CN109055373B

CN109055373B - 一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法

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Publication number: CN109055373B
Application number: CN201810786497.2A
Authority: CN
Inventors: 李程; 严颖刚; 丁秋蓉
Original assignee: Hangzhou View Health Technology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou View Health Technology Co Ltd
Priority date: 2018-07-17
Filing date: 2018-07-17
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2038-07-17
Also published as: CN109055373A

Abstract

本公开提供了一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对待敲入的靶位点的经化学修饰的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、形成待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，通过PCR及测序并筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。通过上述技术方案，本发明建立了一种无需筛选标记，可显著提高大片段基因敲入干细胞效率的技术方案。

Description

一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法。

背景技术

CRISPR基因编辑技术通过在基因组特定位点进行精确的靶向性剪切，形成DNA双链缺口(Double-strand breaks，DSBs)。DSBs可激活细胞内非同源末端链接(Non-homologous end joining，NHEJ)和同源重组(Homologydirected repair，HDR)两种修复机制对DNA进行修复。在哺乳动物细胞中，NHEJ修复基因占主导模式，可引入碱基的随机插入或缺失，实现基因敲除。HDR则需要在外源基因模板存在的情况下，实现对基因组的精确修复。

人多能干细胞因其具有多能性可成为体外不同类型的成体细胞和器官小体的潜在来源，其快速增殖能力使其可为科研分析及大规模药物筛选提供充足原材料。基因编辑技术在人多能干细胞中的应用对实现疾病模拟和推动再生医学的发展具有重要意义，已成为再生医学领域研究的热点。但在多能干细胞中，通过Cas9蛋白剪切实现HDR精准编辑基因组的效率极低，在多能干细胞中提高基因敲入效率成为亟待解决的关键技术问题。2014年Gonzalez研究组报道发现，通过在Cas9人多能干细胞中同时转入gRNA和ssDNA模板，可实现在人多能干细胞单个碱基基因敲入的效率达到10％。同年，另一研究组报道，在用诺考达唑(nocodazale)药物处理细胞使细胞处于M期之后，将Cas9核糖蛋白与ssDNA转染至人胚胎干细胞(hESCs)，基因敲入效率可达1.6％。2017年有研究发现，在CRISPR/Cas9体系下，使用单链脱氧寡核苷酸(ssODNs)作为模板，对10bp以下基因片段进行敲入人iPSC细胞株的效率可达45％。但由于ssODNs的大小与基因编辑效率存在负相关，Cas9/ssODN技术难以实现基因片段长度超过90bp的基因敲入。2017年发明的iCRISPR体系，在hESCs中对小片段基因敲入效率可达30％，但应用于大片段敲入效率则显著下降，只有1％不到的HDR整合率。

另外，由于目前在多能干细胞中基因编辑效率低，通常需要通过筛选标记进行筛选来获得单克隆阳性细胞株，而筛选标记有可能会影响细胞功能，限制其在研究及临床上的应用。虽然通过piggyBac或Cre/loxP体系可以删除筛选标记，但Cre/loxP体系会将大片段的loxP序列滞留在基因组上，piggyBac体系则需要附近存在TTAA位点来防止其他外源序列的引入。

发明内容

本公开的目的是实现一种可显著提高大片段基因敲入干细胞效率的技术方案。

为了实现上述目的，本公开提供了一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对待敲入的靶位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、将插入有模板DNA的同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。

通过上述技术方案，本发明建立了一种可显著提高大片段基因敲入人干细胞效率的技术方案，并可在敲入报告基因的情况下进一步建立无需筛选标记的可用于检测不同干细胞株敲入大片段基因效率的方法，通过此方法可检测不同干细胞株中不同基因位点的基因敲入效率，从而选择最佳的科研及临床应用方案。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开提供了一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对待敲入的靶位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、将插入有模板DNA的同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。

其中，电转是指DNA的电转化，又称作高压电穿孔法(high-voltageelectroproration，简称电穿孔法electroproration)，可用于将DNA导入细胞。

本发明通过RNP复合物以电转的方式将sgRNA和Cas9蛋白转入细胞中，并在电转后的合适的时间内选择AAV病毒来将插入有模板DNA的载体转染入细胞中，最终使得sgRNA、Cas9蛋白和插入有模板DNA的载体共同通过CRISPR基因编辑来使得大片段的外源基因得以定向敲入靶点位置。

其中，可选地，所述sgRNA带有化学修饰基团；针对待编辑的靶位点的sgRNA和Cas9蛋白的用量摩尔比为1:1至1:5。其中，可以使用在线sgRNA设计工具(http://crispr.mit.edu/)依据待编辑的靶位点设计sgRNA的序列并加以合成。其中，sgRNA序列的5’端和3’端末尾的可以分别添加有甲基(-O-Me)化学修饰基团或磷硫酰(-phosphorothioate)化学修饰基团。

其中，可选地，将针对待编辑的靶位点的sgRNA和Cas9蛋白混合的时间为5-20分钟，温度为10-40℃。

其中，可选地，步骤S3中，所述干细胞的悬液与所述RNP复合物混合时，相对于每10⁶个所述干细胞，以sgRNA的量计，所述RNP复合物的用量为1-50μmol；所述干细胞的悬液中，细胞浓度为(1-5)×10⁷个/mL；以sgRNA的量计，所述RNP复合物的终浓度为0.1-1.5μmol/μL。

其中，可选地，步骤S3中，电转的条件包括：电场强度为50-250V/cm，单次脉冲时间为2-15ms，相邻两次脉冲之间的时间间隔为10-60s，总脉冲次数为2-10次。

其中，可选地，步骤S4中，在电转结束后5-20分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行8-24小时的转染，得到转染后的培养物。

其中，可选地，步骤S4中，待转染的AAV病毒颗粒的悬液的加入量使得待转染的AAV病毒颗粒的MOI值为10⁴-10⁶。MOI值是感染时病毒与细胞数量的比值。

其中，优选地，所述干细胞可以为胚胎干细胞、诱导多能干细胞和间充质干细胞中的至少一种；优选所述干细胞为人诱导多能干细胞1016细胞株。所述AAV病毒的血清型为AAV-6病毒、AAV-1病毒或AAV-DJ病毒，优选所述AAV病毒的血清型为AAV-DJ病毒，在该优选情况下，能够进一步增加大片段基因敲入干细胞的效率。

其中，所述模板DNA可以包括左同源臂序列、敲入片段和右同源臂序列；所述左同源臂序列和所述右同源臂序列共同决定了插入的精确位点，可以通过所述左同源臂序列和所述右同源臂序列来精确控制敲入片段插入的位点就是待敲入的靶位点。

优选地，所述敲入片段包括增强子、启动子、敲入基因和polyA。

根据本公开，所述敲入基因的长度可以为200-5000bp；相对于已有的定向敲入方法，在成功率相同的情况下，本公开的方法显著地提高了所述敲入基因的长度。

优选地，所述敲入基因为报告基因；在该优选情况下，可以无需筛选标记来检测不同干细胞株敲入大片段基因效率；进一步优选所述报告基因为荧光蛋白报告基因；所述荧光蛋白报告基因可以为EGFP报告基因。

其中，可选地，所述待敲入的靶位点的sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示；所述模板DNA的序列如SEQ ID NO.6所示；所述载体的骨架序列如SEQ ID NO.7所示。所述载体的骨架序列是指未插入模板DNA的载体的序列。

以下通过实施例进一步详细说明本发明：

实施例1

1、sgRNA设计以及合成

(1)通过在线sgRNA设计工具(http://crispr.mit.edu/)在HBB基因一号外显子上设计靶向识别的HBB sgRNA。

HBB sgRNA:5’-cuugccccacagggcaguaaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu-3’(SEQ ID NO.1)。

在HBB sgRNA中1-20位的序列为识别基序，其余的序列为tracrRNA。

(2)HBB sgRNA由Integrated DNA Technologies US合成并在HBBsgRNA序列的5’端和3’端末尾分别添加O-Me、phosphorothioate的修饰。

2、体外法检测sgRNA的活性

(1)从基因组扩增识别靶序列片段(2400bp)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

HBB-FW:5’-tagatgtccccagttaacctcctat-3’(SEQ ID NO.2)，

HBB-REV:5’-ttattaggcagaatccagatgctca-3’(SEQ ID NO.3)。

(2)将PCR扩增产物200ng，sgRNA 100ng，SpCas9 200ng(购于Sigma-Aldrich，货号：TGEN-CP-500UG)，10×缓冲液2μL配置成20μL反应体系。反应体系在37度保温一小时，在70度保温一小时。

(3)使用TAE配置1％的BioWest琼脂糖胶，在90V的电压下电泳30min，使用凝胶成像仪观察结果。

3、AAV包装系统选择及质粒构建

(1)待编辑细胞为人诱导多能干细胞1016细胞株，根据AAV组织亲和性对照表，优选血清型为AAV-DJ的包装系统。

(2)AAV-DJ的总包装容量为4.7Kb。在AAV包装系统的装载载体上所插入的片段应包含左同源臂(500bp左右)，插入片段以及右同源臂(500bp左右)。

左同源臂序列为SEQ ID NO.4，其中第495-497位碱基为经过突变的PAM位点。

右同源臂序列为SEQ ID NO.5。

插入片段为一个完整的Cassette包括CMV增加子、CMV启动子、EGFP和bGH poly A，共约1452bp，如SEQ ID NO.6所示，其中第1-507位为启动子，第508-1227位为EGFP，第1228-1452位为bGH polyA。使用NheI和BsmI限制性内切酶(购于NEB(北京)有限公司)将Cassette插入到pAAV载体上，载体序列为SEQ ID NO.7。为了避免SpCas9/sgRNA RNP复合物对重组位点的二次切割从而影响基因编辑的效率，通过PrimerStar高保真DNA聚合酶(购于宝生物工程(大连)有限公司，货号：R044A)利用PCR刻环的方法在PAM位点引入了点突变(CGG突变为CTG)，从而避免了了SpCas9/sgRNARNP复合物对识别位点的切割。点突变引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

HBB-PAM-mut-FW:5’-cctgaggagaagtctgcagttactgccctgtgggg-3’(SEQ IDNO.8)。

HBB-PAM-mut-REV:5’-ccccacagggcagtaactgcagacttctcctcagg-3’(SEQ IDNO.9)。

4、AAV病毒包装及纯化

(1)在病毒包装前一天将HEK293T细胞按照每皿5×10⁶的数量种植到直径10cm的含有10mL完全培养基(DMEM+10％FBS+1％P/S双抗)(DMEM培养基，购于ThermoFisherScientific,Inc.，货号：C11995500BT；FBS，购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：sv30087.02；P/S双抗，购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：SV30010)的CORNING培养皿中，共种植30皿。在37度、5％CO₂的细胞培养箱中培养24小时。

(2)病毒包装当天检查HEK293T细胞汇合度是否达到80％。每皿按照以下步骤单独配置转染体系：将10μg的pAAV-Cassette，10μg的pHelper，10μg的pAAV-DJ-RC混合后使用无血清的DMEM(购于购于ThermoFisherScientific,Inc.，货号：11320082)调整体积到910μL后经漩涡振荡器混匀，加入90μL的PEI(购于Polysciences Asia Pacific,Inc.货号：23966-2)后再次使用漩涡振荡器混匀，静置15分钟。将CORNING培养皿中的完全培养基替换成9mL无血清培养基，再将之前经过静置的DNA-PEI复合物均匀滴加到培养皿中，轻柔晃匀后置于37度、5％CO₂的细胞培养箱中培养6小时。转染6h后将CORNING培养皿中的无血清培养基替换成完全培养基，于37度、5％CO₂的细胞培养箱中继续培养。

(3)在转染60小时之后，分别收获上清和细胞。

将收集得到的上清经4000rpm 4度离心10分钟后弃去杂质。将去除杂质的上清加入Amicon Ultra-15超离柱中(购于默克化工技术(上海)有限公司，货号：UFC 905096)，经过若干次4000rpm、4度离心30分钟将体积浓缩至10到15mL。将用细胞刮刀刮下的HEK293T细胞用适量培养基吹匀并转移至50mL离心管中，经1500rpm、4度离心10min后弃上清，所有沉淀总共加3mL细胞裂解缓冲液(150mM NaCl,20mM tris pH8.0)使其重悬。将重悬细胞在-80℃酒精浴和37℃水浴中反复冻融三次。将浓缩的上清和冻融的细胞悬液混匀，添加1MMgCl2至终浓度为1mM。添加Benzonase(购于默克化工技术(上海)有限公司，货号：70746-1kU)至终浓度为25U/mL，混匀后37℃反应40min。取出50mL离心管，4℃，4000rpm离心20min，取上清。

(4)采用碘克沙醇密度梯度离心法纯化病毒(购于Sigma-Aldrich，货号：D1556-250mL)。配置碘克沙醇梯度17％：5mL 10×PBS,0.05mL 1MMgCl₂,0.125mL 1M KCl,10mL 5MNaCl,12.5mL Optiprep，加水补足到50mL。25％：5mL 10×PBS,0.05mL 1M MgCl2,0.125mL1M KCl,20mLOptiprep,0.1mL 0.5％phenol red，加水补足到50mL。40％：5mL 10×PBS,0.05mL 1M MgCl₂,0.125mL 1M KCl,33.3mL Optiprep，加水补足到50mL。60％：0.05mL 1MMgCl₂,0.125mL 1M KCl,50mL Optiprep,0.025mL 0.5％phenol red。向超速离心管中由下至上依次缓慢加入3.5mL 60％、3.5mL 40％、4mL 25％、4mL 17％的碘克沙醇。将浓缩的上清和细胞裂解液缓慢加在离心管最上层，用细胞裂解缓冲液补满离心管。使用贝克曼L-80XP落地超速离心机、70Ti定角转子，加速6，减速9，60000rpm 4度离心2小时。用平头注射器吸取40％浓度层碘克沙醇，转移至Amicon Ultra-15超离柱中，加入10mL PBS 4000rpm 4℃离心20分钟，重复3次。将病毒离心浓缩至1mL。

(5)利用qPCR对AAV-DJ进行滴度检测。根据EGFP序列设计引物，使qPCR产物的长度约200bp。qPCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

AAVGFPF:5’-tcagcttcaggcaccaccac-3’(SEQ ID NO.10)。

AAVGFPR:5’-tgaacttgtggccgtttacgtcg-3’(SEQ ID NO.11)。

制备7个AAV-DJ重组质粒标准品，以1：10的比例进行梯度稀释。从10ng/μL以下的浓度开始稀释，分别为10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL和0.00001ng/μL。

根据以下公式计算稀释的DNA拷贝数：

使用DNaseI对病毒样本进行预处理(购于宝生物工程(大连)有限公司，货号：2270A)。使用2×SYBR PCR mix(购于东洋纺(上海)生物科技有限公司，货号：QPS-201)配置qPCR反应体系。使用Roche 480II实时荧光定量PCR系统进行定量PCR。根据Ct值，绘制标准曲线，并计算AAV-DJ的滴度。

5、RNP复合物组装及待编辑细胞的预处理

(1)将SpCas9(终浓度1μmol/μL)和HBB sgRNA(终浓度1μmol/μL)按照1:3的摩尔比进行混合在室温孵育10min，从而形成SpCas9/sgRNA RNP复合物。

(2)观察1016细胞株(购自美国哈佛大学干细胞库)汇合率达到80％后移除mTeSR培养基(购于Stem Cell Technologies,Inc.，货号：85850)，用PBS漂洗一次。加入Accutase消化酶(购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：A1110501)使之完全覆盖皿底。37℃孵育3-5分钟后停止消化，吸去Accutase消化酶。即刻加入新鲜的mTeSR培养基，用1mL枪扇形吹打培养皿底，使皿/瓶底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，制成干细胞悬液。使用血球计数板对细胞密度进行计数。使用Opti-MEM(14.5mM的ATP、23.6mM的氯化镁)(购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：11058021)调整细胞密度到5×10⁷/mL。

(3)将10μL经过室温孵育的SpCas9/sgRNASNP复合物(以sgRNA的量计，所述RNP复合物的含量为7.5μmol)和10μL经过计数并使用Opti-MEM重悬的1016细胞悬液(其中细胞数量为5×10⁵个)相混合，将20μL混合液转移到16孔电转板条中。使用Lonza 4D核转染系统选择CB150模式(电场强度为150V/cm，单次脉冲时间为10ms，相邻两次脉冲之间的时间间隔为20s，总脉冲次数为5次)进行电转。电转完成后立刻将细胞转移到经过Geltrex包被(购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：A1413202)并且添加了500μL mTeSR和10μM Y-27632(购于Stem Cell Technologies,Inc.，货号：72304)的24孔板中于37度、5％CO₂的细胞培养箱中继续培养。

(4)电转完第5到20分钟内开始按照1×10⁵的MOI值轻柔地滴加AAV-DJ，并于电转完20分钟内滴加完毕。

(5)电转完24小时后将旧培养基移除，更换为新的mTeSR培养基(含有10μM的Y-27632)

6、单克隆细胞株的培养：

(1)电转完第48小时使用PBS漂洗一次培养皿。加入Accutase消化酶使之完全覆盖皿底。37℃孵育3-5分钟后停止消化，吸去Accutase消化酶。即刻加入新鲜的mTeSR培养基，用1mL枪扇形吹打培养皿/瓶底，使皿底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，保证细胞间没有粘连，制成干细胞悬液。使用血球计数板对细胞密度进行计数。按每个10cm培养皿15000个细胞的比例把细胞种植到经过Geltrex包被并且添加了10mL mTeSR和10μM Y-27632的10cm CORNING培养皿中于37度、5％CO₂的细胞培养箱中继续培养。

(2)每24小时进行观察并移除旧的培养基，更换为新的mTeSR培养基(含有10μM的Y-27632)。72小时后可以在镜下观察到克隆的形成。

(3)电转后12到14天在十倍的物镜下可以看到克隆的大小已经相当于一个硬币。不能让克隆继续变大或者相交。在经过Geltrex包被的96孔板上的每个孔中加入120μLmTeSR(含有10μM Y-27632)，标记板O。在超净台中通过显微镜进行观察，将P200移液器调节至45μL使用带有滤芯的枪头刮碎克隆，用移液器收集细胞并转移到96孔板的小孔中。

(4)克隆挑取之后每24小时后将旧的培养基移除，更换为新的mTeSR培养基(含有10μM的Y-27632)四天后细胞汇合率达到80％。

(5)在两块经过Geltrex包被的96孔板上的每个孔中加入133μL mTeSR(含有10μMY-27632)，分别标记为板A、板B。将板O的每孔使用150μL的PBS漂洗。每孔中加入35μL的Accutase消化酶，消化5到10分钟后每孔中添加165μL的mTeSR(含有10μM Y-27632)。从孔中分别移取66μL的细胞悬液转移到板A和板B的对应小孔中。板A用于基因组提取，板B备用。在板O的每个孔中直接添加165μL的mFreSR(购于Stem Cell Technologies,Inc.)后至于深低温冰箱存储。

7、基因编辑效率检测(等位基因插入检测)

(1)因为在HBB基因座上插入的Cassette可以表达绿色荧光蛋白，所以使用流式细胞仪检测并统计能发出绿色荧光的细胞数量以及细胞总量。将能发出绿色荧光的细胞数量除以细胞总量可以的到总的基因编辑效率。

(2)在同源臂外设计引物(非整合位点PCR产物约2400bp左右，整合位点PCR产物3900bp)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

HBB-FW：5’-tagatgtccccagttaacctcctat-3’(SEQ ID NO.12)，

HBB-REV：5’-ttattaggcagaatccagatgctca-3’(SEQ ID NO.13)。

(3)选取20个克隆以及未编辑1016细胞株作为对照，将A板或B板96孔板中的克隆所获得的基因组进行PCR扩增。

(4)将PCR产物进行电泳并分析。只有2400bp左右条带的为非编辑细胞，只有3900bp条带的为双等位基因编辑细胞，既有2400bp左右条带也有3900bp条带的为单等位基因编辑细胞。分别标注并统计这三类编辑类型的比例。

对比例1

按照实施例1的方法进行，不同的是电转完第35min开始按照1×10⁵的MOI轻柔地滴加AAV-DJ，并于电转完50分钟内滴加完毕。

测试实施例1

1、荧光检测等位基因插入效率检测

检测样品：经过电转和AAV感染后第四天经过Accutase消化酶后加入新鲜的mTeSR培养基使其重悬制成的干细胞悬液。

检测方法：因为在目标基因座上插入的Cassette可以表达绿色荧光蛋白，使用流式细胞仪检测并统计能发出绿色荧光的细胞数量以及细胞总量。将能发出绿色荧光的细胞数量除以细胞总量可以得到总的编辑效率。

实验结果：实施例1编辑效率为81.2％，对比例1编辑效率为10.6％。

2、PCR检测等位基因插入效率

检测样品：96孔板培养的单克隆细胞株(A板和B板)

检测方法：在同源臂外设计引物(非整合位点PCR产物约2400bp左右，整合位点PCR产物4600bp)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例1、对比例1使用HBB-FW：5’-tagatgtccccagttaacctcctat-3’(SEQ IDNO.12)

HBB-REV：5’-ttaggcagaatccagatgctca-3’(SEQ ID NO.13)。

将96孔板中的克隆所获得的基因组进行PCR扩增。将PCR产物进行电泳并分析。只有2400bp左右条带的为非编辑细胞，只有4600bp的为双等位基因编辑细胞，既有2400bp左右条带也有4600bp的为单等位基因编辑细胞。

实验结果：实施例1编辑效率：等位基因双编辑64.2％、等位基因单编辑16.4％，对比例1编辑效率：等位基因双编辑0.3％、等位基因单编辑0.7％；可见电转与病毒转染的时间间隔对基因敲入的效率影响较大，在优选在电转结束后5-20分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行8-24小时的转染的情况下，基因敲入的效率最高。

以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 杭州观梓健康科技有限公司

<120> 一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法

<130> 10967-K-HZGZ

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 103

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cuugccccac agggcaguaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tagatgtccc cagttaacct cctat 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttattaggca gaatccagat gctca 25

<210> 4

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caggaagaga tccatctaca tatcccaaag ctgaattatg gtagacaaaa ctcttccact 60

tttagtgcat caacttctta tttgtgtaat aagaaaattg ggaaaacgat cttcaatatg 120

cttaccaagc tgtgattcca aatattacgt aaatacactt gcaaaggagg atgtttttag 180

tagcaatttg tactgatggt atggggccaa gagatatatc ttagagggag ggctgagggt 240

ttgaagtcca actcctaagc cagtgccaga agagccaagg acaggtacgg ctgtcatcac 300

ttagacctca ccctgtggag ccacacccta gggttggcca atctactccc aggagcaggg 360

agggcaggag ccagggctgg gcataaaagt cagggcagag ccatctattg cttacatttg 420

cttctgacac aactgtgttc actagcaacc tcaaacagac accatggtgc atctgactcc 480

tgaggagaag tctgcagtta 500

<210> 5

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgccctgtg gggcaaggtg aacgtggatg aagttggtgg tgaggccctg ggcaggttgg 60

tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcatgt ggagacagag 120

aagactcttg ggtttctgat aggcactgac tctctctgcc tattggtcta ttttcccacc 180

cttaggctgc tggtggtcta cccttggacc cagaggttct ttgagtcctt tggggatctg 240

tccactcctg atgctgttat gggcaaccct aaggtgaagg ctcatggcaa gaaagtgctc 300

ggtgccttta gtgatggcct ggctcacctg gacaacctca agggcacctt tgccacactg 360

agtgagctgc actgtgacaa gctgcacgtg gatcctgaga acttcagggt gagtctatgg 420

gacgcttgat gttttctttc cccttctttt ctatggttaa gttcatgtca taggaagggg 480

ataagtaaca gggtacagtt 500

<210> 6

<211> 1452

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca 120

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttgcacca aaatcaacgg 420

gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 480

cggtgggagg tctatataag cagagctatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 540

gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc 600

ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc 660

ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc 720

ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa 780

ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc 840

gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc 900

aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc 960

tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac 1020

atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 1080

ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac 1140

cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact 1200

ctcggcatgg acgagctgta caagtgacca tagagcccac cgcatcccca gcatgcctgc 1260

tattgtcttc ccaatcctcc cccttgctgt cctgccccac cccacccccc agaatagaat 1320

gacacctact cagacaatgc gatgcaattt cctcatttta ttaggaaagg acagtgggag 1380

tggcaccttc cagggtcaag gaaggcacgg gggaggggca aacaacagat ggctggcaac 1440

tagaaggcac ag 1452

<210> 7

<211> 3024

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccgcg aatgctgcgg cgcgcggcta gcttaacaac 180

aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaact 240

agacccagct ttcttgtaca aagttggcat tagagctcgc ggccgcagga acccctagtg 300

atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 360

gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 420

ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 480

atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 540

tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 600

tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 660

tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 720

gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 780

agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 840

cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 900

agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 960

ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 1020

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 1080

ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 1140

cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 1200

tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 1260

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 1320

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 1380

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 1440

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 1500

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 1560

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 1620

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 1680

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 1740

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 1800

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 1860

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 1920

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 1980

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 2040

ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 2100

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 2160

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 2220

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 2280

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 2340

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 2400

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 2460

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 2520

tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 2580

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 2640

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 2700

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 2760

gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 2820

gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 2880

tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 2940

caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 3000

tttgctggcc ttttgctcac atgt 3024

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctgaggaga agtctgcagt tactgccctg tgggg 35

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccccacaggg cagtaactgc agacttctcc tcagg 35

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcagcttcag gcaccaccac 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgaacttgtg gccgtttacg tcg 23

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tagatgtccc cagttaacct cctat 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttattaggca gaatccagat gctca 25

Claims

1.一种在干细胞中进行基因定向敲入的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

S1、将针对待敲入的靶位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；

S2、将插入有模板DNA的同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；

S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；

S4、在电转结束后5-20分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行8-24小时的转染，得到转染后的培养物；

S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述sgRNA带有化学修饰基团；针对待编辑的靶位点的sgRNA和Cas9蛋白的用量摩尔比为1:1至1:5。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述化学修饰基团为甲基化学修饰基团或磷硫酰化学修饰基团。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，将针对待编辑的靶位点的sgRNA和Cas9蛋白混合的时间为5-20分钟，温度为10-40℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S3中，所述干细胞的悬液与所述RNP复合物混合时，相对于每10⁶个所述干细胞，以sgRNA的量计，所述RNP复合物的用量为10-50 μmol，所述干细胞的悬液中，细胞浓度为(1-5)×10⁷个/mL；以sgRNA的量计，所述RNP复合物的终浓度为0.1-1.5μmol/μL。

6.根据权利要求1或4所述的方法，其中，步骤S3中，电转的条件包括：电场强度为50-250V/cm，单次脉冲时间为2-15ms，相邻两次脉冲之间的时间间隔为10-60s，总脉冲次数为2-10次。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S4中，待转染的AAV病毒颗粒的悬液的加入量使得待转染的AAV病毒颗粒的MOI值为10⁴-10⁶。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述干细胞为胚胎干细胞、诱导多能干细胞和间充质干细胞中的至少一种；所述AAV病毒的血清型为AAV-6病毒、AAV-1病毒或AAV-DJ病毒。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述干细胞为1016细胞株。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述模板DNA包括左同源臂序列、敲入片段和右同源臂序列。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述敲入片段包括增强子、启动子、敲入基因和polyA；所述敲入基因的长度为200-5000 bp。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述敲入基因为报告基因。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述报告基因为荧光蛋白报告基因。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述待敲入的靶位点的sgRNA的序列如SEQ IDNO. 1所示；所述模板DNA的序列如SEQ ID NO. 6所示；所述载体的骨架序列如SEQ ID NO.7所示。