KR20230152503A - 척수강 내 투여에 최적화 된 간세포 성장인자 유전자가 도입된 aav 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 척수강 내 투여에 최적화 된 간세포 성장인자 유전자가 도입된 AAV 벡터에 관한 것이다. 상기 본 발명의 AAV 벡터 및 이를 통해 제조된 AAV 입자는 간세포 성장인자 유전자를 포함하는 AAV 입자의 생산성이 우수하고, 이를 포유동물의 척수강 내 투여시 간세포 성장인자의 발현 효율 또한 매우 우수하다. 따라서 척수강 내 투여에 본 발명의 AAV 벡터 및 입자를 이용하는 경우, 간세포 성장인자 단백질의 발현을 유도함으로써 관련된 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

척수강 내 투여에 최적화 된 간세포 성장인자 유전자가 도입된 AAV 벡터{AAV vector introduced with hepatocyte growth factor gene optimized for intrathecal administration}

본 발명은 척수강 내 투여에 최적화 된 간세포 성장인자 유전자가 도입된 AAV 벡터에 관한 것이다.

유전자 치료는 유전자 재조합 기술을 이용하여 치료 유전자를 환자의 세포 안에 전달하여 대상세포의 유전적 변형을 일으키거나 특정 단백질을 발현시켜 유전적 질환 및 난치병 등을 치료하는 방법이다. 이 때 유전자를 생체 내로 전달하는 물질을 운반체 또는 벡터라고 하는데, 벡터는 크게 바이러스성 벡터와 비바이러스성 벡터로 구분된다. 바이러스성 벡터로는 레트로바이러스, 아데노바이러스가 대표적이며, 비바이러스성 벡터로는 naked DNA, 리포좀(liposome) 등이 있다.

본 발명자들은 간세포 성장인자를 이용한 유전자 치료를 위해, 간세포 성장인자 유전자가 도입된 아데노바이러스-연관 바이러스(Adenovirus-associated virus, AAV)를 제작한 바 있다(Lee et al., BBRC 517:452-457, 2019; Lee et al., Acta Neuropathologica Communications 7:14, 2019). 그러나 종래의 AAV는 생산성이 낮고 척수강 내 투여시 단백질의 발현 수준이 매우 낮은 한계가 있었다. 이에 생산성이 향상되고 척수강 내 투여에 최적화되어 단백질의 발현 수준을 향상시킨 새로운 AAV 벡터 개발의 필요성이 제기되었다.

대한민국 등록특허 제10-2112476호(2020.05.13. 등록)

본 발명자들은 생산성과 단백질 발현 수준이 향상된 신규 AAV 벡터 개발을 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 특정한 프로모터, AAV 혈청형 및 폴리아데닐화 서열 등을 조합하는 경우 AAV 입자의 생산성이 크게 향상됨을 확인하였다. 또한 본 발명자들은 상기 AAV 입자를 척수강 내 투여시 단백질의 발현량이 크게 개선됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 척수강 내 투여에 최적화 된 간세포 성장인자 유전자가 도입된 AAV 벡터, AAV 입자, 및 이를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 형질전환 과정에 의해 벡터가 세포 내에 배치되었을 때 복제될 수 있도록 온전한 레플리콘을 포함하는 비-염색체 핵산을 나타낸다. 상기 벡터는 바이러스성 또는 비바이러스성일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 헤르페스바이러스, 배큘로바이러스, 변형된 배큘로바이러스, 파포바이러스(papovirus) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 핵산을 전달하기 위한 비바이러스성 벡터는 네이키드 DNA; 단독의 또는 양이온성 중합체와 조합된, 양이온성 지질과 복합체를 형성한 DNA; 음이온성 및 양이온성 리포솜; 일부 경우에 리포솜에 함유된, 이종성 폴리리신, 규정된 길이의 올리고펩타이드, 및 폴리에틸렌 이민과 같은 양이온성 중합체와 축합된 DNA를 포함하는 DNA-단백질 복합체 및 입자; 및 바이러스 및 폴리리신-DNA를 포함하는 삼원 복합체의 사용을 포함한다.

"바이러스 벡터"는 생체내, 생체외 또는 시험관내 중 어느 하나에서 숙주 세포에 전달될 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합에 의해 생성된 바이러스 또는 바이러스 입자로서 정의된다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스 벡터, AAV 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터 등이 있다. 알파바이러스벡터, 예컨대 셈리키 포레스트 바이러스-기반 벡터 및 신드비스 바이러스-기반 벡터가 또한 유전자 요법 및 면역요법에 사용하기 위해 개발되었다. (Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 및 Ying, et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827 참조).

상기 벡터는 복제 오리진 등의 숙주 세포에서 복제를 허용하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 숙주 세포에서 복제를 허용하는 핵산 서열이 결핍될 수 있다. 또한, 벡터는 대상 유전자, 하나 이상의 선택적인 마커 유전자, 그 외 당해 기술 분야에 공지된 유전자 요소 또는 임의의 그 외 적절한 인서트를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, "아데노-관련 바이러스(Adeno-associated virus)" 또는 "AAV"는 파보비리대(parvoviridae)과 디펜도파보바이러스(dependoparvovirus) 속에 속한다. 이 바이러스의 다중 혈청형은 유전자 전달에 적합한 것으로 알려져 있다. 적어도 11개의 차례로 넘버링된 AAV 혈청형이 기술분야에 알려져 있다: AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 AAV 혈청형은 변이 혈청형을 포함한다: AAV-DJ. AAV-DJ/8, AAV-PHP.Eb, AAV-PHP.S, AAV rh10, 등.

본원에서 사용되는 바 "AAV 벡터"는 역위 말단 반복부 서열 (inverted terminal repeat sequence, ITR sequence)에 의해 플랭킹 된 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오타이드 (또는 도입유전자)를 포함하는 벡터를 말한다. AAV 벡터는 rep 및 cap 유전자 생성물을 암호화하고 발현하는 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포에서 존재할 때 복제되고 감염성 바이러스 입자로 패키징될 수 있다.

"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화 된 폴리뉴클레오타이드 AAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 나타낸다.

상기 "AAV"는 복제 결핍 파보바이러스이고, 그것의 단일 가닥 DNA 게놈은 길이가 약 4.7 kb이며 2개의 뉴클레오타이드 역위 말단 반복부 (ITR)를 포함하고 있다. AAV의 다중 혈청형이 있다. 상술한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, AAV-1의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_002077로 제공되고; AAV-2의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001401 및 Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)에서 제공되며; AAV-3의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_1829로 제공되고; AAV-4의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001829로 제공되며; AAV-5 게놈은 GenBank 수탁 번호 AF085716로 제공되고; AAV-6의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_00 1862로 제공되며; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 GenBank 수탁 번호 AX753246 및 AX753249로 제공되고; AAV-9 게놈은 Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)에서 제공되며; AAV-10 게놈은 Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)에서 제공되고; 그리고 AAV-11 게놈은 Virology, 330(2): 375-383 (2004)에서 제공된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 AAV의 게놈은 자체 상보성 게놈일 수 있다. 이 경우 바이러스 DNA 복제 (rep), 캡시드화(cap)/포장 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 Cis-작용 서열이 AAV ITR 내에 함유된다. Rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈의 복제에 기여하는 다중 효소 특성을 가지고 있다. cap유전자는 p40 프로모터로부터 발현되고 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3을 암호화한다. 한편, AAV 벡터를 생성하기 위하여, rep 및 cap 단백질은 트랜스로 제공될 수 있다.

AAV는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 배큘로 바이러스 패키징 시스템과 같은 바이러스 패키징 시스템을 사용하여 포장될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 패키징은 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드 및 세포주를 사용함으로써 이루어진다. 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드는 유전자 물질의 세포 안으로의 전달을 용이하게 하는 요소 및 서열(E4, E2a, VA 등)을 포함한다.

헬퍼 플라스미드는 예를 들어, 복제 불능 AAV를 패키징하기 위해 필요한, 그리고 복제 불능 AAV를 생성하지 않으면서 고역가로 복제 불능 AAV를 포장할 수 있는 비리온 단백질을 생성하기 위한 모든 비리온 단백질을 트랜스로 암호화하는 복제 불능 바이러스 게놈으로부터 유래된 적어도 하나의 헬퍼 DNA 서열을 포함할 수 있다.

패키징 과정에서, AAV 바이러스 단백질을 암호화하는 헬퍼 플라스미드 및 플라스미드는 고역가 재조합 레트로바이러스-함유 상층액을 생성하기 위하여 바이러스를 생성할 수 있는 포유류 세포, 예컨대 인간 배아 신장 세포, 예를 들어 293 세포 (ATCC No. CRL1573, ATCC, Rockville, Md.)에 일시적으로 공동트랜스펙션된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터"는 코딩 서열, 예컨대 유전자의 발현을 조절하는 임의의 서열을 나타낸다. 프로모터는 예를 들어, 구성성, 유도성, 억제성, 또는 조직 특이적일 수 있다. "프로모터"는 전사의 개시 및 속도를 제어하는 역할을 수행하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 영역이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 프로모터로는 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (선택적으로 RSV 인핸서 포함), 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 다이하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, U6 프로모터, 또는 EF-1alpha 프로모터가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터 또는 EF-1alpha 프로모터이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 AAV (Adeno-associated virus) 벡터를 제공한다:

(a) CMV 프로모터 서열 또는 EF-1alpha 프로모터 서열: 및

(b) 상기 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된, 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열.

본 명세서에서 용어 "핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 상기 간세포 성장인자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 간세포 성장인자 또는 이의 이형체를 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.

이는 뉴클레오타이드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 간세포 성장인자를 구성하는 아미노산 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성(예컨대 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 69%), 보다 구체적으로는 70% 이상의 상동성(예컨대 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%), 보다 더 구체적으로는 80% 이상의 상동성(예컨대 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%), 보다 더욱더 구체적으로는 90% 이상의 상동성(예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%), 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성(예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)을 나타내는 서열을 의미한다. 상기 60% 이상 100% 이하의 모든 정수 및 이 사이에 존재하는 소수는 % 상동성과 관련하여 본 발명의 범위 내에 포함된다.

서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 ncbi 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 ncbi 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 AAV 벡터는 상술한 간세포 성장인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 대신, 다른 기능을 가진 임의의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 간세포 성장인자는 간세포 성장인자 이형체(HGF isoform)이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "HGF의 이형체(isoform)"는 모든 대립 유전자 변형체들(variants)을 포함하는, 동물에서 자연적으로 생성되는(naturally occurring) HGF 아미노산 서열과 적어도 80％ 동일한 아미노산 서열을 갖는 HGF 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, HGF 이형체는 HGF의 정상형(normal form) 또는 야생형(wild type), 그리고 HGF의 다양한 변이체(예컨대, 스플라이싱 변이체 및 결손 변이체)를 모두 포괄하는 의미를 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 간세포 성장인자 이형체는 전장 간세포 성장인자(full-length HGF, flHGF), 결손된 변이형 간세포 성장인자(deleted variant HGF, dHGF), 또는 이들의 조합이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 용어 "flHGF"는 동물 HGF의 아미노산 1-728 서열, 일 구현예에 따르면 포유동물 HGF의 아미노산 1-728 서열, 다른 구현예에 따르면 인간 HGF의 아미노산 1-728 서열을 의미한다.

상기 용어 "dHGF"는 동물 HGF 유전자, 일 구현예에 따르면 포유동물 HGF 유전자의 선택적 스플라이싱에 의해 생성되는 HGF 단백질의 결손된 변형체를 의미한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 dHGF는 전장 HGF 서열로부터 알파 사슬의 첫 번째 크링글 도메인에서 5 개의 아미노산(F, L, P, S 및 S)이 결손된 723개의 아미노산으로 이루어지는 인간 HGF이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, HGF의 이형체는 둘 이상의 서로 다른 종류의 이형체, 예컨대 flHGF 및 dHGF를 동시에 발현하는 하이브리드(hybrid) HGF 유전자에 의해 암호화될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 하이브리드 HGF 유전자는 인간 HGF 유전자의 엑손 1 내지 4에 해당하는 서열; 인간 HGF 유전자의 인트론 4 또는 그의 단편 서열; 및 인간 HGF 유전자의 엑손 5 내지 18에 해당하는 서열을 포함한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 전장 간세포 성장인자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 결손된 변이형 간세포 성장인자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 인트론 4를 포함하는 하이브리드 HGF 유전자는 7113 bp 길이이며, 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 하이브리드 HGF 유전자는 선택적으로 HGF cDNA의 엑손 4와 5 사이에 인트론 4의 단편을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 AAV 벡터에 삽입되는 유전자의 폴리뉴클레오타이드 서열은, 폴리뉴클레오타이드 서열이 인코딩하는 폴리펩타이드의 안정적인 발현을 위하여 변형될 수 있다. 상기 변형은 예컨대, 삽입되는 유전자의 전체 인트론 서열 대신, 인트론 서열의 일부만을 포함하도록 변형하여 삽입되는 폴리뉴클레오타이드 서열의 길이를 단축시키는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 하이브리드 HGF 유전자는 서열번호 4 내지 서열번호 9, 또는 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 하이브리드 HGF 유전자는 서열번호 5 내지 서열번호 9, 또는 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 서열번호 5 내지 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 4로 표시되는 HGF-X7의 뉴클레오타이드 서열에서 HGF 유전자의 인트론 4 서열의 일부만을 포함하도록 하여 뉴클레오타이드 서열의 길이를 단축시킨 HGF-X7-d1 내지 HGF-X7-d4 유전자를 나타낸다.

본 발명의 "HGF 이형체", "하이브리드 HGF 유전자"(예컨대, HGF-X7)에 관하여서는 WO 2003/078568에 보고된 바 있으며, 상기 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 간세포 성장인자 또는 이의 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화된 것이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 간세포 성장인자 또는 이의 이형체를 인코딩하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 간세포 성장인자 또는 이의 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4 내지 서열번호 9, 또는 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 AAV 벡터는 혈청형(serotype) AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV-DJ. AAV-DJ/8, AAV-PHP.Eb, AAV-PHP.S, 또는 AAV rh10이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 AAV1 또는 AAV9이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 CMV 프로모터 서열은 서열번호 10 또는 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 상기 서열번호 10 또는 11의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 CMV 프로모터 서열은 CMV 프로모터 전체 서열의 단편을 포함하는 것일 수 있다. 상기 단편은 CMV 프로모터 서열의 기능적 최소 서열을 포함한다. 예컨대, 상기 CMV 프로모터 서열은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고, 상기 단편을 기준으로 5'-말단 부위 또는 3'-말단 부위의 CMV 프로모터 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 EF-1 alpha 프로모터 서열은 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 상기 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 분자는 전사 후 조절요소(posttranscriptional regulatory element, PRE)을 추가적으로 포함한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 전사 후 조절요소는 우드 척 간염 바이러스 전사 후 조절요소(Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element, WPRE)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 분자는 폴리아데닐화 서열(polyadenylation sequence)을 추가적으로 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리아데닐화서열은 인간 성장호르몬(human growth hormone, hGH) 폴리아데닐화 서열, 소 성장호르몬(bovine growth hormone, bGH) 폴리아데닐화 서열, SV40 폴리아데닐화 서열, 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 인간 성장호르몬(human growth hormone, hGH) 폴리아데닐화 서열은 서열번호 13 또는 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 상기 서열번호 13 또는 14의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 인간 성장호르몬(human growth hormone, hGH) 폴리아데닐화 서열은 hGH 전체 서열의 단편을 포함하는 것일 수 있다. 상기 단편은 hGH 폴리아데닐화 서열의 기능적 최소 서열을 포함한다. 예컨대, 상기 hGH 폴리아데닐화 서열은 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고, 상기 단편을 기준으로 5'-말단 부위 또는 3'-말단 부위의 hGH 폴리아데닐화 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 소 성장호르몬(bovine growth hormone, bGH) 폴리아데닐화 서열은 서열번호 15 또는 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 상기 서열번호 15 또는 16의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 소 성장호르몬(bovine growth hormone, bGH) 폴리아데닐화 서열은 전체 bGH 폴리아데닐화 서열의 단편을 포함하는 것일 수 있다. 상기 단편은 bGH 폴리아데닐화 서열의 기능적 최소 서열을 포함한다. 예컨대, 상기 bGH 폴리아데닐화 서열은 서열번호 15의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고, 상기 단편을 기준으로 5'-말단 부위 또는 3'-말단 부위의 bGH 폴리아데닐화 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, SV40 폴리아데닐화 서열은 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 상기 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 SV40 폴리아데닐화 서열은 전체 SV40 폴리아데닐화 서열의 단편을 포함하는 것일 수 있다. 상기 단편은 SV40 폴리아데닐화 서열의 기능적 최소 서열을 포함한다. 예컨대, 상기 SV40 폴리아데닐화 서열은 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고, 상기 단편을 기준으로 5'-말단 부위 또는 3'-말단 부위의 SV40 폴리아데닐화 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 핵산 서열 양 측면에 2개의 AAV ITR(inverted terminal repeat)를 포함한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 AAV 벡터를 포함하는, 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 AAV 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 "형질전환된", "형질도입된" 또는 "형질감염된”은 외인성 핵산이 숙주세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질전환된”, "형질도입된" 또는 "형질감염된" 세포는 외인성 핵산으로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 세포이며, 상기 세포는 당해 세포 및 그의 계대 배양으로 인한 자손 세포를 포함한다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명에서 숙주세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 AAV 바이러스 입자 제작에 필요한 단백질을 발현할 수 있으며, 발현된 단백질의 작용 및 이들의 조립에 의해 AAV 바이러스 입자를 얻게 된다.

상기 배양은 통상적으로 진탕 배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 10 내지 40℃의 범위에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5 시간 내지 7 일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지 및 발현을 위해 암피실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 경우 필요하다면 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 AAV 벡터를 포함하는 AAV 입자를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 AAV 입자는 척수강내 투여용이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 AAV 입자는 척수강내 투여시 형질전환된 관심 유전자(gene of interest, GOI)를 단백질로 발현시키는 효과가 우수하다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 AAV 입자를 포함하는 근위축성측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 또는 당뇨병성 신경병증(diabetic peripheral neuropathy, DPN) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 당뇨병성 신경병증은 다발성 말초신경병증(polyneuropathy) 또는 국소성 말초신경병증(focal neuropathy)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 AAV 벡터 또는 AAV 입자를 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 투여, 척수강내 투여, 척수내 투여, 뇌내 투여, 뇌실내 투여, 뇌실질 내 투여, 두개강내 투여, 피하 투여, 근육 투여, 복강 투여, 흉골내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 AAV 바이러스 입자를 기준으로 1x10⁹ - 1x10¹² vg/kg이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 명세서에서 용어 “예방”은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 질환상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 척수강 내 투여에 최적화 된 간세포 성장인자 유전자가 도입된 AAV 벡터, AAV 입자, 및 이를 포함하는 근위축성측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 또는 당뇨병성 신경병증(diabetic peripheral neuropathy, DPN) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 AAV 벡터 및 AAV 입자는 간세포 성장인자 유전자를 포함하는 AAV 입자의 생산성이 우수하고, 이를 포유동물의 척수강 내 투여시 간세포 성장인자의 발현 효율 또한 매우 우수하다. 따라서 척수강 내 투여에 본 발명의 AAV 벡터 및 입자를 이용하는 경우, 간세포 성장인자 단백질의 발현을 유도함으로써 관련된 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 표 1에 나타낸 AAV 벡터 후보군의 구성을 프로모터, GOI, 및 폴리아데닐화 서열의 종류에 따라 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 표 1의 AAV 벡터 후보군의 구성에 따른 hHGF 발현량을 비교하여 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 표 1의 AAV 벡터 후보군의 구성에 따라 제조되는 AAV 입자의 생산성을 비교하여 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 표 2의 AAV 벡터 후보군의 구성에 따라 AAV 입자를 제작하고, 이를 마우스의 척수강 내에 투여한 후의 hHGF 발현량을 비교하여 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1: 후보군 플라스미드 제작 및 발현 효율 비교 ( in vitro )

본 발명자들은 서로 다른 프로모터와 poly A tail을 포함하는 6종의 플라스미드를 아래와 같이 cloning을 통해 제작하였다.

(1) ITR(L)과 ITR(R)을 포함하는 backbone 서열(서열번호 20)을 합성을 통해 확보하였다.

(2) Promoter로 CMV promoter(서열번호 11) 및 EF-1alpha S 계열의 프로모터(서열번호 12)를 각각 MluI과 ClaI 제한효소 서열을 포함하게끔 합성하여 backbone에 삽입하였다.

(3) 서열번호 8의 HGF-X7-d4 서열은 ClaI과 SalI 제한효소 서열을 이용하여 삽입하였다.

(4) Poly(A) 후보서열인 hGH poly A(서열번호 14), bGH poly A(서열번호 16), 그리고 SV40 poly A(서열번호 18)는 각각 SalI과 RsrII 제한효소 서열을 포함하게끔 합성하여 backbone에 삽입하였다.

6종의 플라스미드의 구성을 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다. 양성 대조군으로는 VM202(pCK-HGF-X7)를 사용하였다.

연번	Promoter	Expressed gene	Poly A
1	CMV (1160 bp)	HGFX7d4 (2879 bp)	hGH pA (542 bp)
2	CMV (1160 bp)	HGFX7d4 (2879 bp)	bGH pA (317 bp)
3	CMV (1160 bp)	HGFX7d4 (2879 bp)	SV40 pA (185 bp)
4	EF-1alpha S (784 bp)	HGFX7d4 (2879 bp)	hGH pA (542 bp)
5	EF-1alpha S (784 bp)	HGFX7d4 (2879 bp)	bGH pA (317 bp)
6	EF-1alpha S (784 bp)	HGFX7d4 (2879 bp)	SV40 pA (185 bp)

도 1은 본 발명의 표 1에 나타낸 AAV 벡터 후보군의 구성을 프로모터, GOI, 및 폴리아데닐화 서열의 종류에 따라 나타낸 모식도이다.

HEK293세포는 DMEM + 10% FBS 배지로 컬쳐 하였다. Transfection을 진행하기 하루전에 6-well plate에 1x10⁵ cells/well로 seeding 하였다. 다음날, NC (negative control), VM202 (positive control), #1-6의 플라스미드를 0.5 ug씩 각각 첨가하고 PEI를 사용하여 transfection을 진행하였다. 72시간 후 상층액을 수집하여 human HGF ELISA (R&D, DHG00)를 진행하였다.

결과는 도 2에 나타내었다.

도 2는 본 발명의 표 1의 AAV 벡터 후보군의 구성에 따른 hHGF 발현량을 비교하여 나타낸 도이다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군인 VM202에서 hHGF가 잘 발현됨을 우선 확인하였다. CMV계열 promoter를 장착하고 있는 플라스미드 1 내지 3은 상대적으로 높은 수준의 hHGF를 발현하였으며, SV40 polyA를 포함하고 있는 3번 플라스미드는 1번 또는 2번 보다 낮은 수준으로 hHGF를 발현하였다. EF1alpha S계열의 promoter를 포함하고 있는 4~6번 plasmid는 상대적으로 현저히 낮은 hHGF 발현율을 나타내었다.

실시예 2: 후보군 플라스미드의 AAV 생산성 비교 ( in vitro )

본 발명자들은 상기 실시예 1의 6종의 플라스미드를 이용하여 AAV 벡터를 제작하였다. 먼저 HEK293 세포를 T225 flask에 seeding하고 3개의 플라스미드(pAAV-RC, pAAV-helper, 및 pAAV-HGF)를 PEI를 이용하여 공동 트랜스펙션(co-transfection)하였다. 72시간 후에 세포들을 수집하여 AAV 정제를 진행하였고, 이후에 AAV 에 대한 역가측정(titration)을 진행하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3은 본 발명의 표 1의 AAV 벡터 후보군의 구성에 따라 제조되는 AAV 입자의 생산성을 비교하여 나타낸 도이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, CMV 계열 promoter를 포함하고 있는 plasmid 1번과 3번은 제일 낮은 수준의 AAV 생산성을 나타내었고, 그 중에서 bGH polyA를 가지고 있는 2번 plasmid가 CMV 계열의 프로모터를 포함하는 군 중에서는 가장 우수한 AAV 생산성을 나타냈다.

반면 EF1 alpha 계열의 promoter를 포함하고 있는 4~6번 plasmid는 CMV 계열 프로모터를 포함하는 plasmid에 비해 상대적으로 높은 수준의 AAV 생산성을 보였으며, 특히 5번 plasmid는 1번 후보군에 비해 20배가 향상된 AAV 생산량을 보였다.

실시예 3: 후보군 플라스미드의 hHGF 발현률 비교 ( in vivo )

본 발명자들은 이전의 실시예에서 제작된 플라스미드 1번, 4번, 및 5번과, 5번 플라스미드에서 발현 유전자를 코돈 최적화를 한 HGFX7d4로 치환한 플라스미드 11번을 이용하여 AAV1 또는 AAV9을 생산하고 이를 마우스에 투여하여 in vivo 조건에서의 hHGF 단백질(flHGF)의 발현량을 비교하였다.

그룹	AAV	Promoter	Expressed gene	Poly A
Sham	-	-	-	-
AAV1_#1	AAV1	CMV (1160 bp)	HGFX7d4 (2879 bp)	hGH pA (542 bp)
AAV9_#1	AAV9	CMV (1160 bp)	HGFX7d4 (2879 bp)	hGH pA (542 bp)
AAV1_#4	AAV1	EF-1alpha S (784 bp)	HGFX7d4 (2879 bp)	hGH pA (542 bp)
AAV1_#5	AAV1	EF-1alpha S (784 bp)	HGFX7d4 (2879 bp)	bGH pA (317 bp)
AAV1_#11_codon_opti	AAV1	EF-1alpha S (784 bp)	HGFX7d4 codon opti (2879 bp)	bGH pA (317 bp)
AAV9_#11_codon_opti	AAV9	EF-1alpha S (784 bp)	HGFX7d4 codon opti (2879 bp)	bGH pA (317 bp)

상기 표 2의 조건의 AAV (1x10¹⁰ vg/head)를 C57BL/6 마우스에 intrathecal 경로로 투여하고, 7일 뒤 lumbar spinal cord 및 DRG 부위를 채취하였다. 채취한 조직 샘플은 RIPA buffer를 이용하여 단백질을 추출하였으며, 총 단백질양은 BCA Protein Assay kit (Thermo, Cat# 23225)를 이용하여 정량 하였다. 그 다음으로는, Human HGF Quantikine ELISA kit (R&D, DHG00)을 이용하여 hHGF 단백질의 발현량을 비교하였다. Spinal cord 및 DRG의 lysate를 well당 50uL씩 넣고 항체와 반응할 수 있도록 잘 섞어주었다. ELISA kit에 있는 Human HGF standard로 standard curve 그렸고, 이 curve를 이용하여 최종 샘플의 HGF양을 도출할 수 있었다. 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4는 본 발명의 표 2의 AAV 벡터 후보군의 구성에 따라 AAV 입자를 제작하고, 이를 마우스의 척수강 내에 투여한 후의 hHGF 발현량을 비교하여 나타낸 도이다.

상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 예상과는 다르게 CMV promoter 계열의 AAV 보다는 EF1 alpha 계열의 promoter를 가진 AAV가 전체적으로 높은 양의 hHGF를 발현하였다. 이는 in vitro 결과와는 상반된 결과라는 점에서 의미가 있다. 특히, EF1 alpha promoter에 HGF-X7-d4 codon optimized된 후보군이 눈에 띄게 높은 양의 hHGF를 발현하였다. 정량적 비교를 한 결과, AAV_#1에 비해서 AAV_#11_codon_opti가 spinal cord에서 약 16배, 그리고 DRG에서 약 5배 높은 수준의 발현량을 보였다.

상기 시험 결과를 바탕으로 AAV 생산성이 높고 in vivo hHGF 발현양이 높은 #11번이 최종 후보군으로 선정되었다.

<110> Helixmith Co., Ltd <120> AAV vector introduced with hepatocyte growth factor gene optimized for intrathecal administration <130> PN200443 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 728 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Full-length HGF <400> 1 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 1 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr 165 170 175 Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser 180 185 190 Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu 195 200 205 Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp 210 215 220 His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro 225 230 235 240 His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp 245 250 255 Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr 260 265 270 Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys 275 280 285 Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu 290 295 300 Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile 305 310 315 320 Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu 325 330 335 His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn 340 345 350 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr 355 360 365 Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp 370 375 380 Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met 385 390 395 400 Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp 405 410 415 Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala 420 425 430 Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His 435 440 445 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys 450 455 460 Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu 465 470 475 480 Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val 485 490 495 Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg 500 505 510 Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp 515 520 525 Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 530 535 540 Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys 545 550 555 560 Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly 565 570 575 Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp 580 585 590 Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu 595 600 605 Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn 610 615 620 Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu 625 630 635 640 Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu 645 650 655 Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp 660 665 670 Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu 675 680 685 Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly 690 695 700 Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile 705 710 715 720 Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 725 <210> 2 <211> 723 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Deleted variant HGF <400> 2 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 1 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg 165 170 175 Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg 180 185 190 Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr 195 200 205 Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly 210 215 220 Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe 225 230 235 240 Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg 245 250 255 Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His 260 265 270 Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met 275 280 285 Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln 290 295 300 Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro 305 310 315 320 Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro 325 330 335 Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 340 345 350 Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg 355 360 365 Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln 370 375 380 Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln 385 390 395 400 Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp 405 410 415 Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu 420 425 430 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr 435 440 445 Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp 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gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac 2400 tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg 2460 aattccatgt cagcgttggg attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa 2520 tttcaagtgc aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc 2580 ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg 2640 tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt 2700 atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca 2760 tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc 2820 agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta 2880 ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc 2940 cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac 3000 aaacatagga tggatggtta gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt 3060 gataaaggag agttgggttc ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga 3120 ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca 3180 ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF-X7-d4-codon optimized <400> 9 atgtgggtca ccaagctgct tcctgctctg ctgctccagc acgtgctgct gcacctgctg 60 ctgctgccta tcgccatccc ctacgccgag ggccagagaa agcggagaaa cacaatccac 120 gagttcaaga aaagcgccaa gacgaccctg atcaagatcg accccgccct gaagatcaag 180 accaagaagg tgaacaccgc cgaccagtgc gccaaccggt gcaccagaaa caagggcctg 240 cctttcacct gtaaagcctt cgtgttcgac aaggccagaa agcagtgtct gtggttcccc 300 ttcaacagca tgagcagcgg cgtgaagaag gaattcggcc acgagtttga tctgtacgag 360 aacaaggact acatcagaaa ttgcatcatc ggcaagggca gaagctacaa gggtacagtg 420 tccatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480 aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540 tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600 tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660 tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720 tatttgtgga tccttataag aaaagcaata aacaaacaag taatgatctc aaataagtaa 780 tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt tctcagttct gtcctaagtg 840 gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga aattatgttt cagacaactt 900 cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg ctcatctttc taacttgatg 960 gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt caaacgtttt aaggacagat 1020 ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata taagataaag gatttttcta 1080 ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata ggcgaaaaaa agttgcatgc 1140 tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt gccttcgagc tatcggggta 1200 aagacttgca ggagaactat tgccggaacc ccagaggcga ggaaggcggc ccctggtgct 1260 tcaccagcaa ccccgaggtg agatacgagg tgtgcgacat cccccagtgc agcgaggtcg 1320 agtgcatgac gtgcaacggc gagagctacc ggggcctgat ggaccatacc gagtctggga 1380 agatctgcca gagatgggac caccagacac ctcaccggca caagttcctg ccagaaagat 1440 atcctgacaa gggcttcgac gataactact gcagaaaccc tgacggccaa cctagacctt 1500 ggtgttacac gctggacccc cacaccagat gggaatactg tgctattaag acatgtgccg 1560 acaataccat gaacgacaca gacgtgcctc tcgagacaac agaatgcatc cagggccagg 1620 gagaaggata tagaggtaca gtgaacacca tctggaacgg aattccatgt cagcggtggg 1680 acagccaata cccccacgag cacgatatga cccctgagaa cttcaagtgt aaagacctgc 1740 gggaaaacta ttgcagaaac ccagatggct ctgaatctcc ttggtgcttc acaaccgacc 1800 ctaatatcag agtgggctac tgcagccaga tccccaattg cgacatgagc cacggacagg 1860 actgctacag gggcaatggc aagaactaca tgggaaacct gagccagacc agaagcggcc 1920 tgacctgcag catgtgggat aagaacatgg aagatctgca cagacacatc ttctgggagc 1980 ctgatgcttc taagctgaat gagaactact gccggaaccc tgatgatgat gcccacggcc 2040 cctggtgcta cactggcaac cccctgatcc catgggacta ctgtcctatc agcagatgtg 2100 aaggcgacac cacacctacc atagttaacc tggaccaccc cgtgatcagt tgcgccaaga 2160 ccaagcagct gagagtggtg aacggcatcc ctacaagaac caacatcgga tggatggtgt 2220 ccctgagata cagaaacaag cacatctgcg gcggcagcct gatcaaggaa agctgggtcc 2280 tcaccgccag acagtgtttt cctagccggg acctgaagga ctacgaggcc tggctgggca 2340 tccacgacgt gcacggcaga ggcgacgaga agtgcaagca ggtgcttaac gtgtcccaac 2400 tggtgtacgg ccccgagggc agtgatctgg tgctgatgaa actggccaga cccgccgtgc 2460 tcgacgactt cgtgtctaca atcgacctgc ctaactacgg ctgtaccatc cccgagaaga 2520 ccagctgcag cgtgtacggc tggggctata caggcctcat taactacgac ggactgctga 2580 gagtggctca cctgtacatc atgggcaacg agaaatgctc ccagcaccac agaggcaagg 2640 tgaccctgaa cgagagcgag atctgtgcag gcgccgagaa gatcggcagc ggcccttgcg 2700 agggcgatta cggaggacct ctggtctgcg agcagcacaa gatgcggatg gtcctgggag 2760 tgatcgttcc tggcagagga tgtgccatcc ctaacagacc aggaatcttt gtgcgggtgg 2820 cctactacgc caagtggatc cacaaaatca tcctgaccta caaggtgcca cagtcttga 2879 <210> 10 <211> 1070 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV promoter <400> 10 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300 catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420 ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480 acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg 540 ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc tccgcggatt 600 cgaatcccgg ccgggaacgg tgcattggaa cgcggattcc ccgtgccaag agtgacgtaa 660 gtaccgccta tagagtctat aggcccacaa aaaatgcttt cttcttttaa tatacttttt 720 tgtttatctt atttctaata ctttccctaa tctctttctt tcagggcaat aatgatacaa 780 tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag aataacagtg ataatttctg ggttaaggca 840 atagcaatat ttctgcatat aaatatttct gcatataaat tgtaactgat gtaagaggtt 900 tcatattgct aatagcagct acaatccagc taccattctg cttttatttt atggttggga 960 taaggctgga ttattctgag tccaagctag gcccttttgc taatcatgtt catacctctt 1020 atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca 1070 <210> 11 <211> 1160 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV promoter <400> 11 ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 60 gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 120 tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 180 aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 240 caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 300 acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 360 ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 420 gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 480 gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg 540 tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac 600 gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggat 660 tcgaatcccg gccgggaacg gtgcattgga acgcggattc cccgtgccaa gagtgacgta 720 agtaccgcct atagagtcta taggcccaca aaaaatgctt tcttctttta atatactttt 780 ttgtttatct tatttctaat actttcccta atctctttct ttcagggcaa taatgataca 840 atgtatcatg cctctttgca ccattctaaa gaataacagt gataatttct gggttaaggc 900 aatagcaata tttctgcata taaatatttc tgcatataaa ttgtaactga tgtaagaggt 960 ttcatattgc taatagcagc tacaatccag ctaccattct gcttttattt tatggttggg 1020 ataaggctgg attattctga gtccaagcta ggcccttttg ctaatcatgt tcatacctct 1080 tatcttcctc ccacagctcc tgggcaacgt gctggtctgt gtgctggccc atcactttgg 1140 caaagaattg ggattcgaac 1160 <210> 12 <211> 784 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF-1alpha promoter <400> 12 ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg 60 tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc 120 gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt 180 tcccgcgggc ggcgacgggg cccgtgcgtc ccagcgcaca tgttcggcga ggcggggcct 240 gcgagcgcgg ccaccgagaa tcggacgggg gtagtctcaa gctggccggc ctgctctggt 300 gcctggcctc gcgccgccgt gtatcgcccc gccctgggcg gcaaggctgg cccggtcggc 360 accagttgcg tgagcggaaa gatggccgct tcccggccct gctgcaggga gctcaaaatg 420 gaggacgcgg cgctcgggag agcgggcggg tgagtcaccc acacaaagga aaagggcctt 480 tccgtcctca gccgtcgctt catgtgactc cacggagtac cgggcgccgt ccaggcacct 540 cgattagttc tcgagctttt ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg ggttttatgc 600 gatggagttt ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat 660 gtaattctcc ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca 720 gacagtggtt caaagtttgt tccttccatt tcaggtgtcg tgaaaactac ccctaaaagc 780 caaa 784 <210> 13 <211> 477 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGH pA <400> 13 gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 60 gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 120 ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca 180 acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg 240 ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg 300 ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg 360 ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct 420 tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtcctt 477 <210> 14 <211> 542 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGH pA <400> 14 ctgcagaagc ttgcctcgag cagcgctgct cgagagatct acgggtggca tccctgtgac 60 ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc cagtgcccac cagccttgtc 120 ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt ccttctataa tattatgggg 180 tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga caacctgtag ggcctgcggg 240 gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt ggctcactgc aatctccgcc 300 tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt tgttgggatt ccaggcatgc 360 atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac ggggtttcac catattggcc 420 aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac cttggcctcc caaattgctg 480 ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtccttc tgattttgta ggtaaccacg 540 tg 542 <210> 15 <211> 208 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bGH pA <400> 15 ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60 tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120 tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180 gggaagacaa tagcaggcat gctgggga 208 <210> 16 <211> 317 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bGH pA <400> 16 ctgcagaagc ttgcctcgag cagcgctcga gagagatctc tcgagtctag agggcccgtt 60 taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc 120 tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat 180 gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg 240 caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga gtcgctgatt 300 ttgtaggtaa ccacgtg 317 <210> 17 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40 pA <400> 17 aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60 aataaagc 68 <210> 18 <211> 185 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40 pA <400> 18 ctgcagaagc ttgcctcgag cagcgctgct cgagagatct aacttgttta ttgcagctta 60 taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact 120 gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tactgatttt gtaggtaacc 180 acgtg 185 <210> 19 <211> 2730 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF-X8 <400> 19 atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60 ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120 gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180 accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240 ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300 ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360 aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420 tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480 aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540 tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600 tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660 tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720 tatttgtgga tccttatgtt tcagacaact tcgattcagt tctagaatgt ttgactcagc 780 aaattcacag gctcatcttt ctaacttgat ggtgaatatg gaaattcagc taaatggatg 840 ttaataaaat tcaaacgttt taaggacaga tggaaatgac agaattttaa ggtaaaatat 900 atgaaggaat ataagataaa ggatttttct accttcagca aaaacatacc cactaattag 960 taaaattaat aggcgaaaaa aagttgcatg ctcttatact gtaatgatta tcattttaaa 1020 actagctttt tgccttcgag ctatcggggt aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat 1080 cctcgagggg aagaaggggg accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa 1140 gtctgtgaca ttcctcagtg ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg ggagagttat 1200 cgaggtctca tggatcatac agaatcaggc aagatttgtc agcgctggga tcatcagaca 1260 ccacaccggc acaaattctt gcctgaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat 1320 tgccgcaatc ccgatggcca gccgaggcca tggtgctata ctcttgaccc tcacacccgc 1380 tgggagtact gtgcaattaa aacatgcgct gacaatacta tgaatgacac tgatgttcct 1440 ttggaaacaa ctgaatgcat ccaaggtcaa ggagaaggct acaggggcac tgtcaatacc 1500 atttggaatg gaattccatg tcagcgttgg gattctcagt atcctcacga gcatgacatg 1560 actcctgaaa atttcaagtg caaggaccta cgagaaaatt actgccgaaa tccagatggg 1620 tctgaatcac cctggtgttt taccactgat ccaaacatcc gagttggcta ctgctcccaa 1680 attccaaact gtgatatgtc acatggacaa gattgttatc gtgggaatgg caaaaattat 1740 atgggcaact tatcccaaac aagatctgga ctaacatgtt caatgtggga caagaacatg 1800 gaagacttac atcgtcatat cttctgggaa ccagatgcaa gtaagctgaa tgagaattac 1860 tgccgaaatc cagatgatga tgctcatgga ccctggtgct acacgggaaa tccactcatt 1920 ccttgggatt attgccctat ttctcgttgt gaaggtgata ccacacctac aatagtcaat 1980 ttagaccatc ccgtaatatc ttgtgccaaa acgaaacaat tgcgagttgt aaatgggatt 2040 ccaacacgaa caaacatagg atggatggtt agtttgagat acagaaataa acatatctgc 2100 ggaggatcat tgataaagga gagttgggtt cttactgcac gacagtgttt cccttctcga 2160 gacttgaaag attatgaagc ttggcttgga attcatgatg tccacggaag aggagatgag 2220 aaatgcaaac aggttctcaa tgtttcccag ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg 2280 gttttaatga agcttgccag gcctgctgtc ctggatgatt ttgttagtac gattgattta 2340 cctaattatg gatgcacaat tcctgaaaag accagttgca gtgtttatgg ctggggctac 2400 actggattga tcaactatga tggcctatta cgagtggcac atctctatat aatgggaaat 2460 gagaaatgca gccagcatca tcgagggaag gtgactctga atgagtctga aatatgtgct 2520 ggggctgaaa agattggatc aggaccatgt gagggggatt atggtggccc acttgtttgt 2580 gagcaacata aaatgagaat ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatt 2640 ccaaatcgtc ctggtatttt tgtccgagta gcatattatg caaaatggat acacaaaatt 2700 attttaacat ataaggtacc acagtcatag 2730 <210> 20 <211> 2910 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backbone <400> 20 cggaccgagc ggccgcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct 60 cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg 120 gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc 180 cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct 240 gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 300 ccagcgcctt agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 360 gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 420 ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 480 gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 540 tccaaactgg aacaacactc aactctatct cgggctattc ttttgattta taagggattt 600 tgccgatttc ggtctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 660 ttaacaaaat attaacgttt acaattttat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 720 ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt 780 gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc 840 agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat 900 ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg 960 gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 1020 tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta 1080 ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg 1140 ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg 1200 gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac 1260 gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg 1320 acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 1380 actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg 1440 ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac 1500 cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt 1560 gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag 1620 caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc 1680 aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc 1740 ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta 1800 tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg 1860 ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 1920 ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 1980 ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 2040 tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 2100 cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 2160 taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 2220 gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc 2280 acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 2340 ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 2400 ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 2460 cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 2520 aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 2580 gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 2640 gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 2700 gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgtcctgca 2760 ggcagctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc 2820 ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt 2880 tcctgcggcc gcacgcgtat cgatgtcgac 2910

Claims (18)

1. 다음을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 AAV (Adeno-associated virus) 벡터:
   (a) CMV 프로모터 서열 또는 EF-1alpha 프로모터 서열: 및
   (b) 상기 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된, 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열.
2. 제1항에 있어서, 상기 간세포 성장인자는 간세포 성장인자 이형체(HGF isoform)인, AAV 벡터.
3. 제2항에 있어서, 상기 간세포 성장인자 이형체는 전장 간세포 성장인자(full-length HGF, flHGF), 결손된 변이형 간세포 성장인자(deleted variant HGF, dHGF), 또는 이들의 조합인, AAV 벡터.
4. 제3항에 있어서, 상기 전장 간세포 성장인자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 결손된 변이형 간세포 성장인자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, AAV 벡터.
5. 제1항에 있어서, 상기 간세포 성장인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4 내지 서열번호 9 또는 19의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 동일한 것인, AAV 벡터.
6. 제1항에 있어서, 상기 간세포 성장인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 8 또는 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, AAV 벡터.
7. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 혈청형(serotype) AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV-DJ. AAV-DJ/8, AAV-PHP.Eb, AAV-PHP.S, 또는 AAV rh10인, AAV 벡터.
8. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 AAV1 또는 AAV9인, AAV 벡터.
9. 제1항에 있어서, 상기 CMV 프로모터 서열은 서열번호 10 또는 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, AAV 벡터.
10. 제1항에 있어서, 상기 EF-1alpha 프로모터 서열은 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, AAV 벡터.
11. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 폴리아데닐화 서열(polyadenylation sequence)을 추가적으로 포함하는 것인, AAV 벡터.
12. 제11항에 있어서, 상기 폴리아데닐화서열은 SV40 폴리아데닐화 서열, 인간 성장호르몬(hGH) 폴리아데닐화 서열, 보바인 성장호르몬(bGH) 폴리아데닐화 서열, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, AAV 벡터.
13. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 상기 핵산 서열 양 측면에 2개의 AAV ITR(inverted terminal repeat)를 포함하는 것인, AAV 벡터.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 AAV 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 AAV 벡터를 포함하는 AAV 입자.
16. 제15항에 있어서, 상기 AAV 입자는 척수강내 투여용인, AAV 입자.
17. 제15항의 AAV 입자를 포함하는 근위축성측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 또는 당뇨병성 신경병증(diabetic peripheral neuropathy, DPN) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
18. 제17항에 있어서, 상기 당뇨병성 신경병증은 다발성 말초신경병증(polyneuropathy) 또는 국소성 말초신경병증(focal neuropathy)인, 약제학적 조성물.