CN109097333B

CN109097333B - 抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的间充质干细胞及其制备方法和用途

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Publication number: CN109097333B
Application number: CN201810785793.0A
Authority: CN
Inventors: 李程; 严颖刚; 丁秋蓉
Original assignee: Hangzhou View Health Technology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou View Health Technology Co Ltd
Priority date: 2018-07-17
Filing date: 2018-07-17
Publication date: 2019-07-23
Anticipated expiration: 2038-07-17
Also published as: CN109097333A

Abstract

本公开提供了一种制备抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对基因插入安全岛的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、形成携带GPX7基因的待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转；S4、加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行的转染；S5、进行单克隆化培养并筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株；S6、扩增并定向诱导分化成为MSC。本公开还提供了上述方法制备得到的间充质干细胞及其用途。通过上述技术方案，本发明获得了一种抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的多能干细胞制备方案。

Description

抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的间充质干细胞及其制备方法和用途

技术领域

本公开涉及医药生物技术领域，具体地涉及一种抵抗细胞衰老且具有调节血糖作用的间充质干细胞及其制备方法和用途。

背景技术

I型糖尿病是由胰岛β细胞自身免疫炎症所导致的β细胞破坏，患者体内由于胰岛细胞功能缺失，患者需要终身进行胰岛素注射治疗。最新结果显示，我国每年有13000例新发I型糖尿病，过去20年间，15岁以下儿童发病率增加近4倍。

研究发现间充质干细胞(MSCs)外泌体中的miRNA可缓解胰岛素抵抗。另外，MSCs还可以促进β细胞自噬，促进α细胞向β细胞转变，保护β细胞，促进β细胞再生。在上述两方面共同作用下，产生降糖效应。现阶段国内间充质干细胞疗法的细胞来源主要分为自体来源(骨髓、脂肪组织等)和异体来源(脐带、胎盘等)两种。但是，此两种来源的间充质干细胞，普遍存在着如下问题：(1)难以取材(特别是骨髓)；(2)保存期限较短；(3)随年龄增大间充质干细胞数量和扩增潜力显著降低，体外扩增更会加速间充质干细胞老化；(4)随年龄增大间充质干细胞分化潜力大幅衰退，例如：取自年轻人的间充质干细胞易分化成软骨等细胞，而取自老人的间充质干细胞分化倾向于脂肪细胞；(5)制备过程不易质控，例如：不同个体和同一个体不同组织器官部位来源的间充质干细胞差异非常大，无法预知。这些缺点很大程度上导致了成体来源的间充质干细胞作为干细胞药物，其质控过程缺乏可控性，其疗效存在不稳定性，从而限制了其作为细胞移植药物的临床应用。也就是说，间充质干细胞的复制性衰老的缺陷是限制其临床应用的技术障碍。

CRISPR基因编辑技术通过在基因组特定位点进行精确的靶向性剪切，形成DNA双链缺口(Double-strand breaks,DSBs)，通过细胞内非同源末端链接(Non-homologous endjoining,NHEJ)实现对原位基因的敲除，通过同源重组(Homology directed repair,HDR)在外源基因模板存在的情况下，实现点突变的引入与修复及大片段基因(如报告基因)的插入。如专利文献CN105985985A中所述，利用CRISPR/Cas9系统构建慢病毒，对脐带来源的MSCs中的免疫抗原B2M、炎症因子TNF-α进行敲除，从而实现降低异体间充质干细胞免疫源性的目的。但在哺乳动物细胞中，NHEJ修复基因占主导模式，实现基因敲除比实现基因敲入容易很多。且基因敲入的片段越大，整合几率越低，技术实现更为困难。目前尚未见有在MSCs中进行大片段基因敲入的报道。

发明内容

本公开的目的是克服间充质干细胞存在的易衰老的缺陷，获得一种能够抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的细胞治疗产品。

为了实现上述目的，本公开提供了一种抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的间充质干细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对基因插入安全岛的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、将插入有模板DNA同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述模板DNA包括针对基因插入安全岛的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入有GPx7基因；S3、将iPSC细胞或胚胎干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株；S6、将所述进行了基因定向敲入的单克隆细胞株扩增并定向诱导分化成为间充质干细胞。

另一方面，本公开还提供了上述方法制备得到的间充质干细胞。

再一方面，本公开还提供了上述间充质干细胞的用途，所述用途为如下任意一种：制备改善胰岛素抵抗和/或慢性炎症的产品；制备细胞移植治疗的产品；制备改善β细胞功能的治疗性产品；制备再生和/或修复损伤血管的产品。

通过上述技术方案，本发明在间充质干细胞的基因插入安全岛(包括rDNA 28s、rDNA 18S、rDNA45s、CLYBL及AAVS1)部位精确、高效插入GPx7表达元件，来提升GPx7表达量从而延缓间充质干细胞的复制性衰老，从而延长间充质干细胞的调节血糖的时间。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开提供了一种抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的间充质干细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：S1、将将针对基因插入安全岛的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、将插入有模板DNA的同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述模板DNA包括针对基因插入安全岛的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入有GPx7基因；S3、将iPSC细胞或胚胎干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株；S6、将所述进行了基因定向敲入的单克隆细胞株扩增并定向诱导分化成为间充质干细胞。

本发明通过RNP复合物以电转的方式将sgRNA和Cas9蛋白转入细胞中，并在电转后的合适的时间内选择AAV病毒来将插入GPx7基因的同源重组载体转染到细胞中，最终使得sgRNA、Cas9蛋白和插入有模板DNA的载体共同通过CRISPR基因编辑来使得大片段的外源基因得以定向敲入靶点位置。

其中，所述基因插入安全岛的定义为外源基因安全插入位点，外源基因插入后并不会影响细胞本身的基因表达；所述基因插入安全岛可以为RNA45SN4、rDNA 28S(NCBIGene ID为106632264)、rDNA 18S(NCBI Gene ID为106631781)、rDNA 45S(NCBI Gene ID为109864271)、CLYBL(NCBI Gene ID为171425)或AAVS1(NCBI Gene ID为17)；所述插入基因GPx7，其NCBI Gene ID为2882。优选地，所述基因插入安全岛为RNA45SN4，其NCBI Gene ID为109864271。

其中，可选地，所述sgRNA带有化学修饰基团；所述化学修饰基团优选为甲基化学修饰基团或磷硫酰化学修饰基团；针对基因插入安全岛的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白的用量摩尔比为1:1至1:5。其中，可以使用在线sgRNA设计工具(http://crispr.mit.edu/)依据基因插入安全岛的敲入位点设计sgRNA的序列并加以合成。其中，sgRNA序列的5’端和3’端末尾的可以分别添加有甲基(-O-Me)化学修饰基团或磷硫酰(-phosphorothioate)化学修饰基团。

其中，可选地，将针对基因插入安全岛的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合的时间为5-20分钟，温度为10-40℃。

其中，可选地，步骤S3中，所述iPSC细胞或胚胎干细胞的悬液与所述RNP复合物混合时，相对于每10⁶个所述iPSC细胞或胚胎干细胞，以sgRNA的量计，所述RNP复合物的用量为1-50μmol；所述1016细胞的悬液中，细胞浓度为(1-5)×10⁷个/mL；以sgRNA的量计，所述RNP复合物的终浓度为0.1-1.5μmol/μL。

其中，可选地，步骤S3中，电转的条件包括：电场强度为50-250V/cm，单次脉冲时间为2-15ms，相邻两次脉冲之间的时间间隔为10-60s，总脉冲次数为2-10次。

其中，可选地，步骤S4中，在电转结束后5-20分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行8-24小时的转染，得到转染后的培养物。

其中，可选地，步骤S4中，待转染的AAV病毒颗粒的悬液的加入量使得待转染的AAV病毒颗粒的MOI值为10⁴-10⁶。MOI值是感染时病毒与细胞数量的比值。

其中，优选地。所述AAV病毒的血清型可以为AAV-1病毒、AAV-2病毒、AAV-3病毒、AAV-4病毒、AAV-5病毒、AAV-6病毒、AAV-7病毒、AAV-8病毒、AAV-9病毒、AAV-DJ病毒及AAV-DJ/8病毒，优选为AAV-8病毒、AAV-6病毒、AAV-1病毒或AAV9病毒，更优选所述AAV病毒的血清型为AAV8病毒，在该优选情况下，能够进一步增加大片段基因敲入干细胞的效率。

其中，所述GPx7基因是指内质网谷胱甘肽过氧化物酶7基因，其NCBI Gene ID为2882。

其中，所述模板DNA可以包括左同源臂序列、敲入片段和右同源臂序列；优选地，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间可以插入有CMV增强子、CMV启动子、GPx7基因的表达框和bGH poly A；优选地，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入的序列如SEQ ID NO.4所示。

其中，优选地，所述sgRNA如SEQ ID NO.1所示；相应地，所述左同源臂序列如SEQID NO.2所示；相应地，所述右同源臂序列如SEQ ID NO.3所示。

其中，可选地，所述载体的骨架序列如SEQ ID NO.7所示。所述载体的骨架序列是指未插入模板DNA的载体的序列。

其中，可选地，扩增并定向诱导分化的条件包括：将所述进行了基因定向敲入的单克隆细胞株在低粘附培养板中继续培养18-100小时后形成拟胚体；然后将所述拟胚体接种于基质胶上继续培养10-20天后用流式细胞术分选其中CD73、CD90和CD105均为阳性的细胞群体。

再一方面，本公开还提供了上述间充质干细胞的用途，所述用途为如下任意一种：制备改善胰岛素抵抗和/或慢性炎症的产品；制备细胞移植治疗的产品；制备改善β细胞功能的治疗性产品；和，制备再生和/或修复损伤血管的产品。

以下通过实施例进一步详细说明本发明：

实施例1

构建在1016细胞株(购自美国哈佛大学干细胞库)的安全位点(RNA45SN4)中插入GPX7基因表达Cassette的细胞模型。

1、sgRNA设计以及合成

(1)通过在线sgRNA设计工具(http://crispr.mit.edu/)在基因插入安全岛(RNA45SN4)上设计靶向识别的RNA45SN4sgRNA，优选结果如下：5’-acgccgcggcggccgucgggguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu-3’(SEQ ID NO.1)。其中1-20位的序列为识别基序，其余的序列为tracrRNA。

(2)该sgRNA由Integrated DNA Technologies US公司合成并在该sgRNA序列的5’端和3’端末尾分的三个碱基的二号位和三号位上别添加O-Me、phosphorothioate的修饰。

2、体外法检测sgRNA的活性

(1)从基因组扩增识别靶序列片段(2000bp)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

GPx7FW：5’-gaggaattcccagtaagtgc-3’(SEQ ID NO.5)，

GPx7REV：5’-gcgctcccccgaccctctct-3’(SEQ ID NO.6)。

(2)将PCR扩增产物200ng，sgRNA 100ng，SpCas9 200ng(购于Sigma-Aldrich，货号：TGEN-CP-500UG)，10×缓冲液2μL配置成20μL反应体系。反应体系在37度保温一小时，在70度保温一小时。

(3)使用TAE配置1％的BioWest琼脂糖胶，在90V的电压下电泳30min，使用凝胶成像仪观察结果。

3、AAV包装系统选择及质粒构建

(1)待编辑细胞为1016细胞株，根据AAV组织亲和性对照表，优选血清型为AAV-8的包装系统。

(2)AAV-8的总包装容量为4.7Kb。在AAV包装系统的装载载体上所插入的片段应包含左同源臂(500bp左右)，插入片段以及右同源臂(500bp左右)。

左同源臂序列为SEQ ID NO.2。

右同源臂序列为SEQ ID NO.3，其中第4-7位碱基为经过突变的PAM位点。

插入片段为一个完整的Cassette包括CMV增加子、CMV启动子、GPX7 CDS和bGHpoly A，共1296bp，序列如SEQ ID NO.4所示，其中第1-507位为启动子，第508-1071位为EGFP，第1072-1296位为bGH pol yA。.使用NheI和BsmI限制性内切酶(购于NEB(北京)有限公司)将Cassette插入到pAAV载体上，载体序列为SEQ ID NO.7。为了避免SpCas9/sgRNARNP复合物对重组位点的二次切割从而影响基因编辑的效率，通过PrimerStar高保真DNA聚合酶(购于宝生物工程(大连)有限公司，货号：R044A)利用PCR刻环的方法在PAM位点引入了点突变(TGG突变为TAG)，从而避免了了SpCas9/sgRNA RNP复合物对识别位点的切割。点突变引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

GPx7-PAM-mut-FW:5’-gcggcggccgtcgggtaggggctttacccggcg-3’(SEQ ID NO.8)；

GPx7-PAM-mut-REV:5’-cgccgggtaaagcccctacccgacggccgccgc-3’(SEQ IDNO.9)。

4、AAV病毒包装及纯化

(1)在病毒包装前一天将HEK293T细胞按照每皿5×10⁶的数量种植到直径10cm的含有10mL完全培养基(DMEM+10％FBS+1％P/S双抗)(DMEM培养基，购于ThermoFisherScientific,Inc.，货号：C11995500BT；FBS，购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：sv30087.02；P/S双抗，购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：SV30010)的CORNING培养皿中，共种植30皿。在37度、5％CO₂的细胞培养箱中培养24小时。

(2)病毒包装当天检查HEK293T细胞汇合度是否达到80％。每皿按照以下步骤单独配置转染体系：将10μg的pAAV-Cassette，10μg的pHelper，10μg的pAAV9-RC混合后使用无血清的DMEM调整体积到910μL后经漩涡振荡器混匀，加入90μL的PEI(购于Polysciences AsiaPacific,Inc.，货号：23966-2)后再次使用漩涡振荡器混匀，静置15分钟。将CORNING培养皿中的完全培养基替换成9mL无血清培养基，再将之前经过静置的DNA-PEI复合物均匀滴加到培养皿中，轻柔晃匀后置于37度、5％CO₂的细胞培养箱中培养6小时。转染6h后将CORNING培养皿中的无血清培养基替换成完全培养基，于37度、5％CO₂的细胞培养箱中继续培养。

(3)在转染60小时之后，分别收获上清和细胞。

将收集得到的上清经4000rpm 4度离心10分钟后弃去杂质。将去除杂质的上清加入Amicon Ultra-15超离柱中(购于默克化工技术(上海)有限公司，货号：UFC 905096)，经过若干次4000rpm、4度离心30分钟将体积浓缩至10到15mL。将用细胞刮刀刮下的HEK293T细胞用适量培养基吹匀并转移至50mL离心管中，经1500rpm、4度离心10min后弃上清，所有沉淀总共加3mL细胞裂解缓冲液(150mM NaCl,20mM tris pH8.0)使其重悬。将重悬细胞在-80℃酒精浴和37℃水浴中反复冻融三次。将浓缩的上清和冻融的细胞悬液混匀，添加1MMgCl₂至终浓度为1mM。添加Benzonase(购于默克化工技术(上海)有限公司，货号：70746-1kU)至终浓度为25U/mL，混匀后37℃反应40min。取出50mL离心管，4℃，4000rpm离心20min，取上清。

(4)采用碘克沙醇密度梯度离心法纯化病毒(购于Sigma-Aldrich，货号：D1556-250mL)。配置碘克沙醇梯度17％：5mL 10×PBS,0.05mL 1M MgCl₂,0.125mL 1M KCl,10mL5M NaCl,12.5mL Optiprep，加水补足到50mL。25％：5mL 10×PBS,0.05mL 1M MgCl₂,0.125mL 1M KCl,20mL Optiprep,0.1mL 0.5％phenol red，加水补足到50mL。40％：5mL 10×PBS,0.05mL 1M MgCl₂,0.125mL 1M KCl,33.3mL Optiprep，加水补足到50mL。60％：0.05mL 1M MgCl₂,0.125mL 1M KCl,50mL Optiprep,0.025mL 0.5％phenol red。向超速离心管中由下至上依次缓慢加入3.5mL 60％、3.5mL 40％、4mL 25％、4mL 17％的碘克沙醇。将浓缩的上清和细胞裂解液缓慢加在离心管最上层，用细胞裂解缓冲液补满离心管。使用贝克曼L-80XP落地超速离心机、70Ti定角转子，加速6，减速9，60000rpm 4度离心2小时。用平头注射器吸取40％浓度层碘克沙醇，转移至Amicon Ultra-15超离柱中，加入10mL PBS4000rpm 4℃离心20分钟，重复3次。将病毒离心浓缩至1mL。

(5)利用qPCR对AAV8进行滴度检测。根据EGFP序列设计引物，使qPCR产物的长度约200bp。qPCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

AAV-GPx7-F:5’-actggtgtcgctggagaagt-3’(SEQ ID NO.10)。

AAV-GPx7-R:5’-caatctccttgttgctgtcag-3’(SEQ ID NO.11)。

制备7个AAV8重组质粒标准品，以1：10的比例进行梯度稀释。从10ng/μL以下的浓度开始稀释，分别为10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL和0.00001ng/μL。

根据以下公式计算稀释的DNA拷贝数：

使用DNaseI对病毒样本进行预处理(购于宝生物工程(大连)有限公司，货号：2270A)。使用2×SYBR PCR mix(购于东洋纺(上海)生物科技有限公司，货号：QPS-201)配置qPCR反应体系。使用Roche 480II实时荧光定量PCR系统进行定量PCR。根据Ct值，绘制标准曲线，并计算AAV9的滴度。

5、RNP复合物组装及待编辑细胞的预处理

(1)将SpCas9(终浓度1μmol/μL)和RNA45SN4sgRNA(终浓度1μmol/μL)按照1:3的摩尔比进行混合在室温孵育10min，从而形成SpCas9/sgRNA RNP复合物。

(2)观察1016细胞株汇合率达到80％后移除mTeSR培养基(购于StemCellTechnologies,Inc.，货号：85850)，用PBS漂洗一次。加入Accutase消化酶(购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：A1110501)使之完全覆盖皿底。37℃孵育3-5分钟后停止消化，吸去Accutase消化酶。即刻加入新鲜的mTeSR培养基，用1mL枪扇形吹打培养皿底，使皿/瓶底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，制成干细胞悬液。使用血球计数板对细胞密度进行计数。使用Opti-MEM(14.5mM的ATP、23.6mM的氯化镁)(购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：11058021)调整细胞密度到5×10⁷/mL。

(3)将10μL经过室温孵育的SpCas9/sgRNA SNP复合物(以sgRNA的量计，所述RNP复合物的含量为7.5μmol)和10μL经过计数并使用Opti-MEM重悬的1016细胞悬液(其中细胞数量为5×10⁵个)相混合，将20μL混合液转移到16孔电转板条中。使用Lonza 4D核转染系统选择CB150模式(电场强度为150V/cm，单次脉冲时间为10ms，相邻两次脉冲之间的时间间隔为20s，总脉冲次数为5次)进行电转。电转完成后立刻将细胞转移到经过Geltrex包被(购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：A1413202)并且添加了500μL mTeSR和10μM Y-27632(购于Stem Cell Technologies,Inc.，货号：72304)的24孔板中于37度、5％CO₂的细胞培养箱中继续培养。

(4)电转完第5到20分钟内开始按照1×10⁵的MOI值轻柔地滴加AAV-DJ，并于电转完20分钟内滴加完毕。

(5)电转完24小时后将旧培养基移除，更换为新的mTeSR培养基(含有10μM的Y-27632)

6、单克隆细胞株的培养：

(1)电转完第48小时使用PBS漂洗一次培养皿。加入Accutase消化酶使之完全覆盖皿底。37℃孵育3-5分钟后停止消化，吸去Accutase消化酶。即刻加入新鲜的mTeSR培养基，用1mL枪扇形吹打培养皿/瓶底，使皿底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，保证细胞间没有粘连，制成干细胞悬液。使用血球计数板对细胞密度进行计数。按每个10cm培养皿15000个细胞的比例把细胞种植到经过Geltrex包被并且添加了10mL mTeSR和10μM Y-27632的10cm CORNING培养皿中于37度、5％CO₂的细胞培养箱中继续培养。

(2)每24小时进行观察并移除旧的培养基，更换为新的mTeSR培养基(含有10μM的Y-27632)。72小时后可以在镜下观察到克隆的形成。

(3)电转后12到14天在十倍的物镜下可以看到克隆的大小已经相当于一个硬币。不能让克隆继续变大或者相交。在经过Geltrex包被的96孔板上的每个孔中加入120μLmTeSR(含有10μM Y-27632)，标记板O。在超净台中通过显微镜进行观察，将P200移液器调节至45μL使用带有滤芯的枪头刮碎克隆，用移液器收集细胞并转移到96孔板的小孔中。

(4)克隆挑取之后每24小时后将旧的培养基移除，更换为新的mTeSR培养基(含有10μM的Y-27632)四天后细胞汇合率达到80％。

(5)在两块经过Geltrex包被的96孔板上的每个孔中加入133μLmTeSR(含有10μMY-27632)，分别标记为板A、板B。将板O的每孔使用150μL的PBS漂洗。每孔中加入35μL的Accutase消化酶，消化5到10分钟后每孔中添加165μL的mTeSR(含有10μM Y-27632)。从孔中分别移取66μL的细胞悬液转移到板A和板B的对应小孔中。板A用于基因组提取，板B备用。在板O的每个孔中直接添加165μL的mFreSR(购于Stem Cell Technologies,Inc.)后至于深低温冰箱存储。

7、基因编辑效率检测(等位基因插入检测)

(1)在同源臂外设计引物(非整合位点PCR产物约2000bp左右，整合位点PCR产物3400bp)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

GPx7FW：5’-gaggaattcccagtaagtgc-3’(SEQ ID NO.5)，

GPx7REV：5’-gcgctcccccgaccctctct-3’(SEQ ID NO.6)。

(2)从96孔板中挑取克隆，抽提基因组后进行PCR扩增。

(3)将PCR产物进行电泳并分析。只有2000bp左右条带的为非编辑细胞，既有2000bp左右条带也有3400bp的为编辑细胞。分别标注并统计这两类编辑类型的比例结果如表1所示。

表1

	非编辑细胞比例	基因编辑细胞
			实施例1	25％	75％

8、多能干细胞定向诱导分化成为MSC

将GPx7插入的1016细胞株进行拟胚胎(EB)分化

准备300-500个细胞，大小均一的GPx7插入1016克隆，用室温PBS清洗一次，用Accutase消化酶37度消化3-5分钟。待1016克隆形成球体后，用CDF12培养基重悬后，加到低粘附培养板中(货号3471，购于CORNING公司)。37度、5％CO₂的细胞培养箱中继续培养1到3天后即形成拟胚体。

将获得的拟胚体接种于基质胶(geltrex，购于ThermoFisher Scientific,Inc.，)包被的六孔板中进行培养，继续培养2周至纤维状细胞出现。再经过一次传代后，利用流式细胞术分选其中CD73、CD90、CD105均为阳性的细胞群体，此即为GPx7增强型MSC。

对比例1：脐带间充质干细胞

对比例1培养方法参照《改良的人脐带间充质干细胞培养方法》中所述方法。

测试实施例：

实施例1得到的GPx7增强型MSC体外传代后的衰老状态检测(相对于对比例1)

细胞衰老β-半乳糖苷酶染色是一种基于衰老时SA-β-Gal活性水平的上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的方法。在体外传代10、15代的情况下，分别对从实施例1中获得的GPx7增强型MSC和对比例1的脐带间充质干细胞进行SA-β-Gal染色，并在普通的光学显微镜下观察到细胞或组织的衰老情况，并对两组细胞中的SA-β-Gal阳性细胞染色比率进行定量统计分析。

染色步骤：用PBS洗涤一次供体细胞，再加入染色固定液(2％甲醛+0.2％戊二醛)，室温固定5分钟。弃去固定液，用PBS洗涤1次，每孔加入1ml染色工作液。以X-Gal作为底物，在衰老特异性的β半乳糖苷酶会生成深蓝色产物。实验结果：衰老细胞阳性比率：对比例1>实施例1，结果如表2所示。

表2

将实施例1中获得的GPx7增强型MSC和对比例1的脐带间充质干细胞在体外传代10到15代后分别对衰老高表达基因p16、p21、GATA4的蛋白表达情况进行蛋白质免疫印迹检测。一抗分别为p16(购于BD，货号：550834)、p21(购于Cell Signaling，货号：2947)，GATA4(购于Santa Cruz，货号：SC-1237)、Actin(购于Sigma-Aldrich，货号：A1978)，使用的HRP标记的二抗购于中杉金桥分别为羊抗小鼠，货号：ZDR5307，羊抗兔，货号：ZDR5306，兔抗羊，货号：ZDR5308。

实验结果：p16、p21、GATA4在GPx7增强型MSC中的表达丰度低于其在对比例1的脐带间充质干细胞中的表达丰度。相应蛋白表达丰度＝相应蛋白灰度值/actin条带灰度值，结果如表3所示。

表3

3、实施例1得到的GPx7增强型MSC和对比例1的脐带间充质干细胞对血糖持续调节作用的检测

注射到STZ造模大鼠体内，STZ大鼠造模参照《照脂肪间充质干细胞及其外泌体对炎症状态脂肪细胞及2型糖尿病大鼠的作用及机制》中所述方法。将实施例1得到的GPx7增强型MSC细胞和对比例1的脐带间充质干细胞，按照1ml浓度剂量2x10⁶cell/ml的细胞量通过尾静脉注射至STZ大鼠体内，分别在注射细胞5天，10，天，15天，20天时尾静脉取血，检测空腹血糖浓度。结果如表4

表4

空腹血糖(mM)	d5	d10	d15	d20
					实施例1	4.6	6.1	7.2	10.1
对比例1	5.1	11.1	15.6	20.8

如表4所示，实施例1相较于对比例1具有长时间维持调节血糖作用的能力。

以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 杭州观梓健康科技有限公司

<120> 抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的间充质干细胞及其制备方法和用途

<130> 10996-K-HZGZ

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 103

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgccgcggc ggccgucggg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 2

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggagcggtc cccggccgcg gccccgacga cgtgggtgtc ggcgggcgcg ggggcggttc 60

tcggcggcgt cgcggcgggt ctgggggggt ctcggtgccc tcctccccgc cggggcccgt 120

cgtccggccc cgccgcgccg gctccccgtc ttcggggccg gccggattcc cgtcgcctcc 180

gccgcgccgc tccgcgccgc cgggcacggc cccgctcgct ctccccggcc ttcccgctag 240

ggcgtctcga gggtcggggg ccggacgccg gtcccctccc ccgcctcctc gtccgccccc 300

ccgccgtcca ggtacctagc gcgttccggc gcggaggttt aaagacccct tggggggatc 360

gcccgtccgc ccgtgggtcg ggggcggtgg tgggcccgcg ggggagtccc gtcgggaggg 420

gcccggcccc tcccgcgcct ccaccgcgga ctccgctccc cggccggggc cgcgccgccg 480

ccgacgccgc ggcggccgtc 500

<210> 3

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggtaggggc tttacccggc ggccgtcgcg cgcctgccgc gcgtgtggcg tgcgccccgc 60

gccgtggggg cgggaacccc cgggcgcctg tggggtggtg tccgcgctcg cccccgcgtg 120

ggcggcgcgc gcctccccgt ggtgtgaaac cttccgaccc ctctccggag tccggtcccg 180

ttcgctgtct cgtctggccg gcctgaggca accccctctc ctcttgggcg gggggggggg 240

gacgtgccgc gccaggaagg gcctcctccc ggtgcgtcgt cgggagcgcc ctcgccaaat 300

cgacctcgta cgactcttag cggtggatca ctcggctcgt gcgtcgatga agaacgcagc 360

tagctgcgag aattaatgtg aattgcagga cacattgatc atcgacactt cgaacgcact 420

tgcggccccg ggttcctccc ggggctacgc ctgtctgagc gtcgcttgcc gatcaatcgc 480

ccccgggggt gcctccgggc 500

<210> 4

<211> 1296

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca 120

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttgcacca aaatcaacgg 420

gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 480

cggtgggagg tctatataag cagagctatg gtggcggcga cggtggcagc ggcgtggctg 540

ctcctgtggg ctgcggcctg cgcgcagcag gagcaggact tctacgactt caaggcggtc 600

aacatccggg gcaaactggt gtcgctggag aagtaccgcg gatcggtgtc cctggtggtg 660

aatgtggcca gcgagtgcgg cttcacagac cagcactacc gagccctgca gcagctgcag 720

cgagacctgg gcccccacca ctttaacgtg ctcgccttcc cctgcaacca gtttggccaa 780

caggagcctg acagcaacaa ggagattgag agctttgccc gccgcaccta cagtgtctca 840

ttccccatgt ttagcaagat tgcagtcacc ggtactggtg cccatcctgc cttcaagtac 900

ctggcccaga cttctgggaa ggagcccacc tggaacttct ggaagtacct agtagcccca 960

gatggaaagg tggtaggggc ttgggaccca actgtgtcag tggaggaggt cagaccccag 1020

atcacagcgc tcgtgaggaa gctcatccta ctgaagcgag aagacttata accatagagc 1080

ccaccgcatc cccagcatgc ctgctattgt cttcccaatc ctcccccttg ctgtcctgcc 1140

ccaccccacc ccccagaata gaatgacacc tactcagaca atgcgatgca atttcctcat 1200

tttattagga aaggacagtg ggagtggcac cttccagggt caaggaaggc acgggggagg 1260

ggcaaacaac agatggctgg caactagaag gcacag 1296

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaggaattcc cagtaagtgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcgctccccc gaccctctct 20

<210> 7

<211> 3024

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccgcg aatgctgcgg cgcgcggcta gcttaacaac 180

aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaact 240

agacccagct ttcttgtaca aagttggcat tagagctcgc ggccgcagga acccctagtg 300

atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 360

gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 420

ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 480

atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 540

tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 600

tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 660

tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 720

gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 780

agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 840

cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 900

agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 960

ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 1020

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 1080

ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 1140

cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 1200

tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 1260

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 1320

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 1380

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 1440

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 1500

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 1560

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 1620

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 1680

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 1740

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 1800

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 1860

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 1920

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 1980

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 2040

ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 2100

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 2160

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 2220

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 2280

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 2340

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 2400

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 2460

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 2520

tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 2580

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 2640

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 2700

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 2760

gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 2820

gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 2880

tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 2940

caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 3000

tttgctggcc ttttgctcac atgt 3024

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcggcggccg tcgggtaggg gctttacccg gcg 33

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgccgggtaa agcccctacc cgacggccgc cgc 33

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

actggtgtcg ctggagaagt 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caatctcctt gttgctgtca g 21

Claims

1.一种制备抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的间充质干细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

S1、将针对基因插入安全岛的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；

S2、将插入有模板DNA的同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述模板DNA包括针对基因插入安全岛的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入有GPx7基因；

所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入的序列如SEQ ID NO. 4所示；

所述sgRNA如SEQ ID NO. 1所示；相应地，所述左同源臂序列如SEQ ID NO. 2所示；相应地，所述右同源臂序列如SEQ ID NO. 3所示；

S3、将iPSC细胞或胚胎干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；

S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；

S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株；

S6、将所述进行了基因定向敲入的单克隆细胞株扩增并定向诱导分化成为间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述sgRNA带有化学修饰基团；所述化学修饰基团优选为甲基化学修饰基团或磷硫酰化学修饰基团；针对基因插入安全岛的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白的用量摩尔比为1:1至1:5。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，将针对基因插入安全岛的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合的时间为5-20分钟，温度为10-40℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S3中，所述iPSC细胞或胚胎干细胞悬液与所述RNP复合物混合时，相对于每10⁶个所述iPSC细胞，以sgRNA的量计，所述RNP复合物的用量为10-50 μmol，所述iPSC细胞的悬液中，细胞浓度为(1-5)×10⁷个/mL；以sgRNA的量计，所述RNP复合物的终浓度为0.1-1.5μmol/μL。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其中，步骤S3中，电转的条件包括：电场强度为50-250V/cm，单次脉冲时间为2-15ms，相邻两次脉冲之间的时间间隔为10-60s，总脉冲次数为2-10次。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S4中，在电转结束后5-20分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行8-24小时的转染，得到转染后的培养物。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其中，步骤S4中，待转染的AAV病毒颗粒的悬液的加入量使得待转染的AAV病毒颗粒的MOI值为10⁴-10⁶。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述iPSC细胞为1016细胞株，所述AAV病毒的血清型为AAV-8病毒、AAV-6病毒、AAV-1病毒或AAV9病毒；

扩增并定向诱导分化的条件包括：将所述进行了基因定向敲入的单克隆细胞株在低粘附培养板中继续培养18-100小时后形成拟胚体；然后将所述拟胚体接种于基质胶上继续培养10-20天后用流式细胞术分选其中CD73、CD90和CD105均为阳性的细胞群体。

9.权利要求1-8中任意一项所述的方法制备得到的间充质干细胞。

10.权利要求9所述的间充质干细胞的用途，其特征在于，所述用途为如下任意一种：

制备改善胰岛素抵抗和/或慢性炎症的产品；

制备细胞移植治疗的产品；

制备改善β细胞功能的治疗性产品；

制备再生和/或修复损伤血管的产品。