UA115533C2 - ГУМАНІЗОВАНЕ МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО, СПЕЦИФІЧНЕ ДО КОМПЛЕКСУ αβTCR/СD3 ЛЮДИНИ - Google Patents

Abstract

Винахід стосується гуманізованого моноклонального антитіла, яке специфічне до комплексу αβTCR/CD3 людини, нуклеїнової кислоти, що його кодує, клітини, яка експресує нуклеїнову кислоту. Винахід також стосується зазначеного гуманізованого антитіла для застосування при супресії опосередкованої Т-клітинами відповіді у пацієнта, де Т-клітинна імунна відповідь пов’язана з трансплантацією тканини, розсіяним склерозом та діабетом 1 типу.

Description

Даний винахід відносять до антитіла, специфічного до альфа- та бета-рецептора Т-клітин («ВТСК). Зокрема, винахід відноситься до гуманізованого антитіла ОВТСК, яке походить від моноклонального антитіла ВМАОЗ31 миші, та застосуванню зазначеного гуманізованого антитіла в імуносупресивній терапії.

Вступ

Застосування імуносупресивних засобів при аутоїмунних захворюваннях та терапії при трансплантології є добре задокументованим, однак, цей спосіб є далеким від оптимального. У пацієнтів, яких лікували цими засобами, поширені токсичність, опортуністичні інфекції, цитокінова буря та підвищений ризик раку. Застосування біологічних препаратів в цій галузі в деякій мірі поліпшило результат у пацієнта, однак, ці побічні ефекти поки що залишаються вираженими.

Загальновідомо застосування поліклональної антисироватки проти лімфоцитів з метою імуносупресії. Однак, виготовлення антисироватки є трудомістким, в неї спостерігають властивості, які відрізняються в серіях, а специфічність, яку можна отримати при застосуванні поліклональної антисироватки, обмежена.

Одержання моноклонального антитіла за допомогою технології гібридоми вперше було описане Копіег и Міївівїпй (Маїшге 256:495-497 (1975). Порівняно з поліклональною антисироваткою моноклональні антитіла (тАбБ) більш специфічні та мають більш стабільні властивості. тАБб найчастіше та найуспішніше застосовують для імуносупресивної терапії в клінічній трансплантології. Однак, більшість тАб, застосовуваних в якості імуносупресивних засобів для лікування аутоїмунних захворювань та у пацієнтів після трансплантації, мають значний імуносупресивний потенціал, приводячи, в зв'язку з цим, до небажаної дії на функції широкого спектру імунних клітин, не всі з яких, імовірно, пов'язані з відторгненням трансплантата.

Моноклональні антитіла миші проти антигенів поверхневого рецептора Т-клітини вперше отримали у 1979 р. за допомогою технології гібридоми (Кипо еї аї. (1979) Зсіепсе 206:347-349).

З трьох моноклональних антитіл, відкритих Кипо еї аїЇ., одне антитіло, позначене як муромонаб-

СОЗ (ОКТЗ) проявило специфічність до СОЗ рецептора Т-клітини, реагуючи більш ніж з 95 95 периферичних зрілих Т-клітин без дії на незрілі тимоцити. Зв'язування ОКТЗ з комплексом СОЗ

Зо викликає інтерналізацію рецептора СОЗ та втрату СОЗ позитивних клітин на периферії. Успішне лікування за допомогою ОКТЗ пов'язано зі швидким зниженням СОЗ позитивних Т-клітин від приблизно 60 95 до менш ніж 5 95.

ОКТЗ широко застосовували з метою лікування пацієнтів з гострим відторгненням алотрансплантата після трансплантації нирки (КивзеїЇ, Р.5., СоїЇміп, К.В., Со5іті, А.В. (1984)

Аппи. Кем. Мей. 35:63 та Соб5іті, А.В., Випоп, К.С., СоЇміп, К.В. еї аї. (1981) Тгапзріапіаєйоп 32:535). Крім цього, ОКТЗ та комплемент кроля застосовували для очищення зрілих Т-клітин з кісткового мозку донора для попередження гострої реакції трансплантат проти хазяїна (ЗМНО) при алогенній трансплантації кісткового мозку (Ргепіїсе, Н.О., ВіасКіоскК, Н.А., дапоззу, 0. єї аї. (1982) І апсеї 1:700 та ВіасКіосК, Н.А., Ргепіїсе, Н.О., СПЙптоге, М.9. еї аїІ. (1983) Ехр. Нетайоі. 11:37). Незважаючи на те, що лікування ОКТЗ, імовірно, є ефективним для попередження

СУНО при алогенній трансплантації кісткового мозку при гострому лейкозі, сумісне іп міго/іп мімо лікування ОКТЗ не попереджувало ЗМНО при терапії тяжкого комбінованого імунодефіциту (Наумага, А.К. еї аї. (1982) Сіїп. гар. Орзегу. 100:665). Обробка Т-клітин з ОКТЗ викликає ряд реакцій, несумісних з імунною супресією, включаючи активацію Т-клітин, продукцію імунних медіаторів та ТЗ-модуляцію. Вважають, що комплекс ТЗ-антигена, що розпізнається СОЗ-тАр (наприклад, ОКТЗ), грає ключову роль під час активації Т-клітин. Альфа/бета Т-лімфоцити розпізнають ліганди МНС з пептидами завдяки мультимерному білковому ансамблю, званого комплексом СОЗ сорВ-антигенного рецептора Т-клітини (ТОК). Ця структура складається з варіабельного димеру оф ТСК, який зв'язується з антигенами та трьома інваріантними димерами (СОЗує, бє и сс), які залучені до транспорту поверхневого ТСК.СОЗ, його стабілізації та трансдукції сигналу. Альфа-бета рецептор Т-клітини («ВТСЕ) експресується на більшості (приблизно 95 95) Т-клітин та відіграє ключову роль в активації Т-клітини шляхом включення антигену, презентованого на МНС. 5 95 клітин, що залишилися, є гамма-дельта рецептор- позитивними Т-клітинами (УбТСК). Популяція УСТСЕК позитивних клітин відіграє важливу роль у вродженій імунній відповіді при захисті від опортуністичних інфекцій бактеріального, вірусного та грибкового походження. Гамма-дельта Т-клітини не відіграють ролі у відторгненні трансплантата при трансплантації. Таким чином, цілеспрямований вплив на популяцію ОВТСК позитивних клітин без впливу на популяцію УСТСК позитивних клітин повинен передбачати суттєву терапевтичну ефективність, зберігаючи, в той же час, базовий імунний захист проти бо опортуністичних інфекцій.

Моноклональне антитіло ВМАОЗ1І до ІдсС2Б миші (Вогеї еї аїІ. (Мом. 1990) Нит. Іттипої. 29(3):175-88; ЕРО403156) є специфічним до загальної детермінанти на комплексі ТОК альфа/бета/СО3 та не зв'язується з гамма-дельта ТОК. ВМАОЗ1 є дуже імуносупресивним та здатним до індукування апоптозу активованих Т-клітин шляхом механізму індукованої активації клітинної загибелі (АІСО) (Ууеззеїбого еї а. (Мау 1993) 9. Іттипої. 150(10): 4338-4345). Іп міто воно пригнічує змішану лімфоцитарну реакцію та попередньо проявило клінічну ефективність в попередженні відторгнення трансплантата при деяких варіантах трансплантації цілих органів, а також при лікуванні гострої реакції трансплантат проти хазяїна (асмно) (Китпе еї а. (Рер 1989)

Тгап5ріапі Ргос. 21(1): 1017-1019). ВМАОЗ31 не взаємодіє з гамма-рецепторами людини Ес (Есук) в більшій частині популяції людини (приблизно 10 95 людей мають ЕсукК, які зв'язуються з ізотипом Ід052Б6 миші). Відповідно, це антитіло не викликає активацію Т-клітин шляхом перехресного зв'язування з рецептором Т-клітини, та, таким чином, воно не викликає активацію

Т-клітин або пов'язане вивільнення цитокінів. В зв'язку за цим, його профіль є вкрай переважним відносно ОКТЗ3. Однак, ВМАОЗ1 є антитілом миші та, отже, не є придатним для повторного введення людям внаслідок активованої в них відношенні реакції антитіл людини до антитіл миші (НАМА).

Були описані декілька гуманізованих варіантів ВМАОЗ1 (див. ЕР 0403156; також Зпеагтап еї а!., (1991) У. Іттипої. 147:4366-4373). Як вказано в ЕРО403156, звичайне пересаджування СОК було неуспішним щодо збереження зв'язування антигена. Один клон зі значними змінами каркаса, ЕОСІМ3З, успішно зв'язувався з Т-клітинами; однак, як вказано в ЕРО403156, зв'язування з «ВТСК було не таким ефективним, як у батьківського антитіла ВМАОЗ1, як встановлено за допомогою аналізів конкурентної проточної цитометрії. Також було показано, що здатність

ЕисСІМЗ пригнічувати імунну відповідь іп міго значно знижена порівняно з ВМАОЗ1 (див., фіг.2).

На додаток до цього, ЕиСІМЗ3 спочатку отримали на каркасі дикого типу Ідс1 або Ідс4 людини, який зберігає зв'язування з Есук. Таким чином, ці гуманізовані антитіла робили можливою активацію, проліферацію Т-клітин та супровідне вивільнення цитокінів та, відповідно, суттєво відрізнялись за вихідними властивостями від ВМАОЗ1.

В даній галузі техніки відома модифікація антитіла глікозилюванням. Наприклад, відомо, що неглікозовані антитіла можуть характеризуватися значно модифікованою функціональністю;

Зо див. Воуй сеї аїІ. (1996) Мої. Іттипої. 32:1311-1318. Проте, неглікозильовані форми гуманізованого ВМАОЗ31 або похідні з модифікованими профілями глікозилювання раніше не були описані.

Таким чином, в даній галузі існує необхідність в гуманізованому антитілі до ОВТСК, яке при зв'язуванні поліпшує властивості ЕОСІМЗ та переважно зберігає імуносупресивні та не характерні для Т-клітини активуючі властивості ВМАОЗ31.

Короткий опис даного винаходу

В першому аспекті пропонується гуманізоване моноклональне антитіло, яке містить СОК до

ВМАОЗ1 та зберігає афінність зв'язування ВМАОЗ1 зі своїм когнатним антигеном. В першому варіанті здійснення вказане гуманізоване антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить СОК, викладені в 5ЕО ІЮ МО:7, 12 або 13, та каркас ІЗНЗ-23 людини, викладений в ЗЕО ІЮ МО:17, причому положення б каркаса є донорським залишком; в альтернативному варіанті здійснення в положенні 18 каркаса знаходиться донорський залишок.

Необов'язково, в положенні 49 та/або 69 каркаса знаходяться донорські залишки.

В другому варіанті здійснення гуманізоване моноклональне антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить СОК, викладеними в 5ЕО ІЮ МО:15 або 16, та каркас

ІСШНМ1-3701 людини, викладений в 5ЕО ІЮ МО:18, причому одне або декілька положень 38, 44 та/або 48 є донорським залишком; в альтернативному варіанті здійснення положення 44 та 48 каркаса є донорськими залишками.

В третьому варіанті здійснення гуманізоване моноклональне антитіло містить варіабельну

БО ділянку легкого ланцюга, що містить СОР, викладені в ЗЕО ІЮО МО:14, та каркас ІСКМ3-11701 людини, викладений в ЗЕО ІЮ МО:19, причому положення 70 та/або 71 каркаса є донорськими залишками. Необов'язково, положення 46 є донорським залишком.

Приклади антитіл, відповідно до першого варіанта здійснення, включають антитіла, які містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, вибрану з важких ланцюгів, які містять послідовності, викладені в 5ЕО 10 МО:7, 5ЕО ІЮ МО:12 та 5ЕО ІО МО:13, та послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, яка містить послідовність, викладену в 5ЕО ІЮ МО:14.

Приклади антитіл, відповідно до другого варіанта здійснення, включають антитіла, які містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, вибрану з важких ланцюгів, які містять послідовності, викладені в 5ЕО 0 МО:15 та 5ЕО ІЮО МО:16, та варіабельну ділянку легкого 60 ланцюга, яка містить послідовність, викладену в 5ЕБО ІЮ МО:14. Гуманізовані антитіла,

відповідно до описаних варіантів здійснення, є гуманізованими варіантами ВМАОЗ1. Їх первинні структури відрізняються від структури гуманізованого антитіла ЕиСІМЗ, яке характеризується зниженим зв'язуванням з ВТС порівняно з ВМАОЗ1.

У переліку послідовностей СОК вказані за допомогою анотації або підкреслювання. Каркаси являють собою всі послідовності за межами СОК, які визначені відповідно до системи нумерації "Караї" та розширені, де необхідно, із застосуванням "ІМТ" СОК. Якщо не вказано, що залишок каркаса необхідно змінити для відповідності донорській послідовності, зазвичай його сприйматимуть як акцепторний залишок.

Гуманізовані антитіла можуть містити константу ділянку. В одному варіанті здійснення константа ділянка має людське походження.

Гуманізовані антитіла за даним винаходом можуть бути додатково модифіковані шляхом Ес інженерії. Імуноглобуліни схильні до поперечного зшивання з рецепторами Есу, що може призводити до конститутивної активації Т-клітин щодо антитіл до Т-клітин. Для запобігання поперечного зшивання з Есу антитіла можуть бути модифіковані з видаленням Ес-ділянки, наприклад, шляхом утворення фрагментів Баб або Ем; однак, процесовані імуноглобуліни не характеризуються корисними ефекторними функціями та демонструють знижений період напіввиведення. Таким чином, Ес-ділянка гуманізованого антитіла може бути модифікована для запобігання поперечного зшивання з Есу. Ілюстративні методики включають утворення неглікозильованих імуноглобулінів, наприклад, шляхом модифікації Ес-ділянки мутацією М2970).

Імуноглобуліни, які нездатні зв'язуватись з Есу! І, також описані у Аптоиг єї аї., (1999) Єиг. У.

Ітітипої. 29:2613-2624. Модифікація, здійснена з Ід01, відома як модифікація лавр, та складається з комбінації мутації Да, в якій залишки до замінені в положеннях 327, 330 та 331, а залишки Ідс2 замінені в положеннях 233-236, та мутації ДБ, в якій залишок 236 видалено. В іншому варіанті здійснення можна модифікувати профіль глікозилювання антитіл за даним винаходом.

В одному варіанті здійснення це антитіло містило одну або декілька мутацій 5298М, Т299А та 3005.

В варіантах здійснення антитіло містить дві або більше мутацій М2970, 5298М, Т299А та

У3005. Наприклад, пропонують гуманізоване антитіло, яке містить декілька мутацій

Коо) М2970/5298М/У3005, 5298М/1299А/73005 або 5298М/У3005.

В другому аспекті пропонують гуманізоване моноклональне антитіло, яке містить СОК з

ВМАОЗ31 та зберігає властивості ВМАОЗ1 до супресії Т-клітин. Вказане гуманізоване антитіло переважно містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, викладену в 5ХЕО ІЮ МО: 12, 13, 15 або 16, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, викладену в 5ЕО ІЮ МО:14.

В третьому аспекті пропонують нуклеїнову кислоту, яка кодує, щонайменше, варіабельну ділянку важкого ланцюга гуманізованого моноклонального антитіла відповідно до попередніх аспектів описаних варіантів здійснення. Нуклеїнова кислота може кодувати варіабельну та константну ділянки гуманізованого антитіла. Важкий та легкий ланцюги можна кодувати на окремих нуклеїнових кислотах або на одній молекулі нуклеїнової кислоти.

Відповідно до четвертого аспекту пропонують клітину, яка експресує нуклеїнову кислоту відповідно до попереднього аспекту. Ця клітина, наприклад, є клітиною, адаптованою для експресії молекул антитіла в культурі. Нуклеїнова кислота може включати сигнальні послідовності та/або інші послідовності або модифікації, які потрібні для або які модулюють експресію цієї молекули антитіла в клітині, та/або секрецію цього антитіла з клітини.

У додатковому варіанті здійснення гуманізоване антитіло пропонують, як описано у вищенаведених аспектах, для застосування в супресії реакції, опосередкованої Т-клітинами, у пацієнта.

Наприклад, реакція, опосередкована Т-клітинами, може бути залучена в стан, обраний з тканинної трансплантації, включаючи трансплантат цілих органів та трансплантат ділянки тканин тіла на судинній ніжці, трансплантацію тканини, розсіяний склероз та діабет 1 типу.

Окрім цього, інший варіант здійснення передбачає спосіб лікування пацієнта, який страждає хворобою, до якої залучена аномальна реакція, опосередкована Т-клітинами, що включає уведення пацієнту, який потребує цього, фармацевтично ефективної дози антитіла відповідно до описаних варіантів здійснення.

Таким чином, були створені гуманізовані неактивовані антитіла до «ВТС, які не індукують виділення цитокіну, мають здатність до селективної модуляції «ВТСК та індукції апоптозу активованих «ВТСК-позитивних Т-клітин. Ці антитіла були створені для застосування в якості імуносупресивних засобів при хворобах, опосередкованих Т-клітинами. Ці антитіла були бо створені гуманізацією антитіла миші ВМАОЗ1 до «ВТС та Ес-інженерією гуманізованих антитіл для запобігання залучення Ес гамма-рецепторів. Ці антитіла відповідно до описаних варіантів здійснення зберігають афінність зв'язування ВМАОЗ1, на відміну від гуманізованих варіантів

ВМАОЗ1, доступних в цій області. Також, як вказано в іп міго методах навчання, імуносупресивні властивості антитіл відповідно до описаних варіантів здійснення перевершують такі з ВМАОЗ1.

Крім цього, на відміну від вже відомих гуманізованих антитіл ВМАОЗ1 даної галузі техніки, антитіла відповідно до описаних варіантів здійснення не індукують виділення цитокіну в нормальних РВМС.

Відповідно до п'ятого аспекту пропонують антитіло, яке містить модифікований Ес, в якому вказаний модифікований Ес містить модифікований профіль глікозиляції, який зменшує зв'язування з ЕсукК-рецептором, що містить одну або більше мутацій 5298М, Т299А та 3005.

В одному варіанта здійснення це антитіло містить дві або більше мутацій М2970, 5298М,

Т299А та Уу3005.

В варіантах здійснення це антитіло містить множинні мутації М2970/5298М/У3005, 5298М/1299А/73005 або 5298М/У3005.

Наприклад, це антитіло може бути антитілом, як описано в попередніх аспектах винаходу.

Відповідно до шостого аспекту пропонують поліспецифічне антитіло, яке містить, щонайменше, важкий ланцюг з першим доменом зв'язування, як описано в попередніх аспектах винаходу, та другий домен зв'язування, як описано для пухлино-специфічного антигену.

В одному варіанті здійснення перший домен зв'язування містить важкий ланцюг відповідно до другого аспекту винаходу.

Це поліспецифічне антитіло може містити багато різних конформацій; в одному варіанті здійснення воно включає зсЕм до ТСК/СОЗ та 5сЕм до пухлини.

В одному варіанті здійснення, поліспецифічне антитіло є біспецифічним.

Короткий опис фігур

Фіг. 1. ВМАОЗ1 зв'язується міцніше з ВТС порівняно з ЕиСІМ3.

Конкуренція зв'язування РЕ-міченого антитіла ВМАОЗ1 з антитілами ВМАОЗ1 Мода,

ВМАО31 Ниїдс1 та ЕиСІМЗ Ниїдс1. ЕиСІМУЗ має знижену активність порівняно з ВМАОЗ1.

Фіг. 2. ЕиСІМЗ є менш сильним, ніж ВМАОЗ1 в аналізі з іп міго навчанням (ІМЕ).

Графік вказує на втрату дії гуманізованого антитіла ЕиСІМ3 в біологічному аналізі при

Зо порівнянні з батьківським антитілом ВМАОЗ31. СОВ8-- Т-клітини обробляли антитілами до авТСсК при різних концентраціях (ось х) та сумісно культивували з аутологічними дендритними клітинами, які активували СММ-пептидом 495-503 (ррб5) протягом семи днів.

Фіг. 3. НЕВЕТ зв'язується з ОВТСК порівняно з ВМАОЗ1 в конкурентному аналізі.

Конкуренція зв'язування РЕ-міченого антитіла ВМАОЗ31 з антитілами ВМАОЗ1 Ниїдс1, НЕВЕ1

Ншиїде1 та ЕЄисСІМЗ Ниїдс1. ЄиСІМЗ має знижену активність порівняно з ВМАОЗ1 та НЕВЕ1.

Фіг. 4. НЕВЕ1 має подібну до ЕиСІМЗ активність в аналізі з іп міго навчанням (ІМЕ).

Аналіз з ІМЕ було виконано, як описано відповідно до фіг.2.

Фіг. 5. Схематичні зображення повторюваних циклів мутагенезу варіабельних доменів до оЯвВтТсе.

Каркас в заштрихованому прямокутнику означає ЕК-область, де знаходяться певні залишки антитіла миші. Заштриховані залишки в першому рядку мутацій є амінокислотами антитіла миші, які придатні для підтримки швидкості дисоціації. Заштриховані залишки в другому рядку мутацій є залишками антитіла миші, які оточують області СОК, збережені під час кінцевого зародкового процесу.

Фіг. 6. Оптимізоване гуманізоване антитіло поліпшило швидкість дисоціації порівняно з

ВМАОЗ1.

Кінетику дисоціації антитіла з ОВТСЕ на Т-клітинах було виміряно проточною цитометрією. У

ВМАОЗ31 була краща швидкість дисоціації порівняно з ЕиСІМЗ3 та НЕВЕ1. Оптимізуючи домен зв'язування НЕВЕТ автори змогли поліпшити швидкість дисоціації НЕВЕ1.НІО порівняно з

ВМАОЗ1.

Фіг. 7. Оптимізоване гуманізоване антитіло поліпшило швидкість дисоціації порівняно з

ВМАОЗ1.

Кінетику дисоціації антитіла з «ВТСК на Т-клітинах було виміряно проточною цитометрією.

Оптимізуючи домен зв'язування НЕВЕ1 автори змогли поліпшити швидкість дисоціації

НЕВЕТ.Нбб порівняно з ВМАО31.

Фіг. 8. Оптимізоване гуманізоване антитіло поліпшило швидкість дисоціації порівняно з

ВМАОЗ1 в обох лаб та неглікозильованому форматах.

Кінетику дисоціації антитіла з «ВТС на Т-клітинах було виміряно проточною цитометрією.

Фіг. 9. Оптимізація НЕВЕ1 приводить до еквівалентної дієвості, як і у ВМАОЗ1.

Аналіз з МЕ, який описаний у фіг. 4. ВМАОЗ31 пригнічував навчання СО8--Т-клітин, оскільки вони були неспроможні лізувати специфічні мішені дозо-залежним чином. Батьківське гуманізоване антитіло, НЕВЕЇ, було не таким сильним, як ВМАОЗ1, та було спроможнім пригнічувати навчання лише при найвищий дозі (подібні результати спостерігали з другим не поліпшеним гуманізованим АБ, НЕВЕ1 НІ3). Подальші поліпшення робили з цим гуманізованим антитілом, НЕВЕ1 НІ0, яке має еквівалентну до ВМАОЗ1 силу за цим аналізом.

Фіг. 10. Дані ІМЕ антитіл до «ВТС.

Як НЕВЕТ, так і СІ 1 ВМ серії антитіл показали поліпшення за результатами ІМЕ порівняно з

ВМАОЗ1.

Фіг. 11. Антиген-позитивні клітини з аналізу з МЕ, як встановлено антиген-специфічним тетрамерним зв'язуванням.

Клітини, які є антиген-позитивними (наприклад, навчені в межах аналізу з МЕ), спроможні зв'язуватися з МНС-тетрамерною молекулою. При проведенні аналізу з ІМЕ в присутності антитіла, здатного попередити навчання Т-клітин антигену, менше клітин були спроможними зв'язуватися з МНО-тетрамером наприкінці аналізу.

Фіг. 12. Проліферація РВМС в присутності антитіл до «ВТС, ОКТЗ та стимулюючих гранул.

Стимулююча активність ОКТЗ не була помічена в антитілах до «ВТС в цьому порівнянні.

Фіг. 13. Вивільнення цитокінів з РВМС в присутності антитіл до «ВТС.

Профіль вивільнення цитокінів антитіл до ОоВТСК був подібним до профілю, продемонстрованому ВМАОЗ1.

Фіг. 14. Вивільнення гамма-їЕМ з Т-клітин в аналізі з ІМЕ

СОр8-Т-клітини обробляли антитілами до авт при різних концентраціях (див. фіг. 2, ось х) та культивували сумісно з аутологічними дендритними клітинами, які активували СММ-пептидом 495-503 (ррб5) протягом семи днів в аналізі з іп міго навчанням (ІМЕ). В цьому аналізі виміряли вивільнення гамма-ІЕМ.

Фіг. 15. Індукований активацією апоптоз антитілами до «ВТС.

Антиген-стимульовані СО8-Т-клітини індукували до апоптозу зв'язуванням антитіл до

ЯоВТсЕ ВМАОЗ1 та НЕВЕ1 Нбб. Здатність НЕВЕ!1 Нбб індукувати апоптоз була вищою порівняно з ВМАОЗ31.

Зо Фіг. 16. Виділення мутантів глікозиляції та неглікозильованих антитіл.

Гель, забарвлений кумасі блакитним, показує експресію та очищення мутантів глікозиляції.

Фіг. 17. Зв'язування мутантів за «ОВТСК антитілами з ЕсукШа людини із застосуванням

Віасоге.

Для визначення зв'язування з рекомбінантним ЕсукКШа людини (М158 й 158) використовували Віасоге.

Фіг. 18. Зв'язування мутантів за ОВТСЕК антитілами з ЕсуКІ людини із застосуванням Віасоге.

Для визначення зв'язування з рекомбінантним ЕсукІ людини використовували Віасоге.

Фіг. 19. Вивільнення цитокінів з РВМС в присутності антитіл до ОВТСК мутанту глікозиляції (день 2).

Профіль вивільнення цитокінів для ТМЕРа, М-С5ЗЕ, ІЕЄМУу та І/10 антитілами до ВТС був подібним до профілю, продемонстрованому ВМАОЗ1 та Нбб аена АВ.

Фіг. 20. Вивільнення цитокінів з РВМС в присутності антитіл до ОВТСК мутанту глікозиляції (день 2).

Профіль вивільнення цитокінів для І 6, ІІ 4 та 1/2 антитілами до авто був подібним до профілю, продемонстрованому ВМАОЗ1 та Нбб аека АВ.

Фіг. 21. Вивільнення цитокінів з РВМС в присутності антитіл до ОВТСК мутанту глікозиляції (день 4).

Профіль вивільнення цитокінів для ТМРа, М-С5Е, ІРМу та І-10 антитілами до авТСК був подібним до профілю, продемонстрованому ВМАОЗ1 та Нбб аена АВ.

Фіг. 22. Вивільнення цитокінів з РВМС в присутності антитіл до ОВТСК мутанту глікозиляції (день 4).

Профіль вивільнення цитокінів для І 6, ІІ 4 та 1/2 антитілами до авто був подібним до профілю, продемонстрованому ВМАОЗ1 та Нбб аегца АВ.

Фіг. 23. Профілі зв'язування ТКАСЕК.

Профілі зв'язування біспецифічних антитіл як з пухлинними клітинами-мішенями, так і з Т- клітинами людини визначали шляхом проточної цитометрії.

Фіг. 24. Цитоксична активність різних рекрутингових плечей Т-клітин.

Було створено набір гуманізованих антитіл ВМАОЗ1 та з цього набору було відібрано декілька антитіл, які виявляли цитотоксичну активність проти клітинних ліній з експресією бо антигенів пухлин.

Фіг. 25. Профіль вивільнення цитокінів різними рекрутинговими плечима Т-клітин.

Набір ТКАСЕК з різними рекрутинговими плечей Т-клітин показує подібні профілі вивільнення цитокінів. Великі кількості цитокінів визначають після активації Т-клітини в присутності клітин-мішеней, в той час як в присутності лише нестимульованих РВМС людини рівні цитокіну, що спостерігали, значно нижчі.

Фіг. 26. Зв'язування мутантів антитіла до СО52 з ЕсукІШПа людини з застосуванням Віасоге.

Віасоге використовували для визначення зв'язування модифікованого антитіла до СО52 з рекомбінантним ЕсукКШа (М158) людини. Антитіла до СО52, які містять мутації 5298М/У3005 в домені Ес, використовували для визначення ефекторної функції модифікованої молекули. А: зв'язування з пептидом СО52. В: зв'язування з ЕсукКШа (М158). С: контрольне зв'язування з ЕсКп миші.

Детальний опис винаходу

Якщо не зазначено інше, всі технічні та наукові вирази, які використовують в даному документі, мають такі ж значення, які зазвичай розуміються фахівцем в галузі техніки, до якої належить винахід. Будь-які способи або матеріали, подібні або еквівалентні тим, що описані в даному документі, можна використовувати в способах та методиках даного винаходу. Усі публікації, які цитують в даному документі, включено за посиланням у повному обсязі з метою описання та розкриття методологій, реактивів та засобів, представлених в публікаціях, які можна використовувати у зв'язку з даним винаходом.

Способи та методики даної заявки в цілому представлені відповідно до традиційних способів, добре відомих в даній галузі техніки, та як описано в різних загальних та більш спеціальних посиланнях, що цитують та обговорюють в даній специфікації, якщо не вказано інше. Див. наприклад, Сеппаго, А.В., єд. (1990) Ветіпдюп'5 РНаптасеціїса! Зсіепсев, 181й єд.,

Маск Рибіїзніпя Со. Нагатап, УУ.С., ітбрікга, Ї.Е., апа Сіїтап, А.С, єдв. (2001) Тне РІНаптасоіодіса! Ваві5 ої ТПегарецшіїсв, 101й єд., МсСтгам/-НІЇ! Со.; Соіом/іскК, 5. еї аї., ед5., Меїйодв

Іп Епгутоїіоду, Асадетіс Ргев5, Іпс.; Мвїї, О.М. апа ВіасКмеї!І, С.С., едв. (1986) Напароок ої

Ехрегітепіа! Іттипоіоду, Мої!в. І-ІМ, ВіаскууеїЇ Зсіепійіс Рибіїсайопв; Мапіаїв, Т. еї а!., едв5. (1989)

Моїіесшіаг Сіопіпа: А І арогаюгу Мапиаї, 2па єдйоп, Мо!в. І-І, Со 5ргіпд Натбог І арогаюгу Ргезв;

А!йзибеї, Е.М. еї а!., єдв5. (1999) Зно Ргогосої5 іп МоїІесшаг Віоіоду, 4й єдйіоп, донп У/Пеу б Бопвб;

Зо Веєат еї аї., єдв. (1998) МоїІєсшаг Віоіоду Тесппідпев: Ап Іпівепвіме І арогаїюгу Сошвзе, Асадетіс

Ргев5; МеуУлОоп, С.А. апа Станат, А., едв5. (1997) РСВ (Іпігодисіп ю Віоїеснпідне5 Зегієв), 2па ед., Зргіпде/-Мепад.

Гуманізоване моноклональне антитіло, яке викладено в даному документі, є антитілом, що складається з каркаса антитіла людини, в який вміщені гіперваріабельні ділянки (СОМ) від антитіла нелюдського походження. Також можуть бути зроблені зміни в акцепторному каркасі людини. Процедури для розробки та отримання гуманізованих антитіл добре відомі в галузі техніки та були описані, наприклад, в Сабійу єї аї., патенті США Мо 4816567; СарШу еї аї., заявці на європейський патент 0125023; Во55 єї аІ., патенті США Мо 4816397; Воз55 евї аї., заявці на європейський патент 0120694; Меибегдег, М.5. єї аІ., МО 86/01533; Меибегодег", М.5. еї аї., заявці на європейський патент 0194276 В1; Уміпіеєг, патенті США Мо 5225539; УМіпіег, заявці на європейський патент 0239400; Радіап, Е.А. єї аї., заявці на європейський патент 0519596.

Подальші деталі антитіл, гуманізованих антитіл, сконструйованих антитіл людини та способів їх отримання можна знайти в Копіептапп, К. апа Ойбеї, 5. еавз. (2001, 2010) Апііроду Епдіпеегіпод, 2па єд., Зргіпдеї-Мепад, Мем мок, МУ.

Вираз "антитіло", якщо не зазначено інше, використовують для позначення цілих антитіл, а також антиген-зв'язуючих фрагментів таких антитіл. Наприклад, вираз охоплює чотирьох- ланцюгові молекули до, а також фрагменти антитіл.

Як використовують в даному документі, вираз "фрагменти антитіла" відноситься до частин інтактного антитіла повної довжини, наприклад, як додатково описано нижче.

Антитіла можуть бути будь-якого класу, такими як Ід, ІдДА або Ідм; та будь-якого підкласу, такими як їдс1 або Ідс4ї. Різні класи та підкласи імуноглобуліну мають різні властивості, які можуть бути переважними в різних застосуваннях. Наприклад, антитіла ІдДс4 мають знижене зв'язування з рецепторами Ес.

Специфічність, в контексті антитіл, описаних в даному документі, означає, що заявлене антитіло здатне до селективного зв'язування свого когнатного антигену, яким є комплекс

Я«ВТсКк.сО3. Антитіла за даним винаходом зв'язують комплекс «оВТОК.СОЗ, який експресується на клітинах.

Комплекс «ВТОК/СОЗ людини є рецепторним комплексом Т-клітини, презентованим на поверхні Т-клітин. Див. Кипп5 еї аї., (2006) Іттипйу 24:133-139. Цей комплекс є мішенню для моноклонального антитіла ВМАОЗ31 миші (див. заявку на європейський патент ЕР 0403156; 5ЕО

ІО МО: 1 та 2).

Імуноглобуліни природного походження мають спільну ядерну структуру, в якій два ідентичних легких ланцюга (близько 24 кДа) та два ідентичних важких ланцюга (близько 55 або 70 кДа) утворюють тетрамер. Амінотермінальна частина кожного ланцюга відома як варіабельна (М) область та може відрізнятися від більш консервативних константних (С) областей залишку кожного ланцюга. У варіабельній області легкого ланцюга (також називаного

Мі доменом) є С-кінцева частина, відома, як уУ-область. У варіабельній області важкого ланцюга (також називаного Мн доменом), є Ю-область в доповнення до .-області. Більшість варіації амінокислотної послідовності в імуноглобулінах обмежена трьома окремими положеннями в МУ- областях, відомими як гіперваріабельні області або гіперваріабельні ділянки (СОК), які прямо залучені до зв'язування з антигеном. Починаючи з амінокінця, ці області відповідно позначають як СОКІТ, СОК2 та СОУ. СОР. тримаються на місці більш консервативними областями каркаса (ЕК). Починаючи з амінокінця, ці області відповідно позначають як ЕК1, ЕК2, ЕКЗ та ЕКА4.

Положення областей СОЕК та ЕЕ та система нумерації були визначені Кабаї еї а!. (Кабаї, Е.А. еї аІ,, Зедиєпсев ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодіса! Іпієгеві, Бій Еайіоп, 0.5. Оєераптенпі ої Неайй апа

Нитап 5егмісе5, 0.5. Сомегптепі Ргіпіїпу Опйісе (1991), та його обновлення, які можна знайти у сітці). В доповнення, межі області СОК в подальшому були визначені номенклатурою ІМОТ.

Варіабельні ділянки антитіл відповідно до описаних варіантів здійснення можна знайти в

БЕО ІО МО: 5-7 та 12-16, та можна отримати гуманізацією ВМАО31, тобто перенесенням СОК

ВМАО31 до каркаса людини. Описано дві серії гуманізованих антитіл; серії НЕВЕТ, які містять

ЗЕО ІЮО МО: 5-7, 12 та 13, та серії СІ 1ВМ, які містять варіабельні області важкого ланцюга, як показано в 5ЕО ІЮ МО: 8, 15 та 16. В обох випадках, застосовувана варіабельна область легкого ланцюга є, як показано в 5ЕО ІЮ МО: 14 (БІ 18М МКа43).

Застосовувані каркаси людини є І5НЗ-23 у випадку НЕВЕ1 та ІЗНМ1-3701 та І15КМ3-11701 у випадку СІ 1ВМ.

Константні області можуть походити з будь-яких константних областей антитіла людини.

Гени варіабельної області можна клонувати у вектори експресії в рамці з генами константної області для експресії важкого та легкого ланцюгів імуноглобуліну. Такі вектори експресії можна

Зо трансфікувати в клітини хазяїна, які продукують антитіло, для синтезу антитіл.

Варіабельні та константні області антитіла людини можна отримати з баз даних послідовностей. Наприклад, послідовності імуноглобуліну доступні в базі даних ІМОТЛІСМ (Сіцаїісей еї аї., (2006) Мисівіс Асідє Вев. З4:(зиррі. 1):0781-0784) або МВазе (уразе.тгс- сре.сат.ас.икК).

Неглікозильовані антитіла можуть мати широко модифіковану функціональність; див. Воуа еї аі. (1996) Мої. Іттипої. 32:1311-1318. Модифікація "Зена ар" або Лаб, згадувана в даному документі, є модифікацією Ес, яка описана в Аптоиг еї аї., (1999) Єиг. У. Іттипої. 29:2613-2624.

Методики для модифікації глікозиляцією областей Ес відомі в даній галузі техніки та включають хімічні, ферментативні та мутаційні засоби, наприклад, мутацію положення М297 в домені СН».

Методики для мутування генів антитіла з метою отримання неглікозильованих молекул до описані в Тао апа Могтізоп (1989) 9. Іттипої. 143:2595-2601. "Нуклеїнові кислоти", як викладено в даному документі, включають молекули ДНК, які кодують антитіла за даним винаходом. Перевага віддається векторам експресії, які придатні для експресії генів антитіла в клітині хазяїна. Вектори експресії та клітини хазяїна для експресії гену антитіла відомі в даній галузі техніки; див., наприклад, Мото", К.У. (хепеїїс Епдіпеегіпа 8

Віотесппоїоду Мем (Чипе. 15, 2008) 28(12), апа ВаскКіймаї, сх. еї аІ. (2008) Мисівїс Асід5 Незв. 36(15):696-е96. 1. Антитіла

Винахід охоплює антиген-зв'язуючі фрагменти гуманізованих антитіл до «ВТС. Фрагменти антитіл спроможні до зв'язування з комплексом «ВТоК.СОЗ. Вони охоплюють фрагменти Раб,

Еаб", К(ар)г та К(у) або індивідуальні варіабельні області легкого або важкого ланцюга або їх частину. Фрагменти включають, наприклад, Бар, Раб Е(ар)», Ем та 5сЕм. Ці фрагменти не мають частину Ес інтактного антитіла, швидше виводяться з кровотоку та можуть мати менше неспецифічне тканинне зв'язування, ніж інтактне антитіло. Ці фрагменти можна отримувати з інтактних антитіл, використовуючи добре відомі способи, наприклад, шляхом протеолітичного розщеплення ферментами, такими як папаїн (для створення фрагментів Рабр) або пепсин (для створення фрагментів Е(ав'г).

Антитіла та фрагменти також охоплюють одноланцюгові фрагменти антитіл (5СЕм), які зв'язуються з комплексом «єВТСК.СОЗ3. 5сЕм містить варіабельну область важкого ланцюга 60 антитіла (Мн), ефективно з'єднуючись з варіабельною областю легкого ланцюга антитіла (Мі), де варіабельна область важкого ланцюга та варіабельна область легкого ланцюга, разом або окремо, формують сайт зв'язування, який зв'язує ОВТСК. 5сЕм може містити область Мн на амінокінці та область Мі на карбоксикінці. Альтернативно, 5сбм може містити область Мі на амінокінці та область Мн на карбоксікінці. Також, незважаючи на те, що два домени фрагменту

Ем, Мі та Мн, кодуються окремими генами, їх можна об'єднувати, використовуючи рекомбінантні способи, синтетичним лінкером, що надає їм можливість бути отриманими як одиночний білковий ланцюг, в якому області Мі та Мн паруються для формування моновалентних молекул (відомих як одноланцюговий Ем (5сЕм)). В подальшому 5сЕм може необов'язково містити поліпептидний лінкер між варідзбельною областю важкого ланцюга та варіабельною областю легкого ланцюга.

Антитіла та фрагменти також охоплюють фрагменти домену антитіла (АБ), як описано в

Мага, Е.5. еї а!. (1989) Майшге 341:544-546, який містить домен Мн.

Антитіла та фрагменти також охоплюють антитіла важких ланцюгів (НСАБ). Описано, що ці антитіла утворюють антиген-зв'язуючи області, використовуючи лише варіабельну область важкого ланцюга, в цьому ці функціональні антитіла є дімерами лише важких ланцюгів (називані як "антитіла важких ланцюгів" або "НСАБ"). Відповідно, антитіла та фрагменти можуть бути антитілами важких ланцюгів (НСАБ), які специфічно з'єднуються з комплексом оВТоК.СОЗ.

Антитіла та фрагменти також охоплюють антитіла, які є 5МІР або злитими білками з доменом зв'язування імуноглобуліну, специфічними до комплексу ОВТОК.СОЗ. Ці конструкти є одноланцюговими поліпептидами, які містять антиген-зв'язуючі домени, злиті з імуноглобуліновими доменами, необхідними для здійснення ефекторних функцій антитіла (див.

МО 2005/017148).

Антитіла та фрагменти також охоплюють діатіла. Вони являють собою бівалентні антитіла, в яких домени Мн та Мі експресуються на одиночному поліпептидному ланцюзі, однак, використовуючи лінкер, який є занадто коротким, щоб дозволити спаровування між двома доменами того ж самого ланцюга. Це змушує ці домени спаровуватись з комплементарними доменами іншого ланцюга, і таким чином, утворювати два антиген-зв'язуючи сайти (див., наприклад, УМО 93/11161). Діатіла можуть бути біспецифічними або моноспецифічними.

Антитіло або фрагмент антитіла, таким чином, не реагує перехресно з будь-якою мішенню, відмінною від комплексу ОВТСК.СОЗ.

Антитіло або фрагмент, таким чином, може бути модифікованим для збільшення періоду напіввиведення з плазми, наприклад, додаванням молекул, таких як РЕС або інші водорозчинні полімери, включаючи полісахаридні полімери для підвищення періоду напіввиведення.

Антитіла або фрагменти, таким чином, можуть бути біспецифічними. Наприклад, біспецифічні антитіла можуть походити на одиночні антитіла (або фрагменти антитіл), однак мати два різних антиген-зв'язуючих сайти (варіабельні області). Біспецифічні антитіла можуть бути отримані різними способами, такими як хімічні методики, методики "полідоми" та методиками рекомбінантної ДНК. Біспецифічні антитіла можуть мати зв'язуючи специфічності щонайменше для двох різних епітопів, щонайменше один з яких є комплексом авТсКк.СОЗ3.

Специфічність може бути відібрана з будь-яких корисних або бажаних специфічностей, включаючи, наприклад, специфічність у відношенні сироваткового альбуміну людини для подовження періоду напіввиведення іп мімо.

Застосування біспецифічних антитіл в клініці для онкологічних застосувань в даний час стає реальністю з три-функціональним катумаксомабом (КетомтабФ)), ухваленим для застосування у випадках злоякісних асцитів, та з біспецифічним антитілом блинатумомаб, яке в даний час у ІЇ фазі клінічних випробувань при гемобластозах. Спільним у цих молекул є плече для зв'язування, яка зв'язується з Т-клітинами, та друге плече, яке зв'язується з пухлинною клітиною-мішенню, що приводить до опосередкованого Т-клітинами лізису мішені-пухлини.

Також спільним є те, що ці молекули рекрутують Т-клітини за допомогою білка СОЗ, який розміщений на поверхні клітини. Альтернативою рекрутингу за допомогою СОЗ є застосування аВ-рецептора Т-клітини (ср ТСЕ), який також експресується на поверхні клітини. Таким чином, антитіла, відповідні до даного винаходу, можуть бути застосуванні для розвитку протипухлинних антитіл комбінацією специфічності до пухлино-асоційованого антигену зі специфічністю до ар- рецептора Т-клітини (ФВ ТОК). 2. Отримання антитіла

Амінокислотні послідовності варіабельних доменів антитіл, описаних в даному документі викладені в 5ЕО ІЮ МО: 5-7 та 12-16. Отримання антитіла може бути здійснено за допомогою будь-якої методики, відомої в даній галузі техніки, включаючи трансгенні організми, такі як кози (див. РоїоскК еї аї. (1999) 9. Іттипої. Мешоав 231:147-157), курчата (див. Моїгтом/, К.У.У. (2000) бо Сепеї. Епа. Мем 20:1-55), миші (див. Роїоск еї аї., зхирга) або рослини (див. Богап, Р.М. (2000)

Сит. Оріпіоп Віотеснпої. 11:199-204, Ма. 9У.К-б. (1998) Маї. Мед. 4:601-606, Ваєз, .). єї аї. (2000)

ВіоРпагт. 13:50-54, 5іюодетг, Е. еї аї. (2000) Ріапі Мої. Вісі. 42:583-590). Антитіла також можуть бути отримані шляхом хімічного синтезу або експресії генів, які кодують антитіла в клітинах хазяїна.

Полінуклеотид, який кодує антитіло, ізолюють та вставляють в конструкт, що реплікується, або вектор, такий як плазміду, для подальшого розмноження або експресії в клітині хазяїна.

Конструкти або вектори (наприклад, вектори експресії), придатні для експресії гуманізованого імуноглобуліну, відповідно до описаних варіантів здійснення є доступними в даній галузі техніки.

Ряд векторів є доступним, включаючи вектори, які підтримуються в одиночній копії або багатьох копіях в клітині хазяїна, або які стають інтегрованими в хромосому(и) клітини хазяїна.

Конструкти або вектори можуть бути введені в придатну клітину хазяїна та клітини, які експресують гуманізований імуноглобулін, можуть бути отримані та підтримані в культурі.

Одиночний вектор або багато векторів можна використовувати для експресії гуманізованого імуноглобуліну.

Полінуклеотиди, які кодують антитіло, легко виділяють та секвенують за допомогою традиційних процедур (наприклад, олігонуклеотидних зондів). Вектори, які можна використовувати, включають плазміду, вірус, фаг, траспозони, мініхромосоми, з яких плазміди є типовим варіантом здійснення. В цілому такі вектори в подальшому включають сигнальну послідовність, точку початку реплікації, один або декілька маркерних генів, енхансерний елемент, промотор та послідовності термінації транскрипції, функціонально зв'язані з полінуклеотидами легкого та/або важкого ланцюга для полегшення експресії. Полінуклеотиди, які кодують легкий та важкий ланцюги, можуть бути вставлені в окремі вектори та введені (наприклад, шляхом трансформації, трансфекції, електропорації або трансдукції) в ту ж саму клітину хазяїна одночасно або послідовно або, за бажанням, як важкий ланцюг, так і легкий ланцюг можуть бути вставлені в той же самий вектор перед таким введенням.

Для експресії в придатній клітині хазяїна може передбачатися промотор. Промотори можуть бути конститутивні та індуцибельні. Наприклад, промотор можна функціонально зв'язувати з нуклеїновою кислотою, яка кодує гуманізований імуноглобулін або ланцюг імуноглобуліну, такий, що спрямовує експресію закодованого поліпептиду. Для прокаріотичних та еукаріотичних

Зо хазяїв доступним є ряд придатних промоторів. Промотори прокаріотів включають промотори

Іас, їас, Т3, Т7 для БЕ. соїї; З-фосфогліцераткіназу або інші гліколітичні ферменти, наприклад, енолазу, гліцеральдегід, З-фосфатдегідрогеназу, гексокіназу, піруватдекарбоксилазу, фосфофруктокіназу, глюкозо-6-фосфатізомеразу, З-фосфогліцератмутазу та глюкокіназу.

Промотори еукаріотів включають індуцибільні промотори дріжджів, такі як алкогольдегідрогеназа 2, ізоцитохром С, кисла фосфатаза, металотіонеїн та ферменти, відповідні за метаболізм азоту або утилізацію мальтози/галактози; промотори РНК-полімерази

ІЇ, в тому числі промотори вірусів, таких як поліома, віспа курей та аденовіруси (наприклад, аденовірус 2), вірус папіломи великої рогатої худоби, вірус саркоми птахів, цитомегаловірус (зокрема, промотор передраннього гену), ретровірус, вірус гепатиту В, актин, промотор вірусу саркоми Рауса (К5М) та ранній та пізній промотори вірусу мавп 40 та не вірусні промотори, такі як ЕЕ-1 альфа (Мігих5піта та Мадаїа (1990) Мисієїс Асіа5 Кев. 18(17):5322). Фахівці в даній галузі техніки спроможні підібрати відповідний промотор для експресії гуманізованого антитіла або його частини.

У відповідних випадках, наприклад, для експресії в клітинах вищих еукаріот, можна включати додаткові енхансерні елементи замість тих або такі ж, як знайдені розміщеними в промоторах, описаних вище. Відповідні енхансерні послідовності ссавців включають енхансерні елементи з глобіну, еластази, альбуміну, фетопротеїну, металотіоніну та інсуліну. З іншого боку, можна використовувати енхансерний елемент з вірусу еукаріотичної клітини, такий як енхансер 5М40, енхансер передраннього гену цитомегаловірусу, енхансер поліоми, бакуловірусний енхансер або локус Ід2а миші (див. УМО 04/009823). Хоча ці енхансери часто розміщуються на векторі в сайті, який знаходиться вище промотора, їх також можна розміщувати в іншому місці, наприклад, в нетрансльованій області або нижче сигналу поліаденілування. Вибір та розміщення енхансера можуть бути засновані на сумісності з клітиною хазяїна, що використовується для експресії.

Крім цього, вектори (наприклад, вектори експресії) можуть містити вибираний маркер для вибору клітин хазяїна, які несуть цей вектор, та, у випадку вектору, який реплікують, точку початку реплікації. Гени, які кодують продукти, що надають резистентність до антибіотику або лікарського засобу, являють собою поширені вибирані маркери, та можуть бути застосовувані в прокаріотичних (наприклад, ген їЗ-лактамази (резистентність до ампіциліну), ген Теї бо (резистентність до тетрацикліну)) та еукаріотичних клітинах (наприклад, гени резистентності до неоміцину (05418 або генетицину), орі (мікофенольної кислоти), ампіциліну або гідроміцину).

Маркерні гени дигідрофолатредуктази дозволяють проводити відбір по метотрексату у різноманітних хазяїв. Гени, які кодують генетичний продукт ауксотрофних маркерів хазяїна (наприклад, ГЕО2, ОКАЗ, НІЗЗ) часто використовують в якості вибираних маркерів у дріжджів.

Також розглядають застосування вірусних (наприклад, бакуловірусних) або фагових векторів та векторів, які спроможні до інтегрування до геному клітини хазяїну, такі як ретровірусні вектори.

В еукаріотичних системах сигнали поліаденілювання та термінації функціонально зв'язуються з полінуклеотидом, що кодує антитіло за даним винаходом. Такі сигнали зазвичай розміщуються на 3'-кінці відкритої рамки зчитування. В системах ссавців необмежені приклади сигналів поліаденілювання/термінації включають такі, що походять від генів гормонів росту, фактору елонгації 1 альфа та вірусів (наприклад, 5М40) або ретровірусних довгих термінальних повторів. В системах дріжджів необмежені приклади сигналів поліаденілювання/термінації включають такі, що походять від генів фософгліцераткінази (РОК) та алкогольдегідрогенази 1 (А0Н). В прокаріотичних системах сигнали поліаденілювання зазвичай не потребуються, а замість цього зазвичай використовують більш визначені послідовності термінатора. Вибір послідовностей поліаденілування/термінації може бути заснований на сумісності з клітиною хазяїна, що використовується для експресії. На додаток до вищезазначеного, можна використовувати інші характеристики для підсилення виходу, що включають модифікацію елементів реконструкції хроматину, інтронів та специфічного кодону клітини хазяїна.

Застосування кодону антитіл за даним винаходом може бути модифіковано для пристосування зсуву кодону клітини хазяїна з метою підвищення виходу транскрипту та/або продукту (наприклад, НоеКета, А. еї аї. (1987) Мої. Сеїї ВіоїЇ. 7(8):2914-24). Вибір кодонів може бути заснований на сумісності з клітиною хазяїна, що використовується для експресії.

Таким чином, даний винахід відносять до молекул виділених нуклеїнових кислот, які кодують гуманізовані імуноглобуліни, або їх важкий або легкий ланцюги. Даний винахід також відносять до молекул виділених нуклетових кислот, які кодують антиген-зв'язуючу частину імуноглобулінів та їх ланцюги.

Антитіла можна отримувати, наприклад, шляхом експресії однієї або більше рекомбінантних нуклеїнових кислот, які кодують антитіло, у придатній клітині хазяїна. Клітину хазяїна можна

Зо отримувати, використовуючи будь-який зручний спосіб. Наприклад, конструкти експресії (наприклад, один або більше векторів, наприклад, вектор експресії клітини ссавця), описані в даному документі, можна вводити до придатної клітини хазяїна, а клітину, отриману в результаті цього, можна підтримувати (наприклад, в культурі, в тварині, в рослині) за умов, зручних для експресії конструкту(ів) або вектору(ів). Клітини хазяїна можуть бути прокаріотичними, включаючи бактеріальні клітини, наприклад, Е. соїї (наприклад, штам ОН5ба М) (Іпийгодеп, Сапізрайд, СА), РегСб (Стисеї!, І еідеп, М), В. взиБійй5 та/або інші придатні бактерії; еукаріотичними клітинами, такими як клітини грибів та дріжджів (наприклад, Ріспіа равіогів,

АзрегойПив5 5р., Засспаготусез сегемізіає, 5спігозасспаготусез ротре, Мецгозрога сгазза), або іншими клітинами нижчих еукаріот, та клітинами вищих еукаріот, наприклад, таких як з комах (наприклад, клітини 52 ЮОгозорнйа 5сппівдег, клітини комах 519) (МО 94/126087 (О'Соппог)), клітин ВТІ-ТМ-581-4 комах (Нідп Ріме "М) (Іпмігодеп), ссавців (наприклад, клітин СО5, включаючи

СО5-1 (номер доступу до АТСС, СКІ -1650) та СО5-7 (номер доступу до АТСС, СІ -1651), СНО (наприрклад, номер доступу до АТОС, СВІ -9096), СНО 0с44 (Опацб, а. апа СНавіп, І.А. (1980)

Ргос. Май). Асай. 5сі. ОБА, 77(7):4216-4220), 293 (номер доступу до АТСС, СКІ-1573), Не а (номер доступу до АТСС, ССІ -2), СМІ (номер доступу до АТСС, ССІ -70), МОР (ПОВаївєу, І.., єї аї. (1985) 9. Міго!., 54:739-749), 313, 2931 (Реаг, МУ.5., еї аіІ. (1993) Ргос. Маї). Асад. осі. Ш.5.А., 90:8392-8396), клітини МБО, клітини 5Р2/О, клітини Ниї 78 та інші, та рослин (наприклад, тютюну, лемни (ряски) та водоростей). Див., наприклад, А!Т5!иреї, Е.М. еї аї., едв. Ситепі

Ргоїосої5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, Сгеєепе Рибіїзпіпуд Авзосіаїте5 апа допп Умієу 5 оп Іпс. (1993). В деяких варіантах здійснення, клітина хазяїна не є частиною багатоклітинного організму (наприклад, рослини або тварини), наприклад, вона є виділеною клітиною хазяїна або частиною клітинної культури.

Клітини хазяїна можна культивувати в колбах з перемішуванням, колбах, що струшуються, ролерних флаконах, хвильових реакторах (наприклад, Зузіет 1000 з ул"амебіоїесп.сот) або системах з порожніми волокнами, однак, переважно для великомасштабного виробництва, використовують реакційні апарати з мішалкою або мішкові реактори (наприклад, М/аме Віоїтесі,

Ботегзеї, Мем/ Уегзеу ОА), особливо, для суспензійних культур. Реакційні апарати з мішалкою можна адаптувати для аерації, використовуючи, наприклад, розподілювачі, перегородки або імпелери з низькими обертами. Для барботажних колонок та аероліфтних реакторів може бути бо застосована пряма аерація бульбашками повітря або кисню. В тих випадках, коли клітини хазяїна культивують в безсироватному середовищі, до середовища можна додавати клітинно- протекторний засіб, наприклад, плюроновий Е-68, щоб допомогти запобігти руйнуванню клітин внаслідок процесу аерації. В залежності від характеристик клітини хазяїна, можуть бути застосуванні мікропереносники в якості підкладок для вирощування якірно-залежних клітинних ліній, або клітини можуть бути адаптовані для суспензійної культури. Культивування клітин хазяїна, особливо, клітин хребетного хазяїна, може застосовувати ряд операційних режимів, наприклад, оброблення серії, культури з підживленням, повторної періодичної обробки (див.,

Огареаи еї а. (1994) Суфоіеснпоїоду 15:103-109), подовжений періодичний процес або перфузійну культуру. Незважаючи на те, що рекомбінантно трансформовані клітини хазяїна ссавців можна культивувати в середовищі, що містить, сироватку, такому середовищі, що містить фетальну телячу сироватку (ЕС5), переважно такі клітини хазяїна культивують в безсироватному середовищі, як розкрито в Кееп еї аї. (1995) Сушюіесппоіоду 17:153-163, або комерційно доступних середовищах, наприклад, РРОСНО-СОМ або Ойгасно м (Сатргех М,

ИБА), з додаванням при необхідності джерела енергії, такого як глюкоза, або синтетичних факторів росту, таких як рекомбінантний інсулін. Безсироватне культивування клітин хазяїна може потребувати, щоб клітини були адаптовані до росту в безсироватних умовах. Одним адаптаційним підходом є культивування таких клітин хазяїна в середовищі, яке містить сироватку, та повторний обмін 80 95 середовища культури на безсироватну культуру для того, щоб клітини хазяїна навчились адаптуватись до безсироватних умов (див., наприклад,

Зспапепрего, К. еї аї. (1995) Апіта! СеїЇ Тесппоіоду: ЮОеємеіортепів Томжага5 Ше 215ї Сепішгу (Веимегу, Е.С. єї аї., єдв), рр.619-623, Кіпмег Асадетіс рибіїзНегв5).

Антитіла відповідно до описаних варіантів здійснення можуть бути секретовані в середовище, та відновлені та очищені звідти, за допомогою низки методик з метою забезпечення ступеню очистки, який підходить для запланованого застосування. Наприклад, застосування терапевтичних антитіл для лікування людей зазвичай потребує щонайменше 95 95 чистоти, як визначено зниженням 5О5-РАСЕ, більш типово 98 95 або 99 95 чистоти, порівняно із середовищем культури, що містить терапевтичні антитіла. В першому випадку, клітинні залишки з середовища культури можуть бути видалені за допомогою центрифугування з подальшим етапом очищення супернатанта, наприклад, мікрофільтрації, ультрафільтрації та/або глибинної

Зо фільтрації. З іншого боку, антитіло можна збирати мікрофільтрацією, ультрафільтрацією або глибинною фільтрацією без попереднього центрифугування. Доступною є низка інших методик, такі як діаліз, гель-електрофорез та хроматографічні методики, такі як гідроксіапатитова (НА), афінна хроматографія (вибірково включає афінну тегову систему, таку як полігістидин) та/або хроматографію з гідрофобною взаємодією (НІС) (див., 05 5429746). В одному варіанті здійснення антитіла, які послідовно рухаються різними етапами очищення, захоплюються за допомогою афінної хроматографії білку А або С з подальшими етапами хроматографії, такими як іон-обмінна хроматографія та/лабо НА хроматографія, аніон- або катіон-обмінна, ексклюзійною хроматографією та осадженням сульфатом амонію. Також можуть бути застосовані різні етапи по видаленню вірусів (наприклад, нанофільтрація, із застосуванням, наприклад, фільтру ЮМ-20). Слідом за цими різними етапами, передбачають отримання з очищенням, яке містить щонайменше 10 мг/мл або більше, наприклад, 100 мг/мл або більше антитіла за даним винаходом, та, таким чином, формується інший варіант здійснення винаходу.

Концентрація до 100 мг/мл або більше може бути утворена ультрацентрифугуванням. Такі препарати в значному ступені вільні від агрегованих форм антитіл за даним винаходом.

Бактеріальні системи особливо придатні для експресії фрагментів антитіл. Такі фрагменти розміщуються внутрішньоклітинно або в періплазмі. Нерозчинні періплазматичні білки можуть бути екстраговані та розгорнуті для формування активних білків відповідно до відомих фахівцям даної галузі способів, див., Запопе еї аї. (1999) 9. Віотесппої. 72:13-20; Сирії, Р.М. єї а. (1999)

І ей. Аррі. Містобріо!. 29:273-277.

Даний винахід також відносять до клітин, які містять нуклеїнову кислоту, наприклад, вектор, за даним винаходом (наприклад, вектор експресії). Наприклад, нуклеїнова кислота (тобто, одна або декілька нуклеїнових кислот), яка кодує важкий та легкий ланцюги гуманізованого імуноглобуліну відповідно до описаних варіантів здійснення, або конструкт (тобто, один або більше конструктів, наприклад, один або більше векторів), який містить таку нуклеїнову(ї) кислоту(и), можуть бути введені до придатної клітини хазяїна способом, відповідним для відібраної клітини хазяїна (наприклад, трансформацією, трансфекцією, електропорацією, інфекцією), з нуклеїновою(ими) кислотою(ами), які є або стануть функціонально з'єднаними з одним або декількома елементами контролю експресії (наприклад, в векторі, в конструкті, який створено процесами в цій клітині, інтегрованому в геном клітини хазяїна). Клітини хазяїна можна бо підтримувати за умов, зручних для експресії (наприклад, в присутності індуктора, зручного середовища, в який додано відповідні солі, фактори росту, антибіотичні, харчові домішки тощо), в той час, як продукуються закодований) поліпептид(и). При бажанні закодоване гуманізоване антитіло може бути виділеним, наприклад, з клітин хазяїна, середовища культивування або молока. Цей процес охоплює експресію в клітині хазяїна (наприклад, залозистій клітині ссавця) трансгенної тварини або рослини (наприклад, тютюну) (див., наприклад, УМО 92/03918). 3. Терапевтичні застосування

Супресія активності Т-клітин є бажаною в низці ситуацій, в яких імуносупресія виправдана та/або виникає аутоїмунне захворювання. Відповідно, потребується націлювання на комплекс

ЯеВТсСА.СОЗ при лікуванні хвороб, що включають недоречну або небажану імунну відповідь, наприклад, запалення, аутоїмунну реакцію та інші стани, що включають такі механізми. В одному варіанті здійснення, такою хворобою або порушенням є аутоїмунне та/або запальне захворювання. Прикладами таких аутоїмунних та/або запальних захворювань є системний червоний вовчак (5 'Е), ревматоїдний артрит (КА) та запальне захворювання кишечнику (ІВО) (включаючи виразковий коліт (С) та хворобу Крона (СО)), розсіяний склероз (М5), склеродерму та діабет 1 типу (Т10) та інші захворювання та порушення, такі як РМ (вульгарна пухирчатка), псоріаз, атопічний дерматит, целіакія, хронічна обструктивна хвороба легень, тиреоїдит Хашимото, базедова хвороба (щитоподібна залоза), синдром Шегрена, синдром

Гійєна-Барре, синдром Гудпасчера, хвороба Адісона, грануломатоз Вегенера, первинний склероз жовчних шляхів, склерозуючий холангіт, аутоїмунний гепатит, ревматична поліміалгія, синдром Рейно, темпоральний артеріїт, гігантоклітинний артеріїт, аутоїмунна гемолітична анемія, перніціозна анемія, вузликовий поліартеріїт, хвороба Бехчета, первинний біліарний цироз печінки, увеїт, міокардит, ревматичний поліартрит, анкілозуючий спондиліт, гломерулонефрит, саркоїдоз, дерматоміозит, міастенія гравіс, поліміозит, гніздова алопеція та вітіліго.

В одному варіанті здійснення такою хворобою або порушенням є 5І Е, КА або ІВО. В одному варіанті здійснення такою хворобою або порушенням є М5.

В іншому варіанті здійснення антитіла відповідно до описаних варіантів здійснення використовують для сприяння трансплантації шляхом імуносупресії пацієнта. Таке застосування полегшує реакцію трансплантат проти хазяїна. Для опису існуючих способів лікування реакції трансплантат проти хазяїна див., наприклад, Змеппіїзоп, Вопе Маїтом Тгапзріапіайоп (2005) 35:565-567, та посилання, які цитують, в даному документі. Переважно, антитіла за даним винаходом можна використовувати в комбінації з іншими доступними видами терапії.

Приймаючи до уваги лікування аутоїмунних захворювань, комбінована терапія може включати застосування антитіла за даним винаходом разом з медикаментом, який сумісно з цим антитілом містить ефективну кількість для попередження або лікування таких аутоїмунних захворювань. Якщо вказане аутоіїмунне захворюванням є діабетом 1 типу, комбінована терапія може охоплювати один або декілька засобів, які сприяють росту бета-клітин підшлункової залози або зміцнювати трансплантацію бета-клітин, таких як фактори росту та виживання бета- клітин або імуномодулюючі антитіла. Якщо вказана аутоїмунна хвороба є ревматоїдним артритом, вказана комбінована терапія може охоплювати один або декілька з метотрексату, антитіла до ТМЕ-ВД, злитого білку ТМЕ-В рецептора-Ід, антитіла до 1-15 або 1-21, нестероїдного протизапального лікарського засобу (МЗАЇІЮ) або хворобо-модифікуючого протиревматичного лікарського засобу (ОМАКО). Наприклад, додатковий засіб може бути біологічним засобом, таким як засіб проти ТМЕ (наприклад, Епбге!Ф, інфліксімаб (КетісадефФ) та адалімумаб (НитігафФ) або ритуксімаб (КйихапФ). Якщо вказана аутоїмунна хвороба є відторгненням гематопоетичного трансплантата, можна застосовувати гематопоетичний(ї) фактор(и) росту (такий як еритропоетин, 6-С5Е, (4М-СО5Е, 1-3, 1-11, тромбопоетин тощо) або антимікробний) засіб(оби) (такий як антибіотичні, противірусні, протигрибкові лікарські засоби). Якщо вказане аутоїмунне захворюванням є псоріаз, додатковим засобом може бути один або декілька дьогтей або його похідних, фототерапія, кортикостероїди, циклоспорин А, аналоги вітаміну 0, метотрексат, р38 мітоген-активовані інгібітори протеїнкінази (МАРК), а також біологічні засоби, такі як засоби проти ТМЕ та КішхапФ. Якщо вказане аутоїмунне захворюванням є запальне захворювання кишечнику (ІВО), таке як, наприклад, хвороба Крона або виразковий коліт, додатковий засіб може бути одним або декількома з аміносаліцилатів, кортикостероїдів, імуномодуляторів, антибіотиків або біологічних засобів, таких як Кетісаде?»? та Нитігаф).

Комбіноване лікування може бути проведене будь-яким чином, як вважається за потрібне або вважається придатним фахівцем в даній галузі техніки та для мети цієї специфікації, не передбачається обмежень по відношенню до порядку, кількості, повтору або відносної кількості сполук, які треба застосовувати в комбінації. Таким чином, антитіла відповідно до описаних варіантів здійснення можуть бути складені у фармацевтичні композиції для застосування в терапії. 4. Фармацевтичні композиції

У переважному варіанті здійснення передбачається фармацевтична композиція, котра містить антитіло відповідно до даного винаходу, або ліганд або ліганди, які ідентифікують способом аналізу, який визначений в попередньому аспекті винаходу. Ліганди можуть бути імуноглобулінами, пептидами, нуклесмновими кислотами або малими молекулами, як обговорюється в даному документі. Їх називають, в подальшому обговоренні, як "сполуки".

Фармацевтичною композицією відповідно до даного винаходу є композиція речовини, яка містить сполуку або сполуки, здатні до модуляції активності Т-клітин в якості активного інгредієнта. Сполука знаходиться у формі будь-якої фармацевтично прийнятної солі, або, наприклад, при необхідності, аналогу, форми вільної основи, таутомера, енантіомера, рацемічної суміші або їх комбінації. Припускають, що активні інгредієнти фармацевтичної композиції, які містять активний інгредієнт відповідно до даного винаходу, проявляють терапевтичну активність, наприклад, при лікуванні реакції трансплантат проти хазяїна, при застосуванні у кількості, яка залежить від конкретного випадку.

В іншому варіанті здійснення одну або декілька сполук за даним винаходом можна використовувати у комбінації з будь-якою визнаною в галузі сполукою, яка підходить для лікування визначеного симптому при лікуванні будь-якого із зазначених вище станів. Таким чином, одну або декілька сполук за даним винаходом можна об'єднувати з однією або декількома загальновизнаними в галузі сполуками, котрі, як відомо, придатні для лікування вищенаведених симптомів, так, що зручну однократну композицію можна вводити суб'єкту.

Режими дозування можуть бути пристосовані для забезпечення оптимальної терапевтичної відповіді.

Наприклад, декілька розділених доз можна вводити щоденно або доза може бути пропорційно зменшена, як вказано потребами терапевтичної ситуації.

Активний інгредієнт може бути застосовуваний в зручній спосіб, таким як оральний, внутрішньовенний (якщо водорозчинний), внутрішньом'язовий, підшкірний, інтраназальний, інтрадермальний або супозіторним шляхом або імплантацією (наприклад, використовуючи

Зо молекули з повільним вивільненням).

В залежності від шляху застосування, може бути необхідним покрити активний інгредієнт матеріалом для захисту вказаних інгредієнтів від дії ферментів, кислот та інших природних умов, які можуть інактивувати вказаний інгредієнт.

Для того, щоб увести активний інгредієнт шляхом, відмінним від парентерального введення, він повинен бути вкритим, або вводитися з матеріалом для запобігання його інактивації.

Наприклад, активний інгредієнт може бути застосованим в ад'юванті, сумісно вводитися з інгібітором ферментів або в ліпосомах. Ад'ювант використовують в його найширшому розумінні, та він включає імуностимулюючу сполуку, наприклад, інтерферон. Ад'юванти, які припускають в даному документі, включають резорциноли, неіонні сурфактанти, такі як поліоксиетиленовий олеїловий етер та п-гексадециловий поліетиленовий етер. Інгібітори ферментів включають трипсин підшлункової залози.

Ліпосоми включають вода-в-маслі-у-воді емульсії СОР, а також звичайні ліпосоми.

Активний інгредієнт також може бути застосовуваним парентерально або інтраперітонеально.

Дисперсії також можна отримати в гліцерині, рідких поліетиленгліколях та їх сумішах та в маслах. За звичайних умов зберігання та застосування, ці препарати містять консервант для запобігання росту мікроорганізмів.

Фармацевтичні форми, придатні для ін'єкційного застосування, включають стерильні водневі розчини (якщо водорозчинні) або дисперсії та стерильні порошки для екстемпорального приготування стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій. В усіх випадках форма має бути стерильною і має бути рідкою до ступеня, який повинен бути для легкого ведення через шприц.

Вона має бути стабільною за умов виробництва та зберігання та має бути збереженою від забруднюючої дії мікроорганізмів, таких як бактерії та гриби. Носій може бути розчинником або диспергентом, що містить, наприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь та рідкий поліетиленгліколь та тому подібне), їх прийнятні суміші та рослинні олії. Належну плинність можна підтримувати, наприклад, застосуванням покриття, такого як лецитин, підтримкою необхідного розміру частинки у випадку дисперсії та застосуванням сурфактантів.

Запобігання дії мікроорганізмів може досягатися різними антибактеріальними та 60 протигрибковими засобами, наприклад, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбіновою кислотою, тірмеросалом та тому подібними. У деяких випадках переважним може бути включення ізотонічних засобів, наприклад, цукрів та хлориду натрію. Подовжене всмоктування ін'єкційних композицій може досягатися застосуванням в композиціях засобів, які уповільнюють всмоктування, наприклад, алюмінію моностеарату та желатину.

Стерильні ін'єкційні розчини отримують шляхом включення активного інгредієнта в потрібну кількість відповідного розчинника з низкою інших інгредієнтів, перелічених вище, при необхідності з подальшою стерилізацією фільтруванням. Зазвичай, дисперсії отримують шляхом включення стерилізованого активного інгредієнта в стерильний носій, який містить основний диспергент та потрібні інші інгредієнти з перелічених вище. У випадку стерильних порошків для отримання стерильних ін'єкційних розчинів, переважними методами приготування є вакуумна сушка та методика заморозки-сушки, результатом якої є порошок з активним інгредієнтом з будь-яким додатковим бажаним інгредієнтом з його попередньо стерилізованого фільтрацією розчину.

Різноманітні інші матеріали можуть бути присутніми у якості покриття або для модифікації іншим чином фізичної форми одиниці дозування. Звичайно, будь-який матеріал, який використовують в отриманні будь-якої форми одиниці дозування повинен бути фармацевтично чистим та по суті нетоксичним в кількостях, що застосовуються. Також активний інгредієнт може бути включений в препарати та склади повільного вивільнення.

Як використовується в даному документі "фармацевтично прийнятний носій та/або розчинник" включає будь-які та всі розчинники, диспергенти, покриття, антибактеріальні та протигрибкові засобі, ізотонічні засоби та засоби, що уповільнюють всмоктування, та тому подібне. Застосування таких середовищ та засобів для фармацевтично активних речовин добре відомо в даній галузі техніки. За виключенням випадків, коли традиційне середовище або засіб є несумісним з активним інгредієнтом, пропонується застосування цих терапевтичних композицій. Додаткові активні інгредієнти також можуть бути включені в композиції.

Особливо переважним є складання парентеральних композицій в формі одиниці дозування для легкого введення та однорідності дози. Форма одиниці дозування, що використовують в даному документі, відноситься до фізично дискретних одиниць, які придатні у якості однократної дози для суб'єктів-ссавців, які потребують лікування; кожна одиниця містить попередньо

Зо визначену кількість активного матеріалу, розраховану викликати бажаний терапевтичний ефект разом з необхідним фармацевтичним носієм. Специфікація нових форм одиниць дозування за даним винаходом зумовлена та прямо залежить від а) унікальних характеристик активного матеріалу та конкретного терапевтичного ефекту, що треба досягти, та б) обмежень, притаманних в галузі отримання складу, таких як активний матеріал для лікування хвороби у живих суб'єктів із хворобою, при якому стан фізичного здоров'я погіршується.

Основні активні інгредієнти складають для зручного та ефективного введення в ефективних кількостях з відповідним фармацевтично прийнятним носієм у формі одиниці дозування. У випадку композицій, які містять додаткові активні інгредієнти, дози встановлюють виходячи із звичайної дози та способу введення вказаних інгредієнтів.

Для полегшення доставки пептидних сполук, включаючи антитіла, до клітин, пептиди можна модифікувати для поліпшення їх здатності перетинати клітинну мембрану. Наприклад, 05 5149782 розкриває застосування фузогенних пептидів, пептидів, які утворюють іонний канал, мембранних пептидів, довго ланцюгових жирних кислот та інших мембранних комбінованих засобів для збільшення швидкості білкового транспорту крізь клітинну мембрану. Ці та інші способи також описані у УМО 97/37016 та 05 5108921, що включені в даному документі за посиланням.

В додатковому аспекті пропонується активний інгредієнт за даним винаходом, який описаний вище в даному документі, визначений для застосування при лікуванні хвороби або самостійно, або в комбінації з визнаними в галузі сполуками, які відомі, як придатні для лікування конкретного симптому. Внаслідок цього, пропонується застосування активного інгредієнта за даним винаходом для виробництва медикаменту для лікування хвороби, асоційованої з аномальною імунною відповіддю.

Також пропонується спосіб лікування стану, асоційованого з аномальною імунною відповіддю, який включає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості ліганду, розпізнаваного за допомогою способу аналізу, який описаний вище.

Далі даний винахід описаний в наступних прикладах лише з метою ілюстрації.

Порівняльний приклад 1

Зв'язування та біологічна активність ЕиСІМЗ зменшена порівняно з ВМАОЗ31

За допомогою проточної цитометрії було показано, що ЕиСІМЗ поступається ВМАОЗ1 за бо зв'язуванням з Т-клітиною (фіг.1). В цьому конкурентному методі Т-клітини інкубували на льоді в присутності фіксованої концентрації безпосередньо міченого фікоеритрином МоЇде25-ВМАОЗ31 (мишаче конкурентне антитіло) та при збільшенні концентрації антитіл до «ВТС. Після 20 хвилин інкубації клітини відмивали та зв'язане з поверхнею мічений фікоеритрином МоЇдс2р-

ВМАО31 визначали проточної цитометрією. Хімерне антитілло ВМАОЗ3З1 Ниїдс1 конкурувало значно більш ефективно, ніж ЕиСІМ3.

Для того, щоб оцінити здатність інгібувати активність Т-клітин іп мімо, СОвяж Т-клітини обробляли антитілами до «ВТС при різних концентраціях (див., фіг.2, ось х) та сумісно культивували з аутологічними дендритними клітинами (ОС), активованими СММ пептидом 495- 503 (ррб5) протягом семи днів в іп міго методі навчання (ІМЕ).

Продукти аферезу нормальних донорів від НІ А-А2" осіб отримували від НетасСаге Согр.,

Мап Миу5, Каліфорнія. РВМС виділяли центрифугуванням через фікол (СЕ Неайсаге,

Різсаїаулау, Нью-Джерсі). СО8-Т-клітини виділяли із застосуванням магнітних мікроносіїв (Іпмігодеп, Карсбад, Каліфорнія) відповідно до інструкцій виробника. Для утворення аутологічних незрілих дендритних клітин РВМСОС повторно суспензували в КРМІ 1640/5 95 сироватці АВ людини (5ідіта), висіювали в потрійні колби (Согппіпод) та інкубували більше 2 годин при 37 "С/5 95002. Приклеєні моноцити потім промивали з РВ5 та культивували протягом 6 днів в КЕРМІ 1640/5 95 сироватці АВ людини з додаванням ЗМ-С5Е (Іттипех, Сіетл, Вашингтон) та

І/-4 (РергоТесі, Рокі-Хіл, Нью-Джерсі). Перед утворенням сумісних культур Т-клітина/ос протягом 4 годин ОС активували пептидами (10 мкг/мл) та потім дозволяли їм дозріти. Зрілі дендритні клітини отримували додаванням 50 нг/мл ТМЕ-альфа, 25 нг/мл 1-18, 10 нг/мл ІІ -6, 500 нг/мл РОБЕ-2 (РергоТесії, Рокі-Хіл, Нью-Джерсі) та культивуванням дендритних клітин протягом додаткових 24 годин. Пептид-активовані ОС потім додавали до попередньо виділених

СОр8-Т-клітин у співвідношенні Т:ОС 10:11. Культури негайно живили ІЇ/-2 (100 Мо/мл), який додавали до культур. На 4 день культури доповнювали з ІІ -2 (100 МО/мл). На 7 день змішані культури аналізували щодо пептидної реактивності в аналізі вивільнення хрому.

Діаграма на фіг. 2 показує дані лізису, отримані за результатами аналіза вивільнення хрому, де необроблені Т-клітини успішно навчалися проти пептиду ррб5 та були здатні лізувати специфічні мішені у 250 95 випадків. ВМАОЗ1 пригнічувало навчання цих Т-клітин, оскільки вони були нездатні лізувати специфічні мішені дозозалежним чином. Гуманізоване антитіло ЕиСІМЗ

Зо було менш сильним, ніж ВМАОЗ1, та було здатне пригнічувати навчання лише в найвищий дозі.

Приклад 2

Ес-інженерія хімерних антитіл ВМАОЗ1

Іп міго профіль

Оцінювали іп міго профіль ВМАОЗ31 в панелі тестів. В таблиці 1 показан іп міго профіль

ВМАОЗ1. В цих тестах ВМАО31 порівнювали з ОКТЗ.

В тесті проліферації РВМСО РВМС людини культивували при зростаючих концентраціях терапевтичного антитіла протягом 72 годин, додавали "Н-тимідин та через 18 годин клітини збирали.

В тесті виснаження Т-клітин/вивільнення цитокінів РВМС людини культивували при зростаючих концентраціях терапевтичного антитіла та аналізували щоденно на кількості та життєздатність клітин (Мі-СеїЇ, ВесКтап Социйег) до 7 доби. Також збирали клітинні супернатанти, зберігали при -20 "С та аналізували на 8-секційній цитокіновій панелі (Віо-Вад).

ВМАОЗ1 не індукує: (ї) проліферацію РВМС; (ії) виснаження Т-клітин; (ії) експресію СО25 або (м) вивільнення цитокінів. Навпаки, ОКТЗ індукує всі вищезазначені ефекти. ВМАОЗІ1 та ОКТЗ здатні до блокування навчання СО8-- клітин до пептиду в іп міго тесті навчання (ІМЕ) та також здатні до блокування реакції змішаної культури лімфоцитів (МІК). ВМАОЗ31 також індукує апоптоз активованих Т-клітин (індукована активацією клітинна загибель; АІС).

На відміну від ВМАОЗ31, хімерний варіант ВМАОЗ31 (Ниїдс1і), з константною областю людського ІдС1 дикого типу, має іп міго профіль порівняний до ОКТЗ (таблиця 1). Була висунута гіпотеза, що включення Есук є ключовим для цієї зміни іп міго профілю для ВМАО31

Ншидо1 порівняно з ВМАОЗ31 МоЇдс2р5. Таким чином, отримували фрагменти Е(аб")»2 ВМАОЗ1

Ни4дсї! та знайшли, що вони відновлюють профіль ВМАОЗ1 МоІдб256. За допомогою Ес- інженерії включили модифікації, які усували зв'язування ЕсуК в мутаціях, відомих як "дельта ар" (Аптоиг єї аї. (1999) Єик. У. Іттипої., 29:2613-2624), а також з отриманням неглікозильованої форми Ниїдс4 (М2972)). Антитіла до ОВТОК НиЇдо1 дельта ар та Ниїдся адіу мали такий самий іп міго профіль, що і Моїде2Б5 ВМАОЗ1 (таблиця 1).

Таблиця 1

Ши ее Енея

Зв'язу- | Зв'язу- | Зв'язу- Про- Висна- | Експре- Ви- Інгі- Апоптоз/АІСО Інгі-

ЯК ЯК ке як

З З з Есук ція ср2г5 ня ня ня ІМЕ

УБТсК | авТоКк РВвВМС цитокіну Мі

В І М І М

ВМАОЗІ рев ев ОО КВ І БО Нв. Н.в. МУ

ПО В ПО ПП А -В. -В. КВК вс дар п и дар ен

Ідс4 адім реко ня

Приклад З

Конструювання гуманізованих антитіл з поліпшеним зв'язуванням

Отримували дві серії гуманізованих варіантів ВМАОЗ31 під назвами НЕВЕ! серія (ІНЗ-23) та

СІ 1ТВМ серія (ІСНМ1-3701 ї ІЗКМ3-11701; див., МВазе, мразе.тго-сре.сат.ас.иК). Початкове пересадження СОМ. областей важкого ланцюга ВМАОЗ1 на каркасні області ІЗНЗ-23 (див., ХЕО

ІЮ МО: 5 та 6) поліпшило зв'язування антитіла з осВТСК, як показано за допомогою конкурентного тесту (фіг. 3); див., приклад 2. Однак, це поліпшення не перетворювалося у функціональне поліпшення антитіла, як показано в тесті ІМЕ (фіг. 4).

Приклад 4

Оптимізація гуманізованих антитіл

Стратегія оптимізації гуманізованих антитіл була заснована на мутагенезі та функціональному скринінгі. Оптимізацію розпочинали зі змін блоків амінокислотних залишків в одній з кожних чотирьох каркасних областей варіабельних доменів з миші до людини. Ключові каркасні області ідентифікували в кожній з БІ 1ВМ НС, СІ 1ВМ / С та НЕВЕЇ! НС серій. Після цієї ідентифікації індивідуальні залишки в цих каркасних областях піддавали мутації у залишки зародкової лінії людини з вихідної послідовності миші. Каркасні залишки, для яких ідентичність з послідовністю миші була виявлена важливою для збереження зв'язуючих властивостей антитіла, були збережені, як мишачі залишки. В інших випадках каркасні залишки змінювали для відповідності амінокислотній послідовності зародковій лінії людини. Продовжували впродовж послідовності, доки не ідентифікували мінімальну кількість мишачих залишків для збереження вихідних зв'язуючих властивостей антитіла. Див. фіг. 5. Будо продемонстровано, що декілька антитіл з цих серій мають поліпшене зв'язування порівняно з ВМАОЗ1, як визначено за швидкістю дисоціації антитіла з Т-клітинами (фіг. 6, 7 та 8).

Для тестів швидкості дисоціації інкубували 109 Т-клітин людини протягом 30-60 хвилин при кімнатній температурі в 100 мкл повного ростового середовища, яке містило 2 мкг/мл антитіл, експресованих як Ниїдс1-даб. Ці клітини потім промивали, повторно суспендували в 50 мкл

Зо повного ростового середовища та додавали 20 мкг/мл НЕВЕЇ Р(ар)2 для попередження повторного зв'язування дисоційованих кандидатних антитіл. В кінці періоду проведення цього тесту клітини фіксували та вимірювали рівень зилишившихся антитіл Ниїдос1-даб, зв'язаних з клітинною поверхнею, методом проточної цитометрії за допомогою міченого РЕ вторинного антитіла кози до НиЇдо.

Також було продемонстровано, що антитіла були активні у попередженні імунної відповіді в

ІМЕ (фіг. 9, 10 та 11) та МІ К-тесті. В ІМЕ-тесті використовували зв'язування з тетраметром у якості кількісної міри для ІМЕ. Відсоток клітин, які були антиген-специфічними, визначали за забарвленням Т-клітин безпосередньо міченим тетраметром, який був специфічним до навчального пептида. Коротко, СО8яжТ-клітини 7 доби з ІМЕ красили тетраметром за стандартними протоколами викрашування при проточній цитометрії та аналізували на

ЕАСзЗсСаїйриг, ВО. Окрім того, гуманізовані антитіла демонстрували порівняні рівні проліферативного потенціалу на РВМС та вивільнення цитокінів у порівнянні з ВМАОЗ1 (фіг. 12 та 13).

Антитіла також демонстрували здатність інгібувати вивільнення ІЄМу з Т-клітин у ІМЕ-тесті (фіг. 14). До того ж, було показано, що низка цих антитіл має поліпшену здатність викликати індуковану активацією клітинну загибель (АІСО) активованих сВТСЕ-позитивних Т-клітин порівняно з ВМАОЗ1 (фіг. 15). В тесті АІСО антиген-специфічні СО8--Т-клітини культивували з терапевтичним антитілом. Через 24 години, 48 годин та 72 години клітини красили щодо маркерів апоптозу анексін-М та 7-ААЮ. Клітини також красили тетраметром, щоб простежити апоптоз з ефектами на антиген-специфічні Т-клітини.

Таким чином, було досягнуто значне поліпшення у порівнянні з попередніми спробами гуманізувати ВМАО31. Розробка антитіл з поліпшеною швидкістю дисоціації порівняно з ВМАОЗ31 є несподіваним результатом в цьому способі. Поліпшення в зв'язуванні корелює з поліпшенням в ефективності супресії імунної відповіді, як показано в ІМЕ-тесті (фіг. 10 та 11). Специфічність антитіл до соВТСК, знижена внаслідок гуманізації імуногенність, специфічний апоптоз активованих Т-клітин і відсутність активації Т-клітин при зв'язуванні з антитілом робить ці антитіла відмінними кандидатами для терапевтичних цілей.

Приклад 5

Отримання Ес мутантів зі зниженою ефекторною функцією.

Було розроблені та отримані сконструйовані Ес варіанти, у яких сайт глікозилювання введено в положенні 5ег 298 амінокислотної послідовності після сайту Азп297, що зустрічається в природі. Глікозилювання в А5п297 або підтримували, або нокатували мутаціями. Мутації та результати глікозилювання викладені в таблиці 2.

Таблиця 2 ефекторна функція

Немає глікозилювання в Знижена ефекторна положенні 297, однак, функція

З |М2г970/5298М/У3005 (МОУ) сконструйований сайт глікозилювання в положенні 298

Немає глікозилювання в Знижена ефекторна положенні 297, однак, функція 4 |5з298М/1299А/У30051 (57) сконструйований сайт глікозилювання в положенні 298

Два потенційних сайта Позитивний контроль за глікозилювання в положенні 297 Іізниженою ефекторною 5 Б2О8М/У3005 (ЗУ) а 298; Подвійне функцією глікозилювання. Змішане глікозилювання.

Мутації отримували на важкому ланцюзі клону Мо 66 антитіла до «В рецептора Т-клітини із застосуванням матриці Оцікспапде рЕМТК ГІС 951. Домен МН НЕВЕТ1 Дар дстї Мо 66 ампліфікували з праймерами ГІС та клонували в РЕМТК ГІС ІдС1 мутантного або дикого типу за допомогою ГІС з утворенням мутантів або дикого типу АБ повної довжини. Субклонування перевіряли за допомогою подвійного розщеплення Югапш/хХної, внаслідок чого в успішних клонах

Зо утворюється вставка «1250 по. Потім такі мутанти повної довжини клонували у вектор експресії,

РСЕРА(-Е-)Оеві, за допомогою системи клонування Саїемжау. Потім мутації підтверджували секвенуванням ДНК.

Два конструкти, НЕВЕ1 Адіу Ід04 та НЕВЕ1 лаб Ідс1 в рСЕРА, використовували як контролі при трансфекції НЕК293.

Мутанти, ул та контролі (Адіу та лаб) трансфекували в клітини НЕК293-ЕВМА в потрійній колбі для експресії. Білюи очищували з 160 мл кондиціонованого середовища (СМ) в 1 мл колонках НіТтар з білком А (СЕ) на багатоканальному перистальтичному насосі. П'ять мікрограмів кожного супернатанта аналізували у 4-2095 Пібз-гліцин 50О5-РАОЕ у відновлювальних та невідновлювальних умовах (дивись фіг. 16). Важкий ланцюг неглікозованих мутантів (М2970), Т299А та Адіу контроль) нижче (чорна стрілка), у відповідності з втратою гліканів цього антитіла. Незважаючи на це, важкі ланцюги сконструйованих глікозильованих антитіл (МУ, ЗТ, ЗУ, Дар та ул контроль, червоні стрілки) мігрують так само, як і контроль дикого типу. Цей результат знаходиться узгоджується з очікуваним виходом сконструйованого сайта глікозилювання в 298 положеннях. Аналіз 5ЕС-НРІС показав, що всі мутанти експресувалися як мономери.

Аналіз глікозилювання за допомогою І С-М5.

Сконструйовані Ес варіанти Нбб Ідс1 частково були відновлювали за допомогою 20 мМ ОтТтТ при 37 "С протягом 30 хв. Зразки аналізували капілярним І С/М5 в системі капілярної НРІ С

Адііеєпі 1100, поєднаною з гібридною системою дд ТОЕ О5ТАК (Арріїєа Віозуєіїет). Для аналізу даних використовували білкову реконструкцію Байєса з поправкою базової лінії та комп'ютерним моделюванням в Апаїубзі 05 1.1 (Арріїєй Віобвузієт). Для основного антитіла мутанта 5298М/1299А/У3005 Нбб спостерігали один сайт глікозилювання в положенні 298 амінокислоти з біантенарними та триантенарними гліканами комплексного типу, виявленими як основні види, а також з СОР, С1Е та 2.

Зв'язування мутантів антитіл до ОВТСК з ЕсукКПШа та ЕсукіІ людини з застосуванням Віасоге

Віасоге використовували для оцінювання зв'язування з рекомбінантним ЕсукІШа (М158 8

Е158) та ЕсукіІ людини. Всі 4 проточні комірки СМ5 чипу іммобілізували з антитілом до НРС4 шляхом стандартної процедури зв'язування аміну, викладеної Віасоге. Антитіло до НРС4 розводили до 50 мкг/мл в 10 мМ ацетаті натрію з рН 5,0 для реакції зв'язування та вводили протягом 25 хв при 5 мкл/хв. Близько 12000 КИ антитіла іммобілізували на поверхні чипу.

Рекомбінантні ЕсукШа-мМ158 та ЕсукШа-Р158 людини розводили до 0,6 мкг/мл в зв'язуючому буфері, НВ5-Р з 1 мм Сасі», та вводили в проточні комірки 2 та 4, відповідно, на З хв при 5 мкл/хв для захоплення 300-400 КО рецептора на чип до НРС4. Для відмеження слабких зв'язуючих елементів захоплювали втричі більше гпЕсукШа поверхнею до НРСЯ, ніж зазвичай в цьому тесті. Проточні комірки 1 та З використовували як референс-контролі. Кожне антитіло розводили до 200 нМ в зв'язуючому буфері та вводили у всі 4 проточні комірки на 4 хв з наступною 5 хв дисоціацією в буфері. Поверхні регенерували з 10 мМ ЕОТА в НВ5З-ЕР буфері протягом З хв при 20 мкл/хв.

Результати представлені на фігурі 17.

Зо Віасоге також використовували для порівняння зв'язування з ЕсуКіІ. Антитіло до тетра-Ніб піддавали буферному обміну в 10 мМ ацетаті натрію з рН 4,0 з застосуванням колонки ера

Резайіпд та розводили до 25 мкг/мл в ацетатному буфері для зв'язування аміну. Дві проточні комірки СМ5 чипу імобілізували з «9000 КО антитіла до тетра-Нів після 20 хв введення при 5 мкл/хв. Подібно до попереднього експерименту для порівняння слабких зв'язуючих елементів захоплювали в десять разів більше Есук!І поверхнею до тетра-Ні5. Рекомбінантний Есукі людини розводили до 10 мкг/мл в НВ5-ЕР зв'язуючому буфері та вводили в проточну комірку 2 на 1 хв при 5 мкл/хв для захоплення «1000 КО рецептора чипом до тетра-Ніз. Одноразову концентрацію антитіла, 100 нМ, вводили на З хв при 30 мкл/хв на захоплений рецептор та контрольну поверхню. Дисоціацію відстежували протягом З хв. Поверхню регенерували 30 сек. ін'єкціями 10 мМ гліцину при рН 2,5 при 20 мкл/хв.

Результати представлені на фігурі 18.

Результат дозволяє зробити висновок про дуже мале зв'язування глікосконструйованих мутантів з ЕсукІШа або ЕсукіІ. Зокрема, Нбб 5298М/1299А/и3005 майже повністю не мав зв'язування з обома рецепторами. Цей мутант вибирали як основний для детального характеризування.

Характеризування стабільності за допомогою циркулярного дихроїзму (СО).

Стабільність о мутанта антитіла 5298М/1299А/и3005 відстежували шляхом Раг-ШМ експерименту термоплавління з СО, в якому СО-сигнал при 216 нм та 222 нм відстежували при збільшенні температури, що в результаті призводить до розгортання антитіла. Спектри СО отримували на спектрофотометрі даз5со 815 при концентрації білка приблизно 0,5 мг/мл в РВ5 буфері в кварцевій кюветі (НеПта, пс) з шириною шару 10 мм. Температуру контролювали термоелектричною приладом з елементом Пельтьє (модель ЧУазсо АМУС100) та змінювали зі швидкістю 1"С/хв з 25 до 89"С. Отримували показники СО сигналу та НТ напруження. Дані отримували з 210-260 нм з інтервалами між даними 0,5 нм та з температурними інтервалами 176. Швидкість сканування складала 50 нм/хв. з шагом даних 0,5 нм. Використовували діапазон 2,5 нм з середніми параметрами чутливості. Для кожного зразка виконували сканування у 4 повторах. Результат дозволяє зробити висновок, що як дельта АВ Нбб так і 5298М/1299А6А/73005

Нбб мутанти демонструють подібну температурну поведінку та мають однакову температуру початку деструкції, яка складає близько 63"С. Іншими словами, мутант є таким же стабільним, бо як і формат дельта АВ.

Дивись фігуру 18.

Приклад 6

Функціональний аналіз Ес-сконструйованих мутантів

Тести проліферації РВМС та вивільнення цитокінів виконували, як викладено в прикладі 2.

РВМС нормального донора розморожували та обробляли при наступних умовах (все в середовищі, яке містило комплемент): - Необроблені, - ВМАО31, тоїдо26р 10 мкг/мл, - ОКТЗ, тоЇдога 10 мкг/мл, - Нбб, пиЇдс1 дельта АВ 10 мкг/мл, 1 мкг/мл та 0,1 мкг/мл, - Нбб, пиїдст! 5298М/1299А/У3005 10 мкг/мл, 1 мкг/мл та 0,1 мкг/мл.

Цитокіни збирали на день 2 (02) та день 4 (04) для аналізу Віорієх (112, 114, 116, 1 8, 1-10,

СМ-С5БЕ, ІЄМО, ТМГа). Клітини красили на 04 щодо експресії СО4, СО8, СО25 та артсн.

Результати, представлені на фігурах 19-22, показують, що Нбб 5298М/1299А/и3005 поводився подібно до Нбб дельта АВ в усіх тестах на клітинах, демонструючи мінімальну активацію Т-клітин експресією СО25; зв'язування з арте, хоча і з трохи відмінною кінетикою до дельта АВ; мінімальне вивільнення цитокіну як в 02 так і в 04; фактично мутант перевершував дельта АВ на 04 у відношенні декількох цитокінів.

Таким чином, у мутанта 5298М/1299А/73005 була відсутня ефекторна функція так само ефективно, як і при мутації дельта АВ.

Приклад 7

Біспецифічні антитіла

Сконструювали біспецифічні молекули, які складалися з двох одноланцюгових антитіл (5СЕм), поєднаних разом за допомогою короткого амінокислотного лінкера, де одне плече було здатне до зв'язування з мішенню-пухлиною, а інше здатна до зв'язування з Т-клітинами за допомогою 8 ТСК. В цьому документі біспецифічну молекулу називають ТКАСЕК (Т сеї

Весеріог Асіїмаіейд Сушюіохіс ЕпарієВ).

Отримували наступні гуманізовані 5сЕм конструкти до ОВТСЕ:

СІ /ВМАБХУКІ,

Коо) СІ 1ВМАБ5ХМУКО7,

СІ /ВМА5МУНІ ХМК,

СІ /ВМА5УНІТ5ХМКІ,

СІ І/ІВМА5УН2вХУКа З,

СІ "І ВМА5УНЗІТХУКа3.

Послідовності важкого та легкого ланцюгів викладені в 5ЕО ІЮ по 14-16 та 20-24.

Характеризування цих молекул включало оцінку зв'язування до мішені-пухлини та Т-клітин, цитотоксичну активність іп міго та профіль вивільнення цитокінів в присутності та відсутності клітин-мішеней пухлини.

З профілю зв'язування, отриманого за допомогою проточної цитометрії, видно, що біспецифічні антитіла до В ТС здатні зв'язуватися як з лінією пухлинних клітин-мішеней, так і з Т-клітинами. Дивись фігуру 23.

З цитотоксичної активності іп міго, виміряної за допомогою проточної цитометрії, видно, що

Т-клітини, рекрутовані за допомогою біспецифічного антитіла до оф ТОК, здатні індукувати опосередкований Т-клітинами лізис. Дивись фігуру 24.

Аналіз профілю вивільнення цитокінів показав, що при зв'язуванні обох плечей біспецифічного антитіла має місце високий рівень вивільнення цитокінів ТН1/ТН2 з Т-клітин, що не помічено у відсутності клітин-мішеней. У сукупності цей механізм дії характеризується подібним профілем з біспецифічними конструктами до СОЗ, описаними в літературі.

Приклад 8: Отримання та характеризування сконструйованого Ес варіанта антитіла до

Сбо52.

Для тестування універсальності застосування мутацій Ес, описаних в цьому документі, також отримували мутант за глікозилюванням 5298М/У3005 в антитілі до СО52 (клон 233), щоб продемонструвати чи поширюється модуляція ефекторної функції з втратою зв'язування з

ЕСУКП вна інший остов антитіла. ДНК варіанта 5298М/73005 203 отримували шляхом швидкозмінного мутагенезу. Білок очищували з кондиціонованого середовища після тимчасової трансфекції НЕК293. Паралельно в якості контролю отримували 2С3 антитіло дикого типу до

СО52. Віасоге застосовували для характеризування антиген-зв'язуючих, ЕСУуКІ, та зв'язуючих властивостей очищених антитіл (дивись фігуру 26).

Варіант 5298М/У3005 203 міцно зв'язується з пептидом СО52, а сенсограма зв'язування не відрізняється від контролю дикого типу, що дозволяє зробити висновок, що домен Ес не впливає на його зв'язування з антигеном (фігура 26А).

Для тестування ефекторної функції Ес в дослідженнях щодо зв'язування використовували рецептор ЕсуКн (МаІ158). Мутантне антитіло та контрольне антитіло дикого типу розводили до 200 нМ та вводили до ЕсукПШа, захопленого НРС4-міткою. Зв'язування ЕсукіІї є майже таким, що не виявляється, для мутанта 5298М/У3005, що вказує на втрату ефекторної функції цим варіантом (фігура 268). Мутант також зв'язується з рецептором ЕБоКп з такою ж самою афінністю, як контрольне антитіло дикого типу, таким чином, не очікується зміна в його періоді напіввиведення з кровотоку або інших фармакокінетичних властивостях (дивись фігуру 260).

Можна зробити висновок, що мутація 5298М/73005 можна поширити для антитіла в цілому для зменшення або усунення небажаної ефекторної функції Ес, наприклад, шляхом залучення рецепторів Есу людини.

Перелік послідовностей

ЗЕ МО: 1

НАФТІ Варіабельний домен важкого ланцюга;

ЕМОБООБОРЕСУКРОДЯУКМЗСКАЗОУКЕТВУУМНИУКОКРиООВІ ЕММА УМОУТКУМ

ЕКЕКСКАТІ ТЗрРКОЗЗТАХУМЕЇ З5І ТЗЕОВАУНУСАНИВУТрУОСвУ ДВО ИТЬУТИВА

ЩО:

БМАСЗІ Варіабельний деман пегкого панцюєа:

ОМІ-ТОВРАМОАБРСЕКУТМТОСчАТОВУ ЗУМНУТООКаСТеРКЕМУОТВКІАВСУРАВЕ

БОБОБОТЕХВІТІВЯМЕАЕПААТУСОСХВаМРЕ ТЕО ДОК К

ЕС МО: З боса Бзріабельний домен важкого ланцюга:

ОМОСЧОБСАЕУККРОЗБУКУВСКАВОХУКЕТО УМ УКОЛиВОСІ ЕМ ТІНРУМОУТКИХ

ЕКЕКОКАТІ ТАПЕЗТМТАХМЕ ЗВ АЗЕВТАУНУСАВОВУУОХОсЕУ МОСТУ 5ЕО 1 що 4

ЕШСІУЗ Нащіавбельний домен легкого ланцюга: пОМТОЗеті ЗАЗУЧОВУ ПИТСВАТВВУ ВУМНУХООКРОКАРКАМНТОТЗКІ АЗСУвАВЕ

ІВОЗОСТЕЕТЬ ТВЧ ОРОЮБАТУУСОПСУВОМАЦТЕСОСТКУВІК (Б)

ВЕСНОЮ МО: 5

НЕБЕТ Варівбельний домен важкого ланцюга:

ЕМО ЕЗСОСІ МОРСОБІ НЕ ОСААБСУКЕТВУУМНУУКОАРОКСТЕ МО КМУ ІЗ УТ

ЕКРКОКАТСЯВОМОКМТ ус ОММНАВОТАУНУСАНИВЗУОуО СЕУ УВОСИТЬУТУВЯ

БЕО а МО: В

НЕБЕЇ Варізбельний домен паукого ланцьва:

ПІДМТОВАЕТЗАБУВОНУ ТИТСВАТОВУВУМНИУ ОО КРОКАРКАМУ ВТК АБОУРАНЕЇ

СеСООТЕЕТ ПЕВЕОРОБЕАТУ УСС МРЕТЕВОСТКУВІК

ЗЕ0ІЮ МО т

НЕБЕТ НТО Варіабйольний домен важкого панцюга;

ЕС СОБОРЕЇКРОСАЛАБУКМОСКАВЗОХКЕТВУУМНИЧУКОДРОКОВЕТ УМО ИТКИМ

ЕКЕКОКАТЕЗНОМЕКМТ І СМ ААЕОТАНІСАВОВУКОХОСЕМХОСОСТЬУТУВЯ вва

СІЛВМ Варіабельниай домен нажкого панціюга:

СЛИНІ ВОАЕСККАСАЗУКЮУВСКАВЗСУКЕТВУУМНИУВаАРОСВІЦ ЕМ МСЕК

МЕКЕКИКАТТАОТЗАМТАМЕ БВ АЗЕВТАУТУКАНОВУУОХОВЕУ ОВТ УТиве

ЗЕ МО: Я

СіІЛЕМ Варіабельний домен легкого ланцима:

ЕІМІ.ТОУРАТІБІ ЗРОЕНАТІ СВАТИ ВУМЙНИ ЦК СОАРАНУЛ У ЗКЕАВСУРАНЕВ

ОБОБОТОКТМПОБЕЕРЕОРАУТУСОСТЗаНРЕТЕВСаТКУвІК.

ЗО НЕ МО:

Нвідеї Бе дена аїк

АБТКОРОЧЕРІ АРАЗКОТЗОСТААКОССМКОУРРЕРУТУ ОУН ТОаУНТЕРАУСОВВО часа туУВЗЗЗЦаТа т чЧСНУМНКРЕМКМОККУЕРКОСИКТНТСЕРСРАРРУ АРМ

РЕКРКОТІ МІЗНТРЕУ ТО УКОМОНЕПРЕЧКЕМУ УВО УЕУНКАКТКРВЕЕОУМЕТТНУМЯУ

РА НОМУ КОКЕХКСКУЄМКИаСРОБІЕКТВКАКОСЕВЕРОМ УТ Р БНОЕСТКНОУВІ о

ЕЧКОЕТРОТАУЕТЕВМОССВЕННУКТТВРУ ЗО ЯЕРІ У КСТЧОКВАМ Ода ВОоВиМ

НЕЛЕНННУТОКВЕВЯРаК

ЗЕО КИ ЧІ

Ниїдоа зоіх Бе:

АВТКаРЯЗМЕРІ АРСЗНЗІВЕБТААЦОЯСЬУКОТЕРЕРУТУ ЗИ ОВАСТВОУНТЕРАУазеоі, уВіяБУУТУР ВВЕ ТКТИТСВУОНКРаМТКУЮКАУЕВКУОРРСРРСРАРЕРІ ССРОУРЬКИ

КВК МІЗАТРЕЧУТСУУУрУВОЕВРЕУОЕНИ У УОЗМЕМНМАКТКРЕЕЕ СКОБУ МЕ, ть нарі МаКкЕКСКУЗНКО С РОБІЕКТІЗКАКООРВЕРОУУТІ РЕЗОЕЕМТКНОУВІ ТС

УКОЕУРЗБІАУЕМЕВКОСРЕММНУКТТРРУС ОБОСБЕРІ ХВ ТУВКаВМСЕаМиООоВУМА

ЕЛ НННиТОоКН Ба ОК

ЕОМ: 12

НЕВЕЇ НОБ5 Варіабельний домен важкого ланцюва;

ЕТО ОозбавьУдРООЗЕНіВЗСААЗИУКЕТВУУМНУУНОИДРИКа ем ис чеУчоиТКу

КЕКРКЕВЕТІ ВОМЗКМТ УкОММвІі АБИ ТАУ Усно ХОСЕ У Мас МТУ ВВ.

ЗЕ МО: 13

НЕВЕЇ Н? Варіабельний домен важкого панціюга:

Ето ЕЗаОовічОРОСЗУНЕЗСДАЗОКЕТЗУУМН УНДО КаЦЕ МОТО УТ

МЕКЕКСВЕТ ЯВКУ ОМНВІ ЯАЕОТАУЄИСДНО ВУХ П Ус ис УТ

БЕЗ ОМ: 14

СІЛ УКЯЗ Варіябельний домен легкого ланцюна:

ЕМІТОБРАТ ЗІ БРОЕНАТІ ЗОоБАТОВУВУМИУМОСКРОВАРННІЧОТОКІ АВОУвАдЕе свавстеУТІ ПЕВ ЕРЕРЕАУТУСООТуУБаМРІЛТЕСССТКУВ іхеніежн ання

БІЛаМ УНІВ Варізбепьний домен важкого панцьога:

САНИ МОЗСАВУККРОАБУКУВСКАВИУКЕТОУ УМА КОАРООСІ ЕМО ІМ КМОМ ТК УМ

ЕКЕКОСНУТТНАОТаАЗТАТМЕ БІ АЗЕВТАУУСАНИВУТОУОВЕуУМ МОСТУ

ЗЕ: те

Там УНІ Варіабельний домен важкого іанцнга ап чУаБадЕУКккКРІАВУКУСКАВОСЯУКЕТВУУМНМУВОдЕвОосСіЕМНа жено КУМ

ЕКЕКОНУТИ НОТ ВАБТАУМЕ ВОНО ТАХуУУСАВОоВУ В рОКМУ ОО МТУ

ЗЕ МО: 1 юн оз НЕАМУ СИНАМ

УМО ЕБСОВСІ МОРІ Бі ВСДАВСЕТЕВЕУАМВИУВадРаКОМСЕУВвАВОБВОВаТ

АДЗУКОВРТІВОМОКМТ ТІ ОМС ВАЕДТАХУТСАК

БЕ МО: 18 ванмч-зчи нНЕДУчУ НАВ

ОМОГ МОЗОАЕУККРБАЗУКУВОСКАВОЇ ТЕТ ХАМЕИМУУНОАРОЮВІ ЕМО АСНОМТК

УЗаКЕВСНУТІТВОТВАЗТАУМЕСОВІАБЕОТАМ САН

ЕС ПО МОХ вакмз чи ШеНт СНАХ

ЕРМІ ТОЗРАТІ БІ ЗРОЕНАТІ ЗСВАВОВУВОЖ АТО КеСОДРВЕ ОЛЯ АТОВАНЕВ

СБаБЕТОЕ ТП ТІЗЗСЕРЕОВАМУТСООВВНИУВ,

ЗЕ Мо. 20 сілвмУНАВ

СУС АБЕУККРДВУКУВСКАВОУКЕТО УМОВ ЕД ЧІУНВУТКУ

МЕКЕКОКАТТАОТВАВТАХМЕЇ ВВ АБЕПТАУУСАНОВУОТОСЕ У ОСЮТЬМ УВО

БЕОО Мо 21 біламукі

ВМ ТОБвАТІ Я БРІКЕНАТЬЗСВАТаВУВУМНИМЧУОКРОСАРАВМОТВКЕАВОХРАВЕВ

СЗОЗОТрЕП УВІ ЕРЕОАУ ТС МРІТЕВСОТКУВІК

ЗБОЮ Мо ги слвмУКкаї

ЕІМІ ТОВРАТІ ЗІ ЯРОЕНАТЕ ВСВАТЗВУЗУМНИ ОКОМ ОТВКЕАЗСУРАНЕВ

ОБОБОТОСТЬТОБМЕРЕВЕАУУУСООМавМАІ ТЕОсаткуУвК

ЕС Ю Мо 23 віл уУНАВ УНІ

ОМС МОЗОАЕУККРОАВУКУВОСКАВСУКЕТОУУМНИУКОКРООСЕ ЕМО УМОУТКУМ

ЕКЕКОКАТТАРТЗАВТАУМЕЇ ВІ ЯВЕОТАЧУУСАНОЗУХрХО СЕУ ад атьуТУВа

ЗЕСйИО Мо 24 сілвм унав уні

СХОГ УОЗ ОАЕУККРОАВУКУВСКАВСУКЕТОУУМНИУКОАРООСС ЕОР УМОМТКУМ

ЕКЕКОКАТТНОТОАВТАУМЕЇ ЗБВІЯВЕВТАХУСАНаВУХОУПОвУумоОоті УТА

Claims (8)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Гуманізоване моноклональне антитіло, специфічне до комплексу «ВТСоК/СОЗ3 людини, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з послідовностей, представлених в 5ЕО ІЮ МО: 7, 12, 13, 15 і 16, та варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО І МО: 14.

2. Гуманізоване моноклональне антитіло за п. 1, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 7, 5ЕО ІЮ МО: 121 5ЕОІЮ МО: 13.

3. Гуманізоване моноклональне антитіло за п. 1, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 15 ї 5ЕО ІЮ МО: 16.

4. Гуманізоване моноклональне антитіло за п. 1, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 15.

5. Гуманізоване моноклональне антитіло за п. 1, в якому варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 16.

6. Гуманізоване антитіло за будь-яким одним з попередніх пунктів, яке додатково містить константну ділянку людського походження.

1. Гуманізоване антитіло за п. 6, яке додатково містить модифікацію Ес, що знижує зв'язування з Есу-рецептором.

8. Гуманізоване антитіло за п. 7, яке містить неглікозиловану область Ес або модифікацію дельта аб.

9. Гуманізоване антитіло за п. 7, яке містить модифікований профіль глікозилування.

10. Нуклеїнова кислота, яка кодує щонайменше варіабельну ділянку важкого ланцюга і варіабельну ділянку легкого ланцюга гуманізованого моноклонального антитіла за будь-яким із пп. 1-9.

11. Клітина, яка експресує нуклеїнову кислоту за п. 10.

12. Гуманізоване антитіло за будь-яким із пп. 1-9 для застосування при супресії опосередкованої Т-клітинами відповіді у пацієнта.

13. Гуманізоване антитіло для застосування за п. 12, де опосередкована Т-клітинами відповідь залучена до стану, вибраного з групи, що складається з трансплантації тканини, розсіяного склерозу та діабету 1 типу.

14. Гуманізоване антитіло для застосування за п. 13, в якому трансплантацію тканини Зо вибирають з групи, яка складається з трансплантації цілого органа, трансплантації складної тканини та трансплантації тканинного клаптя. Конкурентний аналіз антитіл да артск то рес - ПО в є А Ше няно БМАОЗЯ НОСІ не ВМАОУЮ Моср шо ло я я жхебо БОСТУЗ Нис х | З «ре ІЗОТИПОВИЙ КОНТРОЛЬ за їй бе о ва 1 за лк Концентрація знтитіла (мкг/мл

Фіг. 1

! вТкІВи Я СПДВМАВНМО 00000 сжевесма ал ся без аюттіло Її мо, - : ! . рода - пеня шен вин Й хо ния т пк пниишшишяшшинннни ЩО і їх З зп її пи в ни нний дня : по я - се счпттятя : і по 225 пив о пз ги й : Н зантитано жекрит

Фіг. 2 Конкурентний аналіз відносно ЗМЕ ВМАОЗІ Мо25 ?о0 Мч й а МЕВЕЇ ів и С « БУС Мис! : че т ВМАОЗІ Нисі Ох - В х Шк й Ка С т1об9ч че х З їх з -а -3 -й - в 3 2 такт/вл

Фіг. З штеови : ! ГТДЖІЕМАНИ сама Ав о ся ай сор аоннв ї ДІД сеесееететееттт осот АТ АИТІоІІ СТ о То ІсоТІсТТЕ ТЕ ЕІгсетттсеття Я хв ши п ци а ! ан Ефес Й нення Й що ЗД реттиия я пн ння : ' 08 он Не» МАН пинння ще ові шия ши і 1 ба фл 928 пов воз оо Гу : : (знтитімі) зінеумя

Фіг. 4

СЕР ОСІ Її ви Її Б | Гой | СЕН М-КВ ЕЙ «ЕВ Свв | свв; Ж флтритрт ре крсти ния рикт шк ящик зн з З Пищик як З ши Я рис ВБ ТВ ЕНН ТИН Гжерй (віейн Ан жа Тен пенем ин борні НК ИН дк пи и ЧИ пив ПАН ТАНВВ | Те МНН с НМ: ЛИ МИ ШК ж труну ях уретк де яри птн що не Я ЗИ ИН ЗНУ я жиле жи шик ат ПОВ ее пев вух! вия (ма ера Має цик пев вда реж реиЯеня руня ре

Фіг. 5 Швидкість дисоціації повтозно гуманізованих НЕВЕ- антитія на Т-клітимах

705. півня ВАС ! сля БОС

Кк. Ша се НЕШе ТР НІЙ з ек Ше я Нев НИ ЗК, Ше Ту зе Нереі НТ ше бе ее Нере НИЗ ж Я х ке ; Не- - і У ее че а ук . ки ШЕУ з у Моя ОС ув Ко о З НІ ваш 1004 а є ак . ' Ми: а а ! п я М МИ ан вкни хх , ше о СВ С В С С СА Час іїха.)

Фіг. 6

Швидність дисоціації повторна гуманізаованих НЕВЕ- антитій на Т-нлітинах І хобно МАЗІ 150 жоїнк Мереї НВ пи ШИ соох Нева НІ - ї ше ЕН оф ві З « я сен г 7 з мас й Й в с КУ т Ше Сх а 5 Ши: ЧИЙ КУ «й ій нн 5 30 7 З 20 є ря хх їх ! 00 б 39 30 5 560 7009000 Час хв.)

Фіг. 7 Шаидкість дисоцію повтарно гуманізованих НЕНК-лВтитія ма Т-клітинах Над АВ іт х Я чек «фе ВМАБОЗІ рив ВО

В. кт тя зх БОРІВ ВРМСЮ, а У Я ем мом збе! ВІКИ КЕ г З їх о Ко ОЛЛИВКМЯВ Кп хво Ку. 2 у із і ШЕ я МОВ НУЄ СВК НК че Й ж ї ку дожиВ Ж ек, що и е ; шо ков вв в вд яв ік ше я чряк (хво) Швидкість дисаціації повторно гуканізованих НЕВЕ-внтитій на Т-клітинах ; І Нидс4-Аціу Ж я Ж З сеча СУДЕ шк я Ж сфе змаркм кр КУ х їж Ши з СКЖУММ СУ ЦЕ а М БАЧ одн ож зе ЕВ ОЗІ оду й ув ше й сей -Же МВВ НАР ОА АВ З в Й сенкан, до за САМО УМОВ СЯ сх ХХ 5 кн Й Ма КО Я х вдо ї в Шо Ж т іч " ре - ак і лек в Ку С С ВК В ШК час

Фіг. З няння нє є єн нн нн нн нн нн нн нн нн нн ни тн нин І З . ! Н ОСММІЕ ЕП зваж Н ; ; спккюннетнт ; орн я ; о во срете ще Е Н НН й Н зн ВОДОЛНКЦННИНН КН Н я КЕВр і аб па о ОВО В В В ВВ ВВ Н У ай ОН ПО и Я С ШУ о ІМ ОО о За іх ав ОКО о З няня У о.

ОВК ооо Ж Її ПО с Я шк с ОО ВХ ПО ОО їао рве не ще ЗВО ПВ ВО С ББВ, У М НН: С В НК С М З ОО ОМВК В хек сур МАФЗМ ОМВК: бФБе: жор ЖЕО Нерше БиЖИ БНЕБСЮ бе борбх ЕМ тю м Мотя сККЕАЮ о пкекай оо ки та БОМ У пк но їчкбже Ж мсоюіЖ ЖІ БУК МІ нак ОМ тм зх КК м , Я Золотий станда ну Батьківське Полісщеня не поліншене Аь туманізвнане АЬ гуманізованейо гуданізоване дО Н Се Не АСК, юні т ЗЕ ліве ІК у Ки : Н В : Н РОК І І М І М М : Н Я МИЦИК : і о оо и : Н ОН В : и : нн А М М ІМ А м Н ИКККК КК нн нн ОО аа ЯН Н А М В М п І В а НИ РОжм ОКО М М ярих Н ВИНИ р а А А на БОМ : ОО КК ОО В ака Н ОО ОО Н і В : А А М І М У : І М Н Н п М Н Ом А р А М : НЕ В В В В : Н блем уко піс олирменом см бу єму зйх кю пиши мебяю мкму : : позах ЕХ гзкопновних 32 ху помкднкомх у МКУ нями БК Кеклюуюи Я до, «МірряУюу : : ргнокнанісвочн ами ніша КО : І ха ОО Я Н : ОК М Я : : ОО М Я : : М о М : : КК ОО НН КК : : КЕ ОБО ОО КЕ КВ : но в и Я : пр і КК В М І Б : : м М М М М І : : ОНИ ОА ПН В ЗБ НИННИ Н дО ОКО КН КК ит : нн А а Н В ОО И с ОО и НІ ВИШ М які НЕТУ С. підт не о пкт НК КОКО ОО мн зрУУщУимнх ни І ОМ М М ті : о : : М ОО Я : : х ПЕ ОО я ММК ММ : : ІМ м А м и м мий мк и і и и в ик й й Б : : Я : : у РО М І М М М М : : о Н : ОО В В В В В В В В В КУ Н : п В В В В В Я : імщемх ОМА КеМУ ЛІ мес пе месму МИР УМО; «ОХЖ МКЄМУ сомфнумицх бобу :

ЄмНевер. Ас У. лев З, ЇХ зктряцир : Б По КК КК МК КК и ки Я М І ДУ о КК ПК В м М М : шо КИНЕ ОО КК : ОК КН : 3 МТМєМфоЕєМмрьє?3уМмМмМ М м мн Нр нн М нм мм : КЗ ОО : ЕВ НО ЕОЗ КО п ян ДОАОЮТ. ЗМК: 3 ММ М Нм сс сн М М М М М ММ ї , ин А А ОН Е ОО ОХ Є дк Ї їх КЕКВ КК ВК В КК лек з М М М В : Ж се БОООШНННННВ : г У ОМ В : х ОО В В В : а М а М : ООБЕНМЕ КК : А : нн М М М : Н З пи с: ка : Жкціюер, зняль т. сви іі: ПАХ : ке Н ПК ОО ОО : А : ен М М М Я : ОТ БОМ и : І В ох : хоч ВИН ОО : ї ПК КО : Ж у ДЕН В кв М нив МИ мет Ж КНУ З не ПККЙВКМ Я. м 3 КІ в М М М МН и Я Е ПО ОО ОО В НН х А : я М : МУ В : ОО м : ром і М І Ін в в в КК КК КК ОК : х З с рих З Н грому ЗА пасив, ЕПС кре реріи; Зрассое ох они Тита о ОО В ППШЛИНННННННН НК ТІ ПИВ Не о В В о В о КН Нео ОО и кн нн М М НН я о С У сани не 55 В Од М М М М М М М М М М М М НЯ ПДШННННу ПШПКНННННННННН Кв й ЕВ ПИ, ОО А ОК: ВН Б З НО З о В я МОМ ВІ ооо о В г. ПК ІЕПИПИИННнНннн г. КН с я зе ххх прп з зів хух «ху Море их й й лЕжчІТЕ : дума, КАК муресофрезвтеки стее те кою схо ЖИТА ШЕ М Кт т т : ПІШКИ ! М ти мМ : ШЕ М : Н р НН : КНИШ КК о в Її ж ях КЕ КК КА Ще НЯ В КОХ ТЗ ЗУ примх НІ М и АН ше о х ж ОО го Кг : ее В | о ВН Н КЕН НН КО М МОН ІНН Н ши ще ОКО их С НИ В | ОКО ВИ Н ПДК ОК : ооо о І: ВН: МОВ о КА Н ВО ВУ: ОКО Я Н ОО МИ ПО ' о а СТКООКЮВВ В КИ МАК ВХ Н ше мих як Мих век пк сою

Фіг. 12 пен п п вв Не М Н Н ПО ОО ! НО я КЕКВ КК Н ЕК я ОК Н РОКИ ОО ОО Н НИ У ПО ' 1: КЕКВ КЕ КОМ ВМ Н ОО НН я НІ ОО РОБКИ их Н МК в РОК ШО РООБИЖИНИМИИИИИ ХНН ПИЛ З 1 Ко ОХ МІ Н ЕОЕВЕКВ СК МУ НО КО ШК : Н есе «ралложюиюя пбехх рен В ім итоє ролеЯДАНя поса лама Н Со инипипциписпипНипцц шипи пипиЧицинНиниц МЕ УКВ УЯ КЕ ЛКК КК Н ОО Я ! ОО і З БКЕККОМКОК Я КО КК Н ОХ ОКОКОКООУ А ЗУ Н ПО Н ХО і ОО ОХ ЩІ днину во ПН КОЖ КАК ЖІ ДАК о Мамая ШЕ ХУ ХК з Н ПКЕЕ вв ї ЕЕ ВО ху х ї ОО ї с ПИ У НК НН ї ПК п. ПН ке . с КЕ НН З М Я І п М М ОО КО Н реавосии км жк скл ве Н Хелм прйлиитю пкт ро Н а а Он а нн пис о: нн ' Н КЕ ї ОКХ Мои опи тлрджниниинии вини нини ї Н ПО , ПК Я Н КОВО ОВ ВО В Ї ПО Е Н 7 НИК нн : ! В ї. Пе ї ПОБИВ МИ ВІК ПН Н ОО ОН НІ ОКХ ' КН фони ЕМ 1: МН РОД В Н РОБОДНЕК Н МО Н РОМНИ РО ВИНННиНн ' ГОМ ПЕООККК В НМ іОБОНМ Кн ! Н КИНЕ УНН ОБОВ ОК Н Н ОВК В КК 1 ТОКОХ С ДОВ СХ ЗХ ЗУ Н Н я осрадлавар вера нн 1 мили пк слини зо п ' Не п коки ну Тк хх 3: я . День 71У Б, ТЕМ гама ВО УКХ у ПО М М М М М М КК М А Б у М М М КА

І о. БОНН ВОНО р фі р ІВ А ПОННННКНКО МО А В ОС БИЙ п БЕК ШЕ нн ЕИПОНИННН ин ОКО 5 в ч КК: ВН КК ННи ОО НІ ВХ На; ШЕ ов ЗК КВ КН ИККннниння ВС ОЗ А НКУ є ОО ЕВ 3 ші 55 ШИ об сю БВ НК ВВ КО: НЕ КО ШЕ кауя : хАДКЕ тс ОО, ХУ ОО Б г " : ЯКЕ Я КВ КО КМ ПИ: : : ТЯ ПИ ВИКЕННИН:КИ Я ШУ ОХ У жо с Н І с: ЩЕ Я с МО КОНЕМ ОМ 1000 си ПК: о М Я ХО ЛЕ, я У : : 55 ск ОХ КОВО й ПЕН ПІ КОВО ПО : Во ПИ ПИШИ КОС ВЯ МНН КА ПЕ. ВО КЕ : 8 КЕ п ОХ КЗ о с: ШІ А : ско ; :

щ. чі гі пла й Чеовпюоблені ВМА тод нев Ав ня Аді Необроблені : Яаща ЗК Мч : День 71 КЕ, ІЕМ рама : : ЩО те : : юррРОІЗЦИВВВВОВОВВВООО ОО ОО М М В М НН В : : ОО : нн а М : зичу. А : ВК КЕ КК : КМИН о : КИШИИНЕИННИ КЕН нн З : М І І М М М НН МКФ МО В : : с КОКС ПЕН Кк ОН : тя : КЗ ІЗ, ОКХ КККЕ КЕ СКК Е КК КЕНЕ КВК Н : ММ МО ОО ОО до КІН ПЕК ОХ ПЕКИ : БОКУ ОО: ШИ ШИ КО о: п : В ВИ КЕН НН ННІ п Ще КЕКВ КК кс о МОМ БИ ру ПИ ня КО ШИ ЗНА З ПИ ОН М : КІ Ци ОКХ ШЕ ОКХ о КЕН сх : МА неволю СН ЗВ Ацу САМ Афу Неаброблені

Я Са» Т-кайквни і шин Н ї М М В , ШИШКНИНИН ИН ПН Н НВ 55555555 Н ІПН о Я Роо пюЮ КУНКово МН гм Кш КДИШИННИН ПО пет 1 а КЕННННННКК о Ко Й Ще ов КИШЕНІ ОВО М Я ркеррйаск Ії а мок МОБ ча вм їх СЕН ОО КЕКВ щи х ОВК ВВ М пане - БИЛИНИ ПОВ ВЯ ОО о ВИН КОД КН Я КЕНЕ ЕК КО З МЕН Пео о МНН Н ПРЕ ОХНЕ ВИ о МОВА МЕН і я КК ОВ М Бо п. М пе ' Н п ШО БОЮ нн ПО ВХ нн В Е 1 СК стиму Без стиму лк ї 3 Е Савмулйх писигенм Н ХЛ мо зд вну ува рох У ШУ лог веж І сх МАВ ТІОМА НКУ КТ ЗК ло дж

М. Кен КВ ню сн пи с пз ОП ва і їі зв | ' У Зх ; Вк п : «А ще Й ЖхКК І ххх лккхХКх БОЯ Ненінчовленнй Тдновлення "'язування Есув Ша лю Зв'язування Її СУКНЯ Людини БПовнорозківний: Сократ А Масвораз чен стале ЗА Зм'язуїхом гІХ Васко ЕВ знеоано у о влхвомини: ГеДН Не інею нвя З. «ПЕСВОНКЕКЕ Тс «ох поп «ФІ НКВКУ ни; хупнанх жк Не - кю кт С пе ох - са ши 1 сам Х уж пляцки х ке Є ї ТКА Ком ши ЖК хх НМ ТИЖ УМХ, шох НМ ТК щшОЖА, К ес ПММ МОущУИ М пек. з шк х уми кохоЄ зе ПИ М п ж що ее ІМУХЄЙИИИ пк Ме сяк хори шлях тов БУ КО кю що ШО трохи. п п отут, Пор ї о и їх У мок хо ох юс пжеоку чЗмиху вла? Фа мшенийе За'язуйкнии Дав ЕН лінклюмят Зв'япнокок Кеаббіаай Ву люкею я ОЕМ КВК у мутоніЗмИи «АЕС НК Не зу ММ хе ХУ ще ше с що рр: ших ле Я і ТС ЕК : я ке ПЕНЮ ОЧІ і ше ПрЕК з чі : пеня хо 3 пек МК хи х - ї с ПЕК й хе І пити ше ДАТІ Но ВКМ, ї й Кк не ЖЛИЖИТТККУ ВЕ ароанаммя де ї ОБОВ рака «дю тов ПО джен тторотортетотнотнтюсн х З хе мот косах жк м в Плєіт Тиссех. х Муже целслніях ха жання БЕК а чадним, закроема ДемУ КОЗЕЛ Іа тю ЕН, Я -

Фіг. 17 і Гесукі ше ; еще тру пе аа язування гсукі лЮдини їй чарок чЕнени ям Хо'я«уконовя ЄсуЕ ази зав нНЕВКі Звеаакнанвя КУН нин хек СН КАК Неї «луівягли м їн храм х М ти я нка щой ІЗ -е ше --ї

З. зве ; суч ци око 7 : се УКМИТУ х ік х Кз м тку їх пе ІК, р - снянноЙ -- ЗХЖЖ Хот - ше ся ПТУ к тики, ХОМ Бан п не МУКОЮ КМ Хода г 7 Що «ее ВЕК УКККМ В шок і не ВАЖКИХ МКК ре й з ПІЖАМИ 2 ! х лХ зе ВДВОХ МК ї Б їх лу : їй фран гу яке Аж і нин их Ше ШО шко З хм У ок що 2 хе всі хе кю Милеу Чак ще ; и . р т Дуже икопіки кож єваняя Бей мусантами. лтлюема ос аНе БОЧЯАЛИЗНХ, нн нн нн у нини нин нн но анна : хек 1: сх : 1: : Мо п Но ОО вв Пов ер ку ВК В КОКО ПВ УК косо ОК ІК пе а ВО ОВООКВКВВ З НЯ Ва ОХККМККК КК їж ВЕК АН НЕ ооо НН Іо КОКО КОКО ІМК пе ДУМА ІЙ МЕ КЕ С С ОД ПИ КОКО В ВВ І З вне о, І ЄВ п. їх зве я ООН В НВ о ІКОН КК о НВ М М : 2 ї Кк х я Я х КЗ : ся й В. х х У щі -Х : ре ИН и: Ко кН ни и НЕ кл нн : : хх - КхЯ 5 я С : Ох х КЗ Се щи ще я ї : Х к в я сей сс й : х 2 Й - ях у Ки І : у Кк 5 «7 : щ КК я Із Н : КУ х Х в : Е - КЗ о Й : х Е Є К- : Х Ба - ж ! : Ку : я Й панни ин ПІПЛЛЄДМАМ ти ї ме : ме 1 ХХ тонни ММ и ке і кто о НК М р М І І В В А В КК і Ж З МЕККА УМ ких п ОН ОО БО ЕКОН Н хх ОВО ОМ їх Те З За ОО В ІК ОО ТО що ОО КВ о о НН В ФВ КСО Ка ОВ ЧІ іо МЕНЯ СКУ КК КК а В Я: ЕМВ ХВ М НН А М А КІ І х х ке КУ х х Н Ки КУ Ся х х цк х Ж на п І НМ п ВН З Я ис и п НН НН КЗ : ЖЖ що Ся У ке ї КУ Н існу са Ка г є ї г : х Ка КЗ Я - К Н 2 КЗ - ке 5 КЕ я : х ї ші І: Ку в. - : 2 ще й й Ще ї «В й хе Н я -й х7 Ж р: т 7 КЗ КЗ : 3 Я г хх НН 3 Ж я хх нн НН М а ! м ЦЕ м і Ще о КК КК НКИ АН КИ А А А Кия я ж Ул ММ ММ ен ППП ДО СО В В о КК о нн А СОС С Осо оо ОО ОО ОО Н ОО ОВО ВО В Ве ООН Ка і па п В В : и ж ооо й по ОО ОО УКВ КМ АК АК КВ А Я р ОК Ме НАМ ПК ВО ОК В В В ШК ЕК еХ Мо ни ККУ УМ КК Чех ЗУ ВХ тя ММК КВК я и » х : х а ж ї дЕо « х КУ х і: ще С ЕЕ 2 х СУ з їх я й 2 х Х З є Еш З ЖЕ КЕ: Кк КУ а КЗ - Са гЗ «Є Ку КЗ є ш Н хо х Ка с Ка ке т п З» х Ки я й КЗ З І ву - кН ж ВУ г : ж СН 8 З Е ї 5 ї ше ще ! Ж КО ща С ХЕ ее в хх Н Х Є не с і ВЗ КЗ ру Бе ' Н х Кй й Ж Н З Е я Ж 1 ! Е ї аа аа нав м оо о оо о ооооввов ввоввовавов ввв вовк 17 В КОКО М ІІІ М НЯЯяЯям м НН 5 НН НН НН НМ НН нин. ПЕВ ТУ КОКО ооо й сен ПОС о, Н п ОО х КИ Се ПА ОККО ОО КО : с - х й сх ко я ох : Я що ож щ- Я БЕ ЗИ дО си и ПИ и НН: : Н ї й а КУ я Н Н х ї ІЗ : А Ка Кз і : З хх х уд Н

Фіг. 20 шт зойк НН Яке : Еко о о мово І ЖК те НИ І ОВ ОК КО БО КО В ГК ОК КК оо В ВК пон : Н Б 0000 ни не ОО оо 12 Те : ж шо с МК а З нн ее З ЕК УБООЄ ИН ЕОЗУ ОК а: ОО ОО НН В КЗ НМ есе Е Ху хо СКККЕКК ННІ КК М я ЧК Ко х З Н п ПН В М М КОМ Н -х и 2 х :. ех ще ах хх Ф х к х - а. -х її : з НН СН НН п В З п а п С В І ЗО п а в В З КОЖ я сш М ик пи НЕ Я а и м п п НЕ Н 3 В 7 г хе Що НЕ я У - Я М Х : Н Є КС Ж и К-Я С Ж я : Н 7 КУ СЕ ШЕ НИ х. в КЗ И : : и Е-Я Ку й НЕ їх Ки Є г Н Кент ситет ЖЖ ЖЕНЕ ж АЖ ЖЖ Ж Ж ня і ж ЖЖ ЖЖ Глен пл ложа ЕЕ Ку Алл АЖ ін дж жк Км г Б Н хе Н Н В ОВО ВВ ВВ ВК ОК ОВ ВВ ен ЗВО МАН ня ОО ІВ ТИХ Е ОО І Дн КАХ диня о М ЗОННЕЯ У ВВЕ ОМА КК НИЙ КОКО АК Ж і ня 5 Ве І ооо НЕ ОКО, А М НО А ла Мо М І ХМ АК ні | о К КО В Го пе я Ов М - ОО ФММ с в: і хо нев В АК БОМ ВК КИЕВ Но овен нн В ОК КВ ї СКАН ЕШВНКІ КС КОАААКХК МКК З ї Кя К- х я х КЗ ш я ях з з « . я Е ; Н и НН м: ЗІ Є Ко и У НН НН ІН ПИ ИН Н Хот ї- КУ й я я Ка Н ГЕ «Е КУ г Ку С ва Й Н Ф Ка З Ж Кя Ки й ї СЯ КК т Я я їй Ка Н НКУ я Ж НЕ СМ НЯ : 1 5 ї сі я 08 ся Н Моїх я к Я НН х Кз Ко. ко Н ? а; Н х : в а п

Фіг. 21 г : я пу М М М М й ОО ОВ ОО УДК С КИ ОО ОК М ОО М Я ДАВ КК Кв ее но а МАКИ ЕК и ОО мм КО а В В А КН КН І А, ОМ В КК КК ВО ск ОН ен о МОМ ВО В В ЕЕ В А КК ооо ос ОКУ в ДМК НК я ІЗ ХЕ їх ХХ ОК їх ї І МО ТАКЕ ПАК КМ АК ПО ОК ПОН НК б с а ОО КОКО КК ке ТЕНИ І о п НН МИ СЕК ОК З ЗХ ОВК КБ ОН Кн ВХ щу КК КОН Я а еВ ОККО ОК В У КВ КОН З МОХ ще и пи ще Пот й Н КУ су К. х х КУ а г К си х ке ри ку кі жк ин НЕ ЗШ по В Є І В о з п п п а п в От г Ж хх я Я Ко 1 (Я й я х КЗ Я з Є Н Б 7 Е в х Ж Не Я М і хи З Б Н х ак КЗ С НІ ї С Б КЗ Н ї Жах ох СИН : ву у КЗ кх НІ ГУ Ж в їх Н нн нн нн т А А А А А и А и и нн ун тен н несення ее РНН НАТАНА ТТН ТТ КЕН Мін Кекс енчечеечн, 1 «г Ї Морхух УУММ КМУ КК І БОМ я І хе НН Я ІК КСО ПИПИШИН НК Ми 5 МОМ МО ооо ОН ВО ЕН 0. Кн

1. У ни ще ОО ОН

1. с ОО и М М І УКХ КАК КК : сх сх ці А у я їх і ше же ПИ І в и я З її д Е х Ка КУ КО Я Н ї Х Ко КУ їх Н її Сл НЯ і ШЕУ Ж ож :

Фіг. 22 "жін деякою ке . ТАС. женпвююоме Я ех ЗАСН. лвекачякіно Т-клзюкк ТКАКЬК» Я некраВкк Ява хі; і й ве й х коза у ше к ота , Де: х Кол жожсу хе шу ї ях хе я і: Ж е их У р х. х щі ди г; У доз Я їх сіпеєкуюкиюу СВ ; Бе х хо В і: мук ІЗ г ш х М; ї й т ї вві Що . : ; і - З яння сн ; Боознннннннитн сен хе нини песня ми и п т вн ви: шт КО чле ро рвакко й б вн чилхек Я рі но са ВАК, ним к хну у «кокіяякх з КАСЕВ, ну кер р оасавнвк НАЕК ЕВ, зклхзуненкя 1 емо вах яке но чЕе- : Яржо Ж ол 1 Жов я вових чаї Ка ій х не тк « ГУ я яка х ІК . ча е Ж Ко ЖЕ іі із ся Я хз м Же й хх, « Н КЗ Ж У зі и Б их їх з ШЕрОкекчже шрот щі б ка т з Кована павввоовавн внвва наливання Б звана: панаво овен звволосввавноя 5. етері, х ї Б н х 3 ї х КУ нх ну 3 х т ку Ще КУ х а ІЗ КІ йх хя. зх ТИАСЖКВ» менту хо мето х зухюхкву сукня ТКАСЕЖ, невукнчожх НУЄ вх Немевнх КК Фа. ТИ КО, коню жом ко еюювкх Ехо ах и хкв . Ж и а же ко 24 Ки мо. кит хе СУЄ т їх шко; - Я СЕ: шо: : « х 5. я й Є 5 я й я с у т а ні ої ж пт - Е; нн ніна нин: и ик і мамев пами зак зва мне вне мим ни и інн! тя Ум Ж

ТИЖ. месоуювютх осуснккюх вккькя Кен КАЕ ЕН, хк'нхук юю их ьхиноме нічо ос РЕААЖІ, об'яв юю оранкою хбосеюсь хи ак ж ую Ж домом щожежи як «Хлнннк - ж Ко їх Я їх ки 1 ден в м» ще я Й С жк ди к х хе 2 Ж - ЖЕ к : 7 з ка - як - ско » як ко к й Мах з - х Ед ст , М Дно ВК оьнтоуютттосіототоя 2 х ж ях У є ї х 2 с 8 г х ї 2 Б г х і В х кк іх ТЕЗ уазажнкиті ПХТ му іст вові: Ко сосодсокь Аеменкхе ВАК пжкорюти ній ме соц гіховонк» ТКА КН кое ваой оо ом мм рми мес звань ау жжя легка юки «ел ї- 7 Кз щк У Фото ше й ск хо змен : ї щу полин БЖ бе Я Акне зо власит Ку ще реч зу зай х я Оля їх СУМНЕ кож я їх 7 пов. 7 х й ї КЕ Ех ке

Ко. Ж є Х в ї Же Й х г х ще р Кж х й х ї ге - шОуру рн сл м за ие пи З З Й офоооооажежнакажкжтжаккужжжк пткемонахеуюм «овочеві КО з Ки з хуужеммемихм А посімесівв КАНІВ на бе ооо о НН НЕККУНИ ес офі В ТОВ ТКА СВ же обі обу км юммемах ховмов хе АКНЕ КВК Н мк мнкні МКК жк, юки Знкнк Нв меню ксеза ек м. хху тари. ще Й РЕК й « волею щої ч я ломи ж дей хм «оА КЯ х о її де Її" я жа з «ех хх к. Є хв ко І ай Й т З Би Х 5 7 ї Ки Її я : 52 ре Ка Я с, Х з» ж х я Б х ще Як хе З ї ї посту х окснрпававаунк : Соки зи им мами ие шо г ІЗ ІЗ ІЗ Н кож У ІЗ х ї х й о 7 зем охх кчукеевовмм у: пік кмкнхкньмиехМ

Нед, ци: ВКОВхнвчев РІК дня ТЕху, пю ок м кує юю КЕН НМ Хі ну з Ваня й о. 8 й | Гу Я В З заст рек кі Ж І появ С Фк: І роса « вах ЖУКОВ НОВЕ ко х шах: ї | Ії Би БУКВ ЖІН Ех ЗК яй дим ЦП З ВЕЯННИЯ НЯ КИ КН - Ї зви ДН Зо ВЕ БА ВЕК жати ка пи Бо В ї В Во: і І В Ще я... ЗБК в й Яви ЖЕНЕ ве вив шани: ЕВ п КН жа БК ЧУ ше ЗИ ; 5. ЗА БІЩИВ ЗБ ММК я ве залий. ин ех Й г С г М ех «У З ке я викон ол ДЕЗИМИМИНКІ КУЖАКИУТЬ ГХКТІ

УК. з км Кк ВЕ ж ак і:

ЗБ. щі кефіхкнюто вх к-анивекких п снекмюм м оікенннмах ТК хв екнтькокккя РЖУК м укнвкахня тяж с те ща ї ло тк й д Мав Б Я ; зе: і яв те ЕЕ, ; зак: в таех) Ж зи | : ше ї ро пов осо БЕН к 4 Я: НАВ Ї ок Зх трутні ху в вач й вик з СПЕ ЯНВ акн КН хх вну ео- Я тов іх» КВННЯЯ еВ Я МИ сно но ЯН. А ОМН.. ВК НА па - с Ф хх кх - чи -ї перинуживомемякі Ме удохдевсю кум

Фіг. 25 й. Зм'ятуваюнн нед пл КТК Х су ЖЕ Ж Ж зов те рони М вв чен БАЯН їв п я я Во Ба 00 1 8о Ж Я ЗИ 555 408 56 550. Чат кі

В. Зк"ніхввюнк Без БЕ ян я т- 8 . С І дяки тв ою Кн З ю т в ! о Ж ак Н К гі ЕІ І З 4 1 о БООВМУдОЮВ я в в | я ще Пн -Б БО чБб оБб ЗО Я5Б) М З ік Мичзунтнині Кей заці Б що І ЕН Я пес КЕ т пеня ВОВНИ Олю - о

40. 0 80 5 Як сб об ЗИ 350 рак іє

Фіг. 26