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WO1997007671A1 - Chimeric animal and method for constructing the same - Google Patents

Chimeric animal and method for constructing the same Download PDF

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WO1997007671A1
WO1997007671A1 PCT/JP1996/002427 JP9602427W WO9707671A1 WO 1997007671 A1 WO1997007671 A1 WO 1997007671A1 JP 9602427 W JP9602427 W JP 9602427W WO 9707671 A1 WO9707671 A1 WO 9707671A1
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WO
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human
cells
chromosome
gene
mouse
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Application number
PCT/JP1996/002427
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English (en)
French (fr)
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Kazuma Tomizuka
Hitoshi Yoshida
Kazunori Hanaoka
Mitsuo Oshimura
Isao Ishida
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kirin Brewery Co Ltd
Original Assignee
Kirin Brewery Co Ltd
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Priority to CA2230759A priority patent/CA2230759C/en
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Priority to DK96928694T priority patent/DK0843961T3/da
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    • C12N2517/02—Cells from transgenic animals

Definitions

  • the present invention relates to a chimeric non-human animal, a method for producing the same, and a method for using the same.
  • the use of the chimeric non-human animal of the present invention makes it possible to retain and express a foreign large DNA fragment of 1 Mb (million base pairs) or more, which has been impossible so far, in an animal individual. Therefore, by using this,
  • the technology for expressing a foreign gene in an animal individual is not only useful for obtaining information on the in vivo function of the gene, but also identifying DNA sequences that regulate gene expression (for example, Magram Et al., Nature, 315: 338, 1985); development of human disease model animals (Yamamura et al., Manual Disease Model Mouse, Nakayama Shoten; 1994); and breeding of livestock (eg, Muller et al., Experient). ia, 47: 923, 1991), and has been used for producing useful substances using it (for example, Vel ander et al., PNAS, 89: 12003, 1992). Mice have been most frequently used for gene transfer. Mice that have been studied in detail as experimental animals and have established embryo manipulation techniques can be said to be the most suitable mammals for this purpose.
  • mice There are two major methods for introducing foreign genes into mice. One is to inject DNA into the pronucleus of the fertilized egg (Gordon et al., PNAS, 77: 7380, 1980), and the other is to insert DNA into embryonic stem cells (hereinafter referred to as ES cells) that retain totipotency. To create chimeric mice (Takahashi et al., Development, 102: 259, 1988) It is. In the latter case, in the chimeric mouse, the transgene is retained only in the cells and tissues that contributed to the ES cells, and in the progeny obtained through germ cells derived from the ES cells, in all cells and tissues. A number of transgenic mice have been produced using these techniques.
  • mice Useful and interesting human genes that are desired to be introduced into mice: antibodies (eg, Cook et al., Nature Genetics, 7: 162, 1994), T cell receptors (Hood et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology) , Vol. LVIII, 339, 1993), histocompatibility antigens (Carrol et al., PNAS, 84: 8535, 1987), dystrophin (Den Dunnen et al., Supra) have known that the coding region itself has a size exceeding 1 Mb.
  • human immunoglobulin heavy chain (: ⁇ 1.5 Mb, Cook et al., Supra), light chain / c (: ⁇ 3 Mb, Zachau, Gene, 135) : 167, 1993), a light chain; a mouse that retains and expresses the full-length gene of I ( ⁇ 1.5 Mb, Frippat et al., Hum. MoI. Genet., 4: 983, 1995). Fabrication is desired, but not possible with current technology (Nikkei Biotech, July 5. 1993).
  • a DNA having a size exceeding the above-mentioned limit In a cultured animal cell, it is possible to introduce a DNA having a size exceeding the above-mentioned limit by a conventional technique. This is mainly done using chromosomes (having a size of about 50-300 Mb in humans). Although several methods for transferring chromosomes into cells have been reported (eg, McBride et al., PNAS, 70: 1258, 1973), it is considered to be the best method for introducing only one desired chromosome. This is the microcell method (Koi et al., Jpn. J. Cancer Res., 80: 413, 1989). A structure called a microcell is one in which one or several chromosomes are enveloped in the nuclear membrane and plasma membrane.
  • chromosomes it is possible to introduce a small number (often one) of chromosomes by isolating microcells induced by drugs that inhibit pituitary formation in certain cells and fusing them to recipient cells. is there.
  • the library of monochromosomal hybrid cells containing only one human chromosome obtained by this method is used to map known genes and to identify chromosomes containing unknown tumor suppressor genes, cell senescence genes, etc. Has been used (eg, Saxon et al., EMBO J., 5: 3461, 1986).
  • irradiating the microcells with gamma rays it is possible to fragment chromosomes and introduce a part of them. (Koi et al., Science, 260: 361, 1993). That is, the microcell method is considered to be suitable as a method for introducing 1 Mb or more of DNA into cultured animal cells.
  • the human chromosomes we can obtain are usually those of finitely growing normal fibroblasts or differentiated somatic cells such as cancer cells, and the chromosomes derived from such somatic cells are undifferentiated ES cells. If introduced into cells, they may cause ES cells to differentiate (Muller et al., Nature, 311: 438, 1984) or to age (Sugawara, Science, 247: 707, 1990). it was thought.
  • somatic cell-derived chromosomes when introduced into early embryos, can function as well as those from germ cells during embryonic development and be responsible for specific gene expression in various tissues and cells Studies are very few.
  • One of the major differences between the two is presumed to be the methylation status of the chromosomal DNA. This changes with cell differentiation, suggesting an important role in tissue-specific gene expression (Ceder, Cell, 53: 3, 1988).
  • a methylated substrate is introduced into B cells for a site-specific DNA recombination reaction essential for the activation of an antibody gene, the methylation state is maintained after replication, and the recombination reaction is inhibited.
  • the present invention provides a chimeric non-human animal that holds a foreign chromosome or a fragment thereof and expresses a gene on the chromosome or a fragment thereof, and a progeny thereof, and a method for producing the chimeric non-human animal.
  • the purpose is to:
  • Another object of the present invention is to provide tissues and cells derived from the chimeric non-human animal and its progeny.
  • another object of the present invention is to provide a hybridoma produced by fusing cells derived from the chimeric non-human animal and its progeny with myeloma cells. Furthermore, the present invention provides a method for producing a biologically active substance which is an expression product of a gene on a foreign chromosome or a fragment thereof using an individual, tissue or cell of a non-human animal. The purpose is to do.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, obtained a chromosome derived from human normal fibroblasts or a partial fragment thereof into mouse ES cells by a microcell method, and obtained a strain stably retaining the cells. succeeded in. Furthermore, from this ES cell line, a chimeric mouse was obtained which retained human chromosomes in its normal tissues and expressed a plurality of human genes including a human antibody heavy chain gene. With this series of methods, we have made it possible to retain large DNA fragments in individuals and to express genes on the DNA fragments, which were not possible before.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a chimeric non-human animal that can be prepared by the method of (1) above, retains one or more foreign chromosomes or fragments thereof, and expresses a gene on the chromosomes or fragments thereof; and A progeny thereof that retains the above-mentioned single or plural foreign chromosomes or fragments thereof and expresses a gene on the chromosome or fragments thereof.
  • a single or non-human chimeric non-human animal or a progeny thereof obtained in the above (3) A non-human animal that has a plurality of foreign chromosomes or fragments thereof and expresses a gene on the chromosome or fragments thereof, and progeny thereof.
  • the chimeric non-human animal or progeny thereof of (3) or the non-human animal or progeny of (6) is deficient in the same or homologous gene as the gene on the chromosome or fragment thereof.
  • the chimeric non-human animal or progeny thereof described in (3) or the non-human animal or progeny thereof described in (6) is deficient in the same or homologous gene as the gene on the chromosome or fragment thereof. Breeding a non-human animal of a certain strain, expressing the gene on one or more foreign chromosomes or fragments thereof in a born offspring individual, tissue or cell, and conducting biology as a product thereof A method for producing a biologically active substance, comprising recovering a biologically active substance.
  • FIG. 1 shows the results of the analysis (PCR analysis) of A9 cells carrying human chromosome 2 (fragment).
  • FIG. 2 shows that human chromosome 22 (fragment) is retained in the E14 resistant strain (PCR analysis).
  • FIG. 3 is an electrophoretic photograph showing that the human L1 sequence is retained in the ES cell-derived chimeric mouse into which chromosome 22 has been introduced (Southern analysis).
  • FIG. 4 is an electrophoresis photograph showing the state of retention of the human chromosome in the organ of the chimeric mouse into which the human chromosome 22 has been introduced (PCR analysis).
  • FIG. 5 is an electrophoresis photograph showing the result of human gene expression (RT-PCR) in a human chromosome 22-introduced chimeric mouse.
  • FIG. 6 is an electrophoretic photograph showing the result of human gene expression (RT-PCR) in the organ of a chimeric mouse into which human chromosome 22 has been introduced.
  • FIG. 7 shows that human chromosome 4 (fragment) is retained in the E14 resistant strain (PCR analysis).
  • FIG. 8 is an electrophoresis photograph showing the result of detection (Southern analysis) of the human L1 sequence in the E14 cell line into which human chromosome 4 has been introduced.
  • FIG. 9 is an electrophoresis photograph showing that the human L1 sequence is retained in the chimeric mouse derived from human chromosome 4 introduced ES cells (Southern analysis).
  • FIG. 10 shows that chromosome 14 (fragment) of human is retained in the TT2-resistant strain (PCR analysis).
  • FIG. 11 is an electrophoretic photograph showing the state of retention of the human chromosome in the chimeric mouse organ derived from human chromosome-transfected ES cells (PCR analysis).
  • FIG. 12 shows the results of the G418 resistance test of the fibroblasts derived from the tail.
  • FIG. 13 shows the human antibody IgM concentration (ELISA) in the serum of a human serum albumin-immunized chimeric mouse.
  • FIG. 14 shows the concentration of human antibody IgG (ELISA) in the serum of a human serum albumin-immunized chimeric mouse.
  • FIG. 15 shows the results of an analysis (ELISA) of the human IgM-producing hybridoma clone H4B7.
  • FIG. 16 is a photograph of a chromosome morphology showing the result of FISH analysis of a mouse ES cell line (TT2 cell line PG15) that has a human chromosome 2 partial fragment and a chromosome 14 partial fragment.
  • FIG. 17 shows an increase in anti-human serum albumin IgG antibody titer in the serum of human serum albumin-immunized chimeric mice.
  • FIG. 18 shows the increase in anti-human serum albumin Ig antibody titer in the serum of human serum albumin-immunized chimeric mice.
  • FIG. 19 is an electrophoresis photograph showing the results of detection (Southern analysis) of the human L1 sequence in the human chromosome 22-transfected TT2 cell line.
  • FIG. 20 shows an increase in the anti-human serum albumin antibody titer in the serum of the human serum albumin-immunized chimeric mouse.
  • FIG. 21 shows that the human chromosome 2 partial fragment was retained in the progeny of the chimeric mouse into which the human chromosome 2 partial fragment was introduced (PCR analysis).
  • FIG. 22 shows the presence of cells expressing human chains on the cell surface in the spleen of a chimeric mouse into which human chromosome 14 has been introduced (flow cytometric analysis).
  • FIG. 23 shows the structure of LoxP-ps tNEO plasmid DNA.
  • FIG. 24 shows the structure of genomic DNA of mouse antibody heavy chain C.
  • FIG. 25 shows the structure of the genomic DNA of the mouse antibody light chain / c.
  • FIG. 26 shows the structure of the mouse antibody heavy chain targeting vector, the probe for Southern blotting, and the DNA fragment to be detected by the homologous recombinant.
  • FIG. 27 shows a mouse antibody light chain / c targeting vector, the structure of a Southern blot probe, and a DNA fragment to be detected by a homologous recombinant.
  • FIG. 28 is an electrophoretic photograph showing the results of Southern analysis of a mouse antibody heavy chain homologous recombinant and a high concentration G418-resistant strain derived from the homologous recombinant. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • a mouse individual carrying a human chromosome or a fragment thereof and expressing a gene on the chromosome or a fragment thereof,
  • a mouse is taken as an example of a non-human animal that holds a human chromosome or a fragment thereof and expresses a gene on the chromosome or a fragment thereof (hereinafter, this mouse is referred to as a “human chromosome”). Introduced mouse " I do. ).
  • human chromosome refers to a complex of natural DNA and protein derived from human cells.
  • normal human chromosomes 24 males
  • 46 normal chromosomes each containing about 50-300 Mb of DNA.
  • stable replication and distribution are possible as independent chromosomes.
  • the size of the DNA is usually greater than 1 Mb, but can be less.
  • a feature of the present invention resides in that a mouse gene is retained and expressed in a mouse individual using a chromosome itself as a medium, without performing cloning in Escherichia coli, yeast, or the like, or performing DNA extraction from cells.
  • the human chromosome-introduced mouse refers to a mouse that retains a single or multiple human chromosomes or fragments thereof in all or a part of the normal somatic cells. Furthermore, it refers to one in which one or more human genes on human chromosomes are expressed in all or a part of the normal somatic cells.
  • a chromosome donor cell holding a labeled human chromosome or a fragment thereof As the chromosome donor cell, 1) a human chromosome labeled with a marker that can be selected by a recipient cell, 2) other And 3) a cell having high microcell forming ability.
  • any cell line derived from human, cancer cells, or primary cultured cells can be used, but the possibility of abnormalities such as chromosome deletion and amplification is low, and culture is easy. Considering these points, normal fibroblasts are suitable.
  • human cells can be transformed by a vector expressing a marker gene such as drug resistance (G418, puromycin, hygromycin, blasticidin).
  • a marker gene such as drug resistance (G418, puromycin, hygromycin, blasticidin).
  • the promoter for controlling the expression used herein works efficiently not only in human cells but also in recipient cells such as mouse ES cells.
  • the SV40 enhancer and a simple virus-virus thymidine kinase promoter were linked (Katoh et al., Cel Struct. Funct., 12: 575, 1987), the mouse PGK-1 promoter (Soriano et al., Cell , 64: 693, 1991).
  • the above transformants can be transformed into cells having high microcell-forming ability, for example, mouse A9 cells (Oshimu ra,., Environ. Health Perspect., 93:57, 1991) to form cells. It is known that the human chromosome is selectively lost in mouse-human hybrid cells. However, the fusion strain obtained here is selected by the above-mentioned method using the above-mentioned mouse. Can be maintained stably.
  • microcells from this cell fusion strain and to fuse them again with mouse # 9 cells. Also in this case, most of the microcell fusion strains obtained by selection with markers on the human chromosome are considered to satisfy the conditions of 1), 2), and 3). Identification of the marked human chromosome was performed by PCR (polymerase-zetidine reaction, Saiki et al., Science, 239: 487, 1988), Southern blot analysis, and mouse-human monochromosomal hybrid cells obtained at the final stage.
  • the marked human chromosome By irradiating gamma rays to a microcell prepared from a mouse hybrid cell, the marked human chromosome can be fragmented and introduced into mouse A9 cells. Even when the microcell is not irradiated with gamma rays, a partially fragmented human Chromosomes may be transferred. In these cases, the resulting microcell fusion strain retains the marked fragment of the human chromosome. These can be used when it is desired to introduce a chromosome partial fragment into a recipient cell.
  • EC cells are obtained mainly from germ cell carcinomas
  • ES cells are obtained from the inner cell mass of blastocysts
  • EG cells are obtained from primordial germ cells that appear early in development.
  • recipient cells for human chromosome transfer in the present invention these cell lines and mutants thereof, and all undifferentiated cells capable of differentiating all or some normal somatic cells in mouse individuals may be used. it can.
  • a microcell prepared from the human chromosome donor cell obtained in (1) or a microcell irradiated with gamma rays can be used. Transfection into recipient cells is performed by fusing recipient cells and microcells by the method described in ⁇ Seiki Hydrogen Co., Cell Engineering Handbook, Yodosha, 19992>.
  • microcell donor cells certain human chromosomes or fragments thereof carry selectable markers in recipient cells. From this, any human chromosome or fragment thereof can be selected by selecting a strain that carries the gene or chromosome or fragment thereof to be introduced by PCR, Southern plot analysis, FISH analysis, etc., as in (1).
  • a recipient cell holding these at the same time can also be obtained. Furthermore, it is also possible to select a cell line in which the number of introduced chromosomes has been increased from among cell lines into which existing human chromosomes have been introduced. This is usually achieved by increasing the concentration of the selective agent added to the culture.
  • Recipient cells selected by markers on the human chromosome (G418 resistance, etc.) It can be confirmed that all or part of the human chromosome retained by the cell is retained as follows. Southern analysis using genomic DNA extracted from the selected recipient cells, using human-specific repetitive sequences (Ll, Alu et al., Korenberg et al., Cell, 53: 391, 1988) and human genes as probes. Is detected by In addition, PCR using human gene-specific primers, and fluorescence in situ hybridization using a human chromosome-specific probe (Lichter et al., Human Genetics, 80: 224, 1988). It can be confirmed by chromosome analysis such as FISH).
  • the chimeric mouse is produced from the ES cell line obtained in (2) by the method described in Shinichi Kuizawa, Biomanual Series 8 Gene Targeting, Yodosha, 1995>. It is desirable to use the conditions that have already been studied for each ES cell line for the selection of the stage of development, strain, etc. of the host embryo for efficient chimeric mouse production. For example, TT2 cells derived from CBAXC57BL / 6F1 (wild color, Yagi et al., Analytical Biochemistry, 214: 70, 1993) were obtained from Balb / c (white, CLEA Japan) or from ICR (white, CLEA Japan). It is desirable to use an 8-cell stage embryo as the host embryo.
  • ES cells The contribution of ES cells to mice born from embryos injected with ES cell lines can be roughly determined by their coat color. However, it cannot be concluded that there is no contribution from other organizations just because there is no contribution to coat color. More detailed retention of the human chromosome in each tissue of the chimeric mouse can be confirmed by Southern analysis, PCR, or the like using genomic DNA extracted from each tissue.
  • Gene expression on the transfected human chromosome is confirmed as follows.
  • the expression of human chromosome-derived mRNA is detected by the RT-PCR method using RNA from each tissue (Kawasaki et al., PNAS, 85: 5698, 1988) and the Northern blot method (Ausubel et al., Supra).
  • Expression at the protein level was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA, Toyama, Ando, Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific Inc.) using an anti-human protein antibody that minimized cross-reactivity with mouse homologous proteins.
  • human IgM, IgG.lgA, etc. in the chimeric mouse serum are compared with a mouse antibody.
  • the cross-reactivity can be detected by an enzyme immunoassay using an anti-human Ig antibody that minimizes cross-reactivity.
  • This chimeric mouse was immunized with a human-derived antigen (eg, human serum albumin), and the spleen cells were fused with mouse myeloma to obtain a hybridoma (Hitopri Doma, Ando Chiba, Monoclonal Antibody Experimental Procedure).
  • Introductory work, Kodansha Syentifik, 1991 can be used to obtain a hybridoma producing human immunoglobulin heavy chain by screening using ELISA.
  • the method of producing a chimeric non-human animal that retains a human chromosome or a fragment thereof and expresses a gene on the chromosome or a fragment thereof has been described above using a mouse as an example.
  • the chromosome or its fragment to be transferred to a human animal is not limited to a human-derived chromosome, and it is possible to widely transfer a foreign chromosome or a fragment thereof and express a gene on the chromosome or its fragment.
  • the “foreign chromosome” is characterized in that the gene is transferred to a cell having pluripotency and the gene on the chromosome or a fragment thereof is expressed in a chimeric non-human animal.
  • mice not only chimeric mice but also other chimeric animals such as mammals such as rats and pigs and other chimeric animals can be produced.
  • the establishment of ES cells or ES-like cells in animal species other than mice is described in rat (lannaccone et al., Dev. Biol., 163, 288-, 1994) and pigs (Wheeler et al., Reprod. Fertil. Dev., 6, 563-, 1994), as well as in medaka and chickens (Sims et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6143-6147, 1994).
  • hidges are transplanted with ES-like cells (ED cells) and nuclei derived from epithelial-like cells obtained by subcultured for more than 10 generations. It is known that unfertilized eggs develop normally (Ca immediately Bell et al., Nature, 380, 64-, 1996).
  • ED cells ES-like cells
  • a chimeric non-human animal that retains a foreign chromosome or a fragment thereof and expresses a gene on the chromosome or a fragment thereof as in a mouse by transfer of a foreign chromosome using these ES or ES-like cells as recipient cells is obtained. Can be manufactured.
  • the cells retaining the pluripotency to which the foreign chromosome or its fragment is transferred are not limited to the ES cells, EC cells, and EG cells described above.
  • transgenic chromosomes or fragments are also observed in progeny obtained by reproduction, and the progeny are located on the introduced chromosome or fragment.
  • the gene is located on the introduced chromosome or fragment.
  • a biologically active substance is produced by expressing a gene on a foreign chromosome or a fragment thereof using the chimeric non-human animal or its progeny obtained as described above, and recovering the product.
  • a chimeric non-human animal or its progeny can be bred under conditions capable of expressing a gene on a foreign chromosome or a fragment thereof, and then the expression product can be recovered from the animal's blood, ascites, etc.
  • a gene on an exogenous chromosome or a fragment thereof such as a chimeric non-human animal or its progeny, a tissue or cell or an immortalized tissue (eg, a hybridoma immortalized by fusion with myeloma cells).
  • an immortalized tissue eg, a hybridoma immortalized by fusion with myeloma cells.
  • a cDNA derived from a foreign chromosome or a fragment thereof retained in a tissue, cell, or immortalized tissue or cell of a human animal or its progeny can be transferred to animal cells or insect cells (eg, CHO cells, BHK cells, liver, etc.).
  • Cancer cells, myeoma cells, SF9 cells, etc.), and culturing the cells under conditions capable of expressing the gene on a foreign chromosome or a fragment thereof, and then expressing the product (eg, specific antigen-specific Antibody protein etc.) can be recovered from the culture.
  • Expression products It can be recovered according to a known method such as centrifugation, and further purified according to a known method such as ammonium sulfate fractionation, distribution chromatography, gel filtration chromatography, adsorption chromatography, preparative thin-layer chromatography, etc. it can.
  • Biologically active substances include all substances encoded on a foreign chromosome, and include, for example, antibodies, particularly human antibodies.
  • a human antibody gene on the chromosome is cloned from immortalized cells such as the obtained chimeric animal spleen cells or its hybridomas, and introduced into Chinese hamster ovary cells (CHO) or myeloma cells to obtain human antibody.
  • immortalized cells such as the obtained chimeric animal spleen cells or its hybridomas
  • myeloma cells to obtain human antibody.
  • the chimeric mice carrying the human chromosomes 2, 14, and 22 (fragments) and their progeny obtained according to the present invention are composed of a human antibody heavy chain (on chromosome 14), a light chain / c (on chromosome 2).
  • Light chain ⁇ (on chromosome 22) Can retain most of the functional sequence of each gene. That is, a known transgenic mouse into which a part of the human antibody gene was introduced using a yeast artificial chromosome or the like (Green et al., Nature Genetics, 7, 13-, 1994, Lonberg et al., Nature, 368, 856-, It is possible to express a much more diverse human antibody repertoire, closer to that observed in humans compared to 1994).
  • a chimeric mouse and its progeny that simultaneously retain chromosomes (fragments) such as Nos. 2 + 14 and 22 + 14 obtained by the present invention, and No. 2 + 14 obtained by crossing them Mice and their progeny that simultaneously retain chromosomes (fragments) such as No. +22 can produce a complete human antibody in which both the heavy and light chains are derived from human. These mice regard the human-derived antigen as a foreign substance and cause an immune reaction to produce an antigen-specific human antibody. This property is very useful for obtaining therapeutic human monoclonal or polyclonal antibodies (Green et al., Supra, Lonberg et al., Supra).
  • Method A A method using mouse antibody-deficient ES cells and mouse ⁇ body-deficient chimeric host embryos.
  • Method B A method in which progeny retaining the human chromosome are obtained from a human chromosome-introduced chimeric mouse and crossed with a mouse strain lacking the mouse antibody gene.
  • Microcell fusion using the strain obtained in step 5 as a recipient cell resulted in human chromosome 2 containing a human antibody light chain gene marked with a drug resistance marker different from 5 (for example, puromycin resistance gene). Fragment) or chromosome 22 (fragment) or Introduce both.
  • mice 22 obtain a mouse strain that retains the human chromosome containing the human antibody heavy chain (# 14) + light chain / c (# 2) + light chain; I (# 22).
  • mouse antibody heavy chain and light chain genes are deleted, only human antibodies are produced mainly from the functional human antibody genes on the transchromosome.
  • the methods A and B described above can be used to efficiently obtain products of not only human antibodies but also all genes present on foreign chromosomes.
  • Example 1 Preparation of a chromosome donor cell holding a human chromosome (fragment) labeled with G418 resistance
  • Plasmid pSTneoB containing G418 resistance gene (Katoh et al., Cell Struct. Funct., 1: 575, 1987; Japanese Collection of Research Biologicals (JCRB), Deposit Number: VE039) is linearized with the restriction enzyme Sail (Takara Shuzo).
  • HFL-1 cells are treated with Tribcine, suspended in Dulbecco's phosphate buffer (PBS) to a volume of 5 x 10 s Zml, and then electrophoresed using Gene Pulser (BioRad) in the presence of 10 ⁇ g DNA.
  • PBS Dulbecco's phosphate buffer
  • BioRad Gene Pulser
  • a voltage of 1000 V was applied at room temperature using an electroporation cell (165-2088, BioRad) with four chairs.
  • Electoporated cells were harvested with 15% fetal bovine serum.
  • the cells were seeded on 3 to 6 100 mm tissue culture plastic dishes (coming) containing Eagle F12 medium (hereinafter referred to as F12) supplemented with (FBS). One day later, the medium was replaced with F12 medium supplemented with 200 ⁇ g / ml G418 (GENETICIN, Sigma). Approximately 100 colonies formed after 2 to 3 weeks were grouped into 52 groups as one group, and were again inoculated on a 100 mm petri dish and cultured.
  • F12 Eagle F12 medium supplemented with 200 ⁇ g / ml G418
  • Mouse A9 cells (Oshimura, Environ. Health Perspect., 93:57, 1991, JCRB0211) were cultured in a 100 mm Petri dish in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). . 52 groups of G418-resistant HF1 cells were cultured in F12 supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS) and 200 zg / ml G418 in 100 dishes each.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • mouse A9 cells and HFL-1 cells were mixed in half to one-quarter each, and seeded on a 100-pan Petri dish, and DMEM and 15% fetal bovine serum (FBS) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) were added.
  • FBS fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • the PEG solution was aspirated, washed three times with serum-free medium (DMEM), and cultured for 1 day in normal medium (10% FBS, DMEM).
  • DMEM serum-free medium
  • Cells were dispersed by Bok Ribushin treatment, Uwabain (1 ⁇ 1 ( ⁇ 5 ⁇ , Sigma) and G418 (800 / g / ml) double selection culture place containing (10% FBS, and suspended in DMEM), 3 sheets 100mm dish After culturing for about 3 weeks, the resulting colonies were dispersed by trypsin treatment and G418 (800 zg / ml) The cells were cultured in a selection medium containing (10% FBS, MEM).
  • the cells were dispersed by trypsin treatment, and the two groups were combined into one and cultured in six 25 cm 2 centrifugal flasks (coaster, 3025) until the cell density reached about 70 to 80% saturation.
  • the medium was replaced with a culture solution (20% FBS, DMEM) containing colcemide (0.05 ⁇ g / nd, demecorcin, Wako Pure Chemical), and cultured for 2 days to form microcells.
  • a culture solution (20% FBS, DMEM) containing colcemide (0.05 ⁇ g / nd, demecorcin, Wako Pure Chemical), and cultured for 2 days to form microcells.
  • the centrifuge flask with the cytochalasin B (10 ⁇ g / ml, Sigma) solution that has been kept warm (37 ° C) in advance, and insert the centrifuge flask into an acrylic centrifuge container.
  • the isolated cells are cultured, and genomic DNA is extracted from the cells using a Puregene DNA Isolation kit (Gentra System).
  • the genomic DNA is transformed into type III, and PCR is performed using human chromosome-specific primers. Clones retaining the human chromosomes 2, 4, 14, and 22 were selected.
  • PCR amplification was performed using about 0.1 ⁇ g of genomic DNA (Innis et al., PCR Experiment Manual, HBJ Publishing Agency, 1991, thermal cycler using GeneAmp 9600, Perkin-Elmer). Taq polymerase was manufactured by Perkin-Elmer.
  • the reaction conditions were as follows: one cycle of 94 ° C for 5 minutes, denaturation at 94 ° C for 15 seconds, annealing at 54 to 57 ° C for 15 seconds (appropriate changes depending on primers), and extension at 72 ° 35 cycles of C20 seconds were performed.
  • Primers include genes present on each chromosome (O'Brien, Genetic Maps, 6th edition, Book 5, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993) and polymorphic markers (Poly morphic STS Primer Pair, BIOS Inc .; Weissenbach) Et al., Nature 359: 794, 1992; Walter et al., Nature Genetics, 7:22, 1994, etc.) were used.
  • Gene primers were prepared based on base sequences obtained from databases such as GenBank and EMBL.
  • the names of the polymorphic primers and the sequences of the gene primers are shown for each chromosome in the following Examples (No. 2: Example No. 4: Example 6, No. 14: Example 9, No. 22: Example 2)
  • the following genetic markers and polymorphic markers (Polymorphic STS Primer Pair, BIOS: D2S207, D2S177, D2S156, D2S159 BIOS) were used to identify chromosome 2.
  • C c immunoglobulin in kappa constant: 5'-TGGAAGGTGGATAACGCCCT (SEQ ID NO: 1), 5 * -TCATTCTCCTCCAACATTAGCA (SEQ ID NO: 2)
  • FABP1 (fatty acid binding protein-1 l i ver): 5, -GCAATCGGTCTGCCGGAAGA (SEQ ID NO: 3), 5'-TTGGATCACTTTGGACCCAG (SEQ ID NO: 4)
  • Vk3-2 immunoglobul in kappa var iable: 5'-CTCTCCTGCAGGGCCAGTCA (SEQ ID NO: 5), 5'-TGCTGATGGTGAGAGTGAACTC (SEQ ID NO: 6)
  • Vkl-2 immunoglobulin in kappa variable: 5'-AGTCAGGGCATTAGCAGTGC (Rokki column number ⁇ ), 5, -GCTGCTGATGGTGAGAGTGA (SEQ ID NO: 8)
  • FISH analysis was performed according to the method described in (Matsubara et al., FISH Experimental Protocol, Shujunsha, 1994), and a human chromosome 2, 4, 14, and 22 specific probe (CHROMOSOME PAINTING G SYSTEM, (Cambio).
  • clones retaining chromosome 2 obtained one or more clones in 10 of 26 groups (745 clones). Five clones were positive for all the chromosome 2 specific primers used. These clones were subjected to FISH analysis.
  • FISH analysis was performed using a human chromosome 2 specific probe (CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, CANB I0) according to the method described in (Matsubara et al., FISH Experimental Protocol, Shujunsha, 1994). . Nearly complete human chromosome 2 was observed in cells that were positive for all primers, and some clones of only one primer-positive clone had an independent chromosome smaller than human chromosome 2. Some cells had chromosomes that were observed or fused to chromosomes other than human chromosome 2 (Fig. 1). In FIG. 1, the row indicates the clone name, and the column indicates the primer used for PCR. Violence was positive and X was negative. The bottom line shows the form of human chromosome 2 observed by FISH. Those not described were not implemented.
  • A9 cells carrying human chromosomes 4, 14, and 22 were obtained.
  • Example 2 Introduction of human chromosome 22 into mouse ES cells by the microcell method
  • a mouse A9 cell line (hereinafter, referred to as A9 / # 22) having human chromosome 22 obtained in (Example 1) was used.
  • a mouse ES cell line E14 obtained from Mart in L. Hooper, Hooper et al., Nature, 326: 292, 1987 was used.
  • G418-resistant ST0 cell line treated with mitomycin C (Sigma) was used as a vegetative cell.
  • microcells were prepared from about 10 8 A9 / # 22. The entire amount of the obtained microcell was suspended in 5 ml of DMEM. After about 10 7 E14s were dispersed with trypsin, they were washed three times with DMEM, suspended in 5 ml of DMEM, combined with a microcell, and centrifuged at 1250 rpm for 10 minutes to remove the supernatant.
  • the precipitate is loosened by tapping, and 1: 1.4 PEG solution (5 g PEG1000, Kuwako Pure Chemicals, lml DMS0 Kusigma) dissolved in 6 ml DMEM) Add 0.5 ml, and let stand at room temperature for 1 minute 30 seconds. Then, 10 ml of DMEM was slowly added. Immediately centrifuge at 1250 rpm for 10 minutes to remove the supernatant, suspend the precipitate in 30 ml of ES cell culture medium, and inoculate three 100-mm diameter tissue culture plastic dishes (coning) pre-coated with nutrient cells. did.
  • Fragmentation of human chromosome 22 was performed by gamma irradiation of microcells (Koi et al., Science, 260: 361, 1993). About 10 8 A9 / # 22 microcells obtained from suspended in DMEM of 5 ml, the Ganmaseru 40 (manufactured by Atomic Energy of Canada Limited) was irradiated with gamma rays 60G y on ice (1. 2 Gy / min x 50 min) . Gamma irradiated microcell fusion as with unirradiated microcells result of performing drug resistant strains selected, the current frequency output of the drug-resistant strain was 1-7 per piece E14 cells 10 7.
  • cryopreservation and DNA acquisition were performed in the same manner as in the case of non-irradiation.
  • the retention of the introduced chromosome in the non-irradiated microcell drug resistant strains E14 / # 22-9 and E14 / # 22-10, and the gamma-irradiated microcell drug resistant strains E14 / # 22-14 and E14 / # 22-25 are as follows (1 ) To (3).
  • PVALB parvalbumin: 5'-TGGTGGCTGAAAGCTAAGAA (SEQ ID NO: 9), 5'-CCAGAAGAA TGGTGTCATTA (SEQ ID NO: 10)
  • MB myoglobin: 5'-TCCAGGTTCTGCAGAGCAAG (SEQ ID NO: 11), 5'-TGTAGTTGGAGGCC ATGTCC (SEQ ID NO: 12)
  • DIA1 (cytochrome b-5 reductase): 5'-CCCCACCCATGATCCAGTAC (SEQ ID NO: 13), 5, -GCCCTCAGAAGACGAAGCAG (SEQ ID NO: 14)
  • ⁇ immunoglobulin lambda: 5'-GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT (SEQ ID NO: 15), 5'-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA (SEQ ID NO: 16)
  • ARSA arylsulfatase A: 5'-GGCTATGGGGACCTGGGCTG (SEQ ID NO: 17), 5'-CAGAGA CACAGGCACGTAGAAG (SEQ ID NO: 18)
  • PCR amplification (Innis et al., Supra) was performed on the above 10 primers using about 0.1 g of genomic DNA as type I.
  • amplification products of the expected length were detected for all primers in the two unirradiated strains and for some primers in the two gamma-irradiated strains.
  • Fig. 2 shows the above results.
  • Fig. 2 on the left, a schematic chromosome map based on the G-band image of human chromosome 22 is shown. (O'Brien, G BNBTIC MAPS, 6th edition, BOOK 5, etc.).
  • the arrangement of the gene and polymorphism markers is roughly determined based on the information available to date (Science, HUMAN GENETIC MAP, 1994, Nature Genetics, 7:22, 1994, Nature 359: 794, 1992, etc.). It shows the relationship, and the order is not always accurate.
  • PC for 4 G418 resistant E14 cell lines Markers in which the expected amplification product was detected by R were marked, and undetectable markers were indicated by squares. The lower side shows the results of observation by FISH analysis.
  • A9 / # 22 is a chromosome donor cell.
  • Southern blot analysis revealed that L1 sequence, a human-specific repetitive sequence (10 4 to 10 5 copies per haplogenome, obtained from RIKEN DNA Bank, Nucleic acids rese arch, 13: 7813, 1985, p. About 2 g of genomic DNA treated with a restriction enzyme (BglII, Takara Shuzo) using the EcoRI-BamHI fragment) as a probe, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994 The test was performed according to the method described in>. As a result, a number of bands hybridizing with the human L1 sequence were detected in each drug-resistant strain DNA. For two unirradiated strains, the amount of human chromosomal DNA relative to mouse genomic DNA can be estimated from the pattern and concentration of each band.
  • the ratio was equivalent to that of A9 / # 22.
  • FISH analysis was performed using a probe specific for human chromosome 22 (CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, Cambio) according to the method described in (Matsubara et al., FISH Experimental Protocol, Shujunsha, 1994).
  • CHROMOSOME PAINTING SYSTEM Cambio
  • E14 / # 22-9 was translocated to the mouse chromosome, and the other three strains detected human chromosome 22 as independent chromosomes.
  • mouse ES cell line E14 / # 22-9 carrying human chromosome 22 had the ability to form chimeras, that is, the ability to differentiate into normal tissues of mouse individuals.
  • genomic DN DN derived from the tail of a chimeric mouse K22-6, 7, 8, 9, 10, 11, 12: 9 is non-chimera
  • control DNA C: C: E14 / # 22-9
  • E14 genomic DNA mixed at a weight ratio of 1: 9 E14 genomic DNA mixed at a weight ratio of 1: 9.
  • the left side shows the DNA molecular weight
  • the right side shows the chimera rate of each chimeric individual. (-: 0%, +: ⁇ 10%, ++: 10-305
  • genomic DNA was obtained from the brain, liver, muscle, heart, spleen, thymus, ovary, and kidney by IS0GEN (Nitsubion Gene).
  • the obtained tissues were subjected to PCR analysis using MB and DIA1 among the gene primers used in (Example 2).
  • expected amplification products were confirmed in all the tissues in each of the two primers.
  • the results obtained with the DIA1 primer are shown in (Fig. 4).
  • the PCR products were electrophoresed on a 2 agarose gel, and then detected by bromide chromatography. Each lane in Fig.
  • B brain
  • L liver
  • SM skeletal muscle
  • H heart
  • Sp spleen
  • Th thymus
  • Ov ovary
  • K kidney
  • nc non-chimeric mouse tail DNA ( Negative control)
  • pc Human fibroblast (HF-1) DNA (positive control).
  • RT-PCR was performed according to the method described in Innis et al., PCR Experiment Manual, HBJ Publishing Agency, 1991>.
  • a random hexamer oligonucleotide (final concentration: lOOpmo, manufactured by Takara Shuzo) was used, and for the reverse transcriptase, BRL (Superscript) was used.
  • BRL Superscript
  • DIA1 5'-CAAAAAGTCCAACCCTATCA (SEQ ID NO: 21), 5 * -GCCCTCAGAAGACGAAGCAG (SEQ ID NO: 22)
  • amplification products specific to the mRNA of both genes were detected (Fig. 5).
  • the RT-PCR product was detected by electrophoresis on a 2.5-agarose gel and then staining with bromide titanium.
  • M indicates a marker (Hind 11 digestion; I DNA + Hae 11 digestion 0 X174 DNA, Takara Shuzo)
  • MB indicates human myoglobin
  • DIA1 indicates cytochrome b5 reductase
  • WT indicates wild-type C3H mouse.
  • each lane shows B: brain, H: heart, Th: thymus, liver, Sp: spleen, K: kidney, 0v: ovary, SM: skeletal muscle, M: marker (from the left) from the left. .
  • the lower band observed in the MB results is considered a non-specific product.
  • Example 6 Transfection of human chromosome 4 or a partial fragment thereof into ES cells
  • A9 cell line (hereinafter referred to as A9) harboring human chromosome 4 obtained in (Example 1). / # 4).
  • Mouse ES cell line E14 (similar to Example 2) was used as the chromosome recipient cell.
  • Microcell fusion experiments and selection of G418 resistant strains were performed as in (Example 2). The frequency of occurrence of drug-resistant strain was one or two of Ri per 10 7 E14 cells.
  • HD (huntington di sease): 5'-TCGTTCCTGTCGAGGATGAA (SEQ ID NO: 23), 5'-TCACT CCGAAGCTGCCTTTC (SEQ ID NO: 24)
  • IL-2 (intell eukin-2): 5'-ATGTACAGGATGCAACTCCTG (SEQ ID NO: 25), 5'-TCATCTG TAAATCCAGCAGT (SEQ ID NO: 26)
  • KIT 5'-GATCCCATCGCAGCTACCGC (SEQ ID NO: 27), 5'-TTCGCCGAGTAGTCGCA CGG (SEQ ID NO: 28)
  • FABP2 (fatty acid binding protein in 2, intestinal): 5'-GATGAACTAGTCCAGGTGAGTT (SEQ ID NO: 29), 5'-CCTTTTGGCTTCTACTCCTTCA (SEQ ID NO: 30)
  • Fig. 7 shows the above results.
  • a schematic chromosome map based on the G-band image of human chromosome 4 is shown on the left side, and which band is located for some markers whose positions are known (see See Example 2).
  • Gene and polymorphism markers The first arrangement shows a rough positional relationship based on information available up to now (see Example 2), and the order is not always accurate.
  • the marker where the expected amplification product was detected by PCR was indicated by an image, and the marker that was not detected was indicated by ⁇ .
  • the lower side shows the results of observation by FISH analysis.
  • A9 / # 4 indicates a chromosome donor cell.
  • each lane is from left to right: 1: 9 / # 4 (chromosome donor cells), 2: A9 / # 4 + A9 (1: 2), 3: A9 / # 4 + A9 (1: 9) ), 4: A9, 5: E14 / # 4-7, 6: E14 / # 4-4.
  • 2 and 3 are mixtures of two types of DNA at the ratios shown in parentheses. The DNA molecular weight is shown on the left.
  • FISH analysis was performed using a human chromosome 4 specific probe (CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, Cambio) in the same manner as in (Example 2).
  • human chromosome 4 or a partial fragment thereof was detected in almost all division images of all three strains.
  • E14 / # 4-4 was translocated to the mouse chromosome, and the other two strains existed as independent chromosomes.
  • the relative size of the observed human chromosomes was consistent with that estimated from the results of the PCR analysis.
  • mice ES cell lines E14 / # 4-4 and E14 / # 4-7 which retain the human chromosome 4 partial fragment, retain the ability to form chimeras, i.e., differentiate into normal tissues of mouse individuals. It was confirmed that he had the ability to do so.
  • Example 2 Southern analysis was performed using the human L1 sequence as a probe for one E14 / # 4-7-derived individual (K # 4-7-1: chimera rate of about 5%) and a 2 g tail as in (Example 2). This was performed on the source genomic DNA. As a result, the presence of a large number of human L1 sequences was confirmed, and the pattern was similar to that of E14 / # 4-7. The ratio to the mouse genome was about 10% of E14 / # 4-7. In FIG. 9, 2 zg of tail-derived genomic DNA digested with Bglll was used in each lane.
  • a mouse A9 cell line (hereinafter, referred to as A9 / # 14) having human chromosome 14 obtained in (Example 1) was used.
  • Mouse as chromosome recipient cell The ES cell line TT2 (purchased from Lifetech Oriental, Yagi et al., Analytical Biochem., 214: 70, 1993) was used. According to the method described in the culture method of TT2, Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, Yodosha, 1995>, the vegetative cells were G418-resistant primary cells treated with mitomycin C (Sigma) (Sigma). (Purchased from Lifetec Quality Oriental).
  • Microcell fusion experiments and selection of G418 resistant strains were performed as in (Example 2). Frequency of drug-resistant strains was three to six of Ri per 10 7 TT2 cells. Cryopreservation of drug-resistant strains and genomic DNA acquisition were performed in the same manner as in (Example 2).
  • Fragmentation of human chromosome 14 was performed by gamma irradiation of microcells (Koi et al., Science, 260: 361, 1993). About 10 8 A9 / # 14 microcells obtained from suspended in DMEM of 5 ml, the Ganmaseru 40 (above), was irradiated with gamma rays 30Gy on ice (1.20 Bruno min 25 min). Gamma irradiated microcells unirradiated microcell as well as fusion, result of performing drug resistant strains selected, the frequency of occurrence of drug-resistant strains was 3 per 10 7 TT2 cells. For drug-resistant strains, cryopreservation and DNA acquisition were performed in the same manner as in (Example 2).
  • G418-resistant strains 1-4 and 1-5 by transfer of gamma-irradiated microcells
  • G418-resistant strains 3-1 and 3-2 by transfer of gamma-irradiated microcells (30 Gy)
  • Total 4 strains of human chromosome 14 or partial fragments The retention was confirmed by the following (1) and (2).
  • NP nucleoside phosphorylase: 5'-ATAGAGGGTACCCACTCTGG (SEQ ID NO: 31), 5'-AACCAGGTAGGTTGATATGG (SEQ ID NO: 32)
  • TCRA T-cell receptor alpha: 5'-AAGTTCCTGTGATGTCAAGC (SEQ ID NO: 33), 5'- TCATGAGCAGATTAAACCCG (SEQ ID NO: 34)
  • MYH6 myos in heavy chai n cardiac: 5'-TGTGAAGGAGGACCAGGTGT (SEQ ID NO: 35), 5'-TGTAGGGGTTGACAGTGACA (SEQ ID NO: 36)
  • IGA2 immunoglobulin alpha-2 constant: 5'-CTGAGAGATGCCTCTGGTGC (SEQ ID NO: 37), 5'-GGCGGTTAGTGGGGTCTTCA (SEQ ID NO: 38)
  • IGG1 immunoglobulin in gamma-1 constant: 5'-GGTGTCGTGGAACTCAGGCG (SEQ ID NO: 39), 5'-CTGGTGCAGGACGGTGAGGA (SEQ ID NO: 40)
  • IGM immunoglu obul in mu constant: 5'-GCATCCTGACCGTGTCCGAA (SEQ ID NO: 41), 5'-GGGTCAGTAGCAGGTGCCAG (SEQ ID NO: 42)
  • IGVH3 immunoglobul in heavy variabl e-3: 5'-AGTGAGATAAGCAGTGGATG (SEQ ID NO: 43), 5'-GTTGTGCTACTCCCATCACT (SEQ ID NO: 44)
  • PCR amplification was performed in the same manner for the above 18 primers (Example 2) .As a result, expected amplification products were confirmed for all or some of the primers Was done.
  • the drug-resistant strains 3-1 and 3-2 obtained using gamma-irradiated microcells tended to lack a partial region of chromosome 14. In addition, even when unirradiated microcells were used, some deletions were observed as in 1-4 strains. Fig. 10 shows the above results. In Fig.
  • a schematic chromosome map based on the G-band image of human chromosome 14 is shown on the left side, and which band is located for some markers whose positions are known (see See Example 2.)
  • the arrangement of the genes and polymorphism markers shows a rough positional relationship based on the information available up to now (see Example 2), and the order is not always accurate.
  • the marker where the expected amplification product was detected by PCR was detected in the country, and the marker not detected was indicated by ⁇ .
  • a 9 / # 14 is a chromosome donor cell. The right end shows the results of Example 11 (1).
  • FISH analysis was performed using a human chromosome 14-specific probe (CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, Cambio) according to the method described in (Matsubara et al., FISH Experimental Protocol, Shujunsha, 1994).
  • human chromosome 14 or a partial fragment thereof was observed as an independent chromosome in almost all division images of all four strains. Observation The relative size of the human chromosome was consistent with that estimated from the results of the PCR analysis.
  • Genomic DNA was prepared from the tail of 1 chimeric mouse from 3-1 (K3-1-1: chimera rate of about 25! In the same manner as in Example 4). PCR analysis was performed on all 14 primers detected in 3-1 among the primers for chromosome 14 analysis described in 9), and as a result, expected amplification products were detected for all 14 primers (No. 10)
  • genomic DNA was obtained from the brain, kidney, spleen, heart, liver, and thymus using Puregene DNA Isolate K, and each tissue was subjected to IGM primer (Example). PCR analysis using 9) was performed. As a result, expected amplification products were confirmed in all tissues (Fig. 11). The PCR products were electrophoresed on a 23 ⁇ 4 agarose gel and then detected by bromide chromatography. In FIG.
  • each lane is from left to right: B: brain, K: kidney, Sp: spleen, H: heart, L: liver, Th: thymus, pc: human fibroblast (HFL-1) DNA (positive control) Troll), nc: non-chimeric mouse tail DNA (negative control), M: marker (Hindlll digested ⁇ + ⁇ & ⁇ digested 0 X174 DNA, Takara Shuzo).
  • mice Of the chimeric mice, two individuals derived from 3-2 ( ⁇ 3-2-1: chimera rate of about 253 ⁇ 4 !, chimera rate of about 50) and one derived from 1-4 (K1-4- 1: Fibroblasts were prepared from the tail with a chimera ratio of about 80) as follows.
  • the tail of a chimera mouse aged 3 to 6 weeks was cut off for 5 to 10 mm, washed several times with PBS / lmM EDTA, and cut with a scalpel to remove the epidermis. Finely chop the internal tissue with a scalpel.
  • the cells After culturing for 7 to 10 days, the cells are detached from the Petri dish by trypsin treatment, about 10 4 cells are seeded per Petri dish on four 35 mm Petri dishes, 400 g / ml G418 is added to two of them, and 5 to 7 Culture for days and count the number of viable cells in each dish. Under these conditions, fibroblasts from wild-type ICR mice die almost 100% in the presence of G418.
  • the ratio of the number of viable cells in the selection medium to the number of viable cells in the non-selection medium is the same as that for G418-resistant fibroblasts, assuming that the growth rate of G418-resistant fibroblasts is equivalent under the two conditions. It is thought to reflect the contribution of blasts to the fibroblast population.
  • the presence of G418-resistant fibroblasts was observed in all three individuals.
  • the resistance ratio was obtained by averaging the values obtained from two sets of selected / unselected 35imn dishes for each individual. ICR indicates a wild type ICR mouse.
  • mouse A9 cell W23 (hereinafter, referred to as A9 / # 2 W23), which retains the human chromosome 2 partial fragment obtained in (Example 1), was used.
  • the mouse ES cell line TT2 (Example 9) was used as a chromosome recipient cell.
  • Microcell fusion experiments and selection of G418 resistant strains were performed in the same manner as in (Example 2).
  • the frequency of appearance of drug-resistant strains was 1 to 3 TT2 cells (1 to 3 cells).
  • Cryopreservation of drug-resistant strains and genomic DNA acquisition were performed in the same manner as in (Example 2). , 5-2, 5-3
  • the retention was confirmed by the following (1) and (2).
  • FISH analysis was performed in the same manner as in (Example 2) using a human chromosome 2 specific probe (CHR0 OSOME PAINTING SYSTEM, Cambio).
  • human chromosome 2 partial fragments were detected as independent chromosomes in almost all division images of all three strains. Its size was comparable to that observed for A9 / # 2 W23.
  • a G418-resistant ES cell line 5-1 obtained in (Example 12) and confirmed to retain a partial fragment of human chromosome 2 was set up from a frozen stock, and the ICR or MCH (ICR) (Japan (Clair) 10-12 embryos per embryo were injected into 8-cell stage embryos obtained by mating male and female mice. After culturing overnight in ES medium (Example 9) to generate blastocysts, pseudopregnancy 2.5 days after fostering, about 10 uteri per uterus of foster parent ICR mice (CLEA Japan) Injection embryos were transplanted.
  • G418-resistant ES cells (5-1) that retain a partial fragment of human chromosome 2 retain chimera-forming ability, that is, the ability to differentiate into normal tissues of mouse individuals. It was confirmed that.
  • Serum human antibody concentrations were measured using Enzymlink Domnosolvent Atssay (ELISA). ELISA followed the method described below. Toyama Ando, Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha, 1987; Ando 'Chiba, Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures, Kodansha, 1991; Ishikawa, Ultrasensitive Enzyme Immunoassay, Academic Publishing Center, 1993; Ed Harlow and David Lane, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; A. Doyle and JB Griffiths, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons Ltd., 1996 0 For reference, some improvements were made, such as performing the reaction overnight or at a temperature of 4 depending on the measurement system.
  • the coat was coated at 4 ° C for 10 days.
  • PBS containing 5% mouse serum Sigma, M5905
  • the PBS containing 1% fetal bovine serum was used for measurement of hybridoma culture supernatants.
  • the dilution was performed using PBS. After washing the coated plate, blocking was performed for 1 hour or more. After washing the plate, samples were added and incubated for at least 30 minutes.
  • an enzyme-labeled anti-human immunoglobulin antibody diluted 100 to 5000-fold was added, and the plate was incubated for 1 hour or more. After that, the plate was washed and a substrate solution was added to develop color. Depending on the measurement system, basically, the same operation was performed using a biotin-labeled antibody. After washing the plate, an avidin-enzyme complex was added thereto, the mixture was incubated, and then the substrate solution was added. The absorbance was measured using a microplate reader (Biotech, EL312e).
  • An anti-human IgM mouse monoclonal antibody (Sigma, 16385) diluted in 50 mM carbonate-bicarbonate buffer pH 9.6 was coated on a 96-well microtiter plate, and the mouse serum (Sigma, M5905) was added to PBS. Diluted serum samples were added.
  • chimera mice (Example 10, K3-1-1, K3-2-1) that retained the human chromosome 14 fragment three times at 27 days, 34 days, and 41 days after birth were dissolved in PBS.
  • This chimeric mouse serum was similarly analyzed by ELISA. The results are shown in Figures 13 and 14.
  • Example 15 Obtaining human antibody heavy chain-producing hybridoma from a chromosome 14 transgenic chimeric mouse
  • the spleen was removed from the chimeric mouse (K3-tol, Example 14) immunized with human albumin in Example 14 on the 44th day after birth, and the cell was fused with myeloma cells to produce a hybridoma. .
  • the method for preparing the hybridoma was as described in ⁇ Ando, Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures, Kodansha Sientifik, 1991>, and P3X63-Ag. -565) was used.
  • the cells were spread on 10 96-well plates, cultured for 1 week, and the culture supernatant was analyzed by ELISA.
  • the ELISA method was performed in the same manner as in Example 14 except that an anti-human IgM mouse monoclonal antibody (Sigma, 16385) was immobilized on a plate, and six positive clones were obtained.
  • HSA as an antigen, a solution having a concentration of 50 mM bicarbonate bicarbonate buffer at pH 9.6 was prepared, and the solution was dispensed at 100 // 1 to all the wells of the EL1SA plate.
  • Detection was performed using an anti-human IgAgG + lgM goat antibody labeled with peroxidase (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., 04-10-17). One positive clone was confirmed in 10 plates.
  • This clone was one of the six human IgM positive clones.
  • This clone (H4B7) was further cultured, and the culture supernatant was diluted.
  • ELISA was performed using a human IgM goat antibody (Tago, 2392)
  • a decrease in absorbance was observed as the dilution ratio of the culture supernatant increased.
  • the absorbance was low in the sample obtained by diluting human IgM (Organon Technicol, 6001-1590) to 2 g / ml with the medium regardless of the dilution ratio.
  • the antibody produced by hybridoma H4B7 is an antibody specific to HSA (Fig. 15).
  • the horizontal axis shows the dilution rate of the culture supernatant sample
  • the vertical axis shows the absorbance at 405 nm.
  • ⁇ 9 cells (W23) (see Example Fig. 1) carrying the human chromosome 2 fragment labeled with G418 resistance were placed in a lOOmm Petri dish using a selection medium (10% FBS, DMG) containing G418 (800 ⁇ g / ml). EM). Plasmid pPGKPuro (purchased from WHIT EHBAD INSTITUTE, Dr. Peter W. Laird) containing the puromycin resistance gene was linearized with the restriction enzyme Sail (Takara Shuzo) before transfection.
  • the cells were treated with trypsin, suspended in Dulbecco's phosphate buffer (PBS) to a volume of 5 x 10 6 Zml, and then electroporated using GenePulsa-1 (BioRad) in the presence of 10 / z gDNA (Example 1). See). A voltage of 1000 V with a capacity of 25 / F was applied at room temperature using a 4 nun-length electroporation cell (Example 1). Electroporated cells were seeded on 3 to 6 100 mm dishes. One day later lO zg / ml pure mouth mycin
  • Human cells were stained by culturing an ES cell line (E14 / # 14-36) carrying the human chromosome 14 fragment marked with the G418 resistance gene in a medium supplemented with high concentrations of G418.
  • a clone of ES cells with doubled chromosomes was obtained (Bio Manual Series 8, Gene targeting, Yodosha, 1995).
  • G418-resistant mouse primary cells purchased from Lifetech Oriental) were seeded in 100 petri dishes without mitomycin treatment and used as vegetative cells.
  • E14 / # 14-36 was inoculated on this 100 mm petri dish, and half a day later, the medium was replaced with a medium having a G418 concentration of 16 mg / ml.
  • the medium was changed every 1 to 2 days, and one week later, the culture was continued at a G418 concentration of 10 mg / ml. From the resulting colonies, 15 were picked and cultured. FISH analysis was carried out using. As a result, the fragment of human chromosome 14 was doubled in 8 clones.
  • Example 16 Of the double drug-resistant clones obtained in (Example 16), a microcell transfer experiment was performed using PG1 as a microcell donor cell and wild-type A9 cells as recipient cells, and the partial fragment of human chromosome 2 retained by PG1 was further purified. It was confirmed that it was marked by the mycin resistance gene. Microcell acquisition and fusion with A9 cells were performed in the same manner as in (Example 1). As a result, a total of 59 G418-resistant colonies appeared 10 days after the microcell fusion. These colonies were replaced with a medium containing 8 ⁇ g / ml of pure mouth mycin, and cultured for 3 days. As a result, 45 (765 colonies) survived.
  • the high transfer rate of both resistance genes at the same time means that the G418 resistance-labeled human chromosome 2 fragment retained by PG1 Pyuroma 'Ishin resistance gene by further c show that it is marked, for each marker monogenic detected on human chromosome 2 partial fragment, A9 / # 2 W23
  • FISH analysis was performed using pSTneoB (Example 1) as a probe for G418 resistance (Example 16) and pPG Puro (Example 16) as a probe for PG1 (Matsubara et al., FISH Experimental Protocol, Shujunsha, 1994).
  • pSTneoB Example 1
  • pPG Puro Example 16
  • PG1 PG1
  • pSTneoB and pPGKPuro are homologous in part of the vector. Since it has a column, pSTneoB is also detected with the pPGKPuro probe. That is, of the four signals observed in PG1, two are considered to be pSTneoB and the other two are signals derived from pPGKPuro. From this result, it was confirmed that the partial fragment of human chromosome 2 retained by PG1 was marked by both G418 resistance and puromycin resistance.
  • This PG1 cell line was used as a chromosome donor cell in order to obtain mouse ES cells simultaneously retaining a human chromosome 2 partial fragment and a chromosome 14 partial fragment.
  • a G418-resistant TT2 cell line 1-4 (Example 9), which already has a partial fragment of human chromosome 14, was used.
  • Microcell fusion experiments and selection of puromycin-resistant strains were carried out in the same manner as in the selection of G418-resistant strains (Example 9) except for a puromycin concentration of 0.75 g / ml. Frequency of occurrence of this result emerging Pew port hygromycin-resistant strains was three to seven 1-4 cells per 10 7.
  • chromosome 2 was analyzed (Example 12; A9 / # 2). W23), for chromosome 14, PCR amplification was performed for each primer confirmed to be present in (Example 9; TT2 / # 14 1-4). As a result, all three primers were expected to be present in all three strains. Amplification products were confirmed.
  • the chromosomes with low brightness are from the mouse, and the two chromosome fragments (indicated by arrows) with high brightness due to the fluorescence of FITC are from humans. Considered a fragment. From the above experiment, it was confirmed that the obtained double-resistant ES cell line simultaneously retains the human chromosome 2 partial fragment and the chromosome 14 partial fragment.
  • ICR or MCH (ICR) (CLEA Japan) 10-12 embryos per embryo were injected into 8-cell stage embryos obtained by mating male and female mice. After culturing overnight in an ES cell culture medium (Example 9) to generate blastocysts, 2.5 days after pseudopregnancy treatment, the uterus of a foster parent ICR mouse (CLEA Japan) was approximately Ten injection embryos were transferred.
  • Table 6 Production of chimeric mice from mouse ES cell lines that simultaneously carry a partial fragment of human chromosome 2 and a partial fragment of chromosome 14
  • KPG-15 (9 weeks old; PG5 derived, chimera rate 10%) and KPG-18 (5 weeks old; PG5 derived, chimera rate 10%) was mixed with human serum albumin (HSA, Sigma, A3782) dissolved in PBS and an adjuvant (MPL + TDM Emulsion, RIBI Immunochem Reseach Inc.) at a concentration of 0.25 mg / ml HSA.
  • HSA human serum albumin
  • MPL + TDM Emulsion RIBI Immunochem Reseach Inc.
  • Anti-human antibody chain antibody (VECTOR LABORATORIES, IN, AI-3060) diluted in 50 mM bicarbonate bicarbonate buffer pH 9.6 was coated on a 96-well microtiter plate, and a serum sample was added. Add a biotin-labeled anti-human antibody / c-chain goat antibody (VECTOR LABORATORIES, INC., ⁇ -3060), incubate, and add a complex of biotinylated ⁇ sabiperoxidase and avidin DH (VECTOR LABOR AT0R IES, INC.).
  • TMBZ 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • a mouse monoclonal antibody (Sigma, 636385) diluted with 50 mM carbonate-bicarbonate buffer pH 9.6 was coated on a 96-well microtiter plate, and a serum sample was added. After adding and incubating a peroxidase-labeled anti-human ⁇ chain mouse antibody (The Binding Site Limited, MP008), the TMBZ (Sumitomo Bei-Client, M-1120T) Upon addition, the enzyme activity was evaluated by absorbance at 450 nm.
  • IgM (mg / 1)
  • IgK (mg / 1)
  • IgM (mg / 1)
  • Ig / c (mg / 1)
  • Chimera mice (K9, K11; both derived from ⁇ 2 cell line 3-2, chimera rates of 50 and 303 ⁇ 4, respectively) retaining the human chromosome 14 fragment prepared in the same manner as in (Example 10) 79 days, 93 days, 107 days, 133 days 4 times ( ⁇ 9), or 74 days, 88 days, HSA was immunized three times on 111 days (Kll) as in Example 20.
  • An antibody containing a human chain to human serum albumin in the serum of the chimera mouse was detected by ELISA (see Example 14).
  • HSA (Sigma, A 3782) diluted in 50 mM bicarbonate bicarbonate buffer pH 9.6 was coated on a 96-well microtiter plate, a sample was added, and then a peroxidase-labeled anti-human IgG mouse antibody (Pharmindin) , 08007E), and incubated, and the enzyme activity was evaluated by the absorbance at 490 nm by adding 0-phenylenediamine (0PD, Sumitomo Bei-Cryte, ML-11300) as a peroxidase substrate.
  • 0-phenylenediamine (0PD, Sumitomo Bei-Cryte, ML-11300
  • Blood was collected from 9-month-old chimeric mice (Example 3, # 22-7; chimera rate: 10%), and human antibodies in the serum; I-chain were detected by ELISA (see Example 14).
  • a 96-well microtiter plate was coated with an anti-human antibody ⁇ chain goat antibody (VECTOR LABOR ATORIES, INC., 3070) diluted with 50 mM carbonate bicarbonate buffer pH 9.6, and a serum sample was added.
  • a biotin-labeled anti-human antibody ⁇ chain goat antibody (VECTOR LABORAT 0RIES, 1NC., BA-3070) is added and incubated, and then a complex of biotinylated ⁇ -peravioxidase and avidin DH (VECTOR LABORATORIES, INC.. Vectas After adding and incubating tain ABC kit PK4000), the enzyme activity was evaluated by the absorbance at 450 nm by adding TMBZ (Sumitomo Bei-Cryte, ML-1120T) as a peroxidase substrate.
  • TMBZ Quantumitomo Bei-Cryte, ML-1120T
  • human IgG (Sigma, 1-4014) having a known concentration having an I chain was used as a standard, and serially diluted with PBS supplemented with mouse serum.
  • chimeric mice harboring human chromosome 2 fragments (Examples 13, ⁇ 2-3, and ⁇ 2-4) were given HSA three times at 66 days, 80 days, and 102 days after birth as in Example 20. Immunity did.
  • human antibody / c chain against HSA in the serum of the chimeric mouse (K2-12) was detected four times at 63 days, 77 days, 91 days, and 116 days after birth by ELISA. See Example 14).
  • HSA (Sigma, A 3782) diluted in 50 mM bicarbonate bicarbonate buffer, pH 9.6, is coated on a 96-well microtiter plate, a sample is added, and then a biotin-labeled anti-human antibody / c-chain goat antibody ( VECTOR LABORATORIES, INC., BA-3060), add and incubate with a biotinylated complex of sabiperoxidase and avidin DH (VECTOR LABORATORIES, INC. Vectas tain ABC kit), and incubate with 0PD as a peroxidase substrate.
  • Example 24 Obtaining human antibody heavy chain (chain or a chain) -producing hybridoma from chimeric mouse into which chromosome 14 has been introduced
  • the spleen was removed from the chimeric mouse K9 immunized with HSA in Example 21 and fused with myeloma cells to produce a hybridoma.
  • the hybridoma was prepared according to the method described in ⁇ Ando Chiba, Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures, Kodansha Science, 1991>, and Sp-2 / 0-Agl4 (Dainippon Pharmaceutical, 05-554) was used. Add 0RIGEN Hybri doma Cl oni ng to the culture
  • HCF H418 Factor
  • a 96-well microtiter plate was coated with an anti-human z-chain mouse monoclonal antibody (Sigma, 1-6385) diluted with 50 mM bicarbonate bicarbonate buffer pH 9.6, and a sample diluted with PBS was added. After adding a peroxidase-labeled anti-human chain mouse antibody (The Bindinng Site Limited.
  • the spleen was removed from the chimeric mouse K2-3 immunized with HSA in (Example 23), and the cell was fused with myeloma cells to prepare a hybridoma.
  • the method for producing the hybridoma was as described in ⁇ Ando, Chiba, Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures, Kodansha Sentifik, 1991>, and P3X63Ag8.653 (Dai Nippon Pharmaceutical, 05 -565) was used.
  • A9 cells carrying human chromosome 22 labeled with G418 resistance (A9 / # 22a2; obtained in Example 1)
  • puromycin of human chromosome 22 was treated in the same manner as in (Example 16). Re-marking by resistance was performed.
  • Approximately 200 double-drug resistant strain colonies obtained by electroporating pPGKPuro into 2 cells were used as one group, and three groups (Pl, P2, P3) were used as donor cells to transfer to wild-type mouse A9 cells. Microcell transfer was carried out. As a result, 6 double drug resistant clones were obtained from P1, 1 from P2, and 3 from P3.
  • CM1 human IgM constant region: 5'-TTGTATTTCCAGGAGAAAGTG (SEQ ID NO: 45)
  • CM2 (same as above): 5'-GGAGACGAGGGGGAAAAGGG (SEQ ID NO: 46)
  • HS1 human heavy chain variable region: 5'-ATGGACTGGACCTGGAGG (AG) TC (CT) TCT (GT) C (SEQ ID NO: 47) (mixture of 8 types)
  • HS2 5'-ATGGAG (CT) TTGGGCTGA (GC) CTGG (GC) TTT (CT) T (SEQ ID NO: 48) (a mixture of 16 species)
  • HS3 5'-ATG (AG) ACAC) (AC) (AT) ACT (GT) TG (GT) (AT) (GCT) C (AT) (CT) (G C) CT (CT) CTG (SEQ ID NO: 49) (mixture of 6144 species)
  • the first PCR was HS1 x CM1, HS2 x CM1, and HS3 X CM1
  • Example 28 Obtaining human antibody / c-chain cDNA from spleen of chimeric mouse expressing human antibody / c-chain and determining the nucleotide sequence
  • KC2 human Ig c constant region: 5
  • -CAGAGGCAGTTCCAGATTTC SEQ ID NO: 50
  • KC3 (same as above): 5'-TGGGATAGAAGTTATTCAGC (SEQ ID NO: 51)
  • KVMIX human Ig / c chain variable region
  • PCR was carried out using a combination of KVMIXxKC2 and KVMIXXKC3 primers at 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 15 seconds, 72 ° C for 20 seconds, and 40 cycles (using PerkinElmer and Samarucycler-9600). Amplification products were detected by 1.5-agarose agarose electrophoresis followed by staining with bromide chidium. As a result, the expected amplification products of about 420bps (KC2) and about 450bps (KC3) were detected in both combinations. On the other hand, no specific amplification product was detected in the two negative controls.
  • amplified products were cloned into the Smal or EcoRV sites of the pBlueScriptll SK + (Stratagene) vector according to the method of Ishida et al. (Gene Expression Experiment Manual, Kodansha Sentific, 1995).
  • the base sequence of the amplified product was determined for one kind of VK- # 1 green derived from KVMIXXKC2 among the plasmids into which the amplified product was introduced, using an automatic fluorescence sequencer (Applied Bio System). Since the obtained nucleotide sequence does not contain a stop codon from the start codon of the human Ig ⁇ chain to the constant region, the cloned amplification product contains a functional human Ig / c chain variable region.
  • Anti-human IgG4 antibody (Sigma, 1-7635) was diluted with lOOmM glycine hydrochloride buffer, pH 2.5, allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and then diluted with lOOmM phosphate buffer, pH 7.0. After dilution 10-fold, a 96-well microtiter plate was coated. A serum sample was added, and then a peroxidase-labeled anti-human IgG antibody (Pharmindin, 08007E) was added and incubated, and then the enzyme activity was evaluated by the addition of TMBZ (Sumitomo Bei-Cryte, M1120T) at an absorbance of 450 nm. The purified human IgG4 (Sigma, Model 4639) with a known concentration was used as a standard, and serially diluted with PBS supplemented with mouse serum.
  • Table 10 shows the results. All subclasses of IgGl, IgG2, IgG3, and IgG4 and IgM were detected in chimeric mice K15A and K16A. Table 10 Human antibody IgG subclass and IgM concentration in chimeric mice (ELISA) Chimeric mouse IgGl IgG2 IgG3 IgG4 IgM (mg / 1)
  • Example 30 Acquisition of mouse ES cell line (TT2) carrying human chromosome 22 To obtain mouse ES cell (TT2) carrying human chromosome 22, the cells were used as chromosome donor cells (Example 26). The obtained 6-1 (A9 / # 22, G418, puromycin resistant) cell strain was used. A wild-type TT2 cell line (Example 9) was used as a chromosome recipient cell. Microcell fusion experiments and selection of puromycin-resistant strains were carried out in the same manner as in the selection of G418-resistant strains (Example 9) except for a puromycin concentration of 0.75 ⁇ g / ml.
  • Pew port hygromycin-resistant strains was 21 to per 10 7 TT2 cells. Cryopreservation of the puromycin-resistant strain and acquisition of genomic DNA were performed in the same manner as in (Example 2). The retention of human chromosome 22 was confirmed for puromycin-resistant strain PG22-1 by the following (1) and (2).
  • a pure bitemycin-resistant ⁇ 2 cell line PG22-1 obtained in Example 30 and confirmed to retain human chromosome 22 was established from a frozen stock, and was used for ICR or MCH (ICR) (Japan (Clair) 10-12 embryos per embryo were injected into 8-cell embryos obtained by mating male and female mice. After culturing overnight in an ES cell culture medium (Example 9) to generate blastocysts, pseudopregnancy treatment 2.5 days after fetal transfer to the uterus of a foster parent ICR mouse (CLEA Japan) Ten injection embryos were transferred.
  • ICR ICR
  • MCH MCH
  • ES cell line / Buromycin Injection of ES cells Child mouse Chimera Contribution to coat color Human chromosome resistant strain number Number of 8-cell stage embryos Number of mice 2020% 20-50% 50-80%
  • a chimeric mouse (Example 31, KPG22-3) was immunized with HSA three times at 79 days, 94 days, and 110 days after birth (Example 20). Human antibody in serum; I chain was detected using ELISA according to (Example 14).
  • HSA (Sigma, A 3782) diluted to 5 ug / ml in 50 mM bicarbonate bicarbonate buffer pH 9.6 was coated on a 96-well microtiter plate, a serum sample was added, and then biotin-labeled anti-human Add immunoglobulin chain antibody (VECTOR LABORATORIES, INC., BA-3070), incubate, and add biotinylated complex of sabiperoxidase and avidin DH (VECTOR LABORAT 0RIES, INC. Vectastain ABC kit). After the incubation, the enzyme activity was evaluated by the addition of TMBZ (Sumitomo Bei-Client, M-1120T) at an absorbance of 450 nm.
  • TMBZ Quantitomo Bei-Client, M-1120T
  • the titer of anti-HSA human ⁇ chain in the serum of chimeric mice immunized with HSA increased after immunization.
  • the titer of the anti-HSA human antibody ⁇ chain after HSA immunization was at the background level.
  • the results are shown in ( Figure 20).
  • the horizontal axis represents the number of days since the first immunization of the chimeric mice with HSA, and the vertical axis represents the absorbance at 450 nm. From these results, it was confirmed that in a chimeric mouse carrying human chromosome 22, the human antibody; the I-chain gene functions; and that the antibody titer of antigen-specific human ig ⁇ increases in response to HSA antigen stimulation. Was done.
  • Example 34 Obtaining human antibody light chain-producing hybridoma from human chromosome 22-introduced chimeric mouse At 113 days after birth, the spleen was removed from the chimeric mouse KPG22-3 immunized with human albumin in (Example 33) in the same manner as in (Example 25), and the cell was fused with myeloma cells to produce a hybridoma.
  • the method for preparing the hybridoma was according to the method described in Kudou Ando 'Chiba, Introduction to Single-Clone Antibody Experiments, Kodansha Scientifiq, 1991>, and SP-2 / 0-Agl4 (Dainippon) Pharmaceutical, 05-554) was used.
  • Example 6-1 (A9 / # 22, G418, puromycin resistance) obtained in Example 26 as chromosome donor cells to obtain mouse ES cells that simultaneously retain human chromosome 22 and chromosome 14 partial fragments.
  • a cell line was used.
  • a G418-resistant TT2 cell line 1-4 (Example 9), which already retains a human chromosome 14 partial fragment, was used.
  • Microcell fusion experiments and selection of puromycin-resistant strains were carried out in the same manner as in the selection of G418-resistant strains (Example 9) except for a puromycin concentration of 0.75 g / ml. This frequency results emerged Pew port hygromycin-resistant strains was 1-2 per 1-4 10 7 cells.
  • Example 36 Production of a chimeric mouse from a mouse ES cell line simultaneously retaining a human chromosome 22 partial fragment and a chromosome 14 partial fragment
  • G418 obtained in (Example 35) and confirmed to retain the human chromosome 22 partial fragment and the chromosome 14 partial fragment, and the PG22-5 puromycin double resistant TT2 cell line PG22-5 were frozen stocks.
  • ICR or MCH (ICR) (CLEA Japan) 10 to 12 embryos per embryo were injected into 8-cell embryos obtained by mating male and female mice. After culturing overnight in an ES cell culture medium (Example 9) to generate blastocysts, pseudopregnancy treatment 2.5 days after foster parent 1CR mice (CLEA Japan) Ten injected embryos were transferred.
  • mice were born. Chimeric individuals are judged by whether or not the wild color (dark brown) derived from TT2 cells is found in the white color derived from the host embryo (ICR) in coat color. Out of the 16 animals born, 5 animals had a wild color part in the coat color, that is, the contribution of ES cells was recognized.
  • mice (KPG22-9, 10, and 12) of Example 36 were immunized with HSA.
  • KPG22-9 and KPG22-10 were immunized at 11 weeks of age, and blood was collected 2 weeks later.
  • KPG22-12 was immunized twice at 7 weeks and 9 weeks of age, and blood was collected 2 weeks after the second immunization.
  • Human antibody / chain and human antibody in serum an antibody having an I chain, a human chain, and a human chain was detected by the ELISA method according to (Example 14).
  • anti-human immunoglobulin diluted with PBS; I-chain antibody (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., 01-10-11) was added to a 96-well microtiter plate.
  • TMBZ peroxidase-labeled anti-human immunoglobulin chain antibody
  • the enzyme activity was evaluated by the absorbance at 450 nm, and the purified human IgM (Dainippon Pharmaceutical Co., U13200) having a purified ⁇ chain was added in PBS containing mouse serum.
  • the concentration of the human antibody in the serum was determined by comparison with that of the human antibody.
  • a human antibody chain and a human antibody; the I chain was detected and quantified by the ELISA method in the same manner as in (Example 29) and (Example 32).
  • the results are shown in Table 14. Both ⁇ and ⁇ chains were detected in chimeric mice. An antibody having a human antibody chain and a ⁇ chain was also detected.
  • a chimeric mouse (K9) having only human chromosome 14 (Example 10) and a chimeric mouse (KPG22-2) having only human chromosome 22 (Example 31) were measured.
  • Human antibody in serum; concentration of antibody with I chain and chain is at background level, confirming that the detection system detects only complete antibody with human ⁇ and / chains was done.
  • Example 38 Detection of a human antibody in the serum of an ES cell-derived chimeric mouse simultaneously retaining a human chromosome 2 partial fragment and a chromosome 14 partial fragment (an antibody having a human ⁇ chain and a human chain)
  • the chimeric mouse KPG-15 (derived from TT2ES clone PG5, chimera rate 103 ⁇ 4! Prepared in (Example 19) was treated with human serum albumin (HSA) dissolved in PBS between 2 and 3 months of age. Sigma, A3782) and an adjuvant (MPL + TDM Emulsion, RIBI Iunounochem Reseach Inc.) were mixed to prepare a 0.25 mg / ml HSA solution, and 0.2 ml was immunized three times and blood was collected. In addition, blood was collected from a chimera mouse KPG-26 (derived from TT2ES clone PG6, chimera rate: 403 ⁇ 40) at 6 weeks of age (Example 19).
  • HSA human serum albumin
  • MPL + TDM Emulsion RIBI Iunounochem Reseach Inc.
  • Serum complete human antibody concentration was determined by ELISA according to (Example 14).
  • Anti-human immunoglobulin chain antibody (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., 01-10-10) diluted in PBS was coated on a 96-well microtiter plate, and mouse serum (Sigma, ⁇ 5905) was coated.
  • a serum sample diluted with PBS supplemented with peroxidase was added, and then a peroxidase-labeled anti-human immunoglobulin chain antibody (The Binding Site Limited. MP008) was added and incubated.
  • the enzyme activity was evaluated by the absorbance at 450 nm by the addition of the mouse serum, and purified mouse serum was used as a standard with purified IgM (organon.Techniki, 6001-1590) having a known concentration. PBS added was serially diluted. Chain, for / z chain concentrated in the same manner as in (Example 20) I asked for degrees. The results are shown in Table 15. An antibody having a human antibody chain and a / c chain was detected. A chimeric mouse having only human chromosome 14 as a control (Example 10)
  • the chimeric mouse (K2-9) which retains only human chromosome 2 (Example 13), has a concentration of less than 0.002 mg / ml of the human antibody in the serum, the / c chain and the chain. At the background level.
  • Example 39 Obtaining mouse ES cell line (TT2F, X0) retaining human chromosome 2 partial fragment-Chromosome donation for obtaining mouse ES cell (X0) retaining human chromosome 2 partial fragment
  • the PG1 cell line obtained in (Example 16) was used as cells. It has been reported that chromosome recipient cells have a (39, X0) chromosome composition and efficiently differentiate into egg cells in chimeric mice (Shinichi Aizawa, Bio Manual Series 8, Gene Evening, Yodosha) , 1995) TT2F cell line (purchased from Lifetech Oriental) was used.
  • Microcell fusion experiments and selection of puromycin-resistant strains were carried out in the same manner as in the selection of G418-resistant strains (Example 9) except for a puromycin concentration of 0.75 g / ml.
  • the frequency of emerged puromycin-resistant strains was TT2F cells 5 out of 10 7 pieces. Cryopreservation of these puromycin-resistant strains and acquisition of genomic DNA were performed in the same manner as in (Example 2).
  • the retention of the human chromosome 2 partial fragment was confirmed for the drug-resistant strains P-20 and P-21 by the following PCR analysis.
  • Example 40 Production of chimeric mouse from mouse ES cell line (TT2F, X0) retaining human chromosome 2 partial fragment
  • a pure-mycin-resistant TT2F cell line P-21 obtained in (Example 39) and confirmed to retain a partial fragment of human chromosome 2 was set up from a frozen stock, and the ICR or MCH ( ICR) (CLEA Japan) 10-12 embryos per embryo were injected into 8-cell stage embryos obtained by mating male and female mice. After culturing overnight in ES cell culture medium (Example 9) to generate blastocysts, and pseudopregnancy treatment 2.5 days after fetal transfer to the offspring of foster parent ICR mice (CLEA Japan) Approximately 10 injection embryos were transferred.
  • mice After transplanting a total of 141 injected embryos, 20 offspring mice were born. Chimeric individuals are judged by whether or not the wild color (dark brown) derived from TT2 cells is found in the white derived from the host embryo UCR) in coat color. The results of chimera production are shown in (Table 16). Out of the 20 born animals, 9 had an apparent wild-colored coat color, ie, the contribution of ES cells was observed. Four of them were chimeric mice with completely wild coat color (derived from ES cells).
  • mice (Example 42) Mouse ES cells (TT2F, X0) retaining a partial fragment of human chromosome 2 Of human chromosome retention in offspring of native chimeric mice
  • K2-1F and K2-4F both 100% coat color chimera ratio were examined to determine whether ES cell-derived progeny would be born by mating with male ICR mice.
  • TT2F cells wild color: dominant
  • TT2F cells wild color: dominant
  • ICR male mice albino, recessive mice
  • ICR-derived eggs produce white offspring.
  • TT2 cells have a (40, XY) chromosome structure, they may have differentiated into functional spermatozoa in male chimera K2-18. In that case, wild-colored offspring will be born from eggs derived from ICR (white: recessive) fertilized by sperm from TT2 cells (wild-color, dominant) in the chimeric mice.
  • Example 44 Detection and Quantification of Human Antibody / c Chain in Serum of Chimeric Mouse Progeny Progeny Serum of Chimeric Mouse Progeny K2-1F-1 to 10 and K2-4F-1 to 5
  • the human antibody / chain concentration was determined by ELISA. Blood was collected from mice about 4 to 6 weeks old after birth, and the human antibody / c chain in the serum was detected by ELISA in the same manner as in (Example 20). The results are shown in Table 18 together with the results of chromosome retention obtained in (Example 42). It was confirmed that the human antibody / c chain gene functions also in offspring born from Chimera mice.
  • Example 45 Analysis of chimeric mouse spleen cells transfected with a partial fragment of human chromosome 14 Analysis by flow cytometry followed the method described in the following literature. Japanese Society of Biochemistry, New Chemistry Laboratory 12 Molecular Immunology I-Immune Cell Site Cykine 1989, Tokyo Kagaku Dojin; Cancer Therapy Research Division, Institute of Medical Science, The University of Tokyo, Special Edition of Cell Engineering 8 New Cell Engineering Protocol 1991, Shujunsha; A. Doyle and JB Griffiths, "Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures", published by John Wiley & Sons td., 1996.
  • a spleen was taken out of a 6-month-old chimeric mouse (KPG06; PG16-derived, chimera rate 30%) obtained in (Example 19), and treated with an aqueous solution of ammonium chloride.
  • the cells were stained with fluorescein isothiosinate (FITC) -labeled anti-mouse CD45R (B220) antibody (Pharmindin, 01124A) in PBS containing 1% serum.
  • FITC fluorescein isothiosinate
  • Chimeric mouse K15A (derived from strain 1-4, Example 10) which was confirmed to express human antibody heavy chain, heavy chain, and small chain in Examples 29, 23, and 32, respectively.
  • spleen-derived cDNA obtained from non-chimeric mouse ICR was used as a negative control. Primers not described in the references were prepared based on base sequences obtained from databases such as Genbank.
  • HIGMEX1-2 5'-CCAAGCTTCAGGAGAAAGTGATGGAGTC (SEQ ID NO: 53)
  • H IGMEX1-1 5'-CCAAGCTTAGGCAGCCAACGGCCACGCT (used for 2nd PCR of VH3BACK) (SEQ ID NO: 54)
  • VH1 / 5BACK (59 ° C, 35cycles, Marks et al., Eur. J. Immnol., 21, 985-, 1991)
  • VH4BACK (59.C, 35cycles, Marks et al., Supra)
  • VH3BACK Is tPCR: 59 ° C, 35cycles
  • 2ndPCR 59 ° C, 35cycles, Marks et al., Supra
  • Vkl / 4BACK 55 ° C, 40cycles, Marks et al., Eur. J. I recitation nol., 21, 985-, 1991
  • Vk2BACK 55 ° C, 40cycles, Marks et al., Supra
  • Vk3BACK 55. C
  • IGL1-CR 5'-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTGATCAG (SEQ ID NO: 56)
  • IGL2-CR 5'-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG (SEQ ID NO: 57)
  • IGL7-CR 5'-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG (SEQ ID NO: 58)
  • variable region VA 1LEA1 (55 ° C, 40 cycles, Williams et al., Eur. J. Immunol., 23, 1456-, 1993), VA2MIX (55 ° C, 40 cycles, Wi V iams et al. ⁇ 2LBA1, V 2JLEAD mixed in equimolar ratio), V; i3MIX (55 ° C, 40 cycle s, 31 ⁇ 81, V ⁇ 3JLEAD, V ⁇ 3BACK4 mixed in equimolar ratio)
  • HIGMEX1-2 (2nd PCR, HIGMEX1) x VH3BACK: 5 clones
  • each nucleotide sequence was converted to a one-letter amino acid sequence using DNASIS. Only the CDR3 region is shown in the table. On the right side of the table, the names of the primers used for cloning each variable region and the names of the clones are described.
  • Mouse antibody gene (heavy chain, light chain / c) was disrupted to TT2 (or TT2F) cells. Marked human # 2 (Example 18) or chromosome 22
  • Example 35 can be introduced.
  • mouse antibody gene (heavy chain, light chain / c) gene transfected with human chromosome 14 + 2 or human chromosome 14 + 22, gene disruption (2) (or TT2F) ES cells + c chain: Example 19, heavy chain + chain: chimeric mice prepared by the method of Example 36) are expected to produce antibodies mainly derived from human heavy and light chains.
  • the abbreviations and the like of the restriction enzymes in FIGS. 23 to 27 shown below are as follows.
  • Kp KpnK B: BamHK RI: EcoRI, RV: EcoRV, N: Notl, SII: Sea II, Sea: Seal, Sfi: Sfil, Sm: SmaK X: Xhol, SI: SalK dKp: deletion of Kpnl, (X): Xhol cleavage site from lambda vector.
  • Cre recombinase (Sauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA) was inserted at both ends of the G418 resistance gene (Example 1) to remove the G418 resistance gene. , 85, 5166-, 1988), the LoxP sequence (Sauer et al., Supra), must be inserted in the same orientation.
  • Plasmid DNA pBS246 containing the LoxP sequence (Plasmid pBS246, 1 ⁇ 2 Cassette Vector, US Patent 4959317) was purchased from GIBCO BRL.
  • An Xhol recognition sequence was obtained by inserting Xhol linker DNA into the EcoRI and Spel cleavage sites of this plasmid.
  • the pstNEO DNA fragment was inserted into the EcoRV cleavage site of the modified PBS246 to obtain a plasmid LoxP-pstNE0 (FIG. 23).
  • TT2 (or TT2F) cells are derived from F1 mice of C57BL / 6 and CBA mice, it is necessary to construct antibody gene knockout vectors using genomic DNA clones derived from C57BL / 6 mice. did.
  • a genomic DNA library a lambda DNA library derived from Clontech's adul t C57BL / 6N male iver was used. The following synthetic DNA sequence (60 mer) was used as a probe for screening. Heavy chain Cz probe: 5'-ACC TTC ATC GTC CTC TTC CTC CTG AGC CTC TTC TAC AGC ACC ACC GTC ACC CTG TTC AAG-3 '(SEQ ID NO: 59)
  • the isolated lambda clone was analyzed, and the DNA fragment containing the heavy chain C or the light chain J-C / c was subcloned into pBluescript SKI K +) plasmid (Stratagene) (heavy chain C: Fig. 24; Light chain J / C-C /: Fig. 25).
  • a targeting vector for disrupting the mouse antibody gene in TT2 (or TT2F) ES cells was prepared as follows.
  • Step 2 In the region encoding Cz of the genomic DNA containing the constant region of the mouse antibody heavy chain prepared in Step 2, a DNA fragment (BamHI to XhoI) containing the second to fourth exons was prepared in Step 1 for LoxP- It was replaced with the ps tNEO gene (Fig. 26). The transcription direction of ps tNEO is opposite to the transcription direction of the antibody gene.
  • This plasmid DNA was amplified using Escherichia coli JM109 and purified by cesium chloride equilibrium centrifugation (Introduction to cell engineering experiments, published by Kodansha in 1992).
  • the purified plasmid DNA was cut at a site with a restriction enzyme Sacl and used for transfection into TT2 (or TT2F) ES cells.
  • TT2 or TT2F
  • a DNA fragment (about 500 base pairs) of the switch region upstream of C ⁇ was used. This DNA fragment was obtained by PCR-amplifying 129 mouse genomic DNA under the following conditions.
  • Sense primer 5'-CTG GGG TGA GCC GGA TGT TTT G-3, (SEQ ID NO: 61)
  • Antisense primer 5, -CCA ACC CAG CTC AGC CCA GTT C-3 '(SEQ ID NO: 62)
  • Template DNA EcoRl digested 129 mouse genome
  • reaction buffer deoxynucleotide mix, and Taq DNA polymerase used were manufactured by Takara.
  • Reaction conditions 94 ° C, 3 minutes, 1 time ⁇ 94 ° C, 1 minute; 55 ° C, 2 minutes; 72 ° C, 2 minutes; 3 times
  • a DNA fragment (EcoR I to SacI I) containing the J region (J1 to J5) of genomic DNA containing the mouse antibody light chain / c J region and constant region prepared in 2 was prepared in 1 and oxP-pstNE 0 The gene was replaced (Fig. 27).
  • the transcription direction of ps tNEO is the same as the transcription direction of the antibody gene.
  • This plasmid DNA was amplified using Escherichia coli JM109 and purified by cesium chloride equilibrium centrifugation. The purified plasmid DNA was cut at one site with the restriction enzyme Kpnl and used for transfection into ⁇ 2 (or TT2F) ES cells.
  • Genomic DNA of TT2 (or TT2F) ES cells transformed with the targeting vector is digested with restriction enzymes EcoRI and Notl, separated by agarose gel electrophoresis, subjected to Southern blotting, and detected with the above probe.
  • TT2 or TT2F
  • the antibody heavy chain targeting vector prepared in (Example 48) -3 was linearized with the restriction enzyme SacI I (Takara Shuzo), and then (Shinichi Aizawa, Bio Manual Series 8 Gene targeting, Yodosha, 1995) and transfected into mouse ES cell TT2F.
  • TT2F cells are trypsinized, suspended in HBS to a concentration of 2.5 x 10 7 cells / ml, 5 jt gDNA is added, and electroporation is performed using a Gene Pulser (biorad, without connecting a resistor unit). Done.
  • a voltage of 250 V with a capacity of 96 0 // F was applied at room temperature using an electroporation cell with a length of 4 rows.
  • the cells subjected to the electoral poration were suspended in 20 ml of ES medium, and seeded on two 100 mm tissue culture plastic dishes (coiling) preliminarily seeded with feeder cells. Similarly, experiments using 10, 15 z gDNA were performed. One day later, the medium was replaced with a medium containing 300 / g / ml G418 (GENETICIN, Sigma).
  • Chimeric individuals are judged by whether or not wild color (dark brown) derived from TT2F cells is found in white from the host embryo (ICR) in coat color. Out of the 22 births, 18 had an apparent wild-colored coat color, that is, 18 individuals contributed to ES cells. Of these, 16 were female chimeric mice (derived from ES cells) with a coat color of more than 80! 3 ⁇ 4. From these results, it was confirmed that the antibody heavy chain homologous recombinant ES cell line # 131 retains chimera-forming ability. Since many of the chimeric mice obtained are females that make a very high contribution, it is highly possible that the ES cells have differentiated into functional germ cells (eggs). 1003 ⁇ 4 out of chimeric mice!
  • the cells were cultured for 10 days in ES medium containing 10, 15, and 20 mg / ml G418 (GENET IC IN, Sigma), respectively. As a result, clear colonies were observed up to a concentration of 3 mg / ml, but no colony formation was observed at 5 mg / ml. Based on this result, the minimum lethal concentration The concentration was determined to be 5 mg / ml, and high-concentration G418-resistant strains were selected at concentrations of 4, 5, 6, 7, and 8 mg / ml. Approximately 10 6 cells were seeded per 10 plates in a total of 100 plates for each of # 131 and # 141, and cultured in ES medium containing G418 at the above concentrations (5 stages, 2 plates at each concentration) did.
  • the G418-resistant marker gene of the antibody heavy chain bilateral allele-disrupted strain (high-concentration G418-resistant strain # 131-3) obtained in (Example 51) was removed by the following procedure.
  • # 131-3 cells were trypsinized, suspended in HBS to 2.5 x 10 7 ml, added with 30 ⁇ g of PBS 185 DNA, and added to Gene Pulser (BioRad, without connecting resistor unit)
  • the electroporation cell was c- 960 ⁇ F with a voltage of 250V and a 4imn long electroporation cell (Example 1).
  • the cells that had been subjected to the electroporation were suspended in 5 ml of ES medium, and seeded on a 60 mm tissue culture plastic dish (Corning) previously seeded with feeder cells.
  • G418-sensitive strains were grown to confluence in a 35M1 Petri dish, and 4/5 of the strain was suspended in 0.5 ml of a storage medium (ES medium + 10 MS0 Sigma) at -80 ° C. Stored frozen. The remaining 1/5 was seeded on a 12-well gelatin-coated plate, cultured for 2 days, and genomic DNA was obtained by the method described in (Example 2).
  • the G418-sensitive TT2F cell line genomic DNA is digested with the restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo), separated by agarose gel electrophoresis, and subjected to Southern blotting. ) Confirmed the removal of the G418 resistance gene.
  • the mouse ES cell line (derived from TT2F, G418 sensitive) lacking the endogenous antibody heavy chain obtained in (Example 52) was marked with the G418 resistance gene as shown in (Example 9).
  • the transfected human chromosome 14 (including the antibody heavy chain gene) is introduced by the microcell method.
  • retention of human chromosome 14 (fragment) containing the human antibody heavy chain gene is confirmed by PCR analysis and the like (Example 9).
  • the antibody heavy chain-deficient mouse ES cell line (G418 resistant) carrying the human chromosome 14 fragment obtained in (Example 53) was marked with the puromycin resistance gene as shown in (Examples 18 and 35).
  • the human chromosome 2 fragment (containing the antibody light chain gene) or human chromosome 22 (the antibody light chain; containing the I gene) is introduced by the microcell method.
  • retention of human chromosome 14 (fragment) and chromosome 2 fragment or chromosome 22 (fragment) was confirmed by PCR analysis (Examples 18, 35). Is done.
  • a chimeric mouse was prepared from an endogenous antibody heavy chain gene-deficient mouse ES cell line that retains chromosome 14 (fragment) containing the human antibody heavy chain gene obtained in (Example 53) (Example 10). This is performed by the method shown in FIG. In the chimeric mouse obtained here, the heavy chain of the human antibody produced in the B cell derived from the ES cell line is detected by the method described in (Example 14). In addition, since the antibody heavy chain gene functional in the ES cell-derived B cells is only derived from the human on the transchromosome, most ES cell line-derived B cells produce human antibody heavy chains.
  • a chimeric mouse was prepared from an endogenous antibody heavy chain gene-deficient mouse ES cell line carrying the chromosomes 14 + 2 and 14 + 22 obtained from (Example 54) (Example 19). , 36) etc.
  • the human antibody heavy chain and light chain / c or light chain ⁇ are detected in the B cells derived from the ES cell line by the method shown in (Examples 14, 23, 32).
  • the antibody heavy chain gene functional in the ES cell-derived ⁇ cells was derived from a human on the transchromosome. Most ES cell-derived B cells produce human antibody heavy chains.
  • the antibody light chain targeting vector prepared in (Example 48-4) was linearized with the restriction enzyme Kpnl (Takara Shuzo), and the method was followed (Shinichi Aizawa, Bio Manual Series 8, Gene Targeting, Yodosha, 1995).
  • the TT2F cell lines pick colonies arising after c 7 to 9 days to introduce into (G418 sensitive), to obtain the freezing store, genomic DNA by the method shown in example 49.
  • G418-resistant genomic DNA was converted to restriction enzymes EcoRI and Notl
  • Example 48-4 After digestion with Takara Shuzo, separation by agarose gel electrophoresis, Southern blot analysis is performed, and homologous recombinants are detected with the probe shown in Example 48-4.
  • strains in which both alleles of the light chain are disrupted are obtained by the following procedure.
  • a high-concentration G418-resistant strain is obtained in the same manner as in (Example 51), and cryopreserved and DNA obtained.
  • the high-concentration G418-resistant strain genomic DNA was digested with restriction enzymes EcoRI and Notl (Takara Shuzo), separated by agarose gel electrophoresis, and subjected to Southern blotting. The probes shown in (Example 48-4) Detect destroyed strains.
  • the G418 resistance marker gene of the antibody light chain bilateral allele-disrupted strain (high-concentration G418-resistant strain) obtained in (Example 59) is removed by the procedure shown in (Example 52).
  • An expression vector pBS185 (BRL) containing a Cre recombinase gene that causes site-specific recombination between the loxP sequences inserted on both sides of the G418 resistance marker gene (Example 48-1) was prepared according to the method of Example 52. Introduce into the above strains.
  • G418-sensitive strains obtained in the same manner as in (Example 52) were grown in a 35-dish petri dish until confluent, and 4/5 thereof was 0.5 ml of a preservation medium (ES medium +10 +! DMS (K Sigma)) The remaining 1/5 is seeded on a 12-well gelatin plate, cultured for 2 days, and the genomic DNA is recovered by the method described in (Example 2).
  • These G418-sensitive TT2F cell genomic DNAs are digested with the restriction enzyme EcoR I (Takara Shuzo), separated by agarose gel electrophoresis, and subjected to Southern blotting.
  • the 3.2 kb Xho I fragment derived from pSTneoB containing the G418 resistance gene is used as a probe. Confirm the removal of the G418 resistance gene.
  • the G418-resistant gene was expressed as shown in (Example 9).
  • the human chromosome 14 (including the human antibody heavy chain gene) marked by the above method is introduced by the microcell method.
  • retention of human chromosome 14 (fragment) containing the human antibody heavy chain gene is confirmed by PCR analysis and the like (Example 9).
  • the mouse ES cell line (TT2F-derived, G418-resistant) lacking the endogenous antibody heavy and light chains and retaining human chromosome 14 obtained in (Example 61) was used.
  • a partial fragment of human chromosome 2 (including the human antibody light chain gene) marked with the puromycin resistance gene is introduced by the microcell method.
  • retention of chromosome 14 (fragment) of human and chromosome 2 fragment is confirmed by PCR analysis and the like (Example 18).
  • Example 63 Introduction of human chromosome 22 (light chain; I) into an ES cell line lacking antibody heavy and light chains and carrying human chromosome 14 (antibody heavy chain)
  • a mouse ES cell line (TT2F-derived, G418-resistant) lacking the endogenous antibody heavy and light chains and retaining human chromosome 14 obtained in (Example 61)
  • the human chromosome 22 (including the human antibody light chain gene) marked with the puromycin resistance gene is introduced by the microcell method.
  • retention of human chromosome 14 (fragment) and chromosome 22 (fragment) is confirmed by PCR analysis and the like (Example 35).
  • human chromosome 2 or chromosome 22 was blasticidin-resistant (Izumi et al., Exp. Cell Res., 197, 229, 1991), and marker by insertion of a marker gene such as hygromycin resistance (Wind et al., Cell, 82, 321-, 1995). This is performed by the method described in (Examples 16 and 26).
  • a mouse ES cell line (derived from TT 2F, G418 resistant) which is deficient in the endogenous antibody heavy chain and light chain, and retains human chromosome 14 (fragment) and a partial fragment of chromosome 2 obtained in (Example 62).
  • chromosome 22 (including human antibody light chain; I gene) marked with blasticidin resistance or hygromycin resistance in the same manner as described in (Example 9).
  • I do. Use feeder cells suitable for each selection marker for ES cell culture. When a hygromycin resistance marker is used, primary cultured fibroblasts obtained from a transgenic mouse strain that retains and expresses the marker (Johnson et al., Nuclear Acids Research, vol. 23, No. 7, 1273-, 1995). The obtained G418, puromycin, hygromycin (or blasticidin) triple resistant strains were confirmed to have the above three types of human chromosomes (fragments) by PCR analysis (Examples 9, 18, 35). You. A mouse ES cell line lacking the endogenous antibody heavy chain and light chain obtained in (Example 63), and having a human chromosome 14 (fragment) and a chromosome 22 partial fragment
  • Example 65 Chimeric mouse from endogenous antibody heavy and light chain gene-deficient mouse ES cells retaining chromosome (fragment) containing human antibody gene (heavy chain + light chain)
  • mice Generation of chimeric mice from a mouse ES cell line deficient in endogenous antibody heavy and light chain genes retaining the chromosome (fragment) containing the human antibody gene obtained in (Examples 61, 62, 63, 64) Example 10) Performed by the method shown in etc.
  • mouse antibodies produced by B cells derived from the host embryo and human antibodies produced mainly by B cells derived from the ES cell line were obtained (Examples 14, 23, 32). It is detected by the method indicated by.
  • the functional antibody heavy chain and light chain / c gene in B cells derived from ES cells are only derived from humans on the transchromosome, most B cells derived from ES cells are human antibody heavy chains.
  • Example 66 Endogenous antibody heavy chain and light chain gene-deficient mouse retaining a chromosome (fragment) containing a human antibody gene (heavy chain + light chain) Mouse Antibody-producing hybrid from ES cell-derived chimeric mouse Dorma acquisition
  • the chimeric mouse obtained in (Example 65) is immunized with the target antigen in the same manner as in (Example 25), the spleen is removed, and the cell is fused with myeloma cells to produce a hybridoma. After culturing for 1 to 3 weeks, the culture supernatant is analyzed by ELISA.
  • the ELISA method (Example 65)
  • Endogenous antibody heavy and light chain deficient and human chromosomes 14 + 2 or 14 + 22 or 14 + 2 + 22 obtained in this system (Examples 62, 63, 64)
  • a chimeric mouse is prepared using the mouse ES cell line retaining (fragment) by the method shown in (Example 10) and the like.
  • the human antibody heavy chain (on chromosome 14), light chain / c (on chromosome 2), light chain; I (on chromosome 22) genes functional in ES cell-derived B cells It produces antibodies consisting mainly of human heavy and light chains.
  • Human chromosome 14 obtained using the same method as in (Example 9) and the method of replacing mouse ES cells in (Example 9) with TT2F (39, X0, Example 39) was used.
  • the chimeric mouse and wild-type ICR mouse (Albino, CLEA Japan) are mixed and crossed.
  • the retention of human chromosome 14 fragments is examined by PCR for genomic DNA prepared from the tail of a born wild-colored offspring mouse (see Examples 9, 42, and 43).
  • Human chromosome 14 (fragment) can be transmitted. That is, it is possible to establish a subcultureable mouse strain that retains chromosome 14 (fragment) containing the human antibody heavy chain gene.
  • human chromosome 14 (fragment) contains the human antibody heavy chain gene
  • human chromosome 2 (fragment) contains the human antibody / c chain gene
  • human 22 Chromosome No. (fragment) refers to one containing the human antibody ⁇ chain gene.
  • Example 69 Transfection of human chromosome 22 (fragment) Retention of human chromosome in offspring of chimeric mice derived from ES cells Chimeric mice harboring human chromosome 22 (fragment) obtained using the same method as in (Example 30), and using the method in which mouse ES cells in (Example 30) are replaced with TT2F (39, X0) And ICR mice are mixed and crossed. Investigate the retention of human chromosome 22 fragments by PCR in genomic DNA prepared from the tail of a born wild-colored mouse.
  • the human chromosome 22 (fragment) can be transmitted to the offspring of the human. That is, it is possible to establish a passable mouse strain that retains chromosome 22 (fragment) containing the human antibody light chain ⁇ gene.
  • Example 70 Creation by crossing mouse individuals that simultaneously hold a human chromosome 2 fragment and a chromosome 14 (fragment)
  • a mouse strain carrying the human chromosome 2 fragment obtained in (Example 42) or (Example 43) and a mouse strain carrying the human chromosome 14 (fragment) obtained in (Example 68) are bred.
  • the genomic DNA prepared from the tail of the offspring born by performing the method is analyzed by the PCR method and the like (Examples 9, 42 and 43), and the human chromosome 2 partial fragment and the human chromosome 14 (fragment) are simultaneously analyzed. Obtain an individual to retain.
  • Genomic DNA prepared from the tail of the offspring mouse is analyzed by PCR and other methods (Examples 30, 42 and 43), and an individual that simultaneously retains human chromosome 22 (fragment) and human chromosome 14 (fragment) Get.
  • a mouse strain carrying the chromosome 2 (fragment) of human chromosome 2 obtained in (Example 70) and the chromosome 14 (fragment) of human and a fragment of chromosome 22 obtained from (Example 69) Similarly, by crossing with a mouse strain, a mouse individual simultaneously retaining three types of human chromosomes is obtained.
  • Example 73 Preparation by crossing mouse strains that mainly produce intact human antibodies No. 2 + 14 (Example 70), No. 14 + 22 (Example 71), No. 2 + 14 + No. 22 (Example 72)
  • the mouse strain retaining the chromosome was used for the endogenous antibody heavy chain (Example 67; Kitamura et al., Nature, 350, 423-, 1991), light chain / c (Zou et al., EBO J. Chen et al., EMBO J., 12, 821-, 1993).
  • mice carrying chromosomes # 2 or # 14 + 22 are selected by PCR analysis (Examples 9, 30, 42, 43) to establish a mouse strain that mainly produces complete humans (Green et al., Nature Genetics, 7, 13-, 1994,
  • Example 74 Obtaining a human antibody-producing hybridoma from a mouse strain having a human chromosome containing a human antibody gene obtained by crossing
  • an antigen of interest can be used for a mouse individual holding a human chromosome containing the human antibody gene obtained in (Examples 42, 43, 68, 69, 70, 71, 72, 73).
  • the spleen is removed, fused with myeloma cells, and cultured for 1-3 weeks to produce a hybridoma.
  • the culture supernatant is analyzed by ELISA.
  • the ELISA method was performed as described in (Examples 14, 15, 21, 22, 25, 33, 34. 37, 38), and human antibody positive and human antibody positive and immunized antigen-specific clones were obtained. obtain.
  • mice born in the method shown in (Example 40) from the mouse antibody heavy chain bilateral allele disrupted TT2F cell line (# 131-3) obtained in (Example 51) were 503 ⁇ 4 and 993 ⁇ 4, respectively.
  • Detection and quantification of mouse IgM in serum was performed for the three individuals. Blood was collected from chimeric mice about 2 weeks old after birth, and the mouse IgM concentration in the serum was quantified using the ELISA method of (Example 14).
  • Anti-mouse IgM antibody diluted with PBS (Kirkegaard & Pe rry Laboratories Inc., 01-18-03) was fixed, and then a serum sample diluted with PBS supplemented with 5BS was added.
  • mice derived from TT2F cells in which alleles of both sides of the mouse antibody heavy chain were disrupted those with a chimera ratio of 99% had low mouse IgM concentrations, confirming that the mouse heavy chain gene of ES cells hardly functions.
  • Table 20 Mouse IgM concentration in chimeric mice (ELISA) Chimera rate% IgM (mg / 1)
  • a chimeric non-human animal that retains one or more foreign chromosomes or fragments thereof and expresses a gene on the chromosome or fragment thereof.
  • the c the present invention capable of producing a biologically active substance, to hold a single or plurality of foreign chromosome or a fragment thereof, ⁇ color bodies or their Pluripotent cells expressing the gene on the fragment were provided.
  • the cells can be used to treat a genetic disease by bone marrow transplantation or the like.
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Description

明 細 書
キメラ動物およびその作製法 技術分野
本発明は、 キメラ非ヒ ト動物、 その作製法およびその利用法に関する。 本発明 のキメラ非ヒ ト動物を用いれば、 これまで不可能であった 1Mb (百万塩基対） 以 上の外来巨大 DNA断片を動物個体で保持発現させることが可能になる。 従つて、 これを利用することにより、
'生物学的に活性な物質をコードする遺伝子の全長、 例えば、 ヒ ト抗体遺伝子 全長を保持し、 発現する動物個体の作製が可能になる。 この動物から得られる生 物学的に活性な物質、 例えば、 ヒト型抗体は医薬品としての利用価値がある。
• ヒ 卜巨大遺伝子 （組織適合性抗原、 ジストロフィ ン等） の動物個体における 機能解析が可能になる。
• ヒ 卜優性遺伝病及び染色体異常症のモデル動物作製に利用できる。 背景技術
外来遺伝子を動物個体において発現させる技術、 すなわちトランスジェニック 動物作製技術は、 その遺伝子の生体内機能に関する情報を得るために有用なばか りでなく、 遺伝子発現を制御する DNA配列の同定 （例えば、 Magramら， Nature, 3 15 : 338， 1985) 、 ヒ ト疾患モデル動物の開発 （山村ら， マニュアル疾患モデルマ ウス， 中山書店； 1994) 、 さらには家畜の育種 （例えば、 Mul l erら， Exper i ent i a, 47 : 923, 1991) 、 それを用いた有用物質の生産に利用されてきた （例えば、 V e l anderら， P. N. A. S. , 89 : 12003, 1992) 。 遺伝子導入の対象としてはこれまで マウスが最も多く用いられてきた。 実験動物として詳細に研究され、 胚操作技術 も確立されているマウスはこの目的に最も適した哺乳動物であるといえる。
マウス個体への外来遺伝子導入法は大きく分けて 2つ知られている。 1っは受 精卵前核に DNAを注入する方法 （Gordonら， P. N. A. S. , 77 : 7380, 1980) であり、 もう一つは分化全能性を保持した胚幹細胞 （以下 ES細胞、 という） に DNAを導入 し、 キメラマウスを作製する方法 （Takahash iら， Deve l opmen t, 102 : 259, 1988) である。 後者の場合、 キメラマウスにおいては、 ES細胞の貢献した細胞、 組織に おいてのみ、 ES細胞由来の生殖細胞を経て得られる子孫においてはすべての細胞、 組織で導入遺伝子が保持される。 これらの技術を利用して現在までに数多くのト ランスジヱニックマウスが作製されてきた。
しカヽし、 現状では導入可能な DNAの大きさに限界があり、 それがこの技術の利 用範囲を大きく制限している。 その限界はクロ一ン化可能な DNAの大きさに依存 し、 これまで最も大きな DNA断片を導入した例の一つは、 酵母人工染色体 （YAC) にクローニングされた約 670kbの DNA断片である （Jakobovi tsら， Nature, 362:25 5, 1993) 。 この実験は、 YACを保持する酵母とマウス ES細胞を融合することによ り行なわれた。 YACにおいては、 約 2Mbまでの外来 DNAをクローニングできるとさ れているが (Den Dunnenら， Hum. Mol. Genet. , 1:19， 1992 ) 、 出芽酵母細胞中 では、 相同 DNA配列同士の組換え頻度が高いことが知られており、 反復配列を多 く有するヒ ト DNA断片を完全な形で安定に保持することが困難な場合がある。 事 実、 ヒ トゲノム DNAを含む YACライブラリ一では、 その 20〜40¾！が何らかの組換え を起こしている （Greenら， Genomics, 11:584, 1991) 。
もう 1つの方法として、 ヒ ト培養細胞から得られる中期染色体を顕微切断し、 その断片 （10Mb以上と推定される） をマウス受精卵に注入することが試みられた (Richaら， Science, 245:175, 1989) 。 この結果得られたマウス個体において ヒ ト特異的 DNA配列 （Alu 配列） が検出されたが、 ヒ ト遺伝子発現については確 認されていない。 また、 ここで用いられた染色体調製法では染色体をスライ ドグ ラスに固定する際、 酢酸メタノールを使用するために、 DNA自体が小さく断片化 してしまうことが避けられず、 注入した DNAが一続きの DNAとして存在している可 能性は低い。
いずれにせよ、 現在まで 1Mb以上の一続きの外来 DNA断片をマウス個体へ導入、 発現させた例はないといえる。
マウスに導入することが望まれる、 有用かつ興味深いヒ ト遺伝子：抗体 （例え ば、 Cookら， Nature Genetics, 7:162, 1994) 、 T細胞受容体 (Hoodら， Cold Sp ring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Vol. LVIII, 339, 1993 ) 、 組織適合性抗原 （Carrolら， P.N.A.S., 84:8535, 1987) 、 ジストロフィ ン （Den Dunnenら， 前記） 等は、 そのコード領域自体が 1Mbを越える大きさを持つことが知 られている。 とりわけ、 ヒ ト型抗体の医薬品としての重要性から、 ヒ トの免疫グ ロブリン重鎖 （：〜 1. 5Mb、 Cookら， 前記） 、 軽鎖/ c (：〜 3Mb、 Zachau, Gene, 13 5 : 167, 1993)、 軽鎖； I (〜1. 5Mb、 Fr i pp i a tら， Hum. Mo l . Gene t. , 4 : 983， 1995) の遺伝子全長を保持し、 発現するようなマウスの作製が望まれているがそれは現 状の技術では不可能である （日経バイオテク， 1993. 7. 5. ) 。
また、 ヒ 卜の優性遺伝疾患、 先天異常を引き起こす染色体異常症 （ダウン症等） の原因遺伝子の多くはクローン化されておらず、 染色体上の大まかな位置情報の み利用可能である。 例えば、 中期染色体をギムザ染色することによって得られる Gバンドは、 通常数 Mb〜： 10Mb以上の大きさを有している。 従って、 ある原因遺伝 子が特定の Gバンド上に存在することが明らかとなっても、 これらの異常形質を マウスに導入するためには、 原因遺伝子周辺の染色体断片 （数 Mb以上） を導入す ることが必要であるが、 これも現状の技術では不可能である。
ここに従来技術の限界である 1Mbを越える外来 DNAをマウス個体に導入し、 発現 させる技術の開発が望まれている。
動物培養細胞においては、 従来技術により上述の限界を越える大きさの DNAを 導入することが可能である。 これは主に、 染色体 （ヒ トの場合約 50〜300Mbの大 きさを持つ） を媒体として行なわれる。 細胞への染色体移入法はいくつか報告さ れているが （例えば、 McBr i deら， P. N. A. S.， 70 : 1258， 1973) 、 その中でも望み の染色体を 1本だけ導入する方法として最適と考えられているのがミクロセル法 である （Ko iら， Jpn. J. Cancer Res. , 80 : 413, 1989) 。 ミクロセルと呼ばれる 構造体は 1本〜数本の染色体が核膜、 形質膜に包まれたものである。 ある種の細 胞において紡垂体形成を阻害する薬剤により誘導されるミクロセルを分離し、 受 容細胞と融合することにより、 少数 （多くの場合は 1本） の染色体を導入するこ とが可能である。 この方法により得られた、 ヒ ト染色体を 1本だけ保持するモノ クロモソーム雑種細胞のライブラリーは既知遺伝子のマッビングや、 未知の癌抑 制遺伝子、 細胞老化遺伝子等の存在する染色体を特定するために利用されてきた (例えば、 Saxonら， EMBO J. , 5 : 3461， 1986 ) 。 さらに、 ミクロセルにガンマ 線を照射することにより、 染色体を断片化しその一部を導入することも可能であ る （Koiら， Sci ence, 260 : 361， 1993) 。 すなわち、 ミクロセル法は、 1Mb以上の DNAを動物培養細胞に導入する方法として適していると考えられる。
培養細胞からマウス個体を作り出すことができないかという期待は、 分化全能 性を安定に保持する ES細胞の発見 （Evansら， Nature, 292 : 154, 1981) により確 実に現実のものとなった。 この ES細胞には外来遺伝子、 種々の突然変異、 さらに は、 標的遺伝子組換えによる変異が導入可能となり、 マウス個体レベルの遺伝的 改変が自在に行なえるようになった （例えば、 Mansourら， Nature, 336 : 348, 19 88) 。 一方、 巨大 DNAの導入という意味では前述の YACベクターにクロ一ニング可 能な外来 DNA断片の大きさが限界と考えられてきた。 その大きさを越える DNAを培 養細胞に導入可能な染色体移入という従来技術がマゥス個体レベルへの遺伝子導 入に利用されたことはなく、 またその達成は困難であると考えられてきた （村松 ら， トランスジエニックバイオロジー， 講談社サイェンティフイク， pl43- , 198 9) 。
理由としては、 以下のようなものが挙げられる。
•受容細胞を正常核型のマウス ES細胞としてこれにヒ ト染色体導入を行なう場 合、 それは染色体異常そのものを導入することである。 これまで、 顕微鏡によつ て識別可能な染色体レベルの大きな遺伝子異常はマウスの発生にとって多くの場 合致死的であると考えられてきた （Groppら， J. Exp. Zool.， 228 : 253， 1983 ; 相 沢慎一， バイオマニュアルシリーズ 8 ジーンタ一ゲティング， 羊土社， 1995)
•我々が得ることのできるヒ ト染色体は通常、 有限増殖の正常繊維芽細胞、 あ るいは癌細胞等の分化した体細胞のものであり、 そのような体細胞由来の染色体 が未分化な ES細胞に導入された場合、 ES細胞を分化させたり （Mul l erら， Nature, 311 : 438， 1984) 、 老化させてしまうのではないか （Sugawara, Sci ence, 247 : 70 7， 1990) と考えられた。
•体細胞由来の染色体が初期胚に導入された場合、 胚発生過程で生殖細胞由来 のそれと同様に正しく機能し、 多様な組織、 細胞における特異的遺伝子発現を担 うことができるかという問題についての研究は非常に少ない。 この 2者における 大きな違いの一つは染色体 DNAのメチル化状態と想像される。 これは細胞の分化 に伴って変化し、 組織特異的な遺伝子発現における重要な役割が示唆されている (Ceder, Ce l l, 53 : 3, 1988) 。 例えば、 抗体遺伝子の活性化に不可欠な部位特 異的 DNA組換え反応について、 メチル化した基質を B細胞に導入した場合、 メチル 化の状態は複製後も保持され、 組換え反応を阻害するという報告がある （Hs i eh ら， EMBO J. , 11 : 315, 1992) 。 また、 株化された細胞中では生体内と比較して、 de novoのメチル化が起こりやすいとされている （Antequeraら， Ce l l, 62 : 503, 1990) 。 よってこれまでの研究から、 繊維芽細胞や、 ヒ トーマウス雑種細胞のお そらく高度にメチル化されているであろう抗体遺伝子がマウスの B細胞で正常に 発現すると想像することは容易ではなかった。
ここで、 関連するものとして I Umenseeらの 2つの報告 （P. N. A. S.， 75 ; 1914， 1 978 ; P. N. A. S.， 76 : 879, 1979 ) に注目しなければならない。 1っはヒ ト肉腫細 胞とマウス EC細胞、 もう 1つはラッ ト肝癌細胞とマウス EC細胞の全細胞融合によ り得られた融合株からキメラマウスを作製したという報告である。 これらの報告 においてはその実験結果に数多くの疑問点が指摘され、 その信憑性は低いと考え られている （野口ら， マウスのテラ トーマ， 理工学社， 5節， 1987) 。 また、 1 日も早い追試が望まれていたにも関わらず、 報告から 17年を経た現在までこの実 験を再現できたという報告は存在しない。 従って、 これらの報告によっては、 マ ウス個体において外来染色体を保持させ、 該染色体上の遺伝子を発現させ得たと いうことはできないと考えられてきた。
こうした状況において、 染色体断片ほどの巨大 DNAをマウスをはじめとする動 物個体に導入し、 発現させることは困難とされ、 実際この問題について検討がな されたことは上記の l l lmenseeらの報告以来ない。
従って、 本発明は、 外来染色体またはその断片を保持し、 該染色体またはその 断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ ト動物およびその子孫、 並びに前記のキメ ラ非ヒ ト動物の作製法を提供することを目的とする。
また、 本発明は、 前記のキメラ非ヒ ト動物およびその子孫に由来する組織およ び細胞を提供することを目的とする。
さらに、 本発明は、 前記のキメラ非ヒ ト動物およびその子孫に由来する細胞と ミエローマ細胞との融合により作製されたハイプリ ドーマを提供することも目的 とする。 さらにまた、 本発明は、 非ヒ ト動物の個体、 組織または細胞を用いて、 外来染 色体またはその断片上の遺伝子の発現産物である生物学的に活性な物質を製造す る方法を提供することを目的とする。
発明の開示
発明者は前記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、 ヒ ト正常繊維芽 細胞由来染色体あるいはその部分断片をミクロセル法によりマウス ES細胞に導入 し、 それを安定に保持する株を得ることに成功した。 さらにこの ES細胞株から、 その正常組織においてヒ ト染色体を保持し、 ヒ ト抗体重鎖遺伝子を含む複数のヒ ト遣伝子を発現するキメラマウスを得た。 我々はこの一連の方法により、 これま で不可能であった巨大 DNA断片の個体における保持、 及び該 DNA 断片上の遺伝子 の発現を可能にした。
本発明の要旨は以下の通りである。
(1)単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、 該 ミクロセルとの融合により、 分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数の 外来染色体あるいはその断片を移入させることを特徴とする、 キメラ非ヒ ト動物 の作製法。
(2)単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、 該 ミクロセルとの融合により、 分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数の 外来染色体あるいはその断片を移人させることを特徵とする、 単一または複数の 外来染色体あるいはその断片を含む分化多能性を保持する細胞の作製法。
(3)前記 (1)の方法により作製することができ、 単一または複数の外来染色体あるい はその断片を保持し、 該染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非 ヒ ト動物、 および前記の単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するその子孫。
(4)前記 (2)の方法により作製することができ、 単一または複数の外来染色体あるい はその断片を含む分化多能性を保持する細胞。
(5)キメラ非ヒ ト動物を作製するための前記 (4)の分化多能性を保持する細胞の使用 c
(6)前記 (3)のキメラ非ヒ ト動物またはその子孫の交配により得られる、 単一または 複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該染色体あるいはその断片上の遺 伝子を発現する非ヒ ト動物およびその子孫。
(7)前記 (3)のキメラ非ヒ ト動物もしくはその子孫または前記 (6)の非ヒ ト動物もしく はその子孫に由来する組織。
(8)前記 (3)のキメラ非ヒ ト動物もしくはその子孫または前記 (6)の非ヒ ト動物もしく はその子孫に由来する細胞。
(9)前記 (8)の細胞とミエローマ細胞との融合により作製されたハイプリ ドーマ。
(10)前記 (3)のキメラ非ヒ ト動物もしくはその子孫または前記 (6)の非ヒ ト動物もしく はその子孫を、 前記の染色体あるいはその断片上の遺伝子と同じあるいは相同の 遺伝子が欠損している系統の非ヒ ト動物と交配させることにより作製された非ヒ ト動物およびその子孫。
(11)前記 (3)のキメラ非ヒ ト動物もしくはその子孫または前記 (6)の非ヒ ト動物もしく はその子孫の個体、 組織または細胞において、 単一または複数の外来染色体ある いはその断片上の遺伝子を発現させ、 その産物としての生物学的に活性な物質を 回収することを特徴とする、 生物学的に活性な物質の製造法。
(12前記 (3)のキメラ非ヒ ト動物もしくはその子孫または前記 (6)の非ヒ ト動物もしく はその子孫を、 前記の染色体あるいはその断片上の遺伝子と同じあるいは相同の 遺伝子が欠損している系統の非ヒ ト動物と交配させ、 誕生した子動物の個体、 組 織または細胞において、 前記の単一または複数の外来染色体あるいはその断片上 の遺伝子を発現させ、 その産物としての生物学的に活性な物質を回収することを 特徴とする、 生物学的に活性な物質の製造法。 図面の簡単な説明
第 1図は、 ヒ 卜 2番染色体 （断片） を保持する A9細胞の解析 （PCR解析） の結 果が示されている。
第 2図は、 E 14耐性株においてヒ ト 22番染色体 （断片） が保持されていること が示されている （PCR解析） 。
第 3図は、 22番染色体導入 ES細胞由来キメラマウスにおいてヒ ト L1配列が保持 されていることを示す電気泳動写真である （サザン解析） 。 第 4図は、 ヒ ト 22番染色体導入キメラマウス臓器におけるヒ ト染色体の保持の 様子を示す電気泳動写真である （PCR解析） 。
第 5図は、 ヒ ト 22番染色体導入キメラマウスにおけるヒ ト遺伝子発現 （RT- PCR) の結果を示す電気泳動写真である。
第 6図は、 ヒ ト 22番染色体導入キメラマウス臓器におけるヒ 卜遺伝子発現 （RT -PCR) の結果を示す電気泳動写真である。
第 7図は、 E14耐性株においてヒ ト 4番染色体 （断片） が保持されていること が示されている （PCR解析） 。
第 8図は、 ヒ ト 4番染色体導入 E14細胞株におけるヒ ト L1配列の検出 （サザン 解析） の結果を示す電気泳動写真である。
第 9図は、 ヒ ト 4番染色体導入 ES細胞由来キメラマウスにおいてヒ ト L1配列が 保持されていることを示す電気泳動写真である （サザン解析） 。
第 10図は、 TT2耐性株においてヒ 卜 14番染色体 （断片） が保持されていること が示されている （PCR解析） 。
第 11図は、 ヒ ト 14番染色体導入 ES細胞由来キメラマウス臓器におけるヒ ト染色 体の保持の様子を示す電気泳動写真である （PCR解析） 。
第 12図は、 尻尾由来繊維芽細胞 G418耐性テス卜の結果が示されている。
第 13図は、 ヒ ト血清アルブミン免疫キメラマウス血清中のヒ ト抗体 IgM濃度 （ ELISA) が示されている。
第 14図は、 ヒ ト血清アルブミ ン免疫キメラマウス血清中のヒ ト抗体 IgG濃度 （ ELISA) が示されている。
第 15図は、 ヒ ト IgM産生ハイプリ ドーマクローン H4B7の解析 （EL ISA) の結果 が示されている。
第 16図は、 ヒ ト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞株 （TT2細胞株 PG15) の F ISH解析の結果を示す染色体の形態の写真である。 第 17図は、 ヒ ト血清アルブミ ン免疫キメラマウス血清中の抗ヒ ト血清アルブミ ンヒ ト IgG抗体価の増加が示されている。
第 18図は、 ヒ ト血清アルブミン免疫キメラマウス血清中の抗ヒ ト血清アルブミ ンヒ ト Ig 抗体価の増加が示されている。 第 19図は、 ヒ ト 22番染色体導入 TT2細胞株におけるヒ ト L1配列の検出 （サザン 解析） の結果を示す電気泳動写真である。
第 20図は、 ヒ ト血清アルブミン免疫キメラマウス血清中の抗ヒ ト血清アルブミ ンヒ ト 抗体価の増加が示されている。
第 21図は、 ヒ ト 2番染色体部分断片導入キメラマウスの子孫においてヒ ト 2番 染色体部分断片が保持されていることが示されている （PCR解析） 。
第 22図は、 ヒ ト 14番染色体導入キメラマウス脾臓において細胞表面にヒ ト 鎖 が発現している細胞の存在を示している （フローサイ トメ トリ一解析） 。
第 23図は、 LoxP-ps tNEOプラスミ ド DNA の構造を示している。
第 24図は、 マウス抗体重鎖 C のゲノム DNAの構造を示している。
第 25図は、 マウス抗体軽鎖 /cのゲノム DNAの構造を示している。
第 26図は、 マウス抗体重鎖ターゲッティングベクター及び、 サザンプロッ ト用 プローブの構造と相同組換え体で検出されるべき DNA断片について示している。 第 27図は、 マウス抗体軽鎖 /cターゲッティ ングベクター及び、 サザンブロッ ト 用プローブの構造と相同組換え体で検出されるべき DNA断片について示している。 第 28図は、 マウス抗体重鎖相同組換え体及び相同組換え体由来高濃度 G418耐性 株のサザン解析の結果を示す電気泳動写真である。 発明を実施するための最良の形態
ヒ 卜染色体またはその断片を保持し、 該染色体またはその断片上の遺伝子を発 現するマウス個体は、
(1) 標識されたヒ ト染色体またはその断片を保持する染色体供与細胞の作製
(2) 分化多能性を保持するマウス細胞へのミクロセル法によるヒ ト染色体また はその断片の移入
(3) 上記マウス細胞を用いたキメラマウスの作製
(4) キメラマウスにおけるヒ ト染色体保持及び、 ヒ ト遺伝子発現確認
の過程を経ることにより得ることができる。 なお、 ここでは、 ヒ ト染色体または その断片を保持し、 該染色体またはその断片上の遺伝子を発現する非ヒ ト動物と して、 マウスを例にとった （以下、 このマウスを 「ヒ ト染色体導入マウス」 と称 する。 ） 。
ここでヒ ト染色体とは、 ヒ ト細胞由来の天然の DNAと蛋白質の複合体のことを 指す。 正常なヒ ト染色体は 23種 （雄は 24種） 46本存在し、 それぞれ約 50〜300Mb の長さの DNAを含むとされるが、 本発明においては独立染色体として安定に複製、 分配が可能な部分断片、 およびマウス染色体上に転座し、 安定に保持されている 部分断片も含まれる。 その DNAの大きさは通常 1Mb以上だが、 それ以下の場合もあ る。 本発明の特徴は大腸菌、 酵母等でのクロ一ニングあるいは細胞からの DNA抽 出処理等を行なわず、 染色体そのものを媒体としてマウス個体でヒ ト遺伝子を保 持、 発現させることにある。
また、 ヒ ト染色体導入マウスとは、 その正常体細胞の全てまたは一部において、 単一あるいは複数のヒ ト染色体あるいはその断片を保持するものを指す。 さらに は、 その正常体細胞の全てまたは一部において、 ヒ ト染色体上の単一あるいは複 数のヒ ト遺伝子を発現しているものを指す。
(1) 標識されたヒ ト染色体またはその断片を保持する染色体供与細胞の作製 染色体供与細胞としては、 1) 受容細胞で選別可能なマーカーで標識されたヒ ト染色体を保持し、 2) それ以外のヒ ト染色体を含まない、 3 ) ミクロセル形成 能が高い細胞、 が望ましい。
ヒ ト染色体提供の材料としては、 ヒ ト由来のあらゆる細胞株、 癌細胞、 初代培 養細胞を用いることが出来るが、 染色体の欠失、 増幅等の異常の可能性が低く、 また培養が容易な点を考慮すると正常繊維芽細胞が適している。
まず 1) について、 ヒ ト細胞は薬剤 （G418, ピューロマイシン，ハイグロマイシ ン， ブラストサイジン） 耐性等のマ一カー遺伝子を発現するべクタ一により形質 転換することができる。 ここで用いるマ一力一発現制御のためのプロモーターと しては、 ヒ ト細胞のみならず、 マウス ES細胞のような受容細胞で効率よく働く も のが望ましい。 この目的には SV40ェンハンサ一と単純へルぺスウィルスチミジン キナーゼプロモーターの連結したもの （Katohら， Cel〖 Struct. Funct.， 12 : 575, 1987) 、 マウス PGK-1プロモーター （Sorianoら， Cel l, 64 : 693, 1991) 等を用 いることが出来る。 エレク ト口ポレーシヨン （石田ら， 細胞工学実験操作入門， 講談社， 1992) 等による形質転換を実施し、 選択することにより、 導入されたマ —カー遺伝子が、 23種 46本あるヒ ト染色体上にランダムに挿入されたようなヒ ト 細胞形質転換体のライブラリ一を得ることが出来る。
3) については、 多くのヒ ト正常細胞がミクロセル形成能が非常に低いので、 上記の形質転換体をミクロセル形成能の高い細胞例えば、 マウス A9細胞 （Oshimu ra, . , Environ. Health Perspect. , 93:57, 1991) と全細胞融合することにより、 形成能を付与することが出来る。 マウス—ヒ ト雑種細胞では、 ヒ ト染色体が選択 的に消失することが知られているが、 ここで得られた融合株は、 先述のマ一力一 で選択することにより、 マーキングされたヒ ト染色体を安定に保持することが出 来る。
さらに、 2) の条件を満たすために、 この細胞融合株からミクロセルを取得し、 マウス Α9細胞と再度融合することが望ましい。 この場合も、 ヒ ト染色体上のマ一 カーで選択することにより、 得られるミクロセル融合株の多くは、 1) 、 2) 、 3) の条件を満たしたものであると考えられる。 マーキングされたヒ ト染色体の同定 は、 最終段階で得られるマウス—ヒ トモノクロモソーム雑種細胞において、 PCR (ポリメラ一ゼチヱインリアクション、 Saikiら， Science, 239:487, 1988) 、 サ ザンブロッ 卜解析 (Ausubelり， Current protocols in molecular biology, Joh n Wiley & Sons, Inc. , 1994) 、 FISH (フルォレツセンスインサイチューハイブ リダィゼ一シヨン、 Lawrenceら， Cell, 52:51, 1988) 解析等により調べること が出来る。 ある特定の染色体導入を望む場合には、 多くのヒ 卜細胞形質転換体ク ローンについて、 それぞれ上記の過程を繰り返して、 目的染色体がマ一キングさ れたものを探す。 あるいは、 ヒ ト細胞形質転換体クローンの混合物について上記 の過程を実施し、 得られる多数のマウス一ヒ 卜モノクロモソーム雑種細胞につい てヒ 卜染色体の同定を行なうことが可能である。
さらに、 導入を望む染色体上の DNA配列を標的とした相同組換え（Thomas ら， C ell, 51:503, 1987) により、 特定の部位にマーカー遺伝子を挿入することも可 能である。
マウス一ヒ ト雑種細胞から調製したミクロセルにガンマ線照射することにより、 マーキングされたヒ ト染色体を断片化してマウス A9細胞に導入することも出来る。 また、 ミクロセルにガンマ線照射しない場合でも、 ある割合で部分断片化したヒ ト染色体が移入されることがある。 これらの場合、 得られるミクロセル融合株は、 マーキングされたヒ ト染色体の部分断片を保持している。 これらは、 受容細胞に 染色体部分断片を導入したい場合に用いることができる。
(2) 分化多能性を保持するマウス細胞へのヒ ト染色体またはその断片の移入 これまでに、 種々の系統のマウス由来の胚性癌腫細胞 （EC細胞、 Hanaokaら， D i f feren t i a t i on, 48 : 83， 1991 ) 、 胚性幹細胞 （ES細胞、 Evansら， Nature, 292 : 154， 1981 ) 、 胚性生殖細胞 （EG細胞、 Matsu iら， Ce l l, 70 : 841, 1992) がマウ ス初期胚に注入あるいは共培養することによりその正常体細胞に寄与する、 すな わちキメラマウス作製可能であることが報告されている。 ES、 EG細胞はその能力 が特に高く、 多くの場合生殖細胞にも寄与し、 その細胞由来の子孫を作ることが できる。 EC細胞は主に生殖細胞癌から、 ES細胞は胚盤胞の内部細胞塊から、 EG細 胞は発生初期に出現する始原生殖細胞から得られる。 本発明におけるヒ ト染色体 移入の受容細胞としてはこれらの細胞株及びその変異株、 さらにはマウス個体に おいて全て、 あるいは一部の正常体細胞に分化可能なあらゆる未分化細胞を用い ることができる。
受容細胞へのヒ ト染色体移入の材料としては （1) で得られたヒ ト染色体供与 細胞から調製されるミクロセルあるいはガンマ線照射したミクロセルを用いるこ とができる。 受容細胞への移入は〈清水素行， 細胞工学ハンドブック， 羊土社， 1 992>等に記された方法で受容細胞とミクロセルを融合することにより行なう。 ミ クロセル供与細胞においてはあるヒ ト染色体またはその断片が受容細胞において 選別可能なマーカーを保持している。 この中から、 （1) と同様 PCR、 サザンプロ ッ ト解析、 F ISH解析等により、 導入を目的とする遺伝子あるいは染色体あるいは その断片を保持する株を選択すれば、 あらゆるヒ ト染色体、 あるいはその断片を 導入することが可能である。 また、 異なる選択マーカ一を保持する複数の染色体、 あるいはその断片を逐次導入することにより、 これらを同時に保持する受容細胞 を得ることもできる。 さらに、 すでにあるヒ ト染色体を導入した細胞株の中から、 導入染色体数が増加したものを選抜することも可能である。 これは通常、 培養液 中に添加する選択薬剤の濃度を高めることにより達成される。
ヒ ト染色体上のマーカー （G418耐性等） により選抜された受容細胞が、 供与細 胞の保持していたヒ ト染色体の全部あるいは一部を保持していることは、 以下の ようにして確認される。 選抜された受容細胞から抽出したゲノム DNAを用い、 プ ローブとしてヒ ト特異的繰り返し配列 （Ll、 Alu等、 Korenbergら， Cell, 53:39 1， 1988) 、 ヒ ト遺伝子等を用いたサザン解析により検出される。 また、 ヒ ト遺 伝子特異的プライマ一による PCR法、 及びヒ ト染色体特異的プローブ （Lichterら， Human Genetics, 80:224， 1988) を用いたフルォレツセンスインサイチューハイ ブリダィゼーシヨン （FISH) 等の染色体解析により確認することができる。
(3) ヒ 卜染色体導入 ES細胞からのキメラマウス作製
(2) で得られた ES細胞株からのキメラマウス作製は、 く 相沢慎一， バイオマ ニュアルシリーズ 8 ジーンターゲティング， 羊土社， 1995〉等に記された方法で 行なう。 効率的なキメラマウス作製を行なうための宿主胚の発生時期、 系統等の 選択については、 それぞれの ES細胞株についてすでに検討された条件を用いるこ とが望ましい。 例えば、 CBAXC57BL/6 F1 由来の TT2細胞 （野生色、 Yagiら， Anal ytical Biochemistry, 214:70, 1993) については Balb/c (白色、 日本クレア 社） あるいは ICR (白色、 日本クレア社） 由来の 8細胞期胚を宿主胚として用いる のが望ましい。
(4) キメラマウスにおけるヒ ト染色体の保持及びヒ ト遺伝子発現
ES細胞株を注入した胚から誕生したマウスにおける ES細胞の貢献率は、 その毛 色によりおおまかに判定することができる。 但し、 毛色に全く貢献が見られない からといって他の組織で貢献がないとは断定できない。 より詳細な、 キメラマウ ス各組織におけるヒ 卜染色体の保持は各組織より抽出されたゲノム DNAを用いた サザン解析、 PCR等によって確認することができる。
導入ヒ ト染色体上の遺伝子発現は以下のようにして確認される。 ヒ ト染色体由 来 mRNAの発現は各組織由来 RNAを用いた RT- PCR法 （Kawasakiら， P. N. A. S. , 85:56 98， 1988) 、 ノーザンブロッ ト法 （Ausubelら， 前記） により検出される。 蛋白 質レベルの発現は、 マウスの相同蛋白質との交差反応性を最小にした抗ヒ ト蛋白 質抗体による酵素免疫測定法 （ELISA、 富山，安東， 単クローン抗体実験マニュ アル， 講談社サイェンティフイク， 1987; 石川， 超高感度酵素免疫測定法， 学会 出版センター， 1993) 、 ウェスタンブロッ ト法 （Ausubelら， 前記） あるいは、 電気泳動度の違いを利用したアイソザィム分析 （Ko i ら， Jpn. J. Cancer Res. , 80 : 413， 1989)等により検出される。 さらに、 キメラマウス細胞中でのヒ ト染色 体の保持及び該染色体上の遺伝子の発現が、 キメラマウス由来初代培養細胞での 薬剤耐性マー力一遺伝子発現による耐性細胞の出現より確認できる。
例えば、 ヒ ト免疫グロプリン重鎖の存在するヒ 卜 14番染色体を保持する ES細胞 から作製されたキメラマウスについて、 キメラマウス血清中のヒ ト I gM、 I gG. l g A等をマウス抗体との交差反応性を最小にした抗ヒ ト I g抗体による酵素免疫測定 法により検出することができる。 また、 このキメラマウスをヒ 卜由来抗原 （例え ばヒ ト血清アルブミン） により免疫し、 その脾臓細胞とマウスミエ口一マを融合 することにより得られる、 ハイプリ ドーマ （安東 ·千葉， 単クローン抗体実験操 作入門， 講談社サイェンティフイク， 1991) を EL ISAによりスクリーニングする ことにより、 ヒ ト免疫グロプリン重鎖を産生するハイプリ ドーマを得ることがで
Sる ο
以上、 マウスを例にとり、 ヒ ト染色体またはその断片を保持し、 該染色体また はその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ ト動物の作製法を説明したが、 本発 明において、 キメラ非ヒ ト動物へ移入される染色体またはその断片は、 ヒ ト由来 のものに限られず、 広く外来染色体またはその断片を移入し、 該染色体またはそ の断片上の遺伝子を発現させることが可能である。 ここで、 「外来染色体」 とは、 分化多能性を保持する細胞へ移入され、 キメラ非ヒ 卜動物において、 該染色体ま たはその断片上の遺伝子が発現することを特徴とするものであり、 その由来とと する生物種は特 限定されるものではない。 また、 本発明の方法により、 キメラ マウスのみならず、 他のキメラ動物、 例えば、 ラッ ト、 ブタ等の哺乳類その他の キメラ動物も作製することができる。 マウス以外の動物種における ES細胞あるい は ES様細胞の樹立はラッ ト （lannacconeら， Dev. B i o l . , 163, 288-, 1994) 、 ブタ （Whee l er ら， Reprod. Fert i l. Dev. , 6， 563-, 1994) 、 ゥシ （S imsら， Pro Nat l. Acad. Sc i . USA, 91, 6143-6147， 1994) において報告され、 さら にメダカ、 ニヮ トリ等でも試みられている （トランスジヱニック動物， 蛋白質核 酸酵素， 1995年 10月号増刊， 共立出版） 。 また、 ヒッジにおいては ES様細胞 （ED 細胞） さらにはそれを 10代以上継代して得られる上皮様細胞由来の核を移植され た未受精卵が正常に発生することが知られている （Ca即 be l lら， Nature, 380, 6 4 -， 1996) 。 これら ESあるいは ES様細胞を受容細胞とした外来染色体移入によつ てマウスの場合と同様に外来染色体あるいはその断片を保持し、 該染色体または その断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ ト動物が作製可能である。
また、 本発明において、 外来染色体あるいはその断片が移入される、 分化多能 性を保持する細胞は、 前述の E S細胞、 E C細胞、 E G細胞に限られるものでは ない。 例えば、 骨髄幹細胞に外来染色体あるいはその断片を移入することが可能 であり、 該骨髄幹細胞の生体への移植により、 遺伝病等の治療を行うことが可能 である。
キメラ非ヒ ト動物において、 外来染色体を保持する ES細胞がその生殖細胞に分 化した場合、 生殖により得られる子孫にも導入染色体または断片が認められ、 そ の子孫は導入された染色体または断片上の遺伝子を発現する。
上記のようにして得られるキメラ非ヒ ト動物またはその子孫を利用して、 外来 染色体またはその断片上の遺伝子を発現させ、 その産物を回収することにより、 生物学的に活性な物質を製造することができる。 具体的には、 キメラ非ヒ ト動物 またはその子孫の個体を外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件 下で飼育し、 その後発現産物を動物の血液、 腹水などから回収することができる c あるいはまた、 キメラ非ヒ ト動物またはその子孫の組織、 細胞あるいはそれを不 死化したもの （例えば、 ミエローマ細胞との融合により不死化したハイプリ ドー マ） などを外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で培養し、 その後発現産物'を培養物から回収することができる。 さらには、 これらキメラ非 ヒ ト動物またはその子孫の組織、 細胞、 あるいはそれを不死化したものから抽出 した外来染色体あるいはその断片、 または外来染色体またはその断片を構成する D N A、 さらにはまた、 キメラ非ヒ ト動物またはその子孫の組織、 細胞、 あるい はそれを不死化したものに保持された外来染色体あるいはその断片に由来する c D N Aを動物細胞あるいは昆虫細胞 （例えば、 C H O細胞、 B H K細胞、 肝ガン 細胞、 ミエ口一マ細胞、 S F 9細胞等） に導入し、 該細胞を外来染色体またはそ の断片上の遺伝子を発現しうる条件下で培養し、 その後発現産物 （例えば、 特定 の抗原特異的な抗体蛋白質等） を培養物から回収することができる。 発現産物は 遠心分離などの公知の方法に従って回収することができ、 さらに、 硫安分画、 分 配クロマトグラフィー、 ゲル濾過クロマトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー, 分取薄層クロマトグラフィ一などの公知の方法に従って精製することができる。 生物学的に活性な物質は、 外来染色体上にコ一ドされているあらゆる物質を含み、 例えば、 抗体、 特にヒ ト抗体などを挙げることができる。 例えば、 得られたキメ ラ動物の脾細胞あるいはそのハイプリ ドーマなどの不死化細胞から該染色体上の ヒ ト抗体遺伝子をクローニングし、 チャイニーズハムスター卵巣細胞 （CHO) やミエローマ細胞に導入してヒ ト抗体を生産することができる （Lynette ら， Bi otechnology, 10， 1121-, 1992; Bebbingtonら， Biotechnology, 10, 169-, 199 2)。
本発明により得られるヒ ト 2番、 14番、 22番染色体 （断片） を保持するキメラ マウス及びその子孫は、 ヒ ト抗体重鎖 （14番染色体上） 、 軽鎖/ c (2番染色体上） 軽鎖 λ (22番染色体上） それぞれの遺伝子の機能的配列の大部分を保持し得る。 すなわち、 酵母人工染色体等を用いてヒ 卜抗体遺伝子の一部を導入した既知のト ランスジエニックマウス （Greenら， Nature Genetics, 7, 13-， 1994, Lonberg ら， Nature, 368, 856-, 1994等） と比較して、 ヒ トにおいて観察されるものに より近い、 非常に多様なヒ ト抗体レパートリーを発現することが可能である。 ま た、 本発明により得られる 2番 +14番、 22番 +14番等の染色体 （断片） を同時に 保持するキメラマウス及びその子孫、 並びに、 それらを交配することにより得ら れる 2番 +14番 +22番等の染色体 （断片） を同時に保持するマウス及びその子孫 は、 重鎖、 軽鎖の両者がヒ ト由来である完全なヒ ト抗体を産生することが可能で ある。 これらのマウスはヒ 卜由来抗原に対してそれを異物とみなして免疫反応を 起こし、 抗原特異的ヒ ト抗体を産生することができる。 この性質は治療用のヒ ト モノクロ一ナル抗体、 あるいはヒ トポリクローナル抗体を得るために非常に有用 である （Greenら、 前記、 Lonbergら、 前記） 。 一方、 特定の抗原に対して親和 性の高いヒ ト抗体を得る効率を上げるためには、 マウス抗体を産生せず、 ヒ ト抗 体のみを産生するマウスを作成することが望まれる （Greenら、 前記、 Lonberg ら、 前記） 。 本発明において、 これは典型的には既知の手法を用いて以下の方法 Aあるいは Bにより達成される。 方法 A： マウス抗体欠損 ES細胞およびマウス钪体欠損キメラ宿主胚を用いる方法。 方法 B： ヒト染色体導入キメラマウスよりヒト染色体を保持する子孫を得てマウ ス抗体遺伝子を欠損するマウス系統との交配を行う方法。
以下に A， Bそれぞれの方法の典型的な例について以下に具体的に記す。
方法 Aの具体的手順
1 . マウス ES細胞に 2コピ一存在するマウス抗体重鎖遺伝子の一方を標的遺伝子 相同組み換え法 （Joynerら， Gene Targe t i ng, 1993， I RL PRESS) を用いて破壊 する。 遺伝子破壊箇所には後に部位特異的組換えにより除去可能な配列、 例えば Ι οχΡ配列 （Creレコンビナーゼにより組み換え、 Sauerら、 前記、 他に FLPレコ ンビナーゼ- FRT配列を用いた 0， Gormanら， Sc i ence, 251, 1351 -， 1991の例があ る） にはさまれた G418耐性遺伝子等のマ一カー遺伝子を挿入する。
2 . 一方の抗体重鎖遣伝子が破壊された上記薬剤耐性マウス ES細胞を高濃度の薬 剤存在下で培養し、 高濃度薬剤耐性となった株を選抜する。 これらの株をスク リ 一二ングすることにより両方の抗体重鎖遺伝子が破壊された株が得られる （相沢 慎一、 前記）
3 . 2 . で得られた両方の抗体重鎖遺伝子が破壊されたマウス ES細胞に 1 . で薬 剤耐性遺伝子の両側に挿入した組換え配列の間で部位特異的組み換え反応を起こ す酵素遺伝子、 例えば Creレコンビナーゼ遺伝子 （Sauerら、 前記） を一時的に 導入し、 Ι οχΡ配列の間で組み換え反応が起こつて両方の抗体重鎖遺伝子に挿入さ れた薬剤耐性遺伝子が除去された薬剤感受性株を選抜する （高津聖志ら、 実験医 学別冊、 免疫研究の基礎技術、 p255-、 1995、 羊土社） 。
4 . マウス抗体軽鎖/ c遺伝子について上記 1〜3の過程を繰り返し、 最終的に抗 体重鎖及び/ c鎖を完全に欠損した薬剤感受性株を取得する。
5 . 4の株 （抗体重鎖、 Λ鎖欠損マウス ES細胞） を受容細胞としたミクロセル融 合により、 薬剤耐性マーカー （例えば G418耐性遺伝子） でマーキングされたヒ ト 抗体重鎖遺伝子を含むヒ ト 14番染色体 （断片） を導入する。
6 . 5で得られた株を受容細胞としたミクロセル融合により、 5とは異なる薬剤 耐性マーカー （例えばピューロマイシン耐性遺伝子） でマーキングされたヒ ト抗 体軽鎖遺伝子を含むヒ ト 2番染色体 （断片） あるいは 22番染色体 （断片） または その両者を導入する。
7 . 自らの抗体を産生することができないマウス系統 （例えば RAG- 2ノックァゥ トマウス、 Shinkaiら， Cel l, 68， 855-, 1992、 膜型〃鎖ノックアウ トマウス、
Ki tamuraら， Nature, 350, 423-， 1991) から得た胚を宿主胚として 6で得られた
ES細胞とのキメラマウスを作成する。
8 . 得られるキメラマウスにおいてほとんどの機能的な ンパ球は ES細胞に由 来する （高津聖志ら、 実験医学別冊、 免疫研究の基礎技術、 P234-、 羊土社、 19 95) 。 この Bリンパ球においてはマウス重鎖、 鎖が欠損しているため、 主とし て導入染色体上の機能的なヒ ト抗体遺伝子よりヒ 卜の抗体のみが産生される。 方法 Bの具体的手順
1 . ヒ ト抗体重鎮、 軽鎖/ または軽鎖 λを含むヒ ト染色体あるいはその断片を保 持するキメラマウスからそれらを安定に保持する継代可能な子孫を得る。
2 . 1 . で得られたヒ ト抗体重鎖または軽鎖を発現するマウス系統あるいはそれ らの交配により得られたヒ ト抗体重鎖および軽鎖の両者を発現するマウス系統と 自らの抗体遺伝子が欠損しているマウス系統 （例えば膜型; 鎖ノックァゥ トマゥ ス、 前記、 軽鎖/ cノックアウ トマウス、 Chenら， EMBO J.， 3， 821-, 1993) との 交配により、 マウス抗体重鎖、 及び軽鎖 cの欠損についてホモ接合体であり、 な おかつヒ ト抗体重鎖 （14番） +軽鎖 /c (2番） 、 抗体重鎖 （14番） +軽鎖; I (22 番） あるいはヒ 卜抗体重鎖 （14番） +軽鎖 /c (2番） +軽鎖； I (22番） を含むヒ ト染色体を保持するマウス系統を得る。 このマウス系統においてはマウス抗体重 鎖、 軽鎖 遺伝子が欠損しているため、 主として導入染色体上の機能的なヒ ト抗 体遺伝子よりヒ 卜の抗体のみが産生される。
なお、 上記の Aおよび Bの方法は、 ヒ 卜抗体のみならず、 外来染色体上に存在 するあらゆる遺伝子の産物を効率的に得るために、 用いることができる。
以下に実施例を示して具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に限定さ れるものでない。
(実施例 1 ) G418耐性標識されたヒ ト染色体 （断片） を保持する染色体供与細胞 の作製 G418耐性遺伝子を含むプラスミ ド pSTneoB (Katohら、 Cell Struct. Funct., 1 2:575, 1987; Japanese Collection of Research Biologicals (JCRB), Deposit N umber: VE039) を制限酵素 Sail (宝酒造） で線状化し、 ヒ ト正常繊維芽細胞 HFい 1
(RIKEN Cell Bankより入手、 RCB0251)へ導入した。 HFL-1細胞を卜リブシン処理し、 5x10s個 Zmlとなるようにダルベッコのリン酸バッファ一 （PBS) に懸濁してから 10〃gDNA存在下でジーンパルサー （バイオラッ ド） を用いてエレク トロポレーシ ヨ ンを行なった （石田ら， 細胞工学実験操作入門， 講談社， 1992) 。 の容量 で 1000Vの電圧を 4議長のエレク トロポレーシヨ ンセル （165-2088、 バイオラッ ド ） を用いて室温で印加した。 エレク ト口ポレーションした細胞を 15%牛胎児血清
(FBS) を添加したイーグル F12培地 （以下 F12、 という） を含む 100mm組織培養用 プラスチックシャーレ （コ一ニング） 3〜6枚に播種した。 1 日後に 200^g/ml の G418 (GENETICIN,シグマ） を含む を添加した F12培地と置き換えた。 2〜 3週間後に生じたコロニー 100個程度を一つの集団として 52グループにそれぞれま とめ、 100 mmシャーレに再び播種し培養した。
マウス A9細胞 (Oshimura, Environ. Health Perspect. , 93:57, 1991, JCRB0211) を 10%牛胎児血清 （FBS) を添加したダルベッコ改変イーグル培地 （以下 DMEM、 という） 中、 100 mm シャーレで培養した。 52グループの G418耐性 HFい 1 細胞を 15 %牛胎児血清（FBS) と 200 zg/mlの G418を添加した F12中で、 それぞれ 100讓シャ ーレで培養した。 マウス A9細胞と HFL-1 細胞をトリプシン処理後それぞれ四分の —から半分量ずつ混合し、 100画シャーレに播種し 10%牛胎児血清 （FBS) を添加 した DMEMと 15%牛胎児血清 （FBS) を添加した F12との等量混合物中で半日から 一日培養した。 細胞融合は （清水ら， 細胞工学ハンドブック， 羊土社， P.127-, 1992) に記述されている方法に従った。 DMEMで細胞表面を 2回洗った後、 2ml の PEG (1 : 1.4) 溶液で 1分間処理し、 さらに、 2mlの PEG (1 : 3) 溶液に換え
1分間処理した。 PEG溶液を吸い取り、 無血清培地 （DMEM) で 3回洗った後、 通 常の培地 （10%FBS、 DMEM) で 1 日間培養した。 細胞を卜リブシン処理により分散 し、 ゥヮバイン （1χ1(Γ5Μ, シグマ） および G418 (800/ g/ml) を含む二重選択培 地 （10%FBS、 DMEM) に懸濁し、 100mmシャーレ 3枚に播種した。 約 3週間培養し た後、 生じたコロニーをトリプシン処理により細胞を分散し G418 (800 zg/ml) を含む選択培地 （10%FBS、 D EM) で培養した。
卜リプシン処理により細胞を分散し 2グループを一つにまとめて、 6本の 25cm2 遠心用フラスコ （コースター、 3025) にて細胞密度が 70〜80%飽和程度まで培養 した。 コルセミ ド （0.05^g/nd， デメコルシン， 和光純薬） を含む培養液 （20%FB S、 DMEM) に交換し、 2日間培養しミクロセルを形成させた。 培養液を除去し、 予め保温 （37°C) しておいたサイ トカラシン B (10^g/ml, シグマ） 溶液を遠心 用フラスコに満たし、 アクリル製遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、 34°C、 80 OOrpm， 1時間の遠心を行なった。 ミクロセルを無血清培地に懸濁し、 フィルター で濾過し精製した。 マウス A9細胞を 80%飽和の状態まで培養した 25cm2 フラスコ に精製した微小核を加え PEG溶液で融合させた。 G418を含む選択培地で培養しコ ロニ一を単離した。 各クローンが保持するヒ ト染色体 （2番、 4番、 14番、 22番） は以下の通り同定した。 上記以外のすべての実験操作及び試薬等は 〈清水ら、 細 胞工学ハンドブック、 羊土社、 p.127-〉 に従った。
(1) PCR解析
単離した細胞を培養し、 細胞から Puregene DNA Isolation kit (Gentra Syste m社） を用いてゲノム DNAを抽出し、 このゲノム DNAを铸型とし、 ヒ ト染色体特異 的なプライマーを用いて PCR法で 2、 4、 14、 22番ヒ ト染色体を保持するクローン を選抜した。 PCR増幅は約 0. l〃gのゲノム DNAを使用し （Innisら， PCR実験マニュ アル， HBJ出版局， 1991, サーマルサイクラ一は GeneAmp 9600, Perkin- Elmer社 を使用） に従い行なった。 Taqポリメラーゼは Perkin-Elmer社製を用い、 反応条 件は、 94°C5分を 1サイクル行なった後、 変性 94°C15秒、 アニーリング 54〜57°C15 秒 （プライマーにより適宜変更） 、 伸長 72°C20秒を 35サイクル行なった。 プライ マ一は各染色体上に存在する遺伝子 （O'Brien, Genetic Maps, 6th edition, Boo k 5， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993 ) 及び多型性マーカー （Poly morphic STS Primer Pair, BIOS 社； Weissenbach ら， Nature 359:794, 1992; Walterら， Nature Genetics, 7:22, 1994等） を用いた。 遺伝子プライマーは GenB ank、 EMBL等のデータベースより入手した塩基配列をもとに作製した。 多型性プ ライマーの名称及び、 遺伝子プライマーの配列はそれぞれの染色体について以下 の実施例で示した （2番：実施例 4番：実施例 6、 14番：実施例 9、 22番：実施例 2) 。 2番染色体の同定には以下に示す遺伝子マーカー及び多型性マーカー （Po l ymorphi c STS Primer Pai r, B IOS社: D2S207, D2S177, D2S156, D2S159 B IOS 社） を用いた。
C c ( immunoglobul in kappa cons tant) ： 5' -TGGAAGGTGGATAACGCCCT (配列番 号 1 )， 5* -TCATTCTCCTCCAACATTAGCA (配列番号 2 )
FABP1 ( fat ty aci d binding protein-1 l i ver) ： 5， -GCAATCGGTCTGCCGGAAGA (配列番号 3 )， 5' -TTGGATCACTTTGGACCCAG (配列番号 4 )
Vk3-2 ( immunoglobul in kappa var iable) ： 5' -CTCTCCTGCAGGGCCAGTCA (配列 番号 5 ), 5' -TGCTGATGGTGAGAGTGAACTC (配列番号 6 )
Vkl-2 ( immunoglobul in kappa variable) ： 5' -AGTCAGGGCATTAGCAGTGC (酉己 列番号 Ί ), 5， -GCTGCTGATGGTGAGAGTGA (配列番号 8 )
(2) フルォレツセンス インサイチューハイブリダィゼーシヨ ン （FISH)
FISH解析は （松原ら， FISH実験プロ トコ一ル， 秀潤社， 1994) に記された方法 に従い、 ヒ ト 2番、 4番、 14番、 22番染色体特異的プローブ （CHROMOSOME PAINTIN G SYSTEM, Cambi o社） を用いて行なった。
例えば、 2番染色体を保持するクローンは 26グループ（745クローン）中 10グルー プに 1個以上のクローンを得た。 このうち用いた 2番染色体特異的なブライマ一 すべてに陽性であつたのは 5クローンだった。 これらのクローンを FISH解析した。
FISH解析は （松原ら， FISH実験プロ トコ一ル、 秀潤社、 1994) に記された方法に 従い、 ヒ ト 2番染色体特異的プローブ （CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, CANB I0社） を用いて行なった。 すべてのプライマーに陽性な細胞ではヒ ト 2番染色体がほぼ 完全な形で観察され、 1部のプライマ一のみ陽性なクローンのうちいくつかのク ローンではヒ ト 2番染色体よりも小さな独立染色体が観察され、 あるいはヒ ト 2 番染色体以外の染色体と融合しているような形の染色体を持つ細胞も観察された (第 1図） 。 第 1図において、 横列がクローン名、 縦列は PCRに使用したプライマ 一を示す。 暴は陽性を、 Xは陰性を示した。 また、 F ISHにより観察されたヒ ト 2 番染色体の存在形態を最下行に示した。 記載のないものは実施していない。
同様にして、 ヒ ト 4番、 14番、 22番染色体を保持する A9細胞を得た。
(実施例 2) マウス ES細胞へのミクロセル法によるヒ ト 22番染色体導入 染色体供与細胞として、 （実施例 1) で得られたヒ ト 22番染色体を保持するマ ウス A9細胞株 （以下 A9/#22、 という） を用いた。 染色体受容細胞としてはマウス ES細胞株 E14 (Mart in L. Hooperより入手、 Hooperら， Nature, 326 : 292, 1987) を用いた。 E14の培養法はく相沢慎一， バイオマニュアルシリーズ 8， ジーンター ゲティ ング， 羊土社， 1995〉に記された方法に従い、 栄養細胞としては、 マイ ト マイシン C (シグマ） 処理した G418耐性 ST0細胞株 （大阪大学、 近藤寿人教授より 入手） を用いた 。 まず清水ら （細胞工学ハンドブック、 羊土社、 1992) の報告 した方法に従い、 約 108個の A9/#22からミクロセルを調製した。 得られたミクロ セルは全量を 5mlの DMEMに懸濁した。 約 107個の E14をトリブシンで分散させた後、 DMEMで 3回洗浄し、 5mlの DMEMに懸濁した後、 ミクロセルとあわせ、 1250rpm、 10分 間遠心して上清を除いた。 沈殿をタッピングによりょくほぐし、 1 : 1. 4PEG溶液 （ 5g PEG1000，く和光純薬〉， lml DMS0くシグマ〉を 6mlDMEMに溶解） 0. 5mlを加えて室温 で 1分 30秒静置した後、 10mlの DMEMをゆっく りと加えた。 直ちに 1250rpm、 10分 間遠心して上清を除き、 沈殿を 30mlの ES細胞用培地に懸濁し、 あらかじめ栄養細 胞をまいた直径 100mmの組織培養用プラスチックシャーレ （コ一ニング） 3枚に播 種した。 24時間後に 300 ;a g/mlの G418 (GENETIC IN, シグマ） を加えた培地と交換 し、 その後毎日培地交換を行なった。 1週間〜 10日後には薬剤耐性コロニーが出現す る。 その出現頻度は E14細胞 107個あたり 0〜5個であった。 そのコロニーをピッ クアップし増殖させ、 5 X 106個あたり lmlの保存用培地 （ES細胞用培地 + 10¾iDMS 0くシグマ >) に懸濁し、 -80°Cにて凍結保存した。 同時に各薬剤耐性株について 106 〜107個の細胞からゲノム DNAを Puregene DNA I solat i on Ki t (Centra Sys tem社） により調製した。
ヒ ト 22番染色体の断片化はミクロセルにガンマ線照射することにより行なった (Ko iら， Sci ence, 260 : 361, 1993) 。 約 108個の A9/#22より取得したミクロセル を 5mlの DMEMに懸濁し、 ガンマセル 40 (カナダ原子力公社製） により、 氷上で 60G yのガンマ線を照射した （1. 2Gy/分 x 50分） 。 ガンマ線照射したミクロセルは未 照射ミクロセルと同様に融合、 薬剤耐性株選抜を行なった結果、 薬剤耐性株の出 現頻度は E14細胞 107個あたり 1〜7個であった。 薬剤耐性株については未照射の場 合と同様にして凍結保存、 DNA取得を行なった。 未照射ミクロセル薬剤耐性株 E14/#22- 9 、 E14/#22-10 、 ガンマ線照射ミクロ セル薬剤耐性株 E14/#22-14、 E14/#22-25における導入染色体の保持は以下の （1) 〜 （3)により確認した。
(1) PCR解析 （第 2図）
薬剤耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒ 卜 22番染色体上に存在する遺伝子 （Geneti c Maps, 前記） 及び多型性マ一カー （Polymorphic STS Primer Pair, BIOS社： D2 2S315, D22S275, D22S278, D22S272, D22S274; Nature 359:794, 1992) の存在 を PCR法により検出した。 GenBank、 EMBL等のデータベースより入手した塩基配列 をもとに作製した遺伝子プライマーオリゴヌクレオチドの配列を記す。
PVALB (parvalbumin) ： 5' -TGGTGGCTGAAAGCTAAGAA (配列番号 9 )， 5' -CCAGAAGAA TGGTGTCATTA (配列番号 10)
MB (myoglobin) ： 5' -TCCAGGTTCTGCAGAGCAAG (配列番号 11), 5' -TGTAGTTGGAGGCC ATGTCC (配列番号 12)
DIA1 (cytochrome b- 5 reductase) ： 5' -CCCCACCCATGATCCAGTAC (配列番号 13)， 5， -GCCCTCAGAAGACGAAGCAG (配列番号 14)
Πλ (immunoglobulin lambda) ： 5' - GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT (配列番号 15)， 5' -GGAGACCACCAAACCCTCCAAA (配列番号 16)
ARSA (arylsulfatase A) ： 5' -GGCTATGGGGACCTGGGCTG (配列番号 17)， 5' -CAGAGA CACAGGCACGTAGAAG (配列番号 18)
約 0.1 gのゲノム DNAを铸型として上記の 10種のプライマーについて PCR増幅 （ Innisら，前記） 'を行なった。 その結果、 未照射の 2株は全てのプライマー、 ガン マ線照射した 2株については一部のプライマーについて期待される長さの増幅産 物が検出された。 以上の結果を第 2図に示す。 第 2図において、 左側にヒ ト 22番染 色体の Gバンド像に基づく模式的な染色体地図、 また、 位置が明らかになつてい るいくつかのマーカーについてはどのバン ドに位置するかを示した （O'Brien, G BNBTIC MAPS, 6th edition, BOOK 5等） 。 遺伝子及び多型性マーカーの並び方は、 現在までに入手出来る情報 （Science, HUMAN GENETIC MAP, 1994, Nature Genet ics， 7:22, 1994, Nature 359:794, 1992等） を基に、 大まかな位置関係を示し たもので、 順序は必ずしも正確ではない。 4種の G418耐性 E14細胞株について、 PC Rにより期待される増幅産物が検出されたマーカーは画で、 検出されなかったマ 一力一を□で示した。 下側には FISH解析による観察結果を示した。 A9/#22は、 染 色体供与細胞である。
(2) サザンプロッ ト解析
サザンブロッ 卜解析はヒ 卜特異的な繰り返し配列である L1配列 （ハプロイ ドゲ ノム当たり 104〜105コピー存在、 RIKEN DNA Bankより入手、 Nucleic acids rese arch, 13:7813, 1985， pUK19A由来 1· 4kb EcoRI- BamHI 断片） をプローブとして、 制限酵素 （BglII、 宝酒造製） 処理を行なった約 2 gのゲノム DNAに対してく Ausub elら， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. , 19 94>に記された方法に従い行なった。 その結果、 各薬剤耐性株 DNAにおいてヒ ト L1 配列とハイブリダィズするバンドが多数検出された。 未照射の 2株については そのパターン及び、 各バンドの濃度から推定できるヒ ト染色体 DNAのマウスゲノム DNAに対する量
比は A9/#22のそれと同等であつた。 ガンマ線照射株の全体のシグナル強度は A9/# 22と比較した場合、 PCR解析で示された欠失の程度と相関していた。
(3) フルォレツセンスインサイチューハイブリダィゼーシヨ ン （FISH)
FISH解析は （松原ら， FISH実験プロ トコ一ル， 秀潤社， 1994) に記された方法 に従い、 ヒ 卜 22番染色体特異的プローブ (CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, Cambio 社） を用いて行なった。 その結果、 観察した分裂像のほとんどにおいて、 E14/#2 2-9 はマウス染色体に転座した形で、 他の 3株は独立した染色体としてヒ ト 22番 染色体が検出された。
以上の実験により、 得られた G418耐性株 E14/#22-9 、 E14/#22-10 はヒ ト 22番 染色体の全てあるいは大部分を、 E14/#22- 14 、 E14/#22-25 はその部分断片を保 持することが確かめられた。
(実施例 3) ヒ ト 22番染色体を保持する ES細胞からのキメラマウス作製
一般的なマウス胚取得、 培養、 ES細胞の胚への注入、 仮親子宮への移植等の手 技については、 く相沢慎一， バイオマニュアルシリーズ 8， ジーンターゲテイング， 羊土社， 1995〉に記された方法に従った。 （実施例 2) で得られ、 ヒ ト 22番染色体 を保持していることが確認された G418耐性 ES細胞株 E14/#22- 9を凍結ストツクょ り立ち上げ、 C57BL/6 X C3H F1雌マウス （日本クレア社） を C3H雄マウス （日本ク レア社） と交配することにより取得した胚盤胞期胚に胚あたり 10〜15 個注入し た。 偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 I CRマウス （日本クレア社） の子宮に片側の子宮あ たり約 10個の ES細胞注入胚を移植した。 その結果を （第 1表） に示す。 第 1表. ヒ ト 22番染色体 （断片） を保持する E14 細胞株からのキメラマウス作製
ES細胞株/ G418耐性 ES細胞を注入し 子マウス キメラマウス 毛色への貢献率 ヒト染色体 株番号 た胚盤胞期胚数 の数 の数 Ί 0¾ 10-30% 30%'
E14/#22 9 166 29 16 7 3 6
計 166個の注入胚を移植した結果 29匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において宿主胚由来の野生色 （濃茶） の中に E14細胞由来の薄灰色が認めら れるかどうかにより判定される。 誕生した 29匹のうち毛色に明らかに薄灰色の部 分のある、 すなわち、 E14細胞の貢献の認められる個体は 16匹であった。 また、 最高の貢献率は K22- 22における約 40¾！であつた。
この結果より、 ヒ ト 22番染色体を保持するマウス ES細胞株 E14/#22-9はキメラ 形成能、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確 認された。
(実施例 4) ヒ 卜 22番染色体を保持する ES細胞由来キメラマウス各組織におけ るヒ ト染色体 DNAの保持確認
(実施例 3) の毛色による判定に加えて、 尻尾より調製したゲノム DNAを铸型と した PCR解析により、 導入染色体の保持を確認した。 誕生後 3週以上を経たキメラ マウスからく勝木元也， 発生工学実験マニュアル， 講談社サイェンティフイク， 1 987>に記された方法に従い尻尾を取得し、 Puregene DNA I so l a t i on Ki tを用いて ゲノム DNAを抽出した。 このゲノム DNAを铸型として （実施例 2) で使用した多型 性プライマーのうち PVALB、 D22S278を用いて増幅産物の確認を行なった。 毛色に 貢献の見られた個体のうち 10匹について解析を行った結果、 全ての個体において 少なくともいずれかのプライマーによる増幅産物が確認された。
サザン解析は （実施例 2) と同様に、 ヒ ト L1配列をプローブとして用い、 6個体 のキメラマウス、 1個体の非キメラマウスの 2 〃gの尻尾ゲノム DNAに対して行な つた。 その結果、 全てのキメラ個体において多数のヒ ト L1配列の存在が認められ、 そのパターンは E14/#22- 9と類似していた。 マウスゲノムに対する量比は最も多 いもので 10%程度であった （第 3図） 。 第 3図において、 各レーンとも、 Bgl l l消化 した 2 gのゲノム DNAを使用した。 3 2P標識ヒ トし 1配列をプローブとし、 シグナル はイメージアナライザー BAS2000 (富士写真フィルム社） により検出した。 右よ り、 キメラマウス （K22-6, 7，8，9, 10， 11， 12 ： 9は非キメラ） の尻尾由来ゲノム DN Αおよびコントロール DNA(C : C は、 E14/#22- 9 と E14ゲノム DNAを 1 : 9の重量比 で混合したもの） のレーンである。 左側に DNA分子量、 右側に各キメラ個体のキ メラ率を示した。 （- ： 0%、 + ： 〜10%、 ++ ： 10〜305
さらに、 毛色に 5%程度の貢献の見られたキメラ個体 （K22- 7) について脳、 肝 臓、 筋肉、 心臓、 脾臓、 胸腺、 卵巣、 腎臓から IS0GEN (二ツボンジーン社） によ りゲノム DNAを取得し、 それぞれの組織について、 （実施例 2) で使用した遺伝子 プライマーのうち MB、 DIA1を用いて PCR解析を行なった。 その結果 2つのプライマ 一とも全ての組織において期待される増幅産物が確認された。 D I A1プライマーに よる結果を （第 4図） に示す。 PCR産物は 2 ァガロースゲルにて電気泳動した後、 臭化工チジゥム染色して検出した。 第 4図の各レーンは左から B：脳、 L :肝臓、 SM：骨格筋、 H：心臓、 Sp：脾臓、 Th：胸腺、 Ov：卵巣、 K： 腎臓、 nc：非キメラ マウス尻尾 DNA (陰性コン トロール）、 pc : ヒ ト繊維芽細胞 （HFい 1) DNA (陽性コン トロール）を示す。
これらの結果より、 E14/#22- 9はマウス個体において種々の正常組織に貢献し、 かつヒ ト 22番染色体を保持していることが確かめられた。
(実施例 5) ヒ ト 22番染色体を保持する ES細胞由来キメラマウスにおけるヒ 卜 遺伝子の発現
ヒ ト遺伝子発現確認のための試料としては、 毛色に 5%程度の貢献の見られた個 体 （K22- 7) の尻尾を液体窒素にて凍結後粉砕したものを用いた。 これは皮膚、 骨、 筋肉、 血液等の組織の混合したものである。 これより IS0GEN (ニッボンジー ン） を使用して総 RNAを抽出し、 RT-PCR法により、 ヒ ト-ミオグロビン （MB) 、 ヒ ト-チトクローム b5 レダクタ一ゼ （DIA1) の mRNAの検出を行なった。 RT-PCRはく Inni sら， PCR実験マニュアル， HBJ出版局， 1991〉に記された方法に従って行なつ た。 逆転写反応用プライマーは、 ランダムへキサマ一オリゴヌクレオチド （終濃 度 lOOpmoし 宝酒造製） を、 逆転写酵素は BRL社製 （スーパ一スクリプト） を使用 した。 cDNAを铸型とした増幅に用いたプライマーを記す。
MB ： 5' -TTAAGGGTCACCCAGAGACT (配列番号 19)， 5' -TGTAGTTGGAGGCCATGTCC (配列 番号 20)
DIA1： 5' -CAAAAAGTCCAACCCTATCA (配列番号 21), 5* -GCCCTCAGAAGACGAAGCAG (配 列番号 22)
その結果、 両遺伝子の mRNAに特異的な増幅産物が検出された （第 5図） 。 RT-P CR産物は 2¾5ァガロースゲルにて電気泳動した後、 臭化工チジゥム染色して検出し た。 第 5図において、 M はマーカー (Hind l l l消化； I DNA+Hae l l l消化 0 X174DNA, 宝酒造） 、 MBはヒ トミオグロビン、 DIA1はヒ トチトクローム b5レダクターセ、 WT は野生型 C3Hマウスを示す。
さらに同じ個体（K22- 7) について、 脳、 心臓、 胸腺、 肝臓、 脾臓、 腎臓、 卵巣、 骨格筋から IS0GENを使用して総 RNAを抽出し、 上記の 2種のプライマーにより各臓 器の RT- PCRを行った。 その結果、 DIA1は全ての臓器で、 MBは心臓と骨格筋のみで 期待される増幅産物が確認された （第 6図） 。 ミオグロビンは筋細胞特異的に発 現することが知'られており（Basse卜 Dubyら， MCB， 12 : 5024, 1992) 、 この結果は 導入したヒ ト染色体上の遺伝子がマウス個体で正常な組織特異的発現制御を受け 得ることを示している。 PCR産物は 2%ァガロースゲルにて電気泳動した後、 臭化 ェチジゥム染色して検出した。 第 6図において、 各レーンは左から B :脳、 H :心臓、 Th :胸腺、 肝臓、 Sp : 脾臓、 K:腎臓、 0v : 卵巣、 SM: 骨格筋、 M:マーカー （上 記） を示す。 MBの結果において観察される下方のバン ドは非特異的産物と考えら れる。
すなわち、 導入されたヒ ト 22番染色体はキメラマウスの正常組織において機能 し得ることが確かめられた。 (実施例 6) ヒ ト 4番染色体またはその部分断片の ES細胞への導入 染色体供与細胞として、 （実施例 1) で得られたヒ ト 4番染色体を保持するマウ ス A9細胞株 （以下 A9/#4、 という） を用いた。 染色体受容細胞としてはマウス ES 細胞株 E14 (実施例 2と同様） を用いた。 ミクロセル融合実験および G418耐性株の 選択は （実施例 2) と同様に行なった。 薬剤耐性株の出現頻度は E14細胞 107個あた り 1〜2個であった。 薬剤耐性株の凍結保存、 ゲノム DNA取得は （実施例 2) と同 様に行なった。 薬剤耐性株 E14/#4 - 4 、 E14/#4-7 、 E14#4_llにおけるヒ 卜 4番染 色体またはその断片の保持は以下の （1) 〜 （3) により確認した。
(1) PCR解析 (第 7図)
薬剤耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒ ト 4番染色体上に存在する遺伝子 （O' Bri e n, Genet i c Maps, 6th edi t i on, Book 5， Col d Spring Harbor Laboratory Press, 1993) 及び多型性マ一力一 （Polymorphi c STS Pr imer Pai r B IOS社： D4S395, D4 S412, D4S422, D4S413, D4S418, D4S426, Fl l ; Nature 359 : 794, 1992 ) の存在 を PCR法により検出した。 GenBank、 EMBL等のデータベースより入手した塩基配 列をもとに作製した遺伝子プライマ一オリゴヌクレオチドの配列を記す。
HD (hunt ington di sease) ： 5' -TCGTTCCTGTCGAGGATGAA (配列番号 23)， 5' -TCACT CCGAAGCTGCCTTTC (配列番号 24)
IL-2 ( i nterl eukin-2) ： 5' -ATGTACAGGATGCAACTCCTG (配列番号 25), 5' - TCATCTG TAAATCCAGCAGT (配列番号 26)
KIT (c-ki t) ： 5' -GATCCCATCGCAGCTACCGC (配列番号 27)， 5' -TTCGCCGAGTAGTCGCA CGG (配列番号 28)
FABP2 (fat ty acid b ind ing prote in 2, intest i nal ) ： 5' -GATGAACTAGTCCAGG TGAGTT (配列番号 29)， 5' -CCTTTTGGCTTCTACTCCTTCA (配列番号 30)
上記の 11種のプライマーについて PCR増幅を行なった結果、 3株共に、 全て、 あ るいは一部のプライマーについて期待される増幅産物が確認された。 E14/#4- 4、 E14/#4-7 株のように一部領域に欠失がみられるものもあった。 以上の結果を第 7図に示す。 第 7図において、 左側にヒ ト 4番染色体の Gバンド像に基づく模式 的な染色体地図、 また、 位置が明らかになっているいくつかのマーカーについて はどのバンドに位置するかを示した （実施例 2参照） 。 遺伝子及び多型性マーカ 一の並び方は、 現在までに入手出来る情報 （実施例 2参照） を基に、 大まかな位 置関係を示したもので、 順序は必ずしも正確ではない。 3種の G418耐性 E14細胞株 について、 PCRにより期待される増幅産物が検出されたマーカーは画で、 検出さ れなかったマーカ一を□で示した。 下側には FISH解析による観察結果を示した。
A9/#4は染色体供与細胞を示す。
(2) サザンブロッ ト解析 （第 8図）
サザンブロッ ト解析は （実施例 2) と同様に、 E14/#4-4 、 B14/S4-7 より取得 したゲノム DNAについてヒ ト L1配列をプローブとして行なった。 その結果、 両株 D NAにおいてヒ 卜 L1 配列とハイブリダィズするバンドが多数検出された。 A9/#4と 比較して、 全体のシグナル強度は PCR解析で示された欠失の程度と相関していた。 第 8図において、 各レーンとも、 Bgl l l消化した 2 z gのゲノム DNAを使用した。
3 2P標識ヒ ト L1配列をプローブとし、 シグナルはイメージアナライザー BAS2000 (富士写真フィルム社） により検出した。 第 8図において、 各レーンは、 左から、 1 :Α9/#4 (染色体供与細胞） 、 2 :A9/#4+A9 (1 : 2) 、 3 :A9/#4+A9 (1 : 9) 、 4 :A9、 5 : E14/#4- 7、 6 : E14/#4-4を示す。 2、 3は 2 種の DNAを括弧内に示した比率で混合 したものである。 左側に DNA分子量を示した。
(3) フルォレツセンスインサイチューハイブリダィゼ一シヨ ン （F ISH)
F ISH解析は （実施例 2) と同様に、 ヒ ト 4番染色体特異的プローブ （CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, Cambi o社） を用いて行なった。 その結果、 3株すベてのほと んどの分裂像において、 ヒ ト 4番染色体あるいはその部分断片が検出された。 E14/ #4- 4はマウス染色体に転座した形で、 他の 2株は独立した染色体として存在して いた。 観察されるヒ ト染色体の相対的な大きさは、 PCR解析の結果から推測され るそれと一致していた。
以上の実験により、 得られた G418耐性株はヒ ト 4番染色体の全てあるいはその 部分断片を保持することが明かとなった。
(実施例 7) ヒ ト 4番染色体部分断片を保持する ES細胞からのキメラマウス作製 ヒ 卜 4番染色体部分断片を保持していることが確認された G418耐性 ES細胞株 E14/ #4-4、 E14/ 4- 7を凍結ストックより立ち上げ、 （実施例 3) と同様にして取得し た胚盤胞期胚に胚あたり 10〜15個注入した。 偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 ICRマウ ス （日本クレア社） の子宮に片側の子宮あたり約 10個の ES細胞注入胚を移植した c その結果を （第 2表） に示す。 第 2表. ヒ ト 4番染色体 （断片） を保持する E14 細胞株からのキメラマウス作製
ES細胞株/ G418耐性 ES細胞を注入し 子マウス キメラマウス 毛色への貢献率 ヒト染色体 株番号 た胚盤胞期胚数 の数 の数 ~ 10¾ 10-30% 30ト
E14/#4 4 160 8 5 5 - -
7 80 5 2 1 1 -
計 240個の注入胚を移植した結果 13匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において宿主胚由来の野生色 (濃茶) の中に E14細胞由来の薄灰色が認めら れるかどうかにより判定される。 誕生した 13匹のうち毛色に明らかに薄灰色の部 分のある、 すなわち、 E14細胞の貢献の認められる個体は 7匹であった。 また、 最 高の貢献率は E14/#4-7由来の 1個体において約 15%であつた。
この結果より、 ヒ ト 4番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞株 E14/#4- 4、 E 14/#4- 7はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化 する能力を保持していることが確認された。
(実施例 8) ヒ ト 4番染色体部分断片を保持する ES細胞由来キメラマウスにおけ るヒ ト染色体 DNAの保持及び、 G418耐性遺伝子の発現確認
( 1) PCR解析
(実施例 7) で得られたキメラマウスのうち E14/#4-7由来の 1個体 （K#4-7- 1 ： キメラ率約 5%) 、 E14/#4-4由来の 1個体 （K#4-4-41： キメラ率約 5%) について (実施例 4) と同様に尻尾よりゲノム DNAを調製した。 それを铸型とし、 （実施 例 6) で示した 4番染色体解析用プライマ一のうち Ε14/#4- 7、 Ε14/#4- 4で検出さ れた多型性マーカ一 F11について PCR解析を行なった。 その結果、 2個体とも期待 される増幅産物が検出された。 (2) サザン解析 （第 9図）
サザン解析は （実施例 2) と同様、 E14/#4- 7由来の 1個体 （K#4- 7- 1： キメラ率 約 5%) についてヒ ト L1配列をプローブとして用い、 2 gの尻尾由来ゲノム DNAに 対して行なった。 その結果、 多数のヒ 卜 L1配列の存在が認められ、 そのパターン は E14/#4- 7と類似していた。 マウスゲノムに対する量比は E14/#4-7の約 10%程度 であった。 第 9図において、 各レーンとも、 Bgl l l消化した 2 z gの尻尾由来ゲノム DNAを使用した。 3 2P標識ヒ ト L1配列をプローブとし、 シグナルはイメージアナラ ィザ一 BAS2000 (富士写真フィルム社） により検出した。 左側に DNA分子量を示し た。 各レーンは左から 1： K#4-7- 1、 2： ブランク、 3： Ε14/#4- 7 を示す。
(3) 尻尾由来繊維芽細胞の G418耐性試験
キメラマウスのうち、 Ε14/#4-7由来の 1個体 （Κ#4- 7- 1：キメラ率約 55 、 B14/ #4- 4由来の 1個体 （Κ#4-4- 41： キメラ率約 5%) について尻尾から以下のように繊 維芽細胞を調製した。 DNA調製 （実施例 4) と同様にキメラマウスの尻尾を 5咖〜1 Omm切断し、 PBS/lmM EDTAで数回洗浄した後、 メスで切れ込みをいれて表皮を除 去し、 内部の組織をメスで細かく切り刻む。 組織細片を 5mlの PBS/lmM EDTAをい れたチューブに移し、 30分〜 1 時間室温静置する。 その後、 1mlの PBS/EDTAを残 して上清を取り除き、 1mlの 0. 25!¾トリプシン/ PBSを加え、 5〜10分間室温でタツ ビングあるいはピペッティングしながら組織をよくほぐす。 1 OOOrpm, 10分間遠心 し、 沈殿を 2mlの DMEM ( 10¾FCS) に懸濁し、 35mmシャーレに播種する。 7〜10日の 培養後、 トリプシン処理により細胞をシャーレからはがし、 シャーレあたり約 104 個の細胞を 35舰'シャーレ 2枚に播種し、 うち 1枚に終濃度 400 g/mlの G418を加え、 5〜7日間培養し、 それぞれのシャーレの生細胞を観察する。 この条件で、 野生型 I CRマウス由来の繊維芽細胞は、 G418存在下でほぼ 100%死滅する。 この結果、 2個 体共 G418耐性の繊維芽細胞の存在が認められた。
これらの結果より、 E14/#4- 7、 E14/#4- 4はマウス個体において種々の正常組織 に貢献し、 かつヒ ト 4番染色体部分断片を保持していることが確認された。
(実施例 9) マウス ES細胞へのヒ ト 14番染色体またはその断片の導入
染色体供与細胞として、 （実施例 1) で得られたヒ ト 14番染色体を保持するマ ウス A9細胞株 （以下 A9/#14、 という） を用いた。 染色体受容細胞としてはマウス ES細胞株 TT2 (ライフテックオリエンタル社より購入、 Yagiら， Analytical Bioch em., 214:70, 1993) を用いた。 TT2の培養法はく相沢慎一， バイオマニュアルシ リーズ 8， ジーンターゲテイ ング， 羊土社， 1995〉に記された方法に従い、 栄養 細胞はマイ トマイシン C (シグマ） 処理した G418耐性初代培養細胞 （ライフテツ クオリエンタル社より購入） を用いた。 ミクロセル融合実験および G418耐性株の 選択は （実施例 2) と同様に行なった。 薬剤耐性株の出現頻度は TT2細胞 107個あた り 3〜6個であった。 薬剤耐性株の凍結保存、 ゲノム DNA取得は （実施例 2) と同 様に行なった。
ヒ ト 14番染色体の断片化はミクロセルにガンマ線照射することにより行なった (Koiら， Science, 260:361， 1993) 。 約 108個の A9/#14より取得したミクロセル を 5mlの DMEMに懸濁し、 ガンマセル 40 (前記） により、 氷上で 30Gyのガンマ線を 照射した （1.20ノ分 25分） 。 ガンマ線照射したミクロセルを未照射ミクロセル と同様に融合、 薬剤耐性株選抜を行なった結果、 薬剤耐性株の出現頻度は TT2細胞 107個あたり 3個であった。 薬剤耐性株については （実施例 2) と同様にして凍結 保存、 DNA取得を行なった。
ガンマ線未照射ミクロセル移入による G418耐性株 1-4、 1-5、 ガンマ線 （30Gy) 照射ミクロセル移入による G418耐性株 3-1、 3-2計 4株におけるヒ ト 14番染色体ま たは部分断片の保持は以下の （1) 、 (2) により確認した。
( 1 ) PCR解析 (第 10図)
薬剤耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒ ト 14番染色体上に存在する遺伝子 （O'Brie n, Genetic Maps, 6th edition, Book 5, Cold Spring Harbor Laboratory ？ res s， 1993 ) 及び多型性マーカー （Polymorphic STS Primer Pair BIOS社： D14S43, D14S51, D14S62, D14S65, D14S66, D14S67, D14S72, D14S75, D14S78, D14S81, PCI ； Nature 359:794, 1992; Nature Genetics, 7:22, 1994) の存在を PCR法によ り検出した。 GenBank、 EMBL等のデータベースより入手した塩基配列をもとに作 製した遺伝子プライマ一オリゴヌクレオチドの配列を記す。
NP (nucleoside phosphorylase) ： 5' -ATAGAGGGTACCCACTCTGG (配列番号 31)， 5' -AACCAGGTAGGTTGATATGG (配列番号 32)
TCRA (T-cell receptor alpha) ： 5' -AAGTTCCTGTGATGTCAAGC (配列番号 33)， 5' - TCATGAGCAGATTAAACCCG (配列番号 34)
MYH6 (myos i n heavy chai n cardiac) ： 5' -TGTGAAGGAGGACCAGGTGT (配列番号 3 5), 5' -TGTAGGGGTTGACAGTGACA (配列番号 36)
IGA2 ( immunoglobul i n alpha-2 cons tant) ： 5' -CTGAGAGATGCCTCTGGTGC (配列 番号 37)， 5' -GGCGGTTAGTGGGGTCTTCA (配列番号 38)
IGG1 ( immunoglobul in gamma- 1 constant) ： 5' -GGTGTCGTGGAACTCAGGCG (配列 番号 39)， 5' -CTGGTGCAGGACGGTGAGGA (配列番号 40)
IGM ( immunogl obul in mu cons tant) ： 5' -GCATCCTGACCGTGTCCGAA (配列番号 41)， 5' -GGGTCAGTAGCAGGTGCCAG (配列番号 42)
IGVH3 ( immunoglobul in heavy variabl e- 3 ) ： 5' -AGTGAGATAAGCAGTGGATG (配 列番号 43)， 5' -GTTGTGCTACTCCCATCACT (配列番号 44)
薬剤耐性株 4株のゲノム DNAを铸型として、 上記の 18種のプライマーについて (実施例 2) 同様に PCR増幅を行なった結果、 全て、 あるいは一部のプライマーに ついて期待される増幅産物が確認された。 ガンマ線照射したミクロセルを用いて 得られた薬剤耐性株 3-1、 3- 2は、 14番染色体の一部領域を欠失している傾向が認 められた。 また、 未照射ミクロセルを用いた場合でも 1-4株のごとく欠失がみら れるものもあった。 以上の結果を第 10図に示す。 第 10図において、 左側にヒ ト 14 番染色体の Gバンド像に基づく模式的な染色体地図、 また、 位置が明らかになつ ているいくつかのマーカーについてはどのバンドに位置するかを示した （実施例 2参照） 。 遺伝子及び多型性マーカーの並び方は、 現在までに入手出来る情報 （ 実施例 2参照） を基に、 大まかな位置関係を示したもので、 順序は必ずしも正確 ではない。 4種の G418耐性 TT2細胞株について、 PCRにより期待される増幅産物が 検出されたマーカ一は國で、 検出されなかったマーカ一を□で示した。 A 9/#14 は染色体供与細胞である。 右端には実施例 11 ( 1) の結果が示されている。
( 2 ) フルォレツセンスインサイチューハイブリダィゼーシヨン （FISH)
F ISH解析は （松原ら， FISH実験プロトコール、 秀潤社、 1994) に記された方法 に従い、 ヒ ト 14番染色体特異的プローブ (CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, Cambi o 社） を用いて行なった。 その結果、 4株すべてについてほとんどの分裂像に、 ヒ ト 14番染色体あるいはその部分断片が、 独立した染色体として観察された。 観察 されるヒ 卜染色体の相対的な大きさは、 PCR解析の結果から推測されるそれと一 致していた。
以上の実験により、 得られた G418耐性株 1 -4、 1 -5、 3-1、 3-2はヒ 卜 14番染色体 の全てあるいはその部分断片を保持することが確かめられた。
(実施例 10) ヒ ト 14番染色体断片を保持する ES細胞からのキメラマウス作製
(実施例 9) で得られ、 ヒ ト 14番染色体を保持していることが確認された G418 耐性 ES細胞株 4株 （1-4、 3-1、 3-2、 1 -5) を凍結ス トックより立ち上げ、 I CRあ るいは MCH ( I CR) (日本クレア社） 雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あ たり 8〜10個注入した。 E S培地 （実施例 9 ) で一晩培養して胚盤胞に発生させ た後、 偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 ICRマウス （日本クレア社） の子宮に片側の子宮 あたり約 10個のインジェクション胚を移植した。 その結果を （第 3表） に示す。 第 3表. ヒ ト 14番染色体 （断片） を保持する TT2 細胞株からのキメラマウス作製
ES細胞株/ G418耐性 ES細胞を注入し 子マウス キメラマウス 毛色への貢献率 ヒト染色体 株番号 た 8細胞期胚数 の数 の数 〜20% 20- 50% 50- 80%
TT2/#14 1 -4 98 20 1
1 -5 110 14 2 1 - 3-1 103 11 2 1 1 3-2 183 19 3 - 2
計 494個の注入胚を移植した結果、 64匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において宿主胚 （I CR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色 （濃茶） が認 められるかどうかにより判定される。 誕生した 64匹のうち毛色に明らかに野生色 の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 8匹であった。 また、 最高の貢献率は 1 -4由来の 1個体における約 80%であった。
この結果より、 ヒ ト 14番染色体またはその断片を保持する G418耐性 ES細胞株 （1 - 4、 1-5、 3- 1、 3-2) はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の 正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。
(実施例 11) ヒ ト 14番染色体断片を保持する ES細胞由来キメラマウスにおける ヒ ト 14番染色体断片の保持確認
(実施例 10) で得られたキメラマウスにおけるヒ ト 14番染色体部分断片の保持 は以下の （1) 〜 （3) により確認した。
( 1) 各種組織由来 DNAを用いた PCR解析
キメラマウスのうち 3-1由来の 1個体 （K3- 1 - 1： キメラ率約 25! について （実 施例 4) と同様に尻尾よりゲノム DNAを調製した。 それを铸型とし、 （実施例 9) で示した 14番染色体解析用プライマーのうち 3-1で検出された 14種全てについて P CR解析を行なった。 その結果、 14種すべてについて期待される増幅産物が検出さ れた （第 10図） 。
さらに、 同じ個体 （K3- 1-1) について脳、 腎臓、 脾臓、 心臓、 肝臓、 胸腺から Puregene DNA I solat i on K によりゲノム DNAを取得し、 それぞれの組織につい て、 IGMプライマ一 （実施例 9) を用いた PCR解析を行なった。 その結果全ての組 織において期待される増幅産物が確認された （第 11図） 。 PCR産物は 2¾!ァガロー スゲルにて電気泳動した後、 臭化工チジゥム染色して検出した。 第 11図において、 各レーンは左から B：脳、 K：腎臓、 Sp：脾臓、 H：心臓、 L：肝臓、 Th：胸腺、 pc ： ヒ ト繊維芽細胞 （HFL- 1) DNA (陽性コン トロール） 、 nc :非キメラマウス尻尾 DNA (陰性コン トロール） 、 M : マーカー （H i nd l l l消化 λ βΝΑ + Η&ε Ι Η消化 0 X174 DNA, 宝酒造） を示す。
(2) 尻尾由来繊維芽細胞の G418耐性試験
キメラマウスのうち、 3- 2由来の 2個体 （Κ3- 2-1： キメラ率約 25¾!，Κ3- 2- 3： キメ ラ率約 50 ) 、 1 -4由来の 1個体 （K1-4- 1： キメラ率約 80 ) について尻尾から以下 のように繊維芽細胞を調製した。 DNA調製 （実施例 4) と同様に 3〜6週令のキメラ マウスの尻尾を 5誦〜 10mm切断し、 PBS/lmM EDTAで数回洗浄した後、 メスで切れ 込みをいれて表皮を除去し、 内部の組織をメスで細かく切り刻む。 組織細片を 5m 1の PBS/lmM EDTAをいれたチューブに移し、 30分〜 1 時間室温静置する。 その後、 lmlの PBS/EDTAを残して上清を取り除き、 1mlの 0. 25%トリプシン/ PBSを加え、 5〜 10分間室温でタツビングあるいはピベッティングしながら組織をよくほぐす。 10 OOrpm, 10分間遠心し、 沈殿を 2mlの DMEM (10¾FCS) に懸濁し、 35mmシャーレに播 種する。 7〜10日の培養後、 トリプシン処理により細胞をシャーレからはがし、 シャーレあたり約 104個の細胞を 35mmシャーレ 4枚に播種し、 うち 2枚に 400 g/ml の G418を加え、 5〜7日間培養し、 それぞれのシャーレの生胞数をカウントする。 この条件で、 野生型 ICRマウス由来の繊維芽細胞は、 G418存在下でほぼ 100¾ί死滅 する。 非選択培地での生細胞数に対する選択培地での生細胞数の割合は、 G418耐 性繊維芽細胞の増殖速度が 2つの条件で同等であると仮定すれば、 G418耐性 ES細 胞株由来繊維芽細胞の繊維芽細胞集団における貢献率を反映していると考えられ る。 この結果、 （第 12図） に示した通り、 3個体共 G418耐性の繊維芽細胞の存 在が認められた。 第 12図において、 耐性率はそれぞれの個体について 2組の選択 Ζ非選択 35imnシャーレから得られた値を平均した。 ICR は野生型 ICRマウスを示 す。
(3) 尻尾由来 G418耐性繊維芽細胞の FISH解析
(実施例 2) と同様な方法で、 上記 （2) で得られた G418耐性繊維芽細胞 （K3 - 2 -3, K1- 4-1由来） の FISH解析を行なった。 プローブは HFい 1細胞 （実施例 1) より 抽出したヒ ト全 DNAを FITC標識した （松原ら， FISH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 994) ものを用いた。 その結果、 2個体共、 ほとんどの分裂像に独立したヒ ト染色 部分断片が観察された。
これらの結果より、 ヒ ト 14番染色体部分断片を保持した TT2細胞株はマウス個 体において種々'の正常組織に貢献し、 かつヒ 卜 14番染色体部分断片を保持してい ることが確かめられた。
(実施例 12) ヒ ト 2番染色体部分断片の ES細胞への導入
染色体供与細胞として、 （実施例 1) で得られたヒ ト 2番染色体部分断片を保持 するマウス A9細胞 W23 (以下 A9/#2 W23、 という） を用いた。 染色体受容細胞とし てはマウス ES細胞株 TT2 (実施例 9) を用いた。 ミクロセル融合実験および G418耐 性株の選択は （実施例 2 ) と同様に行なった。 薬剤耐性株の出現頻度は TT2細胞 1(Τ 個あたり 1〜3個であった。 薬剤耐性株の凍結保存、 ゲノム DNA取得は （実施例 2 ) と同様に行なった。 薬剤耐性株 5-1、 5-2、 5- 3におけるヒ ト 2番染色体部分断片の 保持は以下の （1) 、 (2) により確認した。
(1) PCR解析
薬剤耐性株ゲノム DNAを鋅型としてヒ ト 2番染色体上に存在する遺伝子 （Genet i c Maps,前記） のうち、 染色体供与細胞 A9/#2 W23において検出された C c、 FABP 1の存在を PCR法により検出した。
各プライマーについて PCR増幅を行なった結果、 3株共に、 両方のプライマーに ついて期待される増幅産物が確認された。
(2) フルォレツセンス in s i tuハイブリダィゼーシヨ ン （FISH)
FISH解折は （実施例 2) と同様な方法で、 ヒ ト 2番染色体特異的プローブ （CHR0 OSOME PAINTING SYSTEM, Cambi o社） を用いて行なった。 その結果、 3株すベて のほとんどの分裂像において、 ヒ ト 2番染色体部分断片が独立した染色体として 検出された。 その大きさは A9/#2 W23で観察されたものと同等であった。
以上の実験により、 得られた G418耐性株はヒ ト 2番染色体部分断片を保持する ことが確かめられた。
(実施例 13) ヒ ト 2番染色体断片を保持する ES細胞からのキメラマウス作製
(実施例 12) で得られ、 ヒ ト 2番染色体部分断片を保持していることが確認さ れた G418耐性 ES細胞株 5-1を凍結ストツクより立ち上げ、 ICRあるいは MCH(ICR) (日本クレア社） 雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12 個注入した。 E S培地 （実施例 9 ) で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、 偽妊 娠処理後 2. 5日の仮親 ICRマウス （日本クレア社） の子宮に片側の子宮あたり約 10個のィンジェ 'クション胚を移植した。
キメラ作製の結果を （第 4表） に示す。 第 4表. ヒ ト 2番染色体 （断片） を保持する TT2 細胞株からのキメラマウス作製
ES細胞株/ G418耐性 ES細胞を注入し 子マウス キメラマウス 毛色への貢献率 ヒト染色体 株番号 た 8細胞期胚数 の数 の数 〜20!¾ 20- 50ί¾ 50- 80!¾
ΤΤ2/#2 1 264 51 18 7 5 6
(W23)
計 264個の注入胚を移植した結果、 51匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において宿主胚 （ICR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色 （濃茶） が認 められるかどうかにより判定される。 誕生した 51匹のうち毛色に明らかに野生色 の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 18匹であった。 また、 最高の貢献率は約 80%であつた。
この結果より、 ヒ ト 2番染色体部分断片を保持する G418耐性 ES細胞 （5-1) はキ メラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保 持していることが確認された。
(実施例 14) ヒ ト 14番染色体断片導入キメラマウス血清におけるヒ ト抗体重鎖の 検出
血清中のヒ ト抗体濃度をェンザィムリ ンク ドィムノソルベン トアツセィ（ELISA) を用いて測定した。 ELISA は以下に記載されている方法に従った。 富山 ·安東、 単クローン抗体実験マニュアル、 講談社、 1987; 安東 '千葉、 単クローン抗体実 験操作入門、 講談社、 1991; 石川、 超高感度酵素免疫測定法、 学会出版センタ一、 1993； Ed Harlow and David Lane, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Sp ring Harbor Laboratory, 1988; A. Doyle and J. B. Griff i ths, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons Ltd. , 1996 0 これらの 文献に記載の方法を参考にして、 測定系によっては反応時間や温度を 4 てで終夜 行うなどの改良を行った。 測定しょうとするヒ 卜免疫グロプリンに対する抗体あ るいは抗原を、 0.5 から 10 g/ml程度に（100から 5000倍） に希釈し、 EL1SA プレ ー トを 4 °Cで一晚コ一ティングした。 血清試料の測定では、 ブロッキング、 試料 および標識抗体の希釈に 5¾!マウス血清 （シグマ、 M5905)を添加した PBSを、 ハイ プリ ドーマ培養上清の測定には 1%牛胎児血清を添加した PBSを用いた。 20倍にキ メラマウス血清を希釈する場合には PBSを用いて希釈した。 コ一ティングしたプ レー トを洗浄した後、 ブロッキングを 1時間以上行った。 プレー トを洗浄後、 試 料を加え 30分以上ィンキュベ一トした。 プレート洗浄後 100 から 5000倍に希釈し た酵素標識抗ヒ ト免疫グロプリン抗体を加えて、 1時間以上ィンキュベ一トした 後、 プレートを洗浄し基質液を加えて発色させた。 また測定系によって、 基本的 には同じ操作で、 ピオチン標識した抗体を用い、 プレート洗浄後これにアビジン 一酵素複合体を加えてィンキュベートした後洗浄し基質液を加えた。 マイクロプ レートリーダ— （バイオテック、 EL312e) で吸光度を測定した。
生後 29曰から 35日のキメラマウス （実施例 10、 K3-1-2, K3-2- 2， K3-2-3) より 採血し EL I SAで解析した。 50mMの炭酸—炭酸水素バッファ一 pH9. 6で希釈した抗 ヒ ト IgMマウスモノクローナル抗体 （シグマ， 16385) を 96穴マイクロタイタープ レートにコーティ ングし、 マウス血清 （シグマ、 M5905) を加えた PBSで希釈した 血清試料を加えた。 次いでペルォキシダーゼ標識抗ヒ ト I gMャギ抗体 （Tago，2392) を加えてィンキュベートした後、 ABTS基質 （Ki rkegaard & Perry Laborator i es Inc. , 506200) の添加により酵素活性を 405nmの吸光度で評価した。 精製されたヒ ト I gM抗体 （オルガノン ·テク二力， 6001-1590 ) またはヒ ト I gG抗体 （シグマ， 14506)を標準とした。 標準はマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。 ま たヒ ト I gG測定には抗ヒ ト I gGャギ抗体 （シグマ， 13382) をプレートに固定し、 ペルォキシダーゼ標識抗ヒ ト I gGャギ抗体 （シグマ， A0170) で検出した。 その結 果を （第 5表） に示す。 ヒ ト I gMと I gGは共に検出された。
また生後 27日、 34日、 41日の 3回にわたりヒ ト 14番染色体断片を保持したキメ ラマウス （実施例 10、 K3- 1- 1, K3-2-1) に、 PBSに溶解したヒ ト血清アルブミ ン (HSA,シグマ， A3782) 2mlをアジュバント （MPL+TDM Emul s i on, R I B I Immunochem Reseach I nc. ) と混合しその 0. 25mg/ml を 0. 2 mlを免疫した。 このキメラマウ ス血清も同様に EL ISAによって解析した。 その結果を （第 13図、 第 14図） に示す。 結果は、 HSAで免疫したキメラマウス血清中のヒ ト抗体濃度は免疫後上昇し、 個体 K3- 1-1ではヒ ト IgM18 ig/mlと IgG2.6^g/mlが免疫後 17日目の血清中に検出さ れた。 ヒ ト染色体を導入していないマウスの血清ではヒ 卜抗体の力価は有意では なカヽった。 第 5表. キメラマウス血清中のヒ ト抗体濃度（ELISA) キメラマウス IgG (mg/1) IgM (mg/1)
K3-1-2 0.37 3.7
K3-2-2 0.33 5.9
K3-2-3 0.51 3.4
(実施例 15) ヒ ト 14 番染色体導入キメラマウスからのヒ ト抗体重鎮産生ハイ プリ ドーマ取得
(実施例 14) においてヒ トアルブミンで免疫したキメラマウス（K3-卜 1， 実施 例 14) から生後 44日目に脾臓を取り出し、 ミエ口一マ細胞と細胞融合し、 ハイブ リ ドーマを作製した。 ハイプリ ドーマの作製法は 〈安東、 単クローン抗体実験操 作入門、 講談社サイェンティフイク， 1991〉 に記された方法に従い、 ミエローマ 細胞としては、 P3X63-Ag.8.653 (大日本製薬より購入、 05-565) を使用した。 96 穴プレート 10枚にまき込み、 1週間培養後培養上清を ELISA法で解析した。 ELISA 法は抗ヒ ト IgMマウスモノクローナル抗体 （シグマ、 16385) をプレートに固定化 して実施例 14と同様に行ない、 陽性のクローンを 6個得た。 また HSAを抗原とし 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー pH9.6で濃度 の溶液とし、 EL1SAプレー 卜の全ゥエルに 100 // 1づっ分注した。 ペルォキシダ一ゼで標識した抗ヒ ト IgA g G+lgMャギ抗体 （Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. , 04-10-17) を用いて 検出した。 プレート 10枚中陽性のクローンを 1つ確認した。 このクローンは 6個 のヒ 卜 IgM陽性クローンのうちの 1つであった。 このクローン （H4B7) をさらに 培養し、 培養上清を希釈し HSAを抗原として上述のようにペルォキシダ一ゼ標識抗 ヒ ト I gMャギ抗体 （Tago， 2392) を用いて EL I SAを行なったところ、 培養上清 の希釈率の増加にともなって吸光度の減少が認められた。 一方ヒ ト i gM (オルガ ノン ·テク二力， 6001- 1590)を培地によって 2 ; g/mlに希釈した試料では希釈率 によらず吸光度は低かった。 これはハイプリ ドーマ H4B7が生産する抗体が HSAに 特異性のある抗体であることを示唆するものである （第 15図） 。 第 15図において、 横軸は培養上清試料の希釈率を縦軸は 405nmにおける吸光度を示した。
(実施例 16) G418耐性マーキングされたヒ ト 2番染色体断片のピューロマイシ ン耐性による再マ一キング
G418耐性で標識されたヒ 卜 2番染色体断片を保持する Α9細胞 （W23) ( 実施例 第 1図参照） を lOOmmシャーレで G418 (800 ^ g/ml) を含む選択培地 （10%FBS、 DM EM) で培養した。 ピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミ ド pPGKPuro (WH IT EHBAD INSTITUTE, Dr. Pe ter W. Lai rd から分与） をトランスフヱクシヨ ン前に制 限酵素 Sai l (宝酒造） で線状化した。 細胞をトリプシン処理し、 5xl06 個 Zmlと なるようにダルベッコのリン酸バッファー （PBS) に懸濁してから 10 /z gDNA存在 下でジーンパルサ一 （バイオラッ ド） を用いてエレク トロポレーシヨ ン （実施例 1参照） を行なった。 25 / Fの容量で 1000Vの電圧を 4 nun長のエレク トロポレーシ ヨンセル （実施例 1 ) を用いて室温で印加した。 エレク トロポレーシヨンした細 胞を 100mmシャーレ 3〜 6枚に播種した。 1 日後に lO z g/mlのピュー口マイシン
(シグマ， P-7255) および G418 (800 ^ g/ml) を含む二重選択培地と置き換えた。 2 〜3週間後に生じたコロニー 200個程度を一つの集団としてまとめた。 この細胞を 3つの集団についてそれぞれ 25cm2フラスコ 2〜 3本中で培養し、 ミクロセルを形 成させ 25cm2フラスコで培養したマウス A9細胞と実施例 1と同様に融合した。 100m mシャーレ 2枚に移し G418とピュー口マイシンを含む上記の二重選択培地で培養 し、 3つの集団のうち 1つの集団から 2つの二重薬剤耐性クローンが得られた。 こ のクローンではヒ ト 2番染色体断片にピューロマイシン耐性マーカーが導入され た可能性が高い。
(実施例 Π) ヒ ト染色体導入 ES細胞における導入ヒ ト染色体倍加
G418耐性遺伝子でマ一キングされたヒ ト 14番染色体断片を保持する ES細胞株 （ E14/#14-36) を、 高濃度の G418を添加した培地中で培養することにより、 ヒ ト染 色体が倍化した ES細胞のクローンを取得した （バイオマニュアルシリーズ 8、 ジ ーンターゲテイ ング、 羊土社、 1995) 。 G418耐性マウス初代細胞 （ライフテック オリエンタルより購入） をマイ トマィシン処理することなく 100議シャーレに播 種し栄養細胞とした。 この 100mmシャーレに E14/#14- 36 を播種し、 半日後 G418濃 度 16mg/mlの培地と交換した。 1〜2日毎に培地交換し 1週間後に G418 濃度を 10 m g/mlとして培養を続け、 生じたコロニーの中から 15個を取り出し培養し、 染色 体をヒ ト 14番特異的プローブ （実施例 9参照） を用いて F I SH解析した。 結果とし て 8クローンでヒ ト 14番染色体断片が倍化していた。
(実施例 18) ヒ ト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を同時に保持する マウス ES細胞株の取得
(実施例 16) において取得した二重薬剤耐性クローンのうち PG1をミクロセル 供与細胞、 野性型 A9細胞を受容細胞としたミクロセル移入実験により、 PG1が保 持するヒ ト 2番染色体部分断片がさらにピューロマイシン耐性遺伝子によりマー キングされていることを確認した。 ミクロセル取得及び A9細胞との融合は （実施 例 1) と同様に行なった。 その結果、 ミクロセル融合 10日後に計 59個の G418耐性 コロニーが出現した。 これらのコロニーについて 8〃g/mlのピュー口マイシンを 含む培地に交換後、 さらに 3日間培養したところ、 45個 （765 のコロニーが生 存した。 ミクロセル法においては、 1つの受容細胞に、 多くの場合 1本あるいは 少数の染色体のみが移入されることから、 両耐性遺伝子が高率に同時に移入され ることは、 すなわち、 PG1が保持する G418耐性標識されたヒ ト 2番染色体部分断 片がピューロマ'ィシン耐性遺伝子によりマーキングされていることを示している c さらに、 ヒ ト 2番染色体部分断片上の各マーカ一遺伝子検出のため、 A9/#2 W23
(G418耐性のみ：実施例 16) については pSTneoB (実施例 1) 、 PG1については pPG Puro (実施例 16) をプローブとした F I SH解析を行なった （松原ら， F I SH実験 プロ トコ一ル， 秀潤社， 1994) 。 その結果、 A9/#2 W23では （実施例 12) で確認 されたヒ ト 2番染色体部分断片のそれぞれの姉妹染色分体上に 1個づつ、 計 2個 のシグナルが観察された。 これは、 ヒ ト 2番染色体部分断片上の 1箇所に pSTneo Bが挿入されていることを示す。 また、 PG1では同等の大きさの染色体断片上に 計 4個のシグナルが観察された。 pSTneoBと pPGKPuroはべクタ一部分で相同の配 列を持つので、 pPGKPuroプローブでは pSTneoBも検出される。 すなわち、 PG1で 観察された 4個のシグナルのうち、 2個は pSTneoB、 一方の 2個は pPGKPuro由来 のシグナルと考えられる。 この結果より、 PG1が保持するヒ ト 2番染色体部分断 片は、 G418耐性、 ピューロマイシン耐性両者によりマーキングされていることが 確認された。
ヒ ト 2番染色体部分断片、 14番染色体部分断片を同時に保持するマウス ES細胞 取得のため、 染色体供与細胞としてこの PG1細胞株を用いた。 染色体受容細胞と してはすでにヒ 卜 14番染色体部分断片を保持している G418耐性 TT2細胞株 1-4 ( 実施例 9) を用いた。 ミクロセル融合実験およびピューロマイシン耐性株の選択 は 0. 75 g/mlのピューロマイシン濃度で他は （実施例 9) の G418耐性株選択の場 合と同様に行なった。 この結果出現したピュー口マイシン耐性株の出現頻度は 1- 4細胞 107個あたり 3〜7個であった。 これらのピュー口マイシン耐性株は 300 / g/mlの G418存在下でも増殖することから G418耐性も同時に保持していることが 確認された。 二重薬剤耐性株の凍結保存、 ゲノム DNA取得は （実施例 2) と同様 に行なった。 ヒ ト 2番染色体部分断片及び、 ヒ ト 14番染色体部分断片の保持は二 重薬剤耐性株 PG5、 PG15、 PG16については以下の （1) により、 PG15については さらに （2) により確認した。
(1) PCR解析
二重薬剤耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒ ト 2番、 14番染色体上に存在する遺 伝子 （Gene t i c Maps，前記） のうち、 2番染色体については （実施例 12； A9/#2 W23) 、 14番染色体については （実施例 9； TT2/#14 1-4) で存在が確認されて いる各プライマ一について PCR増幅を行なった結果、 3株共に、 全てのプライマ 一について期待される増幅産物が確認された。
(2) フルォレツセンス i n s i tuハイブリダィゼーシヨ ン （FISH)
FISH解析は （実施例 11) と同様に、 ヒ ト全 DNAを F 1TC標識したものをプローブ として用いて行なった。 その結果、 ほとんどの分裂像において、 大小 2つのヒ ト 染色体断片が確認された。 大きい方は （実施例 9； ΤΤ2/ίί14 1-4) でヒ ト 14番染 色体特異的プローブにより確認された部分断片と、 小さい方は （実施例 12 ; ΤΤ2/ #2 5-1) でヒ ト 2番染色体特異的プローブにより確認された部分断片と同等の大 きさであった。 （第 16図） にその結果を示す。 図中輝度の低い染色体はマウス由 来のもの、 FITCの蛍光により輝度の高い大小 2つの染色体断片 （矢印にて指示） はヒ 卜由来のものであり、 それぞれヒ ト 14番、 2番染色体部分断片と考えられる。 以上の実験により、 得られた二重耐性 ES細胞株はヒ 卜 2番染色体部分断片、 14 番染色体部分断片を同時に保持することが確かめられた。
(実施例 19) ヒ ト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を同時に保持する マウス ES細胞株からのキメラマウス作製
(実施例 18) で得られ、 ヒ ト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保 持していることが確認された G418、 ピューロマイシン二重耐性 TT2細胞株 PG5、 PG15、 PG16を凍結ストックより立ち上げ、 ICRまたは MCH(ICR) (日本クレア社） 雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注入した。 ES細 胞用培地 （実施例 9) で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、 偽妊娠処理後 2. 5 日の仮親 ICRマウス （日本クレア社） の子宮に片側の子宮あたり約 10個のインジ ェクション胚を移植した。
キメラ作製の結果を （第 6表） に示す。 第 6表. ヒ ト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を同時に保持するマウ ス ES細胞株からのキメラマウス作製
ES細胞株/ 2重耐性 ES細胞を注入し 子マウス キメラマウス 毛色への貢献率 ヒト染色体 株番号 た 8細胞期胚数 の数 の数 〜10% 10-50¾ 50%〜
TT2/ PG5 160 26 8
#14+#2 PG15 168 15 3
PG16 223 32 12
計 551個の注入胚を移植した結果、 73匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は. 毛色において宿主胚 （ICR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色 （濃茶） が 認められるかどうかにより判定される。 誕生した 73匹のうち毛色に明らかに野生 色の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 23匹であった。 この結果より、 ヒ ト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保持する ES 細胞株 （PG5、 PG15、 PG16) はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個 体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。
(実施例 20) ヒ ト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を同時に保持する ES細胞由来キメラマウス血清におけるヒ ト抗体の検出
(実施例 19) で作製したキメラマウスのうち、 KPG-15 (9週齢； PG5由来、 キ メラ率 10%) 、 KPG-18 (5週齢； PG5由来、 キメラ率 10%) の 2匹に対して、 PB Sに溶解したヒ ト血清アルブミン （HSA、 シグマ、 A3782) とアジュバント （MP L+TDM Emul s i on, RIBI Immunochem Reseach Inc. ) とを混合して 0. 25mg/mlの HS A溶液を調整し 0. 2mlを免疫した。 免疫直前、 及び 8日後のキメラマウスより採 血し、 血清中のヒ ト抗体/ /鎖およびヒ ト抗体/ c鎖を EL 1SA法を用いて検出した （ 実施例 14参照） 。 50mMの炭酸一炭酸水素バッファ一 pH9. 6で希釈した抗ヒ ト抗体 鎖ャギ抗体 （VECTOR LABORATORIES, IN 、 A I -3060) を 96穴マイクロタイター プレートにコ一ティングし、 血清試料を加え、 次いでピオチン標識抗ヒ ト抗体/ c 鎖ャギ抗体 （VECTOR LABORATORIES, INC. , ΒΑ-3060) を加えてインキュベートし さらにピオチン化ヮサビペルォキシダーゼとアビジン DHの複合体 （VECTOR LABOR AT0R IES, INC.、 Vectas i n ABCキッ ト PK4000) を加えてインキュベートした後、 ペルォキシダーゼ基質として 3， 3'，5, 5' -テトラメチルベンチジン （TMBZ、 住友べ 一クライ ト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。 精 製された/ c鎖を持つ濃度既知のヒ ト IgG (シグマ、 1 -3889) を標準としマウス血 清を添加した PBSで段階的に希釈した。 鎖については 50mMの炭酸—炭酸水素バ ッファー pH9. 6で希釈した抗ヒ ト 鎖マウスモノクローナル抗体 （シグマ、 卜 63 85) を 96穴マイクロタイタープレートにコーティ ングし、 血清試料を加え、 次い でペルォキシダーゼ標識抗ヒ ト ^鎖マウス抗体 （The Bi nding S i te Limi ted. M P008) を加えてインキュベートした後、 TMBZ (住友べ一クライ ト、 Mい 1120T) の 添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。 精製された//鎖を持つ濃度既 知のヒ ト IgM (オルガノン ·テク二力、 6001-1590) を標準としマウス血清 （シ グマ、 M5905) を添加した PBSで段階的に希釈した。 その結果、 2個体とも免疫 前においてヒ ト抗体 鎖、 /c鎖両者が検出され、 その血清中濃度は、 免疫後上昇 した （第 7表、 第 8表） 。 第 7表. キメラマウス KPG 1 5中のヒ ト抗体濃度 （EL I S A)
I gM (m g/ 1 ) I g K (m g/ 1 ) 免疫前 0. 1 9 1. 6
免疫後 8日目 0. 7 5 1. 7
第 8表. キメラマウス KPG 1 8中のヒ ト抗体濃度 （EL I S A)
I gM (mg/ 1 ) I g /c (mg/ 1 ) 免疫前 0. 2 9 0. 5 7
免疫後 8日目 3. 4 0. 8 7
この結果より'、 ヒ ト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保持する ES 細胞由来キメラマウスにおいてヒ ト抗体重鎖、 軽鎖遺伝子は機能することが確認 された。
(実施例 21) ヒ ト 14番染色体断片導入キメラマウス血清における抗 HSAヒ 卜抗体 ァ鎖の検出
(実施例 10) と同様にして作製したヒ ト 14番染色体断片を保持したキメラマウ ス （K9、 K11；共に ΤΤ2細胞株 3- 2由来、 キメラ率はそれぞれ 50 、 30¾) に対 して、 生後 79日、 93日、 107日、 133日の 4回 （Κ9) 、 または生後 74日、 88日、 111日 （Kll) の 3回にわたり （実施例 20) と同様に HSAを免疫した。 このキメ ラマウス血清中のヒ ト血清アルブミンに対するヒ トァ鎖を含む抗体を ELISA法に よって検出した （実施例 14参照） 。 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー pH9. 6で希 釈した HSA (シグマ、 A 3782) を 96穴マイクロタイタープレートにコ一ティ ング し、 試料を加え、 次いでペルォキシダーゼ標識抗ヒ 卜 IgGマウス抗体 （ファーミ ンジヱン、 08007E) を加えてインキュベートした後、 ペルォキシダーゼ基質とし て 0—フヱニレンジァミ ン （0PD、 住友べ一クライ ト、 ML- 11300) の添加により 酵素活性を 490nmの吸光度で評価した。 HSAで免疫したキメラマウス血清中の抗 HSAヒ ト IgGの力価は免疫後上昇した。 対照 ICRマウスでは、 HSA免疫後の抗 HS Aヒ ト IgGの力価はバックグランドレベルであった。 結果を （第 17図） に示した。 第 17図において横軸はキメラマウスに HSAを免疫してからの日数を、 縦軸は 490η mにおける吸光度を示した。 この結果より、 ヒ ト 14番染色体部分断片を保持する キメラマウスにおいて、 HSA抗原刺激に対して抗原特異的ヒ ト IgGの抗体価上昇 が起こることが確認された。
(実施例 22) ヒ ト 22番染色体断片導入キメラマウス血清におけるヒ ト抗体 λ鎖の 検出
9ヶ月齢のキメラマウス （実施例 3、 Κ22- 7； キメラ率 10%) より採血し、 血 清中のヒ ト抗体； I鎖を ELISA法を用いて検出した （実施例 14参照） 。 50mMの炭酸 一炭酸水素バッファー pH9. 6で希釈した抗ヒ ト抗体 λ鎖ャギ抗体 （VECTOR LABOR ATORIES, INC.、 A卜 3070) を 96穴マイクロタイタープレートにコーティングし、 血清試料を加え、 次いでビォチン標識抗ヒ ト抗体 λ鎖ャギ抗体 （VECTOR LABORAT 0RIES， 1NC.、 BA-3070) を加えてインキュベートしさらにピオチン化ヮサビペル ォキシダ一ゼとアビジン DHとの複合体 （VECTOR LABORATORIES, INC. . Vectas tain ABCキッ ト PK4000) を加えてインキュベートした後、 ペルォキシダーゼ基質とし て TMBZ (住友べ一クライ ト、 ML- 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度 で評価した。 精製された； I鎖を持つ濃度既知のヒ ト I gG (シグマ、 1 -4014) を標 準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。 180ng/mlのヒ ト I gGに相 当する濃度のヒ ト抗体 λ鎖がキメラマウス中に検出された。 この結果より、 ヒ ト 22番染色体を保持するキメラマウスにおいてヒ ト抗体 λ鎖遺伝子が機能すること が確認された。
(実施例 23) ヒ 卜 2番染色体断片導入キメラマウス血清におけるヒ ト抗体/ c鎖の 検出
5週齢のキメラマウス （実施例 13、 Κ2- 8、 キメラ率は 70%) および 9週齢のキ メラマウス （実施例 13、 Κ2-3, K2-4、 K2-12, キメラ率はそれぞれ 50%、 20¾, 80¾) より採血し、 血清中のヒ ト抗体/ c鎖を EL ISA法を用いて検出した （実施例 14) 。 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー ρΗ9. 6で希釈した抗ヒ ト抗体/ c鎖ャギ抗 体 （VECTOR LABORATORIES, INC.、 AI-3060) を 96穴マイクロタイタ一プレートに コ一ティ ングし、 血清試料を加え、 次いでピオチン標識抗ヒ ト抗体 鎖ャギ抗体 (VECTOR LABORATORIES, INC.、 BA-3060) を加えてィンキュペートしさらにビォ チン化ヮサビペルォキシダ一ゼとアビジン DHの複合体 （VECTOR LABORATORIES, IN に、 Vectastai n ABCキッ ト） を加えてィンキュベ一トした後、 TMBZ (住友べーク ライ ト、 ML-1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。 精製さ れた c鎖を持つ濃度既知のヒ 卜 IgG (シグマ、 1-3889) を標準としマウス血清を 添加した PBSで段階的に希釈した。 結果を （第 9表） に示した。 第 9表. キメラマウス中のヒ ト抗体/ c鎖濃度 （E L I S A )
キメラマウス Ig / (m g / 1 )
K 2 - 3 1 2 4
Κ 2 - 4 8 5
Κ 2 - 8 2 5
Κ 2 - 1 2 5 6
またヒ ト 2番染色体断片を保持したキメラマウス （実施例 13、 Κ2-3、 および Κ2 -4) に生後 66日、 80日、 102日の 3回にわたり （実施例 20) と同様に HSAを免疫 した。 またキメラマウス （K2- 12) に生後 63日、 77日、 91日、 116日の 4回にわ たり、 このキメラマウス血清中の HSAに対するヒ ト抗体/ c鎖を ELISA法によって 検出した （実施例 14参照） 。 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー pH9. 6で希釈した HSA (シグマ、 A 3782) を 96穴マイクロタイタープレートにコーティ ングし、 試 料を加え、 次いでピオチン標識抗ヒ ト抗体/ c鎖ャギ抗体 （VECTOR LABORATORIES, INC.、 BA-3060) を加えてインキュベートしさらにピオチン化ヮサビペルォキシ ダーゼとアビジン DHの複合体 （VECTOR LABORATOR IES, INC. Vectas tain ABCキッ ト） を加えてインキュベートした後、 ペルォキシダーゼ基質として 0PD (住友べ 一クライ ト、 Mい 11300) の添加により酵素活性を 490nmの吸光度で評価した。 HS Aで免疫したキメラマウス血清中の抗 HSAヒ ト /c鎖の力価は免疫後上昇した。 ― 方対照 ICRマウスでは、 HSA免疫後の抗 HSAヒ ト抗体/ c鎖の力価はバックグラン ドレベルであった。 結果を （第 18図） に示した。 第 18図において横軸はキメラマ ウスに HSAを初めて免疫してからの日数を、 縦軸は 490ηπιにおける吸光度を示し た。 これらの結果より、 ヒ ト 2番染色体部分断片を保持するキメラマウスにおい てヒ ト抗体/ 鎖遺伝子が機能し、 さらには HSA抗原刺激に対して抗原特異的ヒ ト Ig /cの抗体価上昇が起こることが確認された。
(実施例 24) ヒ ト 14番染色体導入キメラマウスからのヒ ト抗体重鎖 （ 鎖もしく はァ鎖） 産生ハイプリ ドーマ取得
(実施例 21) において HSAで免疫したキメラマウス K9から生後 136日目に脾臓 を取り出し、 ミ 'エローマ細胞と細胞融合し、 ハイプリ ドーマを作製した。 ハイブ リ ドーマの作製法は 〈安東 ·千葉、 単クローン抗体実験操作入門、 講談社サイエ ンティフイ ク， 1991〉 に記された方法に従い、 ミエローマ細胞としては、 Sp- 2/0 -Agl4 (大日本製薬、 05-554) を使用した。 培養液に 0RIGEN Hybri doma Cl oni ng
Factor (HCF、 ポクスィ · ブラウン） を 10!¾添加し 96穴プレート 8枚にまき込 み、 3日後に培養液中に G418を lmg/ml添加した。 1〜3週間培養後の培養上清を EL ISA法で解析した （実施例 14参照） 。 鎖は 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー PH9. 6で希釈した抗ヒ ト z鎖マウスモノクローナル抗体 （シグマ、 1-6385) を 96 穴マイクロタイタープレートにコーティングし、 PBSで希釈した試料を加え、 次 いでペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ ト 鎖マウス抗体 （The B i ndi ng S i te Limi ted. MP008) を加えてインキュベートした後、 基質として 2， 2—アジノジー （3—ェ チルベンズチアゾリ ン- 6-スルホン酸） ジアンモニゥム塩 （ABTS、 Ki rkegaard&P erry Laborator i es Inc. . 04-10-17) を用いて検出し 7個の陽性ゥヱルを得た。 y鎖については抗ヒ トァ鎖マウスモノクローナル抗体 （シグマ、 1 -6260) を 96穴 マイクロタイタープレートにコーティングし、 PBSで希釈した試料を加え、 次い でペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ ト 7鎖マウス抗体 （ファーミンジヱン、 08007E) を加えてィンキュベートした後、 ABTS (Ki rkegaard & Perry Laborator i es Inc. 、 04-10-17) を用いて検出し 2個のヒ ト抗体 7鎖陽性ゥヱルを得た。
(実施例 25) ヒ ト 2 番染色体導入キメラマウスからのヒ ト抗体軽鎖産生ハイプリ ドーマ取得
(実施例 23) において HSAで免疫したキメラマウス K2- 3から生後 105日目に脾 臓を取り出し、 ミエローマ細胞と細胞融合し、 ハイプリ ドーマを作製した。 ハイ プリ ドーマの作製法は 〈安東，千葉、 単クローン抗体実験操作入門、 講談社サイ ェンティフイク， 1991〉 に記された方法に従い、 ミエ口一マ細胞としては、 P3X6 3Ag8. 653 (大日本製薬、 05-565) を使用した。 培養液に HCF (ポクスィ · ブラウ ン） を 10%添加し 96穴プレート 10枚にまき込み、 3日後培養液中に G418を lmg/ml 添加し、 1〜3週間培養しコロニーが出現したゥ ルの培養上清を EL ISA法で解 折した。 EL ISA法は （実施例 23) と同様に行ない、 ヒ ト抗体/ c鎖陽性のクローン を 2個得た。 -
(実施例 26) G418耐性マーキングされたヒ ト 22番染色体のピュー口マイシン耐性 による再マ一キング
G418耐性で標識されたヒ ト 22番染色体を保持する A9細胞 （A9/#22ァ 2；実施例 1で取得） について、 （実施例 16) と同様な方法でヒ ト 22番染色体のピューロマ イシン耐性による再マーキングを行った。 ァ 2細胞に pPGKPuroをエレク トロポレ ーションして得られた二重薬剤耐性株コロニー 200個程度を一つの集団とし、 3 つの集団 （Pl、 P2、 P3) を供与細胞として野生型マウス A9細胞へのミクロセル移 入を行なった。 その結果、 P1より 6個、 P2より 1個、 P3より 3個の二重薬剤耐性 クローンが得られた。 取得した二重薬剤耐性クローンのうち P3由来の 6-1をミク ロセル供与細胞、 野性型 A9細胞を受容細胞としたミクロセル移入実験により、 ヒ 卜 22番染色体がさらにピューロマイシン耐性遺伝子によりマーキングされている ことを確認した （実施例 18) 。 ミクロセル取得及び A9細胞との融合は （実施例 1) と同様に行なった。 その結果、 ミクロセル移入 11日後に 28個の G418耐性コロニー が出現した。 これらのコロニーについて 8〃 g/mlのピュー口マイシンを含む培地 に交換した後、 さらに 3日間培養したところ、 21個 （75%) のコロニーが生存し た。 ミクロセル法においては、 1つの供与細胞に、 多くの場合 1本あるいは少数 の染色体のみが移入されることから、 両耐性遺伝子が高率に同時に移入されるこ とは、 すなわち、 6-1が保持する G418耐性標識されたヒ ト 22番染色体がさらにピ ユーロマイシン耐性遺伝子によりマーキングされていることを示している。
(実施例 27) ヒ ト抗体重鎖を産生するハイプリ ドーマからのヒ ト抗体重鎖可変領 域 cDNAの取得及び塩基配列決定
(実施例 15) において取得されたヒ ト抗体重鎖 （IgM) を産生するハイプリ ド —マのうち、 H4B7 (HSA特異的） 及び H8F9 (非特異的） より、 IS0GEN (二ツボン ジーン） を使用して、 総 RNAを取得した。 cDNAの合成は、 Ready- To- Go T-primed
1s t s trandキッ ト （Pharmacia社） を用い各々 5 gの総 RNAを使用した。 得 られた cDNAについて下記に示したプライマ一 (Larr i ckら， B IO/TECHNOLOGY, 7,
934-, 1989、 Wordら， Int. Immunol. , 1， 296-, 1989を参考に作製） により PC Rを行ない、 ヒ ト抗体重鎖可変領域を増幅した。
CM1 (ヒ ト I gM定常領域) ： 5' -TTGTATTTCCAGGAGAAAGTG (配列番号 4 5 )
CM2 (同上) ： 5' -GGAGACGAGGGGGAAAAGGG (配列番号 4 6 )
HS1 (ヒ ト重鎖可変領域） ： 5' -ATGGACTGGACCTGGAGG(AG)TC(CT)TCT(GT)C (配列 番号 4 7 ) (8種の混合物）
HS2 (同上) ： 5' -ATGGAG(CT)TTGGGCTGA(GC)CTGG(GC)TTT(CT)T (配列番号 4 8 ) (16種の混合物）
HS3 (同上) ： 5' -ATG(AG)ACAC) (AC) (AT)ACT(GT)TG(GT) (AT) (GCT)C(AT) (CT) (G C)CT(CT)CTG (配列番号 4 9 ) (6144種の混合物）
* ( )はその位置の塩基が（ ）内のいずれかからなる混合物であることを示す。
H4B7 H8F9共に、 1回目の PCRは HS1 x CM1、 HS2 x CMl、 HS3 X CM1の 3種
のプライマーの組み合わせについて行い （94°C 1分、 50°C 2分、 72°C 3分、 40サ ィクル、 パーキンエルマ一社、 サーマルサイクラ一 140使用） 、 その PCR産物を それぞれ HS1 X CM2、 HS2 X CM2, HS3 X CM2のプライマ一で再度増幅した （温 度条件は前記同様、 30サイクル） 。 増幅産物は 1. 5!¾ァガロース電気泳動後、 臭化 ェチジゥム染色することにより検出した。 その結果、 H4B7については HS3 X CM2 のプライマーで約 490bpの増幅産物が確認された。 また、 H8F9については、 HS3 X CM2プライマーで微かなバンドが同様の位置に確認されたのでこのプライマー で再度増幅した （温度条件は前記同様、 30サイクル） 。 その結果、 増幅産物は非 常に強いシグナルとして検出された。 これらの PCR産物は、 石田ら （遺伝子発現 実験マニュアル、 講談社サイェンティフイク、 1995) の方法に従い、 pBlueScr i p t i l SK+ (S tratagene社） ベクターの Smal部位にクローニングした。 増幅産物の 挿入されたプラスミ ドのうち #2、 #3、 #4 (H4B7) 、 #11、 #13、 #14 (H8F9) に ついて、 自動蛍光シーケンサ一 （Applyed Bi o Sys tem社） により、 増幅産物の塩 基配列を決定した。 得られた塩基配列及び予想されるアミノ酸配列をすでに報告 されているヒ ト抗体 VH領域 （Marksら、 Eur. J. 1讓 unol. 21， 985-, 1991) 、 JH領域 （Ravetchら， Cel l, 27, 583-, 1981) の配列と比較した結果、 H4B7、 H8 F9共に、 VH4フアミ リー、 JH2の組み合わせからなることが判明した。 この結果 は、 ヒ ト 14番染色体部分断片を保持するキメラマウスにおいて、 完全な機能的ヒ 卜抗体重鎖蛋白質が産生されていることを示している。
(実施例 28) ヒ 卜抗体/ c鎖を発現するキメラマウス脾臓からのヒ ト抗体/ c鎖 cDNA の取得と塩基配列決定
(実施例 13) において取得され、 （実施例 23) においてヒ ト抗体/ c鎖を発現す ることが確認されたキメラマウス K2-8の脾臓より （実施例 5) と同様な方法で合 成した cDNAについて、 下記のプライマー （Urr i ckら， B10/TECHN0L0GY， 7, 934 -， 1989、 Wh ehurstら， Nucleic Acids Res.， 20, 4929-, 1992 を参考に作製） により PCRを行ない、 ヒ ト c鎖可変領域を増幅した。 陰性コントロールとして K2 -8より取得した肝臓由来 cDNA及び、 （実施例 10) の TT2/#14 3-2由来キメラマウ ス Κ3- 2- 2より取得した脾臓由来 cDNAを用いた。
KC2 (ヒ ト Ig c鎮定常領域) ： 5， -CAGAGGCAGTTCCAGATTTC (配列番号 5 0 )
KC3 (同上) ： 5' - TGGGATAGAAGTTATTCAGC (配列番号 5 1 )
KVMIX (ヒ ト Ig/c鎖可変領域） ：
5' -ATGGACATG(AG) (AG) (AG) (AGT) (CT)CC(ACT) (ACG)G(CT) (GT)CA(CG)CT T (配列番号 5 2 ) (3456種の混合物）
*( )はその位置の塩基が（ ）内のいずれかからなる混合物であることを示す。
PCRは KVMIXxKC2、 KVMIXXKC3プライマーの組み合わせで 94°C15秒、 55°C 15秒、 72°C20秒、 40サイクル （パーキンエルマ一社、 サ一マルサイクラ一 9600使 用） の条件で行なった。 増幅産物は 1.5!¾ァガロース電気泳動後、 臭化工チジゥム 染色することにより検出した。 その結果、 両者の組み合わせ共に、 期待される約 420bps (KC2) 、 約 450bps (KC3) の長さの増幅産物が検出された。 一方、 2種 の陰性コントロールでは特異的増幅産物は検出されなかった。 これらの増幅産物 は、 石田ら （遺伝子発現実験マニュアル、 講談社サイェンティフイク、 1995) の 方法に従い、 pBlueScriptll SK+ (Stratagene社） ベクターの Smalあるいは EcoR V部位にクローニングした。 増幅産物の揷入されたプラスミ ドのうち KVMIXXKC 2由来の VK- #1グロ一ン 1種類について、 自動蛍光シーケンサー （Applyed Bio System社） により、 増幅産物の塩基配列を決定した。 得られた塩基配列はヒ ト Ig Λ鎖の開始コ ドンから定常領域に至るまで終始コ ドンを含まないので、 クロー二 ングされた増幅産物は機能的ヒ ト Ig/c鎖可変領域をコ一ドしていると考えられる c また、 すでに報告されているヒ ト抗体 V 領域 （Kleinら， Eur. J. I誦 unol.， 23， 3248-, 1993) 、 J /c領域 （Whi tehurstら， 前記） の塩基配列と比較した結 果、 V/c3ファ ミ リー、 J /c 4の組み合わせからなることが判明した。 この結果 は、 ヒ ト 2番染色体部分断片を保持するキメラマウスにおいて、 完全な機能的ヒ 卜抗体/ 鎖蛋白質が産生されていることを示している。 (実施例 29) ヒ 卜 14番染色体断片を保持するキメラマウスの血清中のヒ ト抗体 ァ鎖サブクラスおよび 鎖の検出、 および定量
(実施例 10) の生後 11週齢のキメラマウス （K15Aおよび K16A； 1- 4由来、 キメ ラ率 70、 50¾) より採血し、 血清中のヒ ト抗体 y鎖サブクラス濃度を （実施例 14) に従い EL 1 SA法を用いて検出した。
[ヒ ト IgGlの測定] 抗ヒ ト I gG抗体（シグマ、 卜 6260) を PBSで希釈し、 96穴マ イクロタイタ一プレートをコ一ティングした。 血清試料を加え、 次いでペルォキ シダーゼ標識した抗ヒ ト I gGl抗体 （ファーミンジヱン、 08027E) を加えてインキ ュペートした後、 TMBZ (住友べ一クライ ト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450mnの吸光度で評価した。 精製された濃度既知のヒ ト IgGl (シグマ、 1 -3889) を標準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。
[ヒ ト IgG2の測定] 抗ヒ ト I gG2抗体 （シグマ、 1 -9513) を PBSで希釈し、 96穴マ ィクロタイタープレートをコ一ティングした。 血清試料を加え、 次いでペルォキ シダーゼ標識した抗ヒ ト IgG抗体 （シグマ、 A-0170) を加えてインキュベートし た後、 TMBZ (住友べ一クライ ト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸 光度で評価した。 精製された濃度既知のヒ ト G2 (シグマ、 卜 4139) を標準とし マウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。
[ヒ ト I gG3の測定] 抗ヒ ト I gG3抗体 （シグマ、 1 -7260) を lOOmMグリシン塩酸バ ッファー pH2. 5で希釈し 5分間室温で放置した後、 100mMリン酸バッファ一 pH7. 0で 10倍に希釈し、 96穴マイクロタイタープレートをコ一ティングした。 血清試 料を加え、 次いでペルォキシダ一ゼ標識した抗ヒ ト I gG抗体 （ファーミ ンジェン、 08007E) を加えてインキュベートした後、 TMBZ (住友べ一クライ ト、 ML-1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。 精製された濃度既知のヒ ト I gG3 (シグマ、 1 -4389) を標準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈し た。
[ヒ ト l gG4の測定] 抗ヒ ト l gG4抗体 （シグマ、 1 -7635) を lOOmMグリシン塩酸バ ッファ一 pH2. 5で希釈し 5分間室温で放置した後、 lOOmMリン酸バッファー pH7. 0で 10倍に希釈し、 96穴マイクロタイタープレートをコーティングした。 血清試 料を加え、 次いでペルォキシダーゼ標識した抗ヒ ト I gG抗体 （ファーミ ンジヱン、 08007E) を加えてインキュベートした後、 TMBZ (住友べ一クライ ト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。 精製された濃度既知のヒ ト IgG4 (シグマ、 卜 4639) を標準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈し
[ヒ ト IgMの測定] 鎖については PBSで希釈した抗ヒ ト ^鎖マウスモノクロ一 ナル抗体 （シグマ、 1-6385) を 96穴マイクロタイタープレートにコーティングし、 血清試料を加え、 次いでペルォキシダーゼ標識抗ヒ ト ^鎖マウス抗体 （The Bind ing Site Limited, MP008) を加えてインキュベートした後、 ペルォキシダーゼ 基質として TMBZ (住友べ一クライ ト、 ML- 1120T) の添加により酵素活性を 450nm の吸光度で評価し、 精製された/ z鎖を持つ濃度既知のヒ ト IgM (オルガノン ·テ クニ力、 6001-1590) を標準としマウス血清 （シグマ、 M5905) を添加した PBS で段階的に希釈した。
結果を表 10に示す。 キメラマウス K15Aと K16Aの 2個体で IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 のすベてのサブクラスおよび IgMが検出された。 第 10表 キメラマウス中のヒ ト抗体 IgGサブクラスおよび IgM濃度 （ELISA) キメラマウス IgGl IgG2 IgG3 IgG4 IgM (mg/1)
K15A 2.25 1.96 0.17 0.43 7.09
K16A ' 0.30 0.69 0.10 0.07 0.87
(実施例 30) ヒ ト 22番染色体を保持するマウス ES細胞株 （TT2) の取得 ヒ 卜 22番染色体を保持するマウス ES細胞 （TT2) 取得のため、 染色体供与細胞 として （実施例 26) で取得した 6-1 (A9/#22, G418, ピューロマイシン耐性） 細 胞株を用いた。 染色体受容細胞としては野生型 TT2細胞株 （実施例 9) を用いた。 ミクロセル融合実験およびピュー口マイシン耐性株の選択は 0.75^g/mlのピュー ロマイシン濃度で他は （実施例 9) の G418耐性株選択の場合と同様に行なった。 この結果出現したピュー口マイシン耐性株の出現頻度は TT2細胞 107個あたり 1 〜2個であった。 ピューロマイシン耐性株の凍結保存、 ゲノム DNA取得は （実施 例 2) と同様に行なった。 ヒ ト 22番染色体の保持はピューロマイシン耐性株 PG22 -1について以下の （1 ) 、 （2 ) により確認した。
( 1 ) PCR解析
ピュー口マイシン耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒ ト 22番染色体上に存在する 遺伝子 （Genet i c Maps,前記） のうち、 （実施例 2 ； A9/#22) で存在が確認され ている 10種のプライマーについて PCR増幅を行なった結果、 （実施例 2 ； A9/#22) に存在した全てのマーカーが検出された。
( 2 ) サザンブロッ ト解析 （実施例 2) で示した方法に従い、 ヒ ト L1配列をプロ ーブとして用い、 陰性コン トロール野生型 TT2、 染色体供与細胞 6-1、 ピュー口 マイシン耐性 ΤΤ2細胞株 PG22- 1由来のゲノム DNAについて行った。 その結果を （ 第 19図） に示す。 図中左側に DNA分子量を示した。 PG22-1におけるバン ドパター ンは 6-1のそれと一致し、 シグナル強度も同程度であることから、 6-1細胞株中 の 22番染色体は確かに PG22-1に移入されたことが確認された。
以上の実験によりピュー口マイシン耐性 ΤΤ2細胞株 PG22-1はヒ ト 22番染色体の 全てあるいは大部分を保持することが確認された。
(実施例 31) ヒ ト 22番染色体を保持するマウス ES細胞株 （ΤΤ2) からのキメラ マウス作製
(実施例 30) で得られ、 ヒ ト 22番染色体を保持していることが確認されたピュ 一口マイシン耐性 ΤΤ2細胞株 PG22- 1を凍結ストックより立ち上げ、 ICRまたは MC H(ICR) (日本クレア社） 雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注入した。 ES細胞用培地 （実施例 9) で一晩培養して胚盤胞に発生させ た後、 偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 ICRマウス （日本クレア社） の子宮に片側の子 宫あたり約 10個のインジヱクション胚を移植した。
キメラ作製の結果を （第 11表） に示す。 計 266個の注入胚を移植した結果、 36 匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において宿主胚 （ICR) 由来の白 色の中に TT2細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかにより判定される。 誕生した 36匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢 献の認められる個体は 8匹であった。
この結果より、 ヒ ト 22番染色体を保持する ES細胞株 （TT2由来、 PG22- 1) はキ メラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保 持していることが確認された。 第 11表. ヒ ト 22番染色体を保持する TT2細胞株からのキメラマウス作製
ES細胞株/ ビュ-ロマイシン ES細胞を注入し 子マウス キメラ 毛色への貢献率 ヒト染色体 耐性株番号 た 8細胞期胚数 の数 マウスの数 〜20% 20-50% 50-80%
TT2/#22 PG22-1 266 36 8 4 1 3
(実施例 32) ヒ ト 22番染色体を保持するキメラマウスの血清中のヒ ト抗体 λ鎖 の検出、 および定量
(実施例 31) のキメラマウス KPG22-1〜3の血清中のヒ ト抗体濃度を （実施例
14) に従い ELISA法を用いて定量した。 生後 2 ヶ月のキメラマウスより採血し、 血清中のヒ ト抗体 λ鎖を EL ISA法を用いて検出した。 PBSで希釈した抗ヒ ト免疫 グロブリン； I鎖抗体 （VECTOR LABORATORIES, INC.、 IA-3070) を 96穴マイクロタ イタ一プレートにコーティングし、 血清試料を加え、 次いでピオチン標識した抗 ヒ 卜免疫グロプリンス鎖抗体 (VECTOR LABORATORIES, INC. . BA-3070) を加えて ィンキュベートしさらにビォチン化ヮサビペルォキシダ一ゼとァビジン DHの複合 体 （VECTOR LABORATORIES, INC^ Vectastain ABCキッ ト） を加えてインキュベー トした後、 TMBZ (住友べ一クライ ト， Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nm の吸光度で評価し、 精製された； I鎖を持つ濃度既知のヒ 卜 IgM (大日本製薬、 U1 3200) を標準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。 結果を第 12表 に示す。 この結果より 22番染色体を保持するキメラマウスにおいてヒ ト抗体； I鎖 遺伝子が機能することが確認された。 第 12表. キメラマウス中のヒ ト抗体 λ鎖濃度 （ELISA) キメラマウス キメラ率％ Ig (mg/1)
KPG22-1 50 12
KPG22-2 50 18
KPG22-3 20 24
(実施例 33) ヒ ト 22番染色体導入キメラマウス血清における抗ヒ ト HSAヒ 卜体 ス鎖の検出
キメラマウス （実施例 31、 KPG22-3) に生後 79日、 94日、 110日の 3回にわた り （実施例 20) と同様に HSAを免疫した。 血清中のヒ ト抗体； I鎖を （実施例 14) に従い ELISA法を用いて検出した。 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー pH9.6で 5 ug/mlに希釈した HSA (シグマ、 A 3782) を 96穴マイクロタイタ一プレートにコ 一ティングし、 血清試料を加え、 次いでピオチン標識した抗ヒ ト免疫グロプリン ス鎖抗体 （VECTOR LABORATORIES, INC., BA-3070) を加えてインキュベートしさ らにビォチン化ヮサビペルォキシダーゼとアビジン DHの複合体 （VECTOR LABORAT 0RIES, INC.. Vectastain ABCキッ ト） を加えてインキュベートした後、 TMBZ (住 友べ一クライ ト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。 HSAで免疫したキメラマウス血清中の抗 HSAヒ ト λ鎖の力価は免疫後上昇した。 —方対照とした ICRマウスでは、 HSA免疫後の抗 HSAヒ ト抗体 λ鎖の力価はバッ クグランドレベルであった。 結果を （第 20図） に示す。 第 20図において横軸はキ メラマウスに初めて HSAを免疫してからの日数を、 縦軸は 450nmにおける吸光度 を示した。 これらの結果より、 ヒ ト 22番染色体を保持するキメラマウスにおいて ヒ ト抗体; I鎖遺伝子が機能し、 さらには HSA抗原刺激に対して抗原特異的ヒ ig λの抗体価上昇が起こることが確認された。
(実施例 34) ヒ ト 22番染色体導入キメラマウスからのヒ ト抗体軽鎖産生ハイブ リ ドーマ取得 (実施例 25) と同様に （実施例 33) においてヒ トアルブミ ンで免疫したキメラ マウス KPG22- 3から生後 113日目に脾臓を取り出し、 ミエローマ細胞と細胞融合 し、 ハイプリ ドーマを作製した。 ハイプリ ドーマの作製法は く安東 '千葉、 単ク ローン抗体実験操作入門、 講談社サイェンティフイク， 1991〉 に記された方法に 従い、 ミエローマ細胞としては、 SP-2/0- Agl4 (大日本製薬、 05-554) を使用し た。 培養液に HCF (エア ' ブラウン） を 10%添加し 96穴プレート 5枚にまき込み、 1〜3週間培養しコロニーが出現したゥヱルの培養上清を EL ISA法で解析した。 EL I SA法は （実施例 33) と同様に行ない、 ヒ ト抗体； I鎖陽性のクローンを 4個得
(実施例 35) ヒ ト 22番染色体部分断片及び、 14番染色体部分断片を同時に保持 するマウス ES細胞株の取得
ヒ ト 22番染色体、 14番染色体部分断片を同時に保持するマウス ES細胞取得のた め、 染色体供与細胞として （実施例 26) で取得した 6-1 (A9/#22, G418，ピュー ロマイシン耐性） 細胞株を用いた。 染色体受容細胞としてはすでにヒ ト 14番染色 体部分断片を保持している G418耐性 TT2細胞株 1 -4 (実施例 9) を用いた。 ミク ロセル融合実験およびピューロマイシン耐性株の選択は 0. 75 g/mlのピューロマ イシン濃度で他は （実施例 9) の G418耐性株選択の場合と同様に行なった。 この 結果出現したピュー口マイシン耐性株の出現頻度は 1-4細胞 107個あたり 1〜2 個であった。 これらのピュー口マイシン耐性株は 300 i g/mlの G418存在下でも增 殖することから G418耐性も同時に保持していることが確認された。 二重薬剤耐性 株の凍結保存、 ゲノム DNA取得は （実施例 2) と同様に行なった。 ヒ 卜 22番染色 体及び、 ヒ ト 14番染色体部分断片の保持は二重薬剤耐性株 PG22- 5について以下の PCR解析により確認した。 二重薬剤耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒ ト 22番、 14 番染色体上に存在する遺伝子 （Genet i c Maps，前記） のうち、 22番染色体につい ては （実施例 ； A9/#22) 、 14番染色体については （実施例 9； TT2/#14 1 -4) で存在が確認されている各プライマ一について PCR増幅を行なった結果、 22番染 色体については 10種のうち 3種のマーカ一 （D22S275, D22S315, I g A ) 、 14番染 色体については TT2/#14 1 -4に存在した全てのマ一カーが検出された。 以上の実 験により、 得られた二重耐性 ΤΤ2細胞株はヒ ト 22番染色体部分断片、 14番染色体 部分断片を同時に保持することが確かめられた。
(実施例 36) ヒ ト 22番染色体部分断片及び、 14番染色体部分断片を同時に保持 するマウス ES細胞株からのキメラマウス作製
(実施例 35) で得られ、 ヒ ト 22番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保 持していることが確認された G418、 ピュー口マイシン二重耐性 TT2細胞株 PG22-5 を凍結ストックより立ち上げ、 ICRまたは MCH( ICR) (日本クレア社） 雄雌マウス の交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注入した。 ES細胞用培地 （ 実施例 9) で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、 偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 1C Rマウス （日本クレア社） の子宮に片側の子宮あたり約 10個のインジェクショ ン 胚を移植した。
キメラ作製の結果を （第 13表） に示す。 計 302個の注入胚を移植した結果、 16 匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において宿主胚 （ICR) 由来の白 色の中に TT2細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかにより判定される。 誕生した 16匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢 献の認められる個体は 5匹であった。
この結果より、 ヒ 卜 22番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保持する ES 細胞株 （PG22-5) はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組 織に分化する能力を保持していることが確認された。 第 13表 ヒ ト 22番染色体と 14番染色体を保持する TT2細胞株からのキメラマウス 作製 '
ES細胞株/ 二重耐性 ES細胞を注入し 子マウス キメラ 毛色への貢献率 ヒ 卜染色体 株番号 た 8細胞期胚数 の数 マウス の数 〜20% 20-50¾ 50-80¾
TT2/#22+#14 PG22-5 302 16 5 3 2 0
(実施例 37) ヒ ト 22番染色体部分断片及び、 14番染色体部分断片を同時に保持 する ES細胞由来キメラマウス血清中のヒ ト抗体 λ鎖およびヒ ト抗体 鎖の検出 · 定量
(実施例 36) のキメラマウス （KPG22- 9、 10、 および 12) に対して、 HSAを免 疫した。 KPG22-9と KPG22-10には生後 11週齢で免疫し、 その 2週間後に採血した。 KPG22- 12には生後 7週齡と 9週齢の 2度免疫し、 2度目の免疫の 2週間後に採血 した。
血清中のヒ ト抗体 /鎖およびヒ ト抗体； I鎖さらにヒ トス鎖かつヒ ト 鎖を有す る抗体を （実施例 14) に従い EL I SA法を用いて検出した。
完全ヒ ト抗体の検出には PBSで希釈した抗ヒ 卜免疫グロプリン； I鎖抗体 （Ki rk egaard & Perry Laborator i es I nc.、 01-10-11) を 96穴マイクロタイタ一プレー トにコ一ティ ングし、 血清試料を加え、 次いでペルォキシダーゼ標識抗ヒ 卜免疫 グロブリン 鎖抗体 （The B indi ng Si te Limi ted, P008) を加えてィンキュベ 一卜した後、 ペルォキシダーゼ基質として TMBZ (住友べ一クライ 卜、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価し、 精製された λ鎖を持つ濃度既 知のヒ ト I gM (大日本製薬、 U13200) をマウス血清を添加した PBSで段階的に希 釈したものと比較し血清中のヒ ト抗体濃度を求めた。 ヒ ト抗体 鎖およびヒ ト抗 体; I鎖を EL I SA法を用いて （実施例 29) および （実施例 32) と同様に検出 ·定量 した。 結果を第 14表に示す。 キメラマウスでは λ鎖と〃鎖がともに検出された。 ヒ ト抗体 鎖かつ λ鎖を持つ抗体も検出された。 この結果より、 ヒ ト 22番染色体 部分断片及び 14番染色体部分断片を保持する ES細胞由来キメラマウスにおいてヒ ト抗体; I鎖遺伝子とヒ ト抗体/ i鎖遺伝子は同時に機能し、 一部の B細胞では重鎖 と軽鎖がともにヒ トである完全抗体が産生されることが確認された。
また対照として測定したヒ ト 14番染色体のみを保持する （実施例 10) のキメラ マウス （K9) 、 ヒ ト 22番染色体のみを保持する （実施例 31) のキメラマウス （KP G22-2) の血清中のヒ ト抗体； I鎖かつ 鎖を持つ抗体濃度はバックグランドレべ ルであり、 ここでの検出系はヒ ト λ鎖かつ/ 鎖を持つ完全抗体のみを検出してい ることが確認された。 第 14表 キメラマウス中のヒ ト抗体濃度（ELISA)
ESクロ-ン キメラマウス キメラ 率％ IgM(mg/l) IgA (mg/1) IgM, λ (mg/1)
PG22-5 KPG22-9 30 2.54 9.9 0.043
PG22-5 KPG22-10 5 4.96 21.5 0.333
PG22-5 KPG22-12 40 3.71 7.0 0.048
3-2 K9 50 6.66 く 0.003
PG22-1 KPG22-2 50 17.6 <0· 003
(実施例 38) ヒ ト 2番染色体部分断片及び、 14番染色体部分断片を同時に保持 する ES細胞由来キメラマウス血清におけるヒ ト抗体の検出 （ヒ ト Λ鎖かつヒ 卜 鎖を有する抗体）
(実施例 19) で作製したキメラマウス KPG-15 (TT2ES クローン PG5由来、 キメ ラ率 10¾!) に対して、 生後 2から 3ヶ月齢の間に、 PBSに溶解したヒ ト血清アル ブミン （HSA、 シグマ、 A3782) とアジュバント （MPL+TDM Emulsion, RIBI I誦 unochem Reseach Inc. ) とを混合して 0.25mg/mlの HSA溶液を調整し 0.2mlを 3 回免疫し、 採血した。 また生後 6週齢の （実施例 19) のキメラマウス KPG- 26 (TT 2ES クローン PG6由来、 キメラ率 40¾0 から採血した。 血清中の完全ヒ ト抗体濃 度を （実施例 14) に従い ELISA法で検出した。 PBSで希釈した抗ヒ ト免疫グロブ リ ン 鎖抗体 （Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. , 01-10-10) を 96穴マイ クロタイタープレートにコ一ティングし、 マウス血清 （シグマ、 Μ5905) を加え た PBSで希釈した血清試料を加え、 次いでペルォキシダーゼ標識抗ヒ 卜免疫グロ ブリン 鎖抗体 （The Binding Site Limited. MP008) を加えてィンキュベー卜 した後、 ペルォキシダ一ゼ基質として TMBZ (住友べ一クライ 卜、 Mい 1120T) の添 加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価し、 精製された/ 鎖を持つ濃度既知の ヒ 卜 IgM (オルガノン .テク二力、 6001-1590) を標準としマウス血清を添加し た PBSで段階的に希釈した。 鎖、 /z鎖については （実施例 20) と同様にして濃 度を求めた。 結果を第 15表に示す。 ヒ ト抗体 鎖かつ/ c鎖を持つ抗体が検出され た。 また対照としたヒ ト 14番染色体のみを保持する （実施例 10) のキメラマウス
( 9) 、 ヒ ト 2番染色体のみを保持する （実施例 13) のキメラマウス （K2-9) 血 清中のヒ ト抗体で/ c鎖かつ 鎖を持つ抗体濃度は 0. 002mg/ml以下でバックグラン ドレベルであった。 この結果より、 ヒ ト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分 断片を保持する ES細胞由来キメラマウスにおいてヒ ト抗体/ c鎖遺伝子とヒ ト抗体 /鎖遣伝子は同時に機能し、 一部の B細胞では重鎖と軽鎖がともにヒ トである完 全抗体が産生されることが確認された。 第 15表 キメラマウス中のヒ ト抗体濃度（EL ISA)
ESクロ-ン キメラマウス キメラ 率％ Ig (mg/l ) I g (mg/1 ) I M, κ (mg/1 )
PG-5 KPG15 10 0. 18 1. 01 0. 075
PG-6 KPG26 40 1. 52 1. 26 0. 018
3-2 K9 50 6. 66 0. 002以下
5-1 K2-9 40 135 0. 002以下
(実施例 39) ヒ ト 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞株 （TT2F， X0) の取得 - ヒ 卜 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞 （X0) 取得のため、 染色体供 与細胞として （実施例 16) で取得した PG1細胞株を用いた。 染色体受容細胞とし ては （39， X0) の染色体構成を持ち、 キメラマウスにおいて効率よく卵細胞に分 化することが報告されている （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8， ジーン夕 ーゲティ ング， 羊土社， 1995) TT2F細胞株 （ライフテックオリエンタル社より購 入） を用いた。 ミクロセル融合実験およびピューロマイシン耐性株の選択は 0. 75 g/mlのピューロマイシン濃度で他は （実施例 9) の G418耐性株選択の場合と同 様に行なった。 この結果出現したピューロマイシン耐性株の出現頻度は TT2F細胞 107個あたり 5個であった。 これらのピューロマイシン耐性株の凍結保存、 ゲノ ム DNA取得は （実施例 2) と同様に行なった。 ヒ ト 2番染色体部分断片の保持は 薬剤耐性株 P-20， P- 21について以下の PCR解析により確認した。 薬剤耐性株ゲノ ム DNAを铸型としてヒ ト 2番染色体上に存在する遺伝子 （Genet i c Maps,前記） のうち、 （実施例 1 ； A9/#2 w23) で存在が確認されているプライマー C 、 FA BPK V / 1-2の 3種について PCR増幅を行なった結果、 2株共に、 3種全ての プライマーについて期待される増幅産物が確認された。
以上の実験により、 得られたピューロマイシン耐性 ES細胞株 （TT2F, X0) はヒ ト 2番染色体部分断片を保持することが確かめられた。
(実施例 40) ヒ ト 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞株 （TT2F, X0) からのキメラマウス作製
(実施例 39) で得られ、 ヒ ト 2番染色体部分断片を保持していることが確認さ れたピュー口マイシン耐性 TT2F細胞株 P- 21を凍結ストックより立ち上げ、 ICRま たは MCH(ICR) (日本クレア社） 雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚 あたり 10〜12個注入した。 ES細胞用培地 （実施例 9) で一晩培養して胚盤胞に発 生させた後、 偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 ICRマウス （日本クレア社） の子宫に片 側の子宮あたり約 10個のインジェクション胚を移植した。
計 141個の注入胚を移植した結果、 20匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において宿主胚 UCR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色 （濃茶） が 認められるかどうかにより判定される。 キメラ作製の結果を （第 16表） に示す。 誕生した 20匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢 献の認められる個体は 9匹であった。 うち 4個体は毛色が完全に野生色の （ES細 胞に由来する） キメラマウスであった。
この結果より、 ヒ ト 2番染色体部分断片を保持する ES細胞株 （P- 21) はキメラ 形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持し ていることが確認された。 第 16表 ヒ ト 2番染色体部分断片を保持する TT2F細胞株からのキメラマウス作製
ES細胞株/ ビュ-ロマイシン ES細胞を注入 子マウス キメラ 毛色への貢献率 ヒト染色体 耐性株 した 8細胞期 の数 マウスの数 〜20% 20-50% 50-90¾ 100¾ 番号 胚数
TT2F/#2f g. P-21 141 20 9 0 2 3 4
(実施例 41) ヒ ト 2番染色体部分断片を保持する TT2F由来キメラマウスの血清 中のヒ ト抗体 /c鎖の検出、 および定量
(実施例 40) の生後約 1ヶ月齢のキメラマウス （P-21由来、 キメラ率 100%、 K2 -1F〜4F) より採血し血清中のヒ ト抗体/ c鎖濃度を （実施例 20) と同様に EL ISA 法を用いて定量した。
結果を第 17表に示す。 使用する ES細胞を TT2Fとしてもヒ ト抗体/ 鎖遺伝子がキ メラマウス中で機能することが確認された。
第 17表 キメラマウス中のヒ ト抗体/ c鎖濃度 （EL ISA) キメラマウス キメラ率％ Ig c (mg/1 )
K2-1F 100 66
K2-2F 100 156
K2-3F 100 99
K2-4F 100 20
(実施例 42) ヒ ト 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞 （TT2F, X0) 由 来キメラマウスの子孫におけるヒ ト染色体保持の検出
(実施例 40) で得られた雌キメラマウスのうち K2-1F, K2-4F (共に毛色のキメ ラ率 100« について雄 ICRマウスとの交配により ES細胞由来の子孫が誕生するか を検討した。 この交配において ICR雄マウス （アルビノ、 劣性） 由来精子により 受精したキメラマウス中の TT2F細胞 （野生色：優性） 由来の卵子からは野生色、 ICR由来卵子からは白色の子マウスが誕生する。 それぞれ 1回の交配によって得 られた生存可能な子マウス （K2-1F： 10匹、 K2- 4F： 5匹） のすべてが ES細胞由 来の毛色である野生色を示した。 これらの子マウスの尻尾より調製したゲノム DN Aについてヒ 卜染色体断片の保持を PCR法により検討した。 P-21 (実施例 39) で 存在が確認されている 3種のプライマーについて PCR増幅を行なつた結果、 10匹 中 4匹 （K2-1F) 、 5匹中 2匹 （K2-4F) において P- 21で検出された 3種のマ一 カーの存在が確認された。 15匹の子マウスの PCRの結果を （第 21図） に示す。 図 中右側にマ一力一 （0 X174, Hae l l l断片， 二ツボンジーン） および主なバン ドの DNA分子量を、 左側にそれぞれのプライマーによって期待される増幅産物の長さ を矢印で示した。 右側に陽性コントロールとして親キメラ K2-1F、 K2- 4Fの尻尾 由来 DNAを用いた結果も示す。 これらの結果は、 ヒ ト 2番染色体部分断片を保持 する TT2F細胞株 P-21がキメラマウス中で機能的な卵子に分化し、 その卵子由来の 子孫にヒ ト 2番染色体部分断片が伝達されたことを示している。
(実施例 43) ヒ ト 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞 （TT2, XY) 由 来キメラマウスの子孫におけるヒ ト染色体保持の検出
(実施例 13) で得られたキメラマウスのうち K2- 18 (雄、 キメラ率 70%) と K2 -19 (雌、 キメラ率 60 ) 及び同腹の非キメラ雌を混合して交配し、 ES細胞由来 の子孫が誕生するかを検討した。 TT2細胞は （40， XY) の染色体構成を持つので 雄キメラ K2- 18において機能的な精子に分化している可能性がある。 その場合キ メラマウス中の TT2細胞 （野生色、 優性） 由来精子により受精した ICR (白色： 劣性） 由来の卵子からは野生色の子マウスが誕生する。 交配によって得られた生 存可能な子マウス計 110匹のうち 10匹が ES細胞由来の毛色である野生色を示した。 これらの野生色子マウス 10匹のうち 7匹の尻尾より調製したゲノム DNAについて ヒ ト染色体断片の保持を PCR法により検討した。 5-1株 （TT2/#2fg.，実施例 12) で存在が確認されている 2種のプライマー （C /c、 FABP1) 及び、 （実施例 1) で示した V /c卜 2 プライマ一について PCR増幅を行なった結果、 7匹中 2匹にお いて 3種のマーカ一全ての存在が確認された。 この結果は、 ヒ ト 2番染色体部分 断片を保持する TT2細胞株 5-1がキメラマウス中で機能的な精子に分化し、 その 精子由来の子孫にヒ ト 2番染色体部分断片が伝達されたことを示している。
(実施例 44) キメラマウス子孫の血清中のヒ ト抗体/ c鎖の検出、 および定量 (実施例 42) のキメラマウス子孫 K2-1F- 1〜10および K2- 4F-1〜5の血清中の ヒ ト抗体/ 鎖濃度を ELISA法を用いて定量した。 生後約 4〜6週齡のマウスより 採血し、 血清中のヒ ト抗体/ c鎖を （実施例 20) と同様に ELISA法を用いて検出し た。 結果を （実施例 42) で得られた染色体保持の結果と共に第 18表に示す。 キメ ラマウスから生まれた子孫においてもヒ 卜抗体/ c鎖遺伝子が機能することが確認 された。
第 18表 キメラマウス子孫中のヒ ト抗体/ 鎖濃度 （ELISA) 親キメラマウス マウス個体番号 ヒ ト 2番染色体断片 Ig/c(mg/l)
K2-1F #1 0.58
K2-1F #2 84.1
K2-1F #3 12.8
K2-1F #4 15.1
K2-1F #5 0.52
K2-1F #6 0.58
K2-1F #7 I.30
K2-1F #8 0.90
K2-1F #9 0.56
K2-1F #10 28.8
K2-4F #1 0.04以下
K2-4F #2 23.3
K2-4F #3 II.8
K2-4F #4 0.08
K2-4F #5 0.06
(実施例 45) ヒ ト 14番染色体部分断片導入キメラマウス脾臓細胞の解析 フローサイ トメ トリーによる解析は下記の文献に記載の方法に従った。 日本生 化学会編、 新生化学実験講座 12分子免疫学 I一免疫細胞 ·サイ トカインー 1989、 東京化学同人；東京大学医科学研究所 制癌研究部編、 細胞工学別冊 8 新細胞 工学実験プロ トコ一ル、 1991、 秀潤社； A. Doyle and J. B. Griffiths, "Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures", published by John Wiley & Sons し td. , 1996 。 （実施例 19) の生後 6ヶ月齢のキメラマウス （KPG06； PG16由来、 キメラ率 30%) から脾臓をとりだし、 塩化アンモニゥム水溶液で処理した後ラッ ト血清を 1 %含む PBS中で、 フルォレツセインイソチオシァネー ト （FITC) 標識 抗マウス CD45R(B220)抗体 （ファーミ ンジヱン、 01124A) で細胞を染色した。 洗 浄後 5 %マウス血清を含む PBS中でピオチン標識抗ヒ ト IgM 抗体 （ファーミ ンジ ン、 08072D ) または対照としてピオチン標識抗ヒ トス鎖抗体 （ファーミ ンジ ェン、 08152D ) と反応させた後、 ストレプトアビジンフィコエリスリン （ファ 一ミ ンジェン、 13025D) で染色し、 フローサイ トメ ト リ一 （べク トンデッキンソ ン、 FACSor t) で解析した。 また対照としてヒ ト染色体を保持しない ICRマウス も同様に解析した。 第 22図に結果を示す。 図中横軸はヒ ト IgM 、 縦軸は CD45R(B2 20) を示す。 B細胞マーカー CD45R陽性 （FITC) でかつヒ ト IgM陽性 （PE) であ る細胞集団が 4%増加しており、 これによつてキメラマウスではヒ ト抗体 鎮を 細胞表面に発現している細胞の存在が確認された。
(実施例 46) ヒ ト抗体重鎖、 /C鎖、 λ鎖をそれぞれ発現するキメラマウス脾臓 由来 cDNAからのヒ ト抗体遺伝子可変領域クローニングと塩基配列決定
(実施例 29) 、 （実施 23) 、 （実施例 32) においてヒ ト抗体重鎖、 Λ鎖、 ス 鎖をそれぞれ発現することが確認されたキメラマウス K15A (1-4株由来、 実施例 10に示した方法で作製） 、 K2-8 (実施例 13で作製） 、 KPG22- 2(実施例 31で作製） の脾臓由来 RNAより （実施例 5) と同様な方法で合成した cDNAについて、 下記の プライマーにより PCRを行ない、 それぞれのヒ ト抗体遺伝子可変領域を増幅した。 陰性コントロールとして非キメラマウス ICRより取得した脾臓由来 cDNAを用いた。 参考文献の記載のないプライマーは Genbank等のデータベースより入手した塩基 配列をもとに作製した。
• K15A (重鎖）
定常領域用 ： HIGMEX1- 2： 5' -CCAAGCTTCAGGAGAAAGTGATGGAGTC (配列番号 53)
H IGMEX1-1 ： 5' -CCAAGCTTAGGCAGCCAACGGCCACGCT (VH3BACKの 2ndP CRに使用） （配列番号 54)
可変領域用 ： VH1/5BACK (59°C， 35cycl es, Marksら， Eur. J. Immnol. , 21， 9 85-, 1991) ， VH4BACK (59。C， 35cycles, Marksら， 前記） ， VH3BACK ( Is tP CR : 59°C, 35cycl es, 2ndPCR : 59°C, 35cycl es， Marksら， 前記）
• K2-8 (軽鎖/ c ) 定常領域用 ： KC2H： 5' -CCAAGCTTCAGAGGCAGTTCCAGATTTC (配列番号 55)
可変領域用 ： Vkl/4BACK (55°C，40cycles， Marksら， Eur. J. I誦 nol.， 21, 985 -, 1991) ， Vk2BACK (55°C， 40cycles, Marksら， 前記） ， Vk3BACK (55。C，
40cycles, Marks ζ , 前記)
• KPG22-2 (軽鎖ス )
定常領域用 ： C;iMIX (以下の 3種のプライマーを等モル比で混合したもの） IGL1-CR： 5' -GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTGATCAG (配列番号 56)
IGL2-CR ： 5' -GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG (配列番号 57)
IGL7-CR ： 5' -GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG (配列番号 58)
可変領域用 ： VA 1LEA1 (55°C， 40cycles, Williamsら， Eur. J. Immunol., 23， 1456-， 1993) , VA2MIX (55°C， 40cycles，前記の Wi 11 iamsらの報告にある V λ 2LBA1, V 2JLEAD を等モル比で混合したもの） ， V;i3MIX (55°C, 40 cycle s，前記の \^111&1^らの報告にぁる ス31^八1, V λ 3JLEAD, V λ 3BACK4を等モル比 で混合したもの）
それぞれ定常領域用 X可変領域用 （重鎖 3種、 /C鎖 3種、 ス鎖 3種） の組み合 わせで 94°C15秒、 それぞれの可変領域プライマーに示したァニ一リング温度 15秒、 72°C20秒、 それぞれの可変領域プライマ一に示したサイクル数 （パーキンエルマ —社、 サーマルサイクラ一 9600使用） の条件で行なった。 VH3BACKにおける 2ndP CRは IstPCRの増幅産物を （HIGMEX1-1XVH3BACK) のプライマーの組み合わせで 再度増幅した。 全ての増幅産物は 1.5¾！ァガロース電気泳動後、 臭化工チジゥム染 色することによ ·り検出した。 その結果、 全て組み合わせにおいて、 期待される長 さ （重鎖： 470bp付近、 軽鎖/ c ： 400bp付近、 軽鎖; I ： 510bp付近） の増幅産物 が検出された。 一方、 陰性コントロールでは全てにおいて同じ位置に特異的増幅 産物は検出されなかった。 これらの増幅産物は、 ァガロースゲルより prep. A. gen e (バイオラッ ド） により抽出した後、 制限酵素処理 （重鎖： HindIII-PstI、 軽 鎖/ c ： Hindlll-PvuIK 軽鎖； I ： Hindi I I-EcoRI) し、 pUC119 (宝酒造) ベクタ 一の Hindlll, Pstl 部位 (重鎖) 、 Hindlll, Hincll部位 ( c鎖) 、 Hindlll, B coRl部位 （λ鎖） にクローニングした。 増幅産物の挿入されたプラスミ ドのうち 以下のもの （右側に示したクローン数） について、 自動蛍光シーケンサー （Appl yed Bio System社） により、 増幅産物の塩基配列を決定した。
• HIGMEX1-2XVH1/5BACK： 10クローン、
• HIG EX1-2XVH4BACK： 8クローン、
• HIGMEX1- 2(2nd PCR, HIGMEX卜 1) x VH3BACK： 5クローン
• KC2HXV C 1/4BACK： 6クローン、
• KC2H X V 2BACK： 7クローン、
• KC2HXV 3BACK ： 4 クローン、
• (ΙλΜΙΧχνλ 1LEA1： 5クローン、
• CAMIXXVA2MIX： 6クローン、
• CAMIXXVA3MIX： 5クローン
得られた塩基配列を DNASIS Hitachi Software Engneering) により解析した結 果、 全てがヒ ト由来配列であり、 c鎖、 λ鎖の全て、 重鎖の計 23種中 21種が開始 コ ドンから定常領域に至るまで終始コ ドンを含まない機能的配列であった。 決定 された配列からお互いに同一なものを除くと重鎖 17種、 鎖 11種、 λ鎖 12種のそ れぞれ異なる可変領域配列が同定された。
(実施例 47) ヒ ト抗体重鎖、 Λ;鎖、 λ鎖をそれぞれ発現するキメラマウス脾臓 由来 cDNAからのヒ ト抗体遺伝子可変領域塩基配列の解析
(実施例 46) において決定された塩基配列 （重鎖 17クローン、 /c鎖 11クローン、 λ鎖 12クローン） について以下の点について解析を行った。
1. 各可変領域配列において使用されている既知の生殖系列 V遺伝子断片を特定 2. 各可変領域配列において使用されている既知の生殖系列 J遺伝子断片を特定 3. 重鎖可変領域において使用されている既知の生殖系列！)断片を特定
4. 1、 2、 3の結果をもとにした重鎖可変領域における N領域の付加の同定
5. 各可変領域塩基配列から導かれるアミノ酸配列の決定
その結果を （第 19表） に示す。 1、 2については Genbankに登録されている生 殖系列 V及び J断片とのホモロジ一検索を DNASISにより行い特定した。 VH断片は (Cookら， Nature gentics, 7, 162-, 1994) 、 V c断片は （Kleinら， Eur. J. Immunol, 23, 3248-, 1993) 、 νλ断片は （Williamsら， 前記） の表記法に従い、 各 V断片フアミ リー名と共に表中に記した。 3については （Ichiharaら， The EM BO J. , 7, 13, 4141-, 1988) の報告に記された生殖系列 D断片とのホモロジ一 検索を DNAS1Sにより行い、 連続して 8bp以上一致することを指標として決定し表 中に記した。 DN本については (Greenら， ature Genetics, Ί, 13-, 1994) で 報告された新しい DNファミ リー断片と考えられる。 4については 1 (V) 、 2 ( J) 、 3 (D) の結果をもとに、 いずれの生殖系列断片にも見いだされない塩基 配列を N領域とみなした。 その結果、 D領域の特定された 13種中 11種に N領域が 観察され、 その平均の長さは 8.7bpであった。 5については各塩基配列を DNASIS を使用して 1文字表記のァミノ酸配列に変換した。 表中には CDR3領域のみ示した。 表中右側に各可変領域のクローニングに使用したプライマー名及び各クローン名 ¾ "言己した。
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LZfrO/96df/X3d (実施例 48) TT2(または TT2F)ES細胞の抗体遺伝子 （重鎖、 軽鎖/ ) ノックァゥ ト用のターゲッティングべク夕一の作製
マウス抗体遺伝子 （重鎖、 軽鎖/ c) が破壊された TT2(または TT2F)細胞へ G418 耐性遺伝子でマ一キングされたヒ ト 14番染色体断片 （実施例 9) およびピュー口 マイシン耐性遺伝子でマーキングされたヒ ト 2番 （実施例 18) または 22番染色体
(実施例 35) を導入することが可能となる。 このようなヒ ト 14番 +2番またはヒ ト 14番 +22番染色体を導入したマウス抗体遺伝子 （重鎖、 軽鎖/ c) 遺伝子破壊 ΤΤ2( または TT2F)ES細胞を用いて、 （重鎖 + c鎖：実施例 19、 重鎖 +ス鎖：実施例 36) の方法によって作成されたキメラマウスでは、 主に重鎖と軽鎖がヒ ト由来の抗体 が産生されることが期待される。 以下に示す第 23図〜第 27図における制限酵素の 略称等は、 以下のとおりである。
制限酵素： Kp: KpnK B: BamHK RI: EcoRI 、 RV: EcoRV 、 N: Notl 、 SII: Sea II、 Sea: Seal 、 Sfi: Sfil 、 Sm: SmaK X: Xhol 、 SI: SalK dKp: deletion of Kpnl 、 （X): ラムダベクター由来の Xhol切断部位。
点線部分： pBluescript SKIK+) ブラスミ ド DNA
<\ ： LoxP配列
1. G418耐性遺伝子の両側に LoxP配列を入れた LoxP- pstNEOプラスミ ドの作製
TT2(または TT2F)細胞の抗体遺伝子をノックアウ トした後、 G418耐性遺伝子を 除去するために G418耐性遺伝子 （実施例 1) の両端に Creリコンビネース （Saue rら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85， 5166-, 1988 ) の認識配列である LoxP 配列 （Sauerら、 -前記） を同じ向きに入れる必要がある。 pSTneoBプラスミ ド DN A (実施例 1) より制限酵素 Xholで pstNEO遺伝子を切り出し、 ァガロースゲル電 気泳動により DNA断片を精製したのち T4DNAポリメラーゼ （Takara社製 Blunting endキッ ト） により両端を平滑化した。 LoxP配列が入ったプラスミ ド DNA pBS246 (Plasmid pBS246, 1οχΡ2 Cassette Vector, U.S. Patent 4959317) は、 GIBCO BRL社より購入した。 このプラスミ ドの EcoRI及び Spel切断部位へ Xholリンカ一 DNAを挿入することによって Xhol認識配列に変更したものを使用した。 この改変 PBS246の EcoRV切断部位へ上記 pstNEO DNA断片を挿入してプラスミ ド LoxP- pstNE 0を得た （第 23図） 。 2 . C57BL/6由来抗体重鎖 C （IgM定常領域） 、 軽鎖 J /c - C /c ( l g /c連結領域 および定常領域） を含むゲノム DNAクローンの単離
TT2(または TT2F)細胞は、 C57BL/6マウスと CBAマウスの F 1マウス由来であ ることから、 C57BL/6マウス由来のゲノム DNAクローンを用いて抗体遺伝子ノッ クアウ ト用ベクターを作製することにした。 ゲノム DNAライブラリ一は、 Clonte ch社 adul t C57BL/6N male l i ver由来ラムダ DNAライブラリ一を使用した。 スク リーニングのためにプローブとしては、 以下の合成 DNA配列 （60 mer) を用いた。 重鎖 C zプローブ： 5' - ACC TTC ATC GTC CTC TTC CTC CTG AGC CTC TTC TAC AGC ACC ACC GTC ACC CTG TTC AAG-3' (配列番号 59)
軽鎖 / プローブ： 5，-TGA TGC TGC ACC AAC TGT ATC CAT CTT CCC ACC ATC CAG T GA GCA GTT AAC ATC TGG AGG- 3， (配列番号 60)
単離されたラムダクローンを解析して、 重鎖 C または軽鎖 J - C /cを含む DN A断片を pBl uescri pt SKI K+) プラスミ ド （Stratagene社） へサブクローニング した （重鎖 C〃 ：第 24図；軽鎖 J /C - C / ：第 25図） 。 これらの DNA断片を用いて、 以下のように TT2(または TT2F)ES細胞中のマウス抗体遺伝子破壊のためのターゲ ッティ ングベクタ一を作製した。
3 . マウス抗体重鎖遺伝子破壊用ベクタープラスミ ドの作製
2で調製したマウス抗体重鎖定常領域を含むゲノム DNAの C zをコードする領 域の内で、 第 2〜第 4ェクソンが含まれる DNA断片 （BamHI〜Xho I) を 1で作製 した LoxP-ps tNEO遺伝子と置き換えた （第 26図） 。 ps tNEOの転写方向は、 抗体遺 伝子の転写方向'とは逆向きとなっている。 このプラスミ ド DNAは、 大腸菌 JM109 を用いて増幅し、 セシウムクロライ ド平衡遠心により精製した （細胞工学実験操 作入門、 1992年講談社刊） 。 精製したプラスミ ド DNAは、 制限酵素 Sacl lにより、 —箇所切断して TT2(または TT2F) ES細胞へのトランスフヱクションに使用した。 形質転換体 ΤΤ2(または TT2F)ES細胞の中から抗体重鎖部分がターゲッティ ングべ クタ一と相同組換えが起こったクローンを検出するための形質転換体ゲノム DNA サザンブロッ ト用のプロ一ブとして、 C〃の上流に存在するスィッチ領域の DNA 断片 （約 500塩基対） を用いた。 この DNA断片は以下の条件で 129マウスゲノム DNAを PCR増幅して得た。 センスプライマ一： 5' -CTG GGG TGA GCC GGA TGT TTT G- 3，（配列番号 61)
アンチセンスプライマー ： 5，- CCA ACC CAG CTC AGC CCA GTT C-3' (配列番号 62) テンプレート DNA： EcoRl消化 129マウスゲノム謹 l g
反応バッファ一、 デォキシヌクレオチドミ ックス、 TaqDNAポリメラ一ゼは、 Taka ra社製のものを使用。
反応条件： 94度 3分， 1回 → 94度 C， 1分； 55度 C, 2分； 72度 C， 2分； 3回
→ 94度 C, 45秒； 55度 C， 1分； 72度 C， 1分； 36回
増幅された DNAが Genbankのデータベースにあるとおり、 制限酵素 Hindi Πで —箇所切断されえることを確認して、 pBl uescri ptプラスミ ドの EcoRV切断部位 へサブクローニングした。 このプラスミ ド DNA (S8) を制限酵素 BamHIと Xho lで 切断して、 ァガロースゲル電気泳動で PCR断片 （約 550塩基対） を精製したもの をプローブとした。 ターゲッティングベクターで形質転換した TT2(または TT2F)E S細胞のゲノム DNAを制限酵素 EcoRIと Xho lで消化し、 ァガロースゲル電気泳動 で分離後サザンブロッ トを行ない、 上記プローブで検出する。
4 . マウス抗体遺伝子軽鎖 k破壊用ベクターの作製
2で調製したマウス抗体軽鎖 /c J領域および定常領域を含むゲノム DNAの J領 域 （J1〜J5) が含まれる DNA断片 （EcoR I〜SacI I) を 1で作製したし oxP- pstNE 0遺伝子と置き換えた （第 27図） 。 ps tNEOの転写方向は、 抗体遺伝子の転写方向 と同じ向きとなっている。 このプラスミ ド DNAは、 大腸菌 JM109を用いて増幅し、 セシウムクロライ ド平衡遠心により精製した。 精製したプラスミ ド DNAは、 制限 酵素 Kpn lにより、 一箇所切断して ΤΤ2(または TT2F) ES細胞へのトランスフエクシ ョンに使用した。 形質転換体 ΤΤ2(または TT2F)ES細胞の中から抗体重鎖部分がタ ーゲッティ ングベクタ一と相同組換えが起こったクロ一ンを検出するための形質 転換体ゲノム DNAサザンブロッ ト用のプローブとして、 軽鎖 J C - C cゲノム DNA
(第 25図参照） の 3'端の DNA断片 （Xhol〜EcoRI ；約 1. 4k塩基対） を用いた。 タ ーゲッティ ングベクタ一で形質転換した TT2 (または TT2F) ES細胞のゲノム DNAを 制限酵素 EcoR Iと No t lで消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離後サザンプロッ トを行ない、 上記プローブで検出する。 (実施例 49) マウス ES細胞抗体重鎖遺伝子破壊株の取得
抗体重鎖遺伝子相同組換え体取得の為、 （実施例 48) -3で作成した抗体重鎖タ ーゲッティ ングベクタ一を制限酵素 SacI I (宝酒造） で線状化し、 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8，ジーンターゲテイング， 羊土社， 1995) の方法に従 いマウス ES細胞 TT2Fへ導入した。 TT2F細胞をトリプシン処理し、 2. 5xl07個/ ml となるように HBSに懸濁してから 5 jt gDNAを加え、 ジーンパルサー （バイオラッ ド、 抵抗器ュニッ ト接続せず） を用いてエレク トロポレーシヨンを行なった。 96 0 // Fの容量で 250Vの電圧を 4讓長のエレク トロポレーションセルを用いて室温 で印加した。 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を 20mlの ES培地に懸濁し、 あらか じめフィーダー細胞をまいた 100mm組織培養用プラスチックシャーレ （コ一ニン グ） 2枚に播種した。 同様に 10， 15 z gDNAを用いた実験も行った。 1 日後に 300 // g/mlの G418 (GENETICIN，シグマ） を含む培地と置き換えた。 7〜9日後に生じ たコロニー計 176個をピックアップし、 それぞれを 12穴ブレー卜でコンフルーェ ン トになるまで増殖させ、 その 4/5を 0. 2mlの保存用培地 （ES培地 +10 MS0くシ グマ〉） に懸濁し、 -80°Cにて凍結保存した。 残りの 1/5は 12穴ゼラチンコー ト プレートに播種し、 2日間培養して （実施例 2) に示した方法でゲノム DNAを取 得した。 これらの G418耐性 TT2F細胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoR Iと Xho l (宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離後サザンプロッ トを行ない、 （実施例 48) -3に示したプローブで相同組換え体を検出した。 その結果 176株中 3株が相 同組換え体であるという結果を得た。 野生型 TT2F細胞及び相同組換え体 #131、 #1 41のサザンプロ -、ソ ト解析の結果を （第 28図） 左側 3レーンに示す。 野生型 TT2卩細 胞では EcoRI、 Xhol消化により 2本のバンド （a、 b) が検出される。 相同組換 え体においては、 これらのいずれかのバンドが消失し、 新たに下部にバンド （c) が現われることが予想される。 図中 #131， #141において aのバンドが消失し、 新 たに cのバンドが出現している。 図中左側には DNAの大きさを示した。 すなわち これらのクローンは抗体重鎖遺伝子の片方のァレルが相同組換えにより破壊され たものである。
(実施例 50) 抗体重鎖相同組換え体 ES細胞からのキメラマウス作成
(実施例 49) で得られた抗体重鎖相同組換え体 TT2F細胞株 #131を凍結ストック より立ち上げ、 I CRまたは MCH( ICR) (日本クレア社） 雄雌マウスの交配により得 られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注人した。 ES細胞用培地 （実施例 9) で一 晚培養して胚盤胞に発生させた後、 偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 ICRマウス （日本 クレア社） の子宮に片側の子宮あたり約 10個のインジヱクション胚を移植した。 計 94個の注入胚を移植した結果、 22匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛 色において宿主胚 （ICR) 由来の白色の中に TT2F細胞由来の野生色 （濃茶） が認 められるかどうかにより判定される。 誕生した 22匹のうち毛色に明らかに野生色 の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 18匹であった。 うち 16個体は毛色の 80!¾以上が野生色の （ES細胞に由来する） 雌キメラマウスであつ た。 この結果より、 抗体重鎖相同組換え体 ES細胞株 #131はキメラ形成能を保持し ていることが確認された。 得られたキメラマウスのうち多くの個体は非常に高い 貢献率を示す雌であるので、 ES細胞が機能的な生殖細胞 （卵子） に分化している 可能性が高い。 キメラマウスのうち 100¾！の貢献率を示す雌キメラ 2個体を MCH IC R)雄マウスと交配した結果、 生まれた子マウスはすべて野性色を示した。 これら の子マウスは #131由来であり （実施例 42参照）、 2匹に 1匹の割合で破壊された 抗体重鎖ァレルが伝達していると考えられる。
(実施例 51) 抗体重鎖相同組換え体からの 2重破壊株の取得
片側ァレルが G418耐性遺伝子の揷入により破壊された ES細胞株において、 培養 液中の G418濃度を上げて培養することにより得られる高濃度 G418耐性株をスクリ —ニングすれば両側ァレル共に破壊された株を取得することが可能なことが報告 されている （相沢慎一ら、 バイオマニュアルシリーズ 8，ジーンターゲテイ ング， 羊土社， 1995) 。 これに基づき、 我々は TT2F抗体重鎖相同組換え体 #131, #141に ついて両側アレルの破壊株取得の為、 以下の実験を行った。 まず、 #131， #141両 株にっ 、て致死 G418濃度検定のため 35mmシャーレ各 10枚 （この実施例においては 栄養細胞はマイ トマィシン処理をしていない G418耐性初代培養細胞を使用した。 実施例 9参照） に 1枚あたり約 100個の細胞を播種し、 0， 0. 5, 1， 2， 3, 5, 8,
10， 15， 20 mg/ml の G418 (GENET IC IN, シグマ） をそれぞれ含む ES培地中で 10 日間培養した。 その結果 3mg/mlの濃度までは明らかなコロニーが認められたが、 5mg/mlではコロニー形成は認められなかった。 この結果をもとに最小致死濃度を 5mg/mlと決定し、 4， 5, 6， 7, 8mg/mlの各濃度で高濃度 G418耐性株の選抜を行つ た。 #131, #141それぞれについて 100隱シャーレ計 10枚に 1枚当たり約 106個の 細胞を播種し、 上記の各濃度の G418を含む ES培地 （5段階、 各濃度シャーレ 2枚 づっ） により培養した。 培養開始 12日後に 7mg， 8mg/mlのシャーレにおいて明ら かなコロニー （#131： 12株、 #141： 10株） をピックアップし、 （実施例 49) と同 様に凍結保存、 DNA取得を行った。 これらの高濃度 G418耐性株ゲノム DNAを制限 酵素 EcoR lと Xho l (宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離後サザン プロッ トを行ない、 （実施例 48) -3に示したプローブで両側アレルの破壊された 株を検出した。 その結果 #131株由来の 1株 （#131 -3) が両側アレル破壊株である という結果を得た。 #131由来の 6株についてのサザンブロッ ト解析の結果を （第 28図） に示す。 野生型 TT2F細胞では EcoR I、 Xho l消化により 2本の野生型バンド
(a、 b) が検出される。 片側アレル相同組換え体 （#131, # 141) においては、 上部のバンド aが消失し、 新たにバンド cが現われる （実施例 49) 。 さらに両側 アレルが破壊されることにより、 もう一方の野生型バンド bが消失し、 破壊型バ ンド cのみとなることが予想される。 図中 3 (#131 -3) のクローンにおいてこの バンドパターンが観察された。 すなわちこのクローンは抗体重鎖遺伝子の両方の ァレルが破壊されたものである。
(実施例 52) 抗体重鎖欠損ホモ接合体 TT2F細胞株からの G418耐性マーカ一遺伝子 の除去
(実施例 51) で取得された抗体重鎖両側アレル破壊株 （高濃度 G418耐性株 #131 -3) の G418耐性マ一カー遺伝子を以下の手順により除去した。 G418耐性マーカー 遺伝子の両側に挿入した l oxP配列 （実施例 48- 1) の間で部位特異的組換えを起こ す Creレコンビナーゼ遺伝子を含む発現ベクター pBS185 (BRL) を （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8,ジーンターゲテイ ング， 羊土社， 1995、 及び高津聖 志ら、 実験医学別冊、 免疫研究の基礎技術、 p255-、 1995、 羊土社） の方法に従 い # 131 - 3株へ導入した。 #131 - 3細胞をトリプシン処理し、 2. 5x l07個 Zmlとなる ように HBSに懸濁してから 30 ^ gの PBS 185DNAを加え、 ジーンパルサー （バイオ ラッ ド、 抵抗器ュニッ ト接続せず） を用いてエレク トロポレーシヨンを行なった c 960〃Fの容量で 250Vの電圧を 4imn長のエレク トロポレーシヨンセル （実施例 1 ) を用いて印加した。 エレク 卜口ポレーシヨンした細胞を 5mlの ES培地に懸濁し、 あらかじめフィ一ダー細胞をまいた 60mm組織培養用プラスチックシャーレ （コー ニング） 夂に播種した。 2日後に細胞をトリプシン処理し、 フィーダ一細胞を まいた 100誦シャーレ 3枚にそれぞれシャーレ 1枚当たり 100、 200、 300細胞 となるように再度播種した。 ジーンパルサ一の設定 （抵抗器ュニッ ト接続、 抵抗 値無限大） のみ変更した条件でも同様に行った。 7日後に生じたコロニー計 96個 をピックアップし、 トリプシン処理した後 2つに分け、 フィーダ一細胞をまいた 48穴プレート及びゼラチンコ一ト処理のみを行った 48穴プレート 2枚にそれぞれ 播種した。 後者は 300 / /1111の0418 (GENETIC IN. シグマ） を含む培地で 3日間 培養し、 その生存率で G418耐性を判定した。 その結果 6クローンが G418存在下で 死滅した。 これらの G418感受性株を 35M1シャーレでコンフルーェン卜になるまで 増殖させ、 その 4/5を 0. 5mlの保存用培地 （ES培地 + 10 MS0くシグマ〉） に懸濁 し、 - 80°Cにて凍結保存した。 残りの 1/5は 12穴ゼラチンコートプレートに播種 し、 2日間培養して （実施例 2) に示した方法でゲノム DNAを取得した。 これら の G418感受性 TT2F細胞株ゲノム DNAを制限酵素 EcoRI (宝酒造） で消化し、 ァガ ロースゲル電気泳動で分離後サザンブロッ トを行ない、 G418耐性遺伝子を含む pS TneoB由来 3. 2kb Xho l断片 （プローブ A ) で G418耐性遺伝子の除去を確認した。 その結果、 #131- 3において観察される、 プローブ Aとハイブリダィズするバンド 力 感受性株においては全く検出されなかった。 これらの結果より、 取得された G418感受性株において確かに G418耐性マーカー遺伝子が除去されていることが確 認された。 さらに上記と同様な方法で PBS185DNAを EcoRI消化したプローブ Bを用 いてサザン解析を行った結果、 これら G418感受性株にプローブ Bとハイプリダイ ズする特異的なバンドは検出されなかったことから、 Creレコンビナーゼを含む PBS185は感受性株染色体に挿入されていないと考えられる。 すなわち、 これらの 感受性株は実施例 48- 4に示した抗体軽鎖ノ ックァゥ 卜ベクター （G418耐性遺伝子 の両側に Ι οχΡ配列が存在する） による形質転換を行うことができる。
(実施例 53) 抗体重鎖欠損 ES細胞株へのヒ ト 14番染色体 （抗体重鎖） の導入
(実施例 52) で得られた、 内在性の抗体重鎖を欠損するマウス ES細胞株 （TT2F 由来、 G418感受性） に （実施例 9) で示した通りに G418耐性遺伝子によりマーキ ングされたヒ 卜 14番染色体 （抗体重鎖遺伝子を含む） をミクロセル法により導入 する。 得られる G418耐性株において PCR解析等 （実施例 9) によりヒ ト抗体重鎖 遺伝子を含むヒ ト 14番染色体 （断片） の保持が確認される。
(実施例 54) ヒ 卜 14番染色体 （断片） を保持する抗体重鎖欠損 ES細胞株へのヒ ト 2番染色体断片あるいは 22番染色体の導入
(実施例 53) で得られた、 ヒ ト 14番染色体断片を保持する抗体重鎖欠損マウス ES細胞株 （G418耐性） に （実施例 18、 35) で示した通りにピューロマイシン耐性 遺伝子によりマーキングされたヒ ト 2番染色体断片 （抗体軽鎖 遺伝子を含む） あるいはヒ ト 22番染色体 （抗体軽鎖； I遺伝子を含む） をミクロセル法により導入 する。 得られるピューロマイシン、 G418二重薬剤耐性株において PCR解析等 （実 施例 18、 35) によりヒ ト 14番染色体 （断片） 及び 2番染色体断片あるいは 22番染 色体 （断片） の保持が確認される。
(実施例 55) ヒ ト抗体重鎖遺伝子を含む 14番染色体 （断片） を保持する内在性抗 体重鎖欠損マウス ES細胞からのキメラマウス作成
(実施例 53) で取得されるヒ ト抗体重鎖遺伝子を含む 14番染色体 （断片） を保 持する内在性抗体重鎖遺伝子欠損マウス ES細胞株からのキメラマウス作成は （実 施例 10) で示した方法により行う。 ここで得られるキメラマウスにおいては、 ES 細胞株由来の B細胞で産生されるヒ ト抗体重鎖が （実施例 14) で示した方法によ り検出される。 また、 この ES細胞由来の B細胞において機能的な抗体重鎖遺伝子 は導入染色体上のヒ ト由来のもののみであるので、 ES細胞株由来 B細胞の多くは ヒ ト抗体重鎖を産生する。
(実施例 56) ヒ ト 14番 + 2番、 14番 + 22番染色体 （断片） を保持する内在性抗体 重鎖欠損マウス ES細胞からのキメラマウス作成
(実施例 54) で取得されるヒ ト 14番 + 2番、 14番 + 22番染色体 （断片） を保持 する内在性抗体重鎖遺伝子欠損マウス ES細胞株からのキメラマウス作成は （実施 例 19、 36) 等で示した方法により行う。 ここで得られるキメラマウスにおいては、 ES細胞株由来の B細胞でヒ ト抗体重鎖及び軽鎖/ cあるいは軽鎖 λが （実施例 14、 23、 32) で示した方法により検出される。 また、 （実施例 55) と同様にこの ES細 胞由来の Β細胞において機能的な抗体重鎖遺伝子は導入染色体上のヒ 卜由来のも ののみであるので、 ES細胞由来 B細胞の多くはヒ ト抗体重鎖を産生する。 さらに、
(実施例 37、 38) で示したように重鎖、 軽鎖が共にヒ ト由来である完全なヒ ト抗 体分子が検出される。
(実施例 57) ヒ ト 14番 + 2番、 14番 + 22番染色体 （断片） を保持する内在性抗体 重鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウスからのヒ ト抗体産生ハイプリ ドーマ取得 (実施例 15、 25、 34) と同様に （実施例 56) で作成されるキメラマウスに目的 とする抗原で免疫し、 脾臓を取り出し、 ミエローマ細胞と細胞融合し、 ハイプリ ドーマを作成する。 1〜3週間培養し培養上清を ELISA法で解析する。 ELISA法 は （実施例 14、 15、 21、 24、 25、 33、 34、 37、 38) に示した方法で行ない、 ヒ ト 抗体陽性及びヒ ト抗体陽性かつ免疫した抗原特異的クローンを得る。
(実施例 58) 抗体重鎖欠損ホモ接合体マウス ES細胞からの抗体軽鎖遺伝子破壊株 の取得
(実施例 52) で取得した抗体重鎖欠損ホモ接合体 TT2F細胞株 （G418感受性） に おいてさらに抗体軽鎖遺伝子を破壊した相同組換え体を以下の手順で取得する。
(実施例 48-4) で作成した抗体軽鎖ターゲッティングベクタ一を制限酵素 Kpnl ( 宝酒造） で線状化し、 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8，ジーンターゲテ イ ング， 羊土社， 1995) の方法に従い上記 TT2F細胞株 （G418感受性） へ導入する c 7〜9日後に生じたコロニーをピックアップし、 （実施例 49) に示した方法で凍 結保存、 ゲノム DNAを取得する。 G418耐性株ゲノム DNAを制限酵素 EcoRIと Not l
(宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロッ ト解析を行 ない、 （実施例 48-4) に示したプローブで相同組換え体を検出する。
(実施例 59) 抗体軽鎖相同組換え体からの 2重破壊株の取得
(実施例 58) で得られた TT2F抗体軽鎖相同組換え体 （かつ抗体重鎖欠損ホモ接 合体） について軽鎖両側アレルの破壊株を以下の手順により取得する。 （実施例 51) と同様な方法で高濃度 G418耐性株を取得し、 凍結保存、 DNA取得を行なう。 高濃度 G418耐性株ゲノム DNAを制限酵素 EcoR Iと No t l (宝酒造） で消化し、 ァガ ロースゲル電気泳動で分離後サザンプロッ トを行ない、 （実施例 48-4) に示した プローブで両側ァレルの破壊された株を検出する。
(実施例 60) 抗体軽鎖欠損ホモ接合体 （かつ抗体重鎖欠損ホモ接合体） TT2F細胞 株からの G418耐性マーカー遺伝子の除去
(実施例 59) で取得された抗体軽鎖両側アレル破壊株 （高濃度 G418耐性株） の G418耐性マーカー遺伝子を （実施例 52) で示した手順により除去する。 G418耐性 マーカー遺伝子の両側に挿入した loxP配列 （実施例 48-1) の間で部位特異的組換 えを起こす Creレコンビナーゼ遺伝子を含む発現ベクター pBS185 (BRL) を （実 施例 52) の方法に従い上記の株へ導入する。 （実施例 52) と同様に得られる G418 感受性株を 35譲シャーレでコンフルーェン卜になるまで増殖させ、 その 4/5を 0. 5mlの保存用培地 （ES培地 +10¾!DMS(Kシグマ〉） に懸濁し、 - 80°Cにて凍結保存 する。 残りの 1/5は 12穴ゼラチンコ一卜プレー卜に播種し、 2日間培養して （実 施例 2) に示した方法でゲノム DNAを取得する。 これらの G418感受性 TT2F細胞ゲ ノム DNAを制限酵素 EcoR I (宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離 後サザンブロッ トを行ない、 G418耐性遺伝子を含む pSTneoB由来 3. 2kbXho I断片 をプローブとし、 G418耐性遺伝子の除去を確認する。
(実施例 61) 抗体重鎖、 軽鎖欠損 ES細胞株へのヒ ト 14番染色体 （抗体重鎖） の導 入
(実施例 60) で得られた、 内在性の抗体重鎖及び軽鎖の両者を欠損するマウス ES細胞株 （TT2F由来、 G418感受性） に （実施例 9) で示した通りに G418耐性遺伝 子によりマ一キングされたヒ ト 14番染色体 （ヒ ト抗体重鎖遺伝子を含む） をミク ロセル法により導入する。 得られる G418耐性株において PCR解析等 （実施例 9) によりヒ ト抗体重鎖遺伝子を含むヒ 卜 14番染色体 （断片） の保持が確認される。
(実施例 62) 抗体重鎖、 軽鎖欠損かつヒ ト 14番染色体 （抗体重鎖） を保持する ES 細胞株へのヒ ト 2番染色体 （軽鎖/ c ) の導入
(実施例 61) で得られた、 内在性抗体重鎖及び軽鎖欠損かつヒ ト 14番染色体を 保持するマウス ES細胞株 （TT2F由来、 G418耐性） に （実施例 18) で示した通りに ピューロマイシン耐性遺伝子でマーキングされたヒ ト 2番染色体 （ヒ 卜抗体軽鎖 遺伝子を含む） 部分断片をミクロセル法により導入する。 得られるピューロマ イシン、 G418二重薬剤耐性株において PCR解析等 （実施例 18) によりヒ 卜 14番染 色体 （断片） 及び 2番染色体断片の保持が確認される。 (実施例 63) 抗体重鎖、 軽鎖欠損かつヒ ト 14番染色体 （抗体重鎖） を保持する ES 細胞株へのヒ 卜 22番染色体 （軽鎖; I ) の導入
(実施例 61) で得られた、 内在性抗体重鎖及び軽鎖欠損かつヒ ト 14番染色体を 保持するマウス ES細胞株 （TT2F由来、 G418耐性） に （実施例 35) で示した通りに ピューロマイシン耐性遺伝子でマーキングされたヒ ト 22番染色体 （ヒ ト抗体軽鎖 ス遺伝子を含む） をミクロセル法により導入する。 得られるピューロマイシン、 G418二重耐性株において PCR解析等 （実施例 35) によりヒ ト 14番染色体 （断片） 及び 22番染色体 （断片） の保持が確認される。
(実施例 64) ヒ ト 2番 （抗体軽鎖/ c ) 、 14番 （抗体重鎖） 、 22番 （抗体; I鎖） 染 色体あるいはその部分断片を同時に保持する内在性抗体重鎖、 軽鎖欠損マウス ES 細胞の取得
3種のヒ ト染色体を同時に保持するマウス ES細胞を得るために、 ヒ ト 2番ある いは 22番染色体をブラス トサイジン耐性 （I zumiら、 Exp. Cel l. Res. , 197, 22 9， 1991) 、 ハイグロマイシン耐性 （Windら、 Cel l, 82, 321-, 1995) 等のマー カー遺伝子の挿入によりマ一キングする。 これは （実施例 16、 26) に示した方法 により行う。 （実施例 62) で得られた、 内在性抗体重鎖及び軽鎖欠損でありかつ ヒ 卜 14番染色体 （断片） 及び 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞株 （TT 2F由来、 G418耐性、 ピューロマイシン耐性） に （実施例 9) で示した方法と同様 にブラストサイジン耐性あるいはハイグロマイシン耐性等でマーキングされたヒ 卜 22番染色体 （ヒ 卜抗体軽鎖； I遺伝子を含む） を導入する。 ES細胞培養用のフィ ーダー細胞はそれぞれの選択マーカーに適したものを使用する。 ハイグロマイシ ン耐性マーカーを使用する場合は、 そのマーカ一を保持し、 発現する トランスジ エニックマウス系統より得た初代培養繊維芽細胞 （Johnsonら、 Nucl ei c Aci ds Research, vo l . 23， No. 7, 1273-, 1995) を使用する。 得られる G418、 ピュー ロマイシン、 ハイグロマイシン （あるいはブラス トサイジン） 三重耐性株は上記 3種のヒ 卜染色体 （断片） を保持していること力 PCR解析等 （実施例 9、 18、 35) により確認される。 （実施例 63) で得られた内在性抗体重鎖及び軽鎖欠損であり かつヒ 卜 14番染色体 （断片） 及び 22番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞株
(TT2F由来、 G418耐性、 ピューロマイシン耐性） へのハイグロマイシンあるいは ブラストサイジン耐性遺伝子でマーキングされたヒ ト 2番染色体断片の導入も同 様に行う。
(実施例 65) ヒ ト抗体遺伝子 （重鎖 +軽鎖） を含む染色体 （断片） を保持する内 在性抗体重鎖、 軽鎖遺伝子欠損マウス ES細胞からのキメラマウス作成
(実施例 61、 62、 63、 64) で取得されるヒ 卜抗体遺伝子を含む染色体 （断片） を保持する内在性抗体重鎖、 軽鎖遺伝子欠損マゥス ES細胞株からのキメラマウス 作成は （実施例 10) 等で示した方法により行う。 ここで得られるキメラマウスに おいては、 宿主胚由来の B細胞で産生されるマウス抗体と ES細胞株由来の B細胞 で主に産生されるヒ ト抗体が （実施例 14、 23、 32) で示した方法により検出され る。 また、 この ES細胞由来の B細胞において機能的な抗体重鎖及び軽鎖/ c遺伝子 は導入染色体上のヒ ト由来のもののみであるので、 ES細胞由来の B細胞の多くは ヒ ト抗体重鎖及び軽鎖/ cを産生する （ Lonbergら， Nature, 368, 856-, 1994) 。 さらに、 （実施例 37、 38) で示した方法により重鎖、 軽鎖が共にヒ 卜由来である 完全なヒ 卜抗体分子が検出される。
(実施例 66) ヒ ト抗体遺伝子 （重鎖 +軽鎖） を含む染色体 （断片） を保持する内 在性抗体重鎖、 軽鎖遺伝子欠損マウス ES細胞由来キメラマウスからのヒ ト抗体産 生ハイブリ ドーマ取得
(実施例 25) と同様に （実施例 65) で得られるキメラマウスに目的とする抗原 で免疫し、 脾臓を取り出し、 ミエローマ細胞と細胞融合し、 ハイプリ ドーマを作 成する。 1〜3週間培養し培養上清を ELISA法で解析する。 EL ISA法は （実施例
14、 15、 21、 22-、 23、 24、 25、 33、 34、 37、 38) に示した方法で行ない、 ヒ ト抗 体陽性及びヒ ト抗体陽性かつ免疫した抗原特異的クローンを得る。
(実施例 67) 重鎖遺伝子欠損宿主胚とのキメラマウス作成
(実施例 49) で作成した内在性抗体重鎖片側ァレル欠損 TT2F細胞株由来キメラ マウスの子孫のうち野性色を示すものについてサザン解析あるいは P C R (実施 例 49) 等により欠損アレルを保持する個体を選抜する （期待される確率は 1/2で ある） 。 これらの抗体重鎖欠損へテロ接合体の雌雄個体の交配により生まれる子 マウスについてサザン解析 （実施例 49参照） 、 リンパ球表面での 鎖発現 （Ki ta muraら， Nature, 350, 423-, 1991) 等の解析を行い、 両側アレルが欠損し、 自身 の機能的な抗体をほとんど産生できない抗体重鎖欠損ホモ接合体を得ることがで きる （期待される確率は 1/4である、 膜型; 鎮欠損マウスにおける結果： l tamu ら， Nature, 350, 423-, 1991参照） 。 清浄な環境で飼育したホモ接合体雌雄個 体の交配により得られる胚をキメラマウス作成の際の宿主として利用できる。 こ の場合キメラマウスにおいて機能的な B細胞はほとんど注入した ES細胞に由来す る。 RAG-2欠損マウス （Shinkaiら， Cel l, 68, 855-, 1992) 等、 機能的な B細 胞を自ら作ることができない他のマウス系統もこの目的に同様に利用できる。 こ のシステムにおいて （実施例 62、 63、 64) で得られる内在性抗体重鎖及び軽鎖欠 損かつヒ ト 14番 + 2番あるいは 14番 + 22番あるいは 14番 + 2番 + 22番染色体 （断 片） を保持するマウス ES細胞株を使用し （実施例 10) 等に示した方法でキメラマ ウスを作成する。 得られるキメラマウスでは ES細胞由来の B細胞において機能的 なヒ 卜抗体重鎖 （14番染色体上） 、 軽鎖/ c (2番染色体上） 、 軽鎖; I (22番染色 体上） 遺伝子より主にヒ ト重鎖及びヒ ト軽鎖からなる抗体を生産する。
(実施例 68) ヒ 卜 14番染色体 (断片) 導入 ES細胞由来キメラマウス子孫における ヒ ト染色体の保持
(実施例 9) と同様な方法及び、 （実施例 9) のマウス ES細胞を TT2F (39、 X0、 実施例 39) に置き換えた方法を利用して得られるヒ ト 14番染色体 （断片） を保持 するキメラマウスと野生型 ICRマウス （アルビノ、 日本クレア社） を混合して交 配する。 誕生する野生色の子マウスの尻尾より調製したゲノム DNAについてヒ ト 14番染色体断片の保持を PCR法により検討する （実施例 9、 42、 43参照） 。 ヒ ト 14番染色体 （断片） を保持するマウス ES細胞株は （実施例 42) 及び （実施例 43) で示した通りにキメラマウス中で機能的な卵子あるいは精子に分化し、 それ由来 の子孫にヒ ト 14番染色体 （断片） が伝達可能である。 すなわちヒ 卜抗体重鎖遺伝 子を含む 14番染色体 （断片） を保持する継代可能なマウス系統を確立することが できる。 本実施例及び以下の実施例 69〜74において、 ヒ ト 14番染色体 （断片） は ヒ ト抗体重鎖遺伝子、 ヒ ト 2番染色体 （断片） はヒ ト抗体/ c鎖遺伝子を、 ヒ ト 22 番染色体 （断片） はヒ ト抗体 λ鎖遺伝子を、 それぞれ含むものを指す。
(実施例 69) ヒ ト 22番染色体 （断片） 導入 ES細胞由来キメラマウス子孫における ヒ ト染色体の保持 (実施例 30) と同様な方法及び、 （実施例 30) のマウス ES細胞を TT2F (39、 X0) に置き換えた方法を利用して得られるヒ ト 22番染色体 （断片） を保持するキメラ マウスと I CRマウスを混合して交配する。 誕生する野生色の子マウスの尻尾より 調製したゲノム DNAについてヒ ト 22番染色体断片の保持を PCR法により検討する
(実施例 30、 42、 43参照） 。 ヒ ト 22番染色体あるいはその部分断片を保持するマ ウス ES細胞株は （実施例 42) 及び （実施例 43) で示した通りにキメラマウス中で 機能的な卵子あるいは精子に分化し、 それ由来の子孫にヒ ト 22番染色体 （断片） が伝達可能である。 すなわちヒ ト抗体軽鎖 λ遺伝子を含む 22番染色体 （断片） を 保持する継代可能なマゥス系統を確立することができる。
(実施例 70) ヒ ト 2番染色体断片及び 14番染色体 （断片） を同時に保持するマウ ス個体の交配による作成
(実施例 42) あるいは （実施例 43) で得られたヒ ト 2番染色体断片を保持する マウス系統と （実施例 68) で得られるヒ ト 14番染色体 （断片） を保持するマウス 系統を交配することにより生まれる子マウスの尻尾より調製したゲノム DNAを PC R法等 （実施例 9、 42、 43) により解析して、 ヒ ト 2番染色体部分断片及びヒ ト 14番染色体 （断片） を同時に保持する個体を得る。
(実施例 71) ヒ ト 22番染色体 （断片） 及び 14番染色体 （断片） を同時に保持する マウス個体の交配による作成
(実施例 69) で得られるヒ ト 22番染色体 （断片） を保持するマウス系統と （実 施例 68) で得られるヒ ト 14番染色体 （断片） を保持するマウス系統を交配するこ とにより生まれる子マウスの尻尾より調製したゲノム DNAを PCR法等 （実施例 30、 42、 43) により解析して、 ヒ ト 22番染色体 （断片） 及びヒ ト 14番染色体 （断片） を同時に保持する個体を得る。
(実施例 72) ヒ ト 2番染色体断片、 14番染色体 （断片） 及び 22番染色体 （断片） を同時に保持するマウス個体の交配による作成
(実施例 71) で得られるヒ ト 22番染色体 （断片） 及びヒ ト 14番染色体 （断片） を保持するマウス系統を （実施例 42、 43) で得られたヒ ト 2番染色体断片を保持 するマウス系統と交配することにより生まれる子マウスの尻尾より調製したゲノ ム DNAを PCR法等 （実施例 9、 30、 42、 43) により解析して、 ヒ ト 22番染色体 （ 断片） 及びヒ ト 14番染色体 （断片） 及びヒ ト 2番染色体部分断片の 3種のヒ ト染 色体を同時に保持する個体を得る。 あるいは （実施例 70) で得られるヒ ト 2番染 色体 （断片） 及びヒ ト 14番染色体 （断片） を保持するマウス系統と （実施例 69) で得られるヒ ト 22番染色体断片を保持するマウス系統と交配することによつても 同様に 3種のヒ ト染色体を同時に保持するマウス個体を得る。
(実施例 73) 完全なヒ 卜抗体を主として産生するマウス系統の交配による作成 ヒ ト 2番 + 14番 （実施例 70) 、 14番 + 22番 （実施例 71) 、 2番 + 14番 + 22番 （ 実施例 72) 染色体を保持するマウス系統を内在性抗体重鎖 （実施例 67 ; Ki tamura ら， Nature, 350, 423-, 1991)、 軽鎖/ c (Zouら， E BO J. , 12， 811-， 1993 ; C hen ら， EMBO J.， 12， 821-， 1993)遺伝子を欠損しているマウス系統と交配を繰 り返し、 ヒ ト 2番 + 14番、 14番 + 22番、 または 2番 + 14番 + 22番染色体を保持す るマウスを PCR解析等 （実施例 9、 30、 42、 43) により選抜し、 主に完全なヒ ト を産生するマウス系統を確立する （Greenら， Nature Genet ics, 7, 13-, 1994,
Lonbergら， Nature, 368， 856-, 1994) 。
(実施例 74) 交配により得られるヒ ト抗体遺伝子を含むヒ ト染色体を保持するマ ウス系統からのヒ ト抗体産生ハイプリ ドーマ取得
(実施例 25) と同様に （実施例 42、 43、 68、 69、 70、 71、 72、 73) で得られる ヒ ト抗体遺伝子を含むヒ ト染色体を保持するマウス個体に目的とする抗原で免疫 し、 脾臓を取り出し、 ミエローマ細胞と細胞融合し、 ハイプリ ドーマを作成する 1〜3週間培養し培養上清を ELISA法で解析する。 EL ISA法は （実施例 14、 15、 21、 22、 25、 33、 34. 37、 38) に示した方法で行ない、 ヒ ト抗体陽性及びヒ ト抗体陽 性かつ免疫した抗原特異的クローンを得る。
(実施例 75) マウス抗体重鎖両側ァレル破壊 TT2F細胞株由来キメラマウスの血清 中のマウス I gMの検出および定量
(実施例 51) で取得されたマウス抗体重鎖両側ァレル破壊 TT2F細胞株（#131-3) より （実施例 40) に示した方法で誕生した子マウスのうちキメラ率がそれぞれ 0 50¾ 、 99¾ の 3個体について血清中のマウス l gMの検出および定量を行った。 生 後約 2週齢のキメラマウスより採血し血清中のマウス I gM濃度を （実施例 14) の EL ISA 法を用いて定量した。 PBSで希釈した抗マウス I gM抗体（Ki rkegaard & Pe rry Laboratories Inc. , 01-18- 03)を固定し、 次いで 5 BSを添加した PBSで希 釈した血清試料を加えた。 ペルォキシダ一ゼ標識抗マウス IgM抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. , 074-1803)を加え、 TMBZを基質とし、 450 nmの吸光 度を測定した。 精製されたマウス IgM (ファーミ ンジヱン、 03081D) を標準とし段 階的に FBS添加の PBSで希釈した。 結果を第 20表に示す。 マウス抗体重鎖の両側 アレルが破壊された TT2F細胞由来のキメラマウスのうち、 キメラ率が 99¾ί のもの はマウス IgM濃度が低く、 ES細胞のマウス重鎖遺伝子がほとんど機能しないこと が確認された。 第 20表. キメラマウス中のマウス IgM濃度 （ELISA) キメラ率％ I gM (mg/1)
0 12
50 11
99 1.5
産業上の利用可能性
本発明により、 単一または複数の外来染色体またはその断片を保持し、 該染色 体またはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ ト動物が提供された。 本発明 のキメラ非ヒ 卜動物を利用して、 生物学的に活性な物質を製造することができる c 本発明により、 単一または複数の外来染色体またはその断片を保持し、 該染色 体またはその断片上の遺伝子を発現する分化多能性を持つ細胞が提供された。 該 細胞を利用して、 骨髄移植等による遺伝病治療を行うことができる。 配 列 表
配列番号： 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGGAAGGTGG ATAACGCCCT 20 配列番号： 2
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TCATTCTCCT CCAACATTAG CA 22 配列番号： 3
配列の長さ ： 2 -1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGTAGGGGAC CTGGAGCCTT G 21 配列番号： 4 配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TTGACAACTC ACCTGGACTA G 21 配列番号： 5
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA 20 配列番号： 6
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖- トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGCTGATGGT GAGAGTGAAC TC 22 配列番号： 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
AGTCAGGGCA TTAGCAGTGC 20 配列番号： 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GCTGCTGATG GTGAGAGTGA 20 配列番号： 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGGTGGCTGA AAGCTAAGAA 20 配列番号： 1 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CCAGAAGAAT GGTGTCATTA 20 配列番号： 1 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TCCAGGTTCT GCAGAGCAAG 20 配列番号： 1 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGTAGTTGGA GGCCATGTCC 20 配列番号： 1 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列 CCCCACCCAT GATCCAGTAC 20 配列番号： 1 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GCCCTCAGAA GACGAAGCAG 20 配列番号： 1 5
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GAGAGTTGCA GAAGGGGTGA CT 22 配列番号： 1 6 - 配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GGAGACCACC AAACCCTCCA AA 22 配列番号： 1 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GGCTATGGGG ACCTGGGCTG 20 配列番号： 1 8
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CAGAGACACA GGCACGTAGA AG 22 配列番号： 1 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸- 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TTAAGGGTCA CCCAGAGACT 20 配列番号： 2 0
配列の長さ ： 2 0 配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGTAGTTGGA GGCCATGTCC 20 配列番号： 2 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CAAAAAGTCC AACCCTATCA 20 配列番号： 2 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GCCCTCAGAA GACGAAGCAG 20 配列番号： 2 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TCGTTCCTGT CGAGGATGAA 20 配列番号： 2 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TCACTCCGAA GCTGCCTTTC 20 配列番号： 2 5
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATGTACAGGA TGCAACTCCT G 21 配列番号： 2 6
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TCATCTGTAA ATCCAGCAGT 20 配列番号： 2 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GATCCCATCG CAGCTACCGC 20 配列番号： 2 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TTCGCCGAGT AGTCGCACGG 20 配列番号： 9
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GATGAACTAG TCCAGGTGAG TT 22 配列番号： 3 0
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CCTTTTGGCT TCTACTCCTT CA 22 配列番号： 3 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATAGAGGGTA CCCACTCTGG 20 配列番号： 3 2
配列の長さ ： 2 -0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
AACCAGGTAG GTTGATATGG 20 配列番号： 3 3 配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
AAGTTCCTGT GATGTCAAGC 20 配列番号： 3 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TCATGAGCAG ATTAAACCCG 20 配列番号： 3 5
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖- トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGTGAAGGAG GACCAGGTGT 20 配列番号： 3 6
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGTAGGGGTT GACAGTGACA 20 配列番号： 3 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CTGAGAGATG CCTCTGGTGC 20 配列番号： 3 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GGCGGTTAGT GGGGTCTTCA 20 配列番号： 3 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GGTGTCGTGG AACTCAGGCG 20 配列番号： 4 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CTGGTGCAGG ACGGTGAGGA 20 配列番号： 4 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GCATCCTGAC CGTCTCCGAA 20 配列番号： 4 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列 GGGTCAGTAG CAGGTGCCAG 20 配列番号： 4 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
AGTGAGATAA GCAGTGGATG 20 配列番号： 4 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GTTGTGCTAC TCCCATCACT 20 配列番号： 4 5 - 配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TTGTATTTCC AGGAGAAAGT G 21 配列番号： 4 6
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GGAGACGAGG GGGAAAAGGG 20 配列番号： 4 7
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATGGACTGGA CCTGGAGGRT CYTCTKC 27 配列番号： 4 8
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸- 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATGGAGYTTG GGCTGASCTG GSTTTYT 27 配列番号： 4 9
配列の長さ ： 2 7 配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATGRAMMWAC TKTGKWBCWY SCTYCTG 27 配列番号： 5 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CAGAGGCAGT TCCAGATTTC 20 配列番号： 5 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGGGATAGAA GTTATTCAGC 20 配列番号： 5 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATGGACATGR RRDYCCHVGY KCASCTT 27 配列番号： 5 3
配列の長さ ： 2 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CCAAGCTTCA GGAGAAAGTG ATGGAGTC 配列番号： 5 4
配列の長さ ： 2 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CCAAGCTTAG GCAGCCAACG GCCACGCT 配列番号： 5 5
配列の長さ ： 2 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列 CCAAGCTTCA GAGGCAGTTC CAGATTTC 配列番号： 5 6
配列の長さ ： 2 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
GGGAATTCGG GTAGAAGTCA CTGATCAG 配列番号： 5 7
配列の長さ ： 2 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
GGGAATTCGG GTAGAAGTCA CTTATGAG 配列番号： 5 8 "
配列の長さ ： 2 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
GGGAATTCGG GTAGAAGTCA CTTACGAG
1 o 配列番号： 5 9
配列の長さ ： 6 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ACCTTCATCG TCCTCTTCCT CCTGAGCCTC TTCTACAGCA CCACCGTCAC CCTGTTCAAG 配列番号： 6 0
配列の長さ ： 6 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGATGCTGCA CCAACTGTAT CCATCTTCCC ACCATCCAGT GAGCAGTTAA CATCTGGAGG 配列番号： 6 1
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸- 鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CTGGGGTGAG CCGGATGTTT TG 配列番号： 6 2
配列の長さ ： 2 2 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CCAACCCAGC TCAGCCCAGT TC

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、 該ミクロセルとの融合により、 分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数 の外来染色体あるいはその断片を移入させることを特徴とする、 キメラ非ヒ ト動 物の作製法。
2. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、 該ミクロセルとの融合により、 分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数 の外来染色体あるいはその断片を移入させることを特徴とする、 単一または複数 の外来染色体あるいはその断片を含む分化多能性を保持する細胞の作製方法。
3. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片が 1 M b (百万塩基対） 以上 の大きさを有するものである請求の範囲第 1項または第 2項記載の方法。
4. 外来染色体あるいはその断片が抗体をコードする領域を含むものである請求 の範囲第 1項または第 2項記載の方法。
5. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルが、 単一ま たは複数の外来染色体あるいはその断片を含む細胞とミクロセル形成能の高い細 胞とを融合させて作製されたハイプリ ッ ド細胞から誘導されたものである請求の 範囲第 1項または第 2項記載の方法。
6. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルが、 前記ハ イブリ ッ ド細胞から誘導されたミクロセルをさらにミクロセル形成能の高い細胞 と融合させて作製された細胞から誘導されたものである請求の範囲第 5項記載の 方法。
7. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む細胞がヒ ト正常 2倍体 細胞である請求の範囲第 5項記載の方法。
8. ミクロセル形成能の高い細胞がマウス A 9細胞である請求の範囲第 5項〜第 7項のいずれか一項に記載の方法。
9. 分化多能性を保持する細胞が E S細胞である請求の範囲第 1項または第 2項 記載の方法。
10. 外来染色体あるいはその断片が目的の遺伝子を含むものであり、 分化多能性 を保持する細胞がその外来染色体あるいはその断片上の該目的の遺伝子と同じあ るいは相同の遺伝子が破壊されているものである請求の範囲第 1項または第 2項 記載の方法。
11. その外来染色体あるいはその断片上の前記の目的の遺伝子と同じあるいは相 同の遺伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞に、 該目的の遺伝子と同 じあるいは相同の遺伝子を含む外来染色体あるいはその断片を移入した後、 該細 胞と前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子が欠損している系統の非ヒ ト 動物の胚とのキメラを作製する請求の範囲第 1項記載の方法。
12. 前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子が欠損している系統の非ヒ ト 動物が標的遺伝子相同組み換え法により作製されたものである請求の範囲第 11項 記載の方法。
13. キメラ非ヒ ト動物が、 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持 し、 該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現し、 該外来染色体あるいは その断片を子孫に伝達可能なものである請求の範囲第 1項記載の方法。
14. キメラ非ヒ ト動物が哺乳動物である請求の範囲第 1項記載の方法。
15. 哺乳動物がマウスである請求の範囲第 14項記載の方法。
16. 請求の範囲第 2項に記載の方法により作製することができ、 単一または複数 の外来染色体あるいはその断片を含む分化多能性を保持する細胞。
17. キメラ非ヒ ト動物を作製するための請求の範囲第 16項記載の分化多能性を保 持する細胞の使用。
18. 請求の範囲第 1項および第 3項〜第 15項のいずれか一項に記載の方法により 作製することができ、 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ ト動物、 または、 前記の単一もしくは複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体 あるいはその断片上の遺伝子を発現するその子孫。
19. 請求の範囲第 18項記載のキメラ非ヒ ト動物またはその子孫の交配により得ら れる単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体ある いはその断片上の遺伝子を発現する非ヒ ト動物、 または、 単一もしくは複数の外 来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子 を発現するその子孫。
20. 請求の範囲第 18項記載のキメラ非ヒ ト動物もしくはその子孫または請求の範 囲第 19項記載の非ヒ ト動物もしくはその子孫に由来する組織。
21. 請求の範囲第 18項記載のキメラ非ヒ ト動物もしくはその子孫または請求の範 囲第 19項記載の非ヒ ト動物もしくはその子孫に由来する細胞。
22. B細胞である請求の範囲第 21項記載の細胞。
23. 請求の範囲第 21項記載の細胞とミエローマ細胞との融合により作製されたハ イブリ ドーマ。
24. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体ある いはその断片上の遺伝子を発現する請求の範囲第 18項記載のキメラ非ヒ ト動物も しくはその子孫または請求の範囲第 19項記載の非ヒ ト動物もしくはその子孫を、 該遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子が欠損している系統の非ヒ ト動物と交配さ せることにより作製された非ヒ ト動物、 または、 前記の単一もしくは複数の外来 染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を 発現するその子孫。
25. 請求の範囲第 18項記載のキメラ非ヒ ト動物もしくはその子孫または請求の範 囲第 19項記載の非ヒ ト動物もしくはその子孫の個体、 組織または細胞において、 単一または複数の外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現させ、 その産物 としての生物学的に活性な物質を回収することを特徴とする、 生物学的に活性な 物質の製造法。
26. キメラ非ヒ ト動物の細胞が B細胞である請求の範囲第 25項記載の方法。
27. B細胞がミエローマ細胞と融合して、 不死化されている請求項 26記載の方法 c
28. 生物学的に活性な物質が抗体である請求の範囲第 25項〜第 27項のいずれか一 項に記載の方法。
29. 抗体が哺乳動物の抗体である請求の範囲第 28項記載の方法。
30. 哺乳動物の抗体がヒ ト抗体である請求の範囲第 29項記載の方法。
31. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体ある いはその断片上の遺伝子を発現する請求の範囲第 18項記載のキメラ非ヒ ト動物も しくはその子孫または請求の範囲第 19項記載の非ヒ ト動物もしくはその子孫を、 該遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子が欠損している系統の非ヒ ト動物と交配さ せ、 誕生した子動物の個体、 組織または細胞において、 前記の単一または複数の 外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現させ、 その産物としての生物学的 に活性な物質を回収することを特徴とする、 生物学的に活性な物質の製造法。
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