E1-2)的肽基团。
44.根据权利要求5至39中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中E1和/或E2各自独立地是由以下表示的肽基团：
其中RE是亲水性基团RH。
45.根据权利要求44所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中(E1-3)中的所述亲水性基团RH是其中e是介于20与30之间的整数(例如25)。
46.根据权利要求45所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中e是25。
47.根据权利要求42所述的化合物或药学上可接受的盐，其中E1和E2各自是
48.根据权利要求12至47中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2独立地选自键和-OC(＝O)-*，其中*表示分别与D1或D2的附接点。
49.根据权利要求12至48中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2独立地选自键、和-OC(＝O)-*，其中*表示分别与D1或D2的附接点。
50.根据权利要求48所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2各自是键。
51.根据权利要求48所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2都是-OC(＝O)-*。
52.根据权利要求48所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2中的一者是OC(＝O)-*，并且A1和A2中的另一者是键。
53.根据权利要求49所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2独立地是键或其中*表示与D1或D2的附接点。
54.根据权利要求53所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2中的一者是并且A1和A2中的另一者是键。
55.根据权利要求53所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2都是
56.根据权利要求49所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2中的一者是并且A1和A2中的另一者是OC(＝O)-*。
57.根据权利要求49所述的化合物或药学上可接受的盐，其中A1和A2都是OC(＝O)-*；
(ii)A1和A2是
(iii)A1是OC(＝O)-*并且A2是键
(iv)A1是OC(＝O)-*并且A2是
(v)A1是键并且A2是或者
(vi)A1是键并且A2是OC(＝O)-*，
其中*表示与D1或D2的附接点。
58.根据权利要求12至57中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中：
i)L4和L5各自独立地是间隔子部分，所述间隔子部分具有结构
其中：
Z是-O-、-CH2-、-CH2O-、-CH2N(RL45)C(＝O)O-、
-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NH-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)-、-C(＝O)NRL45-、-C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)NRL45-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中每个RL45独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基；并且
X是键、三唑基或-CH2-三唑基-，
其中X连接至R2或R3；或者
(ii)L4和L5独立地是间隔子部分，所述间隔子部分具有结构
其中：
Z是-CH2-、-CH2O-、-CH2N(RL45)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NH-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)-、-C(＝O)NRb-、-C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)NRL45-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中每个RL45独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基；并且
X是-CH2-三唑基-C1-C4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-C4-C6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-、-CH2-三唑基-C1-C4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-、-C4-C6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-，其中每个n独立地是1、2或3，
其中X连接至R2或R3。
59.根据权利要求58所述的化合物或药学上可接受的盐，其中Z是-O-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-或-CH2O-；X是键、三唑基或-CH2-三唑基-；并且RL45在每次出现时独立地是H或C1-C3烷基。
60.根据权利要求12至59中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中L4和L5各自独立地是选自由以下组成的组的间隔子部分：
其中L4或L5的@表示与苯基的直接附接点，并且L4或L5的@@表示与R2或R3的直接附接点。
61.根据权利要求12至60中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中由R2和R3表示的亲水性基团各自独立地包括聚乙二醇、聚亚烷基二醇、多元醇、聚肌氨酸、糖、寡糖、多肽、被1至3个 取代的C2-C6烷基、或被1至2个独立地选自-OC(＝O)NHS(O)2NHCH2CH2OCH3、-NHC(＝O)C1-C4亚烷基-P(O)(OCH2CH3)2和-COOH基团的取代基取代的C2-C6烷基。
62.根据权利要求12至60中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2或/和R3各自独立地选自由以下组成的组：
其中n是介于1与6之间的整数；
63.根据权利要求12至60中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中R2或/和R3独立地包含：
(i)具有以下部分的聚肌氨酸：
其中
f是介于3与25之间的整数；并且
R23是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
(ii)具有下式的聚乙二醇：其中
g和h独立地是介于2与30之间的整数；或者
(iii)由表示的部分。
64.根据权利要求12至60中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中由R2或R3表示的亲水性基团各自独立地包含：
(i)具有以下部分的聚肌氨酸：
其中f是介于3与25之间的整数；并且R23是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；或者
(ii)具有下式的聚乙二醇：其中g和h独立地是介于2与30之间的整数；或者
(iii)由表示的部分。
65.根据权利要求12至60中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中R2或/和R3各自独立地选自由 组成的组；其中
g和h独立地是介于20与30之间的整数(例如23或24)。
66.根据权利要求65所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2或/和R3包含：
67.根据权利要求65所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2和R3各自独立地包含具有下式的聚乙二醇： 其中g和h独立地是介于2与30之间的整数。
68.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2是相同的。
69.根据权利要求1至67中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2是不同的。
70.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2各自独立地选自细胞毒性药物、细胞生长抑制药物和免疫抑制药物。
71.根据权利要求1至69中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2各自独立地选自澳瑞他汀、喜树碱、倍癌霉素、依托泊苷、美登素、类美登素、紫杉烷、苯二氮类或含苯二氮类药物(例如，吡咯并[1,4]-苯二氮类(PBD)、吲哚并苯二氮类和噁唑烷并苯二氮类)和长春花生物碱。
72.根据权利要求1至69中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2各自独立地选自由以下组成的组：
(例如)(例如)，
其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。
73.根据权利要求72所述的化合物或药学上可接受的盐，
其中：
i)D1是并且D2是
ii)D1是并且D2是
iii)D1是并且D2是
iv)D1是并且D2是
v)D1是并且D2是
vi)D1是并且D2是
vii)D1是并且D2是
viii)D1是并且D2是
ix)D1是并且D2是
x)D1是并且D2是
xi)D1是并且D2是
xii)D1是并且D2是
xiii)D1是并且D2是
xiv)D1是并且D2是
xv)D1是并且D2是
xvi)D1是并且D2是
xvii)D1是并且D2是
xviii)D1是并且D2是
xix)D1是并且D2是
xx)D1是并且D2是
xxi)D1是并且D2是
xxii)D1是并且D2是
xxiii)D1是并且D2是
xxiv)D1是并且D2是
xxv)D1是并且D2是
xxvi)D1是并且D2是
xxvii)D1是并且D2是
xxviii)D1是并且D2是
xxix)D1是并且D2是
xxx)D1是并且D2是
xxxi)D1是并且D2是
xxxii)D1是并且D2是
xxxiii)D1是并且D2是
xxxiv)D1是并且D2是
xxxv)D1是并且D2是
xxxvi)D1是并且D2是
xxxvii)D1是并且D2是
xxxviii)D1是并且D2是
xxxix)D1是并且D2是
xl)D1是并且D2是
xli)D1是并且D2是
xlii)D1是并且D2是
xliii)D1是并且D2是
xliv)D1是并且D2是
vl)D1是并且D2是
xlvi)D1是并且D2是
xlvii)D1是并且D2是
xlviii)D1是并且D2是
il)D1是并且D2是
l)D1是并且D2是
li)D1是并且D2是
lii)D1是并且D2是
liii)D1是并且D2是
liv)D1是并且D2是
lv)D1是并且D2是
lvi)D1是并且D2是
lvii)D1是并且D2是
lviii)D1是并且D2是
lix)D1是并且D2是
lx)D1是并且D2是
lxi)D1是并且D2是
lxii)D1是并且D2是
lxiii)D1是并且D2是
lxiv)D1是并且D2是
其中*表示与分子的其余部分的连接点。
74.根据权利要求1至69中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中：
i)A1-D1是并且A2-D2是
ii)A1-D1是并且A2-D2是
iii)A1-D1是并且A2-D2是
iv)A1-D1是并且A2-D2是
v)A1-D1是并且A2-D2是
vi)A1-D1是并且A2-D2是
vii)A1-D1是并且A2-D2是
viii)A1-D1是并且A2-D2是
ix)A1-D1是并且A2-D2是
x)A1-D1是并且A2-D2是
xi)A1-D1是并且A2-D2是
xii)A1-D1是并且A2-D2是
xiii)A1-D1是并且A2-D2是
xiv)A1-D1是并且A2-D2是
xv)A1-D1是并且A2-D2是
xvi)A1-D1是并且A2-D2是
xvii)A1-D1是并且A2-D2是
xviii)A1-D1是并且A2-D2是
xix)A1-D1是并且A2-D2是
xx)A1-D1是并且A2-D2是
xxi)A1-D1是并且A2-D2是
xxii)A1-D1是并且A2-D2是
xxiii)A1-D1是并且A2-D2是
xxiv)A1-D1是并且A2-D2是
xxv)A1-D1是并且A2-D2是
xxvi)A1-D1是并且A2-D2是
xxvii)A1-D1是并且A2-D2是
xxviii)A1-D1是并且A2-D2是
xxix)A1-D1是并且A2-D2是
xxx)A1-D1是并且A2-D2是
xxxi)A1-D1是并且A2-D2是
xxxii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxiii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxiv)A1-D1是并且A2-D2是
xxxv)A1-D1是并且A2-D2是
xxxvi)A1-D1是并且A2-D2是
xxxvii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxviii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxix)A1-D1是并且A2-D2是
xl)A1-D1是并且A2-D2是
xli)A1-D1是并且A2-D2是
xlii)A1-D1是并且A2-D2是
xliii)A1-D1是并且A2-D2是
xliv)A1-D1是并且A2-D2是
xlv)A1-D1是并且A2-D2是
xlvi)A1-D1是并且A2-D2是
xlvii)A1-D1是并且A2-D2是
xlviii)A1-D1是并且A2-D2是
xlix)A1-D1是并且A2-D2是
l)A1-D1是并且A2-D2是
li)A1-D1是并且A2-D2是
lii)A1-D1是并且A2-D2是
liii)A1-D1是并且A2-D2是
liv)A1-D1是并且A2-D2是lv)A1-D1是并且A2-D2是lvi)A1-D1是并且A2-D2是
lvii)A1-D1是并且A2-D2是lviii)A1-D1是并且A2-D2是
lix)A1-D1是并且A2-D2是
lx)A1-D1是并且A2-D2是
lxi)A1-D1是并且A2-D2是
lxii)A1-D1是并且A2-D2是
lxiii)A1-D1是并且A2-D2是或者
lxiv)A1-D1是并且A2-D2是
其中*表示与分子的其余部分的连接点。
75.根据权利要求1至69中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和/或D2是澳瑞他汀。
76.根据权利要求75所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2都是澳瑞他汀。
77.根据权利要求1至69中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和/或D2是拓扑异构酶1抑制剂。
78.根据权利要求77所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2都是拓扑异构酶1抑制剂。
79.根据权利要求1至69中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2是澳瑞他汀，并且D1和D2中的另一者是拓扑异构酶1抑制剂。
80.根据权利要求79所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1是澳瑞他汀并且D2是拓扑异构酶1抑制剂。
81.根据权利要求79所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1是拓扑异构酶1抑制剂并且D2是澳瑞他汀。
82.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。
83.根据权利要求82所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
84.根据权利要求1至69或72中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中
D1和D2独立地选自由以下组成的组：
(例如)和(例如)，
其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。
85.根据权利要求72所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。
86.根据权利要求1至69中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2各自独立地选自抗微管蛋白剂、微管蛋白抑制剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂和/或长春花生物碱。
87.根据权利要求1至69中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2各自独立地选自Eg5抑制剂、V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、核输出蛋白CRM1抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DHFR抑制剂或促凋亡剂，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物。
88.根据权利要求1至69中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2各自独立地选自拓扑异构酶1抑制剂或其对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘代衍生物和/或与药学上可接受的酸或碱的加成盐。
89.根据权利要求88所述的化合物或药学上可接受的盐，其中所述拓扑异构酶1抑制剂是拓扑替康、依喜替康、德鲁替康或SN-38。
90.根据权利要求88所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
其中*表示与分子的其余部分的附接点。
91.根据权利要求1至69中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐，其中D1和D2各自独立地选自抗有丝分裂药物或其对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘代衍生物和/或与药学上可接受的酸或碱的加成盐。
92.根据权利要求91所述的化合物或药学上可接受的盐，其中所述抗有丝分裂药物是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或紫杉烷。
93.根据权利要求92所述的化合物或药学上可接受的盐，其中所述紫杉烷选自多西他赛、紫杉醇或卡巴他赛。
94.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的组：
以及
95.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐。
96.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的组：
，
或其药学上可接受的盐。
97.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐。
98.根据权利要求97所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的组：
或其药学上可接受的盐。
99.根据权利要求1至87中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自：
，
或其药学上可接受的盐。
100.根据权利要求1至87中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自：
或其药学上可接受的盐。
101.根据权利要求1至87中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自：
或其药学上可接受的盐。
102.根据权利要求1至87中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自：
或其药学上可接受的盐。
103.一种缀合物，其包含通过双接头共价连接至两种药学活性药物的抗体或其抗原结合片段，并且其中所述双接头具有连接至所述抗体的一个附接点和连接至所述两种药学活性药物的两个附接点，条件是两种药学活性药物都不是BH3模拟物。
104.根据权利要求103所述的缀合物，其中所述两种药学活性药物是相同或不同的。
105.根据权利要求103或权利要求104所述的缀合物，其中所述药学活性药物选自细胞毒性药物、细胞生长抑制药物和免疫抑制药物。
106.根据权利要求103至105中任一项所述的缀合物，其中所述药学活性药物选自澳瑞他汀、喜树碱、倍癌霉素、依托泊苷、美登素、类美登素、紫杉烷、苯二氮类或含苯二氮类药物(例如，吡咯并[1,4]-苯二氮类(PBD)、吲哚并苯二氮类和噁唑烷并苯二氮类)和长春花生物碱。
107.根据权利要求106所述的缀合物，其中所述药学活性药物是澳瑞他汀。
108.根据权利要求103或权利要求104所述的缀合物，其中所述药学活性药物选自抗微管蛋白剂、微管蛋白抑制剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂和/或长春花生物碱。
109.根据权利要求103或权利要求104所述的缀合物，其中所述药学活性药物选自Eg5抑制剂、V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、核输出蛋白CRM1抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DHFR抑制剂或促凋亡剂。
110.根据权利要求103或权利要求104所述的缀合物，其中所述药学活性药物选自拓扑异构酶1抑制剂或其对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘代衍生物和/或与药学上可接受的酸或碱的加成盐。
111.根据权利要求110所述的缀合物，其中所述药学活性药物是其中所述拓扑异构酶1抑制剂选自拓扑替康、依喜替康、德鲁替康和SN-38。
112.根据权利要求103或权利要求104所述的缀合物，其中所述药学活性药物选自抗有丝分裂药物或其对映异构体、非对映异构体、阻转异构体、氘代衍生物和/或与药学上可接受的酸或碱的加成盐。
113.根据权利要求112所述的缀合物，其中所述抗有丝分裂药物是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或紫杉烷。
114.根据权利要求113所述的缀合物，其中所述紫杉烷选自多西他赛、紫杉醇或卡巴他赛。
115.根据权利要求103所述的缀合物，其中所述缀合物包含根据权利要求1至102中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
116.一种具有式(A-2)的缀合物：
其中：
Ab是抗体或其片段；
R100是偶联基团；
L1是桥联间隔子；
W是支化部分；
L2'和L3'各自独立地是接头；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，条件是D1和D2都不是BH3模拟物；并且
a是1至16的整数。
117.根据权利要求116所述的缀合物，其中L2'和L3'中的每一者包含可切割基团，任选地至少一个可切割基团包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团和/或自脱落基团(例如肽基团和自脱落基团)。
118.根据权利要求117所述的缀合物，其中L2'和L3'中的每一者包含肽基团和自脱落基团。
119.根据权利要求116所述的缀合物，其中L2'和L3'中的每一者包含可切割基团，任选地至少一个可切割基团包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团、糖(例如葡糖醛酰胺)基团、肽基团和/或自脱落基团(例如肽基团和自脱落基团)。
120.根据权利要求116至118中任一项所述的缀合物，其具有式(B-2)：
其中：
Ab是抗体或其片段；
R100是偶联基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是酶切割元件或亲水性部分(例如E1和E2各自是酶切割元件)；
V1和V2独立地包含i)自脱落基团，ii)酶切割元件(例如V1和V2各自独立地是自脱落基团)或iii)自脱落基团和酶切割元件；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，条件是D1和D2都不是BH3模拟物；并且
a是1至16的整数。
121.根据权利要求120所述的缀合物，其中V1和V2各自独立地是i)自脱落基团，或ii)酶切割元件(例如V1和V2各自独立地是自脱落基团)。
122.根据权利要求120或权利要求121所述的缀合物，其中W是N或CH。
123.根据权利要求120至122中任一项所述的缀合物，其中E1和E2各自是酶切割元件。
124.根据权利要求120至123中任一项所述的缀合物，其中V1和V2各自独立地是自脱落基团。
125.根据权利要求116至124中任一项所述的缀合物，其中a是1至6或1至4的整数，或者a是1或2。
126.根据权利要求116至125中任一项所述的缀合物，其中a通过液相色谱-质谱法(LC-MS)确定。
127.根据权利要求116至126中任一项所述的缀合物，其中(i)所述可切割接头包含磷酸酯基团、焦磷酸酯基团和/或自脱落基团；(ii)所述可切割接头包含自脱落基团；或(iii)所述可切割接头包含自脱落基团，所述自脱落基团包括-CH2-O-、-NH-CH2-、-C(＝O)-、对氨基苄基-氨基甲酸酯、对氨基苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-铵、对氨基-(磺基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(烷氧基-PEG-烷基)苄基-氨基甲酸酯、对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-氨基甲酸酯或对氨基-(聚羟基羧基四氢吡喃基)烷基-苄基-铵。
128.根据权利要求127所述的缀合物，其中W是N或CH。
129.根据权利要求127或权利要求128所述的缀合物，其中R2和R3各自是亲水性基团。
130.根据权利要求116至129中任一项所述的缀合物，其具有式(C-2)：
其中：
Ab是抗体或其抗原结合片段；
R100是偶联基团；
L1是桥联间隔子；
W是N或CRw，其中Rw是H或C1-C6烷基(例如Rw是H)；
L2和L3各自独立地是连接间隔子；
E1和E2各自独立地是包含1至6个氨基酸的肽基团，其中所述肽基团任选地被亲水性基团取代；
A1和A2各自独立地是键、-OC(＝O)-*、 -OC(＝O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)C(＝O)-*或-OC(＝O)N(CH3)C(Ra)2C(Ra)2N(CH3)C(＝O)-*，
其中每个Ra独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基，并且A1或A2的*表示与D1或D2的附接点；
D1和D2各自独立地是药学活性药物，条件是D1和D2都不是BH3模拟物；
L4和L5各自独立地是间隔子部分；
R2和R3各自独立地是亲水性基团或酶切割元件(例如R2和R3各自是亲水性基团)；并且
m和n各自独立地是0或1。
131.根据权利要求130所述的缀合物，其具有式(D1-2)、(D2-2)或(D3-2)：
132.根据权利要求131所述的缀合物，其中对于式(D1-2)，R2和R3各自独立地是亲水性基团，其中对于式(D2-2)，R2和R3各自独立地是酶切割元件；并且对于式(D3-2)，R2是亲水性基团并且R3是酶切割元件。
133.根据权利要求116至131中任一项所述的缀合物，其中R100选自由以下组成的组：
酰胺；
以及
二硫键，
其中：
R16是H、C1-C4烷基、苯基、嘧啶或吡啶；
R18是H、C1-C6烷基、苯基或被1至3个-OH基团取代的C1-C4烷基；
每个R15独立地选自H、C1-C6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-C4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-C4烷基；
R17独立地选自H、苯基和吡啶；
q是0、1、2或3；
R19是H或甲基；并且
R20是H、-CH3或苯基。
134.根据权利要求116至133中任一项所述的缀合物，其中R100选自由 组成的组，其中R100的***表示与Ab的附接点。
135.根据权利要求134所述的缀合物，其中R100是其中R100的***表示与Ab的附接点。
136.根据权利要求116至135中任一项所述的缀合物，其中：
(1)L1包含：
或*-CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)-**，
其中每个n是1至12的整数，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(2)L1是并且n是1至12的整数或n是1或n是12，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(3)L1是并且n是1至12的整数，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
(4)L1包含其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；或者
(5)L1是桥联间隔子，其包含：
*-C(＝O)(CH2)mO(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)NH((CH2)mO)t(CH2)n-**；*-C(＝O)O(CH2)mSSC(RL1)2(CH2)mC(＝O)NRL1(CH2)mNRL1C(＝O)(CH2)m-**；*-C(＝O)O(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mNH(CH2)nC(＝O)-**；*-C(＝O)(CH2)mX1(CH2)m-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)n-**；*-C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nNHC(＝O)(CH2)nX1(CH2)n-**；*-C(＝O)((CH2)mO)t(CH2)nC(＝O)NH(CH2)m-**；*-C(＝O)(CH2)mC(RL1)2-**或*-C(＝O)(CH2)mC(＝O)NH(CH2)m-**，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接(例如直接)附接点；
X1是并且
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；并且
每个t独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；并且
每个RL1独立地选自H和C1-C6烷基。
137.根据权利要求116至136中任一项所述的缀合物，其中L1包含由以下表示的部分：
其中n是1至12的整数(例如4至8，例如4或8)，其中L1的*表示与W的直接或间接(例如直接)附接点，并且L1的**表示与R1的直接或间接附接点。
138.根据权利要求137所述的缀合物，其中n是4至8的整数。
139.根据权利要求138所述的缀合物，其中n是4或8。
140.根据权利要求116至110中任一项所述的缀合物，其中L1由下式表示：
其中
n是1至12的整数(例如4至8，例如4或8)；
x是0至6的整数(例如0至4，例如0至2，例如0或2)；
y是0或1；
z是0至6的整数(例如0至4，例如0至2，例如0或2)；
u是0或1；并且
其中L1的*表示与W的直接附接点，并且L1的**表示与R1的直接附接点。
141.根据权利要求140所述的缀合物，其中n是4至8的整数。
142.根据权利要求141所述的缀合物，其中n是4或8。
143.根据权利要求140至142中任一项所述的缀合物，其中x是0至2的整数。
144.根据权利要求143所述的缀合物，其中x是0或2。
145.根据权利要求140至144中任一项所述的缀合物，其中z是0至2的整数。
146.根据权利要求145所述的缀合物，其中z是0或2。
147.根据权利要求116至146中任一项所述的缀合物，其中L1选自由以下组成的组：
148.根据权利要求120至147中任一项所述的缀合物，其中L2和L3各自独立地是连接间隔子，所述连接间隔子包含由以下表示的部分：
其中
k是0至6的整数；
r是0或1；
o是0至12的整数；
p是0至6的整数；并且
其中L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接或间接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接或间接附接点。
149.根据权利要求120至147中任一项所述的缀合物，其中L2和L3各自独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
以及
其中
k在每次出现时独立地是0至4的整数；
r在每次出现时独立地是0或1；
o在每次出现时独立地是0至10的整数；
p在每次出现时独立地是0至4的整数；
RL23是氢或C1-C6烷基；
RL是氢或-C(O)-RH；
RH是亲水性基团；并且
L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接附接点；
条件是当W是N时，L2和L3不是(L2c)、(L2d)、(L2f)或(L2k)。
150.根据权利要求149所述的缀合物，其中L2和L3各自独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
以及
其中
k在每次出现时独立地是1至3的整数；
o在每次出现时独立地是1至9的整数；
p在每次出现时独立地是1至3的整数；
RL23是氢或C1-C3烷基；
RL是氢或-C(O)-RH；
RH是亲水性基团；并且
L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，并且L2或L3的##表示与W的直接附接点；条件是当W是N时，L2和L3不是(L2FF)、(L2MM)、(L2NN)、(L2OO)或(L2PP)。
151.根据权利要求120至150中任一项所述的缀合物，其中L2和L3独立地是选自由以下组成的组的连接间隔子：
其中L2或L3的#分别表示与E1或E2的直接附接点，L2或L3的##表示与W的直接附接点；RL是氢或-C(O)-RH；并且
RH是并且d是20至30的整数(例如25)。
152.根据权利要求151所述的缀合物，其中d是25。
153.根据权利要求130至152中任一项所述的缀合物，其中每个肽基团独立地包含1至4、1至3或1至2个氨基酸残基。
154.根据权利要求153所述的缀合物，其中每个肽基团独立地包含2个氨基酸残基。
155.根据权利要求153或权利要求154所述的缀合物，其中每个氨基酸残基独立地选自甘氨酸(Gly)、L-缬氨酸(Val)、L-瓜氨酸(Cit)、L-半胱氨酸(磺基-Ala)、L-赖氨酸(Lys)、L-异亮氨酸(Ile)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-甲硫氨酸(Met)、L-天冬酰胺(Asn)、L-脯氨酸(Pro)、L-丙氨酸(Ala)、L-亮氨酸(Leu)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)和β-丙氨酸(β-Ala)。
156.根据权利要求130至153中任一项所述的缀合物，其中每个肽基团独立地选自Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Leu-Cit、Cit-(β-Ala)、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly和磺基-Ala-Val-Ala。
157.根据权利要求120至153中任一项所述的缀合物，其中E1和/或E2各自独立地是选自由以下组成的组的肽基团：
其中E1-1或E1-2的^表示与式(B)中的V1或V2的直接附接点或与式(C)和(D)中的-NH-基团的直接附接点；并且E1-1或E1-2的^^分别表示与L2或L3的直接附接点(例如，其中E1和E2各自是独立地选自(E1-1)和(E1-2)的肽基团)。
158.根据权利要求157所述的缀合物，其中E1和E2各自是独立地选自(E1-1)和(E1-2)的肽基团。
159.根据权利要求120至153中任一项所述的缀合物，其中E1和/或E2各自独立地是由以下表示的肽基团：
其中RE是亲水性基团RH。
160.根据权利要求159所述的缀合物，其中(E1-3)中的所述亲水性基团RH是其中e是介于20与30之间的整数(例如25)。
161.根据权利要求160所述的缀合物，其中e是25。
162.根据权利要求157所述的缀合物，其中E1和E2各自是
163.根据权利要求130至162中任一项所述的缀合物，其中A1和A2独立地选自键和-OC(＝O)-*，其中*表示分别与D1或D2的附接点。
164.根据权利要求130至162中任一项所述的缀合物，其中A1和A2独立地选自键、和-OC(＝O)-*，其中*表示分别与D1或D2的附接点。
165.根据权利要求163所述的缀合物，其中A1和A2是键。
166.根据权利要求163所述的缀合物，其中A1和A2都是-OC(＝O)-*。
167.根据权利要求163所述的缀合物，其中A1和A2中的一者是OC(＝O)-*，并且A1和A2中的另一者是键。
168.根据权利要求164所述的缀合物，其中A1和A2独立地是键或其中*表示分别与D1或D2的附接点。
169.根据权利要求164所述的缀合物，其中A1和A2中的一者是并且A1和A2中的另一者是键。
170.根据权利要求164所述的缀合物，其中A1和A2都是
171.根据权利要求164所述的缀合物，其中A1和A2中的一者是并且A1和A2中的另一者是OC(＝O)-*。
172.根据权利要求164所述的缀合物，其中：
i)A1和A2是-OC(＝O)-*；
(ii)A1和A2是
(iii)A1是OC(＝O)-*并且A2是键
(iv)A1是OC(＝O)-*并且A2是
(v)A1是键并且A2是或者
(vi)A1是键并且A2是OC(＝O)-*，
其中*表示与D1或D2的附接点。
173.根据权利要求130至167中任一项所述的缀合物，其中：
i)L4和L5各自独立地是间隔子部分，所述间隔子部分具有结构
其中：
Z是-O-、-CH2-、-CH2O-、-CH2N(RL45)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NH-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)-、-C(＝O)NRL45-、-C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)NRL45-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中每个RL45独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基；并且
X是键、三唑基或-CH2-三唑基-，
其中X连接至R2或R3；或者
(ii)L4和L5独立地是间隔子部分，所述间隔子部分具有结构
其中：
Z是-CH2-、-CH2O-、-CH2N(RL45)C(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)C(RL45)2NH-、-NHC(＝O)C(RL45)2NHC(＝O)-、-C(＝O)NRb-、-C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-、-CH2NRL45C(＝O)NRL45-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)O-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-NH-，其中每个RL45独立地选自H、C1-C6烷基和C3-C8环烷基；并且
X是-CH2-三唑基-C1-C4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-C4-C6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-、-(CH2CH2O)n-C(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-、-CH2-三唑基-C1-C4亚烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-、-C4-C6亚环烷基-OC(O)NHS(O)2NH-(CH2CH2O)n-，其中每个n独立地是1、2或3，
其中X连接至R2或R3。
174.根据权利要求173所述的缀合物，其中Z是-O-、-CH2NRL45C(＝O)-、-CH2NRL45C(＝O)NH-或-CH2O-；X是键、三唑基或-CH2-三唑基-；并且RL45在每次出现时独立地是H或C1-C3烷基。
175.根据权利要求130至174中任一项所述的缀合物，其中L4和L5各自独立地是选自由以下组成的组的间隔子部分：
其中L4或L5的@表示与苯基的直接附接点，并且L4或L5的@@表示与R2或R3的直接附接点。
176.根据权利要求130至175中任一项所述的缀合物，其中由R2和R3表示的亲水性基团各自独立地包括聚乙二醇、聚亚烷基二醇、多元醇、聚肌氨酸、糖、寡糖、多肽、被1至3个取代的C2-C6烷基、或被1至2个独立地选自-OC(＝O)NHS(O)2NHCH2CH2OCH3、-NHC(＝O)C1-C4亚烷基-P(O)(OCH2CH3)2和-COOH基团的取代基取代的C2-C6烷基。
177.根据权利要求130至175中任一项所述的缀合物，其中R2或/和R3各自独立地选自由以下组成的组：
其中n是介于1与6之间的整数；
178.根据权利要求130至175中任一项所述的缀合物，其中R2或/和R3各自独立地包含：
(i)具有以下部分的聚肌氨酸：
其中
f是介于3与25之间的整数；并且
R23是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；
(ii)具有下式的聚乙二醇：其中g和h独立地是介于2与30之间的整数；或者
(iii)由表示的部分。
179.根据权利要求130至175中任一项所述的缀合物，其中由R2或R3表示的亲水性基团各自独立地包含：
(i)具有以下部分的聚肌氨酸：
其中f是介于3与25之间的整数；并且R23是H、-CH3或-CH2CH2C(＝O)OH；或者
(ii)具有下式的聚乙二醇：其中g和h独立地是介于2与30之间的整数；
或者
(iii)由表示的部分。
180.根据权利要求130至175中任一项所述的缀合物，其中R2和R3各自独立地选自由 组成的组；其中
g和h独立地是介于20与30之间的整数(例如23或24)。
181.根据权利要求180所述的其缀合物，其中R2或/和R3包含：
182.根据权利要求151所述的缀合物，其中R2和R3各自独立地包含具有下式的聚乙二醇：其中g和h独立地是介于2与30之间的整数。
183.根据权利要求103至182中任一项所述的缀合物，其中D1和D2是相同的。
184.根据权利要求103至182中任一项所述的缀合物，其中D1和D2是不同的。
185.根据权利要求103至184中任一项所述的缀合物，其中D1和D2各自独立地选自细胞毒性药物、细胞生长抑制药物和免疫抑制药物。
186.根据权利要求103至184中任一项所述的缀合物，其中D1和D2各自独立地选自澳瑞他汀、喜树碱、倍癌霉素、依托泊苷、美登素、类美登素、紫杉烷、苯二氮类或含苯二氮类药物(例如，吡咯并[1,4]-苯二氮类(PBD)、吲哚并苯二氮类和噁唑烷并苯二氮类)和长春花生物碱。
187.根据权利要求186所述的缀合物，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
(例如)(例如)，其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。
188.根据权利要求187所述的缀合物，其中：
i)D1是并且D2是
ii)D1是并且D2是
iii)D1是并且D2是
iv)D1是并且D2是
v)D1是并且D2是
vi)D1是并且D2是
vii)D1是并且D2是
viii)D1是并且D2是
ix)D1是并且D2是
x)D1是并且D2是
xi)D1是并且D2是
xii)D1是并且D2是
xiii)D1是并且D2是
xiv)D1是并且D2是
xv)D1是并且D2是
xvi)D1是并且D2是
xvii)D1是并且D2是
xviii)D1是并且D2是
xix)D1是并且D2是
xx)D1是并且D2是
xxi)D1是并且D2是
xxii)D1是并且D2是
xxiii)D1是并且D2是
xxiv)D1是并且D2是
xxv)D1是并且D2是
xxvi)D1是并且D2是
xxvii)D1是并且D2是
xxviii)D1是并且D2是
xxix)D1是并且D2是
xxx)D1是并且D2是
xxxi)D1是并且D2是
xxxii)D1是并且D2是
xxxiii)D1是并且D2是
xxxiv)D1是并且D2是
xxxv)D1是并且D2是
xxxvi)D1是并且D2是
xxxvii)D1是并且D2是
xxxviii)D1是并且D2是；
xxxix)D1是并且D2是
xl)D1是并且D2是
xli)D1是并且D2是
xlii)D1是并且D2是
xliii)D1是并且D2是
xliv)D1是并且D2是
vl)D1是并且D2是
xlvi)D1是并且D2是
xlvii)D1是并且D2是
xlviii)D1是并且D2是
il)D1是并且D2是
l)D1是并且D2是
li)D1是并且D2是
lii)D1是并且D2是
liii)D1是并且D2是
liv)D1是并且D2是
lv)D1是并且D2是
lvi)D1是并且D2是
lvii)D1是并且D2是
lviii)D1是并且D2是
lix)D1是并且D2是
lx)D1是并且D2是
lxi)D1是并且D2是
lxii)D1是并且D2是
lxiii)D1是并且D2是或者
lxiv)D1是并且D2是
其中*表示与分子的其余部分的连接点。
189.根据权利要求103至188中任一项所述的缀合物，其中：
i)A1-D1是并且A2-D2是
ii)A1-D1是并且A2-D2是
iii)A1-D1是并且A2-D2是
iv)A1-D1是并且A2-D2是
v)A1-D1是并且A2-D2是
vi)A1-D1是并且A2-D2是
vii)A1-D1是并且A2-D2是
viii)A1-D1是并且A2-D2是ix)A1-D1是并且A2-D2是
x)A1-D1是并且A2-D2是
xi)A1-D1是并且A2-D2是
xii)A1-D1是并且A2-D2是
xiii)A1-D1是并且A2-D2是
xiv)A1-D1是并且A2-D2是
xv)A1-D1是并且A2-D2是
xvi)A1-D1是并且A2-D2是
xvii)A1-D1是并且A2-D2是
xviii)A1-D1是并且A2-D2是
xix)A1-D1是并且A2-D2是
xx)A1-D1是并且A2-D2是
xxi)A1-D1是并且A2-D2是
xxii)A1-D1是并且A2-D2是
xxiii)A1-D1是并且A2-D2是
xxiv)A1-D1是并且A2-D2是
xxv)A1-D1是并且A2-D2是
xxvi)A1-D1是并且A2-D2是
xxvii)A1-D1是并且A2-D2是
xxviii)A1-D1是并且A2-D2是
xxix)A1-D1是并且A2-D2是
xxx)A1-D1是并且A2-D2是
xxxi)A1-D1是并且A2-D2是
xxxii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxiii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxiv)A1-D1是并且A2-D2是
xxxv)A1-D1是并且A2-D2是
xxxvi)A1-D1是并且A2-D2是
xxxvii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxviii)A1-D1是并且A2-D2是
xxxix)A1-D1是并且A2-D2是
xl)A1-D1是并且A2-D2是
xli)A1-D1是并且A2-D2是
xlii)A1-D1是并且A2-D2是
xliii)A1-D1是并且A2-D2是
xliv)A1-D1是并且A2-D2是
xlv)A1-D1是并且A2-D2是
xlvi)A1-D1是并且A2-D2是
xlvii)A1-D1是并且A2-D2是
xlviii)A1-D1是并且A2-D2是
xlix)A1-D1是并且A2-D2是
l)A1-D1是并且A2-D2是
li)A1-D1是并且A2-D2是
lii)A1-D1是并且A2-D2是
liii)A1-D1是并且A2-D2是
liv)A1-D1是并且A2-D2是
lv)A1-D1是并且A2-D2是
lvi)A1-D1是并且A2-D2是
lvii)A1-D1是并且A2-D2是
lviii)A1-D1是并且A2-D2是
lix)A1-D1是并且A2-D2是
lx)A1-D1是并且A2-D2是
lxi)A1-D1是并且A2-D2是
lxii)A1-D1是并且A2-D2是
lxiii)A1-D1是并且A2-D2是或者
lxiv)A1-D1是并且A2-D2是
其中*表示与分子的其余部分的连接点。
190.根据权利要求103至184中任一项所述的缀合物，其中D1和/或D2是澳瑞他汀。
191.根据权利要求190所述的缀合物，其中D1和D2都是澳瑞他汀。
192.根据权利要求116至184中任一项所述的缀合物，其中D1和/或D2是拓扑异构酶1抑制剂。
193.根据权利要求192所述的缀合物，其中D1和D2都是拓扑异构酶1抑制剂。
194.根据权利要求116至184中任一项所述的缀合物，其中D1和D2中的一者是澳瑞他汀，并且D1和D2中的另一者是拓扑异构酶1抑制剂。
195.根据权利要求194所述的缀合物，其中D1是澳瑞他汀并且D2是拓扑异构酶1抑制剂。
196.根据权利要求194所述的缀合物，其中D1是拓扑异构酶1抑制剂并且D2是澳瑞他汀。
197.根据权利要求190所述的缀合物，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
其中*表示与A1或A2的附接点。
198.根据权利要求197所述的缀合物，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
199.根据权利要求187所述的缀合物，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
(例如)(例如)，
其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。
200.根据权利要求187所述的缀合物，其中D1和D2独立地选自由以下组成的组：
其中*表示与A1或A2的附接点；或其药学上可接受的盐。
201.根据权利要求103至184中任一项所述的缀合物，其中D1和D2各自独立地选自抗微管蛋白剂、微管蛋白抑制剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂和/或长春花生物碱。
202.根据权利要求103至184中任一项所述的缀合物，其中D1和D2各自独立地选自Eg5抑制剂、V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、核输出蛋白CRM1抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DHFR抑制剂或促凋亡剂，任选地条件是D1和D2都不是BH3模拟物。
203.一种缀合物，其包含与独立地选自权利要求94或权利要求96的一种或多种(例如1至16种，例如1至4种)化合物结合的抗体或抗原结合片段。
204.根据权利要求103至203中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段结合癌细胞上的靶抗原。
205.根据权利要求204所述的缀合物，其中：
(i)所述靶抗原选自BCMA、CD33、HER2、CD38、CD48、CD79b、PCAD、CD74、CD138、SLAMF7、CD123、CLL1、FLT3、CD7、CKIT、CD56、SEZ6、DLL3、DLK1、B7-H3、EGFR、CD71、EphA2、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、TROP2、LIV1、CD46、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2和GPNMB；
(ii)所述靶抗原选自EGFR、CD7、HER2、EPCAM、FOLR1、ENPP3、MET、AXL、SLC34A2、Nectin4、MSLN、F3、MUC16、SLC39A6、TFRC、TACSTD2和GPNMB；或者
(iii)所述靶抗原是PCAD、CD48、CD74、EphA2、HER2、TROP2、B7-H3或5T4。
206.根据权利要求204或权利要求205所述的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段选自表D1。
207.根据权利要求204所述的缀合物，其中具有CDR序列的所述抗体或抗原结合片段选自表D3和D8中的那些，或具有可变区的所述抗体或抗原结合片段选自表D2和D8中的那些，或具有全长的所述抗体或抗原结合片段选自表D4、D5和D7中的那些。
208.根据权利要求204所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段是抗CD74抗体，其包含选自由以下组成的组的三个重链CDR和三个轻链CDR：
1)由SEQ ID NO:256组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:257组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:268组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:264组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:265组成的轻链CDR3(LCDR3)；
2)由SEQ ID NO:258组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:170组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:172组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:173组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)；
3)由SEQ ID NO:259组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:260组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:261组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:269组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:264组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)；
4)由SEQ ID NO:169组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:170组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:172组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:173组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)；
5)由SEQ ID NO:256组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:257组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:263组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:264组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:265组成的轻链CDR3(LCDR3)；
6)由SEQ ID NO:258组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:170组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:266组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:173组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)；
7)由SEQ ID NO:259组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:260组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:261组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:215组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:264组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
8)由SEQ ID NO:169组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:170组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:171组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:266组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:173组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:174组成的轻链CDR3(LCDR3)。
209.根据权利要求204所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段是抗CD74抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:262的氨基酸序列的轻链可变区，或(b)包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列的轻链可变区。
210.根据权利要求204所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段是抗CD74抗体，其包含：
(a)SEQ ID NO:118的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:118至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:237的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:237至少95％相同的序列；
(b)SEQ ID NO:236的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:236至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:237的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:237至少95％相同的序列；或者
(c)SEQ ID NO:118的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:118至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:239的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:239至少95％相同的序列。
211.根据权利要求204所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段是抗CD48抗体，其包含选自由以下组成的组的三个重链CDR和三个轻链CDR：
1)由SEQ ID NO:271组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:272组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:273组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:281组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:282组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:283组成的轻链CDR3(LCDR3)；
2)由SEQ ID NO:274组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:275组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:273组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:284组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:285组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:286组成的轻链CDR3(LCDR3)；
3)由SEQ ID NO:276组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:277组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:278组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:287组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:282组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:286组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
4)由SEQ ID NO:279组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:275组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:273组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:284组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:288组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:286组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
5)由SEQ ID NO:51组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:52组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:53组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:54组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:55组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:56组成的轻链CDR3(LCDR3)。
212.根据权利要求204所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段是抗CD48抗体，其包含a)包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列的轻链可变区；或b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。
213.根据权利要求204所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段是抗CD48抗体，其包含(a)SEQ ID NO:240的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:240至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:243的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:243至少95％相同的序列；或(b)SEQ IDNO:242的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:242至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:243的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:243至少95％相同的序列；c)SEQ ID NO:240的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:240至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:69的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:70至少95％相同的序列。
214.根据权利要求204所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段是抗Her2抗体，其包含选自由以下组成的组的三个重链CDR和三个轻链CDR：
1)由SEQ ID NO:289组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:290组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:291组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:297组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:298组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:299组成的轻链CDR3(LCDR3)；
2)由SEQ ID NO:292组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:40组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:291组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:300组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:301组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)；
3)由SEQ ID NO:293组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:294组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:295组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:302组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:298组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
4)由SEQ ID NO:39组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:40组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:291组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:300组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:301组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)。
215.根据权利要求204所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段是抗Her2抗体，其包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:296的氨基酸序列的轻链可变区。
216.根据权利要求204所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段是抗Her2抗体，其包含SEQ ID NO:245的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:245至少95％相同的序列，以及SEQID NO:66的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:66至少95％相同的序列。
217.根据权利要求204所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段是抗PCAD抗体，其包含选自由以下组成的组的三个重链CDR和三个轻链CDR：
1)由SEQ ID NO:304组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:305组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:306组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:312组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:313组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:314组成的轻链CDR3(LCDR3)；
2)由SEQ ID NO:307组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:308组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:306组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:315组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:25组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:316组成的轻链CDR3(LCDR3)；
3)由SEQ ID NO:309组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:277组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:278组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:317组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:313组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:316组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
4)由SEQ ID NO:310组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:308组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:306组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:315组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:25组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:316组成的轻链CDR3(LCDR3)。
218.根据权利要求204所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段是抗PCAD抗体，其包含含有SEQ ID NO:303的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的轻链可变区。
219.根据权利要求204所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段是抗PCAD抗体，其包含SEQ ID NO:248的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:248至少95％相同的序列，以及SEQID NO:250的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:250至少95％相同的序列。
220.根据权利要求204所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段是抗EphA2抗体，其包含选自由以下组成的组的三个重链CDR和三个轻链CDR：
1)由SEQ ID NO:319组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:320组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:321组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:330组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:331组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:332组成的轻链CDR3(LCDR3)；
2)由SEQ ID NO:322组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:323组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:324组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:333组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:334组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:335组成的轻链CDR3(LCDR3)；
3)由SEQ ID NO:325组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:326组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:327组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:336组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:331组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:335组成的轻链CDR3(LCDR3)；以及
4)由SEQ ID NO:328组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:323组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:321组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:333组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:334组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:335组成的轻链CDR3(LCDR3)。
221.根据权利要求204所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段是抗EphA2抗体，其包含含有SEQ ID NO:318的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:329的氨基酸序列的轻链可变区。
222.根据权利要求204所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段是抗EphA2抗体，其包含SEQ ID NO:252的重链氨基酸序列或与SEQ ID NO:252至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:254的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:254至少95％相同的序列。
223.根据权利要求208至222中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含一个或多个半胱氨酸取代，所述一个或多个半胱氨酸取代选自所述抗体或其抗原结合片段的重链的E152C、S375C、或E152C和S375C两者，其中位置根据EU系统编号。
224.根据权利要求208至222中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含一个或多个Fc沉默突变。
225.一种组合物，其包含根据权利要求103至224中任一项所述的抗体-药物缀合物的多个拷贝，其中所述组合物中所述抗体-药物缀合物的平均a是约1至约8，例如约1至约6、约1至约4、或约1至约2。
226.根据权利要求1至87中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其由下式中的任一个表示：
其中：
A1和A2各自独立地选自键、和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点；
g在每次出现时独立地是介于20与30之间的整数(例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)；
o在每次出现时独立地是介于1与9之间(例如，介于2和5之间)的整数；并且
n是介于1与12之间(例如，介于2与5之间)的整数。
227.根据权利要求226所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中A1和A2各自独立地选自键和O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点。
228.根据权利要求116至224中任一项所述的缀合物，其由下式中的任一个表示：
其中：
A1和A2各自独立地选自键、和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点；
g在每次出现时独立地是介于20与30之间的整数(例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)；
o在每次出现时独立地是介于1与9之间(例如，介于2和5之间)的整数；
n是介于1与12之间(例如，介于2与5之间)的整数；并且
＊＊-表示与Ab的附接点。
229.根据权利要求228所述的缀合物，其中A1和A2各自独立地选自键和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点。
230.根据权利要求1至87中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(D5a-1)：
其中：
A1和A2各自独立地选自键、和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点；
g在每次出现时独立地是介于20与30之间的整数(例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)；
o在每次出现时独立地是介于1与9之间(例如，介于1和3之间)的整数；并且
n是介于1与12之间(例如，介于5与10之间)的整数。
231.根据权利要求230所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中A1和A2各自独立地选自键和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点。
232.根据权利要求116至224中任一项所述的缀合物，其具有式(D5a-2)：
其中：
A1和A2各自独立地选自键、和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点；
g在每次出现时独立地是介于20与30之间的整数(例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)；
o在每次出现时独立地是介于1与9之间(例如，介于1和3之间)的整数；
n是介于1与12之间(例如，介于5与10之间)的整数；并且
＊＊-表示与Ab的附接点。
233.根据权利要求232所述的缀合物，其中A1和A2各自独立地选自键和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点。
234.根据权利要求116至224中任一项所述的缀合物，其由下式中表示：
以及
其中A1或A2各自独立地选自键、和-OC(＝O)-*，其中*表示与D1或D2的附接点；＊＊-表示与Ab的附接点；并且表示与D1或D2的直接附接点。
235.根据权利要求234所述的缀合物，其中A1和A2各自独立地选自键和-O-C(＝O)-*，其中A1和A2中的*表示与D1或D2的附接点。
236.一种药物组合物，其包含根据权利要求103至224和234中任一项所述的缀合物和药学上可接受的载剂。
237.一种治疗患有或疑似患有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求103至235中任一项所述的缀合物或根据权利要求236所述的药物组合物。
238.根据权利要求237所述的方法，其中所述癌症表达靶抗原。
239.根据权利要求237或权利要求238所述的方法，其中所述癌症是肿瘤或血液癌症，任选地，所述癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性成淋巴细胞性白血病在内的成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。
240.一种减少或抑制受试者中肿瘤的生长的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求103至235中任一项所述的缀合物或根据权利要求236所述的药物组合物。
241.根据权利要求240所述的方法，其中所述肿瘤表达靶抗原。
242.根据权利要求240或权利要求241所述的方法，其中所述肿瘤是乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。
243.一种减少或抑制受试者的血液癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求103至235中任一项所述的缀合物或根据权利要求236所述的药物组合物。
244.根据权利要求243所述的方法，其中所述血液癌症表达靶抗原。
245.根据权利要求243或权利要求244所述的方法，其中所述血液癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性髓单核细胞性白血病(CMML)、急性单核细胞性白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或骨髓增生异常综合征(MDS)。
246.根据权利要求240至245中任一项所述的方法，其中所述缀合物或药物组合物的施用使所述肿瘤或血液癌症的生长减少或抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
247.一种减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求103至235中任一项所述的缀合物或根据权利要求236所述的药物组合物。
248.根据权利要求247所述的方法，其中所述癌细胞群表达靶抗原。
249.根据权利要求247或权利要求248所述的方法，其中所述癌细胞群来自肿瘤或血液癌症，任选地其中所述癌细胞群来自乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、包括急性成淋巴细胞性白血病在内的成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、脾癌、胰腺癌、胃部癌、结肠癌或头颈癌。
250.根据权利要求247至249中任一项所述的方法，其中所述缀合物或药物组合物的施用使所述癌细胞群减少或使所述癌细胞群的扩增减缓至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
251.根据权利要求237至250中任一项所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物作为单一疗法施用。
252.根据权利要求237至250中任一项所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物作为另一种治疗剂或放射疗法的辅助施用。
253.根据权利要求252所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物以有效使肿瘤细胞对一种或多种另外的治疗剂和/或放射疗法敏感的量施用。
254.根据权利要求237至250中任一项所述的方法，其进一步包括向有需要的受试者施用至少一种另外的治疗剂。
255.根据权利要求254所述的方法，其中所述一种另外的治疗剂是紫杉烷、长春花生物碱、MEK抑制剂、ERK抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或RAF抑制剂。
256.根据权利要求103至235中任一项所述的缀合物或根据权利要求198所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于(i)治疗患有或疑似患有癌症的受试者，(ii)减少或抑制受试者中肿瘤的生长，(iii)减少或抑制受试者的血液癌症，或(iv)减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增。
257.根据权利要求103至235中任一项所述的缀合物或根据权利要求198所述的药物组合物，其用于(i)治疗患有或疑似患有癌症的受试者，(ii)减少或抑制受试者中肿瘤的生长，(iii)减少或抑制受试者的血液癌症，或(iv)减少或减缓受试者中癌细胞群的扩增。
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