TWI844587B

TWI844587B - Aav病毒載體及其用途

Info

Publication number: TWI844587B
Application number: TW108143173A
Authority: TW
Inventors: 詹姆士麥可哈特菲爾德; 羅伯特艾彌爾賀智; 道格拉斯費爾特納; 約瑟夫貝利迪爾; 馬修馬利吉歐立; 布萊恩Ｋ凱斯柏; 艾倫亞曼凱斯柏
Original assignee: 瑞士商諾華公司
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2024-06-11
Also published as: AU2019389047A1; TW202039859A; EP3886919A1; CN113226380A; WO2020113034A1; US20220001028A1; MX2021006359A; KR20210099025A; JP2022511776A; IL282885A; CA3116630A1; BR112021009739A2

Abstract

本文中揭示包含AAV9病毒載體之組合物及使用其治療SMA患者，例如II型及III型脊髓性肌萎縮(SMA)患者之方法。

Description

AAV病毒載體及其用途

本發明係關於病毒顆粒之組合物及用途。

腺相關病毒(AAV)為細小病毒科(parvoviridae)家族之成員。AAV基因組包含長度為約4.7千鹼基(kb)之直鏈單股DNA分子，其具有編碼非結構性Rep (複製)及結構性Cap (衣殼)蛋白質之兩個主要開放閱讀框架。兩個順式作用反向末端重複(ITR)序列與AAV編碼區側接，該等反向末端重複(ITR)序列之長度為約145個核苷酸，具有間雜的回文序列，該等回文序列可摺疊成髮夾結構，其在DNA複製之起始期間充當引子。除其在DNA複製中之作用以外，已證實ITR序列在病毒整合、自宿主基因組之救援及病毒核酸衣殼化成成熟病毒粒子中起作用(Muzyczka, (1992) Curr. Top. Micro. Immunol. 158:97-129)。

存在AAV之多種血清型且提供不同的組織向性。已知的血清型包括例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及AAV11。AAV9描述於中美國專利案第7,198,951號及Gao等人, J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)中，其以全文引用之方式併入本文中。AAV6及AAV8之遞送之發展使得有可能在簡單的全身性靜脈內或腹膜內注射之後進行骨骼及心肌之由此等血清型進行之轉導。參見Pacak等人, Circ. Res., 99(4): 3-9 (2006)及Wang等人, Nature Biotech. 23(3): 321-8 (2005)。但使用AAV靶向中樞神經系統內之細胞類型需要外科實質內注射。參見Kaplitt等人, 「Safety and tolerability of gene therapy with an adeno-associated virus (AAV) borne GAD gene for Parkinson's disease: an open label, phase I trial」 Lancet, 369:2097-2105；Marks等人, 「Gene delivery of AAV2-neurturin for Parkinson's disease: a double-blind, randomized, controlled trial」 Lancet Neurol 9:1164-1172；及Worgall等人, 「Treatment of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis by CNS administration of a serotype 2 adeno-associated virus expressing CLN2 cDNA」 Hum Gene Ther, 19(5):463-74。

AAV血清型2 (AAV2)基因組之核苷酸序列呈現於Srivastava等人, J Virol, 45: 555-564 (1983)中，如由Ruffing等人, J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994)校正。指導病毒DNA複製(rep)、衣殼化/封裝及宿主細胞染色體整合之順式作用序列包含於ITR內。三種AAV啟動子(針對其相關映射位置命名為p5、p19及p40)驅動編碼兩個AAV內部開放閱讀框架之rep及cap基因的表現。兩個rep啟動子(p5及p19)，與單個AAV內含子之差異性剪接(在核苷酸2107及2227處)偶合，引起自rep基因產生四種rep蛋白質(rep 78、rep 68、rep 52及rep 40)。rep蛋白質具有最終負責複製病毒基因組的多種酶特性。cap基因由p40啟動子表現，且其編碼三種衣殼蛋白VP1、VP2及VP3。替代性剪接及非共同轉譯起始位點負責產生三種相關之產生。單個共同聚腺苷酸化位點係位於AAV基因組之映射位置95處。AAV之生命週期及遺傳評述於Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)中。

來源於AAV之載體對於遞送遺傳物質而言尤其有吸引力，因為(i)其能夠感染(轉導)廣泛多種未分裂及分裂細胞類型，包括肌纖維及神經元；(ii)其不具有病毒結構性基因，藉此消除對病毒感染之天然宿主細胞反應，例如干擾素介導之反應；(iii)野生型病毒從未與人類中之任何病變相關聯；(iv)與野生型AAV相比，其能夠整合至宿主細胞基因組中，複製缺陷型AAV載體通常保持呈游離基因體形式，因此限制致癌基因之插入性突變誘發或活化之風險；及(v)與其他載體系統相比，AAV載體不觸發顯著免疫反應(參見ii)，因此實現治療性轉基因之長期表現(限制條件為其基因產物不被排斥)。

自互補腺相關載體(scAAV)為自天然存在之腺相關病毒(AAV)工程改造之用於基因療法之病毒載體。ScAAV稱為「自互補」，因為編碼區已經設計以形成分子內雙股DNA模板。標準AAV基因組生命週期之限速步驟涉及第二股合成，因為典型的AAV基因組為單股DNA模板。然而，scAAV基因組並非如此。在感染時，而非等待細胞介導之第二股之合成，scAAV之兩個互補的半部分將結合以形成一個雙股DNA (dsDNA)單元，其準備好立即進行複製及轉錄。

脊髓性肌萎縮(SMA)為由染色體5q13上之運動神經元存活1基因(SMN1)之損失或突變引起之神經發生性病症，該損失或突變引起SMN蛋白質含量降低及運動神經元之選擇性功能障礙。SMA為常染色體隱性、早期兒童疾病，其在活嬰兒中之發病率為1:10,000。Sugarman等人, 「Pan-ethnic carrier screening and prenatal diagnosis for spinal muscular atrophy: clinical laboratory analysis of ＞72,400 specimens」 European journal of human genetics, 20(1): 27-32。SMA之所有形式在遺傳中為常染色體隱性且由運動神經元存活1基因(SMN1)之缺失或突變引起。人類亦具有SMN1基因之第二、幾乎一致的複本，稱為SMN2。SMN1及SMN2基因皆表現SMN蛋白質，然而，由SMN2產生之功能性全長蛋白質之量遠低於(達到10-15%)由SMN1產生之量。儘管SMN2不能完全補償SMN1基因之損失，但具有SMA之較輕度的形式之患者通常具有更高的SMN2複本數。在由Feldkotter等人進行值大型早期研究中，SMN2之2個複本對於產生I型SMA為97%預測性，SMN2之3個複本對於產生II型SMA為83%預測性，且SMN2之4個複本對於III型SMA為84%預測性。Feldkotter等人, 「Quantitative analyses of SMN1 and SMN2 based on real-time lightCycler PCR: fast and highly reliable carrier testing and prediction of severity of spinal muscular atrophy」 American Journal of Human Genetics, 70(2): 358-368。因為此等百分比不反映修飾因子突變之可能的影響，其可能潛在反映複本數(在不存在遺傳修飾因子之情況下)與臨床表型之間的關係。在113名患有I型SMA之患者中，9名具有一個SMN2複本之患者存活＜11個月，94名具有兩個SMN2複本之患者中之88名存活＜21個月，且10名具有三個SMN2複本之患者中之8名存活33-66個月。

I型SMA為由遺傳疾病引起之嬰兒死亡之主要原因。疾病嚴重程度及臨床預後取決於SMN2之複本數。在其最常見及嚴重的形式(I型)中，在生命的前幾個月觀測到低張症及進行性虛弱，在年齡為6個月時引起診斷且接著在兩歲時由於呼吸衰竭而死亡。I型SMA為嬰兒死亡之主要遺傳原因。I型SMA中之運動神經元損失在產後早期較顯著(或可能甚至在產前開始)，且患者從未實現獨立坐立。I型SMA患者通常具有1或2個SMN2基因之複本。相比之下，II型SMA在最初18個月內顯現，且罹患此病狀之兒童能夠在無需幫助之情況下保持坐立，但從未獨立行走。II型SMA患者通常具有3個SMN2基因之複本。III型SMA患者實現獨立行走之能力。在III型量規下，IIIa型患者通常在＜3歲時顯現出疾病發作，而IIIb型患者在3歲之後發作。II型及III型SMA患者之運動神經元似乎在發育期間調整及補償且持續至成年人壽命。III型SMA患者通常具有3或4個SMN2基因之複本。來自各種神經生理及動物研究之結果證實在胚胎期及產後早期之運動神經元之早期損失。Swoboda等人, 「Natural history of denervation in SMA: relation to age, SMN2 copy number, and function」 Annals of neurology 57(5): 704-12；Le等人, 「Temporal requirement for high SMN expression in SMA mice」 Human molecular genetics, 20(18): 3578-91；Farrar等人, 「Corticomotoneuronal integrity and adaptation in spinal muscular atrophy」 Archives of neurology, 69(4): 467-73。

II型及III型SMA患者具有相對穩定的臨床病程。此外，研究表明結果差異與實現兒童生長期間之運動神經元調整及補償且持續至成年人壽命的SMN2複本之數目相關。此與其中運動神經元損失在產後早期顯著(或甚至可能自產前開始，尤其對於在生命之前三個月之I型SMA患者)之I型SMA不同。已證實SMN之過表現在小鼠及非人類靈長類動物中良好耐受，且在人類之高SMN2複本數中不具有風險(如在具有高SMN2複本數之II型、III型及IV型患者中所見)。提高SMA患者中之SMN (例如II型及III型SMA)含量提供一種治療選項。

迄今為止，SMA (例如II型及III型SMA)中之治療成果主要集中於小分子提高SMN含量之潛力。此等小分子包括脫乙醯基酶抑制劑，諸如丙戊酸、丁酸鈉、丁酸苯基酯及曲古黴素A (trichostatin A)。此等試劑活化SMN2啟動子，引起SMA動物模型中全長SMN蛋白質增加，其目的在於針對在III型SMA患者中發現之較輕度的特徵修飾疾病表型。Riessland等人, 「SAHA ameliorates the SMA phenotype in two mouse models for spinal muscular atrophy」 Human molecular genetics, 19(8): 1492-506；Dayangac-Erden等人, 「Carboxylic acid derivatives of histone deacetylase inhibitors induce full length SMN2 transcripts: a promising target for spinal muscular atrophy therapeutics」 Arch Med Sci, 7(2): 230-4 2011。

使用若干種此等試劑(最值得注意的是丁酸苯基酯、丙戊酸及羥基脲)之臨床試驗未產生足夠的臨床益處。Darbar等人, 「Evaluation of muscle strength and motor abilities in children with Type II and III spinal muscle atrophy treated with valproic acid」 BMC Neurol, 11: 36; www.ClinicalTrials.gov。FDA最近批准諾西那生(nusinersen)，一種反義寡核苷酸(ASO)藥物，其經設計以藉由調節SMN2基因之剪接，藉此補償潛在遺傳缺陷來提高SMN蛋白質之產量。臨床研究已證實某種程度的改良運動功能之前景；然而，必須以每季度為基礎經由鞘內注射無限期地投與治療，在實現有效性之前需要冗長的誘導期，且具有需要臨床監測之安全性考慮因素。因此，仍需要使用替代物(諸如本文中揭示之替代物)之經改良之SMA (包括II型及III型SMA)之治療。

本文中揭示包含AAV9病毒載體之組合物及使用其治療SMA，例如II型及III型SMA患者之方法。在一些實施例中，該等方法包含鞘內注射具有修飾SMA (例如II型及III型SMA表現型)之能力的AAV9病毒載體，例如引起較輕度的疾病進程、停止疾病進程及/或改良之功能性發育。

本發明提供應用於治療SMA (例如II型或III型SMA)之組合物及方法。重組病毒載體，例如本文中揭示之表現SMN轉基因之scAAV，可提供用於提高SMN含量之治療方法。因為SMN轉基因較小，因此其可由scAAV有效封裝，實現與原型單股AAV病毒載體相比較低的病毒效價。然而，通常在較晚的年齡診斷出II型及III型SMA患者，此時其可能太大而不能接受安全及有效的基於體重之rAAV之靜脈內劑量。因此，鞘內投藥，其中AAV病毒載體通過血腦障壁直接遞送至腦脊髓液，可提供安全及有效的用於轉移較低病毒效價之替代性方式。

本發明提供治療有需要之患者中之SMA (例如II型或III型脊髓性肌萎縮SMA))之方法，其包含鞘內投與包含編碼運動神經元存活(SMN)蛋白質之聚核苷酸之AAV9病毒載體，其中病毒載體係以約1×10¹³ vg - 5×10¹⁴ vg之劑量投與。在一個此類實施例中，AAV9病毒載體包含經修飾之AAV2 ITR、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)即刻/早期強化子、經修飾之SV40晚期16S內含子、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號及未經修飾之AAV2 ITR。在另一實施例中，聚核苷酸編碼SEQ ID NO:2之SMN蛋白質。在另一實施例中，AAV9病毒載體包含SEQ ID NO:1。在一些實施例中，患者在投藥時年齡為六個月或更大。在其他實施例中，患者在投藥時年齡為24個月或更小，視情況年齡在6個月與24個月之間。在其他實施例中，患者在投藥時年齡為60個月或更小，視情況年齡在24個月與60個月之間。在一些實施例中，AAV9病毒載體係以約5.0×10¹³ vg - 3.0×10¹⁴ vg之劑量投與。在一些實施例中，AAV9病毒載體係以至多約6.0×10¹³ vg之劑量投與。在一些實施例中，AAV9病毒載體係以約6.0×10¹³ vg之劑量投與。在一些實施例中，AAV9病毒載體係以至多約1.2×10¹⁴ vg之劑量投與。在一些實施例中，AAV9病毒載體係以約1.2×10¹⁴ vg之劑量投與。在一些實施例中，AAV9病毒載體係以至多約2.4×10¹⁴ vg之劑量投與。在一些實施例中，AAV9病毒載體係以約2.4×10¹⁴ vg之劑量投與。

在一些實施例中，AAV9病毒載體係以包含約1.0×10¹³ vg - 9.9×10¹⁴ vg之單位劑量投與。在一些實施例中，AAV9病毒載體係以包含約1.0×10¹³ vg - 5.0×10¹⁴ vg之單位劑量投與。在一些實施例中，AAV9病毒載體係以包含約5.0×10¹³ vg - 3.0×10¹⁴ vg之單位劑量投與。在一些實施例中，AAV9病毒載體係以包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量投與。在一些實施例中，AAV9病毒載體係以包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量投與。在一些實施例中，AAV9病毒載體係以包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量投與。

在一些實施例中，患者包含雙對偶基因SMN1 無效突變或不活化缺失，視情況其中突變包含SMN1 之外顯子七之缺失。在一些實施例中，患者具有三個SMN2 之複本。在一些實施例中，患者在至少一個SMN2 基因之複本上之外顯子7中不具有c.859G＞C取代。在一些實施例中，藉由一或多種基因組測試來確定有需要之患者。在一些實施例中，患者在年齡為約12個月之前顯現出疾病發作。在一些實施例中，患者在投藥時具有在無需幫助之情況下坐立約10秒或更長時間之能力，但不能站立或行走。在一些實施例中，患者在投藥時具有在無需幫助之情況下坐立之能力，例如由世界衛生組織多中心生長參考研究(World Health Organization Multicentre Growth Reference Study；WHO-MGRS)標準定義。在一些實施例中，患者在投藥之後具有在無支撐情況下站立至少約三秒之能力，例如由Bayley Scales of Infant and Toddler Development®定義，例如在投藥之後評估約1-24個月，例如12個月。在一些實施例中，患者在投藥之後具有在無輔助情況下行走之能力，例如由Bayley Scales of Infant and Toddler Development®定義，例如在投藥之後評估約1-24個月，例如約12個月。在一些實施例中，患者在投藥之後具有獨立地行走至少五步之能力，例如由Bayley Scales of Infant and Toddler Development®定義，如在投藥之後評估約1-24個月，例如約12個月。在一些實施例中，患者在治療之後展示自治療時之基線量測值之變化，例如由Bayley Scales of Infant and Toddler Development®定義，如在投藥之後評估約1-24個月，例如約12個月。

在一些實施例中，患者在投藥之後不具有嚴重的脊柱側彎，例如在X射線檢驗時顯而易見的脊椎≥50°彎曲，如在投藥之後評估約1-24個月，例如約12個月。在一些實施例中，患者未禁忌脊椎穿刺程序或鞘內療法之投藥。在一些實施例中，患者先前未經歷脊柱側彎修復手術或程序，且視情況其中患者在投藥之後6個月至3年內，例如1年內未經歷脊柱側彎修復手術或程序。在一些實施例中，患者在投藥之前及/或之後無需使用侵入性通氣支持。在一些實施例中，患者在投藥之前不具有獨立站立或步行之歷史。在一些實施例中，患者在投藥之前及/或之後未使用胃飼管。在一些實施例中，患者在治療時不具有活性病毒感染(包括人類免疫缺陷病毒(HIV)或對B型或C型肝炎或茲卡病毒(Zika virus)呈血清學陽性)。在一些實施例中，患者在投藥之前四週內未患有嚴重的非肺部/呼吸道感染(例如腎盂腎炎或腦膜炎)。在一些實施例中，患者在投藥之前未患有伴隨疾病，例如重度腎或肝損傷、已知的癲癇發作、糖尿病、特發性低鈣尿症或症狀性心肌病。在一些實施例中，患者在投藥之前不具有細菌腦膜炎或腦部或脊髓疾病之病史。在一些實施例中，患者在投藥之前不具有已知的對普賴蘇穠(prednisolone)或其他糖皮質類固醇或賦形劑之過敏性或過敏反應。在一些實施例中，患者在投藥之前不具有已知的對碘或含碘產品之過敏性或過敏反應。在一些實施例中，患者未使用藥物治療肌病或神經病。在一些實施例中，患者在投藥之前3個月內未接受免疫抑制性療法、血漿清除術、免疫調節劑，諸如阿達木單抗(adalimumab)。

在一些實施例中，患者在投藥之前具有等於或低於1:25、1:50、1:75或1:100之抗AAV9抗體效價，例如藉由ELISA結合免疫分析法測定。在一些實施例中，患者在投藥之前具有以下中之一或多者：小於正常值上限之約3倍之γ-麩胺醯基轉移酶、小於約3.0 mg/dL之膽紅素含量、小於約1.0 mg/dL之肌酐含量、在約8-18 g/dL之間的Hgb含量及/或小於約20000個/mm³ 之白血球計數。在一些實施例中，患者在投藥之前尚未接受意欲治療SMA之研究性或經批准之化合物產品或療法。在一些實施例中，其中AAV9病毒載體與造影劑共同投與，視情況其中造影劑包含碘海醇(iohexol)。在一些實施例中，所投與之造影劑之體積為約1.0-2.0 mL，例如約1.5 mL，視情況其中在投藥之前將造影劑與AAV9病毒載體混合，例如在投藥之前少於24小時、少於12小時、少於6小時、少於5小時、少於4小時、少於3小時、少於2小時、少於1小時、少於30分鐘或在即將投藥之前。在一些實施例中，依序投與造影劑及AAV9病毒載體，例如其中首先投與(例如鞘內)造影劑且在投與造影劑之後投與(例如鞘內)AAV9病毒載體。在一些實施例中，依序投與造影劑及AAV9病毒載體，例如其中首先投與(例如鞘內)AAV9病毒載體且在投與AAV9病毒載體之後投與(例如鞘內)造影劑。在其中依序投與AAV9病毒載體及造影劑之實施例中，在彼此間隔2小時內、1小時內、45分鐘內、30分鐘內、15分鐘內、10分鐘內或5分鐘內投與AAV9病毒載體及造影劑之投藥。在一些實施例中，其中向患者投與之AAV9病毒載體及造影劑之總體積不超過約10 mL、約9 mL或約8 mL。在一些實施例中，該方法進一步包含鎮靜或麻醉。在一些實施例中，患者在AAV9病毒載體之投藥期間及/或之後處於垂頭仰臥位(Trendelenburg position)。在一些實施例中，在投與AAV9病毒載體之後，使患者處於頭向下傾斜約30°保持約10-60分鐘，例如約15分鐘。

在一些實施例中，在投與AAV9病毒載體之前，向患者投與口服類固醇至少約1-48小時，例如約24小時。在一些實施例中，在投與病毒載體之後，向患者投與口服類固醇保持至少約10-60天，例如約30天。在一些實施例中，每天一次投與口服類固醇。在一些實施例中，每天兩次投與口服類固醇。在一些實施例中，在投與病毒載體之後監測患者之ALT及/或AST含量，且其中在30天之後繼續投與口服類固醇直至AST及/或ALT含量低於正常值上限之兩倍或低於約120 IU/L。在一些實施例中，在投與AAV9病毒載體之後監測患者之T細胞反應程度，且其中在30天之後繼續投與口服類固醇直至來自患者之樣品(例如血液樣品)中之T細胞反應降低至低於100個斑點形成細胞(SFC)/10⁶ 個外周血液單核細胞(PBMC)。

在一些實施例中，以約1 mg/kg之劑量投與口服類固醇。

在一些實施例中，在AST及ALT低於正常值上限之兩倍或低於約120 IU/L之後逐漸減少口服類固醇。在一些實施例中，逐漸減少包含使增量逐步變成約0.5毫克/公斤/天保持2週，接著變成約0.25毫克/公斤/天再保持2週。在一些實施例中，以約1 mg/kg之劑量投與口服類固醇保持30天，且接著逐漸減少至0.5毫克/公斤/天保持2週，接著以約0.25毫克/公斤/天再保持2週。在一些實施例中，口服類固醇為普賴蘇穠或等效物。

在一些實施例中，使用Bayley Scales of Infant and Toddler Development®量表及/或哈默史密斯功能性運動擴展量表(Hammersmith Functional Motor Scale-Expanded；HFMSE)測定治療功效。在一些實施例中，該方法進一步包含與AAV9病毒載體之投藥同時或依序向患者投與第二治療劑。在一些此類實施例中，第二治療劑包含肌肉增強劑或神經保護劑。在其他此類實施例中，第二治療劑包含靶向SMN1 及/或SMN2 之一或多種反義寡核苷酸。在一些實施例中，第二治療劑包含諾西那生(nusinersen)及/或司他莫單抗(stamulumab)。在一些實施例中，其中使用ddPCR量測AAV9病毒載體基因組之量。在一些實施例中，患者在投藥之後具有等於或高於1:25、1:50、1:75或1:100之抗AAV9抗體效價，例如藉由ELISA結合免疫分析法測定，且監測約1-8週或直至效價降低至低於1:25、1:50、1:75或1:100。在一些實施例中，患者在投藥之後具有等於或高於1:25、1:50、1:75或1:100之抗AAV9抗體效價，例如藉由ELISA結合免疫分析法測定，且投與類固醇(例如普賴蘇穠)直至效價降低至低於1:25、1:50、1:75或1:100。在一些實施例中，在投藥之前，患者之血小板計數高於約67,000個細胞/毫升或高於約100,000個細胞/毫升，或高於約150,000個細胞/毫升。在一些實施例中，在投藥之後，患者之血小板計數低於約67,000個細胞/毫升，或低於約100,000個細胞/毫升，或低於約150,000個細胞/毫升，且監測約1-8週或直至血小板計數增加至約67,000個細胞/毫升，或高於約100,000個細胞/毫升，或高於約150,000個細胞/毫升。在一些實施例中，在投藥之後，患者之血小板計數低於約67,000個細胞/毫升且藉由血小板輸注來治療。在一些實施例中，患者在投與AAV9病毒載體之前具有正常肝功能。在一些實施例中，患者在投藥之前具有小於約8-40 U/L之肝轉胺酶含量。

在一些實施例中，肝轉胺酶係選自AST、ALT及其組合。在一些實施例中，AAV9病毒載體呈適用於鞘內投藥之醫藥調配物形式。

本發明亦提供AAV9病毒載體之用途，其係用於根據本文中所描述之方法治療SMA，例如II型或III型脊髓性肌萎縮(SMA)。

本發明提供一種醫藥組合物，其包含AAV9病毒載體及適用於鞘內投藥之醫藥學上可接受之載劑，其中AAV9病毒載體包含經修飾之AAV2 ITR、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)即刻/早期強化子、經修飾之SV40晚期16S內含子、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號及未經修飾之AAV2 ITR。在一些實施例中，聚核苷酸編碼SEQ ID NO:2之SMN蛋白質。在一些實施例中，AAV9病毒載體包含SEQ ID NO:1。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含造影劑。在一些實施例中，對比劑以約1.0-2.0 mL，例如約1.5 mL之量存在。

在一些實施例中，AAV9病毒載體及造影劑之總體積不超過約10 mL、約9 mL或約8 mL。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含其他治療劑。在一些實施例中，醫藥組合物係用於本文中所描述之任一種治療方法。

在一些實施例中，醫藥組合物為包含約1.0×10¹³ vg - 9.9×10¹⁴ vg之單位劑量。在一些實施例中，醫藥組合物為包含約1.0×10¹³ vg - 5.0×10¹⁴ vg之單位劑量。在一些實施例中，醫藥組合物為包含約5.0×10¹³ vg - 3.0×10¹⁴ vg之單位劑量。

在一些實施例中，醫藥組合物為包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量。在一些實施例中，醫藥組合物為包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量。在一些實施例中，醫藥組合物為包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量。

在一些實施例中，醫藥組合物包含以下中之至少一者：(a)約pH 7.7-8.3，(b)約390-430 mOsm/kg，(c)每個容器中尺寸≥25 µm之顆粒少於約600個，(d)每個容器中尺寸≥10 µm之顆粒少於約6000個，(e)約1.7×10¹³ - 5.3×10¹³ vg/mL基因組效價，(f)每1.0×10¹³ vg之感染效價為約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU，(g)每1.0×10¹³ vg之總蛋白質為約100-300 µg，(h)Pluronic F-68含量為約20-80 ppm，(i)相對效能為約70-130%，(j)在7.5×10¹³ vg/kg之劑量下，SMNΔ7小鼠模型中之中值存活期大於或等於24天，(k)小於約5%空衣殼，(l)且總純度大於或等於約95%，及(m)小於或等於約0.13 EU/mL內毒素。

在一些實施例中，醫藥組合物包含以下條件中之至少一者：(a)每1.0×10¹³ vg小於約0.09 ng全能核酸酶(benzonase)，(b)小於約30 µg /g (ppm)銫，(c)約20-80 ppm泊洛沙姆(Poloxamer)188，(d)每1.0×10¹³ vg小於約0.22 ng BSA，(e)每1.0×10¹³ vg小於約6.8×10⁵ pg殘餘質體DNA，(f)每1.0×10¹³ vg小於約1.1×10⁵ pg殘餘hcDNA，(g)每1.0×10¹³ vg小於約4 ng rHCP，(h)約pH 7.7-8.3，(i)約390-430 mOsm/kg，(j)每個容器中尺寸≥25 µm之顆粒少於約600個，(k)每個容器中尺寸≥10 µm之顆粒少於約6000個，(l)約1.7×10¹³ - 5.3×10¹³ vg/mL基因組效價，(m)每1.0×10¹³ vg之感染效價為約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU，(n)每1.0×10¹³ vg之總蛋白質為約100-300 µg，(o)相對效能為約70-130%，及(p)小於約5%空衣殼。

在一些實施例中，本文中所描述之方法或組合物之用途引起與先前投藥分數相比，哈默史密斯功能性運動擴展量表之分數改良。在一些實施例中，本文中所描述之方法或組合物之用途引起與先前投藥分數相比，Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, 第三版(Bayley®-III)之分數改良。

相關申請案 本申請案主張2018年11月30日提交之美國臨時專利申請案第62/773,894號及2019年4月17日提交之美國臨時專利申請案第62/835,242號之優先權。此等申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。

序列表 本申請案含有序列表，其已以ASCII格式以電子方式提交且其全部內容以引用之方式併入本文中。該ASCII複本於2019年11月12日創建，名為14452_0025-00304_SL.txt且大小為14,833個位元組。

為了更好地理解本發明，本文中論述某些例示性實施例。此外，論述某些術語以幫助理解。

在一些實施例中，「載體」意指任何基因元件，諸如質體、噬菌體、轉位子、黏質體、染色體、病毒、病毒粒子等，其能夠在與適當的控制元件結合時複製且其可在細胞之間轉移基因序列。因此，該術語包括選殖及表現媒劑，以及病毒載體。

在一些實施例中，「AAV載體」意指來源於腺相關病毒血清型之載體，包括(但不限於)AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8及AAV-9。AAV載體可具有一或多個AAV野生型基因之整體或部分缺失，例如rep及/或cap基因，但保留功能性側接ITR序列。功能性ITR序列為AAV病毒粒子之救援、複製及封裝所必需的。因此，AAV載體在本文中定義為至少包括用於實現病毒之複製及封裝之cis (例如功能性ITR)中之序列。ITR無需為野生型核苷酸序列且可變化，例如藉由核苷酸之插入、缺失或取代，只要序列實現功能性救援、複製及封裝即可。在一個實施例中，載體為AAV-9載體，具有AAV-2衍生之ITR。又，「AAV載體」意指蛋白質殼或衣殼，其提供用於將載體核酸遞送至目標細胞之細胞核之有效媒劑。

在一些實施例中，「scAAV」意指自互補腺相關病毒(scAAV)，其為用於基因療法之自天然存在之腺相關病毒(AAV)工程改造之病毒載體。scAAV稱為「自互補」，因為編碼區已經設計以形成分子內雙股DNA模板。

在一些實施例中，「重組病毒」意指以遺傳方式改變(例如藉由向顆粒中添加或插入異源核酸構築體)之病毒。「重組」可縮寫為「r」，例如rAAV可指重組AAV。如本文中所使用，術語「AAV」意欲涵蓋「重組AAV」或「rAAV」。

在一些實施例中，「AAV病毒粒子」意指完整的病毒顆粒，諸如野生型(wt)AAV病毒顆粒(包含與AAV衣殼蛋白包衣結合之線形、單股AAV核酸基因組)。在此方面，任一種互補含義之單股AAV核酸分子，例如「有義」或「反義」股，可封裝至任一個AAV病毒粒子中且兩個股皆為感染性。

在一些實施例中，術語「重組AAV病毒粒子」、「rAAV病毒粒子」、「AAV載體顆粒」、「完全蛋白殼」及「完全顆粒」在本文中定義為包括AAV蛋白質殼之感染性、複製缺陷型病毒，包裹在兩側上由AAV ITR側接之相關異源核苷酸序列。rAAV病毒粒子在適合的宿主細胞中產生，該宿主細胞之序列指定AAV載體、AAV輔助功能及引入其中之附屬功能。以此方式，使得宿主細胞能夠編碼AAV多肽，該等多肽係用於實現將AAV載體(含有相關重組核苷酸序列)封裝至感染性重組病毒粒子顆粒中以用於後續基因遞送。

除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語皆具有與一般熟習此項技術者通常所理解相同的含義。本文中所引用之所有參考文獻皆以全文引用之方式併入。在參考文獻中之術語或論述內容與本發明衝突之情況下，應以本發明為準。

如本文中所使用，除非上下文另外明確規定，否則字組之單數形式亦包括複數形式；作為實例，術語「一(a/an)」及「該」應理解為單數或複數。舉例而言，「元件」意謂一或多個元件。除非特定上下文另外指示，否則術語「或」應意謂「及/或」。

術語「包含(comprising)」或諸如「包含(comprises)」之變化形式應理解為暗示包涵所陳述之要素、整數或步驟，或要素、整數或步驟之群，但不排除任何其他要素、整數或步驟，或要素、整數或步驟之群。貫穿本說明書，字組「由……組成(consisting of)」或諸如「由……組成(consists of)」之變化形式應理解為暗示包涵所陳述之要素、整數或步驟，或要素、整數或步驟之群，且不排除任何其他要素、整數或步驟，或要素、整數或步驟之群。貫穿本說明書，字組「基本上由……組成(consisting essentially of)」或諸如「基本上由……組成(consists essentially of)」之變化形式應理解為暗示包涵所陳述之要素、整數或步驟，或要素、整數或步驟之群，及任何其他不實質上影響本發明及/或申請專利範圍之基本及新穎特性之要素、整數或步驟，或要素、整數或步驟之群。

約可理解為在所述值之+/-10%，例如+/-10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%內。在關於百分比值使用時，「約」可理解為在±1%內(例如「約5%」可理解為在4%-6%內)或在±0.5%內(例如「約5%」可理解為在4.5%-5.5%內)。除非上下文另外明確說明，否則本文中所提供之所有數值均皆由術語「約」修飾。本文中所使用之所有範圍皆涵蓋端點。

rAAV 病毒載體 在一個態樣中，本文中揭示rAAV基因組。在一些實施例中，rAAV基因組包含一或多個側接編碼SMN多肽之聚核苷酸之AAV ITR。在一些實施例中，聚核苷酸可操作地連接至在目標細胞中起作用以形成基因卡匣之轉錄控制DNA元件，例如啟動子DNA、一或多個強化子DNA及/或聚腺苷酸化信號序列DNA。基因卡匣亦可包括內含子序列，以在哺乳動物細胞中表現時促進RNA轉錄物之處理。

在一些實施例中，本文中揭示之rAAV基因組不具有AAV rep及cap DNA。rAAV基因組中之AAV DNA (例如ITR)可來自能夠衍生重組病毒之任何AAV血清型，包括(但不限於)AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10及AAV-11。AAV血清型之基因組之核苷酸序列為此項技術中已知的。舉例而言，AAV-1之完整基因組在GenBank寄存編號NC_002077中提供；AAV-2之完整基因組在GenBank寄存編號NC_001401及Srivastava等人, J. Virol., 45: 555-564 {1983)中提供；AAV-3之完整基因組在GenBank寄存編號NC_1829中提供；AAV-4之完整基因組在GenBank寄存編號NC_001829中提供；AAV-5基因組在GenBank寄存編號AF085716中提供；AAV-6之完整基因組在GenBank寄存編號NC_00 1862中提供；至少一部分AAV-7及AAV-8基因組分別在GenBank寄存編號AX753246及AX753249中提供；AAV-9基因組在Gao等人，J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)中提供；AAV-10基因組在Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)中提供；且AAV-11基因組在Virology，330(2): 375-383 (2004)中提供。

如本文中所使用，「pSMN」載體質體包含編碼SMN蛋白質之聚核苷酸，亦即，SMN cDNA表現卡匣，其中卡匣由腺相關病毒反向末端重複(ITR)序列側接，例如編碼SMN基因之聚核苷酸之「左側」及「右側」。在一些實施例中，編碼SMN之聚核苷酸為人類SMN序列，例如天然存在之人類SMN序列或其同功異型物、變異體或突變體。在一些實施例中，ITR序列為原生、變異型或經修飾之AAV ITR序列。在一些實施例中，至少一個ITR序列為原生、變異型或經修飾之AAV2 ITR序列。在一些實施例中，兩個ITR序列皆為原生、變異型或經修飾之AAV2 ITR序列。在一些實施例中，「左側」ITR為經修飾之AAV2 ITR序列，其實現自互補基因組之產生，且「右側」ITR為原生AAV2 ITR序列。在一些實施例中，「右側」ITR為經修飾之AAV2 ITR序列，其實現自互補基因組之產生，且「左側」ITR為原生AAV2 ITR序列。在一些實施例中，pSMN質體進一步包含CMV強化子/雞β-肌動蛋白(「CB」)啟動子。在一些實施例中，pSMN質體進一步包含猴病毒40 (SV40)內含子。在一些實施例中，pSMN質體進一步包含牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化(polyA)終止信號。可用於上文所論述之組件中之一或多者之例示性序列展示於以下表1中。在一些實施例中，使用以下表1中展示之所有序列。在一些實施例中，「AVXS-101」為使用表1中之所有序列的載體構築體之非限制性實例且屬於術語pSMN之範疇內。此等載體之實施例以及其製備及純化方法提供於例如PCT/US2018/058744中，其以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，pSMN載體可包含SMN cDNA表現卡匣、經修飾之AAV2 ITR、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)即刻/早期強化子、經修飾之SV40晚期16s內含子、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號及未經修飾之AAV2 ITR。經修飾及未經修飾之ITR可相對於SMN cDNA表現卡匣呈任一種定向(即，5'或3')。

表1：AVXS-101載體構築體DNA序列概述組件(所有nt起始及終止位置係相對於SEQ ID NO:1)。

	起始位置	終止位置	尺寸(nt)	說明	潛在益處之非限制性說明
「左側」突變型AAV2 ITR	1	106	106	藉由刪除末端解析位點來進行之對「左側」ITR修飾，以實現基因組之髮夾形成	不受理論約束，此突變型ITR可實現第二代自互補載體以最大化載體效能，實現更低的全身劑量
CMV強化子/CB啟動子	153	432	280	CMV即刻/早期強化子之一部分	不受理論約束，此可實現組成性大量SMN表現
439	704	266	CB核心啟動子
SV40內含子	774	870	97	來自SV40之內含子(以增強用於轉譯之穩定量之mRNA之積聚)	不受理論約束，此可實現基因表現增加
人類SMN cDNA	1003	1887	885	自Genbank寄存編號NM_017411修飾	不受理論約束，此可實現全長SMN蛋白質之表現
BGH Poly A終止信號	1973	2204	232	BGH Poly A信號	不受理論約束，此可提供用於大量、有效基因表現之SMN mRNA之Poly A (轉錄終止信號)
「右側」AAV2 ITR	2217	2359	143	未經修飾之AAV2 ITR	不受理論約束，cis 中之此AAV2 ITR可實現病毒DNA複製及AAV載體基因組之封裝

在一些實施例中，載體構築體序列經衣殼化，例如進入AAV9病毒粒子。在此等實施例中，衣殼化位於能夠遞送穩定、功能轉基因(例如完全功能人類SMN轉基因)之非複製、重組AAV9衣殼中。在一些實施例中，衣殼包含藉由選擇性剪接產生之60個病毒蛋白(VP1、VP2、VP3)，例如以1:1:10之比率，使得VP2及VP3為VP1之兩種截短形式，皆具有通用C端序列。在一些實施例中，製造方法之產物(例如藥物產品)可包含非複製、重組AAV9衣殼以遞送穩定、完全功能性人類SMN轉基因。在一些實施例中，衣殼以1:1:10之比率包含藉由選擇性剪接產生之60個病毒蛋白(VP1、VP2、VP3)，使得VP2及VP3為VP1之兩種截短形式，皆具有通用C端序列。此等載體構築體之實施例以及其製備及純化方法提供於例如PCT/US2018/058744中，其以全文引用之方式併入本文中。

在各種實施例中，pSMN載體構築體(例如AVXS-101載體構築體)之DNA序列包含SEQ ID NO:1：。

在一些實施例中，由pSMN質體(例如AVX101)編碼之SMN蛋白質之胺基酸序列包含：。

在一些實施例中，AAV衣殼蛋白VP1、VP2、VP3係來源於相同轉錄物。此等衣殼蛋白具有替代性起始位點，但共有羧基端。下文中，VP1特異性胺基酸序列以黑體展示且加粗。VP1及VP2共有之胺基酸序列帶下劃線且呈斜體。所有三種衣殼蛋白共有之胺基酸加粗且呈斜體。。

在一個實施例中，AAV衣殼蛋白係來源於編碼SEQ ID NO:3中所闡述之胺基酸序列之轉錄物。

在各種實施例中，本文中揭示包含rAAV基因組之DNA質體。將DNA質體轉移至容許用AAV之輔助病毒(例如腺病毒，E1缺失之腺病毒或疱疹病毒)感染之細胞，以用於將rAAV基因組組裝至具有AAV9衣殼蛋白之感染性病毒顆粒中。此項技術中可使用用於產生其中封裝AAV基因組(rep及cap基因)之rAAV顆粒及向細胞提供輔助病毒功能之技術。在一些實施例中，rAAV之產生涉及單個細胞(本文中稱為封裝細胞)內存在以下組分：rAAV基因組、不同於rAAV基因組(亦即不在其中之)AAV rep及cap基因以及輔助病毒功能。假模式化rAAV之產生揭示於例如WO 01/83692中，其以全文引用之方式併入本文中。在各種實施例中，AAV衣殼蛋白可經修飾以增強重組載體之遞送。對衣殼蛋白之修飾通常為此項技術中已知的。參見例如US 2005/0053922及US 2009/0202490，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。

rAAV產生之一般原理評述於例如Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539；及Muzyczka, 1992, CUM Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129中。各種方法描述於Ratschin等人, Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984)；Hennonat等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984)；Tratschin等人, Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985)；McLaughlin等人, J. Virol., 62:1963 (1988)；及Lebkowski等人, 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988)中。Samulski等人 (1989, J. Virol., 63:3822-3828)；美國專利案第5,173,414號；WO 95/13365及對應的美國專利案第5,658,776號；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441 (PCT/US96/14423)；WO 97/08298 (PCT/US96/13872)；WO 97/21825 (PCT/US96/20777)；WO 97/06243 (PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人 (1995) Vaccine 13:1244-1250；Paul等人 (1993) Human Gene Therapy 4:609-615；Clark等人 (1996) Gene Therapy 3:1124-1132；美國專利案第5,786,211號；美國專利案第5,871,982號；及美國專利案第6,258,595號。此外，本文中揭示之rAAV可根據PCT/US2018/058744之揭示內容製備、純化、製造及/或調配。前述文獻係以全文引用之方式併入本文中，其中尤其強調文獻中關於rAAV製備、純化、產生、製造及調配之章節。

在另一態樣中，包含編碼SMN蛋白質之聚核苷酸之rAAV(諸如本文中所論述之rAAV9)稱為「rAAV SMN」。在一些實施例中，rAAV SMN基因組在序列中具有第一AAV2 ITR、具有細胞巨大病毒強化子之雞-β肌動蛋白啟動子、SV40內含子、編碼SMN之聚核苷酸、來自牛生長激素之聚腺苷酸化信號序列及第二AAV2 ITR。在一些實施例中，編碼SMN之聚核苷酸為人類SMN基因，例如GenBank寄存編號MN_000344.2、Genbank寄存編號NM_017411中所闡述或有氣衍生，或任何其他適合的人類SMN同功異型物。例示性SMN序列包含以下序列：。

亦涵蓋SMN DNA之保守性核苷酸取代(例如GenBank寄存編號NM_000344.2之位置625處之鳥嘌呤變成腺嘌呤)。在一些實施例中，基因組不具有AAV rep及cap DNA，亦即，在基因組之ITR之間不存在AAV rep或cap DNA。所涵蓋之SMN多肽包括(但不限於)NCBI蛋白質資料庫編號NP_000335.1中闡述之人類SMN1多肽。在實施例中，SMN DNA包含編碼人類SMN多肽(例如由Uniprot寄存編號Q16637，同功異型物1 (Q16637-1)鑑別之人類SMN蛋白質)之聚核苷酸。亦涵蓋SMN1修飾因子多肽網素-3 (PLS3)[Oprea等人, Science 320(5875): 524-527 (2008)]。對於SMN DNA，編碼其他多肽之序列可經取代。

醫藥組合物 在各種實施例中，可在適用於鞘內投藥之醫藥組合物中提供本發明之病毒顆粒(稱為病毒性顆粒)。可在除病毒性顆粒以外，亦包含一或多種非活性成分及/或一或多種其他活性成分之調配物中提供組合物。在一些實施例中，可使用此項技術中已知的組分及技術，在適用於哺乳動物個體(例如人類)中之鞘內投藥之調配物中調配本發明之組合物。

在一些實施例中，醫藥調配物包含(a)AAV9病毒載體，其包含編碼運動神經元存活(SMN)蛋白質之聚核苷酸，(b)Tris緩衝液，(c)氯化鎂，(d)氯化鈉，及(e)泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)，其中醫藥組合物不包含防腐劑。在調配物之一個實施例中，AAV9病毒載體進一步包含經修飾之AAV2 ITR、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)即刻/早期強化子、經修飾之SV40晚期16s內含子、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號及未經修飾之AAV2 ITR。在調配物之一個實施例中，Tris緩衝液濃度為約10-30 nM，例如約20 mM。在一個實施例中，調配物之pH值為約7.7至約8.3，例如約pH 8.0 (例如藉由USP＜791＞(以全文引用之方式併入)量測)。在調配物之一個實施例中，氯化鎂濃度為約0.5-1.5 mM，例如約1 mM。在調配物之一個實施例中，氯化鈉濃度為約100-300 mM，例如約200 mM。在一個實施例中，調配物包含約0.001-0.15% w/v之泊洛沙姆188，例如約0.005% w/v之泊洛沙姆188。在一些實施例中，調配物包含約1-8×10¹³ vg/mL，例如約1.9-4.2×10¹³ vg/mL之AAV9病毒載體。在一些實施例中，調配物包含約1-8×10¹³ vg/mL且AAV9病毒載體係以約6.0×10¹³ vg之單位劑量投與。在一些實施例中，調配物包含約1.9-4.2×10¹³ vg/mL且AAV9病毒載體係以約6.0×10¹³ vg之單位劑量投與。在一些實施例中，調配物包含約1-8×10¹³ vg/mL且AAV9病毒載體係以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量投與。在一些實施例中，調配物包含約1.9-4.2×10¹³ vg/mL且AAV9病毒載體係以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量投與。在一些實施例中，調配物包含約1-8×10¹³ vg/mL且AAV9病毒載體係以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量投與。在一些實施例中，調配物包含約1.9-4.2×10¹³ vg/mL且AAV9病毒載體係以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量投與。

當以溶液或懸浮液形式調配時，遞送系統可包含可接受之載劑，例如水性載劑。可使用多種水性載體，例如水、緩衝水及/或生理食鹽水。調配物亦可包含張力調節劑以使溶液呈等滲性或等張性，例如NaCl、糖、甘露醇及其類似物。調配物亦可包含界面活性劑以使組合物對界面及剪應力穩定，例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80及其類似物。調配物可經緩衝以保持最佳pH值及穩定性，例如使用乙酸鹽、丁二酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸、磷酸鹽或Tris緩衝液及其類似物。此等組合物可使用滅菌技術滅菌，或可經無菌過濾。所得水性溶液可經封裝以按原樣使用，或凍乾，經凍乾之製劑在投與之前與無菌溶液組合。組合物，例如醫藥組合物，可含有醫藥學上可接受之助劑物質以模擬生理學條件，諸如pH值調節劑及緩衝劑、張力調節劑、濕潤劑及其類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂酸脫水山梨糖醇酯、油酸三乙醇胺等。在一些實施例中，醫藥組合物包含防腐劑。在一些其他實施例中，醫藥組合物不包含防腐劑。

在一些實施例中，醫藥組合物視情況亦包含一或多種其他活性或非活性組分，例如造影劑(例如Omnipaque^TM 180)。在一些實施例中，醫藥組合物包含病毒載體(其包含本文中揭示之SMN聚核苷酸)且亦包含造影劑(例如Omnipaque^TM ，或含有碘海醇之試劑)。在一些此等實施例中，造影劑與醫藥組合物預先混合。在一些其他實施例中，造影劑不與醫藥組合物預先混合。在一些實施例中，在即將鞘內投藥之前混合造影劑與醫藥組合物。在一些實施例中，造影劑(例如Omnipaque^TM 、碘海醇及其類似物)增加運動神經元轉導。在一些實施例中，造影劑(例如Omnipaque^TM 、碘海醇及其類似物)幫助將鞘內針引導至蛛膜下空間中。

在一些實施例中，造影劑與本文中揭示之包含SMN聚核苷酸之病毒載體組合投與，其中造影劑在投藥之前不與病毒載體預先混合或共同調配。舉例而言，在一些實施例中，依序投與造影劑及本文中揭示之包含SMN聚核苷酸之病毒載體。在一些實施例中，在即將以單次推注方式投藥之前混合造影劑與包含SMN聚核苷酸之病毒載體。

在一些實施例中，可根據此項技術中已知之方法，例如PCT/US2018/058744 (其以全文引用之方式併入本文中)中描述之方法製備及純化醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物具有小於約7%空衣殼(例如7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少，或其間的任何百分比之空衣殼)，例如由例如qPCR或ddPCR評估。在一些實施例中，醫藥組合物具有以下純度特徵中之一或多者：每1.0×10¹³ vg少於0.09 ng全能核酸酶、少於30 µg /g (ppm)之銫、約20-80 ppm泊洛沙姆188、每1.0×10¹³ vg少於0.22 ng BSA、每1.0×10¹³ vg少於6.8×10⁵ pg殘餘質體DNA、每1.0×10¹³ vg少於1.1×10⁵ pg殘餘hcDNA及每1.0×10¹³ vg少於4 ng rHCP。

在各種實施例中，醫藥組合物保持參考標準之+/-20%之間、+/-15%之間、+/-10%之間或+/-5%之間的效能。在一個實施例中，使用Foust等人, Nat. Biotechnol., 28(3), 第271-274頁 (2010)中之方法針對參考標準評估效能。可使用任何適合的參考標準。在一個實施例中，醫藥組合物具有活體內效能，如藉由SMAΔ7小鼠測試。在一個實施例中，接受7.5×10¹³ vg/kg劑量之測試小鼠之中值存活期超過15天、超過20天、超過22天或超過24天。在一個實施例中，醫藥組合物之效能為參考標準及/或適合的對照物之50-150%、60-140%或70-130%，如藉由活體外基於細胞之分析法測試。

在一些實施例中，醫藥組合物中之rAAV病毒載體之濃度在約1×10¹³ vg/mL與1×10¹⁵ vg/mL之間，例如在約1-8×10¹³ vg/mL之間。在一些實施例中，醫藥組合物具有小於約10%、小於約8%、小於約7%或小於約5%空病毒衣殼。在一些實施例中，醫藥組合物具有每1×10¹³ vg/mL小於約100 ng/mL之宿主細胞蛋白質。在一些實施例中，醫藥組合物具有每1×10¹³ vg/mL小於約5×10⁶ pg/mL、小於約1×10⁶ pg/mL、小於約7.5×10⁵ pg/mL或小於6.8×10⁵ pg/mL之殘餘宿主細胞DNA (hcDNA)。在一些實施例中，醫藥組合物具有每1.0×10¹³ vg/mL小於約10 ng、小於約8 ng、小於約6 ng或小於約4 ng殘餘宿主細胞蛋白質(rHCP)。在一些實施例中，每毫升醫藥組合物中之至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約100% rAAV (例如AAV9)病毒載體基因組為功能性的。在一些實施例中，醫藥組合物具有小於或等於1.7×10⁶ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)，或1×10⁵ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)至1.7×10⁶ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)之殘餘質體DNA。在一些實施例中，醫藥組合物之全能核酸酶濃度小於0.2 ng (每1.0×10¹³ vg)、小於0.1 ng (每1.0×10¹³ vg)或小於0.09 ng (每1.0×10¹³ vg)。在一些實施例中，以醫藥組合物之牛血清白蛋白(BSA)濃度小於0.5 ng (每1.0×10¹³ vg)、小於0.3 ng (每1.0×10¹³ vg)或小於0.22 ng (每1.0×10¹³ vg)。在一些實施例中，醫藥組合物之內毒素含量小於約1 EU/mL (每1.0×10¹³ vg/mL)、小於約0.75 EU/mL (每1.0×10¹³ vg/mL)、小於約0.5 EU/mL (每1.0×10¹³ vg/mL)、小於約0.4 EU/mL (每1.0×10¹³ vg/mL)、小於約0.35 EU/mL (每1.0×10¹³ vg/mL)、小於約0.3 EU/mL (每1.0×10¹³ vg/mL)、小於約0.25 EU/mL (每1.0×10¹³ vg/mL)、小於約0.2 EU/mL (每1.0×10¹³ vg/mL)、小於約0.13 EU/mL (每1.0×10¹³ vg/mL)、小於約0.1 EU/mL (每1.0×10¹³ vg/mL)、小於約0.05 EU/mL (每1.0×10¹³ vg/mL)或小於約0.02 EU/mL (每1.0×10¹³ vg/mL)。在一些實施例中，醫藥組合物中之銫之濃度小於100 µg/g (ppm)、小於50 µg/g (ppm)或小於30 µg/g (ppm)。在一些實施例中，該等方法產生具有約10-100 ppm、15-90 ppm或約20-80 ppm泊洛沙姆188之rAAV病毒載體。在一些實施例中，以每個容器計，醫藥組合物具有少於2000、少於1500、少於1000或少於600個尺寸≥25 µm之顆粒。在一些實施例中，以每個容器計，醫藥組合物具有少於10000、少於8000、少於1000或少於6000個尺寸≥10 µm之顆粒。在一些實施例中，醫藥組合物之pH值在7.5至8.5之間、在7.6至8.4之間或在7.8至8.3之間。在一些實施例中，醫藥組合物之重量莫耳滲透濃度在330至490 mOsm/kg之間、在360至460 mOsm/kg之間或在390至430 mOsm/kg之間。在一些實施例中，醫藥組合物之感染效價為每1.0×10¹³ vg約1.0×10⁸ - 10.0×10¹⁰ IU、每1.0×10¹³ vg約2.5×10⁸ - 9.0×10¹⁰ IU或每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU。在一些實施例中，基於活體外基於細胞之分析法，相對於參考標準及/或適合的對照物，醫藥組合物具有約30-150%、約60-140%或約70-130%相對效能。在一些實施例中，醫藥組合物之總蛋白質含量為每1.0×10¹³ vg約10-500 µg、每1.0×10¹³ vg約50-400 µg或每1.0×10¹³ vg約100-300 µg。在一些實施例中，醫藥組合物具有活體內效能，如藉由接受7.5×10¹³ vg/kg劑量之SMNΔ7小鼠之中值存活期超過15天、超過20天、超過22天或超過24天測定。在一些實施例中，醫藥組合物符合一或多種(例如所有)前述標準之組合。

本發明亦提供用於治療有需要之患者中之SMA (例如II型或III型SMA)之套組，其中套組包含一或多種劑量之本文中所揭示之醫藥組合物，例如一種劑量包含有效量或劑量之本文中揭示之包含SMN聚核苷酸之病毒載體且視情況亦包含一或多種其他活性或非活性組分，例如造影劑(例如Omnipaque^TM 180)，及如何使用醫藥製劑或組合物之說明。在一些實施例中，套組包含一或多種劑量之本文中所揭示之醫藥組合物，例如一種劑量包含有效量或劑量之本文中揭示之包含SMN聚核苷酸之病毒載體且亦視情況包含造影劑(例如Omnipaque^TM ，或含有碘海醇之試劑)。

在一些實施例中，套組包含與醫藥組合物在相同容器中預先混合之造影劑。在一些實施例中，套組包含在套組中之一或多個容器中提供之造影劑及在一或多個其他容器中提供之醫藥組合物。在一些實施例中，在鞘內投藥之前混合造影劑與醫藥組合物。

在一些實施例中，套組含有病毒載體醫藥組合物之一或多個小瓶。在一些實施例中，各小瓶含有至多或約6.0×10¹³ vg之劑量(例如單位劑量)之病毒載體醫藥組合物。在一些實施例中，套組中之病毒載體之各小瓶(例如各單位劑量)含有約6.0×10¹³ vg之劑量之醫藥組合物。在一些實施例中，套組中之病毒載體之各小瓶(例如各單位劑量)含有至多或約1.2×10¹⁴ vg之劑量之醫藥組合物。在一些實施例中，套組中之病毒載體之各小瓶(例如各單位劑量)含有約1.2×10¹⁴ vg之劑量之醫藥組合物。在一些實施例中，套組中之病毒載體之各小瓶(例如各單位劑量)含有至多或約2.4×10¹⁴ vg之劑量之醫藥組合物。在一些實施例中，套組中之病毒載體之各小瓶(例如各單位劑量)含有約2.4×10¹⁴ vg之劑量之醫藥組合物。在一些實施例中，病毒載體醫藥組合物之濃度為約0.1-5.0×10¹³ vg/mL。在一些實施例中，各小瓶含有單次劑量之rAAV病毒載體。在一些實施例中，各小瓶含有多於單次劑量之rAAV病毒載體。在一些實施例中，各小瓶含有少於單次劑量之rAAV病毒載體。

rAAV9 病毒載體之用途 在各種實施例中，本文中揭示用於向需要治療SMA(例如II型或III型SMA)之患者遞送聚核苷酸之方法，其包含投與具有基因組之rAAV9，該基因組包括rAAV SMN聚核苷酸。在一些實施例中，遞送為鞘內遞送至患者之中樞神經系統，包含投與本文中揭示之rAAV9。在一些實施例中，rAAV9與造影劑一起投與。在一些此類實施例中，rAAV9及造影劑係同時投與，例如在單一醫藥組合物中。在其他此類實施例中，rAAV9及造影劑係依序投與。舉例而言，在一些實施例中，首先投與造影劑且在投與造影劑之後投與rAAV9。在一些實施例中，首先投與rAAV9且在投與AAV9病毒載體之後投與造影劑。在其中依序投與AAV9病毒載體及造影劑之實施例中，AAV9病毒載體及造影劑之投藥可在彼此間隔例如約2小時內、1小時內、45分鐘內、30分鐘內、15分鐘內、10分鐘內或5分鐘內投與。在一些實施例中，鞘內投與造影劑及rAAV9中之至少一者。在一些實施例中，造影劑及rAAV9(無論同時或依序投與)皆係鞘內投與。

在一些實施例中，造影劑為非離子性、低滲透造影劑。在一些實施例中，造影劑可增加患者之中樞神經系統中目標細胞之轉導。在一些實施例中，造影劑可幫助遞送直接靶向蛛膜下空間。在一些實施例中，rAAV9基因組為自互補基因組。在其他實施例中，rAAV9基因組為單股基因組。

在一些實施例中，將rAAV病毒載體鞘內遞送至脊椎管或蛛膜下空間中使得其到達腦脊髓液(CSF)。在一些實施例中，rAAV病毒載體可在CSF內擴散至遞送位點之遠端區域。在一些實施例中，將rAAV病毒載體遞送至大腦區。在一些實施例中，將rAAV病毒載體遞送至運動皮質及/或腦幹。在一些實施例中，將rAAV病毒載體遞送至脊髓。在一些實施例中，將rAAV病毒載體遞送至下運動神經元。本發明之實施例使用rAAV9將rAAV病毒載體遞送至神經及膠細胞。在一些實施例中，膠細胞為微神經膠質細胞、寡樹突神經膠細胞或星形膠質細胞。在一些實施例中，使用rAAV9將rAAV病毒載體遞送至許旺氏細胞(Schwann cell)。

所投與之rAAV病毒載體之效價可視例如特定rAAV、投藥模式、治療目標、所治療之個體之年齡及其他特徵以及所靶向之細胞類型而變化。可藉由已知方法測定效價。rAAV之效價可在每毫升約1×10⁶ 、約1×10⁷ 、約1×10⁸ 、約1×10⁹ 、約1×10¹⁰ 、約1×10¹¹ 、約1×10¹² 、約1×10¹³ 、約1×10¹⁴ 、約1×10¹⁵ 或更多個DNase抗性顆粒(DRP)範圍內。劑量亦可以載體基因組(vg)之單位表示。可使用如本申請、Lock等人中所描述之ddPCR或此項技術中已知之任何其他方法測定基因組效價。劑量亦可基於對人類之投藥時序而變化。在成年人或新生兒中，rAAV之此等劑量可在每公斤體重約1×10¹¹ vg/kg、約1×10¹² vg/kg、約1×10¹³ vg/kg、約1×10¹⁴ vg/kg、約1×10¹⁵ vg/kg、約1×10¹⁶ vg/kg或更多的載體基因組範圍內。在一些實施例中，rAAV9係以1.0×10¹³ vg - 9.9×10¹⁴ vg之劑量投與。在一些實施例中，rAAV9係以5.0×10¹³ vg - 3.0×10¹⁴ vg之劑量投與。在一些實施例中，rAAV9係以至多6.0×10¹³ vg之劑量投與。在一些實施例中，rAAV9係以約6.0×10¹³ vg之劑量投與。在一些實施例中，rAAV9係以至多1.2×10¹⁴ vg之劑量投與。在一些實施例中，rAAV9係以約1.2×10¹⁴ vg之劑量投與。在一些實施例中，rAAV9係以至多2.4×10¹⁴ vg之劑量投與。在一些實施例中，rAAV9係以約2.4×10¹⁴ vg之劑量投與。

在一些實施例中，rAAV9係以約1.0×10¹³ vg - 9.9×10¹⁴ vg之單位劑量投與。在一些實施例中，rAAV9係以約1.0×10¹³ vg - 5.0×10¹⁴ vg之單位劑量投與。在一些實施例中，rAAV9係以約5.0×10¹³ vg - 3.0×10¹⁴ vg之單位劑量投與。

在一些實施例中，rAAV9係以約6.0×10¹³ vg之單位劑量投與。在一些實施例中，rAAV9係以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量投與。在一些實施例中，rAAV9係以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量投與。

可藉由任何適合的方法測定劑量。舉例而言，具有對病毒載體具有特異性之引子之PCR可提供相關量測，而qPCR可用於較小樣品及絕對量測。在一些實施例中，使用ddPCR。ddPCR為用於進行數位PCR之方法，其係基於水-油乳液液滴技術。Baker等人, 「Digital PCR hits its stride」 Nature Methods, 9(6):541-544。Sykes等人, 「Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution」 Biotechniques, 13(3)444-449。將樣品分餾為成千上萬個液滴，且在每個個別液滴中進行模板分子之PCR擴增。由於無需繪製標準曲線或使用具有高擴增效率之引子，因此ddPCR使用之樣品通常少於傳統的基於PCR之技術。可商購的ddPCR機器之實例包括(但不限於)BioRad QX100 ddPCR及RainDance Raindrop Digital PCR。在一個實施例中，使用PCR測定劑量。在另一實施例中，使用qPCR測定劑量。在另一實施例中，使用數位液滴PCR (ddPCR)測定劑量。在一些實施例中，使用多種方法。在一些實施例中，基於PCR之方法使用經特定設計之靶向SMN基因之引子及探針偵測及定量衣殼化AAV9病毒基因組。在其他實施例中，基於PCR之方法使用經特定設計之靶向雞β-肌動蛋白啟動子之引子及探針偵測及定量衣殼化AAV9病毒基因組。在其他實施例中，基於PCR之方法使用經特定設計之靶向CMV強化子之引子及探針偵測及定量衣殼化AAV9病毒基因組。在其他實施例中，基於PCR之方法使用經特定設計之靶向ITR序列之引子及探針偵測及定量衣殼化AAV9病毒基因組。在其他實施例中，基於PCR之方法使用經特定設計之靶向牛生長激素聚腺苷酸化信號之引子及探針偵測及定量衣殼化AAV9病毒基因組。在一些實施例中，使用適合的活體外細胞分析法或活體內動物模型量測效能。舉例而言，可使用SMA之動物模型(例如SMNΔ7小鼠)或使用適合的細胞株(例如自SMAΔ7小鼠之皮質分離之初生神經先驅細胞(NPC))之定量性基於細胞之分析法測定效能或功能性AAV SMN病毒性顆粒百分比。在一個實施例中，使用Foust等人, Nat. Biotechnol., 28(3), 第271-274頁 (2010)中之方法針對參考標準評估效能。可使用任何適合的參考標準。此外，用於測定本文中揭示之rAAV病毒載體中之功能性病毒載體之劑量、純度及百分比之例示性方法亦提供於PCT/US2018/058744之揭示內容中，其以全文引用之方式併入本文中。

所投與之rAAV病毒載體之調配物可視例如鞘內投藥方法、劑量體積及醫藥賦形劑而變化。Grouls等人, 「General considerations in the formulation of drugs for spinal delivery」 Spinal Drug Delivery, 第15章, Elsevier Science, Yaksh版。在一些實施例中，可在適用於鞘內投藥之治療性調配物中投與rAAV病毒載體。在一些實施例中，可以快速注射形式鞘內投與rAAV病毒載體。在一些實施例中，可以緩慢輸注形式鞘內投與rAAV病毒載體。在一些實施例中，可在無菌等張性藥物溶液中調配rAAV病毒載體。在一些實施例中，可在生理食鹽水溶液中調配rAAV病毒載體。在一些實施例中，可在人工CSF(例如艾氏B溶液(Elliott's B solution))中調配rAAV病毒載體。在一些實施例中，在投藥之前過濾治療性調配物。

在各種實施例中，本文中揭示之方法及材料指示用於且可用於治療SMA，例如藉由對缺乏SMN1之功能性複本之患者進行鞘內投藥。人類亦具有SMN基因之第二、幾乎一致的複本，稱為SMN2。Lefebvre等人「Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene」 Cell, 80(1):155-65。Monani等人「Spinal muscular atrophy: a deficiency in a ubiquitous protein; a motor-neuron specific disease」 Neuron, 48(6):885-896。SMN1及SMN2基因皆表現SMN蛋白質，然而SMN2在外顯子7中含有轉譯緘默突變，其引起SMN2轉錄物中之外顯子7之含量不足。因此，SMN2產生全長SMN蛋白質及不具有外顯子7之SMN之截短版本，其中截短版本為主要形式。因此，由SMN2產生之功能性全長蛋白質之量遠低於(達70-90%)由SMN1產生之量。Lorson等人「A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy」 PNAS, 96(11) 6307-6311。Monani等人, 「A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2」 Hum Mol Genet 8(7):1177-1183。儘管SMN2不能完全補償SMN1基因之損失，但具有SMA之較輕度的形式之患者通常具有更高的SMN2複本數。Lefebvre等人, 「Correlation between severity and SMN protein level in spinal muscular atrophy」 Nat Genet 16(3):265-269。Park等人, 「Spinal muscular atrophy: new and emerging insights from model mice」 Curr Neurol Neurosci Rep 10(2):108-117。超過95%的患有SMA之個體保留至少一個SMN2基因之複本。一項說明為SMN2複本數並非唯一的表現型修飾物。特定言之，已報導SMN2基因之外顯子7中之c.859G＞C變異體為陽性疾病修飾物。具有此特定突變之患者具有嚴重性較低的疾病表現型。Prior等人, 「A positive modified of spinal muscular atrophy in the SMN2 gene」 Am J Hum Genet 85(3):408-413。在一些實施例中，向具有超過一個、超過兩個、超過三個、超過四個或超過五個SMN2基因之複本及/或在SMN2基因之外顯子7中不具有c.859G＞C變異體之II型SMA患者投與本文中揭示之rAAV SMN。在一些實施例中，向具有超過兩個、超過三個、超過四個或超過五個SMN2基因之複本及/或在SMN2基因之外顯子7中不具有c.859G＞C變異體之III型SMA患者投與本文中揭示之rAAV SMN。在一些實施例中，向II型SMA患者鞘內投與本文中揭示之rAAV SMN。在一些實施例中，向III型SMA患者鞘內投與本文中揭示之rAAV SMN。

I型SMA (亦稱為嬰兒發作或韋-霍二氏病(Werdnig-Hoffmann disease))為在出生或年齡為6個月時存在SMA症狀。在此類型中，嬰兒通常具有低肌肉張力(低張症)、哭泣無力及呼吸窘迫。其通常具有吞咽及吮吸困難，且未達到能夠在無需幫助之情況下坐立之發育重要事件。其通常展示選自以下之SMA症狀中之一或多者：低張症、運動技能遲緩、頭部控制不良、圓肩姿勢及關節過度活動。通常，此等嬰兒具有兩個SMN2基因之複本，每個染色體5上一個。超過一半的所有新SMA病例為I型SMA。對於I型SMA，約80%的患者具有1或2個SMN2基因之複本。

II型或中度SMA為在年齡為7與18個月之間且在兒童可獨立站立或行走之前發作之SMA。患有II型SMA之兒童通常具有至少三個SMN2基因，且約82%的II型SMA患者具有3個SMN2基因之複本。遲發型SMA (亦稱為III型及IV型SMA、輕度SMA、成年發病型SMA及庫-威二氏病(Kugelberg-Welander disease))引起不同程度之無力。III型SMA在18個月之後發作，且兒童可獨立站立及行走，儘管可能需要幫助。在III型SMA患者中，約96%的患者具有3或4個SMN2基因之複本。IV型SMA在成人期發作，且人在其成年期間能夠行走。患有III型或IV型SMA之人通常具有四至八個SMN2基因，由其可產生大量的全長SMN蛋白質。

在一個實施例中，可鞘內投與rAAV (例如本文中揭示之rAAV9載體)以治療SMA，例如II型或III型SMA。術語「治療」及該術語之其他相關形式包含向有需要之動物(包括人類)投與(例如鞘內)有效劑量或有效多個劑量之組合物之步驟，該組合物包含如本文中所揭示之rAAV。若劑量在病症/疾病發作之前投與，則投藥為預防性的。若劑量在罹患病症/疾病之後投與，則投藥為治療性的。在實施例中，有效劑量為部分或完全緩解(消除或減少)至少一種與所治療之病症/疾病病況相關之症狀的劑量、減緩或阻止病症/疾病病況發展的劑量、減緩或阻止病症/疾病病況發展的劑量、減輕疾病程度的劑量、引起疾病緩解(部分或全部)的劑量及/或延長存活期的劑量。本文中闡述預期治療之疾病病況之實例。

在一個實施例中，向需要治療SMA (例如II型或III型SMA)之患者鞘內投與本發明之rAAV9組合物。

在一些實施例中，患者年齡為0-72個月。在一些其他實施例中患者年齡為6-60個月。在一些實施例中，患者年齡為6-24個月。在一些實施例中，患者年齡為至少6個月。在一些實施例中，患者年齡超過24個月。

在一些實施例中，患者在一個SMN1基因之複本中具有一或多個突變，例如無效突變(null mutation)(涵蓋任何使經編碼之SMN1蛋白質成為非功能性之突變)。在一些實施例中，患者在兩個SMN1基因之複本中具有一或多個突變，例如無效突變。在一些實施例中，患者在所有SMN1基因之複本中具有一或多個突變，例如無效突變。在一些實施例中，患者在一個SMN1基因之複本中具有缺失。在一些實施例中，患者在兩個SMN1基因之複本中具有缺失。在一些實施例中，患者具有雙對偶基因SMN1突變，亦即，染色體之兩個對偶基因中SMN1之缺失或取代。在一些實施例中，患者具有至少一個SMN2基因之功能性複本。在一些實施例中，患者具有至少兩個SMN2基因之功能性複本。在一些實施例中，患者具有至少三個SMN2基因之功能性複本。在一些實施例中，患者具有至少四個SMN2基因之功能性複本。在一些實施例中，患者具有至少五個SMN2基因之功能性複本。在一些實施例中，患者具有雙對偶基因SMN1無效突變或缺失且具有三個SMN2之複本。在一些實施例中，患者在至少一個SMN2基因之複本之外顯子7中不具有c.859G＞C取代。在一些實施例中，患者具有雙對偶基因SMN1無效突變或缺失、具有三個SMN2之複本且在至少一個SMN2基因之複本之外顯子7中不具有c.859G＞C取代。在一些實施例中，可藉由例如雜交、PCR擴增及/或部分或完全染色體或基因組定序來確定SMN1或SMN2基因之遺傳序列。在其他實施例中，可藉由高通量定序來確定SMN1或SMN2基因之遺傳序列及複本數。在一些實施例中，可藉由微陣列分析來確定SMN1或SMN2基因之遺傳序列及複本數。在一些實施例中，可藉由桑格定序(Sanger sequencing)來確定SMN1或SMN2基因之遺傳序列及複本數。在一些實施例中，可藉由螢光原位雜交(FISH)來確定SMN1或SMN2基因之複本數。

在一些實施例中，患者在治療之前或在治療的同時被診斷患有SMA，例如II型或III型SMA，例如藉由基因組測試及/或運動功能測試及/或體檢。在一些實施例中，藉由臨床症狀評估來診斷II型或III型SMA，例如CHOP INTEND、Bayley Scales of Infant and Toddler Development®或哈默史密斯功能性運動擴展量表(HFMSE)。在一些實施例中，藉由體檢診斷II型或III型SMA。在一些實施例中，如藉由本文中所揭示之方法治療之II型SMA患者在年齡為24個月、22個月、20個月、18個月、16個月、14個月、12個月、10個月、8個月或6個月或其間的任何年齡之前具有或顯現出疾病症狀之發作。在一些實施例中，藉由本文中所揭示之方法治療之III型SMA患者在年齡為12個月、14個月、16個月、18個月、20個月、22個月或24個月或其間的任何年齡之後具有或顯現出疾病症狀之發作。在一些實施例中，在患者顯現出II型或III型SMA之症狀(例如，一或多種症狀)之前治療患者，且實情為確定患者需要治療，例如使用一種本文中所描述之基因測試。在一些實施例中，在患者顯現出II型或III型SMA之症狀(例如，一或多種症狀)之後治療患者，例如使用一種本文中所描述之測試測定。在一些實施例中，在患者顯現出II型或III型SMA之症狀之前治療患者。在一些實施例中，在患者顯現出症狀之前，基於基因測試診斷患者患有II型或III型SMA。

在一些實施例中，患者顯現出一或多種SMA症狀。SMA症狀可包括低張症、運動技能遲緩、頭部控制不良、圓肩姿勢及關節過度活動。在一些實施例中，藉由在肩部(前部及後部)提供幫助之情況下使患者處於環形坐姿來測定頭部控制不良。藉由患者保持頭部直立之能力來評估頭部控制。在一些實施例中，在患者處於仰臥姿勢時觀測自發性移動，且藉由患者抬起肘部、膝部、手部及足部離地來評估運動技能。在一些實施例中，藉由將手指置放於患者的手掌中且提昇患者直至其肩部離地來量測患者之握力。藉由患者保持抓握之速度/時間長度來量測低張症及握力。在一些實施例中，藉由使患者的頭部處於可實現的最大旋轉且量測患者使頭部轉回正中位置的能力來評估頭部控制。在一些實施例中，可藉由使患者在具有頭部及軀幹支撐之情況下坐下，且觀測患者是否彎曲肘部或肩部以拿取刺激物來評估肩部姿勢，該刺激物係以手臂長度與肩部齊平放置。在一些實施例中，亦可藉由使患者處於側臥位，且觀測患者是否彎曲肘部或肩部以拿取刺激物來評估肩部姿勢，該刺激物係以手臂長度與肩部齊平放置。在一些實施例中，藉由觀測患者在其足部被撫摸、胳肢或掐捏時是否彎曲其髖部或膝部來評估運動技能。在一些實施例中，可藉由已知的臨床措施(例如CHOP INTEND)來評估肩部彎曲、肘部彎曲、髖部內收、頸部彎曲、頭部伸出、頸部伸出及/或脊柱彎曲。可根據已知的臨床措施(例如CHOP INTEND評估)其他SMA症狀。

在一些實施例中，患者顯現出坐立能力，但不能行走。在一些實施例中，患者顯現出在無需幫助之情況下坐立10秒或更長時間之能力，但不能站立或行走。在一些實施例中，患者顯現出在無需幫助之情況下，在頭部直立之情況下坐立10秒或更長時間之能力，但不能行走或站立。在一些實施例中，患者顯現出獨立坐立之能力，如由世界衛生組織多中心生長參考研究(WHO-MGRS)標準定義。

不受理論束縛，鞘內投藥可允許藥物繞過血腦障壁。因此，對於以中樞神經系統為目標之藥物，藉由鞘內投藥進行之直接遞送可實現所需醫藥組合物之總劑量及/或體積降低，藉此降低肝毒性風險。此外，直接遞送至蛛膜下空間中可實現中樞神經系統中之細胞(例如下運動神經元、神經膠質細胞及其類似物)之更高的轉導效率。蛛膜下空間中之腦脊髓液(CSF)之體積可影響選擇用於鞘內遞送之有效劑量濃度。因為人類中之CSF體積在約3歲之後保持相對恆定，因此可在不同患者中更容易及統一地控制患者之劑量。在一些實施例中，使用鞘內投藥以通過血腦障壁。在一些實施例中，向有需要之患者(例如鑑別為需要治療II型或III型SMA之患者)鞘內遞送本文中揭示之rAAV9病毒載體。在一些實施例中，將rAAV9注射至脊椎管中。在一些實施例中，將rAAV9注射至蛛膜下空間中。在一些實施例中，在PICU患者室或其他能夠立即進行急性重症監護管理之適合的環境(例如介入套件、操作室、專用程序室)中，在無菌條件下注射rAAV9病毒載體。在一些實施例中，約每15±5分鐘一次監測患者生命體徵保持4小時且在投與病毒載體之後，每一小時±15分鐘一次監測患者生命體徵保持24小時。在一些實施例中，rAAV9病毒載體不包含防腐劑。在一些實施例中，在投與rAAV9病毒載體之前，向患者提供鎮靜劑或麻醉劑。在一些實施例中，可對處於俯臥位、膝胸臥位、側臥位、辛氏臥位(Sim's position)或側偃臥位之患者進行rAAV9病毒載體之鞘內投藥。在一些實施例中，在注射器或導管中投與rAAV9病毒載體。在一些實施例中，可將導管插入L1-L2、L2-L3、L3-L4或L4-L5棘突間隙，進入蛛膜下空間。在一些實施例中，進行腰椎穿刺，收集至多10 mL、至多9 mL、至多8 mL、至多7 mL、至多6 mL、至多5 mL、至多4 mL、至多3 mL、至多2 mL或至多1 mL腦脊髓液。在一些實施例中，將rAAV9病毒載體直接注射至蛛膜下空間中。在一些實施例中，預先混合rAAV9病毒載體與適合的放射性造影溶液(例如甲泛葡胺(metrizamide)、碘帕醇(iopamidol)、碘海醇、碘佛醇(ioversol)、Omnipaque^TM 等)且直接注射至蛛膜下空間中。在一些實施例中，在鞘內投與rAAV9病毒載體之前，鞘內投與造影溶液(例如甲泛葡胺、碘帕醇、碘海醇、碘佛醇、Omnipaque^TM 等)。在一些實施例中，在鞘內投與rAAV9病毒載體之前2小時內、1小時內、45分鐘內、30分鐘內、15分鐘內、10分鐘內或5分鐘內鞘內投與造影溶液。在一些實施例中，在鞘內投與rAAV9病毒載體之後，鞘內投與造影溶液(例如甲泛葡胺、碘帕醇、碘海醇、碘佛醇、Omnipaque^TM 等)。在一些實施例中，在鞘內投與rAAV9病毒載體之後2小時內、1小時內、45分鐘內、30分鐘內、15分鐘內、10分鐘內或5分鐘內鞘內投與造影溶液。

在一些實施例中，所投與之造影劑之體積為至多約0.5 mL、至多約1.0 mL、至多約1.5 mL、至多約2.0 mL或至多約2.5 mL。在一些實施例中，所投與之總體積(rAAV9病毒載體及造影劑)不超過約5 mL、不超過約6 mL、不超過約7 mL、不超過約8 mL、不超過約9 mL或不超過約10 mL。在一些實施例中，在投與rAAV9病毒載體之後，使患者處於不同體位。在一些實施例中，在投與rAAV9病毒載體之後，使患者處於垂頭仰臥位，或頭向下傾斜20°-40°，例如30°。在一些實施例中，在投與rAAV9病毒載體之後，使患者處於垂頭仰臥位，或頭向下傾斜30°保持10-30分鐘，例如約15分鐘。

在一些實施例中，治療可有效預防、減少、緩解、減緩及/或部分或完全逆轉SMA (例如II型或III型SMA)之一或多種症狀。在治療之前及之後，可使用多種用於運動技能之測試來測定治療方法之功效。特定言之，Bayley Scales of Infant and Toddler Development®為用於評估嬰兒及幼童之發育之標準量測系列。Bayley N. 「Bayley Scales of Infant and Toddler Development」第3版, Harcourt Assessment Inc., 2006。特定言之，Bayley Scales®之第III版運動量表部分(Motor Scale component of Version III)(第三版)量測粗大及精細運動技能，如抓握、坐立、堆積木及攀爬樓梯。在一些實施例中，評估患者之手部在大部分時間是否握拳。在一些實施例中，評估患者以觀察其眼睛是否跟隨移動的人。在一些實施例中，評估患者是否會故意嘗試將其手部放入嘴中。在一些實施例中，評估患者以觀察在不嘗試任務時，患者是否會在大部分時間保持其手部張開。在一些實施例中，評估患者以觀察當操控小型物件時，患者是否能夠將其手腕自手掌向下自由地旋轉至手掌向上。在一些實施例中，向患者提供積木且評估以觀察患者是否使用一隻或兩隻拾取積木、將積木自一隻手轉移至另一隻手、用拇指墊或指尖抓取積木及患者是否藉由拇指與手指部分相對來抓取積木。在一些實施例中，向患者提供食物丸粒且評估以觀察患者是否用拇指墊或指尖抓取積木，及患者是否藉由拇指與手指部分相對來抓取積木。在一些實施例中，向患者提供書籍且評估以觀察患者是否翻開一頁或一次性翻開若干頁。在一些實施例中，向患者提供蠟筆或鉛筆及紙張且評估以觀察患者是否使用手掌抓握、靜態三指抓握或四指抓握來抓取蠟筆或鉛筆且在紙上做標記。在其他實施例中，評估患者以觀察在紙上做標記時，患者之抓握是否為熟練、受控及動態的。在一些實施例中，評估患者以觀察患者是否用一隻手將紙張保持在適當位置同時用另一隻手塗寫或繪畫。

在一些實施例中，評估患者以觀察患者在玩耍時是否挺伸其手臂或腿部若干次。在一些實施例中，評估患者以觀察患者可在無支撐之情況下間歇地抬起其頭部。在一些實施例中，評估患者以觀察患者是否可在無支撐之情況下保持其頭部直立至少3秒。在一些實施例中，評估患者以觀察患者是否具有協調及平衡地行走至少5步之能力。在一些實施例中，根據Bayley®-III - Gross Motor之項目43，評估患者以觀察患者是否具有協調及平衡地行走至少5步之能力。評估患者以觀察患者是否具有在無幫助或支撐表面之情況下站立之能力，及患者是否具有反饋姿勢控制。在一些實施例中，根據Bayley®-III - Gross Motor之項目40，評估患者以觀察患者是否具有在無幫助之情況下站立之能力。在一些實施例中，若患者在投與治療之後約24個月、12個月、9個月或6個月具有在無支撐之情況下站立之能力，則認為患者接受有效治療。在一些實施例中，若患者在投與治療之後約24個月、12個月、9個月或6個月具有在無幫助之情況下行走之能力(如由在呈現協調及平衡情況下獨立地行走至少五步所定義)，則認為患者接受有效治療。

另一種常用的嬰兒發育量測方式為哈默史密斯功能性運動擴展量表(HFMSE)。O'Hagen等人, 「An expanded version of the Hammersmith Functional Motor Scale for SMA II and III patients」 Neuromuscul Disord, 17(9-10):693-7；Glanzman等人, 「Validation of the Expanded Hammersmith Functional Motor Scale in spinal muscular atrophy type II and III」 J Child Neurol, 26(12):1499-1507。儘管哈默史密斯功能性運動量表可成功評估患有SMA之無法行走之個體的能力，但HFMSE提供其他13個附加項目，其可成功地區分患有II型及III型SMA之個體之運動技能。在一些實施例中，評估患者在無支撐之情況下坐立在椅子或地板上之能力。在一些實施例中，評估患者在無支撐之情況下坐立在椅子或地板上時，用一隻手觸摸其頭部之能力。在一些實施例中，評估患者在無支撐之情況下坐立在椅子或地板上時，用兩隻手觸摸其頭部之能力。在一些實施例中，評估患者在躺下時是否能夠側滾。在一些實施例中，評估患者在躺下時是否能夠自面朝上翻滾成面朝下或反之亦然。在一些實施例中，評估患者是否能夠自坐立體位以控制方式躺下。在一些實施例中，評估患者在俯臥時是否能夠支撐在前臂上。在一些實施例中，評估患者在俯臥體位時是否能夠抬頭。在一些實施例中，評估患者在俯臥時是否能夠用豎直手臂支撐保持數到3。在一些實施例中，評估患者是否能夠在不翻身之情況下自躺臥變成坐立體位。在一些實施例中，評估患者是否能夠在保持頭部直立之情況下用手及膝部支撐保持數到3。在一些實施例中，評估患者是否能夠用手及膝部向前爬。在一些實施例中，評估患者在仰臥且手臂交叉疊在胸部時是否能夠抬頭。在一些實施例中，評估患者是否能夠在用一隻手支撐或不用手支撐之情況下站立保持數到3。在一些實施例中，評估患者是否能夠在無任何幫助之情況下行走。在一些實施例中，評估患者在仰臥時是否能夠使任一個膝部向胸部移動。在一些實施例中，評估患者是否能夠在不使用手臂之情況下自高跪位變成半跪。在一些實施例中，評估患者是否能夠在不使用手臂之情況下自高跪位變成站立。在一些實施例中，評估患者是否能夠在不使用手臂之情況下自站立變成坐立。在一些實施例中，評估患者是否能夠在不使用手臂之情況下自站立變成蹲坐。在一些實施例中，評估患者是否能夠自站立向前跳躍12吋。在一些實施例中，評估患者是否能夠在無幫助之情況下或藉助於一個護欄向上或向下走4步。在一些實施例中，若患者在投與治療之後約24個月、12個月、9個月或6個月在HFMSE中呈現自基線之5-10點增加，例如8點增加，則認為患者接受有效治療。在一些實施例中，若患者在投與治療之後約24個月、12個月、9個月或6個月在HFMSE中呈現自基線之9點增加，則認為患者接受有效治療。在一些實施例中，若患者在投與治療之後約24個月、12個月、9個月或6個月在HFMSE中呈現自基線之10點增加，則認為患者接受有效治療。

在一些實施例中，藉由發育能力之變化量測治療功效。在一些實施例中，在投與rAAV9病毒載體之前進行基線量測。在一些實施例中，基線量測包含量測Bayley Scales of Infant and Toddler Development®之精細及粗大運動部分。在一些實施例中，基線量測包含量測Bayley Scales of Infant and Toddler Development®之粗大運動部分之項目43 (在無幫助之情況下行走至少5步)。在一些實施例中，基線量測包含量測Bayley Scales of Infant and Toddler Development®之粗大運動部分之項目40 (在無支撐之情況下站立至少3秒)。在一些實施例中，基線量測包含根據哈默史密斯功能性運動擴展量表(HFMSE)評估患者。在一些實施例中，藉由量測Bayley Scales of Infant and Toddler Development®之粗大運動部分之項目43 (在無幫助之情況下行走至少5步)且與基線比較來評估治療功效。在一些實施例中，藉由量測Bayley Scales of Infant and Toddler Development®之粗大運動部分之項目40 (在無支撐之情況下站立至少3秒)且與基線比較來評估治療功效。在一些實施例中，藉由根據HFMSE評估患者且與治療之前的基線比較來評估治療功效。在一些實施例中，藉由在治療之前30天內之量測值來建立基線。在一些實施例中，在治療之第30天內評估治療功效。在一些實施例中，在治療之後每月一次評估治療功效保持十二個月。在一些實施例中，將功效之評估錄影。在一些實施例中，藉由表2中展示之標準運動重要事件發育調查(Motor Milestone Development Survey)來評估顯著運動重要事件。在一些實施例中，在治療之後至少12個月、至少24個月、至少48個月、至少72個月或10年評估治療功效。

表2：運動重要事件發育調查

Developmental Milestone - Bayley Scale®項目編號	效能準則
頭部控制 - 粗大運動子測試第4項	兒童在無支撐之情況下保持頭部直立至少3秒
自背面滾動至側面 - 粗大運動子測試第20項	兒童自背部翻轉至右側及左側
在無支撐之情況下坐立 - 粗大運動子測試第26項	兒童在無支撐之情況下獨立坐立至少30秒
在具有幫助之情況下站立 - 粗大運動子測試第33項	兒童支撐自身體重至少2秒
爬行 - 粗大運動子測試第34項	兒童藉由用手及膝部爬行來向前移動至少5呎。
拉著站起來 - 粗大運動子測試第35項	兒童使用椅子或其他便利的用於支撐之物件自行站起來
在具有幫助之情況下行走 - 粗大運動子測試第37項	兒童藉由進行協調、交替跨步運動來行走
獨立站立 - 粗大運動子測試第40項	在釋放兒童手部之後，兒童獨立站立至少3秒
獨立行走 - 粗大運動子測試第43項	兒童獨立行走至少五步，呈現協調及平衡

在一些實施例中，用於評估治療功效之測試不限於Bayley Scales of Infant and Toddler Development®、哈默史密斯功能性運動擴展量表(HFMSE)或運動重要事件發育調查，但亦可包括此項技術中已知的其他運動技能測試，包括(但不限於)CHOP INTEND、TIMP、CHOP TOSS、皮博迪發育運動量表(Peabody Development Motor Scales)、布拉澤爾頓新生兒行為評估測試(Brazelton Neonatal Behavior Assessment test)、經由交互式視訊評估捕捉之能力(Ability Captured Through Interactive Video Evaluation；ACTIVE)及複合運動動作電位(CMAP)之量測。

亦涵蓋對可接受治療之患者之預先篩檢，例如根據本文中揭示之鑑別SMA (例如II型或III型SMA)之方法，以及向根據本文中揭示之標準鑑別之患者投與治療。 AAV可引起細胞及體液性免疫反應。因此，對於基於AAV之基因療法，一部分潛在患者具有預先存在之針對AAV之抗體。Jeune等人, 「Pre-existing anti-Adeno-Associated Virus antibodies as a challenge in AAV gene therapy」 Hum Gene Ther Methods, 24(2):59-67。Boutin等人, 「Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against adeno-associated virus (AAV) types 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the healthy population: implications for gene therapy using AAV vectors」 Hum Gene Ther, 21:704-712。因為即使極少量抗體亦可阻止成功轉導，前體抗AAV抗體對AAV基因療法之普遍應用造成重大阻礙。在一些實施例中，在投與AAV病毒載體之前測定患者中抗AAV9抗體效價之水準，且僅在抗體效價低於臨限值時才藉由鞘內投藥向患者提供AAV。在一些實施例中，藉由ELISA結合免疫分析法測定患者中抗AAV9抗體效價之水準。在一些實施例中，患者之抗AAV9抗體效價等於或低於1:100，如在投與治療之前藉由ELISA結合免疫分析法所測定。在一些實施例中，患者之抗AAV9抗體效價等於或低於1:50，如在投與治療之前藉由ELISA結合免疫分析法所測定。在一些實施例中，患者之抗AAV9抗體效價高於1:100，如在治療之後藉由ELISA結合免疫分析法所測定且監測1-8週或直至效價降低至低於1:100。在一些實施例中，患者之抗AAV9抗體效價高於1:100，如在治療之後藉由ELISA結合免疫分析法所測定且監測1-8週或直至效價降低至低於1:50。

在一些實施例中，可向具有高抗AAV抗體效價之患者投與一或多種免疫抑制性藥物。舉例而言，單株抗CD20抗體(諸如利妥昔單抗(rituximab))與環孢素A (cyclosporine A)之組合可降低抗AAV效價。Mingozzi等人, 「Pharmacological modulation of humoral immunity in a nonhuman primate model of AAV gene transfer for hemophilia B」 Mol Ther, 20:1410-1416。在一些實施例中，患者之抗AAV9抗體效價高於1:100，如在治療之前或之後藉由ELISA結合免疫分析法所測定，且用一或多種免疫抑制性藥物(例如類固醇，如普賴蘇穠)治療。在一些實施例中，患者之抗AAV9抗體效價高於1:50，如在治療之前或之後藉由ELISA結合免疫分析法所測定，且用一或多種免疫抑制性藥物(例如類固醇，如普賴蘇穠)治療。

在一些實施例中，在載體投藥之前及/或之後，具有高抗AAV抗體效價之患者可經歷血漿清除術以消耗中和抗體。Monteilhet等人, 「A 10 patient case report on the impact of plasmapheresis upon neutralizing factors against adeno-associated virus (AAV) types 1, 2, 6, and 8」 Mol Ther, 19(11):2084-2091。在血漿清除術期間，自患者抽取血液且藉由離心或中空纖維過濾來分離血漿及血球。接著，使血球與經處理之血漿或替代性流體(諸如含4.5%人類白蛋白之生理食鹽水)一起返回患者。治療性血球分離術之常用用途為移除不合需要的免疫球蛋白，諸如抗AAV抗體。在一些實施例中，患者之抗AAV9抗體效價高於1:100，如在治療之前或之後藉由ELISA結合免疫分析法所測定，且用血漿清除術治療。在一些實施例中，患者之抗AAV9抗體效價高於1:50，如在治療之前或之後藉由ELISA結合免疫分析法所測定，且用血漿清除術治療。

預先存在之針對AAV9之母體抗體可經由母乳或子宮內胎盤轉移而轉移至幼小患者。在一些實施例中，患者之抗AAV9抗體效價高於1:100，如在治療之前或之後藉由ELISA結合免疫分析法所測定，且改為配方奶粉餵養。在一些實施例中，患者之抗AAV9抗體效價高於1:50，如在治療之前或之後藉由ELISA結合免疫分析法所測定，且改為配方奶粉餵養。

在投與治療之前及之後，可監測患者之病狀。在一些實施例中，接受基於AAV之治療之患者可經歷低血小板計數或血小板減少，其為由低血小板計數特定表徵之病狀。可在血球計上使用經稀釋之血液樣品，藉由完全血球計數來偵測血小板減少。亦可藉由在顯微鏡下觀察用患者血液製備之載玻片(薄血液膜或外周血塗片)來偵測血小板減少。正常人類血小板計數在150,000個細胞/毫升至約450,000個細胞/毫升範圍內。

在一些實施例中，在投藥之前，患者之血小板計數高於約67,000個細胞/毫升或高於約100,000個細胞/毫升，或高於約150,000個細胞/毫升。在一些實施例中，在投藥之前，患者之血小板計數低於約150,000個細胞/毫升或低於約100,000個細胞/毫升，或低於約67,000個細胞/毫升，且監測1-8週或直至血小板計數增加至高於約67,000個細胞/毫升，或高於約100,000個細胞/毫升，或高於約150,000個細胞/毫升。在一些實施例中，當在投與病毒載體之後血小板計數低於約67,000個細胞/毫升時，可藉由血小板輸注來治療患者。在一些實施例中，在投與病毒載體之前，患者不具有血小板減少。在一些實施例中，患者在投與病毒載體之後具有血小板減少且監測約1-8週或直至患者不具有血小板減少。在一些實施例中，患者在投與病毒載體之後具有血小板減少且藉由血小板輸注來治療。

監測患者之病狀亦可涉及量測以下中之一或多者之含量之標準血液測試：血小板、血清蛋白質電泳、血清γ-麩胺醯基轉移酶(GGT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)及丙胺酸轉胺酶(ALT)、總膽紅素、葡萄糖、肌酸激酶(CK)、肌酐、血尿素氮(BUN)、電解質、鹼性磷酸酶及澱粉酶。肌鈣蛋白I含量為心臟健康之一般量度，且含量升高反映心臟損傷或心臟相關病狀。在一些實施例中，在投與病毒載體之後監測肌鈣蛋白-I含量。在一些實施例中，在投與病毒載體之前，患者之肌鈣蛋白-I含量可小於約0.3、0.2、0.15或0.1 µg/ml。在一些實施例中，在投與病毒載體之前，患者之肌鈣蛋白-I含量可小於約0.176 µg/ml。在一些實施例中，在投與病毒載體之後，患者之肌鈣蛋白-I含量可高於約0.176 µg/ml。在一些實施例中，患者在投與病毒載體之後接受心臟監測直至肌鈣蛋白-I含量小於約0.176 µg/ml。

天冬胺酸轉胺酶(AST)及丙胺酸轉胺酶(ALT)以及總膽紅素為肝功能之一般量度，而肌酐反映腎功能。AST、ALT或總膽紅素含量升高可指示肝功能障礙。在一些實施例中，患者在投與病毒載體之前具有正常肝功能。在一些實施例中，在投與病毒載體之前，患者之肝轉胺酶含量小於約8-40 U/L。在一些實施例中，在投與病毒載體之前，患者之AST或ALT含量小於約8-40 U/L。在一些實施例中，患者之γ-麩胺醯基轉移酶(GGT)低於正常值上限之3倍，例如藉由此項技術中已知之臨床標準及方法(例如CLIA標準)測定。在一些實施例中，在投與病毒載體之前，患者之膽紅素含量小於3.0 mg/dL。在一些實施例中，在投與病毒載體之前，患者之肌酐含量小於1.8 mg/dL、小於1.4 mg/dL或小於1.0 mg/dL。在一些實施例中，在投與病毒載體之前，患者之血色素(Hgb)含量在8-18 g/dL之間。在一些實施例中，在投與病毒載體之前，患者之白血球(WBC)計數小於20000個/立方毫米。

在各種實施例中，使用如本文中所描述之AAV載體之基因療法可產生針對AAV載體之抗原特異性T細胞反應，例如在基因轉移後2-4週之間。此類抗原特異性T細胞反應之一種可能結果為清除經轉導之細胞及轉基因表現損失。為了嘗試減弱針對基於AAV之療法之宿主免疫反應，可向患者提供免疫抑制劑。在一些實施例中，可藉由ELISPOT分析法量測T細胞反應。在一些實施例中，在投與載體之前，T細胞反應為100個斑點形成細胞(SFC)/10⁶ 個外周血液單核細胞(PBMC)。在一些實施例中，在投與病毒載體之前，可向患者提供糖皮質激素。在一些實施例中，在投與病毒載體之前，可向患者提供皮質類固醇。在一些實施例中，在投與病毒載體之前，可向患者提供口服類固醇。口服類固醇之實例包括(但不限於)潑尼松(prednisone)、普賴蘇穠、甲基普賴蘇穠、曲安西龍(triamcinolone)、貝塞米松(bethamethasone)、地塞米松(dexamethasone)及氫化可的松(hydrocortisone)。在一些實施例中，口服類固醇為或包含普賴蘇穠。

在一些實施例中，在投與病毒載體之前至少12-48小時(例如至少24小時)開始向患者提供預防性類固醇。在一些實施例中，在投與病毒載體之後至少10-60天(例如至少30天)向患者提供口服類固醇。在一些實施例中，每天一次投與口服類固醇。在一些實施例中，每天兩次投與口服類固醇。在一些實施例中，以約0.1-10 mg/kg，例如約1 mg/kg之劑量提供口服類固醇。在一些實施例中，以約0.1-10毫克/公斤/天，例如約1毫克/公斤/天之劑量提供口服類固醇。在一些實施例中，在投與病毒載體之後監測AST及ALT之含量。在此類實施例中，當AST及ALT含量超過正常值上限之兩倍(例如藉由此項技術中已知之臨床標準及方法所測定)或約120 IU/L時投與口服類固醇治療。在一些實施例中，投與口服類固醇治療超過30天且只要AST及ALT含量超過正常值上限之兩倍(例如藉由此項技術中已知之臨床標準及方法所測定)或只要含量超過約120 IU/L即保持投藥。在一些實施例中，只要T細胞反應高於100個SFC/10⁶ 個PBMC，則投與口服類固醇超過30天。在一些實施例中，投與口服類固醇治療超過30天，直至T細胞反應降低至低於100個SFC/10⁶ 個PBMC。在持續用皮質類固醇進行治療期間，腎上腺天然降低皮質醇之產量。若突然停止皮質類固醇治療，則身體可能經歷皮質醇不足。在一些實施例中，當向患者提供口服類固醇保持至少30天時，隨時間推移而緩慢地逐漸減少類固醇劑量。在一些實施例中，當AST及ALT含量降低至低於正常值上限之兩倍(例如藉由此項技術中已知之臨床標準及方法所測定)或約120 IU/L時逐漸減少口服類固醇劑量。在一些實施例中，逐漸減少包含逐步減少至0.5毫克/公斤/天保持約2週，接著0.25毫克/公斤/天再保持約2週。在一些其他實施例中，由醫師酌情進行口服類固醇之逐漸減少。在一些實施例中，收集血液樣品且藉由ELISA測試針對AAV9之血清抗體、藉由ELISA測試針對SMN之血清抗體或藉由ELISpots測試干擾素γ (IFN-g)。本文中亦涵蓋用於選擇將受益於本文中揭示之治療的患者之方法。在一些實施例中，患者未禁忌脊椎穿刺程序或鞘內療法之投藥。在一些實施例中，患者不具有脊柱側彎或嚴重脊柱側彎，例如由在X射線檢驗時顯而易見的脊椎≥50°彎曲所定義。在一些實施例中，患者在投與rAAV9病毒載體之2年、1年或6個月內未接受預先、計劃或預期安排的脊柱側彎修復手術或程序。在一些實施例中，患者無需侵入性通氣支持或胃飼管。在一些實施例中，患者不具有獨立站立或行走之歷史。在一些實施例中，患者在投與rAAV9病毒載體時不具有活性病毒感染。在其他實施例中，此等病毒感染包括(但不限於)人類免疫缺陷病毒(HIV)或血清學陽性B型或C型肝炎或茲卡病毒。在一些實施例中，患者不具有伴隨疾病，例如嚴重腎或肝損傷、已知的癲癇發作、糖尿病、特發性低鈣尿症或症狀性心肌病。在一些實施例中，患者在投與rAAV9病毒載體之四週內不具有嚴重非肺部感染或呼吸道感染(例如腎盂腎炎或腦膜炎)。在一些實施例中，患者不具有細菌性腦膜炎、腦部或脊髓疾病之歷史。在一些實施例中，患者不具有已知的對糖皮質類固醇(例如潑尼松或普賴蘇穠)或其賦形劑之過敏性或過敏反應。在一些實施例中，患者不具有已知的對碘或含碘產品之過敏性或過敏反應。在一些實施例中，患者未伴隨使用用於治療肌病或神經病之藥物。在一些實施例中，患者在投與rAAV9病毒載體之三個月內未接受免疫抑制性療法、血漿清除術、免疫調節劑，諸如阿達木單抗。

本文中亦涵蓋組合療法。如本文中所使用之組合包含同時治療或依序治療。方法之組合可包括添加某些標準醫學治療(例如含利魯唑(riluzole)之ALS)及/或與新穎療法之組合。舉例而言，可用於所揭示之組合療法中的其他用於SMA之療法包括反義寡核苷酸(ASO)，其改變與前體mRNA之結合且改變其剪接模式。Singh.等人, 「A multi-exon-skipping detection assay reveals surprising diversity of splice isoforms of spinal muscular atrophy genes」 Plos One, 7(11):e49595。在一些實施例中，可使用諾西那生(nusinersen)(美國專利案8,361,977及US 8,980,853，其以引用之方式併入本文中)。諾西那生為經批准之ASO，其靶向SMN2前體mRNA之內含子6、外顯子7或內含子7，調節SMN2之剪接以更有效地產生全長SMN蛋白質。在一些實施例中，包含AAV9病毒載體之治療方法與肌肉增強劑組合投與。在一些實施例中，所揭示之治療方法包含投與AAV9病毒載體與神經保護劑之組合。在一些實施例中，所揭示之治療方法包含投與AAV9病毒載體與靶向SMN之基於反義寡核苷酸之藥物之組合。在一些實施例中，所揭示之治療方法包含投與AAV9病毒載體與諾西那生之組合。在一些實施例中，所揭示之治療方法包含投與AAV9病毒載體與肌肉抑制素抑制藥物之組合。在一些實施例中，所揭示之治療方法包含投與AAV9病毒載體與司他莫單抗之組合。在一些實施例中，所揭示之治療方法包含投與AAV9病毒載體與超過一種其他治療之組合。

可根據此項技術中已知之製備及純化方法製備本文中揭示之rAAV病毒載體。在一些實施例中，純化方法之目的在於移除來自宿主細胞之污染物及在收集病毒載體期間添加之化學物質。在一些實施例中，使用PCT/US2018/058744中揭示之方法，且該PCT係以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，該等方法以約1×10¹³ vg/mL與1×10¹⁵ vg/mL之間，例如約1-8×10¹³ vg/mL之間的濃度產生rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法以約1.0×10¹³ vg - 9.9×10¹⁴ vg之劑量(例如單位劑量)產生rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法以約1.0×10¹³ vg - 5.0×10¹⁴ vg之劑量(例如單位劑量)產生rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法以約5.0×10¹³ vg - 3.0×10¹⁴ vg之劑量(例如單位劑量)產生rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法以約6.0×10¹³ vg之劑量(例如單位劑量)產生rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法以約1.2×10¹⁴ vg之劑量(例如單位劑量)產生rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法以約2.4×10¹⁴ vg之劑量(例如單位劑量)產生rAAV病毒載體。

在一些實施例中，該等方法產生具有小於約10%、小於約8%、小於約7%或小於約5%空病毒衣殼之rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法產生具有每1×10¹³ vg/mL小於約100 ng/mL之宿主細胞蛋白質之rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法產生具有每1×10¹³ vg/mL小於約5×10⁶ pg/mL、小於約1×10⁶ pg/mL、小於約7.5×10⁵ pg/mL或小於6.8×10⁵ pg/mL之殘餘宿主細胞DNA (hcDNA)之rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法產生具有每1.0×10¹³ vg/mL小於約10 ng、小於約8 ng、小於約6 ng或小於約4 ng殘餘宿主細胞蛋白質(rHCP)之rAAV病毒載體。在一些實施例中，以每毫升計，該等方法所產生之rAAV (例如AAV9)病毒載體基因組中之至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約100%為功能性的。在一些實施例中，該等方法產生具有小於或等於1.7×10⁶ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)或1×10⁵ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)至1.7×10⁶ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)之殘餘質體DNA之rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法產生具有每1.0×10¹³ vg小於0.2 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.1 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.09 ng之全能核酸酶濃度之rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法產生具有每1.0×10¹³ vg小於0.5 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.3 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.22 ng之牛血清白蛋白(BSA)濃度之rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1.0×10¹³ vg/mL小於約1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.75 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.5 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.4 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.35 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.3 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.25 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.2 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.13 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.05 EU/mL或每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.02 EU/mL之內毒素含量。在一些實施例中，該等方法產生具有小於100 µg/g (ppm)、小於50 µg/g (ppm)或小於30 µg/g (ppm)之銫濃度之rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法產生具有約10-100 ppm、15-90 ppm或約20-80 ppm泊洛沙姆188之rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法產生以每個容器計，尺寸≥25 µm之顆粒少於2000、少於1500、少於1000或少於600個之rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法產生以每個容器計，尺寸≥10 µm之顆粒少於10000、少於8000、少於1000或少於6000個之rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法產生具有7.5至8.5之間、7.6至8.4之間或7.8至8.3之間的pH值之rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法產生具有330至490 mOsm/kg之間、360至460 mOsm/kg之間或390至430 mOsm/kg之間的重量莫耳滲透濃度之rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法產生具有每1.0×10¹³ vg約1.0×10⁸ - 10.0×10¹⁰ IU、每1.0×10¹³ vg約2.5×10⁸ - 9.0×10¹⁰ IU或每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU之感染效價之rAAV病毒載體。在一些實施例中，基於活體外基於細胞之分析法，該等方法產生相對於參考標準及/或適合的對照物具有約30-150%、約60-140%或約70-130%相對效能之rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法產生具有每1.0×10¹³ vg約10-500 µg、每1.0×10¹³ vg約50-400 µg或每1.0×10¹³ vg約100-300 µg之總蛋白質含量之rAAV病毒載體。在一些實施例中，該等方法產生具有活體內效能之rAAV病毒載體，如藉由以7.5×10¹³ vg/kg之劑量給藥之SMNΔ7小鼠之中值存活期大於15天、大於20天、大於22天或大於24天所測定。

在以上實施例中之任一者中，製備及/或純化方法可產生rAAV病毒載體，其可經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在以上實施例中之任一者中，製備及/或純化方法可產生rAAV病毒載體，其可經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在以上實施例中之任一者中，製備及/或純化方法可產生rAAV病毒載體，其可經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。

舉例而言，在一些實施例中，該等方法產生具有小於約10%、小於約8%、小於約7%或小於約5%空病毒衣殼之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生具有小於約10%、小於約8%、小於約7%或小於約5%空病毒衣殼之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生具有小於約10%、小於約8%、小於約7%或小於約5%空病毒衣殼之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有小於約10%、小於約8%、小於約7%或小於約5%空病毒衣殼。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有小於約10%、小於約8%、小於約7%或小於約5%空病毒衣殼。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有小於約10%、小於約8%、小於約7%或小於約5%空病毒衣殼。

在一些實施例中，該等方法產生具有每1×10¹³ vg/mL小於約100 ng/mL之宿主細胞蛋白質之rAAV病毒載體，且rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生具有每1×10¹³ vg/mL小於約100 ng/mL之宿主細胞蛋白質之rAAV病毒載體，且rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生具有每1×10¹³ vg/mL小於約100 ng/mL之宿主細胞蛋白質之rAAV病毒載體，且rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1×10¹³ vg小於約100 ng/mL之宿主細胞蛋白質。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1×10¹³ vg小於約100 ng/mL之宿主細胞蛋白質。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1×10¹³ vg小於約100 ng/mL之宿主細胞蛋白質。

在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1×10¹³ vg/mL小於約5×10⁶ pg/mL、小於約1×10⁶ pg/mL、小於約7.5×10⁵ pg/mL或小於6.8×10⁵ pg/mL之殘餘宿主細胞DNA (hcDNA)，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1×10¹³ vg/mL小於約5×10⁶ pg/mL、小於約1×10⁶ pg/mL、小於約7.5×10⁵ pg/mL或小於6.8×10⁵ pg/mL之殘餘宿主細胞DNA (hcDNA)，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1×10¹³ vg/mL小於約5×10⁶ pg/mL、小於約1×10⁶ pg/mL、小於約7.5×10⁵ pg/mL或小於6.8×10⁵ pg/mL之殘餘宿主細胞DNA (hcDNA)，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1×10¹³ vg/mL小於約5×10⁶ pg/mL、小於約1×10⁶ pg/mL、小於約7.5×10⁵ pg/mL或小於6.8×10⁵ pg/mL之殘餘宿主細胞DNA (hcDNA)。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1×10¹³ vg/mL小於約5×10⁶ pg/mL、小於約1×10⁶ pg/mL、小於約7.5×10⁵ pg/mL或小於6.8×10⁵ pg/mL之殘餘宿主細胞DNA (hcDNA)。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1×10¹³ vg/mL小於約5×10⁶ pg/mL、小於約1×10⁶ pg/mL、小於約7.5×10⁵ pg/mL或小於6.8×10⁵ pg/mL之殘餘宿主細胞DNA (hcDNA)。

在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1.0×10¹³ vg/mL小於約10 ng、小於約8 ng、小於約6 ng或小於約4 ng殘餘宿主細胞蛋白質(rHCP)，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1.0×10¹³ vg/mL小於約10 ng、小於約8 ng、小於約6 ng或小於約4 ng殘餘宿主細胞蛋白質(rHCP)，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1.0×10¹³ vg/mL小於約10 ng、小於約8 ng、小於約6 ng或小於約4 ng殘餘宿主細胞蛋白質(rHCP)，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1.0×10¹³ vg/mL小於約10 ng、小於約8 ng、小於約6 ng或小於約4 ng殘餘宿主細胞蛋白質(rHCP)。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1.0×10¹³ vg/mL小於約10 ng、小於約8 ng、小於約6 ng或小於約4 ng殘餘宿主細胞蛋白質(rHCP)。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1.0×10¹³ vg/mL小於約10 ng、小於約8 ng、小於約6 ng或小於約4 ng殘餘宿主細胞蛋白質(rHCP)。

在一些實施例中，以每毫升計，該等方法產生之AAV9病毒載體基因組中之至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約100%為功能性的，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，以每毫升計，該等方法產生之AAV9病毒載體基因組中之至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約100%為功能性的，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，以每毫升計，該等方法產生之AAV9病毒載體基因組中之至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約100%為功能性的，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中以每毫升計，至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約100%的rAAV (例如rAAV9)病毒載體基因組為功能性的。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中以每毫升計，至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約100%的rAAV (例如rAAV9)病毒載體基因組為功能性的。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中以每毫升計，至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約100%的rAAV (例如rAAV9)病毒載體基因組為功能性的。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有小於或等於1.7×10⁶ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)，或1×10⁵ pg/ml(每1×10¹³ vg/ml)至1.7×10⁶ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)之殘餘質體DNA，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有小於或等於1.7×10⁶ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)，或1×10⁵ pg/ml(每1×10¹³ vg/ml)至1.7×10⁶ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)之殘餘質體DNA，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有小於或等於1.7×10⁶ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)，或1×10⁵ pg/ml(每1×10¹³ vg/ml)至1.7×10⁶ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)之殘餘質體DNA，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有小於或等於1.7×10⁶ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)，或1×10⁵ pg/ml(每1×10¹³ vg/ml)至1.7×10⁶ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)之殘餘質體DNA。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有小於或等於1.7×10⁶ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)，或1×10⁵ pg/ml(每1×10¹³ vg/ml)至1.7×10⁶ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)之殘餘質體DNA。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有小於或等於1.7×10⁶ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)，或1×10⁵ pg/ml(每1×10¹³ vg/ml)至1.7×10⁶ pg/ml (每1×10¹³ vg/ml)之殘餘質體DNA。

在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1.0×10¹³ vg小於0.2 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.1 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.09 ng之全能核酸酶濃度，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1.0×10¹³ vg小於0.2 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.1 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.09 ng之全能核酸酶濃度，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1.0×10¹³ vg小於0.2 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.1 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.09 ng之全能核酸酶濃度，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1.0×10¹³ vg小於0.2 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.1 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.09 ng之全能核酸酶濃度。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1.0×10¹³ vg小於0.2 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.1 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.09 ng之全能核酸酶濃度。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1.0×10¹³ vg小於0.2 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.1 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.09 ng之全能核酸酶濃度。

在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1.0×10¹³ vg小於0.5 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.3 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.22 ng之牛血清白蛋白(BSA)濃度，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1.0×10¹³ vg小於0.5 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.3 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.22 ng之牛血清白蛋白(BSA)濃度，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1.0×10¹³ vg小於0.5 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.3 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.22 ng之牛血清白蛋白(BSA)濃度，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1.0×10¹³ vg小於0.5 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.3 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.22 ng之牛血清白蛋白(BSA)濃度。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1.0×10¹³ vg小於0.5 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.3 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.22 ng之牛血清白蛋白(BSA)濃度。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1.0×10¹³ vg小於0.5 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.3 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.22 ng之牛血清白蛋白(BSA)濃度。

在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1.0×10¹³ vg/mL小於約1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.75 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.5 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.4 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.35 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.3 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.25 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.2 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.13 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.05 EU/mL或每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.02 EU/mL之內毒素含量，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1.0×10¹³ vg/mL小於約1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.75 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.5 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.4 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.35 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.3 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.25 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.2 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.13 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.05 EU/mL或每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.02 EU/mL之內毒素含量，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1.0×10¹³ vg/mL小於約1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.75 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.5 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.4 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.35 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.3 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.25 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.2 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.13 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.05 EU/mL或每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.02 EU/mL之內毒素含量，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1.0×10¹³ vg/mL小於約1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.75 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.5 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.4 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.35 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.3 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.25 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.2 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.13 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.05 EU/mL或每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.02 EU/mL之內毒素含量。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1.0×10¹³ vg/mL小於約1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.75 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.5 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.4 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.35 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.3 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.25 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.2 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.13 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.05 EU/mL或每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.02 EU/mL之內毒素含量。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1.0×10¹³ vg/mL小於約1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.75 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.5 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.4 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.35 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.3 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.25 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.2 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.13 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.05 EU/mL或每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.02 EU/mL之內毒素含量。

在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有小於100 µg/g (ppm)、小於50 µg/g (ppm)或小於30 µg/g (ppm)之銫濃度，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有小於100 µg/g (ppm)、小於50 µg/g (ppm)或小於30 µg/g (ppm)之銫濃度，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有小於100 µg/g (ppm)、小於50 µg/g (ppm)或小於30 µg/g (ppm)之銫濃度，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有小於100 µg/g (ppm)、小於50 µg/g (ppm)或小於30 µg/g (ppm)之銫濃度。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有小於100 µg/g (ppm)、小於50 µg/g (ppm)或小於30 µg/g (ppm)之銫濃度。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有小於100 µg/g (ppm)、小於50 µg/g (ppm)或小於30 µg/g (ppm)之銫濃度。

在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有約10-100 ppm、15-90 ppm或約20-80 ppm泊洛沙姆188，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有約10-100 ppm、15-90 ppm或約20-80 ppm泊洛沙姆188，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有約10-100 ppm、15-90 ppm或約20-80 ppm泊洛沙姆188，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有約10-100 ppm、15-90 ppm或約20-80 ppm泊洛沙姆188。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有約10-100 ppm、15-90 ppm或約20-80 ppm泊洛沙姆188。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有約10-100 ppm、15-90 ppm或約20-80 ppm泊洛沙姆188。

在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，以每個容器計，其中尺寸≥25 µm之顆粒少於2000、少於1500、少於1000或少於600個，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，以每個容器計，其中尺寸≥25 µm之顆粒少於2000、少於1500、少於1000或少於600個，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，以每個容器計，其中尺寸≥25 µm之顆粒少於2000、少於1500、少於1000或少於600個，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中以每個容器計，rAAV病毒載體中尺寸≥25 µm之顆粒少於2000、少於1500、少於1000或少於600個。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中以每個容器計，rAAV病毒載體中尺寸≥25 µm之顆粒少於2000、少於1500、少於1000或少於600個。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中以每個容器計，rAAV病毒載體中尺寸≥25 µm之顆粒少於2000、少於1500、少於1000或少於600個。

在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，以每個容器計，其中尺寸≥10 µm之顆粒少於10000、少於8000、少於1000或少於6000個，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，以每個容器計，其中尺寸≥10 µm之顆粒少於10000、少於8000、少於1000或少於6000個，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，以每個容器計，其中尺寸≥10 µm之顆粒少於10000、少於8000、少於1000或少於6000個，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中以每個容器計，rAAV病毒載體中尺寸≥10 µm之顆粒少於10000、少於8000、少於1000或少於6000個。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中以每個容器計，rAAV病毒載體中尺寸≥10 µm之顆粒少於10000、少於8000、少於1000或少於6000個。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中以每個容器計，rAAV病毒載體中尺寸≥10 µm之顆粒少於10000、少於8000、少於1000或少於6000個。

在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其pH值在7.5至8.5之間、在7.6至8.4之間或在7.8至8.3之間，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其pH值在7.5至8.5之間、在7.6至8.4之間或在7.8至8.3之間，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其pH值在7.5至8.5之間、在7.6至8.4之間或在7.8至8.3之間，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體之pH值在7.5至8.5之間、在7.6至8.4之間或在7.8至8.3之間。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體之pH值在7.5至8.5之間、在7.6至8.4之間或在7.8至8.3之間。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體之pH值在7.5至8.5之間、在7.6至8.4之間或在7.8至8.3之間。

在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其重量莫耳滲透濃度在330至490 mOsm/kg之間、在360至460 mOsm/kg之間或在390至430 mOsm/kg之間，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其重量莫耳滲透濃度在330至490 mOsm/kg之間、在360至460 mOsm/kg之間或在390至430 mOsm/kg之間，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其重量莫耳滲透濃度在330至490 mOsm/kg之間、在360至460 mOsm/kg之間或在390至430 mOsm/kg之間，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體之重量莫耳滲透濃度在330至490 mOsm/kg之間、在360至460 mOsm/kg之間或在390至430 mOsm/kg之間。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體之重量莫耳滲透濃度在330至490 mOsm/kg之間、在360至460 mOsm/kg之間或在390至430 mOsm/kg之間。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體之重量莫耳滲透濃度在330至490 mOsm/kg之間、在360至460 mOsm/kg之間或在390至430 mOsm/kg之間。

在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1.0×10¹³ vg約1.0×10⁸ - 10.0×10¹⁰ IU、每1.0×10¹³ vg約2.5×10⁸ - 9.0×10¹⁰ IU或每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU之感染效價，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1.0×10¹³ vg約1.0×10⁸ - 10.0×10¹⁰ IU、每1.0×10¹³ vg約2.5×10⁸ - 9.0×10¹⁰ IU或每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU之感染效價，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其具有每1.0×10¹³ vg約1.0×10⁸ - 10.0×10¹⁰ IU、每1.0×10¹³ vg約2.5×10⁸ - 9.0×10¹⁰ IU或每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU之感染效價，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1.0×10¹³ vg約1.0×10⁸ - 10.0×10¹⁰ IU、每1.0×10¹³ vg約2.5×10⁸ - 9.0×10¹⁰ IU或每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU之感染效價。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1.0×10¹³ vg約1.0×10⁸ - 10.0×10¹⁰ IU、每1.0×10¹³ vg約2.5×10⁸ - 9.0×10¹⁰ IU或每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU之感染效價。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有每1.0×10¹³ vg約1.0×10⁸ - 10.0×10¹⁰ IU、每1.0×10¹³ vg約2.5×10⁸ - 9.0×10¹⁰ IU或每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU之感染效價。

在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，基於活體外基於細胞之分析法，其相對於參考標準及/或適合的對照物具有約30-150%、約60-140%或約70-130%相對效能，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，基於活體外基於細胞之分析法，其相對於參考標準及/或適合的對照物具有約30-150%、約60-140%或約70-130%相對效能，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，基於活體外基於細胞之分析法，其相對於參考標準及/或適合的對照物具有約30-150%、約60-140%或約70-130%相對效能，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中基於活體外基於細胞之分析法，rAAV病毒載體相對於參考標準及/或適合的對照物具有約30-150%、約60-140%或約70-130%相對效能。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中基於活體外基於細胞之分析法，rAAV病毒載體相對於參考標準及/或適合的對照物具有約30-150%、約60-140%或約70-130%相對效能。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中基於活體外基於細胞之分析法，rAAV病毒載體相對於參考標準及/或適合的對照物具有約30-150%、約60-140%或約70-130%相對效能。

在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其總蛋白質含量為每1.0×10¹³ vg約10-500 µg、每1.0×10¹³ vg約50-400 µg或每1.0×10¹³ vg約100-300 µg，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其總蛋白質含量為每1.0×10¹³ vg約10-500 µg、每1.0×10¹³ vg約50-400 µg或每1.0×10¹³ vg約100-300 µg，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生rAAV病毒載體，其總蛋白質含量為每1.0×10¹³ vg約10-500 µg、每1.0×10¹³ vg約50-400 µg或每1.0×10¹³ vg約100-300 µg，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體之總蛋白質含量為每1.0×10¹³ vg約10-500 µg、每1.0×10¹³ vg約50-400 µg或每1.0×10¹³ vg約100-300 µg。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體之總蛋白質含量為每1.0×10¹³ vg約10-500 µg、每1.0×10¹³ vg約50-400 µg或每1.0×10¹³ vg約100-300 µg。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體之總蛋白質含量為每1.0×10¹³ vg約10-500 µg、每1.0×10¹³ vg約50-400 µg或每1.0×10¹³ vg約100-300 µg。

在一些實施例中，該等方法產生具有活體內效能之rAAV病毒載體，如藉由以7.5×10¹³ vg/kg之劑量給藥之SMNΔ7小鼠之中值存活期大於15天、大於20天、大於22天或大於24天所測定，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約6.0×10¹³ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生具有活體內效能之rAAV病毒載體，如藉由以7.5×10¹³ vg/kg之劑量給藥之SMNΔ7小鼠之中值存活期大於15天、大於20天、大於22天或大於24天所測定，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，該等方法產生具有活體內效能之rAAV病毒載體，如藉由以7.5×10¹³ vg/kg之劑量給藥之SMNΔ7小鼠之中值存活期大於15天、大於20天、大於22天或大於24天所測定，其中rAAV病毒載體經調配以用於投藥及/或以約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有活體內效能，如藉由以7.5×10¹³ vg/kg之劑量給藥之SMNΔ7小鼠之中值存活期大於15天、大於20天、大於22天或大於24天所測定。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有活體內效能，如藉由以7.5×10¹³ vg/kg之劑量給藥之SMNΔ7小鼠之中值存活期大於15天、大於20天、大於22天或大於24天所測定。在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體，其中rAAV病毒載體具有活體內效能，如藉由以7.5×10¹³ vg/kg之劑量給藥之SMNΔ7小鼠之中值存活期大於15天、大於20天、大於22天或大於24天所測定。

在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體及以下釋放標準中之一或多者：小於約10%、小於約8%、小於約7%或小於約5%空病毒衣殼；每1×10¹³ vg/mL小於約100 ng/mL之宿主細胞蛋白質；每1×10¹³ vg/mL小於約5×10⁶ pg/mL、小於約1×10⁶ pg/mL、小於約7.5×10⁵ pg/mL或小於6.8×10⁵ pg/mL之殘餘宿主細胞DNA (hcDNA)；每1.0×10¹³ vg/mL小於約10 ng、小於約8 ng、小於約6 ng或小於約4 ng殘餘宿主細胞蛋白質(rHCP)；以每毫升計，至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約100%的rAAV病毒載體基因組為功能性的；小於或等於1.7×10⁶ pg/mL (每1×10¹³ vg/mL)，或1×10⁵ pg/mL (每1×10¹³ vg/mL)至1.7×10⁶ pg/mL (每1×10¹³ vg/mL)之殘餘質體DNA；每1.0×10¹³ vg小於0.2 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.1 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.09 ng之全能核酸酶濃度；每1.0×10¹³ vg小於0.5 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.3 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.22 ng之牛血清白蛋白(BSA)濃度；每1.0×10¹³ vg/mL小於約1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.75 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.5 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.4 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.35 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.3 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.25 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.2 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.13 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.05 EU/mL或每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.02 EU/mL之內毒素含量；銫濃度小於100 µg/g (ppm)、小於50 µg/g (ppm)或小於30 µg/g (ppm)；約10-100 ppm、15-90 ppm或約20-80 ppm泊洛沙姆188；以每個容器計，尺寸≥25 µm之顆粒少於2000、少於1500、少於1000或少於600個；以每個容器計，尺寸≥10 µm之顆粒少於10000、少於8000、少於1000或少於6000個；pH值在7.5至8.5之間、在7.6至8.4之間或在7.8至8.3之間；重量莫耳滲透濃度在330至490 mOsm/kg之間、在360至460 mOsm/kg之間或在390至430 mOsm/kg之間；感染效價為每1.0×10¹³ vg約1.0×10⁸ - 10.0×10¹⁰ IU、每1.0×10¹³ vg約2.5×10⁸ - 9.0×10¹⁰ IU或每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU；基於活體外基於細胞之分析法，相對於參考標準及/或適合的對照物約30-150%、約60-140%或約70-130%相對效能；總蛋白質含量為每1.0×10¹³ vg約10-500 µg、每1.0×10¹³ vg約50-400 µg或每1.0×10¹³ vg約100-300 µg；活體內效能，如藉由以7.5×10¹³ vg/kg之劑量給藥之SMNΔ7小鼠之中值存活期大於15天、大於20天、大於22天或大於24天所測定。

在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體及以下釋放標準中之一或多者：pH值為約7.7-8.3；重量莫耳滲透濃度為約390-430 mOsm/kg；以每個容器計，尺寸≥25 µm之顆粒少於約600個；以每個容器計，尺寸≥10 µm之顆粒少於約6000個；基因組效價為約1.7×10¹³ - 5.3×10¹³ vg/mL；感染效價為每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU；總蛋白質含量為每1.0×10¹³ vg約100-300 µg；Pluronic F-68含量為約20-80 ppm；基於活體外基於細胞之分析法，相對效能為約70-130%，其中該效能係相對於參考標準及/或適合的對照物；由在7.5×10¹³ vg/kg之劑量下，SMNΔ7小鼠模型中之中值存活期大於或等於24天表徵之活體內效能；小於約5%空衣殼；總純度大於或等於約95%；小於或等於約0.13 EU/mL之內毒素。

在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約6.0×10¹³ vg之單位劑量之rAAV病毒載體及以下釋放標準中之一或多者：每1.0×10¹³ vg小於約0.09 ng全能核酸酶；小於約30 µg/g (ppm)銫；約20-80 ppm泊洛沙姆188；每1.0×10¹³ vg小於約0.22 ng BSA；每1.0×10¹³ vg小於約6.8×10⁵ pg殘餘質體DNA；每1.0×10¹³ vg小於約1.1×10⁵ pg殘餘hcDNA；每1.0×10¹³ vg小於約4 ng rHCP；pH值為約7.7-8.3；重量莫耳滲透濃度為約390-430 mOsm/kg；以每個容器計，尺寸≥25 µm之顆粒少於約600個；以每個容器計，尺寸≥10 µm之顆粒少於約6000個；基因組效價為約1.7×10¹³ - 5.3×10¹³ vg/mL；感染效價為每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU；總蛋白質含量為每1.0×10¹³ vg約100-300 µg；基於活體外基於細胞之分析法，相對效能為約70-130%，其中該效能係相對於參考標準及/或適合的對照物；小於約5%空衣殼。

在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體及以下釋放標準中之一或多者：小於約10%、小於約8%、小於約7%或小於約5%空病毒衣殼；每1×10¹³ vg/mL小於約100 ng/mL之宿主細胞蛋白質；每1×10¹³ vg/mL小於約5×10⁶ pg/mL、小於約1×10⁶ pg/mL、小於約7.5×10⁵ pg/mL或小於6.8×10⁵ pg/mL之殘餘宿主細胞DNA (hcDNA)；每1.0×10¹³ vg/mL小於約10 ng、小於約8 ng、小於約6 ng或小於約4 ng殘餘宿主細胞蛋白質(rHCP)；以每毫升計，至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約100%的rAAV病毒載體基因組為功能性的；小於或等於1.7×10⁶ pg/mL (每1×10¹³ vg/mL)，或1×10⁵ pg/mL (每1×10¹³ vg/mL)至1.7×10⁶ pg/mL (每1×10¹³ vg/mL)之殘餘質體DNA；每1.0×10¹³ vg小於0.2 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.1 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.09 ng之全能核酸酶濃度；每1.0×10¹³ vg小於0.5 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.3 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.22 ng之牛血清白蛋白(BSA)濃度；每1.0×10¹³ vg/mL小於約1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.75 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.5 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.4 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.35 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.3 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.25 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.2 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.13 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.05 EU/mL或每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.02 EU/mL之內毒素含量；銫濃度小於100 µg/g (ppm)、小於50 µg/g (ppm)或小於30 µg/g (ppm)；約10-100 ppm、15-90 ppm或約20-80 ppm泊洛沙姆188；以每個容器計，尺寸≥25 µm之顆粒少於2000、少於1500、少於1000或少於600個；以每個容器計，尺寸≥10 µm之顆粒少於10000、少於8000、少於1000或少於6000個；pH值在7.5至8.5之間、在7.6至8.4之間或在7.8至8.3之間；重量莫耳滲透濃度在330至490 mOsm/kg之間、在360至460 mOsm/kg之間或在390至430 mOsm/kg之間；感染效價為每1.0×10¹³ vg約1.0×10⁸ - 10.0×10¹⁰ IU、每1.0×10¹³ vg約2.5×10⁸ - 9.0×10¹⁰ IU或每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU；基於活體外基於細胞之分析法，相對於參考標準及/或適合的對照物約30-150%、約60-140%或約70-130%相對效能；總蛋白質含量為每1.0×10¹³ vg約10-500 µg、每1.0×10¹³ vg約50-400 µg或每1.0×10¹³ vg約100-300 µg；活體內效能，如藉由以7.5×10¹³ vg/kg之劑量給藥之SMNΔ7小鼠之中值存活期大於15天、大於20天、大於22天或大於24天所測定。

在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體及以下釋放標準中之一或多者：pH值為約7.7-8.3；重量莫耳滲透濃度為約390-430 mOsm/kg；以每個容器計，尺寸≥25 µm之顆粒少於約600個；以每個容器計，尺寸≥10 µm之顆粒少於約6000個；基因組效價為約1.7×10¹³ - 5.3×10¹³ vg/mL；感染效價為每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU；總蛋白質含量為每1.0×10¹³ vg約100-300 µg；Pluronic F-68含量為約20-80 ppm；基於活體外基於細胞之分析法，相對效能為約70-130%，其中該效能係相對於參考標準及/或適合的對照物；由在7.5×10¹³ vg/kg之劑量下，SMNΔ7小鼠模型中之中值存活期大於或等於24天表徵之活體內效能；小於約5%空衣殼；總純度大於或等於約95%；小於或等於約0.13 EU/mL之內毒素。

在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約1.2×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體及以下釋放標準中之一或多者：每1.0×10¹³ vg小於約0.09 ng全能核酸酶；小於約30 µg/g (ppm)銫；約20-80 ppm泊洛沙姆188；每1.0×10¹³ vg小於約0.22 ng BSA；每1.0×10¹³ vg小於約6.8×10⁵ pg殘餘質體DNA；每1.0×10¹³ vg小於約1.1×10⁵ pg殘餘hcDNA；每1.0×10¹³ vg小於約4 ng rHCP；pH值為約7.7-8.3；重量莫耳滲透濃度為約390-430 mOsm/kg；以每個容器計，尺寸≥25 µm之顆粒少於約600個；以每個容器計，尺寸≥10 µm之顆粒少於約6000個；基因組效價為約1.7×10¹³ - 5.3×10¹³ vg/mL；感染效價為每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU；總蛋白質含量為每1.0×10¹³ vg約100-300 µg；基於活體外基於細胞之分析法，相對效能為約70-130%，其中該效能係相對於參考標準及/或適合的對照物；小於約5%空衣殼。

在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體及以下釋放標準中之一或多者：小於約10%、小於約8%、小於約7%或小於約5%空病毒衣殼；每1×10¹³ vg/mL小於約100 ng/mL之宿主細胞蛋白質；每1×10¹³ vg/mL小於約5×10⁶ pg/mL、小於約1×10⁶ pg/mL、小於約7.5×10⁵ pg/mL或小於6.8×10⁵ pg/mL之殘餘宿主細胞DNA (hcDNA)；每1.0×10¹³ vg/mL小於約10 ng、小於約8 ng、小於約6 ng或小於約4 ng殘餘宿主細胞蛋白質(rHCP)；以每毫升計，至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約100%的rAAV病毒載體基因組為功能性的；小於或等於1.7×10⁶ pg/mL (每1×10¹³ vg/mL)，或1×10⁵ pg/mL (每1×10¹³ vg/mL)至1.7×10⁶ pg/mL (每1×10¹³ vg/mL)之殘餘質體DNA；每1.0×10¹³ vg小於0.2 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.1 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.09 ng之全能核酸酶濃度；每1.0×10¹³ vg小於0.5 ng、每1.0×10¹³ vg小於0.3 ng或每1.0×10¹³ vg小於0.22 ng之牛血清白蛋白(BSA)濃度；每1.0×10¹³ vg/mL小於約1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.75 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.5 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.4 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.35 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.3 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.25 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.2 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.13 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.1 EU/mL、每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.05 EU/mL或每1.0×10¹³ vg/mL小於約0.02 EU/mL之內毒素含量；銫濃度小於100 µg/g (ppm)、小於50 µg/g (ppm)或小於30 µg/g (ppm)；約10-100 ppm、15-90 ppm或約20-80 ppm泊洛沙姆188；以每個容器計，尺寸≥25 µm之顆粒少於2000、少於1500、少於1000或少於600個；以每個容器計，尺寸≥10 µm之顆粒少於10000、少於8000、少於1000或少於6000個；pH值在7.5至8.5之間、在7.6至8.4之間或在7.8至8.3之間；重量莫耳滲透濃度在330至490 mOsm/kg之間、在360至460 mOsm/kg之間或在390至430 mOsm/kg之間；感染效價為每1.0×10¹³ vg約1.0×10⁸ - 10.0×10¹⁰ IU、每1.0×10¹³ vg約2.5×10⁸ - 9.0×10¹⁰ IU或每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU；基於活體外基於細胞之分析法，相對於參考標準及/或適合的對照物約30-150%、約60-140%或約70-130%相對效能；總蛋白質含量為每1.0×10¹³ vg約10-500 µg、每1.0×10¹³ vg約50-400 µg或每1.0×10¹³ vg約100-300 µg；活體內效能，如藉由以7.5×10¹³ vg/kg之劑量給藥之SMNΔ7小鼠之中值存活期大於15天、大於20天、大於22天或大於24天所測定。

在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體及以下釋放標準中之一或多者：pH值為約7.7-8.3；重量莫耳滲透濃度為約390-430 mOsm/kg；以每個容器計，尺寸≥25 µm之顆粒少於約600個；以每個容器計，尺寸≥10 µm之顆粒少於約6000個；基因組效價為約1.7×10¹³ - 5.3×10¹³ vg/mL；感染效價為每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU；總蛋白質含量為每1.0×10¹³ vg約100-300 µg；Pluronic F-68含量為約20-80 ppm；基於活體外基於細胞之分析法，相對效能為約70-130%，其中該效能係相對於參考標準及/或適合的對照物；由在7.5×10¹³ vg/kg之劑量下，SMNΔ7小鼠模型中之中值存活期大於或等於24天表徵之活體內效能；小於約5%空衣殼；總純度大於或等於約95%；小於或等於約0.13 EU/mL之內毒素。

在一些實施例中，調配物或醫藥組合物包含約2.4×10¹⁴ vg之單位劑量之rAAV病毒載體及以下釋放標準中之一或多者：每1.0×10¹³ vg小於約0.09 ng全能核酸酶；小於約30 µg/g (ppm)銫；約20-80 ppm泊洛沙姆188；每1.0×10¹³ vg小於約0.22 ng BSA；每1.0×10¹³ vg小於約6.8×10⁵ pg殘餘質體DNA；每1.0×10¹³ vg小於約1.1×10⁵ pg殘餘hcDNA；每1.0×10¹³ vg小於約4 ng rHCP；pH值為約7.7-8.3；重量莫耳滲透濃度為約390-430 mOsm/kg；以每個容器計，尺寸≥25 µm之顆粒少於約600個；以每個容器計，尺寸≥10 µm之顆粒少於約6000個；基因組效價為約1.7×10¹³ - 5.3×10¹³ vg/mL；感染效價為每1.0×10¹³ vg約3.9×10⁸ - 8.4×10¹⁰ IU；總蛋白質含量為每1.0×10¹³ vg約100-300 µg；基於活體外基於細胞之分析法，相對效能為約70-130%，其中該效能係相對於參考標準及/或適合的對照物；小於約5%空衣殼。

臨床前評估 SMNΔ7小鼠為適用於研究基因轉移之模型。Butchbach等人, 「Abnormal motor phenotype in the SMNΔ7 mouse model of spinal muscular atrophy」 Neurobiology of disease, 27(2): 207-19。將scAAV9.CB.SMN之5×10¹¹ 個病毒基因組注射至年齡為1天之小鼠之面靜脈可援救SMNΔ7小鼠模型。Foust等人, 「Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN」 Nature biotechnology, 28(3): 271-4。約42±2%的腰脊椎運動神經元在經scAAV9.CB.SMN處理之小鼠中轉導。與未經處理之SMA小鼠相比，經scAAV9.CB.SMN處理之動物之腦部、脊髓及肌肉中之SMN含量亦增加(儘管低於WT對照物)。在P1評估經scAAV9.CB.SMN或scAAV9.CB.GFP處理之SMA動物之恢復正常體位之能力且與野生型(WT)對照小鼠及未經處理之小鼠比較。WT對照物可獨立快速恢復正常體位，而經SMN及綠色螢光蛋白(GFP)處理之SMA動物在P5時展示困難。然而，在P13時，與經GFP處理之對照物為20%及未經處理之SMA動物為0%相比，90%的經SMN處理之動物可獨立恢復正常體位。在P18時，經SMN處理之動物大於經GFP處理之動物，但小於WT對照物。經SMN處理之小鼠之運動能力與WT對照物幾乎相同，如藉由開放空間測試及轉輪運動所分析。

與經GFP處理之SMA動物相比，經SMN處理之SMA動物之存活期顯著改良。經GFP處理之對照動物皆未存活超過P22且中值壽命為15.5天。GFP小鼠之體重在P10達到峰值且接著突然下降直至死亡，而SMN小鼠展示穩定體重增加直至約P40且穩定在17 g (WT對照物之體重之約一半)。經校正之動物之較小尺寸可能與scAAV9之向性及不完全轉導相關，產生其中一些細胞未經轉導之『嵌合』動物。此外，較小尺寸表明SMN之胚胎作用。最值得注意的是，經SMN處理之小鼠良好地存活超過年齡為250天。

亦研究毒理學生物分佈。在非良好實驗室實踐(non-Good Laboratory Practice；non-GLP)研究中，藉由血管遞送向24隻小鼠及4隻非人類靈長類動物(NHP)注射scAAV9.CB.SMN。為了評估毒性及安全性，用媒劑(PBS)(3隻雄性/6隻雌性)或3.3×10¹⁴ vg/kg之scAAV9.CB.SMN (6隻雄性/9隻雌性)，經由面顳靜脈將scAAV9.CB.SMN注射至P1野生型弗蘭德病毒(friend virus)b型(FVB)小鼠中。先前證實此劑量在SMA16之SMNΔ7小鼠模型中最有效。預期使用P1小鼠模擬嬰兒中之潛在臨床研究，其為首次用於人體之臨床試驗之計劃群體。所有小鼠在注射程序後存活且最初的24小時觀測期未顯示任何窘迫或體重損失之跡象。量測身體質量，且對於研究之其餘部分，每週一次進行實際觀測；未顯示對照物與經處理之群組之間的任何差異(圖1)。

在注射後第60、90及180天，自小鼠收集血液以用於血液學研究及臨床化學評估(ALT、AST、ALK Phos、肌酐、BUN、電解質及CK)。除在90天時間點時的一個變化以外，所有皆為正常的。此差異似乎歸因於與抽血位點相關之技術問題，該位點與所有其他小鼠之抽血位點不同。關於組織病理學，在注射後第120天對13隻小鼠且在第180天對8隻小鼠進行屍檢。所有器官為正常的；尤其未在任何器官(心臟、肝、腎臟、肌肉、性腺、腦、肺、淋巴結及腸)之任何切片中發現發炎。

在四隻雄性食蟹獼猴(Cynomolgus Macaques)之安全性研究中，在年齡為90天時對個體進行注射以精密模擬在I型SMA嬰兒中之治療之可能的投藥年齡。以6.7×10¹³ /kg之劑量(其對應於SMN-Δ7小鼠展示存活期之顯著增加之最低測試劑量)，藉由隱靜脈之導管插入術在某一時間投與scAAV9.CB.SMN載體。對動物隨訪六個月直至其在年齡為約9個月時被處死。未發現副作用，且所有臨床化學反應為正常的。在外周血液單核細胞(PBMC)中使用ELISpot測試T細胞免疫反應，且在注射後6個月時皆為陰性。

在此等非GLP研究中，血清化學反應及血液學研究以及組織病理學評估為不顯著的。NHP個體對衣殼(但非轉基因)產生適合的免疫反應，其中在注射後6個月持續極高的轉基因表現。此等研究提供即使在用於血腦障壁滲透之高劑量下，全身性遞送scAAV9.CB.SMN亦為安全及良好耐受之強有力證據。Foust等人 Nat. Biotechnol., 28(3), 第271-274頁 (2010)。

當在第1天以高達3.3×10¹⁴ vg/kg之水準對新生FVB小鼠進行scAAV9.CB.SMN之單次靜脈內注射時，在投藥之後第24週之時間點未發現測試物品相關死亡或毒性證據。治療相關之平均體重及平均體重增加之降低以及較低的活化部分凝血活酶時間(APTT)值為輕度治療作用，但不產生毒性。

scAAV9.CB.SMN之活性由腦部及脊髓(主要目標治療組織)中特異性轉基因核糖核酸(RNA)表現之生物分佈及存在證明。在以3.3×10¹⁴ vg/kg給藥之雄性及雌性(第3組)中，在12及24週之後發現少量的針對AAV9衣殼之抗體。在臨床病理學及組織病理學分析中未觀測到變化。基於此等結果，認為scAAV9.CB.SMN在新生雄性及雌性小鼠中之無可觀測的不良作用含量(NOAEL)為3.3×10¹⁴ vg/kg。

在此等研究中，在小鼠(至第12週)及獼猴(至注射後14個月)中針對CSF之scAAV9.CB.SMN鞘內投藥為安全及良好耐受的。小鼠中之CSF遞送可能降低scAAV9.CB.SMN之周邊暴露且定性聚合酶鏈反應(qPCR)結果指示與胸部區域相比，子宮頸及腰部區域中之轉基因表現較高。猴在注射時保持垂頭仰臥位5分鐘且在注射之前確認對抗AAV9抗體呈血清反應陰性。在注射後6個月，所有非人類靈長類動物對AAV9抗體呈高陽性。在注射後6個月未觀測到針對AAV9衣殼或SMN轉基因之細胞毒性T淋巴細胞反應。未觀測到腦部或脊髓中之組織退化或反應性反應。

在關鍵良好實驗室實踐(GLP)順應性3個月小鼠毒理學研究中，毒性之主要目標器官為心臟及肝。在小鼠中之IV輸注之後，載體及轉基因廣泛分佈且通常在心臟及肝中觀測到最高表現，及腦部及脊髓中之大量表現。心臟之心室中之AVXS-101相關結果包含劑量相關發炎、水腫及纖維化，且在心房中，發炎及栓塞。肝結果包含肝細胞肥大、庫普弗細胞活化(Kupffer cell activation)及分散性肝細胞壞死。在小鼠中之AVXS-101相關心臟及肝結果中未發現NOAEL，且最大耐受劑量定義為1.5×10¹⁴ vg/kg，提供相對於建議治療劑量1.1×10¹⁴ vg/kg之約1.4倍安全性界限。此時尚未知曉小鼠中之觀測結果轉譯至靈長類動物之能力。

此等資料支持進行臨床試驗。

為測定與靜脈內(IV)注射相比，CSF遞送是否可降低周邊器官之轉導，對頭向下保持垂頭仰臥位5或10分鐘之非人類靈長類動物(n=5)之組織進行詳細的生物分佈分析。由於治療在脊髓及腦部中之顯著改良之分佈而選擇此等動物，而非未處於頭向下體位之非人類靈長類動物，使得此方法有利於臨床試驗。在注射後兩週，處死食蟹獼猴且收集各種組織以進行詳細的脫氧核糖核酸(DNA)及RNA生物分佈分析。與腦部及脊髓中之高含量相比，scAAV9.CBA.GFP在大部分周邊組織(除脾及肝以外)中較少。此等結果與來自其他組之先前報導一致。Dirren等人, 「Intracerebroventricular injection of adeno-associated virus 6 and 9 vectors for cell type specific transgene expression in the spinal cord」 Hum Gene Ther 25: 109-120；Gray等人, 「Global CNS gene delivery and evasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAV administration in non-human primates」 Gene Ther 20: 450-459。在骨骼肌及CNS中，DNA與RNA含量之間存在強相關性，而在軟組織及腺體中，RNA含量通常低於所偵測之病毒基因組之預期值。特定言之，睪丸、腸及脾中之RNA分子比DNA少1,000倍。儘管在周邊器官中偵測到AAV，但與全身性注射相比，在周邊偵測到之載體之量顯著降低。Dirren等人；Gray等人。此外，當在P1治療後第24週比較經靜脈內或腦室內注射之小鼠時，獲得類似的觀測結果。因此，CSF遞送使得用AVXS-101進行之未來臨床試驗增加顯著潛在安全性組分。

在一些實施例中，垂頭仰臥位改良CSF遞送。在經由單次注射直接遞送至CSF之SMA小鼠及非人類靈長類動物中評估scAAV9-SMN之給藥及功效。當使用比靜脈內施用低10倍的劑量時，在小鼠及非人類靈長類動物之全部脊髓中觀測到廣泛分佈的轉基因表現。在非人類靈長類動物中，對於類似的運動神經元靶向效率，可使用低於小鼠中之劑量的劑量。當個體保持垂頭仰臥位以促進載體擴散時，發現轉導功效進一步改良。Meyer等人, 「Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates」 Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 23, 477-487。使動物傾斜可顯著改良脊髓之胸部及子宮頸區域中之轉導，如藉由GFP/ChAT雙重陽性運動神經元之免疫螢光及定量證明。傾斜10分鐘足以分別使子宮頸、胸部及腰部區域中之運動神經元轉導增加55、62及80%，根據在小鼠模型中觀測之救援，其意味著患者之重要益處。運動神經元計數與各脊髓區段中之GFP轉錄物定量緊密相關。

藉由以下實例進一步說明本發明，其不應解釋為限制性。出於所有目的，本申請案中所引用之所有參考文獻、專利案及公開專利申請案之內容以及圖式皆以全文引用之方式併入本文中。

實例 1 - 臨床試驗方案 對具有滿足以下條件之嬰兒及兒童進行1期、開放標記、單次劑量投藥臨床試驗：符合SMA之遺傳診斷、SMN1之雙對偶基因缺失及3個SMN2之複本(無遺傳修飾因子)，在進入研究時能夠坐立但不能站立或行走。如下文所描述，患者在劑量比較安全性研究中接受多達三(3)種潛在治療劑量之AVXS-101。將患者分為兩組，在給藥時年齡≥6個月且＜24個月及在給藥時年齡≥24個月且＜60個月。登記至少十五(15)名≥6個月且＜24個月之患者且登記十二(12)名≥24且＜60個月之患者。

第一組登記三(3)名年齡≥6個月且＜24個月之患者(群組1)，其接受6.0×10¹³ vg之AVXS-101之投藥(劑量A)。群組內每位患者之給藥之間存在至少四(4)週間隔。在繼續登記之前，研究者向資料安全監測委員會(Data Safety Monitoring Board；DSMB)彙報在48小時內可能、很可能或明確與研究試劑相關之所有第III級或更高級別的AE。在登記前三名患者之後且基於可用的安全性資料，做出以下決策：a)是否因毒性而停止，或b)是否使用劑量B繼續進行群組2。

對於劑量B，登記三(3)名年齡＜60個月之患者接受1.2×10¹⁴ vg之AVXS-101之投藥(劑量B)。又，群組內三名患者之給藥之間存在至少4週間隔。基於來自三名群組2患者及所有群組1患者之可用的安全性資料，可能無需患者給藥之間的額外4週間隔。在繼續登記之前，研究者向DSMB彙報在48小時內可能、很可能或明確與研究試劑相關之所有第III級或更高級別的AE。在登記前六(6)名患者之後且基於可用的安全性資料，做出以下決策：a)是否因毒性而停止，或b)是否繼續登記其他21名患者直至十二(12)名≥6個月且＜24個月之患者及十二(12)名≥24個月且＜60個月之患者接受劑量B。

基於正在進行中的安全性評估及來自用1.2×10¹⁴ vg劑量治療之患者之功效資料，考慮第三劑量(劑量C)之測試。三(3)名年齡＜60個月之患者接受劑量C，將鞘內投與高達2.4×10¹⁴ vg。與群組1及2相同，前三名接受劑量C之患者之給藥之間再次存在四週間隔。在登記前三(3)名劑量C患者之後且基於可用的安全性資料，做出以下決策：a)是否因毒性而停止，或b)是否繼續登記其他21名患者直至總共十二(12)名＞6個月且＜24個月之患者及十二(12)名≥24個月且＜60個月之患者接受劑量C。

可由來自接受劑量B (1.2×10¹⁴ vg)之患者之臨床結果之正在進行中的安全性及功效評述來支持用於測試劑量C之適合的劑量及調整方式之選擇。所選擇之劑量高達鞘內遞送2.4×10¹⁴ vg。已對體重達到8.4 kg之兒童安全地全身性(靜脈內)投與高達1.1×10¹⁴ vg/kg之劑量(總劑量9.24×10¹⁴ vg)。此外，在臨床前研究中，在大型非人類靈長類動物中，在2×10¹³ vg/kg之劑量下，scAAV9.CB.SMN之鞘內投藥直至注射後14個月亦為安全及良好耐受的。

整體研究設計概述於圖2中。

經由監測不良事件(AE)報導及伴隨藥物用量以及藉由進行體檢、生命徵象評估、心臟血管評估及實驗室評估來評估安全性。患者在鞘內注射後48小時內留在醫院接受觀測。患者在第7、14、21及30天返回以進行隨訪。在第30天隨訪之後，患者接著每月返回一次直至劑量投藥後第12個月。在研究完成後，要求研究患者參與重要的長期後續研究，其檢驗AVXS-101之持續安全性長達15年。

患者數目 至少27名患者參與；若確定需要遞增至劑量C，則多達51名患者可能參與。

治療指定 此為開放標記、比較性單次劑量研究。根據本文中指定之劑量遞增計劃表指定治療。

劑量調節準則 研究調查AVXS-101之單次鞘內注射。

研究終止準則 獨立的資料安全監測委員會(DSMB)及醫學監測器在整個試驗期間持續監測安全性資料。DSMB可出於安全性原因而建議提前終止試驗。若任何患者經歷第III級或更高級別，則由研究者停止研究參與。非預期性及可能、很可能或明確與研究產物相關之AE毒性與臨床症狀一起呈現且需要醫學治療。此包括任何與研究試劑之投藥相關之患者死亡、重要臨床實驗室結果或注射區域中任何嚴重的局部併發症。

若DSMB出於安全性原因建議提前終止研究，則可終止試驗。亦可由監管機構之建議而終止試驗。最後，若患者發展不可接受之毒性水準，則亦可終止試驗，定義為出現任何非預期性CTCAE第3級或更高級別的AE/毒性，其可能、很可能或明確與基因替代療法相關，且與臨床症狀相關聯及/或需要醫學治療。

患者納入準則 患者滿足所有以下納入準則： 1. 在藉由基因型進行之篩檢期期間的診斷確認之後，給藥時的患者年齡≥6個月且年齡為至多60個月(1800天)，患者顯示在無需幫助之情況下坐立10秒或更長時間之能力，但不能站立或行走 - 藉由基因型進行之診斷確認包括SMN1外顯子7之同型接合子不存在之實驗室資料；具有確切的三個SMN2之複本。 2. SMN2基因修飾因子突變(c.859G＞C)之陰性基因測試。 3. 在年齡＜12個月時臨床症狀發作且症狀符合SMA。 4. 能夠獨立坐立且不能獨立站立或行走。獨立坐立之定義係由世界衛生組織(World Health Organization；WHO) -MGRS準則，即能夠在無支撐之情況下，在頭部直立情況下坐立至少10秒定義。兒童不應使用手臂或手部保持身體平衡或支撐體位(Wijnhoven 2004)。 5. 滿足使用麻醉及鎮靜(如由研究者決定必需)之適齡制度準則。 6. 使用最新的兒童疫苗。根據美國兒科學會(American Academy of Pediatrics)(AAP 2009)，亦建議包括用於預防呼吸道融合病毒(RSV)感染之帕利珠單抗預防(亦稱為Synagis)之季節性疫苗接種。 7. 父母/法定監護人願意且能夠完成知情同意書過程。

患者排除準則 患者必須不符合以下排除準則中之任一者： 1. 當前或歷史上具有獨立站立或行走之能力。 2. 禁忌脊椎穿刺程序或鞘內療法之投藥(例如脊柱裂、腦膜炎、缺陷或凝血異常，或阻止有效進入CSF空間之阻塞性脊椎硬體)或存在植入之用於CSF之引流之分流器或植入之CNS導管。 3. 嚴重攣縮，如由指定理療師在篩檢時測定，其干擾達到/顯示功能性量度(例如站立、行走)之能力或干擾接受IT給藥10之能力。在X射線檢驗時顯而易見的嚴重脊柱側彎(定義為脊椎≥50°彎曲)。 4. 在劑量投藥之1年內具有預先、計劃或預期的脊柱側彎修復手術/程序。 5. 使用侵入性通氣支持(在正壓下之氣管切開術)或在患者甦醒時，在篩檢時脈搏血氧測定法＜95%飽和度，或對於高海拔＞1000 m，在患者甦醒時氧飽和度＜92% - 在篩檢與給藥當天之最高值之間，脈搏血氧飽和度必須不降低≥四(4)個百分點。 6. 在給藥之前兩週，每天使用或需要侵入性通氣支持達12小時或更長時間。 7. 對胃飼管具有醫學必要性，其中大部分餵食係藉由非口服方法(即，鼻胃管或鼻空腸管)進行，或基於世界衛生組織兒童生長標準(WHO Child Growth Standards)(Onis 2006)，患者之年齡別體重(weight-for-age)降低百分之3。在篩檢之前進行永久性胃造口術不為排除標準。 8. 活性病毒感染(包括HIV或對B型或C型肝炎呈血清學陽性，或茲卡病毒)。 9. 在進入研究之前的兩(2)週內需要全身性治療及/或住院之嚴重非呼吸道疾病。 10. 在進入研究之前的四(4)週內需要醫療照顧、醫學介入或任何方式之支持性護理增加之呼吸道感染。 11. 在研究給藥之前的四(4)週內嚴重非肺/呼吸道感染(例如腎盂腎炎，或腦膜炎)，或在PI觀點看來，產生不必要的基因轉移風險之伴隨疾病，諸如： - 重度腎或肝損傷 - 已知的癲癇發作 - 糖尿病 - 特發性低鈣尿症 - 症狀性心肌病 12. 細菌性腦膜炎或腦部或脊髓疾病(包括腫瘤)之病史，或藉由MRI或CT發現之將干擾LP程序或CSF循環之異常。 13. 已知的對普賴蘇穠或其他糖皮質類固醇或其賦形劑之過敏性或過敏反應。 14. 已知的對碘或含碘產品之過敏性或過敏反應。 15. 伴隨使用以下中之任一者：用於治療肌病或神經病之藥物、用於治療糖尿病之藥劑，或正在進行中的免疫抑制性療法、血漿清除術、免疫調節劑(諸如阿達木單抗)，或在研究給藥之3個月內的免疫抑制性療法(例如皮質類固醇、環孢素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)、甲胺喋呤、環磷醯胺、靜脈內免疫球蛋白、利妥昔單抗)。 16. 在劑量投藥之前24小時無法停止使用輕瀉劑或利尿劑。 17. 抗AAV9抗體效價＞1:50，如藉由ELISA結合免疫分析法所測定 - 若潛在患者顯示抗AAV9抗體效價＞1:50，則其可在篩檢期之30天內接受重新測試且若在重新測試時抗AAV9抗體效價≤1:50，則將符合條件。 18. 在研究給藥之前認為異常實驗室值為臨床顯著(INR＞1.4)、GGT＞3X ULN、膽紅素≥3.0 mg/dL、肌酐≥1.0 mg/dL、Hgb＜8或＞18 g/Dl；WBC＞20,000/cmm。 19. 在此研究之篩檢之前的任何時間，參與當前SMA治療臨床試驗或接受研究性或經批准之化合物產品或接受意圖治療SMA之療法(例如丙戊酸、諾西那生) - 必須在給藥之前30天停止口服β促效劑 - 在此研究之篩檢之前的任何時間，出於呼吸道(支氣管擴張劑)管理之目的而特定指定之吸入型沙丁胺醇(albuterol)為可接受的且不為禁忌。 20. 在1年研究評估期期間預期進行重大手術程序(例如脊椎手術或氣管切開術)。 21. 無法或不願意遵守研究程序或無法旅行以進行重複隨訪。 22. 不願意對研究結果/觀測結果保密或不願意避免在社交媒體網站上發佈機密研究結果/觀測結果。 23. 拒絕簽署同意書。

患者退出準則及中止 若患者發展不可接受之毒性水準，則其亦可中止研究，定義為出現任何非預期性CTCAE第3級或更高級別的AE/毒性，其可能、很可能或明確與基因替代療法相關，且與臨床症狀相關聯及/或需要醫學治療。若患者死亡，則其退出，在此情況下，除未經治療之患者以外，必須對參與基因轉移研究之後死亡的任何患者進行屍檢。除非由於住院，否則若患者未能遵守方案要求的隨訪或研究程序(3個或更多個未重新要求的連續隨訪)，則其亦可退出。父母或法定監護人撤回同意書之患者亦退出研究。最終，可由研究者決定患者退出。對於出於任何原因而提前中斷研究之任何患者，提前終止程序應在14天內完成。

研究產品之說明 生物產品為在細胞巨大病毒(CMV)強化子/雞-β-肌動蛋白-雜交啟動子(CB)之控制下的非複製、重組、自互補腺相關病毒血清型9 (AAV9)，其含有人類SMN基因之cDNA。AAV反向末端重複(ITR)已經修飾以促進轉基因之分子內黏接，由此形成準備進行轉錄之雙股轉基因。已證實此經修飾之ITR，稱為「自互補」(sc)ITR可顯著提高轉基因之轉錄速度及所產生之所得蛋白質。經AVXS-101 (scAAV9.CB.hSMN)轉導之細胞表現人類SMN蛋白質。

表3：研究產品

	研究產品
產品名稱	AVXS-101
單位劑量	6.0 × 10¹³ vg (劑量A) 1.2 × 10¹⁴ vg (劑量B) 不超過2.4 × 10¹⁴ vg (劑量C)
投藥途徑	鞘內注射
物理說明	在解凍之後，AVXS-101透明至略微不透明，無色至淡白色溶液，不含可見顆粒

先前及伴隨藥物 自研究給藥之前兩週開始，以電子病例報表(eCRF)形式記錄先前及伴隨藥物直至研究隨訪結束。

普賴蘇穠之預防性投藥 在正在進行中的經由靜脈內灌注進行的研究AVXS-101治療之1期臨床研究中觀測針對AAV載體之抗原特異性T細胞反應。此為基因轉移後2-4週之間的預期反應。此類抗原特異性T細胞反應之一種可能結果為清除經轉導之細胞及轉基因表現損失。

為了嘗試減弱針對基於AAV之療法之宿主免疫反應，患者在AVXS-101給藥之前24小時接受預防性普賴蘇穠(糖皮質激素)(約1毫克/公斤/天)。治療根據以下治療指南持續約30天： • 至少直至灌注後第30天：1毫克/公斤/天 • 第5週及第6週：0.5毫克/公斤/天 • 第7週及第8週：0.25毫克/公斤/天 • 第9週：停止普賴蘇穠

在30天治療之後若天冬胺酸轉胺酶(AST)或丙胺酸轉胺酶(ALT)值＞正常值上限(ULN)之2倍，或若T細胞反應≥100 SFC/10⁶ PBMC，則保持普賴蘇穠之劑量直至AST及ALT值降低至低於臨界值。若T細胞反應持續超過第60天，則應由研究者判斷考慮保持普賴蘇穠之風險益處。由研究者基於每名患者之潛在安全性問題決定此等建議之變化。

禁止藥物 禁止伴隨使用任何以下藥物： • 用於治療肌病或神經病之藥物 • 用於治療糖尿病之藥劑 • 接受意圖治療SMA之療法(例如丙戊酸、諾西那生) - 在基因療法給藥之前，必須停止口服β-促效劑至少30天。 - 可以使用吸入型β促效劑治療SMA之呼吸道併發症，限制條件為此類藥物以臨床上適合的量給藥 • 正在進行中的免疫抑制性療法、血漿清除術、免疫調節劑(諸如阿達木單抗)，或在試驗開始3個月內之免疫抑制性療法(例如皮質類固醇、環孢素、他克莫司、甲胺喋呤、環磷醯胺、靜脈內免疫球蛋白、利妥昔單抗)

作為常規臨床管理之一部分，由主治醫師決定允許在普賴蘇穠逐漸減少完成之後使用皮質類固醇。在此類情形中使用之潑尼松應適當地記錄為伴隨藥物，且引起其使用之事件應適當地記錄為AE。

皮質類固醇之使用(除用於支氣管痙攣之吸入型皮質類固醇以外)應視為在普賴蘇穠逐漸減少過程期間護理之一部分，此醫學管理應與贊助商醫學監測員一起討論，其負責與逐漸減少相關之任何所指示之藥物調節。

治療順應性 AVXS-101係以單次鞘內注射形式投與。

隨機化及盲式處理 此為開放標記研究。

研究產品劑量及劑量調整 患者經由鞘內注射接受單次劑量之AVXS-101 (6.0×10¹³ vg、1.2×10¹⁴ vg)，或高達2.4×10¹⁴ vg之第三劑量(若確定需要)。經由鞘內注射直接遞送至CSF中可使病毒載體之量降低約十分之一，同時在整個CNS中具有均等分佈及功效，降低病毒載體負荷且進一步最佳化。由正在進行中的臨床結果之安全性及功效評述進一步支持用於研究所有劑量遞增之適合的劑量之選擇及調整，該等臨床結果來自接受如所描述之先前劑量的患者。所選擇之最高劑量高達鞘內遞送2.4×10¹⁴ vg。已向體重達到8.4 kg之兒童安全地全身性(靜脈內)投與高達1.1×10¹⁴ vg/kg之劑量(總劑量9.24×10¹⁴ vg)。此外，在臨床前研究中，在大型非人類靈長類動物中，在2×10¹³ vg/kg之劑量下，scAAV9.CB.SMN之鞘內投藥直至注射後14個月亦為安全及良好耐受的。

研究產品製備 由藥劑師在無菌條件下以無菌方式進行AVXS-101之製備。

預先混合AVXS-101與適合的造影劑，該造影劑經批准及標記用於兒科用途，用於經由腰部鞘內注射進行之注射之放射性監測。AVXS-101 + 造影劑之總體積不超過8 mL。

將劑量遞送容器遞送至指定兒科加護病房(PICU)患者室或其他能夠立即進行急性重症監護管理之適合的環境(例如介入套件、操作室、專用程序室)。

患者在PICU患者室或其他能夠立即進行急性重症監護管理之適合的環境(例如介入套件、操作室、專用程序室)中，在無菌條件下接受AVXS-101鞘內注射。接納患者，且每15 (+/-5)分鐘一次監測生命體徵保持四小時且在AVXS-101給藥程序之後每小時(+/-15分鐘)一次保持24小時。

向站點發送指令以使用以斜邊平行於硬腦膜纖維方式插入之非創傷性針；已證實此可顯著減少對硬腦膜之損傷且因此降低在腰椎穿刺之後的腦脊髓液洩漏風險(包括在兒童中)。Ebinger等人, 「Headache and backache after lumbar puncture in children and adolescents: a prospective study」 Pediatrics, 113:1588-1592；Kiechl-Kohlendorfer等人, 「Cerebrospinal fluid leakage after lumbar puncture in neonates: incidence and sonographic appearance」 Am J Roentgenol, 181:231-234。

所有接受AVXS-101之患者需要鎮靜/麻醉。由當地麻醉師決定方法及藥物，但應併入足量的鎮靜劑或鎮靜劑以確保止痛且在程序中及程序後保持垂頭仰臥位而不移動。在投與載體之後，使患者處於垂頭仰臥位，頭向下傾斜30°保持15分鐘，以增強子宮頸及腦部區域之分佈。

由研究者或介入放射學家或其他經適當培訓且有經驗的醫師在無菌條件下，藉由螢光鏡/放射性引導根據機構指南投與AVXS-101。使患者處於側偃臥位且藉由腰椎穿刺將具有探針之導管插入L3-L4或L4-L5棘突間隙空間，進入蛛膜下空間。藉由來自導管之透明腦脊髓液(CSF)之流動確認蛛膜下套管插入。移除約四(4)mL CSF以用於劑量A及劑量B，移除與所注射之AVXS-101加造影劑之體積(高達七(7)mL)極近似的體積之CSF以用於劑量C且根據機構指南進行處理。將含AVXS-101之預先混合之造影劑溶液直接注射至蛛膜下空間中。允許根據機構標準/指南用0.5 mL生理食鹽水沖洗注射針。

投藥後程序 在AVXS-101投藥後，使患者返回指定的PICU床或其他適合的環境，同時密切監測生命體徵。在給藥程序後，亦監測及記錄伴隨藥物及所有AE/嚴重AE。

患者在PICU患者室或其他能夠立即進行急性重症監護管理之適合的環境(例如介入套件、操作室、專用程序室)中留置48小時以更密切地監測精神狀態。在患者留置期間，人員應根據關於感染控制之機構標準遵循適合的安全性防護措施；標準應對個人保護性儀器(PPE)具有要求，該儀器諸如手術服、手套、面罩、玻璃及閉趾鞋。向患者之家庭提供關於精神狀態變化之監測的標準化、經IRB批准之報導，其包括監測發熱、應激性、頸痛、光敏感性及嘔吐。當符合以下準則時，患者可出院： • 無發熱 • 不存在過敏反應 • 不存在假性腦膜炎 • 不存在暗示可能的CNS感染或併發症之異常實驗室值

劑量遞增 群組1內之所有患者之間存在4週給藥間隔，以實現在下一位患者之給藥之前，來自六個時間點(第1、2、7、14、21、30天)之安全性分析之評述。

在繼續登記之前，研究者向DSMB彙報在48小時認知內可能、很可能或明確與研究試劑相關之所有第III級或更高級別的AE。在登記在給藥時年齡≥6個月且＜24個月之前三(3)名患者之後且基於可用的安全性資料，做出以下決策：a)是否因毒性而停止，或b)使用劑量B繼續進行群組2。

對於劑量B，在群組內給藥時，年齡＜60個月之前三(3)名患者之給藥之間的存在至少4週間隔。基於來自前三(3)名群組2患者及所有群組1患者之可用的安全性資料，可能無需患者給藥之間的額外4週間隔。在繼續登記之前，研究者向DSMB彙報在48小時內可能、很可能或明確與研究試劑相關之所有第III級或更高級別的AE。在登記前六(6)名患者之後且基於可用的安全性資料，做出以下決策：a)是否因毒性而停止，或b)是否繼續登記其他21名患者直至十二(12)名在給藥時年齡≥6個月且＜24個月之患者及十二(12)名在給藥時年齡＞24個月且＜60個月之患者接受劑量B。

基於正在進行中的安全性評估及來自用1.2×10¹⁴ vg劑量治療之患者之功效資料，可考慮第三劑量(劑量C)之測試。三(3)名年齡＜60個月之患者接受劑量C，將鞘內投與高達2.4×10¹⁴ vg。前三名接受劑量C之患者之給藥之間將再次存在四週間隔，與群組1及2相同。在登記前三(3)名劑量C患者之後且基於可用的安全性資料，做出以下決策：a)是否因安全性問題而停止投與劑量C，或b)是否繼續登記其他21名患者直至總共十二(12)名≥6個月且＜24個月之患者及十二(12)名≥24個月且＜60個月之患者接受劑量C。

物理療法評估 ： 哈默史密斯功能性運動擴展量表 設計哈默史密斯功能性運動擴展量表以用於患有2型及3型脊髓性肌萎縮之兒童，以得到關於運動能力及臨床進程之客觀資訊。

對於所有年齡≥24個月之患者，由理療師根據表4在30天給藥內且每月一次投與哈默史密斯功能性運動擴展量表保持十二(12)個月。在給藥時年齡＜24個月之患者在年齡達到24個月時開始進行哈默史密斯功能性運動擴展量表評估。對哈默史密斯功能性運動擴展量表評估過程進行錄影。

物理療法評估 ： Bayley Scales of Infant and Toddler Development® Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, 第三版為標準化、標準參考嬰兒評估。在基線處，在給藥之前30天內完成粗大及精細運動子測試且接著每月一次直至第12個月。對Bayley Scales®評估進行錄影。

物理療法評估 ： 運動重要事件發育調查 由理療師使用表2中展示之標準運動重要事件發育調查評估顯著運動重要事件之達成，其中每項重要事件之定義由Bayley Scales®促成(參見物理療法手冊(Physical Therapy Manual))。理療師根據表4記錄患者是否實現運動重要事件發育調查中之各項重要事件。一旦觀測到，即認為實現運動重要事件。由觀測到重要事件之隨訪日期來決定每項運動重要事件之實現日期。在篩檢隨訪期間，理療師根據表4完成基線重要事件實現之評估；用視訊記錄此評估且記載結果。因為Bayley Scales®未必需要兒童重複先前實現之重要事件，因此可用視訊捕捉各項重要事件。記載發育重要事件評估過程。

表4：評估計劃表

研究間隔	基線篩檢	載體(AVXS-101)注射(住院病人)
隨訪編號	1	2	3	4	5	6	每月一次(7-16)	第12個月或EOS (17)
研究中之天數/月數	-60至-2	-1	1	2-3	7	14	21	30	至第11個月	第12個月
窗口					+/- 2	+/- 7	+/- 7
知情同意書	X
脊椎X射線	X
人口統計資料/病史	X		X	X	X	X	X	X	X	X
體檢	X		X	X	X	X	X	X	X	X
生命體徵/體重/身長/身高	X		X	X	X	X	X	X	X	X
脈搏血氧飽和度			X	X	X	X	X	X	X	X
肺部檢驗	X							X	X	X
12導聯ECG	X		X	X					X	X
12導聯動態心電圖(Holter Monitor)	X	X	X	X				X	X	X
心動回聲圖	X								X	X
毛細血管血氣		X		X
哈默史密斯功能性運動擴展量表(具有視訊)	X							X	X	X
Bayley®-III (具有視訊)	X							X	X	X
運動重要事件發育調查(具有視訊)	X							X	X	X
血液學/化學反應	X	X		X	X	X	X	X	X	X
CK-MB	X				X			X	X	X
肌鈣蛋白I	X				X			X	X	X
凝血	X	X		X	X	X	X	X	X	X
尿分析	X	X		X	X	X	X	X	X	X
病毒血清學	X
用於診斷確認測試之血液	X
唾液、尿液及糞便樣品(關於病毒排出)		X		X	X	X		X
母體之基線篩檢(抗AAV9 Ab)	X
免疫學實驗室(抗AAV9/SMN)	X				X	X	X	X
免疫學實驗室(IFN-γ T細胞)					X	X	X	X
普賴蘇穠給藥		X	X	X	X	X	X	X
藉由螢光鏡/放射性引導進行之研究產品投藥			X
照片注射位點			X		X	X	X	X
不良事件	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
先前及伴隨藥物	自研究給藥之前2週開始收集，直至最後一次研究隨訪

視訊證據 對每次研究隨訪時的物理療法評估進行錄影以產生有力、明顯、有記載的功效證據，如藉由功能性能力之變化所測定。父母/法定監護人亦可與研究點共享證明達成功能性能力之家庭視訊。

將視訊提供至獨立、集中的審查員以進行無偏見的重要事件實現評估。獨立審查員使用運動重要事件發育。進行調查以記載視訊是否顯示實現每項運動重要事件之證據。運動重要事件實現日期計算為證明實現重要事件之最早視訊日期。

其他臨床評估 ： 人口統計資料 / 病史在基線處收集患者人口統計資料及病史資訊且捕捉於病例報表(CRF)中。遍及整個研究，在每次隨訪時收集病史。病史資訊包括(但不限於)：脊髓性肌萎縮之家族病史(包括受影響的兄弟姐妹或父母載體)、出生時的胎齡、出生時的身長/身高/頭圍、出生時的住院資訊(包括住院次數、持續時間及原因，包括ICD-10編碼(若可獲得))、歷史通氣支持(若存在)及歷史進食支持(若存在)。

其他臨床評估 ： 生命體徵 生命體徵包括30天給藥內及在表4中指定之時間點時的血壓、呼吸速率、脈搏及腋溫。在注射期間由小組成員持續監測及記錄生命體徵，包括脈搏血氧飽和度及心跳速率。在第2次隨訪時，每15分鐘(+/-5分鐘)一次監測及記錄生命體徵保持四小時且在AVXS-101給藥程序之後每一小時(+/-15分鐘)一次保持24小時，該等生命體徵包括血壓、呼吸速率、脈搏、腋溫、脈搏血氧飽和度及心跳速率。

其他臨床評估 ： 體重及身長 / 身高視需要根據表4中指定之時間點量測體重以及身長及/或身高。

其他臨床評估 ：體檢體檢包括以下系統之評述：頭、眼、耳、鼻及咽喉(HEENT)、肺/胸腔、心臟血管、腹部、肌肉骨胳、神經、皮膚、淋巴及泌尿生殖。在每次體檢時量測頭圍。為量測頭圍，審查員將可撓性量測帶牢固得包裹在頭部外圍，在前額之最寬部分上高於眉毛、高於耳朵且在枕骨之最突出部分上。應進行3次量測，且應以0.1 cm之準確度記錄最大量測值。在30天給藥內且根據表4中指定之時間點完成基線體檢。

其他臨床評估 ： 疫苗接種建議 鼓勵患者遵循如由疾病控制中心(Center for Disease Control；CDC)建議之所有常規計劃免疫。根據美國兒科學會(American Academy of Pediatrics)(AAP 2009)，亦建議包括用於預防呼吸道融合病毒(RSV)感染之帕利珠單抗預防(亦稱為Synagis)之季節性疫苗接種。

其他臨床評估 ： 12 導聯 心電圖 (ECG) 在篩檢/基線、第1天、第2天、第3天、第3個月、第6個月、第9個月及第12個月(或提前終止)時進行12導聯ECG。由心臟病專家收集ECG圖或ECG機器資料以用於集中評述。在基因遞送當天以及在基因遞送後第2天及第3天進行12導聯ECG(與動態心電圖同時進行)。由研究者根據當地機構指南決定其他電生理學監測。

其他臨床評估 ： 12 導聯 動態心電圖 在第-1天，在劑量投藥之前24小時，患者進行12導聯連續動態心電圖。動態心電圖保持48小時(第3天)。在以下時間點一式三份地自動態心電圖獲取連續ECG資料：給藥前、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時、24小時、36小時及48小時。在篩檢及第1、2、3、6、9及12個月隨訪(或提前終止)時進行二十四小時動態心電圖。

其他臨床評估 ： 心臟超音波檢查 在篩檢/基線以及第3個月、第6個月、第9個月及第12個月隨訪(或提前終止)時進行心臟超音波檢查。

其他臨床評估 ：脊椎 X 射線在篩檢/基線時進行脊椎X射線以排除具有嚴重脊柱側彎或在1年研究評估期期間將需要重大脊椎手術程序之患者。

其他臨床評估 ： 肺部檢驗 由肺科專家在表4中指定之時間點評估患者且可由肺科專家及/或研究者決定配備非侵入性正壓呼吸器(例如BiPAP)。要求需要非侵入性通氣支持之患者在每次研究隨訪時攜帶機器，使得研究工作人員可取出記錄實際使用資料之SD卡。將此使用資料轉移至臨床資料庫。在錯過研究隨訪之情況下，要求需要非侵入性通氣支持之患者取出SD卡且運送至研究點。

AVXS-101 注射之螢光鏡 / 放射性引導 由介入放射學家或其他經適當培訓且有經驗的醫師根據機構指南，在螢光分析術下，在無菌條件下進行AVXS-101鞘內注射程序。此程序可能無需捕捉放射影像。

其他臨床評估 ： 注射位點之照片 在表4中指定之時間點時獲取注射位點之照片至第30天，以監測注射傷口之恢復。

其他臨床評估 ： 實驗室評估 遍及整個試驗，在表4中指定之時間點時收集生物樣品。收集生物樣品且運送至中央實驗室。在給藥之前，收集給藥之前一天(第-1天)用於實驗室測試之樣品且由研究點之經臨床實驗室改善修正案(Clinical Laboratory Improvement Amendment；CLIA)認證之當地實驗室進行在當地進行處理。在一些情況下，出於直接結果或其他安全性或物流問題，可在當地收集樣品。

表5：總血量

隨訪	測試	總體積
篩檢	血液學、化學/CK-MB或肌鈣蛋白I凝血、病毒血清學、免疫學樣品(僅AAV9/SMN Ab)、診斷確認樣品	19.3-19.6 mL
第1天	血液學、化學、凝血、毛細血管血氣	6.0 mL
第2天	血液學、化學、凝血、毛細血管血氣	6.0 mL
第7天	血液學、化學/CK-MB3或肌鈣蛋白I、凝血、免疫學樣品	10.0-12.3 mL
第14天	血液學、化學、凝血、免疫學樣品	9.0-11.0 mL
第21天	血液學、化學、凝血、免疫學樣品	9.0-11.0 mL
第30天	血液學、化學/CK-MB3或肌鈣蛋白I、凝血、免疫學樣品	11.0-12.3 mL
第2個月	血液學、化學/CK-MB3或肌鈣蛋白I、凝血	6.0-6.3 mL
第3個月	血液學、化學、凝血	5 mL
第4個月	血液學、化學、凝血	5 mL
第5個月	血液學、化學、凝血	5 mL
第6個月	血液學、化學/CK-MB3或肌鈣蛋白I、凝血	6.0-6.3 mL
第7個月	血液學、化學、凝血	5 mL
第8個月	血液學、化學、凝血	5 mL
第9個月	血液學、化學/CK-MB3或肌鈣蛋白I、凝血	6.0-6.3 mL
第10個月	血液學、化學、凝血	5 mL
第11個月	血液學、化學、凝血	5 mL
最後一次研究隨訪(第12個月)	血液學、化學/CK-MB3或肌鈣蛋白I、凝血	6.0-6.3 mL
研究之總體積(1年持續時間)	135-137.1 mL

在無法自患者收集足夠的血液之情況下，按以下優先順序使用血液，其中第一項最大優先權且最後一項具有最小優先權： 1. 安全性血液實驗室：化學＞血液學＞凝血＞CK-MB或肌鈣蛋白 2. 用於偵測T細胞反應之IFN-γ ELISpots 3. 針對AAV9及SMN之血清抗體 4. 遺傳學重新確認測試

若在篩檢隨訪時不具有足以包括遺傳學重新確認測試樣品之血量，則患者在第2次隨訪之前返回。所有患者完成遺傳學重新確認測試。

其他臨床評估 ： 血液學 血液學分析包括用塗片進行之具有差異及血小板計數之CBC。根據由中央實驗室提供之實驗室手冊收集及運送樣品。根據當地實驗室之研究點標準程序，在住院給藥期間進行即刻/同一天血液學分析，如由研究者決定。

其他臨床評估 ： 血清化學 根據由中央實驗室提供之實驗室手冊收集及運送樣品。

根據當地實驗室之研究點標準程序，在住院給藥期間進行即刻/同一天化學分析，如由研究者決定。

化學分析在所有研究隨訪時包括以下：血清γ麩胺醯基轉移酶(GGT)、AST/ALT、血清總膽紅素、直接膽紅素、白蛋白、葡萄糖、總肌酸激酶、肌酐、BUN、電解質、鹼性磷酸酶。

在篩檢、第7天、第30天、第60天以及第6、9及12個月/研究結束時收集CK-MB或肌鈣蛋白I。在修正案5 (第6.0版方案)起效之後篩檢及登記之新患者中量測肌鈣蛋白I代替CK-MB。在修正案5 (第6.0版方案)起效時已經篩檢及登記，但尚未接受基因代替療法(第2次隨訪)之參與者在用AVXS-101治療之前進行基線肌鈣蛋白I測試，且進行肌鈣蛋白I測試代替CK-MB。自所有其他參與者收集CK-MB。研究者自中央實驗室接收來自所有研究隨訪之實驗室結果(除第-1天以外)。

其他臨床評估 ： 病毒血清學 AAV載體之投藥具有引起免疫介導性肝炎之風險。對於具有HIV或對B型或C型肝炎或茲卡病毒呈陽性血清學之患者，AAV載體之投藥可能表示不合理的風險；因此，在治療之前，在篩檢時確認陰性血清學測試。根據由中央實驗室提供之實驗室手冊收集及運送此等樣品。

其他臨床評估 ： 凝血研究 凝血研究包括凝血酶原時間(PT)、部分凝血酶原時間(PTT)及國際標準化比值(INR)，根據由中央實驗室提供之實驗室手冊收集。根據表4中指定之時間點進行凝血研究。

其他臨床評估 ： 尿分析 根據表4中指定之時間點，根據由中央實驗室提供之實驗室手冊收集尿液樣品。根據當地實驗室之研究點標準程序，在住院給藥期間進行第-1天及即刻/同一天尿分析，如由研究者決定。尿分析包括以下參數：顏色、透明度/渾濁度、pH值、比重、葡萄糖、酮、亞硝酸鹽、白細胞酯酶、膽紅素、血液、蛋白質、紅血球、白血球、鱗狀上皮細胞、管型、晶體、細菌、酵母。

其他臨床評估 ： 毛細血管血氣 根據表4中指定之時間點完成毛細血管血氣。在高血管化區域(腳跟、手指、腳趾)處，用刺血針或類似裝置在患者皮膚之皮膚層中形成穿孔或小型切口。為了加速血液流動及降低動脈與靜脈氣壓之間的差異，在穿孔之前使該區域升溫。隨著血液自穿孔位點自由流動，在毛細管中收集樣品。

其他臨床評估 ： ELISA ：抗 AAV9 Ab 根據實驗室手冊(用於在篩檢時測試針對AAV9之血清抗體)且根據表4中指定之時間點收集血液樣品且運送至中央實驗室。

其他臨床評估 ： ELISA ：抗 SMN Ab 根據表4中指定之時間點，根據實驗室手冊(用於測試針對SMN之血清抗體)收集血液樣品且運送至中央實驗室。

其他臨床評估 ： IFN-γ ELISpots 根據表4中指定之時間點，根據實驗室手冊(用於進行干擾素γ (IFN-γ)ELISpots以偵測對AAV9及SMN之T細胞反應)收集血液且運送至中央實驗室。

其他臨床評估 ： 母體之基線篩檢 存在所登記之患者之母體可能具有預先存在之針對AAV9之抗體之可能性，該等抗體可能經由子宮內胎盤轉移或理論上經由母乳轉移至患者。要求患者之母親簽署知情同意書以關於針對AAV9之循環抗體篩檢母體。在獲得知情同意書之後，自外周靜脈抽取母體之血液且運送至中央實驗室以用於篩檢抗AAV9抗體。若發現AAV9抗體，則研究者應與母親商討是否繼續或停止哺乳。無法進行抗AAV9抗體測試之食用來自供體來源之備用母乳之患者在參與之前過渡至配方奶粉。

其他臨床評估 ： 用於診斷確認測試之血液 根據實驗室手冊在篩檢隨訪期間收集血液樣品且運送至中央實驗室，以用於SMN1缺失、SMN2複本數及不存在外顯子7基因修飾因子突變(c.859G＞C)之重新確認。進行此步驟以確保診斷測試操作之一致性。

其他臨床評估 ： 唾液、尿液及糞便收集 研究表明一些載體可在注射之後持續若干週自身體分泌出；此稱為「病毒排出」。載體排出可在注射之後持續一週見於血液、尿液、唾液及糞便中。此時尚未知與排出載體相關聯之風險；然而，不太可能存在風險，因為載體為非感染性且無法複製。無論如何，向患者家庭及護理者提供經IRB批准之關於以下之說明：若/當與患者體液及/或廢料直接接觸時，則使用防護性手套，以及在注射之後最少兩週內保持良好手部衛生。此外，在載體注射之後兩年內禁止患者獻血。

根據表4 (包括給藥後24及48小時)，根據實驗室手冊收集唾液、尿液及糞便樣品以用於病毒排出研究。對於至少一次排泄及一次排便，所有研究點之≥48個月的不再使用尿布之患者在第7天、第14天及第30天提供全部體積尿液及全部體積糞便樣品。根據實驗室手冊製備樣品，儲存於-80℃冷凍器中，且根據實驗室手冊運送至中央實驗室。選擇參與病毒排出子研究之在研究點的患者子集收集24小時總體積尿液及糞便樣品至給藥後24小時及給藥後48小時(以包括此等時段中之所有排泄物)。

實例 2 - SMA 患者中之 AVXS-101 研究 ( 臨床試驗中間結果 I) 根據實例1中所描述之方案鑑別、治療及評估患者。向脊髓性肌萎縮(SMA)患者鞘內投與AVXS-101，該等患者在進入研究時能夠坐立，但不能站立或行走。除SMN1之雙對偶基因缺失以外，患者具有3個SMN2基因之複本。將患者分為兩組，在給藥時年齡＞6個月且＜24個月及在給藥時年齡≥24個月且＜60個月。登記十六名＞6個月且＜24個月之患者及十二名≥24且＜60個月之患者。在較年幼組中，三名患者接受6.0×10¹³ vg之AVXS-101之投藥(劑量A)。其餘較年幼患者及所有較年長患者接受1.2×10¹⁴ vg之AVXS-101 (劑量B)。

患者經由腰部鞘內(IT)注射，以單次投藥形式接受預先與用於放射性監測之1.5 mL適合的造影劑混合之AVXS-101。患者在治療之後的前兩個月接受預防性普賴蘇穠以減弱宿主免疫反應。在治療之後12個月時段內週期性評估安全性及功效。對於在給藥時年齡＞6個月且＜24個月之患者，功效量度為獲得獨立站立能力之患者之比例(Bayley Scales of Infant and Toddler Development® - 粗大運動子集第40號)。評估其他重要事件，由世界衛生組織多中心生長參考研究(WHO-MGRS)規則(Wijnhoven 2004)定義，包括自背面滾動至側面、爬行、在具有支撐之情況下站立、拉著站起來及在存在或不存在幫助之情況下行走。對於在給藥時年齡≥24個月且＜60個月之患者，量測結果為哈默史密斯功能性運動擴展量表(HFMSE)中自基線之變化。每月評估反應者(定義為實現HFMSE分數＞3分；Swoboda等人, 2010)之百分比。

在接受劑量A (6.0×10¹³ vg；n=3)或劑量B (1.2×10¹⁴ vg；n=13)鞘內AVXS-101之後的五至12個月評估年齡在6與24個月之間的2型SMA患者。如表6中所示，Bayley®粗大運動量表分數之變化在-1與14分之間的範圍內(平均增量+SD為3.6+3.5 pts)，其中16名患者中之14名(87.5%)展示自基線之改良。16名患者中之七名在治療之後實現至少一個新的Bayley®項目。兩名患者(每個劑量組中一名)實現獨立站立之研究終點(E02、E24)；一名患者(E24)實現在年齡為20個月之前站立且現在可獨立走動。

表6：年齡為6個月-24個月之2型SMA患者中，所選擇之Bayley Scales of Infant and Toddler Development - 粗大運動量表之項目

患者

注射時之年齡(月)

獨立坐立*

自背面滾動至側面(第20項)

拉著坐起來(第23項)

在無支撐之情況下坐立(第26項)

支撐重量(第33項)

爬行(第34項)

拉著站起來(第35項)

在具有幫助之情況下行走(第37項)

獨立站立(第40項)

治療之後的月數

Bayley®中之變化

E-01⁺

18.8

X

O

X

O

12

5

E-02⁺

20.2

X

O

X

O

12

5

E-03^*

12.5

X

12

7

E-04

14.7

X

O

X

11

E-06

23.2

X

8

3

E-09

20

X

7

3

E-12

19.8

X

7

2

E-14

14.3

X

O

7

3

E-15

12

X

7

-1

E-20

19.9

X

6

2

E-21

20.3

X

5

4

E-23

19.8

X

5

1

E-24

7

X

O

5

17

E-25

17.1

X

O

X

4

2

E-27

11.9

X

5

6

E-28

15.1

X

O

5

0

(X)表示在治療之前獨立進行項目之能力；(O)表示在治療之後新的獨立進行項目之能力。

在接受劑量B (1.2×10¹⁴ vg；n=12)鞘內AVXS-101之後的五至九個月評估年齡在兩歲與五歲之間的2型SMA患者。如表7中所示，Bayley®粗大運動量表分數之變化在-8與10分之間的範圍內(平均增量+SD為2.1+1.3 pts)，其中12名患者中之九名(75%)展示自基線之改良。12名患者中之五名(42%)在治療之後實現至少一個新的Bayley®項目。兩名患者(E07；E13)在治療之後顯示在具有支撐之情況下站立之能力。一名患者(E07)現在能夠在具有幫助之情況下行走。

表7：年齡為2歲至5歲之2型SMA患者中所選擇的Bayley Scales of Infant and Toddler Development® - 粗大運動量表之項目

患者

注射時之年齡(月)

獨立坐立*

自背面滾動至側面(第20項)

拉著坐起來(第23項)

在無支撐之情況下坐立(第26項)

支撐重量(第33項)

爬行(第34項)

拉著站起來(第35項)

在具有幫助之情況下行走(第37項)

獨立站立(第40項)

治療之後的月數

Bayley®中之變化

E-05

29.5

X

9

1

E-07

50

X

O

X

O

6

3

E-08

35.6

X

O

X

7

8

E-10

45.3

X

7

2

E-11

53.7

X

7

1

E-13

30.7

X

O

7

10

E-16

28

X

O

X

6

3

E-17

32

X

6

0

E-18

54.5

X

6

0

E-19

26.2

X

6

-8

E-22

37.2

X

6

-1

E-26

27.3

X

O

X

5

4

對在達到兩歲之後的患者(6至24個月年齡組)及更年長的患者(2至5歲年齡組)進行哈默史密斯功能性運動擴展量表(HFMSE)。HFMSE分數之變化在-4與14分之間的範圍內(平均增量+SD為4.3+5.3 pts)，19名患者中之12名(63.1%)展示自基線之改良。較年長組(2至5歲)中之12名患者中之七名(58%)展示HFMSE之改良，而較年幼(6至24個月)組中之七名患者中之五名(71%)得到改良。一名在年齡為20.3個月時接受治療之患者(E02)獲得在無支撐之情況下站立之能力。19名患者中之十二名(63%)視為反應者(實現三分或更高的HFMSE改良)(圖3)。未發現在治療時，HFMSE分數與患者年齡之間的相關性。Swoboda等人 (2010) 「SMA CARNI-VAL Trial Part I: Double-Blind, Randomized, Placebo-Controlled Trial of L-Carnitine and Valproic Acid in Spinal Muscular Atrophy,」 PLOS ONE 5(8): e12140。

表8：在評估時年齡為2歲至5歲之2型SMA患者中的所選擇之哈默史密斯功能性運動擴展量表(HFMSE)

患者	注射時之年齡(月)	獨立坐立(第1項)	自一側滾動至另一側(第6-9項)	自坐立躺下(第10項)	四點跪(第15項)	爬行(第16項)	支撐站立(第18項)	在無支撐之情況下站立(第19項)	治療之後的月數	HFMSE中之變化
E-01⁺	18.8	XX	X		XX	XX	O		12	-2
E-02⁺	20.3	XX	XO	XO	XO	OO	XO	OO	12	8
E-04	14.7	XX	XX	XO	O				11	5
E-05	29.5	XX	XX	O					9	7
E-06	23.2	XX	XO	O					8	11
E-07	50	XX	XO	XO	XX	XX	OO		6	7
E-08	35.1	XX	XO	O					7	8
E-09	49.6	XX	XX	O					7	4
E-10	45	XX	XX	X	XX	XX	O		7	0
E-11	53.6	XX	X						7	0
E12	19.8	XX	O						7	3
E-13	30.7	XX	XO	OO	OO	O	OO		7	14
E-16	28	XX	XO	XO	XX	XX			6	8
E-17	31.9	XX							6	-1
E-18	54	XX	X	X	X				6	-3
E-19	26	XX	XX						6	-4
E-20	19.9	XX	XX	X					6	-1
E-22	37.2	XX	O	O					6	7
E-26	27.2	XX	O						5	9

(X)表示在治療之前在具有幫助之情況下進行項目之能力；(XX)表示在治療之前獨立進行項目之能力。(O)表示在治療之後新的在具有幫助之情況下進行項目之能力；(OO)表示在治療之後新的獨立進行項目之能力。(XO)表示在治療之前在具有幫助之情況下進行項目之能力及在治療之後新的在無幫助之情況下進行項目之能力。

圖3展示個別患者之HFMSE分數與患者年齡之關係。不在6至24個月年齡組中之患者中開始HFMSE之測試直至其年齡達到24個月。百分之六十三的患者(19名中之12名)展示HFMSE之改良。劑量A (6.0×10¹³ vg)組中之一名患者在八個月治療時展示八分之改良；第二名劑量A患者在七個月評估之後降低兩分。

在此研究中，實現至少3分HFMSE改良之患者表徵為反應者。對於較年長的群組(兩歲至五歲)，對於12名患者，自基線開始評估HFMSE直至治療之第5個月，且對於10名及5名患者，分別在第六個月及第七個月評估。對於較年幼的群組(六個月至兩歲)，在三個月及四個月時評估一名患者，且在接受AVXS-101治療之後六個月及七個月評估五名患者。較年長組中之所有患者以及較年幼組中之年齡達到兩歲及更大的患者展示於圖5中。在一個月治療後即觀測到50%之快速反應率。反應率保持等於或高於50%至研究之第七個月，反應率具有隨時間推移而增加之趨勢。

對於自基線至五個月治療之完全群組(n=12)，進行HFMSE評估之較年長群組(兩歲至五歲)中之患者之每月反應者比率展示於圖6中。在一個月治療後即觀測到50%之反應率。除治療後第六個月以外，反應者比率保持等於或高於50%至研究之第七個月。一名早期反應者在六個月評估時出現HFMSE降低，使此時間點之反應者比率降低至低於50%。

總而言之，在四至十二個月之觀測期期間，在24名患者中之11名中觀測到二十三件新的運動重要事件(表6至8)。在較年長群組中，在研究之第5個月與第9個月之間，平均HFMSE分數增加4.3分(表8)。兩個年齡群組中之大部分患者(63%)在治療之後具有HFMSE分數之改良，與劑量無關(圖3、4)。此研究中之百分之五十的患者在僅一個月療法之後具有HFMSE之臨床上有意義的改良(亦即，反應者，分數＞3分)，其中反應者比率隨時間推移而逐漸增加。用AVXS-101進行之治療比關於其他療法(諸如護理標準)所報導更有效。此等結果表明大部分患者對鞘內AVXS-101之單次給藥具有早期反應且展示快速反應起效，且在研究鞘內投與之AVXS-101期間保持作用。

實例 3 - SMA 患者中之 AVXS-101 研究 ( 臨床試驗中間結果 II) 本文中呈現如實例1及2中詳細描述之臨床試驗之其他中間結果。向脊髓性肌萎縮(SMA)患者鞘內(IT)投與AVXS-101，該等患者在進入研究時能夠在無支撐之情況下坐立≥10秒，但不能獨立站立或行走。除SMN1之雙對偶基因缺失以外，患者具有3個SMN2基因之複本。將患者分成兩個組，在給藥時年齡≥6個月且＜24個月及在給藥時年齡≥24個月且＜60個月。使用Bayley Scales®對所有研究患者(年齡≥6個月且＜60個月)進行治療前基線評估，且使用HFMSE對年齡≥24月且＜60個月之組進行其他基線評估。

在此等兩個年齡組內，如所描述投與三種不同的治療劑量：三名在給藥時年齡≥6個月且＜24個月之患者接受6.0×10¹³ vg之AVXS-101之單次IT投藥(劑量A)。十三名年齡≥6個月且＜24個月之患者及十二名年齡≥24月且＜60個月之患者接受1.2×10¹⁴ vg之AVXS-101之單次IT投藥(劑量B)。三名在給藥時年齡≥6個月且＜24個月之患者接受2.4×10¹⁴ vg之AVXS-101之單次IT投藥(劑量C)。在未來的研究中，將向額外的21名患者投與劑量C，其中此等患者中之9名來自在給藥時年齡≥6個月且＜24個月之組，且此等患者中之12名來自在給藥時年齡≥24月且＜60個月之組。

當前研究群體亦包括意向治療(Intent-to-Treat；ITT)集合中之31名患者，其定義為所有接受IT AVXS-101之患者，其中19名患者在登記時年齡≥6個月且＜24個月，且12名患者在登記時年齡≥24月且＜60個月。此外，功效完成分析集合(ECAS)中包括4名患者(3名劑量A及1名劑量B患者)，其定義為所有完成12個月給藥後隨訪之患者。在中間結果中，使用ITT集合作為主要群體且使用ECAS作為支持性群體進行所有功效分析。

比較來自用AVXS-101治療之患者之資料與患者水準資料，該患者水準資料係來自由兒科神經肌肉臨床研究(Pediatric Neuromuscular Clinical Research；PNCR)網路收集之同行審閱及廣泛所引用之天然病史資料集。Kaufmann等人, 「Prospective cohort study of spinal muscular atrophy types 2 and 3」 (2012) Neurology, 79(18):1889-1897。PNCR為自337名患有任何形式之SMA之患者之群組開發之大型天然病史研究，在3個具有顯著的管理SMA之專業知識之大型、國際認可之三級醫學中心(哈佛大學(Harvard University)/波士頓兒童醫院(Boston Children's Hospital)、哥倫比亞大學(Columbia University)及賓夕法尼亞大學(University of Pennsylvania)/費城兒童醫院(Children's Hospital of Philadelphia))進行。資料不含使用Bayley Scales of Infant and Toddler Development®進行之評估，其限制PNCR資料用於≥6個月且＜24個月年齡組。PNCR研究群組中未評估由Prior及同事描述之SMN2修飾因子突變(c.859G＞C)。Prior等人, 「A positive modifier of spinal muscular atrophy in the SMN2 gee」 (2009) A. J. Hum. Genet., 85(3):408-441。

PNCR N=51 天然病史對照組 ：對於年齡≥6個月且＜24個月之患者，自PNCR天然病史研究抽取之51名患者之群組稱為「群體匹配」對照群組。此對比群組包括滿足以下準則之全部51名參與PNCR研究之患者：(1)患有2型或3型SMA，(2)3個SMN2之複本，(3)症狀在年齡為12個月之前發作，及(4)在年齡為36個月時或之前進行至少一次隨訪。在此群組中，7/51名患者(13.74%)實現獨立站立之能力，其定義為在年齡為36個月時或之前的任何時間，實現HFMSE之第19項之評分為2。5/51名患者(10%)實現獨立行走之能力，且定義為在年齡為36個月時或之前的任何時間，實現HFMSE之第20項之評分為2。

PNCR N=15 天然病史對照組 ：對於年齡≥24個月且＜60個月之患者，選擇自PNCR天然病史研究抽取之15名患者之群組之患者水準資料作為「群體匹配」對照群組。此對照組用於初步分析。此天然病史對照組具有：(1)2型或3型SMA，(2)3個SMN2之複本，(3)症狀在年齡為12個月之前發作，(4)在年齡為24個月之前診斷患有SMA，及(5)在參與PNCR研究時不能站立或行走。群組成員在年齡為24與60個月之間接受HFMS或HFMSE評估，其用作與後續評估之比較之基線。此15名患者之PNCR組具有一名在基線及所有後續隨訪時記錄HFMSE評分為0之患者。在來自該群組之5/15 (33%)名個體中，收集HFMSE分數保持超過12個月之時段。最後一次隨訪為18個月(2/15名患者，13%)、42個月(2/15名患者，13%)及48個月(1/15名患者，7%)。

PNCR N=17 天然病史對照組 ：對於年齡≥24個月且＜60個月之患者，鑑別自PNCR研究抽取之17名患者之群組之患者水準資料，以改良患者組與天然病史對照組之間的匹配。此對照組用於敏感性分析。十二名原先在PNCR N=15對照組中之患者現屬於PNCR N=17天然病史對照組。不包括三名原先在PNCR N=15對照組中之患者(一名個體在基線及後續隨訪時HFMSE=0，2名個體在＞12個月時進行最後一次隨訪)。此等17名個體具有與研究組儘可能緊密匹配之年齡、臨床及遺傳準則。在≥24個月且＜60個月年齡範圍內之第一次隨訪定義為基線隨訪。使用在12個月間隔內之後續隨訪測定HFMSE之自基線之變化。臨床上，此等個體能夠坐立，但不能獨立站立或行走。遺傳學上，患者持有雙對偶基因SMN1缺失及3個SMN2之複本。使用PNCR天然病史對照組之限制在於參與者中之評估間隔不一致。因此，此對照組中之一些個體之資料≤12個月(參見例如表13)。

所有參與之患者之按照治療及按照年齡進行之患者配置詳細描述於表9中。安全性分析集合之按照治療及按照年齡組進行之人口統計資料及基線特徵之概述提供於表10中。

表9：患者配置 - 所有患者(中間結果II截止值)

	劑量A	劑量B	劑量C	總計
	年齡＜24個月	年齡＜24個月	年齡≥24且＜60個月	年齡＜24個月	年齡≥24且＜60個月
篩檢之患者	36
患者篩檢失敗	5
登記集合中之患者(n (%))	3	13	12	3	0	31
ITT集合中之患者(n (%))	3 (100)	13 (100)	12 (100)	3 (100)	0	31 (100)
完全分析集合中之患者(n (%))	3 (100)	13 (100)	12 (100)	3 (100)	0	31 (100)
安全性分析集合中之患者(n (%))	3 (100)	13 (100)	12 (100)	3 (100)	0	31 (100)
功效完成分析集合中之患者(n (%))	3 (100)	1 (7.7)	0	0	0	4 (12.9)
迄今為止完成研究之患者(n (%))	3 (100)	1 (7.7)	0	0	0	4 (12.9)
中止研究之患者(n (%))	0	0	0	0	0	0

表10：人口統計資料及基線特徵 - 安全性分析集合

人口統計資料/ 特徵類別/ 統計資料	劑量A	劑量B	劑量C	總計
年齡＜24 個月	年齡＜24 個月	年齡≥24 且＜60 個月	年齡＜24 個月	年齡＜24 個月
年齡( 月)
n	3	13	12	3	-	31
平均值(SD)	15.67 (4.041)	15.46 (4.427)	35.92 (10.483)	18.00 (3.464)	-	23.65 (12.200)
中值(最小值，最大值)	18.00 (11.0，18.00)	16.00 (6.0，22.0)	32.00 (25.0，53.0)	16.0 (16.0，22.0)	-	19.00 (6.0，53.0)
性別(n (%))
男性	1 (33.3)	7 (53.8)	6 (50.0)	3 (100)		17 (54.8)
女性	2 (66.7)	6 (46.2)	6 (50.0)	0		14 (45.2)
種族(n (%))
西班牙或拉丁裔	2 (66.7)	3 (23.1)	0	0	0	5 (16.1)
非西班牙或拉丁裔	1 (33.3)	10 (76.9)	12 (100)	3 (100)	0	26 (83.9)
人種(n (%))
白種人	2 (66.7)	10 (76.9)	8 (66.7)	2 (66.7)	0	22 (71.0)
亞裔	0	1 (7.7)	4 (33.3)	1 (33.3)	0	6 (19.4)
其他	0	1 (7.7)	0	0	0	1 (3.2)
多起源	1 (33.3)	1 (7.7)	0	0	0	2 (6.5)
基線體重(kg)
n	3	13	12	3	-	31
平均值(SD)	9.90 (1.900)	9.67 (0.778)	13.36 (3.235)	9.23 (0.252)	-	11.08 (2.783)
中值(最小值，最大值)	9.90 (8.0，11.8)	9.50 (8.3，10.8)	12.70 (9.8，20.2)	9.20 (9.0，9.5)	-	10.10 (8.0，20.2)
基線身長/ 身高(cm)
n	3	13	12	3	-	31
平均值(SD)	76.63 (4.744)	77.12 (5.308)	92.28 (8.449)	74.50 (2.500)	-	82.68 (9.998)
中值(最小值，最大值)	74.90 (73.0，82.0)	75.50 (69.0，87.0)	89.00 (82.5，112.0)	74.50 (72.0，77.0)	-	81.00 (69.0，112.0)
基線BMI (kg/m² )
n	3	13	12	3	-	31
平均值(SD)	16.736 (1.4937)	16.363 (1.6485)	15.530 (1.9429)	16.653 (0.6724)	-	16.105 (1.6973)
中值(最小值，最大值)	17.549 (15.01，17.65)	16.576 (12.55，18.90)	15.223 (12.78，18.66)	16.576 (16.02，17.36)	-	16.139 (12.55，18.90)
SMA 之家族病史，包括受影響的兄弟姐妹或父母載體(n [%])
是(n (%))	1 (33.3)	1 (7.7)	1 (8.3)	0	0	3 (9.7)
否(n (%))	1 (33.3)	12 (92.3)	11 (91.7)	2 (66.7)	0	26 (83.9)
未知(n (%))	1 (33.3)	0	0	1 (33.3)	0	2 (6.5)
出生胎齡( 週)
n	3	13	11	3	-	30
平均值(SD)	38.33 (1.155)	39.15 (0.899)	39.45 (2.162)	40.00 (1.000)	-	39.27 (1.507)
中值(最小值，最大值)	39.00 (37.0，39.0)	39.00 (38.0，41.0)	40.00 (35.0，42.0)	40.00 (39.0，41.0)	-	39.00 (35.0，42.0)
出生體重(kg)
n	3	12	11	3	-	29
平均值(SD)	3.193 (0.3722)	3.699 (0.8065)	3.248 (0.5360)	3.483 (0.2937)	-	3.453 (0.6507)
中值(最小值，最大值)	3.240 (2.80，3.54)	3.590 (3.10，6.13)	3.200 (2.55，4.20)	3.430 (3.22，3.80)	-	3.410 (2.55，6.13)
出生身長 (cm)
n	3	9	7	3	-	22
平均值(SD)	50.557 (2.2748)	50.459 (1.9058)	51.261 (2.2702)	49.520 (2.1478)	-	50.600 (2.0272)
中值(最小值，最大值)	50.170 (48.50，53.00)	51.000 (47.00，52.07)	51.000 (48.26，55.50)	48.300 (48.26，52.00)	-	51.000 (47.00，55.50)
出生頭圍(cm)
n	3	5	7	2	-	17
平均值(SD)	36.880 (3.4063)	34.464 (0.8328)	34.814 (1.5356)	34.750 (1.0607)	-	35.068 (1.8300)
中值(最小值，最大值)	36.000 (34.00，40.64)	34.800 (33.02，35.00)	34.000 (33.00，36.70)	34.750 (34.00，35.50)	-	34.800 (33.00，40.64)
患者報導之住院(n [%])
是(n (%))	1 (33.3)	4 (30.8)	5 (41.7)	1 (33.3)	0	11 (35.5)
否(n (%))	2 (66.7)	9 (69.2)	7 (58.3)	2 (66.7)	0	20 (64.5)
患者報導之進食支持(n [%])
是(n (%))	0	0	0	0	0	0
否(n (%))	3 (100)	13 (100)	12 (100)	3 (100)	0	31 (100)
患者報導之通氣支持(n [%])
是(n (%))	0	0	1 (8.3)	0	0	1 (3.2)
否(n (%))	3 (100)	13 (100)	11 (91.7)	3 (100)	0	30 (96.8)

中間結果： 主要功效終點之 ≥6 個月且 ＜24 個月組 中間評估 ( 劑量 A 、 B 及 C ；總 n=19) 此年齡組之主要功效終點為實現Bayley Scales of Infant and Toddler Development® - 粗大運動子集第40項，「在無支撐之情況下站立至少3秒」。若在12個月給藥後隨訪期間的任何時間達成重要事件，則認為患者實現此重要事件。由獨立的中央審查員確認重要事件之研究點評估之視訊記錄。

ITT集合之給藥之主要功效結果概述於下文及表11中：對於劑量A (6.0×10¹³ vg之AVXS-101)，3名患者中之1名(33.3%)，患者007-001，在治療後11個月實現在具有支撐之情況下站立。此患者在給藥時之年齡為約20個月。儘管患者未獨立站立，但此患者在進入研究時實現以下技能：支撐重量(Bayley®第33項)、在具有支撐之情況下行走(Bayley®第37項)及在具有支撐之情況下側向行走(Bayley®第38項)。

對於劑量B (1.2×10¹⁴ vg之AVXS-101)，13名患者中之1名(7.7%)，患者007-002，在治療後3個月內實現在無支撐之情況下站立。此患者在給藥時之年齡為約7個月。根據研究醫師，此患者不具有由神經檢驗鑑別之SMA之臨床表現。因為患者具有受影響之兄弟姐妹，患者在生命早期藉由基因測試進行診斷且隨後進行神經傳導研究。在進入研究之前，患者之複合肌動作電位(CMAP)異常。

對於劑量C (2.4×10¹⁴ vg之AVXS-101)，無患者(3名患者中0名)直至在治療後12個月之評估中實現在無支撐之情況下站立之重要事件(表11)。

對於劑量B+劑量C，16名患者中之1名(6.3%)，患者007-002 (上文所描述)，在治療後3個月實現在無支撐之情況下站立之重要事件。

表11：在直至12個月之任一次基線後隨訪時實現獨立站立之能力的在給藥時年齡＜24個月之患者之比例 - ITT集合

評估	統計資料	PNCR天然病史對照組(n=51)	劑量A (n=3)	劑量B (n=13)	劑量C (n=3)	劑量B+C (n=16)
實現獨立站立之能力之患者之比例	是	7 (13.7)	1 (33.3)	1 (7.7)	0	1 (6.3)
否	44 (86.3)	2 (66.7)	12 (92.3)	3 (100.0)	15 (93.8)
比例差異測試*	比例之差異(95% CI)	-6.0 (-21.8，22.8)	-13.7 (-28.9，56.5)	-7.5 (-22.0，17.2)
p值(費雪精確測試(Fisher's exact test))	＞0.9999	＞0.9999	0.6687

* 僅對劑量B、C及B+C進行費雪精確測試。

對於來自PNCR N=51資料集之患有2型及3型SMA之天然病史對照組，51名患者中之7名(13.7%)實現在無支撐之情況下站立之重要事件(如表11中所示)。

使用費雪精確測試(用於各組之間關於實現重要事件(主要功效終點)之患者的比例之比較)及卡本-麥爾分析(Kaplan-Meier analysis)(用於支持性功效終點)，根據方案進行統計分析。在直至12個月之任一次基線後隨訪時實現獨立站立之能力之主要功效終點概述於表11中。

對於PNCR組中之所有患者以及藉由ITT集合之中劑量，概述實現獨立站立之能力之時間。使用Cox比例風險模型評估治療差異，其中在基線時之患者年齡作為共變量，風險比(95% CI)為0.43 (0.05，3.93)(劑量B組)、0 (0，不可評估)(劑量C組)及0.37 (0.04，3.39)(劑量B+劑量C組)，其中p值分別為0.4576、0.9951及0.3826。大部分研究患者在截至報導中間結果時未實現獨立站立之重要事件，阻止諸如百分之25中值及百分之75之值之計算。

中間結果 ： 主要功效終點之 ≥24 個月且 ＜60 個月組中間評估 ( 劑量 B ；總 n=12) a. PNCR N=15 天然病史對照組之主要功效分析 此年齡組之主要功效終點為在第12個月時HFMSE之自基線之變化。使用ITT集合概述及分析HFMSE中之基線、基線後及自基線值之變化。對於方案中指定之分析，使用PNCR N=15天然病史對照組作為主要「群體匹配」對照群組。

用AVXS-101劑量B治療之個體及PNCR N=15天然病史對照組的直至第12個月時的HFMSE分數之自基線之變化之意大利麵圖顯示於圖7中。經治療之患者及對照組之描述性統計資料提供於表12中。

在PNCR N=15天然病史對照組中，基線HFMSE分數之平均值±標準差(SD)為11.8±7.34。在此PNCR對照組中，可在第2個月(-0.6±1.35)、第4個月(0.4±0.98)、第6個月(0.2±1.72)、第9個月(1.0±2.16)及第12個月(0.8±2.86)計算HFMSE分數自基線之變化。

在AVXS-101劑量B治療組中，基線HFMSE值為14.8±9.98。大部分經治療之患者具有長達8個月之HFMSE資料(11/12)。在第2、4、6、9及12個月時的HFMSE分數自基線之變化分別為3.5±4.38、3.6±5.07、3.9±5.85、5.7±6.72及7。與PNCR N=15天然病史對照組相比，劑量B治療組展示HFMSE分數之穩定增加。

表12：指定時間點(年齡≥24個月且＜60個月之患者)時之HFMSE值 - ITT集合 - 劑量B

隨訪評估	PNCR 天然病史對照組(N=15)	劑量B (N = 12)
n	平均值(SD)	中值( 最小值，最大值)	n	平均值(SD)	中值( 最小值，最大值)
基線
觀測值	15	11.8 (7.34)	9.0 (0，22)	12	14.8 (9.98)	12.0 (3，32)
第1 個月
觀測分數	NA	NA	NA	12	17.2 (10.05)	15.0 (2，36)
自基線分數之變化	NA	NA	NA	12	2.4 (3.34)	3.0 (-4，8)
第2 個月
觀測分數	10	-13.9 (6.30)	15.5 (5，21)	12	18.3 (11.04)	14.5 (5，38)
自基線分數之變化	10	-0.6 (1.35)	-1.0 (-2，2)	12	3.5 (4.38)	3.0 (-4，14)
第3 個月
觀測分數	NA	NA	NA	12	18.5 (10.94)	15.5 (4，39)
自基線分數之變化	NA	NA	NA	12	3.8 (3.93)	5.0 (-4，11)
第4 個月
觀測分數	7	14.1 (7.15)	15.0 (4，23)	12	18.3 (11.83)	15.5 (4，40)
自基線分數之變化	7	0.4 (0.98)	0.0 (-1，2)	12	3.6 (5.07)	5.0 (-4，12)
第5 個月
觀測分數	NA	NA	NA	12	19.3 (11.69)	16.5 (4，40)
自基線分數之變化	NA	NA	NA	12	4.5 (5.79)	5.5 (-3，16)
第6 個月
觀測分數	6	10.5 (7.69)	9.5 (0，22)	12	18.7 (11.72)	15.5 (2，39)
自基線分數之變化	6	0.2 (1.72)	0.0 (-2，3)	12	3.9 (5.85)	4.5 (-4，16)
第7 個月
觀測分數	1	21.0	21 (21，21)	11	17.5 (10.14)	16.0 (4，32)
自基線分數之變化	1	-1.0	-1.0 (-1，-1)	11	4.3 (5.35)	4.0 (-3，14)
第8 個月
觀測分數	1	20	20 (20，20)	11	20.5 (11.89)	17.0 (7，39)
自基線分數之變化	1	2.0	2.0 (2，2)	11	4.7 (6.48)	4.0 (-7，16)
第9 個月
觀測分數	7	13.7 (7.78)	16.0 (2，22)	10	22.3 (11.76)	19.5 (7，39)
自基線分數之變化	7	1.0 (2.16)	1.0 (-2，5)	10	5.7 (6.72)	5.5 (-4，20)
第10 個月
觀測分數	1	21.0	21 (21，21)	3	26.3 (12.10)	22.0 (17，40)
自基線分數之變化	1	-1.0	-1.0 (-1，-1)	3	8.3 (0.58)	8.0 (8，9)
第11 個月
觀測分數	NA	NA	NA	1	17.0	17.0 (17，17)
自基線分數之變化	NA	NA	NA	1	9.0	9.0 (9，9)
第12 個月
觀測分數	9	10.2 (7.36)	10.0 (0，22)	1	15.0	15.0 (15，15)
自基線分數之變化	9	0.8 (2.86)	0.0 (-2，6)	1	7.0	7.0 (7，7)

a. 使用 PNCR N=17 天然病史對照組之敏感性分析 劑量B及PNCR N=17天然病史對照組之描述性統計資料及意大利麵圖提供於表13及圖8中。在PNCR N=17天然病史對照組中，基線HFMSE分數為12.1±9.21。可在第2個月(-0.2±1.56)、第4個月(0.5±1.05)、第6個月(-0.4±5.32)、第9個月(1.1±2.03)及第12個月(-0.2±8.11)計算基線HFMSE分數之平均變化。百分之四十一(7/17)的PNCR患者不具有12個月HFMSE分數。

AVXS-101劑量B治療組之HFMSE基線分數為14.8±9.98。在第2、4、6、9及12個月時的平均HFMSE分數自基線之變化分別為3.5±4.38、3.6±5.07、3.9±5.85、5.7±6.72及7。

與PNCR N=17天然病史對照組相比，劑量B治療組展示HFMSE分數之穩定增加。

表13：指定時間點(年齡≥24個月且＜60個月之患者)時之HFMSE值 - ITT集合(敏感性PNCR) - 劑量B

隨訪評估	PNCR 天然病史對照組(N=17)	劑量B (N=12)
n	平均值(SD)	中值( 最小值，最大值)	n	平均值(SD)	中值( 最小值，最大值)
基線
觀測分數	17	12.1 (9.21)	8.0 (2，39)	12	14.8 (9.98)	12.0 (3，32)
第1 個月
觀測分數	NA	NA	NA	12	17.2 (10.05)	15.0 (2，36)
自基線分數之變化	NA	NA	NA	12	2.4 (3.34)	3.0 (-4，8)
第2 個月
觀測分數	9	12.1 (6.21)	8.0 (5，21)	12	18.3 (11.04)	14.5 (5，38)
自基線分數之變化	9	-0.2 (1.56)	-1.0 (-2，2)	12	3.5 (4.38)	3.0 (-4，14)
第3 個月
觀測分數	1	2.0	2.0 (2，2)	12	18.5 (10.94)	15.5 (4，39)
自基線分數之變化	1	-2.0	-2.0 (-2，-2)	12	3.8 (3.93)	5.0 (-4，11)
第4 個月
觀測分數	6	12.8 (6.85)	12.5 (4，23)	12	18.3 (11.83)	15.5 (4，40)
自基線分數之變化	6	0.5 (1.05)	0.5 (-1，2)	12	3.6 (5.07)	5.0 (-4，12)
第5 個月
觀測分數	NA	NA	NA	12	19.3 (11.69)	16.5 (4，40)
自基線分數之變化	NA	NA	NA	12	4.5 (5.79)	5.5 (-3，16)
第6 個月
觀測分數	8	13.6 (7.42)	10.5 (6，27)	12	18.7 (11.72)	15.5 (2，39)
自基線分數之變化	8	-0.4 (5.32)	0.5 (-12，6)	12	3.9 (5.85)	4.5 (-4，16)
第7 個月
觀測分數	NA	NA	NA	11	17.5 (10.14)	16.0 (4，32)
自基線分數之變化	NA	NA	NA	11	4.3 (5.35)	4.0 (-3，14)
第8 個月
觀測分數	NA	NA	NA	11	20.5 (11.89)	17.0 (7，39)
自基線分數之變化	NA	NA	NA	11	4.7 (6.48)	4.0 (-7，16)
第9 個月
觀測分數	8	12.8 (7.70)	13.0 (2，22)	10	22.3 (11.76)	19.5 (7，39)
自基線分數之變化	8	1.1 (2.03)	1.0 (-2，5)	10	5.7 (6.72)	5.5 (-4，20)
第10 個月
觀測分數	NA	NA	NA	3	26.3 (12.10)	22.0 (17，40)
自基線分數之變化	NA	NA	NA	3	8.3 (0.58)	8.0 (8，9)
第11 個月
觀測分數	NA	NA	NA	1	17.0	17.0 (17，17)
自基線分數之變化	NA	NA	NA	1	9.0	9.0 (9，9)
第12 個月
觀測分數	10	13.6 (7.53)	14.0 (1，25)	1	15.0	15.0 (15，15)
自基線分數之變化	10	-0.2 (8.11)	0.0 (-20，11)	1	7.0	7.0 (7，7)

中間結果 ： 次要功效終點 - 運動重要事件 ， 獨立行走至少 5 步對於≥6個月且＜24個月年齡組及≥24且＜60個月年齡組，次要功效終點為Bayley Scales of Infant and Toddler Development® - 粗大運動子集第43項(「獨立行走≥5步」)。在任一次治療後隨訪時對此重要事件進行評分直至第12個月研究隨訪。由獨立的中央審查員審查及確認初始重要事件評估之視訊證據。

對於在給藥時年齡≥6個月且＜24個月之患者，一名接受劑量B (1.2×10¹⁴ vg)之患者(007-002)在第4個月隨訪時在無幫助之情況下行走(參見先前章節中之患者說明)。實現在無幫助之情況下行走之能力的患者之比例為0% (0/3)(劑量A (6.0×10¹³ vg))、7.7% (1/13)(劑量B (1.2×10¹⁴ vg))及0% (0/3)(劑量C (2.4×10¹⁴ vg))。使用PNCR N=51天然病史對照組進行此分析。此對照組中之51名患者中之五名(9.8%)在基線時能夠獨立行走。在隨訪期期間，此對照組中沒有患者能夠獨立行走。

對於在給藥時年齡≥24個月且＜60個月之患者，所有患者接受劑量B (1.2×10¹⁴ vg)。此年齡組中沒有患者接受劑量C。用劑量B治療之患者皆不能獨立行走。主要PNCR N=15天然病史對照組或敏感性PNCR N=17天然病史對照組中之患者皆不能獨立行走。

中間結果 ： 探索性功效終點 - Bayley Scales of Infant and Toddler Development® 評估對於≥6個月且＜24個月年齡組及≥24且＜60個月年齡組，評估Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, 第三版(Bayley®-III)之精細及粗大運動部分之自基線之變化。對於≥6個月且＜24個月年齡組，第二探索性終點為繼續參與研究超過年齡為24個月且記錄至少6個月的有價值的基線後HFMSE評估之患者中HFMSE之自基線之改變。因為PNCR資料集中未評估Bayley Scales®，因此僅提供年齡＜24個月之患者之描述性統計資料。

儘管1型SMA患者具有嚴重的精細運動障礙，其中嬰兒不能使用其整個手進行抓握，但精細運動功能在2型SMA及3型SMA中保留相對良好，如精細運動發育之Bayley®分數所反映。De Sanctis等人, 「Developmental milestones in type I spinal muscular atrophy」 (2016) Neuromuscul. Disord. 26(11):754-759；Chabanon等人, 「Prospective and longitudinal natural history study of patients with Type 2 and 3 spinal muscular atrophy: Baseline data NatHis-SMA study」 (2018) PLoS ONE ,13(7): e0201004。在2型及3型SMA中，近端肌肉功能障礙顯著大於遠端肌肉功能障礙，如粗大運動發育之Bayley®分數所反映。

a. 在 給藥時年齡 ≥6 個月且 ＜24 個月之患者 劑量A (6.0×10¹³ vg)：此組中之全部3名患者完成給藥後12個月評估期。在第12個月時，Bayley Scales®之自基線之變化為12.3±6.51 (精細運動子測試)及5.7±1.15 (粗大運動子測試)。

劑量B (1.2×10¹⁴ vg)：可獲得全部13名患者之精細運動子測試中之自基線之變化至第6個月(5.4±3.57)。後續月的可用資料不完全：第7個月(n=11；7.8±3.03)、第8個月(n=10；7.4±3.60)、第9個月(n=6；8.2±3.25)、第10個月(n=3；11.7±3.06)、第11個月(n=2；12.5±4.95)。在第12個月，一名患者之自基線之變化為16.0。此等患者中之精細運動技能繼續改良，如藉由天然病史研究所預測。Chabanon等人, 「Prospective and longitudinal natural history study of patients with Type 2 and 3 spinal muscular atrophy: Baseline data NatHis-SMA study」 (2018) PLoS ONE. 13(7): e0201004。

可獲得全部13名患者的粗大運動子測試中之自基線之變化至第6個月(3.8±5.01)。後續月之可用資料不完全：第7個月(n=12；4.7±4.29)、第8個月(n=10；4.9±6.45)、第9個月(n=6；3.5±2.07)、第10個月(n=3；5.7±4.73)、第11個月(n=2；8.0±4.24)及第12個月(n=1；11.0)。患者繼續實現粗大運動重要事件。無患者損失重要事件。

劑量C (2.4×10¹⁴ vg)：可獲得的精細運動子測試中之自基線之變化的資料有限：第2個月(n=3；0.7±0.58)、第3個月(n=2；3.5±0.71)；在第4個月，一名患者之自基線之變化為6.0。可獲得粗大運動子測試中之自基線之變化至第4個月：第2個月(n=3；0.3±1.53)、第3個月(n=2；0.5±3.54)及第4個月(n=1；4.0)。

劑量B+劑量C：劑量B+劑量C之直至第12個月的Bayley Scales®中之自基線之變化之意大利麵圖提供於圖9(精細運動)及圖10(粗大運動)中。Bayley Scales®之描述性統計資料提供於表14中。

表14：在給藥時年齡＜24個月之患者在直至第12個月的任一次基線後隨訪時，Bayley Scale for Infant and Toddler Development®之粗大及精細運動分數之自基線之最大變化之分析 - ITT集合

隨訪統計資料類別	劑量A (N=3)	劑量B (N=13)	劑量C (N=3)	劑量B+C (N=16)
粗大運動
基線
n	3	13	3	16
平均值(SD)	26.3 (8.62)	20.8 (4.46)	25.0 (7.00)	21.6 (5.03)
中值(最小值，最大值)	28.0 (17，34)	20.0 (14，3)	25.0 (18，32)	20.0 (14，32)
在最大CFB 觀測值下之隨訪之基線後值
n	3	13	3	16
平均值(SD)	32.0 (7.55)	26.3 (8.48)	26.0 (5.29)	26.3 (7.83)
中值(最小值，最大值)	33 (24，39)	24.0 (18，51)	24.0 (22，32)	24.0 (18，51)
自基線之變化
n	3	13	3	16
平均值(SD)	5.7 (1.15)	5.5 (5.43)	1.0 (2.65)	4.7 (5.28)
中值(最小值，最大值)	5.0 (5，7)	4.0 (1，21)	0.0 (-1，4)	4.0 (-1，21)
精細運動
基線
n	3	13	3	16
平均值(SD)	31.3 (2.89)	31.2 (4.64)	36.0 (6.08)	32.1 (5.08)
中值(最小值，最大值)	33.0 (28，33)	31.0 (22，38)	33.0 (32，43)	31.5 (22，43)
在最大CFB 觀測值下之隨訪之基線後值
n	3	13	3	16
平均值(SD)	46.7 (5.03)	40.5 (5.97)	39.0 (3.61)	40.3 (5.53)
中值(最小值，最大值)	46.0 (42，52)	41.0 (32，50)	38.0 (36，43)	40.0 (32，50)
自基線之變化
n	3	13	3	16
平均值(SD)	15.3 (5.51)	9.3 (3.75)	3.0 (3.00)	8.1 (4.35)
中值(最小值，最大值)	18.0 (9，19)	11.0 (3，16)	3.0 (0，6)	9.0 (0，16)

b. 在 給藥時年齡 ≥4 個月且 ＜60 個月之患者 ≥24且＜60個月年齡組由12名接受劑量B (1.2×10¹⁴ vg)之患者構成。觀測精細及粗大運動子集之增進。可獲得全部12名患者之精細運動子測試中之自基線之變化至第6個月(7.6±5.62)。後續月之可用資料不完全：第7個月(n=11；6.6±5.33)、第8個月(n=11；8.0±5.74)、第9個月(n=10；7.9±5.53)及第10個月(n=2；10.5±0.71)。一名患者在第11個月(n=1)及第12個月(n=1)具有資料，其中分數分別為9.0及10.0。

對於粗大運動子集，可獲得全部12名患者之自基線之變化至第6個月(1.8±4.47)。後續月之可用資料不完全：第7個月(n=11；2.0±4.36)、第8個月(n=11；2.3±4.47)、第9個月(n=10；2.4±5.08)、第10個月(n=2；5.5±6.36)。沒有患者損失Bayley®粗大運動重要事件。

劑量B之直至第12個月的Bayley Scales®中之自基線之變化之意大利麵圖提供於圖11及圖12中。患者008-003之曲線不正確。患者008-003之基線分數為20而非28 (如最初報導)。因此，基線量測值與第1個月之間的粗大運動分數之變化為「0」而非「-8」。此外，患者008-003之粗大運動分數自基線量測值之變化為「0」(第2及3個月)、「+1」(第4個月)、「0」(第5及6個月)、「+1」(第7-11個月)及「+2」(第12個月)。

此等中間資料概述截至治療後12個月的實例1中所描述之臨床試驗之功效結果。Bayley Scales®之描述性統計資料提供於表15中。

表14：在給藥時年齡≥24且＜60個月之患者在直至第12個月的任一次基線後隨訪時，Bayley Scale for Infant and Toddler Development®之粗大及精細運動分數之自基線之最大變化之分析 - ITT集合

隨訪統計資料類別	劑量B (N=12)
粗大運動
基線
n	12
平均值(SD)	23.2 (6.15)
中值(最小值，最大值)	20.5 (16，35)
在最大CFB 觀測值下之隨訪之基線後值
n	12
平均值(SD)	26.2 (6.83)
中值(最小值，最大值)	24.5 (18，38)
自基線之變化
n	12
平均值(SD)	3.0 (4.51)
中值(最小值，最大值)	3.0 (-7，11)
精細運動
基線
n	12
平均值(SD)	46.2 (8.77)
中值(最小值，最大值)	47 (32，60)
在最大CFB 觀測值下之隨訪之基線後值
n	12
平均值(SD)	55.6 (5.66)
中值(最小值，最大值)	55.0 (46，65)
自基線之變化
n	12
平均值(SD)	9.4 (5.32)
中值(最小值，最大值)	10.0 (1，23)

中間結果 ： 繼續參與研究超過年齡為 24 個月之年齡 ≥6 個月且 ＜24 個月之患者的 HFMSE 分數之變化 在年齡≥6且＜24個月之患者組中，記錄年齡達到24個月之患者之HFMSE評分。因為無法獲得任何患者之治療前基線，將HFMSE之第一次記錄定義為基線。以下月份標示係相對於年齡≥24個月時HFMSE之第一次記錄，而非研究月份。

劑量A (6.0×10¹³ vg)：兩名患者年齡達到24個月。提供自HFMSE之第一次記錄之變化：第1個月(n=2；-0.5±4.95)、第2個月(n=2；4.0±0.00)、第3個月(n=2；3.5±0.71)、第4個月(n=2；3.0±2.83)、第5個月(n=1；5.0)及第6個月(n=2；2.0±5.66)。

劑量B (1.2×10¹⁴ vg)：八名患者年齡達到24個月。提供自HFMSE之第一次記錄之變化：第1個月(n=7；2.0±2.83)、第2個月(n=7；2.7±2.69)、第3個月(n=6；1.3±4.97)、第4個月(n=3；4.7±4.51)及第5個月(n=2；7.5±0.71)。

劑量B之直至第12個月的HFMSE分數之自基線之變化之意大利麵圖提供於圖13中。劑量B之直至第12個月的任一次基線後隨訪時的HFMSE值之自基線之最大變化(平均值±SD)為17.7±5.28 (n=7)，如表15中所示。

劑量C (2.4×10¹⁴ vg)：一名患者在年齡≥24個月時實現HFMSE之第一次記錄。僅可獲得此單一「基線」資料點。

表15：繼續參與研究超過年齡為24個月的在給藥時＜24個月之患者在直至第12個月的任一次基線後隨訪時HFMSE之自基線之最大變化 - ITT集合

隨訪統計資料類別	劑量B (N=13)	劑量C (N=3)
基線定義為當患者年齡達到24 個月時，在研究期間之第一次HFMSE 評估
n	8	1
平均值(SD)	13.0 (5.61)	33.0
中值(最小值，最大值)	13.0 (6，21)	33.0 (33，33)
在最大CFB 觀測值下之隨訪之基線後值
n	7	0
平均值(SD)	17.7 (5.28)	-
中值(最小值，最大值)	17 (11，25)	-
自基線之變化
n	7	0
平均值(SD)	5.9 (5.34)	-
中值(最小值，最大值)	4.0 (2, 17)	-

中間結論 本文中所描述之臨床試驗為經診斷患有脊髓性肌萎縮(SMA)之年齡≥6個月且＜60個月之嬰兒及兒童中的正在進行中的1期、開放標記、單次劑量鞘內(IT)投藥研究。迄今為止，在經治療之患者中獲得之資料展示運動功能之臨床上有意義的變化，包括促進技能、促進重要事件及疾病穩定，其描述於以下各年齡組之概述中。

≥6 個月且 ＜24 個月年齡組 十九名年齡≥6個月且＜24個月之患者參與臨床試驗。三名患者接受6.0×10¹³ vg之AVXS-101之單次給藥(劑量A)，13名患者接受1.2×10¹⁴ vg之AVXS-101之單次給藥(劑量B)，且3名患者接受2.4×10¹⁴ vg之AVXS-101之單次給藥(劑量C)。四名患者完成給藥後12個月評估：劑量A組中之3名患者及劑量B組中之1名患者。

此年齡組之主要功效終點為實現Bayley Scales of Infant and Toddler Development® - 粗大運動子集第40項，「在無支撐之情況下站立至少3秒」。兩名患者實現主要功效終點。接受劑量A之患者007-001在治療後11個月實現在無支撐之情況下站立至少3秒。接受劑量B之患者007-002在治療後3個月實現在無支撐之情況下站立。

次要功效終點為Bayley Scales of Infant and Toddler Development® - 粗大運動子集第43項(「獨立行走≥5步」)。一名接受劑量B之患者(007-002)在治療後4個月實現在無幫助之情況下行走至少5步。

探索性終點為Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, 第三版(Bayley®-III)之精細及粗大運動部分之自基線之變化。因為PNCR資料集中未評估Bayley Scales®，因此僅提供年齡＜24個月之患者之描述性統計資料。然而，患者繼續實現粗大運動重要事件。沒有患者損失重要事件。

≥24 個月且 ＜60 個月年齡組 十二名年齡≥24個月且＜60個月之患者參與臨床試驗且接受劑量B。此年齡組中沒有患者接受劑量C。一名患者完成治療後12個月評估。

此年齡組之主要功效終點為HFMSE中之自基線之變化。為將在劑量B組中觀測之變化置放於上下文中，HFMSE分數之≥3分改良視為對利益關係人(諸如照護者及臨床醫師)有意義及重要的，且用作用於檢測臨床試驗中之有意義的變化之臨界值。Mercuri等人, 「Nusinersen versus sham control in later-onset spinal muscular atrophy」 N Engl J Med. 378(7): 625-635。與PNCR N=15天然病史對照組相比，劑量B治療組展示HFMSE分數之穩定增加。對於PNCR N=15天然病史對照組，在第9個月觀測到HFMSE分數之最大變化(n=7)，其為1.0±2.16。當使用PNCR N=17天然病史對照組進行敏感性分析時觀測到類似結果，其中在第9個月(n=8)時的HFMSE分數之最大變化為1.1±2.03。

對於在第9個月(n=10)時HFMSE分數之變化，劑量B治療組展示臨床上有意義的增加，其為5.7±6.72。

探索性終點為Bayley®-III之精細及粗大運動部分中的自基線之變化。與較年幼組類似，患者繼續實現粗大運動重要事件。沒有患者損失重要事件。

圖1展示在AAV投藥之後，經處理及對照小鼠之身體質量。圖2展示患有II型或III型SMA之嬰兒及兒童之階段I、開放標記單次劑量投藥研究之初始研究設計。患者在劑量對比安全性研究中接受AVXS-101。圖3展示在年齡為24個月之後評估的在接受劑量A (6.0×10¹³ vg；用菱形標註)或劑量B (1.2×10¹⁴ vg)鞘內AVXS-101之2型SMA患者中，哈默史密斯功能性運動擴展量表(HFMSE)之自基線之改變之瀑布圖，以最高至最低排序。年齡在六個月與兩歲之間的患者在輸注時之結果由灰色柱描繪；黑色柱指示在輸注時，年齡在2與5歲之間。圖4展示個別2型SMA患者之HFMSE分數。圖5展示在治療時，年齡在六個月與五歲之間的患者對AVXS-101治療之反應，如藉由HFMSE量測。圖6展示在治療時，年齡在兩歲與五歲之間的接受1.2×10¹⁴ vg之劑量的患者對AVXS-101治療之反應，如藉由HFMSE量測。圖7展示在≥24個月且＜60個月年齡組(初步PNCR分析)-ITT集合中，至第12個月時HFMSE分數之自基線之變化之意大利麵圖(spaghetti plot)。圖8展示在≥24個月且＜60個月年齡組(敏感性PNCR分析)-ITT集合中，至第12個月時HFMSE分數之自基線之變化之意大利麵圖。圖9展示在給藥時年齡＜24個月之患者-ITT集合中，至12個月時在每次基線後隨訪時，精細運動評分之自基線之變化之意大利麵圖，如藉由Bayley Scales®測定。圖10展示在給藥時年齡＜24個月之患者-ITT集合中，至12個月時在每次基線後隨訪時，粗大運動評分之自基線之變化之意大利麵圖，如藉由Bayley Scales®測定。圖11展示在給藥時年齡≥24且＜60個月之患者-ITT集合中，至12個月時在每次基線後隨訪時，精細運動評分之自基線之變化之意大利麵圖，如藉由Bayley Scales®測定。圖12展示在給藥時年齡≥24且＜60個月之患者-ITT集合中，至12個月時在每次基線後隨訪時，粗大運動評分之自基線之變化之意大利麵圖，如藉由Bayley Scales®測定。圖13展示在給藥時年齡＜24個月、在年齡超過24個月後繼續參與研究之患者-ITT集合中，在每次基線後隨訪時，HFMSE之自基線之變化之意大利麵圖。

<110> 瑞士商諾華公司(NOVARTIS AG)

<120> AAV病毒載體及其用途

<130> 14452.0025-00304

<140> TW108143173

<141> 2019-11-27

<150> US62/835,242

<151> 2019-04-17

<150> US62/773,894

<151> 2018-11-30

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2359

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註釋=「人工序列之說明：合成聚核苷酸」

<400> 1

<210> 2

<211> 294

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註釋=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 2

<210> 3

<211> 736

<212> PRT

<213> 腺相關病毒

<400> 3

<210> 4

<211> 1621

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

Claims

一種AAV9病毒載體的用途，其係用於製備治療有需要之患者之脊髓性肌萎縮(SMA)之藥物，其中該AAV9病毒載體包含編碼運動神經元存活(SMN)蛋白質的聚核苷酸，且其中該AAV9病毒載體係經調配用於以約6.0×10¹³vg至約2.4×10¹⁴vg之劑量鞘內投與。
如請求項1之用途，其中該AAV9病毒載體進一步包含經修飾之AAV2ITR、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)即刻/早期強化子、經修飾之SV40晚期16S內含子、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號及未經修飾之AAV2 ITR。
如請求項1之用途，其中該SMN蛋白質包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列，或該AAV9病毒載體包含SEQ ID NO：1之核酸序列。
如請求項1之用途，其中該AAV9病毒載體包含衣殼，該衣殼包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。
如請求項1之用途，其中該AAV9病毒載體進一步包含適用於鞘內投與之醫藥學上可接受之載劑。
如請求項1之用途，其中該AAV9病毒載體進一步包含造影劑。
如請求項6之用途，其中該造影劑包含碘海醇(iohexol)。
如請求項1之用途，其中該藥物係於容器中且包含以下中之至少一者：a)約7.7-8.3之pH，b)約390-430mOsm/kg之滲透濃度，c)以每個容器計，尺寸
25μm之顆粒少於約600個，d)以每個容器計，尺寸
10μm之顆粒少於約6000個，e)約1.7×10¹³-5.3×10¹³vg/mL之基因組效價，f)感染效價為每1.0×10¹³vg約3.9×10⁸-8.4×10¹⁰IU，g)總蛋白質為每1.0×10¹³vg約100-300μg，h)Pluronic F-68(白洛沙姆(Poloxamer)188)含量為約20-80ppm，i)基於活體外基於細胞之分析法，相對效能為約70-130%，其中該效能係相對於參考標準或適合的對照物，j)效能之特徵在於在SMN△7小鼠模型中，在7.5×10¹³vg/kg之劑量下，中值存活期大於或等於24天，k)小於約5%空衣殼，l)總純度大於或等於約95%，m)小於或等於約0.13EU/mL之內毒素，n)每1.0×10¹³vg小於約0.09ng全能核酸酶(benzonase)，o)小於約30μg/g(ppm)之銫，p)每1.0×10¹³vg小於約0.22ng牛血清白蛋白(BSA)， q)每1.0×10¹³vg小於約6.8×10⁵pg殘餘質體DNA，r)每1.0×10¹³vg小於約1.1×10⁵pg殘餘hcDNA，及s)每1.0×10¹³vg小於約4ng rHCP。
如請求項1之用途，其中該AAV9病毒載體係經調配以約1.2×10¹⁴vg之劑量投與。
如請求項1之用途，其中該AAV9病毒載體係經調配以約2.4×10¹⁴vg之劑量投與。
如請求項1之用途，其中該SMA為II型SMA或III型SMA。
如請求項1之用途，其中在投與該藥物時，該患者年齡為6個月或更大。
如請求項1之用途，其中在投與該藥物時，該患者年齡為6個月至24個月。
如請求項1之用途，其中在投與該藥物時，該患者年齡為24個月至60個月。
如請求項1之用途，其中在投與該藥物前或在投與該藥物時，該患者： a)具有雙對偶基因SMN1無效(null)突變或不活化缺失；b)具有SMN1之外顯子7之缺失；c)具有三個或多於三個SMN2之複本；d)在至少一個該SMN2基因之複本上之外顯子7中不具有c.859G>C取代；e)在年齡為約12個月之前顯現出疾病發作；f)具有在無需幫助之情況下坐立約10秒或更長時間之能力，但不能站立或行走，係由世界衛生組織多中心生長參考研究(World Health Organization Multicentre Growth Reference Study；WHO-MGRS)準則所定義；g)具有以下中之一或多者：小於正常值上限之約3倍之γ-麩胺醯基轉移酶含量、小於約3.0mg/dL之膽紅素含量、小於約1.0mg/dL之肌酐含量、在約8-18g/dL之間之Hgb含量或小於約20000個/立方毫米之白血球計數；h)具有高於約67,000個細胞/毫升之血小板計數；i)具有正常肝功能；j)具有小於約8-40U/L之肝轉胺酶含量；k)具有等於或低於1：25、1：50、1：75或1：100之抗AAV9抗體效價，其係藉由酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)所測定；l)在X射線檢驗時不具有嚴重脊柱側彎(定義為脊椎
50°彎曲)；m)未禁忌脊椎穿刺程序或鞘內療法之投與；n)先前未經歷脊柱側彎修復手術或程序；o)無需使用侵入性通氣支持； p)不具有獨立站立或行走之歷史；q)未使用胃飼管；r)不具有活性病毒感染；s)在四週內未患有嚴重的非肺部或呼吸道感染；t)不具有伴隨疾病、重度腎或肝損傷、已知的癲癇發作、糖尿病、特發性低鈣尿症或症狀性心肌病；u)不具有細菌性腦膜炎或腦部或脊髓疾病之病史；v)不具有已知的對普賴蘇穠(prednisolone)或其他糖皮質類固醇或賦形劑之過敏性或過敏反應；w)不具有已知的對碘或含碘產品之過敏性或過敏反應；x)未正在使用用於治療肌病或神經病之藥物；y)在3個月內未接受免疫抑制性療法、血漿清除術或免疫調節劑；或z)未接受治療SMA的研究性或經批准之化合物產品或療法。
如請求項15之用途，其中在投與該藥物前或在投與該藥物時，該患者未接受阿達木單抗(adalimumab)。
如請求項1之用途，其中該患者在該藥物之投與期間、之後或其兩者處於垂頭仰臥位(Trendelenburg position)。
如請求項1之用途，其中在投與口服類固醇後至少約1-48小時，投與該藥物，且其中向該患者投與該口服類固醇： a)約1mg/kg之劑量；b)保持至少約10-60天；c)直至天冬胺酸轉胺酶(AST)或丙胺酸轉胺酶(ALT)含量或其兩者低於正常值上限之兩倍或低於約120IU/L；d)直至來自該患者之血液樣品中之T細胞反應降低至低於100個斑點形成細胞(SFC)/10⁶個外周血液單核細胞(PBMC)；e)直至該患者之抗AAV9抗體效價降低至低於1：25、1：50、1：75或1：100，其係藉由ELISA所測定；f)其中向該患者每天一次或兩次投與該口服類固醇；或g)(a)-(f)之任何組合。
如請求項18之用途，其中該患者係以約1毫克/公斤/天之劑量投與該口服類固醇，且接著逐漸減少至0.5毫克/公斤/天保持2週，接著以0.25毫克/公斤/天再保持2週。
如請求項18之用途，其中該患者係投與該口服類固醇保持至少30天。
如請求項18之用途，其中該口服類固醇為普賴蘇穠(prednisolone)或等效物。
如請求項1之用途，其中該藥物係與第二治療劑同時或依序地投與。
如請求項22之用途，其中該第二治療劑包含靶向SMN1或SMN2或其兩者之反義寡核苷酸、肌肉增強劑或神經保護劑或肌肉增強劑及神經保護劑兩者。
如請求項1之用途，其中在投與該藥物後，該患者：a)在X射線檢驗時不具有嚴重的脊柱側彎(定義為脊椎
50°彎曲)；或b)在6個月至3年內，未經歷脊柱側彎修復手術或程序。
如請求項1之用途，其中在投與該藥物後，該患者：a)無需使用侵入性通氣支持；或b)未使用胃飼管。
如請求項1之用途，其中在投與該藥物後，該患者具有等於或高於1：25、1：50、1：75或1：100之抗AAV9抗體效價，其係藉由ELISA所測定；且監測約1-8週或直至效價降低至低於1：25、1：50、1：75或1：100。
如請求項1之用途，其中在投與該藥物後，該患者：a)具有低於67,000個細胞/毫升之血小板計數，且監測約1-8週或直至血小板計數增加至約67,000個細胞/毫升；或b)具有低於67,000個細胞/毫升之血小板計數，且藉由血小板輸注來治療。
如請求項1至27中任一項之用途，其中與投與前分數相比，該藥物有效改善在哈默史密斯功能性運動擴展量表(Hammersmith Functional Motor Scale-Expanded)之患者分數；或與投與前分數相比，該患者在Bayley Scales of Infant and Toddler Development®或兩者達到改良之分數。
如請求項28之用途，其中在投與後1-24個月，該患者達到：a)在無支撐之情況下站立至少約三秒之能力；b)在無幫助之情況下行走之能力；c)具有獨立行走至少五步之能力；或d)治療後自治療時之基線量測值之變化；其中a)、b)、c)或d)係由Bayley Scales of Infant and Toddler Development®所定義。
如請求項28之用途，其中該患者達到：a)與投與前分數相比，投與後9個月在哈默史密斯功能性運動擴展量表分數改良至少3分；b)與投與前分數相比，投與後在Bayley Scales of Infant and Toddler Development®之粗大運動部分改良至少三分；c)投與後12個月在無支撐之情況下站立至少三秒之能力；或d)投與後12個月具有獨立行走至少五步之能力。
如請求項30之用途，其中該患者達到與投與前分數相比，投與後9個月在哈默史密斯功能性運動擴展量表分數改良至少4分。
如請求項30之用途，其中該患者達到與投與前分數相比，投與後9個月在哈默史密斯功能性運動擴展量表分數改良至少5分。